JP2004041143A

JP2004041143A - Method for increasing activity of antibody enzyme

Info

Publication number: JP2004041143A
Application number: JP2002206284A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 宇田　泰三; Kinji Matsuura; 松浦　欽司; Emi Hifumi; 一二三　恵美
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2022-07-15
Also published as: JP4316194B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for readily and easily increasing an enzyme activity of an antibody enzyme. <P>SOLUTION: The method for increasing the enzyme activity of the antibody enzyme comprises removing at least a constant region of a Bence-Jones protein of the light chain of an enzyme known as the antibody enzyme by using a protease such as a lysyl endopeptidase to provide a variable region fragment. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、バイオテクノロジーに属し、抗体酵素の活性向上法に関し、より詳細には、適切なプロテアーゼを用いて抗体酵素の定常領域を切断し抗体酵素の酵素活性を向上させる抗体酵素の活性法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗体酵素は抗体でありながら酵素作用を示す非常にユニークなタンパク質であり、抗体触媒、ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂｚｙｍｅとも言われている。世界的にいくつかの抗体酵素が報告されているが、基礎的な研究が多いのが現状である。
【０００３】
現在までに報告されている抗体酵素は、その酵素活性が低く、この点が抗体酵素の実用化を妨げている最も大きな要因の１つである。
【０００４】
このため、抗体酵素の酵素活性を向上させるために、ファージディスプレイ法、遺伝子組換え、点突然変異といった方法が試みられている。これらのうち、ファージディスプレイ法を用いて抗体酵素の酵素活性を向上させることに成功した例がある。しかしながら、抗体酵素の酵素活性を向上させる研究は少なく、上記ファージディスプレイ法以外の方法で抗体酵素の酵素活性を向上させた例は知られていない。
【０００５】
ファージディスプレイ法により抗体酵素の酵素活性を向上させる方法は、抗体遺伝子ライブラリーを組み込んだファージ群にそれぞれ組み込まれた遺伝子の抗体を表面に発現させ、目的とする標的または酵素阻害剤を固着させたプレートにそのファージを撒いた後洗い流して、目的とする標的または酵素阻害剤と結合するものと、結合しないものとに分別する。そして、結合したファージを再び溶出し集めて、前記と同様の方法によりプレートに撒き、更に結合の強い抗体成分を発現しているファージを集める。この操作を繰り返し、結合条件を強くしながら、標的物または酵素阻害剤と強い親和性を持った抗体をスクリーニングしていき、その遺伝子を大腸菌に組み込み、可溶性タンパク質として取得し、酵素活性を測定して、酵素活性の向上した抗体酵素を取得するものである（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ　５１　３７７−３９４：　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ：Ｓ．Ｐａｕｌ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記ファージディスプレイ法によって抗体酵素の酵素活性を向上させる方法は、操作が多く煩雑であり、高度の技術が必要となる手法である。それゆえ、ファージディスプレイ法を用いた抗体酵素の活性向上法は、実用化することが困難であるという問題点を有している。
【０００７】
それゆえ、抗体酵素を実用化するためには、簡単な操作で効率よく、しかも安価で工業的に有利な抗体酵素の酵素活性を向上させる方法を開発することが必須となる。
【０００８】
ところで、抗体酵素の中には完全抗体よりもその部分断片である抗体結合部位（Ｆａｂフラグメント）、または、軽鎖（Ｌ鎖）の酵素活性が高いものがあることが今までの研究から分かっている。そこで、本願発明者等は、これらの領域が抗体酵素の酵素活性と密接に関連しており、その関連性を明らかにすれば抗体酵素の酵素活性を向上させる方法が開発できると考え、抗体酵素の酵素活性とＦａｂフラグメントまたは軽鎖（Ｌ鎖）に着目して抗体酵素の活性向上法を開発したのである。
【０００９】
すなわち、本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、簡便かつ容易に抗体酵素の酵素活性を向上させる方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題に鑑みて鋭意に検討した。その結果、ヒト型抗体軽鎖であるベンスジョーンズタンパク（Ｂｅｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＪＰ）をプロテアーゼ処理して定常領域を除去し可変領域断片とすれば、プロテアーゼ処理しない場合に比べて、抗体酵素の酵素活性が数倍から数十倍向上すること見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる抗体酵素の活性向上法は、上記の課題を解決するために、抗体酵素の少なくとも定常領域を除去することを特徴としている。換言すれば、本発明にかかる抗体酵素の活性向上法は、抗体酵素の可変領域断片を取り出すことを特徴としている。
【００１２】
上記の方法によれば、抗体酵素の定常領域が除去されているので、当該抗体酵素は可変領域断片となっている。これにより、定常領域が除去され可変領域断片となった抗体酵素の酵素活性は、定常領域が除去されていない元の抗体酵素の酵素活性よりも向上する。
【００１３】
上記定常領域は、例えば、プロテアーゼにより容易に除去することができる。
【００１４】
上記プロテアーゼとしては、特に限定されるものではないが、エンドペプチダーゼ、より詳細には、リシルエンドペプチダーゼまたはサーモライシンを好適に用いることができる。
【００１５】
また、本発明において、上記抗体酵素は、ヒト型抗体酵素であることが好ましい。さらに、上記抗体酵素は、抗体軽鎖であってもよい。
【００１６】
上記抗体酵素としては、例えば、ベンスジョーンズタンパクを用いることができる。
【００１７】
このように、本発明の抗体酵素の活性向上法は、抗体酵素の定常領域を除去して、可変領域を取り出すだけでよいので、簡便かつ容易に抗体酵素の酵素活性を向上させることができる。それゆえ、本発明の抗体酵素の活性向上法により、抗体酵素の実用化が可能となる。
【００１８】
本発明には上記した抗体酵素の活性向上法によって得られる抗体も含まれる。すなわち、本発明の抗体酵素は、定常領域が除去され、かつ、定常領域が除去される前よりも酵素活性が向上していることを特徴としている。
【００１９】
従来、抗体酵素の酵素活性が低いことが抗体酵素の実用化を妨げている最も大きな要因であった。しかしながら、本発明の抗体酵素は、酵素活性が向上しているため十分実用化することができる。
【００２０】
【本発明の実施の形態】
（１）本発明の抗体酵素の活性向上法
本発明の実施の一形態について、図１ないし図１２に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
本発明にかかる抗体酵素の活性向上法は、抗体酵素の少なくとも定常領域を除去して抗体酵素の活性を向上させる方法である。換言すれば、抗体酵素の可変領域断片を取り出すことにより抗体酵素の活性を向上させる方法である。
【００２２】
ここで、「抗体酵素」とは、抗体としての機能と酵素としての機能とを併せ持つ抗体のことであり、当該抗体酵素はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体は、抗体と構造的に関連したタンパク質も包含する意味、すなわち免疫グロブリンの意味である。なお、酵素活性を向上させる試料となる抗体酵素は、例えば、ヒトの尿や血液から精製したものであってもよいし、公知の抗体酵素のアミノ酸配列に基づいて作製したものであってもよく、特に限定されるものではない。
【００２３】
一般的に抗体は、２本の重鎖（Ｈ鎖）と相同の２本の軽鎖（Ｌ鎖）とからなり、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）は、それぞれ可変領域と、定常領域とから構成されている。
【００２４】
上記可変領域は、抗体を構成するアミノ酸配列上の変異頻度の高い領域をいい、同じクラスの同一抗原に特異的な抗体活性をもつ抗体でも、その重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）のＮ末端側約１００残基に相当する可変領域は個々の抗体分子に固有の配列を示している。なお、重鎖（Ｈ鎖）の可変領域はＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域と表される場合もある。
【００２５】
また、これらの可変領域中には、特に高次の変異を示す部分である超可変領域が存在し、抗体活性基を構成している。超可変領域は、抗体活性基を構成する相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびＣＤＲ４（Ｈ鎖の場合）に分散して存在する。ＣＤＲは抗体分子ごとに固有のアミノ酸配列をもち、免疫グロブリン遺伝子の突然変異などの際に生じた多様性を表現する標識とされ、イディオタイプの抗原構造部位である。
【００２６】
上記定常領域（Ｃ領域とも表される）は、同一クラスに属する抗体を構成するアミノ酸配列上で、極めて類似性の高い構造をもつ領域である。
【００２７】
例えば、配列番号１にはヒト骨髄腫患者から精製されたベンスジョーンズタンパク（ＨＩＲタンパク）のアミノ酸配列が示される。また、図１にはＨＩＲタンパクの一部と、ベンスジョーンズタンパク（ＲＥＩタンパク）のアミノ酸配列のうちリジンのみを示した概略図が示される。図１に示されるように、抗体軽鎖（Ｌ鎖）であるベンスジョーンズタンパクは、可変領域（Ｖ_Ｌ）と定常領域（Ｃ_Ｌ）とから構成されている。そして、可変領域（Ｖ_Ｌ）は、さらに、超可変領域または抗原相補決定領域（ＣＤＲ１〜３）と、構造領域（フレームワーク（ＦＲ１〜４））とから構成されている。なお、配列番号１に示される（ＨＩＲタンパク）のアミノ酸配列において、ＦＲ１は１番〜２６番のアミノ酸、ＣＤＲ１は２７番〜３２番のアミノ酸、ＦＲ２は３３番〜４９番のアミノ酸、ＣＤＲ２は５０番〜５２番のアミノ酸、ＦＲ３は５３番〜８７番のアミノ酸、ＣＤＲ３は８８番〜９７番のアミノ酸、ＦＲ４は９８番〜１０７番のアミノ酸に相当し、定常領域は１０８番〜２１４番のアミノ酸に相当する。また、配列番号１に示されるＨＩＲタンパクの全アミノ酸配列は、本願発明者等によって今回始めて決定された。
【００２８】
上記「少なくとも定常領域を除去」とは、定常領域を除去することはもちろん、さらに、可変領域の一部を除去してもよいことを意味する。可変領域には酵素の活性中心があり、また、特に変異が多く抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域として知られている領域も存在する。したがって、さらに可変領域の一部を除去する場合、酵素の活性中心およびＣＤＲ以外の領域を除去することが好ましい。換言すれば、酵素活性および抗体の性質に関与する領域を除去しなければ、可変領域も除去してもよいということになる。
【００２９】
なお、酵素の活性中心は、例えば、セリン、メチオニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、グルタミン酸などのアミノ酸である場合が挙げられるので、可変領域を除去する場合、これらのアミノ酸以外のアミノ酸を除去することが好ましい。また、超可変領域は、可変領域の中でも特に高次の変異を示している領域であるので、その領域は容易に認識できる。
【００３０】
上記定常領域を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、タンパク質のペプチド結合を分解するプロテアーゼを用いれば、定常領域を容易に除去できる。プロテアーゼを用いて定常領域を除去した抗体酵素は、ゲル濾過カラム等の周知の方法で簡単に分離して精製することができる。このように、プロテアーゼにより定常領域を除去する方法は、操作が簡便であり、しかも容易に目的の抗体酵素を取得できるため、非常に好ましい。
【００３１】
上記プロテアーゼは、タンパク質分子の内部からペプチド結合を分解するエンドペプチダーゼであっても、タンパク質分子のＣ末端またはＮ末端から分解するエキソペプチダーゼであってもよい。エンドペプチダーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、などが含まれる。エキソペプチダーゼには、Ｃ末端から分解するカルボキシペプチダーゼ、Ｎ末端から分解するアミノペプチダーゼが含まれる。
【００３２】
エンドペプチダーゼには、タンパク質分子の特定のアミノ酸のペプチド結合を特異的に切断するものが多く存在する。それゆえ、定常領域に多く含まれ、目的とする断片（例えば、定常領域が除去された断片、可変領域の活性中心と超可変領域とを含む断片など）が切断されないエンドペプチダーゼを選択することにより、確実に定常領域を除去することができる。これにより、目的とする可変領域断片を取得することができる。
【００３３】
例えば、エンドペプチダーゼであるリシルエンドペプチダーゼは、図２に示されるように、タンパク質分子のリジン残基とＣ末端側アミノ酸との間のペプチド結合を特異的に切断することができる。それゆえ、後述の実施例のように、ベンスジョーンズタンパク（ＨＩＲ）は、定常領域にはリジンが多く、可変領域にはほとんどリジン存在しないため、効率よく定常領域を除去できる。
【００３４】
このようにプロテアーゼ、特にエンドペプチダーゼは、抗体酵素において分解するアミノ酸の種類、分解する位置によって適宜選択することにより、定常領域の大部分もしくはすべてを除去できるので好ましい。なお、後述の実施例のように、ベンスジョーンズタンパクの定常領域を除去するためには、リシルエンドペプチダーゼ、または、サーモライシンを用いれば定常領域を除去して可変領域断片とすることができる。また、サーモライシンはエンドペプチダーゼ（詳細にはメタロプロテアーゼ）の一種であり、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニンなどの疎水性側鎖を有するアミノ酸のペプチド結合を特異的に切断するものである。
【００３５】
このように、本発明の抗体酵素の活性向上法は、抗体酵素の１次構造に基づき超可変領域を含む定常領域を取り出せるプロテアーゼを選択し、抗体酵素と当該プロテアーゼとを反応させる方法ということもできる。
【００３６】
なお、プロテアーゼを用いて定常領域を除去して可変領域とする以外にも、例えば、ＰＣＲ法によって目的とする可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子等（目的とする可変領域又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を増幅し、当該遺伝子を導入した組換え発現ベクターを作成し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、定常領域が除去され酵素活性が向上した可変領域断片の抗体酵素を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた組換え発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。また、産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、例えば、タグの利用等により比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【００３７】
なお、少なくとも定常領域が除去された可変領域断片は、さらに１またはそれ以上のアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。この場合、置換、挿入、および／または付加されるアミノ酸は特に限定されるものではないが、例えば、酵素の活性中心およびＣＤＲ以外の領域のアミノ酸を置換、挿入、および／または付加させればよい。
【００３８】
本発明において、上記抗体酵素は、ヒト型抗体酵素であることが好ましい。ヒト型の抗体酵素であれば、ヒトの疾患の病態解析や、抗体カラムを作製して疾患の免疫学的診断薬として利用することができる。
【００３９】
本発明において、上記抗体酵素は、抗体の機能と酵素の機能とを備えていれば特に限定されるものではなく、例えば、ベンスジョーンズタンパクのように軽鎖（Ｌ鎖）のみで抗体酵素となる抗体軽鎖であってもよいし、軽鎖（Ｌ鎖）と重鎖（Ｈ鎖）とからなる通常の完全抗体の抗体酵素であってもよい。
【００４０】
なお、完全抗体の酵素活性を向上させたい場合、例えば、抗体を還元条件下、パパイン分解すればＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントとに分解できる。そのうち、Ｆａｂフラグメントについて、酵素処理することによって、目的とする可変領域断片を取得することできる。これにより、完全抗体であっても酵素処理することにより、酵素活性を向上させることができる。
【００４１】
抗体軽鎖（Ｌ鎖）として知られているベンスジョーンズタンパクの酵素活性と骨髄腫の病態とは、関連性があることが示唆されている。それゆえ、本発明により活性が向上したベンスジョーンズタンパクは、骨髄腫の病態解析に利用可能であり、酵素活性と病態との関連性を解析することができる。
【００４２】
以上のような抗体酵素の活性向上法によって、目的とする可変領域断片、すなわち、酵素活性の向上した抗体酵素を得ることができる。換言すれば、抗体酵素の定常領域が除去されることにより、酵素活性が向上した抗体酵素を得ることができる。したがって、本発明の抗体酵素の活性向上法は、酵素活性が向上した活性化抗体酵素の製造方法ということができる。なお、本発明には、上記本発明の抗体酵素の活性向上法によって得られた酵素も含まれる。すなわち、本発明の抗体酵素は、定常領域が除去され、かつ、定常領域が除去される前よりも酵素活性が向上している。
【００４３】
なお、本発明の抗体酵素の活性向上法は、プロテアーゼにより抗体酵素を構成するアミノ酸を除去する方法ということもできる。前述のように、酵素活性を向上させるために除去するアミノ酸は、抗体酵素の定常領域のアミノ酸を除去すればよい。また、さらに可変領域のアミノ酸も除去してもよく、この場合酵素の活性中心となるアミノ酸（例えば、セリン、メチオニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、グルタミン酸など）および超可変領域のアミノ酸は除去しない方が好ましい。これにより、抗体酵素の少なくとも定常領域を除去し、当該抗体酵素の可変領域断片を取り出すことができる。
【００４４】
このような活性向上法によって得られる抗体酵素の酵素活性が向上していることを確認する方法は、抗体酵素の酵素活性の種類によって異なるため、特に限定されるものではない。例えば、酵素処理により抗体酵素の定常領域を除去する前と、除去した後との酵素活性を比較することにより、容易に酵素活性の向上が確認できる。例えば、後述の実施例のように、ベンスジョーンズタンパクの酵素活性の向上を確認する場合、クロモザイムトライを用いて、プロテアーゼにより定常領域を除去する前と除去した後とのアミダーゼ活性を比較することにより酵素活性の向上が確認できる。なお、クロモザイムトライは、ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。そして、クロモザイムトライ切断活性によるアミダーゼ活性の測定は、酵素を用いてクロモザイムトライを分解することにより生成するｐ−ＮＡ（パラニトロアニリド；ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）の量を吸光度測定し、アミダーゼ活性を測定するものである。
【００４５】
従来の抗体酵素は、酵素活性が低いために実用化が妨げられていた。また、抗体酵素の酵素活性を向上させることに成功した唯一の方法であるファージディスプレイ法は、操作が煩雑であり、実用化（工業化）するには適していなかった。これに対して、本発明の抗体酵素の活性向上法は、抗体酵素をプロテアーゼ処理などによって定常領域を除去して可変領域断片とする至って簡単便利な方法であり、経済的にも従来よりも遥かに有利な方法である。すなわち、本発明は極めて容易に抗体酵素の酵素活性の向上が図れるものであり、実用化に向けた価値は非常に高いものである。
【００４６】
（２）本発明の利用および有用性
以上のような、本発明の抗体酵素の活性向上法および本発明の抗体酵素は以下に示すような有用性がある。
▲１▼抗体酵素を酵素処理して可変領域断片にするという非常に簡単な操作で、酵素活性を向上させることができる。そのため、酵素活性が向上した種々の抗体酵素を製造することができる。それゆえ、抗体酵素の実用化が可能となる。
▲２▼これまで、酵素活性を有することが知られていない抗体であっても、可変領域断片とすれば、高い酵素活性を得る可能性がある。そのため、新しい医薬品として有用性や利用が出来るだけでなく、将来は、これまでにない難病を克服する画期的な新薬の開発に繋がる可能性がある。
▲３▼生体内において、酵素活性のないあるいは弱いＬ鎖や抗体も、生体内の酵素で断片化されることにより酵素活性が向上し、病態生理に何らかの影響を与えている可能性がある。すなわち、抗体酵素およびＢＪＰなどは生体中の酵素により活性化され、病原性を獲得する可能性を有している。例えば、炎症の際の白血球プロテアーゼ、補体、エンドサイトーシス後のライソゾーム等により、抗体が切断され、疾患を引き起こす可能性がある。それゆえ、本発明の方法により抗体を断片化すれば、疾患と抗体断片との関係が明らかとなり、様々な疾患の病態解析を行うことができる。
▲４▼酵素活性が向上された抗体酵素は、例えば、微生物の生存に不可欠なタンパク質（またはペプチド）を抗原して、特異的に認識すると共に、その抗原を酵素活性により分解することができる。それゆえ、抗生物質と異なり、薬剤耐性を示さない微生物の除菌のための予防または治療薬としての利用が期待される。
▲５▼抗体の高い分子認識能と酵素の持つ基質変換能力を併せ持つ抗体酵素は、新しいバイオマテリアルとして新型のバイオセンサにも応用可能で病気の診断、環境測定などに利用可能である。また、食品工業、化学工業における効果的な合成手段などにも展開できる。
▲６▼免疫学的診断にＲＩＡやＥＬＩＳＡが現在多用されているが、酵素活性が向上した抗体酵素により、新しい臨床診断法や診断薬の開発が期待される。
▲７▼酵素活性の強いベンスジョーンズタンパクは、細胞傷害作用も強いことが知られている。したがって、酵素活性が向上したＢＪＰの中から、癌細胞を傷害および／または増殖抑制するＢＪＰを選抜すれば、当該ＢＪＰを治療薬に利用することが可能である。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【００４８】
以下の実施例では、抗体酵素として、軽鎖からなるモノクローナル抗体（すなわちモノクローナルな抗体軽鎖）として知られているベンスジョーンズタンパク（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＪＰ）を例に挙げて説明する。すなわち、抗体酵素であるＢＪＰの活性向上法は、配列番号１に示されるＢＪＰ（サブタイプＨＩＲ；ＨＩＲタンパク）を酵素処理することにより、定常領域を除去する方法である。
【００４９】
〔ベンスジョーンズタンパクについて〕
ベンスジョーンズタンパクはモノクローナルな抗体軽鎖であることは良く知られており、このベンスジョーンズタンパクが様々なタイプの酵素活性を持つという報告が最近多く見られる様になってきた。そのため、例えば、Ｐａｕｌをはじめ（Ｐａｕｌ，　Ｓ．，　Ｌｉ，　Ｌ．，　Ｋａｌａｇａ，　Ｒ．，　Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｓｔｅｖｅｎｓ，　Ｐ，　Ｓｔｅｖｅｎｓ，　Ｆ．Ｊ．，　＆　Ｓｏｌｏｍｏｍ，　Ａ．　：　Ｎａｔｕｒａｌ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆＢｅｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ　ｐｒｐｔｅｉｎ　ａｎｄ　ＶＬ　ｆｒａｇｍｅｎｔ．　Ｊ　．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７０：１５２５７，　１９９５．）、篠原らのグループにより精力的な研究が行われている。多発性骨髄腫患者の尿から採取されるベンスジョーンズタンパクは、患者間で基質に対する反応性がかなり異なっている。アミダーゼ活性（Ｍａｔｓｕｕｒａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｓｉｎｏｈａｒａ，　Ｈ．　：　Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　Ｂｅｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ａｒｇｉｎｙｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ　ｂｏｎｄ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７７：５８７，　１９９６）やペプチダーゼ活性（Ｍａｔｕｕｒａ，　Ｋ．，　Ｉｋｏｍａ，　Ｓ．，　Ｓｕｇｉｙａｍａ，　Ｍ．，　Ｆｕｎａｕｃｈｉ，　Ｍ．，　＆　Ｓｉｎｏｈａｒａ，　Ｈ．　　Ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｓｅｒａ　ｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，　Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　９５：２６，　１９９８）さらにはＤＮＡ分解活性（Ｍａｔｓｕｕｒａ，　Ｋ．，　Ｉｋｏｍａ，　Ｓ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｓｉｎｏｈａｒａ，　Ｈ．，　ＤＮＡ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｅｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ，　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２４３：７１９，　１９９８．）を持つものなどが知られている。しかし、多くの場合その酵素活性は幅広い。健常人に存在するタンパク濃度は低く（ｎＭ程度）、この濃度では効果を発揮し得ないとされている。しかし、骨髄腫になりその濃度上昇し、ｍＭ程度にも達すると酵素活性がトータルで効果を発揮するようになり、生理学的に重要になると言われている。また、中には非常に高い酵素活性と特徴的な生化学的性質を示すベンスジョーンズタンパクも認められている。
【００５０】
このように、多発性骨髄腫患者の尿中に存在するベンスジョーンズタンパクは、モノクローナル抗体軽鎖（Ｌ鎖）であるが、ベンスジョーンズタンパクには酵素活性を有するものがあることが報告されている。さらに、上記酵素活性が骨髄腫の病態との関連性があることも示唆されている。
【００５１】
そこで、このような知見に基づいて、ベンスジョーンズタンパク（抗体軽鎖（Ｌ鎖））を断片化して、抗体酵素活性の酵素活性を検討した。
【００５２】
〔実施例１〕
（ａ）リシルエンドペプチダーゼ処理（試料の調整）
ベンスジョーンズタンパクであるＨＩＲタンパクは、骨髄腫患者の尿から硫安塩析、疎水性カラム、ゲル濾過カラム等を用いる常法により精製した。次に、
精製したＨＩＲタンパクに約１／５０濃度のリシルエンドペプチダーゼ（　ｉｎ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．４）を加えＴｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．４　ｂｕｆｆｅｒ中、３７℃で約１時間反応させた。
【００５３】
なお、ＨＩＲタンパクのＮ末端アミノ酸配列をシークエンスしたところ、得られた４９残基のＮ末端アミノ酸配列は、ベンスジョーンズタンパク（ＲＥＩ）と高い相同性を示した。そこで、ＨＩＲタンパクをリシルエンドペプチダーゼで処理すれば、どのように断片化されるのかをＲＥＩタンパクのアミノ酸配列に基づいて予測した。その結果、図１の概略図に示されるように、ＨＩＲタンパクのＮ末端から４９残基までのアミノ酸配列にリジンが確認されなかったことから、ＨＩＲの可変領域は比較的長い領域の断片となり、また、ＲＥＩタンパクと同様に定常領域にはリジンが多く含まれていると予測されることから、定常領域は細かな断片になることが予測された。
【００５４】
（ｂ）酵素活性（クロモザイムトライ（Ｃｒｏｍｏｚｙｍ−ＴＲＹ）切断活性）の測定
次に、リシルエンドペプチダーゼ処理したＨＩＲタンパクをゲル濾過カラム（ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２）にかけ、分画し蛋白画分ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４，　１５，　１６を得た（図５）。続いて、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４，　１５，　１６およびｆｒａｃｔｉｏｎ　１４と同濃度のリシルエンドペプチダーゼ未処理のＨＩＲの酵素活性を測定した。
【００５５】
酵素活性の測定は、サンプルに終濃度０．１ｍＭの（ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を加えＴｒｉｓＨＣｌ　，ｐＨ　７．４　，　０．１％　ＮａＮ_３　ｂｕｆｆｅｒ中で反応させ一定時間後の４１０ｎｍ吸光度を測定した。なお、サンプルを加えずＴｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒにクロモザイムトライを加えたものをコントロールとした。また、サンプルはｆｒａｃｔｉｏｎ　１４，　１５，　１６およびＨＩＲタンパク６μＬ、クロモザイムトライ１００μＬ、０．１％ＮａＮ_３の条件で行った。
【００５６】
（ｃ）酵素活性の測定結果
酵素活性を測定した結果、図６に示されるように、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４は処理前に比べ酵素活性が有意に上昇していた。また、図７に示されるように、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４および未処理のＨＩＲタンパクを電気泳動した結果、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４は１１ｋＤａに、未処理のＨＩＲタンパクは２２ｋＤａにバンドを認めた。さらに、１１ｋＤａのバンドのＮ末端アミノ酸配列をシークエンスした結果、ＨＩＲタンパクのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１に示される１番目〜１０番目のアミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ）と一致した。これにより、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４に含まれる酵素活性が向上した断片は、ＨＩＲタンパクの可変領域でることが推定される。
【００５７】
なお、配列番号１には、ＨＩＲタンパクの全アミノ酸配列が示される。配列番号１に示されるように、ＨＩＲタンパクをリシルエンドペプチダーゼ処理すれば、１０３番目のリジンで切断されると考えられる。したがって、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１番目〜１０３番目のアミノ酸であると推定される。このことは、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４の分子量が１１ｋＤａであったことからも支持される。
【００５８】
（ｄ）カイネティック・パラメーターの測定
３．５ｕＭの未処理のＨＩＲタンパクと高い酵素活性が見られたｆｒａｃｔｉｏｎ　１４とについて、１０，２５，５０，７５，１００，５００ｍＭの濃度のクロモザイムトライを加え３７℃で２３時間後の酵素活性を測定した。その結果、表１に示されるように、Ｋｍ値については、未処理のＨＩＲタンパクの方がｆｒａｃｔｉｏｎ　１４と比較して約７倍高く強い親和性を示していたが、Ｋｃａｔ値については、ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４の方が未処理のＨＩＲタンパクと比較して約８０倍も高く、基質転換能力が高いことが確認された。
その結果、リシルエンドペプチダーゼ処理して得られた断片のＫｃａｔ（酵素反応速度）は約８３倍上昇していた。なお、図３にはｆｒａｃｔｉｏｎ　１４のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔが、図４には未処理のＨＩＲタンパクのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔがそれぞれ示される。
【００５９】
【表１】

【００６０】
〔実施例２〕ＢＪＰの活性向上の可能性
５種類のベンスジョーンズタンパク（ＨＩＲタンパク、ＨＩＺタンパク、ＹＡＭタンパク、ＭＯＲタンパク、ＭＯＫタンパク）について、実施例１と同様の方法で酵素活性の向上を検討した。なお、サンプルはベンスジョーンズタンパク１３．４μＬ、クロモザイムトライ１００μＬ、０．１％ＮａＮ_３の条件で行った。
【００６１】
すなわち、それぞれのベンスジョーンズタンパクを精製し、リシルエンドペプチダーゼ処理、および未処理の酵素活性を比較した。その結果、図８〜図１２に示されるように、５例中３例（ＨＩＲタンパク、ＹＡＭタンパク、ＭＯＲタンパク）でリシルエンドペプチダーゼ処理後顕著な酵素活性が認められた。特に、ＹＡＭタンパクは、エンドペプチダーゼ未処理ではほとんど酵素活性が認められなかったにもかかわらず、酵素処理により断片化すると強い酵素活性が得られた。
【００６２】
〔実施例３〕他の酵素（サーモライシン）による酵素活性の向上
ペプチダーゼとして、リシルエンドペプチダーゼの代わりにサーモライシンを用いる以外は、実施例１と同様の方法により、ベンスジョーンズタンパク（ＭＯＲタンパク）の酵素活性の向上について検討した。
【００６３】
すなわち、ベンスジョーンズタンパクであるＭＯＲタンパクに１／５０濃度のサーモライシンを加え３時間３７℃でインキュベーションした。続いて、この反応液をゲル濾過により分画した画分の酵素活性を測定した。その結果、実施例１のリシルエンドペプチダーゼ処理した場合と同様に、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　１４の画分は、未処理に比べて高い酵素活性を確認した。なお、図示しないが、この画分を電気泳動した結果、分子量は約１２ｋＤａで、アミノ酸シークエンスでは軽鎖のＮ末配列と一致した。これにより、サーモライシンにより断片化した場合でも、酵素活性が向上することが確認された。
【００６４】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、酵素処理などにより、定常領域を除去して可変領域断片とする至って簡単便利な方法であり、経済的にも従来よりも遥かに有利な方法である。すなわち、本発明は極めて容易に抗体酵素の酵素活性の向上が図れるものであり、実用化に向けた価値は非常に高いものである。また、本発明によれば、酵素活性が弱い抗体酵素であっても、酵素処理などによって抗体酵素の断片化、または、可変領域を用いることにより、抗体酵素の酵素活性を向上させることができる。
【００６５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態にかかる抗体軽鎖であるベンスジョーンズタンパク、ＨＩＲタンパクおよびＲＥＩタンパクの構成を示す概略図である。
【図２】リシルエンドペプチダーゼの分解位置を示す図である。
【図３】実施例１におけるｆｒａｃｔｉｏｎ　１４のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔを示すグラフである。
【図４】実施例１における未処理のＨＩＲタンパクのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔを示すグラフである。
【図５】実施例１におけるリシルエンドペプチダーゼ処理したＨＩＲタンパクをゲル濾過カラムにより分画した蛋白画分を示す図である。
【図６】実施例１におけるクロモザイムトライ切断活性により酵素活性を示す図である。
【図７】実施例１におけるフラクション１４と未処理のＨＩＲタンパクとの電気泳動した結果を示す図である。
【図８】実施例２における、酵素処理前のベンスジョーンズタンパク（ＨＩＺタンパク）と、酵素処理後のＨＩＺ断片との酵素活性を比較したグラフである。
【図９】実施例２における、酵素処理前のベンスジョーンズタンパク（ＹＡＭタンパク）と、酵素処理後のＹＡＭ断片との酵素活性を比較したグラフである。
【図１０】実施例２における、酵素処理前のベンスジョーンズタンパク（ＨＩＲタンパク）と、酵素処理後のＨＩＲ断片との酵素活性を比較したグラフである。
【図１１】実施例２における、酵素処理前のベンスジョーンズタンパク（ＭＯＲタンパク）と、酵素処理後のＭＯＲ断片との酵素活性を比較したグラフである。
【図１２】実施例２における、酵素処理前のベンスジョーンズタンパク（ＭＯＫタンパク）と、酵素処理後のＭＯＫ断片との酵素活性を比較したグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to pharmaceuticals and biotechnology, and relates to a method for improving the activity of an antibody enzyme, and more particularly, to the activity of an antibody enzyme that improves the enzyme activity of an antibody enzyme by cleaving the constant region of the antibody enzyme using an appropriate protease. It is about the law.
[0002]
[Prior art]
An antibody enzyme is a very unique protein that exhibits an enzymatic action even though it is an antibody, and is also called an antibody catalyst, catalytic antibody, or abzyme. Although some antibody enzymes have been reported worldwide, there are many basic studies at present.
[0003]
The antibody enzyme reported to date has a low enzyme activity, and this is one of the biggest factors preventing the practical use of the antibody enzyme.
[0004]
Therefore, methods such as phage display, gene recombination, and point mutation have been attempted to improve the enzyme activity of the antibody enzyme. Among these, there is an example in which the enzymatic activity of the antibody enzyme has been successfully improved using the phage display method. However, there are few studies to improve the enzyme activity of the antibody enzyme, and there is no known example of improving the enzyme activity of the antibody enzyme by a method other than the phage display method.
[0005]
The method of improving the enzyme activity of the antibody enzyme by the phage display method is to express the antibody of the gene incorporated in each phage group incorporating the antibody gene library on the surface and fix the target or enzyme inhibitor of interest After the phage is spread on the plate, the phage is washed off and separated into those that bind to the target or enzyme inhibitor of interest and those that do not. Then, the bound phages are eluted again and collected, spread on a plate in the same manner as described above, and the phages expressing the antibody component having strong binding are collected. This procedure is repeated to screen for antibodies that have a strong affinity for the target substance or enzyme inhibitor while increasing the binding conditions, incorporate the gene into Escherichia coli, obtain it as a soluble protein, and measure the enzyme activity. To obtain an antibody enzyme with improved enzyme activity (Methods in Molecular Biology, Vol 51 377-394: Antibody Engineering Protocols Edited by: S. Paul Humana Press Inc., N.J.).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, the method of improving the enzyme activity of an antibody enzyme by the phage display method is a technique that requires many operations and is complicated, and requires a high level of technology. Therefore, the method for improving the activity of an antibody enzyme using the phage display method has a problem that it is difficult to put it to practical use.
[0007]
Therefore, in order to put the antibody enzyme into practical use, it is essential to develop a method for improving the enzyme activity of the antibody enzyme which is efficient, simple, inexpensive and industrially advantageous by a simple operation.
[0008]
Studies have shown that some antibody enzymes have a higher enzymatic activity of the antibody binding site (Fab fragment) or light chain (L chain), which is a partial fragment thereof than the complete antibody. I have. Therefore, the present inventors believe that these regions are closely related to the enzyme activity of the antibody enzyme, and that if the relationship is clarified, it is possible to develop a method for improving the enzyme activity of the antibody enzyme. The present inventors have developed a method for improving the activity of an antibody enzyme by focusing on the enzyme activity and Fab fragment or light chain (L chain).
[0009]
That is, the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for easily and easily improving the enzyme activity of an antibody enzyme.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors diligently studied in view of the above problems. As a result, the Bence Jones Protein (BJP), which is a human antibody light chain, is treated with a protease to remove the constant region to form a variable region fragment. Was improved by several times to several tens times, and the present invention was completed.
[0011]
That is, the method for improving the activity of an antibody enzyme according to the present invention is characterized in that at least the constant region of the antibody enzyme is removed in order to solve the above problems. In other words, the method for improving the activity of an antibody enzyme according to the present invention is characterized by extracting a variable region fragment of the antibody enzyme.
[0012]
According to the above method, since the constant region of the antibody enzyme has been removed, the antibody enzyme is a variable region fragment. As a result, the enzyme activity of the antibody enzyme from which the constant region has been removed to form a variable region fragment is higher than the enzyme activity of the original antibody enzyme from which the constant region has not been removed.
[0013]
The constant region can be easily removed by, for example, a protease.
[0014]
The protease is not particularly limited, but endopeptidase, more specifically, lysyl endopeptidase or thermolysin can be suitably used.
[0015]
In the present invention, it is preferable that the antibody enzyme is a human antibody enzyme. Further, the antibody enzyme may be an antibody light chain.
[0016]
As the antibody enzyme, for example, Bence Jones protein can be used.
[0017]
As described above, in the method for improving the activity of an antibody enzyme of the present invention, it is only necessary to remove the constant region of the antibody enzyme and extract the variable region, so that the enzyme activity of the antibody enzyme can be easily and easily improved. Therefore, the method for improving the activity of the antibody enzyme of the present invention enables the practical use of the antibody enzyme.
[0018]
The present invention also includes an antibody obtained by the above-described method for improving the activity of an antibody enzyme. That is, the antibody enzyme of the present invention is characterized in that the constant region is removed and the enzyme activity is higher than before the constant region is removed.
[0019]
Conventionally, the low enzyme activity of an antibody enzyme has been the biggest factor preventing the practical use of an antibody enzyme. However, the antibody enzyme of the present invention can be sufficiently put to practical use because of its improved enzyme activity.
[0020]
[Embodiment of the present invention]
(1) Method for improving the activity of the antibody enzyme of the present invention
One embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. Note that the present invention is not limited to this.
[0021]
The method for improving the activity of an antibody enzyme according to the present invention is a method for improving the activity of an antibody enzyme by removing at least a constant region of the antibody enzyme. In other words, this is a method for improving the activity of the antibody enzyme by extracting the variable region fragment of the antibody enzyme.
[0022]
Here, the "antibody enzyme" is an antibody having both the function as an antibody and the function as an enzyme, and the antibody enzyme may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. In addition, the above antibody also includes proteins structurally related to the antibody, that is, immunoglobulins. The antibody enzyme used as a sample for improving the enzyme activity may be, for example, one purified from human urine or blood, or one prepared based on the amino acid sequence of a known antibody enzyme. It is not particularly limited.
[0023]
In general, an antibody consists of two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains) homologous, and the heavy chains (H chains) and light chains (L chains) each have a variable region , And a constant region.
[0024]
The variable region refers to a region having a high mutation frequency in the amino acid sequence constituting the antibody. Even in an antibody having antibody activity specific to the same antigen of the same class, the heavy chain (H chain) and light chain (L chain The variable region corresponding to about 100 residues on the N-terminal side of ()) indicates a sequence unique to each antibody molecule. The variable region of the heavy chain (H chain) is V _H And V _L Sometimes referred to as an area.
[0025]
In addition, in these variable regions, there is a hypervariable region which is a portion showing a higher-order mutation, and constitutes an antibody active group. The hypervariable regions are distributed in the complementarity-determining regions constituting the antibody active group, CDR1, CDR2, CDR3 and CDR4 (in the case of H chain). CDR has a unique amino acid sequence for each antibody molecule, and is used as a marker to express the diversity generated at the time of mutation of an immunoglobulin gene and the like, and is an idiotype antigen structural site.
[0026]
The constant region (also referred to as C region) is a region having a structure with extremely high similarity in an amino acid sequence constituting an antibody belonging to the same class.
[0027]
For example, SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of Bence Jones protein (HIR protein) purified from a human myeloma patient. FIG. 1 is a schematic diagram showing a part of the HIR protein and only the lysine in the amino acid sequence of the Bence Jones protein (REI protein). As shown in FIG. 1, Bence Jones protein, which is an antibody light chain (L chain), has a variable region (V _L ) And the constant region (C _L ). Then, the variable region (V _L ) Is further composed of a hypervariable region or an antigen complementarity determining region (CDR1 to 3) and a structural region (framework (FR1 to 4)). In the amino acid sequence of (HIR protein) shown in SEQ ID NO: 1, FR1 is amino acids 1 to 26, CDR1 is amino acids 27 to 32, FR2 is amino acids 33 to 49, and CDR2 is 50. The amino acids Nos. 52-52, FR3 corresponds to the amino acids Nos. 53-87, CDR3 corresponds to the amino acids Nos. 88-97, FR4 corresponds to the amino acids Nos. 98-107, and the constant region is the amino acids Nos. 108-214. Is equivalent to Further, the entire amino acid sequence of the HIR protein shown in SEQ ID NO: 1 has been determined for the first time by the present inventors.
[0028]
The above-mentioned “remove at least the constant region” means that the constant region may be removed and a part of the variable region may be removed. The variable region has the active center of the enzyme, and also has a region that is particularly mutated and known as the antigen complementarity determining region (CDR) or hypervariable region. Therefore, when further removing a part of the variable region, it is preferable to remove a region other than the active center and CDR of the enzyme. In other words, if the regions involved in enzyme activity and antibody properties are not removed, the variable regions may also be removed.
[0029]
The active center of the enzyme includes, for example, amino acids such as serine, methionine, aspartic acid, histidine, and glutamic acid.When removing the variable region, it is preferable to remove amino acids other than these amino acids. . In addition, the hypervariable region is a region showing particularly high-order mutation among the variable regions, and therefore, the region can be easily recognized.
[0030]
The method for removing the constant region is not particularly limited, but the constant region can be easily removed by using a protease that degrades a peptide bond of a protein. The antibody enzyme from which the constant region has been removed using a protease can be easily separated and purified by a well-known method such as a gel filtration column. As described above, the method of removing the constant region with a protease is very preferable because the operation is simple and the target antibody enzyme can be easily obtained.
[0031]
The protease may be an endopeptidase that degrades a peptide bond from inside a protein molecule or an exopeptidase that degrades from the C-terminus or N-terminus of a protein molecule. Endopeptidases include serine proteases, cysteine proteases, aspartic proteases, metalloproteases, and the like. Exopeptidases include carboxypeptidases that degrade from the C-terminus and aminopeptidases that degrade from the N-terminus.
[0032]
Many endopeptidases specifically cleave peptide bonds of specific amino acids in protein molecules. Therefore, by selecting an endopeptidase which is contained in a large amount in the constant region and which does not cleave a fragment of interest (for example, a fragment from which the constant region has been removed, a fragment containing the active center of the variable region and the hypervariable region). Thus, the constant region can be reliably removed. Thereby, the target variable region fragment can be obtained.
[0033]
For example, lysyl endopeptidase, an endopeptidase, can specifically cleave a peptide bond between a lysine residue and a C-terminal amino acid of a protein molecule, as shown in FIG. Therefore, as in the examples described later, Bence Jones protein (HIR) has a large amount of lysine in the constant region and almost no lysine in the variable region, so that the constant region can be efficiently removed.
[0034]
As described above, a protease, particularly an endopeptidase, is preferable because most or all of the constant region can be removed by appropriately selecting the type of amino acid to be decomposed in the antibody enzyme and the position of the decomposition. As described in Examples below, in order to remove the constant region of Bence Jones protein, if lysyl endopeptidase or thermolysin is used, the constant region can be removed to obtain a variable region fragment. Thermolysin is a type of endopeptidase (specifically, a metalloprotease) and specifically cleaves peptide bonds of amino acids having a hydrophobic side chain such as isoleucine, leucine, valine, phenylalanine, and methionine.
[0035]
As described above, the method for improving the activity of an antibody enzyme of the present invention is a method of selecting a protease from which a constant region including a hypervariable region can be extracted based on the primary structure of the antibody enzyme, and reacting the antibody enzyme with the protease. it can.
[0036]
In addition to removing the constant region using a protease to obtain a variable region, for example, a gene encoding the amino acid sequence of the target variable region by PCR (for example, the target variable region or its homologous molecule, etc. Amplifying cDNA, etc.), producing a recombinant expression vector into which the gene has been introduced, incorporating into a microorganism such as Escherichia coli or yeast or animal cells by a well-known method, and transforming the protein encoded by the cDNA. By expressing and purifying, it is possible to easily obtain an antibody enzyme of a variable region fragment in which the constant region is removed and the enzyme activity is improved. When a foreign gene is introduced into a host as described above, there are various recombinant expression vectors and hosts that incorporate a promoter that functions in the host into the recombination region of the foreign gene. You just have to select The method for removing the produced protein varies depending on the host used and the properties of the protein. For example, it is possible to relatively easily purify the target protein by using a tag or the like.
[0037]
The variable region fragment from which at least the constant region has been removed may further have one or more amino acids substituted, inserted, and / or added. In this case, amino acids to be substituted, inserted, and / or added are not particularly limited. For example, amino acids in a region other than the active center and CDR of the enzyme may be substituted, inserted, and / or added. .
[0038]
In the present invention, the antibody enzyme is preferably a human antibody enzyme. If it is a human antibody enzyme, it can be used as a pathological analysis of human disease or an antibody diagnostic column prepared by preparing an antibody column.
[0039]
In the present invention, the antibody enzyme is not particularly limited as long as it has the function of an antibody and the function of an enzyme. For example, only a light chain (L chain) such as Bence Jones protein becomes an antibody enzyme. It may be an antibody light chain, or may be an ordinary whole antibody antibody enzyme consisting of a light chain (L chain) and a heavy chain (H chain).
[0040]
When it is desired to improve the enzymatic activity of a complete antibody, for example, papain digestion of the antibody under reducing conditions can decompose it into Fab fragments and Fc fragments. The desired variable region fragment can be obtained by subjecting the Fab fragment to an enzyme treatment. Thereby, even if it is a complete antibody, the enzyme activity can be improved by the enzyme treatment.
[0041]
It has been suggested that the enzyme activity of Bence Jones protein known as an antibody light chain (L chain) is related to the pathology of myeloma. Therefore, the Bence Jones protein whose activity has been improved by the present invention can be used for analyzing the pathological state of myeloma, and the relationship between the enzyme activity and the pathological state can be analyzed.
[0042]
By the method for improving the activity of an antibody enzyme as described above, a target variable region fragment, that is, an antibody enzyme with improved enzyme activity can be obtained. In other words, an antibody enzyme with improved enzyme activity can be obtained by removing the constant region of the antibody enzyme. Therefore, the method for improving the activity of an antibody enzyme of the present invention can be said to be a method for producing an activated antibody enzyme having improved enzyme activity. The present invention also includes an enzyme obtained by the above-described method for improving the activity of the antibody enzyme of the present invention. That is, the antibody enzyme of the present invention has the constant region removed, and the enzyme activity is higher than before the constant region was removed.
[0043]
The method for improving the activity of an antibody enzyme of the present invention can also be said to be a method for removing amino acids constituting the antibody enzyme with a protease. As described above, the amino acids to be removed to improve the enzyme activity may be those in the constant region of the antibody enzyme. Further, amino acids in the variable region may be further removed. In this case, it is preferable not to remove amino acids (eg, serine, methionine, aspartic acid, histidine, glutamic acid, etc.) which are active centers of the enzyme and amino acids in the hypervariable region. . Thereby, at least the constant region of the antibody enzyme can be removed, and the variable region fragment of the antibody enzyme can be extracted.
[0044]
The method for confirming that the enzyme activity of the antibody enzyme obtained by such an activity improving method is improved is not particularly limited because it differs depending on the type of the enzyme activity of the antibody enzyme. For example, by comparing the enzyme activities before and after removing the constant region of the antibody enzyme by the enzyme treatment, an improvement in the enzyme activity can be easily confirmed. For example, when confirming the improvement of the enzyme activity of Bence Jones protein as in the examples described below, the chromozyme try is used to compare the amidase activity before and after removing the constant region with the protease. As a result, an improvement in the enzyme activity can be confirmed. In addition, chromozyme try means a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by z-Val-Gly-Arg-pNA. And the measurement of amidase activity by chromozyme try cleavage activity measures the amount of p-NA (para-nitroanilide; p-nitroanilide) generated by decomposing chromozyme try using an enzyme, and measures the amidase activity. It is to be measured.
[0045]
Practical use of conventional antibody enzymes has been hindered due to low enzyme activity. In addition, the phage display method, which is the only method that succeeded in improving the enzyme activity of an antibody enzyme, requires complicated operations and is not suitable for practical use (industrialization). On the other hand, the method for improving the activity of an antibody enzyme of the present invention is a very simple and convenient method for removing a constant region of an antibody enzyme by protease treatment or the like to obtain a variable region fragment, and is economically far more convenient than before. This is an advantageous method. That is, the present invention can very easily improve the enzymatic activity of an antibody enzyme, and is extremely valuable for practical use.
[0046]
(2) Use and usefulness of the present invention
As described above, the method for improving the activity of the antibody enzyme of the present invention and the antibody enzyme of the present invention have the following usefulness.
{Circle around (1)} The enzyme activity can be improved by a very simple operation of enzymatically treating an antibody enzyme into a variable region fragment. Therefore, various antibody enzymes with improved enzyme activity can be produced. Therefore, practical use of the antibody enzyme becomes possible.
{Circle around (2)} Even if the antibody has not been known to have an enzymatic activity, a high enzymatic activity may be obtained if it is a variable region fragment. Therefore, not only can it be useful and used as a new drug, but in the future, it may lead to the development of a revolutionary new drug that overcomes unprecedented intractable diseases.
{Circle around (3)} In the living body, even an L chain or an antibody having no or weak enzyme activity may be enzymatically enhanced by being fragmented with the enzyme in the living body, possibly affecting the pathophysiology. That is, antibody enzymes, BJP, and the like are activated by enzymes in the living body and have a possibility of acquiring pathogenicity. For example, leukocyte proteases during inflammation, complement, lysosomes after endocytosis, etc. may cleave antibodies and cause disease. Therefore, when the antibody is fragmented by the method of the present invention, the relationship between the disease and the antibody fragment becomes clear, and the pathological analysis of various diseases can be performed.
{Circle around (4)} An antibody enzyme with improved enzyme activity can, for example, specifically recognize and inactivate a protein (or peptide) indispensable for the survival of a microorganism and degrade the antigen by the enzyme activity. Therefore, unlike antibiotics, utilization as a prophylactic or therapeutic agent for eradication of microorganisms that do not exhibit drug resistance is expected.
(5) An antibody enzyme having both the high molecular recognition ability of an antibody and the substrate conversion ability of the enzyme can be applied to a new biosensor as a new biomaterial, and can be used for disease diagnosis, environmental measurement, and the like. It can also be applied to effective synthetic means in the food industry and chemical industry.
(6) Although RIA and ELISA are currently frequently used for immunological diagnosis, the development of new clinical diagnostic methods and diagnostic agents is expected with the use of antibody enzymes with improved enzyme activity.
(7) It is known that Bence Jones protein having a strong enzyme activity has a strong cytotoxic effect. Therefore, if BJP that suppresses cancer cell damage and / or growth is selected from among BJPs with improved enzyme activity, the BJP can be used as a therapeutic drug.
[0047]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. Note that the present invention is not limited to the description of the following embodiments, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
[0048]
In the following examples, Bence-Jones Protein (BJP) known as a monoclonal antibody composed of a light chain (that is, a monoclonal antibody light chain) will be described as an example of the antibody enzyme. That is, the method for improving the activity of BJP, which is an antibody enzyme, is a method of removing the constant region by enzymatically treating BJP (subtype HIR; HIR protein) shown in SEQ ID NO: 1.
[0049]
[About Bence Jones Protein]
It is well known that Bence Jones protein is a monoclonal antibody light chain, and there have been many reports recently that Bence Jones protein has various types of enzymatic activities. For this reason, for example, Paul (Paul, S., Li, L., Kalaga, R., Wilkins-Stevens, P, Stevens, FJ., & Solomom, A .: Natural catalysts: J. Biol. Chem., 270: 15257, 1995.) and Shinohara et al. Bence Jones protein from the urine of multiple myeloma patients varies considerably in their reactivity to substrates among patients. Amidase activity (Matsuura, K., and Sinohara, H.:.. Catalytic cleavage of vasopressin by human Bence Jones proteins at the arginyglycinamide bond Biol Chem, 377:. 587, 1996) and peptidase activity (Matuura, K., Ikoma, S., Sugiyama, M., Funauchi, M., & Sinohara, H. Amidolitic and peptolytic activities of immunoglobulin G presentation in trophy. yndrome and systemic lupus erythematosus. Immunology, 95:26, 1998) and DNA degrading activity (Matsuura, K., Ikoma, S., Yoshida, Yoshoda, K., and a. Biochem. Biophys, Res. Commun., 243: 719, 1998.) and the like are known. However, in many cases the enzyme activity is broad. The protein concentration present in healthy individuals is low (about nM), and it is said that the effect cannot be exhibited at this concentration. However, it is said that when a myeloma occurs and its concentration rises and reaches about mM, the enzyme activity becomes effective in total and becomes physiologically important. In addition, Bence Jones protein, which exhibits extremely high enzyme activity and characteristic biochemical properties, has been recognized.
[0050]
As described above, Bence Jones protein present in the urine of multiple myeloma patients is a monoclonal antibody light chain (L chain), and it has been reported that some Bence Jones proteins have enzymatic activity. . Furthermore, it has been suggested that the above enzyme activity is related to the pathology of myeloma.
[0051]
Therefore, based on such knowledge, Bence Jones protein (antibody light chain (L chain)) was fragmented, and the enzyme activity of the antibody enzyme activity was examined.
[0052]
[Example 1]
(A) Lysyl endopeptidase treatment (sample preparation)
HIR protein, a Bence Jones protein, was purified from urine of a myeloma patient by a conventional method using ammonium sulfate precipitation, a hydrophobic column, a gel filtration column or the like. next,
Lysyl endopeptidase (in Tris-HCl, pH 7.4) at a concentration of about 1/50 was added to the purified HIR protein, and the mixture was reacted at 37 ° C. for about 1 hour in Tris-HCl, pH 7.4 buffer.
[0053]
When the N-terminal amino acid sequence of the HIR protein was sequenced, the obtained N-terminal amino acid sequence of 49 residues showed high homology with Bence Jones protein (REI). Therefore, it was predicted on the basis of the amino acid sequence of the REI protein how the HIR protein would be fragmented if it was treated with lysyl endopeptidase. As a result, as shown in the schematic diagram of FIG. 1, no lysine was found in the amino acid sequence from the N-terminal to 49 residues of the HIR protein, so that the HIR variable region became a fragment of a relatively long region, In addition, since the constant region is predicted to contain a large amount of lysine similarly to the REI protein, the constant region was predicted to be a fine fragment.
[0054]
(B) Measurement of enzyme activity (Chromozym-TRY) cleavage activity
Next, the lysyl endopeptidase-treated HIR protein was applied to a gel filtration column (superose 12) and fractionated to obtain

protein fractions fractions

14, 15, and 16 (FIG. 5). Subsequently, the enzyme activities of

fractions

14, 15, 16 and HIR which were not treated with lysyl endopeptidase at the same concentration as fraction 14 were measured.
[0055]
The enzyme activity was measured by adding 0.1 mM (z-Val-Gly-Arg-pNA) to the sample, adding TrisHCl, pH 7.4, and 0.1% NaN. ₃ The reaction was performed in a buffer, and the absorbance at 410 nm after a certain time was measured. In addition, what added chromozyme try to Tris buffer without adding a sample was used as control. In addition, the samples were

fractions

14, 15, 16 and 6 μL of HIR protein, 100 μL of chromozyme try, 0.1% NaN ₃ The conditions were as follows.
[0056]
(C) Measurement results of enzyme activity
As a result of measuring the enzyme activity, as shown in FIG. 6, the activity of Fraction 14 was significantly increased as compared to before the treatment. As shown in FIG. 7, as a result of electrophoresis of the fraction 14 and the untreated HIR protein, a band was observed at 11 kDa for the fraction 14 and 22 kDa for the untreated HIR protein. Furthermore, as a result of sequencing the N-terminal amino acid sequence of the 11-kDa band, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of the HIR protein (first to tenth amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1: DIQMTQSPSS). Thus, it is presumed that the fragment having improved enzyme activity contained in fraction 14 is a variable region of the HIR protein.
[0057]
In addition, SEQ ID NO: 1 shows the entire amino acid sequence of the HIR protein. As shown in SEQ ID NO: 1, when HIR protein is treated with lysyl endopeptidase, it is considered that the protein is cleaved at lysine at position 103. Therefore, fraction 14 is presumed to be the 1st to 103rd amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. This is supported by the fact that the molecular weight of fraction 14 was 11 kDa.
[0058]
(D) Measurement of kinetic parameters
For 3.5 uM untreated HIR protein and fraction 14 showing high enzyme activity, a chromozyme tri at a concentration of 10, 25, 50, 75, 100, or 500 mM was added, and the enzyme activity was measured at 37 ° C. for 23 hours. Was measured. As a result, as shown in Table 1, as for the Km value, the untreated HIR protein showed a strong affinity about 7 times higher than that of the fraction 14, but the Kcat value showed the fraction 14 Was about 80 times higher than the untreated HIR protein, confirming that the substrate conversion ability was higher.
As a result, the Kcat (enzyme reaction rate) of the fragment obtained by lysyl endopeptidase treatment was increased about 83 times. FIG. 3 shows a Lineweaver-Burk plot of the fraction 14, and FIG. 4 shows a Lineweaver-Burk plot of the untreated HIR protein.
[0059]
[Table 1]

[0060]
[Example 2] Possibility of improving activity of BJP
For five types of Bence Jones proteins (HIR protein, HIZ protein, YAM protein, MOR protein, and MOK protein), the improvement of the enzyme activity was examined in the same manner as in Example 1. The samples were 13.4 μL of Bence Jones protein, 100 μL of Chromozym Try, 0.1% NaN ₃ The conditions were as follows.
[0061]
That is, each Bence Jones protein was purified, and the lysyl endopeptidase-treated and untreated enzyme activities were compared. As a result, as shown in FIGS. 8 to 12, remarkable enzyme activity was observed after treatment with lysyl endopeptidase in 3 out of 5 cases (HIR protein, YAM protein, MOR protein). In particular, YAM protein showed strong enzymatic activity when fragmented by enzymatic treatment, although almost no enzymatic activity was observed without endopeptidase treatment.
[0062]
[Example 3] Improvement of enzyme activity by another enzyme (thermolysin)
Improvement of the enzyme activity of Bence Jones protein (MOR protein) was examined in the same manner as in Example 1 except that thermolysin was used instead of lysyl endopeptidase as the peptidase.
[0063]
That is, 1/50 concentration of thermolysin was added to MOR protein, which is a Bence Jones protein, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours. Subsequently, the enzyme activity of the fraction obtained by fractionating the reaction solution by gel filtration was measured. As a result, as in the case of the lysyl endopeptidase treatment of Example 1, the fraction of Fraction 14 confirmed higher enzyme activity than that of the untreated fraction. Although not shown, as a result of electrophoresis of this fraction, the molecular weight was about 12 kDa, which was consistent with the N-terminal sequence of the light chain in the amino acid sequence. This confirmed that the enzyme activity was improved even when fragmented with thermolysin.
[0064]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is a very simple and convenient method to remove a constant region by enzymatic treatment or the like to obtain a variable region fragment, and it is a far more economically advantageous method than before. That is, the present invention can very easily improve the enzymatic activity of an antibody enzyme, and is extremely valuable for practical use. Further, according to the present invention, even if an antibody enzyme has weak enzyme activity, the enzyme activity of the antibody enzyme can be improved by fragmenting the antibody enzyme by enzyme treatment or using a variable region.
[0065]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the structures of Bence Jones protein, HIR protein, and REI protein, which are antibody light chains according to one embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a view showing the degradation position of lysyl endopeptidase.
FIG. 3 is a graph showing a Lineweaver-Burk plot of fraction 14 in Example 1.
FIG. 4 is a graph showing Lineweaver-Burk plot of untreated HIR protein in Example 1.
FIG. 5 is a view showing a protein fraction obtained by fractionating a HIR protein treated with lysyl endopeptidase by a gel filtration column in Example 1.
FIG. 6 is a diagram showing enzyme activity by chromozyme try cleavage activity in Example 1.
FIG. 7 shows the results of electrophoresis of fraction 14 and untreated HIR protein in Example 1.
FIG. 8 is a graph comparing the enzymatic activities of Bence Jones protein (HIZ protein) before the enzyme treatment and the HIZ fragment after the enzyme treatment in Example 2.
FIG. 9 is a graph comparing the enzyme activities of Bence Jones protein (YAM protein) before the enzyme treatment and the YAM fragment after the enzyme treatment in Example 2.
FIG. 10 is a graph comparing the enzyme activities of Bence Jones protein (HIR protein) before the enzyme treatment and the HIR fragment after the enzyme treatment in Example 2.
FIG. 11 is a graph comparing the enzyme activities of Bence Jones protein (MOR protein) before the enzyme treatment and the MOR fragment after the enzyme treatment in Example 2.
FIG. 12 is a graph comparing the enzyme activities of Bence Jones protein (MOK protein) before the enzyme treatment and the MOK fragment after the enzyme treatment in Example 2.

Claims

抗体酵素の少なくとも定常領域を除去することを特徴とする抗体酵素の活性向上法。A method for improving the activity of an antibody enzyme, comprising removing at least a constant region of the antibody enzyme.

プロテアーゼにより上記定常領域を除去することを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素の活性向上法。The method for improving the activity of an antibody enzyme according to claim 1, wherein the constant region is removed by a protease.

上記プロテアーゼは、エンドペプチダーゼであることを特徴とする請求項２に記載の抗体酵素の活性向上法。The method for improving the activity of an antibody enzyme according to claim 2, wherein the protease is endopeptidase.

上記プロテアーゼは、リシルエンドペプチダーゼまたはサーモライシンであることを特徴とする請求項２または３に記載の抗体酵素の活性向上法。4. The method according to claim 2, wherein the protease is lysyl endopeptidase or thermolysin.

上記抗体酵素は、ヒト型抗体酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体酵素の活性向上法。The method for improving the activity of an antibody enzyme according to any one of claims 1 to 4, wherein the antibody enzyme is a human antibody enzyme.

上記抗体酵素は、抗体軽鎖であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体酵素の活性向上法。The method for improving the activity of an antibody enzyme according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody enzyme is an antibody light chain.

上記抗体酵素は、ベンスジョーンズタンパクであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体酵素の活性向上法。The method for improving the activity of an antibody enzyme according to any one of claims 1 to 6, wherein the antibody enzyme is a Bence Jones protein.

定常領域が除去され、かつ、定常領域が除去される前よりも酵素活性が向上していることを特徴とする抗体酵素。An antibody enzyme, wherein the constant region is removed and the enzyme activity is higher than before the constant region is removed.