JP2004081156A - Marker for prediction of diabetes and diabetes-relating disease and method for classifying individual - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for the classification of human individuals, useful for the diagnosis of diabetes and diabetes-relating diseases and the evaluation of the treating agent for the diseases. <P>SOLUTION: Human individuals are classified into a group 1 composed of high activity type ALDH2 and high activity type ADH2, a group 2 composed of high activity type ALDH2 and low activity type ADH2, a group 3 composed of low activity type ALDH2 and high activity type ADH2, and a group 4 composed of low activity type ALDH2 and low activity type ADH2 based on the activity levels of ALDH2 and ADH2. The quantity of aldehyde in the cytoplasm and mitochondria can be predicted by the classification to predict the onset risk of diabetes and diabetic complications. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカー、複合酵素マーカーおよび個体分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、慢性の全身性代謝障害を引き起こす疾患であり、高血糖、糖尿、体タンパク質の崩壊、ケトーシス（ケトン血症）およびアシドーシスを呈し、病状が進行すると、神経障害、網膜障害、腎障害若しくは心臓障害等の合併症がおこる。糖尿病は、現代の飽食の時代を反映して、国民的疾患となっており、その有効な予防法および治療法の確立が望まれている。糖尿病の診断方法としては、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）が、一般的であり、その他、１，５−ＡＧ、フルクトサミン（糖化アルブミン）、ＨｂＡ１ｃ等が診断の指標とされている。他方、近年のゲノム研究の進展と相俟って、疾患を遺伝子レベルで理解するための研究が盛んになっており、そのなかでも遺伝子の多型を分析して、個体レベルでの発症リスク等を予測する試みがなされている。例えば、アルコール性疾患では、その病因の理解を深めるために、アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子とアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子の多型の組み合わせが利用されている（参考文献：　Ａｒｕｋｏｒｕ　Ｋｅｎｋｙｕｔｏ　Ｙａｋｕｂｕｔｓｕ　Ｉｓｏｎ　１９９５　Ｆｅｂ；３０（１）：３３−４２　等）。また、非活性型ＡＬＤＨ２遺伝子の多型分析により、アルコールを多量に摂取する人のガン発生のリスクを予測できることが報告されている（参考文献：Ｃａｎｃｅｒ　Ｅｐｉｄｅｎｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ　＆　Ｐｒｅｙ　１９９６；　５：９９−１０２等）。この他にも、アルコール摂取の心筋梗塞への影響がＡＤＨ３遺伝子の多型分析で調べられている（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．３４４，Ｎｏ．８　ｐ５４９−５５５）。アルツハイマー病については、本発明者により、ＡＬＤＨ２遺伝子とアポリポブロテインＥ（ＡＰＯＥ）遺伝子の多型により、発症リスクを予測することが提案されている（特開２００１−２９９３９７号公報）。しかしながら、糖尿病については、遺伝子レベルでの理解が十分とはいえず、糖尿病および合併症の診断や治療薬の評価等の遺伝子レベルでの実施は、十分ではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、遺伝子レベルでの糖尿病の理解に基づいたマーカーであって、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価等に有用なマーカーの提供を、その目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、糖尿病を遺伝子レベルで理解するために、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型をそれぞれ高活性型と低活性型に分け、個体を下記の表１に記載の４つのグループに分類するという着想を得た。そして、この着想をさらに発展させ、各グループについて、細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド濃度を下記表２に示すように予想する理論を構築した。そして、この理論の検証を行ったところ、後述のように、糖尿病のメカニズム等を理論的に説明することが可能であることを突き止めた。そして、この理論に基づき、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型およびこれらの多型に応じて発現した酵素自身が、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のマーカーとして有用であることを見出し、本発明に到達した。遺伝子多型は、個体が存在する間（生まれてから死ぬまで）、変化しないから、本発明の基礎となる前記理論によれば、糖尿病発症以前の体の状態も予測でき、さらには、先祖若しくは子孫への遺伝的な予測も可能である。
【０００５】
（表１）
グループ１：高活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ２：高活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ３：低活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ４：低活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
【０００６】

【０００７】
すなわち、本発明の複合遺伝子マーカーは、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のＡＬＤＨ２をコードする遺伝子および高活性型若しくは低活性型のＡＤＨ２をコードする遺伝子を含む複合遺伝子マーカーである。
【０００８】
また、本発明の複合酵素マーカーは、糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための複合酵素マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のＡＬＤＨ２および高活性型若しくは低活性型のＡＤＨ２を含む複合酵素マーカーである。
【０００９】
さらに、本発明の個体分類方法は、前記本発明のマーカーを用いて、個体を上記表１の４つのグループに分類する方法である。
【００１０】
前記の両複合マーカーにより、診断対象の個体を、上記表１の４つのグループに分類することができ、分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測することができる。前記分類はモンゴロイド民族に適しており、特に日本人に最適であるから、本発明において、前記個体は、モンゴロイド民族が好ましく、より好ましくは日本人である。また、前記個体は、例えば、健康人、糖尿病患者あるいはブドウ糖負荷試験における境界型領域に属する人等である。この予測に基づけば、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価を行うことが可能となる。前記診断としては、例えば、糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測等がある。前記治療薬の評価としては、例えば、アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善剤、経口血糖降下剤（スルフォニルウレア系薬剤を含む）およびα−ｌｉｐｏｉｃ　ａｃｉｄなどを含む抗酸化剤等の医薬の薬効を各個体毎に予測すること等がある。前記インスリン抵抗性改善薬としては、ＰＰＡＲγ受容体に作用をもつと考えられサイアゾリジン系の薬剤等がある。本発明のマーカーや分類方法により、個体の体質を評価すれば、薬剤についての感受性を予測でき、その個体が、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ、ｍｉｌｄ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ若しくはｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒであるかを判断して薬剤を投与できる。したがって、本発明により、糖尿病および糖尿病合併症においてテーラーメイド医療が実施可能となる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００１２】
ＡＬＤＨ２は、細胞のミトコンドリア内に存在するアルデヒド脱水素酵素のアイソザイムの一つである。ＡＬＤＨ２遺伝子はヒト染色体の１２ｑ２４に存在し、そのｅｘｏｎ１２に位置する４７８番アミノ酸（Ｇｌｕ）のコドンＧＡＡにおいて、ＧからＡへの点変異（ＡＡＡ；Ｌｙｓ）の多型があり、正常なタイプ（Ｇ）をＡＬＤＨ２^１遺伝子といい、活性欠損遺伝子（Ａ）をＡＬＤＨ２^２という。本発明において、ＡＬＤＨ２の高活性型および低活性型の基準は、特に制限されず、マーカーの用途等に応じ適宜決定できる。例えば、ＡＬＤＨ２^１遺伝子にコードされた酵素はアセトアルデヒドを酢酸に変換する活性が高く、これに対して、ＡＬＤＨ２^２遺伝子にコードされた酵素はアセトアルデヒドを酢酸に変換する酵素活性がほとんどない。また、この酵素はテトラマー（４量体）を形成し、そのうちＡＬＤＨ２^２遺伝子にコードされるタンパク質が一つでもが含まれると酵素活性を失う。したがって、本発明のマーカーにおいて、例えば、ＡＬＤＨ２^１遺伝子のホモ接合体およびその酵素（４７８番目のアミノ酸がＧｌｕ）を高活性型と定義することができ、それ以外の場合、すなわち、ＡＬＤＨ２^２遺伝子／ＡＬＤＨ２^１遺伝子のヘテロ接合体およびＡＬＤＨ２^２遺伝子／ＡＬＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体と、それらの酵素（４８７番目のアミノ酸がＬｙｓ）とを、低活性型と定義することができる。但し、この定義は、本発明において一例に過ぎない。
【００１３】
ＡＤＨは、分子量が約４０ｋＤａのサブユニット２個からなるダイマーであり、構成するサブユニットの違いから複数のアイソザイムが知られている。これまで同定されたヒトＡＤＨ遺伝子は、Ｉ第４染色体（４ｑ２１−２５）に存在する。ＡＤＨは、生化学的特性からＩからＩＶ型に分類される。一般に、経口摂取されるアルコールの代謝にかかわるのはＩ型であり、これはエタノールなどの短鎖のアルコールを加水分解し、ピラゾールで不活化されるという特徴を持つ。Ｉ型ＡＤＨには、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３の３つのアイソザイムが存在し、これらは独立した遺伝子座の産物である。本発明のＡＤＨ２は、Ｉ型であり細胞質に存在する。日本人における遺伝子多型は、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３双方の遺伝子に存在する。ＡＤＨ２のサブユニットにはβ１、β２、β３の３つがあり、β１はＡＤＨ^１遺伝子、β２はＡＤＨ^２遺伝子、β３はＡＤＨ^３遺伝子にそれぞれコードされている。ＡＤＨ２の多型は、一塩基点変異により、補酵素との相互作用部位であるＺｎとＮＡＤ結合部位のアミノ酸が変化することによって生じる。アミノ酸レベルで見ると、β２は、β１の４７番目のアルギニンがヒスチジンに変異したものである。これらの酵素活性には違いがあり、β２β２のホモ接合体は、β１β１のホモ接合体より、生理的条件下で高い活性を示す。特にβ２β２は、β１β１に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで４０倍のＶｍａｘ値を持ち、ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨと言われている。日本人においては、ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨが一般的である。本発明のＡＤＨ２の高活性型および低活性型を区別する基準は、特に制限されず、マーカーの用途等により適宜決定される。例えば、高活性型は、前記ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨをコードする遺伝子（β２サブユニットをコードするＡＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体）およびその酵素（β２のホモダイマー）と定義し、低活性型は、前記遺伝子以外の遺伝子（ＡＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体以外のＡＤＨ２遺伝子）およびその酵素（β２ホモダイマー以外のダイマー）と定義できる。但し、この基準は、本発明の一例に過ぎない。
【００１４】
つぎに、本発明の複合遺伝子マーカーは、例えば、プローブ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ミスマッチＰＣＲ法を利用した方法により検出できる。
【００１５】
前記プローブは、例えば、ＡＬＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型を区別して検出可能なＤＮＡプローブと、ＡＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型とを区別して検出可能なＤＮＡプローブとを含む複合プローブ等がある。また、この複合プローブを、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップを含む）に適用すれば、多数の個体サンプルにおいて、本発明の複合遺伝子マーカーを効率よく検出できる。
【００１６】
前記ＲＦＬＰ分析を利用した方法は、例えば、所定のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて、ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅し、増幅産物を、制限酵素で処理し、アガロース電気泳動等で断片長を比較する方法である。この方法は、キット化することができる。このキットは、ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅する際に使用するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと、ＡＬＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別して切断する制限酵素と、ＡＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別して切断する制限酵素とを含む。
【００１７】
ＡＬＤＨ２遺伝子のＰＣＲのためのプライマーとしては、例えば、５’−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴ−３’（ｓｅｎｓｅ）と５’−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の組み合わせ等があり、前記制限酵素としては、例えば、ＭｂｏＩＩ等がある。
【００１８】
ＡＤＨ２遺伝子のＰＣＲのためのプライマーとしては、例えば、５’−ＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’（ｓｅｎｓｅ）と５’−ＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧ　−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の組み合わせ等があり、前記制限酵素としては、例えば、ＭａｅＩＩＩ等がある。
【００１９】
この他に、本発明の遺伝子マーカーは、Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法（ミスマッチＰＣＲ法）あるいはＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等によっても検出できる。
【００２０】
本発明の複合酵素マーカーは、抗体を含む試薬で検出可能である。この試薬としては、例えば、高活性型若しくは低活性型ＡＬＤＨ２と特異的に反応する抗体と、高活性型若しくは低活性型ＡＤＨ２と特異的に反応する抗体とを含む試薬等がある。前記抗体としては、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体がある。抗体は、通常の方法で作成できる。例えば、抗体を作成するには、アミノ酸配列が異なる領域のペプチドを化学合成し、蛋白などの高分子に共有結合で結合し、家兎やマウスなどに免疫することによって、ＡＬＤＨ２^１とＡＬＤＨ２^２にそれぞれコードされる蛋白を識別する抗体、あるいはＡＤＨ２β１とＡＤＨ２β２にそれぞれコードされる蛋白を識別する抗体を作成することができる。免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合すると、それぞれの前記蛋白を識別するモノクローナル抗体を作成することができる。ただし、この作成法は一例をしめしたものであって、この方法にかぎらずそれぞれを識別できる抗体は作成できる。
【００２１】
（本発明の分類方法の基礎理論）
つぎに、本発明の基礎となる前記分類について、前記表１、表２および図１〜５を参照して詳しく説明する。
【００２２】
（本発明の分類概念）
前記表１の４つのグループは、前記表２に示すような細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量をとると推察される。まず、アルデヒドの代謝に着目すると、グループ４では、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２の双方とも低活性であるため、アルデヒド体が代謝をうけにくくなり、ミトコンドリア内および細胞質内に蓄積しやすくなる。これに対し、グループ１では、前記両酵素共に高活性であるため、アルデヒドが代謝を受けやすく、細胞質内およびミトコンドリア内にアルデヒドが蓄積し難い。グループ２では、ＡＬＤＨ２が高活性であるから、ミトコンドリア内のアルデヒドの蓄積は少なく、ＡＤＨ２が低活性であるから、細胞質のアルデヒドの蓄積が多い。グループ３は、アルデヒドの蓄積において、グループ２と反対の傾向を示す。つぎに、図１に示すように、高血糖により脂質の過酸化が起こると、アルデヒド（図１では、４−ｈｙｄｒｏｘｙ　２　ｎｏｎｅｎａｌ：４−ＨＮＥ）が細胞内に蓄積する。アルデヒドは、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２によりカルボン酸（図１では、４−ｈｙｄｒｏｘｙ　２　ｎｏｎａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ：ＨＮＡ）とアルコール（図１では、１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎｅ：１，４ＤＨＮ）に代謝され、その際、ＡＬＤＨ２ではＮＡＤ^＋が消費されてＮＡＤＨが生じ、ＡＤＨ２ではＮＡＤＨが消費されＮＡＤ^＋が生成する。ＡＤＨ２が触媒する反応は可逆反応であり、ＮＡＤＨが高濃度の条件下であってはじめて、４？ＨＮＥは１，４ＤＨＮに変換される。ＡＤＨ２の酵素反応の際に必要となるＮＡＤＨは、高血糖によりポリオール代謝が亢進する際に生じるＮＡＤＨで賄われる。
【００２３】
（グループ４の特徴）
図２に、グループ４のアルデヒド代謝を中心とした糖尿病の代謝図を示す。上述のように、このグループでは、アルデヒド（図２では、４−ＨＮＥ）が高濃度で存在する。高血糖であれば、ポリオール代謝が亢進してＮＡＤＨが産生されるが、ＡＤＨ２が低活性であるため、ＮＡＤＨをあまり消費することができず、これが活性酸素種（ＲＯＳ）発生の一要因となる。また、アルデヒドが高濃度で存在することは、ミトコンドリア膜に障害を与え、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）が減少することになり、ＡＴＰが低下してしまう。また、ＲＯＳの発生は、ミトコンドリアＤＮＡに損傷を起こし、アポトーシスを誘導し、エネルギー生成（ＡＴＰ）が低下し、代謝に悪影響を及ぼす。さらに、ミトコンドリア膜からのフリーラジカル産生を亢進させ、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌を低下させる。また、これらのミトコンドリの特性（体質）は、母系遺伝によって子孫に遺伝され、また糖尿病の発症年齢が若くなるという現象が生じる。また、グループ４では、アルデヒドが細胞質およびミトコンドリアに高濃度で蓄積することから、他の毒性物質（アルコール等）に対する感受性が増加する。４−ＨＮＥの神経内蓄積は、Ｎａ−Ｋ　ＡＴＰａｓｅを阻害し、神経の酸化的ストレスに対する感受性を高め、神経に対し障害を惹起しやすくなる。その結果、糖尿病の患者において、末梢神経障害のような神経障害がおきやすくなる。
【００２４】
（グループ１の特徴）
図３に、グループ１のアルデヒド代謝を中心とした糖尿病の代謝図を示す。上述のように、このグループでは、アルデヒド（図３では、４−ＨＮＥ）が低濃度となる。高血糖であれば、ポリオール代謝が亢進してＮＡＤＨが産生されるが、ＡＤＨ２が高活性であるため、ＮＡＤＨが消費され、活性酸素種（ＲＯＳ）もあまり発生しない。また、アルデヒドが低濃度であるため、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）にもあまり影響はない。また、ＲＯＳがあまり発生しないため、ミトコンドリアＤＮＡの損傷も少なく、損傷したとしても修復され、正常細胞が増殖することとなる。一方、アルデヒドが低濃度であることは、４？ＨＮＥが低濃度になりやすく、低濃度の４？ＨＮＥは、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ（アイソザイムであるβＩ、βＩＩ）の活性を増加させ、これによって虚血（血管障害）を起こし、網膜症や腎症（タンパク尿等）等の合併症が生じやすくなる。
【００２５】
（アルコール代謝と糖尿病との関係）
糖尿病患者においては、アルコールを日常的に飲み続けている患者が多い。そうした患者においては、アルコールがアセトアルデヒドに代謝され、さらにアセタルデヒドが酢酸に代謝される際に、ＮＡＤ^＋が補酵素として利用され、ＮＡＤＨに還元される事により、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比が上昇しやすくなる。しかも、糖尿病患者は高血糖を有しているため、図２に示すように、肝臓や末梢神経内などにおいてＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比が上昇し、それが維持される。したがって、糖尿病患者がアルコールを摂取すると、高血糖の影響とアルコール摂取の影響とは、相乗効果をもって現れる。その結果、末梢神経細胞内において、図２で示すような４−ＨＮＥの代謝分解が抑制された均衡状態（アルデヒドの高濃度蓄積状態）になりやすい。本発明の分類を基に考えると、グループ３と４とでは、ミトコンドリア内にアルデヒド体が蓄積する傾向となる。４−ＨＮＥはアルコールを飲む量に比例して蓄積されることが考えられるため、グループ３と４において、飲酒をしている糖尿病患者では、アルコール摂取量に比例して、末梢神経に障害が起こると予測できる。
【００２６】
（ポリオール代謝と遺伝子多型）
ポリオール代謝は、グルコースからソルビトールを経てフルクトースに変換される経路である。図４に示すように、高血糖状態では、ポリオール代謝が亢進し、神経細胞内において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比が上昇し、また、ＮＡＤＰＨが減少して、ＮＡＤＰが増加する。その結果、一酸化窒素（ＮＯ）が減少して組織が虚血状態になりやすく、還元型グルタチオン（ＧＳＤ）が減少し、酸化型グルタチオンが増加する傾向となる。このことは、酸化的ストレスを亢進させ、フリーラジカルの発生を高めることになる。このフリーラジカル産生増加が脂質過酸化を亢進させ、４−ＨＮＥやその他の脂質過酸化による毒性アルデヒドを増やし、これが細胞毒性を起こし、またミトコンドリア機能に対して障害を及ぼす。図４に示すように、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２が毒性アルデヒドを消去するため、糖尿病により高血糖状態になっても、生体的平衡（ホメオスターシス）を維持できる。しかし、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子は多型を示すため、毒性アルデヒドの消去にも個体によって程度に差が生じ、これが糖尿病および糖尿病合併症の発症等に影響を及ぼす。本発明の分類方法やマーカーは、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型から、細胞質およびミトコンドリアにおけるアルデヒド量を予測するから、この予測を基に、さらに糖尿病および糖尿病合併症の発症等を予測できる。
【００２７】
（アルドース還元酵素）
アルドース還元酵素は、アルデヒド還元酵素の一種であり、ポリオール代謝では、ブドウ糖をソルビトールに変換する。高血糖によるポリオール代謝の亢進は、神経障害を引き起こすおそれがある。したがって、アルドース還元酵素の阻害剤（インヒビター）は、糖尿病性神経障害に対する治療薬として有効であり、実際に臨床で使用されている。図４に示すように、アルデヒド還元酵素阻害剤は、グルコースからソルビトールへの代謝を阻害し、それによって、ソルビトールが減少し、結果として、フルクトースも減少する。その結果、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比等の酸化還元状態が変わる。また、ＮＡＤＰの生成も抑制するから、一酸化窒素の低下も抑制し、組織が虚血に陥ることを防止すると考えられている。一方、アルドース還元酵素は、図４に示すように、アルデヒドの代謝にも関与する。したがって、高血糖状態になってポリオール代謝の亢進によりアルドース還元酵素の需要が高まったり、またインヒビターによってアルドース還元酵素が阻害されたりすると、毒性アルデヒドの代謝に悪影響がでるおそれがある。実際、様々な種類のアルドース還元酵素阻害剤が、開発され、臨床応用が試みられたが、臨床治験の段階で副作用が確認されるなどから、開発が中止されている薬剤も多い。その副作用が特定臓器において、なぜ起こるのかの原因は解明されていない。しかし、アルドース還元酵素阻害剤が、上記で論じた毒性アルデヒドの影響を、ある特定臓器において強めたり、弱めたりしている可能性もある。また、一方、本発明者等が論文で報告している糖尿病患者の２例においては、アルドース還元酵素阻害剤を服薬すると、四肢のしびれを強く感じることがあった（鈴木吉彦，　松岡健平．「Ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ投与後下肢異常感覚が出現した症例　Ｅｐａｌｒｅｓｔａｔ　Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒか？」．現代医療２７巻増刊ＩＶ　Ｐａｇｅ３４１７−３４２０（１９９５．１１））。この２例は、グループ４に属しており、このようにＡＬＤＨ２の低活性およびＡＤＨ２の低活性の組み合わせが、アルドース還元酵素阻害剤の作用に対して強く影響を及ぼしうる群は、本分類のなかのいずれかの分類に傾向として集中しうる可能性がある。つまり、このように、アルドース還元酵素阻害剤の生体への作用を考える上でも、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型によりアルデヒドの代謝を考慮した本発明の分類方法およびマーカーは重要な意義を有する。本発明の分類方法およびマーカーを使用すれば、アルドース還元酵素阻害剤の生体への感受性を予め予測することができる。あるいは、副作用がおこりやすい患者を予め予測し、投薬の対象から除外することによって、アルドース還元酵素阻害剤は、副作用の少ない安全な薬剤として、糖尿病患者に服薬を勧めることができるようになる。
【００２８】
（ＡＧＥに対する影響）
細胞質内やミトコンドリア内で蓄積されたアルデヒド体は、他の物質と結合し、ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　（以下、ＡＧＥと略す）を生じやすくなる。あるいは、例えば、上記で示した４−ＨＮＥは、システインなどが有するＳＨ基と結合し、そのＳＨ基を有するたんぱく質の機能を低下させる場合もある。本分類によって、毒性アルデヒドが、組織内で及ぼすＡＧＥ作成あるいは、特定の部位への攻撃を、あらかじめ予測し、それによって治療法の選択に役立てることが可能である。また、ＡＧＥ阻害剤は、体内に蓄積したＡＧＥの生成を抑制することを目的として、糖尿病性合併症の予防薬として開発中であるが、それら薬剤の効果判定において、上記で示したグループ１から４の分類は、薬剤効果の反応性を決定する要因になりうるものである。
【００２９】
（酸化還元状態）
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比等の酸化還元状態は、ミトコンドリア内のＭｎ−ＳＯＤの活性に影響を及ぼす。また、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比等も、脂質過酸化などの誘導に影響を及ぼす。すなわち、細胞内の酸化還元状態は、様々な酵素反応や酵素活性を調節し、それによって酸化的ストレスを調節することが知られている。例えば、Ｍｎ−ＳＯＤはミトコンドリア内における酸化的ストレスを消去するのに重要な酵素である。また、スーパーオキシドと一酸化窒素は容易に反応しペルオキシナイトライトという反応性の高い物質にかわるが、Ｍｎ−ＳＯＤはミトコンドリア内のペルオキシナイトライトの生成を阻止している可能性も示唆されている。また、Ｍｎ−ＳＯＤの転写や翻訳の両段階においては酸化還元調節を受けており、外的刺激に対応してＭｎ−ＳＯＤの酵素活性は速やかに上昇し、このメカニズムによりミトコンドリアを保護している。一方、グルタチオンペルオキシダーゼの一種についても、その酵素に結合する蛋白質の中には、酸化還元状態によって、核に移行し転写因子として働くものがある。このようなことから、アルデヒド体の多少で規定されるミトコンドリア内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比の高低は、Ｍｎ−ＳＯＤの転写や翻訳、グルタチオンペルオキシダーゼ等の過酸化物無毒化酵素などの作用に影響を及ぼすと推定される。
【００３０】
（ピルビン酸および乳酸の産生と、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比）
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比の変化は、ピルビン酸と乳酸との産生に影響を及ぼす。一般に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比の上昇は、乳酸を増やしピルビン酸を減少させる（図４参照）。ピルビン酸は、細胞膜を自由に通過できるので、ミトコンドリア機能の低下した細胞は、ピルビン酸が供給されることによって、過還元状態を是正されていると推察できる。また、ピルビン酸は、過酸化水素と非酵素的に反応し、脱炭酸されて酢酸となるので、抗酸化剤としての作用もある。糖尿病においては、ポリオール代謝系の亢進によってピルビン酸が低下するため、このような作用が障害されやすいと考えられる。このピルビン酸の産生を左右するのが、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比、つまり酸化還元状態であるが、図４に示すように、この酸化還元状態が、ＡＬＤＨ２遺伝子とＡＤＨ２遺伝子との多型によりアルデヒド量の多少を介して調節を受けるとすると、糖尿病患者における高血糖の程度と併行する可能性があるといえる。ピルビン酸は、ミトコンドリア内のエネルギー代謝における重要な物質であり、ミトコンドリア内におけるピルビン酸の低下は、ＡＴＰ産生の低下にもつながる。
【００３１】
（高血糖状態および正常血糖状態）
糖尿病患者では、高血糖状態を長期間持続している場合が多い。このような患者において、糖尿病に関する正しい教育指導をうけ、食事療法や運動療法を遵守し、また血糖降下剤などの経口糖尿病治療薬などを治療的介入を受けると、血糖値は下がり、正常人と同じレベル（空腹時血糖値が１００ｍｇ／１００ｍｌ前後）に落ちつくものである。こうした治療介入を急激に起こすことにより、それまで高血糖状態で均衡を保っていた状態（高血糖時のホメオスターシス：図４参照）が、正常血糖のホメオスターシス（図５参照）に変化することになる。血糖値が正常レベルになることは、良いことであるが、それが急激であると、様々な不都合が生じると予測される。例えば、ポリオール代謝が低下してＮＡＤＰが低下し、一酸化窒素（ＮＯ）が増加するが、これがきっかけとなって、酸化的ストレスが増加することが考えられる。すなわち、ＮＯは、血管拡張作用を有するため、それまでの高血糖状態による組織内の低酸素状態あるいは虚血状態などが改善されるが、ＮＯは、スーパーオキシドと容易に反応し、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）という反応性の高い物質に変わる。ペルオキシナイトライトは、ミトコンドリアを損傷させたり、ラジカルを発生させ脂質過酸化を促進させる。また、虚血再潅流説（Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）によれば、低酸素あるいは虚血状態が急激に改善した場合には、フリーラジカルの産生も高まることが示唆されている。長期間の高血糖を放置した症例において、急激な血糖調節を行うと、時に、下肢のしびれ、下腿の浮腫、眼底出血などが起こる患者の群がいることが知られている。例えば、ミトコンドリア性糖尿病というミトコンドリア遺伝子異常（例えば塩基番号３２４３部位の変異）を有する糖尿病患者において、血糖調節後に下肢に疼痛が起こる例が多い（これについては、本発明者等は、米国糖尿病学会会誌に報告している。文献名：Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｐｏｓｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｄｉａｂｅｔｉｃｓ　ｗｉｔｈ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｔＲＮＡ^{（Ｌｅｕ）}　ｍｕｔａｔｉｏｎ．　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　１７：　７７７−７７８）。これらの症状は、高血糖時のホメトスターシスから正常血糖時のホメオスターシスへ（図４から図５）急激に変化することによって起こると推察される。このような場合、細胞質内およびミトコンドリアにおいて、アルデヒド量も急激に変化し、それに伴いＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋比も変化すると推察される。この調節には、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２が関与しているため、それらの遺伝子多型は、前記の治療後神経障害の発症や状態を予測する上で重要な意義を持つ。
【００３２】
（ミトコンドリ遺伝子の異常）
ミトコンドリア遺伝子異常（例えば塩基番号３２４３部位の変異）は、通常、末梢血の白血球や、筋肉で検出することができる。ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２は、末梢血内の白血球内に検出されるミトコンドリア遺伝子の変異量を制御するため、それらの多型が、ミトコンドリア遺伝子異常に関与していると推察できる。したがって、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型を基礎にした本発明の分類およびマーカーは、ミトコンドリア遺伝子異常を診断する上で有用である。
【００３３】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００３４】
２型糖尿病患者１５８名について、以下の方法により、ＡＬＤＨ２遺伝子とＡＤＨ２遺伝子の多型を調べ、前記表１の４つのグループに分類した。そして、前記患者１５８名につき、性別、遺伝的特性、糖尿病発症年齢、身体的データ（身長、体重等）、神経障害および網膜障害の各項目について、前記４つのグループで比較した。その結果を、下記の表３に示す。
【００３５】
（分析手法）
研究内容を説明した後、糖尿病患者から血液を研究に使用することに同意を得て、抹消血を採取した。血液の白血球より常法によって全ＤＮＡを抽出した。
【００３６】
ＡＤＨ２遺伝子多型はエクソン３部分をＰＣＲ法によって遺伝子断片を増幅し、制限酵素ＭａｅＩＩＩで切断後、２％アガロース電気泳動によって塩基配列の違いを判定した。ＭａｅＩＩＩで切断されたＤＮＡ断片は、ＡＤＨ２β２遺伝子配列を含み、切断されないＤＮＡ断片はＡＤＨ２β１遺伝子配列を含む。
【００３７】
（ＰＣＲの具体的条件）
溶液：５０μＬ
ＤＮＡ：１００ｎｇから２００ｎｇ程度
プライマー：各５ｐｍｏｌｅ
（５’−ＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’、５’−ＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧ−３’）
ｄＮＴＰ：５０μＭのｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＣＴＰ
ＭｇＣｌ_２：１．５ｍＭ
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１ｕｎｉｔ
反応条件：９４℃３０秒、５８℃２分、７２℃３０秒のサイクルを３５回くり返した。
【００３８】
ＡＬＤＨ２遺伝子多型は、エクソン１２部分をミスマッチＰＣＲ法によって遺伝子断片を増幅し、制限酵素ＥａｒＩで切断後、２．５％アガロース電気泳動によって塩基配列の違いを判定した。切断されたＤＮＡ断片はＡＬＤＨ２^１遺伝子配列を含み、切断されないＤＮＡ断片はＡＬＤＨ２^２遺伝子配列を含む。
【００３９】
（ＰＣＲの具体的条件）
溶液：５０μＬ
ＤＮＡ：１００ｎｇから２００ｎｇ程度
プライマー：５ｐｍｏｌｅ
（５’−ＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’、５’−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’）
ｄＮＴＰ：５０μＭのｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＣＴＰ
ＭｇＣｌ_２：１．５ｍＭ
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１　ｕｎｉｔ
反応条件：９４℃１５秒、５８℃１分３０秒、７２℃３０秒のサイクルを３５回くり返した。
【００４０】
【表３】

【００４１】
前記表３に示すように、各グループ（１〜４）間で、さまざまな特徴が確認できた。まず、末梢神経障害の知覚異常の頻度が、グループ４とそれ以外のグループとで有意な差があり、グループ４が顕著に高かった。また、糖尿病の母親をもつ患者の頻度や、３５歳未満で糖尿病を発病する患者の頻度が、グループ４では、他のグループと比較すると高値であった。これらの結果から、グループ４に分類された人は、母系遺伝により、ミトコンドリア遺伝子異常に関係した糖尿病の疾患表現形が遺伝しやすく、発症年齢も低いことが予測でき、また末梢神経障害がおこりやすと予測できる。一方、グループ１の場合は、糖尿病の血管障害に関係した合併症において特徴があった。すなわち、グループ１は、それ以外のグループよりも、タンパク尿や増殖性網膜症の頻度が高かった。
【００４２】
（実施例２）
糖尿病患者１４名について、ミトコンドリア遺伝子異常（３２４３変異）を、以下に示すＰＣＲ−ＲＥＦＰ法およびＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ法で検出すると共に、前述の方法により、前記表１の４つのグループに分類した。その結果を、下記の表４に示す。なお、前記ミトコンドリア遺伝子以上は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法によっても検出した。
【００４３】
（ＰＣＲ？ＲＦＬＰ法を用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出法）
１００から　２００　ｎｇ　の　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　を、　５　ｐｍｏｌ　の各プライマーとミックスさせた。各プライマーは、（５‘−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴ−３’　ｓｅｎｓｅ）および（５‘−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３‘　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）であり、５０μＭのｄＮＴＰ、１．５　ｍＭのＭｇＣｌ２、１　Ｕ　のＴａｇ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）をミックスさせ増幅させた。ＰＣＲ条件は、商品名ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，　Ｏａｋ　Ｂｒｏｏｋ，　ＩＬ）を用い、９４　℃１５　秒、５８　℃１分３０秒、７２℃３０　秒のサイクルを３５回繰り返した（Ｊ　Ｊａｐａｎ　Ｄｉａｂ　Ｓｏｃ　３８：４０１−４０４，　１９９５）。
【００４４】
（Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法を用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出および定量法）
末梢白血球から全ＤＮＡを抽出し、Ｈ鎖側に変異特異的プライマー３２４３Ｇ３’（５’−ＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣ−３’）を用い、対となるプライマーｃｏｍｍｏｎ　５’　（５’−ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＧＣＣ−３’）とでＰＣＲで増幅した。この方法はプライマー３’末端塩基にマッチした変異ＤＮＡは増幅されるが、ミスマッチの正常ＤＮＡは増幅されないという原理を利用した方法である。あらかじめＰＣＲ条件を検討し、９４℃１分、５７℃２分、７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した。反応系は、合計５０μｌで行い、プライマー各２５ｐｍｏｌ，　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　１００　ｎｇ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造）１．２５　Ｕを用いた（Ｊ　Ｊａｐａｎ　Ｄｉａｂ　Ｓｏｃ　３８：４０１−４０４，　１９９５）。
【００４５】
（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲを用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出および定量法）
ミトコンドリア遺伝子３２４３変異の検出において、プライマーは、ＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＣ　（３，０４８−３，０６６）　と　ＡＴＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣ　（３，２５８−３，２４３）　を用いた。ミトコンドリアＤＮＡの定量については、ＧＣＣＴＴＣＣＣＣＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴ　（３，１６３−３，１８３）　と　ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧ　（３，２９８−３，２７５）　を用いた。ＴａｇＭａｎ　プローブの塩基配列は、ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴ　（３，２４１−３，２１３）である。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣで純化し、コンタミネーションを防いだ。ＰＣＲ条件は、　９５℃１５秒、５１℃１０秒、５７℃１分の４０サイクルである。反応液には、　ＡＢＩ　ＴａｑＭａｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ，　０．０５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　２．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　ｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＴＴＰを各　０．１６ｍＭ，　Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ　（ＡＢＩ）を０．６　ｕｎｉｔｓ，　１００　ｎＭ　ＴａｑＭａｎ　プローブ、２００ｎＭ　の　ｆｏｒｗａｒｄ　と　ｒｅｖｅｒｓｅ　プライマーを、あるいは、３００　ｎＭ　のｆｏｒｗａｒｄ　プライマーと　１００　ｎＭ　のｒｅｖｅｒｓｅ　プライマーを含ませ、ミトコンドリアＤＮＡの定量のために用いた。（野見山、他。Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２００２）。
【００４６】
【表４】

【００４７】
前記表４に示すように、糖尿病患者１４名において、ミトコンドリア遺伝子異常（３２４３変異）をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法およびＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法の両方で検出できる患者８名中（ヘテロプラスミーは約１％以上と考えられる）、グループ１および３に属する患者は８名であった。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では検出しにくいがＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法では検出できた患者６名中、グループ１および３に属する患者は、３名であった。これらの結果は、ＡＤＨ２遺伝子の多型が、末梢血白血球内のミトコンドリア遺伝子異常のヘテロプラスミーと関係する事を示す。したがって、本発明の分類方法およびマーカーにより、ミトコンドリア性糖尿病か否かを判断できるといえる。
【００４８】
【発明の効果】
以上のように、本発明のマーカーおよび分類方法は、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価等に有用である。したがって、本発明のマーカーおよび分類方法を用いれば、例えば、糖尿病の発症リスク、発症年齢、合併症の予測、体質にあわせた治療薬の投与（テーラーメード医療）等が可能となる。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】高血糖状態のアルデヒドの代謝を示す図である。
【図２】アルデヒドが高濃度の場合の代謝を示す図である。
【図３】アルデヒドが低濃度の場合の代謝を示す図である。
【図４】高血糖状態のポリオール代謝を示す図である。
【図５】高血糖を長く続けていた糖尿病患者が、インスリン療法や経口血糖降下薬他、糖尿病治療薬などによって、短期間に、急激に血糖コントロールが改善した場合の、ポリオール代謝を上流として考えた影響を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a composite gene marker, a composite enzyme marker, and an individual classification method for diagnosing diabetes and diabetic complications and evaluating therapeutic agents.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is a disease that causes chronic systemic metabolic disorders and presents with hyperglycemia, diabetes, breakdown of body proteins, ketosis (ketonemia) and acidosis, and as the disease progresses, neurological disorders, retinal disorders, renal disorders or Complications such as heart failure occur. Diabetes has become a national disease reflecting the modern satiety era, and it is desired to establish effective preventive and therapeutic methods. As a diagnostic method for diabetes, an oral glucose tolerance test (OGTT) is generally used, and 1,5-AG, fructosamine (glycated albumin), HbA1c, and the like are used as diagnostic indices. On the other hand, coupled with the recent progress in genomic research, studies for understanding diseases at the gene level have become active, and among them, analysis of gene polymorphisms has led to the risk of onset at the individual level. Attempts have been made to predict. For example, in alcoholic diseases, a polymorphic combination of the aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) gene and the alcohol dehydrogenase 2 (ADH2) gene is used to deepen the understanding of the etiology (Reference: Arukoru). Kenkyuto Yakubutsu Ison 1995 Feb; 30 (1): 33-42 etc.). In addition, it has been reported that polymorphism analysis of the inactive ALDH2 gene can predict the risk of developing cancer in a person who consumes a large amount of alcohol (Reference: Cancer Epideniol Biomarkers & Prey 1996; 5: 99-102, etc.). ). In addition, the effect of alcohol intake on myocardial infarction has been examined by polymorphism analysis of the ADH3 gene (N Engl J Med, Vol. 344, No. 8 p549-555). Regarding Alzheimer's disease, the present inventors have proposed to predict the onset risk based on polymorphisms in the ALDH2 gene and the apolipoprotein E (APOE) gene (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-299297). However, understanding of diabetes at the genetic level is not sufficient, and implementation at the genetic level, such as diagnosis of diabetes and complications and evaluation of therapeutic agents, is not sufficient.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such circumstances, and provides a marker based on the understanding of diabetes at the gene level, which is useful for diagnosis of diabetes and diabetic complications, evaluation of therapeutic drugs, and the like. And its purpose.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to understand diabetes at the genetic level, the present inventors divided polymorphisms of the ALDH2 gene and the ADH2 gene into high-activity type and low-activity type, respectively, and classified individuals into four groups shown in Table 1 below. I got the idea of doing it. By further developing this idea, a theory was established for predicting the cytoplasmic and mitochondrial aldehyde concentrations for each group as shown in Table 2 below. When the theory was verified, they found that it is possible to theoretically explain the mechanism of diabetes and the like as described later. Based on this theory, they found that the polymorphisms of the ALDH2 gene and the ADH2 gene and the enzymes themselves expressed in accordance with these polymorphisms are useful as markers for diagnosing diabetes and diabetic complications and evaluating therapeutic drugs. Reached the present invention. Since the genetic polymorphism does not change during the life of the individual (from birth to death), according to the theory underlying the present invention, it is also possible to predict the state of the body before the onset of diabetes, Genetic prediction for offspring is also possible.
[0005]
(Table 1)
Group 1: a group having highly active ALDH2 and highly active ADH2
Group 2: Group having high-activity ALDH2 and low-activity ADH2
Group 3: a group having low-activity ALDH2 and high-activity ADH2
Group 4: a group having low-activity ALDH2 and low-activity ADH2
[0006]

[0007]
That is, the composite gene marker of the present invention is a composite gene marker for diagnosing diabetes and diabetic complications and evaluating a therapeutic agent, and includes a gene encoding a high-activity type or low-activity type ALDH2 and a high activity type or a low activity type. It is a composite gene marker containing a gene encoding active ADH2.
[0008]
Further, the complex enzyme marker of the present invention is a complex enzyme marker for diagnosing diabetes or diabetic complications or evaluating a therapeutic agent, and includes a high activity type or low activity type ALDH2 and a high activity type or low activity type ADH2. And a complex enzyme marker.
[0009]
Furthermore, the individual classification method of the present invention is a method of classifying individuals into the four groups shown in Table 1 using the marker of the present invention.
[0010]
Based on the above two composite markers, the individuals to be diagnosed can be classified into the four groups in Table 1 above, and the cytoplasmic and mitochondrial aldehyde levels of each of the classified individuals are predicted as shown in Table 2 above. can do. In the present invention, the individual is preferably a Mongoloid ethnic group, more preferably a Japanese, because the classification is suitable for a Mongoloid ethnic group and is particularly suitable for Japanese. The individual is, for example, a healthy person, a diabetic patient, or a person belonging to a boundary type region in a glucose tolerance test. Based on this prediction, it is possible to diagnose diabetes and diabetic complications and evaluate therapeutic agents. Examples of the diagnosis include prediction of diabetes onset probability and age of onset, prediction of mitochondrial gene mutation, prediction of neuropathy, prediction of retinal disorder, prediction of renal disorder, prediction of heart disorder, prediction of brain dysfunction, and the like. . The evaluation of the therapeutic agent includes, for example, an aldose reductase inhibitor, an advanced glycation end-products inhibitor, a Protein Kinase C inhibitor, a methylcobalamin preparation, an insulin sensitizer, an oral hypoglycemic agent (a sulfonylurea drug, ) And anti-oxidants including α-lipoic acid and the like. Examples of the insulin sensitizer include thiazolidine drugs which are considered to have an effect on PPARγ receptors. If the constitution of an individual is evaluated by the marker or the classification method of the present invention, the sensitivity to the drug can be predicted, and the drug can be administered by judging whether the individual is a responder, a mild responder or a non-responder. Therefore, according to the present invention, tailor-made medicine can be performed for diabetes and diabetic complications.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, the present invention will be described in detail.
[0012]
ALDH2 is one of the aldehyde dehydrogenase isozymes present in the mitochondria of cells. The ALDH2 gene is present at 12q24 of the human chromosome, and has a polymorphism of a point mutation from G to A (AAA; Lys) at the codon GAA of the 478th amino acid (Glu) located at exon 12 thereof, indicating that the normal type (G ) For ALDH2 ¹ The activity-deficient gene (A) is called ALDH2 ² That. In the present invention, the criteria for the high activity type and the low activity type of ALDH2 are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the use of the marker and the like. For example, ALDH2 ¹ The enzyme encoded by the gene has a high activity of converting acetaldehyde to acetic acid, whereas the enzyme encoded by ALDH2 ² The enzyme encoded by the gene has little enzymatic activity to convert acetaldehyde to acetic acid. This enzyme also forms tetramers (tetramers), of which ALDH2 ² If at least one protein encoded by the gene is included, the enzyme activity is lost. Therefore, in the marker of the present invention, for example, ALDH2 ¹ A homozygote of the gene and its enzyme (amino acid at position 478 is Glu) can be defined as a highly active form, otherwise, ALDH2 ² Gene / ALDH2 ¹ Heterozygotes of the gene and ALDH2 ² Gene / ALDH2 ² Homozygotes of genes and their enzymes (the 487th amino acid is Lys) can be defined as a low-activity form. However, this definition is only an example in the present invention.
[0013]
ADH is a dimer consisting of two subunits having a molecular weight of about 40 kDa, and a plurality of isozymes are known from the difference in the constituent subunits. The human ADH gene identified so far is located on chromosome I (4q21-25). ADH is classified into types I to IV based on biochemical properties. Generally, type I is involved in the metabolism of orally consumed alcohol, which is characterized by hydrolyzing short-chain alcohols such as ethanol and inactivating them by pyrazole. Type I ADH has three isozymes, ADH1, ADH2, and ADH3, which are the products of independent loci. ADH2 of the present invention is type I and is present in the cytoplasm. Genetic polymorphisms in Japanese are present in both ADH2 and ADH3 genes. There are three subunits of ADH2, β1, β2 and β3, where β1 is ADH ¹ The gene, β2, is ADH ² The gene, β3, is ADH ³ Each is encoded by a gene. ADH2 polymorphism is caused by a single base point mutation that changes the amino acid at the Zn and NAD binding sites, which are sites of interaction with the coenzyme. At the amino acid level, β2 is arginine at position 47 of β1 mutated to histidine. There is a difference in these enzyme activities, and β2β2 homozygotes show higher activity under physiological conditions than β1β1 homozygotes. In particular, β2β2 has a Vmax value that is 40 times that of β1β1 in vitro and is referred to as superactive ADH. In Japanese, superactive ADH is common. The criterion for distinguishing between the high-activity type and the low-activity type of ADH2 of the present invention is not particularly limited and is appropriately determined depending on the use of the marker and the like. For example, the highly active form is a gene encoding the superactive ADH (ADH2 encoding the β2 subunit). ² Gene is defined as a homozygote of the gene) and its enzyme (a homodimer of β2). ² ADH2 gene other than homozygote of the gene) and its enzyme (dimer other than β2 homodimer). However, this criterion is merely an example of the present invention.
[0014]
Next, the composite gene marker of the present invention can be detected, for example, by a method using a probe, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, and mismatch PCR.
[0015]
The probe has, for example, a DNA probe having a sequence complementary to a part or the whole of the base sequence of the ALDH2 gene, and a DNA probe capable of distinguishing between a high activity type and a low activity type of the gene and a base sequence of the ADH2 gene. There is a composite probe or the like having a sequence complementary to a part or all of the sequence, and including a DNA probe capable of distinguishing between the high activity type and the low activity type of the gene and detectable. Further, if the composite probe is applied to a DNA microarray (including a DNA chip), the composite gene marker of the present invention can be efficiently detected in a large number of individual samples.
[0016]
In the method using the RFLP analysis, for example, the ADLH2 gene and the ADH2 gene are amplified by PCR using predetermined primers, DNA polymerase, dNTP, and the like, the amplified product is treated with a restriction enzyme, and agarose electrophoresis is used. This is a method for comparing fragment lengths. This method can be made into a kit. This kit comprises primers, DNA polymerase and dNTPs used for amplifying the ADLH2 gene and the ADH2 gene by PCR, a restriction enzyme that cleaves the ALDH2 gene between the high-activity type and the low-activity type, and the high activity of the ADH2 gene. And a restriction enzyme that cleaves the type with low activity.
[0017]
Primers for PCR of the ALDH2 gene include, for example, a combination of 5′-CAAAATTACAGGGTCAAGGGCT-3 ′ (sense) and 5′-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3 ′ (antisense). Examples of the restriction enzyme include MboII and the like. There is.
[0018]
Examples of the primer for PCR of the ADH2 gene include a combination of 5′-AATCTTTTCTGGAATCTGAACAG-3 ′ (sense) and 5′-GAAGGGGGGTCACCAGGTTG-3 ′ (antisense), and examples of the restriction enzyme include MaeIII. There is.
[0019]
In addition, the gene marker of the present invention can also be detected by Allele-Specific PCR amplification (mismatch PCR), TaqMan PCR, or the like.
[0020]
The complex enzyme marker of the present invention can be detected with a reagent containing an antibody. Examples of the reagent include a reagent containing an antibody that specifically reacts with high-activity or low-activity ALDH2 and an antibody that specifically reacts with high-activity or low-activity ADH2. Examples of the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. Antibodies can be prepared by ordinary methods. For example, to prepare an antibody, ALDH2 is synthesized by chemically synthesizing a peptide in a region having a different amino acid sequence, covalently bonding the peptide to a polymer such as a protein, and immunizing a rabbit or mouse. ¹ And ALDH2 ² Antibodies that identify the proteins encoded by ADH2β1 and ADH2β2, respectively. By fusing the spleen cells of the immunized mice with the myeloma cells, a monoclonal antibody that recognizes each of the above proteins can be prepared. However, this method is only an example, and the present invention is not limited to this method.
[0021]
(Basic theory of the classification method of the present invention)
Next, the classification which forms the basis of the present invention will be described in detail with reference to Tables 1 and 2 and FIGS.
[0022]
(Classification concept of the present invention)
It is presumed that the four groups in Table 1 take the cytoplasmic and mitochondrial aldehyde amounts as shown in Table 2 above. First, focusing on aldehyde metabolism, in group 4, since both ALDH2 and ADH2 have low activity, aldehydes are less likely to be metabolized, and are more likely to accumulate in mitochondria and cytoplasm. On the other hand, in group 1, both enzymes are highly active, so that aldehydes are easily metabolized, and aldehydes hardly accumulate in cytoplasm and mitochondria. In group 2, the accumulation of aldehydes in mitochondria is low due to the high activity of ALDH2, and the accumulation of cytoplasmic aldehydes is high due to the low activity of ADH2. Group 3 shows the opposite trend in group 2 in aldehyde accumulation. Next, as shown in FIG. 1, when lipid peroxidation occurs due to hyperglycemia, aldehyde (4-hydroxy 2 nonenal: 4-HNE in FIG. 1) accumulates in the cells. The aldehyde is metabolized by ALDH2 and ADH2 into a carboxylic acid (4-hydroxy2 nonanoic acid: HNA in FIG. 1) and an alcohol (1,4-dihydroxynonone: 1,4DHN in FIG. 1). ⁺ Is consumed and NADH is generated. In ADH2, NADH is consumed and NAD is consumed. ⁺ Is generated. The reaction catalyzed by ADH2 is a reversible reaction, and it is only 4? HNE is converted to 1,4DHN. NADH required for the enzymatic reaction of ADH2 is covered by NADH generated when polyol metabolism is enhanced by hyperglycemia.
[0023]
(Characteristics of Group 4)
FIG. 2 shows a metabolic diagram of diabetes centered on aldehyde metabolism of group 4. As described above, in this group, the aldehyde (4-HNE in FIG. 2) is present at a high concentration. If the blood glucose level is high, polyol metabolism is enhanced and NADH is produced. However, since ADH2 is low in activity, it is not possible to consume much NADH, which is a factor in generating reactive oxygen species (ROS). . In addition, the presence of a high concentration of aldehyde impairs the mitochondrial membrane, resulting in a decrease in oxidative phosphorylation (OXPHOS) in the mitochondria and a decrease in ATP. In addition, the occurrence of ROS causes damage to mitochondrial DNA, induces apoptosis, decreases energy production (ATP), and adversely affects metabolism. In addition, it enhances free radical production from mitochondrial membranes and reduces insulin secretion from β cells of the pancreas. In addition, the characteristics (constitution) of these mitochondria are inherited by offspring by maternal inheritance, and a phenomenon occurs in which the onset age of diabetes becomes young. Also, in group 4, aldehydes accumulate at high concentrations in the cytoplasm and mitochondria, increasing sensitivity to other toxic substances (such as alcohol). Neuronal accumulation of 4-HNE inhibits Na-K ATPase, increases the sensitivity of nerves to oxidative stress, and tends to cause damage to nerves. As a result, neuropathy such as peripheral neuropathy is more likely to occur in diabetic patients.
[0024]
(Characteristics of Group 1)
FIG. 3 shows a metabolic diagram of diabetes mellitus centering on aldehyde metabolism of group 1. As described above, this group has a low concentration of aldehyde (4-HNE in FIG. 3). If the blood glucose level is high, the polyol metabolism is enhanced to produce NADH. However, since ADH2 is highly active, NADH is consumed, and less reactive oxygen species (ROS) are generated. Also, because of the low concentration of aldehyde, it has little effect on oxidative phosphorylation (OXPHOS) in mitochondria. In addition, since ROS does not frequently occur, mitochondrial DNA is less damaged, and even if damaged, it is repaired and normal cells proliferate. On the other hand, the low concentration of aldehyde means 4? HNE is likely to be low in concentration, and low concentration of 4? HNE increases the activity of protein kinase C (isozymes βI and βII), thereby causing ischemia (vascular disorders) and easily causing complications such as retinopathy and nephropathy (proteinuria and the like).
[0025]
(Relationship between alcohol metabolism and diabetes)
Many diabetic patients continue to drink alcohol on a daily basis. In such patients, when alcohol is metabolized to acetaldehyde and acetaldehyde is metabolized to acetic acid, NAD ⁺ Is used as a coenzyme and is reduced to NADH, whereby NADH / NAD ⁺ The ratio tends to rise. Moreover, since diabetic patients have high blood sugar, as shown in FIG. 2, NADH / NAD in the liver and peripheral nerves. ⁺ The ratio rises and is maintained. Therefore, when a diabetic patient consumes alcohol, the effects of hyperglycemia and the effects of alcohol consumption appear with a synergistic effect. As a result, in the peripheral nerve cells, the metabolic degradation of 4-HNE is easily suppressed as shown in FIG. 2 (the aldehyde accumulation state is high). Based on the classification of the present invention, in groups 3 and 4, aldehyde bodies tend to accumulate in mitochondria. Because 4-HNE is likely to accumulate in proportion to alcohol consumption, in groups 3 and 4, in diabetic patients who drink alcohol, peripheral nerve damage occurs in proportion to alcohol intake Can be predicted.
[0026]
(Polyol metabolism and genetic polymorphism)
Polyol metabolism is the pathway by which glucose is converted to fructose via sorbitol. As shown in FIG. 4, in a hyperglycemic state, polyol metabolism is enhanced, and NADH / NAD ⁺ The ratio increases, NADPH decreases, and NADP increases. As a result, nitric oxide (NO) decreases and the tissue tends to become ischemic, reduced glutathione (GSD) decreases, and oxidized glutathione tends to increase. This will increase oxidative stress and increase the generation of free radicals. This increase in free radical production enhances lipid peroxidation, increasing toxic aldehydes due to 4-HNE and other lipid peroxidations, which cause cytotoxicity and impair mitochondrial function. As shown in FIG. 4, ALDH2 and ADH2 scavenge toxic aldehydes, so that even if they become hyperglycemic due to diabetes, biological balance (homeostasis) can be maintained. However, since the ALDH2 gene and the ADH2 gene show polymorphism, the degree of elimination of toxic aldehyde varies depending on individuals, and this affects the onset of diabetes and diabetic complications. Since the classification method and the marker of the present invention predict the amount of aldehyde in the cytoplasm and mitochondria from the polymorphism of the ALDH2 gene and the ADH2 gene, it is possible to further predict the onset of diabetes and diabetic complications based on this prediction.
[0027]
(Aldose reductase)
Aldose reductase is a type of aldehyde reductase and converts glucose to sorbitol in polyol metabolism. Increased polyol metabolism due to hyperglycemia may cause neuropathy. Therefore, inhibitors (inhibitors) of aldose reductase are effective as therapeutic agents for diabetic neuropathy, and are actually used clinically. As shown in FIG. 4, aldehyde reductase inhibitors inhibit the metabolism of glucose to sorbitol, thereby reducing sorbitol and consequently fructose. As a result, NADH / NAD ⁺ The redox state such as the ratio changes. In addition, since the production of NADP is also suppressed, it is considered that the decrease in nitric oxide is also suppressed and the tissue is prevented from falling into ischemia. On the other hand, aldose reductase is also involved in aldehyde metabolism, as shown in FIG. Therefore, when a hyperglycemic state occurs and the polyol metabolism is increased, the demand for aldose reductase is increased, or when the aldose reductase is inhibited by an inhibitor, the metabolism of toxic aldehyde may be adversely affected. In fact, various types of aldose reductase inhibitors have been developed and clinical applications have been attempted, but many drugs have been discontinued due to their side effects being confirmed at the stage of clinical trials. The reason why the side effect occurs in specific organs has not been elucidated. However, aldose reductase inhibitors may enhance or attenuate the effects of the toxic aldehydes discussed above in certain organs. On the other hand, in two diabetic patients reported by the present inventors in a paper, numbness of the limbs was sometimes felt strongly when taking an aldose reductase inhibitor (Yoshihiko Suzuki, Kenhei Matsuoka. "Case where abnormal sensation of lower limbs appeared after administration of Aldose reductase inhibitor? Is it Epalrestat Responder?", Vol. These two cases belong to Group 4, and the group in which the combination of the low activity of ALDH2 and the low activity of ADH2 can strongly influence the action of the aldose reductase inhibitor belongs to this class. It may be possible to concentrate as a tendency on any of the classifications. In other words, the classification method and the marker of the present invention in which the aldehyde metabolism is considered by the polymorphisms of the ALDH2 gene and the ADH2 gene also have an important significance in considering the effect of the aldose reductase inhibitor on the living body. By using the classification method and the marker of the present invention, the sensitivity of an aldose reductase inhibitor to a living body can be predicted in advance. Alternatively, by predicting patients who are likely to have side effects in advance and excluding them from medication, the aldose reductase inhibitor can be recommended to diabetics as a safe drug with few side effects.
[0028]
(Impact on AGE)
Aldehyde bodies accumulated in the cytoplasm or mitochondria are likely to bind to other substances and generate advanced glycation end-products (hereinafter abbreviated as AGE). Alternatively, for example, the above-described 4-HNE may bind to the SH group of cysteine or the like and reduce the function of the protein having the SH group. According to this classification, it is possible to predict in advance the generation of AGE or the attack on a specific site caused by a toxic aldehyde in a tissue, and thereby to use it in selecting a treatment method. In addition, AGE inhibitors are being developed as preventive agents for diabetic complications for the purpose of suppressing the generation of AGE accumulated in the body. Classification of 4 can be a factor in determining the reactivity of the drug effect.
[0029]
(Redox state)
NADH / NAD ⁺ The redox state, such as the ratio, affects the activity of Mn-SOD in mitochondria. The NADPH / NADP ratio also affects the induction of lipid peroxidation. That is, it is known that the intracellular redox state regulates various enzyme reactions and enzyme activities, thereby regulating oxidative stress. For example, Mn-SOD is an important enzyme for eliminating oxidative stress in mitochondria. In addition, it is suggested that Mn-SOD may prevent the production of peroxynitrite in mitochondria, although superoxide and nitric oxide easily react and replace a highly reactive substance called peroxynitrite. . In addition, both the transcription and translation stages of Mn-SOD are under redox regulation, and the enzymatic activity of Mn-SOD rapidly increases in response to external stimuli, and mitochondria are protected by this mechanism. . On the other hand, as for a kind of glutathione peroxidase, some of the proteins that bind to the enzyme move to the nucleus and act as transcription factors depending on the redox state. Therefore, NADH / NAD in mitochondria defined by the number of aldehydes ⁺ It is presumed that the change in the ratio affects the transcription and translation of Mn-SOD, and the action of peroxide detoxifying enzymes such as glutathione peroxidase.
[0030]
(Pyruvate and lactate production and NADH / NAD ⁺ ratio)
NADH / NAD ⁺ Changes in the ratio affect the production of pyruvate and lactic acid. Generally, NADH / NAD ⁺ Increasing the ratio increases lactic acid and decreases pyruvate (see FIG. 4). Since pyruvate can freely pass through the cell membrane, it can be inferred that the cells with reduced mitochondrial function are corrected for the hyperreduced state by the supply of pyruvate. In addition, pyruvate reacts non-enzymatically with hydrogen peroxide and is decarboxylated to form acetic acid, which also acts as an antioxidant. In diabetes, pyruvate decreases due to an increase in the polyol metabolic system, so that such an effect is likely to be impaired. The production of pyruvate is influenced by NADH / NAD ⁺ As shown in FIG. 4, if the redox state is regulated via the amount of aldehyde by a polymorphism between the ALDH2 gene and the ADH2 gene, as shown in FIG. It can be said that there is a possibility that this may be accompanied by the degree of blood sugar. Pyruvate is an important substance in energy metabolism in mitochondria, and a decrease in pyruvate in mitochondria also leads to a decrease in ATP production.
[0031]
(Hyperglycemia and normoglycemia)
In diabetic patients, a hyperglycemic state is often maintained for a long time. In such patients, if they receive proper education and guidance on diabetes, adhere to diet and exercise therapy, and undergo therapeutic intervention such as antihyperglycemic drugs such as antihyperglycemic drugs, their blood sugar levels will decrease and normal patients will have lower blood sugar levels. It is settled at the same level (fasting blood glucose level is around 100 mg / 100 ml). By rapidly initiating such intervention, the state of equilibrium in the hyperglycemic state (homeostasis during hyperglycemia: see FIG. 4) changes to homeostasis of normoglycemia (see FIG. 5). become. It is good that the blood sugar level becomes a normal level, but if it is abrupt, various inconveniences are expected to occur. For example, it is considered that polyol metabolism decreases, NADP decreases, and nitric oxide (NO) increases. This may trigger oxidative stress to increase. That is, since NO has a vasodilatory effect, a hypoxic state or an ischemic state in the tissue due to the hyperglycemic state up to that time is improved, but NO easily reacts with superoxide to form peroxynitrite. (ONOO ⁻ ). Peroxynitrite damages mitochondria and generates radicals to promote lipid peroxidation. In addition, according to the ischemia-reperfusion hypothesis, it is suggested that when hypoxia or ischemia rapidly improves, the production of free radicals also increases. It is known that there is a group of patients who sometimes suffer from numbness of the lower limbs, edema of the lower leg, ocular fundus bleeding, etc. when rapid blood glucose control is performed in a case in which hyperglycemia is left for a long period of time. For example, in a diabetic patient having a mitochondrial gene abnormality called mitochondrial diabetes (for example, mutation at base number 3243), pain often occurs in the lower limbs after blood glucose control (for this, the present inventors have reported in the Journal of the American Diabetes Society). Reference name: Suzuki, Y et al. (1994) Posttreatment neuropathy in diabetics with mitochondrial tRNA. ^(Leu) Mutation. Diabetes Care 17: 777-778). It is presumed that these symptoms are caused by a sudden change from homeostasis during hyperglycemia to homeostasis during normoglycemia (FIGS. 4 to 5). In such a case, the amount of aldehyde rapidly changes in the cytoplasm and in mitochondria, and accordingly, NADH / NAD ⁺ It is presumed that the ratio also changes. Since ALDH2 and ADH2 are involved in this regulation, their genetic polymorphisms have important significance in predicting the onset and condition of the above-mentioned post-treatment neuropathy.
[0032]
(Abnormal mitochondrial gene)
Abnormal mitochondrial genes (for example, mutations at base number 3243) can usually be detected in leukocytes and muscle of peripheral blood. Since ALDH2 and ADH2 control the amount of mitochondrial gene mutation detected in leukocytes in peripheral blood, it can be inferred that those polymorphisms are involved in mitochondrial gene abnormalities. Therefore, the classifications and markers of the present invention based on the polymorphisms of the ALDH2 gene and the ADH2 gene are useful for diagnosing mitochondrial gene abnormalities.
[0033]
【Example】
Next, examples of the present invention will be described.
[0034]
For 158 type 2 diabetic patients, polymorphisms of the ALDH2 gene and the ADH2 gene were examined by the following method, and classified into the four groups shown in Table 1 above. Then, for the 158 patients, gender, genetic characteristics, age of onset of diabetes, physical data (height, weight, etc.), neuropathy and retinal disorder were compared in the four groups. The results are shown in Table 3 below.
[0035]
(Analysis method)
After explaining the study, peripheral blood was collected from the diabetic with consent to use the blood for the study. Total DNA was extracted from leukocytes of blood by a conventional method.
[0036]
The ADH2 gene polymorphism was obtained by amplifying a gene fragment of exon 3 by PCR, cutting with a restriction enzyme MaeIII, and determining a difference in base sequence by 2% agarose electrophoresis. The DNA fragment digested with MaeIII contains the ADH2β2 gene sequence, and the DNA fragment not digested contains the ADH2β1 gene sequence.
[0037]
(Specific conditions for PCR)
Solution: 50 μL
DNA: about 100 ng to 200 ng
Primers: 5 pmole each
(5'-AATCTTTCTGAATCTGAACAG-3 ', 5'-GAAGGGGGGTCACCAGGTTG-3')
dNTP: 50 μM dATP, dGTP, TTP, dCTP
MgCl ₂ : 1.5 mM
TaqDNA polymerase: 1 unit
Reaction conditions: A cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 2 minutes and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 35 times.
[0038]
The ALDH2 gene polymorphism was obtained by amplifying a gene fragment of exon 12 by mismatch PCR, cutting with a restriction enzyme EarI, and then determining the difference in base sequence by 2.5% agarose electrophoresis. The cut DNA fragment is ALDH2 ¹ The DNA fragment containing the gene sequence and not being cleaved is ALDH2 ² Includes gene sequence.
[0039]
(Specific conditions for PCR)
Solution: 50 μL
DNA: about 100 ng to 200 ng
Primer: 5 pmole
(5'-TTACAGGGTCAACTGCTATG-3 ', 5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3')
dNTP: 50 μM dATP, dGTP, TTP, dCTP
MgCl ₂ : 1.5 mM
Taq DNA polymerase: 1 unit
Reaction conditions: A cycle of 94 ° C for 15 seconds, 58 ° C for 1 minute and 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was repeated 35 times.
[0040]
[Table 3]

[0041]
As shown in Table 3, various characteristics could be confirmed among the groups (1 to 4). First, there was a significant difference between Group 4 and the other groups in the frequency of perceptual abnormalities of peripheral neuropathy, and Group 4 was significantly higher. In addition, the frequency of patients having a diabetic mother and the frequency of patients developing diabetes before the age of 35 were higher in Group 4 than in the other groups. Based on these results, those who were classified into group 4 could be predicted to have a low risk of mitochondrial genetic phenotypes associated with mitochondrial gene abnormalities, a low age of onset, and peripheral neuropathy due to maternal inheritance. Can be predicted. On the other hand, Group 1 was characterized by complications related to diabetic vascular disorders. That is, Group 1 had a higher frequency of proteinuria and proliferative retinopathy than the other groups.
[0042]
(Example 2)
For 14 diabetic patients, mitochondrial gene abnormalities (3243 mutations) were detected by the following PCR-REFP method and Allele-Specific PCR method, and classified into the four groups in Table 1 by the above-described method. The results are shown in Table 4 below. The mitochondrial gene and above were also detected by TaqMan PCR.
[0043]
(Method of detecting mitochondrial DNA 3243 mutation using PCR? RFLP method)
100-200 ng of genomic DNA was mixed with 5 pmol of each primer. Each primer was (5'-CAAAATTCAGGGTCAAGGGCT-3'sense) and (5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3'antisense), 50 μM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 U Tag DNA polymerase, Promega, Promega WI) was mixed and amplified. As for the PCR conditions, a cycle of 94 ° C. for 15 seconds, 58 ° C. for 1 minute 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 35 times using GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Oak Brook, Ill.) (J Japan Diab). Soc 38: 401-404, 1995).
[0044]
(Detection and quantification of mitochondrial DNA 3243 mutation using Allele-Specific PCR amplification method)
Total DNA was extracted from peripheral leukocytes, and PCR was carried out using the mutation-specific primer 3243G3 '(5'-TTTTATGCCGATTACCGGGGCC-3') on the H chain side and a primer 5 '(5'-AGGACAAGAGAAAATAAGCC-3') as a counterpart primer. Amplified. This method is based on the principle that a mutant DNA that matches the 3 ′ terminal base of the primer is amplified, but a mismatched normal DNA is not amplified. The PCR conditions were examined in advance, and a cycle of 94 ° C. for 1 minute, 57 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 35 times. The reaction was carried out in a total of 50 μl, using 25 pmol of each primer, 100 ng of genomic DNA, and 1.25 U of Recombinant Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo) (J Japan Diab Soc 38: 401-404, 1995).
[0045]
(Detection and quantification of mitochondrial DNA 3243 mutation using TaqMan PCR)
In detection of the mitochondrial gene 3243 mutation, ATTAAAGTCCTACGTGATC (3,048-3,066) and ATGCGAATTACCGGGGCC (3,258-3,243) were used as primers. For quantification of mitochondrial DNA, GCCTTCCCCCGTAAATGADATA (3,163-3,183) and GAAGAGGAATTGAACCTCTGACTG (3,298-3,275) were used. The nucleotide sequence of the TagMan probe is TGCCATCTTAACAAACCCTGTTCTTGGGGTT (3,241-3,213). Oligonucleotides were purified by HPLC to prevent contamination. The PCR conditions were 95 ° C. for 15 seconds, 51 ° C. for 10 seconds, and 57 ° C. for 1 minute for 40 cycles. The reaction solution was ABI TaqMan buffer A, 0.05% glycerol, 2.5 mM MgCl2, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 0.16 mM each, Ampli Taq Gold (ABI) 0.6 units, and 100 nM AnM. Probes were included for the quantification of mitochondrial DNA with the inclusion of 200 nM forward and reverse primers, or 300 nM forward and 100 nM reverse primers. (Nomiyama, et al. Diabetologia, in press, 2002).
[0046]
[Table 4]

[0047]
As shown in Table 4, among the 14 diabetic patients, the mitochondrial gene abnormality (3243 mutation) was detectable by both the PCR-RFLP method and the Allele-Specific PCR amplification method (heteroplasmy was about 1%). Probably the above), 8 patients belonged to groups 1 and 3. Among the six patients that were difficult to detect by the PCR-RFLP method but were detected by the Allele-Specific PCR amplification method, three patients belonged to Groups 1 and 3. These results indicate that the polymorphism in the ADH2 gene is associated with heteroplasmy of mitochondrial gene abnormalities in peripheral blood leukocytes. Therefore, it can be said that the classification method and the marker of the present invention can determine whether or not mitochondrial diabetes is present.
[0048]
【The invention's effect】
As described above, the marker and the classification method of the present invention are useful for diagnosis of diabetes and diabetic complications, evaluation of therapeutic drugs, and the like. Therefore, by using the marker and the classification method of the present invention, for example, the risk of onset of diabetes, age of onset, prediction of complications, administration of a therapeutic drug according to the constitution (tailor-made medicine), and the like can be performed.
[0049]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the metabolism of aldehyde in a hyperglycemic state.
FIG. 2 is a diagram showing metabolism when aldehyde is at a high concentration.
FIG. 3 is a diagram showing metabolism when aldehyde is at a low concentration.
FIG. 4 is a diagram showing polyol metabolism in a hyperglycemic state.
[Fig. 5] Considering the polyol metabolism as the upstream in the case where a diabetic patient who has continued hyperglycemia for a long time has rapidly improved blood glucose control in a short period of time by insulin therapy, oral hypoglycemic drugs, and other diabetes treatment drugs, etc. FIG.

Claims (25)

糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカーであって、高活性型若しくは低活性型のアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）をコードする遺伝子および高活性型若しくは低活性型のアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）をコードする遺伝子を含む複合遺伝子マーカー。A complex gene marker for diagnosing diabetes and diabetic complications and evaluating a therapeutic agent, comprising a gene encoding a highly active or low active aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) and a high active or low active type A composite gene marker comprising a gene encoding alcohol dehydrogenase 2 (ADH2). 診断対象の個体を、下記表１の４つのグループに分類するための請求項１記載の複合遺伝子マーカー。
（表１）
グループ１：高活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ２：高活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ３：低活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ４：低活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループThe composite gene marker according to claim 1, for classifying the individual to be diagnosed into four groups shown in Table 1 below.
(Table 1)
Group 1: Group having highly active ALDH2 and highly active ADH2 Group 2: Group having highly active ALDH2 and low active ADH2 Group 3: Group having low active ALDH2 and highly active ADH2 Group 4: Low activity Group having type ALDH2 and low activity type ADH2 グループ１から４に分類された各個体の細胞質（厳密には細胞質内にミトコンドリアも含まれるため、ここで表現する細胞質とは細胞質サイトゾルの意味だが、以下では細胞質として簡略し表現する）およびミトコンドリアのアルデヒド量を、下記表２に記載のように予測するための請求項２記載の複合遺伝子マーカー。

The cytoplasm of each of the individuals classified into groups 1 to 4 (strictly speaking, mitochondria are included in the cytoplasm, so the cytoplasm expressed here means cytosolic cytosol, but is simply abbreviated as cytoplasm below) and mitochondria The composite gene marker according to claim 2, for predicting the amount of aldehyde as shown in Table 2 below.

高活性型ＡＬＤＨ２遺伝子は、４７８番目アミノ酸のコドンがＧＡＡ（Ｇｌｕ）であるＡＬＤＨ２^１遺伝子のホモ接合体であり、
低活性型ＡＬＤＨ２遺伝子は、４７８番目のアミノ酸のコドンがＡＡＡ（Ｌｙｓ）であるＡＬＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体若しくはＡＬＤＨ２^１遺伝子とＡＬＤＨ２^２遺伝子のヘテロ接合体であり、
高活性型ＡＤＨ２遺伝子は、β２サブユニットをコードするＡＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体であり、
低活性型ＡＤＨ２遺伝子は、前記ＡＤＨ２^２遺伝子のホモ接合体以外のＡＤＨ２遺伝子の接合体である請求項１から３のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。Highly active ALDH2 gene, codon 478 th amino acid is homozygous for ALDH2 ¹ gene is GAA (Glu),
Low active ALDH2 gene, 478 amino acid codon homozygous or ALDH2 ¹ gene and ALDH2 ² gene heterozygous for ALDH2 ² gene is AAA (Lys),
Highly active ADH2 gene is a homozygous ADH2 ² genes encoding the β2-subunit,
Low active ADH2 gene complex genetic marker according to any one of claims 1-3 which is conjugates of ADH2 genes other than homozygotes of the ADH2 ² gene. 診断対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項２から４のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。The composite gene marker according to any one of claims 2 to 4, wherein the individual to be diagnosed is a Mongoloid ethnic group. 糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測に使用される請求項１から５のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。Any one selected from the group consisting of prediction of diabetes onset and age at onset, prediction of mitochondrial gene mutation, prediction of neuropathy, prediction of retinal disorder, prediction of renal disorder, prediction of cardiac disorder and prediction of cerebral dysfunction The composite gene marker according to any one of claims 1 to 5, which is used for one prediction. アルドース還元酵素阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　　−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項１から６のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。Efficacy in each individual of at least one drug of the group consisting of an aldose reductase inhibitor, a Protein Kinase C inhibitor, an Advanced glycation end-products inhibitor, a methylcobalamin preparation, an insulin sensitizer, a hypoglycemic agent and an antioxidant The composite gene marker according to any one of claims 1 to 6, which is used to predict 請求項１から７のいずれかに記載の複合遺伝子を検出するための複合プローブであって、
ＡＬＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型を区別して検出可能なＤＮＡプローブと、
ＡＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型とを区別して検出可能なＤＮＡプローブとを含む複合プローブ。A composite probe for detecting the composite gene according to any one of claims 1 to 7,
A DNA probe having a sequence complementary to part or all of the base sequence of the ALDH2 gene, and capable of distinguishing between the high-activity type and the low-activity type of the gene,
A composite probe having a sequence complementary to a part or all of the base sequence of the ADH2 gene, and comprising a DNA probe capable of distinguishing between a high activity type and a low activity type of the gene and detectable. 請求項８記載の複合プローブを有するＤＮＡマイクロアレイ。A DNA microarray having the composite probe according to claim 8. 請求項１から７のいずれかに記載の複合遺伝子マーカーを検出する方法であって、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を利用した方法。A method for detecting the composite gene marker according to any one of claims 1 to 7, wherein the method utilizes restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. 請求項１０記載の検出方法に使用するキットであって、
ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅する際に使用するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと、
ＡＬＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別できる制限酵素と、
ＡＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別できる制限酵素とを含むキット。A kit for use in the detection method according to claim 10,
Primers, DNA polymerase and dNTP used for amplifying ADLH2 gene and ADH2 gene by PCR;
A restriction enzyme capable of distinguishing between a high activity type and a low activity type of the ALDH2 gene;
A kit comprising a restriction enzyme capable of distinguishing between a high activity type and a low activity type of the ADH2 gene. 糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための複合酵素マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）および高活性型若しくは低活性型のアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）を含む複合酵素マーカー。Highly active or lowly active aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) and highly or lowly active alcohol dehydrogenases, which are complex enzyme markers for diagnosis or evaluation of therapeutic agents for diabetes and diabetic complications 2 (ADH2). 診断対象の個体を、上記表１の４つのグループに分類するための請求項１２記載の複合酵素マーカー。13. The complex enzyme marker according to claim 12, for classifying the individual to be diagnosed into the four groups shown in Table 1 above. グループ１から４に分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測するための請求項１３記載の複合酵素マーカー。14. The complex enzyme marker according to claim 13, for predicting the cytoplasmic and mitochondrial aldehyde levels of each of the individuals classified into groups 1 to 4, as shown in Table 2 above. 高活性型ＡＬＤＨ２のアミノ酸配列では、４７８番目アミノ酸がＧｌｕであり、
低活性型ＡＬＤＨ２のアミノ酸配列では、４７８番目のアミノ酸がＬｙｓであり、
高活性型ＡＤＨ２は、β２サブユニットのホモダイマーであり、
低活性型ＡＤＨ２は、β２サブユニットのホモダイマー以外のダイマーである請求項１２から１４のいずれかに記載の複合酵素マーカー。In the amino acid sequence of highly active ALDH2, the 478th amino acid is Glu,
In the amino acid sequence of the low-activity ALDH2, the amino acid at position 478 is Lys;
Highly active ADH2 is a homodimer of β2 subunit,
The complex enzyme marker according to any one of claims 12 to 14, wherein the low-activity ADH2 is a dimer other than a homodimer of the β2 subunit. 診断対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項１２から１５のいずれかに記載の複合酵素マーカー。The complex enzyme marker according to any one of claims 12 to 15, wherein the individual to be diagnosed is a Mongoloid ethnic group. 糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測に使用される請求項１２から１６のいずれかに記載の複合酵素マーカー。Any one selected from the group consisting of prediction of diabetes onset and age at onset, prediction of mitochondrial gene mutation, prediction of neuropathy, prediction of retinal disorder, prediction of renal disorder, prediction of cardiac disorder and prediction of cerebral dysfunction 17. The complex enzyme marker according to any one of claims 12 to 16, which is used for one prediction. アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項１２から１７のいずれかに記載の複合酵素マーカー。Efficacy in each individual of at least one drug of the group consisting of aldose reductase inhibitors, advanced glycation end-products inhibitors, protein kinase C inhibitors, methylcobalamin preparations, insulin sensitizers, hypoglycemic agents and antioxidants The complex enzyme marker according to any one of claims 12 to 17, which is used for predicting the following. 請求項１２から１８のいずれかに記載の複合酵素マーカーを検出するための試薬であって、
高活性型若しくは低活性型ＡＬＤＨ２と特異的に反応する抗体と、
高活性型若しくは低活性型ＡＤＨ２と特異的に反応する抗体とを含む試薬。A reagent for detecting the complex enzyme marker according to any one of claims 12 to 18,
An antibody that specifically reacts with high-activity or low-activity ALDH2;
A reagent comprising a highly active or low active form ADH2 and an antibody which specifically reacts with ADH2. 抗体がモノクローナル抗体である請求項１９記載の試薬。The reagent according to claim 19, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための個体分類方法であって、請求項１から２０のいずれかに記載のマーカーを用いて、個体を上記表１の４つのグループに分類する方法。An individual classification method for diagnosing diabetes or diabetic complications or evaluating a therapeutic drug, wherein the individual is classified into the four groups in Table 1 using the marker according to any one of claims 1 to 20. Method. グループ１から４に分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測するための請求項２１記載の分類方法。22. The classification method according to claim 21, for predicting the cytoplasmic and mitochondrial aldehyde levels of each of the individuals classified into groups 1 to 4 as shown in Table 2 above. 分類対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項２１または２２に記載の分類方法。The classification method according to claim 21 or 22, wherein the individual to be classified is a Mongoloid ethnic group. 糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測のために使用される請求項２１から２３のいずれかに記載の分類方法。Any one selected from the group consisting of prediction of diabetes onset and age at onset, prediction of mitochondrial gene mutation, prediction of neuropathy, prediction of retinal disorder, prediction of renal disorder, prediction of cardiac disorder and prediction of cerebral dysfunction The classification method according to any one of claims 21 to 23, which is used for one prediction. アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項２１から２４のいずれかに記載の分類方法。Efficacy in each individual of at least one drug of the group consisting of aldose reductase inhibitors, advanced glycation end-products inhibitors, protein kinase C inhibitors, methylcobalamin preparations, insulin sensitizers, hypoglycemic agents and antioxidants 25. The classification method according to any one of claims 21 to 24, which is used for predicting.

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