JP2004117233A - 生化学解析用ユニットおよびその製造方法並びに化学発光法および生化学解析装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】化学発光法におけるバックグラウンドの発光量を低減させる。
【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。このリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。続いて、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を光電的に検出する。
【選択図】 なし
【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。このリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。続いて、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を光電的に検出する。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを検出するための生化学解析用ユニットおよびその製造方法、並びに生化学解析用ユニットを利用して標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法、さらには生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、cDNA、DNA、RNAなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて吸着性領域に滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、DNA、mRNAなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプタまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【0003】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の吸着性領域の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【0004】
標識されたレセプタまたはリガンドを解析する別の方法として、化学発光法を用いた検出方法が知られている。これは、担体表面上の異なる位置にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原などで標識されたレセプタまたはリガンド(以下、標識レセプタまたは標識リガンドという)をハイブリダイゼーションなどによって、担体表面上に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体を、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識し(以下、酵素標識抗体という)、この酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する方法である。
【0005】
【特許文献1】
特許第2837276号公報
【0006】
【非特許文献1】
「nature genetics」Vol.21, p.25−p.32(1999)
【0007】
【非特許文献2】
「バイオインダストリー」Vol.18, p.13−p.19(2001)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
上述の化学発光法においても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上が要求されている。しかし、化学発光法ではバックグラウンドが高いために、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量(ノイズあるいはバックグラウンド)に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量(信号)の比(S/N比)が小さく、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【0009】
化学発光法は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質と特異的に結合した酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出して解析を行うが、化学発光基質が酵素と反応する際に、酵素以外の何らかの作用によって発光する場合には、バックグラウンドが高くなる。
【0010】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、バックグラウンドを低減させることが可能な生化学解析用ユニットおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。また、この生化学解析用ユニットを利用した化学発光法、さらに生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置も提供することを目的とするものである。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットであって、該生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とするものである。
【0012】
本発明の生化学解析用ユニットの製造方法は、複数の孔を有する基板の前記孔内に、それぞれ吸着性材料を充填することによって吸着性領域を形成し、前記孔内に吸着性領域が形成された生化学解析用ユニットを滅菌することを特徴とする方法である。
【0013】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる化学発光法において、前記生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とする方法である。
ここで、生化学解析用ユニットの滅菌はリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して行われる。
【0014】
本発明の生化学解析装置は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットが取付部によって着脱可能に取り付けられ、前記リガンドまたはレセプタと標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドとを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させる流動手段とからなる生化学解析装置であって、前記生化学解析用ユニットが滅菌されているものであることを特徴とするものである。
【0015】
ここで、滅菌された生化学解析用ユニットはリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して滅菌が行われたものである。
【0016】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットが滅菌されたものであるため、これを化学発光法に用いた場合に化学発光基質が酵素以外の何らかの作用によって発光することが抑制され、バックグラウンドを低減させることが可能となる。また、バックグラウンドを低減させることができるため、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量(ノイズあるいはバックグラウンド)に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量(信号)の比(S/N比)を大きく検出することが可能となるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出可能となり、検出限界を向上させることができる。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図1は本発明の生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図1に示す生化学解析用ユニット1は、孔3が複数設けられた基板2と、孔3の内部に充填され、多孔性材料が基板2と接着された吸着性領域4とからなる。
【0018】
基板2の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、放射線または光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、放射線または光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【0019】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−6やナイロン−6,6などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【0020】
放射線または光を減衰させるために、プラスチックに金属酸化物粒子やガラス繊維などを充填することが好ましく、金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素、アルミナ、二酸化チタン、酸化鉄、酸化銅などがあげられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【0021】
ここで、放射線または光を減衰させるとは、前記基板2の孔3に充填された多孔質材料表面または内部のリガンドまたはレセプタと結合した標識レセプタまたは標識リガンドから発する放射線または光が、基板の孔から基板壁を透過して、隣接する孔に到達する強度が好ましくは1/5以下、さらに好ましくは1/10以下になることを意味する。
【0022】
放射性標識した試料からの電子線などの放射線を効果的に遮蔽するためには、基板2の平均密度は、一般には0.6g/cm3以上であり、好ましくは1〜20g/cm3の範囲にあり、さらには2〜10g/cm3の範囲であることが好ましい。電子線の透過距離は密度に反比例するので、放射性物質が、32P、33P、35S、14Cなどのような一般的な放射性同位元素(RI)であれば、基板2の平均密度をこの範囲とすることにより、各孔3内に固定されることになる試料のRIからの電子線を基板2の隔壁で遮蔽して、電子線の透過、散乱による放射線画像の分解能の低下を防ぐことができる。
【0023】
基板2の厚みは、一般には50〜1000μmの範囲であることが好ましく、100〜500μmの範囲であることがより好ましい。
【0024】
基板2に開ける孔3の開口部の面積(サイズ)は、孔3の密度を高めるために、一般には5mm2 未満であり、好ましくは1mm2 未満であり、0.3mm2 未満がより好ましく、さらには0.01mm2 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは0.001mm2 以上であることが好ましい。
【0025】
孔3のピッチ(隣接する二つの孔の中心から中心までの距離)は0.05〜3mmの範囲であることが好ましく、孔3の間隔(隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離)は、0.0l〜1.5mmの範囲であることが好ましい。孔3の数(密度)は、一般には10個/cm2 以上であり、好ましくは100個/cm2 以上、より好ましくは500個/cm2 以上、さらには1000個/cm2 以上であることが好ましい。そして、好ましくは100000個/cm2 以下、さらには10000個/cm2 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔3は全て図1に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック(単位)に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【0026】
基板2に複数の孔3を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に1枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを2つのロール間に連続搬送してもよい。
【0027】
図2は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図である。図2に示す生化学解析用ユニットは、多孔性膜21と基板2とを重ね合わせてプレスし、基板2の孔3に多孔性膜21を圧入する方法により作製されるものである。図2(a)に示すように、孔3が形成された基板2と多孔性膜21を重ねて、プレスロール22とバックアップロール23の間に送り込みプレスすることにより、図2(b)に示すように基板2の孔3に多孔性膜1を圧入する。この場合、プレスロール22とバックアップロール23を加熱する方法などにより、多孔性膜21を軟化させてもよい。
【0028】
本発明の生化学解析用ユニットは、基板の孔に多孔質材料を含有している溶液(以下、ドープという)を注入することによっても作製することができる。図3は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図である。連続的、もしくは間欠的に搬送されている基板2の上方に、ドープ31を基板2の孔3に注入するディスペンサ30が配置されており、このディスペンサ30は各孔3へ間欠的にドープ31を注入する。ドープ31が注入された後、基板に温度と湿度が制御された風を一定風速で供給し、徐々に溶剤を揮発させることによって多孔を形成することができる。なお、多孔性膜は、ドープを支持体上に流延または塗布後、多孔性膜のポリマーの貧溶媒、もしくは良溶媒と貧溶媒の混合液に浸漬した後、水洗乾燥するか、またはドープを支持体上に流延または塗布後、徐々に乾燥することにより別途作製してもよい。
【0029】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機/無機複合体であってもよい。
【0030】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体(例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど)、脂肪族ポリアミド類(例えば、ナイロン6、ナイロン6,6、ナイロン4,10など)、ポリオレフィン類(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど)、含塩素ポリマー類(例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど)、フッ素樹脂類(例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど)、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体(例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸/ポリリシンポリイオンコンプレックスなど)、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体(混合体)も用いることができる。
【0031】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【0032】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属(例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど)、金属等の酸化物(例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど)、金属塩(例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど)及びこれらの複合体などがあげられる。
【0033】
生化学解析用ユニットの滅菌には、ガスまたは電気によって直接加熱するか、加熱した空気を循環させて乾燥高温状態を保つ方式によって、乾燥空気中で加熱することによって菌を殺菌する乾熱滅菌法、適当な温度と圧力の飽和水蒸気中で加熱することによって菌を殺菌する高圧蒸気法や加熱水蒸気を直接流通させることによって菌を殺菌する流通蒸気法等の湿熱滅菌法、放射線同位元素を含む線源からのガンマ線あるいは加速器による電子線などの放射線の照射により菌を殺菌する放射線滅菌法、紫外線を照射することで菌を殺菌する紫外線滅菌法などを好ましく用いることができる。
【0034】
図4は菌の生存曲線とD値の関係を示すグラフである。D値は菌数を1/10にするのに必要な滅菌時間である。ある菌数をある滅菌方法で滅菌すると、滅菌時間が経過するに従って菌は指数関数的に減少する。図4は、最初に存在した106 個の菌数が、6時間処理後には100 個すなわち1個になり、これをさらに6時間継続させた時に菌数は10−6個になることを示している。菌数10−6個は106 個の生化学解析用ユニットを滅菌処理すると、そのうち1個に菌が生存しているという確率的な意味を示すものである。
【0035】
弱い菌ではD値が小さいため、滅菌時間が少なくても充分な滅菌ができるが、強い菌ではD値が大きくなるため、滅菌時間を長くする必要がある。生存する菌種は生化学解析用ユニットの製造環境下によって異なるため、滅菌条件は適宜決定することが好ましいが、例えば、乾熱滅菌法では100℃以上かつメンブレンの融点以下の温度で10分以上加熱、湿熱滅菌法では110℃以上130℃未満で5分以上加熱、放射線滅菌法では吸収線量が0.5kGy以上となるように放射、紫外線滅菌法では波長250〜260nmの紫外線を1mJ/cm以上で照射することが好ましい。
【0036】
滅菌の確認は、計器類によるチェック、化学的インジケータ、生化学的インジケータなどによって行うことができる。化学的インジケータは、一般には紙に塗りつけた化学薬品またはガラス管に密封された物質が、滅菌に必要な物理的条件の変化に対応して変質、変性、変色することを応用したものであって、一般に市販されているものを用いることができる。化学的インジケータは、その変色等が明瞭であって滅菌処理の前後で判別が容易であり、希望する滅菌条件になったときに初めて完全に変色等し、使用するまでの保管中に変色したり性能が変化しない等の条件を満たしているものが好ましい。生物学的インジケータは菌を接種した濾紙を包装したものであり、特定の滅菌処理で効果的に滅菌されたか否かを培養によって確認するものである。生物学的インジケータは滅菌装置に積み込んだ生化学解析用ユニットのうち、滅菌が最も難しいと予想される箇所において、指定された条件により滅菌処理を行い、確認することが好ましい。
【0037】
以上のようにして生化学解析用ユニットを滅菌することができるが、上記のように作製後の生化学解析用ユニットを滅菌するのではなく、生化学解析用ユニットを構成する材料を全て滅菌し、滅菌が保たれた状態で生化学解析用ユニットを製造する方法によって作製してもよい。
【0038】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【0039】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、cDNA、DNA、RNAなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、滅菌された生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【0040】
次に、ハイブリダイゼーションバッグ内に生化学解析用ユニットを入れ、ここに標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、DNA、mRNAなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。
【0041】
生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグに洗浄液を対流あるいは拡散によって移動させて、吸着性領域を洗浄する。これによって多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、剥離させ、除去することができる。
【0042】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、剥離させ、除去することが可能になる。
【0043】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。ブロッキングによって、酵素標識抗体が標識レセプタまたは標識リガンドの抗原とではなく、吸着性領域に直接結合することを防止することができる。
【0044】
洗浄後、洗浄液を廃棄し、酵素標識抗体を含む反応溶液をハイブリダイゼーションバッグに入れて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体(標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原)を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【0045】
続いて、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【0046】
化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【0047】
【実施例】
(実施例1)
大きさが90mm×90mm、厚み100μmのSUS304シート(基板材料シート)に、孔径0.3mmの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ0.4mm、孔間隔0.1mmで、計400個形成した。
【0048】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、ポアサイズ0.45μm、厚み170μmのナイロン6,6メンブレンを重ね、150℃に加熱しながら、圧力が1cm2 当たり300kgとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にナイロン6,6メンブレンを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。次いで、この生化学解析用ユニットを波長253.7nmの紫外線を1mJ/cm以上照射し紫外線滅菌を行った。
【0049】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、0.2μmの組織培養フィルターユニット(ナルジェヌンクインターナショナル社製)にて濾過したブロッキングバッファをバッグ内に供給して1時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識DIG抗体をあらかじめ、孔径0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過し、濃度が1/10000となるように、孔径0.2μmの組織培養フィルターユニット(ナルジェヌンクインターナショナル社製)にて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して1時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【0050】
続いて、ケミルミ洗浄液(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)を供給し、15分間振盪して洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)で5分間浸漬の後、化学発光基質であるCDP−star(CDP−star,read to use)を含む溶液と1時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却CCDカメラ(LAS1000:富士写真フィルム社製)によって光電的に検出した。
【0051】
(比較例1)
滅菌を行わない生化学解析用ユニットを用いた以外は、実施例1と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【0052】
実施例1と比較例1のバックグラウンドの発光量の比を表1に示す。
【表1】
【0053】
(実施例2)
実施例1で作製した生化学解析用ユニットを、オートクレーブで30分115℃の条件で滅菌処理を行った。
【0054】
TEバッファに溶解した分子量マーカーpBR328/BgII,HinfI(250nl/μg:ロッシュ社製)を5分煮沸後、1分間氷冷しpBR328/BgII,HinfIを1本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射(254nm、33mJ/cm2 )して、吸着性領域に1本鎖のpBR328/BgII,HinfIを固定した。
【0055】
次にジゴキシゲニン(DIG)で標識されたpBR328−DNA溶液(ロッシュ社製)10pgを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ(6×SSC,0.01MEDTA,5×denhardt’s solution,0.5%SDS,100μgSheard,denatured salmon sperm DNA)5mlに添加した。
【0056】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、バッグ内に65℃のプレハイブリダイゼーションバッファ(上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの)5mlを供給し1時間振盪させた。次に、DIG標識pBR328−DNA溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを65℃の条件下18時間振盪させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて洗浄バッファ1(2×SSC,0.1%SDS)で5分間振盪させて洗浄し、洗浄バッファ2(0.1×SSC,0.1%SDS)で5分間振盪させて洗浄した(バッファ温度はいずれも65℃)。
【0057】
洗浄液を廃棄し、0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過したブロッキングバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)をバッグ内に供給して1時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識DIG抗体をあらかじめ、孔径0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過し、濃度が1/10000となるように、同じく孔径0.22μmのウルトラフリーにて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して1時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【0058】
続いて、ケミルミ洗浄液(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)を供給し、15分間振盪して洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)で5分間浸漬の後、化学発光基質であるCDP−star(CDP−star,read to use)を含む溶液と1時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却CCDカメラ(LAS1000:富士写真フィルム社製)によって光電的に検出した。
【0059】
(比較例2)
滅菌処理していない生化学解析用ユニットを使用した以外は、実施例2と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【0060】
【表2】
【0061】
実施例1および比較例1は、生化学解析用ユニットにDNAをスポットすることなく、化学発光法によりバックグラウンドのみを検出したものである。表1から明らかなように、紫外線照射により滅菌した実施例1の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例1の生化学解析用ユニットに比べて、バックグラウンドの発光を半分近くまで抑えることができた。滅菌した生化学解析用ユニット上では化学発光基質に作用して化学発光を生じさせる菌が存在していないため、バックグラウンドの発光量が低減されたものと考えられる。
【0062】
実施例2および比較例2は、吸着性領域に1本鎖のpBR328/BgII,HinfIが固定された生化学解析用ユニットで、DIG標識pBR328−DNAを検出したものである。表2から明らかなように、湿熱滅菌法で滅菌した実施例2の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例2の生化学解析用ユニットに比べてバックグラウンドの発光量は低減しており、逆に、シグナルの発光量は高く検出された。滅菌した生化学解析用ユニットでバックグラウンドの発光量が低減されたのは上記と同様の理由によるものと考えられる。一方で、滅菌した生化学解析用ユニットでシグナルの発光量が高くなったのは、予期しえない効果であったが、これによって標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもS/N比の大きい検出を行うことができる。
【0063】
なお、上記実施の形態及び実施例では、生化学解析用ユニットと反応溶液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドあるいは酵素標識抗体を対流あるいは拡散によって移動させて特異的に結合させる、いわゆる振盪方式によって行う場合を例にとって説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に生化学解析用ユニットを取り付けて行ってもよい。
【0064】
また、本発明の生化学解析用ユニットは、酵素標識抗体の酵素が化学発光基質と接触することによって化学発光基質が分解あるいは反応する等して発光する化学発光法のみではなく、標識物質に色素基質(酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には4−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−D−ガラクトシドなど)あるいは蛍光基質(酵素がアルカリホスファターゼの場合4−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には3(4−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、4−メチルウンベリフェニルβ−D−ガラクトシドなど)を接触させて、色素基質や蛍光基質が分解あるいは反応する等して発色あるいは蛍光を放出し、これを検出する生化学解析にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図2】本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図
【図3】本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図
【図4】菌の生存曲線とD値の関係を示すグラフ
【符号の説明】
1 生化学解析用ユニット
2 基板
3 孔
4 吸着性領域
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを検出するための生化学解析用ユニットおよびその製造方法、並びに生化学解析用ユニットを利用して標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法、さらには生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、cDNA、DNA、RNAなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて吸着性領域に滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、DNA、mRNAなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプタまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【0003】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の吸着性領域の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【0004】
標識されたレセプタまたはリガンドを解析する別の方法として、化学発光法を用いた検出方法が知られている。これは、担体表面上の異なる位置にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原などで標識されたレセプタまたはリガンド(以下、標識レセプタまたは標識リガンドという)をハイブリダイゼーションなどによって、担体表面上に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体を、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識し(以下、酵素標識抗体という)、この酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する方法である。
【0005】
【特許文献1】
特許第2837276号公報
【0006】
【非特許文献1】
「nature genetics」Vol.21, p.25−p.32(1999)
【0007】
【非特許文献2】
「バイオインダストリー」Vol.18, p.13−p.19(2001)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
上述の化学発光法においても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上が要求されている。しかし、化学発光法ではバックグラウンドが高いために、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量(ノイズあるいはバックグラウンド)に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量(信号)の比(S/N比)が小さく、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【0009】
化学発光法は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質と特異的に結合した酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出して解析を行うが、化学発光基質が酵素と反応する際に、酵素以外の何らかの作用によって発光する場合には、バックグラウンドが高くなる。
【0010】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、バックグラウンドを低減させることが可能な生化学解析用ユニットおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。また、この生化学解析用ユニットを利用した化学発光法、さらに生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置も提供することを目的とするものである。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットであって、該生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とするものである。
【0012】
本発明の生化学解析用ユニットの製造方法は、複数の孔を有する基板の前記孔内に、それぞれ吸着性材料を充填することによって吸着性領域を形成し、前記孔内に吸着性領域が形成された生化学解析用ユニットを滅菌することを特徴とする方法である。
【0013】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる化学発光法において、前記生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とする方法である。
ここで、生化学解析用ユニットの滅菌はリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して行われる。
【0014】
本発明の生化学解析装置は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットが取付部によって着脱可能に取り付けられ、前記リガンドまたはレセプタと標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドとを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させる流動手段とからなる生化学解析装置であって、前記生化学解析用ユニットが滅菌されているものであることを特徴とするものである。
【0015】
ここで、滅菌された生化学解析用ユニットはリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して滅菌が行われたものである。
【0016】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットが滅菌されたものであるため、これを化学発光法に用いた場合に化学発光基質が酵素以外の何らかの作用によって発光することが抑制され、バックグラウンドを低減させることが可能となる。また、バックグラウンドを低減させることができるため、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量(ノイズあるいはバックグラウンド)に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量(信号)の比(S/N比)を大きく検出することが可能となるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出可能となり、検出限界を向上させることができる。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図1は本発明の生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図1に示す生化学解析用ユニット1は、孔3が複数設けられた基板2と、孔3の内部に充填され、多孔性材料が基板2と接着された吸着性領域4とからなる。
【0018】
基板2の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、放射線または光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、放射線または光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【0019】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−6やナイロン−6,6などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【0020】
放射線または光を減衰させるために、プラスチックに金属酸化物粒子やガラス繊維などを充填することが好ましく、金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素、アルミナ、二酸化チタン、酸化鉄、酸化銅などがあげられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【0021】
ここで、放射線または光を減衰させるとは、前記基板2の孔3に充填された多孔質材料表面または内部のリガンドまたはレセプタと結合した標識レセプタまたは標識リガンドから発する放射線または光が、基板の孔から基板壁を透過して、隣接する孔に到達する強度が好ましくは1/5以下、さらに好ましくは1/10以下になることを意味する。
【0022】
放射性標識した試料からの電子線などの放射線を効果的に遮蔽するためには、基板2の平均密度は、一般には0.6g/cm3以上であり、好ましくは1〜20g/cm3の範囲にあり、さらには2〜10g/cm3の範囲であることが好ましい。電子線の透過距離は密度に反比例するので、放射性物質が、32P、33P、35S、14Cなどのような一般的な放射性同位元素(RI)であれば、基板2の平均密度をこの範囲とすることにより、各孔3内に固定されることになる試料のRIからの電子線を基板2の隔壁で遮蔽して、電子線の透過、散乱による放射線画像の分解能の低下を防ぐことができる。
【0023】
基板2の厚みは、一般には50〜1000μmの範囲であることが好ましく、100〜500μmの範囲であることがより好ましい。
【0024】
基板2に開ける孔3の開口部の面積(サイズ)は、孔3の密度を高めるために、一般には5mm2 未満であり、好ましくは1mm2 未満であり、0.3mm2 未満がより好ましく、さらには0.01mm2 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは0.001mm2 以上であることが好ましい。
【0025】
孔3のピッチ(隣接する二つの孔の中心から中心までの距離)は0.05〜3mmの範囲であることが好ましく、孔3の間隔(隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離)は、0.0l〜1.5mmの範囲であることが好ましい。孔3の数(密度)は、一般には10個/cm2 以上であり、好ましくは100個/cm2 以上、より好ましくは500個/cm2 以上、さらには1000個/cm2 以上であることが好ましい。そして、好ましくは100000個/cm2 以下、さらには10000個/cm2 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔3は全て図1に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック(単位)に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【0026】
基板2に複数の孔3を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に1枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを2つのロール間に連続搬送してもよい。
【0027】
図2は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図である。図2に示す生化学解析用ユニットは、多孔性膜21と基板2とを重ね合わせてプレスし、基板2の孔3に多孔性膜21を圧入する方法により作製されるものである。図2(a)に示すように、孔3が形成された基板2と多孔性膜21を重ねて、プレスロール22とバックアップロール23の間に送り込みプレスすることにより、図2(b)に示すように基板2の孔3に多孔性膜1を圧入する。この場合、プレスロール22とバックアップロール23を加熱する方法などにより、多孔性膜21を軟化させてもよい。
【0028】
本発明の生化学解析用ユニットは、基板の孔に多孔質材料を含有している溶液(以下、ドープという)を注入することによっても作製することができる。図3は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図である。連続的、もしくは間欠的に搬送されている基板2の上方に、ドープ31を基板2の孔3に注入するディスペンサ30が配置されており、このディスペンサ30は各孔3へ間欠的にドープ31を注入する。ドープ31が注入された後、基板に温度と湿度が制御された風を一定風速で供給し、徐々に溶剤を揮発させることによって多孔を形成することができる。なお、多孔性膜は、ドープを支持体上に流延または塗布後、多孔性膜のポリマーの貧溶媒、もしくは良溶媒と貧溶媒の混合液に浸漬した後、水洗乾燥するか、またはドープを支持体上に流延または塗布後、徐々に乾燥することにより別途作製してもよい。
【0029】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機/無機複合体であってもよい。
【0030】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体(例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど)、脂肪族ポリアミド類(例えば、ナイロン6、ナイロン6,6、ナイロン4,10など)、ポリオレフィン類(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど)、含塩素ポリマー類(例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど)、フッ素樹脂類(例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど)、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体(例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸/ポリリシンポリイオンコンプレックスなど)、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体(混合体)も用いることができる。
【0031】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【0032】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属(例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど)、金属等の酸化物(例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど)、金属塩(例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど)及びこれらの複合体などがあげられる。
【0033】
生化学解析用ユニットの滅菌には、ガスまたは電気によって直接加熱するか、加熱した空気を循環させて乾燥高温状態を保つ方式によって、乾燥空気中で加熱することによって菌を殺菌する乾熱滅菌法、適当な温度と圧力の飽和水蒸気中で加熱することによって菌を殺菌する高圧蒸気法や加熱水蒸気を直接流通させることによって菌を殺菌する流通蒸気法等の湿熱滅菌法、放射線同位元素を含む線源からのガンマ線あるいは加速器による電子線などの放射線の照射により菌を殺菌する放射線滅菌法、紫外線を照射することで菌を殺菌する紫外線滅菌法などを好ましく用いることができる。
【0034】
図4は菌の生存曲線とD値の関係を示すグラフである。D値は菌数を1/10にするのに必要な滅菌時間である。ある菌数をある滅菌方法で滅菌すると、滅菌時間が経過するに従って菌は指数関数的に減少する。図4は、最初に存在した106 個の菌数が、6時間処理後には100 個すなわち1個になり、これをさらに6時間継続させた時に菌数は10−6個になることを示している。菌数10−6個は106 個の生化学解析用ユニットを滅菌処理すると、そのうち1個に菌が生存しているという確率的な意味を示すものである。
【0035】
弱い菌ではD値が小さいため、滅菌時間が少なくても充分な滅菌ができるが、強い菌ではD値が大きくなるため、滅菌時間を長くする必要がある。生存する菌種は生化学解析用ユニットの製造環境下によって異なるため、滅菌条件は適宜決定することが好ましいが、例えば、乾熱滅菌法では100℃以上かつメンブレンの融点以下の温度で10分以上加熱、湿熱滅菌法では110℃以上130℃未満で5分以上加熱、放射線滅菌法では吸収線量が0.5kGy以上となるように放射、紫外線滅菌法では波長250〜260nmの紫外線を1mJ/cm以上で照射することが好ましい。
【0036】
滅菌の確認は、計器類によるチェック、化学的インジケータ、生化学的インジケータなどによって行うことができる。化学的インジケータは、一般には紙に塗りつけた化学薬品またはガラス管に密封された物質が、滅菌に必要な物理的条件の変化に対応して変質、変性、変色することを応用したものであって、一般に市販されているものを用いることができる。化学的インジケータは、その変色等が明瞭であって滅菌処理の前後で判別が容易であり、希望する滅菌条件になったときに初めて完全に変色等し、使用するまでの保管中に変色したり性能が変化しない等の条件を満たしているものが好ましい。生物学的インジケータは菌を接種した濾紙を包装したものであり、特定の滅菌処理で効果的に滅菌されたか否かを培養によって確認するものである。生物学的インジケータは滅菌装置に積み込んだ生化学解析用ユニットのうち、滅菌が最も難しいと予想される箇所において、指定された条件により滅菌処理を行い、確認することが好ましい。
【0037】
以上のようにして生化学解析用ユニットを滅菌することができるが、上記のように作製後の生化学解析用ユニットを滅菌するのではなく、生化学解析用ユニットを構成する材料を全て滅菌し、滅菌が保たれた状態で生化学解析用ユニットを製造する方法によって作製してもよい。
【0038】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【0039】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、cDNA、DNA、RNAなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、滅菌された生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【0040】
次に、ハイブリダイゼーションバッグ内に生化学解析用ユニットを入れ、ここに標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、DNA、mRNAなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。
【0041】
生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグに洗浄液を対流あるいは拡散によって移動させて、吸着性領域を洗浄する。これによって多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、剥離させ、除去することができる。
【0042】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、剥離させ、除去することが可能になる。
【0043】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。ブロッキングによって、酵素標識抗体が標識レセプタまたは標識リガンドの抗原とではなく、吸着性領域に直接結合することを防止することができる。
【0044】
洗浄後、洗浄液を廃棄し、酵素標識抗体を含む反応溶液をハイブリダイゼーションバッグに入れて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体(標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原)を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【0045】
続いて、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【0046】
化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【0047】
【実施例】
(実施例1)
大きさが90mm×90mm、厚み100μmのSUS304シート(基板材料シート)に、孔径0.3mmの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ0.4mm、孔間隔0.1mmで、計400個形成した。
【0048】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、ポアサイズ0.45μm、厚み170μmのナイロン6,6メンブレンを重ね、150℃に加熱しながら、圧力が1cm2 当たり300kgとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にナイロン6,6メンブレンを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。次いで、この生化学解析用ユニットを波長253.7nmの紫外線を1mJ/cm以上照射し紫外線滅菌を行った。
【0049】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、0.2μmの組織培養フィルターユニット(ナルジェヌンクインターナショナル社製)にて濾過したブロッキングバッファをバッグ内に供給して1時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識DIG抗体をあらかじめ、孔径0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過し、濃度が1/10000となるように、孔径0.2μmの組織培養フィルターユニット(ナルジェヌンクインターナショナル社製)にて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して1時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【0050】
続いて、ケミルミ洗浄液(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)を供給し、15分間振盪して洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)で5分間浸漬の後、化学発光基質であるCDP−star(CDP−star,read to use)を含む溶液と1時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却CCDカメラ(LAS1000:富士写真フィルム社製)によって光電的に検出した。
【0051】
(比較例1)
滅菌を行わない生化学解析用ユニットを用いた以外は、実施例1と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【0052】
実施例1と比較例1のバックグラウンドの発光量の比を表1に示す。
【表1】
【0053】
(実施例2)
実施例1で作製した生化学解析用ユニットを、オートクレーブで30分115℃の条件で滅菌処理を行った。
【0054】
TEバッファに溶解した分子量マーカーpBR328/BgII,HinfI(250nl/μg:ロッシュ社製)を5分煮沸後、1分間氷冷しpBR328/BgII,HinfIを1本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射(254nm、33mJ/cm2 )して、吸着性領域に1本鎖のpBR328/BgII,HinfIを固定した。
【0055】
次にジゴキシゲニン(DIG)で標識されたpBR328−DNA溶液(ロッシュ社製)10pgを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ(6×SSC,0.01MEDTA,5×denhardt’s solution,0.5%SDS,100μgSheard,denatured salmon sperm DNA)5mlに添加した。
【0056】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、バッグ内に65℃のプレハイブリダイゼーションバッファ(上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの)5mlを供給し1時間振盪させた。次に、DIG標識pBR328−DNA溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを65℃の条件下18時間振盪させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて洗浄バッファ1(2×SSC,0.1%SDS)で5分間振盪させて洗浄し、洗浄バッファ2(0.1×SSC,0.1%SDS)で5分間振盪させて洗浄した(バッファ温度はいずれも65℃)。
【0057】
洗浄液を廃棄し、0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過したブロッキングバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)をバッグ内に供給して1時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識DIG抗体をあらかじめ、孔径0.22μmのウルトラフリー(ミリポア社製)にて濾過し、濃度が1/10000となるように、同じく孔径0.22μmのウルトラフリーにて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して1時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【0058】
続いて、ケミルミ洗浄液(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)を供給し、15分間振盪して洗浄し、これを3回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ(ロッシュ社製DIG、Wash and Block buffer Set に記載のもの)で5分間浸漬の後、化学発光基質であるCDP−star(CDP−star,read to use)を含む溶液と1時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却CCDカメラ(LAS1000:富士写真フィルム社製)によって光電的に検出した。
【0059】
(比較例2)
滅菌処理していない生化学解析用ユニットを使用した以外は、実施例2と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【0060】
【表2】
【0061】
実施例1および比較例1は、生化学解析用ユニットにDNAをスポットすることなく、化学発光法によりバックグラウンドのみを検出したものである。表1から明らかなように、紫外線照射により滅菌した実施例1の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例1の生化学解析用ユニットに比べて、バックグラウンドの発光を半分近くまで抑えることができた。滅菌した生化学解析用ユニット上では化学発光基質に作用して化学発光を生じさせる菌が存在していないため、バックグラウンドの発光量が低減されたものと考えられる。
【0062】
実施例2および比較例2は、吸着性領域に1本鎖のpBR328/BgII,HinfIが固定された生化学解析用ユニットで、DIG標識pBR328−DNAを検出したものである。表2から明らかなように、湿熱滅菌法で滅菌した実施例2の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例2の生化学解析用ユニットに比べてバックグラウンドの発光量は低減しており、逆に、シグナルの発光量は高く検出された。滅菌した生化学解析用ユニットでバックグラウンドの発光量が低減されたのは上記と同様の理由によるものと考えられる。一方で、滅菌した生化学解析用ユニットでシグナルの発光量が高くなったのは、予期しえない効果であったが、これによって標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもS/N比の大きい検出を行うことができる。
【0063】
なお、上記実施の形態及び実施例では、生化学解析用ユニットと反応溶液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドあるいは酵素標識抗体を対流あるいは拡散によって移動させて特異的に結合させる、いわゆる振盪方式によって行う場合を例にとって説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に生化学解析用ユニットを取り付けて行ってもよい。
【0064】
また、本発明の生化学解析用ユニットは、酵素標識抗体の酵素が化学発光基質と接触することによって化学発光基質が分解あるいは反応する等して発光する化学発光法のみではなく、標識物質に色素基質(酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には4−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−D−ガラクトシドなど)あるいは蛍光基質(酵素がアルカリホスファターゼの場合4−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には3(4−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、4−メチルウンベリフェニルβ−D−ガラクトシドなど)を接触させて、色素基質や蛍光基質が分解あるいは反応する等して発色あるいは蛍光を放出し、これを検出する生化学解析にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図2】本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図
【図3】本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図
【図4】菌の生存曲線とD値の関係を示すグラフ
【符号の説明】
1 生化学解析用ユニット
2 基板
3 孔
4 吸着性領域
Claims (4)
- 複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットであって、該生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とする生化学解析用ユニット。
- 複数の孔を有する基板の前記孔内に、それぞれ吸着性材料を充填することによって吸着性領域を形成し、前記孔内に吸着性領域が形成された生化学解析用ユニットを滅菌することを特徴とする生化学解析用ユニットの製造方法。
- リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる化学発光法において、
前記生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。 - リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットが取付部によって着脱可能に取り付けられ、前記リガンドまたはレセプタと標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドとを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させる流動手段とからなる生化学解析装置であって、
前記生化学解析用ユニットが滅菌されているものであることを特徴とする生化学解析装置。
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JP2011179955A (ja) * | 2010-03-01 | 2011-09-15 | Hitachi Chem Co Ltd | 検出装置及び検出方法 |
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2002
- 2002-09-27 JP JP2002282297A patent/JP2004117233A/ja not_active Withdrawn
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