【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養するために用いられる培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、移植に必要充分な量の細胞を患者から採取することが困難であるために、患者から採取した少量の細胞を培養して、移植に必要充分な量まで増殖させることが行われている。この場合において、細胞の培養は、適当な培地内に細胞を混合して、所定の培養条件下に配した状態で、例えば、１〜２週間程度の期間にわたって行われる。
【０００３】
細胞は、この間、培地内に含有されている各種成分を栄養源として成長する。したがって、細胞の成長とともに培地内の栄養源が減少し、排出物が増大するので、培養途中においてこれを補う必要がある。
このため、従来より、培養途中における定期的な培地交換作業が行われている。培地交換により、失われた栄養源が補給され、細胞の成長が継続的に行われることになる。
【０００４】
従来、細胞の培養は、クリーンルーム内において、所定の培養容器内に細胞と培地とを投入することにより行われ、培地交換は、作業者がアスピレータ等を用いて、培養容器内部の培地を培養容器の開口から流し出すことにより行われていた。
【０００５】
【特許文献１】
特公平３−６９５０８号公報（第１頁、第１図）
【特許文献２】
特公平３−５７７４４号公報（第７頁、第４図）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アスピレータを用いる交換方法では、塵埃等が混入する可能性が高く、培地を培養容器の開口から流し出す方法による培地交換では、流れ出た培地の微細な飛沫が散乱するので、クリーンルーム内の清浄度が低下する不都合がある。したがって、培養容器からの廃培地の放出は、クリーンルーム外で行うことが好ましい。しかしながら、細胞をクリーンルーム外へ持ち出すことは、細菌等による汚染防止の観点から好ましくない。
また、培地交換を人手によることなく自動的に行うことが考えられるので、自動化容易であることも必要である（例えば、特許文献１、特許文献２参照。）。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、培地交換時における塵埃の発生を低減し、簡易に培地交換を行うことを可能とし、かつ、培地交換の自動化を容易にすることができる培養容器を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地を貯留可能な容器本体と、該容器本体の底面と略同等の面積を有し、該容器本体内に取り出し可能に挿入される平面状の培養面を有する培養面部材とを備える培養容器を提供する。
【０００９】
この発明によれば、容器本体に培養面部材を挿入することで、培養面によって容器本体内部の底面全体が覆われる。この状態で、容器本体内に培地を貯留し、細胞を培養することにより、培養面上において細胞を成長させることが可能となる。そして、培地を交換する際には、細胞の付着した培養面部材を容器本体から取り出し、例えば、新たな培地を貯留した新たな容器本体に浸漬することにより、培養を継続することが可能となる。また、廃棄する培地を容器本体内に残すことができるので、廃棄する培地を貯留した容器本体をクリーンルーム外に移動させて培地を廃棄することにより、クリーンルーム内における塵埃の発生を防止することが可能となる。
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養容器において、前記培養面部材が、前記容器本体内に貯留される培地の液面上に露出する把持部を備える培養容器を提供する。
この発明によれば、培地交換の際に培地の液面上に露出する把持部を把持して培養面を培地内から引き出すことが可能となる。その結果、培地や培養面上の細胞に外部部材を接触させることなく、培地交換を容易に行うことが可能となる。
【００１１】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の培養容器において、前記培養面に貫通孔が設けられている培養容器を提供する。
この発明によれば、培養面を容器本体から引き出す際に、培養面に設けた貫通孔を通して培地を流通させることにより、廃棄すべき培地を容器本体内に残しながら、細胞の付着した培養面を容易に取り出すことが可能となる。
【００１２】
請求項４に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の培養容器において、前記容器本体の底面に傾斜面を備え、前記培養面部材が前記傾斜面に沿って容器本体内に取り出し可能に挿入されている培養容器を提供する。
この発明によれば、培養面部材は容器本体の傾斜面に沿うように配置され、その傾斜した培養面部材に細胞が付着する。そして、培養面部材を容器本体から取り出す際に、傾斜面に沿って取り出すことにより、培養面部材の上方に存在する培地を培養面部材に沿って流しながら取り出すことが可能となる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この発明の各実施形態に係る培養容器について説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図８に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００１４】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００１５】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００１６】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００１７】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填材は密封されて製品として提供される。
【００１８】
以下に説明するこの発明の一実施形態に係る培養容器は、主に、上述した培養工程の内、一次培養工程において使用されるものであるが、二次培養工程において使用してもよい。
この発明の一実施形態に係る培養容器について、図１から図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図１および図２に示されるように、上方に開口し、底面を有する比較的浅く広い円筒状の容器本体２と、該容器本体２の上部開口３から容器本体２内に挿入される培養面部材４とから構成されている。
【００１９】
前記培養面部材４は、図１に示されるように、容器本体２の底面５とほぼ同等の大きさおよび形状を有する平板状の培養面６と、該培養面６から立ち上がる把持部７とを備えている。前記培養面６は、前記容器本体２内に挿入されたときに、容器本体２の底面５全体を覆うように構成されている。前記把持部７は、図３に示されるように、培養面部材４を容器本体２内に挿入し、培養面６が容器本体２の底面に接触する位置に配置されたときに、容器本体２に貯留される培地８の液面よりも上方に突出する程度の長さ寸法に形成されている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る培養容器１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１を用いて細胞の培養を行うには、培養面部材４を容器本体２内に挿入して、容器本体２内に適当な培地８および培養すべき細胞を混合して投入する。これにより、培養面部材４の培養面６が容器本体２の底面５を被覆するように配置されるとともに、培養面部材４の把持部７が培地８の液面から上方に突出して配置される。
【００２１】
この状態で、所定の培養条件、例えば、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度に維持することにより、培地８内において細胞が培養される。細胞、特に幹細胞は、底面５に付着して成長する性質を有しており、培養中に底面５を構成している培養面部材４の培養面６に付着して成長する。
【００２２】
そして、所定の培地交換時期に、図４に示されるように、他の容器本体９に新たな培地１０を貯留して用意するとともに、作業者またはマニピュレータが把持部７を把持して、細胞が付着した培養面部材４を培地８内から取り出す。その後に、図４に矢印で示されるように、新たな培地１０が貯留されている容器本体９内に、細胞が付着した培養面部材４を投入する。これにより、培地交換が行われ、細胞の培養を継続して行うことが可能となる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係る培養容器１では、ピペットのような外部部材によって廃棄する培地８を吸引する必要がなく、培地８の液面上に露出している把持部７を把持して引き上げるだけで細胞を培地８内から取り出すことができる。その結果、外部部材から細胞に、塵埃や細菌が移る機会を低減し、細胞の健全性を維持することができる。
【００２４】
また、培養容器１から培地８を流し出すのではなく、培地８を容器本体２内に残すので、培養面部材４を取り去った後の培地８を容器本体２ごとクリーンルーム内から持ち出すことができる。したがって、クリーンルーム内において培養容器１から流し出す必要がないので、クリーンルーム内に廃棄する培地８の飛沫が散乱することを防止し、クリーンルーム内の清浄度を維持することができる。
【００２５】
なお、本実施形態に係る培養容器１では、上方に開口した有底円筒状の容器本体２に、培養面部材４を上方から挿入するものを例に挙げて説明したが、容器本体２内への上方からの塵埃の降下による汚染を効果的に防止することが望まれる場合には、例えば、図５および図６に示されるような容器本体２の側壁に設けた開口１１から培養面部材４を挿入する構造を採用してもよい。このように構成することにより、上方から降下する塵埃等が容器本体２内に入る機会を低減することができる。
【００２６】
また、容器本体２の底面全域を覆う培養面６を有する培養面部材４を容器本体２から取り出す際に、培地８が容器本体２内に残り易くするために、培養面６に貫通孔１２を形成しておいてもよい。この場合に、培養された細胞が付着し難い箇所、例えば、外周近傍に形成すればよい。また、貫通孔１２に代えて切欠を形成してもよい。
【００２７】
また、図７に示されるように、容器本体１３の底面１４を水平面に対して一定の角度で傾斜した傾斜面により構成し、該容器本体１３内に挿入される培養面部材１５の培養面１６を、容器本体１３の底面１４に沿う方向（図６に矢印で示す方向）に移動させるように構成されていてもよい。
このように構成された培養容器１７によれば、細胞が付着した培養面１６を容器本体１３から抜き出す際に、培養面１６上に配されている培地８を持ち上げることがなく、培地８を流動させずに、培養された細胞を容器本体１３から取り出すことができる。したがって、培地交換にあたって培地８の飛沫が散乱することをより低減することが可能となる。
【００２８】
また、この発明においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞の培養にも使用できる。
【００２９】
また、培養面部材４，１５に付着した細胞は、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて剥がされた後に２次培養されるが、これに代えて、培養面部材４，１５の培養面６，１６に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
【００３０】
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域である。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、培養面６，１６を高い親水性を呈するように変化させ、容易に間葉系幹細胞を剥離させることができる。このようにすれば、トリプシン処理や遠心分離工程を行う必要がなく、細胞を健全な状態で回収することができる。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明によれば、容器本体から細胞の付着した培養面部材を引き出すだけで、廃棄する培地を激しく流動させることなく、培地と細胞とを分離することができる。その結果、簡易な構成で、周囲に廃棄する培地の飛沫を散乱させることなく培地交換等を行うことができるという効果を奏する。
また、培地の液面から露出する把持部を把持して容器本体から培養面部材を取り出すという簡易な操作によって、培地と細胞との分離が行われるので、自動化が容易であり、省力化、作業の高速化を容易に図ることができるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す斜視図である。
【図２】図１の培養容器の容器本体から培養面部材を取り出した状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の培養容器の容器本体に培養面部材を挿入した状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の培養容器において培地を入れ替えるステップを説明する図である。
【図５】図１の培養容器の変形例を示す斜視図である。
【図６】図５の培養容器を示す縦断面図である。
【図７】図１の培養容器の他の変形例を示す縦断面図である。
【図８】この発明の一実施形態に係る培養容器が使用される培養工程を説明する模式図である
【符号の説明】
１，１７ 培養容器
２，１３ 容器本体
４，１５ 培養面部材
５ 底面
６，１６ 培養面
７ 把持部
８ 培地
１２ 貫通孔[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a culture container used for culturing cells.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, since it is difficult to collect a sufficient amount of cells from a patient necessary for transplantation, it has been practiced to culture a small amount of cells collected from the patient and grow them to a sufficient and sufficient amount for transplantation. I have. In this case, the cells are cultured in a state where the cells are mixed in an appropriate medium and placed under predetermined culture conditions, for example, for a period of about 1 to 2 weeks.
[0003]
During this time, the cells grow using the various components contained in the medium as nutrient sources. Therefore, as the cells grow, the nutrient sources in the medium decrease and the excretion increases, which must be compensated for during the culture.
For this reason, conventionally, a medium exchange operation during culture has been performed regularly. The medium exchange replenishes the lost nutrient sources and results in continuous cell growth.
[0004]
Conventionally, cell culture is performed by charging cells and a medium into a predetermined culture vessel in a clean room, and the medium is replaced by an operator using an aspirator or the like to transfer the medium inside the culture vessel to the culture vessel. This was done by pouring it out of the opening.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 3-69508 (Page 1, Figure 1)
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 3-57744 (page 7, FIG. 4)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the replacement method using an aspirator, there is a high possibility that dust or the like may be mixed, and in the medium replacement method in which the medium is poured out from the opening of the culture vessel, fine droplets of the flowed-out medium are scattered. There is an inconvenience that the degree decreases. Therefore, the release of the waste medium from the culture vessel is preferably performed outside the clean room. However, taking the cells out of the clean room is not preferable from the viewpoint of preventing contamination by bacteria and the like.
In addition, since it is conceivable that the medium is exchanged automatically without manual operation, it is necessary that automation be easy (for example, see Patent Documents 1 and 2).
[0007]
The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and reduces the generation of dust at the time of medium exchange, enables easy medium exchange, and facilitates automation of medium exchange. It is an object of the present invention to provide a culture vessel capable of carrying out the above-mentioned steps.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The invention according to claim 1 is a culture having a container main body capable of storing a culture medium, a flat culture surface having an area approximately equal to the bottom surface of the container main body, and being removably inserted into the container main body. A culture container comprising a surface member is provided.
[0009]
According to the present invention, by inserting the culture surface member into the container body, the entire bottom surface inside the container body is covered by the culture surface. In this state, the medium is stored in the container body and the cells are cultured, whereby the cells can be grown on the culture surface. Then, when replacing the culture medium, the culture surface member to which the cells are attached is removed from the container main body, and, for example, the culture can be continued by immersing the culture medium in a new container main body storing a new culture medium. . In addition, since the medium to be discarded can be left inside the container body, it is possible to prevent the generation of dust in the clean room by moving the container body storing the discarded medium outside the clean room and discarding the medium. It becomes.
[0010]
According to a second aspect of the present invention, there is provided the culture container according to the first aspect, wherein the culture surface member includes a grip portion exposed on a liquid surface of the culture medium stored in the container body.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, when replacing | exchanging a culture medium, it becomes possible to hold | grip the grip part exposed on the liquid surface of a culture medium, and to pull out a culture surface from inside a culture medium. As a result, the medium can be easily exchanged without bringing the external member into contact with the medium or the cells on the culture surface.
[0011]
The invention according to claim 3 provides the culture vessel according to claim 1 or 2, wherein a through-hole is provided in the culture surface.
According to the present invention, when the culture surface is pulled out of the container body, the medium is allowed to flow through the through-holes provided in the culture surface, so that the culture surface to which the cells are attached is removed while leaving the medium to be discarded in the container body. It can be easily taken out.
[0012]
According to a fourth aspect of the present invention, in the culture vessel according to the first or second aspect, an inclined surface is provided on a bottom surface of the container body, and the culture surface member can be taken out into the container body along the inclined surface. To provide a culture vessel inserted into the container.
According to the present invention, the culture surface member is arranged along the inclined surface of the container body, and the cells adhere to the inclined culture surface member. Then, when the culture surface member is taken out from the container body, by taking out the culture surface member along the inclined surface, it is possible to take out the culture medium existing above the culture surface member while flowing along the culture surface member.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Before describing the culture vessel according to each embodiment of the present invention, a manufacturing process of a bone filling body as a living tissue filling body will be schematically described. In order to produce a bone filling, as shown in FIG. 8, first, bone marrow fluid is collected from a patient's iliac bone or the like. The collected bone marrow fluid is centrifuged and swirled to extract bone marrow cells having a high specific gravity.
[0014]
The extracted bone marrow cells are put into a culture vessel together with a previously prepared medium and mixed. A portion of the medium is removed and sent for infection testing.
Thereafter, the mixed bone marrow fluid and culture medium are maintained under culture conditions such as a predetermined temperature (for example, 37 ± 0.5 ° C.) and a CO 2 concentration (for example, 5%), so that constant culture conditions are maintained for a predetermined time. The cells are primarily cultured in. At a predetermined exchange time during the culturing of the cells, the medium is discarded from the inside of the culture vessel. Then, the medium is mixed again, and the culturing step is repeated and continued. A portion of the discarded medium is sent for infection testing.
[0015]
After a predetermined culture period is over, after the medium is discarded from the culture vessel, a protease such as trypsin is charged and mixed into the culture vessel. As a result, the mesenchymal stem cells attached to and grown on the bottom surface of the culture container are detached from the bottom surface of the main culture container. The mesenchymal stem cells thus detached are extracted by being subjected to a centrifugal separator.
[0016]
The extracted mesenchymal stem cells are mixed in a culture vessel in which a bone filling material and an appropriate medium have been charged after the cell number is adjusted. In practice, mesenchymal stem cells are attached to a bone substitute and injected into a medium. Then, in the same manner as described above, the mixed mesenchymal stem cells and the medium are maintained at culture conditions such as a predetermined temperature (for example, 37 ± 0.5 ° C.) and a CO 2 concentration (for example, 5%). The cells are subcultured under a constant culture condition for a predetermined time.
[0017]
In the secondary culture step as well, as in the primary culture step, the medium is changed periodically, and a part of the medium to be supplied and a part of the medium to be discarded are each sent for an infection test. Then, after a lapse of a predetermined culture period, sample extraction for quality inspection and infection inspection for shipping is performed, and the manufactured bone replacement material is sealed and provided as a product.
[0018]
The culture vessel according to one embodiment of the present invention described below is mainly used in the primary culture step of the culture steps described above, but may be used in the secondary culture step.
A culture vessel according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
As shown in FIG. 1 and FIG. 2, the culture vessel 1 according to the present embodiment includes a relatively shallow and wide cylindrical vessel body 2 having an open top and a bottom surface, and an upper opening 3 of the vessel body 2. And a culture surface member 4 inserted into the container body 2.
[0019]
As shown in FIG. 1, the culture surface member 4 includes a flat culture surface 6 having a size and a shape substantially equal to the bottom surface 5 of the container body 2, and a grip portion 7 rising from the culture surface 6. Have. The culture surface 6 is configured to cover the entire bottom surface 5 of the container body 2 when inserted into the container body 2. As shown in FIG. 3, when the culture surface member 4 is inserted into the container main body 2, and the culture surface 6 is arranged at a position where the culture surface 6 contacts the bottom surface of the container main body 2, as shown in FIG. Is formed to have a length that protrudes above the liquid level of the culture medium 8 stored in the medium.
[0020]
The operation of the culture container 1 according to the present embodiment thus configured will be described below.
In order to culture cells using the culture container 1 according to the present embodiment, the culture surface member 4 is inserted into the container body 2, and an appropriate medium 8 and cells to be cultured are mixed in the container body 2. And put it in. Thereby, the culture surface 6 of the culture surface member 4 is arranged so as to cover the bottom surface 5 of the container body 2, and the gripping portion 7 of the culture surface member 4 is arranged to protrude upward from the liquid surface of the culture medium 8. .
[0021]
In this state, the cells are cultured in the medium 8 by maintaining predetermined culture conditions, for example, 37 ± 0.5 ° C. and 5% CO 2 concentration. Cells, especially stem cells, have the property of growing by attaching to the bottom surface 5, and grow by attaching to the culture surface 6 of the culture surface member 4 constituting the bottom surface 5 during culture.
[0022]
Then, at a predetermined medium exchange time, as shown in FIG. 4, a new medium 10 is stored and prepared in another container body 9, and an operator or a manipulator grasps the grasping portion 7 and the cells are removed. The attached culture surface member 4 is taken out of the culture medium 8. Thereafter, as indicated by an arrow in FIG. 4, the culture surface member 4 to which the cells adhere is put into the container body 9 in which a new culture medium 10 is stored. As a result, the medium is exchanged, and the cell culture can be continued.
[0023]
In this case, in the culture vessel 1 according to the present embodiment, there is no need to suck the culture medium 8 to be discarded by an external member such as a pipette, and the gripping part 7 exposed on the liquid surface of the culture medium 8 is gripped. The cells can be taken out of the medium 8 simply by pulling up. As a result, it is possible to reduce the chance that dust and bacteria are transferred from the external member to the cells, and maintain the soundness of the cells.
[0024]
Further, since the culture medium 8 is left in the container main body 2 instead of flowing out the culture medium 8 from the culture container 1, the culture medium 8 from which the culture surface member 4 has been removed can be taken out of the clean room together with the container main body 2. Therefore, since it is not necessary to flow out of the culture vessel 1 in the clean room, it is possible to prevent scattering of the culture medium 8 to be discarded in the clean room and maintain cleanliness in the clean room.
[0025]
In the culture vessel 1 according to the present embodiment, an example is described in which the culture surface member 4 is inserted from above into the bottomed cylindrical vessel body 2 that opens upward. When it is desired to effectively prevent contamination due to the descent of dust from above, for example, the culture surface member 4 is opened through an opening 11 provided on the side wall of the container body 2 as shown in FIGS. May be adopted. With this configuration, it is possible to reduce the chance that dust and the like falling from above enter the container body 2.
[0026]
When the culture surface member 4 having the culture surface 6 covering the entire bottom surface of the container main body 2 is taken out from the container main body 2, a through hole 12 is formed in the culture surface 6 so that the culture medium 8 can easily remain in the container main body 2. It may be formed. In this case, it may be formed in a place where the cultured cells are hardly attached, for example, in the vicinity of the outer periphery. Further, a notch may be formed instead of the through hole 12.
[0027]
As shown in FIG. 7, the bottom surface 14 of the container body 13 is formed by an inclined surface inclined at a constant angle with respect to the horizontal plane, and the culture surface 16 of the culture surface member 15 inserted into the container body 13 is formed. May be moved in the direction along the bottom surface 14 of the container body 13 (the direction indicated by the arrow in FIG. 6).
According to the culture container 17 configured as described above, when the culture surface 16 with the cells attached thereto is extracted from the container body 13, the culture medium 8 disposed on the culture surface 16 is not lifted, and Without culturing, the cultured cells can be taken out of the container body 13. Therefore, it is possible to further reduce scattering of the droplets of the culture medium 8 when replacing the culture medium.
[0028]
Further, in the present invention, bone was taken as an example of a biological tissue, and a case where mesenchymal stem cells extracted from bone marrow fluid were cultured was described, but it was decided to extract not only bone marrow fluid but also peripheral blood and cord blood. Is also good. The cells are not limited to mesenchymal stem cells, and can be used for culturing somatic cells such as ES cells, somatic stem cells, bone cells, chondrocytes, and nerve cells.
[0029]
The cells adhered to the culture surface members 4 and 15 are secondarily cultured after being detached using a protease such as trypsin. , 16 may be subjected to a temperature responsive process of switching between hydrophobicity and hydrophilicity at a predetermined temperature as a boundary.
[0030]
The temperature-responsive treatment is performed by immobilizing a temperature-responsive polymer poly (N-isopropylacrylamide) with a covalent bond. The region subjected to the temperature responsive treatment has a boundary temperature of 32 ° C., above which a weak hydrophobicity similar to that of a commercially available cell culture vessel is exhibited, but a high hydrophilicity is obtained by cooling the temperature below the boundary temperature. Is an area which comes to exhibit. Therefore, for example, by culturing at 37 ° C. and then cooling to 32 ° C. or lower, the culture surfaces 6, 16 can be changed to exhibit high hydrophilicity, and the mesenchymal stem cells can be easily detached. By doing so, it is not necessary to perform a trypsin treatment or a centrifugation step, and the cells can be collected in a healthy state.
[0031]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the medium and the cells can be separated only by pulling out the culture surface member to which the cells are attached from the container body without violently flowing the discarded medium. As a result, with the simple configuration, it is possible to exchange the medium without scattering the droplets of the medium to be discarded around.
In addition, the separation of the culture medium and the cells is performed by a simple operation of grasping the grasping portion exposed from the liquid surface of the culture medium and taking out the culture surface member from the container body, so that automation is easy, labor saving, and work. There is also an effect that it is possible to easily achieve a high speed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view showing a culture vessel according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a longitudinal sectional view showing a state where a culture surface member is taken out of a container main body of the culture container of FIG.
FIG. 3 is a longitudinal sectional view showing a state in which a culture surface member is inserted into a container main body of the culture container of FIG.
FIG. 4 is a diagram illustrating a step of replacing a culture medium in the culture vessel of FIG.
FIG. 5 is a perspective view showing a modification of the culture vessel of FIG.
FIG. 6 is a longitudinal sectional view showing the culture vessel of FIG.
FIG. 7 is a longitudinal sectional view showing another modified example of the culture vessel of FIG. 1.
FIG. 8 is a schematic diagram illustrating a culture step in which a culture vessel according to an embodiment of the present invention is used.
1, 17 culture container 2, 13 container body 4, 15 culture surface member 5, bottom surface 6, 16 culture surface 7, gripper 8, culture medium 12, through hole
