JP2004035409A

JP2004035409A - New fusion protein for use as vector

Info

Publication number: JP2004035409A
Application number: JP2002140441A
Authority: JP
Inventors: L Fuu Paul; ポール　エル．フー
Original assignee: GENESHUTTLE BIOPHARM Inc
Current assignee: GENESHUTTLE BIOPHARM Inc
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2002-05-15
Publication date: 2004-02-05

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a delivery system which is a fusion protein for efficiently delivering a desired molecule into cells or nuclei. <P>SOLUTION: The fusion protein for delivering the desired molecule into the cells or nuclei comprises (i) a cold shock domain and the homologue or the functional equivalent derivatives thereof and (ii) a membrane translocation sequence or the functional equivalent peptides and/or derivatives thereof. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞に分子を送達するための新規ベクターと呼ばれる融合タンパク質に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物における細胞への遺伝子物質の伝達は、治療上および商業上の重要性が増加している。例えば、遺伝子治療手順は、後天性および遺伝性の遺伝子欠損、癌、ならびにウイルス感染を修正するために使用される。ヒトにおいて人工の遺伝子を発現する能力は、他の療法による治療の影響を受けにくい多くの疾患を含む、多くの主要なヒト疾患の予防および／または治癒を促進する。しかしながら、生物学的膜は、生体系における区分の中心の天然バリアである。それゆえに、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、一般に限定された治療価値であるとみなされる。多数の研究が、かかるポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドの送達の問題を克服するために行なわれている。
【０００３】
初期の研究のほとんどは、これらの細胞を形質転換するレトロウイルスベクターの使用に焦点を当てた。しかしながら、レトロウイルスに伴う多数の問題点が報告されている。例えば、一定の細胞型を感染させることは困難である。レトロウイルスは、典型的にはレセプターを介して細胞に入り、かかるレセプターが細胞に存在しないかまたは多数で存在しない場合、感染は可能でないかまたは効率が悪い。
【０００４】
多数の研究者が、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドを細胞に送達するためのリポソーム系を開発した。リポソームは膜で囲まれた小さな球体であり、その中に適切なＤＮＡが閉じ込められて形成されている。しかしながら、この系はまた、固有の問題点を有している。リポソームの大きさの制御は困難であり、このために個々の細胞に対する送達の均一性を制御するのは困難である。さらに、リポソームの中身の漏出を阻止するのは困難であり、他の技術と同様に、細胞型特異性を管理するのは困難である。
【０００５】
最近、タンパク質伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれるいくつかのタンパク質の小さな領域が、分子を細胞に輸送するために開発されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．１２，　Ｎｏ．６，　２００１）。かかるＰＴＤは、レセプター−またはトランスポーター−独立で、不飽和であり、かつエネルギーを消費しない方法で、自由に細胞膜を移動しうる。ＰＴＤは、１時間未満で細胞膜のバリアを横切りうる。哺乳動物細胞に影響を及ぼすＴＡＴ融合タンパク質の創造、単離および利用に対して基本的に必要なものは、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈａｐａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４，　２４７−２５６，２００１に記載されている。Ｓｔｅｖｅｎらにおける、αヘリックス含量を強化し、アルギニン残基の位置を最適化する合成のＰＴＤ系列を合成した。いくつかのＰＴＤペプチドは、ＴＡＴと比較して有意に増大したタンパク質伝達ポテンシャルを所有した（Ｓｔｅｖｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６１，　４７４−４７７，　２００１年　１月１５日）。さらに、ＵＳＰ６，０９０，６１９は、新規な非ウイルスベクターの調製について記載しており、それは、所望のＤＮＡに結合して、ヒトまたは動物細胞の疾患したミトコンドリアをトランスフェクトするのに有用な組み合わせを形成しうる。ＵＳＰ６，３３９，１３９は、リガンドオリゴペプチド／ポリカチオン性ポリペプチド／エンドソーム放出オリゴペプチド／外因性ＤＮＡからなる４−エレメント複合体遺伝子伝達系、またはリガンドオリゴペプチド／ポリカチオン性ポリペプチド／外因性ＤＮＡからなる３−エレメント複合体を含有してなる成長因子レセプターに結合する遺伝子伝達系を提供する。
【０００６】
当該分野で送達ベクター系は、下記の１つ以上の障害に直面した。第１に、免疫応答は、ウイルスベクターおよびカチオン性リポソームが生存動物に注射される場合、それらによって惹起される。第２に、血流のような細胞の細胞外流体は、遺伝子カーゴ（ｃａｒｇｏ　）を希釈するかまたは最終的に消化し、それは、送達される遺伝子の損失を生じる。第３に、細胞膜のリン脂質二重層は、ヌクレオチド分子の侵入に対する天然のバリアーを形成する。それゆえ、ＤＮＡ遺伝子のような大きな分子は、細胞膜を自由な（能動的なまたは受動的な）輸送方法で細胞膜を横切り、外来ＤＮＡ遺伝子カーゴを細胞に送達できない。第４に、ゲル様細胞質はプロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼ環境中に豊富にあり、そこでＤＮＡ遺伝子カーゴはエンドソーム捕捉の機構により分解される。第５に、細胞の細胞質におけるベクターＤＮＡカーゴは、第２のバリアー−−核膜に遭遇する。ＤＮＡ遺伝子カーゴは核膜を通過し、遺伝子が作用しうる核においてＤＮＡ遺伝子カーゴを放出しなければならない。第６に、たとえＤＮＡ遺伝子カーゴが細胞核に侵入する能力を有していたとしても、その送達効率は低い。
【０００７】
上記障害に基づき、所望の分子を細胞または核に効率よく送達するための送達系を開発する必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、所望の分子を細胞または核に効率よく送達するための送達系を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質に関する。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
（１）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質、
（２）　寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦＥ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（３）　寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質ＡおよびＢならびにＦＲＧ　Ｙ１からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（４）　寒冷ショックドメインの機能的に等価な誘導体が、ＤＮＡ縮合（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを寒冷ショックドメインに挿入することにより改変される前記（１）記載の融合タンパク質、
（５）　ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４および正に帯電した核局在化配列（ＮＬＳ＋）からなる群より選ばれる前記（４）記載の融合タンパク質、
（６）　膜トランスロケーション配列が、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）または膜融合配列である前記（１）記載の融合タンパク質、
（７）　ＰＴＤが、配列番号：１　〜８からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（８）　ＰＴＤが、配列番号：１　、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（９）　膜融合配列が、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１０）　膜融合配列が、配列番号：９、１０、１１、１２および２０からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１１）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）タンパク質伝達ドメインまたはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質、
（１２）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜融合配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質、
（１３）　さらに核局在化配列を含有してなる前記（１２）記載の融合タンパク質、
（１４）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１５）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１４）記載の融合タンパク質、
（１６）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１１）記載の融合タンパク質、
（１７）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１６）記載の融合タンパク質、
（１８）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１２）記載の融合タンパク質、
（１９）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１８）記載の融合タンパク質、
（２０）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１３）記載の融合タンパク質、
（２１）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（２０）記載の融合タンパク質、
（２２）　遺伝子送達のための細胞への核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（２３）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（２４）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（２５）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（２６）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（２７）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（２８）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
（２９）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
（３０）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（３１）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（３２）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（３３）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
現代のバイオテクノロジーは、単にＤＮＡ遺伝子送達基盤に基づいて構築されている；例えば、嚢包性線維症、インスリン不足性糖尿病および血友病ＡおよびＢ等を含む体細胞遺伝子治療、およびトランスジェニック動物。これらの研究分野および商業上重要な論点の全ては、ヒトの健康管理改良の目標を達成するように、より効率がよく、実用的でかつ安全な遺伝子送達ベクターの確保を必要とする。
【００１２】
本発明は、ベクターとして使用される新規な融合タンパク質を提供する。本発明のベクターは、非ウイルスベクターであり、所望の核酸に結合でき、それを動物、細胞株および胚などのいずれの有機体へも効率的に送達できる。それは最少量のコストで大量に作製され得、トランスジェニック動物および遺伝子治療などの種々の分野で広く適用されうる。
【００１３】
本発明の組換え融合タンパク質
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、標的ポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列と、標的タンパク質のいずれのドメインとも異なりかつ実質上ホモログでないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を規定する第２またはそれ以上のアミノ酸配列との融合に関する。
【００１４】
本発明は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供する。
【００１５】
寒冷ショックドメイン
本発明のいずれの適切な寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体も、本発明の融合タンパク質に使用されうる。寒冷ショックドメイン（ＣＳＤ）を選択する理由は、その利点により充分説明される：（１）ＣＳＤは、一般的に保存された核酸結合ドメインであり、それは原核生物および真核生物界に優勢に存在し、その結果免疫応答の危険性を最小化するかまたはかかる危険性を零に下げさえすることに寄与する。それゆえに、ＣＳＤは、遺伝子送達タンパク質ベクターの構築のための最も適切な候補である。ＣＳＤは、遺伝子送達ベクターを受ける宿主の大きな免疫応答を生じないので、（２）ＣＳＤの内因性核酸結合作用は、細胞の外側と内側において異なるＮａ＋／Ｋ＋イオン分布に適応しうる。それは、ＣＳＤが送達プロセスの間に遺伝子カーゴを失なうことなく、高い効率の遺伝子送達を達成することが非常に起こりうることを意味し、（３）アルファウイルス、フラビウイルスの外被糖タンパク質が、宿主細胞の膜の挿入にβバレル型構造を採用し、したがって、ＣＳＤとの融合誘導（ｆｕｓｏｑｕｅｎｉｃ）ペプチドイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合が、エンドソーム捕捉または直接の細胞膜融合から免れうることを最近Ｌｅｓｃａｒらは提案している（Ｌｅｓｃａｒ，Ｊ，　、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ａ，、Ｗｅｉｎ，Ｍ．Ｗ．　、Ｎａｖａｚａ，Ｊ．　、Ｆｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．　、Ｗｅｎｇｌｅｒ，Ｇ．、Ｗｅｎｇｌｅｒ，Ｇ．およびＲｅｙ，Ｆ．Ａ．（２００１）。セムリキ森林熱ウイルスの融合糖タンパク質殻：エンドソームのｐＨで融合誘導（ｆｕｓｏｇｕｅｎｉｃ）活性のためにプライムされる（ｐｒｉｍｅｄ）二十面体集合。Ｃｅｌｌ　１０５、１３７−１４８　およびＫｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．　ら、Ｃｅｌｌ　１０８、７１７−７２５　；２００２）。
【００１６】
ＣＳＤは、既に構造的によく特徴づけられており、それは逆平行、５鎖βバレル構造と呼ばれ、ＯＢ−フォールドとして示される。それゆえ、ＣＳＤに類似する構造を有するＯＢ−フォールドファミリーは、本発明の融合タンパク質において使用されうる。多くの研究結果は、ＣＳＤが、一本鎖核酸に結合しうることを示している。例えば、寒冷ショックドメインの外側の表面上のＲＮＰ−１およびＲＮＰ−２　ＲＮＡ結合モチーフならびにフェニルアラニン、リジン残基は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ結合を担っている（Ｂｙｃｒｏｆｔ　ら、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．８８、２３５−２４２　、１９９７年１月２４日）。Ｉｚｕｍｉ　らは、Ｙ−ボックス結合タンパク質−１が一本鎖核酸に結合することを示した（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、１２００−１２０７　）。好ましくは、寒冷ショックドメインは、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ　１）からなる群より選ばれる。より好ましくは、寒冷ショックドメインは、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質Ｂからなる群より選ばれる。
【００１７】
本発明のＣＳＤは、上記説明した種に限定されることなく、いずれの他の供給源から得られたホモログ配列をも含むことが理解されるだろう。上記開示により、当業者は、核酸に結合しうるいずれのＣＳＤホモログもまた本発明の融合タンパク質に使用しうることを理解しうる。
【００１８】
本発明のＣＳＤの機能的に等価な誘導体およびそのホモログはまた、本発明の融合タンパク質において使用されうる。ＣＳＤまたはそのホモログは、二本鎖核酸の結合を改変しうる。ＣＳＤの「機能的に等価な誘導体」およびそのホモログは、参照分子と同様に機能して所望の結果を達成する組換え的に作製された分子または化学的に合成されたポリペプチドを含む。したがって、ＣＳＤの機能的に等価な誘導体およびそのホモログは、内部でまたはそのアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる単一または複数のアミノ酸付加、置換および／または欠失を含む誘導体、ならびにＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ縮合ドメインの挿入などの任意の改変を含む誘導体を包含する。ＣＳＤは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合できるように修飾しうることも証明されている。例えば、Ｗａｎｇらは、真核生物の対応物のＹＢ−１タンパク質由来の正に帯電したアミノ酸と交換したドメインにより改変されたＣｓｐＡの寒冷ショックドメインが、二本鎖ＤＮＡ結合活性の獲得を生じうることを見出した（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　３８（３）：　５２６−５３４．　２０００　）。
【００１９】
本発明のＣＳＤは、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ結合活性を有する誘導体を得るために改変され得、それはＣＳＤにＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインのいずれかを挿入することによりなし遂げられうる。ＤＮＡ縮合ドメインは、より多くのＤＮＡおよび／または縮合ＤＮＡ分子と結合して、ＤＮＡアーゼ消化に耐性であるヌクレオソーム様構造を形成しえ、それにより、より少ない融合タンパク質が使用される。本発明により、二本鎖ＤＮＡに結合するように寒冷ショックドメイン／リボソームタンパク質Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメインを改変しうるいずれの適切なＤＮＡ縮合または結合ドメインも、本発明で使用しうる。例えば、適切なＤＮＡ縮合配列またはＤＮＡ結合配列は、ＳＶ４０のラージＴ抗原、Ｍｙｃ、ＹＢ１タンパク質および他の推定のＮＬＳなどの正に帯電したアミノ酸のアルギニン、リジンが豊富な、ヒストン、高速移動群（ＨＭＧ）タンパク質または核局在化配列（ＮＬＳ）に由来するＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４である。
【００２０】
膜トランスロケーション配列
本発明の融合タンパク質の膜トランスロケーション配列は、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）および膜融合配列ならびにその機能的に等価なペプチドまたは誘導体などのタンパク質伝達と呼ばれるプロセスで生物学的膜を効率よく横切る能力を持つものである。タンパク質伝達は、慣用のレポーター−、トランスポーター−、またはエンドソーム−媒介様式を介して生じないことが知られている。膜トランスロケーション配列は、迅速にかつ効率よく分子を細胞に形質導入する。膜トランスロケーション配列の例を、下の表に示す。
【００２１】

【００２２】
本発明の１つの好ましい態様は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーションドメインを含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供することである。ＰＴＤが細胞膜および核膜を横切って核酸を送達しうることは、当該分野で公知である。ＣＳＤおよびＰＴＤをあわせることにより、本発明の融合タンパク質は、所望の核酸を細胞質および細胞核に十分に送達しうる。いくらかのＰＴＤならびにそれらの特性、特徴および効力を研究により見出した（Ｆｉｓｃｈｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，２００１，Ｖｏｌ．１２，　Ｎｏ．６，　８２５−８４１；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｔｉｐｓ−Ｍａｒｃｈ　２０００，　Ｖｏｌ．２１；Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈｅｐａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４，　２４７−２５６，２００１；　およびＨｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６１，　４７４−４７７，２００１年１月１５日）。例えば、Ｔａｔは、ウイルス株に依存する８６〜１０２アミノ酸の長さの転写活性化因子であり、ＨＩＶの複製に関与する。最小のＴａｔ伝達ドメインは、塩基性残基（ｂａｓｉｃ　ｒｅｓｉｄｕｅ　）４９〜５７である。単純ヘルペスウイルス１由来の３８−ｋＤａの構造タンパク質であるＶＰ２２は、優れた細胞内輸送特性を有する。最小のＶＰ２２伝達ドメインは、塩基性残基２６７〜３００である。Ａｎｔｐは、キイロショウジョウバエのホメオティック転写因子であり、ヘリックス２と３の間のβターンを有する３つのαヘリックスから構成される。Ａｎｔｐの３番目のαヘリックス（残基４３〜５８）は、伝達に必要である。
【００２３】
好ましくは、ＰＴＤは配列番号：１〜８からなる群より選ばれる。より好ましくは、ＰＴＤは配列番号：１、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる。
【００２４】
本発明の別の態様は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供することである。膜融合配列が細胞膜に分子を移動しうることもまた、当該分野で公知である。ＣＳＤおよび膜融合配列をあわせることにより、本発明の融合タンパク質は、所望の核酸を細胞質に送達しうる。所望の核酸を細胞核に送達するために、融合タンパク質はさらに核局在化配列を含有する。例えば、１つの典型的な膜融合配列は、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭである。ＰｒｅＳ２は、そのトランスロケーションモチーフがＰｒｅＳ２−ＴＬＭと呼ばれる透過性ペプチドである。ＰｒｅＳ２−ＴＬＭは、ＰｒｅＳ２タンパク質の残基４１〜５２の両親媒性αヘリックスに対応する。このペプチドは、植物細胞を含む種々の細胞を貫通しうると思われる。好ましくは、膜融合配列は、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる。より好ましくは、膜融合配列は、９、１０、１１、１２および１３からなる群より選ばれる。
【００２５】
タンパク質精製タグ化配列
本発明の融合タンパク質は、タンパク質精製タグ化配列をさらに含みうる。本発明の精製タグ化配列は、融合タンパク質の任意エレメントに過ぎず、タンパク質の精製のためだけのものである。本発明の融合タンパク質は、化学的精製技術により精製されうる。例えば、Ｔａｔ−ＰＴＤ含有タンパク質は、ヘパリンカラムにより精製されうる（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ　ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｃｉｅｎｃｅ　（２００１）、１０：２１３８−２１３９。さらに、ＤＮＡカラムはまた、本発明の融合タンパク質の精製に使用されうる。
【００２６】
本発明のタンパク質精製タグ化配列は、遺伝子送達タンパク質ベクターとのＮ−またはＣ−末端融合でありうる。好ましくは、タンパク質精製タグ化配列は、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる。より好ましくは、タンパク質精製タグ化配列は、Ｈｉｓ６タグである。
【００２７】
本発明の融合タンパク質の調製
本発明の融合タンパク質は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、それにより産生されたタンパク質を単離することにより産生されうる。
【００２８】
本発明の融合タンパク質の発現に適したＤＮＡ構築物、すなわち組換えＤＮＡ分子が、本発明において使用され得る。本発明のタンパク質の発現のために、ＤＮＡ構築物は、本発明の融合タンパク質を発現する発現ベクターにクローン化される。発現ベクターは、もちろん、前記タンパク質の発現に選択された宿主細胞の性質に従って選択される。適切なかかる発現ベクターは市販されている。適切な発現ベクターが、Ｎｏｖａｇｅｎ．Ｃｏから提供されるｐＥＴ系の細菌プラスミドなどの原核生物発現ベクターである場合、発現は、好ましくは原核生物宿主、より好ましくは微生物宿主、特に大腸菌において行われる。
【００２９】
本発明の融合タンパク質の応用
本発明は、送達ベクターとして融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、インビトロおよび特にインビボでトランスフェクションの高い効率を有し、細胞、胚および生存動物に遺伝子を送達しうる。前記融合タンパク質により行われる遺伝子送達は、種特異的、さらに個体特異的な方法で行われうる。それゆえ、本発明の融合タンパク質は、遺伝子治療およびトランスジェニック動物の生産の分野において有効なツールである。
【００３０】
以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、限定のためではない。
【００３１】
【実施例】
実施例１
本発明の融合タンパク質のクローニングおよび構築
大腸菌株ＤＨ５αの単一コロニーをピックアップし、次いで１００μｌの滅菌水に加えた。得られた溶液を５分間沸騰させた。短い遠心分離の後、１０μｌのアリコートを取り出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＣｓｐＡ遺伝子増幅のＤＮＡテンプレートとして使用した。プライマー１およびプライマー２を、大腸菌由来のＣｓｐＡ遺伝子を増幅するために使用した。プライマー１および２の配列を以下に列挙する：
プライマー１；
５’−ｇｃｔａｇｃＡＴＧＴＣＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧＴＡＡＡ−３’
プライマー２；
５’−ｃｔｃｇａｇＡＴＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＴＴＡ−３’（小文字はＮｈｅＩ切断部位を示す。下線の小文字はＸｈｏＩ切断部位を示す）
【００３２】
２５サイクルのＰＣＲ（アニーリング温度を５５℃、１分に設定した）の後、ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動により解析し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ産物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｃｏ．　）により精製した。精製したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏ．　）にクローン化し、組換えプラスミドのスクリーニングを、製造業者の技術マニュアルにより行い、プラスミドｐＧＥＭ（Ｔ）／ＣｓｐＡを得、次いでＤＮＡ配列決定により確認した。それゆえ、本発明の寒冷ショックドメインにＤＮＡ縮合または結合ドメインを挿入することによりさらに改変されたかかる寒冷ショックタンパク質Ａ（ＣｓｐＡ；寒冷ショックドメイン）は、二本鎖核酸に結合させるために使用される。
【００３３】
融合タンパク質Ｉ：融合タンパク質の最もシンプルな形態は、ＴＡＴおよびＣＳＤに由来するＮＬＳ＋／ＰＴＤの組み合わせにより構成され、ｒＴＡＴと呼ばれる（図１参照）。ＤＮＡ結合／ＮＬＳ＋／ＰＴＤ、Ｔａｔペプチド配列のリバース形態（ｒＴａｔ）は、以下の合成オリゴヌクレオチドによりコードされていた：
オリゴ（１）：
５’−ｔａＴＧＧＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＧＣＧＣＣＧＴＴ−３’
オリゴ（２）：
５’−ｃｔａｇＡＡＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡ−３’
【００３４】
融合タンパク質ＩＩ：融合タンパク質の第２形態は、ＴＡＴに由来するＮＬＳ＋／ＰＴＤと（ＳＰＫＲ）４およびＣＳＤのＤＮＡ縮合配列との組合せから構成され、（ＳＰＫＲ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡと呼ばれる（図２参照）。ＤＮＡ縮合配列（ＳＰＲＫ）４は、以下の合成オリゴヌクレオチドによりコードされていた：
オリゴ（３）：
５’−ｔａＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴ
ＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴ　ＣＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＴＴ−３’
オリゴ（４）：
５’−ｃｔａｇＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＧ
ＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧ　ＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡ−３’
【００３５】
１００ｐｍｏｌのそれぞれオリゴ（１）およびオリゴ（２）またはオリゴ（３）およびオリゴ（４）を別々に混合し、９５℃で５分間加熱した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドを、緩徐に４℃に冷却し、２０℃で一晩保存した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端標識を、製造業者の薦めによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏ．から購入）およびＡＴＰを用いて行った。３７℃で１時間のインキュベーションの後、反応を熱不活化により停止し、次いでフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ｖ／ｖ／ｖ＝２５：２４：１；Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ　Ｃｏ．　）により抽出した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドを、グリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ　Ｃｏ．　）および冷無水エタノール（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｏ．　）により沈殿させた。
【００３６】
Ｔａｔペプチド配列のリバース形態（ｒＴａ）またはＤＮＡ縮合配列（ＳＰＫＲ）４をコードする合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ．Ｃｏｍ．　）により、各々、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ処理ｐＧＥＭ（Ｔ）／ＣｓｐＡにクローン化し、大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、各々、ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡおよびｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡ　ＤＮＡプラスミドを得た。膜トランスロケーション活性を有する、改変（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡをさらに構築するために、我々は、ＣｓｐＡの部分コード配列に相補的であるプライマー３および４を用い、ＴＡＴ由来のＰＴＤコード配列をプライマー４に組み入れてＤＮＡプラスミドｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡをＰＣＲテンプレートとして用いた。２５サイクルのＰＣＲの後、ＰＴＤ配列を、Ｔａｑ酵素（Ｔａｋａｒａ．Ｃｏ．から購入）を用いてプライマー３および４によりｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡに導入した。ＰＴＤプライマー３および４の配列を以下に列挙する：
プライマー３：
５’−ＮＮＮＮＮＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣ−３’
プライマー４：
５’−ＮＮＮＮＮＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＴ
ＣＡＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡ．　（下線の文字はＢａｍＨＩ切断部位を示す）
【００３７】
アニーリング温度は５４℃で１分に設定する。２５サイクルのＰＣＲの後、得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キットにより精製し、ＤｐｎＩおよびＢａｍＨＩ消化に供した。制限酵素消化の後、ＤＮＡを１％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）において分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ．Ｃｏ　）によりＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡを自己連結させ、次いで大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、ｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドを得た。
【００３８】
発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドによりコードされる融合タンパク質配列を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化に供し、次いで１％アガロースゲルにおいて分離し、ＤＮＡインサートとして使用したｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ融合タンパク質のコード配列をそれぞれ含むＤＮＡ断片を切り出した。発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ　Ｃｏ．　）を同じ制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理し、次いでＤＮＡインサートｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ融合タンパク質コード配列にそれぞれ連結し、次いで大腸菌株のＤＨ５αを形質転換し、ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡを得、次いでｐＥＴ発現ベクターをＤＮＡ配列決定に供する。配列決定により、本発明の融合タンパク質の発現のための、それぞれ、ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドが大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍから購入）に形質転換されたことが確認された。
【００３９】
本発明の融合タンパク質の発現および精製
ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドを保有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞をＬＢ（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）プレート上で増殖させた。単一コロニーをピックアップし、２ｍｌのＬＢブロス（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）に播種し、次いで３７℃で４時間インキュベートした。さらなるインキュベーションのために光学密度ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、細菌培養物の１ｍＬアリコートを４００ｍＬのテリフィック（ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）に播種した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、次いで３７℃で５〜７時間さらにインキュベートした。ＩＰＴＧ誘導性大腸菌細胞を、遠心分離により収集した。得られたペレットを、さらなるタンパク質精製のために冷凍庫中−７０℃で保存した。
【００４０】
本発明の融合タンパク質の精製
本発明のタンパク質の精製を、ｐＥＴシステムの製造業者の指示マニュアルに従って行った。ＩＰＴＧ誘導性発現大腸菌宿主ペレットを、８Ｍ尿素を含有する１×Ｈｉｓ結合バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）に再懸濁し、次いで超音波処理により細胞を破壊した。超遠心の後、超音波処理した上清画分をニッケルイオンアフィニティカラムに供し、次いでカラムを、８Ｍ尿素を含有する１０容積の１×結合緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）および８Ｍ尿素を含有する１×洗浄緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。Ｈｉｓ６タグ融合タンパク質を、８Ｍ尿素を含有する１×溶出緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．９）によりカラムから溶出させた。Ｈｉｓ６タグタンパク質を、４Ｍ尿素溶液、次いで滅菌Ｈ_２Ｏに対して透析した。透析したタンパク質を凍結乾燥し、タンパク質粉体を１×ＰＢＳ溶液に溶解させ、タンパク質濃度をＢＣＡ（ＰＩＥＲＣＥ．Ｃｏ　）の方法により決定した。精製融合タンパク質を５％〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて解析し、クーマシーブルーでゲルを染色した（図３参照）。得られたタンパク質溶液は、核酸結合アッセイ（ゲル遅延またはＥｔＢｒ排除アッセイ）の用意ができており、その遺伝子送達活性について試験した。
【００４１】
実施例２
本発明の融合タンパク質のＤＮＡ結合能力
手短に説明すると、０．５μｇレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ．　から購入した）を、１×ＰＢＳ緩衝液の存在下で種々の量の融合タンパク質ベクターｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡとともにインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を１％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）において分離し、ＥｔＢｒで染色し、写真を撮った。大きなＤＮＡ−タンパク質複合体が形成されると、レポータープラスミドＤＮＡは、融合タンパク質結合によりゲルのトップウェルに遅滞し、それゆえ、ゲル内に泳動できず、ＥｔＢｒでウェルを染色できなかった（図４参照）。
【００４２】
実施例３
融合タンパク質ベクターおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドによるＨｅｌａ細胞培養物のインビトロでのトランスフェクション
血清被覆カバーガラス上にプレーティングしたサブコンフルエント、単層のＨｅｌａ細胞のオーバーナイト増殖物（約１０^６細胞）を、２回の無血清ＤＭＥＭ培地および５回の１×ＰＢＳ緩衝液で穏やかに洗浄し、次いで５μｇのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１のみでまたは融合タンパク質（ｒＴａｔまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ）−レポーターＤＮＡプラスミド複合体（５μｇ）のいずれかでそれぞれ細胞を処理した。３７℃で１時間のＨｅＬａ細胞のインキュベーションに、０．４５ｍｌの新鮮な血清＋ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で６時間インキュベートし、および１ｍｌの新鮮な血清＋ＤＭＥＭ培地を加え、さらにインキュベートした。ＥＧＦＰタンパク質発現でトランスフェクしたＨｅｌａ細胞の観察を、インキュベーションの２４時間後に蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．Ｃｏ．　）により直接行った。図５に示されるように、融合タンパク質ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞は、細胞において有意なグリーン蛍光シグナルを示す。結果は、本発明の融合タンパク質が細胞にＤＮＡを効率的に送達しうることを示す。
【００４３】
実施例４
本発明の融合タンパク質およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドによりインビトロでトランスフェクトされた帯除去マウス胚
トランスフェクションに用いたマウス胚を、本質的にはＧｏｒｄｏｎら（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．　およびＲｕｄｄｌｅ，Ｆ．Ｈ．　（１９８３）．　、マウス胚への遺伝子移入、前核注射によるトランスジェニックマウスの産生、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，　Ｐａｒｔ　Ｃ．，　１０１，　４１１−４３３　）およびＨｏｇａｎ，　Ｂ．　、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，　Ｆ．およびＬａｃｙ，　Ｅ．　（１９８６）　マウス胚の操作：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）に記載のように調製した。手短には、ＩＣＲ非近交系株をＮＴＵ研究動物センター（Ｔａｉｐｅｉ）から購入し、次いでＳｉｇｍａ　から購入した２．５ＩＵの妊馬血清ゴナドトロピン（Ｇ４５２７　）の注射、続いて４８時間後の５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．，Ｃ８５５４　）の注射により過***させ、ＩＣＲ雄とともに個々に一晩ケージに入れた。マウス胚の１つの細胞を、ｈＣＧ注射後２４時間に卵管フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）から収集した。マウス胚を、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．　）中の０．５％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ、Ｐ５１４７）のアリコートとともに３７℃で５分間処理し、透明帯を取り出し、Ｍ２培地および１×ＰＢＳ緩衝液で穏やかに数回洗浄し、次いで０．７５μｇの対照プラスミドｐＣＤＮＡ３．１またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドを使用した以外はＨｅｌａ細胞のトランスフェクションと同じ条件下で、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍから購入した対照プラスミドｐｃＤＮＡ３．１または融合タンパク質ベクター（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡおよびレポーターｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。３７℃で１５分のインキュベーションの後、１ｍｌのＭ１６培養培地（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．　，Ｍ７２９２）を添加し、次いで胚を鉱油（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏｍ．，Ｍ８４１０）とともにマウントした。インキュベーションの２４時間おきに、胚を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　Ｃｏ．　）によりＥＧＦＰタンパク質発現について調査した。図６に示すように、融合タンパク質（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミド（左）は、蛍光顕微鏡写真において有意なグリーン蛍光シグナルを示し、これは融合タンパク質がＤＮＡ　ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドを胚に首尾良く送達しうることを示す。
【００４４】
実施例５
本発明の融合タンパク質を用いたレポーターＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１のマウスへの送達
２０μｇのＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１を、１×ＰＢＳ緩衝液中の本発明の融合タンパク質ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡとともに混合し、ＲＴ℃で１５分間インキュベートし、それぞれマウスに腹腔内に注射した。４８時間後、マウスを屠殺し、その肝臓を凍結組織切片に供し、次いで共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．Ｃｏ．　）によりＥＧＦＰタンパク質発現を観察した。図７は、本発明の融合タンパク質ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡがインビボで肝細胞にＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１を首尾良く送達し得たことを示す。
【００４５】
実施例６
本発明の融合タンパク質のＲＮＡ結合能力
ヒト５ｓ　ｒＤＮＡのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ（Ｔ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｃｏ．　Ｅｌｏｎｇ　Ｌｉｎ　博士から寄贈）にクローン化した。ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｈ５Ｓ　ｒＤＮＡプラスミドをＳｐｅＩで消化し、次いで１％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）において分離した。線状ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｈ５Ｓ　ｒＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ．Ｃｏ．）により精製した。ヒト５ＳｒＲＮＡをＲｉｂｏＭＡＸ／Ｔ７大規模ＲＮＡ産生システム（Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｃｏ．　）を用いることにより合成し、ＵＴＰ〔α−３２Ｐ〕（８００ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍｌ；ＮＥＮ．Ｃｏ．　）を用いてヒト５Ｓ　ｒＲＮＡの均一な標識を、製造業者の指示マニュアルによって行った。インビトロ合成したヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを１２％ＵＲＥＡ−ＰＡＧＥにおいて分離し、次いでＵＶ陰影法によりゲルから精製した。ヒト５Ｓ　ｒＲＮＡの酢酸アンモニウムおよびエタノール沈殿後、５分間の沸騰水浴において加熱することにより変性し、次いで室温に緩徐に冷却し、−２０℃で一晩保存した。１２５ｎｇのヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを種々の量の本発明のタンパク質ｒＴＡＴタンパク質とともに混合し、ＲＴ℃で３０分間インキュベートし、次いでＲＮａｓｅＴ１（１０Ｕ；Ａｍｂｉｏｎ．Ｃｏ．）ありまたはなしで処理し３７℃にて１０分間さらにインキュベートした。結合複合体を８％未変性ＰＡＧＥ（０．５ＸＴＢＥ）で分離し、次いで１０％のさらなる酢酸でゲルを固定化し、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。図８に示すように、ＲＮａｓｅ−耐性結合複合体を記号「＊」　で示す。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、遺伝子治療およびトランスジェニック動物の産生の分野で有効なツールとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の融合タンパク質、ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡをコードする遺伝子の構築物が単純化されたフローチャートにより表されることを示す。ＣｓｐＡ遺伝子は、プライマー１および２を用いてＰＣＲにより大腸菌から増幅し、ＴＡＴ−ＰＴＤペプチド配列のリバース形態をコードするアニールした合成オリゴ１および２の挿入による二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性を得、ＣｓｐＡ遺伝子に導入し、次いで得られた本発明の改変遺伝子（ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ）をｐＥＴ２８ａ発現ベクターにサブクローン化した。
【図２】図２は、本発明の融合タンパク質、（ＳＰＫＲ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡをコードする遺伝子の構築が、単純化されたフローチャートにより表されることを示す。ＣｓｐＡ遺伝子は、プライマー１および２を用いてＰＣＲにより大腸菌から増幅し、ＤＮＡ縮合配列（ＳＰＫＲ）４およびＰＴＤ配列をコードするアニールした合成オリゴ３および４の挿入により二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性を得、プライマー３および４を用いたＰＣＲ増幅により改変ＣｓｐＡ遺伝子にさらに導入し、次いで得られた本発明の改変遺伝子をｐＥＴ２８ａ発現ベクターにサブクローン化した。
【図３】図３は、融合タンパク質の誘導および精製が製造業者の指示に従って行なわれ、精製タンパク質が５％〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析され、クーマシーブルーを用いてゲルが染色されたことを示す；レーン１はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の全細胞溶解物である；レーン２はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理した上清１である；レーン３はｐＲＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理した上清２である；レーン４はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理したペレットである；レーン５はニッケル−ビーズアフィニティカラムクロマトグラフィ後のフロースルー画分である；レーン６は１×結合緩衝溶中に２０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄画分である；レーン７は、溶出緩衝液中に６０ｍＭイミダゾールを含有する溶出物１画分である；およびレーン８は、溶出緩衝液中に６０ｍＭイミダゾールを含有する溶出物２画分である；レーン９はＡｍｅｒｓｈａｎ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏｍｐａｎｙから購入したタンパク質分子量マーカーである；レーン１０は精製ｉＴａｔタンパク質（０．２５μｇ）である；ならびにレーン１１は精製ｒＴａｔタンパク質（１．０μｇ）である。
【図４】図４は、ゲル遅滞アッセイを示す。０．５μｇのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ．　から購入）を、１×ＰＢＳ緩衝液の存在下で、種々の量のタンパク質ベクター、「ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ」または「ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ」とともにインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を、１％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）において分離し、ＥｔＢｒでゲルを染色した。
【図５】図５は、（１）ＤＮＡプラスミドなし（左パネル）、（２）ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体（中央）、および（３）（ＳＰＲＫ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１でトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞からのグリーン蛍光タンパク質発現を示す。細胞とＤＮＡ−タンパク質複合体との１時間のインキュベーションの後、０．４５ｍＬの血清＋ＤＭＥＭブロスを添加し、３７℃で６時間インキュベートし、次いで１ｍＬの血清＋ＤＭＥＭブロスを添加し、細胞をさらに３７℃で２４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡によりＥＧＦＰ遺伝子発現を調査した。
【図６】図６は、マウス胚にトランスフェクトした本発明の融合タンパク質ベクターｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体に由来するグリーン蛍光タンパク質発現を示す。帯除去マウス胚を、０．７５μｇのＤＮＡプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（左パネル）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポーターＤＮＡプラスミド（右パネル）、それぞれとともに本発明のタンパク質ベクター、ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡでトランスフェクトした。インキュベーションの間隔の時間の後、マウス胚を、蛍光顕微鏡によりグリーン蛍光タンパク質発現を調査した。
【図７】図７は、ｉ．ｐ．注射により本発明のタンパク質ベクターの複合体ｒＴＡＴ−またはｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１　ＤＮＡ複合体で処理したマウスに由来する、肝臓の凍結組織切片を示す。４８時間後、マウスを屠殺し、次いで共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．ｃｏｍ．）により肝臓におけるグリーン蛍光タンパク質発現を観察した。
【図８】図８は、本発明のタンパク質、ｒＴＡＴおよびヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを用いて行った電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to fusion proteins called novel vectors for delivering molecules to cells.
[0002]
[Prior art]
The transfer of genetic material to cells in mammals is of increasing therapeutic and commercial importance. For example, gene therapy procedures are used to correct acquired and inherited genetic defects, cancer, and viral infections. The ability to express artificial genes in humans promotes the prevention and / or cure of many major human diseases, including many diseases that are not susceptible to treatment with other therapies. However, biological membranes are the natural barrier at the center of the compartment in biological systems. Therefore, polypeptides and oligonucleotides are generally considered to have limited therapeutic value. Numerous studies have been conducted to overcome the problems of delivering such polypeptides and oligonucleotides.
[0003]
Most of the early work focused on the use of retroviral vectors to transform these cells. However, a number of problems with retroviruses have been reported. For example, it is difficult to infect certain cell types. Retroviruses typically enter cells via receptors, and if such receptors are absent or abundant in cells, infection is not possible or inefficient.
[0004]
Many investigators have developed liposome systems for delivering polypeptides and oligonucleotides to cells. Liposomes are small spheres surrounded by a membrane, in which appropriate DNA is trapped and formed. However, this system also has its own problems. Controlling the size of the liposomes is difficult, which makes it difficult to control the uniformity of delivery to individual cells. In addition, it is difficult to prevent leakage of the contents of the liposome and, like other techniques, to manage cell type specificity.
[0005]
Recently, small regions of some proteins called protein transduction domains (PTDs) have been developed to transport molecules into cells (Fischer et al., Bioconjugates Chem., Vol. 12, Vol. 12, No. 6,). 2001). Such PTDs are free to translocate cell membranes in a receptor- or transporter-independent, unsaturated and energy-consuming manner. PTDs can cross cell membrane barriers in less than one hour. Basic requirements for the creation, isolation and utilization of TAT fusion proteins affecting mammalian cells are described in Becker-Hapak et al., Methods # 24, # 247-256, 2001. A synthetic PTD series was synthesized in Steven et al. That enhanced the α-helix content and optimized the position of arginine residues. Some PTD peptides possessed significantly increased protein transduction potential compared to TAT (Steven et al., Cancer Research 61, 474-477, January 15, 2001). In addition, US Pat. No. 6,090,619 describes the preparation of a novel non-viral vector, which binds to the desired DNA and provides a useful combination for transfecting diseased mitochondria in human or animal cells. Can be formed. US Pat. No. 6,339,139 describes a 4-element complex gene transfer system consisting of ligand oligopeptide / polycationic polypeptide / endosome-releasing oligopeptide / exogenous DNA, or ligand oligopeptide / polycationic polypeptide / exogenous DNA A gene transfer system that binds to a growth factor receptor comprising a three-element complex comprising:
[0006]
Delivery vector systems in the art have faced one or more of the following obstacles. First, an immune response is elicited by viral vectors and cationic liposomes when they are injected into living animals. Second, the extracellular fluid of the cells, such as the bloodstream, dilutes or eventually digests the gene cargo, which results in a loss of the delivered gene. Third, the phospholipid bilayer of the cell membrane forms a natural barrier to nucleotide molecule entry. Therefore, large molecules such as DNA genes cannot cross the cell membrane in a free (active or passive) manner of transport across the cell membrane and deliver foreign DNA gene cargo to the cell. Fourth, the gel-like cytoplasm is abundant in a protease and / or nuclease environment where the DNA gene cargo is degraded by mechanisms of endosomal capture. Fifth, the vector DNA cargo in the cytoplasm of the cell encounters a second barrier--the nuclear envelope. The DNA gene cargo must pass through the nuclear envelope and release the DNA gene cargo in the nucleus where the gene can act. Sixth, even if the DNA gene cargo has the ability to enter the cell nucleus, its delivery efficiency is low.
[0007]
Based on the above obstacles, there is a need to develop a delivery system to efficiently deliver the desired molecule to the cell or nucleus.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a delivery system for efficiently delivering a desired molecule to a cell or a nucleus.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to the production of cells or nuclei comprising i) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof and ii) a membrane translocation sequence or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof. It relates to a fusion protein for delivery of a desired molecule.
[0010]
That is, the gist of the present invention is:
(1) Δi) a cold shock domain and homologs or functionally equivalent derivatives thereof and ii) a desired cell or nucleus comprising a membrane translocation sequence or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof. Fusion proteins for the delivery of molecules of the
(2) The cold shock domain is CspA, CspB, CspC, CspD, rpl {S1} RNA binding domain, eukaryotic Y-box protein, DNA binding protein B (DBPB), DBPA, EFE-1, mRNP3, mRNP4, FRG @ Y1 And the fusion protein according to the above (1), which is selected from the group consisting of nuclease-sensitive element binding protein 1 (NSEP1),
(3) The fusion protein according to (1) above, wherein the cold shock domain is selected from the group consisting of CspA, rpl {S1} RNA binding domain, human YB-1 and DNA binding proteins A and B, and FRG @ Y1.
(4) The fusion protein according to (1), wherein the functionally equivalent derivative of the cold shock domain is modified by inserting a DNA condensation domain or a DNA binding domain into the cold shock domain.
(5) The fusion protein according to the above (4), wherein the DNA condensation domain or the DNA binding domain is selected from the group consisting of a DNA condensation domain (SPKR) 3-4 and a positively charged nuclear localization sequence (NLS +).
(6) The fusion protein according to the above (1), wherein the membrane translocation sequence is a protein transduction domain (PTD) or a membrane fusion sequence.
(7) The fusion protein according to the above (1), wherein {PTD is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 8;
(8) The fusion protein according to (1) above, wherein {PTD is SEQ ID NO: 1}, selected from the group consisting of 2, 4, 5, 6, and 7;
(9) The fusion protein according to (1), wherein the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 21;
(10) The fusion protein according to the above (1), wherein the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12 and 20;
(11) Δi) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof, and ii) a fusion protein comprising a protein transduction domain or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof,
(12) Δi) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof, and ii) a fusion protein comprising a membrane fusion sequence or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof;
(13) The fusion protein according to the above (12), further comprising a nuclear localization sequence.
(14) The fusion protein according to (1), further comprising a protein purification tagging sequence.
(15) The fusion protein according to (14), wherein the tag sequence for protein purification is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tag;
(16) The fusion protein according to the above (11), further comprising a protein purification tagging sequence.
(17) The fusion protein according to (16), wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tags;
(18) The fusion protein according to (12), further comprising a protein purification tagging sequence.
(19) The fusion protein according to (18), wherein the tag sequence for protein purification is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tag;
(20) The fusion protein according to the above (13), further comprising a tag sequence for protein purification,
(21) The fusion protein according to the above (20), wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tag;
(22) The fusion protein according to (1) above, for use in delivering nucleic acid (DNA and / or RNA) to cells for gene delivery.
(23) The fusion protein according to (1) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.
(24) The fusion protein of (11) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.
(25) The fusion protein of (11) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.
(26) The fusion protein according to (12) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.
(27) The fusion protein according to (12) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.
(28) The fusion protein according to (13) above, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.
(29) The fusion protein of (13) above for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.
(30) A fusion protein according to (1) above for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.
(31) The fusion protein of (11) above for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.
(32) A fusion protein according to (12) above for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.
(33) The fusion protein of (13) above for use in delivering nucleic acid to embryos and live animals for the production of transgenic animals.
It is.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Modern biotechnology is built solely on the basis of DNA gene delivery; somatic gene therapy, including, for example, cystic fibrosis, insulin deficient diabetes and hemophilia A and B, and transgenic animals . All of these research areas and commercially important issues require the provision of more efficient, practical and safe gene delivery vectors to achieve the goals of improved human health care.
[0012]
The present invention provides a novel fusion protein used as a vector. The vectors of the present invention are non-viral vectors that can bind to a desired nucleic acid and efficiently deliver it to any organism, such as animals, cell lines and embryos. It can be made in large quantities with minimal cost and can be widely applied in various fields such as transgenic animals and gene therapy.
[0013]
Recombinant fusion protein of the present invention
As used herein, a "fusion protein" refers to a first amino acid sequence that encodes a target polypeptide and a first amino acid sequence that differs from any domain of the target protein and that is substantially non-homologous (eg, a polypeptide portion). It relates to fusion with two or more amino acid sequences.
[0014]
The present invention relates to the production of cells or nuclei comprising i) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof and ii) a membrane translocation sequence or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof. A fusion protein is provided for delivery of a desired molecule.
[0015]
Cold shock domain
Any suitable cold shock domain of the present invention and homologs or functionally equivalent derivatives thereof can be used for the fusion proteins of the present invention. The reasons for choosing a cold shock domain (CSD) are well explained by its advantages: (1) CSD is a generally conserved nucleic acid binding domain, which predominates in the prokaryote and eukaryote kingdoms And thus contribute to minimizing the risk of an immune response or even reducing such risk to zero. Therefore, CSD is the most suitable candidate for construction of a gene delivery protein vector. (2) The endogenous nucleic acid binding action of CSD can accommodate different Na + / K + ion distributions outside and inside the cell, since CSD does not produce a large immune response in the host receiving the gene delivery vector. It means that it is very possible that CSD achieves high efficiency gene delivery without losing the gene cargo during the delivery process, and (3) the envelope glycoprotein of alphavirus, flavivirus Employ a β-barrel type structure for insertion of host cell membranes, thus fusogenic peptide-in-frame fusions with CSD can be spared from endosomal capture or direct cell membrane fusion. (Lescar, J,, Roussel, A, Wein, MW, Navaza, J., Fuller, SD, Wengler, G., Wengler, G. and Rey. , FA (2001) Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest fever virus: D . Fusogenic at pH of Dosomu primed for (fusoguenic) activity (primed) icosahedral set .Cell 105,137-148 and Kuhn, R.J. et al., Cell 108,717-725; 2002).
[0016]
CSD is already well characterized structurally, which is called an antiparallel, five-chain β-barrel structure and is denoted as OB-fold. Therefore, the OB-fold family having a structure similar to CSD can be used in the fusion proteins of the present invention. Many studies have shown that CSDs can bind to single-stranded nucleic acids. For example, RNP-1 and RNP-2 RNA binding motifs and phenylalanine, lysine residues on the outer surface of the cold shock domain are responsible for single-stranded DNA, RNA binding (Bycroft et al., Cell, Vol. 88, 235-242, January 24, 1997). Have shown that Y-box binding protein-1 binds to single-stranded nucleic acids (Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 5, 1200-1207). Preferably, the cold shock domain is CspA, CspB, CspC, CspD, rpl S1 RNA binding domain, eukaryotic Y-box protein, DNA binding protein B (DBPB), DBPA, EF-1, mRNP3, mRNP4, FRG Y1. And nuclease-sensitive element binding protein 1 (NSEP # 1). More preferably, the cold shock domain is selected from the group consisting of CspA, rpl {S1} RNA binding domain, human YB-1 and DNA binding protein B.
[0017]
It will be appreciated that the CSDs of the present invention include homologous sequences obtained from any other source without being limited to the species described above. Given the above disclosure, one of skill in the art will appreciate that any CSD homolog that can bind to nucleic acids can also be used in the fusion proteins of the invention.
[0018]
Functionally equivalent derivatives of the CSDs of the invention and homologs thereof can also be used in the fusion proteins of the invention. CSD or a homolog thereof can alter the binding of a double-stranded nucleic acid. “Functionally equivalent derivatives” of CSD and homologs thereof include recombinantly produced molecules or chemically synthesized polypeptides that function similarly to the reference molecule to achieve the desired result. Thus, functionally equivalent derivatives of CSD and homologs thereof include derivatives containing single or multiple amino acid additions, substitutions and / or deletions occurring internally or at the amino or carboxy terminus thereof, as well as DNA binding domains or DNA. Derivatives that include any modifications, such as insertion of a condensation domain, are included. It has also been demonstrated that CSD can be modified to bind double-stranded DNA or RNA. For example, Wang et al. Show that the cold shock domain of CspA modified by a domain that exchanges for a positively charged amino acid from the eukaryotic counterpart YB-1 protein can result in the acquisition of double-stranded DNA binding activity. (Wang et al., Mol. {Microbiology, {38 (3): {526-534.} 2000}).
[0019]
The CSDs of the present invention can be modified to obtain derivatives having double-stranded RNA / DNA binding activity, which can be accomplished by inserting either a DNA condensation domain or a DNA binding domain into the CSD. The DNA condensation domain can bind more DNA and / or condensed DNA molecules to form a nucleosome-like structure that is resistant to DNAase digestion, thereby using less fusion protein. According to the present invention, any suitable DNA condensation or binding domain that can modify the cold shock domain / ribosomal protein S1 RNA binding domain to bind to double-stranded DNA may be used in the present invention. For example, suitable DNA condensation or DNA binding sequences include the arginine, lysine-rich, histones, fast-moving groups of the positively charged amino acids arginine, lysine such as the SV40 large T antigen, Myc, YB1 protein and other putative NLS. HMG) DNA condensation domain (SPKR) 3-4 derived from protein or nuclear localization sequence (NLS).
[0020]
Membrane translocation sequence
The membrane translocation sequences of the fusion proteins of the invention have the ability to efficiently cross biological membranes in a process called protein transduction, such as protein transduction domains (PTDs) and membrane fusion sequences and their functionally equivalent peptides or derivatives. Have. It is known that protein transduction does not occur via conventional reporter-, transporter-, or endosomal-mediated modes. Membrane translocation sequences rapidly and efficiently transduce molecules into cells. Examples of membrane translocation sequences are shown in the table below.
[0021]

[0022]
One preferred embodiment of the present invention is for the delivery of a desired molecule to a cell or nucleus comprising i) a cold shock domain and homologs or functionally equivalent derivatives thereof and ii) a membrane translocation domain. It is to provide a fusion protein. It is known in the art that PTDs can deliver nucleic acids across cell and nuclear membranes. By combining CSD and PTD, the fusion protein of the present invention can sufficiently deliver a desired nucleic acid to cytoplasm and nucleus. Some PTDs and their properties, characteristics and potency have been found by research (Fischer et al., Bioconjugate Chem., 2001, Vol. 12, No. 6, $ 825-841; Lindgren et al., Tips-March $ 2000, @Vol. 21; Becker-Hepak et al., Methods {24, {247-256, 2001;} and Ho et al., Cancer {Research} 61, {474-477, January 15, 2001). For example, Tat is a transcriptional activator that is 86-102 amino acids long, depending on the virus strain, and is involved in HIV replication. The smallest Tat transduction domain is basic residues (residue) 49-57. VP22, a 38-kDa structural protein from herpes simplex virus 1, has excellent intracellular transport properties. The smallest VP22 transduction domain is basic residues 267-300. Antp is a Drosophila homeotic transcription factor and is composed of three α helices with β turns between helices 2 and 3. The third α helix of Antp (residues 43-58) is required for transmission.
[0023]
Preferably, the PTD is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-8. More preferably, the PTD is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, and 7.
[0024]
Another aspect of the present invention is to provide a fusion protein for delivery of a desired molecule to a cell or nucleus comprising i) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof. . It is also known in the art that membrane fusion sequences can transfer molecules to cell membranes. By combining the CSD and the membrane fusion sequence, the fusion protein of the invention can deliver the desired nucleic acid to the cytoplasm. In order to deliver the desired nucleic acid to the cell nucleus, the fusion protein further contains a nuclear localization sequence. For example, one typical membrane fusion sequence is PreS2-TLM. PreS2 is a permeable peptide whose translocation motif is called PreS2-TLM. PreS2-TLM corresponds to the amphipathic α helix of residues 41-52 of the PreS2 protein. It is believed that this peptide can penetrate various cells, including plant cells. Preferably, the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-21. More preferably, the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of 9, 10, 11, 12 and 13.
[0025]
Protein purification tagging sequence
The fusion proteins of the invention can further include a protein purification tagging sequence. The purification tagging sequence of the present invention is only an optional element of the fusion protein and is only for protein purification. The fusion proteins of the present invention can be purified by chemical purification techniques. For example, a Tat-PTD-containing protein can be purified by a heparin column (Hakansson et al., Protein science (2001), 10: 2138-2139. In addition, DNA columns can also be used to purify the fusion proteins of the invention.
[0026]
A protein purification tagging sequence of the invention can be an N- or C-terminal fusion with a gene delivery protein vector. Preferably, the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, His6 tags. More preferably, the protein purification tagging sequence is a His6 tag.
[0027]
Preparation of the fusion protein of the present invention
The fusion protein of the present invention can be produced by culturing a host cell transformed with a recombinant vector under conditions that allow expression of the protein, and isolating the protein produced thereby. .
[0028]
DNA constructs suitable for expression of the fusion proteins of the invention, ie, recombinant DNA molecules, can be used in the present invention. For expression of a protein of the invention, a DNA construct is cloned into an expression vector that expresses a fusion protein of the invention. The expression vector is, of course, selected according to the nature of the host cell chosen for expression of the protein. Suitable such expression vectors are commercially available. Suitable expression vectors are described in Novagen. In the case of a prokaryotic expression vector such as a pET-based bacterial plasmid provided by Co, expression is preferably performed in a prokaryotic host, more preferably a microbial host, especially E. coli.
[0029]
Application of the fusion protein of the present invention
The present invention provides a fusion protein as a delivery vector. The fusion proteins of the invention have a high efficiency of transfection in vitro and especially in vivo, and can deliver genes to cells, embryos and live animals. Gene delivery performed by the fusion protein can be performed in a species-specific and even individual-specific manner. Therefore, the fusion protein of the present invention is an effective tool in the field of gene therapy and production of transgenic animals.
[0030]
The following examples are provided by way of illustration, not limitation.
[0031]
【Example】
Example 1
Cloning and construction of fusion proteins of the invention
A single colony of E. coli strain DH5α was picked and then added to 100 μl of sterile water. The resulting solution was boiled for 5 minutes. After a brief centrifugation, a 10 μl aliquot was removed and used as a DNA template for CspA gene amplification by polymerase chain reaction (PCR). Primer 1 and Primer 2 were used to amplify the CspA gene from E. coli. The sequences of primers 1 and 2 are listed below:
Primer 1;
5'-gctagcATGTCCGGTAAATGACTGGTATCTGTAAA-3 '
Primer 2;
5'-ctcgagATTACAGGCTGGTTACGTTA-3 '(lowercase indicates NheI cleavage site; underlined lowercase indicates XhoI cleavage site)
[0032]
After 25 cycles of PCR (annealing temperature set to 55 ° C., 1 minute), the PCR products were analyzed by 1.2% agarose gel electrophoresis and then purified by QIAquick PCR Product Purification Kit (QIAGEN, {Co.}). . The purified PCR product is cloned into a pGEM-T vector (Promega {Co.}) and the recombinant plasmid is screened according to the manufacturer's technical manual to obtain the plasmid pGEM (T) / CspA and then confirmed by DNA sequencing. did. Therefore, such a cold shock protein A (CspA; cold shock domain) further modified by inserting a DNA condensation or binding domain into the cold shock domain of the present invention is used to bind to double-stranded nucleic acid. .
[0033]
Fusion Protein I: The simplest form of the fusion protein is composed of a combination of NLS + / PTD from TAT and CSD and is called rTAT (see FIG. 1). DNA binding / NLS + / PTD, the reverse form of the Tat peptide sequence (rTat) was encoded by the following synthetic oligonucleotide:
Oligo (1):
5'-taTGGGTCGCCGTCGTCAACGTCGTAAAAAGCGCCGTT-3 '
Oligo (2):
5'-ctagAACCGCGCTTTTTACGACGTTGACGACGGCGACCCA-3 '
[0034]
Fusion protein II: The second form of the fusion protein is composed of a combination of NLS + / PTD derived from TAT and DNA condensed sequences of (SPKR) 4 and CSD and is called (SPKR) 4-iTAT-CspA (FIG. 2). reference). DNA condensed sequence (SPRK) 4 was encoded by the following synthetic oligonucleotide:
Oligo (3):
5'-taTGGGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGCTCT
CCTAAACGCTCT CCTAAACGGTGGTT-3 '
Oligo (4):
5'-ctagAACCACGTTTTAGGAGAGCGTTTTAGGAGAGCG
TTTAGGAGAG {CGTTTAGGAGAGCCCA-3 '
[0035]
100 pmol of each of Oligo (1) and Oligo (2) or Oligo (3) and Oligo (4) were separately mixed and heated at 95 ° C. for 5 minutes. The annealed double-stranded oligonucleotide was slowly cooled to 4 ° C and stored at 20 ° C overnight. 5 'end labeling of the annealed double stranded oligonucleotide was performed using T4 polynucleotide kinase (purchased from Amersham @ Co.) And ATP as recommended by the manufacturer. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the reaction was stopped by heat inactivation and then extracted with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (v / v / v = 25: 24: 1; Applichem {Co.}). Annealed double-stranded oligonucleotides were precipitated with glycogen (Roche {Co.}) and cold absolute ethanol (Merck {Co.}).
[0036]
Synthetic oligonucleotides encoding the reverse form of the Tat peptide sequence (rTa) or the DNA condensed sequence (SPKR) 4 were converted to NdeI and NheI treated pGEM (T) / CspA by T4 DNA ligase (New {England} Biolab. Com.), Respectively. It was cloned and transformed into E. coli strain DH5α to obtain pGEM (T) / rTAT-CspA and pGEM (T) / (SPKR) 4-CspAΔ DNA plasmids, respectively. To further construct a modified (SPKR) 4-CspA with membrane translocation activity, we used primers 3 and 4 which are complementary to the partial coding sequence of CspA, and And the DNA plasmid pGEM (T) / (SPKR) 4-CspA was used as a PCR template. After 25 cycles of PCR, the PTD sequence was introduced into pGEM (T) / (SPKR) 4-CspA with primers 3 and 4 using the Taq enzyme (purchased from Takara. Co.). The sequences of PTD primers 3 and 4 are listed below:
Primer 3:
5'-NNNNNNGGATCCAGAGAAGTGTACGAACACATC-3 '
Primer 4:
5'-NNNNNNGGATCCCGCAAGAAACGCCCGT
CAACGCCGCAGAGGATCTCTGGACGAAGGTCAGAAA. (Underlined letters indicate BamHI cleavage sites)
[0037]
The annealing temperature is set at 54 ° C. for 1 minute. After 25 cycles of PCR, the resulting PCR product was purified using a QIAquick® PCR purification kit and subjected to DpnI and BamHI digestion. After restriction enzyme digestion, the DNA was separated on a 1% agarose gel (1 × TAE), and the DNA was purified using a QIAquick gel extraction kit (QIAGEN.Co). The purified DNA was self-ligated and then transformed into E. coli strain DH5α to obtain the pGEM (T) / (SPKR) 4-iTat-CspA plasmid.
[0038]
Construction of expression vector
The fusion protein sequence encoded by the pGEM (T) / rTAT-CspA or (SPKR) 4-iTat-CspA plasmid was subjected to NdeI and XhoI digestion, then separated on a 1% agarose gel and used as a DNA insert for rTAT- DNA fragments each containing the coding sequence of CspA or (SPKR) 4-iTat-CspA fusion protein were cut out. The expression vector pET28a (Novagen {Co.}) is treated with the same restriction enzymes NdeI, XhoI, then ligated to the DNA insert rTAT-CspA or (SPKR) 4-iTat-CspA fusion protein coding sequence, respectively, and then transformed into DH5α of E. coli strain. Convert to obtain pET28a / rTAT-CspA or pET28a / (SPKR) 4-iTat-CspA, and then subject the pET expression vector to DNA sequencing. By sequencing, pET28a / rTAT-CspA or pET28a / (SPKR) 4-iTat-CspA plasmids were purchased from E. coli strain BL21 (DE3) codon plus cells (Stratagene.com, respectively) for expression of the fusion proteins of the invention. ) Was confirmed.
[0039]
Expression and purification of fusion proteins of the invention
E. coli strain BL21 (DE3) codon-plus cells carrying the pET28a / rTAT-CspA or pET28a / (SPKR) 4-iTat-CspA plasmid were grown on LB (Kan +, Cm +) plates. Single colonies were picked and inoculated into 2 ml of LB broth (Kan +, Cm +) and then incubated at 37 ° C. for 4 hours. A 1 mL aliquot of the bacterial culture was inoculated into 400 mL terrific broth (Kan +, Cm +) until the optical density OD600 reached 0.6-0.8 for further incubation. A final concentration of 1 mM IPTG was added, followed by a further incubation at 37 ° C. for 5-7 hours. IPTG-induced E. coli cells were collected by centrifugation. The resulting pellet was stored at -70 C in a freezer for further protein purification.
[0040]
Purification of the fusion protein of the present invention
Purification of the protein of the invention was performed according to the manufacturer's instructions for the pET system. The IPTG-inducible expression E. coli host pellet was resuspended in 1 × His binding buffer (500 mM NaCl, 20 mM imidazole and 20 mM Tris-Cl, pH 7.9) containing 8 M urea, and the cells were then sonicated. Destroyed. After ultracentrifugation, the sonicated supernatant fraction was applied to a nickel ion affinity column, and the column was then applied to 10 volumes of 1 × binding buffer containing 8 M urea (500 mM NaCl, 25 mM imidazole and 20 mM Tris -Cl, pH 7.9) and 1x wash buffer (500 mM NaCl, 40 mM imidazole, 20 mM Tris-Cl, pH 7.9) containing 8 M urea. The His6-tagged fusion protein was eluted from the column with 1 × elution buffer containing 8M urea (500 mM NaCl, 60 mM imidazole, 20 mM TrisCl, pH 7.9). The His6-tagged protein was added to a 4M urea solution followed by sterile H₂Dialyzed against O. The dialyzed protein was freeze-dried, the protein powder was dissolved in a 1 × PBS solution, and the protein concentration was determined by the method of BCA (PIERCE.Co). The purified fusion protein was analyzed on 5-15% SDS-PAGE and the gel was stained with Coomassie blue (see FIG. 3). The resulting protein solution was ready for a nucleic acid binding assay (gel delay or EtBr exclusion assay) and was tested for its gene delivery activity.
[0041]
Example 2
DNA binding ability of the fusion protein of the present invention
Briefly, 0.5 μg of the reporter plasmid pEGFP-N1 (purchased from Clontech.com.) Was loaded with various amounts of fusion protein vector rTAT-CspA or (SPKR) 4-iTat in the presence of 1 × PBS buffer. -Incubated with CspA. After a 30 minute incubation at room temperature, the DNA-protein complex was separated on a 1% agarose gel (1 × TBE), stained with EtBr, and photographed. When a large DNA-protein complex was formed, the reporter plasmid DNA was delayed in the top well of the gel due to fusion protein binding and therefore could not migrate into the gel and stain the well with EtBr (FIG. 4). reference).
[0042]
Example 3
In vitro transfection of Hela cell culture with fusion protein vector and pEGFP-N1 reporter plasmid
Overgrowth of subconfluent, monolayer Hela cells plated on serum-coated coverslips (approximately 10⁶Cells) are gently washed with two portions of serum-free DMEM medium and five portions of 1 × PBS buffer, and then with 5 μg of the reporter plasmid pEGFP-N1 alone or with the fusion protein (rTat or (SPKR) 4-iTat-CspA). ) -Reporter DNA plasmid complex (5 μg) each. To the incubation of HeLa cells at 37 ° C. for 1 hour, 0.45 ml of fresh serum + DMEM medium was added, incubated at 37 ° C. for 6 hours, and 1 ml of fresh serum + DMEM medium was added and further incubated. Observation of Hela cells transfected with EGFP protein expression was performed directly by fluorescence microscopy (Leica. Co.) after 24 hours of incubation. As shown in FIG. 5, Hela cells transfected with the fusion protein pEGFP-N1 complex show a significant green fluorescent signal in the cells. The results show that the fusion proteins of the invention can efficiently deliver DNA to cells.
[0043]
Example 4
Stripped mouse embryos transfected in vitro with the fusion protein of the invention and the pEGFP-N1 reporter plasmid
The mouse embryos used for transfection were essentially purified by Gordon et al. (Gordon, JWＪ and Ruddle, FH (1983).), Gene transfer into mouse embryos, production of transgenic mice by pronuclear injection. , Methods {in} Enzymol., {Recombinant} DNA, {Part} C., {101, {411-433}) and Hogan, {B. Ｃｏ, Costantini, F. And Lacy, E. {(1986)} Manipulation of mouse embryos: A was prepared as described in Laboratory {Manual}. Briefly, ICR outbred strains were purchased from the NTU Research Animal Center (Taipei) and then injected with 2.5 IU of pregnant horse serum gonadotropin (G4527 #) purchased from Sigma II followed by 5 IU of humans 48 hours later. Superovulated by injection of chorionic gonadotropin (hCG; Sigma. Co., C8554 °) and individually caged with ICR males overnight. One cell of the mouse embryo was collected from tubal flushing 24 hours after hCG injection. Mouse embryos were treated with an aliquot of 0.5% pronase (Sigma. Co, P5147) in M2 medium (Sigma. Co.) for 5 minutes at 37 ° C., the zona pellucida was removed, M2 medium and 1 × PBS buffer And several times with invitrogen. Under the same conditions as for transfection of Hela cells, except that 0.75 μg of the control plasmid pCDNA3.1 or the pEGFP-N1 reporter plasmid was used. Transfected with either the control plasmid pcDNA3.1 purchased from Com or the fusion protein vector (SPKR) 4-iTat-CspA and the reporter pEGFP-N1 plasmid. After 15 minutes incubation at 37 ° C., 1 ml of M16 culture medium (Sigma. Co., M7292) was added, and the embryos were then mounted with mineral oil (Sigma. Com., M8410). Every 24 hours of incubation, embryos were examined for EGFP protein expression by fluorescence microscopy (Leica {Co.}). As shown in FIG. 6, the fusion protein (SPKR) 4-iTat-CspA-pEGFP-N1 reporter plasmid (left) showed a significant green fluorescent signal in the fluorescence micrograph, indicating that the fusion protein was a DNA @ pEGFP-N1 reporter. It shows that plasmids can be successfully delivered to embryos.
[0044]
Example 5
Delivery of Reporter DNA Plasmid pEGFP-N1 to Mice Using the Fusion Protein of the Present Invention
20 μg of the DNA plasmid pEGFP-N1 was mixed with the fusion protein rTAT-CspA or (SPKR) 4-iTat-CspA of the present invention in 1 × PBS buffer, incubated at RT ° C. for 15 minutes, and intraperitoneally injected into the mice respectively Was injected. Forty-eight hours later, mice were sacrificed, their livers were subjected to frozen tissue sections, and EGFP protein expression was observed by confocal laser scanning microscopy (Leica. Co.). FIG. 7 shows that the fusion proteins rTAT-CspA or (SPKR) 4-iTat-CspA of the invention were able to successfully deliver the DNA plasmid pEGFP-N1 to hepatocytes in vivo.
[0045]
Example 6
RNA binding ability of the fusion protein of the present invention
The human 5s rDNA PCR product was cloned into a pGEM (T) vector (donated by Dr. Promega. Co. {Elong {Lin}). The pGEM (T) / h5SΔrDNA plasmid was digested with SpeI and then separated on a 1% agarose gel (1 × TAE). The linear pGEM (T) / h5S rDNA fragment was excised from an agarose gel and purified using a QIAquick gel purification kit (QIAGEN. Co.). Human 5S rRNA was synthesized by using RiboMAX / T7 large-scale RNA production system (Promega. Co.), and human 5S rRNA was synthesized using UTP [α-32P] (800 ci / mmol, 10 mCi / ml; NEN. Co.). Was performed according to the manufacturer's instructions. In vitro synthesized human 5SΔrRNA was separated on 12% UREA-PAGE and then purified from the gel by UV shading. After precipitation of human 5S rRNA with ammonium acetate and ethanol, denatured by heating in a boiling water bath for 5 minutes, then slowly cooled to room temperature and stored at -20 ° C overnight. 125 ng of human 5SΔrRNA is mixed with various amounts of the protein of the invention, rTAT protein, incubated at RT ° C. for 30 minutes, then treated with or without RNase T1 (10 U; Ambion. Co.) for 10 minutes at 37 ° C. Further incubation. The bound complexes were separated on 8% native PAGE (0.5 × TBE), then the gel was immobilized with additional 10% acetic acid, the gel dried and subjected to autoradiography. As shown in FIG. 8, the RNase-resistant binding complex is indicated by the symbol “*”.
[0046]
【The invention's effect】
The present invention is useful as an effective tool in the fields of gene therapy and production of transgenic animals.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows that the construct of the gene encoding the fusion protein of the invention, rTAT-CspA, is represented by a simplified flow chart. The CspA gene was amplified from E. coli by PCR using primers 1 and 2 to obtain double-stranded DNA / RNA binding activity by insertion of annealed synthetic oligos 1 and 2 encoding the reverse form of the TAT-PTD peptide sequence, After introduction into the CspA gene, the obtained modified gene of the present invention (rTAT-CspA) was subcloned into a pET28a expression vector.
FIG. 2 shows that the construction of the gene encoding the fusion protein of the invention, (SPKR) 4-iTAT-CspA, is represented by a simplified flowchart. The CspA gene was amplified from E. coli by PCR using primers 1 and 2 and its double-stranded DNA / RNA binding activity was enhanced by the insertion of annealed synthetic oligos 3 and 4 encoding the DNA condensation sequence (SPKR) 4 and the PTD sequence The modified CspA gene was further introduced by PCR amplification using primers 3 and 4, and the resulting modified gene of the present invention was subcloned into a pET28a expression vector.
FIG. 3. Derivation and purification of the fusion protein was performed according to the manufacturer's instructions, the purified protein was analyzed on 5-15% SDS-PAGE, and the gel was stained with Coomassie Blue. Lane 1 is whole cell lysate of pET28a / fusion protein; Lane 2 is sonicated supernatant 1 of pET28a / fusion protein; Lane 3 is sonicated pRT28a / fusion protein. Lane 2 is the sonicated pellet of pET28a / fusion protein; Lane 5 is the flow-through fraction after nickel-bead affinity column chromatography; Lane 6 is 20 mM in 1 × binding buffer solution. Wash fraction containing imidazole; lane 7 contains 60 mM imidazole in elution buffer. Eluate 1 fraction having; and lane 8 is eluate 2 fraction containing 60 mM imidazole in elution buffer; lane 9 is a protein molecular weight marker purchased from Amershan-Pharmacia @ Company; lane 10 Is purified iTat protein (0.25 μg); and lane 11 is purified rTat protein (1.0 μg).
FIG. 4 shows a gel retardation assay. 0.5 μg of the reporter plasmid pEGFP-N1 (purchased from Clontech.com.) Was incubated with various amounts of protein vector, “rTAT-CspA” or “iTAT-CspA”, in the presence of 1 × PBS buffer. . After incubation for 30 minutes at room temperature, the DNA-protein complex was separated on a 1% agarose gel (1 × TBE) and the gel was stained with EtBr.
FIG. 5 shows (1) no DNA plasmid (left panel), (2) rTAT-CspA-pEGFP-N1 complex (middle), and (3) (SPRK) 4-iTAT-CspA-pEGFP-. FIG. 9 shows green fluorescent protein expression from Hela cells transfected with N1. After 1 hour incubation of the cells with the DNA-protein complex, add 0.45 mL of serum + DMEM broth and incubate at 37 ° C. for 6 hours, then add 1 mL of serum + DMEM broth and allow the cells to grow further at 37 ° C. For 24 hours, and EGFP gene expression was examined by fluorescence microscopy.
FIG. 6 shows the expression of a green fluorescent protein derived from the fusion protein vector iTAT-CspA-pEGFP-N1 complex of the present invention transfected into a mouse embryo. Stripped mouse embryos were transfected with the protein vector of the invention, iTAT-CspA, along with 0.75 μg of DNA plasmid pcDNA3.1 (left panel) or pEGFP-N1 reporter DNA plasmid (right panel), respectively. After a period of incubation interval, mouse embryos were examined for green fluorescent protein expression by fluorescence microscopy.
FIG. 7 shows i. p. 2 shows frozen tissue sections of liver from mice treated by injection with the protein vector complexes of the invention, rTAT- or iTAT-CspA-pEGFP-N1 本 DNA complex. Forty-eight hours later, mice were sacrificed, and then green fluorescent protein expression in the liver was observed by confocal laser scanning microscopy (Leica.com.).
FIG. 8 shows an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) performed using a protein of the present invention, rTAT and human 5SΔrRNA.

Claims

ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質。i) the cold shock domain and homologs or functionally equivalent derivatives thereof and ii) the desired molecule to the cell or nucleus comprising a membrane translocation sequence or a functionally equivalent peptide and / or derivative thereof. Fusion protein for delivery.

寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦＥ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The cold shock domain is CspA, CspB, CspC, CspD, rplｐS1 RNA binding domain, eukaryotic Y-box protein, DNA binding protein B (DBPB), DBPA, EFE-1, mRNP3, mRNP4, FRG Y1 and nuclease sensitivity The fusion protein according to claim 1, which is selected from the group consisting of element binding protein 1 (NSEP1).

寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質ＡおよびＢならびにＦＲＧ　Ｙ１からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the cold shock domain is selected from the group consisting of CspA, rpl {S1} RNA binding domain, human YB-1 and DNA binding proteins A and B, and FRG @ Y1.

寒冷ショックドメインの機能的に等価な誘導体が、ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを寒冷ショックドメインに挿入することにより改変される請求項１記載の融合タンパク質。2. The fusion protein according to claim 1, wherein the functionally equivalent derivative of the cold shock domain is modified by inserting a DNA condensation domain or a DNA binding domain into the cold shock domain.

ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４および正に帯電した核局在化配列（ＮＬＳ＋）からなる群より選ばれる請求項４記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 4, wherein the DNA condensation domain or DNA binding domain is selected from the group consisting of a DNA condensation domain (SPKR) 3-4 and a positively charged nuclear localization sequence (NLS +).

膜トランスロケーション配列が、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）または膜融合配列である請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the membrane translocation sequence is a protein transduction domain (PTD) or a membrane fusion sequence.

ＰＴＤが、配列番号：１　〜８からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the PTD is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 8.

ＰＴＤが、配列番号：１　、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the PTD is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, and 7.

膜融合配列が、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 21.

膜融合配列が、配列番号：９、１０、１１、１２および２０からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, wherein the membrane fusion sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12 and 20.

ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）タンパク質伝達ドメインまたはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質。A fusion protein comprising i) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof and ii) a protein transduction domain or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof.

ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜融合配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質。A fusion protein comprising: i) a cold shock domain and a homolog or a functionally equivalent derivative thereof; and ii) a membrane fusion sequence or a functionally equivalent peptide and / or a derivative thereof.

さらに核局在化配列を含有してなる請求項１２記載の融合タンパク質。13. The fusion protein according to claim 12, further comprising a nuclear localization sequence.

さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 1, further comprising a protein purification tagging sequence.

タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１４記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 14, wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tags.

さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１１記載の融合タンパク質。The fusion protein according to claim 11, further comprising a protein purification tagging sequence.

タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１６記載の融合タンパク質。17. The fusion protein according to claim 16, wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tags.

さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１２記載の融合タンパク質。13. The fusion protein according to claim 12, further comprising a protein purification tagging sequence.

タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１８記載の融合タンパク質。19. The fusion protein according to claim 18, wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tags.

さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１３記載の融合タンパク質。14. The fusion protein according to claim 13, further comprising a protein purification tagging sequence.

タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項２０記載の融合タンパク質。21. The fusion protein according to claim 20, wherein the protein purification tagging sequence is selected from the group consisting of HA, GST, and His6 tags.

遺伝子送達のための細胞への核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。The fusion protein of claim 1 for use in delivering nucleic acids (DNA and / or RNA) to cells for gene delivery.

遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。2. The fusion protein of claim 1 for use in delivering nucleic acids to cells in vivo for gene delivery.

遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。12. The fusion protein of claim 11, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.

遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。12. The fusion protein of claim 11, for use in delivering nucleic acids to cells in vivo for gene delivery.

遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。13. The fusion protein of claim 12, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.

遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。13. The fusion protein of claim 12, for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.

遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。14. The fusion protein of claim 13, for use in delivering a nucleic acid to a cell for gene delivery.

遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。14. The fusion protein of claim 13, for use in delivering a nucleic acid to a cell in vivo for gene delivery.

トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。2. The fusion protein of claim 1 for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.

トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。12. The fusion protein of claim 11 for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.

トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。13. The fusion protein of claim 12, for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.

トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。14. The fusion protein of claim 13, for use in delivering nucleic acids to embryos and live animals for the production of transgenic animals.