JP2004037110A - Gel for electrophoresis - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To separate proteins by molecular sizes by using an agarose gel. <P>SOLUTION: Through the use of agarose having high separating performance by a stacking gel or an additive, the proteins are separated by molecular sizes. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は，アガロースゲルを用いて血清や尿，その他の蛋白含有生体材料を電気泳動し，臨床検査などのライフサイエンス分野で利用するアガロースゲルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
最初，ポリアクリルアミドゲルを支持体とした電気泳動法でタンパク質を分離したのはＲａｙｍｏｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂによってである（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１３０；　７１１，　１９５９）。彼らは重合したアクリルアミドゲルを用い，血清タンパク質の分画を試み，この人工ポリマーが従来の支持体に比べ大きな利点をもつことを見出した。また，Ｓｈａｐｉｒｏらは，界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔｅ）の存在下においてタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う際に，タンパク質の分子量とゲル中における移動度によい相関があることを明らかにした（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２８；　８１５−２０，　１９６７）。その後，電気泳動に用いる緩衝液系が改良され，連続緩衝液系としてはＳｈａｐｉｒｏら，Ｗｅｒｂｅｒら（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２４４；　４４０６−１２，　１９６９），Ｆａｉｒｂａｎｋｓら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０；　２６０６−１７，　１９７１）の系が用いられることが多く，一方，不連続緩衝液系としては，Ｏｒｎｓｔｅｉｎ−Ｄａｖｉｓの系（Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　１２１；　４０４−２７，　１９６９），ならびにＬａｅｍｍｌｉの系（Ｎａｔｕｒｅ　２２７；　６８０−８５，　１９７０）が多用されている。連続系は電極液およびサンプル，ゲルの全てにおいて，同じｐＨの緩衝液を用いる方法である。この方法では，単一の組成から成るゲルの上に，サンプルを直接アプライし，通電する。このため，ゲル作成が簡便であるが分離能は不連続系に比べると低い。
【０００３】
一方，不連続系はそれぞれ異なるｐＨの緩衝液，サンプル，濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ），分離ゲル（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｇｅｌ）を用いる方法である。現在，タンパク質の分離にはＬａｅｍｍｌｉの方法が最も多用されている。
ポリアクリルアミドは未重合であると，一過性の神経毒となり危険である。また，ポリアクリルアミドゲルを自製するのは手間がかかるのが問題である。また，泳動時間が，１．５時間以上かかることも添える。
【０００４】
一方，アガロースゲルでは，縦型で，ＳＤＳを含む緩衝液を用いて蛋白を分子量で分離することが一般的に行われている。Ｗｕらは（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２４；　６７６−８，　１９９８），ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動を縦型で行っており，濃縮ゲルにはｐＨ６．８のトリス−塩酸緩衝液を，また，分離ゲルにはｐＨ８．６のトリス−ホウ酸緩衝液を使用している。更に，７％濃度のアガロースを分離ゲルとして使用しており，ゲル作製に使用する道具類，例えば，ゲル作製プレートやゲル注入シリンジ等の温度コントロールが必要となり，かつ，サンプルコームを挿入し取り出す際の操作性が煩雑である。また，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒらは（Ａｒｃｈ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ　１１９；　１４８−５２，　１９９５），ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動を水平型で行っており，濃縮ゲルにはｐＨ　６．７のトリス−塩酸緩衝液を，また，分離ゲルにはｐＨ　９のトリス−グリシン緩衝液を使用している。分離アガロース濃度は１．５％であり，更に，陰極端にサンプルアプライ用ゲルとして，同アガロースの１．２％濃度のものをｐＨ　８．４５のトリス−グリシン緩衝液で調整したゲルも使用しており，計３分画からなる水平型アガロースゲルを提案している。この方法では，重合して高分子となった血液中のフォンウィルブランド因子を分離し，ウエスタンブロッティングで検出している。彼らの方法では，低分子の蛋白は観察が困難である。
【０００５】
以上のようにアガロースを用いて蛋白を分子量で分けるという手法の報告はいくつかあるが，未だに一般的でないのは，ポリアクリルアミドゲルと比べてアガロースは毒性はないが，ゲル作製おいてはポリアクリルアミドゲル作製とほとんど変わらないくらいの煩雑さがあるということが挙げられる。また，低分子ＤＮＡ用のアガロースも市販されており，それを蛋白用アガロースゲルに応用しているが，このようなアガロースは，様々な加工を施されていると考えられ，そのためゲルの最現性が難しいのではないかと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，蛋白の分子量による分離性はポリアクリルアミドゲルより広範囲の分子量の分離や，特定範囲の分子量の分離が良く，また毒性もなくかつ，電気泳動により分離する際の操作性，取扱性，保存性の優れた新規なアガロースゲルに関する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出題の発明では，上記の問題点を持つポリアクリルアミドゲルに替わる，タンパク分離用ゲルとして，毒性がなくかつ分離能に優れ，また，Ｍｕｐｉｄゲルメーカー（アドバンス社）を用いることにより，簡易に短時間で作製可能なアガロースゲルを実現した。また，アガロースにデキストランなどの多糖類やポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーを添加混合し，物理的及び化学的にアガロースゲルの網目構造を変えることにより蛋白分子量分離性を著しく上げることができた。更に分離ゲル領域に対し濃度勾配をつけることにより，蛋白の広範囲の分子量分離性を得ることができた。このゲルをＭｕｐｉｄゲルメーカー（アドバンス社）を用いると，簡便，容易に均一な高分離性を持った水平型アガロースゲルを作製しかつ，プレキャストゲルとして完成することが出来た。
【０００８】
【作用】
濃縮ゲル，分離ゲルについて
濃縮ゲルはおおよそ１％，分離ゲルはおおよそ５％が好ましい。用いるアガロースは例えばアガロースＳ（和光純薬工業株式会社製）等の低硫酸含量（０．１％以下），低電気浸透度（０．１以下）のアガロースゲルとする。ゲル作製および泳動に用いる緩衝液は例えばｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液とする。分離ゲルを５％とすると約１４Ｋ〜２２０Ｋの範囲のタンパクが分離可能である。濃縮ゲルは１％程度だとタンパク量が約５μｇでも泳動緩衝液中へのロスの影響が小さい。また，濃縮ゲル領域での泳動の際は低電圧，分離ゲル領域では高電圧をかける。例えば、濃縮ゲル領域では５０Ｖ（約５Ｖ／ｃｍ）、分離ゲル領域では１００Ｖ（約１０Ｖ／ｃｍ）とする。
【０００９】
ゲルに添加する多糖類について
アガロースは海藻中に存在する多糖類で，テングサ科，オゴノリ科，イギス科，ノリ科，オバクサ科，サイシ科などの海藻中により精製したものである。本発明はこれらの海藻中多糖類に対し，海藻以外の多糖類として豆類に存在する多糖類，樹液に存在する多糖類，および果実や穀類に存在する多糖類，微生物の産生する多糖類を添加混合しアガロースゲルの網目構造を微細構造に変えたり，化学構造を変えることにより蛋白の分子量分離性を著しく向上することができた。これらの添加する化学構造としてあげると，ムコ多糖，例えば酸性ムコ多糖として，ウロン酸，硫酸，リン酸などの残基を含むもので，コンドロイチン，ヘパリン，コンドロイチン硫酸，キチンなどがある。また，糖脂質として例えば，セレブロシド硫酸，ガングリオシドなどがある。その他の多糖としてグルコースのみよりなる多糖，例えばアミロース，デキストランなどがある。又，ガラクトースのみより成るガラクタン，マンノースのみより成るマンナン，フルクトースのみより成るフルクタン，アラビノースのみより成るアラビナン，キシロースのみより成るキシランなどがある。これら多糖のアガロースゲルに混入する比率は，　例えば０．０１　から１重量％で、好ましくは０．０５　から０．５　重量％が示される。
尚、上述した範囲に限らず、当該多糖類は、アガロースゲルの種類に応じ，又，多糖の性質により適宜選ぶことができる。
【００１０】
ゲルに添加する水溶性ポリマーについて
上述した多糖体であるアガロースに水溶性ポリマーを適宜加えることによりアガロースゲルの網目構造を微細構造に変えたり，化学構造を変えることにより蛋白の分子量分離性を著しく向上することができた。これらの添加する化学構造としてあげると，天然ポリマーとしてでんぷん質，例えば，コーンスターチや小麦でんぷん，かんしょでんぷん，ばれいしょでんぷん，タピオカでんぷんがある。又，植物粘質物ではアラビアゴム，トロロアオイ，トラガントゴム，タンパク質ではゼラチン，カゼイン，にかわ，コラーゲンである。更に，半合成品として，セルロース系ではビスコース，メチルセルロース，エチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，カルボキシメチルセルロースがあり，でんぷん系として，可溶性でんぷん，カルボキシメチルデンプン，ジアルデヒドデンプンがある。さらに，合成品としては，ポリビニルアルコール，ポリアクリル酸ナトリウム，ポリエチレンオキシドがある。これら水溶性ポリマーのアガロースゲルに混入する比率は，　例えば０．０１から１重量％で、好ましくは０．０５　から０．５　重量％が示される。
尚、上述した範囲に限らず、当該水溶性ポリマーは、アガロースゲルの種類に応じ，又，多糖の性質により適宜選ぶことができる。
【００１１】
濃度勾配（グラジエント）アガロースゲルについて
温度コントロールできる容器に，１％および５％に調整したアガロース液をそれぞれ別々に入れ，それらアガロース液を適宜混ぜ合わせることにより，作製するゲルの陰極末端から陽極末端へと濃度が１〜５％の勾配をつける。アガロースに各種添加剤を加えることで，アガロースを高濃度に調製しても粘度が抑えられ，グラジエントゲルの作製が容易となった。濃度勾配をつけたゲルにより，広範囲にわたる分離能を実現できる。
【００１２】
【実施例】
組成の一例を以下に示す。（書ける範囲で調整して下さい）
組成例１
アガロースＳ　　　　　　　　　　　　４　　重量％
（λ−カラギーナン　　　　　　　　０．１　　重量％）
２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−　１９０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．０２％　ＳＤＳ，　０．０３％ＬＤＳ含む，ｐＨ　８．３）を使用。
【００１３】
組成例２
アガロースＳ　　　　　　　　　　　　　４　重量％
（ポリビニルアルコール１０００　　　　０．５　重量％）
２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−　１９０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．０２％　ＳＤＳ，　０．０３％ＬＤＳ含む，ｐＨ　８．３）を使用。
【００１４】
実験例１に基づき，濃縮ゲル領域の長さにおける泳動パターンの違いを図１に示す。
電圧は，濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖとした。濃縮ゲル領域の長さは，ゲル孔から５ｍｍ，１０ｍｍ，１５ｍｍとした。濃縮ゲル領域の長さの違いにおける泳動パターンの差はさほど見られないが，本ゲルサイズは５×６ｃｍと小さいので，タンパク分画範囲を考えると，濃縮ゲル領域の長さがゲル孔から５ｍｍで十分であると考えられた。
【００１５】
実験例２に基づき，かける電圧を１００Ｖで一定にした場合と，濃縮ゲルでは５０Ｖ，分離ゲルでは１００Ｖと変えた場合の泳動パターンの違いを示す。濃縮ゲルの長さはゲル孔から５ｍｍである。１００Ｖの定電圧の泳動パターンは電圧を変えたときのパターンと比べて，かなりブロードであった。これは，タンパクの泳動速度が速かったために，濃縮ゲルの長さが５ｍｍでは十分濃縮されず，移動度の差がついたまま泳動されたと考えられる。
【００１６】
実験例３に基づき，ゲル作製に用いる緩衝液の違いによる泳動パターンを図３に示す。蒸留水で作製したゲルでは，血清タンパクの分離が悪く，また，低分子量マーカーの１４．４Ｋ〜２０．１Ｋのバンドの分離が不良であった。また，トリス−グリシン緩衝液中の界面活性剤を除いた液で作製したゲルでの分離は，比較的良好であったが，低分子量マーカーの１４．４Ｋ〜２０．１Ｋのバンドの分離が悪かった。トリス−塩酸緩衝液で作製したゲルでは，シャープなバンドが得られたが，各レーンにおける泳動速度が違ったために，歪んだ泳動像が得られた。これは，このゲルにおける温度分布の不均一性が原因であると考えられる。トリス−グリシン緩衝液（０．０２５％ＳＤＳおよび０．０２５％ＬＤＳ含む）で作製したゲルにおけるタンパクの分離が最も優れていた。
【００１７】
実験例 １
本実験例では濃縮ゲル領域の長さの違いにおける泳動パターンの差を示す。
本ゲルはｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液（０．０２５％ＳＤＳおよび０．０２５％ＬＤＳ含む）を用い，濃縮ゲル領域にはアガロースＳ（和光純薬工業株式会社）を１％にしたものを，分離ゲル領域では５％にしたものを使用した。Ｍｕｐｉｄゲルメーカーの５×６ｃｍサイズのゲルトレーを用いた。濃縮ゲル領域の長さは図１の左から５ｍｍ（ａ），１０ｍｍ　（ｂ），１５ｍｍ　（ｃ）である。用いたサンプルは，　左から１０倍希釈した血清，１０倍希釈した血清　，低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），高分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），ワイドレンジマーカー（シグマ社）である。濃縮ゲル領域では５０Ｖの電圧を，分離ゲル領域では１００Ｖの電圧をかけた。泳動後，ゲルをトリクロロ酢酸−スルホサリチル酸溶液で３０分固定し，その後，４０℃で温風乾燥し，ＣＢＢ染色（クイックＣＢＢ；和光純薬工業株式会社）を４０℃，１時間行った。
【００１８】
実験例 ２
本実験例では，定電圧で泳動した場合と，濃縮ゲル領域と分離ゲル領域で電圧を変えた場合の比較を示す。濃縮ゲル領域の長さは，ゲル孔から５ｍｍである。
図２（ａ）は濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖと電圧を変えた場合，図２（ｂ）は，１００Ｖの定電圧の場合を示す。ゲルの組成およびサンプルおよび泳動後の操作は実験例１同様である。
【００１９】
実験例 ３
本実験例では，ゲル作製の際の用いる緩衝液の違いによる泳動パターンの差を示す。図３（ｄ）は、トリス−グリシン緩衝液（０．０２％ＳＤＳおよび０．０３％ＬＤＳ含む）ゲル，図３（ｃ）は、トリス−グリシン緩衝液（界面活性剤を含まない）ゲル，図３（ｂ）は、蒸留水で作製したゲル，図３（ａ）は、トリス−塩酸緩衝液で作製したゲルを示す。前３者で使用したサンプルは実験例１同様である。トリス−塩酸緩衝液で使用したサンプルは，左から，低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社），トランスフェリン（シグマ社），ＩｇＧ（シグマ社），ワイドレンジマーカー（シグマ社）である。濃縮ゲル領域の長さはゲル孔から５ｍｍで，濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖの電圧をかけた。泳動後の操作は実験例１〜２同様である。
【００２０】
実験例 ４
本実験例では，水溶性ポリマーを添加した際の泳動パターンを示す。アガロースＳ（和光純薬工業株式会社）を４％濃度になるようにｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液に溶解し，更にポリビニルアルコールを０．５％になるように添加し，この溶液を沸騰温浴中でゾル化させ，Ｍｕｐｉｄゲルメーカーの５×６ｃｍのゲルトレーに均一に流延させた。図４は左側から２倍希釈した高蛋白尿，１０倍希釈した血清の泳動パターンを示す。１００Ｖの電圧をかけた。泳動後の操作は実験例１〜３同様である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例について濃縮ゲルの長さの違いにおける泳動像を写真で示し説明した図
【図２】本発明の実施例についてゲルを使用する際にかける電圧を変えた際の泳動像を写真で示し説明した図
【図３】本発明の実施例についてゲルを作製する際に使用する緩衝液を変えた場合の泳動像を写真で示し説明した図
【図４】の実施例についてポリビニルアルコールを添加したアガロースゲルを使用した場合の泳動像を写真で示し説明した図[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to an agarose gel for electrophoresis of serum, urine, and other protein-containing biomaterials using the agarose gel, which is used in a life science field such as a clinical test.
[0002]
[Prior art]
Initially, proteins were separated by electrophoresis using polyacrylamide gel as a support by Raymond and Weintraub (Science 130; 711, 1959). They attempted to fractionate serum proteins using polymerized acrylamide gels and found that this artificial polymer had significant advantages over conventional supports. Shapiro et al. Also found that when performing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in the presence of the surfactant SDS (sodium dodecyl sulfate), a good correlation was found between the molecular weight of the proteins and the mobility in the gel. (Biochem Biophys Res Commun 28; 815-20, 1967). Thereafter, the buffer system used for electrophoresis was improved, and continuous buffer systems include Shapiro et al., Werber et al. (J Biol Chem 244; 4406-12, 1969) and Fairbanks et al. (Biochemistry 10; 2606-17, 1971). Systems are often used, while discontinuous buffer systems include the Ornstein-Davis system (Ann NY Acad Sci 121; 404-27, 1969) and the Laemmli system (Nature 227; 680-85, 1970) is frequently used. The continuous system is a method in which a buffer solution having the same pH is used for the electrode solution, the sample, and the gel. In this method, a sample is directly applied onto a gel having a single composition, and a current is applied. For this reason, gel preparation is easy, but the separation ability is lower than that of a discontinuous system.
[0003]
On the other hand, the discontinuous system is a method using a buffer solution, a sample, a stacking gel, and a separating gel having different pHs. At present, the method of Laemmli is most frequently used for separating proteins.
If polyacrylamide is not polymerized, it becomes a transient neurotoxin and is dangerous. Another problem is that it takes time and effort to produce polyacrylamide gel by itself. It also adds that the electrophoresis time takes 1.5 hours or more.
[0004]
On the other hand, in agarose gels, it is general practice to separate proteins by molecular weight using a vertical buffer solution containing SDS. Wu et al. (BioTechniques 24; 676-8, 1998) performed SDS-agarose gel electrophoresis in a vertical format, and used a concentrated gel with a Tris-HCl buffer (pH 6.8) and a separated gel with a pH 8 buffer. .6 Tris-borate buffer is used. Furthermore, since agarose with a concentration of 7% is used as a separation gel, tools used for gel preparation, for example, temperature control such as a gel preparation plate and a gel injection syringe are required, and when inserting and removing a sample comb. Operability is complicated. Also, Slougher et al. (Arch Pathol Lab Med 119; 148-52, 1995) performed SDS-agarose gel electrophoresis in a horizontal type, and concentrated Tris-HCl buffer at pH 6.7, The separation gel uses a pH 9 tris-glycine buffer. The concentration of the separated agarose was 1.5%, and a gel prepared by preparing a 1.2% concentration of the same agarose with a Tris-glycine buffer at pH 8.45 was used as a gel for sample application at the cathode end. And proposed a horizontal agarose gel consisting of three fractions. In this method, von Willebrand factor in blood polymerized into a polymer is separated and detected by Western blotting. In their method, small proteins are difficult to observe.
[0005]
As described above, there are some reports on the method of separating proteins by molecular weight using agarose, but it is still uncommon that agarose is less toxic than polyacrylamide gel, but polyacrylamide is not used in gel preparation. There is such a complexity that it is almost the same as gel preparation. Also, agarose for low molecular weight DNA is commercially available and is applied to agarose gel for protein. Such agarose is considered to have been subjected to various processes, and therefore, the gel It is thought that sex is difficult.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
According to the present invention, the separation of proteins by molecular weight is better than that of polyacrylamide gels in a wide range of molecular weights and in a specific range of molecular weights. It relates to a novel agarose gel having excellent storage stability.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In the invention of this question, a protein separation gel which is non-toxic and has excellent separation ability, replacing polyacrylamide gel having the above-mentioned problems, and can be easily and simply prepared by using a Mupid gel maker (Advanced). An agarose gel that can be prepared in a short time was realized. In addition, a polysaccharide such as dextran or a water-soluble polymer such as polyvinyl alcohol was added to and mixed with agarose, and the network structure of the agarose gel was changed physically and chemically, thereby significantly improving the protein molecular weight separability. Further, by giving a concentration gradient to the separation gel region, it was possible to obtain a wide range of molecular weight separation of proteins. When this gel was used with a Mupid gel maker (Advance), a horizontal agarose gel having high uniformity and uniformity was easily and easily produced, and completed as a precast gel.
[0008]
[Action]
About the concentrated gel and the separation gel, the concentration gel is preferably about 1%, and the separation gel is preferably about 5%. The agarose used is, for example, an agarose gel having a low sulfuric acid content (0.1% or less) and a low electroosmosis (0.1 or less) such as agarose S (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The buffer used for gel preparation and electrophoresis is, for example, a Tris-glycine buffer at pH 8.3. Assuming that the separation gel is 5%, proteins in the range of about 14K to 220K can be separated. When the concentration of the concentrated gel is about 1%, even if the amount of protein is about 5 μg, the influence of the loss on the electrophoresis buffer is small. In addition, a low voltage is applied during electrophoresis in the concentrated gel region, and a high voltage is applied in the separation gel region. For example, the voltage is set to 50 V (about 5 V / cm) in the concentrated gel area and to 100 V (about 10 V / cm) in the separation gel area.
[0009]
Agarose is a polysaccharide that is present in seaweed and is purified from seaweed, such as Atenaceae, Ogonoriaceae, Aegisaceae, Noriaceae, Obaxaceae, and Psychiaceae. According to the present invention, polysaccharides present in beans, polysaccharides present in sap, polysaccharides present in fruits and cereals, and polysaccharides produced by microorganisms are added to these polysaccharides in seaweed as polysaccharides other than seaweed. By mixing and changing the network structure of the agarose gel to a fine structure or changing the chemical structure, the molecular weight separability of the protein was significantly improved. As a chemical structure to be added, mucopolysaccharides, for example, acidic mucopolysaccharides containing residues such as uronic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, include chondroitin, heparin, chondroitin sulfate, and chitin. Examples of glycolipids include cerebroside sulfate and ganglioside. Other polysaccharides include polysaccharides composed of only glucose, such as amylose and dextran. Further, there are galactan consisting only of galactose, mannan consisting of only mannose, fructan consisting of only fructose, arabinan consisting of only arabinose, and xylan consisting of only xylose. The ratio of these polysaccharides to be mixed into the agarose gel is, for example, 0.01 to 1% by weight, preferably 0.05 to 0.5% by weight.
The polysaccharide is not limited to the above-mentioned range, and can be appropriately selected depending on the type of agarose gel and the properties of the polysaccharide.
[0010]
Water-soluble polymer to be added to the gel The above-mentioned polysaccharide, agarose, is appropriately added with the water-soluble polymer to change the network structure of the agarose gel to a fine structure, or to change the chemical structure to significantly improve the molecular weight separation of proteins. We were able to. As a chemical structure to be added, starch is a natural polymer such as corn starch, wheat starch, sweet potato starch, potato starch, and tapioca starch. Gum arabic, trolley mallow, tragacanth gum are used for plant mucilage, and gelatin, casein, glue and collagen are used for proteins. Further, as a semi-synthetic product, there are viscose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose and carboxymethylcellulose in the cellulosic system, and soluble starch, carboxymethyl starch and dialdehyde starch in the starch system. Furthermore, synthetic products include polyvinyl alcohol, sodium polyacrylate, and polyethylene oxide. The ratio of these water-soluble polymers to be mixed in the agarose gel is, for example, 0.01 to 1% by weight, preferably 0.05 to 0.5% by weight.
The water-soluble polymer is not limited to the above-mentioned range, and can be appropriately selected depending on the type of agarose gel and the properties of the polysaccharide.
[0011]
Concentration gradient (gradient) Agarose gel adjusted to 1% and 5% is separately placed in a vessel capable of controlling the temperature of the agarose gel, and the agarose solutions are mixed appropriately to change the gel from the cathode end to the anode end. And a gradient having a concentration of 1 to 5%. By adding various additives to agarose, the viscosity was suppressed even if the agarose was prepared at a high concentration, and the preparation of a gradient gel became easy. A wide range of resolution can be achieved by using a gradient gel.
[0012]
【Example】
An example of the composition is shown below. (Please adjust as much as possible)
Composition Example 1
Agarose S 4% by weight
(Λ-carrageenan 0.1% by weight)
Use 25 mM Tris-190 mM glycine buffer (containing 0.02% SDS, 0.03% LDS, pH 8.3).
[0013]
Composition Example 2
Agarose S 4% by weight
(Polyvinyl alcohol 1000 0.5% by weight)
Use 25 mM Tris-190 mM glycine buffer (containing 0.02% SDS, 0.03% LDS, pH 8.3).
[0014]
FIG. 1 shows the difference in the migration pattern in the length of the concentrated gel region based on Experimental Example 1.
The voltage was 50 V in the concentrated gel region and 100 V in the separation gel region. The length of the concentrated gel region was 5 mm, 10 mm, and 15 mm from the gel hole. Although there is not much difference in the migration pattern in the length of the concentrated gel region, the gel size is as small as 5 × 6 cm. Therefore, considering the protein fractionation range, the length of the concentrated gel region is 5 mm from the gel hole. Was considered sufficient.
[0015]
Based on Experimental Example 2, the difference in migration pattern between the case where the applied voltage is fixed at 100 V and the case where the concentration gel is changed to 50 V and the separation gel is changed to 100 V is shown. The length of the concentrated gel is 5 mm from the gel hole. The migration pattern at a constant voltage of 100 V was considerably broader than the pattern when the voltage was changed. This is considered to be because the concentration of the concentrated gel was not sufficiently concentrated when the length of the concentrated gel was 5 mm because the migration speed of the protein was high, and the gel was migrated with a difference in mobility.
[0016]
FIG. 3 shows an electrophoretic pattern based on the difference in the buffer used for gel preparation based on Experimental Example 3. In the gel prepared with distilled water, the separation of the serum protein was poor, and the separation of the low molecular weight marker band of 14.4K to 20.1K was poor. Separation was relatively good in the gel prepared from the Tris-glycine buffer solution excluding the surfactant, but the low molecular weight marker band of 14.4K to 20.1K was poorly separated. Was. In the gel prepared with the Tris-HCl buffer, a sharp band was obtained, but a distorted electrophoretic image was obtained due to the different electrophoretic speed in each lane. This is thought to be due to the non-uniformity of the temperature distribution in the gel. The separation of proteins in gels made with Tris-glycine buffer (containing 0.025% SDS and 0.025% LDS) was the best.
[0017]
Experimental example 1
In this experimental example, the difference in the migration pattern due to the difference in the length of the concentrated gel region is shown.
This gel used a Tris-glycine buffer solution (containing 0.025% SDS and 0.025% LDS) of pH 8.3, and agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was 1% in the concentrated gel region. In the separation gel region, 5% was used. A 5 × 6 cm size gel tray from a Mupid gel maker was used. The length of the concentrated gel region is 5 mm (a), 10 mm (b), and 15 mm (c) from the left in FIG. The samples used were 10-fold diluted serum from the left, 10-fold diluted serum, low molecular weight markers (Amersham Biosciences), low molecular weight markers (Amersham Biosciences), high molecular weight markers (Amersham Biosciences), Wide It is a range marker (Sigma). A voltage of 50 V was applied in the concentrated gel area, and a voltage of 100 V was applied in the separation gel area. After the electrophoresis, the gel was fixed with a trichloroacetic acid-sulfosalicylic acid solution for 30 minutes, then dried with warm air at 40 ° C., and stained with CBB (Quick CBB; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 40 ° C. for 1 hour.
[0018]
Experimental example 2
In this experimental example, a comparison is made between the case where the electrophoresis is performed at a constant voltage and the case where the voltage is changed between the concentrated gel region and the separation gel region. The length of the concentrated gel area is 5 mm from the gel hole.
FIG. 2A shows a case where the voltage is changed to 50 V in the concentrated gel region and 100 V in the separation gel region, and FIG. 2B shows a case where the voltage is constant at 100 V. The composition of the gel, the sample, and the operation after the electrophoresis were the same as in Experimental Example 1.
[0019]
Experimental example 3
In this experimental example, the difference in the electrophoretic pattern due to the difference in the buffer used in the gel preparation is shown. FIG. 3 (d) shows a Tris-glycine buffer (containing 0.02% SDS and 0.03% LDS) gel, and FIG. 3 (c) shows a Tris-glycine buffer (without surfactant) gel. FIG. 3 (b) shows a gel prepared with distilled water, and FIG. 3 (a) shows a gel prepared with Tris-HCl buffer. The samples used in the former three are the same as in Experimental Example 1. The samples used in the Tris-HCl buffer were, from the left, low molecular weight markers (Amersham Biosciences), BSA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), transferrin (Sigma), IgG (Sigma), wide-range markers ( Sigma). The length of the concentrated gel region was 5 mm from the gel hole, and a voltage of 50 V was applied to the concentrated gel region and a voltage of 100 V was applied to the separated gel region. The operation after the electrophoresis is the same as in Experimental Examples 1 and 2.
[0020]
Experimental example 4
In this experimental example, the migration pattern when a water-soluble polymer is added is shown. Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in Tris-glycine buffer at pH 8.3 to a concentration of 4%, and polyvinyl alcohol was further added to a concentration of 0.5%. The sol was formed into a sol in a boiling water bath and uniformly cast on a 5 × 6 cm gel tray of a Mupid gel maker. FIG. 4 shows, from the left side, the migration pattern of high proteinuria diluted 2-fold and serum diluted 10-fold. A voltage of 100 V was applied. The operation after the electrophoresis is the same as in Experimental Examples 1 to 3.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram illustrating an electrophoretic image of a difference in the length of a concentrated gel in a photograph for an example of the present invention, and FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the present invention when a voltage applied when using a gel is changed. FIG. 3 is a diagram illustrating an electrophoretic image by a photograph. FIG. 3 is a diagram illustrating an electrophoretic image by a photograph when a buffer used in preparing a gel is changed in the example of the present invention. Figure showing photographs of electrophoresis images when using agarose gel with polyvinyl alcohol added

Claims (3)

アガロースに他の多糖類及び／又は水溶性ポリマーを添加して得られる電気泳動用ゲルElectrophoresis gel obtained by adding another polysaccharide and / or water-soluble polymer to agarose 濃縮ゲル部と分離ゲル部の組み合わせよりなる請求項１に記載の電気泳動用ゲル。2. The gel for electrophoresis according to claim 1, comprising a combination of a concentration gel part and a separation gel part. ゲル組成に濃度勾配を施すことを特徴とする請求項１，２に記載の電気泳動用ゲル。The gel for electrophoresis according to claim 1, wherein a concentration gradient is applied to the gel composition.

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