JP2004097111A - Variant polynucleotide and nucleic acid molecule usable for gene diagnosis of sensitivity to medicament by using inhibition of thymidylic acid synthetic enzyme as mechanism of action - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a nucleic acid probe and a primer usable for judgment of sensitivity to a medicament by using the inhibition of a thymidylic acid synthetic enzyme as a mechanism of action. <P>SOLUTION: The nucleic acid molecule can detect the mutation in which a codon encoding an arginine residue at the 115th position of the thymidylic acid synthetic enzyme is converted to a nonsense codon in a gene of the thymidylic acid synthetic enzyme. The nucleic acid molecule contains a polynucleotide having the mutation in which the codon encoding the arginine residue at the 115th position is converted to the nonsense codon in the polynucleotide encoding the protein containing a specific amino acid sequence, or a nucleotide fragment hybridizing with the polynucleotide complementary to the polynucleotide. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
薬物が患者の示す疾患、症状等に応じて投与される場合、個々の患者の薬物に対する反応性には差違が生ずる。しかし、従来、そのような個々人の薬物感受性に応じて薬物を投与することは困難であった。
【０００３】
近年においては、遺伝子解析技術の進歩に伴い、薬物に対する患者の反応性と患者の遺伝子型との関連性が次第に明らかになってきている。
【０００４】
例えば、５−フルオロウラシル（以下「５−ＦＵ」という）は、癌細胞でのＤＮＡ合成阻害を目的とした抗癌剤であり、１９５０年代にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒらによって合成されて以来（非特許文献１：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１７９：６６３−６６６　（１９５７））、癌化学療法に最も寄与する薬物の一つとされている。
【０００５】
５−ＦＵの標的酵素であるチミジル酸合成酵素は、テトラヒドロ葉酸由来のメチル基をデオキシウリジル酸（ｄＵＭＰ）に転移することによりチミジル酸（ＴＭＰ）を合成し、ＤＮＡ合成におけるＴＭＰの新規合成経路において重要な役割を果たしている。
【０００６】
５−ＦＵは、静脈内投与または経口投与されると、その化学構造を保持したまま腫瘍に到達する。５−ＦＵは、ウラシルの誘導体であるため、そこで癌細胞に取り込まれる。その後、５−ＦＵはリン酸化を受けてフルオロデオキシＵＭＰ（以下「ＦｄＵＭＰ」という）となり、ＤＮＡ合成において重要な酵素であるチミジル酸合成酵素の作用に関してその生体内基質であるｄＵＭＰと拮抗することにより、当該酵素を阻害して癌細胞に対する殺細胞効果を発現する。
【０００７】
チミジル酸合成酵素はチミジル酸合成酵素遺伝子（以下「ＴＹＭＳ遺伝子」という）によりコードされている。ＴＹＭＳ遺伝子はＬｅｄｂｅｔｔｅｒらにより１８番染色体に位置することが明らかとされており（非特許文献２：Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ　Ｄ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　３６：２０３Ｓ　（１９８４））、そのｃＤＮＡはＨｏｒｉらにより単離されている（非特許文献３：Ｈｏｒｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｏｍａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌｅｃ．　Ｇｅｎｅｔ．　１１：２７７−２８３　（１９８５））。そしてその後の研究から、本遺伝子は染色体１８ｐ１１．３２に位置し（非特許文献４：Ｈｏｒｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　８５：５７６−５８０　（１９９０））、７個のエクソンから構成されていることが明らかになっている（非特許文献５：Ｋａｎｅｄａ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５：２０２７７−２０２８４　（１９９０））。
【０００８】
ＴＹＭＳ遺伝子については、ＴＹＭＳ遺伝子のプロモーター領域のタンデムリピート数によりその酵素活性が変化することがよく知られている。例えば、ＴＹＭＳ遺伝子のプロモーター領域のタンデムリピートが３リピートの場合に比べて、２リピートの場合の方が酵素の発現量が低いと報告されている（非特許文献６：Ｈｏｒｉｅ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｆｕｎｃｔ．　２０：１９１−７　（１９９５）；　非特許文献７：Ｌａｃｏｐｅｔｔａ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８５：８２７−８３０　（２００１）；　非特許文献８：Ｋａｗａｋａｍｉ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　７：４０９６−４１０１　（２００１）；　非特許文献９：Ｐｕｌｌａｒｋａｔ　Ｓ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｊ．　１：６５−７０　（２００１））。また、前記タンデムリピートが３リピートである遺伝子を２つ持たないヒトの方が、５−ＦＵによる延命効果が高いと報告されている（非特許文献１０：Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　１９：１７７９−１７８６（２００１））。
【０００９】
さらに、本酵素を標的とした抗癌剤に抵抗性を示す大腸がん由来の細胞株では、３３番目のチロシンのヒスチジンへの変異が見られ、この細胞株はＦｄＵＭＰの前駆体である５−ＦｄＵｒｄに対して約３〜４倍の抵抗性を示すことが報告されている（非特許文献１１：Ｂａｒｂｏｕｒ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　３７：５１５−５１８（１９９０）；　非特許文献１２：Ｂａｒｂｏｕｒ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　４２：２４２−２４８　（１９９２）；　非特許文献１３：Ｈｕｇｈｅｙ　Ｃ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　４４：３１６−３２３　（１９９３））。このことから、３３番目のチロシンのヒスチジンへの変異は、チミジル酸合成酵素のＦｄＵＭＰによる阻害作用に影響を及ぼすものと考えられる。
【００１０】
しかしながら、このような活性に影響を与えるＴＹＭＳ遺伝子の多型性、特に日本人における多型性についてはほとんど知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１７９：６６３−６６６　（１９５７）
【非特許文献２】
Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ　Ｄ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　３６：２０３Ｓ　（１９８４）
【非特許文献３】
Ｈｏｒｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｏｍａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌｅｃ．　Ｇｅｎｅｔ．　１１：２７７−２８３　（１９８５）
【非特許文献４】
Ｈｏｒｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　８５：５７６−５８０　（１９９０）
【非特許文献５】
Ｋａｎｅｄａ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５：２０２７７−２０２８４　（１９９０）
【非特許文献６】
Ｈｏｒｉｅ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｆｕｎｃｔ．　２０：１９１−７　（１９９５）
【非特許文献７】
Ｌａｃｏｐｅｔｔａ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８５：８２７−８３０　（２００１）
【非特許文献８】
Ｋａｗａｋａｍｉ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　７：４０９６−４１０１　（２００１）
【非特許文献９】
Ｐｕｌｌａｒｋａｔ　Ｓ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｊ．　１：６５−７０　（２００１）
【非特許文献１０】
Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　１９：１７７９−１７８６（２００１）
【非特許文献１１】
Ｂａｒｂｏｕｒ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　３７：５１５−５１８　（１９９０）
【非特許文献１２】
Ｂａｒｂｏｕｒ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　４２：２４２−２４８　（１９９２）
【非特許文献１３】
Ｈｕｇｈｅｙ　Ｃ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　４４：３１６−３２３　（１９９３）
【００１２】
【発明の概要】
本発明者らは、ＴＹＭＳ遺伝子において、チミジル酸合成酵素タンパク質の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが翻訳終止コドンとなり、チミジル酸合成酵素の機能が欠損すると考えられる遺伝子多型を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１３】
上記の多型部位において終止コドンへの変異を有するヒトにおいては、チミジル酸合成酵素の発現量が減少するため、該酵素の阻害を作用機序とする薬物の効果が発揮されやすい。
【００１４】
従って、本発明は、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子の提供を目的とする。
【００１５】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチドである。
【００１６】
さらに、本発明による核酸分子は、ＴＹＭＳ遺伝子における、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１７】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、ＴＹＭＳ遺伝子における、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異（本発明において「Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異」という）を検出することができる。
【００１８】
チミジル酸合成酵素の発現レベルは、ＴＹＭＳ遺伝子のプロモーター領域のタンデムリピートが３リピートの場合よりも２リピートの場合の方が低いと報告されている（前述、Ｈｏｒｉｅ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．）。また、前記タンデムリピートが３リピートである遺伝子を２つ持たないヒトの方が、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物による延命効果が高いと報告されている（前述、Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．）。これらのことから、チミジル酸合成酵素の阻害を目的として体内に投与される薬物は、体内におけるチミジル酸合成酵素の発現量が低い場合に、より高い効果を奏すると考えられる。
【００１９】
本発明により検出されるＴＹＭＳ遺伝子中の変異は、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなるものである。このような変異としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３４３番目（配列番号１中では第４４８番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が挙げられる。チミジル酸合成酵素は３１３個のアミノ酸残基を含んでなるため、第１１５番目のアルギニン残基以降のアミノ酸が欠失すると、約６５％のアミノ酸が失われることになる。このため、上記のＴＹＭＳ遺伝子中の変異により、チミジル酸合成酵素の機能は失われる。従って、上記の変異を検出することにより、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の判定が可能となる。特に、このような薬物の投与前に、ＴＹＭＳ遺伝子上のＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出することにより、薬物が奏効しやすいヒトを見出すとともに、そのようなヒトに対する薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能となる。
【００２０】
本発明において感受性判定の対象とする薬物は、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物であればよいが、好ましくは、癌細胞に対して殺細胞効果を発現する薬物、例えば５−ＦＵ、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ＴＳ−１またはこれらの誘導体であり、より好ましくは５−ＦＵまたはその誘導体である。
【００２１】
変異型ポリヌクレオチド
Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異を検出するためには、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００２２】
Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、ヒトＴＹＭＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドとされる。ヒトＴＹＭＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を発現しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡを生体内において生産しうるヌクレオチド配列とされ、例えば、ＮＣＢＩデータベースに登録番号Ｄ０００５９６として登録されているゲノム配列中のＴＹＭＳ遺伝子配列が挙げられる。Ｄ０００５９６のゲノム配列中におけるＴＹＭＳ遺伝子には７個のエクソンが含まれる。ＴＹＭＳ遺伝子の両末端部位は当業者にとって明らかであるが、好ましくはＴＹＭＳ遺伝子のエクソン１の５’末端からエクソン７の３’末端までとする。
【００２３】
また、Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列（特に、第１０６〜１０４７ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列）において、配列番号１に示される第４４８番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２４】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００２５】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、チミジル酸合成酵素の活性を軽減する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２６】
核酸分子およびこれを用いた薬物感受性予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２７】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。また、あるヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、そのヌクレオチド分子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、そのヌクレオチド分子に相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２８】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２９】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００３０】
本発明による核酸分子は、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００３１】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００３２】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００３３】
また、本発明による核酸分子は、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３４】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチドとする。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３６】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３７】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異の有無を検出することができ、これにより、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性を判定することができる。
【００３８】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性判定方法が提供される。
【００３９】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被験者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００４０】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００４１】
また、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【００４２】
さらに、上述のような核酸増幅法によって得られた増幅断片につき、その増幅断片中に何らかの変異が存在するか否かを簡便な方法により調べ、変異を有すると判断されたサンプルについてのみ、Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異の検出を行なうこともできる。
【００４３】
上記の簡便法としては、例えば、一本鎖高次構造多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を利用した方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１１．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　１９９２　Ｊａｎ　１；　１２（１）：　１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　１９９１　Ａｕｇ　１；　６（８）：　１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．　１９９５　Ａｐｒ　１；　４（５）：　２７５−２８２）が挙げられる。この方法では、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで、この一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。この方法において増幅するＤＮＡ断片の鎖長は２００〜４００ｂｐとすることが好ましい。
【００４４】
上記の簡便法としては、また、変性剤濃度勾配ゲル法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）を用いることもできる。この方法では、増幅したＤＮＡをＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。このような方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば適切に実施することができる。
【００４５】
本発明による薬物感受性判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００４６】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性判定方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４７】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被検者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００４８】
本発明による核酸分子をハイブリダイゼーション法による変異の検出においてプローブとして用いる場合、本発明による核酸分子を基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験者由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子を基板上に固定してなる、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いてＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性を判定する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２５ヌクレオチドとする。このようなＤＮＡチップを用いて変異を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、２０００年）、当業者であれば、本発明による核酸分子を用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いてＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００４９】
ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。この方法は、Ｒ１１５ＳＴＯＰ変異が一塩基多型である場合において特に好ましい。このような一塩基多型としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３４３番目（配列番号１中では第４４８番目）のシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異が挙げられる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００５１】
ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５２】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｈｍａｄｉａｎ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｖｏｌ．２８０，　ｐｐ１０３−１１０，　（２０００））においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５３】
ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異が上述のような一塩基多型である場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いてその変異を検出することもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００５４】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ　ＫＪ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．　ｖｏｌ．１４，　ｐｐ１４３−１４９，　（１９９９））においては、多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＣアレルおよびＴアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００５５】
ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異の検出に用いることのできる他の方法としては、質量分析法による方法（Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＴＪ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ　ＬＭ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　ｖｏｌ．　１８，　ｐｐ７７−８４，　（２０００））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ　Ｖ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　ｖｏｌ．　１７，　ｐｐ２９２−２９６，　（１９９９）；「遺伝子医学」ｖｏｌ．４，　Ｎｏ．１，　メディカルドゥ社発行、ｐｐ４４−５１およびｐｐ６８−７２　（２０００））が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の変異を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。
【００５６】
本発明による薬物感受性判定法において、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異が存在すると評価されたサンプルは、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性が高いものと、すなわち、該薬物が奏効しやすいものと判断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５７】
以上のような薬物への感受性の判定のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＴＹＭＳ遺伝子におけるＲ１１５ＳＴＯＰ変異部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００５９】
例１：ヒトゲノムＤＮＡ中のＴＹＭＳ遺伝子のエクソンおよびその周辺配列の解析
ヒトゲノムＤＮＡを用い、ＴＹＭＳ遺伝子のエクソンおよびその周辺の塩基配列を解読した。ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてエクソン及び周辺領域を増幅する段階から、最終的に塩基配列の解読を行うまでを記述した。
【００６０】
材料および試薬
日本人由来樹立細胞株６２系
遺伝子全長増幅用プライマー（表１）
エクソン増幅用プライマー（表２）
シークエンス用プライマー（表３）
タカラ　Ｚ−ｔａｑ，　Ｅｘ−Ｔａｑ，　ＬＡ　ｔａｑ　ｗｉｔｈ　ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒ　（ＰＣＲ増幅用試薬キット）
ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（ＵＳＢ　Ｃｏ．，　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　ＯＨ）：ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ　（１０　Ｕ／ｍＬ）およびＳｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（２Ｕ／ｍＬ）が別々に含まれている。
【００６１】
ＡＢＩ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）
ＤｙｅＥｘ９６　ｐｌａｔｅ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）
装置および機器
ＰＣＲ９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）
冷却遠心機（Ｓａｋｕｍａ　Ｍ２００−ＩＶＤ）
ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
作業手順
ＴＹＭＳ遺伝子のシークエンス
ＴＹＭＳ遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩ，　登録番号　ＮＴ　０１１００５）に基づき、ＴＹＭＳ遺伝子の全長増幅用（表１）および各エクソン増幅用（表２）、シークエンス用（表３）のプライマーセットを、ＴＹＭＳ遺伝子の上流および下流、イントロン中にＴＹＭＳ遺伝子特異的となるよう設計した。
【００６２】
【表１】

【００６３】
【表２】

【００６４】
【表３】

シークエンス手順としては、まず、全長増幅用のプライマーセット（表１、各０．２　μＭ）とＺ−Ｔａｑ（１．２５　ｕｎｉｔｓ；　Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ（４００　ｎｇ）よりＴＹＭＳ遺伝子を含むＤＮＡ領域を増幅した。この際の反応液の全量は５０　μＬで、４００　μＭの　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（通常の２倍量）を加え、ＰＣＲの条件は、「９８℃で５秒、５５℃で５秒および７２℃で３分１０秒」を３０サイクル行った。
【００６５】
その反応液にＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔに含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩとＳｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを２０　μＬずつ加えて３７℃で１５分、ついで８０℃で１５分反応させ、４℃に冷却した。
【００６６】
次に各エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表２、各０．５　μＭ）を用いて、ＴＹＭＳ遺伝子の全エクソンを含むＤＮＡ断片（前記、ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔによる処理を行った反応液を０．５　μｌ用いる）より、エクソン１を除く各エクソンを含むＤＮＡ断片をＥｘ−Ｔａｑ（０．６２５　ｕｎｉｔｓ；　Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて増幅した。この際の反応液の全量は５０　μＬで、ＰＣＲの条件は、９４℃で５分処理後、「９４℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分」を３０サイクル行い、その後７２℃で７分処理した。
【００６７】
エクソン１を含むＤＮＡ断片については、反応緩衝液としてＧＣ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｉを用い、ＬＡ　ｔａｑ　（２．５　ｕｎｉｔｓ；　Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）にて増幅した。この際の反応液の全量は５０　μＬで、ＰＣＲの条件は、９４℃で１分処理後、「９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で１分３０秒」を３５サイクル行い、その後７２℃で５分処理した。
【００６８】
その後、ＰＣＲ増幅産物のうち５　μＬにＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＵＳＢ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　ＯＨ）に含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉを０．２　μＬ、Ｓｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを０．２　μＬ、精製水を１．６　μＬ加えて、３７℃で１５分、８０℃で１５分処理し、その後４℃に冷却した。
【００６９】
このような処理を行ったＰＣＲ産物を両鎖につき表３のプライマーを用いて、ＡＢＩＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　２，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）により直接塩基配列決定した。すなわち、計７μＬのＰＣＲ増幅産物に１　μＭのプライマー３．２　μＬ、ＢｉｇＤｙｅ（Ｖｅｒ．　２）を４　μＬ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを２　μＬ、精製水３．８　μＬを加えて合計２０μＬとし、「９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分」を２５サイクル行い、その後、４℃に冷却した。
【００７０】
過剰な色素をＤｙｅＥｘ９６　ｐｌａｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて除去し、溶出液２０　μＬをＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。その際、溶出液に精製水２５　μＬを加え、９４℃で２分間、ヒートショックを行った。
【００７１】
結果と考察
日本人６２人に由来するゲノムＤＮＡに関し、ＴＹＭＳ遺伝子のアミノ酸コーディングエクソンを中心に解析を行なった。その結果、１例から第３４３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換することにより終止コドンを生じ、チミジル酸合成酵素タンパク質の第１１４番目のアミノ酸までしか翻訳が起こらない多型を見出した。この一塩基置換により、チミジル酸合成酵素を構成するアミノ酸の約６５％が欠失する。このことから、この一塩基置換は、チミジル酸合成酵素の機能を消失させるものであり、当該酵素の阻害を作用機序とする薬物の効果を増強させると考えられる。さらに、この一塩基置換を有するヒトに対しては、上記のような薬物の投与量を低減させることが可能であるため、その薬物の副作用を軽減させうると考えられる。
【００７２】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Field of the invention
The present invention relates to mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of susceptibility to drugs whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase.
[0002]
Background art
When a drug is administered according to a disease, symptom, or the like exhibited by a patient, a difference occurs in the responsiveness of the individual patient to the drug. However, conventionally, it has been difficult to administer drugs according to such individual drug sensitivity.
[0003]
In recent years, with the progress of gene analysis technology, the relationship between patient responsiveness to a drug and the patient's genotype has been gradually clarified.
[0004]
For example, 5-fluorouracil (hereinafter, referred to as “5-FU”) is an anticancer agent intended to inhibit DNA synthesis in cancer cells, and has been synthesized by Heidelberger et al. In the 1950s (Non-patent Document 1: Heidelberger, C). Et al., Nature 179: 663-666} (1957)), which is one of the most contributing drugs to cancer chemotherapy.
[0005]
Thymidylate synthase, which is a target enzyme of 5-FU, synthesizes thymidylate (TMP) by transferring a methyl group derived from tetrahydrofolate to deoxyuridylic acid (dUMP), and a novel synthesis pathway of TMP in DNA synthesis. Plays an important role in
[0006]
When administered intravenously or orally, 5-FU reaches its tumor while retaining its chemical structure. Because 5-FU is a derivative of uracil, it is taken up by cancer cells there. Thereafter, 5-FU is phosphorylated to form fluorodeoxy UMP (hereinafter referred to as “FdUMP”), and by antagonizing dUMP, which is an in vivo substrate, with respect to the action of thymidylate synthase, which is an important enzyme in DNA synthesis. Inhibits the enzyme to exert a cell killing effect on cancer cells.
[0007]
Thymidylate synthase is encoded by a thymidylate synthase gene (hereinafter, referred to as “TYMS gene”). It has been clarified that the TYMS gene is located on chromosome 18 by Ledbetter et al. (Non-Patent Document 2: Ledbetter DH et al., (Abstract) Am J. Hum. Genet. 36: 203S (1984) )), And its cDNA has been isolated by Hori et al. (Non-Patent Document 3: Hori {T. et al., Somat. Cell Molec. Genet. 11: 277-283} (1985)). From subsequent studies, this gene is located on chromosome 18p11.32 (Non-Patent Document 4: Hori T. et al., Hum. Genet. 85: 576-580} (1990)) and is composed of seven exons. (Kaneda S. et al., J Biol. Chem. 265: 20277-20284) (1990).
[0008]
It is well known that the enzyme activity of the TYMS gene changes depending on the number of tandem repeats in the promoter region of the TYMS gene. For example, it has been reported that the expression level of the enzyme is lower in the case of 2 repeats than in the case of 3 repeats of the tandem repeat of the promoter region of the TYMS gene (Non-Patent Document 6: Horie N. et al., Cell Struct Funct. 20: 191-7 (1995); Non-Patent Document 7: Lacopetta B. et al., {Br.} J. Cancer 85: 827-830 (2001); {Non-patent Document 8: Kawakami K. et al. {Clin. {Cancer Res. 7: 4096-4101} (2001); {Non-Patent Document 9: Pullarkat ST et al., Pharmacogenomics J. 1: 65-70} (2001)). It has also been reported that a human without two genes whose tandem repeats are three repeats has a higher survival prolonging effect by 5-FU (Non-Patent Document 10: Villafranca E. et al., J Clin Oncol. 19: 1779-1786 (2001)).
[0009]
Furthermore, in a colon cancer-derived cell line showing resistance to an anticancer drug targeting this enzyme, a mutation of tyrosine at position 33 to histidine was observed, and this cell line was found to be 5-FdUrd, a precursor of FdUMP. It has been reported to exhibit about 3 to 4 times as much resistance (Non-Patent Document 11: Barbour KW et al., Mol Pharmacol. 37: 515-518 (1990); Non-Patent Document 12: Barbour KW et al., Mol Pharmacol. 42: 242-248 (1992); Non-Patent Document 13: Hughey CT et al., Mol Pharmacol. 44: 316-323 (1993)). From this, it is considered that the mutation of tyrosine at position 33 to histidine affects the inhibitory effect of thymidylate synthase by FdUMP.
[0010]
However, little is known about polymorphisms in the TYMS gene that affect such activities, especially in Japanese.
[0011]
[Non-patent document 1]
Heidelberger, {C. {Et} al. , {Nature} 179: 663-666} (1957).
[Non-patent document 2]
Ledbetter @ D. H. {Et} al. , {(Abstract)} Am. {J. Hum. {Genet. {36: 203S} (1984)
[Non-Patent Document 3]
Hori @ T. {Et} al. , {Somat. {Cell} Molec. {Genet. {11: 277-283} (1985)
[Non-patent document 4]
Hori @ T. {Et} al. , @Hum. {Genet. {85: 576-580} (1990)
[Non-Patent Document 5]
Kaneda @ S. {Et} al. , {J} Biol. {Chem. {265: 20277-20284} (1990)
[Non-Patent Document 6]
Horie @ N. {Et} al. , {Cell} Struct} Funct. {20: 191-7} (1995)
[Non-Patent Document 7]
Lacopetta @ B. {Et} al. , {Br. {J. {Cancer 85: 827-830} (2001)
[Non-Patent Document 8]
Kawakami @ K. {Et} al. , @Clin. {Cancer} Res. {7: 4096-4101} (2001)
[Non-Patent Document 9]
Pullarkat @ S. T. {Et} al. , {Pharmacogenomics} J. {1: 65-70} (2001)
[Non-Patent Document 10]
Villafranca @ E. {Et} al. , J Clin Oncol 19: 1779-1786 (2001).
[Non-Patent Document 11]
Barbour @ K. W. {Et} al. , {Mol} Pharmacol. {37: 515-518} (1990)
[Non-Patent Document 12]
Barbour @ K. W. {Et} al. , {Mol} Pharmacol. {42: 242-248} (1992)
[Non-patent document 13]
Hughey @ C. T. {Et} al. , {Mol} Pharmacol. {44: 316-323} (1993)
[0012]
Summary of the Invention
The present inventors have found a polymorphism in the TYMS gene in which the codon encoding the arginine residue at position 115 of the thymidylate synthase protein is a translation stop codon, and the function of thymidylate synthase is considered to be defective. . The present invention is based on this finding.
[0013]
In humans having a mutation at the polymorphic site to a stop codon, the expression level of thymidylate synthase is reduced, so that the effect of a drug whose mechanism of action is inhibition of the enzyme is likely to be exerted.
[0014]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a mutant polynucleotide and a nucleic acid molecule that can be used for genetic diagnosis of sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase.
[0015]
The mutant polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a termination codon of a codon encoding the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2. A polynucleotide having a mutation to
[0016]
Further, the nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the TYMS gene in which the codon encoding the 115th arginine residue of thymidylate synthase is a termination codon, A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to a polynucleotide or a polynucleotide complementary thereto.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
According to the present invention, a mutation in the TYMS gene in which the codon encoding the 115th arginine residue of thymidylate synthase becomes a termination codon (referred to as “R115STOP mutation” in the present invention) can be detected.
[0018]
It has been reported that the expression level of thymidylate synthase is lower when the tandem repeat of the promoter region of the TYMS gene is 2 repeats than when it is 3 repeats (the aforementioned Horie N. et al., Supra). It has also been reported that a human without two genes whose tandem repeats are three repeats has a higher life-prolonging effect by a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase (Villafranca ＶE. et @ al.). From these facts, it is considered that a drug administered to the body for the purpose of inhibiting thymidylate synthase has a higher effect when the expression level of thymidylate synthase in the body is low.
[0019]
The mutation in the TYMS gene detected according to the present invention is a mutation in which the codon encoding the 115th arginine residue of thymidylate synthase is a termination codon. Examples of such a mutation include a mutation of the 343rd cytosine residue (448th position in SEQ ID NO: 1) from the translation initiation codon to a thymine residue. Since thymidylate synthase contains 313 amino acid residues, about 65% of the amino acids will be lost if amino acids after the 115th arginine residue are deleted. Therefore, the function of thymidylate synthase is lost due to the mutation in the TYMS gene. Therefore, by detecting the above mutation, it is possible to determine the sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase. In particular, by detecting the R115STOP mutation on the TYMS gene before administration of such a drug, it is possible to find a human who is likely to respond to the drug, and to adjust the dose of the drug to such a human to reduce the occurrence of side effects. It can be suppressed.
[0020]
The drug to be subjected to sensitivity determination in the present invention may be a drug having a mechanism of action of inhibition of thymidylate synthase, and is preferably a drug that exhibits a cell-killing effect on cancer cells, for example, 5- FU, tegafur, UFT, doxyfluridine, carmofur, TS-1 or a derivative thereof, and more preferably 5-FU or a derivative thereof.
[0021]
Mutant polynucleotide
In order to detect the R115STOP mutation, in the polynucleotide encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the codon encoding the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2 is changed to a stop codon. A polynucleotide comprising the mutation can be targeted. That is, the R115STOP mutation can be detected by confirming the presence of such a mutant polynucleotide.
[0022]
When detecting the R115STOP mutation, the mutant polynucleotide in the genome can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is the arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2 in the polynucleotide comprising the genomic DNA sequence of the human TYMS gene. Is mutated to a stop codon. The genomic DNA sequence of the human TYMS gene is not particularly limited, as long as it can express a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is preferably thymine (T) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. A nucleotide sequence capable of producing in vivo a mRNA comprising a nucleotide sequence in which a residue has been substituted with a uracil (U) residue. The nucleotide sequence may be, for example, TYMS in a genomic sequence registered as accession number D000596 in the NCBI database. Gene sequences. The TYMS gene in the D000596 genomic sequence contains seven exons. Although both terminal sites of the TYMS gene will be apparent to those skilled in the art, it is preferably from the 5 'end of exon 1 to the 3' end of exon 7 of the TYMS gene.
[0023]
In addition, when detecting the R115STOP mutation, a cDNA generated against mRNA, which is a transcription product of the mutant polynucleotide in the genome, can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (particularly, the nucleotide sequence represented by nucleotides 106 to 1047). And the nucleotide sequence in which the 448th cytosine (C) residue is replaced with a thymine (T) residue.
[0024]
The mutant polynucleotide according to the present invention may be a single strand or a double strand in which a complementary strand has hybridized.
[0025]
As described above, the mutant polynucleotide according to the present invention is useful as a target for detecting the R115STOP mutation, and is also useful for screening for a compound that reduces the activity of thymidylate synthase. .
[0026]
Nucleic acid molecule and drug sensitivity prediction / detection method using the same
The nucleic acid molecule according to the present invention is capable of detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, and the nucleic acid molecule comprises a nucleotide fragment that hybridizes to the mutant polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto. .
[0027]
In the present invention, `` hybridize '' means that a nucleic acid molecule according to the present invention hybridizes to a target nucleotide molecule under ordinary hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions, and to a nucleotide molecule other than the target nucleotide molecule. Means do not hybridize. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex of the nucleic acid molecule of the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, and the like. Sambrook, E. F. Frisch, T. {Maniatis; Molecular Cloning} 2nd edition, {Cold Spring Harbor} Laboratory (1989) and the like can be referred to. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the nucleic acid molecule used, the nucleic acid molecule can specifically hybridize to the target nucleotide molecule. Also, a nucleic acid molecule that hybridizes to a nucleotide molecule does not need to be completely complementary to the nucleotide molecule as long as specific hybridization is possible, but is preferably complementary to the nucleotide molecule. Or all or part of the sequence of a unique nucleotide molecule.
[0028]
In the present invention, the term “nucleic acid molecule” is used to include DNA, RNA, and PNA (peptide @ nucleoic @ acid). According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is DNA.
[0029]
The nucleotide sequence of the nucleic acid molecule according to the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art. For example, when the detection target is a genome, the nucleic acid molecule according to the present invention can include not only a portion that hybridizes to an exon but also a portion that hybridizes to an intron, or either one of them. It may be constituted only by.
[0030]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid probe in detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a region of the mutant polynucleotide according to the invention or a polynucleotide complementary thereto comprising the part corresponding to the arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2. It is preferred to comprise a nucleotide fragment that hybridizes to The nucleic acid probe may be prepared as a synthetic oligonucleotide using a commercially available oligonucleotide synthesizer or the like, or may be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by treatment with a restriction enzyme or the like.
[0031]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 15 nucleotides or more, more preferably 100 nucleotides or less, and more preferably 50 nucleotides or less.
[0032]
Furthermore, when the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, it is preferable that the nucleic acid molecule is appropriately labeled. As a method of labeling, the 5 'end of the oligonucleotide is ligated using T4 polynucleotide kinase.³²A method of labeling by phosphorylation with P, and using a DNA polymerase such as Klenow enzyme, using a random hexamer oligonucleotide or the like as a primer³²A method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as P, a fluorescent dye, or biotin (a random prime method, etc.) is exemplified.
[0033]
In addition, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid amplification primer in detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention is obtained by amplifying, in a nucleic acid amplification method, a region of the mutant polynucleotide according to the present invention, which contains a portion corresponding to the arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2. It is preferable that it can be.
[0034]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a primer for nucleic acid amplification, the nucleic acid molecule preferably has a chain length of 15 to 100 nucleotides, more preferably 17 to 30 nucleotides.
[0035]
According to another preferred embodiment of the invention, the length of the nucleic acid molecule according to the invention is between 15 and 100 nucleotides, more preferably at least 17 nucleotides, even more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably between 18 and 50 nucleotides. . The nucleic acid molecule according to the present invention having such a chain length is particularly preferable for detecting the above-mentioned Q126STOP mutation from a nucleic acid sample containing contaminants.
[0036]
The nucleic acid amplification method is usually performed using a pair of primers. Therefore, according to the present invention, a primer pair for detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, which corresponds to the arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2 of the mutant polynucleotide according to the present invention, A primer pair capable of amplifying a region containing the same in a nucleic acid amplification method is provided. As the two primers constituting such a primer pair, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used. Such primers can be appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified. For example, one primer of the primer pair has a sequence at the 5 ′ end in the nucleotide sequence of the amplification target region, and the other primer has a 5 ′ end in the nucleotide sequence of the complementary strand of the amplification target region. It can have an array.
[0037]
By using the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention, the presence or absence of the R115STOP mutation in the TYMS gene can be detected, whereby the sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase can be reduced. Can be determined.
[0038]
Specifically, the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, and more specifically, the mutant type according to the present invention. The polynucleotide can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for amplifying a region containing a portion corresponding to the arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2. Therefore, according to the present invention, a step of performing a nucleic acid amplification method using a nucleic acid sample or a nucleic acid sample according to the present invention and a nucleic acid sample derived from a subject as a template, and detecting an R115STOP mutation in the obtained amplification product A method for determining sensitivity to a drug, the mechanism of action of which is inhibition of thymidylate synthase, comprising:
[0039]
In determining drug sensitivity by this method, for example, a sample of blood, peripheral blood leukocytes, liver, kidney, adrenal gland, brain, uterus, etc. is collected from a subject, and a nucleic acid sample such as genomic DNA or mRNA is extracted from the obtained sample. Then, if necessary, cDNA is prepared from mRNA by reverse transcriptase, and the obtained nucleic acid sample is used as a template to perform a nucleic acid amplification method using the nucleic acid molecule or the primer pair according to the present invention. By analyzing the nucleotide sequence, the R115STOP mutation in the TYMS gene can be detected. Any method known in the art may be used as a nucleic acid amplification method and a mutation detection method using the nucleic acid amplification method. For example, as a nucleic acid amplification method, when genomic DNA or cDNA is used as a template, an ordinary PCR method or the like can be used. When mRNA is used as a template, an RT-PCR method, a NASBA method, or the like is used. Can be.
[0040]
Analysis of the nucleotide sequence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be easily performed by, for example, a direct sequencing method using a sequencing primer. Such methods are well known in the art and can be performed, for example, using commercially available kits.
[0041]
In addition, in the case of the R115STOP mutation in the TYMS gene, when a recognition sequence by a specific restriction enzyme is lost or generated by this mutation, a method using a restriction fragment length polymorphism (RFLP), for example, a PCR-RFLP method is used. Can be used to detect the above mutations. Such a method is, for example, using a primer pair that amplifies a region containing the restriction enzyme recognition sequence in the above-described nucleic acid amplification method, digesting the obtained amplified fragment with this restriction enzyme, and then obtaining the obtained fragment. And their chain lengths. Such methods are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately set appropriate restriction enzymes, primers, amplification reaction conditions, restriction enzyme reaction conditions, and the like.
[0042]
Furthermore, for the amplified fragment obtained by the nucleic acid amplification method as described above, whether or not any mutation is present in the amplified fragment is examined by a simple method, and only the sample determined to have the mutation has an R115STOP mutation. Can also be detected.
[0043]
As the above-mentioned simple method, for example, a method using a single-strand higher-order polymorphism (PCR-SSCP method: Cloning and polymerase chain reaction-symbolization characterization information morphology and morphology). on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146. Detection of p53 gene mutations in human brain by singular-stratroconor. . Polymorphism analysis of polymerase chain reactionproducts Oncogene 1991 Aug 1; 6 (8):.... 1313-1318, Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling, PCR Methods Appl 1995 Apr 1; 4 (5): 275- 282). In this method, the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA, and the single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel, and the mobility on the gel is determined by the mobility of a control sample having no mutation. Compare with The DNA fragment to be amplified in this method preferably has a chain length of 200 to 400 bp.
[0044]
As the above simple method, a denaturant gradient gel method (DGGE method) can also be used. In this method, the amplified DNA is separated on a gel with increasing concentrations of DNA denaturant, and the mobility on the gel is compared to that of a control sample without mutation. Such methods are known in the art and can be appropriately performed by those skilled in the art.
[0045]
In the method for determining drug sensitivity according to the present invention, primers can also be designed so that allele-specific PCR can be performed. Specifically, one of the primers can be designed to be able to pair with the mutation site, and the other can be designed to be able to pair with a region not containing the mutation site. When a nucleic acid amplification method is performed using a primer pair designed in this manner, an amplification product is obtained when a mutation is present in the nucleic acid sample, and an amplification product is not obtained when the mutation is not present. Therefore, in this case, the presence or absence of the mutation can be determined by detecting the presence or absence of the amplification product.
[0046]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a probe for detecting a mutation by a hybridization method or the like. Thus, according to the present invention, inhibition of thymidylate synthase comprising the steps of hybridizing a nucleic acid molecule according to the present invention with a nucleic acid sample derived from a subject and then detecting the presence of a hybridization complex. And a method for determining sensitivity to a drug, the mechanism of action being: The presence of the hybridization complex indicates the presence of the R115STOP mutation in the TYMS gene. The method using the hybridization method can also be applied to an amplification product obtained by the method using the nucleic acid amplification method described above.
[0047]
In determining drug sensitivity by this method, for example, a sample of blood, peripheral blood leukocytes, liver, kidney, adrenal gland, brain, uterus, etc. is collected from a subject, and a nucleic acid sample such as genomic DNA or mRNA is obtained from the obtained sample. Is extracted, and if necessary, cDNA is prepared from mRNA by reverse transcriptase, and under stringent conditions, the presence or absence of hybridization with the nucleic acid molecule of the present invention is detected to detect the R115STOP mutation in the TYMS gene. be able to. The nucleic acid sample can be subjected to restriction enzyme treatment or the like, if necessary, to have a length suitable for hybridization. Any method known in the art may be used as a hybridization method and a method for detecting a mutation using the hybridization method. For example, techniques such as Southern hybridization and colony hybridization can be used. Sambrook, E. F. Frisch, T. {Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory} (1989).
[0048]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a probe in detecting a mutation by a hybridization method, a DNA chip in which the nucleic acid molecule according to the present invention is immobilized on a substrate is prepared, and the DNA chip and a nucleic acid sample derived from a subject are subjected to hybridization conditions. The contact may be made underneath to detect the presence or absence of hybridization. Therefore, according to the present invention, a DNA chip comprising the nucleic acid molecule according to the present invention immobilized on a substrate and capable of detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, and a step of detecting the R115STOP mutation using the DNA chip are provided. A method for determining sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase is provided. In the present invention, the chain length of the probe bound to the substrate is not particularly limited, but is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 15 to 50 nucleotides, and still more preferably 17 to 25 nucleotides. Techniques for detecting mutations using such a DNA chip are well known in the art (Genomics of post-sequence, vol. 1, "Strategy for SNP gene polymorphism", Kenichi Matsubara, Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, p128) -135, 2000), a person skilled in the art can prepare an appropriate DNA chip using the nucleic acid molecule according to the present invention, and detect the R115STOP mutation using this DNA chip.
[0049]
When detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, a primer extension method using the nucleic acid molecule according to the present invention as a primer can also be used. This method is particularly preferred when the R115STOP mutation is a single nucleotide polymorphism. Such single nucleotide polymorphisms include, for example, mutation of the 343rd cytosine residue (C in SEQ ID NO: 1) to a thymine residue (T) counted from the translation initiation codon. Can be The primer extension method is known to those skilled in the art, and the operating procedure and the specific nucleotide sequence of the primer to be used can be easily determined by those skilled in the art.
[0050]
According to a preferred embodiment of the present invention, the primer extension method includes SNaPshot^TMThe method known as the Pyrosequencing method is used.
[0051]
SNaPshot^TMIn the method, a primer which is adjacent to the single nucleotide polymorphism site and whose nucleotide added to its 3 'end by extension reaction is complementary to the single nucleotide polymorphism site is used. Using such a primer, a primer extension reaction is carried out using a nucleic acid sample from a subject as a template. At this time, by using ddNTP (dideoxy NTP), the extension reaction is carried out at the above polymorphic site. Stop when the corresponding single nucleotide is taken up. The incorporated nucleotide is easily identified by labeling it with a fluorescent label or the like in advance, and thus the nucleotide at the polymorphic site is identified. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedure of operation and the specific nucleotide sequence of the primer used can be easily determined by those skilled in the art.
[0052]
In the Pyrosequencing method (Ahmadian A et al., Anal. Biochem. Vol. 280, pp 103-110, (2000)), four types of primers are used in the extension reaction of a primer using a nucleic acid sample from a subject as a template. The dNTPs are reacted one by one. When any of the dNTPs is incorporated, an equal amount of pyrophosphate (PPi) is released, and the released PPi reacts with sulfurylase to generate ATP, and the ATP causes a luciferase reaction to cause luminescence. Therefore, when luminescence occurs when a particular dNTP is added, it is clear that the nucleotide corresponding to the dNTP has been incorporated, and thereby the nucleotide at the target site in the nucleic acid sample is identified. In this method, since dNTP is used, SNaPshot^TMIt is not necessary to use a primer adjacent to the polymorphic site as used in the method, and a primer separated by several bases may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedure of operation and the specific nucleotide sequence of the primer used can be easily determined by those skilled in the art.
[0053]
When the R115STOP mutation in the TYMS gene is a single nucleotide polymorphism as described above, the mutation is further reduced using a genotyping method (typing method) using the nucleic acid molecule according to the present invention as a probe and / or primer. It can also be detected. The method of genotyping is known to those skilled in the art, and the operating procedure thereof and the specific nucleotide sequence of the probe and / or primer to be used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned genotyping method uses a method known as TaqMan PCR method.
[0054]
TaqMan PCR method (Livak KJ.)Genet. Anal.Vol. 14, pp143-149, (1999)), are two types of probes that specifically hybridize to the C allele and the T allele with respect to the region containing the nucleotide at the polymorphic site. A probe (TaqMan probe) obtained by attaching a fluorescent label to the 5 ′ end, attaching a quencher (quencher) for the fluorescent label to the 3 ′ end, and further phosphorylating the 3 ′ end is used. It is added to a PCR reaction solution, and a PCR reaction is performed using a nucleic acid sample from a subject as a template. A nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a TaqMan probe and a primer for PCR, and the specific nucleotide sequence thereof can be appropriately determined by those skilled in the art. The two types of fluorescent labeling substances may be any combination that can be distinguished from each other, and such a combination of fluorescent labeling substances can be used together with each quencher with those known to those skilled in the art. And a combination of VIC. In this PCR reaction, first, a TaqMan probe hybridizes to each allele, and when the extension reaction from the primer reaches the hybridization region, a fluorescent labeling substance is released by the action of Taq DNA polymerase. Since the released fluorescent labeling substance is not affected by the quencher, it emits fluorescence. Therefore, according to this method, each fluorescence having an intensity corresponding to the abundance of each allele can be observed, whereby the genotype (C / C, C / T, or T / T) of the subject can be observed. Is easily determined.
[0055]
As another method that can be used for detecting the R115STOP mutation in the TYMS gene, a method by mass spectrometry (Griffin, TJ and Smith, LM,Trends Biotechnol.Vol. {18, pp77-84, (2000)), Invader method (Lyamichev et al.,).Nat. Biotechnol.Vol. {17, pp 292-296, (1999); 4, @No. 1, {Medical Do Co., Ltd., pp44-51 and pp68-72} (2000)), but are not limited thereto, and any method can be used as long as it can detect gene mutation. it can.
[0056]
In the method for determining drug sensitivity according to the present invention, a sample evaluated as having the R115STOP mutation in the TYMS gene has a high sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase, that is, the drug is effective. It can be determined that it is easy to do. Further, according to the present invention, a diagnosis can be made before birth and immediately after birth.
[0057]
For determining the sensitivity to a drug as described above, necessary reagents can be put together into a kit. Thus, a kit according to the invention comprises a nucleic acid molecule according to the invention and / or a primer pair according to the invention. The kit according to the present invention may further include reagents, reaction vessels, instructions and the like, depending on the specific method for identifying the nucleotide at the R115STOP mutation site in the TYMS gene.
[0058]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0059]
Example 1: Analysis of exon and its surrounding sequence of TYMS gene in human genomic DNA
Using human genomic DNA, the exon of the TYMS gene and the base sequence around it were decoded. The steps from the step of amplifying exons and peripheral regions using the polymerase chain reaction (PCR) using human genomic DNA as a template to the final decoding of the base sequence are described.
[0060]
Materials and reagents
Japanese-derived established cell line 62
Primers for full-length gene amplification (Table 1)
Exon amplification primers (Table 2)
Sequence primer (Table 3)
Takara Z-taq, Ex-Taq, LA taq with GC buffer (Reagent kit for PCR amplification)
PCR Product Pre-Sequence Kit (USB Co., Cleveland, OH): Exclusively I (10 U / mL) and Shrimk alkaline phosphatase (2U / mL).
[0061]
ABI BigDye Terminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)
DyeEx96 {plate} (Qiagen, Hilden, Germany)
Equipment and equipment
PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
Cooling centrifuge (Sakuma @ M200-IVD)
ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)
Work procedure
Sequence of TYMS gene
Based on the TYMS gene genome sequence (NCBI, {Accession No.} NT # 011005), primer sets for full-length amplification of the TYMS gene (Table 1), amplification of each exon (Table 2), and sequencing (Table 3) were obtained. Designed to be TYMS gene specific in the upstream and downstream, introns.
[0062]
[Table 1]

[0063]
[Table 2]

[0064]
[Table 3]

As a sequencing procedure, first, a genomic DNA (400 ng) was prepared using a primer set for full-length amplification (Table 1, 0.2 μM for each) and Z-Taq (1.25 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan). The DNA region containing the TYMS gene was amplified. At this time, the total volume of the reaction solution was 50 μL, 400 μM of {dNTP} Mixture (2 times the usual amount) was added, and the PCR conditions were “98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes. "10 seconds" was performed for 30 cycles.
[0065]
Exonuclease I and Shrimp alkaline phosphatase contained in PCR product Pre-Sequencing Kit were added to the reaction solution in an amount of 20 μL each, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes, then at 80 ° C. for 15 minutes, and cooled to 4 ° C.
[0066]
Next, using a primer set for PCR amplification of each exon (Table 2, each 0.5 μM), a DNA fragment containing all exons of the TYMS gene (the reaction solution after the treatment with the PCR Product Pre-Sequencing Kit) was used. DNA fragments containing exons other than exon 1 were amplified using Ex-Taq (0.625 units; @Takara Shuzo, Kyoto, Japan). At this time, the total volume of the reaction solution was 50 μL, and the PCR conditions were as follows: after treatment at 94 ° C. for 5 minutes, 30 cycles of “94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes” were performed, and then Treated at 72 ° C for 7 minutes.
[0067]
The DNA fragment containing exon 1 was amplified by LA \ taq (2.5 units; Takara \ Shuzo, Kyoto, Japan) using GC \ buffer \ I as a reaction buffer. At this time, the total volume of the reaction solution was 50 μL, and the PCR conditions were as follows: after treating at 94 ° C. for 1 minute, 35 cycles of “30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 1 minute 30 seconds at 72 ° C.” And then treated at 72 ° C. for 5 minutes.
[0068]
After that, 0.2 μL of Exonuclease I contained in PCR Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH) was added to 5 μL of PCR amplification product, 0.2 μL of Shrimp alkaline phosphatase was added to 1 μL of purified water, and 5 μL of purified water was added to 5 μL of PCR product. After adding 6 μL, the mixture was treated at 37 ° C. for 15 minutes and at 80 ° C. for 15 minutes, and then cooled to 4 ° C.
[0069]
The PCR product subjected to such treatment was directly sequenced by ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Version 2, Applied Biosystems, Foster City, CA) using the primers in Table 3 for both strands. That is, 3.2 μL of 1 μM primer, 4 μL of BigDye (Ver. 2), 2 μL of 5 × Sequence buffer, and 3.8 μL of purified water were added to a total of 7 μL of the PCR amplification product to make a total of 20 μL. 25 cycles of “96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 4 minutes” were performed, and then cooled to 4 ° C.
[0070]
Excess dye was removed using a DyeEx96 plate (Qiagen, Hilden, Germany), and 20 μL of the eluate was analyzed using an ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems). At that time, 25 μL of purified water was added to the eluate, and heat shock was performed at 94 ° C. for 2 minutes.
[0071]
Results and discussion
Genomic DNA derived from 62 Japanese was analyzed mainly on the amino acid coding exon of the TYMS gene. As a result, a polymorphism was found in which the 343rd cytosine (C) was substituted with thymine (T) to generate a stop codon, and translation occurred only up to the 114th amino acid of the thymidylate synthase protein. Was. By this single base substitution, about 65% of the amino acids constituting thymidylate synthase are deleted. From this, it is considered that this single-base substitution abolishes the function of thymidylate synthase, and enhances the effect of a drug whose mechanism of action is inhibition of the enzyme. Furthermore, for humans having this single base substitution, the dose of the above-mentioned drug can be reduced, and thus it is considered that the side effects of the drug can be reduced.
[0072]
[Sequence list]

Claims (11)

配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチド。A polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, having a mutation in the codon encoding the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2 to a stop codon . ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a genomic DNA sequence of a human thymidylate synthase gene, which is a polynucleotide having a mutation of a codon encoding an arginine residue at position 115 in SEQ ID NO: 2 to a stop codon. Item 3. The polynucleotide according to Item 1. 配列番号１中の第１０６〜１０４７ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列において、配列番号１に示される第４４８番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。In the nucleotide sequence represented by nucleotides 106 to 1047 in SEQ ID NO: 1, it comprises a nucleotide sequence in which the 448th cytosine (C) residue shown in SEQ ID NO: 1 has been substituted with a thymine (T) residue. The polynucleotide of claim 1. チミジル酸合成酵素遺伝子における、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。A nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in which a codon encoding the 115th arginine residue of thymidylate synthase in the thymidylate synthase gene is a stop codon,
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3 or a polynucleotide complementary thereto. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項４に記載の核酸分子。The nucleotide which hybridizes to the region containing the part corresponding to the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, or a polynucleotide complementary thereto. 5. The nucleic acid molecule of claim 4, comprising a fragment. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項４に記載の核酸分子。4. The polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, wherein a region including a portion corresponding to the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2 can be amplified by a nucleic acid amplification method. 3. The nucleic acid molecule according to claim 1. チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の判定に用いるための、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。The nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 6, which is used for determining sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase. チミジル酸合成酵素遺伝子における、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出するためのプライマーペアであって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１１５番目のアルギニン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。In the thymidylate synthase gene, a primer pair for detecting a mutation in which a codon encoding the 115th arginine residue of thymidylate synthase is a termination codon,
A primer pair capable of amplifying a region containing a portion corresponding to the 115th arginine residue in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3 by a nucleic acid amplification method. チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の判定に用いるための、請求項８に記載のプライマーペア。The primer pair according to claim 8, which is used for determining sensitivity to a drug whose mechanism of action is inhibition of thymidylate synthase. チミジル酸合成酵素遺伝子の変異を検出することにより、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性を判定する方法であって、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを用いて、チミジル酸合成酵素遺伝子における、チミジル酸合成酵素の第１１５番目のアルギニン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。A method for determining sensitivity to a drug having a mechanism of action of inhibition of thymidylate synthase by detecting a mutation in the thymidylate synthase gene,
The arginine at position 115 of thymidylate synthase in the thymidylate synthase gene using the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 7 and / or the primer pair according to claim 8 or 9. Detecting the presence or absence of a mutation in which a codon encoding a residue becomes a stop codon. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを含んでなる、チミジル酸合成酵素の阻害を作用機序とする薬物への感受性の判定用キット。A sensitivity to a drug having a mechanism of action of inhibition of thymidylate synthase, comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 7 and / or the primer pair according to claim 8 or 9. Kit for determination.