JP2004081001A - METHOD FOR EXAMINING MUTATION OF Arx GENE RELATED TO X-LINKED LISSENCEPHALY - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はＸ染色体連鎖性滑脳症に関連する変異を有するＡｒｘ遺伝子、この変異遺伝子を利用したＸ染色体連鎖性滑脳症に関連する遺伝子変異の検査法、およびＸ染色体連鎖性滑脳症に関連する変異を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド等に関する。具体的には、Ｘ染色体連鎖性滑脳症の患者に特異的に見られるＡｒｘ遺伝子（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ）が有する塩基配列中の変異、該変異によりＡｒｘ蛋白質が有するアミノ酸配列に生じる変異、これらの変異の有無を指標とするＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子の変異を検査する方法、該検査方法に利用されるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む試薬キット、Ｘ染色体連鎖性滑脳症に特異的な変異Ａｒｘ蛋白質と反応する抗体、さらにはＸ染色体連鎖性滑脳症特異的な変異を有するＡｒｘ遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子及びこれを含む形質転換体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｘ染色体連鎖性滑脳症（以下、これを「ＸＬＡＧ」と称することがある）は、１９９４年にＢｅｒｒｙ−ＫｒａｖｉｓとＩｓｒａｅｌにより新規のＸ染色体連鎖性滑脳症候群として報告され（Ｂｅｒｒｙ−ＫｒａｖｉｓとＩｓｒａｅｌ， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５， ９０−９２ （１９９４））、その後１９９９年Ｄｏｂｙｎｓ等により詳細に解析された（Ｄｏｂｙｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８６， ３３１−３３７ （１９９９））。その後引き続きいくつかの論文によりその表現型が確認されている（Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ９４， １７４−１７６ （２０００）， Ｂｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５１， ３４０−３４９ （２００２））。罹患患者はいずれも男性の遺伝子型を有しており、重症の先天性もしくは生後の小頭症、滑脳症、脳梁の形成不全、新生児期に発症した難治性癲癇、体温調節不全、慢性の下痢、および生殖器の形成不全ないし発達不全を伴っていた。ＸＬＡＧにおける滑脳症は皮質の厚さがわずか６〜７ｍｍであることから、ＬＩＳ１遺伝子及びＤＣＸ遺伝子、あるいはＲＥＬＮの変異による古典的な滑脳症（Ｒｅｉｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６４， ７１７−７２１ （１９９３） ； ｄｅｓ Ｐｏｒｔｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ９２， ５１−６１ （１９９８） ； Ｇｌｅｅｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ９２， ６３−７２ （１９９８） ； Ｈｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２６， ９３−９６ （２０００））とは明らかに異なるものである。加えて、ＸＬＡＧの大脳白質は古典的滑脳症と比較して非常に未成熟である。しかし、現在までＸＬＡＧと連関する遺伝子上の変異は検出されていなかった。
【０００３】
一方、Ａｒｘ遺伝子（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ：ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ関連ホメオボックス遺伝子）はＸ染色体連鎖性であり、マウス胎仔の場合、前脳、底板および精巣に発現する（Ｍｉｕｒａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６５， ９９−１０９ （１９９７））。しかし、該遺伝子の詳細な機能については未だ解明されていなかった。近年Ａｒｘ遺伝子がＸ染色体連鎖性の精神遅滞と癲癇を伴う、１形態の原因遺伝子であることが報告されている（Ｓｔｒｏｍｍｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．， ３０， ４４１−４４５ （２００２）； Ｂｉｅｎｖｅｎｕ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．， １１，９８１−９９１ （２００２））。これらの報告に見られる大部分の患者は、重度の精神遅滞や乳児期けいれんを含む強度の癲癇等の神経異常を示す点においてＸＬＡＧと類似するが、その症状は軽度であり、長期の生存を示す。他は癲癇を伴わないＸ連鎖精神遅滞とジストニア（失調症）を有している。ＸＬＡＧに類似した脳や生殖器の奇形をもつものはいないことから、これらは表現型上異なる症候群を形成している。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、重篤な脳の構造および機能異常を示すＸ染色体連鎖性滑脳症 （ＸＬＡＧ）の明確な診断のための手段、およびＸＬＡＧの発症のメカニズムを解析するための手段を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、前脳と精巣の形成におけるＡｒｘ蛋白質の機能を明らかにするためＡｒｘ遺伝子欠損マウスを作製した。該マウスは雄が致死性であり、その表現型がＸＬＡＧに酷似していた。つまり前脳における細胞増殖抑制とそれに伴う領域性の欠損を原因とする脳の小型化および精巣分化の異常が、Ａｒｘ遺伝子欠損雄胎仔マウスで観察された。さらに神経節***と新皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの異常な移動と分化も、Ａｒｘ遺伝子欠損雄胎仔マウスで観察された。この結果から、生殖器異常を伴うＸＬＡＧの臨床的特徴をモデル動物において一部再現することに成功した。本発明者らはこの知見を基礎にＸＬＡＧの患者のＡｒｘ遺伝子を解析したところ、９検体の全てにおいてそのＡｒｘ遺伝子に変異を見出した。本発明はこられの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
つまり本発明は、以下からなる発明を提供する。
１．Ａｒｘ遺伝子が有する塩基配列中のＸ染色体連鎖性滑脳症に特有の変異の有無を指標にすることを特徴とするＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子の変異の検査方法。
２．変異が、Ａｒｘ遺伝子中のエクソンＩＩ〜ＩＶの何れか一に存在し、かつ該変異により３’側のトリプレットコドンの読み枠に変異が生じる前項１の検査方法。
３．変異が、Ａｒｘ遺伝子中のエクソンＩＩ〜ＩＶの何れか一に存在し、かつ該変異により終止コドンとなる前項１の検査方法。
４．変異が、以下の少なくとも一から選択される前項１〜３の何れか一に記載の検査方法。
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番が欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番が欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）上記（３）の塩基番号１１１７番の置換がシトシンからチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）上記（９）の塩基番号９９５番の置換がグアニンからアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）上記（１１）の塩基番号１０２８番の置換がチミンからアデニンに置換しているもの
５．変異が、少なくとも一つのアミノ酸レベルでの置換をもたらす請求項１の検査方法。
６．変異が、以下の少なくとも一から選択される前項５の検査方法。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番をコードする塩基配列に変異があるもの
（２）上記（１）のアミノ酸番号３３２番のアルギニンがヒスチジンに置換しているもの
（３）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番をコードする塩基配列に変異があるもの
（４）上記（３）のアミノ酸番号３４３番のロイシンがグルタミンに置換しているもの
７．前項１〜６の何れか一に記載の方法に用いられる検査用ＤＮＡ断片であって、Ｘ染色体連鎖性滑脳症に特有の変異を基礎にして設計された検査用ＤＮＡ断片。
８．ポリメラーゼチェインリアクションに用いられるプライマーである前項７のＤＮＡ断片。
９．配列番号１に示す塩基配列の塩基番号４２０〜４５１、７９０、９９５、１０２８、１１１７、１１８８、１３７２番、エクソンＩおよび／またはエクソンＩＩの少なくとも一を含むＤＮＡ断片を増幅できることを特徴とする前項８のＤＮＡ断片。
１０．配列番号３〜１７の少なくとも一に表された塩基配列を含む前項８のＤＮＡ断片。
１１．配列表の配列番号３〜１７に記載の塩基配列と相補配列からなるもの、配列番号３〜１７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるもの、これらの配列または配列番号３〜１７に表される塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列の少なくとも一を含む前項９のＤＮＡ断片。
１２．前項７〜１１の何れか一に記載のＤＮＡ断片を含むＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子の変異検査用試薬キット。
１３．Ａｒｘ遺伝子である配列番号１の塩基配列を含み、かつ該配列中に以下の少なくとも一の変異を有するポリヌクレオチド；
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番の欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番の欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）上記（３）の塩基番号１１１７番の置換がシトシンからチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）上記（９）の塩基番号９９５番の置換がグアニンからアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）上記（１１）の塩基番号１０２８番の置換がチミンからアデニンに置換しているもの
１４．前項１３の少なくとも一の塩基配列によりコードされるポリペプチド。
１５．前項１４に記載のポリペプチドと反応するが、健常人のＡｒｘ蛋白質とは反応しないことを特徴とする抗体。
１６．前項１４に記載のポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列又は前項１３に記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列を含む組み換え用ＤＮＡ分子、及びこれの何れか一を含む形質転換体。
１７．Ｘ染色体連鎖性滑脳症患者のＡｒｘ遺伝子が有する塩基配列を解析し、健常者の配列と異なる部分を同定することを特徴とするＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子の変異の検査方法に用いられる変異箇所の同定方法。
１８．Ａｒｘ遺伝子が有する塩基配列中の前項１７に記載の方法により同定された変異の有無を指標とすることを特徴とするＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子上の変異の検査方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）Ａｒｘ遺伝子解析
本発明の１は、ＸＬＡＧの可能性のある個体から、Ａｒｘ遺伝子を含むＤＮＡを抽出し、該Ａｒｘ遺伝子が有する塩基配列中のＸ染色体連鎖性滑脳症に特有の変異を検出することを特徴とするＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子の変異の検出方法、すなわちＸＬＡＧの遺伝子診断方法である。
ＸＬＡＧの可能性のある個体とは、ＸＬＡＧが発症する家系にある個体が挙げられる。具体的には、ヒトで該家系にある女性や、男性であることが判明した胎児等が挙げられる。Ａｒｘ遺伝子は、Ｍｉｕｒａ， ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６５，９９−１０９（１９９７））に記載のとおり前脳、底板および精巣に発現する遺伝子であり、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００６１０３）、ヒト（ゲノム：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＣ００２５０４、ｃＤＮＡ：ＡＹ０３８０７１）およびゼブラフィッシュ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００６１０４）等でクローニングされている。具体的にはヒトのＡｒｘ遺伝子のｃＤＮＡ配列について配列表の配列番号１、また配列番号２にアミノ酸配列を示した。
【０００８】
ＸＬＡＧ患者のＡｒｘ遺伝子（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ関連ホメオボックス遺伝子）が有する塩基配列中における変異を指標にし、健康人配列との差異を分析すれば、ＸＬＡＧ（Ｘ染色体連鎖性滑脳症）に関連するＡｒｘ遺伝子上の変異の検査を可能とする。変異は、後述する塩基配列、アミノ酸配列における変異が明瞭なＸＬＡＧに関連するＡｒｘ遺伝子の変異と推定できるが、これら以外にも、Ａｒｘ遺伝子の上記の解析により同定されるＸＬＡＧ特有の変異はかなりの確かさでＸＬＡＧとの関連が推定可能である。そして、少なくとも既知の１）Ｘ染色体連鎖性幼児痙攣症候群、２）パーティントン症候群、３）Ｘ染色体連鎖性非症候群性精神遅滞での変異とは区別することで、より確かさをもってＡｒｘ遺伝子の変異とＸＬＡＧの関連が推定可能である。
【０００９】
検査における指標としては、例えば以下における変異等が挙げられる。変異が、Ａｒｘ遺伝子中のエクソンＩＩ〜ＩＶの何れか一に存在する置換・欠失・挿入・付加の何れかである場合。そしてこの変異が、該変異により３’側のトリプレットコドンの読み枠に変異が生じる場合。さらにこれらの変異が、該変異により終止コドンとなる場合等である。
具体的な変異マーカーとしては、例えば以下のものが挙げられる。
【００１０】
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番の欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番の欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番のシトシンがチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番のグアニンがアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番のチミンがアデニンに置換しているもの
【００１１】
さらに、具体的な変異のうち少なくとも一つのアミノ酸レベルでの変異をもたらす場合としては以下がある。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番に変異があるもの
（２）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番のアルギニンがヒスチジンに置換しているもの
（３）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番に変異があるもの
（４）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番のロイシンがグルタミンに置換されているもの
【００１２】
上記したＡｒｘ遺伝子のＸＬＡＧ特有の変異の検査方法としては、（１）ＸＬＡＧの可能性のある個体からＤＮＡを精製し、（２）該ＤＮＡのＡｒｘ遺伝子をそれ自体既知の通常用いられる方法によって解析することによって行うことができる。
ＸＬＡＧの可能性のある個体から精製するＤＮＡは、Ａｒｘ遺伝子を含むものであれば如何なるものであってもよく、ゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。ここで、ｃＤＮＡを取得するためには、Ａｒｘ遺伝子が発現している限られた組織を得る必要があるため、ゲノムＤＮＡが好ましく用いられる。ＤＮＡを精製するために上記個体から取得される生体試料としては、生体から取得することが容易であり、Ａｒｘ遺伝子を含むＤＮＡを含有するものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、血液に含まれる白血球細胞や、毛髪、生体材料組織、手術切除組織が用いられる。また、出生前の個体の場合には羊水中の胎児由来の細胞、絨毛、血液、皮膚、肝細胞、母体血液中の胎児由来細胞、あるいは母体子宮腔内のフラッシング溶液中の胎児由来細胞等が用いられる。このうち、羊水中の細胞はほとんどが死滅しているので、培養を行い、培養細胞を生体試料として用いる。これらの生体試料からのＤＮＡの取得は、それ自体既知の通常用いられる方法を用いて行うことができる。
【００１３】
かくして得られたＤＮＡについて、Ａｒｘ遺伝子上の上記した変異を解析する方法としては、Ｎｏｌｌａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４３， １１１４−１１２０（１９９７）、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９６））、および「ＰＣＲ」第２版（Ｎｅｗｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９７））等に記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えばＡ）ＰＣＲ断片シークエンシング法、Ｂ）一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Ｏｒｉｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６（８）， ２７６６−２７７０（１９８９））、Ｃ）ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｖ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６（１）， ２３２−２３６（１９８９））、Ｄ）インベーダー法（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １８， ７７（２０００））、Ｅ）ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｆ）タックマンＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ， Ｋ． Ｊ．， Ｇｅｎｅｌ． Ａｎａｌ．， １４， １４３（１９９９）； Ｍｏｒｒｉｓ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３４， ２９３３（１９９６））、Ｇ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９６（１１）， ６３０１−６（１９９９））、Ｈ）制限酵素長多型解析法（ＲＦＬＰ：Ｍｕｒｒａｙ， Ｊ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８０（１９）， ５９５１−５９５５（１９８３））、Ｉ）ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Ｋｏｋｏｒｉｓ， Ｋ．，ｅｔａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ．， ３６， ７３０（１９９９））、Ｊ）Ｍａｓｓｃｏｄｅ ＴＭ法（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等に例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではなく、遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。
【００１４】
このうち、例えば、Ａ）ＰＣＲ断片シークエンシング法は、取得したＤＮＡを鋳型として、Ａｒｘ遺伝子の上記の変異を含む断片をＰＣＲにより増幅した後に、これを適当な方法によりシークエンシングして変異の有無を解析する方法である。具体的には、例えば配列番号１の塩基番号７９０が欠失している変異については、実施例に示すとおり、配列番号８と配列番号６に記載の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した断片をシークエンスして７９０番の塩基が欠失しているか否かを解析する。ここで、用いられるプライマーとしては、Ａｒｘ遺伝子の上記の変異部分を含むＤＮＡ断片を増幅し得るものが用いられる。具体的には、例えばヒトＡｒｘ遺伝子の全てのエクソンを増幅し得るプライマーとして、配列番号３〜１７に記載のものが挙げられる。
【００１５】
また、Ｉ）ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法においては、例えば、Ａｒｘ遺伝子の上記変異部分を含む５〜１０ベースの塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをガラス基盤などに固定した後に、取得したＤＮＡを適当な蛍光物質などで標識してこれに接触させ、ハイブリダイズした場合、変異を有すると判断することができる。ここで、基盤に固定化するポリヌクレオチドとしては、Ａｒｘ遺伝子の上記変異部分を含む塩基配列、または上記変異部分に４種のアリルを有する配列に相補的な配列を有するものが用いられる。
【００１６】
Ｇ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法においては、取得したＤＮＡのＡｒｘ遺伝子の上記変異を有する塩基配列の１塩基隣の塩基までを有する適当な長さのポリヌクレオチドをＰＣＲなどにより増幅し、これに変異部分が伸長されるようなプライマーを用いてプライマーエクステンションを行い、この前後の分子量をマススペクトルなどを用いて解析し、野生型と異なる分子量を示した場合、変異を有すると判断することができる。ここで用いられるプライマーは、Ａｒｘ遺伝子の上記変異の１塩基程度隣接する塩基配列からなるＤＮＡ断片に対し、変異部分を伸長し得る配列を有するものが用いられる。
【００１７】
本発明には、Ａｒｘ遺伝子の上記変異を検出するために、変異を基礎にして設計された上記方法で用いられる全てのポリヌクレオチド、プライマー、あるいはプローブなどが含まれる（本明細書中では、これらを「検査用ＤＮＡ断片」と称することがある）。また、これらの検査用ＤＮＡ断片には、必要であれば適当な蛍光物質などにより修飾したものも含まれる。
【００１８】
本発明においては、上記変異に関する情報をもとに、既知遺伝子変異検出手段と組み合わせ、さらに各検出手段所望の検出試薬と前記選択される検査用ＤＮＡ断片等を組合わせれば、好適なＸ染色体連鎖性滑脳症に関連するＡｒｘ遺伝子上の変異の検査用試薬キットが提供される。
【００１９】
（２）Ａｒｘ遺伝子のＸＬＡＧ特有の変異を有するポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、並びに組み換え蛋白質
上記（１）の検査法により指標とされる変異を有するＡｒｘ遺伝子であるポリヌクレオチド（以下、これを「変異Ａｒｘポリヌクレオチド」と称することがある）は、これを用いて通常のＤＮＡ組換え法を行うことにより組換えポリペプチド（以下、これを「変異Ａｒｘポリペプチド」と称することがある）を調製することができる。該ポリヌクレオチドは、ＸＬＡＧの患者が生体内に有しているＡｒｘ蛋白質と同様のものである可能性が極めて高いため、ＸＬＡＧの研究に非常に有用である。
変異Ａｒｘポリヌクレオチドとしては、ヒトの配列として、配列番号１に記載の塩基配列において、上記（１）の検査法により指標とされる変異を有するものが挙げられる。具体的な変異としては、例えば、以下のものが挙げられる。
【００２０】
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番の欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番の欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番のシトシンがチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番のグアニンがアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番のチミンがアデニンに置換しているもの
【００２１】
さらに、具体的な変異のうち少なくとも一つのアミノ酸レベルでの変異をもたらす場合としては以下がある。
（１）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番に変異があるもの
（２）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番のアルギニンがヒスチジンに置換しているもの
（３）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番に変異があるもの
（４）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番のロイシンがグルタミンに置換されているもの
【００２２】
このようなポリヌクレオチドとしては、Ａｒｘ遺伝子の全長を含むものに限らず、少なくとも１つの上記変異を有するものであれば如何なるものでもよい。また、これらのポリヌクレオチドは、ＸＬＡＧの個体から上記（１）に記載した方法により取得したＤＮＡからＰＣＲなどの方法により調製したものでもよいし、野生型のＡｒｘ遺伝子を有する個体から取得したＤＮＡにそれ自体既知の通常用いられる方法により変異を導入して作製することもできる。さらには、化学合成により取得することもできる。
上記変異Ａｒｘポリヌクレオチドは、これを含む組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入し、該導入宿主を適当な条件下で培養した培養物から組み換え蛋白質を抽出する方法等が挙げられる。組み換え蛋白質を発現するためのベクターとしてはこれを導入する宿主内で変異Ａｒｘポリヌクレオチドまたはそれを含むポリヌクレオチドが発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いる。また、プラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
【００２３】
具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。また、ｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山和夫、細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール、ｐ．２５９，
秀潤社、（１９９３））等も好ましく用いられる。
【００２４】
変異Ａｒｘ ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、宿主が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。またほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、変異Ａｒｘポリヌクレオチドに固有のプロモーターを用いることもできる。
【００２５】
これらのベクターへの変異Ａｒｘポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチドまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターと変異Ａｒｘポリヌクレオチドとの間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．， Ｇｅｎｅ， ２３４， １８７， （１９９９））を挿入したり、変異Ａｒｘポリヌクレオチドの下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
７， ５８０， （１９８９））等が挙げられる。
【００２６】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ５５１（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１５， １６６（１９８２））、電気パルス法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ７１６１（１９８４））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７２， ５８１（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ， ３７， １０５３（１９８４））、あるいはリポフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製））等によって適当な宿主に導入される。
【００２７】
このとき、該組み換えベクターを導入する宿主としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ変異Ａｒｘポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばＡｃＮＰＶ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ． Ｖｉｏｌ． ， ２６， ２９１（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４２１６（１９８０））やアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション）等が挙げられる。
【００２８】
上記したような組み換えベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した変異Ａｒｘポリヌクレオチドを宿主の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７， ２０３６（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １１， ７３９（１９９４））等を用いて発現させることができる。
【００２９】
組み換えベクターを導入した導入体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、ＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １， １１７， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＨａｍ−１２培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）等を挙げることができる。また、培養は通常温度２０℃〜４５℃、ＣＯ２濃度２〜１０％の範囲で行うことが好ましい。培養時間は、宿主及び組み換えベクター等によって適宜選択することができるが、好ましくは１２〜８０時間である。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入された変異Ａｒｘポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されればいかなるものであってもよい。
【００３０】
このようにして培養された導入体の回収方法は、例えば宿主が細胞である場合には、培養物を遠心分離等により細胞を分離した後、細胞体あるいは培養上清として回収する方法等が用いられる。回収された細胞体からの組み換え蛋白質の抽出方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられるが、例えば、細胞をリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に懸濁した後に、等量のサンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）、０．２％ ｂｒｏｍｏｐｈａｎｏｌ ｂｌｕｅ（ＢＰＢ））を添加して９８℃で１〜１０分間ボイルする方法等が挙げられる。
【００３１】
また、上記変異Ａｒｘポリヌクレオチドは、公知の無細胞蛋白質合成系等によっても組み換え蛋白質を調製することができる。無細胞蛋白質合成系に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌等の微生物、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等、既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ， Ｈａｍｅｓ， １７９−２０９， Ｂ． Ｄ． ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。
【００３２】
市販の細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。
【００３３】
抽出された蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により分離し、適当な染色試薬、例えば、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）等によりゲルを染色することにより確認することができる。また、後述する本発明の蛋白質の抗体との結合性を解析することによってもその発現状態を確認することができる。
【００３４】
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体または他の塩に変換することができる。この様な塩も本発明の蛋白質に含まれる。また、上記した導入宿主が産生する蛋白質を、精製前または後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾蛋白質とすることができる。これらの修飾蛋白質も（１）に記載したＸＬＡＧ特有の変異を有するＡｒｘポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドである限り本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
（３）抗変異Ａｒｘポリペプチド抗体
（１）に記載したＸＬＡＧ特有の変異を有するＡｒｘポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが有するアミノ酸配列のうち、野生型と異なる部分を抗原とすることにより、変異Ａｒｘポリヌクレオチドと反応するが、健常人のＡｒｘ蛋白質とは反応しないことを特徴とする抗変異Ａｒｘポリペプチド抗体を調製することができる。
【００３６】
抗変異Ａｒｘポリペプチド抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができる。抗原として用いられるポリペプチドは、（１）に記載したＸＬＡＧ特有のアミノ酸配列の変異箇所を含む部分ペプチドが用いられる。
【００３７】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明の変異Ａｒｘ蛋白質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリア蛋白質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００３８】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００３９】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００４０】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
【００４１】
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）とＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）、あるいはＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３由来のハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４ （ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ． Ｚｉｍｍｅｒ− ｍａｎｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， ６８， ５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００４２】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００４３】
かくして取得される抗変異Ａｒｘポリペプチド抗体は、エピトープとした部分ポリペプチドまたは変異Ａｒｘ蛋白質には反応するが、健常人から得られる野生型のＡｒｘ蛋白質には反応しないことを上記のＥＬＩＳＡなどで確認することにより本発明の抗変異Ａｒｘポリペプチド抗体として取得される。
【００４４】
また、本発明の蛋白質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３５， ２５６−２５９ （１９８８）； Ｄｕｃｈｏｓａｌ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ２５８−２６２ （１９９２）。
【００４５】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子ＤＮＡをクローニングして、この遺伝子ＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００４６】
かくして得られる本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体は、本発明の蛋白質に特異的に結合することによってＸＬＡＧの発症メカニズムの解明等に有用である。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１）Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの作製
Ａｒｘ蛋白質の発現を抑制するため、ＬａｃＺ遺伝子を挿入してＡｒｘ遺伝子のエクソンＩＩを分断し、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスを作製した。
Ａｒｘ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして用いて、マウスＡｒｘ遺伝子を１２９ＳＶｊマウスゲノムライブラリー （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からクローン化した（Ｍｉｕｒａら， Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６５，９９−１０９ （１９９７））。５種類の独立したゲノムクローンを単離し、シークエンス解析でエクソン／イントロン構造を確認した。ターゲティングベクターの構築にはレポーター遺伝子カセットＩＲＥＳ−ＬａｃＺを使用した。Ａｒｘ蛋白質の翻訳終結を生じさせる停止コドンをＩＲＥＳの前に挿入した。ホメオボックスのＡｒｔＩＩ部位の３’−位置にあるＳＴＯＰ−ＩＲＥＳ−ＬａｃＺカセットと４．５ｋｂ ＡｒｔＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントおよびｐＫＪ２のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントをライゲートし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩにサブクローン化した。さらに、ホメオボックスのＡｒｔＩＩ部位の５’−位置にある２．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ−ＡｒｔＩＩフラグメントとＴＫ遺伝子カセットをこの順序でコンストラクトに挿入した。
【００４９】
（ＥＳ細胞トランスフェクション、スクリーニングおよびＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウスの作製）
標的ＥＳ細胞を得るため、１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞系Ｅ１４ＴＧ２ａにおいてポジティブ−ネガティブセレクション法を用いた。ターゲットベクターに含まれるゲノム配列とＮｅｏの外側に５’プローブと３’プローブを用いて、サザンブロットのパターンによりＥＳコロニーをスクリーニングした。その結果、３００クローンのうち２２のＥＳクローンに相同的組換えが起こったことがわかった。陽性ＥＳクローンをＣ５７ＢＬ胚盤胞にインジェクトし、偽妊娠している雌レシピエントに移植した。その結果得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬの雌と交配した。ターゲットＡｒｘ遺伝子座のトランスミッションは、サザンブロットのパターンから確認した。以下の分析に用いたＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウス（Ｘ＊はＡｒｘ遺伝子が欠損したＸ染色体を示す；以下、これを「Ａｒｘ遺伝子欠損マウス」と称することがある）は、Ｆ２ ＡｒｘＸ＊ＹマウスとＦ２ ＡｒｘＸＹマウスの交雑より得た。２つの独立した標的ＥＳ細胞系由来のＡｒｘＸ＊Ｙ半接合体は、区別のつかない表現型を示した。
【００５０】
ＡｒｘＸ＊Ｘヘテロ接合型雌マウスとＡｒｘＸＹ野生型雄マウスとの交配により、標準的なメンデル率に従った４種類のゲノム型マウス（ＡｒｘＸＸ：ＡｒｘＸ＊Ｘ：ＡｒｘＸＹ：ＡｒｘＸ＊Ｙ）が誕生した。ＡｒｘＸ＊Ｙ半接合型の突然変異雄マウスは、生後半日以内、胎生１９．５日に死亡した。ＡｒｘＸ＊Ｙ変異の新生仔マウス脳は野生型に比べて小さかった。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの嗅球は小さく異常な形状を呈していた。また、新生仔Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣のサイズも野生型に比べて小さかったのに対し、Ａｒｘ遺伝子欠損マウス精巣の精細管直径は大きかった。同様に、精嚢の形成不全、ウォルフ管の派生物が観察された。外性器、精巣上体および精管などの生殖管ではこれ以外の明白な差は観察されなかった。生後の脳の発達の研究の為、プロジェステロンの投与により分娩を遅らせ、帝王切開にて胎生２０．５日で胎仔を回収した。生まれた変異個体は３日間人工飼育して生後３日（Ｐ３ｈｆ）で解析した。
【００５１】
ＡｒｘＸ＊Ｘヘテロ接合型雌マウスはやや肥満傾向にあるが、生殖可能であった。胎仔脳の組織学的所見では、頭部腹側中央部の視床に形成不全がある以外は、正常であった。本検討では、ＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウスにおける、脳の小型化、大脳皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの移動と分化、神経節***および精巣分化に焦点を当てた。その結果、前脳における細胞増殖抑制とそれに伴う領域性の欠損を原因とする脳の小型化が、Ｘ染色体連鎖性Ａｒｘ遺伝子欠損雄胎仔マウスで観察された。さらに神経節***と新皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの異常な移動と分化も、Ｘ染色体連鎖性Ａｒｘ遺伝子欠損雄胎仔マウスで観察された。精巣分化にもまた異常がみられた。こうした結果は、生殖器異常を伴うＸ染色体連鎖性滑脳症 （ＸＬＡＧ）の臨床的特徴を一部再現するものであることを確認できた。
【００５２】
（実施例２） Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの特徴の解析
１）新皮質における神経上皮細胞の増殖抑制とほぼ正常な移動
Ａｒｘ蛋白質の発現が胎生１２．５日、で背側終脳（大脳皮質および海馬）、大脳基底部（内側方神経節***（ＭＧＥ）および側方神経節***（ＬＧＥ））、***視床および腹側視床において認められた（ ＭｉｕｒａらによるＡｒｘ遺伝子の発現パターン， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６５， ９９−１０９ （１９９７））。ＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウスはＡｒｘ遺伝子が発現しているそれぞれの領域において異常な形態を持っていた。
本発明者等は脳の小型化の原因を調べるため、まず大脳皮質における細胞増殖と視床の中の領域欠損について解析した。その結果、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの皮質板（ＣＰ）は野生型のそれに比べ胎生１９．５日では薄かった。
新皮質の脳室体（ＶＺ）中の神経上皮細胞の増殖を調べる為に、胎生１２．５日でのＢｒｄＵ一回投与の実験を行い、側方大脳皮質について解析した。その結果、野生型と変異型の側方新皮質の脳室体のラベリングインデックス（ＬＩ）はそれぞれ４３．１±４．２％と３８．８±３．０％であった。野生型と変異型の新皮質の脳室体のａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔの中でのＢｒｄＵ陽性細胞数は２４３±７と１９３±１５であった。野生型と変異型の胎生１２．５日における新皮質の脳室体のラベリングインデックスおよびＢｒｄＵ細胞数に関しては統計学的には有為差があるが、その差は小さかった。
そこで新皮質の脳室体における神経上皮細胞の増殖を、胎生１４．５日と胎生１８．５日で調べた。胎生１４．５日における野生型と変異型の側方新皮質の脳室体のラベリングインデックスは各々５８．６±７．６％および３６．６±４．０％であった。さらに野生型と変異型の新皮質の脳室体のａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔの中でのＢｒｄＵ陽性細胞数は３４５±２３および２３０±３７であった。そして変異型の新皮質の脳室体は野生型に比べ薄かった。胎生１８．５日では野生型と変異型の側方新皮質の脳室体のラベリングインデックスに類似の違いはなかった。胎生１４．５日と１８．５日での変異型大脳皮質に、変異型に特異なアポトーシスは検出されなかった。一方、変異型脳室下領域のＰ３ｈｆにおいて散発的にこれが見られた。これらの知見は、変異型での胎生期マウスの薄い大脳皮質は活性化アポトーシスに依存するというよりは、むしろ変異型の大脳皮質、とくに側方大脳皮質の全体的な新皮質の脳室体中の神経上皮細胞の増殖の減少（非加速型）によることを示唆している。
【００５３】
Ａｒｘ遺伝子欠損マウスにおける皮質の層形成を調べる目的で、ＢｒｄＵ／一回投与／追跡実験を行った。ＢｒｄＵを胎生１２．５日、１３．５日、１４．５日に投与し、脳を１４．５日に固定した。実験の各ステージでの変異個体のＢｒｄＵ取り込みパターンでは、胎生１９．５日における皮質形成パターンはマウスにおける皮質の分化の最終段階というよりはむしろ中間段階であることを示しているとはいうものの、複製や逆位といった皮質層のメジャーな異常は見られなかった。しかしながらＡｒｘ遺伝子欠損マウス胎生１３．５日でのラベル化ＢｒｄＵ陽性細胞の皮質板への移動は野生型より正確性が低下していた。この観察は、グルタミン酸陽性神経細胞が野生型のＰ３ｈｆでの皮質板のＶ層に制御下位置するのに対し、変異型のＰ３ｈｆでの皮質板がＩＩ層からＶ層に分散されるという観察からも支持された。
従って、本実験においては、変異個体における、神経上皮細胞の皮質板における移動は投射ニューロン部分以外についてはほぼ正常であることを示している。
【００５４】
２）領域欠損と神経繊維経路の異常
Ａｒｘ遺伝子の欠損は胎生１２．５日の視床***におけるＷｎｔ８ｂおよびＬｈｘ９の発現欠損をきたした。Ａｒｘ遺伝子の欠損はまた胎生１２．５日の腹部視床におけるＤｌｘ１の発現の領域が顕著に減少するという結果をもたらした。これらの消失は胎生１９．５日において、背側−腹側中央部視床核たとえば背側−中央視床核と中央視床核の大部分の欠損をきたした。このことはＡｒｘ蛋白質が背側−腹側中央部視床の形成において、Ｗｎｔ８ａ、Ｌｈｘ９やＤｌｘ１の上流の制御因子として機能していることを示唆する。視床の部分的な発育不全が第３脳室の拡大につながっている。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスでの海馬の発育不全、特に歯状回とＣＡ３領野における発育不全が、胎生１９．５日において見られた。
【００５５】
多くの神経繊維経路がＡｒｘ遺伝子欠損マウスにおいて異常形成を示した。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの脳梁は胎生１９．５日において、嘴尾軸に沿って短縮化をともなう形態異常を示した。短くなった脳梁はＡｒｘ遺伝子欠損マウスのＰ３ｈｆでもやはり異常が見られた。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスにおいて、内包に向かっての視床皮質軸は扁桃付近に位置を占めるという異常な経路にそって伸展していた。これはおそらくＡｒｘ遺伝子欠損マウスにおける腹側視床の部分的欠損に依存しているであろう。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスにおける視床皮質軸もまた同じ経路を利用していた。さらに、Ｆｉｍｂｒｉａ−海馬交連の欠損がＡｒｘ遺伝子欠損マウスの海馬で見い出された。
【００５６】
３）Ａｒｘ蛋白質を発現する介在ニューロンの性格付け
Ａｒｘ蛋白質発現細胞が胎生１３．５日で、大脳皮質の脳室帯（ＶＺ）に加えて、皮質線状体境界部周囲の片縁帯 （ＭＺ）、皮質板 （ＣＰ）、サブプレート （ＳＰ）、中間帯 （ＩＺ）および脳室下領域 （ＳＶＺ）で認められた。胎生１８．５日では、ｐｉａ−ａｒａｃｈｎｏｉｄ（軟膜−くも膜（ＰＩＡ））、片縁帯、 脳室下領域および新皮質の脳室体において密集するＡｒｘ蛋白質発現細胞を認めたほか、Ａｒｘ蛋白質発現細胞が皮質板で散在しているのが認められた。Ｐ１４では、密集したＡｒｘ蛋白質発現細胞の領域は片縁帯から消失していたが、Ａｒｘ蛋白質発現細胞は皮質板に散在していた。
二重免疫組織化学的試験から、胎生１８．５日で一部のＡｒｘ蛋白質発現細胞は線条体にニューロペプチドＹ （ＮＰＹ）を共発現させることが明らかになった。皮質板ではＡｒｘ蛋白質発現細胞の少なくとも５０％が胎生１８．５日においてＧＡＢＡを共発現したのに対し、片縁帯ではその約１０％がＧＡＢＡを共発現させた。Ｐ１４では、Ａｒｘ蛋白質発現細胞の７５％が皮質板でＧＡＢＡを共発現した。片縁帯におけるＡｒｘ蛋白質発現細胞はカルレチニンを共発現しなかった。
【００５７】
４）ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの神経節***からの初期移動異常
ＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウスにおいて神経節***マーカー遺伝子の発現およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの内側方神経節***からの初期移動について検討した。内側方神経節***のマーカー遺伝子であるＮｋｘ２．１の発現は、胎生１２．５日および胎生１４．５日でＡｒｘ遺伝子欠損マウスの内側方神経節***から側方神経節***の脳室下領域に向かって拡大がみられた。Ｌｈｘ６発現パターンの同様の変化がＡｒｘ遺伝子欠損マウスの神経節***に認められた。また、胎生１４．５日で内側方神経節***と側方神経節***のマーカー遺伝子であるＤｌｘ１の発現もＡｒｘ遺伝子欠損マウスで拡大した。このほか、Ｎｋｘ２．１の発現もＡｒｘ遺伝子欠損マウスで観察されたが、野生型の皮質脳室下領域では観察されなかった。一方、Ｌｈｘ６とＤｌｘ１の発現は野生型皮質片縁帯および中間帯でみられたが、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスでは認められなかった。
【００５８】
神経節***マーカー遺伝子の発現パターンにみるこれらの変化は、Ｄｉｌ標識細胞およびカルビンジン （ＣＢ）−陽性介在ニューロンの局在異常を来した。胎生１３．５日でＡｒｘ遺伝子欠損マウスの内側方神経節***にＤｉｌを配置して２日間培養したところ、内側方神経節***から皮質中間帯への移動がみられないことが明らかになり、内側方神経節***から皮質脳室下領域に移動する標識細胞のみが皮質線条体境界部で認められた。これはカルビンジン免疫組織化学法でさらに確認した。カルビンジン−陽性介在ニューロンは野生型の皮質片縁帯、皮質板、 中間帯および脳室下領域でみられたのに対し、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスでは皮質脳室下領域にのみ観察された。さらに、胎生１４．５日でＡｒｘ遺伝子欠損マウスの皮質脳室下領域と新皮質の脳室体にＬａｃＺ−陽性細胞（Ａｒｘ蛋白質非発現細胞）も認められた。したがって、Ａｒｘ遺伝子欠損は内側方神経節***から皮質中間帯へのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの直接移動を欠如させたのに対し、内側方神経節***から皮質脳室下領域への側方神経節***を介する介在ニューロン移動は維持された。
【００５９】
５）皮質板におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの異常局在
Ａｒｘ遺伝子欠損マウスのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンが正常に分化し最終的にＡｒｘ遺伝子欠損マウスの皮質板に適切に局在するかどうかを検討した。胎生１６．５日では、カルビンジン−陽性介在ニューロンが野生型の片縁帯、 皮質板、 サブプレートおよび中間帯に認められたのに対し、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスではこれらの細胞がサブプレート、中間帯および脳室下領域に認められ、皮質板にはみられなかった。Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの中間帯におけるカルビンジン−陽性介在ニューロンは野生型に比べて数が増大し、５種類のカルビンジン−陽性介在ニューロンが集合してクラスターを形成した。また、ＧＡＢＡ−陽性介在ニューロンも野生型の片縁帯、皮質板、サブプレートおよび中間帯にみられたが、胎生１６．５日ではＡｒｘ遺伝子欠損マウスのサブプレート、中間帯および脳室下領域にのみ認められた。胎生１８．５日で、カルビンジン−およびＧＡＢＡ−陽性介在ニューロンが野生型の皮質板に散在していたのに対し、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスではサブプレートに限定されていた。胎生１８．５日で、ＧＡＤ６７−陽性介在ニューロンはＧＡＢＡ作動性介在ニューロンと同じパターンを示した。ＧＡＢＡ作動介在性ニューロンのサブプレートにおける異常な位置が脳の発達の後期にまで維持されているかどうかが調べられた。ＧＡＢＡ作動介在性ニューロンは野生型のＰ３ｈｆにおいて皮質Ｖ層に濃縮されていたが、変異型ではＰ３ｈｆにおいては皮質板全体に散在していた。
【００６０】
６）線条体におけるニューロペプチドＹ−陽性介在ニューロンの欠如
ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブセットであるニューロペプチドＹ−陽性介在ニューロンは内側方神経節***に特異的にみられ、線条体で分化する（Ｍａｒｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，８７２−８７５ （２０００））。胎生１８．５日においてＮｋｘ２．１は野生型線条体の限られた細胞に発現するが、ＬａｃＺ−陽性細胞がみられるＡｒｘ遺伝子欠損マウスの線条体では認められなかった。しかし、アポトーシスは確認されなかった。胎生１８．５日でＬｈｘ６はＮｋｘ２．１と同じ発現パターンを示した。胎生１８．５日ではニューロペプチドＹ−陽性介在ニューロンはＡｒｘ遺伝子欠損マウスの線条体には認められず、神経一酸化窒素シンターゼ （ＮＯＳ）−陽性介在ニューロンも認められなかった。したがってＡｒｘ蛋白質とニューロペプチドＹの共発現を考慮に入れ、Ａｒｘ蛋白質はニューロペプチドＹ陽性介在ニューロンの分化に関与すると結論した。さらに、ニューロペプチドＹ陽性介在ニューロンの欠如がＡｒｘ遺伝子欠損マウスの新皮質と海馬において認められた。
【００６１】
７）精巣におけるＡｒｘ蛋白質発現細胞の性格付け
胎生１４．５日でＡｒｘ蛋白質の強発現が雄の性腺間質に認められたのに対し、雌の中腎近位の性腺領域では弱発現のみが観察された。ウォルフマン管とミュラー管では発現は検出できなかった。発達段階の雄の性腺間質はいくつかの異なる細胞型からなるため、免疫組織化学法によりＡｒｘ蛋白質が発現するタイプを検討した。胎生 １２．５日ではＡｒｘ蛋白質は精細管周囲の筋様細胞、白膜、血管内皮細胞および白膜下に裏打ちしている細胞で検出された。このほか、Ａｒｘ蛋白質は間質性線維芽細胞様細胞に発現した。一方、セルトリ細胞と生殖細胞の染色はいずれもほとんど検出できなかった。胎生１４．５日で基本的に類似した染色プロファイルが精巣で得られた。しかし、非染色細胞が間質で明瞭に検出された。これらの細胞は精細管周囲の筋様細胞、内皮細胞、および線維芽細胞様細胞のいずれでもないため、本発明者らはステロイド産生ライディヒ細胞であると推測した。これを確認するため、ライディヒ細胞マーカーとしてよく用いられるステロイド産生遺伝子３β−ＨＳＤ（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｅｍｄｏｃｉｎ Ｒｅｖ ９， ２９５−３１８ （１９８８））の発現を検討した。Ａｒｘ蛋白質と３β−ＨＳＤの分布は相互排除的であったことから、Ａｒｘ蛋白質はライディヒ細胞では発現せず、むしろ周囲の間質細胞で発現することが示された。
【００６２】
８）精巣分化異常
胎生１４．５日での胎仔精巣において、野生型とＡｒｘＸ＊Ｙ 変異マウスのいずれの精巣でも精細管周囲の筋様細胞により精索が構築される。精索の内部構造を形成するセルトリ細胞と生殖細胞は、組織学的に正常であると考えられた。白膜と血管はほとんど影響を受けないように思われた。しかし、入念な観察から、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣には通常、間質の形成異常という特徴があり、主として豊富な細胞質を含有する細胞における有意な低下によると考えられることがわかった。その代わり、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣間質は主に線維芽細胞様細胞で占有されていた。新生仔Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣でも同様の欠陥が観察された。また、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣のマーカー遺伝子発現についても検討した。胎生１４．５日で胎仔性セルトリ細胞の特異的産物であるＭＩＳが野生型とＡｒｘ遺伝子欠損マウス精巣の精索において明瞭に検出された。しかし、ライディヒ細胞マーカー３β−ＨＳＤの発現は、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣の間質部で著しく減少した。このことから、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスにみる影響にはばらつきがあるが、ライディヒ細胞の分化はある段階で阻害されると考えられた。通常ライディヒ細胞とセルトリ細胞の双方に発現するＡｄ４ＢＰ／ＳＦ−１の発現プロファイルにより、さらに欠陥について確認した。このマーカー遺伝子は、野生型ではライディヒ細胞で強発現し、セルトリ細胞で弱発現するが（Ｈａｔａｎｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０， ２７８７−２７９７ （１９９４））、予測した通り、Ａｒｘ遺伝子欠損マウスの精巣では強発現が認められなかったのに対して弱発現は維持された。
【００６３】
９）なお、上記実験で抗体、組織学的分析、Ｂｒｄｕラベリング、アポトーシス、器官培養、Ａｒｘ遺伝子欠損マウス飼育は以下によった。
【００６４】
（１）ポリクローナル抗体の作製
ＫＬＨと結合させたＡｒｘ蛋白質のアミノ酸１５８−１８１（アミノ酸配列：ＬＫＩＳＱＡＰＱＶＳＩＳＲＳＫＳＹＲＥＮＧＡＰＦＣ （配列番号：１８））に対応するペプチドをウサギに注射し、Ａｒｘ 蛋白質に特異的なポリクローナル抗体を産生させた。
【００６５】
（２）組織学的解析
固定した脳（Ｍａｒｉｎら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ６０６３−６０７６ （２０００））と精巣（Ｍｏｒｏｈａｓｈｉら， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７， １１９６−１２０４ （１９９３）； Ｎｏｍｕｒａら， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２４， ２１７−２２４ （１９９８））の免疫組織化学染色を記載の通り実施した。基本的にＫｉｔａｍｕｒａら （Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６７， ８３−９６ １９９７； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６， ５７４９−５７５８ （１９９９））とＫａｗａｂｅら （Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３， １２６７−１２８４ （１９９９））の記載に従い、固定組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとＬａｃＺ染色を実施した。ＤＡＢとＡＰ−Ｒｅｄ基質キット （Ｚｙｍｅｄ）をそれぞれ用いて、ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼによる比色反応を実施した。
【００６６】
（３）ＢｒｄＵラベリング
ＢｒｄＵ（２ｍｇ／妊娠マウス）を各分化ステージにおいて経腹腔に投与した。神経上非細胞のパルスラベルには、投与１時間後に胎仔を処置した。ラベルされた神経上皮細胞のチェースには胎生１９．５日に処置した。野生型および変異型の大脳皮質のＢｒｄＵ陽性細胞の分布を調べるために、連続組織切片（厚さ５μｍ）を作成し、ＢｒｄＵを染色し、続いて全ての核がＰＩ（プロピディウムイオダイド）で染色した。新皮質の脳室体の特定の領域でのＢｒｄＵ陽性またはＰＩ陽性細胞の数を数え、ラベル化インデックスを統計的に計算した。
【００６７】
（４）アポトーシス
ＡｐｏｐＴａｇプラスフルオレッセインインサイチューアポトーシス検出キット（ＩＮＴＥＲＧＥＮ）をメーカーの指示書に従って用いた。
【００６８】
（５）器官培養
Ａｎｄｅｒｓｏｎら （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８， ４７４−４７６ （１９９７）； Ｎｅｕｒｏｎ １９， ２７−３７ （１９９７））が記載している通り、器官培養を実施した。
【００６９】
（６）ＡｒｘＸ＊Ｙ変異マウスの人工飼育
出産を遅らせるため胎生１７日、１８日、１９日に０．１５ｍｇ／ｄａｙで皮下にプロゲステロンを投与し、胎生２０．５日に帝王切開した。野生型とＡｒｘ遺伝子欠損マウスはそのあと、３日間マウス乳で人工飼育した。
【００７０】
（実施例３） ＸＬＡＧ患者におけるヒトＡｒｘ遺伝子の構造解析
ＡｒｘＸ＊Ｙ 変異マウスの前脳と精巣で観察される構造的および機能的欠陥ならびにＸｐ２２へのＡｒｘの染色体局在から、ＡｒｘがＸＬＡＧの妥当な候補遺伝子であることが確認された（Ｄｏｂｙｎｓら， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８６， ３３１−３３７ （１９９９）； Ｏｇａｔａ， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ９４， １７４−１７６ （２０００））。この可能性をヒトにおいて検討するため、ＸＬＡＧ患者８例およびＸＬＡＧ患者を兄弟にもつ脳梁形成不全の少女１例についてＡｒｘのコード領域をシークエンスした。図１に示した通り、Ａｒｘは５６２個のアミノ酸をエンコードしている５つのエクソンからなる。一連のＸＬＡＧ患者におけるＡｒｘのシークエンス解析で８つの突然変異が検出された（表１と図１）。
【００７１】
【表１】
Ａｒｘ （ＡＣ００２５０４）の５つのエクソンとフランキング領域のヌクレオチド配列を以下の通り決定した。表２に挙げたプライマー（上から各配列番号３〜１７）を用いて、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅した。エクソンＩＩではＧ／Ｃ含有率が高いため、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ （ＴＯＹＯＢＯ）を使用してプライマーＡＲＸ２−５とＡＲＸ２−３を用いて２ステップおよびステップダウンＰＣＲにより増幅を実施した。シークエンシングにはエクソンＩＩを除き表２に挙げたプライマーを使用し、エクソンＩＩは３種類のｆｏｒｗａｒｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプライマー（ＡＲＸ２−５−１， ＡＲＸ２−５−２およびＡＲＸ２−５−３）と２種類のｒｅｖｅｒｓｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプライマー（ＡＲＸ２−３およびＡＲＸ２−３−２）を用いてシークエンスした。
【００７３】
【表２】
患者１はエクソンＩＩの４２０−４５１ｂｐが欠失しており、８５個のアミノ酸の異常ペプチドを伴うＮ−末端１４０のアミノ酸からなる短縮蛋白質を来すことが予測される。患者２はエクソンＩＩの７９０ｂｐにおいて単一塩基が欠失しており、これにより異常な６０個のアミノ酸を伴うＮ−末端２６３のアミノ酸を有する短縮蛋白質を来すに至る。患者３および患者４はそれぞれ、９９５ （Ｇ９９５Ａ）ｂｐと１１１７（Ｃ１１１７Ｔ）ｂｐに単一ヌクレオチドの置換がある。前者の突然変異はコドン３３２ （Ｒ３３２Ｈ）においてヒスチジンによるアルギニンの置換を招くのに対し、後者では３７３ （Ｑ３７３Ｘ）での未熟終結の原因となる。患者３と患者４の母親はいずれも突然変異に関してヘテロ接合型であったのに対し、父親は正常であった。患者５はエクソンＩＶの１１８８ｂｐにおいて単一塩基の挿入があり、Ｎ−末端３９６のアミノ酸に加えて１３４個のアミノ酸を含む短縮蛋白質を生ずる。患者６では、エクソンＩとＩＩがＰＣＲで増幅できなかったが、それ以外のエクソンはすべて正常であった。これはエクソンＩとＩＩを含む大きな欠失があることを示唆しているが、切断点は未だ確認されていない。患者７には１３７２ｂｐの単一ヌクレオチド欠失があり、４個の異常アミノ酸を伴うＮ−末端４５７のアミノ酸からなる短縮蛋白質を来す原因となる。最後に、患者８と患者９（兄弟）は１０２８ｂｐ （Ｔ１０２８Ａ）に同一の単一ヌクレオチド置換があり、ロイシンからグルタミン （Ｌ３４３Ｑ）へのアミノ酸置換をもたらす。この母親は突然変異に関してヘテロ接合型であったのに対し、父親と母方の祖父母は正常であった。患者３と患者８／９で確認された突然変異は、エクソンＩＩにおいて単一アミノ酸の置換を生じさせる。突然変異が良性多型である可能性を除外するため、健常者の１００を超す対立遺伝子においてエクソンＩＩをシークエンスした。予測した通り、これらの突然変異のいずれも健常者では観察されなかった。さらに本発明者らは、健常者の２０を超すＡｒｘ遺伝子におけるすべてのエクソンの塩基配列を決定したが、多型を見いだすことはできなかった。
【００７５】
以上からＡｒｘ遺伝子の変異がヒトのＸＬＡＧを引き起こすことを確認した。本発明において、ＸＬＡＧ患者で８種類の異なる配列変化を確認した。Ａｒｘ遺伝子はＸ染色体上にあるため、数名の母親は突然変異のヘテロ接合型保因者であろうと予測した。このため、患者３，４，６，７および８／９の親のＡｒｘ遺伝子を調べた。患者３，４と８／９の母親は発端者と同一の突然変異を有することがわかり、これらの家族におけるＸ染色体連鎖性遺伝が裏づけられた。患者６と７の親は正常なＡｒｘ遺伝子を有しており、このことから独立で生ずる突然変異が示唆された。
【００７６】
全体として、ナンセンス突然変異１件（患者４）、フレームシフト突然変異４件（患者１，２，５と７）、ミスセンス突然変異２件（患者３と８／９）および大きな欠失１件（患者６）を認めた。２種類の短縮Ａｒｘ蛋白質（患者５と７）はホメオドメインをもつが、ｐｒｄ様ホメオドメイン蛋白質に保存されるＣ−ペプチド （ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ）ドメインは欠如している（Ｍｉｕｒａら， １９９７）。ドメインの機能は未だ不明であるが、我々の試験結果から生理的重要性が示される。さらに本発明者等は、Ｒ３２２ＨおよびＬ３４３Ｑというアミノ酸置換を引き起こす２種類のミスセンス突然変異を確認した。いずれのアミノ酸もホメオドメインにあり、ｐｒｄ様ホメオドメイン蛋白質内でよく保存されているため、その突然変異がＤＮＡ結合などの機能不全を生じさせると推測するのは妥当である。
【００７７】
ＸＬＡＧを対象として見い出した変異は蛋白質のホメオドメイン内での短縮化またはアミノ酸の置換であった。興味あることに、最近Ａｒｘ蛋白質のいくつかのミスセンス変異（そのほとんどがポリアラニンの長鎖化であるが）がＸ連鎖幼児痙攣症候群（ＩＳＳＸ；ウエストシンドローム）とパーティントン症候群において報告されており （Ｓｔｒｏｍｍｅ等 Ｎａｔｕｒ Ｇｅｎｅｔ． ３０， ４４１−４４５ （２００２）； Ｂｉｅｎｖｅｎｕ等 Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １１， ９８１−９９１ （２００２））、さらにみかけ上はＸ連鎖非症候群性精神遅滞（Ｂｉｅｎｖｅｎｕ等 Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １１， ９８１−９９１ （２００２））でも見られている。同様のポリアラニンの長鎖化は他のいくつかの転写因子においても観察されている（Ｂｒａｉｓ等Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １８， １６４−１６７ （１９９８９）； Ｂｒｏｗｎ等 Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ １０， ７９１−７９６ （２００１））。ＸＬＡＧの子供はＩＳＳＸやパーティントン症候群の患者より症状は重症で、脳とＩＳＳＸやパーティントン症候群の患者にはない先天的な形成不全を伴っている。表現型でのこの顕著な差異は、ポリグルタミン長鎖化でも観察されている、ポリアミン長鎖化に伴う蛋白のアグリゲーションに起因する蛋白の構造上の差異によると説明できる（Ｚｏｇｈｂｉ ａｎｄ Ｏｒｒ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３， ２１７−２４７ （２０００））。しかしながら、軽症な表現型の原因がポリアミン長鎖化だけに起因するということはできない。というのはエクソンＶだけの３’側の欠失による短縮化と、ホメオボックス内での保存的ミスセンス変異（Ｐ３５３Ｌ）でもＩＳＳＸが起こっている。前者では、精神遅滞を伴う間代性筋痙攣性癲癇からなる軽症の癲癇症候群であり、後者は痙攣症であるからである（Ｓｔｒｏｍｍｅ等 Ｎａｔｕｒ Ｇｅｎｅｔ． ３０， ４４１−４４５ （２００２）； Ｂｉｅｎｖｅｎｕ等 Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １１， ９８１−９９１ （２００２））。さらに短縮化したＡｒｘ蛋白を持つマウスはＸＬＡＧに似た表現型を示す。かくして、本発明者らはＡｒｘ蛋白質の機能欠損はＸＬＡＧ患者に見られる重症な表現型を引き起こすと結論した。
【００７８】
【発明の効果】
本発明は、ＸＬＡＧ患者のＡｒｘ遺伝子上に特有の変異が存在することを見出した。そして、Ａｒｘ遺伝子上のＸＬＡＧに特有の変異がＸＬＡＧにおけるＡｒｘ遺伝子変異の検査に有用であることを確認した。このことは、ＸＬＡＧの遺伝子診断、また、その治療、新薬の研究において新規な展開を達成するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】健常人とＸＬＡＧ患者におけるＡｒｘ遺伝子を示す図である。上部はＡｒｘ遺伝子のゲノム構造を示し、下図はＡｒｘ蛋白質を示す。ＰＣＲとシークエンシングに用いたプライマーは矢印で示している。
【図２】健常人（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）に対する患者（Ｐ＃２、Ｐ＃３、Ｐ＃５）の突然変異の位置を示す図である。
【図３】健常人（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）に対する患者（Ｐ＃１〜５およびＰ＃７〜９）の変化したヌクレオチド配列と置換したアミノ酸配列を示す図である。
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an Arx gene having a mutation associated with X-linked encephalopathy, a method for testing a gene mutation associated with X-linked encephalopathy using the mutated gene, and a mutation associated with X-linked encephalopathy And the like. Specifically, a mutation in the nucleotide sequence of the Arxless related homeobox gene, which is specifically observed in patients with X-linked encephalopathy, and a mutation caused in the amino acid sequence of the Arx protein due to the mutation, A method for testing a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy using the presence or absence of the mutation, a DNA fragment used in the test method, a reagent kit containing the DNA fragment, The present invention relates to an antibody that reacts with a specific mutant Arx protein, a recombinant DNA molecule containing an Arx gene having a mutation specific to X-chromosome-linked encephalopathy, and a transformant containing the same.
[0002]
[Prior art]
X-linked encephalopathy (hereinafter sometimes referred to as “XLAG”) was reported by Berry-Kravis and Israel as a novel X-linked encephalopathy syndrome in 1994 (Berry-Kravis and Israel, Ann. Neurol. 25, 90-92 (1994)) and subsequently analyzed in detail by Dobyns et al., 1999 (Dobyns et al., Am. J. Med. Genet. 86, 331-337 (1999)). Subsequently, several papers have subsequently confirmed the phenotype (Ogata et al., Am. J. Med. Genet. 94, 174-176 (2000), Bonneau et al., Ann. Neurol. 51, 340). -349 (2002)). All affected patients have a male genotype, severe congenital or postnatal microcephaly, encephalopathy, hypoplasia of the corpus callosum, refractory epilepsy in neonatal period, thermoregulation, chronic He was accompanied by diarrhea and genital or hypoplasia. Since the cerebral encephalopathy in XLAG has a cortex thickness of only 6 to 7 mm, classical cerebral encephalopathy (Reiner, et al., Nature 364, 717-721 (1993) due to mutations in the LIS1 gene and DCX gene or RELN. Des Portes, et al., Cell 92, 51-61 (1998); Gleeson, et al., Cell 92, 63-72 (1998); Hong, et al., Nature Genet. 26, 93-96 (1998). 2000)). In addition, the cerebral white matter of XLAG is very immature compared to classic encephalopathy. However, no mutation on the gene associated with XLAG has been detected to date.
[0003]
On the other hand, the Arx gene (ariestless related homebox gene: aristales-related homeobox gene) is X-linked, and is expressed in the forebrain, bottom plate, and testis in the case of mouse embryos (Miura, H., et al., Mech. Dev. 65, 99-109 (1997)). However, the detailed function of the gene has not been elucidated yet. Recently, the Arx gene has been reported to be a form of the causative gene associated with X-linked mental retardation and epilepsy (Stromme, P., et al., Nature Genet., 30, 441-445 (2002). Bienvenu, T., et al., Hum. Mol. Gen., 11, 981-991 (2002)). Most of the patients found in these reports are similar to XLAG in showing neurologic abnormalities such as severe mental retardation and severe epilepsy, including convulsion in infancy, but the symptoms are mild and long-term survival is poor. Show. Others have X-linked mental retardation without epilepsy and dystonia (schizophrenia). Since none have XLAG-like brain and genital malformations, they form a phenotypically different syndrome.
[0004]
[Problems to be solved by the present invention]
The present invention provides a means for unambiguous diagnosis of X chromosome-linked encephalopathy (XLAG) showing severe brain structural and functional abnormalities, and a means for analyzing the mechanism of development of XLAG. Make it an issue.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, produced Arx gene-deficient mice in order to clarify the functions of Arx proteins in forebrain and testis formation. The mice were male lethal and closely resembled XLAG in phenotype. That is, brain miniaturization and abnormal testis differentiation caused by suppression of cell growth in the forebrain and accompanying regional deficiency were observed in Arx gene-deficient male fetal mice. In addition, abnormal migration and differentiation of GABAergic interneurons in ganglionic ridges and neocortex were also observed in Arx gene-deficient male fetal mice. From these results, the clinical characteristics of XLAG with genital abnormalities were partially reproduced in model animals. The present inventors analyzed the Arx gene of XLAG patients based on this finding, and found mutations in the Arx gene in all nine samples. The present invention has been accomplished based on these findings.
[0006]
That is, the present invention provides the following inventions.
1. A method for testing a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy, wherein the presence or absence of a mutation specific to X-linked encephalopathy in the base sequence of the Arx gene is used as an index.
2. The test method according to the
3. 2. The test method according to the
4. The test method according to any one of
(1) SEQ ID NO: 1 in which nucleotide numbers from 420 to 451 are deleted
(2) SEQ ID NO: 1 in which
(3) base sequence 1117 in the base sequence of SEQ ID NO: 1
(4) The above (3) wherein the substitution at base number 1117 is a substitution of cytosine for thymine.
(5) SEQ ID NO: 1 with one base inserted at
(6) SEQ ID NO: 1 in which nucleotide number 1372 is deleted
(7) those in which all of exons I and II in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted
(8) SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted
(9) those in which the base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted
(10) wherein the substitution at base number 995 in (9) above is guanine to adenine
(11) SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide No. 1028 of the nucleotide sequence is substituted
(12) wherein the substitution at the base number 1028 in the above (11) substitutes thymine for adenine.
5. 2. The method of
6. The test method according to the
(1) a mutation in the nucleotide sequence encoding amino acid number 332 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(2) A protein in which arginine at amino acid number 332 in (1) above is substituted with histidine
(3) those having a mutation in the nucleotide sequence encoding amino acid number 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(4) Leucine at amino acid number 343 in (3) above substituted with glutamine
7. 7. A test DNA fragment used in the method according to any one of the
8. 8. The DNA fragment according to the
9. The preceding
10. 9. The DNA fragment according to the
11. A sequence consisting of a sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NOS: 3 to 17 in the sequence listing; a sequence consisting of a sequence capable of hybridizing with the base sequence of SEQ ID NOs: 3 to 17 under stringent conditions; 10. The DNA fragment according to the
12. A reagent kit for testing a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy comprising the DNA fragment according to any one of the
13. A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which is an Arx gene and having at least one of the following mutations in the sequence:
(1) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 lacking nucleotide numbers from 420 to 451
(2) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with the deletion of
(3) base sequence 1117 in the base sequence of SEQ ID NO: 1
(4) The above (3) wherein the substitution at base number 1117 is a substitution of cytosine for thymine.
(5) SEQ ID NO: 1 with one base inserted at
(6) SEQ ID NO: 1 in which nucleotide number 1372 is deleted
(7) those in which all of exons I and II in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted
(8) SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted
(9) those in which the base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted
(10) wherein the substitution at base number 995 in (9) above is guanine to adenine
(11) SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide No. 1028 of the nucleotide sequence is substituted
(12) wherein the substitution at the base number 1028 in the above (11) substitutes thymine for adenine.
14． 14. A polypeptide encoded by at least one nucleotide sequence of the preceding item 13.
15. 15. An antibody, which reacts with the polypeptide according to the above 14, but does not react with Arx protein of a healthy subject.
16. 15. A recombinant DNA molecule comprising the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the polypeptide according to the above item 14 or the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the above item 13, and a transformant comprising any one of them.
17. A method for examining a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy, which comprises analyzing a base sequence of the Arx gene of a patient with X-linked encephalopathy and identifying a portion different from the sequence of a healthy subject. Identification method of mutation site used.
18. 18. A method for examining a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy, wherein the presence or absence of the mutation identified in the nucleotide sequence of the Arx gene by the method described in 17 above is used as an index.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(1) Arx gene analysis
One feature of the present invention is to extract DNA containing an Arx gene from an individual having a possibility of XLAG, and to detect a mutation specific to X chromosome-linked encephalopathy in the base sequence of the Arx gene. This is a method for detecting a mutation in the Arx gene associated with X-linked encephalopathy, ie, a method for diagnosing XLAG.
An individual having a possibility of XLAG includes an individual in a family in which XLAG develops. Specific examples include a female in the family and a fetus found to be a male. The Arx gene is described in Miura, et al. , (Mech. Dev. 65, 99-109 (1997)), and is a gene expressed in the forebrain, bottom plate, and testis, and is a mouse (Genbank accession No. AB006103), human (genome: Genbank accession No. AC002504). , CDNA: AY038071) and zebrafish (Genbank accession No. AB006104). Specifically, the amino acid sequences of the cDNA sequence of the human Arx gene are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
[0008]
Using the mutation in the base sequence of the Arx gene (aristarless-related homeobox gene) of the XLAG patient as an index and analyzing the difference from the sequence of a healthy person, it can be seen that the Arx gene associated with XLAG (X-linked cerebral encephalopathy) Enables testing for mutations. Mutations can be presumed to be mutations in the Arx gene associated with XLAG in which the mutations in the base sequence and amino acid sequence described later are clear, but in addition to these, XLAG-specific mutations identified by the above analysis of the Arx gene are considerable. The association with XLAG can be estimated with certainty. And, by distinguishing from at least known mutations in 1) X-linked infantile convulsive syndrome, 2) Partington's syndrome, and 3) X-linked non-syndromic mental retardation, the mutation of the Arx gene can be more reliably determined. And XLAG can be estimated.
[0009]
Examples of the index in the test include the following mutations. When the mutation is any one of substitution, deletion, insertion, and addition existing in any one of exons II to IV in the Arx gene. When the mutation causes a mutation in the reading frame of the triplet codon on the 3 ′ side. Furthermore, there are cases where these mutations result in termination codons.
Specific examples of the mutation marker include the following.
[0010]
(1) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 lacking nucleotide numbers from 420 to 451
(2) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with the deletion of
(3) base sequence 1117 in the base sequence of SEQ ID NO: 1
(4) SEQ ID NO: 1 in which the cytosine at base number 1117 is substituted with thymine
(5) SEQ ID NO: 1 with one base inserted at
(6) SEQ ID NO: 1 in which nucleotide number 1372 is deleted
(7) those in which all of exons I and II in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted
(8) SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted
(9) those in which the base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted
(10) A nucleotide in which guanine at base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted with adenine.
(11) SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide No. 1028 of the nucleotide sequence is substituted
(12) Thymine at base number 1028 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 having been substituted with adenine
[0011]
Further, among the specific mutations, the case where a mutation at the level of at least one amino acid is caused is as follows.
(1) Amino acid number 332 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a mutation
(2) Arginine at amino acid number 332 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with histidine
(3) those having a mutation at amino acid number 343 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(4) Leucine at amino acid number 343 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamine
[0012]
As a method for testing the XLAG-specific mutation of the Arx gene described above, (1) DNA is purified from an individual having the possibility of XLAG, and (2) the Arx gene of the DNA is analyzed by a method known per se and commonly used. Can be done by doing
The DNA to be purified from an individual having the possibility of XLAG may be any DNA containing the Arx gene, and may be genomic DNA or cDNA. Here, in order to obtain cDNA, it is necessary to obtain a limited tissue in which the Arx gene is expressed. Therefore, genomic DNA is preferably used. The biological sample obtained from the individual for purifying the DNA may be any biological sample that can be easily obtained from a living body and contains DNA containing the Arx gene. Specifically, leukocyte cells contained in blood, hair, biological material tissue, and surgically resected tissue are used. In the case of a prenatal individual, fetal cells in amniotic fluid, villi, blood, skin, hepatocytes, fetal cells in maternal blood, or fetal cells in a flushing solution in the maternal uterine cavity, etc. Used. Since most of the cells in amniotic fluid have died, culture is performed and the cultured cells are used as a biological sample. Acquisition of DNA from these biological samples can be performed using a commonly used method known per se.
[0013]
Methods for analyzing the above-described mutations in the Arx gene in the DNA thus obtained are described in Nollau, et al. , Clin. Chem. , 43, 1114-1120 (1997), "Laboratory Protocols for Mutation Detection" (Landegren, U., et al., Oxford University Press (1996)), and "PCR" second edition (Newton, et al.). , BIOS Scientific Publishers Limited (1997)) or the like can be applied. Specifically, for example, A) PCR fragment sequencing method, B) Single-stranded conformation polymorphism method (SSCP method: Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86 ( 8), 2766-2770 (1989)), C) Heteroduplex denaturant concentration gradient gel electrophoresis (DGGE method: Sheffield, VC, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 86 (1), 232-236 (1989)), D) Invader method (Griffin, TJ, et al., Trend Biotech, 18, 77 (2000)), E) SniPer. TM (Amersham pharmacia biotech), F) Taqman PCR (Livak, KJ, Genel. Anal., 14, 143 (1999); Morris, T., et al., J. Clin. Microbiol. 2933 (1996)), G) MALDI-TOF / MS method (Griffin, TJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96 (11), 6301-6 (1999)), H) Restriction enzyme length polymorphism analysis method (RFLP: Murray, JC, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80 (19), 5951-5955 (1983)), I) DNA Chip hybridization method (Kokoris, K. et al. , Et al., J. Med. Genet., 36, 730 (1999)), J) Masscode. TM The method can be selected from known methods such as the method (Qiagen Genomics), but is not limited thereto, and any method can be applied as long as it is a method for detecting a gene mutation.
[0014]
Among them, for example, in the A) PCR fragment sequencing method, a fragment containing the above mutation of the Arx gene is amplified by PCR using the obtained DNA as a template, and then sequenced by an appropriate method to determine the presence or absence of the mutation. Is a method of analyzing Specifically, for example, for a mutation in which
[0015]
In addition, in the I) DNA chip hybridization method, for example, a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of 5 to 10 bases including the above-mentioned mutated portion of the Arx gene was fixed on a glass substrate or the like and then obtained. When the DNA is labeled with an appropriate fluorescent substance or the like and brought into contact with the DNA and hybridized, it can be determined that the DNA has a mutation. Here, as the polynucleotide to be immobilized on the base, one having a base sequence containing the above-mentioned mutated portion of the Arx gene or a sequence complementary to a sequence having four kinds of alleles in the mutated portion is used.
[0016]
G) In the MALDI-TOF / MS method, a polynucleotide of an appropriate length having up to one base adjacent to the base having the above mutation in the Arx gene of the obtained DNA is amplified by PCR or the like, and the mutation Primer extension is performed using a primer whose part is extended, and the molecular weight before and after this is analyzed using a mass spectrum or the like. When the molecular weight is different from that of the wild type, it can be determined that the gene has a mutation. As the primer used here, a primer having a sequence capable of extending a mutated portion with respect to a DNA fragment consisting of a base sequence adjacent to the above-mentioned mutation of the Arx gene by about 1 base is used.
[0017]
The present invention includes all polynucleotides, primers, probes and the like used in the above-described method designed on the basis of the mutation in order to detect the above-mentioned mutation in the Arx gene. May be referred to as “test DNA fragment”). These test DNA fragments also include those modified with an appropriate fluorescent substance if necessary.
[0018]
In the present invention, a suitable X chromosome linkage can be obtained by combining with a known gene mutation detecting means based on the information on the above mutation, and further combining a desired detection reagent with each of the selected test DNA fragments and the like. A reagent kit for testing a mutation on the Arx gene associated with encephalopathy is provided.
[0019]
(2) Polynucleotide having mutation specific to XLAG of Arx gene, polypeptide encoded by the polynucleotide, and recombinant protein
A polynucleotide which is an Arx gene having a mutation indicated by the above-mentioned test method (1) (hereinafter, may be referred to as a “mutated Arx polynucleotide”) can be used in a normal DNA recombination method. To prepare a recombinant polypeptide (hereinafter sometimes referred to as “mutant Arx polypeptide”). The polynucleotide is very useful for the study of XLAG, since it is very likely that the polynucleotide is similar to the Arx protein that the XLAG patient has in vivo.
Examples of the mutant Arx polynucleotide include, as a human sequence, those having, in the base sequence of SEQ ID NO: 1, a mutation that is used as an index by the above-described test method (1). Specific mutations include, for example, the following.
[0020]
(1) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 lacking nucleotide numbers from 420 to 451
(2) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with the deletion of
(3) base sequence 1117 in the base sequence of SEQ ID NO: 1
(4) SEQ ID NO: 1 in which the cytosine at base number 1117 is substituted with thymine
(5) SEQ ID NO: 1 with one base inserted at
(6) SEQ ID NO: 1 in which nucleotide number 1372 is deleted
(7) those in which all of exons I and II in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted
(8) SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted
(9) those in which the base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted
(10) A nucleotide in which guanine at base number 995 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 has been substituted with adenine.
(11) SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide No. 1028 of the nucleotide sequence is substituted
(12) Thymine at base number 1028 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 having been substituted with adenine
[0021]
Further, among the specific mutations, the case where a mutation at the level of at least one amino acid is caused is as follows.
(1) Amino acid number 332 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a mutation
(2) Arginine at amino acid number 332 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with histidine
(3) those having a mutation at amino acid number 343 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(4) Leucine at amino acid number 343 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamine
[0022]
Such a polynucleotide is not limited to a polynucleotide containing the full length of the Arx gene, and may be any polynucleotide having at least one mutation. In addition, these polynucleotides may be those prepared by a method such as PCR from the DNA obtained by the method described in the above (1) from XLAG individuals, or may be DNAs obtained from individuals having a wild-type Arx gene. It can also be prepared by introducing a mutation by a commonly used method known per se. Furthermore, it can also be obtained by chemical synthesis.
The above-mentioned mutant Arx polynucleotide includes a method of producing a recombinant vector containing the same, introducing the vector into an appropriate host, and extracting a recombinant protein from a culture obtained by culturing the introduced host under appropriate conditions. . The vector for expressing the recombinant protein is not particularly limited as long as the mutant Arx polynucleotide or a polynucleotide containing the same is expressed in the host into which the recombinant protein is to be introduced, but usually a promoter suitable for the host is inserted. A commercially available protein expression vector is used. Further, both a plasmid vector and a phage vector can be used.
[0023]
Specific examples include ZAP Express (manufactured by Stratagene), pSVK3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and pEGFP-C1 (manufactured by Clontech). Also, pMKITNeo (Kazuo Maruyama, Cell Engineering
Shujunsha, (1993)) and the like are also preferably used.
[0024]
As a promoter for expressing the mutant Arx polynucleotide, a promoter held by a host can be generally used, but is not limited thereto. Specifically, when the host microorganism is Escherichia coli, T3, T7, Tac and lac promoters can be used, and in the case of yeast, the nmt1 promoter, Gal1 promoter and the like can be used. In the case of cultured animal cells, SV40 promoter, CMV promoter and the like can be mentioned. When a host capable of functioning with a mammalian-derived promoter is used, a promoter specific to the mutant Arx polynucleotide can also be used.
[0025]
Insertion of the mutant Arx polynucleotide into these vectors is performed by ligating the polynucleotide or a DNA fragment containing the polynucleotide downstream of the promoter in the vector under the control of the promoter. In addition, a Kozak sequence (Kozak, M., Gene, 234, 187, (1999)) is inserted between the promoter and the mutant Arx polynucleotide, or a tag-encoding polypeptide downstream of the mutant Arx polynucleotide is encoded. A vector having a structure into which DNA has been inserted is also preferably used. The polypeptide serving as a tag is not particularly limited. For example, a FLAG tag (BioTechniques,
7, 580, (1989)).
[0026]
The recombinant vector of the present invention thus obtained can be obtained by the calcium phosphate method (Science, 221, 551 (1983)), the DEAE dextran method (Science, 215, 166 (1982)), or the electric pulse method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161 (1984)), in vitro packaging method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581 (1975)), virus vector method (Cell, 37, 1053 (1984)). Alternatively, it is introduced into an appropriate host by lipofection method (Lipofection Reagent (manufactured by Gibco BRL)) or the like.
[0027]
At this time, the host for introducing the recombinant vector is not particularly limited as long as the vector is replicable in the body and a protein encoded by the mutant Arx polynucleotide is produced. Baculovirus (Arthropod Polyhedrovirus)-Insect cells, animal cells and the like. More specifically, BL21 and XL-2Blue (manufactured by Stratagene) are used for Escherichia coli, SP-Q01 (manufactured by Stratagene) is used for yeast, and AcNPV is used for baculovirus is used, for example, AcNPV (J. Biol. Chem., 263, 7406). (1988)) and its host Sf-9 (J. Biol. Chem., 263, 7406 (1988)). As animal cells, mouse fibroblasts C127 (J. Viol., 26, 291 (1978)), Chinese hamster ovary cells CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)) and African green monkeys Kidney-derived COS-7 (ATCC CRL1651: American Type Culture Collection) and the like.
[0028]
In addition to the above-described expression method using a recombinant vector, a homologous recombination technique of directly inserting a mutant Arx polynucleotide linked to a promoter into the chromosome of a host (A.A. Vertes et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. , 57, 2036 (1993)), or a transposon or an inserted sequence (AA Vertes et al., Molecular Microbiol., 11, 739 (1994)).
[0029]
The transfectant into which the recombinant vector has been introduced is cultured in a medium suitable for each. The medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, vitamins, serum, drugs used for resistance screening and the like necessary for growth of the transformant. Specifically, when the host of the transformant is Escherichia coli, for example, an LB medium (manufactured by Nacalai Tesque) or the like, and when the host is a yeast, a YPD medium (Genetic Engineering, 1, 117, Plenum Press (1979)). When the host is an insect cell or an animal cell, examples thereof include a Ham-12 medium, a MEM medium, a DMEM medium, and an RPMI1640 medium (manufactured by SIGMA) containing 20% or less of fetal calf serum. The cultivation is usually performed at a temperature of 20 ° C. to 45 ° C. 2 It is preferable to carry out in a concentration range of 2 to 10%. The culturing time can be appropriately selected depending on the host, the recombinant vector and the like, but is preferably 12 to 80 hours. Further, ventilation and stirring are performed as necessary. Any medium may be used as long as the introduced host grows under a medium composition or culture conditions other than those described above and the protein encoded by the inserted mutant Arx polynucleotide is generated.
[0030]
For example, when the host is a cell, a method of recovering the introduced culture cultured in this manner is, for example, a method of separating the culture by centrifugation or the like, and then collecting the cell as a cell body or a culture supernatant. Can be As a method for extracting the recombinant protein from the recovered cell body, a commonly used method known per se can be used. For example, after suspending the cells in a phosphate buffer (Phosphate Buffered Saline: PBS), Sample buffer (0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 10% β-mercaptoethanol (2-ME), 0.2% bromophenol blue (BPB) ) And boiling at 98 ° C. for 1 to 10 minutes.
[0031]
In addition, a recombinant protein can be prepared from the mutant Arx polynucleotide by a known cell-free protein synthesis system or the like. Specific examples of the cell extract used in the cell-free protein synthesis system include known cells such as microorganisms such as Escherichia coli, embryos of plant seeds, and cell extracts such as rabbit reticulocytes. These can be used commercially, or a method known per se, specifically, an Escherichia coli extract is described in Pratt, J .; M. et al. J., Transcription and Tranlation, Hames, 179-209, B.C. D. & Higgins, S.W. J. , Eds, IRL Press, Oxford (1984), and the like.
[0032]
As a commercially available cell extract, those derived from E. coli are described in E. coli. E.coli S30 extract system (Promega) and RTS500 Rapid Transcription System (Roche), and the like. TM (Manufactured by TOYOBO) and the like.
[0033]
The extracted protein can be separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like, and can be confirmed by staining the gel with an appropriate staining reagent, for example, Coomassie brilliant blue (CBB). The expression state can also be confirmed by analyzing the binding of the protein of the present invention to an antibody described later.
[0034]
When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt form, it is converted to a free form or another salt. be able to. Such salts are also included in the protein of the present invention. In addition, the protein produced by the above-described introduced host may be optionally modified before or after purification by the action of an appropriate protein modifying enzyme, or the polypeptide may be partially removed to obtain a modified protein. it can. These modified proteins are also included in the scope of the present invention as long as they are polypeptides encoded by Arx polynucleotides having the XLAG-specific mutation described in (1).
[0035]
(3) Anti-mutant Arx polypeptide antibody
In the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the Arx polynucleotide having the XLAG-specific mutation described in (1), a portion different from the wild type is used as an antigen to react with the mutant Arx polynucleotide, but is healthy. An anti-mutant Arx polypeptide antibody characterized by not reacting with human Arx protein can be prepared.
[0036]
As a method for preparing the anti-mutant Arx polypeptide antibody, a commonly used known method can be used. As the polypeptide used as the antigen, a partial peptide containing a mutation site in the amino acid sequence unique to XLAG described in (1) is used.
[0037]
As the polypeptide used as the antigen, a synthetic peptide synthesized according to a known method or the mutant Arx protein of the present invention itself can be used. The polypeptide serving as an antigen may be prepared in an appropriate solution or the like according to a known method and immunized to a mammal, for example, a rabbit, a mouse, a rat, or the like. It is preferable to use an antigen peptide as a conjugate with a suitable carrier protein or to add an adjuvant or the like for immunization.
[0038]
The route of administration of the antigen upon immunization is not particularly limited, and any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, or intramuscular may be used. Specifically, for example, a method of inoculating BALB / c mice several times every several days to several weeks with an antigen polypeptide is used. The amount of the antigen to be taken is preferably about 0.3 to 0.5 mg / time when the antigen is a polypeptide, but is appropriately adjusted depending on the type of the polypeptide and the animal species to be immunized.
[0039]
After immunization, blood is appropriately collected as a test, and an increase in the antibody titer is confirmed by a method such as enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter sometimes referred to as “ELISA”) or Western blotting. Blood is collected from animals with increased titers. A polyclonal antibody can be obtained by subjecting this to an appropriate treatment used for antibody preparation. Specifically, for example, there is a method of obtaining a purified antibody obtained by purifying an antibody component from serum according to a known method. For purification of the antibody component, methods such as centrifugation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used.
[0040]
Alternatively, a monoclonal antibody can be prepared by using a hybridoma fused with spleen cells and myeloma cells of the animal according to a known method (Milstein, et al., Nature, 256, 495 (1975)). . The monoclonal antibody can be obtained, for example, by the following method.
[0041]
First, antibody-producing cells are obtained from an animal whose antibody titer has increased due to immunization with the above-described antigen. The antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any of the individuals, but is preferably obtained from the spleen, lymph nodes, peripheral blood and the like. As a myeloma to be fused with these cells, generally, a cell line obtained from a mouse, for example, a P3X63-Ag8.653 (ATCC: CRL) which is an 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line is used. -1580) and P3-NS1 / 1Ag4.1 (RIKEN cell bank: RCB0095), or hybridoma SP2 / 0-Ag14 (ATCC: CRL-1581) derived from P3X63-Ag8.653 is preferably used. For cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at an appropriate ratio, and 50% polyethylene is added to an appropriate cell fusion medium such as RPMI1640, Iskov's modified Dulbecco's medium (IMDM), or Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). It can be carried out by using a solution in which glycol (PEG) is dissolved. It can also be carried out by the electrofusion method (U. Zimmer-mann. Et al., Naturewissenschaften, 68, 577 (1981)).
[0042]
Hybridomas were prepared using a myeloma cell line that was resistant to 8-azaguanine, using 5% CO2 in a normal medium (HAT medium) containing an appropriate amount of hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) solution. 2 At 37 ° C. for an appropriate time. This selection method can be appropriately selected and used depending on the myeloma cell line to be used. The antibody titer of the antibody produced by the selected hybridoma is analyzed by the above-described method, the hybridoma producing the antibody having a high antibody titer is separated by a limiting dilution method or the like, and the separated fused cells are cultured in an appropriate medium. The monoclonal supernatant can be obtained by purifying the resulting culture supernatant by an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation and affinity chromatography. For purification, a commercially available monoclonal antibody purification kit can also be used. Furthermore, ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by growing the antibody-producing hybridoma obtained above in the abdominal cavity of an animal of the same strain as the immunized animal or a nude mouse.
[0043]
It was confirmed by the above-mentioned ELISA and the like that the thus obtained anti-mutant Arx polypeptide antibody reacts with the partial polypeptide or the mutant Arx protein used as an epitope, but does not react with the wild-type Arx protein obtained from a healthy person. By doing so, it is obtained as the anti-mutant Arx polypeptide antibody of the present invention.
[0044]
When a human-derived protein is obtained as the protein of the present invention, the above-described method is applied to a Severe combined immunodeficiency (SCID) mouse transplanted with human peripheral blood lymphocytes using the polypeptide or a partial peptide thereof as an antigen. A humanized antibody can also be prepared by immunization in the same manner as described above and preparing a hybridoma between the antibody-producing cells of the immunized animal and human myeloma cells (Mosier, DE, et al. Nature, 335, 256-259 (1988); Duchosal, MA, et al., Nature, 355, 258-262 (1992).
[0045]
Further, RNA is extracted from the obtained hybridoma producing the human antibody, the gene DNA encoding the desired human antibody is cloned, the gene DNA is inserted into an appropriate vector, and the gene is introduced into an appropriate host. Thus, human antibodies can be produced in larger quantities. Here, an antibody with low binding to an antigen can be obtained as an antibody with even higher binding by using an evolutionary engineering technique known per se. A partial fragment such as a monovalent antibody can be prepared by cleaving the Fab and Fc portions using, for example, papain or the like, and collecting the Fab portion using an affinity column or the like.
[0046]
The antibody that specifically binds to the protein of the present invention thus obtained is useful for elucidating the onset mechanism of XLAG by specifically binding to the protein of the present invention.
[0047]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[0048]
(Example 1) Preparation of Arx gene-deficient mouse
In order to suppress the expression of Arx protein, LaxZ gene was inserted to divide exon II of Arx gene to prepare Arx gene-deficient mice.
The mouse Arx gene was cloned from a 129 SVj mouse genomic library (Stratagene) using the Arx gene cDNA as a probe (Miura et al., Mech. Dev. 65, 99-109 (1997)). Five independent genomic clones were isolated and sequence analysis confirmed the exon / intron structure. The reporter gene cassette IRES-LacZ was used for construction of the targeting vector. A stop codon that causes translation termination of the Arx protein was inserted before the IRES. The STOP-IRES-LacZ cassette at the 3'-position of the ArtII site in the homeobox, the 4.5 kb ArtII-PstI fragment and the EcoRI-XhoI fragment of pKJ2 were ligated and subcloned into pBluescriptII. In addition, a 2.5 kb HindII-ArtII fragment at the 5'-position of the ArtII site in the homeobox and the TK gene cassette were inserted into the construct in this order.
[0049]
(ES cell transfection, screening and Arx X * Y Production of mutant mice)
To obtain target ES cells, a positive-negative selection method was used in the 129 / Sv-derived ES cell line E14TG2a. Using the genomic sequence contained in the target vector and the 5 ′ probe and 3 ′ probe outside Neo, ES colonies were screened by a Southern blot pattern. As a result, it was found that homologous recombination occurred in 22 ES clones out of 300 clones. Positive ES clones were injected into C57BL blastocysts and transplanted into pseudopregnant female recipients. The resulting chimeric mice were crossed with C57BL females. Transmission of the target Arx locus was confirmed by Southern blot patterns. Arx used in the following analysis X * Y Mutant mouse (X * Indicates the X chromosome deficient in the Arx gene; hereinafter, this may be referred to as "Arx gene-deficient mouse"). X * Y Mouse and F2 Arx XY Obtained from crosses of mice. Arx from two independent target ES cell lines X * Y Hemizygotes showed an indistinguishable phenotype.
[0050]
Arx X * X Heterozygous female mice and Arx XY By mating with wild-type male mice, four types of genomic mice (Arx XX : Arx X * X : Arx XY : Arx X * Y ) Was born. Arx X * Y Hemizygous mutant male mice died within the latter half of life, at embryonic day 19.5. Arx X * Y The mutant newborn mouse brain was smaller than the wild type. The olfactory bulb of the Arx gene-deficient mouse exhibited a small and abnormal shape. In addition, the size of the testis of the neonatal Arx gene-deficient mouse was smaller than that of the wild type, whereas the diameter of the seminiferous tubule of the Arx gene-deficient mouse testis was large. Similarly, hypoplasia of seminal vesicles and a derivative of Wolff's canal were observed. No other obvious differences were observed in the genital tract, such as the external genitalia, epididymis and vas deferens. For the study of postnatal brain development, delivery was delayed by administration of progesterone and fetuses were harvested at 20.5 days of embryogenesis by cesarean section. Mutated individuals born were bred artificially for 3 days and 3 days after birth (P3 hf ).
[0051]
Arx X * X Heterozygous female mice were slightly obese but reproductive. The histological findings of the fetal brain were normal except for hypoplasia of the thalamus in the ventral center of the head. In this study, Arx X * Y The focus was on brain miniaturization, migration and differentiation of GABAergic interneurons in the cerebral cortex, ganglionic ridges and testis differentiation in mutant mice. As a result, suppression of cell growth in the forebrain and the resulting brain miniaturization due to regional deficiency were observed in X-linked Arx gene-deficient male fetal mice. In addition, abnormal migration and differentiation of GABAergic interneurons in ganglionic ridges and neocortex were also observed in X-linked Arx gene-deficient male fetal mice. Testicular differentiation was also abnormal. These results were confirmed to partially reproduce the clinical characteristics of X-linked encephalopathy with genital abnormalities (XLAG).
[0052]
(Example 2) Analysis of characteristics of Arx gene-deficient mouse
1) Suppression of proliferation of neuroepithelial cells and almost normal migration in neocortex
Expression of Arx protein at 12.5 days of embryonic day, dorsal telencephalon (cerebral cortex and hippocampus), basal cerebrum (medial ganglion ridge (MGE) and lateral ganglion ridge (LGE)), raised thalamus and abdomen It was observed in the lateral thalamus (Arura gene expression pattern by Miura et al., Mech. Dev. 65, 99-109 (1997)). Arx X * Y Mutant mice had abnormal morphology in each region where the Arx gene was expressed.
The present inventors first analyzed cell proliferation in the cerebral cortex and region defects in the thalamus in order to investigate the cause of brain miniaturization. As a result, the cortical plate (CP) of the Arx gene-deficient mouse was thinner at 19.5 days of fetal life than that of the wild type.
In order to examine the proliferation of neuroepithelial cells in the neocortical ventricle (VZ), a single BrdU administration experiment was performed at 12.5 days of embryonic development and the lateral cerebral cortex was analyzed. As a result, the labeling index (LI) of the ventricle of the lateral neocortex of the wild type and the mutant type was 43.1 ± 4.2% and 38.8 ± 3.0%, respectively. The number of BrdU-positive cells in the arbitrary unit of the ventricle of the wild type and mutant neocortex was 243 ± 7 and 193 ± 15. There was a statistically significant difference in the labeling index and BrdU cell number of the neocortical ventricle at day 12.5 between the wild-type and mutant embryos, but the difference was small.
Therefore, the proliferation of neuroepithelial cells in the neocortical ventricle was examined at embryonic day 14.5 and embryonic day 18.5. The ventricular bodies of the wild type and mutant lateral neocortex at 14.5 days of embryonic embryo had a labeling index of 58.6 ± 7.6% and 36.6 ± 4.0%, respectively. Furthermore, the number of BrdU-positive cells in the arbitrary unit of the ventricle of the wild type and mutant neocortex was 345 ± 23 and 230 ± 37. The mutant neocortical ventricle was thinner than the wild type. At embryonic day 18.5, there was no similar difference in the ventricular body labeling index of the wild type and mutant lateral neocortex. Mutant-specific apoptosis was not detected in the mutant cerebral cortex at embryonic days 14.5 and 18.5. On the other hand, P3 in the mutant subventricular region hf This was seen sporadically in These findings suggest that the thin cerebral cortex of fetal mice in the mutant form is not dependent on activated apoptosis, but rather in the ventricular body of the mutant neocortex, especially the entire neocortex of the lateral cerebral cortex. Suggests that this is due to a decrease in non-accelerated neuroepithelial cell proliferation.
[0053]
BrdU / single dose / follow-up experiments were performed to examine cortical layer formation in Arx gene deficient mice. BrdU was administered at embryonic days 12.5, 13.5 and 14.5, and the brain was fixed at 14.5 days. The BrdU incorporation patterns of mutant individuals at each stage of the experiment indicate that the cortical formation pattern at 19.5 fetal embryos is an intermediate rather than a final stage of cortical differentiation in mice, No major cortical abnormalities such as replication or inversion were observed. However, the migration of the labeled BrdU-positive cells to the cortical plate at 13.5 days of embryonic Arx gene-deficient mouse embryos was less accurate than the wild type. This observation indicates that glutamate-positive neurons were not hf Is located in the V layer of the cortical lamina at hf This was supported by the observation that the cortical plate was dispersed from the II layer to the V layer.
Therefore, this experiment indicates that the migration of neuroepithelial cells in the cortical plate in the mutant individual is almost normal except for the projection neuron portion.
[0054]
2) Regional defects and abnormal nerve fiber pathways
Deletion of the Arx gene resulted in defective expression of Wnt8b and Lhx9 in the thalamic ridge on embryonic day 12.5. Deletion of the Arx gene also resulted in a marked reduction in the area of Dlx1 expression in the abdominal thalamus at embryonic day 12.5. These disappearances resulted in the loss of the dorsal-ventral central thalamic nuclei, such as the dorsal-central and central thalamic nuclei, at 19.5 days of fetal life. This suggests that the Arx protein functions as a regulatory factor upstream of Wnt8a, Lhx9 and Dlx1 in the formation of the dorsal-ventral central thalamus. Partial hypoplasia of the thalamus has led to enlargement of the third ventricle. Hippocampal hypoplasia in Arx gene deficient mice, particularly in the dentate gyrus and CA3 field, was seen at 19.5 days of embryonic age.
[0055]
Many nerve fiber pathways showed abnormal formation in Arx gene deficient mice. The corpus callosum of the Arx gene-deficient mouse showed a morphological abnormality with shortening along the beak-tail axis at embryonic day 19.5. The shortened corpus callosum is P3 of Arx gene deficient mouse hf But again, something was wrong. In Arx gene-deficient mice, the thalamocortical axis toward the internal capsule extended along an abnormal path of occupying the vicinity of the tonsils. This is probably due to a partial defect of the ventral thalamus in Arx gene deficient mice. Thalamocortical axis in Arx gene deficient mice also utilized the same pathway. In addition, a defect of the Fimbria-hippocampal commissure was found in the hippocampus of Arx gene deficient mice.
[0056]
3) Characterization of interneurons expressing Arx protein
When the Arx protein-expressing cells were embryonic at 13.5 days, in addition to the ventricular zone (VZ) of the cerebral cortex, a unilateral zone (MZ) around the cortical striatum boundary, a cortical plate (CP), and a subplate (SP ), In the intermediate zone (IZ) and in the subventricular zone (SVZ). On day 18.5 of the embryo, Arx protein-expressing cells clustered in pia-arachnoid (pia-arachnoid (PIA)), the unilateral zone, the subventricular region, and the ventricular body of the neocortex were observed. Were scattered in the cortical plate. At P14, the region of the dense Arx protein-expressing cells had disappeared from the marginal zone, but the Arx protein-expressing cells were scattered on the cortical plate.
Double immunohistochemical studies revealed that at 18.5 days of embryonic age, some Arx protein-expressing cells co-express striatum with neuropeptide Y (NPY). At least 50% of Arx protein-expressing cells in the cortical plate co-expressed GABA on embryonic day 18.5, whereas about 10% in the marginal zone co-expressed GABA. At P14, 75% of Arx protein expressing cells co-expressed GABA in the cortical plate. Arx protein expressing cells in one marginal zone did not co-express calretinin.
[0057]
4) Abnormal initial movement of GABAergic interneurons from ganglion elevation
Arx X * Y We examined the expression of ganglionic ridge marker genes and the initial migration of GABAergic interneurons from medial ganglion ridges in mutant mice. Expression of Nkx2.1, a marker gene for medial ganglion prominence, was observed in the subventricular region from medial ganglion prominence to lateral ganglion prominence in Arx gene-deficient mice at embryonic day 12.5 and embryonic day 14.5. The expansion was seen toward. A similar change in Lhx6 expression pattern was observed in ganglionic ridges in Arx gene deficient mice. In addition, the expression of Dlx1, a marker gene for medial and lateral ganglion ridges, was expanded in Arx gene-deficient mice at 14.5 days of embryogenesis. In addition, Nkx2.1 expression was also observed in Arx gene-deficient mice, but not in wild-type cortical subventricular regions. On the other hand, Lhx6 and Dlx1 expression was found in the unilateral marginal zone and the middle zone of the wild-type cortex, but not in Arx gene-deficient mice.
[0058]
These changes in the expression pattern of the ganglionic ridge marker gene resulted in abnormal localization of Dil-labeled cells and calbindin (CB) -positive interneurons. When Dil was placed on the medial ganglion ridge of Arx gene-deficient mice at 13.5 days of embryonic age and cultured for 2 days, it was revealed that there was no migration from the medial ganglion ridge to the intercortical zone, Only labeled cells migrating from the medial ganglion ridge to the cortical subventricular region were found at the cortical striatal border. This was further confirmed by calbindin immunohistochemistry. Calbindin-positive interneurons were found in the wild-type cortical marginal zone, cortical plate, intermediate zone, and subventricular region, whereas in Arx gene-deficient mice, they were observed only in the cortical subventricular region. Further, LacZ-positive cells (cells not expressing Arx protein) were also found in the subcortical region of the Arx gene-deficient mouse and in the ventricle of the neocortex on day 14.5 of embryonic day. Thus, the Arx gene deficiency lacked direct migration of GABAergic interneurons from the medial ganglion ridge to the midcortical zone, while the lateral ganglion from the medial ganglion ridge to the cortical subventricular region. Interneuron migration through the ridge was maintained.
[0059]
5) Abnormal localization of GABAergic interneurons in cortical plate
It was examined whether the GABAergic interneurons of Arx gene-deficient mice were normally differentiated and ultimately appropriately localized in the cortical plate of Arx gene-deficient mice. At embryonic day 16.5, calbindin-positive interneurons were observed in the wild-type unilateral marginal zone, cortical plate, subplate and intermediate zone, whereas in Arx gene-deficient mice, these cells were expressed in the subplate, intermediate zone. And in the subventricular region, but not in the cortical plate. The number of calbindin-positive interneurons in the middle zone of Arx gene-deficient mice was increased as compared with the wild type, and five types of calbindin-positive interneurons clustered to form a cluster. GABA-positive interneurons were also found in the wild-type unilateral marginal zone, cortical plate, subplate, and intermediate zone, but at day 16.5 embryos, the subplate, intermediate zone, and subventricular zone of Arx gene-deficient mice. Was recognized only. At embryonic day 18.5, calbindin- and GABA-positive interneurons were scattered in the wild-type cortical plate, whereas in Arx gene-deficient mice, they were restricted to subplates. At embryonic day 18.5, GAD67-positive interneurons showed the same pattern as GABAergic interneurons. It was examined whether the abnormal location of GABAergic interneurons in the subplate was maintained until late in brain development. GABAergic interneurons are wild-type P3 hf Was concentrated in the cortical V layer, but P3 was hf Were scattered throughout the cortical plate.
[0060]
6) Absence of neuropeptide Y-positive interneurons in the striatum
Neuropeptide Y-positive interneurons, a subset of GABAergic interneurons, are found specifically in medial ganglion ridges and differentiate in the striatum (Marin et al., Science 293, 872-875 (2000)). At 18.5 days of embryonition, Nkx2.1 was expressed in limited cells of the wild-type striatum, but not in the striatum of Arx gene-deficient mice in which LacZ-positive cells were observed. However, apoptosis was not confirmed. At embryonic day 18.5, Lhx6 showed the same expression pattern as Nkx2.1. At embryonic day 18.5, no neuropeptide Y-positive interneurons were found in the striatum of Arx gene-deficient mice, and no neuronal nitric oxide synthase (NOS) -positive interneurons were found. Therefore, considering the co-expression of Arx protein and neuropeptide Y, it was concluded that Arx protein is involved in the differentiation of neuropeptide Y-positive interneurons. Furthermore, the absence of neuropeptide Y-positive interneurons was observed in the neocortex and hippocampus of Arx gene-deficient mice.
[0061]
7) Characterization of Arx protein-expressing cells in testis
At 14.5 days of embryonic embryos, strong expression of Arx protein was observed in the gonad stroma of the male, whereas only weak expression was observed in the gonad region proximal to the mid-kidney of the female. No expression was detectable in Wolfman and Müller tubes. Since the developing male gonadal stroma consists of several different cell types, the type of expression of the Arx protein was examined by immunohistochemistry. At day 12.5, Arx protein was detected in muscle-like cells surrounding seminiferous tubules, white membrane, vascular endothelial cells and cells lining under the white membrane. In addition, the Arx protein was expressed in stromal fibroblast-like cells. On the other hand, almost no staining of Sertoli cells and germ cells could be detected. An essentially similar staining profile was obtained in the testes at 14.5 days of embryo. However, unstained cells were clearly detected in the stroma. Since these cells are not any of myeloid cells, endothelial cells, and fibroblast-like cells around the seminiferous tubules, the present inventors speculated that they were steroid-producing Leydig cells. To confirm this, the expression of the steroidogenic gene 3β-HSD (Miller,
[0062]
8) Abnormal testicular differentiation
In fetal testes at embryonic day 14.5, wild type and Arx X * Y In all testes of mutant mice, spermatic cords are constructed by myioid cells around the seminiferous tubules. Sertoli cells and germ cells, which form the internal structure of the spermatic cord, were considered histologically normal. The lamina and blood vessels appeared to be largely unaffected. However, careful observations have shown that the testes of Arx gene deficient mice are usually characterized by stromal dysplasia, presumably due to a significant decrease in cells containing abundant cytoplasm. Instead, the testis stroma of Arx gene-deficient mice was mainly occupied by fibroblast-like cells. Similar defects were observed in the testis of neonatal Arx gene-deficient mice. In addition, the testis marker gene expression of Arx gene-deficient mice was also examined. At 14.5 days of fetal life, MIS, a specific product of fetal Sertoli cells, was clearly detected in the spermatic cords of wild-type and Arx gene-deficient mouse testes. However, the expression of the Leydig cell marker 3β-HSD was significantly reduced in the interstitium of the testis of Arx gene-deficient mice. This suggests that the effects of Arx gene-deficient mice vary, but that Leydig cell differentiation is inhibited at some stage. The defect was further confirmed by the expression profile of Ad4BP / SF-1 which is normally expressed in both Leydig cells and Sertoli cells. This marker gene is strongly expressed in Leydig cells in wild type and weakly expressed in Sertoli cells (Hatano et al., Development 120, 2787-2797 (1994)), but as expected, strongly expressed in testis of Arx gene-deficient mice. Although weak expression was not observed, weak expression was maintained.
[0063]
9) In the above experiment, antibody, histological analysis, Brdu labeling, apoptosis, organ culture, and rearing of Arx gene-deficient mice were as follows.
[0064]
(1) Preparation of polyclonal antibody
Rabbits were injected with a peptide corresponding to amino acids 158-181 of the Arx protein (amino acid sequence: LKISQAPQVSISRSKSYRENGAPFC (SEQ ID NO: 18)) bound to KLH to produce a polyclonal antibody specific to the Arx protein.
[0065]
(2) Histological analysis
Fixed brain (Marin et al., J. Neurosci. 20, 6063-6076 (2000)) and testis (Morohashi et al., Mol. Endocrinol. 7, 1196-1204 (1993); Nomura et al., J. Biochem. 124-217). 224 (1998)) was performed as described. Basically, fixed tissues are described in accordance with Kitamura et al. (Mech. Dev. 67, 83-96 1997; Development 126, 5749-5758 (1999)) and Kawabe et al. (Mol. Endocrinol. 13, 1267-1284 (1999)). Was performed for in situ hybridization and LacZ staining. A colorimetric reaction with peroxidase and alkaline phosphatase was performed using DAB and AP-Red substrate kit (Zymed), respectively.
[0066]
(3) BrdU labeling
BrdU (2 mg / pregnant mouse) was administered intraperitoneally at each differentiation stage. Fetuses were treated 1 hour post-dose for non-neuronal pulse labeling. Chase of labeled neuroepithelial cells were treated at embryonic day 19.5. To determine the distribution of BrdU-positive cells in the wild-type and mutant cerebral cortex, serial tissue sections (5 μm in thickness) were prepared, stained for BrdU, and then all nuclei were PI (propidium iodide) Stained. The number of BrdU-positive or PI-positive cells in specific areas of the neocortical ventricle was counted and the labeling index was calculated statistically.
[0067]
(4) Apoptosis
ApopTag plus fluorescein in situ apoptosis detection kit (INTERGEN) was used according to the manufacturer's instructions.
[0068]
(5) Organ culture
Organ cultures were performed as described by Anderson et al. (Science 278, 474-476 (1997); Neuron 19, 27-37 (1997)).
[0069]
(6) Arx X * Y Artificial rearing of mutant mice
To delay childbirth, progesterone was administered subcutaneously at 0.15 mg / day on embryos 17, 18, and 19, and cesarean section was performed on embryo 20.5. Wild type and Arx gene deficient mice were then artificially reared in mouse milk for 3 days.
[0070]
(Example 3) Structural analysis of human Arx gene in XLAG patients
Arx X * Y Structural and functional defects observed in the forebrain and testis of mutant mice and the chromosomal localization of Arx to Xp22 confirmed that Arx was a valid candidate gene for XLAG (Dobyns et al., Am. J. Med. Genet. 86, 331-337 (1999); Ogata, Am. J. Med. Genet. 94, 174-176 (2000)). To examine this possibility in humans, the Arx coding region was sequenced in eight XLAG patients and one hypocallosal hypoplasia girl with a XLAG patient sibling. As shown in FIG. 1, Arx consists of five exons encoding 562 amino acids. Sequence analysis of Arx in a series of XLAG patients detected eight mutations (Table 1 and FIG. 1).
[0071]
[Table 1]
The nucleotide sequences of the five exons and flanking regions of Arx (AC002504) were determined as follows. Genomic DNA was amplified by PCR using the primers listed in Table 2 (each of SEQ ID NOs: 3 to 17 from the top). Since exon II has a high G / C content, amplification was performed by two-step and step-down PCR using primers ARX2-5 and ARX2-3 using KOD-Plus-DNA polymerase (TOYOBO). The primers listed in Table 2 were used for sequencing except for exon II. Exon II was composed of three types of forward-sequencing primers (ARX2-5-1, ARX2-5-2 and ARX2-5-3) and two types of forward-sequencing primers. Were sequenced using the reverse-sequencing primers (ARX2-3 and ARX2-3-2).
[0073]
[Table 2]
[0075]
From the above, it was confirmed that mutation of the Arx gene causes human XLAG. In the present invention, eight different sequence changes were identified in XLAG patients. Because the Arx gene is on the X chromosome, we predicted that some mothers would be heterozygous carriers of the mutation. For this, the Arx genes of the parents of
[0076]
Overall, one nonsense mutation (patient 4), four frameshift mutations (
[0077]
The mutations found for XLAG were truncations or amino acid substitutions within the homeodomain of the protein. Interestingly, several missense mutations in the Arx protein, most of which are polyalanine extensions, have recently been reported in X-linked infantile spasm syndrome (ISSX; West Syndrome) and Partinton syndrome ( Stromme et al., Nature Genet. 30, 441-445 (2002); Bivenuu et al., Hum. Mol. Gen. 11, 981-991 (2002)), and apparently X-linked non-syndromic mental retardation (Bienvenu et al., Hum. Mol. Gen. 11, 981-991 (2002)). Similar longening of polyalanine has been observed in several other transcription factors (Brais et al., Nature Genet. 18, 164-167 (19989); Brown et al., Hum. Mol. Genet 10, 791-796 ( 2001)). XLAG children are more severely ill than patients with ISSX or Partington's syndrome, with congenital hypoplasia not found in patients with brain and ISSX or Partington's syndrome. This marked difference in phenotype can be explained by a structural difference in the protein, which is also observed in polyglutamine elongation and results from aggregation of the protein associated with polyamine elongation (Zghbi and Orr, Ann. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000)). However, the cause of the mild phenotype cannot be attributed solely to polyamine lengthening. This is because ISSX occurs even in the truncation of exon V caused by deletion at the 3 'side and in a conservative missense mutation (P353L) in the homeobox. The former is a mild epilepsy syndrome consisting of clonic muscular spasm with epilepsy with mental retardation, and the latter is a convulsion (Stromme et al. Natur Genet. 30, 441-445 (2002); Bienvenu et al. Hum). Mol. Gen. 11, 981-991 (2002)). Mice with the shortened Arx protein show a phenotype similar to XLAG. Thus, we conclude that deficient function of the Arx protein causes a severe phenotype seen in XLAG patients.
[0078]
【The invention's effect】
The present invention has found that a unique mutation exists on the Arx gene of an XLAG patient. Then, it was confirmed that the XLAG-specific mutation on the Arx gene was useful for testing the Arx gene mutation in XLAG. This achieves new developments in XLAG gene diagnosis, its treatment, and research on new drugs.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the Arx gene in healthy individuals and XLAG patients. The upper part shows the genomic structure of the Arx gene, and the lower part shows the Arx protein. Primers used for PCR and sequencing are indicated by arrows.
FIG. 2 is a diagram showing the positions of mutations in patients (
FIG. 3 is a view showing an amino acid sequence substituted for an altered nucleotide sequence of patients (
[Sequence list]
Claims (18)
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番が欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番が欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）上記（３）の塩基番号１１１７番の置換がシトシンからチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）上記（９）の塩基番号９９５番の置換がグアニンからアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）上記（１１）の塩基番号１０２８番の置換がチミンからアデニンに置換しているものThe test method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mutation is selected from at least one of the following.
(1) a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which nucleotide numbers from 420 to 451 are deleted (2) a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which nucleotide number 790 is deleted (3) SEQ ID NO: 1 (4) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which the substitution of nucleotide number 1117 is replaced with cytosine to thymine (4). One having an insertion of one base at No. 1188 (6) A deletion of base No. 1372 of the base sequence of SEQ ID No. 1 (7) A deletion of all exons I and II of the base sequence of SEQ ID No. 1 (8) A nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted (9) A nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide 995 is substituted (10 ) Is the substitution at base number 995 in (9) above guanine? Adenine substitution (11) A substitution of base number 1028 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 (12) Substitution of base number 1028 in (11) above substitutes thymine for adenine thing
（１）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３２番をコードする塩基配列に変異があるもの
（２）上記（１）のアミノ酸番号３３２番のアルギニンがヒスチジンに置換しているもの
（３）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号３４３番をコードする塩基配列に変異があるもの
（４）上記（３）のアミノ酸番号３４３番のロイシンがグルタミンに置換しているものThe test method according to claim 5, wherein the mutation is selected from at least one of the following.
(1) A mutation in the nucleotide sequence encoding amino acid No. 332 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (2) A mutation in which arginine at amino acid No. 332 of (1) is replaced with histidine (3) Sequence A mutation in the nucleotide sequence encoding amino acid No. 343 of the amino acid sequence of No. 2 (4) a substitution of glutamine for leucine at amino acid No. 343 of (3) above
（１）配列番号１の塩基配列の塩基番号４２０〜４５１番の欠失しているもの
（２）配列番号１の塩基配列の塩基番号７９０番の欠失しているもの
（３）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１１７番が置換しているもの
（４）上記（３）の塩基番号１１１７番の置換がシトシンからチミンに置換しているもの
（５）配列番号１の塩基配列の塩基番号１１８８番に１塩基の挿入があるもの
（６）配列番号１の塩基配列の塩基番号１３７２番が欠失しているもの
（７）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの全部が欠失しているもの
（８）配列番号１の塩基配列のエクソンＩ及びＩＩの一部が欠失しているもの
（９）配列番号１の塩基配列の塩基番号９９５番が置換しているもの
（１０）上記（９）の塩基番号９９５番の置換がグアニンからアデニンに置換しているもの
（１１）配列番号１の塩基配列の塩基番号１０２８番が置換しているもの
（１２）上記（１１）の塩基番号１０２８番の置換がチミンからアデニンに置換しているものA polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which is an Arx gene and having at least one of the following mutations in the sequence:
(1) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which the nucleotide numbers from 420 to 451 are deleted (2) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which the nucleotide number of 790 is deleted (3) SEQ ID NO: 1 (4) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which the substitution of nucleotide number 1117 is replaced with cytosine to thymine (4). One having an insertion of one base at No. 1188 (6) A deletion of base No. 1372 of the base sequence of SEQ ID No. 1 (7) A deletion of all exons I and II of the base sequence of SEQ ID No. 1 (8) A nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in which exons I and II are partially deleted (9) A nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 wherein nucleotide 995 is substituted (10 ) Is the substitution at base number 995 in (9) above guanine? Adenine substitution (11) A substitution of base number 1028 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 (12) Substitution of base number 1028 in (11) above substitutes thymine for adenine thing
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2421207A1 (en) * | 2013-05-31 | 2013-08-29 | Universidad De León | Procedure and diagnostic kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) |
-
2002
- 2002-08-22 JP JP2002242202A patent/JP2004081001A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2421207A1 (en) * | 2013-05-31 | 2013-08-29 | Universidad De León | Procedure and diagnostic kit for lissencephaly with cerebellar hypoplasia in sheep (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) |
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