JP2004053359A - Standard and method for measuring soluble fibrin - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a standard for measuring soluble fibrin accurately. <P>SOLUTION: This standard for measuring the soluble fibrin comprises a reaction complex of a reaction product of one molecule of one molecular species selected from the group of des-AA fibrin monomer, des-AABB fibrin monomer, a fragment E derived from fibrin, a fragment Y and a fragment X, and a two molecules of one molecular species selected from the group of fibrinogen, a fragment D derived from fibrin, the fragment Y and the fragment X. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性フィブリン測定用の標準物質と、該標準を用いる可溶性フィブリンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンは、血液中に通常存在するフィブリノゲンに作用して、連続的にＡα鎖のフィブリノペプチドＡ及びＢβ鎖のフィブリノペプチドＢを遊離させ、それぞれモノマーのＩ型フィブリン（デスＡＡフィブリン）及びモノマーのＩＩ型フィブリン（デスＡＡＢＢフィブリン）を形成する。これらのフィブリンは、ある濃度まで血中のフィブリノゲンと結合して可溶性フィブリンとして血液中に存在することができる。しかし、濃度が高くなるにつれて、モノマーのフィブリンが重合してフィブリン凝固物を形成する。従って、フィブリン凝固物形成（血栓形成）を早期に予測し、血管中の血液凝固形成（血栓形成）を防止する処置を至急に行うためには、血液中の可溶性フィブリンを早期に検出することが望ましい。そうした可溶性フィブリンの検出は、フィブリノゲン及びフィブリンの誘導体とは反応しないで、可溶性フィブリンに対して反応性を示す抗体を利用することにより達成され、この目的のため、フィブリンに特異的な抗体の調製、例えば、カドリック等（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８９−９４，１９８４）、ヒュイ等（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ５，２１５−２２２，１９８５）、欧州特許出願第１５２，６１２号明細書、特開昭６０−１５８３５３号公報、特開平２−２８１９７号公報（オランダ国特許出願第３１，８８０１２２７号に相当）及びＷＯ９５／１２６１７公報等、従来より種々報告されている。
【０００３】
しかし、可溶性フィブリンを測定するための抗体があっても、正確に測定するためには、可溶性フィブリンの標準品が確かなもの、品質の均一なものを安定的に供給できなくてはならない。一般に検量用、精度管理用の測定用標準は、ヒト血清を集めて調製されたプール血清、あるいはヒト血清程度の粘性に調製されたウシ血清アルブミン等のタンパク質溶液に、既知量（濃度や活性値として）の測定対象物質を添加する方法で調製される。可溶性フィブリンの標準としては、生体中（血中）に存在するような一分子のヒトフィブリンモノマーと二分子のヒトフィブリノゲンとの結合物質を用いるのが一般的で、特にこの場合、フィブリン供給原としてはヒト血漿が利用されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
測定用標準は、大学病院の検査室や検査センターにおいて、検量用または精度管理用として日常の測定に使われる。そのため、生体中における測定対象物質の挙動を正確に反映し得る物質を標準としなくてはならない。特に本願の対象である可溶性フィブリンは、生体中での存在様式が前述の如く複雑であり、血管内の凝固亢進状態を正確に把握するため、測定用標準の選択・性能維持は重要である。更に、標準は長期にわたり安定保存できることが望ましい。
【０００５】
しかし、可溶性フィブリン測定用標準である一分子のヒトフィブリンモノマーと二分子のヒトフィブリノゲンとの結合物質は、安定化剤等を添加しても微量のトロンビンによってフィブリン塊を形成してしまう。このため可溶性フィブリン測定用標準としては安定性の点で問題があった。フィブリン凝固物形成を早期に予測し、血管中の血液凝固形成を防止する処置を至急に行う必要のある医療現場では、より正確な可溶性フィブリンの測定方法が望まれており、生体中の可溶性フィブリンの挙動を最も正確に反映し、且つ安定な可溶性フィブリン測定用標準を提供するため鋭意検討の結果本発明を完成させた。
【０００６】
なお、検量とは、標準について所望の反応によって吸光度などの測定値を得、標準の濃度等の値とそれらの値の関係式を求めることをいい、検査用試料の測定値を関係式に当てはめることにより、未知試料の目的物質量を求めることができる。また、精度管理とは、多数の試料を連続して測定する際に、あるタイミング（数百検体測定ごと、数時間ごと、など）で標準について測定を行ない、試験精度を確認することをいう。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
デスＡＡフィブリンモノマーあるいはデスＡＡＢＢフィブリンモノマー、フィブリンモノマー由来のフラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種１分子と、フィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種２分子との反応生成複合体からなり、但し、ヒトデスＡＡフィブリンモノマーあるいはヒトデスＡＡＢＢフィブリンモノマーとヒトフィブリノゲンの複合体を除く、可溶性フィブリン測定用標準、
に関する。
更に、デスＡＡフィブリンモノマーあるいはデスＡＡＢＢフィブリンモノマー、フィブリンモノマー由来のフラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種１分子と、フィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種２分子との反応生成複合体で、但し、ヒトデスＡＡフィブリンモノマーあるいはヒトデスＡＡＢＢフィブリンモノマーとヒトフィブリノゲンの複合体を除く、を標準として用いることを特徴とする可溶性フィブリンの測定方法、
にも関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の測定対象である血液中の可溶性フィブリンは、トロンビンがフィブリノゲンに作用して、連続的にＡα鎖のフィブリノペプチドＡ及びＢβ鎖のフィブリノペプチドＢを遊離させ、それぞれモノマーのＩ型フィブリン（デスＡＡフィブリン）及びモノマーのＩＩ型フィブリン（デスＡＡＢＢフィブリン）を形成し、この１分子にフィブリノゲン２分子が結合して血中に存在するものである。従って、可溶性フィブリン測定用標準もこれと同一か、あるいは免疫学的に同等の部位を有する物質であることが必須である。
【０００９】
本発明の標準は、デスＡＡフィブリンモノマーあるいはデスＡＡＢＢフィブリンモノマー、フィブリン由来のフラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種１分子と、フィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種２分子との反応生成複合体であれば良い。換言すれば、フィブリノゲンのＡα鎖Ｎ末から１６アミノ酸を失ったＥフラグメントを含む分子種１分子と、フィブリノゲンあるいはそのＤフラグメントを含む分子種２分子を反応させて生成する複合体である。
【００１０】
複合体を得るためには、１分子側としてフィブリンモノマー、フィブリン由来のフラグメントＥ、Ｙ、Ｘが必要であり、２分子側としてフィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、Ｙ、Ｘが必要となる。それら各分子種は、市販品あるいは血液を処理・抽出・精製等したものいずれも利用することができる。また、２分子側のフィブリノゲンについては、血漿をそのまま用いることもできる。何故なら、血漿中にはフィブリノゲンが大量に含まれており、他のフラグメントに比較してフィブリンモノマー（フィブリン由来のフラグメントＥ、Ｙ、Ｘを含む）との親和力が高いので、優先的にフィブリノゲンとの複合体を形成する。
【００１１】
前記で使用する血漿は、ヒト、ウサギ、ウシ、ブタ等哺乳動物由来の血漿であれば使用できる。但し、フィブリンモノマーに対して血漿（フィブリノゲン）を利用するとき、特にヒト血漿の場合はそれ自身が高価で、ロットサイズが小さく同一性能を有する標準を大量に供給できず、更にはロット間の保存性に問題が生じる等から、ヒト以外の血漿を使用する方が好適である。但し、１分子側がフィブリンモノマー以外の分子種の場合は、安定性の面では特段の問題はないため、ヒト血漿も適用できる。
【００１２】
それぞれ所望の組み合わせの複合体を形成させるには、各分子種を適当な溶媒（緩衝液等）に溶解して混合すればよい。濃度的には２分子側分子種のモル比を１分子側の少なくとも２倍以上にすればよい。
例えば、最小構成要件となる１分子側にＥフラグメント、２分子側にＤフラグメントを選択した場合、Ｅのα鎖Ｃ末端（‘Ａ’結合サイト）とＤの‘ａ’結合サイトが化学量論的に反応するため、かならず３分子の結合体を形成する。この形態が可溶性フィブリンの必須部位を構成しており、ネオアンチゲンとして免疫学的に検出するためのターゲットサイトとなる。
【００１３】
こうして形成される複合体は、可溶性フィブリン測定用の標準として使用できる。各種複合体は、反応混合液をそのまま、あるいは生理食塩水、緩衝液（リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等）、血漿等で希釈したもの、または複合体をカラムクロマト法等で単離・精製したものを生理食塩水、緩衝液、血漿等に溶解して使用することが出来る。あるいは、公知の方法により錠剤、凍結乾燥品として、使用時に精製水、生理食塩水や緩衝液等に溶解してもよい。
【００１４】
本発明は、上述のように得られた標準を用いて、可溶性フィブリンを測定することができる。本発明における測定方法とは、デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノゲンと結合したフィブリン・フィブリノゲン複合体、すなわちヒト可溶性フィブリンが形成される際にフィブリン分子内に新たに出現するネオ・アンチジェンを免疫学的に検出する方法であり、更に詳細には、ヒトフィブリノゲンとは反応しない抗体を用いる免疫学的測定方法である。より詳細には、本発明で使用できる抗体は、ヒト可溶性フィブリンと特異的に反応するが、ヒトフィブリノゲンとは反応しないモノクローナル抗体であり、血漿検体をチオシアン酸ナトリウム（ＫＳＣＮ）等のタンパク変性剤で前処理することなく、血漿中に存在する可溶性フィブリンを迅速かつ正確に、しかも検体中に共存するフィブリノゲン、各種フィブリノゲンフラグメント、各種フィブリンフラグメント及び安定化フィブリンの各種プラスミン分解物とは反応せず、かつそれらの阻害を受けないものが好適である。
【００１５】
本発明の可溶性フィブリン測定方法に用いる被検試料は、可溶性フィブリンを含有する可能性のある試料であれば特に制限されるものではないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、血漿又は尿、好ましくは血漿である。
【００１６】
より具体的な測定方法としては、凝集法、サンドイッチＥＩＡ法等公知の手段を用いることができる。凝集反応を利用する場合、不溶性担体としては、一般に抗原抗体の凝集反応を利用する免疫学的測定方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。こうして、抗体と不溶性担体との複合体を形成し、本発明標準と被検試料それぞれのシグナルを測定し、被検試料中の可溶性フィブリンの濃度を知ることができる。
【００１７】
サンドイッチＥＩＡ法を利用する場合は、抗体を適当な不溶性担体に固定化し（固定化抗体）、次に、本発明標準または検体試料を加えて一定時間反応させる（１次反応）。続いて、抗体に標識を付した第２抗体を加えて一定時間反応させ（２次反応）、洗浄後、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を検出する。その値から、検体試料中の可溶性フィブリンの量を算出することができる。不溶性担体は特に限定されるものではなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。標識物質として酵素、蛍光物質又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としてはアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としてはフルオレセンイソチオシアネート等、また、発光物質としてはアクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００１８】
上述の測定方法により、血漿中の可溶性フィブリンを測定することで、臨床的に重要なＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）の診断や治療後の経過観察を正確に把握することができる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】フィブリンモノマー−フィブリノゲン
ＸＩＩＩ因子フリーのフィブリノゲン（Ｋａｂｉ社）１ｇ（乾燥重量）を、５％ＥＤＴＡを含む生理食塩水２リットルに溶解し、５０ＮＩＨのトロンビンを添加した後、３７℃で９０分間保温した。生じたフィブリンクロットを、生理食塩水５００ｍｌで３回遠心分離法で洗浄した。洗浄後のフィブリンクロットを酢酸で可溶化し、酢酸可溶化フィブリンモノマー（デスＡＡＢＢ）を得た。得られた酢酸可溶化フィブリンモノマーをウシ血漿（コージンバイオ社）に対し、８０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、３７℃の恒温槽内で加温しながら、３時間撹拌、撹拌後、混合物をろ過し、可溶性フィブリン標準（１分子側：フィブリンモノマー、２分子側フィブリノゲン）溶液とした。
同様に酢酸可溶化フィブリンモノマーをヒト血漿（国際バイオ社）に対して８０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、以下同様に操作し、比較標準溶液とした。
【００２０】
前記可溶性フィブリン標準液をウシ血漿で、比較標準液をヒト血漿でそれぞれ希釈し、０、１０、２０、４０、８０μｇ／ｍＬの濃度となるように希釈列を調製した。なお、濃度８０μｇ／ｍＬは標準溶液をそのまま用いた。この各希釈列に対して、可溶性フィブリン測定用試薬（イアトロＳＦ、ヤトロン製）を用いて日立自動分析装置Ｈ７１７０で可溶性フィブリン濃度を測定した。その結果を図１に示す。
【００２１】
図１において、□はウシ血漿を用いた標準、◆はヒト血漿を用いた標準の結果である。図１から明らかなように、ウシ血漿を用いても可溶性フィブリン測定用標準として使用できることがわかった。なお、同様にウサギ血漿（コージンバイオ社）、ブタ血漿（コージンバイオ社）についても同様に操作した結果、問題なく使用できることがわかった。
【００２２】
【実施例２】血漿種別による比較
ロットの異なる複数の各ウシ血漿、ヒト血漿、ウサギ血漿、ブタ血漿を用いて実施例１と同様に操作し、各標準液を調製した。これを２５℃で１ヶ月保存した後、各標準液の可溶性フィブリン濃度を測定した。調製直後の可溶性フィブリン濃度を１００％とした時の、６ヵ月後の結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】

【００２４】
表１のように、ヒト血漿においては保存安定性の面でロット間差を生じる可能性があることがわかる。特に、一分子側にフィブリンモノマーを使用した場合、ウシ血漿、ウサギ血漿、ブタ血漿（フィブリノゲンの供給原）との組み合わせが好適である。
【００２５】
【実施例３】各種組み合わせ複合体の確認
以下の各種材料を調製した。
（１）フィブリノゲン由来フラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸの調製
（フラグメントＹ及びＸ）
フィブリノゲン（エンザイムリサーチ社）４５０ｍｇを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．０５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）４５ｍＬに溶解する。５ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した後、ヒトプラスミン（クロモジェニックス社）０．３ｍｇを添加し、３７℃で１時間加温した。その後、反応混合物をゲルろ過し、フィブリノゲン由来フラグメントＸ、フラグメントＹを得た。
（フラグメントＤ）
フィブリノゲン（エンザイムリサーチ社）４５０ｍｇを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．０５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）４５ｍＬに溶解する。５ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した後、ヒトプラスミン（クロモジェニックス社）０．３ｍｇを添加し、３７℃で２２時間加温した。その後、反応混合物をアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、フィブリノゲン由来フラグメントＤを得た。
（２）フィブリン由来フラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸの調製（フラグメントＹ及びＸ）
上記（１）の方法で得たフラグメントＸ及びＹの１００ｍｇに５００ＮＩＨのトロンビンを添加し、３７℃で９０分間加温した。生じたクロットを生理食塩水５００ｍＬで３回遠心分離法で洗浄した。洗浄後のクロットを酢酸で可溶化し、フィブリン由来フラグメントＹ及びＸを得た。
（フラグメントＥ）
フィブリノゲン（エンザイムリサーチ社）５００ｍｇを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．０５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬに溶解する。５ｍＭになるよう塩化カルシウムを添加した後、５０ＮＩＨのトロンビンを添加し、３７℃で２時間保温した。生じたフィブリンクロットを、濾紙上にとり、生理食塩水５００ｍｌで洗浄した。水分を十分除去し、乳鉢を使って、粒子が均一になるまで擦りつぶし、フィブリンパウダーを得る。得られたフィブリンパウダー０．５ｇを５ｍＭの塩化カルシウムを含む、０．１５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．８）に浮遊させる。プラスミン（クロモジェニックス社）１２０μｇを添加し、３７℃の恒温槽内で加温しながら、穏やかに撹拌する。反応物をセファクリルＳ−３００ＨＲカラムでゲルろ過し、ＸＤＰ（フェーズ４）を得る。得られたＸＤＰに６Ｍになるように尿素を添加し、３７℃で３時間加温する。反応物を上記Ｓ−３００ＨＲカラムでゲルろ過し、フラグメントＥを得た。
【００２６】
フィブリンフラグメントＸ１００μｇをフィブリノゲンフラグメントＸを２００μｇ、１５０ｍＭＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、３７℃で３時間加温しながら混合したものを標準として、実施例１に準じて可溶性フィブリンを測定した。結果を図２に示す。
【００２７】
図２から明らかなように、１分子側にフィブリンフラグメントＸ、２分子側にフィブリノゲンフラグメントＸを用いた標準も、可溶性フィブリン測定用標準として適用できることが確認できた。
【００２８】
その他の分子種の各組み合わせについても同様に試験を行った。なお、フィブリノゲンはエンザイムリサーチ社製（ヒト由来）のものを使用した。結果を表２に示す。表２の「〇」は、可溶性フィブリン測定用標準として適用できたものを示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
表２から明らかなように、少なくとも１分子側にＥフラグメント、２分子側にＤフラグメントを有する分子種の複合体であれば、可溶性フィブリン測定用標準として適用できる。また、保存性も良好であった。
【００３１】
【発明の効果】
以上のように、本発明による可溶性フィブリン測定用標準を用いることで、正確に可溶性フィブリンを測定できることができる。また、一般的に入手困難なヒト血漿を使用しなくても、ウシ等の血漿を利用することができ、安定で、ロット間差の無い可溶性フィブリン測定用標準品の調製が可能である。二次的な効果としては、安価になる点も挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行った、１分子側にフィブリンモノマー、２分子側にヒト血漿フィブリノゲン（◆）複合体、及び１分子側にフィブリンモノマー、２分子側にウシ血漿フィブリノゲン（□）複合体を用いた標準希釈列中の可溶性フィブリン値を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実施例３で行った、１分子側にフィブリンフラグメントＸ、２分子側にフィブリノゲンフラグメントＸの複合体を用いた標準希釈列中の可溶性フィブリン値を測定した結果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a standard substance for measuring soluble fibrin and a method for measuring soluble fibrin using the standard.
[0002]
[Prior art]
Thrombin acts on fibrinogen normally present in the blood to continuously release fibrinopeptide A of the Aα chain and fibrinopeptide B of the Bβ chain, respectively, the monomer type I fibrin (des AA fibrin) and the monomer Form type II fibrin (Death AABB fibrin). These fibrins can be present in the blood as soluble fibrin by binding to fibrinogen in the blood to a certain concentration. However, as the concentration increases, the monomeric fibrin polymerizes to form a fibrin clot. Therefore, in order to predict the formation of fibrin clots (thrombus formation) at an early stage and to promptly take measures to prevent the formation of blood clots (thrombus formation) in blood vessels, it is necessary to detect soluble fibrin in the blood at an early stage. desirable. The detection of such soluble fibrin is achieved by utilizing an antibody reactive with soluble fibrin without reacting with fibrinogen and a derivative of fibrin.For this purpose, preparation of an antibody specific to fibrin, For example, Cadric et al. (Macromolecular Immunology, 89-94, 1984), Huy et al. (Hybridoma 5, 215-222, 1985), European Patent Application No. 152,612, JP-A-60-158353, JP-A-60-158353. Various reports have hitherto been made, such as -28197 (corresponding to Dutch Patent Application No. 31,88012227) and WO95 / 12617.
[0003]
However, even if there is an antibody for measuring soluble fibrin, in order to accurately measure the soluble fibrin, it is necessary to be able to stably supply a reliable soluble fibrin standard product and a product of uniform quality. In general, the standard for measurement for calibration and quality control is the use of a known amount (concentration or activity value) in a pooled serum prepared by collecting human serum or in a protein solution such as bovine serum albumin prepared to be as viscous as human serum. ) Is prepared by a method of adding a substance to be measured. As a standard for soluble fibrin, it is common to use a binding substance of one molecule of human fibrin monomer and two molecules of human fibrinogen as present in a living body (blood). Used human plasma.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The measurement standard is used for daily measurement in a laboratory or an inspection center of a university hospital for calibration or quality control. Therefore, a substance that can accurately reflect the behavior of the measurement target substance in the living body must be used as a standard. In particular, soluble fibrin, which is the subject of the present application, has a complicated mode of existence in a living body as described above. In order to accurately grasp the state of hypercoagulation in a blood vessel, it is important to select a measurement standard and maintain its performance. In addition, it is desirable that the standard can be stored stably for a long period of time.
[0005]
However, the binding substance of one molecule of human fibrin monomer and two molecules of human fibrinogen, which is a standard for measuring soluble fibrin, forms a fibrin clot with a trace amount of thrombin even when a stabilizer or the like is added. Therefore, there is a problem in terms of stability as a standard for measuring soluble fibrin. In medical settings where it is necessary to predict fibrin clot formation at an early stage and to take urgent measures to prevent blood clot formation in blood vessels, a more accurate method for measuring soluble fibrin is desired. As a result of intensive studies, the present invention was completed as a result of the most accurate reflection of the behavior of the present invention and the provision of a stable standard for measuring soluble fibrin.
[0006]
Note that calibration refers to obtaining measured values such as absorbance of a standard by a desired reaction and obtaining a relational expression between the values of the standard concentration and the values, and applying the measured values of the test sample to the relational expression. Thereby, the amount of the target substance of the unknown sample can be obtained. In addition, accuracy control refers to confirming the test accuracy by measuring a standard at a certain timing (every several hundred samples, every several hours, etc.) when continuously measuring a large number of samples.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
One molecule of one kind selected from des AA fibrin monomer or des AABB fibrin monomer, fragment E, fragment Y, or fragment X derived from fibrin monomer, and selected from fibrinogen, fragment D, fragment Y, and fragment X derived from fibrinogen. A standard for measuring soluble fibrin, which comprises a reaction product complex of two molecules of one molecular species, except for a complex of human des AA fibrin monomer or a complex of human des AABB fibrin monomer and human fibrinogen,
About.
Further, one molecule of one kind selected from the group consisting of des AA fibrin monomer or des AABB fibrin monomer, fragment E derived from fibrin monomer, fragment Y and fragment X, and fibrinogen, fragment D derived from fibrinogen, fragment Y and fragment X Measurement of soluble fibrin, which comprises using, as a standard, a reaction product complex of two selected one molecular species, excluding a complex of human des AA fibrin monomer or a complex of human des AABB fibrin monomer and human fibrinogen. Method,
Related to
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Soluble fibrin in the blood to be measured according to the present invention is characterized in that thrombin acts on fibrinogen to continuously release fibrinopeptide A of the Aα chain and fibrinopeptide B of the Bβ chain, each of which is a monomeric type I fibrin. (Des AA fibrin) and monomeric type II fibrin (des AABB fibrin), and two molecules of fibrinogen bind to one molecule and are present in the blood. Therefore, it is essential that the standard for measuring soluble fibrin be the same or a substance having an immunologically equivalent site.
[0009]
The standard of the present invention includes one molecule of one molecular species selected from des AA fibrin monomer or des AABB fibrin monomer, fibrin-derived fragment E, fragment Y, and fragment X, and fibrinogen, fibrinogen-derived fragment D, fragment Y, Any complex can be used as long as it is a reaction product complex with two molecules of one molecular species selected from fragment X. In other words, it is a complex formed by reacting one molecule of a molecular species containing an E fragment, which has lost 16 amino acids from the N-terminal of the Aα chain of fibrinogen, with two molecules of a molecular species containing fibrinogen or its D fragment.
[0010]
In order to obtain the complex, fibrin monomer and fibrin-derived fragments E, Y, and X are required on one molecule side, and fibrinogen and fibrinogen-derived fragments D, Y, and X are required on the two molecule side. As each of these molecular species, any of commercially available products or those obtained by treating, extracting, or purifying blood can be used. In addition, for fibrinogen on the two-molecule side, plasma can be used as it is. This is because plasma contains a large amount of fibrinogen and has a higher affinity for fibrin monomers (including fibrin-derived fragments E, Y, and X) than other fragments. To form a complex.
[0011]
The plasma used in the above can be any plasma derived from mammals such as human, rabbit, cow, pig and the like. However, when plasma (fibrinogen) is used for the fibrin monomer, especially in the case of human plasma, it is expensive in itself, the lot size is small, and it is not possible to supply a large amount of the standard having the same performance, and furthermore, the storage between lots It is more preferable to use non-human plasma because of problems such as sex problems. However, when one molecule side is a molecular species other than the fibrin monomer, there is no particular problem in terms of stability, and therefore human plasma can be applied.
[0012]
In order to form a complex of a desired combination, each molecular species may be dissolved in an appropriate solvent (such as a buffer) and mixed. In terms of the concentration, the molar ratio of the molecular species on the two-molecule side may be at least twice or more than that on the one-molecule side.
For example, when an E fragment is selected on one molecule side and a D fragment on the two molecule side which are the minimum constitutional requirements, the stoichiometry of the C-terminal ('A' binding site) of E and the 'a' binding site of D Reaction, a conjugate of three molecules is always formed. This form constitutes an essential site of soluble fibrin and serves as a target site for immunological detection as neoantigen.
[0013]
The complex thus formed can be used as a standard for measuring soluble fibrin. Various complexes are prepared by diluting the reaction mixture as it is, or diluted with physiological saline, buffer solution (phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Good buffer solution, etc.), plasma, etc., or complex by column chromatography or the like. The isolated and purified product can be used by dissolving it in physiological saline, buffer, plasma or the like. Alternatively, it may be dissolved in purified water, physiological saline, a buffer or the like at the time of use as a tablet or a lyophilized product by a known method.
[0014]
In the present invention, soluble fibrin can be measured using the standard obtained as described above. The measurement method according to the present invention refers to a method of immunizing des AABB fibrin or a fibrin / fibrinogen complex in which des AA fibrin is bound to fibrinogen, that is, neo-antigen newly appearing in the fibrin molecule when human soluble fibrin is formed. And more specifically, an immunoassay using an antibody that does not react with human fibrinogen. More specifically, the antibody that can be used in the present invention is a monoclonal antibody that specifically reacts with human soluble fibrin but does not react with human fibrinogen, and a plasma sample is treated with a protein denaturing agent such as sodium thiocyanate (KSCN). Without pretreatment, soluble fibrin present in plasma is rapidly and accurately, and does not react with fibrinogen coexisting in the sample, various fibrinogen fragments, various fibrin fragments and various plasmin degradation products of stabilized fibrin, and Those that do not suffer from such inhibition are preferred.
[0015]
The test sample used in the method for measuring soluble fibrin of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain soluble fibrin, and is, for example, a biological sample, particularly blood, serum, plasma or urine. , Preferably plasma.
[0016]
As a more specific measurement method, a known method such as an aggregation method and a sandwich EIA method can be used. When an agglutination reaction is used, as the insoluble carrier, any insoluble carrier generally used in an immunological assay method utilizing an antigen-antibody agglutination reaction can be used. For example, latex particles (particularly, polystyrene latex particles) ). In order to immobilize the antibody on the insoluble carrier, a known method, for example, a chemical bonding method (using carbodiimide, glutaraldehyde or the like as a crosslinking agent) or a physical adsorption method can be used. Thus, a complex of the antibody and the insoluble carrier is formed, and the signal of each of the standard of the present invention and the test sample is measured, whereby the concentration of soluble fibrin in the test sample can be known.
[0017]
When the sandwich EIA method is used, the antibody is immobilized on a suitable insoluble carrier (immobilized antibody), and then the standard or specimen sample of the present invention is added and reacted for a certain period of time (primary reaction). Subsequently, a labeled second antibody is added to the antibody and reacted for a certain period of time (secondary reaction). After washing, the amount of the labeled antibody present on the insoluble carrier is detected. From that value, the amount of soluble fibrin in the sample can be calculated. The insoluble carrier is not particularly limited, for example, polyethylene, polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polymers such as polysaccharide, other nitrocellulose, paper, agarose and these Can be exemplified. It is advantageous to use enzymes, fluorescent substances or luminescent substances as labeling substances. As the enzyme, alkaline phosphatase, peroxidase, β-D-galactosidase and the like can be used. As the fluorescent substance, fluorescein isothiocyanate and the like can be used. As the luminescent substance, acridinium ester and luciferin can be used.
[0018]
By measuring soluble fibrin in plasma by the above-described measurement method, diagnosis of clinically important DIC (disseminated intravascular coagulation syndrome) and follow-up after treatment can be accurately grasped.
[0019]
【Example】
Examples are shown below, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Fibrin Monomer-Fibrinogen Factor XIII-free 1 g (dry weight) of fibrinogen (Kabi) was dissolved in 2 liters of physiological saline containing 5% EDTA, and 50 NIH of thrombin was added. Incubated for 90 minutes. The resulting fibrin clot was washed three times with 500 ml of physiological saline by centrifugation. The washed fibrin clot was solubilized with acetic acid to obtain an acetic acid solubilized fibrin monomer (DESAABB). The obtained acetic acid-solubilized fibrin monomer was added to bovine plasma (Kojin Bio Co., Ltd.) to a concentration of 80 μg / mL, and the mixture was stirred for 3 hours while being heated in a thermostat at 37 ° C. The mixture was filtered to obtain a soluble fibrin standard (one molecule side: fibrin monomer, two molecule side fibrinogen) solution.
Similarly, an acetic acid-solubilized fibrin monomer was added to human plasma (International Bio Inc.) so as to have a concentration of 80 μg / mL, and the same operation was carried out to obtain a comparative standard solution.
[0020]
The soluble fibrin standard solution was diluted with bovine plasma, and the comparative standard solution was diluted with human plasma, and a dilution series was prepared to have a concentration of 0, 10, 20, 40, and 80 μg / mL. Note that the standard solution was used as it was at a concentration of 80 μg / mL. The concentration of soluble fibrin was measured for each of the dilution series with a Hitachi automatic analyzer H7170 using a reagent for measuring soluble fibrin (IATRO SF, manufactured by Yatron). The result is shown in FIG.
[0021]
In FIG. 1, □ shows the results of a standard using bovine plasma, and ◆ shows the results of a standard using human plasma. As is clear from FIG. 1, it was found that bovine plasma could be used as a standard for measuring soluble fibrin. Similarly, rabbit plasma (Kojin Bio) and porcine plasma (Kojin Bio) were operated in the same manner. As a result, it was found that they can be used without any problem.
[0022]
Example 2 Comparison by plasma type A plurality of standard solutions were prepared in the same manner as in Example 1 using a plurality of bovine plasmas, human plasmas, rabbit plasmas, and pig plasmas of different lots. After storing this at 25 ° C. for one month, the concentration of soluble fibrin in each standard solution was measured. Table 1 shows the results after 6 months when the soluble fibrin concentration immediately after preparation was taken as 100%.
[0023]
[Table 1]

[0024]
As shown in Table 1, it is understood that there is a possibility that a difference between lots may occur in human plasma in terms of storage stability. In particular, when a fibrin monomer is used on one molecule side, a combination with bovine plasma, rabbit plasma, and pig plasma (a source of fibrinogen) is suitable.
[0025]
Example 3 Confirmation of Various Combination Composites The following various materials were prepared.
(1) Preparation of fibrinogen-derived fragment D, fragment Y, and fragment X (fragments Y and X)
450 mg of fibrinogen (Enzyme Research) is dissolved in 45 mL of 0.05 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. After adding calcium chloride to 5 mM, 0.3 mg of human plasmin (Chromogenix) was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the reaction mixture was subjected to gel filtration to obtain fibrinogen-derived fragments X and Y.
(Fragment D)
450 mg of fibrinogen (Enzyme Research) is dissolved in 45 mL of 0.05 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. After adding calcium chloride to 5 mM, 0.3 mg of human plasmin (Chromogenix) was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 22 hours. Thereafter, the reaction mixture was purified by affinity chromatography to obtain fibrinogen-derived fragment D.
(2) Preparation of fragment E, fragment Y and fragment X derived from fibrin (fragments Y and X)
To 100 mg of the fragments X and Y obtained by the method (1), thrombin of 500 NIH was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 90 minutes. The resulting clot was washed three times with 500 mL of physiological saline by centrifugation. The washed clot was solubilized with acetic acid to obtain fibrin-derived fragments Y and X.
(Fragment E)
500 mg of fibrinogen (Enzyme Research) is dissolved in 50 mL of 0.05 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. After adding calcium chloride to 5 mM, thrombin of 50 NIH was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 2 hours. The resulting fibrin clot was taken on filter paper and washed with 500 ml of physiological saline. Remove enough water and grind using a mortar until particles are uniform to obtain fibrin powder. 0.5 g of the obtained fibrin powder is suspended in a 0.15 M Tris buffer (pH 7.8) containing 5 mM calcium chloride. 120 μg of plasmin (Chromogenix) is added, and the mixture is gently stirred while heating in a thermostat at 37 ° C. The reaction is gel filtered through a Sephacryl S-300HR column to give XDP (Phase 4). Urea is added to the obtained XDP to a concentration of 6 M, and the mixture is heated at 37 ° C. for 3 hours. The reaction product was subjected to gel filtration using the above-mentioned S-300HR column to obtain fragment E.
[0026]
According to Example 1, 100 μg of fibrin fragment X was dissolved in 200 μg of fibrinogen fragment X in 0.05 M Tris buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, and mixed while heating at 37 ° C. for 3 hours as a standard. Soluble fibrin was measured. FIG. 2 shows the results.
[0027]
As is clear from FIG. 2, it was confirmed that the standard using fibrin fragment X on one molecule side and fibrinogen fragment X on the two molecule side can also be applied as a standard for measuring soluble fibrin.
[0028]
The same test was performed for each combination of other molecular species. The fibrinogen used was one manufactured by Enzyme Research (human). Table 2 shows the results. “〇” in Table 2 indicates those applicable as standards for measuring soluble fibrin.
[0029]
[Table 2]

[0030]
As is clear from Table 2, a complex of molecular species having an E fragment on at least one molecule side and a D fragment on at least two molecules side can be applied as a standard for measuring soluble fibrin. Also, the storage stability was good.
[0031]
【The invention's effect】
As described above, soluble fibrin can be accurately measured by using the standard for measuring soluble fibrin according to the present invention. In addition, it is possible to use bovine plasma or the like without using generally available human plasma, which makes it possible to prepare a stable standard product for measuring soluble fibrin without lot-to-lot difference. A secondary effect is that it is cheaper.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a fibrin monomer on one molecule side, a human plasma fibrinogen (◆) complex on one molecule side, and a bovine plasma fibrinogen (□) complex on one molecule side, performed in Example 1. It is a graph which shows the result of having measured the soluble fibrin value in the standard dilution series using a body.
FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the soluble fibrin value in a standard dilution series performed in Example 3 using a complex of fibrin fragment X on one molecule side and fibrinogen fragment X on two molecule side.

Claims (2)

デスＡＡフィブリンモノマーあるいはデスＡＡＢＢフィブリンモノマー、フィブリン由来のフラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種１分子と、フィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種２分子との反応生成複合体からなり、但し、ヒトデスＡＡフィブリンモノマーあるいはヒトデスＡＡＢＢフィブリンモノマーとヒトフィブリノゲンの複合体を除く、可溶性フィブリン測定用標準。One molecule of one molecular species selected from des AA fibrin monomer or des AABB fibrin monomer, fibrin-derived fragment E, fragment Y, and fragment X, and one molecule selected from fibrinogen, fibrinogen-derived fragment D, fragment Y, and fragment X. A standard for measuring soluble fibrin, which comprises a complex formed by reaction of two kinds of molecular species with the exception of human des AA fibrin monomer or a complex of human des AABB fibrin monomer and human fibrinogen. デスＡＡフィブリンモノマーあるいはデスＡＡＢＢフィブリンモノマー、フィブリン由来のフラグメントＥ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種１分子と、フィブリノゲン、フィブリノゲン由来のフラグメントＤ、フラグメントＹ、フラグメントＸから選ばれる一種類の分子種２分子との反応生成複合体で、但し、ヒトデスＡＡフィブリンモノマーあるいはヒトデスＡＡＢＢフィブリンモノマーとヒトフィブリノゲンの複合体を除く、を標準として用いることを特徴とする可溶性フィブリンの測定方法。One molecule of one molecular species selected from des AA fibrin monomer or des AABB fibrin monomer, fibrin-derived fragment E, fragment Y, and fragment X, and one molecule selected from fibrinogen, fibrinogen-derived fragment D, fragment Y, and fragment X. A method for measuring soluble fibrin, which comprises using, as a standard, a complex formed by reaction between two molecules of different molecular species, except for a complex of human des AA fibrin monomer or a complex of human des AABB fibrin monomer and human fibrinogen.

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