JP2004091780A - Polysaccharides of antrodiacamphorata fungus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一種の薬用真菌Antrodia camphorataの多糖類で、抗B型肝炎ウイルス表面抗原活性及びe抗原活性を備えていることが実験により証明されたものである。 The present invention is a polysaccharide of a kind of medicinal fungus, Antrodia camphorata, which has been proved by experiments to have anti-hepatitis B virus surface antigen activity and e-antigen activity.
真菌は二次代謝産物の生合成能を有しており、また多様な二次代謝産物を生み出すものであり、薬用として利用し、注目されな植物である。真菌のこの能力は誘導することが可能で、また生み出しやすく、区域や地理、季節や環境の影響を受けにくいことが共通の特性を明らかしている。このため冬虫夏草、霊芝、ブクリョウなどの菌類を、発酵方式を通じて大量生産し、新薬の開発を進めることが可能となる。 Fungi have the ability to biosynthesize secondary metabolites and produce a variety of secondary metabolites, and are used as medicinal plants and are attracting attention. This ability of fungi is inducible and easy to produce, revealing common characteristics that it is insensitive to area, geography, season and environment. For this reason, fungi such as Cordyceps, Reishi, and Bukuro can be mass-produced through a fermentation method, and the development of new drugs can be promoted.
Antrodia camphorataは、原名Ａ. cinnamomeaまたはGanoderma comphoratam と呼ばれ、台湾特有の真菌で、台湾特有の樹木牛樟樹(Cinnamum kanehirae)で育つ。擔子菌門(Basidiomycota) 、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、同擔子菌綱(Homobasidiomycetes)、無摺菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)の新種である。 Antrodia camphorata, originally called A. cinnamomea or Ganoderma comphoratam, is a Taiwan-specific fungus that grows on the Taiwan-specific cypress tree (Cinnamum kanehirae). It is a new species of Bacillus phylum (Basidiomycota), Bacillus subphylum (Basidiomycotina), Homobasidiomycetes, Aphillophorales, Polyporaceae and Antrodia.
Antrodia camphorataは台湾ですでに腫瘤疾病の治療での民間用薬品として用いられており、その化学組織には配糖体（グリコシド）、ステロイドおよびトリテルペンが含まれている。Chen, C.H.らはトリテルペンに抗レシチンと抗血清素での活性化作用があると報じている(非特許文献1)。多糖類は生体中におけるエネルギー貯蔵体である。 Antrodia camphorata is already used as a folk medicine in the treatment of mass disease in Taiwan, and its chemical tissues include glycosides, glycosides, steroids and triterpenes. Chen, C.H. et al. Have reported that triterpenes have an activating effect with anti-lecithin and antiserum (Non-Patent Document 1). Polysaccharides are energy stores in living organisms.
活性測定の面で、Chen et al.はAntrodia camphorata菌糸体が少量でも肝臓腫瘍細胞(Hep G2)に強力な細胞毒殺作用があると報じている(非特許文献2)。C57BL/6 とBALB/cを以って試験を進めると、マウスの血液中のTNF-α、INF-γ、及びIL-2が明らかに増加していることがわかる。 In terms of activity measurement, Chen et al. Report that even a small amount of Antrodia camphorata mycelium has a strong cytotoxic effect on liver tumor cells (Hep G2) (Non-Patent Document 2). Proceeding with C57BL / 6 and BALB / c, it is clear that TNF-α, INF-γ, and IL-2 in the blood of mice are clearly increased.
民間において、長期的に Antrodia camphorataが肝臓病と癌の治療、特にウイルス性肝炎の治療に使用されているが、これまでのところAntrodia camphorataについて菌種の確立、基因研究、培養条件、品質管理の関係を論述した論文報告は極めて少ない。
本発明の主要な目的は、Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類、分離、品質管理方法に関する。また、これらの多糖類が坑Ｂ型肝炎ウイルスの活性を有することに関する。 主要 The main object of the present invention relates to a polysaccharide of Antrodia camphorata fungi, isolation and quality control methods. It also relates to these polysaccharides having anti-hepatitis B virus activity.
Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られる。実験を経て抗B肝炎ウイルス表面抗原(anti-Hepatits B virus surface antigen)及びe抗原(e antigen)の活性を備えていることに注目したものである。 The polysaccharide of Antrodia camphorata fungi is obtained by strains Antrodia camphorata CCRC35396, CCRC35398, B71, B85 and B86. It is noted that it has the activity of anti-Hepatitis B virus surface antigen and e antigen (e antigen) through experiments.
当該技術に熟練している人であれば、以下の異なる図説が示す詳細な説明を閲読した後、本発明が示す技術と目的をはっきりと理解するであろう。 Persons skilled in the art will appreciate the art and objectives of the present invention after reading the detailed description provided by the different illustrations below.
本発明は上記の課題を解決するために次のような構成を有する。
（１）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図中における当該擔子菌類子実体に含まれ、中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸收ピークを有する多糖類。
（２）Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである上記（1）に記載の多糖類。
（３）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の抗B肝炎ウイルス多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図表中における当該擔子菌類子実体に含まれる中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸收ピークを有する多糖類。
（４）Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorataCCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである上記（３）に記載の多糖類。
（５）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類が産生し得る、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する多糖類。
（６）抗Ｂ型肝炎ウイルス活性は、B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)活性または／およびB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)活性である上記（３）〜（５）に記載の多糖類。
（７）上記（３）〜（６）のいずれかに記載の多糖類を有効成分とする、抗Ｂ型肝炎ウイルス医薬組成物。
The present invention has the following configuration to solve the above problems.
(1) A kind of medicinal fungus, Antrodia camphorata, a polysaccharide of the fungi, which is contained in the fruiting body of the fungi in the high-performance anion exchange chromatography (HPAEC) diagram, and has a medium molecular weight compound and some high molecular weight compounds. Polysaccharide having an absorption peak of
(2) The polysaccharide according to (1) above, wherein the polysaccharide of the fungus Antrodia camphorata is obtained by strains Antrodia camphorata CCRC35396, CCRC35398, B71, B85, and B86.
(3) An anti-hepatitis B virus polysaccharide of a kind of medicinal fungus, Antrodia camphorata, which is a medium-molecular-weight compound contained in the fruiting body of the fungi, and some of them, in high performance anion exchange chromatography (HPAEC) chart. A polysaccharide having an absorption peak of a high molecular weight compound.
(4) The polysaccharide according to (3) above, wherein the polysaccharide of Antrodia camphorata fungi is obtained by strains Antrodia camphorata CCRC35396, CCRC35398, B71, B85, and B86.
(5) A polysaccharide having anti-hepatitis B virus activity, which can be produced by a kind of medicinal fungus, Antrodia camphorata.
(6) The polysaccharide according to the above (3) to (5), wherein the anti-hepatitis B virus activity is hepatitis B virus e antigen (HBeAg) activity and / or hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) activity.
(7) An anti-hepatitis B virus pharmaceutical composition comprising the polysaccharide according to any one of (3) to (6) as an active ingredient.
本発明はAntrodia camphorataの菌糸から得られる全ての多糖類であり、これらは抗B型肝炎ウイルス(anti-hepatitis B virus) 活性を有しており、αインターフェロン と同等あるいはそれ以上の効果を得る。 The present invention is all polysaccharides obtained from the hypha of Antrodia camphorata, which have anti-hepatitis B virus activity and have an effect equal to or higher than that of α-interferon.
本発明のAntrodia camphorata多糖類はCCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によるもので、図1の示す５種のAntrodia camphorataの生長曲線、生長速度は成長から第ｎ日目の菌糸乾燥重量と第0日目の菌糸乾燥重量の比較によって表示する。培養を経た後 CCRC３５３９６とCCRC３５３９８の２種の菌株の成長速度はそのほかの菌株よりも速く、培養から18日には成長対数期(log phase)に達している。高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)の図２は、子実体中に数多くの中分子量、およびいくつかの高分子量吸収ピークが含まれていることを示す。しかしその濃度はいずれも低い。Antrodia camphorata多糖類は室温のもと、90分間以内にNaOAcを100-700mM程度、90mM NaOHの条件下で分析する。図4〜6はそれぞれB８５、B８６、CCRC３５３９６菌株に数多くの比較的小さな分子量化合物があることを示している。しかし高い分子量のあるところでは、いずれも2〜3個の多糖類の吸収ピークが出現している。図3、7が示すようにB７１菌株およびCCRC３５３９８菌株には、特に大量の吸収ピークが含まれている。上述の小さな分子量は、延滞時間30分以前に分布した吸収ピークで、中分子量では30〜65分間で吸収ピークが分布し、高分子量では66〜90分間に吸収ピークが分布する。
The Antrodia camphorata polysaccharide of the present invention is derived from strains CCRC35396, CCRC35398, B71, B85, and B86. The growth curves and growth rates of the five Antrodia camphorata shown in FIG. Indicated by comparing the mycelium dry weight on
菌糸体生産のための液体培養２６日目に、粗多糖類は水により抽出され、それに続いて加水分解される。Antrodia camphorataの子実体と菌糸に含まれた多糖類は異なるもので、即ち、各単糖の分量も異なる。各単糖成分は表１の示す通り、μmol ／gを単位とし、B７１菌株の多糖類には半乳糖(galactose)10.5μmol ／g、ブドウ糖(glucose)146.74μmol ／g、甘露糖(mannose)69.15μmol ／g、半乳糖アミン(galactosamine)10.5μmol ／g が含まれる。B８５菌株の多糖類には半乳糖283.76μmol ／g、ブドウ糖35.6μmol ／g、甘露糖19.21μmol ／g、半乳糖アミン4.41μmol ／gが含まれる。
B８６菌株の多糖類には半乳糖381.22μmol ／g、ブドウ糖63.9μmol ／g、甘露糖43.05μmol ／g、半乳糖アミン5.72μmol ／gが含まれる。
CCRC３５３９６菌株の多糖類には半乳糖104μmol ／g、ブドウ糖137.32μmol ／g、甘露糖63.6μmol ／g、半乳糖アミン9.33μmol ／g が含まれる。
CCRC３５３９８菌株の多糖類には半乳糖109.35μmol ／g、ブドウ糖209.56μmol ／g、甘露糖70.82μmol ／g、半乳糖アミン2.1μmol ／gが含まれる。
On day 26 of liquid culture for mycelium production, the crude polysaccharide is extracted with water and subsequently hydrolyzed. The polysaccharides contained in the fruit body and hypha of Antrodia camphorata are different, that is, the amount of each monosaccharide is also different. As shown in Table 1, each monosaccharide component is expressed in units of μmol / g, and the polysaccharides of B71 strain include 10.5 μmol / g of galactose, 146.74 μmol / g of glucose, and 69.15 of mannose sugar. μmol / g and 10.5 μmol / g of hemi-lactose amine (galactosamine). The polysaccharide of strain B85 contains 283.76 μmol / g of hemi-lactose, 35.6 μmol / g of glucose, 19.21 μmol / g of honeydew sugar, and 4.41 μmol / g of hemi-lactose amine.
The polysaccharides of the B86 strain include 381.22 μmol / g of hemi-lactose, 63.9 μmol / g of glucose, 43.05 μmol / g of cane sugar and 5.72 μmol / g of hemi-lactose amine.
The polysaccharides of CCRC 35396 strain include hemi-lactose 104 μmol / g, glucose 137.32 μmol / g, honey sugar 63.6 μmol / g, hemi-lactose amine 9.33 μmol / g Is included.
The polysaccharides of CCRC 35398 contain 109.35 μmol / g of hemi-lactose, 209.56 μmol / g of glucose, 70.82 μmol / g of honeydew sugar, and 2.1 μmol / g of hemi-lactose amine.
Blumberg, B. S.の報道によると、抗B型肝炎ウイルス表面抗原は当時Australia Antigenと呼ばれており(非特許文献3)、これはBlumbergにより初めてオーストラリア・アボリジニの血液中で発見されている。B型肝炎ウイルスは決定型a及び４つの亜型 d、y、w、rからなる表面抗原の皮膜（capsule）で覆われており、d、yとw、rは相互に重複しない。このためB型肝炎ウイルスは四種の亜型adw、adr、aywとayrに分類することができる。
またOno, T. H. (非特許文献4)の報道によれば、異なる亜型では、ヌクレオチドの配列と長さが異なると信じられている。全世界のB型肝炎ウイルスには主要な３種類の血清型（adw、adr、ayw）があり、地域の格差によって異なる分布を見せている。
According to a report by Blumberg, BS, the anti-hepatitis B virus surface antigen was then called the Australian Antigen (Non-Patent Document 3), which was first discovered by Blumberg in the blood of Aboriginal Australia. Hepatitis B virus is covered by a surface antigen capsule consisting of determinant a and four subtypes d, y, w, r, and d, y and w, r do not overlap each other. For this reason, hepatitis B virus can be classified into four subtypes, adw, adr, ayw and ayr.
According to Ono, TH (Non-Patent Document 4), it is believed that different subtypes have different nucleotide sequences and lengths. There are three major serotypes of hepatitis B virus worldwide (adw, adr, ayw), with different distributions depending on regional disparities.
Sung, J.-L. と Chen, D. S. (非特許文献5)の研究で明示したところによると、わが国（中国）の長江以北をadr血清型、長江以南をadw血清型とする。HBeAgは、２つのp17サブユニットからなり、プレC遺伝子(pre gene) とC遺伝子から翻訳される。オープンリ−デイングフレームの最初のコドンAUGの上流で転写が開始され、25Kdの先核心(precore) 蛋白を形成する。 According to a study by Sung, J.-L. and Chen, DS (Non-Patent Document 5), north of the Yangtze River in Japan (China) is defined as adr serotype, and south of the Yangtze River is defined as adw serotype. HBeAg consists of two p17 subunits and is translated from a pre-C gene and a C gene. Transcription is initiated upstream of the first codon AUG in the open reading frame, forming a 25 Kd precore protein.
Garcia, P. D.の報道(非特許文献6)によると、アミノ酸配列分析装置により、先核心(precore)蛋白のN末端の29個のアミノ酸は、シグナル分泌性タンパク質(hydrophobic animo acids signal secretory protein)の疎水性アミノ酸であることがわかった。タンパク質はその後細胞外にまで分泌され、17k HBeAgとなる。 According to a report by Garcia, PD (Non-Patent Document 6), the amino acid sequence analyzer revealed that the N-terminal 29 amino acids of the precore protein were hydrophobic in the signal secretory protein (hydrophobic animo acids signal secretory protein). Was found to be a sex amino acid. The protein is then secreted extracellularly and becomes 17k HBeAg.
台湾の民間で長期間Antrodia camphorataが使用され、肝臓病やガンの治療が普遍的に行なわれており、特にウイルス性の肝炎の治療に多く使用されてきた。しかし、これまで関連の論文報告は存在しない。 AnAntrodia camphorata has been used for a long time in the Taiwanese private sector, and liver disease and cancer have been universally treated, especially for the treatment of viral hepatitis. However, there is no related paper report so far.
患者はB型肝炎ウイルスを感染しているかどうか、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)の測定だけで評価すると、いずれも不明瞭な結果になる。主な理由は、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)は未感染患者、感染したばかりで潜伏期の患者、及び感染後すでに完治した患者の評価に対してすべて陰性の反応を示す。このため、多くの場合、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)を測定するほかに、B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)の測定も行なわなければならない。 Evaluation of whether a patient is infected with hepatitis B virus by measurement of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) alone gives unclear results. The main reason is that hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) all responds negatively to the evaluation of uninfected patients, newly infected and latent patients, and patients who have already healed after infection. Therefore, in many cases, in addition to the measurement of the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), the measurement of the hepatitis B virus e antigen (HBeAg) must also be performed.
本発明のAntrodia camphorata多糖類はB型肝炎ウイルスを産生する細胞株MS-G2を経て５種のAntrodia camphorataの抗ウイルス能力の評価を進めており、またAntrodia camphorata多糖類のB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)とB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)能力について、αインターフェロンを正のコントロールとして定量される。その計算公式は下記の通りである。
抑制百分率＝(コントロール OD 値−サンプルOD値) /コントロールOD 値
The Antrodia camphorata polysaccharide of the present invention has been evaluated for the antiviral ability of five Antrodia camphorata via the hepatitis B virus-producing cell line MS-G2, and the hepatitis B virus e antigen of Antrodia camphorata polysaccharide. (HBeAg) and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) capacity are quantified using alpha interferon as a positive control. The calculation formula is as follows.
Percent inhibition = (control OD value-sample OD value) / control OD value
図8は、菌糸から得られる全ての多糖類が抗B型肝炎ウイルス(anti-hepatitis B virus) 活性を有していることを示している。B８６菌株の多糖類は50 μg/mlのもとで最高の表面抗原反応を示しており、そのデータとαインターフェロン 1,000 units/mlを使用した結果と比較すると、αインターフェロンよりも良好である。
図9は、B８６とCCRC３５３９８の菌株のみが本質的な抗B型肝炎e抗原(substain anti-hepatitis B e antivities)活性を有していること示している。すべての菌糸の多糖類には細胞毒性はない。
FIG. 8 shows that all polysaccharides obtained from hyphae have anti-hepatitis B virus activity. The B86 strain polysaccharide shows the highest surface antigen response at 50 μg / ml, and is better than α-interferon when comparing the data with the results using 1,000 units / ml of α-interferon.
FIG. 9 shows that only strains B86 and CCRC35398 have essential substain anti-hepatitis e antivities activity. All mycelial polysaccharides are not cytotoxic.
B型肝炎ウイルス細胞株MS-G2を用いて、B型肝炎ウイルスに抵抗する程度について、５種のAntrodia camphorataの多糖類ウイルスの能力を測定すると、B８６が最も効果的であることがわかった。また抗B型肝炎ウイルス表面抗原(Anti-HBsAg)の抑制率は、1,000 units/ml αインターフェロンがわりと高く、またB７１、B８５、CCRC３５３９６、CCRC３５３９８はいずれも250 units/ml αインターフェロンよりも効果的である。B８６、CCRC３５３９８のみが抗B型肝炎ウイルス表面抗原(Anti-HBsAg)の活性を有しており、その有効性は1,000 units/ml αインターフェロンよりも低いが、２５０ units/ml αインターフェロンよりも高い。 す る と Using the hepatitis B virus cell line MS-G2 and measuring the ability of five Antrodia camphorata polysaccharide viruses to resist hepatitis B virus, it was found that B86 was the most effective. In addition, the inhibition rate of anti-hepatitis B virus surface antigen (Anti-HBsAg) is relatively high at 1,000 units / ml α-interferon, and B71, B85, CCRC35396, and CCRC35398 are all more effective than 250 units / ml α-interferon. is there. Only B86 and CCRC35398 have the activity of anti-hepatitis B virus surface antigen (Anti-HBsAg), the efficacy of which is lower than 1,000 units / ml α-interferon but higher than 250 units / ml α-interferon.
多糖類は通常、アスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST, aspartate transaminase) Kキットを以って細胞への損傷の測定を行なっており、もしアスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST)値が２５I.U. L-1よりも高ければ、細胞に対して有害であることを示す。５種のAntrodia camphorataの多糖類は細胞損傷の測定を経て、アスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST)値がいずれも２５よりも低い結果が明らかになっており、Antrodia camphorataから得られた多糖類が、いずれも細胞毒性がないことを示している。 Polysaccharides are usually measured for cell damage using an aspartate transaminase (AST) K kit, and if the aspartate transaminase (AST) value is 25I. If it is higher than U.L- 1, it is harmful to cells. The five types of antrodia camphorata polysaccharides have been shown to have aspartate aminotransferase (AST) values of less than 25 after cell damage measurement, indicating that polysaccharides obtained from antrodia camphorata were obtained. However, none of them shows no cytotoxicity.
本発明の多糖類（ＰＳ）はAntrodia camphorataの野生子実体および実験室で培養された５種の菌糸抽出物から得られたものである。５種の菌糸の多糖類は高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC, high performance anion exchange chromatography)を用いて分析したものであり、産生の多様化および単糖の組成を示している。 The polysaccharide (PS) of the present invention is obtained from wild fruit bodies of Antrodia camphorata and five kinds of mycelium extracts cultured in a laboratory. The five types of mycelial polysaccharides were analyzed using high performance anion exchange chromatography (HPAEC), and show diversification of production and monosaccharide composition.
本発明は様々な修飾と変形が認められる。開示された特徴的なフォームに限定されず、しかし、意図はクレームに定義される発明の精神と目的を失うことなく、すべての修飾、等価なもの及び代案を含むと理解されるべきである。 Various modifications and variations are recognized in the present invention. It is to be understood that the invention is not limited to the particular form disclosed, but that the intent is to cover all modifications, equivalents, and alternatives without losing the spirit and purpose of the invention as defined in the claims.
Antrodia camphorataの菌株をジャガイモブドウ糖寒天(PDA, potato dextrose agar)の中において、３週間に１回交換する。菌種は滅菌した25ml ジャガイモブドウ糖寒天(PDA)の培養皿の中央に接種し、28℃の状態で19日間保存し、培養した菌糸を1x1センチ(cm)に切り、再び25mlのジャガイモブドウ糖肉汁(PDB, potato- dextrose-broth)に置く。20g/Lブドウ糖を加えた後、pH =5.6 250ml瓶のなかに入れ、暗闇のなかで、26日間培養した後、250 mM NaCl遠心性速やかに細胞外の多糖体および培養液を洗浄し、冷凍乾燥を経た後、4℃冷蔵庫にて保存する。 The strain of Antrodia camphorata is exchanged in potato dextrose agar (PDA, potato dextrose agar) once every three weeks. The strain is inoculated in the center of a sterilized 25 ml potato glucose agar (PDA) culture dish, stored at 28 ° C. for 19 days, cut the cultured mycelia into 1 × 1 cm (cm), and again reconstitute 25 ml potato dextrose juice ( PDB, potato- dextrose-broth). After adding 20 g / L glucose, place in a 250 ml bottle at pH = 5.6 250 ml, culture in the dark for 26 days, then centrifuge at 250 mM NaCl. After drying, store in a refrigerator at 4 ° C.
Antrodia camphorata 菌種をジャガイモブドウ糖寒天(PDA) (Sigma社から購入、馬鈴薯萃殻の摂取物、ブドウ糖および洋菜を含む)に置いて培養、当該の菌糸をジャガイモブドウ糖肉汁(PDB)培養液で光を避けて２６日間放置して保存した。遠心分離、冷凍乾燥を経て菌糸体から１：１００ (w/w)の ８０℃の水で抽取した後、４倍の95体積％のアルコールを加えて、4℃の冷蔵庫のなかで一晩保存した。さらに遠心分離で、沈殿物を除き去った後、冷凍乾燥で粗多糖類を得た。粗多糖類を高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)に置いて、室温のもとNaOAcと９０mM NaOHの混合溶媒分析を行い、最後にPRIME DAK systemのソフトウェアでデータを収集した。HClによる加水分解を行い、その後冷却し、真空ポンプ(vacuum pump, Spe-Vac)で酸抽出した後、再び水によって、ナイロン膜(０．２μm) でろ過を経た後、炭水化物濃度、タンパク質濃度、光学旋光度又は多糖類構造の鑑定を行なった。
冷凍乾燥後の菌糸体を、水で６hr抽出し、冷凍放置した後に４倍の９５体積％のアルコールを加え、４℃の冷蔵庫で一晩保存した後、再び遠心分離し、冷凍乾燥によって粗多糖類を得た。
高速陰イオン交換クロマトグラフィー(high performance anion exchange chromatography)を利用して多糖類を分析した。
２００mgの粗多糖類を、Gradient pump、金の作用電極を使ったPulsed Amperometric Detector(ＰＡＤ−ＩＩ)、陰イオン交換カラム(Carbopac PA-１００，４．６×２５０ｍｍ)を備えたＨＰＥＡＣ（Dionex BiolＣ）によって分離した。
サンプルは、自動サンプリング(ＡＳ３５００、Spectra ＳＹＳＴＥＭ（登録商標))を使用して、200 μlのサンプルループ(sample loop)のマイクロインジェクションにより注入した。多糖類分析は、室温で、９０ 分間(min)、９０mM NaOH中で、１００-７００mM NaOAcの線形変化率(linear gradient)、のもとで行われた。データはPRIME DAK system上で収集され、積分された。
Antrodia camphorata strain is cultured on potato dextrose agar (PDA) (purchased from Sigma, including ingested potato husks, dextrose and western vegetables). And stored for 26 days. After centrifugation, freeze-drying, and extraction from the mycelium with 1: 100 (w / w) water at 80 ° C, add 4 times 95% by volume of alcohol, and store in a refrigerator at 4 ° C overnight. did. Further, after removing precipitates by centrifugation, freeze-drying was performed to obtain a crude polysaccharide. The crude polysaccharide was subjected to high-performance anion exchange chromatography (HPAEC), mixed solvent analysis of NaOAc and 90 mM NaOH was performed at room temperature, and finally data was collected using PRIME DAK system software. After hydrolysis with HCl, cooling, extraction with an acid by a vacuum pump (vacuum pump, Spe-Vac), filtration through a nylon membrane (0.2 μm) again with water, carbohydrate concentration, protein concentration, The optical rotation or polysaccharide structure was determined.
The freeze-dried mycelium was extracted with water for 6 hours, left to freeze, added with 4 times 95% by volume of alcohol, stored in a refrigerator at 4 ° C. overnight, centrifuged again, and freeze-dried to obtain a crude product. Sugars were obtained.
Polysaccharides were analyzed using high performance anion exchange chromatography.
HPEAC (Dionex BiolC) equipped with a gradient pump, a Pulsed Amperometric Detector (PAD-II) using a gold working electrode, and an anion exchange column (Carbopac PA-100, 4.6 × 250 mm) was used for 200 mg of crude polysaccharide. Separated by
Samples were injected by microinjection of a 200 μl sample loop using automatic sampling (AS3500, Spectra SYSTEM®). Polysaccharide analysis was performed at room temperature for 90 minutes (min) in 90 mM NaOH under a linear gradient of 100-700 mM NaOAc. Data was collected and integrated on the PRIME DAK system.
多糖類の加水分解
多糖類の加水分解は、粗多糖類試料の１ｍｇを６N HCl、８０℃のヒーテイングブロック中、６−８時間で行われる。その後試料を冷却し、酸を蒸発する。加水分解された多糖類を、精製水で再懸濁し、Millipore-Gxナイロン膜で濾過し、分析に供した。
Polysaccharide Hydrolysis Polysaccharide hydrolysis is performed on 1 mg of the crude polysaccharide sample in 6N HCl, 80 ° C. heating block for 6-8 hours. Thereafter, the sample is cooled and the acid is evaporated. The hydrolyzed polysaccharide was resuspended in purified water, filtered through a Millipore-Gx nylon membrane and submitted for analysis.
一般的糖分析方法
全炭水化物濃度は、フェノール硫酸(phenol-sulfuric acid)法により測定した。全蛋白濃度は、Bradford 法(Bradford,(1976) Analytical Biochemistry, 72, 248-254)により測定した。自動旋光計により５８９nmで特定の光学旋光度を測定する。
General sugar analysis method Total carbohydrate concentration was measured by the phenol-sulfuric acid method. Total protein concentration was measured by the Bradford method (Bradford, (1976) Analytical Biochemistry, 72, 248-254). A specific optical rotation is measured at 589 nm by an automatic polarimeter.
多糖類の構造決定
多糖類の加水分解産物である単糖類は、上述した陰イオン交換カラム(Carbopac PA-１０，４．６x２５mm，Dionex)によって高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)で分離された。単糖類の分析は、１８mM NaOH中、室温のもとで行なわれた
Structure determination of polysaccharide Monosaccharide, which is a hydrolysis product of polysaccharide, was separated by high-performance anion exchange chromatography (HPAEC) using the above-mentioned anion exchange column (Carbopac PA-10, 4.6 × 25 mm, Dionex). Monosaccharide analysis was performed at room temperature in 18 mM NaOH.
抗B型肝炎ウイルステスト
B型肝炎ウイルスを産生する細胞株MS-G2は、２４ wellの底が平らな組織培養皿の上に、３×１０5 cells/ml-wellになるように置かれた。一晩培養し、その細胞が完全に付着していることを確認し、多糖類または比較のためのインターフェロンα−２ａの試験を行なう。テストサンプルは、いろいろな濃度（例えば、１０、２５，５０μｇ／ｍｌ）になるように滅菌された精製水で溶解した。追加の組が、対照として、等量の滅菌精製水で処理された。その結果として、培養物は３日ごとに、収集され、坑ウイルス活性の分析がなされた。
Anti-hepatitis B virus test Cell line MS-G2 producing hepatitis B virus was placed on a 24-well flat-bottomed tissue culture dish at 3 × 10 5 cells / ml-well. . After overnight culture, confirm that the cells are completely attached, and test for polysaccharide or interferon α-2a for comparison. Test samples were dissolved in purified water that had been sterilized to various concentrations (eg, 10, 25, 50 μg / ml). An additional set was treated with an equal volume of sterile purified water as a control. As a result, cultures were collected every three days and analyzed for antiviral activity.
ＥＬＩＳＡ法(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)試験用材（キット）を使用して、４９２ ｎｍの状況のもとでB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)およびB型肝炎ウイルス表面e抗原(HBeAg)の値を測定した。
また対照組とウイルス抑制での百分率を比較し、抗ウイルスでの活性を評価し、３組の結果は平均値の標準偏差(standard deviation of the mean,SDM)統計を使用し、またアスパラギン酸塩アミノ基転移酵素試験用材(AST Kit)を以って細胞損傷の測定を行なった。
ＡＳＴ値は２５ＩＵ／Ｌより高く、細胞損傷を示した。
Using an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test material (kit), the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and the hepatitis B virus surface e antigen (HBeAg) were measured at 492 nm. The value was measured.
In addition, the percentage of virus suppression was compared with that of the control group, and the activity in antivirus was evaluated. The results of the three groups used the standard deviation of the mean (SDM) statistics, Cell damage was measured using a transaminase test material (AST Kit).
AST values were higher than 25 IU / L, indicating cell damage.
本発明に係る一種の薬用真菌Antrodia camphorataの多糖類が、抗B型肝炎ウイルス表面抗原活性及びe抗原活性を備えていることが実験により証明されたことからこれらを当該患者の治療に用いることが可能となる。 It has been proved by experiments that the polysaccharide of the medicinal fungus Antrodia camphorata according to the present invention has anti-hepatitis B virus surface antigen activity and e-antigen activity, so that these can be used for the treatment of the patient. It becomes possible.
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008260695A (en) * | 2007-04-10 | 2008-10-30 | Nissei Bio Kk | Hepatopathy inhibitor |
| GB2450949A (en) * | 2007-07-09 | 2009-01-14 | Golden Biotechnology Corp | Cyclohexenones from Antrodia Camphorata for use in the treatment of hepatitis B (HBV) |
| CN101921346A (en) * | 2010-08-31 | 2010-12-22 | 浙江省林业科学研究院 | Radial flow chromatography |
| CN102901831A (en) * | 2012-10-25 | 2013-01-30 | 杭州宝康亿富生物科技有限公司 | Method for detecting biological activities of immune regulation polysaccharides and nucleic acids |
| CN103554285A (en) * | 2013-10-15 | 2014-02-05 | 甘肃省商业科技研究所 | Extraction method of chanterelle mycelium polysaccharide |
| CN104448026A (en) * | 2014-12-31 | 2015-03-25 | 三生源生物科技（天津）有限公司 | Method for improving antioxidant activity of antrodia polysaccharide |
| JP2016102111A (en) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 恩揚生物科技股▲分▼有限公司 | Pharmaceutical compositions considered as supplementary chemotherapy pharmaceuticals and applications thereof |
| WO2017005134A1 (en) * | 2015-07-03 | 2017-01-12 | 暨南大学 | Preparation method and use of linseed polysaccharide having antiviral and immunological activity |
| CN109420019A (en) * | 2017-09-04 | 2019-03-05 | 汉圣制药科技股份有限公司 | Application of antrodia camphorata fruiting body compound wine extract in preparation of medicine for treating hepatitis B |
-
2003
- 2003-08-11 JP JP2003291018A patent/JP2004091780A/en active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008260695A (en) * | 2007-04-10 | 2008-10-30 | Nissei Bio Kk | Hepatopathy inhibitor |
| GB2450949A (en) * | 2007-07-09 | 2009-01-14 | Golden Biotechnology Corp | Cyclohexenones from Antrodia Camphorata for use in the treatment of hepatitis B (HBV) |
| FR2918663A1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-01-16 | Golden Biotechnology Corp | CYCLOHEXENONES OF ANTRODIA CAMPHORATA FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS B VIRUS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
| GB2450949B (en) * | 2007-07-09 | 2012-04-11 | Golden Biotechnology Corp | Inhibition of hepatitis B virus by cyclohexenone compounds from antrodia camphorata |
| CN101921346A (en) * | 2010-08-31 | 2010-12-22 | 浙江省林业科学研究院 | Radial flow chromatography |
| CN102901831A (en) * | 2012-10-25 | 2013-01-30 | 杭州宝康亿富生物科技有限公司 | Method for detecting biological activities of immune regulation polysaccharides and nucleic acids |
| CN103554285A (en) * | 2013-10-15 | 2014-02-05 | 甘肃省商业科技研究所 | Extraction method of chanterelle mycelium polysaccharide |
| JP2016102111A (en) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 恩揚生物科技股▲分▼有限公司 | Pharmaceutical compositions considered as supplementary chemotherapy pharmaceuticals and applications thereof |
| CN104448026A (en) * | 2014-12-31 | 2015-03-25 | 三生源生物科技（天津）有限公司 | Method for improving antioxidant activity of antrodia polysaccharide |
| WO2017005134A1 (en) * | 2015-07-03 | 2017-01-12 | 暨南大学 | Preparation method and use of linseed polysaccharide having antiviral and immunological activity |
| US10835552B2 (en) | 2015-07-03 | 2020-11-17 | Jinan University | Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide |
| CN109420019A (en) * | 2017-09-04 | 2019-03-05 | 汉圣制药科技股份有限公司 | Application of antrodia camphorata fruiting body compound wine extract in preparation of medicine for treating hepatitis B |
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