JP2004026866A

JP2004026866A - 遺伝子送達用担体

Info

Publication number: JP2004026866A
Application number: JP2002181003A
Authority: JP
Inventors: Tetsuji Yamaoka; 山岡　哲二; Yutaka Tokiwa; 常盤　豊; Masaru Kitagawa; 北川　優; Hiromi Shimakawa; 嶋川　博己
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd; Konan Kako KK
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd; Konan Kako KK
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2004-01-29
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: JP3783102B2

Abstract

【課題】目的とする組織や細胞に対し、効率的に遺伝子導入を行うことができ、生体内での安全性も高い遺伝子送達用担体を提供すること。
【解決手段】新規な構造を有する糖含有共重合体、並びに該糖含有共重合体を用いて形成された遺伝子送達用担体。
【選択図】図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖を含有する共重合体、並びに該共重合体から形成される遺伝子送達用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近注目されている遺伝子治療では、患者の体内から取り出した細胞に培養系で外来遺伝子を導入し、形質転換細胞を増殖させた後に患者に再移植する「Ｅｘ　ｖｉｖｏ遺伝子導入法」が主として実施されている。この場合、患者から単離できる細胞は限られているため、多くの場合末梢血リンパ球が利用されている。しかし、ターゲットとなる細胞は、その対象疾患によって異なり、特に体細胞や臓器組織の細胞をターゲットとする場合には、外来遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを直接生体に投与する必要がある（Ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子導入法）。
【０００３】
Ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子導入法は、多くの研究者によって検討が行われており、遺伝子を効率よく生体内に導入し、安全性が確保できる遺伝子送達用担体の開発が強く望まれている。
【０００４】
一方、米国ＦＤＡにより認可されている、遺伝子治療プロトコールの８５％以上においては、アデノウィルスやレトロウィルスなどが使用されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　４９，　８０７，　１９９５）。ウィルスによる遺伝子導入効果は極めて高く、有効であるが、米国で実施された遺伝子治療においてはウィルスに対する免疫反応が原因と考えられる事故が起こるなど、ウィルス増殖などの危険性が指摘されていた。
【０００５】
そのため、カチオニックリポソーム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８４，　７４１３，　１９８７）やカチオンポリマー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　９２，　７２９７，　１９９５，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　６，　７，　１９９５）などの非ウィルス性担体を遺伝子送達用担体として用いることが検討されてきた。具体的には、従来、ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−ｄｅｘ）やポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）などの直鎖状ポリカチオンが検討されてきた。
【０００６】
ポリカチオンの遺伝子導入効率はリポソームより低いが、リポソームに比べて生体内に直接投与したときに肝臓に集積する傾向が少なく、体内動態のコントロールが比較的容易であるという利点がある。しかし、ポリカチオンの一つで、従来、遺伝子送達用担体として精力的に検討されてきたポリ−Ｌ−リジンは、近年その遺伝子導入能が極めて低いことが報告された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な構造を有する糖含有共重合体、並びに、該糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体を提供することを主な目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、水溶性で体内動態制御が容易であって、効率的に遺伝子導入を行うことができる高分子化合物について鋭意研究した結果、特定の構造を有する糖含有共重合体から形成される担体が、優れた効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の事項に係る。
【００１０】
項１：下記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される繰り返し単位を有し、（Ｉ）と（ＩＩ）のモル比率が１：９〜９：１であって、且つ、重量平均分子量が１×１０^４〜５×１０^８である糖含有共重合体。
一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化３】

【００１２】
（式中、ｎは１〜１０を示す。）
一般式（ＩＩ）：
【００１３】
【化４】

【００１４】
（式中、Ｓ（ＯＨ）_ｑ−１は糖骨格Ｓとそれに結合するｑ個の水酸基からなる糖化合物から１個の水酸基を除いた糖残基を示し、ｍは２〜１０を示す。）
項２：（Ｉ）と（ＩＩ）のモル比率が２：８〜３：７である、項１に記載の糖含有共重合体。
【００１５】
項３：重量平均分子量が５×１０^６〜２×１０^７である、項１又は２のいずれかに記載の糖含有共重合体。
【００１６】
項４：一般式（Ｉ）におけるｎが３であって、一般式（ＩＩ）におけるｍが４である、項１乃至３のいずれかに記載の糖含有共重合体。
【００１７】
項５：項１乃至４のいずれかに記載の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００１９】
糖含有共重合体
本発明の糖含有共重合体は一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される繰り返し単位を有する。
一般式（Ｉ）：
【００２０】
【化５】

【００２１】
（式中、ｎは１〜１０を示す。）
一般式（ＩＩ）：
【００２２】
【化６】

【００２３】
（式中、Ｓ（ＯＨ）_ｑ−１は、糖骨格Ｓとそれに結合するｑ個の水酸基からなる糖化合物から１個の水酸基を除いた糖残基を示し、ｍは２〜１０を示す。）
糖含有共重合体における、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）のモル比率は、１：９〜９：１程度であって、目的に応じて、適宜調整して使用される。
【００２４】
特に、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）のモル比率が２：８〜３：７程度であるものが、ＤＮＡと複合体を形成し易く、遺伝子の発現効率が高い点で好ましい。
【００２５】
一般式（Ｉ）におけるｎは１〜１０、また一般式（ＩＩ）におけるｍは２〜１０を示し、所望の性質を有する共重合体を得ることを目的として、適宜設定することができる。
【００２６】
特に一般式（Ｉ）におけるｎが３であって、かつ、一般式（ＩＩ）におけるｍが４である糖含有共重合体が、遺伝子との複合体形成のし易さ及び細胞への取り込み時に糖質の細胞への親和性が高まる点において、好ましい。
【００２７】
糖含有共重合体の分子量は、通常、重量平均分子量で１×１０^４〜５×１０^８程度である。特に、５×１０^６〜２×１０^７程度であるものが、遺伝子の発現効率が高い点で好ましい。
【００２８】
糖含有共重合体の製造方法
本発明の糖含有共重合体は、一般式（ＩＩＩ）で表されるカチオン性単量体と、一般式（ＩＶ）で表される糖含有単量体を、重合することによって得ることができる。
一般式（ＩＩＩ）：
【００２９】
【化７】

【００３０】
（式中、ｎは１〜１０を示す。）
一般式（ＩＶ）：
【００３１】
【化８】

【００３２】
（式中、Ｓ（ＯＨ）_ｑ−１は、糖骨格Ｓとそれに結合するｑ個の水酸基からなる糖化合物から１個の水酸基を除いた糖残基を示し、ｍは２〜１０を示す。）
一般式（ＩＩＩ）で表されるカチオン性単量体におけるｎの値は、目的に応じて適宜設定することができるが、特に、ｎ＝３である、ジメチルアミノプロピルアクリルアミドが、製造し易さなどの点から好ましい。
【００３３】
また、一般式（ＩＶ）で表される糖含有単量体におけるｍの値も、目的に応じて適宜設定することができるが、特にｍ＝４であるビニルアジピン酸エステルが、安定性、合成し易さなどの点からみて、好適である。
【００３４】
また、一般式（ＩＶ）における糖骨格Ｓを有する糖化合物としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、デンプン、セルロース等の単糖、小糖、多糖及び多糖の加水分解生成物等の天然糖及び合成糖などが挙げられる。このうち、グルコースが、製造し易さなどの点で好ましい。
【００３５】
一般式（ＩＩＩ）で表されるカチオン性単量体と、一般式（ＩＶ）で表される糖含有単量体を、重合する方法としては、例えば、ラジカル重合等が挙げられる。
【００３６】
また、重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、アゾイソブチルニトリル（ＡＩＢＮ）等のアゾ系開始剤や有機過酸化物などを使用することができる。
【００３７】
遺伝子送達用担体
本発明の糖含有共重合体は、遺伝子送達用担体として、好適に使用することができる。
【００３８】
遺伝子送達において、担体となる糖含有共重合体は、静電的作用によって遺伝子を凝縮し、複合体を形成する。この複合体がエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、遺伝子が細胞内に送達されることとなる。
【００３９】
本発明の糖含有共重合体は、一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有し、生理的ｐＨ範囲内で正電荷を有する残基を含んでいることから、静電的作用によってＤＮＡ等の分子を凝縮し、より効率良く、遺伝子を導入することができる。
【００４０】
また、本発明の共重合体は、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を有し、糖骨格及び非電荷親水基を含んでいることから、水溶性や生分解性が向上し、体内動態制御がより容易となっている。
【００４１】
特に、（Ｉ）と（ＩＩ）をモル比率２：８〜３：７で有する共重合体とすることによって、より高い遺伝子発現効率が可能となる。
【００４２】
担体により運ばれる遺伝子としては、ＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に制限されないが、例としては、特定の蛋白質をコードする遺伝子やアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
【００４３】
また複合体における糖含有共重合体と遺伝子の比率は、糖含有共重合体のカチオン基のモル数（Ｃ）のＤＮＡ又はＲＮＡのリン酸基のモル数（Ａ）に対する比率（以下、これをＣ／Ａ比と言う）で表して、通常２．５以上、好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上である。Ｃ／Ａ比が大きくなるほど発現効率は高くなる。
【００４４】
糖含有共重合体と遺伝子との複合体を形成する方法は特に限定されず、例えば、遺伝子を含有する溶液と、糖含有共重合体を含有する溶液を混合することによって、適宜調整することができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を用いて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【００４６】
実施例１〜４：糖含有共重合体の作成
ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡ　：Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ　ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）と６−ビニルアジポイルグルコース（ＧＶＡ　：６−ｖｉｎｙｌａｄｉｐｏｙｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ）を、表１に示した仕込み比で用いた。溶媒として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、重合開始剤として、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ：Ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）を用い、反応温度６０℃で、真空下４時間重合した。
【００４７】
得られた糖含有共重合体の収率、重量平均分子量、およびＮＭＲ測定により求めた共重合組成比を、表１に示す。なお、平均分子量は、ディテクターとしてＧＰＣ／ＲＩＤディテクター（島津社製）、またカラムとしてα−Ｍ（東ソー）を用い、プルラン換算分子量で算出した。
【００４８】
【表１】

【００４９】
実施例５：糖含有共重合体−ＤＮＡ複合体の調製
ＤＮＡとしては、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃを用いた。実施例２で作成した糖含有共重合体２．４ｍｇを１０００μｌのＤ−ＭＥＭ培地に溶解してストック溶液を作製した。このストック溶液５μｌとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ溶液４５μｌ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを１００ｎｇ含有）を混合することで、Ｃ／Ａ比＝５０とした。ストック溶液を段階希釈し、同濃度のｐＣＭＶ−Ｌｕｃ溶液と混合することで、Ｃ／Ａ比の異なる試料溶液（Ｃ／Ａ比＝０．５、１．０、３．０、５．０、１０．０）を調製した。
異なるＣ／Ａ比の試料について、ルシフェラーゼ遺伝子ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを混合して、電気泳動を行った。結果を図１に示す。
【００５０】
この結果、糖含有共重合体とＤＮＡとのＣ／Ａ比が３より大きいもので、バンドが一本となり、本発明の糖含有共重合体とＤＮＡとの複合体が形成されていることが確認できた。
【００５１】
実施例６：遺伝子導入の評価
９６穴マルチプレートの各ウェルにＣＯＳ−１細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、上清を除去した。各ウェルに、上記実施例５で作成した複合体溶液５０μｌ　／ｗｅｌｌを、種々のＣ／Ａ比によって別々に添加し、さらに、２００μＭのクロロキンを含む血清不含のＤ−ＭＥＭ　５０μｌ添加した。３７℃５％ＣＯ_２条件下で１２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄して、１０％の血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（１００μｌ　／ウェル）に交換し、さらに４０時間培養を続けた。細胞をＰＢＳ洗浄後、５０μｌのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で３０分間処理して細胞を溶解し、その一部（２０μｌ）をサンプリングし、１００μｌの発光基質液と混合した。各ウェルの発光強度をルミカウンターで定量することにより、遺伝子の発現効率を測定した。
【００５２】
測定結果を図２〜図３に示す。
【００５３】
図２は、遺伝子発現効率の測定結果を、ルシフェラーゼ活性で示したものである。また図３は、遺伝子発現効率の測定結果を、タンパク当たりのルシフェラーゼ活性で示したものである。
【００５４】
図２〜図３に示されるように、ＤＮＡ、細胞のみでは当然活性は見られなかった。また、比較例として、末端に荷電したアミノ基を有し、糖を含有しない重合体（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ^ＴＭ、Ｃ／Ａ比＝５．０、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、発現効率の違いを調べたところ、本発明の糖含有共重合体を用いた複合体は、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ^ＴＭと比べて、より高い遺伝子発現効率を有することが確認された。また、Ｃ／Ａ比が大きくなるほど発現効率が高くなることが確認された。
【００５５】
【発明の効果】
上述した結果に示されるように、本発明の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体は、従来の遺伝子送達用担体と比べて、より高い遺伝子発現効率を示す。また、本発明の共重合体は、生分解性や水溶性が向上しており、体内動態制御が容易であって、高分子分野や医学分野においてより有用に利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々のＣ／Ａ比からなる糖含有共重合体と遺伝子ｐＣＭＶ−Ｌｕｃとの複合体の、アガロースゲル（０．８％）電気泳動を示す図である。
【図２】図２は、ＣＯＳ−１細胞へ遺伝子を導入し、遺伝子の発現効率を測定した図である（ルシフェラーゼ活性で示した場合）。
【図３】図３は、ＣＯＳ−１細胞へ遺伝子を導入し、遺伝子の発現効率を測定した図である（タンパク当たりのルシフェラーゼ活性で示した場合）。

Claims

下記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される繰り返し単位を有し、（Ｉ）と（ＩＩ）のモル比率が１：９〜９：１であって、且つ、重量平均分子量が１×１０^４〜５×１０^８である糖含有共重合体。
一般式（Ｉ）：

（式中、ｎは１〜１０を示す。）
一般式（ＩＩ）：

（式中、Ｓ（ＯＨ）_ｑ−１は、糖骨格Ｓとそれに結合するｑ個の水酸基からなる糖化合物から１個の水酸基を除いた糖残基を示し、ｍは２〜１０を示す。）
（Ｉ）と（ＩＩ）のモル比率が２：８〜３：７である、請求項１に記載の糖含有共重合体。
重量平均分子量が５×１０^６〜２×１０^７である、請求項１又は２のいずれかに記載の糖含有共重合体。
一般式（Ｉ）におけるｎが３であって、一般式（ＩＩ）におけるｍが４である、請求項１乃至３のいずれかに記載の糖含有共重合体。
請求項１乃至４のいずれかに記載の糖含有共重合体から形成される遺伝子送達用担体。