JP2004041179A

JP2004041179A - New protein and dna encoding the same

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Publication number: JP2004041179A
Application number: JP2003124833A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Hayashizaki; 林崎　良英; Mamoru Kamiya; 神谷　守; Hideo Kubodera; 久保寺　英夫
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Dnaform KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Dnaform KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2004-02-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for the use of a protein and a DNA encoding the protein by analyzing the base sequence of a cDNA clone in a catalogized complete length cDNA library, specifying the physiological activity of the protein encoded by the cDNA when the sequence of the clone is new and using the physiological activity as a base of the utilization. <P>SOLUTION: The protein is (a) a protein composed of a specific amino acid sequence or (b) a protein composed of an amino acid sequence obtained by the deletion, substitution and/or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein (a) and having an IAP (inhibitor-of-apoptosis)-like protein activity. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｃＤＮＡの取得及びその塩基配列解析は、生体内に発現するタンパク質の生理活性を解析し、その活性に基づくタンパク質の利用方法を開発するうえで不可欠である。さらに、全遺伝子種に対応する完全長ｃＤＮＡをカタログ化したライブラリーの作製は、ヒトゲノムプロジェクトの重要な課題の一つである。カタログ化したライブラリーとは、ライブラリーに含まれるｃＤＮＡに重複がないという意味であり、各ｃＤＮＡが１種類ずつ含まれているライブラリーのことである。
【０００３】
完全長ｃＤＮＡクローニング法については、特開平９−２４８１８７号公報及び特開平１０−１２７２９１号公報に記載されている。この方法は、ｍＲＮＡの５’キャップサイトに存在するジオール構造にタグになる分子を結合させる工程、前記タグ分子を結合させたｍＲＮＡを鋳型とし、ｏｌｉｇｏ　ｄＴをプライマーとして逆転写によりＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を作製し、この複合体の内、ｍＲＮＡの完全長に対応するＤＮＡを有するものをタグ分子の機能を利用して分離する工程を含むことを特徴とする方法である。
【０００４】
また効率のよい逆転写法として、鋳型が高次構造を形成しないような高温で行うための方法も開発されている（特開平１０−８４９６１号公報）。さらに、合成された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片についてその鎖長に関わらず一律にクローニングすることができるクローニングベクターも開発されている（特開平１１−９２７３号公報）。
【０００５】
このような技術により作製された完全長ｃＤＮＡライブラリーは、ライブラリーの個々の要素として全て均等に異なるものが含まれている訳ではなく、存在割合の高いクローンや逆に極微量にしか存在しないクローンもある。この極微量にしか存在しないクローンは新規である可能性が高いため、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法も開発されている（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　３７，　３２７−３３６（１９９６））。
【０００６】
かくして得られるカタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーの各クローンについて、公知の方法により塩基配列の解析を行えばその塩基配列は同定されるが、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質の生理活性は依然不明のままである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうち配列が新規なものについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウス完全長ｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡクローンが有する塩基配列を解析し、該配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にＩＡＰ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）様タンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がＩＡＰ様タンパク質であると同定した。また、これらのｃＤＮＡの各組織における発現量を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
すなわち本発明によれば、以下の（１）〜（１５）に記載の発明が提供される。
（１）　以下の　（ａ）　または　（ｂ）　のタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＡＰ様タンパク質作用を有するタンパク質。
【００１０】
（２）　（１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）　（１）に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
（４）　以下の　（ａ）　、　（ｂ）又は（ｃ）　の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
（５）　（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６）　（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
（７）　（６）に記載の細胞により産生される、（１）に記載のタンパク質。
【００１２】
（８）　（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【００１３】
（９）　（１）または（７）に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
（１０）　抗体がモノクローナル抗体である（９）に記載の抗体。
（１１）　モノクローナル抗体が（１）または（７）に記載のタンパク質のＩＡＰ様タンパク質作用を中和する作用を有することを特徴とする（１０）に記載の抗体。
【００１４】
（１２）　（１）または（７）に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
（１３）　（６）に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
（１４）　（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
（１５）　（１）に記載のタンパク質、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または当該アミノ酸配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、若しくは逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつＩＡＰ様タンパク質をコードし得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
【００１６】
具体的には、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８９〜１１３８に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’及び／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には、例えば、下述の方法により取得することができる。まず、適当な動物、好ましくは哺乳動物の組織等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するが、このとき完全長のｃＤＮＡを合成するために５’キャップ（^７ＭｅＧ_ｐｐｐＮ）サイトに特異的なジオール構造にタグになる分子を化学結合させ、このｍＲＮＡを鋳型としてｏｌｉｇｏ　ｄＴをプライマーとして逆転写した後に、タグ分子の機能を利用して完全長のｃＤＮＡのみを分離する方法（特開平９−２４８１８７号公報；特開平１０−１２７２９１号公報）を用いることが好ましい。また、逆転写の際には、鋳型が高次構造を形成して逆転写の効率が低下することを阻止するために、トレハロース等の存在下で、耐熱性逆転写酵素を用いて高温下で逆転写を行う方法（特開平１０−８４９６１号公報）を用いるのが好ましい。ここで、高温下とは４０〜８０℃を意味する。
【００１８】
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、様々な鎖長のＤＮＡを一律にクローニングすることが可能な、クローニングサイトの両末端にリコンビナーゼ認識配列を有し、感染以外の方法で宿主に挿入される直鎖状のベクター（特開平１１−９２７３号公報）が好ましく用いられる。かくして得られるｃＤＮＡライブラリーは、全てのクローンが均一に存在している（以下、これを「カタログ化されている」と称することがある）訳ではなく、このライブラリー中に極微量にしか存在しないクローンこそ新規である確率が高い。そこで、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　３７，　３２７−３３６（１９９６））を用いることが好ましい。
【００１９】
カタログ化されたｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡ全長の場合にはその末端１００ベースの配列について得られた塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベースについて検索し、最も高い相同性を示す配列でも一致度が３０％以下であるものを新規として以下の解析に供することとした。
【００２０】
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８９〜１１３８に示される配列を有するものが挙げられる。
【００２１】
かくして取得された新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．　Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３−４１０　（１９９０））による相同性検索　（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；　Ｅｄｄｙ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　１４，　７５５−７６３　（１９９８））　の機能群のひとつである　ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索　（ｐｒｏｆｉｌｅ　ｓｅａｒｃｈ：　ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００２２】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されているアミノ酸配列の機能ドメイン部分と、本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のこれに対応する部分との一致度がｅ−ｖａｌｕｅとして１０^−４以下のものか、あるいは３０％以上のものを示す。
【００２３】
例えば、上位にヒットした機能ドメイン配列の多くがＩＡＰ様タンパク質としての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、ＩＡＰ様タンパク質としての機能を持つであろうという予測が成り立つ。
【００２４】
ＨＭＭＰＦＡＭでは、Ｐｆａｍという蛋白質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有する配列の特徴を、解析対象である配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析が行なわれる。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない構造でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し、機能予測ができる。かくして行われるタンパク質の機能予測の具体的な例として以下に説明する。
【００２５】
配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチによりＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２０３が、ｅ−ｖａｌｕｅ：７×１０^−６７、３４８アミノ酸残基に亘り４３％の一致度で、またＭｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：１×１０^−３８、３５５アミノ酸残基に亘り３３％の一致度で、さらに、Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｆｉ−１６が、ｅ−ｖａｌｕｅ：６×１０^−３９、３５１アミノ酸残基に亘り３３％の一致度でヒットする。これらの結果より、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質はインターフェロンによって発現誘導され核内に存在することが推測できる。
また、上記Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２０３タンパク質（ＩＡＰ様タンパク質）はＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（”２００−ｆａｍｉｌｙ”）の一つであり、マウス　（ＩＦＩ２０２ａ，　ＩＦＩ２０２ｂ，　ＩＦＩ２０３，　ＩＦＩ２０４　ａｎｄ　Ｄ３）および　ヒト（ＭＮＤＡ，　ＩＦＩ−１６　及び　ＡＩＭ２）　で構造上類似しているのみならず、核内に存在すること、並びにＩＦＩ２０２の遺伝子産物ｐ２０２は転写因子ＮＦ−κＢ、ｃ−Ｆｏｓ，及びｃ−Ｊｕｎに結合し転写を抑制することが（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，（１９９６）　３５９−３６８）、上記Ｍｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４１：４０−４３（１９９５））から骨髄系での転写の調節に関わることが、また上記Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｆｉ−１６タンパク質は、データベース中の文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７：１１９２４−１１９３１（１９９８））から転写の抑制に関わることがそれぞれわかる。
【００２６】
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ、配列番号２のアミノ酸番号３−８７にタンパク質相互作用を行う分子の特徴を示す配列（ＰｆａｍにＰＡＡＤ＃ＤＡＰＩＮとしてエントリーされる配列）を見出した。
これらのことから、配列番号１に示す塩基配列がコードするタンパク質はＩＡＰ様タンパク質であり、インターフェロンによって発現誘導され、タンパク質相互作用を介して転写因子の働きを修飾する機能を有する転写制御因子であることが推測できる。本明細書において、ＩＡＰ様タンパク質作用を有するタンパク質とは、より具体的には、インターフェロンによって発現誘導され、タンパク質相互作用を介して転写因子の働きを修飾する機能を有する転写制御因子を言う。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、翻訳配列中に塩基の欠失もしくは挿入を有した状態で取得されることがあるが、上記のような相同性検索やタンパク質特徴検索を行った結果、該ＤＮＡの塩基配列中の欠失もしくは挿入が推測された場合には、当業者において通常用いられているライブラリースクリーニングやＰＣＲクローニング等の方法を用いて塩基の欠失もしくは挿入の無い完全長ｃＤＮＡを取得することができる。かくして得られる完全長ｃＤＮＡを用いて本発明のタンパク質を発現させ、これを機能解析に用いることができる。
【００２８】
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは上記の配列番号１に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下を意味する。）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、これらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号２に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするものが含まれる。
【００２９】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列とＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００３０】
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
また、配列番号１に記載の塩基配列は、マウスを由来とするものであるが、上記したｃＤＮＡライブラリーの作製法に従ってヒトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーに対して配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。本発明の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトのホモログＤＮＡや下述するヒトのオルソログＤＮＡも含まれる。
【００３１】
また、インフォマティックスを利用して、ヒトホモログＤＮＡが有する塩基配列を予測し、該塩基配列を基に上記のヒトｃＤＮＡライブラリーなどからヒトホモログＤＮＡを取得することもできる。
一般的に、インフォマティックスを利用して目的とするタンパク質のホモログタンパク質をコードする塩基配列を予測する方法としては、例えば、（ｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒト等のｃＤＮＡデータベース（インフォマティックスにより予測されるｃＤＮＡデータベースを含む）に対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行う方法や、（ｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとしてヒト等のＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、ヒットしたＥＳＴが有する配列を目的とするｃＤＮＡの塩基配列を参照して連結する方法、さらに（ｉｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒトなどのゲノムデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、目的とするｃＤＮＡの遺伝子が存在するゲノム上の位置を特定し、そのゲノム領域に対してＧｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．　ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）やＳｉｍ４（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　８：　９７６−７４　（１９９８））等を用いて、該ゲノム中の遺伝子部分の塩基配列を予測する方法等が挙げられる。
【００３２】
マウス由来のｃＤＮＡのヒトホモログＤＮＡの塩基配列を予測する場合、上記の方法のいずれも用いることができるが、本発明の配列番号１に記載の塩基配列を有するｃＤＮＡはいずれも新規であり、上記（ｉ）の方法では、ヒトホモログＤＮＡの塩基配列を取得できないと考えられるため、（ｉｉ）あるいは（ｉｉｉ）に記載の方法などが好ましく用いられる。
【００３３】
かくして予測されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列を基に、上記のヒトｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。具体的な取得方法としては、例えば、予測されたヒトホモログＤＮＡの５’端、および３’端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う方法や、予測されたヒトホモログＤＮＡの一部の配列をプローブとして、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーションを行う方法等が挙げられる。
【００３４】
一般的に、目的遺伝子が有する塩基配列とホモロジーの高い塩基配列を有する類似遺伝子を「ホモログ」と呼び、上記の方法においてもヒトホモログの取得を目的としているが、遺伝子の機能解析においては、塩基配列が類似していることだけではなく、ホモログとして取得された遺伝子が、目的遺伝子のファミリーメンバーであることを確認することが重要である。２種類の生物間で「ホモログ」として取得された遺伝子は、共通の祖先遺伝子から進化した同一の遺伝子である「オルソログ」である可能性と、また、共通の祖先遺伝子からの重複によって生じた異なる遺伝子である「パラログ」である可能性がある。
【００３５】
つまり、上記でホモログとして取得されたヒト由来のＤＮＡは、これを、本発明のタンパク質と同一の機能を有すると解するには、また、該ヒト由来のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を、本発明のタンパク質のマウスにおける機能として推定検証するには、上記ヒトホモログが本発明のマウス遺伝子の近縁種のオルソログであることを確認することが好ましい。
【００３６】
オルソログであることの確認方法は、例えば、以下の方法などが用いられる。（１）まず、本発明のｃＤＮＡの塩基配列と、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、本発明のｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるヒト塩基配列について相同性検索を行い、取得されたヒトホモログＤＮＡとクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度より高いことを確認する。さらに、（２）取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列と、対応する本発明のｃＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるマウス塩基配列について相同性検索を行い、本発明のｃＤＮＡとクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列との一致度より高いことを確認する。上記（１）および（２）を確認することにより、取得されたヒトホモログが、本発明のｃＤＮＡに対応するヒトオルソログであると同定することができる。上記（１）および（２）に記載した相同性の解析はアミノ酸配列の比較を用いても良く、また、分子進化系統樹を描いて検討することもできる。また、上記（１）および（２）に記載した相同性解析による一致度は、クエリーの全長にわたる一致度として解析することが好ましい。
【００３７】
かくして取得されたヒトホモログＤＮＡ、あるいはオルソログＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索やＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
本発明の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトホモログ、あるいはオルソログタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００３８】
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を決定すること等ができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号２に記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＡＰ様タンパク質作用を有するタンパク質も含まれる。
【００３９】
本発明のタンパク質の取得方法としては、（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
【００４０】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体、又は他の塩に変換することができる。この様な本発明のタンパク質の塩も本発明のタンパク質に含まれる。また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製前、又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も、上記したＩＡＰ様タンパク質作用を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００４２】
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物、または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
【００４３】
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
【００４４】
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４，（１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１，　（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
【００４５】
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，　７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４２１６，　（１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１：アメリカン　タイプ　カルルチャー　コレクション保存細胞）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）、ヒト子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−２）等が好ましく用いられる。
【００４６】
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．　Ｖｅｒｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９，　（１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
【００４７】
得られた培養物は、細胞あるいは菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
【００４８】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００４９】
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、ＩＡＰ様ものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
【００５０】
かくして得られたタンパク質は、他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用等を解析することにより、生体内における多面的な機能を知ることができる。上記相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。
【００５１】
（３）オリゴヌクレオチドの調製および該オリゴヌクレオチドを用いる機能解析上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００５２】
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
【００５３】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００５４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法（以下、これを「ＲＮＡｉ法」と称することがある）に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　４１１，　４９４−４９８（２００１））に記載の方法等を用いることができる。
上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
【００５５】
標的遺伝子とは、本発明のＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞おいては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ，　Ｐ．　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，　５，　１１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：　Ｂａｓｓ，　Ｂ．Ｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　４１１，　４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’、５’ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ，　Ｂ．Ｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　４１１，　４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物、または該動物由来の細胞、あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、最も好ましくは２１ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’、または３’末端が一部突出したものも含むが、３’末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。
【００５６】
２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００５７】
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は、相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００５８】
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業で、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００５９】
被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００６０】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００６１】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００６２】
（４）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ　Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。
【００６３】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００６４】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００６５】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００６６】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，　４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
【００６７】
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ．　Ｚｉｍｍｅｒ−　ｍａｎｎ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８，　５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００６８】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ_２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００６９】
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ，　Ｄ．　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，　３３５，　２５６−２５９　（１９８８）；　Ｄｕｃｈｏｓａｌ，　Ｍ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　３５５，　２５８−２６２（１９９２））。
【００７０】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００７１】
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するＩＡＰ様タンパク質作用を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触させ、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
【００７２】
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００７３】
（５）本発明のタンパク質が有する活性の確認および解析
本発明のタンパク質は、これを上記（２）に記載のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに上述（４）のとおりに作製した抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
本発明のタンパク質は、ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（”２００−ｆａｍｉｌｙ”）であるマウス　ＩＦＩ２０２，　ＩＦＩ２０３，　ＩＦＩ２０４および　ヒトＭＮＤＡ，　ＩＦＩ−１６　ＡＩＭ２と構造上類似していることから、インターフェロン誘導タンパク質ファミリー分子であり転写制御に関与すると思われる。このような本発明のタンパク質の転写制御活性を測定する方法としては、例えば、以下に説明する方法等が挙げられる。
【００７４】
本発明タンパク質の転写制御活性は、当業者であれば例えば以下の様にレポータージーンアッセイ等を行うことで検討できる（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，（１９９６）　３５９−３６８）。ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、およびＯＣＴ１などによって制御されるプロモーターの下流にそれぞれルシフェラーゼ遺伝子またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を連結させたレポータージーンアッセイ用ベクターを構築する。本発明タンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのベクターとレポータージーンアッセイ用ベクターを、Ｌ９２９細胞またはＥＬ４細胞に一過性に遺伝子導入し、インターフェロン、ｐｏｌｙ（ｒＩ）・ｐｏｌｙ（ｒＣ）、またはＰＭＡの存在・非存在下で定法に従ってレポータージーンの活性を測定することができる。
【００７５】
また、本発明タンパク質が例えば転写因子ＮＦ−κＢと結合することは、本発明タンパク質のＮ末端またはＣ末端にＧＳＴを連結させた融合タンパク質をグルタチオンアガロースビーズに結合させ、これに細胞抽出液を添加し４℃にて一晩インキュベーションを行い、バッファーでビーズを洗浄し非特異的吸着物質を除いた後、ビーズ結合物を回収しＳＤＳゲル電気泳動後、抗ＮＦ−κＢ抗体を用いて免疫ブロッティングを行うことにより、本発明タンパク質とＮＦ−κＢとの特異的結合能の有無を検討することができる。
【００７６】
さらに、例えば、ＤＮＡ・ＲＮＡに結合して転写に関与するタンパク質については、既知の転写関連因子が認識し標的とするプロモーターやエンハンサー等の遺伝子転写調節領域（以下、これを「標的転写調節領域」と称することがある）のＤＮＡおよびその部分断片を用いて、これらに対する結合能を測定することにより網羅的に転写制御活性を解析することもできる（特開２００１−３１４１９０号公報）。解析に使用する標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片として、既知の標的転写調節領域の塩基配列（以下、これを「標的配列」と称することがある）を有するものだけでなく、既知の標的転写調節領域の塩基配列をデーターベース解析し分類してそれぞれ設計した、転写関連因子が共通して認識する標的転写調節領域の共通塩基配列（以下、これを「コンセンサス標的配列」と称することがある）を有するものを使用してもよい。既知の転写関連因子としては、例えば、ｖ−ｊｕｎ，　ｃ−ｊｕｎ，　ｊｕｎＢ，　ｊｕｎＤ，　ｄＪＲＡ，　ｃ−ｆｏｓ，　ｆｏｓＢ１，　ｆｏｓＢ２，　Ｆｒａ−１，　ＬＲＦ−１，　ｖ−ｍａｆ，　ｍａｆＧ，　ＮＦ−Ｅ２　ｐ４５，　ａＮＦ−Ｅ２，　ｆＮＦ−Ｅ２，　Ｎｒｆ　ｓｈｏｒｔ　ｆｏｒｍ，　ＧＣＮ４，　ｙＡＰ−１，　ＣＲＥＢ−２，　ＡＴＦ−３，　ＣＲＥ−ＢＰ１，　ＣＲＥ−ＢＰ３，　ＡＴＦ−ａ，　ＣＲＥＢ−３４１，　ＣＲＥＢ−３２７，　ＣＲＥＭ，　ｄＣＲＥＢ２，　ｄＣＲＥＢ２−ｂ，　ｄＣＲＥＢ２−ｃ，　ｄＣＲＥＢ２−ｄ，　ｄＣＲＥＢ２−ｑ，　ｄＣＲＥＢ２−ｒ，　ｄＣＲＥＢ２−ｓ，　Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ，　Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ，　ｐ３４Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ，　ＣＨＯＰ−１０，　ＶＢＰ，　Ｈｌｆ，　ＣＰＲＦ−２，　ＥｍＢＰ−１ｂ，　ＥｍＢＰ−１ｂ，　ＧＢＦ１，　ＧＢＦ２，　ＧＢＦ３，　ＣＰＲＦ−１，　ＴＡＦ−１，　ＨＢＰ−１ａ，　ＧＢＦ９，　ＧＢＦ１，　ＧＢＦ１２，　ＣＰＲＦ−３，　ＴＧＡ１ａ，　ＴＧＡ１ｂ，　Ｏ２，　ＳＴＥ４，　ＯＰＩ１，　Ｅ２Ａ，　Ｅ４７，　ＩＴＦ−２／ＳＥＦ２−１Ｂ，　ＳＥＦ−１Ａ，　ＭｙｏＤ，　ｐ４２Ｔａｌ−１，　ＨＥＮ−１，　ＡｈＲ，　Ａｒｎｔ，　ＵＳＦ，　ＮＦ−１Ａ１，　ＮＦ−１Ａ１．１，　ＮＦ−１Ａ６，　ＮＦ−１Ｂ１，　ＮＦ−１Ｂ１，　ＮＦ−１Ｂ２，　ＮＦ−１Ｃ２／ＣＴＦ−２，　ＣＴＦ−４，　ＣＴＦ−６，　ＲＦ−Ｘ１，　ＡＰ２ａｌｐｈａＡ／ＡＰ−２ａｌｐｈａ１，　ＡＰ２ａｌｐｈａ２，　ＡＰ２ａｌｐｈａ３，　ＡＰ２ａｌｐｈａ４，　ＡＰ２ａｌｐｈａＢ，　ＡＰ２ｂｅｔａ，　ＡＰ２ｇａｍｍａ，　ＧＲ，　ＡＲ，　ＥＲ，　ＲＸＲ−ａｌｐｈａ，　ＰＰＡＲａｌｐｈａ，　ＰＰＡＲｇａｍｍａ，　ＣＯＵＰ−ＴＦ１，ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ１，　ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ２，　ＣＦ１，　ＧＡＴＡ−１，　ＧＡＴＡ−２，　ＧＡＴＡ−３，　ＧＡＴＡ−４，　ＡＲＥＡ／ＮＩＴ−２，　Ｓｐ１，　ＹＹ１，　Ｅｇｒ−１，　Ｅｇｒ−２，　Ｅｇｒ−３，　Ｓｎａｉｌ，　ＣＦ２−ＩＩ，　Ｅｖｉ−１，　Ｉｋａｒｏｓ，　ＭＺＦ−１，　Ｔｒａｍｔｒａｃｋ６９Ｋ，　ＨＯＸ９，　ＣＤＰ，　ＨＮＦ−１Ａ，　Ｎｋｘ−２．２，　Ｎｋｘ−２．５，　ＴＴＦ−１，　Ｏｃｔ−１Ａ，　Ｏｃｔ−１Ｂ，　Ｏｃｔ−１Ｃ，　Ｏｃｔ−２，　Ｏｃｔ−２．１／Ｏｃｔ−２Ｂ，　Ｐａｘ−３，　Ｐａｘ−６，　Ｐａｘ−１，　ＨＳＦ１（ｓｈｏｒｔ），　ＨＳＦ２，　ｄＨＳＦ，　ｆｕｎｇａｌＨＳＦ，　ｃ−Ｍｙｂ，　Ａ−Ｍｙｂ，　ｖ−Ｍｙｂ，　Ｐ（ｌｏｎｇ），　Ｐ（ｓｈｏｒｔ），　Ｃ１（ｌｏｎｇ），　Ｃ１（ｓｈｏｒｔ），　ｃ−Ｅｔｓ−１＿ｐ５４，　Ｅｔｓ−１＿ｄｅｌｔａｉＶ／ＶＩＩ，　Ｅｔｓ−２，　Ｅｌｋ−１，　ＳＡＰ−１，　ＳＡＰ−１ｂ，　Ｅｒｇ−１，　ｐ５５ｅｒｇ，　Ｆｌｉ−１ｂ，　Ｅ４ＴＦ１−６０／ＧＡＢＰ−ａｌｐｈａ，　Ｅ７４Ａ，　ＩＲＦ−１，　ＩＲＦ−２，　ｐ５０，　ＮＦ−ＡＴｃ，　ＮＦ−Ａｔｐ，　ｐ９１，　ｐ８４，　ＳＴＡＴ２，　ＳＴＡＴ３，　ＳＴＡＴ４，　ＳＴＡＴ５Ａ，　ＳＴＡＴ５Ｂ，　ＳＴＡＴ６，　ｐ５３，　ＭＥＦ−２Ａ，　ＳＲＦ，　Ｅ２，　ＴＢＰ，　ＳＲＹ，　Ｓｏｘ−５，　Ｓｏｘ−９，　ｍａｔ−Ｍｃ，　ＣＰ１Ａ，　ＣＰ１Ｂ，　ＣＢＦ−Ｃ，　ＡＭＬ１ａ，　等が知られており、これらの転写関連因子の標的転写調節領域の塩基配列もそれぞれ報告されている（田村隆明、外２名編、「Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　実験医学別冊　新用語ライブラリー　転写因子」、第２版、株式会社羊土社、１９９９年１２月）。
【００７７】
このような転写制御活性を有するタンパク質と標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片との結合は、それ自体公知の測定系を使用して検出することができる。例えば、標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片を固定化したプレートに本発明のタンパク質を含む被検試料を添加し、両者の直接的な結合をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，　表面プラズモン共鳴）法を用いて検出することができる。その場合には、前記したような転写に関連するタンパク質が認識する標的転写調節領域のＤＮＡまたはその部分断片をセンサーチップに固定化する。ＤＮＡ及びその部分断片は、アニーリングさせたものを固定化する。また、前記のように、本発明のタンパク質または標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片を蛍光標識したものを用いて、両者の結合を検出することもできる。
【００７８】
本発明のタンパク質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することにより蛋白質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。
【００７９】
また、転写に関連するタンパク質は、疾患に関与する種々の遺伝子の転写を調節する転写因子（以下、「疾患関連転写因子」と称する）への作用を解析することにより、該タンパク質が特定の疾患に直接的または間接的に関与しているか否かを解析することも有用である。疾患関連転写因子としては、例えば、ＰＰＡＲ，　ｐ５３，　ＮＦκＢ，　ＡＰ−１，　ＨＩＦ−１，　ＣＲＥＢ等が知られており、これら既知の因子への作用を上記と同様の方法等を用いて解析すればよい。
【００８０】
例えば、ＳＰＲ法を用いて解析を行う場合には、前記疾患関連転写因子が有する標的転写調節領域のＤＮＡまたはその部分断片が特に好ましく用いられる。このようなＤＮＡまたは部分断片が固定化されたセンサーチップに本発明のタンパク質を含む被検試料を適宜添加し、センサーチップ表面のＤＮＡと被検試料中に含まれる該タンパク質との間の相互作用を解析する。固定化ＤＮＡと親和性を有する場合、コントロールに比較してＳＰＲ応答値が上がり、転写関連因子が固定化ＤＮＡと親和性を有していることが推定できる。このような解析により、本発明のタンパク質が特定の疾患においてどのような機能を有しているかを解析することができる。
【００８１】
ここで、本発明のタンパク質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することにより蛋白質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。
【００８２】
疾患関連転写因子は、該疾患関連転写因子が含まれている細胞抽出液または細胞核抽出液から取得することができる。また、前述のように、疾患関連転写因子をコードするＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、疾患関連転写因子をコードするｃＤＮＡを使用し、その全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または動物に導入し、疾患関連転写因子が発現したこれらの遺伝子導入細胞の培養上清または細胞内、組織、体液より、組換え蛋白質である疾患関連転写因子を取得することができる。
【００８３】
なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。また、これらの機能アッセイ系は、後述する本発明のタンパク質の機能賦活物質や機能阻害物質のスクリーニングや本発明のタンパク質の発現調節物質のスクリーニングにも用いることができる。
【００８４】
本発明のタンパク質の機能解析の方法として一般的には、例えば、（ｉ）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ｉｉ）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（ｉｉｉ）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（ｉｖ）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。このような方法によれば、対象タンパク質に特異的な活性を多面的に解析することができる。
【００８５】
（ｉ）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．，　Ｅｄ．　ｂｙ　Ｈａｒｒｉｓ，　Ｎ．　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，　Ｄ．　Ｇ．，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０））、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などが挙げられる。ここで、解析の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Ｗｏｎｇ，　Ｙ．，　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔ．，　３２０：　　１４１−１４５　（２００２））等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合にも、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００８６】
（ｉｉ）の方法においては、本発明のタンパク質と既知のタンパク質との相互作用の有無を調べて、本発明のタンパク質の機能を解析することができる。相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
【００８７】
（ｉｉｉ）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、本発明のＤＮＡあるいは公知のバリアントをコードするＤＮＡを同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はＤＮＡ結合活性またはＩＡＰ様タンパク質作用を有するものであることがわかっているので、ＤＮＡ結合タンパク質またはＩＡＰ様タンパク質が関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
【００８８】
（ｉｖ）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
【００８９】
（６）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
【００９０】
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、まずはじめに本発明のタンパク質と被検物質とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
【００９１】
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記（４）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。
【００９２】
具体的な解析方法としては、具体的には、上記（５）に記載の方法等を用いて行うことができる。転写制御活性、あるいは、転写因子との結合性が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質は転写制御活性化物質あるいは転写因子結合促進物質として機能する可能性があり、また低下または阻害された場合には物質は転写制御阻害物質として機能する可能性があると同定できる。
【００９３】
ここで、医薬活性成分のスクリーニングを目的とするため、用いる本発明のＤＮＡ、あるいは組み換えタンパク質については、上記したヒトのホモログタンパク質またはオルソログタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、これらの生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。
【００９４】
本発明タンパク質はインターフェロン誘導タンパク質ファミリー分子であり転写制御に関与すると思われるので、本発明タンパク質の発現制御物質、機能賦活物質、または機能阻害物質は、免疫応答に関連する種々の疾患、癌、糖尿病、肥満、炎症疾患、呼吸器系疾患等の治療剤として用いられ得るものである。
【００９５】
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９６】
（７）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、上記（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
【００９７】
被検物質としては、上記（６）に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
【００９８】
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９９】
（８）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より、具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰***させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【０１００】
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
【０１０１】
（９）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体としてもちいられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。
【０１０２】
ここで、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
【０１０３】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。このＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【０１０４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１　ｃＤＮＡライブラリーの調製
（１）ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡ調製マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）各器官または組織０．５〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、ｐＨ４．０　の２Ｍ　酢酸ナトリウム１ｍｌと、同量のフェノール／　クロロホルム（体積比５：１）混液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、ＲＮＡが水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、１５分間４，０００ｒｐｍで冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。この検体を７０％エタノールで洗い、８ｍｌの水に溶解後、２ｍｌの５Ｍ　ＮａＣｌ、１　％　ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ−　ｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０　の水溶液１６ｍｌを加えることでＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【０１０５】
続いて室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【０１０６】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製したｍＲＮＡ　１５μｇを使って逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔ　により、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ　ＫＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌ　ＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター　５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号３）（配列中、ＶはＡ，Ｇ，又はＣを示し、ＮはＡ，　Ｇ，　Ｃ，又はＴを示す）１２．６μｌをプライマーとして用いた。
【０１０７】
この反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−^３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　８μｌ、１０％　ＳＤＳ　２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ　２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【０１０８】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。それらは、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジドと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【０１０９】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％　ＳＤＳ　０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％　ＳＤＳ　５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５Ｍ　ＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）　７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【０１１０】
（４）ＲＮａｓｅ　Ｉによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記（３）で取得したビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ　Ｉで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記（３）で得られた試料７０μｌに１０×ＲＮａｓｅ　Ｉバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅ　Ｉ（ＲＮａｓｅ　Ｏｎｅ^ＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間１本鎖ＲＮＡを消化した。
【０１１１】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅ　Ｉ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液にて洗った。
【０１１２】
このビーズを５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、（４）で取得したＲＮａｓｅ　Ｉ処理を施されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液で４回、０．４％　ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅ　Ｈ用バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ））で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅ　Ｈ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅ　Ｈ　３ｕｎｉｔを加え、３７℃下３０分間加温した。その後、１０％　ＳＤＳ　１μｌ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１１３】
このようにして回収された１本鎖完全長ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１１４】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
上記（５）で回収された１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌは、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＣｏＣｌ_２、１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００μＭ　ｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１１５】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍｇ／μｌ　ＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ　６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター（配列番号４）６００ｎｇを加え、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ；ＴａＫａＲａ社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅ　Ｈ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１６】
０．５Ｍ　ＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、更に蛋白成分を溶解するために、１０％　ＳＤＳ　１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）　Ｋ　１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１１７】
（８）ライブラリーの調製
以上の方法により得られた二本鎖完全長ｃＤＮＡは、λＺＡＰＩＩＩベクターに挿入し、ライブラリーとして回収した。λＺＡＰＩＩＩベクターはλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）ベクターのマルチクローニングサイトの一部の配列（配列番号５）を配列番号６に改変し、二つのＳｆｉＩサイトを新たに導入したものである。
【０１１８】
さらにλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクターを作製し、ｃＤＮＡを挿入した。λＰＳ（ＲＩＫＥＮ）（λ−ＦＬＣ−１と命名（ＦＬＣとはＦＵＬＬ−ＬＥＮＧＴＨ　ｃＤＮＡを意味する））とは、ＭｏＢｉＴｅｃ社（ドイツ）のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変したものである。即ち１０ｋｂｐ　ｓｔｕｆｆｅｒの両側に存在するクローニングサイトにｃＤＮＡ挿入に便利なＢａｍＨＩならびにＳａｌＩを各々導入するとともに、０．５ｋｂから１３ｋｂ程度までのｃＤＮＡがクローニングできるようにＸｂａＩサイトに６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したものである（特開２０００−３２５０８０号公報）。このλ−ＦＬＣ−１を用いると、例えば肺臓ｃＤＮＡライブラリーの場合には、インサートの平均鎖長は２．５７ｋｂとなり、実際に０．５ｋｂから１２ｋｂまでのインサートをクローニングすることが出来た。従来法のλＺＡＰの場合には、インサートの平均鎖長は０．９７ｋｂであったことから、λ−ＦＬＣ−１を用いることによって、サイズの大きなｃＤＮＡもλＺＡＰに比べて効率よくクローニングできることがわかる。
【０１１９】
実施例２　完全長ｃＤＮＡライブラリーのノーマライゼーション／サブトラクション
（１）ドライバーの調製
実施例１（１）で作製したｍＲＮＡ（以下、これを「（ａ）ＲＮＡドライバー」と称することがある）、及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応で作成したＲＮＡをドライバーとして用いた。後者のＲＮＡはさらに２種類（以下、これを「（ｂ）ＲＮＡドライバー」、及び「（ｃ）ＲＮＡドライバー」と称する）に分けられる。１つはノーマライゼーションにより除かれたＲＮＡ−ｃＤＮＡからｃＤＮＡを回収し、ファージベクターにクローニングしたものである。大腸菌に感染後１つの出発材料あたり１０００から２０００プラークを混ぜ合わせて１つのライブラリー（ミニライブラリー）とし、常法によりプラスミドＤＮＡに変換する（ファージをヘルパーファージとともに再度大腸菌に感染させ、ファージミドとし、さらにもう一度感染させてプラスミドＤＮＡを得る）。
【０１２０】
得られたＤＮＡについてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる）を行い、ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＲＱ１−ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ処理後、フェノール／クロロホルム抽出をしてＲＮＡ（ｂ）ＲＮＡドライバーを得た。この際、通常出発材料としては９種類（すい臓、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、睾丸、小腸、胃）の組織からそれぞれミニライブラリーを作成して、９種類のミニライブラリーを混合してＲＮＡを得る。もう一つのＲＮＡはすでに重複のないクローンとして保存されているライブラリー（クローン数約２万個）を培養し、得られたＤＮＡについて（ｂ）ＲＮＡドライバーと同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応を行い（ｃ）ＲＮＡドライバーとした。
【０１２１】
これら３種のＲＮＡは、Ｌａｂｅｌ−ＩＴ　Ｂｉｏｔｉｎ　ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｍｉｒｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いてビオチン化標識を行ったあと、１：１：１の割合でテスターｃＤＮＡに添加し、Ｒｏｔ１０での反応（４２℃）を行い、ストレプトアビジンビーズ（ＣＰＧ）処理を行って回収した上清について、第２鎖の合成を行った。
【０１２２】
実施例３　完全長ｃＤＮＡクローンの塩基配列決定
（１）クローンのｒｅａｒｒａｙ
各クラスタからひとつの代表クローンを選んだ。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ　ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにａｒｒａｙ化した。その際、大腸菌は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ｃＤＮＡライブラリーがＰＳベクターに導入され大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、Ｚａｐベクターに導入し、ＳＯＬＲシステムに導入している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを添加して行った。
【０１２３】
（２）プラスミドの抽出とＩｎｓＳｉｚｉｎｇ
上記（１）で培養した各クローンは、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養され、遠心分離により菌体を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　９６　Ｔｕｒｂｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動を行った。
【０１２４】
（３）配列決定
かくして取得されたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。その際、プラスミドはベクターがＰＳの場合には配列番号７（センス鎖）、及び配列番号８（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いて、またベクターがＺａｐの場合には配列番号９（センス鎖）、配列番号１０（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いてＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＰｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応し、Ｌｉｃｏｒ　ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１２５】
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ３７７及び／またはＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）とＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔとＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１２６】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によった。その際、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＩＳＡ　３８４とＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
このＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入し、更に該組み換えベクターにより大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から上記（２）と同様にしてプラスミドを調製した。
【０１２７】
それらの代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｓｈｅａｒｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ　Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマーウォーキングによって決定した。
【０１２８】
実施例４　塩基配列の解析
ｄｎａｆｏｒｍ３５７６３は、配列番号１に示すように、１１３８塩基から成り、そのうち塩基番号８９から１１３８までがオープンリーディングフレーム　（終止コドンは現れず、１１３８が塩基配列中の最終コドン）　になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、３５０アミノ酸残基から成る　（配列番号２）。配列番号１がコードするアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース　（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの）　中に、（ｉ）データベース登録記号Ｏ３５３６８、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２０３が、ｅ−ｖａｌｕｅ：７×１０^−６７、３４８アミノ酸残基に亘り４３％の一致度で、また（ｉｉ）データベース登録記号Ｐ４１２１８、Ｍｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：１×１０^−３８、３５５アミノ酸残基に亘り３３％の一致度で、さらに（ｉｉｉ）データベース登録記号Ｑ１６６６６、Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｆｉ−１６が、ｅ−ｖａｌｕｅ：６×１０^−３９、３５１アミノ酸残基に亘り３３％の一致度でヒットした。これらの結果より配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質はインターフェロンによって発現誘導され核内に存在することが推測された。
【０１２９】
また、上記（ｉ）のタンパク質（ＩＡＰ様タンパク質）はＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（”２００−ｆａｍｉｌｙ”）の一つであり、マウス　（ＩＦＩ２０２ａ，　ＩＦＩ２０２ｂ，　ＩＦＩ２０３，　ＩＦＩ２０４　ａｎｄ　Ｄ３）および　ヒト（ＭＮＤＡ，　ＩＦＩ−１６　及び　ＡＩＭ２）　で構造上類似しているのみならず、核内に存在すること、並びにＩＦＩ２０２の遺伝子産物ｐ２０２は転写因子ＮＦ−κＢ、ｃ−Ｆｏｓ，及びｃ−Ｊｕｎに結合し転写を抑制することが報告されている（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，（１９９６）　３５９−３６８）。（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４１：４０−４３（１９９５））から骨髄系での転写の調節に関わることが、また上記（ｉｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７：１１９２４−１１９３１（１９９８））から転写の抑制に関わることがそれぞれ明らかとなった。
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ配列番号２のアミノ酸番号３−８７にタンパク質相互作用を行う分子の特徴を示す配列（ＰｆａｍにＰＡＡＤ＃ＤＡＰＩＮとしてエントリーされる配列）を見出した。
【０１３０】
これらのことから、配列番号１に示す塩基配列がコードするタンパク質はＩＡＰ様タンパク質であり、インターフェロンによって発現誘導され、タンパク質相互作用を介して転写因子の働きを修飾する機能を有する転写制御因子であることが推測された。
【０１３１】
実施例５　ＰＣＲ法を用いた組織発現解析
本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの正常マウスおよび疾患マウスでの組織発現変動を検討するために、定法（Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１１：　１０２６−３０　（１９９３））に従い、ＰＣＲ法を用いた組織発現解析を行った。
【０１３２】
（１）ｃＤＮＡ合成
以下のマウス（森脇和郎、外１名編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ別冊、Ｖｏｌ．　３６「自然発症疾患モデル動物　」、中山書店、１９９９年）の１９組織からトータルＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとして逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
（ａ）正常マウスの組織および糖尿病モデルマウスの組織
▲１▼対照マウスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ　−　＋ｍ／＋ｍ　Ｊｃｌ（メス、８週齢）の全脳、視床、肺、腎臓、骨髄、膵臓、脂肪細胞、肝臓、眼
▲２▼糖尿病モデルマウスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ　−　ｄｂ／ｄｂ　Ｊｃｌ（メス、８週齢）の膵臓、脂肪細胞、肝臓、眼
（ｂ）老化促進マウスの組織
▲１▼正常老化マウス　ＳＡＭ　　Ｒ１／ＴＡ　Ｓｌｃ（オス、１３週齢）の海馬、前頭葉皮質
▲２▼老化促進マウス　ＳＡＭ　　Ｐ８／Ｔａ　Ｓｌｃ（オス、１５週齢）の海馬、前頭葉皮質
（ｃ）　癌転移モデルマウスの組織
▲１▼対照マウスＢａｌｂ／ｃ（メス、５週齢）の正常結腸
▲２▼癌転移モデルマウスＢａｌｂ／ｃ（メス、６週齢）の結腸癌（マウス腹腔に結腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６を移植し、２週間後に結腸癌を摘出）
【０１３３】
（２）ＰＣＲ法による定量
下記の本発明のタンパク質をコードしているｍＲＮＡの発現は、ライトサイクラー定量ＰＣＲ装置（ロシュ・ダイアグノスティクス社）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡマスターＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ試薬を用いて、製品に添付されているプロトコールに従い定量した。定量ＰＣＲに用いた合成ＤＮＡ配列を以下に示す。
ｄｎａｆｏｒｍ３５７６３
５’側プライマー：ＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＧＡ（配列番号１１）
３’側プライマー：ＧＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴ（配列番号１２）
【０１３４】
定量結果はＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として、補正した。即ち、各組織での対象遺伝子の発現量（コピー数／μｌ）をＧＡＰＤＨの発現量（コピー数／μｌ）で除し、定数（１×１０^６）（注：１０の６乗）を乗して表示した（表１）。
【０１３５】
【表１】

【０１３６】
結果をまとめると、ｄｎａｆｏｒｍ３５７６３は骨髄、肺で強力に発現し、糖尿病の脂肪細胞および結腸癌で発現が増強した。該クローンのｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、糖尿病や癌などの治療や診断に応用できる。また該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、上記のようなｍＲＮＡ発現の変動が見られる組織あるいはｍＲＮＡ発現量の多い組織に関わる疾患に関与している可能性がある。
実施例６　完全長ｃＤＮＡがコードするタンパク質の総合解析
上記実施例４および実施例５の結果より、下記のとおり、本発明の完全長ｃＤＮＡがコードするタンパク質の総合解析を行った。
本発明のｃＤＮＡがコードするタンパク質は、ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓと類似しており、対照（１７．５日齢胎児全身）と比較して、骨髄、肺で強力に発現し、糖尿病の脂肪細胞および結腸癌で発現が増強した。
これらのことから、本タンパク質は、免疫応答に関連する種々の疾患、癌、糖尿病、肥満、炎症疾患、呼吸器系疾患等に関連する機能を有し、これらの治療薬の開発に有用であると考えられた。
【０１３７】
【発明の効果】
本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡはＩＡＰ様タンパク質であり、インターフェロンによって発現誘導され、タンパク質相互作用を介して転写因子の働きを修飾する機能を有する転写制御因子であることから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて該活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発に有用である。
本出願は、２００２年４月３０日付けの日本特許出願（特願２００２−１２８７７９）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【０１３８】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel protein, a DNA encoding the protein, a full-length cDNA encoding the protein, a recombinant vector having the DNA, an oligonucleotide comprising a partial sequence of the DNA, and a transgenic cell into which the DNA has been introduced. And antibodies that specifically bind to the protein.
[0002]
[Prior art]
Obtaining cDNA and analyzing its base sequence are indispensable for analyzing the physiological activity of a protein expressed in a living body and developing a method for utilizing the protein based on the activity. Furthermore, creating a library in which full-length cDNAs corresponding to all gene types are cataloged is one of the important issues of the human genome project. The cataloged library means that there is no duplication in the cDNAs contained in the library, and refers to a library containing one type of each cDNA.
[0003]
The full-length cDNA cloning method is described in JP-A-9-248187 and JP-A-10-127291. This method comprises the steps of binding a molecule serving as a tag to a diol structure present at the 5 ′ cap site of mRNA, using the mRNA bound with the tag molecule as a template, and oligo-dT as a primer to reverse-transcribe the RNA-DNA complex. And separating the complex having a DNA corresponding to the full length of the mRNA using the function of the tag molecule.
[0004]
As an efficient reverse transcription method, a method for performing the transcription at a high temperature such that the template does not form a higher-order structure has been developed (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 10-84661). Furthermore, a cloning vector has been developed which can uniformly clone a DNA fragment contained in a synthesized full-length cDNA library regardless of its chain length (Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-9273).
[0005]
A full-length cDNA library produced by such a technique does not necessarily include all the elements that are different evenly as individual elements of the library, and is present only in clones with a high abundance ratio or, conversely, in very small amounts. There are clones. Since a clone present in only a trace amount is highly likely to be novel, a subtraction method and a normalization method for enriching such a clone have also been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-325080; Carninci, P. et al., Genomics, $ 37, $ 327-336 (1996)).
[0006]
The nucleotide sequence of each clone of the cataloged full-length cDNA library thus obtained can be identified by a known method, but the physiological activity of the protein encoded by the cDNA is still unknown. Remains.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention analyzes the nucleotide sequence of a cDNA clone contained in a cataloged full-length cDNA library, and among those having a novel sequence, identifies the biological activity of the protein encoded by the cDNA sequence and determines the biological activity. It is an object of the present invention to propose a method of using a protein based thereon and DNA encoding the same.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors analyzed the nucleotide sequence of the cDNA clone in the mouse full-length cDNA library, and searched a database based on the homology of the sequence, and found that the sequence contained an IAP (Interferon-activatable protein) -like protein. A specific sequence was found, and the protein encoded by these cDNAs was identified as an IAP-like protein. The expression levels of these cDNAs in each tissue were analyzed. The present invention has been achieved based on these findings.
[0009]
That is, according to the present invention, the following inventions (1) to (15) are provided.
(1) A protein of the following {(a)} or {(b)}.
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having an IAP-like protein action;
[0010]
(2) DNA encoding the protein of (1).
(3) A full-length cDNA encoding the protein of (1).
(4) DNA of any of the following {(a)}, {(b) or (c)}.
(A) DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(B) a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 with one or several bases deleted, substituted and / or added, and encoding an IAP-like protein;
(C) a DNA having a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary thereto, and encoding an IAP-like protein.
[0011]
(5) A recombinant vector containing the DNA according to any one of (2) to (4).
(6) A gene-transfected cell into which the DNA according to any one of (2) to (4) or the recombinant vector according to (5) has been introduced, or an individual comprising the cell.
(7) The protein according to (1), which is produced by the cell according to (6).
[0012]
(8) センス A sense oligonucleotide having the same sequence as 5 to 100 consecutive nucleotides in the base sequence of the DNA according to any one of (2) to (4), and an antisense having a sequence complementary to the sense oligonucleotide. An oligonucleotide selected from the group consisting of an oligonucleotide and an oligonucleotide derivative of the sense or antisense oligonucleotide.
[0013]
(9) An antibody or a partial fragment thereof that specifically binds to the protein of (1) or (7).
(10) The antibody according to (9), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(11) The antibody according to (10), wherein the monoclonal antibody has an action of neutralizing the IAP-like protein action of the protein according to (1) or (7).
[0014]
(12) の A method for controlling an activity of a protein, comprising bringing the protein according to (1) or (7) into contact with a test substance and measuring a change in the activity of the protein caused by the test substance. Screening method.
(13) Screening for a substance regulating the expression of DNA, which comprises bringing the test substance into contact with the gene-introduced cell according to (6) and detecting a change in the expression level of the DNA introduced into the cell. Method.
(14) At least one or more amino sequence information selected from the amino acid sequence of the protein described in (1) and / or at least one selected from the nucleotide sequence of the DNA described in any of (2) to (4) A computer-readable recording medium storing one or more base sequence information.
(15) A carrier to which the protein according to (1) and / or the DNA according to any of (2) to (4) are bound.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
(1) Acquisition of full-length cDNA and analysis of nucleotide sequence
The DNA of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or, in the amino acid sequence, one or several (the number is not particularly limited, for example, 20 or less, preferably 15 or less, more preferably 10 or less, even more preferably 5 or less) amino acid residue substitution, deletion, insertion, addition, or inversion or inversion, and the IAP-like protein Any code can be used. Specifically, it may be only the translation region encoding the amino acid sequence or may include the full length of the cDNA.
[0016]
Specifically, as the DNA containing the full-length cDNA, for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the like can be mentioned. Examples of the translation region include those having the sequence shown in base numbers 89 to 1138 of SEQ ID NO: 1. Further, the DNA of the present invention includes not only the full length of the above-mentioned cDNA but also those containing the above-mentioned translation region and a portion adjacent to the 3 'and / or 5' end thereof, which is the minimum necessary for the expression of the translation region. .
[0017]
The DNA of the present invention may be obtained by any method as long as it can be obtained, but specifically, for example, can be obtained by the method described below. First, mRNA is prepared from a suitable animal, preferably a mammalian tissue or the like by a method known per se and generally used. Next, cDNA is synthesized using this mRNA as a template. At this time, a 5 ′ cap (^7MeG_pppN) A molecule serving as a tag is chemically bonded to a diol structure specific to the site, reverse transcription is performed using this mRNA as a template and oligo dT as a primer, and then only the full-length cDNA is separated using the function of the tag molecule. It is preferable to use the method (JP-A-9-248187; JP-A-10-127291). In addition, in the case of reverse transcription, in order to prevent the template from forming a higher-order structure and lowering the efficiency of reverse transcription, in the presence of trehalose or the like, use a thermostable reverse transcriptase at a high temperature. It is preferable to use a method of performing reverse transfer (Japanese Patent Laid-Open No. 10-84661). Here, high temperature means 40-80 degreeC.
[0018]
The thus obtained cDNA is cloned by inserting it into an appropriate cloning vector. The vector used herein has a recombination recognition sequence at both ends of a cloning site capable of uniformly cloning DNAs of various chain lengths, and is a linear vector inserted into a host by a method other than infection. (JP-A-11-9273) is preferably used. In the cDNA library thus obtained, not all clones exist uniformly (hereinafter, this may be referred to as "cataloged"), but only a very small amount exists in this library. A clone that does not have a high probability of being new. Therefore, it is preferable to use a subtraction method or a normalization method for enriching such clones (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-325080; Carinci, P. et al., Genomics, # 37, # 327-336 (1996)).
[0019]
The nucleotide sequence of the cataloged cDNA library is analyzed by a commonly used method known per se. In the case of the DNA of the present invention, in the case of the full-length cDNA, the base sequence obtained from the sequence based on the terminal 100 is obtained by combining BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; National Center Center of Biotechnology Information). ), NCBI databases such as Genbank, EMBL, and DDBJ were searched, and even the sequence showing the highest homology was found to have a similarity of 30% or less as a new sequence for the following analysis.
[0020]
Examples of the DNA having the nucleotide sequence of such a full-length cDNA include those having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Examples of the translation region include those having the sequence shown in base numbers 89 to 1138 of SEQ ID NO: 1.
[0021]
The novel nucleotide sequence thus obtained is subjected to homology search by BLAST (Basic local alignment search tool; Altschul, S.F., F.et.al., J. Mol. Biol., 215, 403-410) (1990). HMMPF (HMMPFAM), a sequence analysis method using a hidden Markov model; {Eddy, {S.R., {Bioinformatics} 14, {755-663} (1998))}, {protein feature search using HMMPFAM} //Pfam.wustl.edu) or the like, the function of the protein encoded by the nucleotide sequence can be estimated.
[0022]
In the homology search by BLAST, the function of the clone to be analyzed can be estimated from various kinds of annotation information associated with hit sequences having sufficiently significant homology obtained as a result of the search. Here, a sufficiently significant hit sequence means that the degree of coincidence between the registered functional domain portion of the amino acid sequence and the corresponding portion of the amino acid sequence encoded by the DNA of the present invention is 10 as an e-value.^-4Show the following or 30% or more.
[0023]
For example, if many of the functional domain sequences hit in the upper order have been confirmed to function as an IAP-like protein, the clone to be analyzed that is similar in sequence to that of the functional domain sequence also has the same function, that is, the function as an IAP-like protein. The prediction holds that we will have
[0024]
In HMMPFAM, an analysis is performed by a method of checking whether or not a sequence to be analyzed has a feature of a sequence included in an entry in a database in which a protein profile called Pfam is accumulated. Profiles are extracted from a series of proteins with the same characteristics, and even if the structure cannot be determined by comparing one-to-one sequences over the entire length, if there is a characteristic region in the sequence, it can be found and its function can be predicted. . A specific example of the function prediction of the protein thus performed will be described below.
[0025]
The amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was obtained by interferon-activatable protein 203 by BLAST search, and e-value: 7 × 10⁻⁶⁷With 43% identity over 348 amino acid residues, and Myeloid \ cell \ nuclear \ differentiation \ antigen gave e-value: 1 × 10⁻³⁸Gamma-interferon-inducible \ protein \ Ifi-16 with 33% identity over 355 amino acid residues, e-value: 6 × 10⁻³⁹, 351 amino acid residues with a 33% match. From these results, it can be inferred that the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is induced by interferon and is present in the nucleus.
Further, the above Interferon-activatable protein 203 protein (IAP-like protein) is one of IFN-inducible proteins {(200-family)), and mouse {(IFI202a, {IFI202b, {IFI203, {IFI204} and @ D3N), and {human} M). -16} and {AIM2)} are not only structurally similar but also present in the nucleus, and the gene product p202 of IFI202 binds to transcription factors NF-κB, c-Fos, and c-Jun and represses transcription. (Mol. Cell. Biol. 16, (1996) 359-368), and the above-mentioned Myloid cell nuclear difference. From the literature information in the database (Immunogenetics @ 41: 40-43 (1995)), the nigengen protein is involved in the regulation of transcription in the myeloid system. Literature information (Biochemistry # 37: 11924-11931 (1998)) shows that each is involved in the suppression of transcription.
[0026]
In addition, a protein characteristic search was performed on the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 by using HMMPFAM. As a result, a sequence (Pfam PAAD # DAPIN).
From these facts, the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is an IAP-like protein, a transcription control factor that is induced to be expressed by interferon and has a function of modifying the function of a transcription factor through protein interaction. I can guess. In the present specification, a protein having an IAP-like protein action refers more specifically to a transcription control factor that is induced to be expressed by interferon and has a function of modifying the function of a transcription factor through protein interaction.
[0027]
The DNA of the present invention may be obtained in a state where a base sequence is deleted or inserted in the translated sequence. As a result of performing the homology search or the protein feature search as described above, the base sequence of the DNA is determined. If a deletion or insertion in the DNA is estimated, it is possible to obtain a full-length cDNA having no base deletion or insertion by using a method commonly used in the art such as library screening or PCR cloning. it can. The protein of the present invention is expressed using the full-length cDNA thus obtained, and can be used for functional analysis.
[0028]
Thus obtained, the base sequence is determined, and the DNA of the present invention whose function is estimated is not limited to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or the one having the base sequence shown above as a translation region thereof, In these base sequences, one or several (the number is not particularly limited, but is, for example, 60 or less, preferably 30 or less, more preferably 20 or less, further preferably 10 or less, Particularly preferably, the number of bases is 5 or less.) DNAs having a base sequence with deletion, substitution and / or addition of bases, and encoding IAP-like proteins, and hybridizing with these under stringent conditions. Also included are soybeans and DNAs encoding IAP-like proteins. As described above, these DNAs comprise an amino acid sequence in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of the protein represented by SEQ ID NO: 2, and encode an IAP-like protein. Is included.
[0029]
Here, a DNA that hybridizes under stringent conditions means a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence by BLAST analysis. And a DNA containing a base sequence having the formula: Further, the hybridization under stringent conditions means that the reaction is carried out in a normal hybridization buffer at a temperature of 40 to 70 ° C, preferably 60 to 65 ° C, and a salt concentration of 15 mM to 300 mM, preferably The washing can be performed according to a method of washing in a washing solution of 15 mM to 60 mM or the like.
[0030]
Further, the DNA of the present invention may be obtained by the above-described method or may be synthesized. The DNA base sequence can be easily replaced with a commercially available kit such as a site-directed mutagenesis kit (Takara Shuzo) or a quick change site-directed mutagenesis kit (Stratagene).
The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from a mouse, and a human cDNA library is prepared according to the above-described method for preparing a cDNA library. By performing hybridization using a DNA fragment having a nucleotide sequence as a probe, a DNA encoding a human homolog protein of the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can also be obtained. The DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence also includes such human homologous DNA and human orthologous DNA described below.
[0031]
Further, it is also possible to predict the base sequence of the human homolog DNA by using informatics, and to obtain the human homolog DNA from the above-mentioned human cDNA library or the like based on the base sequence.
In general, as a method for predicting a base sequence encoding a homolog protein of a target protein using informatics, for example, (i) using a base sequence of a target cDNA as a query, A method of performing a homology search on a database (including a cDNA database predicted by informatics) using BLAST or the like; and (ii) BLAST against a human or other EST database using the base sequence of the target cDNA as a query. A method of performing homology search using such a method and linking the sequence of the hit EST with reference to the base sequence of the target cDNA, and (iii) using the base sequence of the target cDNA as a query Homology search for genome database using BLAST etc. In addition, the position on the genome where the gene of the cDNA of interest is located is specified, and Genscan (http: //[email protected]/GENSCAN.html) or Sim4 (Genome @ Res., # 8: 977-74 (1998)) and the like, and a method of predicting the nucleotide sequence of a gene portion in the genome.
[0032]
When predicting the nucleotide sequence of the human homolog DNA of mouse-derived cDNA, any of the above methods can be used. However, any cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention is novel, and In the method (i), it is considered that the nucleotide sequence of the human homolog DNA cannot be obtained, so the method described in (ii) or (iii) is preferably used.
[0033]
Based on the nucleotide sequence of the human homolog DNA thus predicted, a DNA encoding a human homolog protein of the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from the above human cDNA library. As a specific acquisition method, for example, using a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence at the 5 ′ end and 3 ′ end of the predicted human homolog DNA, PCR is performed using the above human cDNA library as a template. And a method of performing hybridization with the above human cDNA library using a partial sequence of the predicted human homolog DNA as a probe.
[0034]
Generally, a similar gene having a nucleotide sequence having a high homology with the nucleotide sequence of the target gene is referred to as a “homolog”, and the above-described method also aims to obtain a human homolog. It is important to confirm that not only the similarity but also that the gene obtained as a homolog is a family member of the target gene. Genes acquired as "homologs" between two species of organisms are likely to be "orthologs", the same gene evolved from a common ancestral gene, and differ from each other caused by duplication from a common ancestral gene It may be a "paralog" that is a gene.
[0035]
That is, in order for the human-derived DNA obtained as a homologue to have the same function as the protein of the present invention, the function of the protein encoded by the human-derived DNA must be In order to verify the function of the protein of the present invention as a mouse, it is preferable to confirm that the human homolog is an ortholog of a closely related species of the mouse gene of the present invention.
[0036]
For example, the following method is used as a method for confirming the ortholog. (1) First, the homology between the nucleotide sequence of the cDNA of the present invention and the nucleotide sequence of the obtained human homolog DNA is analyzed. Next, using the base sequence of the cDNA of the present invention as a query, a homology search was performed for human base sequences contained in international base sequence databases such as DDBJ, EMBL, and GenBank, and patent databases. Confirm that the degree of matching of the base sequence is higher than the degree of matching between the base sequence obtained from the database and the base sequence of the query. Further, (2) homology is analyzed between the obtained nucleotide sequence of the human homolog DNA and the corresponding nucleotide sequence of the cDNA of the present invention. Next, using the base sequence of the obtained human homolog DNA as a query, a homology search was performed for the mouse base sequence contained in the international base sequence database such as DDBJ, EMBL, and GenBank, and in the patent database. Confirm that the degree of matching of the base sequence is higher than the degree of matching between the base sequence obtained from the database and the base sequence of the query. By confirming the above (1) and (2), the obtained human homolog can be identified as a human ortholog corresponding to the cDNA of the present invention. The homology analysis described in (1) and (2) above may be performed by comparing amino acid sequences, or by drawing a molecular evolutionary phylogenetic tree and examining it. In addition, it is preferable that the degree of coincidence by the homology analysis described in the above (1) and (2) be analyzed as the degree of coincidence over the entire length of the query.
[0037]
By performing a homology search by BLAST or a protein feature search by HMMPFAM on the nucleotide sequence of the thus obtained human homologous DNA or orthologous DNA, the function of the protein encoded by the nucleotide sequence can be estimated.
The DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence also includes DNA encoding such a human homolog or ortholog protein.
[0038]
(2) Protein encoded by the novel cDNA
The translation region of the protein encoded by the DNA of the present invention is, for example, a base sequence of the DNA which is converted into amino acids by three types of reading frames, and the range encoding the longest polypeptide is defined as the translation region of the present invention. The amino acid sequence can be determined. Examples of such an amino acid sequence include those described in SEQ ID NO: 2. The protein of the present invention is not limited to the above-mentioned amino acid sequence, but comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence. Proteins having an effect are also included.
[0039]
As a method for obtaining the protein of the present invention, the method of transcription / translation of the DNA of the present invention described in (1) by an appropriate method is preferably used. Specifically, a recombinant vector inserted into a suitable expression vector or a suitable vector together with a suitable promoter is prepared, and this recombinant vector is used to transform a suitable host microorganism or introduced into a suitable cultured cell. Thus, it can be obtained by purifying this.
[0040]
When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt form, it can be converted to a free form or another salt. can do. Such salts of the protein of the present invention are also included in the protein of the present invention. Further, a protein produced by the transformant may be modified before or after purification by applying an appropriate protein modifying enzyme to modify the protein arbitrarily or partially removing the polypeptide. Can be. These modified proteins are also included in the scope of the present invention as long as they have the above-mentioned IAP-like protein action.
[0041]
When producing the protein of the present invention, the vector used for the production of the recombinant vector containing the DNA of the present invention is not particularly limited as long as the DNA is expressed in the transformant. Any of vectors may be used. Of these, usually, a commercially available protein expression vector into which an expression control region DNA such as a promoter suitable for a host into which the DNA is introduced has already been inserted is used. Specific examples of such a protein expression vector include pET3 and pET11 (manufactured by Stratagene) and pGEX (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) when the host is E. coli, and pESP- when the host is yeast. I expression vector (Stratagene) and the like. In the case of insect cells, BacPAK6 (Clontech) and the like are used. When the host is an animal cell, examples include ZAP @ Express (manufactured by Stratagene) and pSVK3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
[0042]
When using a vector into which the expression control region has not been inserted, it is necessary to insert at least a promoter as the expression control region. Here, as the promoter, a promoter contained in a host microorganism or a cultured cell can be used. However, the promoter is not limited thereto. For example, when the host is Escherichia coli, T3, T7, tac, A lac promoter or the like can be used. In the case of yeast, an nmt1 promoter, a Gal1 promoter, or the like can be used. When the host is an animal cell, SV40 promoter, CMV promoter and the like are preferably used.
[0043]
When a host capable of functioning with a mammalian-derived promoter is used, a promoter specific to the gene of the present invention can also be used. Insertion of the DNA of the present invention into these vectors may be performed by linking the DNA or a DNA fragment containing the DNA to the amino acid sequence of the protein encoded by the gene DNA downstream of the promoter in the vector.
[0044]
The recombinant vector thus prepared can be used to transform a host described below by a method known per se to prepare a DNA transductant. As a method for introducing the vector into a host, specifically, a heat shock method (J. @Mol. Biol., 53, 154 (1970)), a calcium phosphate method (Science, 221, 551, @ (1983)), DEAE Dextran method (Science, 215, 166, (1982)), in vitro packaging method (Proc. Natl. Acad. @ Sci. USA, 72, 581, (1975)), virus vector method (Cell, 37, 1053, (1984)) )), And the electric pulse method (Chu. Et al., Nuc. Acids Res., 15, 1331 (1987)).
[0045]
The host for preparing the DNA transfectant is not particularly limited as long as the DNA of the present invention is expressed in the body. For example, Escherichia coli, yeast, baculovirus (arthropod polyhedrosis virus) -insect cells, or Animal cells and the like can be mentioned. Specifically, BL21 and XL-2Blue (manufactured by Stratagene) are used for E. coli, SP-Q01 (manufactured by Stratagene) is used for yeast, and AcNPV is used for baculovirus (J. Biol. Chem., 263, 7406, ( 1988)) and its host, Sf-9 (J. Biol. Chem., 263, # 7406, (1988)). Examples of animal cells include mouse fibroblast C127 (J. Viol., 26, 291, (1978)) and Chinese hamster ovary cell CHO cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216, 1980). Among them, COS-7 derived from African green monkey kidney (ATCC CRL1651: American Type Culture Collection collection cell), HEK293 cell derived from human fetal kidney (ATCC CRL 1573), human cervix Cancer HeLa cells (ATCC @ CCL-2) and the like are preferably used.
[0046]
In addition to the expression method using the protein expression vector as described above, a homologous recombination technique (AA Vertes @ et @ al., Biosci.) In which a DNA fragment of the present invention linked to a promoter is directly inserted into the chromosome of a host microorganism. Biotechnol. Biochem., 57, 2036, (1993)) or a transposon or an insertion sequence (AA Vertes et al., Molecular Microbiol., 11, 739, 1994). It can also be made.
[0047]
The obtained culture is obtained by collecting cells or cells by a method such as centrifugation, suspending the cells or cells in a suitable buffer, and sonicating, lysozyme, and / or freezing and thawing. After the disruption, a crude protein solution is obtained by centrifugation, filtration or the like, and further purified by a combination of appropriate purification methods. Thus, the protein of the present invention is obtained. In addition to the above-described expression method using the protein expression recombinant vector, protein expression is induced by subjecting the DNA of the present invention obtained in (1) to a cell-free transcription / translation system to obtain the protein of the present invention. be able to. The cell-free transcription / translation system used in the present invention is a system containing all the elements necessary for transcription from DNA to mRNA and translation from mRNA to protein. Refers to any system by which the protein being synthesized is synthesized. Specific examples of the cell-free transcription / translation system include a transcription / translation system prepared based on an eukaryotic cell and a bacterial cell, or an extract from a part thereof. A transcription / translation system prepared based on an extract from Erythrocytes, wheat germ and Escherichia coli (Escherichia coli S30 extract) may be mentioned.
[0048]
Separation and purification of the protein of the present invention from the obtained transcription / translation product of the cell-free transcription / translation system can be carried out by a commonly used method known per se. Specifically, for example, a DNA region encoding an epitope peptide, a polyhistidine peptide, glutathione-S-transferase (GST), a maltose binding protein, or the like is introduced into the DNA to be transcribed and translated, and expressed as described above. The protein can be purified by utilizing the affinity of the protein with a substance having affinity.
[0049]
The expression of the target protein is separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like, and stained with Coomassie Brilliant Blue (manufactured by Sigma) or detected by an antibody that specifically binds to the protein of the present invention described later. It can be confirmed by the method of performing. In general, it is known that an expressed protein is cleaved (processed) by a proteolytic enzyme present in a living body. The protein of the present invention is naturally included in the protein of the present invention as long as it is an IAP-like protein, even if it is a partial fragment of the truncated amino acid sequence.
[0050]
By analyzing the interaction between the thus obtained protein and other proteins and DNA, it is possible to know the multifaceted functions in the living body. As a method for analyzing the interaction, a conventional method known per se can be used. Specifically, for example, yeast two-hybrid method, fluorescence depolarization method, surface plasmon method, phage display method, ribosomal method Display method and the like can be mentioned.
[0051]
(3) Preparation of Oligonucleotide and Functional Analysis Using the Oligonucleotide Using the DNA of the present invention or a fragment thereof obtained by the method described in (1) above, the DNA of the present invention is prepared by a conventional method using a DNA synthesizer or the like. Oligonucleotides such as antisense oligonucleotides and sense oligonucleotides having a partial sequence of DNA can be prepared.
[0052]
Examples of the oligonucleotide include a DNA having the same sequence as 5 to 100 consecutive bases in the base sequence of the DNA or a DNA having a sequence complementary to the DNA. Specific examples include a DNA having the same sequence as 5 to 100 consecutive nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a DNA having a sequence complementary to the DNA. When used as a sense primer and an antisense primer, the above-mentioned oligonucleotides in which the melting temperature (Tm) and the number of bases of both do not extremely change are preferable. The length of the sequence is generally 5 to 100 bases, preferably 10 to 60 bases, and more preferably 15 to 50 bases.
[0053]
In addition, derivatives of these oligonucleotides can also be used as the oligonucleotide of the present invention. Examples of the oligonucleotide derivative include an oligonucleotide derivative in which a phosphoric diester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide in which a phosphoric diester bond in an oligonucleotide is converted to an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond. Nucleotide derivative, oligonucleotide derivative in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, oligonucleotide derivative in which uracil in oligonucleotide is substituted with C-5 propynyluracil, uracil in oligonucleotide is Oligonucleotide derivatives substituted with C-5 thiazole uracil, oligonucleotide derivatives substituted with cytosine in the oligonucleotide with C-5 propynylcytosine, oligonucleotides Is an oligonucleotide derivative in which cytosine is substituted by phenoxazine-modified cytosine, an oligonucleotide derivative in which ribose in the oligonucleotide is substituted by 2′-O-propylribose, or ribose in the oligonucleotide is 2 Oligonucleotide derivatives substituted with '-methoxyethoxyribose can be mentioned.
[0054]
The oligonucleotide of the present invention can be applied to the RNA interference method (hereinafter, this may be referred to as “RNAi method”) by preparing it as double-stranded RNA. For the method for preparing double-stranded RNA and the RNA interference method, for example, the method described in (Elbashir, S., et al., Nature, 411, 494-498 (2001)) can be used. .
The double-stranded RNA does not need to be all RNA. Specifically, as a part of which is DNA, those described in WO 02/10374 can be used.
[0055]
The target gene may be any DNA as long as it is the DNA of the present invention. A double-stranded polynucleotide consisting of RNA having a sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of these DNAs (hereinafter sometimes referred to as “double-stranded polynucleotide”) is a target gene. And a sequence substantially identical to a sequence of 15 bp or more, which may be any part of the base sequence. Here, “substantially the same” means that it has 80% or more homology with the sequence of the target gene. The nucleotide length of the nucleotide may be any length from 15 bp to the entire length of the open reading frame (ORF) of the target gene, but a length of about 15 to 500 bp is preferably used. However, it is known that mammalian-derived cells have a signal transduction system activated in response to a long double-stranded RNA of 30 bp or more. This is called an interferon reaction (Mareus, P. I., et al., Interferon, 5, 115-180 (1983)), and when the double-stranded RNA enters a cell, PKR (dsRNA-responsive) is obtained. protein kinase: Non-specifically inhibits the initiation of translation of many genes via Bass, BL, Nature, 411, ２８428-429 (2001)), and at the same time, 2 ′, 5 ′ oligoadenylate synthese (Bass, B.L., Nature, 411, ２８428-429 (2001)), RNaseL is activated, and non-specific degradation of intracellular RNA is caused. These non-specific reactions mask the specific response of the target gene. Therefore, when a mammal, or a cell or tissue derived from the animal is used as a recipient, a double-stranded polynucleotide of 15 to 30 bp, preferably 19 to 24 bp, and most preferably 21 bp is preferably used. The double-stranded polynucleotide does not need to be entirely double-stranded, and includes those in which the 5 'or 3' end is partially protruded, but those in which the 3 'end is protruded by two bases are preferably used.
[0056]
The double-stranded polynucleotide means a double-stranded polynucleotide having complementarity, but may be a self-annealed single-stranded polynucleotide having self-complementarity. The single-stranded polynucleotide having self-complementarity includes, for example, one having an inverted repeat sequence.
[0057]
The method for preparing the double-stranded polynucleotide is not particularly limited, but a known chemical synthesis method is preferably used. In chemical synthesis, a single-stranded polynucleotide having complementarity can be separately synthesized, and can be converted into a double-stranded strand by associating them by an appropriate method. Examples of the method of association include a method in which the above polynucleotides are mixed, heated to a temperature at which the double strand is dissociated, and then gradually cooled. The associated double-stranded polynucleotide is confirmed using an agarose gel or the like, and the remaining single-stranded polynucleotide is removed by, for example, decomposing it with an appropriate enzyme.
[0058]
The transfectant into which the double-stranded polynucleotide thus prepared is introduced may be any as long as the target gene can be transcribed into RNA or translated into protein in the cell. Specific examples include those belonging to plant, animal, protozoan, virus, bacterial, or fungal species. The plant may be a monocotyledonous, dicotyledonous or gymnosperm, and the animal may be a vertebrate or invertebrate. Preferred microorganisms are those used in agriculture or by industry, and are pathogenic to plants or animals. Fungi include organisms in both mold and yeast forms. Examples of vertebrates include mammals, including fish, cows, goats, pigs, sheep, hamsters, mice, rats and humans, and invertebrates include nematodes and other reptiles, Drosophila melanogaster ( Drosophila), and other insects. Preferably, the cells are vertebrate cells.
[0059]
The transductant means a cell, tissue, or individual. Here, the cell may be from germline or somatic, totipotent, or pluripotent, split or undivided, parenchymal tissue or epithelium, immortalized or transformed, and the like. The cells may be gametes or embryos, in the case of embryos, single-cell or constitutive cells, or cells from multi-cell embryos, including fetal tissue. Furthermore, they may be undifferentiated cells, such as stem cells, or differentiated cells, such as from cells of an organ or tissue, including fetal tissue, or any other cells present in an organism. Differentiating cell types include adipocytes, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, nerve cells, glial, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, eosinophils, Includes basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes and cells of the endocrine or exocrine glands.
[0060]
As a method for introducing a double-stranded polynucleotide into a transfectant, when the transfectant is a cell or tissue, calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, virus infection, double-stranded polynucleotide solution Immersion, transformation, or the like. Examples of a method for introducing the gene into an embryo include microinjection, electroporation, and virus infection. When the recipient is a plant, a method of injecting or perfusing the plant into a body cavity or stromal cells, or spraying is used. In the case of an individual animal, it is introduced systemically by oral, topical, parenteral (including subcutaneous, intramuscular and intravenous administration), vaginal, rectal, nasal, ocular and intraperitoneal administration. A method, an electroporation method, a virus infection, or the like is used. For methods for oral introduction, the double-stranded polynucleotide can be mixed directly with the food of the organism. Furthermore, when introduced into an individual, it can be administered, for example, by administration as an implanted long-term release preparation or the like, or by ingesting an introduced body into which a double-stranded polynucleotide has been introduced.
[0061]
The amount of the double-stranded polynucleotide to be introduced can be appropriately selected depending on the introduced substance and the target gene, but it is preferable to introduce an amount sufficient to introduce at least one copy per cell. Specifically, for example, when the transfectant is a human cultured cell and the double-stranded polynucleotide is introduced by the calcium phosphate method, 0.1 to 1000 nM is preferable.
By suppressing the expression of the gene of the present invention in the transfectant by RNA interference, the function of the protein encoded by the gene of the present invention can be confirmed, or a new function can be analyzed.
[0062]
(4) Antibodies that specifically bind to the protein of the present invention
As a method for preparing an antibody that specifically binds to the protein of the present invention, a commonly used known method can be used. For a polypeptide used as an antigen, an epitope (antigen determination An appropriate sequence can be selected and used as the group. As a method for selecting an epitope, for example, commercially available software such as Epitope Adviser (manufactured by Fujitsu Kyushu System Engineering Co., Ltd.) can be used.
[0063]
As the polypeptide used as the above antigen, a synthetic peptide synthesized according to a known method or the protein of the present invention itself can be used. The polypeptide serving as an antigen may be prepared in an appropriate solution or the like according to a known method and immunized to a mammal, for example, a rabbit, a mouse, a rat, or the like. It is preferable to use an antigen peptide as a conjugate with a suitable carrier protein or to add an adjuvant or the like for immunization.
[0064]
The route of administration of the antigen upon immunization is not particularly limited, and any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, or intramuscular may be used. Specifically, for example, a method of inoculating BALB / c mice several times every several days to several weeks with an antigen polypeptide is used. The amount of the antigen to be taken is preferably about 0.3 to 0.5 mg / time when the antigen is a polypeptide, but is appropriately adjusted depending on the type of the polypeptide and the animal species to be immunized.
[0065]
After immunization, blood is appropriately collected as a test, and an increase in the antibody titer is confirmed by a method such as enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter sometimes referred to as “ELISA”) or Western blotting. Blood is collected from animals with increased titers. A polyclonal antibody can be obtained by subjecting this to an appropriate treatment used for antibody preparation. Specifically, for example, there is a method of obtaining a purified antibody obtained by purifying an antibody component from serum according to a known method. For purification of the antibody component, methods such as centrifugation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used.
[0066]
A monoclonal antibody can also be prepared by using a hybridoma fused with spleen cells and myeloma cells of the animal according to a known method (Milstein, et al., Nature, 256, 495 (1975)). . The monoclonal antibody can be obtained, for example, by the following method.
[0067]
First, antibody-producing cells are obtained from an animal whose antibody titer has increased due to immunization with the above-described antigen. The antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any of the individuals, but is preferably obtained from the spleen, lymph nodes, peripheral blood and the like. As a myeloma to be fused with these cells, generally, a cell line obtained from a mouse, for example, a P3X63-Ag8.653 (ATCC: CRL) which is an 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line is used. -1580), P3-NS1 / 1Ag4.1 (RIKEN cell bank: RCB0095) and the like are preferably used. For cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at an appropriate ratio, and 50% polyethylene is added to an appropriate cell fusion medium such as RPMI1640, Iskov's modified Dulbecco's medium (IMDM), or Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). It can be carried out by using a solution in which glycol (PEG) is dissolved. It can also be carried out by the electrofusion method (U. Zimmer-mann. Et al., Naturewissenschaften, 68, 577 (1981)).
[0068]
Hybridomas were prepared using a myeloma cell line that was resistant to 8-azaguanine, using 5% CO2 in a normal medium (HAT medium) containing an appropriate amount of hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) solution.₂At 37 ° C. for an appropriate time. This selection method can be appropriately selected and used depending on the myeloma cell line to be used. The antibody titer of the antibody produced by the selected hybridoma is analyzed by the above-described method, the hybridoma producing the antibody having a high antibody titer is separated by a limiting dilution method or the like, and the separated fused cells are cultured in an appropriate medium. The monoclonal supernatant can be obtained by purifying the resulting culture supernatant by an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation and affinity chromatography. For purification, a commercially available monoclonal antibody purification kit can also be used. Furthermore, ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by growing the antibody-producing hybridoma obtained above in the abdominal cavity of an animal of the same strain as the immunized animal or a nude mouse.
[0069]
In addition, when a human-derived protein is obtained as the protein of the present invention, the above-described method is applied to a Severe-combined-immune-deficiency (SCID) mouse transplanted with human peripheral blood lymphocytes using the polypeptide or a partial peptide thereof as an antigen. A humanized antibody can also be prepared by immunizing in the same manner as described above and preparing a hybridoma between the antibody-producing cells of the immunized animal and human myeloma cells (Mosier, D. E., et al. Nature, 335, {256-259} (1988); Duchosal, M.A., et al., Nature, 355, 258-262 (1992)).
[0070]
Further, RNA is extracted from the obtained hybridoma producing the human antibody, a gene encoding the target human antibody is cloned, this gene is inserted into an appropriate vector, and this is introduced into an appropriate host. By expression, human antibodies can be produced in larger quantities. Here, an antibody with low binding to an antigen can be obtained as an antibody with even higher binding by using an evolutionary engineering technique known per se. A partial fragment such as a monovalent antibody can be prepared by cleaving the Fab and Fc portions using, for example, papain or the like, and collecting the Fab portion using an affinity column or the like.
[0071]
The thus-obtained antibody that specifically binds to the protein of the present invention can also be used as a neutralizing antibody that specifically binds to the protein of the present invention to thereby inhibit the IAP-like protein action of the protein. There is no particular limitation on the method of selecting a substance that inhibits the activity of the protein. For example, it is possible to contact an antibody with the DNA transfectant prepared in (2) above and determine whether the function of the target protein in the transfectant is inhibited. And a method of analyzing the above.
[0072]
Such a neutralizing antibody may be used alone when the clinical application is performed, or may be used as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. At this time, the ratio of the active ingredient to the carrier can be varied between 1 and 90% by weight. Such drugs can be administered in various forms, such as tablets, capsules, granules, powders, orally administered by syrup or the like, or injections, drops, liposomes, Parenteral administration with suppositories and the like can be mentioned. In addition, the dose can be appropriately selected depending on symptoms, age, body weight, and the like.
[0073]
(5) Confirmation and analysis of the activity of the protein of the present invention
The protein of the present invention is prepared as a recombinant protein as described in the above (2), and by analyzing this, it can be confirmed that it has the activity estimated in (1). Furthermore, analysis can also be performed by combination with the antibody or the like prepared as described in (4) above.
The protein of the present invention is an interferon-derived protein family molecule because it is structurally similar to mouse {IFI202, $ IFI203, $ IFI204 and $ human MNDA, $ IFI-16} AIM2, which are IFN-inducible proteins ("200-family"). May be involved in transcriptional regulation. Examples of the method for measuring the transcription control activity of the protein of the present invention include the methods described below.
[0074]
The transcription control activity of the protein of the present invention can be examined by those skilled in the art, for example, by performing a reporter gene assay or the like as described below (Mol. Cell. Biol. 16, 16, (1996) 359-368). A reporter gene assay vector is constructed in which a luciferase gene or a chloramphenicol acetyltransferase gene is linked downstream of a promoter controlled by NF-κB, AP-1, AP-2, OCT1, or the like. A vector for expressing a gene encoding the protein of the present invention and a reporter gene assay vector are transiently introduced into L929 cells or EL4 cells, and the presence of interferon, poly (rI) / poly (rC), or PMA is present. -The activity of the reporter gene can be measured according to a standard method in the absence of the reporter gene.
[0075]
Further, the fact that the protein of the present invention binds to, for example, the transcription factor NF-κB means that a fusion protein in which GST is linked to the N-terminus or C-terminus of the protein of the present invention is bound to glutathione agarose beads, and a cell extract is added thereto. After incubating overnight at 4 ° C., the beads were washed with a buffer to remove non-specifically adsorbed substances, and the beads were collected, subjected to SDS gel electrophoresis, and subjected to immunoblotting using an anti-NF-κB antibody. By doing so, the presence or absence of specific binding ability between the protein of the present invention and NF-κB can be examined.
[0076]
Furthermore, for example, for proteins involved in transcription by binding to DNA / RNA, gene transcription regulatory regions such as promoters and enhancers that are recognized and targeted by known transcription-related factors (hereinafter referred to as “target transcription regulatory regions”). (Sometimes referred to as DNA) and partial fragments thereof, and by measuring the binding ability thereof, the transcription control activity can be comprehensively analyzed (JP-A-2001-314190). The DNA of the target transcription control region and its partial fragments used in the analysis include not only those having a known base sequence of the target transcription control region (hereinafter, this may be referred to as “target sequence”), but also known targets. The base sequence of the transcription regulatory region is analyzed and classified into a database, and each is designed. The common base sequence of the target transcription regulatory region that is commonly recognized by transcription-related factors (hereinafter, this may be referred to as a “consensus target sequence” ) May be used. Examples of known transcription-related factors include, for example, v-jun, ｊc-jun, junB, junD, dJRA, c-fos, fosB1, fosB2, Fra-1, LRF-1, v-maf, mafG, NF-E2 p45. , ANF-E2, fNF-E2, Nrf short form, GCN4, yAP-1, CREB-2, ATF-3, CRE-BP1, CRE-BP3, ATF-a, CREB-341, CREB-327, CREM, dCREB2 , DCREB2-b, dCREB2-c, dCREB2-d, dCREB2-q, dCREB2-r, dCREB2-s, C / EBPalpha, C / EBPbeta, p34C / EBPbeta, CHOP-10, VBP, Hlf, CPRF-2, EmBP-1b, EmBP-1b, GBF1, GBF2, GBF3, CPRF-1, TAF-1, HBP-1a, GBF9, GBF1, GBF12, CPRF-3, TGA1a, TGA1b, TGA1b. STE4, OPI1, E2A, E47, ITF-2 / SEF2-1B, SEF-1A, MyoD, p42Tal-1, HEN-1, AhR, Arnt, USF, NF-1A1, NF-1A1.1, NF-1A6, NF-1B1, NF-1B1, NF-1B2, NF-1C2 / CTF-2, CTF-4, CTF-6, RF-X1, AP2alphaA / AP-2alpha1, AP2alpha2, AP2alpha , AP2alpha4, AP2alphaB, ２AP2beta, AP2gamma, GR, AR, ER, RXR-alpha, PPARalpha, PPARgamma, COUP-TF1, HNF-4alpha1, HNF-4alpha, TA-1, GA, TAGA, TAGA, TAGA, TAGA -4, ／ AREA / NIT-2, Sp1, YY1, Egr-1, Egr-2, Egr-3, Snail, CF2-II, Evi-1, Icaros, MZF-1, Tramtrack 69K, HOX9, CDP, HNF-1A , Nkx-2.2, Nkx-2.5, TTF-1, Oct-1A, Oct-1B, Oct-1C, Oct-2, Oct- 2.1 / Oct-2B, Pax-3, ｘPax-6, Pax-1, HSF1 (short), HSF2, dHSF, fungalHSF, c-Myb, A-Myb, v-Myb, P (long), P ( short), C1 (long), C1 (short), c-Ets-1_p54, Ets-1_deltaV / VII, Ets-2, Elk-1, ＡＰSAP-1, SAP-1b, Erg-1, p55erg, Fli-1b , １−E4TF1-60 / GABP-alpha, E74A, IRF-1, IRF-2, p50, NF-ATc, NF-Atp, p91, p84, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, p53. MEF-2A, SRF, E2, TBP, SRY, Sox-5, Sox-9, mat-Mc, CP1A, CP1B, CBF-C, AML1a, and the like are known, and target transcriptional regulation of these transcription-related factors is known. The nucleotide sequences of the regions have also been reported (Takaaki Tamura, et al., Edited by Bio, Science, Experimental Medicine Separate Volume, New Term Library, Transcription Factor, Second Edition, Yodosha Co., Ltd., December 1999).
[0077]
The binding between the protein having such transcription control activity and the DNA of the target transcription control region and its partial fragment can be detected using a measurement system known per se. For example, a test sample containing the protein of the present invention is added to a plate on which the DNA of the target transcription regulatory region and a partial fragment thereof are immobilized, and the direct binding between the two is determined by the SPR (Surface Plasmon Resonance, Surface Plasmon Resonance) method. Can be used for detection. In this case, the DNA of the target transcription regulatory region recognized by the transcription-related protein or a partial fragment thereof is immobilized on the sensor chip. The annealed DNA and its partial fragments are immobilized. As described above, the binding of the protein of the present invention or the DNA of the target transcriptional regulatory region and its partial fragments can be detected using fluorescent labels.
[0078]
The test sample for analysis containing the protein of the present invention can be prepared by the method of transcribing / translating the DNA of the present invention by an appropriate method as described above. Specifically, for example, protein expression can be induced by subjecting the DNA of the present invention to a cell-free transcription / translation system to obtain the protein of the present invention.
[0079]
In addition, a protein associated with transcription is analyzed for its effect on a transcription factor that regulates the transcription of various genes involved in a disease (hereinafter, referred to as “disease-related transcription factor”). It is also useful to analyze whether or not they are directly or indirectly involved. Known disease-related transcription factors include, for example, PPAR, p53, NFκB, AP-1, HIF-1, CREB, and the like. The effects on these known factors can be analyzed using the same method as described above. Just fine.
[0080]
For example, when analysis is performed using the SPR method, DNA of the target transcription regulatory region of the disease-related transcription factor or a partial fragment thereof is particularly preferably used. The test sample containing the protein of the present invention is appropriately added to the sensor chip on which such DNA or partial fragment is immobilized, and the interaction between the DNA on the sensor chip surface and the protein contained in the test sample is performed. Is analyzed. When it has an affinity with the immobilized DNA, the SPR response value is higher than that of the control, and it can be estimated that the transcription-related factor has an affinity with the immobilized DNA. By such an analysis, it is possible to analyze what function the protein of the present invention has in a specific disease.
[0081]
Here, the test sample for analysis containing the protein of the present invention can be prepared by the method of transcription / translation of the DNA of the present invention by an appropriate method as described above. Specifically, for example, protein expression can be induced by subjecting the DNA of the present invention to a cell-free transcription / translation system to obtain the protein of the present invention.
[0082]
The disease-related transcription factor can be obtained from a cell extract or a cell nucleus extract containing the disease-related transcription factor. In addition, as described above, it can be prepared by a method of transcription / translation of a DNA encoding a disease-related transcription factor by an appropriate method. Specifically, for example, a cDNA encoding a disease-related transcription factor is used, and its full length or a part thereof is inserted into an appropriate expression vector, and this is inserted into microorganisms such as Escherichia coli, insect cells, yeast, animal cells or animals. The disease-related transcription factor, which is a recombinant protein, can be obtained from the culture supernatant of these transfected cells into which the disease-related transcription factor has been expressed, or from cells, tissues, or body fluids.
[0083]
Note that confirmation of the activity of the protein of the present invention is not limited to the method described above. In addition, these functional assay systems can also be used for screening of a function activator or a function inhibitor of the protein of the present invention described later, and a screening of a protein expression regulator of the present invention.
[0084]
In general, the method for analyzing the function of the protein of the present invention includes, for example, (i) a method for comparatively analyzing the expression state of each tissue, disease, or developmental stage, and (ii) an interaction with another protein or DNA. A method of analyzing, (iii) a method of introducing into a suitable cell or individual, and analyzing a phenotypic change, and (iv) a method of analyzing the phenotypic change by inhibiting the expression of the protein in a suitable cell or individual. And the like. According to such a method, the activity specific to the target protein can be analyzed from multiple aspects.
[0085]
In the method (i), the expression of the protein of the present invention can be analyzed at the mRNA level or the protein level. When the expression level is analyzed at the mRNA level, for example, an in situ hybridization method (In situ hybridization: Application to Developmental Biology &Medicine; Medicine, Ed., By, Harry, N., Canada, UK, UK, UK, UK, UK, UK, UK, UK, UK, UK, UK, Canada, UK, UK, UK, UK, UK, UK, Canada, Canada, UK 1990)), a hybridization method using a DNA chip, a quantitative PCR method, and the like. When the analysis is performed at the protein level, a tissue staining method using an antibody that specifically binds to the protein of the present invention described later, an ELISA method, a Western blot method, and the like can be mentioned. Here, when the protein to be analyzed is a splicing variant in which a known variant is present, a probe that is present only in the cDNA encoding the protein to be analyzed and does not hybridize with the cDNA encoding the known variant should be used. Is preferred. In the case of the quantitative PCR method, a method of selecting and performing a primer capable of producing an amplified fragment having a different length between the target variant and the known variant (Wong, {Y., {Neuroscience} Let., {320: {141-145} (2002)), etc.> Is mentioned. Also, when analyzing at the protein level, it is preferable to use an antibody that reacts only with the target protein and does not react with a known variant.
[0086]
In the method (ii), the function of the protein of the present invention can be analyzed by examining the presence or absence of interaction between the protein of the present invention and a known protein. As a method for analyzing the interaction, a conventional method known per se can be used, and specifically, for example, yeast two-hybrid method, fluorescence depolarization method, surface plasmon method, phage display method, ribosomal display And the like. In the method, when the protein to be analyzed is a splicing variant in which a known variant is present, the known variant is similarly analyzed for interacting substances, and a substance that specifically interacts with the target protein is identified. Is preferred.
[0087]
In the method (iii), the cells into which the cDNA of the present invention is introduced are not particularly limited, but human cultured cells and the like are particularly preferably used. Methods for introducing DNA into cells include those described in (2) above. In addition, the phenotype of the introduced cells can be observed with a microscope, such as cell viability, cell growth rate, cell differentiation, neurite outgrowth when cells are neurons, localization and migration of intracellular proteins, etc. And those that can be analyzed by biochemical experiments, such as changes in the expression of specific proteins in cells. These phenotypes are related to the variant to be analyzed by introducing the DNA of the present invention or a DNA encoding the known variant into cells in the same manner as in the case of a splicing variant in which a known variant exists, and performing comparative analysis. The phenotype can be identified. Further, since it is known that the protein of the present invention has a DNA binding activity or an IAP-like protein effect, the analysis is performed by focusing on the phenotype and the like found in diseases associated with the DNA-binding protein or the IAP-like protein. It is also preferred.
[0088]
The method (iv) can be efficiently performed by a method using an oligonucleotide described below or an RNA interference method. In this method, if a known variant is present in the target protein to be analyzed, a similar analysis is performed for the known variant and other variants, and a function specific to the target protein is identified by comparative analysis. Can be.
[0089]
(6) Screening for a molecule that regulates the activity of the protein of the present invention
By screening for a substance that specifically binds to the protein of the present invention and has an action of inhibiting, antagonizing, or enhancing the function (activity) of the protein of the present invention, a function modulator of the protein of the present invention (hereinafter, referred to as (Sometimes referred to as "modulators").
[0090]
This method of screening for a regulatory substance may be any method as long as it can obtain a substance that specifically binds to the protein of the present invention and has an activity of inhibiting, antagonizing or enhancing the activity of the protein. For example, a method of first contacting a protein of the present invention with a test substance and selecting the test substance based on the binding property to the protein as an index, and then selecting a test substance using the change in the activity of the protein of the present invention as an index. Can be used.
[0091]
The test substance may be any substance as long as it interacts with the protein of the present invention and may affect the activity of the protein. , Proteins, non-peptidic compounds, low molecular weight compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, animal tissue extracts and the like. These substances may be novel substances or known substances. As a method for analyzing the interaction between the test substance and the protein of the present invention, a conventional method known per se can be used. Specifically, for example, yeast two-hybrid method, fluorescence depolarization method, surface plasmon method Phage display method, ribosomal display method, or the competition analysis method with the antibody described in the above (4). A substance found to bind to the protein of the present invention by such a method is then analyzed by analyzing how the activity of the protein of the present invention is affected in the presence of the substance. Whether it is used as a modulator is identified.
[0092]
As a specific analysis method, specifically, the method described in the above (5) can be used. If the transcription control activity or the binding to a transcription factor is increased as compared to the absence of the substance, the substance may function as a transcription control activator or a transcription factor binding promoter. Yes, and if reduced or inhibited, the substance can be identified as potentially functioning as a transcriptional control inhibitor.
[0093]
Here, for the purpose of screening for a pharmaceutically active ingredient, it is preferable to use the above-mentioned human homologous protein or orthologous protein for the DNA or recombinant protein of the present invention to be used. Furthermore, the substances screened by the above method may be selected as drug candidates by screening in vivo.
[0094]
Since the protein of the present invention is an interferon-induced protein family molecule and seems to be involved in transcriptional regulation, the protein of the present invention may be used as an expression regulator, a function activator, or a function inhibitor for various diseases, cancers, and diabetes related to the immune response. , Obesity, inflammatory diseases, respiratory diseases and the like.
[0095]
Such modulators can be used alone for the clinical application, but can also be used as pharmaceutical compositions by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. At this time, the ratio of the active ingredient to the carrier can be varied between 1 and 90% by weight. Such drugs can be administered in various forms, such as tablets, capsules, granules, powders, orally administered by syrup or the like, or injections, drops, liposomes, Parenteral administration with suppositories and the like can be mentioned. In addition, the dose can be appropriately selected depending on symptoms, age, body weight, and the like.
[0096]
(7) Screening of the DNA expression regulator of the present invention
Examples of the screening method include a method of analyzing the expression level of the protein of the present invention or the mRNA encoding the same in the presence of a test substance. Specifically, for example, cells expressing the protein of the present invention described in (2) above are cultured in an appropriate medium containing a test substance, and the amount of the protein of the present invention expressed in the cells is determined by ELISA. And the like, or by analyzing the amount of mRNA encoding the protein of the present invention in the cells by quantitative reverse transcription PCR, Northern blotting, or the like.
[0097]
As the test substance, those described in the above (6) can be used. According to this analysis, if the amount of the protein or mRNA expressed in the cells cultured in the absence of the test substance increases as compared with the amount of the test substance, the substance functions as a substance for promoting the expression of the DNA of the present invention. If it is possible and, on the contrary, decreases, it can be determined that the substance can be used as a substance inhibiting the expression of the DNA of the present invention.
[0098]
The above-mentioned active ingredient can be used alone for clinical application, but can also be used as a pharmaceutical composition by blending it with a pharmaceutically acceptable carrier. At this time, the ratio of the active ingredient to the carrier can be varied between 1 and 90% by weight. Such drugs can be administered in various forms, such as tablets, capsules, granules, powders, orally administered by syrup or the like, or injections, drops, liposomes, Parenteral administration with suppositories and the like can be mentioned. In addition, the dose can be appropriately selected depending on symptoms, age, body weight, and the like.
[0099]
(8) The DNA-introduced animal of the present invention
The transfected DNA containing the DNA of the present invention described in the above (1) is constructed, introduced into a fertilized egg of a mammal other than a human, and this is transplanted into a female individual uterus to generate the DNA. A non-human mammal into which DNA has been introduced can be produced. More specifically, for example, after superovulation of a female individual by hormone administration, it is mated with a male, a fertilized egg is extracted from an oviduct on the first day after mating, and the introduced DNA is microinjected into the fertilized egg. And so on. Thereafter, after culturing by an appropriate method, the surviving fertilized eggs are transplanted into the uterus of a pseudopregnant female individual (foster parent) to give birth. Whether or not the target DNA has been introduced into the newborn can be identified by performing Southern blot analysis on DNA extracted from cells of the individual. Examples of mammals other than humans include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs, cats, and the like.
[0100]
The thus-obtained DNA-introduced animal of the present invention obtains its offspring by crossing this individual and subculturing it in a normal breeding environment while confirming that the introduced DNA is stably retained. be able to. In addition, the offspring can be obtained by repeating in vitro fertilization, and the strain can be maintained.
The non-human mammal into which the DNA of the present invention has been introduced can be used as an analysis of the function of the DNA of the present invention in a living body, or as a screening system for a substance regulating the function.
[0101]
(9) Other uses of the protein of the present invention and DNA containing a nucleotide sequence encoding the same
The protein of the present invention can be used as a carrier having it bound on a substrate. Further, a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a partial fragment thereof can be used as a carrier to which they are bound on a substrate. These may be hereinafter referred to as “protein chips”, “DNA chips” or “DNA arrays” (DNA microarrays and DNA macroarrays). These protein chips or DNA chips or arrays may contain other proteins and DNAs in addition to the proteins and DNAs of the present invention.
[0102]
Here, a resin substrate such as a nylon film or a polypropylene film, a nitrocellulose film, a glass plate, a silicon plate, or the like is used as a substrate for binding a protein or DNA. When using a fluorescent substance or the like, a glass plate or a silicon plate containing no fluorescent substance is preferably used. The binding of the protein or DNA to the base can be easily carried out by a commonly used method known per se. These protein chips, DNA chips, or DNA arrays are also included in the scope of the present invention.
[0103]
In addition, the amino acid sequence of the protein of the present invention and the nucleotide sequence of DNA can also be used as sequence information. The base sequence of the DNA includes the base sequence of the corresponding RNA. That is, a database of amino acid sequences and nucleotide sequences can be constructed by storing the obtained amino acid sequences and nucleotide sequences in an appropriate recording medium in a computer-readable predetermined format. This database may contain the base sequences of other types of proteins and DNAs encoding them. Further, in the present invention, the database also means a computer system that writes the above-mentioned sequence on an appropriate recording medium and performs a search according to a predetermined program. Suitable recording media include, for example, magnetic media such as flexible disks, hard disks, and magnetic tapes; optical disks such as CD-ROM, MO, CD-R, CD-RW, DVD-R, and DVD-RAM; and semiconductor memories. And the like.
[0104]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 Preparation of cDNA library
(1) Preparation of mRNA
mRNA-prepared mouse (C57BL / 6) 0.5 to 1 g of each organ or tissue is homogenized with 10 ml of a suspension, and 1 ml of 2M sodium acetate at pH 4.0 and the same amount of phenol / chloroform (5: 1 by volume). The mixture was added and extracted. When the same amount of isopropanol was added to the aqueous layer after the extraction, RNA separated and precipitated from the aqueous phase. After incubating the sample on ice for 1 hour, the precipitate was collected in a refrigerated centrifuge at 4,000 rpm for 15 minutes. The sample was washed with 70% ethanol, dissolved in 8 ml of water, and added with 2 ml of 5 M NaCl, 1% CTAB (acetyltrimethyl-lammonium bromide), 16 ml of an aqueous solution of pH 7.0 containing 4 M urea and 50 mM Tris to add RNA. The precipitate was removed to remove the polysaccharide (CTAB precipitation).
[0105]
Subsequently, the RNA was centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes at room temperature to dissolve the RNA in 4 ml of 7M guanidine-C1. After adding twice the volume of ethanol, the mixture was incubated on ice for 1 hour, centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes, and the resulting precipitate was washed with 70% ethanol to collect RNA, which was dissolved again in water. RNA purity was measured by reading the OD ratios 260/280 (> 1.8) and 230/260 (<0.45).
[0106]
(2) Preparation of first strand cDNA
Using the mRNA prepared in (1) above (15 μg, reverse transcriptase 3,000 units), 5-methyl-dCTP, dATP, dTTP, and dGTP were converted to 0.54 mM and 0.6 M trehalose in a final reaction volume of 165 μl. 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂The reverse transcription reaction was performed under the conditions of 10 mM {DTT, 52 ng / μl} BSA, RNase inhibitor 5 units. An oligonucleotide containing a recognition sequence of a restriction enzyme XhoI (SEQ ID NO: 3) (in the sequence, V represents A, G, or C, and N represents A, ΔG, ΔC, or T) 12.6 μl as a primer Was.
[0107]
At the start of the reaction, 1/4 of the reaction solution is collected and 1.5 μl of [α-³²By adding [P] -dGTP (3000 Ci / mmol, 10 μCi / μl; manufactured by Amersham), the synthesis efficiency of the first-strand cDNA was measured. 0.5 μl of the RI-labeled reaction solution was spotted on DE-81 paper, and the RI activity before and after washing three times with 0.5 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) was measured and calculated. Thereafter, the RI-labeled reaction solution and the unlabeled reaction solution were mixed, and 0.5 M EDTA 8 μl, 10% SDS 2 μl, and proteinase K 20 μg were added, and the mixture was heated at 45 ° C. for 15 minutes. After extraction with phenol / chloroform and ethanol precipitation, the precipitate was dissolved in 47 μl of RNase-free water (hereinafter referred to as RNase-free water).
[0108]
(3) 5 'cap structure and addition of biotin to 3' end
Biotinylated RNA Diol In order to bind biotin to the diol site (present at both the 5 'end of the Cap structure and the ribose at the 3' end of the poly A chain), a two-step reaction was performed. They are the oxidation of a diol group followed by the coupling reaction of biotin hydrazide with an oxidized RNA. First, 15 μg of the RNA-first strand cDNA complex obtained by the reverse transcription reaction was placed in a 50 μl reaction mixture using a 6.6 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) and sodium periodate as an oxidizing agent. Processed. This oxidation reaction was performed on ice under light-shielding conditions for 45 minutes.
[0109]
Subsequently, 11 μl of 5 M sodium chloride, 0.5 μl of 10% SDS, and the same amount of isopropanol were added, the mixture was left on ice for 60 minutes, and centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes at 15,000 rpm to obtain a precipitate. The precipitate was washed with 70% ethanol and redissolved in 50 μl of RNase-free water. To the sample were added 5 μl of 1 M sodium acetate (pH 6.1), 5 μl of 10% SDS, and 150 μl of 10 mM biotin hydrazide (manufactured by Sigma), and the mixture was reacted at room temperature (22 to 26 ° C.) overnight. Finally, 5 μl of 5 M NaCl, 1 M sodium acetate (pH 6.1) 75 μl, and 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was cooled on ice for 1 hour, centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes, and biotinylated. After the reaction, the reaction solution was centrifuged for 15 minutes to precipitate the RNA-DNA complex again. The precipitate was washed once with 70% ethanol and once with 80% ethanol, and dissolved in 70 μl of RNase-free water.
[0110]
(4) Selection of full-length cDNA by RNase I
By treating the biotinylated RNA-DNA complex obtained in the above (3) with RNase I that digests single-stranded RNA, mRNA whose complete cDNA elongation was not obtained during the reverse transcription reaction, and mRNA The biotin residue labeled at the 3 'end was removed. Specifically, 10 μl of 10 × RNase I buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM EDTA, 2 M NaOAc) was added to 70 μl of the sample obtained in (3), and RNase I (RNase One).^TM200 units (Promega), and the single-stranded RNA was digested at 37 ° C. for 15 minutes.
[0111]
(5) Collection of full-length cDNA
In order to prevent non-specific adsorption of cDNA to magnetic beads coated with streptavidin, 5 mg (500 μl) of magnetic beads (MPG) particles of 100 μg of yeast tRNA (treated with DNase I) were added. (CPG, NJ)) and left on ice for 1 hour, followed by washing with a solution of 50 mM EDTA and 2 M NaCl.
[0112]
The beads were suspended in 500 μl of a solution of 50 mM EDTA and 2 M NaCl, and the RNase I-treated cDNA obtained in (4) was added. By stirring for 30 minutes at room temperature, the magnetic beads and the full-length cDNA were bound. The beads capturing the full-length cDNA were washed four times with a solution of 50 mM EDTA, 2 M NaCl, and once with 0.4% SDS, 50 μg / μl yeast tRNA, 10 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). Once with 20% glycerol, once with 50 μg / μl aqueous solution of yeast tRNA, RNase H buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM
MgCl₂, 20 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM dithiothreitol (DTT)), suspended in 100 µl of RNase に H buffer, added 3 units of RNase H, and heated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 1 μl of 10% SDS and 2 μl of 0.5 M EDTA were added, the mixture was exposed to 65 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected.
[0113]
The thus recovered single-stranded full-length cDNA was extracted with phenol / chloroform, and the volume of the solution was reduced to 100 μl or less using a speed bag, and then subjected to G25 / G100 Sephadex chromatography. The fraction having RI activity was collected in a silicon-treated microtube, and 2 μg of glycogen was added, and the precipitate obtained by ethanol precipitation was dissolved in 30 μl of ultrapure water.
[0114]
(6) Addition of oligo dG to single-stranded cDNA
30 μl of the single-stranded cDNA recovered in the above (5) was mixed with 200 mM sodium cacodylate (pH 6.9), 1 mM @MgCl in a final volume of 50 μl of the reaction solution.₂1 mM @ CoCl₂Under the conditions of 1 mM ３７2-mercaptoethanol and 100 μM dGTP, oligo dG addition reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes using 32 units of terminal deoxynucleotidyl transferase (TaKaRa). At the end of the reaction, EDTA was added to 50 mM and dissolved in 31 μl of ultrapure water through a series of extractions with phenol / chloroform and ethanol precipitation.
[0115]
(7) Second strand cDNA synthesis
The synthesis of the second-strand cDNA using the first-strand cDNA as a template was performed as follows. In a reaction system having a final volume of 60 μl, a second strand low buffer (200 mM Tris-HCl (pH 8.75), 100 mM KCl, 100 mM₄)₂SO₄, 20 mM @ MgSO₄1% Triton X-100, 1 mg / μl BSA) 3 μl, second strand high buffer (200 mM Tris-HCl (pH 9.2), 600 mM KCl, 20 mM MgCl₂) 3 μl, 0.25 mM each of dCTP, dATP, dTTP and dGTP, β-NADH 6 μl, 31 μl of first-strand cDNA with oligo dG added, 600 ng of second-strand primer-adapter (SEQ ID NO: 4), and Ex Taq DNA polymerase ( Second-strand cDNA was synthesized using 15 units of TaKaRa \ Ex \ Taq (TaKaRa), 150 units of thermostable DNA ligase (Ampligase; Epicentre), and 3 units of thermostable RNase \ H (Hybridase; Epicentre).
[0116]
The reaction was stopped by adding 1 μl of 0.5 M EDTA, and further heated at 45 ° C. for 15 minutes in the presence of 10 μg of 10% SDS and 10 μg of proteinase to dissolve the protein component. A double-stranded full-length cDNA purified by extraction with ethanol / chloroform and ethanol precipitation was obtained.
[0117]
(8) Preparation of library
The double-stranded full-length cDNA obtained by the above method was inserted into a λZAPIII vector and recovered as a library. The λZAPIII vector is a λZAPII (manufactured by STRATAGENE) vector obtained by modifying a part of the sequence (SEQ ID NO: 5) of the multiple cloning site to SEQ ID NO: 6, and newly introducing two SfiI sites.
[0118]
Further, a λPS (RIKEN) vector was prepared, and cDNA was inserted. λPS (RIKEN) (named λ-FLC-1 (FLC means FULL-LENGTHＴcDNA)) is a λPS vector of MoBiTec (Germany) modified for cDNA. That is, BamHI and SalI convenient for cDNA insertion are respectively introduced into cloning sites existing on both sides of 10 kbp ｋ stuffer, and a 6 kb DNA fragment is inserted into the XbaI site so that a cDNA of about 0.5 kb to about 13 kb can be cloned. (JP-A-2000-325080). Using this λ-FLC-1, for example, in the case of a lung cDNA library, the average chain length of the insert was 2.57 kb, and it was possible to actually clone an insert of 0.5 kb to 12 kb. In the case of the conventional method λZAP, the average chain length of the insert was 0.97 kb, indicating that the use of λ-FLC-1 enables the cloning of a large-sized cDNA more efficiently than λZAP.
[0119]
Example 2 Normalization / subtraction of full-length cDNA library ® down
(1) Preparation of driver
The mRNA prepared in Example 1 (1) (hereinafter, this may be referred to as “(a) RNA driver”) and the RNA prepared by an in vitro transcription reaction were used as drivers. The latter RNA is further divided into two types (hereinafter referred to as “(b) RNA driver” and “(c) RNA driver”). One is obtained by recovering cDNA from RNA-cDNA removed by normalization and cloning into a phage vector. After infection with Escherichia coli, 1000 to 2000 plaques per starting material are mixed to form one library (mini-library), which is converted into plasmid DNA by a conventional method (the phage is infected again with Escherichia coli together with helper phage to form phagemid) , And another infection to obtain plasmid DNA).
[0120]
The obtained DNA was subjected to an in vitro transcription reaction (using T3 RNA polymerase or T7 RNA polymerase), treated with DNase I (RQ1-RNase free; manufactured by Promega) and Proteinase K, and extracted with phenol / chloroform to obtain RNA (b). An RNA driver was obtained. At this time, as a starting material, a mini-library is prepared from each of nine types of tissues (pancreas, liver, lung, kidney, brain, spleen, testes, small intestine, stomach), and the nine types of mini-libraries are mixed. To obtain RNA. As another RNA, a library (about 20,000 clones) already stored as a non-overlapping clone is cultured, and the obtained DNA is subjected to an in vitro transcription reaction (b) in the same manner as an RNA driver (c). ) RNA driver.
[0121]
These three types of RNAs were labeled with biotinylated using Label-IT \ Biotin \ Labeling Kit (manufactured by Mirus Corporation), added to tester cDNA at a ratio of 1: 1: 1, and reacted with Rot10 (42 ° C). The second strand was synthesized with respect to the supernatant collected after the treatment with streptavidin beads (CPG).
[0122]
Example 3 Nucleotide sequencing of full-length cDNA clones
(1) clone rearray
One representative clone was selected from each cluster. Representative clones were selected by Q-bot (GENETIX @ LIMITED) and arrayed on a 384-well plate. At that time, E. coli was cultured in 50 μl of LB medium at 30 ° C. for 18 to 24 hours. At this time, when the cDNA library was introduced into the PS vector and transformed Escherichia coli DH10B, 100 mg / ml ampicillin and 50 mg / ml kanamycin were added, introduced into the Zap vector, and introduced into the SOLR system. If so, 100 mg / ml ampicillin and 25 mg / ml streptavidin were added.
[0123]
(2) Extraction of plasmid and InsSizing
Each of the clones cultured in the above (1) is further cultured in 1.3 ml of an HT solution containing 100 mg / ml ampicillin, and the cells are collected by centrifugation. Then, QIAprep @ 96 Turbo (manufactured by QIAGEN) is used. To recover and purify the plasmid DNA. In order to examine the chain length of the cDNA inserted in the obtained plasmid, 1/30 of the plasmid DNA obtained above was digested with the restriction enzyme PvuII and subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
[0124]
(3) Sequencing
Three types of sequencers were used to analyze the full-length nucleotide sequence of the full-length cDNA inserted into the thus obtained plasmid. In addition, plasmids were divided into two categories: those having insertion sequences shorter than 2.5 kb and those having longer insertion sequences. Among these, the nucleotide sequence of the clone having an insertion sequence shorter than 2.5 kb was analyzed from both ends. At this time, the plasmid was prepared using the primers of SEQ ID NO: 7 (sense strand) and SEQ ID NO: 8 (antisense strand) when the vector was PS, and SEQ ID NO: 9 (sense strand) when the vector was Zap. Using the primers described in SEQ ID NO: 10 (antisense strand) and Thermosequenase Primer Sequencing Kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), analysis was performed using Licor DNA4200 (long reader sequence).
[0125]
Gaps that could not be analyzed by the above nucleotide sequence analysis were determined by the primer walking method. At this time, ABI Prism 377 and / or ABI Prism 3700 (manufactured by Applied Biosystems Inc.), BigDye terminator kit, and Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Ambition, Inc.) were used.
[0126]
In addition, the sequence of a clone in which the inserted cDNA was longer than 2.5 kb was determined by the shotgun method. At that time, Shimadzu RISA 384 and DYEnic ET terminator cycle sequencing kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) were used. To generate a shotgun library, 48 DNA fragments grown by PCR from 48 independent representative clones were used. The end of the amplified DNA fragment was blunt-ended with T4 DNA polymerase.
This DNA fragment was inserted into a pUC18 vector, and Escherichia coli DH10B was transformed with the recombinant vector. A plasmid was prepared from this E. coli in the same manner as in the above (2).
[0127]
About those representative clones, the base sequence was determined by base sequence analysis from both ends, and the base sequences were ligated on a computer, and then subjected to sharing by Double, Stroke, Shearing, Device (manufactured by Fire Inc.). Nucleotide sequence determination by the shotgun method was performed with duplication of 12 to 15 clones. The gap whose sequence could not be determined by the nucleotide sequence determination was determined by primer walking in the same manner as described above.
[0128]
Example 4 Analysis of nucleotide sequence
As shown in SEQ ID NO: 1, dnaform 35763 was composed of 1138 bases, and among them, base numbers 89 to 1138 had an open reading frame {(a stop codon does not appear and 1138 is the last codon in the base sequence)}. The amino acid sequence predicted from the open reading frame consists of 350 amino acid residues (SEQ ID NO: 2). A homology search was performed on the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 using BLAST. As a result, (i) database registration was performed in the SPTR protein database {(integrated SWISS-PROT protein sequence database and TrEMBL nucleic acid translation database)}. Symbol O35368, Interferon-activatable protein 203 was e-value: 7 × 10⁻⁶⁷And 43% identity over 348 amino acid residues, and (ii) the database registration code P41218, Myloid \ cell \ nuclear \ differentiation \ antigen, e-value: 1 × 10⁻³⁸(Iii) database registration symbol Q16666, Gamma-interferon-inducible \ protein \ Ifi-16, e-value: 6 × 10⁻³⁹351 amino acid residues with 33% identity. From these results, it was presumed that the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was induced to be expressed by interferon and was present in the nucleus.
[0129]
The protein (IAP-like protein) of the above (i) is one of IFN-inducible proteins {(200-family)), and is composed of mouse (IFI202a, IFI202b, IFI203, IFI204 and ANDD3) and human (MNDA, IFI- 16} and {AIM2)} are not only structurally similar but also present in the nucleus, and the gene product p202 of IFI202 binds to transcription factors NF-κB, c-Fos, and c-Jun and represses transcription. (Cell. Biol. 16, (1996) 359-368). The protein (ii) is related to the regulation of transcription in the myeloid lineage from literature information (Immunogenetics # 41: 40-43 (1995)) in the database, and the protein (iii) is the literature information in the database. (Biochemistry # 37: 11924-11931 (1998)) revealed that they are involved in the suppression of transcription.
The amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was subjected to a protein characteristic search using HMMPFAM. As a result, a sequence exhibiting the characteristics of a molecule that interacts with a protein at amino acid numbers 3-87 of SEQ ID NO: 2 (Pfam: PAAD #DAPIN).
[0130]
From these facts, the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is an IAP-like protein, a transcription control factor that is induced to be expressed by interferon and has a function of modifying the function of a transcription factor through protein interaction. That was speculated.
[0131]
Example 5 Tissue expression analysis using PCR method
In order to examine the tissue expression variation of the mRNA encoding the protein of the present invention in normal mice and diseased mice, the PCR method was used according to a standard method (Higuchi R, et al., Biotechnology, {11: 10230-30} (1993)). The tissue expression analysis used was performed.
[0132]
(1) cDNA synthesis
Total RNA was extracted from 19 tissues of the following mice (Kazuo Moriwaki, one extra edition, Molecular Medicine Separate Volume, Vol. 36, “Spontaneous Disease Model Animals”, Nakayama Shoten, 1999), and reverse transcription was performed using oligo dT as a primer. CDNA synthesis was performed using the enzyme.
(A) Tissue of normal mouse and tissue of diabetic model mouse
{Circle around (1)} Control mouse C57BL / KsJ-、 + m / + m Jcl (female, 8 weeks old) whole brain, thalamus, lung, kidney, bone marrow, pancreas, fat cells, liver, eyes
(2) Diabetes model mouse C57BL / KsJ-db / db Jcl (female, 8-week-old) pancreas, fat cells, liver, eyes
(B) Tissue of senescence accelerating mouse
(1) Normal senescent mouse SAM R1 / TA Slc (male, 13 weeks old) hippocampus, frontal cortex
(2) Senescence-accelerated mouse: SAM P8 / Ta Slc (male, 15 weeks old) hippocampus, frontal cortex
(C) Tissue of mouse model of cancer metastasis
(1) Normal colon of control mouse Balb / c (female, 5 weeks old)
(2) Colon metastasis model mouse Balb / c (female, 6 weeks old) colon cancer (colon cancer cells Colon 26 are transplanted into the mouse abdominal cavity, and colon cancer is removed 2 weeks later)
[0133]
(2) Quantification by PCR method
The expression of the following mRNA encoding the protein of the present invention was performed using a LightCycler quantitative PCR apparatus (Roche Diagnostics) and a LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green I reagent according to the protocol attached to the product. Quantified. The synthetic DNA sequences used for quantitative PCR are shown below.
dnaform35763
5 'primer: CCCCCAAAACTCCAAAAAAGA (SEQ ID NO: 11)
3'-side primer: GAACCTTGCTTGGTGACCATT (SEQ ID NO: 12)
[0134]
The quantification result was corrected using Glyceraldehyde @ 3-phosphate @ dehydrogenase (GAPDH) as an internal standard. That is, the expression amount (copy number / μl) of the target gene in each tissue was divided by the expression amount of GAPDH (copy number / μl) to obtain a constant (1 × 10⁶) (Note: 10 to the sixth power) and displayed (Table 1).
[0135]
[Table 1]

[0136]
To summarize the results, dnaform35763 was strongly expressed in bone marrow and lung, and increased in diabetic adipocytes and colon cancer. The cDNA of the clone and the protein encoded by the cDNA can be applied to the treatment and diagnosis of diabetes and cancer. Further, the protein encoded by the cDNA may be involved in a disease relating to a tissue in which the expression of mRNA is fluctuated as described above or a tissue having a high mRNA expression level.
Example 6 Comprehensive analysis of protein encoded by full-length cDNA
Based on the results of Example 4 and Example 5, comprehensive analysis of the protein encoded by the full-length cDNA of the present invention was performed as follows.
The protein encoded by the cDNA of the present invention is similar to IFN-inducible proteins, is more strongly expressed in bone marrow and lung compared to controls (17.5-day-old fetal whole body), and has diabetes mellitus adipocytes and colon. Expression was enhanced in cancer.
From these facts, the present protein has functions related to various diseases related to the immune response, cancer, diabetes, obesity, inflammatory diseases, respiratory diseases, etc., and is useful for the development of these therapeutic agents. It was considered.
[0137]
【The invention's effect】
The protein of the present invention and the DNA encoding the same are IAP-like proteins, which are transcription-regulating factors that are induced by interferon and have the function of modifying the function of transcription factors through protein interaction. A substance that regulates the activity can be screened using the DNA encoding the protein, which is useful for the development of a medicament that can act on a disease or the like in which the protein is involved.
This application is based on Japanese Patent Application (No. 2002-128779) filed on Apr. 30, 2002, the contents of which are incorporated herein by reference. The contents of the documents cited in the present specification are also incorporated herein by reference.
[0138]
[Sequence list]

Claims

以下の　（ａ）　または　（ｂ）　のタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＡＰ様タンパク質作用を有するタンパク質。The following protein (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having an IAP-like protein action;

請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。A DNA encoding the protein according to claim 1.

請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。A full-length cDNA encoding the protein of claim 1.

以下の　（ａ）　、　（ｂ）又は（ｃ）　の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつＩＡＰ様タンパク質をコードするＤＮＡ。A DNA according to any one of the following (a), (b) or (c):
(A) DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(B) a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 with one or several bases deleted, substituted and / or added, and encoding an IAP-like protein;
(C) a DNA having a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary thereto, and encoding an IAP-like protein.

請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。A recombinant vector comprising the DNA according to claim 2.

請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。A gene-introduced cell into which the DNA according to any one of claims 2 to 4 or the recombinant vector according to claim 5 has been introduced, or an individual comprising the cell.

請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載のタンパク質。A protein according to claim 1, which is produced by the cell according to claim 6.

請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。A sense oligonucleotide having the same sequence as 5 to 100 consecutive bases in the base sequence of the DNA according to any one of claims 2 to 4, an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to the sense oligonucleotide, and An oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotide derivatives of the sense or antisense oligonucleotide.

請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。An antibody or a partial fragment thereof that specifically binds to the protein according to claim 1.

抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。The antibody according to claim 9, wherein the antibody is a monoclonal antibody.

モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質のＩＡＰ様タンパク質作用を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。The antibody according to claim 10, wherein the monoclonal antibody has an action of neutralizing the IAP-like protein action of the protein according to claim 1 or 7.

請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。A method for screening for an activity-regulating substance of a protein, comprising bringing the protein according to claim 1 or 7 into contact with a test substance, and measuring a change in the activity of the protein due to the test substance.

請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。A method for screening a substance regulating the expression of a DNA, comprising bringing the test substance into contact with the gene-transfected cell according to claim 6, and detecting a change in the expression level of the DNA introduced into the cell.

請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。At least one or more amino acid sequence information selected from the amino acid sequence of the protein according to claim 1 and / or at least one or more nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of the DNA according to any one of claims 2 to 4. A computer-readable recording medium that stores information.

請求項１に記載のタンパク質、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。A carrier to which the protein according to claim 1 and / or the DNA according to any one of claims 2 to 4 are bound.