【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然型および遺伝子組換え型のいずれをも包含するものであって、以下の（１）〜（３）の機能を有するネコアクチビンＡに関する。
（１） ネコの赤血球に作用し、ヘモグロビン誘導を行う。
（２） ネコの膵臓のベータ細胞に作用し、その分化を行う。
（３） ネコフォリスタチンとの結合能を有する。
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であるネコインヒビンサブユニットを遺伝子操作技術により作製し、その結果得られるネコアクチビンＡを量産し、以て動物用医薬品（慢性貧血、糖尿病治療薬、難治性骨疾患治療薬）とすることを目的とした、プラスミド、形質転換体、ネコアクチビン及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクチビンＡはサブユニットであるインヒビンβＡ（アミノ酸１１６個のポリペプチド鎖）２本からなるホモダイマー構造を有するタンパク質で、分子量は約２５，０００ダルトンである。フォリスタチンと結合能を有し、下垂体培養細胞の濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）産生を促進する作用を有している（非特許文献１参照）。
【０００３】
アクチビンＡは赤血球の分化、骨形成、膵ベータ細胞の分化、性腺ステロイド生成に関わっているのではないかとの報告があり、またアクチビンＡを構成するインヒビンβＡｍＲＮＡは、精巣、胎盤、下垂体、副腎、骨髄、脳組織中に検出される。
【０００４】
アクチビンＡは卵胞液中に同定されそこから精製され、遺伝子操作技術によりクローニングが行われ、発現されている。（非特許文献２参照）
ネコの疾患の中には、慢性腎不全によるとされる腎性貧血が知られている。この腎性貧血では、ステロイド製剤やヒトエリスロポエチン製剤などが使用されているが、ネコ特有に治療薬はない。
【０００５】
またネコでは内分泌系、中でも糖尿病の症例も比較的多く報告があり、その治療薬としてブタインスリンを使用しているが、ネコ特有のタンパク医薬品はない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｈｅｌｅｎｅ Ｈ著：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８８．， ８５、 ｐ２４７−２５１
【０００７】
【非特許文献２】
Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ著：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ．．、１９８６．， ８３、 ｐ３０９１−３０９５
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ネコのアクチビンＡを製造することにより、従来とは異なる作用によるネコの腎性貧血および糖尿病治療薬を提供することを目的としている。
すなわち、慢性腎疾患で生じる貧血を、アクチビンＡの作用の一つである赤血球に作用しヘモグロビンを誘導させる能力により改善する治療方法を提供する。
さらに、糖尿病を、膵臓のベータ細胞の分化を促進しインスリン分泌能を向上させる作用により改善する治療方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、ネコインヒビンβＡ ｃＤＮＡクローニングおよびそれを用いた大量生産を目的とし、創意工夫をなし、ネコのｃＤＮＡからネコインヒビンβＡをコードする遺伝子をクローニング及び全塩基コードを解読することに成功し、更にこれらを発現ベクターに連結したプラスミドを用いてネコアクチビンＡを生産する細胞の作製に成功し、以って簡単に大量にネコアクチビンＡを製造する方法を確立し、かくして本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ネコの赤血球に作用してヘモグロビンの誘導を促進する能力、及び／又は、ネコ膵臓のベータ細胞に作用してその分化およびインスリン分泌能を促進する能力を有するネコアクチビンＡを本旨とするものである。又は、ネコアクチビンＡを生産させるプラスミド、これらのプラスミドを有する大腸菌の形質転換体、およびこのプラスミドにより形質転換された動物細胞、ならびにこれらの形質転換体から得られるネコアクチビンＡを提供するものである。さらに本発明はネコアクチビンＡをコードする遺伝子も提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のネコアクチビンＡを構成するサブユニットであるネコインヒビンβＡ蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだベクター（プラスミド等）は例えば次のようにして製造することができる。すなわち、ネコの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、これからネコインヒビンＡの遺伝子を選択的にクローニングした後、これをベクターに組み込むことにより得られる。前記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換した形質転換体によりアクチビンＡ得ることができる。
【００１２】
ネコの臓器や細胞、ネコの腎細胞由来のＣＲＦＫ細胞などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えばポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法があげられる。ネコ細胞からＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１）、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理した後フェノール抽出を行う方法（文献２）、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理した後、塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選択して行うことができる。
【００１３】
得られたＲＮＡから塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素やプライマーによるＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する。
【００１４】
このｃＤＮＡを鋳型として、マウスやヒトの塩基配列を基にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによりネコインヒビンβＡ遺伝子をクローニングできる。また合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。λファージが感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークを適当なフィルター等の媒体に転写し、予め標識したオリゴマーもしくはＰＣＲで得られた遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションによりネコインヒビンβＡ遺伝子をクローニングすることができる。
【００１５】
宿主としては原核生物もしくは真核生物を用いることができる。原核生物の例としては大腸菌を用いることができる。真核生物としては例えば、動物細胞や昆虫細胞などを使用することができる。
【００１６】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、レトロウイルス等を使用できる。
【００１７】
前記の発現ベクターを宿主細胞（大腸菌などの細菌、カイコなどの昆虫細胞、ネコなどの動物細胞）に導入して、形質転換体とする。なお、発現ベクター中のプロモーター及び薬剤選択マーカーは宿主細胞に依存して選択される。例えば細菌ではｌａｃプロモーター、昆虫細胞ではバキュロウイルスプロモーター、動物細胞ではＳＶ４０プロモーター等である。また前記の発現ベクターが導入された形質転換体の培養は常法に従って行うことができる。
【００１８】
形質転換体より産生されたネコインヒビンβＡ（分子量は約１２，０００〜１５，０００）は、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、インヒビンβＡの二量体（ホモダイマー）であるアクチビンＡ（分子量約２４，０００〜２８，０００）となるが、真核生物細胞より産生された場合は、その細胞内でインヒビンβＡは代謝作用等により２量体のアクチビンＡとなる。なお、前記分子量に幅があるのは、特に真核生物細胞において産生された場合、ネコインヒビンβＡやネコアクチビンＡには、糖鎖で修飾されることが多く、それにより分子量が増加するからである。なお、ネコインヒビンβＡやネコアクチビンＡのポリペプチド構造を有するもの、又は、その構造において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたものでさえあれば、糖鎖やその他の修飾はあってもなくても良い。
【００１９】
生産されたネコアクチビンＡは、以下のような能力を持つ。すなわち、ヘモグロビン誘導能、ベータ細胞の分化、フォリスタチンとの結合能である。ヘモグロビン誘導は、ヒトの場合、赤白血球細胞（Ｋ５６２）を用いたヘモグロビンの定量により確認することができる。
【００２０】
またベータ細胞への作用は、膵臓のベータ細胞にアクチビンを処理したとき、ベータ細胞の分化が促進され、さらにインスリンの分泌能が向上することをインスリンの定量を行うことにより確認することができる。
【００２１】
ネコフォリスタチンと結合能を有するか否かは、フォリスタチンをラベルしたバインディング・アッセイにより確認することができる。すなわち、フォリスタチンを放射性ヨードでラベルし、アクチビンを加えることによりヨードラベル化されたフォリスタチンが結合させ、アクチビンと結合していないフォリスタチンのヨードの量を定量することにより結合能を確認する。
【００２２】
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であるネコインヒビンサブユニットを遺伝子操作技術により作製し、その結果得られるネコアクチビンＡを量産し、以て動物用医薬品（慢性貧血、糖尿病治療薬、難治性骨疾患治療薬）とすることを目的とした、プラスミド、形質転換体、ネコアクチビン及びその製造法に関する。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００２４】
実施例１ （ネコインヒビン遺伝子のクローニング）
（１）ネコｃＤＮＡの調製
ネコ腎由来細胞ＣＲＦＫを１５０ｃｍ２フラスコでゴナトロピン存在下、３〜４日培養し、５×１０７ｃｅｌｌｓの細胞沈殿物を調製する。ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ社）によりｍＲＮＡを調製する。すなわち、ＣＲＦＫの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含むｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２１Ｇニードルで混入しているＤＮＡをせん断する。次にｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え遠心を行い、その上清を得る。得られた上清をオリゴｄＴセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め６８℃に加温しておいたｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒによりポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。次に得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ−Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりｃＤＮＡを合成した。すなわちＲＮａｓｅ ＦｒｅｅのマイクロチューブにｍＲＮＡおよびｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、オリゴｄＴプライマー、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを加えてメスアップし、逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ−Ａｃｅを添加し、４２℃、２０分処理する。９９℃で処理して酵素を失活させて、反応を停止させ、氷上で５分置いた。
【００２５】
（２）ネコインヒビンβＡ遺伝子のクローニング
ヒトインヒビンβＡの塩基配列（文献３）をもとに、配列番号 ６と配列番号７の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のＣＲＦＫｃＤＮＡを０．５ｍＬのマイクロチューブに１μＬを入れ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ）を添加し、全量５０μＬとする。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献４）に従って調製した。
【００２６】
このＤＮＡ断片をｐＵＣ１０８（アマシャムファルマシア社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲおよびＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素処理により確認し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（文献５）でヒトやマウスなどのインヒビンβＡとのホモロジーを確認し、ネコインヒビンβＡと推定されるＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００２７】
この配列を配列番号２に示す。また、この配列を含む、３００ｂｐのＤＮＡ断片に日本ロッシュ社製のＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔを用いてＤＩＧ標識し、プローブを作製した。 次にネコ腎由来細胞ＣＲＦＫを１５０ｃｍ２フラスコで３〜４日培養し、５×１０７ｃｅｌｌｓの細胞沈殿物を調製した。ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ社）によりｍＲＮＡを調製した。すなわち、ＣＲＦＫの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含むｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２１Ｇニードルで混入しているＤＮＡをせん断した。次にｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを加え遠心を行い、その上清を得た。得られた上清をオリゴｄＴセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め６８℃に加温しておいたｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒによりポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。次に得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて、ＺＡＰ−ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。すなわちｋｉｔのマニュアルに従い２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。次にＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ ｖｅｃｔｏｒに連結した後、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてパッケージングを行い、組換え体ファージライブラリーを作製した。この組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’上でプラークとして形成させ、日本ロシュ社製のナイロンメンブレンに常法に従って転写した。転写したナイロンメンブレンは、ＤＮＡの固定を行った後、２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液中に浸し、３７℃１時間インキュベートした。さらにそのナイロンメンブレンを、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬになるように前記プローブを加えたＤＩＧ ＥＡＳＹ ＨＹＢ（日本ロシュ社製）中に入れ、４２℃で１晩インキュベートを行い、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたナイロンメンブレンを、２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中５分、２回洗浄を行い、さらに０．５×ＳＳＣ（７．５ｍＭＮａＣｌ、０．７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中６５℃下、１５分、２回洗浄を行った。ナイロンメンブレンをＣＤＰ−Ｓｔａｒによる化学発光により陽性プラークの検出を行った。すなわち、洗浄したナイロンメンブレンをブロッキング溶液（日本ロシュ社製）に室温下３０分以上インキュベートした後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（日本ロシュ社製）を含むブロッキング溶液内に入れてさらに３０分インキュベートした。抗体溶液を捨て、洗浄バッファー（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）で１５分間、各２回ずつナイロンメンブレンを洗浄し、検出バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）内に溶解させたＣＤＰ−Ｓｔａｒをナイロンメンブレンに処理し、５分間室温で、さらに１５分間３７℃下でインキュベートした。得られたナイロンメンブレンをＸ−ｒａｙ Ｆｉｌｔｅｒに露光し、陽性シグナルを有するプラークを常法に従い再スクリーニングした。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージのプラークを得た。この組換え体ファージよりｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｉｓｉｏｎ法により、組換えプラスミドを含む大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、常法に従いプラスミドを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法でヒトやマウスなどのインヒビンβＡとのホモロジーを確認し、３‘末端側を含むネコインヒビンβＡ ＤＮＡの部分塩基配列（配列番号４）を決定した（但し、この塩基配列には、プライマーに用いたヒトインヒビン部分配列により一部置換されている）。
【００２８】
（３）５’ＲＡＣＥ法によるネコインヒビンβＡ遺伝子５’末端のクローニング
（２）で得られたネコインヒビンβＡの部分塩基配列をもとに、配列番号８と配列番号９と配列番号１０の３種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のＣＲＦＫｍＲＮＡを０．５ｍＬのマイクロチューブに２μＬを入れ、５’ＲＡＣＥｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてネコインヒビンβＡの５’側末端を含むＤＮＡを調製した。すなわち、ＣＲＦＫｍＲＮＡおよびＲＮａｓｅを不活化するためのＤＥＰＣ水、プライマー２５ｐｍｏｌ（配列番号８）を加え、７０℃１０分間処理した。次に氷上で１分間おき、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴをそれぞれ添加し４２℃で１分加温した。次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴを添加し、さらに４２℃で３０分処理し続けて７０℃１５分処理して、ｃＤＮＡへの逆転写を行った。最後にＲＮａｓｅＭｉｘを加え３７℃で２０分処理を行ってＲＮＡを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅにより逆転写されたｃＤＮＡの精製を行った。すなわち、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６Ｍ ＮａＩ）をサンプルに添加し、Ｓｐｉｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅにセットした後１３，０００Ｇ、２０秒遠心を行った。４００μＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで洗浄を繰り返し、さらに７０％エタノールで洗浄を加えた後、予め６５℃に熱しておいた滅菌水を加えて１３，０００Ｇ、２０秒遠心を加えた。溶出したサンプル１０μＬ、ＤＥＰＣ処理水６．５μＬ、ｔａｉｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、２ｍＭｄＣＴＰ２．５μＬを混合し、９４℃、３分処理した後、氷上で１分静置した。次に５’ＲＡＣＥ ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ社製）のｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１μＬを加え、３７℃１０分処理し、さらに６５℃、１０分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃＤＮＡ５’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号９）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物を用いてプライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号１０）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００２９】
このＤＮＡ断片をｐＵＣ１０８（アマシャムファルマシア社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法で５’末端を含むネコインヒビンβＡのＤＮＡの一部と推定される塩基配列を決定した（配列番号５）。
【００３０】
（４）ネコインヒビンβＡのｃＤＮＡ配列
上記の（２）および（３）により、決定された塩基配列をつき合わせて、ネコインヒビンβＡのｃＤＮＡ完全配列が明らかになった（配列番号１）。
【００３１】
得られた得られたネコインヒビンβＡ遺伝子のホモロジー検索の結果、Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）：９１％、Ｏ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）：９０％、Ｐｏｒｃｉｎｅ（ブタ）：９３％、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）：９０％、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）：８８％、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）：８８％であった。
実施例２
（ネコアクチビンＡの生産）
（１）ネコインヒビンβＡトランスファーベクターの調製およびｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ネコインヒビンβＡＤＮＡ断片は配列番号１１と配列番号１２の２種類のプライマー（それぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位に相当する塩基配列を有する）を作製し、実施例１の（２）と（３）で調製したｃＤＮＡ断片を鋳型とし、ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。エタノール沈殿後、１％アガロースゲル電気泳動にて約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅによりリン酸化した後、予めＳｍａＩ処理し、脱リン酸化処理したｐＵＣ１０８に挿入した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβＡＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３２】
本プラスミドを２種類の制限酵素（ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ）で処理し、電気泳動法によりネコインヒビンβＡＤＮＡ断片を得た。一方、哺乳動物細胞用トランスファーベクターｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、調製した。こうして得られたネコインヒビンβＡＤＮＡ断片と切断されたベクターにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結させた。この連結させたベクターを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβＡＤＮＡの塩基配列を確認した。次にこのプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞にＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。
【００３３】
（２）ＣＨＯ−Ｋ１でのネコアクチビンＡの発現
上記（１）で得られた細胞を、３７℃下４〜５日間培養を行い、その培養上清を回収し、１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心を行い、ネコアクチビンＡを含む上清画分を得た。
【００３４】
（３）ネコアクチビンＡの活性測定
上記（２）で生産されたネコアクチビンＡの活性測定は以下のようにして行った。すなわちアクチビンＡによるＫ５６２細胞のヘモグロビン放出により行った。（文献６）
９６穴プレートにＫ５６２細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地により、（３）で得られたアクチビンＡを含む培養上清非存在下または存在下、４日間培養を行う。次に細胞をＰＢＳにより２回Ｗａｓｈし、滅菌した水５０μＬに懸濁し、遠心操作により上清画分４０μＬを得る。得られた上清に０．５ｍｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ と０．０３％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液２００μＬを加え、暗下１５分処理した。その後２．５Ｍ硫酸を５０μＬ加え、４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果、ネコアクチビンＡ存在下の方の実施サンプル（Ａｃｔ）は、非存在下の方のコントロールサンプル（ｃｏｎｔ）に比べて有意にヘモグロビンの誘導を行った（図１）。
【００３５】
参考文献
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２．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９． １８． ５１４３−４９
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５．Ｔａｋａｂｅら：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８８ ．８ ．４６６−４７２
６．Ｊｅｎｎｉｅら：Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９３．１３２．２７３２−３４
【００３６】
【発明の効果】
本発明によりネコアクチビンＡを効率良く産生させることができる。
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネコアクチビンＡを用いたヘモグロビン誘導を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to feline activin A, which includes both natural and recombinant forms, and has the following functions (1) to (3).
(1) Acts on red blood cells of cats to induce hemoglobin.
(2) It acts on beta cells of the cat pancreas to differentiate them.
(3) It has the ability to bind to cat follistatin.
The present invention provides a Necotihibin subunit in which the primary structure of a protein is derived from the genetic information of a cat by genetic engineering technology, mass-produces the resulting Necoactivin A, and thereby produces a veterinary drug (for treating chronic anemia and diabetes). A plasmid, a transformant, a feline activin, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Activin A is a protein having a homodimer structure composed of two subunits, inhibin βA (a polypeptide chain of 116 amino acids), and has a molecular weight of about 25,000 daltons. It has the ability to bind follistatin and promotes the production of follicle-stimulating hormone (FSH) in pituitary cells (see Non-Patent Document 1).
[0003]
Activin A has been reported to be involved in erythrocyte differentiation, bone formation, pancreatic beta cell differentiation, and gonadal steroidogenesis. Inhibin βA mRNA that constitutes activin A is expressed in testis, placenta, pituitary, adrenal gland , Bone marrow and brain tissue.
[0004]
Activin A has been identified in follicular fluid, purified therefrom, cloned by genetic engineering techniques and expressed. (See Non-Patent Document 2)
Among cat diseases, renal anemia attributed to chronic renal failure is known. In this renal anemia, steroid preparations and human erythropoietin preparations are used, but there is no specific treatment for cats.
[0005]
In cats, the endocrine system, particularly diabetes, has been reported relatively frequently, and porcine insulin is used as a remedy, but there is no protein drug specific to cats.
[0006]
[Non-patent document 1]
Helene H: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. , 85, p247-251
[0007]
[Non-patent document 2]
Robert G: Proc Natl Acad Sci. USA. . 1986. , 83, pp. 3091-3095
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for renal anemia and diabetes in cats, which has a different effect from conventional ones, by producing cat activin A.
That is, the present invention provides a therapeutic method for improving anemia caused by chronic kidney disease by the ability to act on erythrocytes, which is one of the actions of activin A, to induce hemoglobin.
Further, the present invention provides a therapeutic method for improving diabetes by promoting pancreatic beta cell differentiation and improving insulin secretion ability.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor aimed at cloning of Necoinhibin βA cDNA and mass production using the same, devising ingenuity, cloning a gene encoding Necoinhibin βA from cat cDNA and encoding all bases. Was successfully deciphered.Furthermore, cells that produce feline activin A were successfully produced using a plasmid obtained by ligating these to an expression vector, thereby establishing a method for easily producing feline activin A in large quantities. Thus, the present invention has been completed.
[0010]
That is, the present invention provides feline activin A having the ability to act on red blood cells of cats to promote the induction of hemoglobin and / or the ability to act on beta cells of cat pancreas to promote their differentiation and insulin secretion ability. It is assumed that. Also, the present invention provides a plasmid for producing feline activin A, a transformant of Escherichia coli having these plasmids, an animal cell transformed with the plasmid, and feline activin A obtained from these transformants. . The present invention further provides a gene encoding feline activin A.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The vector (plasmid or the like) into which the DNA encoding the necotihibin βA protein, which is a subunit constituting the feline activin A of the present invention, can be produced, for example, as follows. That is, it can be obtained by extracting poly (A) RNA from cat cells, synthesizing cDNA, selectively cloning the gene of catinhibin A therefrom, and incorporating this into a vector. Activin A can be obtained from a transformant obtained by transforming a host cell using the vector.
[0012]
Methods for obtaining RNA from cat organs or cells, CRFK cells derived from cat kidney cells, and the like include ordinary methods, for example, methods using polysome separation, sucrose density gradient centrifugation, and electrophoresis. As a method for extracting RNA from cat cells, guanidine / thiocyanate-cesium chloride method in which CsCl density gradient centrifugation is performed after treatment with guanidine / thiocyanate (Reference 1), treatment with a surfactant using a vanadium complex in the presence of a ribonuclease inhibitor And then phenol extraction (Reference 2), guanidine thiocyanate-hot phenol method, guanidine thiocyanate-guanidine hydrochloride method, guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method, treatment with guanidine thiocyanate, and treatment with lithium chloride Then, an appropriate method can be selected from methods for precipitating RNA and the like.
[0013]
MRNA is isolated from the obtained RNA by the lithium chloride / urea method, guanidine / isothiocyanate method, oligo dT cellulose column method, etc., and cDNA is synthesized from the obtained mRNA using a reverse transcriptase or a DNA polymerase with primers.
[0014]
Using this cDNA as a template, the Necoinhibin βA gene can be cloned by performing a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) using primers based on mouse or human base sequences. After the synthesized cDNA is ligated to a λ phage vector, it is packaged in vitro by mixing with a λ phage coat protein and the like, and the resulting phage particles are infected to Escherichia coli as a host. E. coli infected with λ phage is lysed, and individual clones are recovered as plaques. The plaque is transferred to a suitable medium such as a filter, and the Necoinhibin βA gene can be cloned by hybridization using a pre-labeled oligomer or a gene obtained by PCR as a probe.
[0015]
Prokaryotes or eukaryotes can be used as hosts. Escherichia coli can be used as an example of a prokaryote. As eukaryotes, for example, animal cells, insect cells, and the like can be used.
[0016]
As an expression vector, a plasmid, a phagemid, a cosmid, a phage, a retrovirus, or the like can be used.
[0017]
The above-described expression vector is introduced into host cells (bacteria such as Escherichia coli, insect cells such as silkworms, and animal cells such as cats) to obtain transformants. The promoter and the drug selection marker in the expression vector are selected depending on the host cell. For example, the lac promoter is used for bacteria, the baculovirus promoter is used for insect cells, and the SV40 promoter is used for animal cells. The transformant into which the expression vector has been introduced can be cultured according to a conventional method.
[0018]
Necoinhibin βA (molecular weight of about 12,000 to 15,000) produced from the transformant was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions to obtain a dimer (homodimer) of inhibin βA, activin A ( (Molecular weight of about 24,000 to 28,000), but when produced from a eukaryotic cell, inhibin βA is converted into a dimeric activin A by metabolism or the like in the cell. In addition, the reason why the molecular weight has a range is that, especially when produced in eukaryotic cells, Necoinhibin βA and Necoactivin A are often modified with sugar chains, thereby increasing the molecular weight. is there. In addition, as long as it has a polypeptide structure of Necoinhibin βA or Necoactivin A, or a structure in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, sugar chains and other modifications are not allowed. It may or may not be present.
[0019]
The produced feline activin A has the following abilities. That is, the ability to induce hemoglobin, the differentiation of beta cells, and the ability to bind to follistatin. In the case of human, the induction of hemoglobin can be confirmed by quantification of hemoglobin using red and white blood cells (K562).
[0020]
In addition, the effect on beta cells can be confirmed by performing insulin quantification to confirm that when beta cells of the pancreas are treated with activin, beta cell differentiation is promoted and insulin secretion ability is further improved.
[0021]
Whether or not it has the ability to bind to cat follistatin can be confirmed by a binding assay in which follistatin is labeled. That is, follistatin is labeled with radioactive iodine, iodo-labeled follistatin is bound by adding activin, and the binding ability is confirmed by quantifying the amount of follistatin iodine not bound to activin.
[0022]
The present invention provides a Necotihibin subunit in which the primary structure of a protein is derived from the genetic information of a cat by genetic engineering technology, mass-produces the resulting Necoactivin A, and thereby produces a veterinary drug (for treating chronic anemia and diabetes). A plasmid, a transformant, a feline activin, and a method for producing the same.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0024]
Example 1 (Cloning of Necoinhibin Gene)
(1) Preparation of Feline cDNA The feline kidney-derived cell CRFK is cultured in a 150 cm 2 flask in the presence of gonatropin for 3 to 4 days to prepare a cell precipitate of 5 × 10 7 cells. An mRNA is prepared using an mRNA isolation kit (Stratagene). That is, a denaturing solution containing guanidine thiocyanate is added to the CRFK precipitate, and the mixed DNA is sheared with a 21G needle. Next, an elution buffer is added and centrifugation is performed to obtain a supernatant. The resulting supernatant was applied to an oligo dT cellulose column, and after washing the column, poly (A) RNA was eluted with an elution buffer preheated to 68 ° C. Next, using the obtained poly (A) RNA, cDNA was synthesized by Reverse Tra-Ace (TOYOBO). That is, mRNA and dNTP mixture, oligo dT primer, RNase free H 2 O are added to a microtube of RNase Free to make up the volume, and ReverseTra-Ace, a reverse transcriptase, is added, followed by treatment at 42 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by treatment at 99 ° C. to inactivate the enzyme and left on ice for 5 minutes.
[0025]
(2) Cloning of Necoinhibin βA Gene Based on the nucleotide sequence of human inhibin βA (Reference 3), two types of primers of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were synthesized by a DNA synthesizer. 1 μL of the CRFK cDNA of the above (1) was placed in a 0.5 mL microtube, and 20 pmol of each primer, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1.5 mM MgSO 4 , 25 mM KCl, 50 μM each dNTP, DNA polymerase (TOYOBO) (KOD), to make a total volume of 50 μL. DNA denaturation conditions of 94 ° C. for 30 seconds, primer annealing conditions of 60 ° C. for 30 seconds, primer extension conditions of 68 ° C. for 1 minute, and 35 cycles of reaction using a Bio-RAD DNA thermal cycler. I let it. This was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 300 bp was prepared according to a conventional method (Reference 4).
[0026]
This DNA fragment was transferred to pUC108 (Amersham Pharmacia) using DNA Ligation kit Ver. 2 and ligated. Using this, Escherichia coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method. Next, the insertion of the PCR fragment into this plasmid was confirmed by PCR under the same conditions as described above and restriction enzyme treatment with EcoRI and HindIII, and the BigDye Terminator Cycle Sequencing method (Reference 5) was performed by ABI PRISM 377XL (Applied Biosystems). Then, the homology with human or mouse inhibin βA was confirmed, and the nucleotide sequence of DNA presumed to be necobinhibin βA was determined.
[0027]
This sequence is shown in SEQ ID NO: 2. A 300 bp DNA fragment containing this sequence was labeled with DIG using a DIG DNA Labeling kit manufactured by Roche Japan to produce a probe. Next, the cat kidney-derived cell CRFK was cultured in a 150 cm2 flask for 3 to 4 days to prepare a cell precipitate of 5 × 10 7 cells. mRNA was prepared using the mRNA isolation kit (Stratagene). That is, denaturing solution containing guanidine thiocyanate was added to the CRFK precipitate, and the contaminating DNA was sheared with a 21G needle. Next, elution buffer was added and centrifuged to obtain a supernatant. The resulting supernatant was applied to an oligo dT cellulose column, and after washing the column, poly (A) RNA was eluted with an elution buffer preheated to 68 ° C. Next, using the obtained poly (A) RNA, a cDNA phage library was synthesized using a ZAP-DNA Synthesis kit (TOYOBO). That is, a double-stranded cDNA was synthesized according to the kit manual, and an EcoRI / NotI adapter was further ligated. Next, after linking to Uni-ZAP XR vector, packaging was performed using Gigapack III packaging extract (Stratagene) to prepare a recombinant phage library. This recombinant phage library was formed as a plaque on Escherichia coli XL1Blue MRF 'and transcribed to a nylon membrane manufactured by Roche Japan in a conventional manner. After immobilizing the DNA, the transferred nylon membrane was immersed in a 2 mg / mL proteinase K solution and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, the nylon membrane was put into DIG EASY HYB (manufactured by Roche Japan) to which the above-mentioned probe was added so as to have a final concentration of 20 ng / mL, incubated at 42 ° C. overnight, and hybridized. The hybridized nylon membrane was washed twice in 2 × SSC (30 mM NaCl, 3 mM sodium citrate) and 0.1% SDS for 5 minutes, and further washed with 0.5 × SSC (7.5 mM NaCl, 0.75 mM citric acid). Sodium), and washed twice in 0.1% SDS at 65 ° C. for 15 minutes. Positive plaques were detected on the nylon membrane by chemiluminescence using CDP-Star. That is, the washed nylon membrane was incubated in a blocking solution (manufactured by Nippon Roche) at room temperature for 30 minutes or more, then placed in a blocking solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody (manufactured by Nippon Roche), and further incubated for 30 minutes. . The antibody solution is discarded, and the nylon membrane is washed twice with a washing buffer (100 mM maleic acid, 150 mM NaCl, 0.3% Tween 20) for 15 minutes, and placed in a detection buffer (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl). The dissolved CDP-Star was treated on a nylon membrane and incubated at room temperature for 5 minutes and at 37 ° C. for another 15 minutes. The obtained nylon membrane was exposed to an X-ray Filter, and plaques having a positive signal were rescreened according to a conventional method. As a result of three screenings, one plaque of the recombinant phage having a positive signal was obtained. Escherichia coli containing the recombinant plasmid was obtained from the recombinant phage by the in vivo extrusion method. The Escherichia coli is cultured, a plasmid is prepared according to a conventional method, and homology with human or mouse inhibin βA such as human or mouse is confirmed by ABI PRISM 377XL (Applied Biosystems) by BigDye Terminator Cycle Sequencing method, and the cat including the 3′-terminal is confirmed. The partial nucleotide sequence of inhibin βA DNA (SEQ ID NO: 4) was determined (however, this nucleotide sequence was partially substituted by the human inhibin partial sequence used for the primer).
[0028]
(3) Cloning of 5 'end of Necoinhibin βA gene by 5'RACE method Based on the partial nucleotide sequence of Necoinhibin βA obtained in (2), three types of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 Were synthesized using a DNA synthesizer. 2 μL of the CRFK mRNA of the above (1) was placed in a 0.5 mL microtube, and DNA containing the 5 ′ end of necobinhibin βA was prepared using 5 ′ RACE kit (manufactured by GIBCO). That is, DEPC water for inactivating CRFK mRNA and RNase and 25 pmol of primer (SEQ ID NO: 8) were added, and the mixture was treated at 70 ° C. for 10 minutes. Next, the mixture was kept on ice for 1 minute, 10 × PCR Buffer, 25 mM MgCl 2 , 10 mM dNTP, and 0.1 M DTT were added thereto, and the mixture was heated at 42 ° C. for 1 minute. Next, SuperScriptIIRT was added, and the treatment was further continued at 42 ° C. for 30 minutes, followed by treatment at 70 ° C. for 15 minutes to perform reverse transcription to cDNA. Finally, RNase Mix was added, and the mixture was treated at 37 ° C. for 20 minutes to degrade RNA. Using the sample thus obtained, cDNA reverse transcribed by Spin Cartridge was purified. That is, a binding solution (6M NaI) was added to the sample, and the sample was set on a Spin cartridge, followed by centrifugation at 13,000 G for 20 seconds. Washing was repeated with 400 μL wash buffer, and after washing with 70% ethanol, sterile water preheated to 65 ° C. was added, followed by centrifugation at 13,000 G for 20 seconds. 10 μL of the eluted sample, 6.5 μL of DEPC-treated water, 5 μL of tailing buffer, and 2.5 μL of 2 mM dCTP were mixed, treated at 94 ° C. for 3 minutes, and left still on ice for 1 minute. Next, 1 μL of terminal deoxynucleotidyl transferase of 5′RACE kit (manufactured by GIBCO) was added, the mixture was treated at 37 ° C. for 10 minutes, and further treated at 65 ° C. for 10 minutes to obtain a base sequence complementary to the adapter primer described below. cDNA was added to the 5 'end. Using the obtained sample, 20 pmol of the primer (SEQ ID NO: 9) and 20 pmol of the adapter primer, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1.5 mM MgSO 4 , 25 mM KCl, 50 μM each of dNTP and KOD were added, and the total amount was added. The volume was 50 μL. DNA denaturation conditions of 94 ° C. for 30 seconds, primer annealing conditions of 62 to 50 ° C. for 30 seconds, primer extension conditions of 68 ° C. for 1 minute, and 35 minutes using a Bio-RAD DNA thermal cycler. A cycle reaction was performed. Using the obtained PCR product, 20 pmol of the primer (SEQ ID NO: 10) and 20 pmol of the adapter primer, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1.5 mM MgSO 4 , 25 mM KCl, 50 μM each of dNTP and KOD were added, and the total amount was added. The volume was 50 μL. DNA denaturation conditions of 94 ° C. for 30 seconds, primer annealing conditions of 62 to 50 ° C. for 30 seconds, primer extension conditions of 68 ° C. for 1 minute, and 35 minutes using a Bio-RAD DNA thermal cycler. A cycle reaction was performed. This was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 400 bp was prepared according to a conventional method.
[0029]
This DNA fragment was transferred to pUC108 (Amersham Pharmacia) using DNA Ligation kit Ver. 2 and ligated. Using this, Escherichia coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method. Next, the fact that the PCR fragment was inserted into this plasmid was confirmed by PCR under the same conditions as described above, and the DNA of Necoinhibin βA containing the 5 ′ end was analyzed by ABI PRISM 377XL (Applied Biosystems) using the BigDye Terminator Cycle Sequencing method. A nucleotide sequence presumed to be part was determined (SEQ ID NO: 5).
[0030]
(4) cDNA sequence of Necoinhibin βA From (2) and (3) above, the complete nucleotide sequence of Necoinhibin βA was revealed by combining the determined nucleotide sequences (SEQ ID NO: 1).
[0031]
As a result of the homology search of the obtained Necoinhibin βA gene, Equus caballus (horse): 91%, Oaries (sheep): 90%, Porcine (porcine): 93%, Homosapiens (human): 90%, Rattus norvegicus (rat): 88%, Mus musculus (mouse): 88%.
Example 2
(Production of Necoactivin A)
(1) Preparation of Necoinhibin βA Transfer Vector and Transfection
For the Necobinhibin βA DNA fragment, two types of primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (each having a nucleotide sequence corresponding to a cleavage site of restriction enzymes XhoI and EcoRI) were prepared, and (2) and (3) of Example 1 were prepared. Using the cDNA fragment prepared in step (1) as a template, DNA denaturation conditions are 94 ° C. for 30 seconds, primer annealing conditions are 60 ° C. for 30 seconds, and primer extension conditions are 68 ° C. for 1 minute, manufactured by Bio-RAD. The reaction was performed for 35 cycles using a DNA thermal cycler. After ethanol precipitation, a DNA fragment of about 1.3 kbp was prepared by 1% agarose gel electrophoresis. This DNA fragment was phosphorylated by T4 polynucleotide kinase, and then inserted into pUC108 that had been previously treated with SmaI and dephosphorylated. Using this, Escherichia coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method. Further, the nucleotide sequence of Necoinhibin βA DNA in the prepared plasmid was confirmed.
[0032]
This plasmid was treated with two kinds of restriction enzymes (XhoI and EcoRI), and a Necoinhibin βA DNA fragment was obtained by electrophoresis. On the other hand, a mammalian cell transfer vector pOPRSVI / MCS (Stratagene) was cut with restriction enzymes XhoI and EcoRI to prepare. The DNA ligation kit Ver. 2 and ligated. Escherichia coli was transformed using the ligated vector according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method. Further, the nucleotide sequence of Necoinhibin βA DNA in the prepared plasmid was confirmed. Next, this plasmid was transfected to CHO-K1 cells using GenePORTER Transfection Reagent.
[0033]
(2) Expression of Necoactivin A in CHO-K1 The cells obtained in (1) above were cultured at 37 ° C. for 4 to 5 days, and the culture supernatant was collected and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes. Was performed to obtain a supernatant fraction containing feline activin A.
[0034]
(3) Activity measurement of feline activin A The activity of feline activin A produced in the above (2) was measured as follows. That is, hemoglobin was released from K562 cells by activin A. (Reference 6)
K562 cells (2 × 10 5 cells / mL) were placed in a 96-well plate with RPMI-1640 medium containing 10% FBS in the absence or presence of the culture supernatant containing activin A obtained in (3) for 4 days. Perform culture. Next, the cells are washed twice with PBS, suspended in 50 μL of sterilized water, and centrifuged to obtain a supernatant fraction of 40 μL. 200 μL of a citrate buffer containing 0.5 mg / mL O-phenylenediamine and 0.03% hydrogen peroxide was added to the obtained supernatant, and the mixture was treated in the dark for 15 minutes. Thereafter, 50 μL of 2.5 M sulfuric acid was added, and the absorbance at 490 nm was measured. As a result, the working sample (Act) in the presence of feline activin A significantly induced hemoglobin as compared with the control sample (cont) in the absence thereof (FIG. 1).
[0035]
Reference 1. Chirgwin et al .: Biochemistry 1979. 18. 5294-5304
2. Berger et al .: Biochemistry 1979. 18. 5143-49
3. Mason AJ et al .: Nature. 1985. 318. p659-663
4. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 1982
5. Takabe et al .: Mol Cell Biol. 1988. <8. 466-472
6. Jennie et al .: Endcrinology. 1993.132.2732-34
[0036]
【The invention's effect】
According to the present invention, feline activin A can be efficiently produced.
[0037]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing induction of hemoglobin using feline activin A.
