JP2003534782A - Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase - Google Patents

Abstract

Disclosed are techniques for detection of nucleic acids, amplification of nucleic acids, or both, involving ligation by T4 RNA ligase of DNA strands hybridized to an RNA strand. These techniques are particularly useful for the detection of RNA sequences and for amplification of nucleic acids from, or dependent on, RNA sequences. It has been discovered that T4 RNA ligase can efficiently ligate DNA ends of nucleic acid strands hybridized to an RNA strand. In particular, this ligation is more efficient than the same ligation carried out with T4 DNA ligase. Thus, techniques involving ligation of DNA ends of nucleic acid strands hybridized to RNA can be performed more efficiently by using T4 RNA ligase. Many known ligation-based detection and amplification techniques are improved through the use of T4 RNA ligase acting on DNA strands or ends. Such techniques include ligase chain reaction (LCR), ligation combined with reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR), ligation-mediated polymerase chain reaction (LMPCR), polymerase chain reaction/ligation detection reaction (PCR/LDR), ligation-dependent polymerase chain reaction (LD-PCR), oligonucleotide ligation assay (OLA), ligation-during-amplification (LDA), ligation of padlock probes, open circle probes, and other circularizable probes, and iterative gap ligation (IGL).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 発明の背景 開示される発明は全般に核酸の検出および増幅の分野に属し、特にオリゴヌク
レオチドの標的特異的ライゲーションに基づく検出および増幅を含む。BACKGROUND OF THE INVENTION The disclosed invention relates generally to the field of nucleic acid detection and amplification, and specifically includes detection and amplification based on target-specific ligation of oligonucleotides.

【０００２】 核酸の検出および／または増幅に関する多数の技術が既知である。これら多数
の技術には、オリゴヌクレオチドのライゲーション（連結）が含まれる。このよ
うな技術には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Wiedmann et al., PCR Methods App
l. 3(4):S51-64(1994); U.S. Pat. No. 5,516,663 to Backman et al.）、ライ
ゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭＰＣＲ；Rodriguez and Akman, E
lectrophoresis 19:646-652 (1998)）、ライゲーション依存性ポリメラーゼ連鎖
反応（ＬＤ−ＰＣＲ；Park et al., Am J Pathol 149(5):1485-1491 (1996)）、
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ；Tobe et al., Nucleic A
cids Res. 24:3728-3732 (1996)）、およびパドロックプローブ（padlock probe
s）または開環プローブ（open circle probes）のライゲーション（Nilsson et
al., Science 265:2085-2088 (1994); U.S. Patent No. 5,854,033 to Lizardi
）が含まれる。Many techniques are known for detecting and / or amplifying nucleic acids. Many of these techniques include ligation of oligonucleotides. Such techniques include ligase chain reaction (LCR; Wiedmann et al., PCR Methods App
l. 3 (4): S51-64 (1994); US Pat. No. 5,516,663 to Backman et al.), ligation-mediated polymerase chain reaction (LMPCR; Rodriguez and Akman, E.
lectrophoresis 19: 646-652 (1998)), ligation-dependent polymerase chain reaction (LD-PCR; Park et al., Am J Pathol 149 (5): 1485-1491 (1996)),
Oligonucleotide ligation assay (OLA; Tobe et al., Nucleic A
cids Res. 24: 3728-3732 (1996)), and padlock probe.
s) or ligation of open circle probes (Nilsson et
al., Science 265: 2085-2088 (1994); US Patent No. 5,854,033 to Lizardi.
) Is included.

【０００３】 これらの技術は総じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼまたは他のＤＮＡリガーゼによる
ＤＮＡ末端のライゲーションを含む。多くのライゲーションに基づく技術には、
別の核酸ストランドとハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドのライゲーショ
ンが含まれ、これは概して、互いに隣接しているオリゴヌクレオチドの末端に依
存する。ＤＮＡリガーゼには、ＲＮＡストランドとハイブリダイズされたＤＮＡ
ストランドの末端を連結（ライゲート）できるものがある。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
はこの一例である（Hsuih et al., Quantitative detection of HCV RNA using
novel ligation-dependent polymerase chain reaction, American Associaton
for the Study of Liver Diseases, Abstract 1002 (Chicago, IL, November 3-
7, 1995)）。These techniques generally include ligation of DNA ends with T4 DNA ligase or other DNA ligases. Many ligation-based technologies include:
Ligation of an oligonucleotide hybridized with another nucleic acid strand is included, which generally depends on the ends of the oligonucleotides being adjacent to each other. For DNA ligase, DNA hybridized with RNA strand
Some strands can be linked (ligated) at the ends. T4 DNA ligase is an example of this (Hsuih et al., Quantitative detection of HCV RNA using
novel ligation-dependent polymerase chain reaction, American Associaton
for the Study of Liver Diseases, Abstract 1002 (Chicago, IL, November 3-
7, 1995)).

【０００４】 Ｔ４ＲＮＡリガーゼは３’−ヒドロキシル−末端アクセプター（受容体）オリ
ゴリボヌクレオチドを５’−ホスフェート−末端ドナー（供与体）オリゴリボヌ
クレオチドと結合する（Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3009
(1972)）。その名称が示すように、Ｔ４ＲＮＡリガーゼは主にＲＮＡ末端のライ
ゲーションに関して既知である。Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いる研究では、これが
短いオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルおよび５’ホスフェート間のホスホ
ジエステル結合形成を触媒できることが示された（Brennan et al., Methods in
Enzymology 100 (Part B):38-52 (1982); Tessier et al, Analytical Biochem
. 158:171-178 (1986)）。この反応は高濃度の核酸を必要とし、効率的でなかっ
た。これらの研究では、ＲＮＡとハイブリダイズされているＤＮＡストランドの
ライゲーションは試されなかった。ＲＮＡ指向ＲＮＡリガーゼは、標的配列とハ
イブリダイズされたＲＮＡプローブを連結（ライゲート）するのに用いられた（
U.S. Pat. No. 5,807,674）。このライゲーションを用いて、ＲＮＡプローブ対
がハイブリダイズする特異的配列が検出された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは好ましい
リガーゼであった。T4 RNA ligase links 3'-hydroxyl-terminal acceptor (acceptor) oligoribonucleotides with 5'-phosphate-terminal donor (donor) oligoribonucleotides (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3009
(1972)). As its name implies, T4 RNA ligase is known primarily for ligation of RNA ends. Studies with T4 RNA ligase have shown that it can catalyze the formation of phosphodiester bond between the 3'hydroxyl and 5'phosphates of short oligonucleotides (Brennan et al., Methods in
Enzymology 100 (Part B): 38-52 (1982); Tessier et al, Analytical Biochem
.158: 171-178 (1986)). This reaction required high concentrations of nucleic acid and was not efficient. In these studies, ligation of DNA strands hybridized with RNA was not tried. RNA-directed RNA ligase was used to ligate the RNA probe hybridized with the target sequence (
US Pat. No. 5,807,674). This ligation was used to detect the specific sequence to which the RNA probe pair hybridizes. T4 DNA ligase was the preferred ligase.

【０００５】 ＲＮＡまたはＤＮＡストランドとハイブリダイズされたＲＮＡ分子が連結され
た。例えばｍＲＮＡとハイブリダイズされたＲＮＡパドロックプローブのライゲ
ーションは Brian Johnston によって記載されている（IBCs Fifth Annual Inte
rnational Conference on "Antisense: DNA and RNA Based Therapeutics, " Fe
bruary 2-3, 1998, Coronado, CA）。Moore and Sharpe, Science 256:922 (199
2) はＤＮＡ「スプリント（splint）」を用いるＲＮＡの環化（circularization
）を記載している。RNA molecules hybridized with RNA or DNA strands were linked. For example, ligation of RNA padlock probes hybridized with mRNA has been described by Brian Johnston (IBCs Fifth Annual Inte
rnational Conference on "Antisense: DNA and RNA Based Therapeutics," Fe
bruary 2-3, 1998, Coronado, CA). Moore and Sharpe, Science 256: 922 (199
2) is the circularization of RNA using DNA "splint"
) Is described.

【０００６】 ライゲーションを含むＲＮＡ検出および増幅技術の効率を改善することは有用
であろう。It would be useful to improve the efficiency of RNA detection and amplification techniques, including ligation.

【０００７】 したがって本発明の課題は、ＲＮＡ配列のライゲーション媒介性の検出を可能
にする技術を提供することである。The object of the present invention is therefore to provide a technique allowing the ligation-mediated detection of RNA sequences.

【０００８】 本発明のさらなる課題は、ＲＮＡ配列のライゲーション媒介性の増幅を可能に
する技術を提供することである。A further object of the present invention is to provide a technique that allows ligation-mediated amplification of RNA sequences.

【０００９】 本発明のさらなる課題は、ＲＮＡ配列のライゲーション依存性検出を可能にす
る技術を提供することである。A further object of the present invention is to provide a technique that allows ligation-dependent detection of RNA sequences.

【００１０】 本発明のさらなる課題は、ＲＮＡ配列のライゲーション依存性増幅を可能にす
る技術を提供することである。A further object of the present invention is to provide a technique that allows ligation-dependent amplification of RNA sequences.

【００１１】 本発明のさらなる課題は、ＲＮＡ配列のライゲーション媒介性またはライゲー
ション依存性の増幅および検出を可能にする技術を提供することである。A further object of the invention is to provide a technique which allows ligation-mediated or ligation-dependent amplification and detection of RNA sequences.

【００１２】 本発明のさらなる課題は、ＲＮＡ発現レベルの定量的分析のための、ＲＮＡ配
列のライゲーション媒介性またはライゲーション依存性の増幅および検出を可能
にする技術を提供することである。[0012] A further object of the present invention is to provide a technique that enables ligation-mediated or ligation-dependent amplification and detection of RNA sequences for the quantitative analysis of RNA expression levels.

【００１３】 発明の要旨 ＲＮＡストランドとハイブリダイズされたＤＮＡストランドをＴ４ＲＮＡリガ
ーゼにより連結することが絡む、核酸の検出、核酸の増幅、または両者に関する
技術を開示する。これらの技術は、ＲＮＡ配列の検出および、ＲＮＡ配列からの
、あるいはＲＮＡ配列に依存する核酸の増幅に関して特に有用である。多くの既
知のライゲーションに基づく検出および増幅技術は、ＤＮＡストランドまたはＤ
ＮＡ末端に対して作用するＴ４ＲＮＡリガーゼを使用することにより改善される
。このような技術には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖
反応（ＲＴＰＣＲ）と組み合わされたライゲーション、ライゲーション媒介性ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＬＭＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応／ライゲーション検
出反応（ＰＣＲ／ＬＤＲ）、ライゲーション依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＤ
−ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、増幅時ラ
イゲーション（ligation-during-amplification、ＬＤＡ）、およびパドロック
プローブ、開環プローブ、および他の環化可能プローブのライゲーション、およ
び反復性ギャップライゲーション（ＩＧＬ）が含まれる。SUMMARY OF THE INVENTION Disclosed is a technique relating to nucleic acid detection, nucleic acid amplification, or both involving ligation of a DNA strand hybridized with an RNA strand by T4 RNA ligase. These techniques are particularly useful for the detection of RNA sequences and the amplification of nucleic acids from or dependent on RNA sequences. Many known ligation-based detection and amplification techniques rely on DNA strands or D
It is improved by using T4 RNA ligase acting on the NA terminus. Such techniques include ligase chain reaction (LCR), ligation combined with reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR), ligation mediated polymerase chain reaction (LMPCR), polymerase chain reaction / ligation detection reaction (PCR / LDR). , Ligation-dependent polymerase chain reaction (LD
-PCR), oligonucleotide ligation assay (OLA), ligation-during-amplification (LDA), and ligation of padlock probes, ring-opening probes and other circularizable probes, and repetitive gap ligation (IGL). ) Is included.

【００１４】 好ましい技術は、標的核酸がＲＮＡである開環プローブ（U.S. Patent No. 5,
854,033 to Lizardi を参照；これはパドロックプローブとしても知られる；Nil
sson et al., Science 265:2085-2088 (1994) を参照）の標的媒介性ライゲーシ
ョンである。これは次いで、連結された開環プローブのローリングサークル増幅
（ＲＣＡ）に付され、標的依存性核酸増幅を生じさせることができる。指数関数
的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）はさらに多くの増幅を提供できる。A preferred technique is a ring-opening probe (US Patent No. 5, wherein the target nucleic acid is RNA).
854,033 to Lizardi; also known as padlock probe; Nil
sson et al., Science 265: 2085-2088 (1994)). This can then be subjected to rolling circle amplification (RCA) of the ligated open ring probe, resulting in target-dependent nucleic acid amplification. Exponential rolling circle amplification (ERCA) can provide even more amplification.

【００１５】 ＲＮＡストランドとハイブリダイズされた核酸ストランドのＤＮＡ末端をＴ４
ＲＮＡリガーゼが効率的に連結できることが発見された。特に、このライゲーシ
ョンはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行われる同一のライゲーションより効率的で
ある。したがって、ＲＮＡとハイブリダイズされた核酸ストランドのＤＮＡ末端
のライゲーションを含む技術は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いることによってより
効率的に行うことができる。The DNA end of the nucleic acid strand hybridized with the RNA strand is labeled with T4.
It was discovered that RNA ligase can be ligated efficiently. In particular, this ligation is more efficient than the same ligation performed with T4 DNA ligase. Thus, techniques involving ligation of the DNA ends of nucleic acid strands hybridized with RNA can be performed more efficiently by using T4 RNA ligase.

【００１６】 発明の詳しい説明 開示されている技術には、Ｔ４ＲＮＡリガーゼの使用が関与する。Ｔ４ＲＮＡ
リガーゼは、ＲＮＡストランドとハイブリダイズされた核酸ストランドのＤＮＡ
末端を効率的に連結できることが発見された。驚くべきことに、このライゲーシ
ョンはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行われる同一のライゲーションより効率的で
ある。したがって、ＲＮＡとハイブリダイズされた核酸ストランドのＤＮＡ末端
のライゲーションを含む技術は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いてより効率的に行う
ことができる。この発見は、ＲＮＡとハイブリダイズされたＤＮＡプローブ、プ
ライマー、およびオリゴヌクレオチドの有効な使用を初めて可能にするものであ
り、この技術にはライゲーションが関与する。実施例は、ＲＮＡストランドとハ
イブリダイズされたＤＮＡストランド末端のライゲーションが有効で効率的であ
ることを具体的に示している。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる同一の手順は、有意
に有効性が低い。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The disclosed technology involves the use of T4 RNA ligase. T4 RNA
Ligase is DNA of nucleic acid strands hybridized with RNA strands.
It has been discovered that the ends can be efficiently linked. Surprisingly, this ligation is more efficient than the same ligation performed with T4 DNA ligase. Thus, techniques involving ligation of the DNA ends of nucleic acid strands hybridized with RNA can be performed more efficiently using T4 RNA ligase. This discovery, for the first time, makes possible the efficient use of DNA probes, primers, and oligonucleotides hybridized with RNA, the technique involving ligation. The examples demonstrate that ligation of the ends of DNA strands hybridized with RNA strands is effective and efficient. The same procedure with T4 DNA ligase is significantly less effective.

【００１７】 ＲＮＡストランドとハイブリダイズされたＤＮＡストランドをＴ４ＲＮＡリガ
ーゼにより連結することが絡む、核酸の検出、核酸の増幅、または両者に関する
技術を開示する。これらの技術は、ＲＮＡ配列の検出および、ＲＮＡ配列からの
、あるいはＲＮＡ配列に依存する核酸の増幅に関して特に有用である。多くの既
知のライゲーションに基づく検出および増幅技術は、ＤＮＡストランドまたはＤ
ＮＡ末端に作用するＴ４ＲＮＡリガーゼを使用することにより改善される。この
ような技術には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Wiedmann et al., PCR Methods A
ppl. 3(4):S51-64(1994); Lee, Biologicals 24(3):197-199 (1996); Laffler e
t al., Ann Biol Clin (Paris) 51(9):821-826 (1993); U.S. Pat. No. 5,516,6
63 to Backman et al.）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わされたライゲ
ーション（ＲＴＰＣＲ；U.S. Pat. No. 5,187,060 to Cerruti et al.）、ライ
ゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭＰＣＲ；Becker and Mahler, Ant
isense Nucleic Acid Drug Dev. 9:313-319 (1999); Rodriguez and Akman, Ele
ctrophoresis 19:646-652 (1998)）、ポリメラーゼ連鎖反応／ライゲーション検
出反応（ＰＣＲ／ＬＤＲ；Zirvi et al., Nucleic Acids Res. 27: e40 (1999);
U.S. Pat. No. 6,027,889 to Barany et al.; U.S. Pat. No. 5,912, 148 to E
ggerding）、ライゲーション依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＤ−ＰＣＲ；Park
et al., Am J Pathol 149(5):1485-1491 (1996)）、オリゴヌクレオチドライゲ
ーションアッセイ（ＯＬＡ；Tobe et al., Nucleic Acids Res. 24:3728-3732 (
1996); Gasparini et al., J. Med. Screen. 6:67-69 (1999)）、増幅時ライゲ
ーション（ＬＤＡ；Chen and Ruffner, Nucleic Acids Res. 26:1126-1127 (199
8)）、および、パドロックプローブ（Nilsson et al., Science 265:2085-2088
(1994); Baner et al., Nucleic Acids Res. 26:5073-5078 (1998); Thomas et
al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123:1170-1176 (1999)）、開環プローブ（U.S.
Patent No. 5,854,033 to Lizardi）、および他の環化可能プローブ（Zhang et
al., Gene 211:277-285 (1998)）のライゲーション、反復性ギャップライゲーシ
ョン（ＩＧＬ；Stewart et al., Nucleic Acids Res. 26:961-966 (1998)）、お
よびライゲーションが関与する他の技術（Stefano et al., Mol. Cell Probes 1
1:407-426 (1997); U.S. Pat. No. 6,025,139 to Yager et al.; U.S. Pat. No.
6,020,138 to Akhaven-Tafti; U.S. Pat. No. 5,998,175 to Akhaven-Tafti; U
.S. Pat. No. 5,962,223 to Whiteley et al.; U.S. Pat. No. 5,959,095 to Ma
rtinelli et al.; U.S. Pat. No. 5,942,609 to Hunkapiller et al.; U.S. Pat
. No. 5,888,731 to Yager et al.; U.S. Pat. No. 5,871,914 to Nathan; U.S.
Pat. No. 5,800,994 to Martinelli et al.; U.S. Pat. No. 5,770,408 to Sat
o）が含まれる。Disclosed are techniques relating to nucleic acid detection, nucleic acid amplification, or both involving ligation of RNA strands and hybridized DNA strands with T4 RNA ligase. These techniques are particularly useful for the detection of RNA sequences and the amplification of nucleic acids from or dependent on RNA sequences. Many known ligation-based detection and amplification techniques rely on DNA strands or D
It is improved by using T4 RNA ligase acting on the NA terminus. Such techniques include ligase chain reaction (LCR; Wiedmann et al., PCR Methods A).
ppl. 3 (4): S51-64 (1994); Lee, Biologicals 24 (3): 197-199 (1996); Laffler e
t al., Ann Biol Clin (Paris) 51 (9): 821-826 (1993); US Pat. No. 5,516,6
63 to Backman et al.), Ligation combined with reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR; US Pat. No. 5,187,060 to Cerruti et al.), Ligation mediated polymerase chain reaction (LMPCR; Becker and Mahler, Ant).
isense Nucleic Acid Drug Dev. 9: 313-319 (1999); Rodriguez and Akman, Ele
ctrophoresis 19: 646-652 (1998)), polymerase chain reaction / ligation detection reaction (PCR / LDR; Zirvi et al., Nucleic Acids Res. 27: e40 (1999);
US Pat. No. 6,027,889 to Barany et al .; US Pat. No. 5,912, 148 to E
ggerding), ligation-dependent polymerase chain reaction (LD-PCR; Park
et al., Am J Pathol 149 (5): 1485-1491 (1996)), an oligonucleotide ligation assay (OLA; Tobe et al., Nucleic Acids Res. 24: 3728-3732 (
1996); Gasparini et al., J. Med. Screen. 6: 67-69 (1999)), ligation during amplification (LDA; Chen and Ruffner, Nucleic Acids Res. 26: 1126-1127 (199).
8)) and a padlock probe (Nilsson et al., Science 265: 2085-2088).
(1994); Baner et al., Nucleic Acids Res. 26: 5073-5078 (1998); Thomas et
al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123: 1170-1176 (1999)), ring-opening probe (US
Patent No. 5,854,033 to Lizardi), and other cyclizable probes (Zhang et
al., Gene 211: 277-285 (1998)), repetitive gap ligation (IGL; Stewart et al., Nucleic Acids Res. 26: 961-966 (1998)), and other techniques involving ligation. (Stefano et al., Mol. Cell Probes 1
1: 407-426 (1997); US Pat.No. 6,025,139 to Yager et al .; US Pat.No.
6,020,138 to Akhaven-Tafti; US Pat. No. 5,998,175 to Akhaven-Tafti; U
.S. Pat. No. 5,962,223 to Whiteley et al .; US Pat. No. 5,959,095 to Ma
rtinelli et al .; US Pat. No. 5,942,609 to Hunkapiller et al .; US Pat
No. 5,888,731 to Yager et al .; US Pat. No. 5,871,914 to Nathan; US
Pat. No. 5,800,994 to Martinelli et al .; US Pat. No. 5,770,408 to Sat
o) is included.

【００１８】 これらの方法は、連結されるＤＮＡ型プローブ、プライマー、オリゴヌクレオ
チド、またはストランドを用い、この連結されるＤＮＡプローブ、プライマー、
オリゴヌクレオチド、またはストランドに対するハイブリダイゼーション基質と
してＲＮＡを用い、そしてＴ４ＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行うこ
とにより、開示されている方法での使用に適合させることができる。These methods use DNA-type probes, primers, oligonucleotides or strands to be ligated,
The use of RNA as the hybridization substrate for the oligonucleotide or strand and ligation with T4 RNA ligase can be adapted for use in the disclosed method.

【００１９】 好ましい技術は、標的核酸がＲＮＡである開環プローブの標的媒介性ライゲー
ションである。これは次いで、連結された開環プローブのローリングサークル増
幅（ＲＣＡ）に付され、標的依存性核酸増幅を生じさせることができる。指数関
数的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）はさらに多くの増幅を提供できる。A preferred technique is target-mediated ligation of ring-opening probes where the target nucleic acid is RNA. This can then be subjected to rolling circle amplification (RCA) of the ligated open ring probe, resulting in target-dependent nucleic acid amplification. Exponential rolling circle amplification (ERCA) can provide even more amplification.

【００２０】 材料 Ａ．Ｔ４ＲＮＡリガーゼ 開示されている方法はＴ４ＲＮＡリガーゼを用いる。Ｔ４ＲＮＡリガーゼはＲ
ＮＡストランドとハイブリダイズされた核酸ストランドのＤＮＡ末端を効率的に
連結可能であることが発見された。Ｔ４ＲＮＡリガーゼはよく特徴付けされてお
り、市販されている。Material A. T4 RNA Ligase The disclosed method uses T4 RNA ligase. T4 RNA ligase is R
It was discovered that the DNA ends of nucleic acid strands hybridized with NA strands can be efficiently ligated. T4 RNA ligase is well characterized and is commercially available.

【００２１】 Ｂ．ＤＮＡプローブ 開示されている方法には、ＲＮＡストランドとハイブリダイズされている２核
酸ストランドのライゲーションが関与する。連結されるこの核酸ストランドは、
本明細書中ではＤＮＡプローブと称する。開示されているＤＮＡプローブの重要
な側面は、このＤＮＡプローブの３’−および５’−末端ヌクレオチドがデオキ
シリボヌクレオチドであることである。B. DNA Probe The disclosed method involves the ligation of two nucleic acid strands that are hybridized with an RNA strand. This nucleic acid strand to be ligated is
In the present specification, it is referred to as a DNA probe. An important aspect of the disclosed DNA probe is that the 3'- and 5'-terminal nucleotides of this DNA probe are deoxyribonucleotides.

【００２２】 連結される核酸分子をＤＮＡプローブと称するのは、単に容易に参照するため
であり、このストランドがプローブとして用いられることを必要とすることを意
図しない。開示されているＤＮＡプローブが連結される種々の方法においては、
連結されたストランドがプローブ、プライマー、検出可能タグ、核酸増幅用基質
、捕獲または固定化部分、および多数の他の機能物として働くことが様々に必要
とされることが理解される。一般に、ＤＮＡプローブ（すなわち連結されるスト
ランド）の設計は採用する方法の必要性にしたがう。このような必要性は当技術
分野において既知である。開示されているＤＮＡプローブの重要な側面は、この
ＤＮＡプローブの３’−および５’−末端ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオ
チドであることである。The nucleic acid molecule to be ligated is referred to as a DNA probe for ease of reference only and is not intended to require this strand to be used as a probe. In various methods in which the disclosed DNA probes are ligated,
It is understood that it is variously required that the linked strands act as probes, primers, detectable tags, nucleic acid amplification substrates, capture or immobilization moieties, and numerous other functionalities. In general, the design of the DNA probe (ie the strand to be ligated) depends on the needs of the method employed. Such a need is known in the art. An important aspect of the disclosed DNA probe is that the 3'- and 5'-terminal nucleotides of this DNA probe are deoxyribonucleotides.

【００２３】 右および左プローブは単一分子、例えばオリゴヌクレオチドの部分であり、各
プローブはこの分子の一端として作用する。好ましい例は開環プローブであり、
右標的プローブ部分は右プローブであり、左標的プローブ部分は左プローブであ
る。開環プローブはローリングサークル増幅に関するセクションに詳細に記載さ
れている。The right and left probes are parts of a single molecule, eg an oligonucleotide, each probe acting as one end of this molecule. A preferred example is a ring-opening probe,
The right target probe portion is the right probe and the left target probe portion is the left probe. Ring-opening probes are described in detail in the section on rolling circle amplification.

【００２４】 Ｃ．ＲＮＡ標的 本明細書中で用いられる、ＲＮＡ標的とは、開示されているＤＮＡプローブが
ライゲーション用にハイブリダイズされているＲＮＡ分子である。開示されてい
る方法において任意のＲＮＡ分子をＲＮＡ標的として用いることができる。好ま
しいＲＮＡ標的は、天然に存在するＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ウイルスＲＮ
Ａ、およびリボソームＲＮＡである。C. RNA Target As used herein, an RNA target is an RNA molecule to which the disclosed DNA probe has been hybridized for ligation. Any RNA molecule can be used as an RNA target in the disclosed methods. Preferred RNA targets are naturally occurring RNA molecules such as mRNA, viral RN.
A, and ribosomal RNA.

【００２５】 標的ＲＮＡは、任意のソース由来であってよい。例えば標的ＲＮＡはｍＲＮＡ
サンプル、核酸ライブラリー、細胞、培養、組織、体液、尿、血清、生検サンプ
ル、および環境サンプルから得られる。多数の他のＲＮＡソースが既知であるか
、あるいは作成可能であり、任意のものが開示されている方法とともに使用可能
である。任意のＲＮＡサンプルを開示されている方法における標的サンプルとし
て用いることができる。適当な標的サンプルの例には、ｍＲＮＡサンプル、核酸
ライブラリー、全細胞サンプル、環境サンプル、培養サンプル、組織サンプル、
体液、尿サンプル、血清サンプル、および生検サンプルが含まれる。多数の他の
ソースの標的サンプルが既知であるか、あるいは開発可能であり、任意のものが
開示されている方法とともに使用可能である。The target RNA may be from any source. For example, the target RNA is mRNA
Obtained from samples, nucleic acid libraries, cells, cultures, tissues, body fluids, urine, serum, biopsy samples, and environmental samples. Many other RNA sources are known or can be created and any can be used with the disclosed methods. Any RNA sample can be used as a target sample in the disclosed method. Examples of suitable target samples include mRNA samples, nucleic acid libraries, whole cell samples, environmental samples, culture samples, tissue samples,
Includes body fluids, urine samples, serum samples, and biopsy samples. Numerous other source target samples are known or can be developed and any can be used with the disclosed methods.

【００２６】 Ｄ．固形ＤＮＡプローブ ＤＮＡプローブは基質とカップリングさせることができる。そのようにするこ
とは、（ライゲーションを介する）他のＤＮＡプローブの捕獲、反応物または反
応生成物の固定化（これによりアッセイ時に試薬および反応物を容易に洗浄でき
、ならびに連結されたプローブの同定または検出が補助される）を含む種々の目
的のために有用である。D. Solid DNA probe The DNA probe can be coupled to a substrate. Doing so allows capture of other DNA probes (via ligation), immobilization of reactants or reaction products, which facilitates washing of reagents and reactants during the assay, and identification of ligated probes. Or is assisted in detection).

【００２７】 ＤＮＡプローブを結合させることができる固形基質には、オリゴヌクレオチド
を、直接的または間接的にカップリングさせることが可能な任意の固形材料が含
まれる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、
ポリスチレン、ポリエチレン、ビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタク
リレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート（po
lysilicates）、ポリカルボナート、テフロン、フルオロ炭素、ナイロン、シリ
コンラバー（silicon rubber）、ポリアンヒドライド（polyanhydrides）、ポリ
グリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート（poly
propylfumerate）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸が
含まれる。固形基質は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、皿、ファイバ
ー、織繊維、成型ポリマー（shaped polymer）、粒子および微粒子を含む任意の
有用な形態を有してよい。固形基質に関して好ましい形態は、平面（flat surfa
ces）およびビーズ、特にマグネティックビーズである。Solid substrates to which DNA probes can be attached include any solid material to which oligonucleotides can be coupled, directly or indirectly. This includes acrylamide, cellulose, nitrocellulose, glass,
Polystyrene, polyethylene, vinyl acetate, polypropylene, polymethacrylate, polyethylene, polyethylene oxide, glass, polysilicate (po
lysilicates), polycarbonate, Teflon, fluorocarbon, nylon, silicon rubber, polyanhydrides, polyglycolic acid, polylactic acid, polyorthoester, polypropyl fumarate (poly
propylfumerate), collagen, glycosaminoglycans, and polyamino acids. Solid substrates may have any useful form including thin films or membranes, beads, bottles, plates, fibers, woven fibers, shaped polymers, particles and microparticles. The preferred form for solid substrates is the flat surfa
ces) and beads, especially magnetic beads.

【００２８】 オリゴヌクレオチドを固形基質に固定化する方法は十分に確立されている。Ｄ
ＮＡプローブは確立されたカップリング方法を用いて基質とカップリングさせる
ことができる。例えば適当な結合方法は、Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 91(11):5022-5026(1994) 、および Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (
USSR) 25:718-730(1991) に記載されている。３’−アミンオリゴヌクレオチド
をカゼインでコーティングされたスライドグラスに固定化する方法は、Stimpson
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383(1995) に記載されている
。オリゴヌクレオチドを固形基質に結合する好ましい方法は、Guo et al., Nucl
eic Acids Res. 22:5456-5465(1994) に記載されている。Methods for immobilizing oligonucleotides on solid substrates are well established. D
The NA probe can be coupled to the substrate using established coupling methods. For example, a suitable conjugation method is Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 91 (11): 5022-5026 (1994), and Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (
USSR) 25: 718-730 (1991). A method for immobilizing 3′-amine oligonucleotides on casein-coated slides is described in Stimpson.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379-6383 (1995). A preferred method of attaching oligonucleotides to solid substrates is Guo et al., Nucl.
eic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994).

【００２９】 固形基質上でオリゴヌクレオチドのアレイを作成する方法もまた既知である。
このような技術の例は、U.S. Patent No. 5,871,928 to Fodor et al., U.S. Pa
tent No. 5,54,413, U.S. Patent No. 5,429,807, および U.S. Patent No. 5,5
99,695 to Pease et al. に記載されている。Methods for making arrays of oligonucleotides on solid substrates are also known.
Examples of such techniques are described in US Patent No. 5,871,928 to Fodor et al., US Pa.
tent No. 5,54,413, US Patent No. 5,429,807, and US Patent No. 5,5
99,695 to Pease et al.

【００３０】 記載されているＤＮＡプローブのアレイは単一ユニットまたは構造であるのが
好ましいが、これが必要とされるわけではない。プローブのセットは任意の数の
固形支持体にわたって分配することができる。例えば、極端な例では、各プロー
ブは別々の試験管、コンテナー、またはビーズに固定化してもよい。The array of DNA probes described is preferably a single unit or structure, although this is not required. The set of probes can be distributed over any number of solid supports. For example, in the extreme case, each probe may be immobilized in a separate test tube, container, or bead.

【００３１】 Ｅ．固形標的 ＲＮＡ標的は基質とカップリングさせることができる。そのようにすることは
、反応物または反応生成物の固定化（これによりアッセイ時に試薬および反応物
を簡単に洗浄でき、連結されたプローブの同定または検出が補助され、ならびに
複数のサンプルを同時にアッセイすることがより容易になる）を含む種々の目的
のために有用である。E. Solid Target RNA target can be coupled to a substrate. Doing so will immobilize the reactants or reaction products, which will allow easy washing of reagents and reactants during the assay, assist in the identification or detection of linked probes, and will allow multiple samples to be assayed simultaneously. Is easier to do).

【００３２】 ＲＮＡ標的を結合させることができる固形基質は、核酸を、直接的または間接
的に結合、接着、またはカップリングさせることが可能な任意の固形材料を含み
得る。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポ
リスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレ
ート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカ
ルボナート、テフロン、フルオロ炭素、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒ
ドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフ
マレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような材
料が含まれる。固形基質は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、皿、ファ
イバー、織繊維、成型ポリマー、粒子および微粒子を含む任意の有用な形態を有
してよい。固形基質に関して好ましい形態は、平面およびビーズ、特にマグネテ
ィックビーズである。Solid substrates capable of binding RNA targets can include any solid material capable of binding, adhering, or coupling nucleic acids, either directly or indirectly. This includes acrylamide, cellulose, nitrocellulose, glass, polystyrene, polyethylene vinyl acetate, polypropylene, polymethacrylate, polyethylene, polyethylene oxide, glass, polysilicate, polycarbonate, Teflon, fluorocarbon, nylon, silicone rubber, polyanhydride. Materials such as rides, polyglycolic acid, polylactic acid, polyorthoesters, polypropyl fumarate, collagen, glycosaminoglycans, and polyamino acids are included. Solid substrates may have any useful form including thin films or membranes, beads, bottles, plates, fibers, woven fibers, molded polymers, particles and microparticles. Preferred forms for solid substrates are flat surfaces and beads, especially magnetic beads.

【００３３】 核酸を固形基質に固定化する方法は十分に確立されている。一般に、ＲＮＡ標
的は、ＲＮＡ標的を含む核酸サンプルまたは他のサンプルの部分として基質上に
固定化できる。ＲＮＡ標的は確立されたカップリング方法を用いて基質とカップ
リングさせることができる。例えば適当な結合方法は、Pease et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026(1994), Guo et al., Nucleic Acids Res
. 22:5456-5465(1994), and Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25:718-
730 (1991) に記載されている。３’−アミンオリゴヌクレオチドをカゼインで
コーティングされたスライドガラスに固定化する方法は、Stimpson et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383(1995) に記載されている。Methods for immobilizing nucleic acids on solid substrates are well established. Generally, the RNA target can be immobilized on a substrate as part of a nucleic acid sample or other sample containing the RNA target. The RNA target can be coupled to the substrate using established coupling methods. For example, a suitable conjugation method is Pease et al., Proc.
tl. Acad. Sci. USA 91 (11): 5022-5026 (1994), Guo et al., Nucleic Acids Res
.22: 5456-5465 (1994), and Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25: 718-
730 (1991). Methods for immobilizing 3'-amine oligonucleotides on casein-coated glass slides are described by Stimpson et al., Pro.
c. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379-6383 (1995).

【００３４】 固形基質上で核酸のアレイを作成する方法もまた既知である。このような技術
の例は、U.S. Patent No. 5,871,928 to Fodor et al., U.S. Patent No. 5,54,
413, U.S. Patent No. 5,429,807, および U.S. Patent No. 5,599,695 to Peas
e et al. に記載されている。ＲＮＡ標的のマイクロアレイは例えば Schena et
al., Science 270:487-470 (1995) に記載されている方法を用いて作成できる。Methods for making arrays of nucleic acids on solid substrates are also known. Examples of such techniques are described in US Patent No. 5,871,928 to Fodor et al., US Patent No. 5,54,
413, US Patent No. 5,429,807, and US Patent No. 5,599,695 to Peas
e et al. Microarrays of RNA targets are described, for example, by Schena et
It can be prepared using the method described in al., Science 270: 487-470 (1995).

【００３５】 ＲＮＡ標的のアレイは単一ユニットまたは構造であるのが好ましいが、これが
必要とされるわけではない。プローブのセットは任意の数の固形支持体にわたっ
て分配することができる。例えば、極端な例では、各ＲＮＡ標的または各核酸サ
ンプルは別々の試験管、コンテナー、またはビーズに固定化してもよい。The array of RNA targets is preferably a single unit or structure, although this is not required. The set of probes can be distributed over any number of solid supports. For example, in the extreme case, each RNA target or each nucleic acid sample may be immobilized in a separate tube, container, or bead.

【００３６】 Ｆ．検出ラベル 連結されたＤＮＡプローブの検出および定量を補助するために、ラベルをＤＮ
Ａプローブに包含させるか、あるいはＤＮＡプローブとカップリングさせること
ができる。ラベルはＤＮＡプローブと直接的または間接的に結合可能な任意の分
子であり、測定可能、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じるもので
ある。核酸に包含させるか、あるいは核酸とカップリングさせるための多数のこ
のようなラベルが知られている。開示されている方法において使用するのに適当
なラベルの例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光性分子、酵素、抗体、および
リガンドである。F. Detection Label A label was added to the DN to aid in the detection and quantification of the ligated DNA probe.
It can be included in the A probe or coupled with the DNA probe. A label is any molecule capable of binding, directly or indirectly, to a DNA probe, which directly or indirectly produces a measurable, detectable signal. Many such labels are known for inclusion in or coupling with nucleic acids. Examples of labels suitable for use in the disclosed method are radioisotopes, fluorescent molecules, phosphorescent molecules, enzymes, antibodies, and ligands.

【００３７】 適当な蛍光ラベルの例には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキ
シメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３
−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミ
ン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（4'-6-diamidino-2-pheny
linodole、ＤＡＰＩ）、およびシアニン色素 Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃ
ｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。好ましい蛍光ラベルはフルオレセイン（５−
カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびロ
ーダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。同時検出用に好ましい蛍
光ラベルはＦＩＴＣおよびシアニン色素 Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５
．５およびＣｙ７である。これらの蛍光物（fluors）に関する吸収および放出最
大値はそれぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；
５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；
６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎ
ｍ；７７８ｎｍ）であり、したがってこれらは同時に検出可能である。蛍光ラベ
ルは種々の販売元、例えば Molecular Probes, Eugene, OR and Research Organ
ics, Cleveland, Ohio から入手できる。Examples of suitable fluorescent labels include fluorescein (FITC), 5,6-carboxymethylfluorescein, Texas Red, Nitrobenz-2-oxa-1,3.
-Diazol-4-yl (NBD), coumarin, dansyl chloride, rhodamine, 4'-6-diamidino-2-phenylindole (4'-6-diamidino-2-pheny
linodole, DAPI), and cyanine dyes Cy3, Cy3.5, Cy5, C
Includes y5.5 and Cy7. A preferred fluorescent label is fluorescein (5-
Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester) and rhodamine (5,6-tetramethylrhodamine). Preferred fluorescent labels for simultaneous detection are FITC and the cyanine dyes Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.
． 5 and Cy7. The absorption and emission maxima for these fluors are respectively: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm;
568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm;
672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) and Cy7 (755n).
m; 778 nm) and thus they can be detected simultaneously. Fluorescent labels are available from various vendors, such as Molecular Probes, Eugene, OR and Research Organ.
Available from ics, Cleveland, Ohio.

【００３８】 ラベルされたヌクレオチドは合成時に直接ＤＮＡプローブに包含させることが
できるので、好ましいラベル形態である。ＤＮＡまたはＲＮＡに包含させること
ができるラベルの例には、ヌクレオチドアナログ、例えばＢｒｄＵｒｄ（Hoy an
d Schimke, Mutation Research 290:217-230(1993)）、ＢｒＵＴＰ（Wansick et
al., J. Cell Biology 122:283-293(1993)）および、ビオチン（Langer et al,.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633(1981)）または適当なハプテン、例えば
ジゴキシゲニン（Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364(1992)）で修飾された
ヌクレオチドが含まれる。適当な蛍光ラベルされたヌクレオチドはフルオレセイ
ンイソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５
−ｄＵＴＰ（Yu et al., Nucleic Acids Res., 22:3226-3232(1994)）である。
ＤＮＡに関する好ましいヌクレオチドアナログ検出ラベルはＢｒｄＵｒｄ（ＢＵ
ＤＲトリホスフェート、Sigma）であり、ならびにＲＮＡに関する好ましいヌク
レオチドアナログ検出ラベルはビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェ
ート（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Boehringher Mannheim）である。フルオレセ
イン、Ｃｙ３、およびＣｙ５は直接のラベル化用にｄＵＴＰに連結することがで
きる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニンラベル化プ
ローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利
用できる。Labeled nucleotides are a preferred form of label because they can be incorporated directly into a DNA probe during synthesis. Examples of labels that can be included in DNA or RNA include nucleotide analogs such as BrdUrd (Hoy an
d Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)), BrUTP (Wansick et
al., J. Cell Biology 122: 283-293 (1993)) and biotin (Langer et al ,.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)) or a suitable hapten such as digoxigenin (Kerkhof, Anal. Biochem. 205: 359-364 (1992)) modified nucleotides. Suitable fluorescently labeled nucleotides are fluorescein isothiocyanate-dUTP, cyanine-3-dUTP and cyanine-5.
-DUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res., 22: 3226-3232 (1994)).
The preferred nucleotide analog detection label for DNA is BrdUrd (BU
DR triphosphate, Sigma), and a preferred nucleotide analog detection label for RNA is biotin-16-uridine-5'-triphosphate (biotin-16-dUTP, Boehringher Mannheim). Fluorescein, Cy3, and Cy5 can be linked to dUTP for direct labeling. Cy3.5 and Cy7 are available as avidin or anti-digoxigenin conjugates for secondary detection of biotin- or digoxigenin labeled probes.

【００３９】 核酸に包含されるラベル、例えばビオチンは、当分野に周知の鋭敏な方法を用
いて後に検出可能である。例えばビオチンは、ビオチンと結合した後、適当な基
質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム、３−(４−メトキシスピロ
−[１，２−ジオキセタン−３−２’−(５’−クロロ)トリシクロ[３．３．１．
１^３，７]デカン]−４−イル)フェニルホスフェート；Tropix, Inc.）の化学発
光によって検出できるストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲ
ート（Tropix,Inc.）を用いて検出できる。The label included in the nucleic acid, eg biotin, can later be detected using sensitive methods well known in the art. For example, biotin is bound to biotin and then bound to a suitable substrate (eg, chemiluminescent substrate CSPD: disodium, 3- (4-methoxyspiro- [1,2-dioxetane-3-2 '-(5'-chloro). Tricyclo [3.3.1.
1 ^3,7 ] decane] -4-yl) phenyl phosphate; Tropix, Inc.) can be detected using a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (Tropix, Inc.).

【００４０】 ラベルによって生じるシグナルを検出および測定する方法は既知である。例え
ば放射性同位体はシンチレーションカウントまたは直接の可視化によって検出可
能であり；蛍光分子は蛍光測光器を用いて検出可能であり；リン光性分子は測光
器を用いて検出でき、あるいはカメラを用いて直接可視化でき；酵素は、その酵
素によって触媒される反応の生成物の検出または可視化により検出可能であり；
抗体は、その抗体とカップリングされた二次検出ラベルを検出することにより検
出可能である。このような方法は、開示されている増幅および検出方法において
直接用いることができる。本明細書中で用いられる、検出分子とは、増幅された
核酸と相互作用する分子であって、１またはそれ以上の検出ラベルがカップリン
グされている分子である。Methods of detecting and measuring the signal produced by the label are known. For example radioisotopes can be detected by scintillation counting or direct visualization; fluorescent molecules can be detected using a fluorescence photometer; phosphorescent molecules can be detected using a photometer or directly using a camera Can be visualized; the enzyme is detectable by detection or visualization of the product of the reaction catalyzed by the enzyme;
The antibody can be detected by detecting a secondary detection label coupled to the antibody. Such methods can be used directly in the disclosed amplification and detection methods. As used herein, a detection molecule is a molecule that interacts with amplified nucleic acid and has one or more detection labels coupled to it.

【００４１】 Ｇ．捕獲タグ 捕獲タグは、捕獲タグを有する化合物または複合体を捕獲タグを有していない
ものから分離するのに用いることができる任意の化合物である。好ましくは、捕
獲タグは、別の化合物、例えばリガンド結合分子または抗体と結合するか、ある
いは相互作用するリガンドまたはハプテンのような化合物である。また、捕獲タ
グと捕獲する成分との間のそのような相互作用は、ハプテンと抗体またはリガン
ドとリガンド結合分子間のような特異的相互作用であるのが好ましい。G. Capture Tag A capture tag is any compound that can be used to separate a compound or complex with a capture tag from one without a capture tag. Preferably, the capture tag is a compound such as a ligand or hapten that binds or interacts with another compound, eg, a ligand binding molecule or antibody. Also, preferably such interaction between the capture tag and the capturing component is a specific interaction such as between the hapten and the antibody or the ligand and the ligand binding molecule.

【００４２】 核酸プローブに関して記載される好ましい捕獲タグは、Syvnen et al., Nucle
ic Acids Res., 14:5037(1986) に記載されている。好ましい捕獲タグには、核
酸に包含させることができるビオチンが含まれる。開示されている方法において
、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡ標的に包含されている捕獲タグは該プローブまた
は標的が基質に捕獲され、接着され、あるいはカップリングされることを可能に
する。このような捕獲はプローブおよび標的を簡単に洗浄し、取り扱うこと可能
にし、この方法のすべてまたは部分を自動化することを可能にする。捕獲タグは
また、開示されている方法の特定の態様において他の特定の成分とともに用いる
ことができる。Preferred capture tags described for nucleic acid probes are Syvnen et al., Nucleus.
ic Acids Res., 14: 5037 (1986). Preferred capture tags include biotin, which can be incorporated into nucleic acids. In the disclosed method, the capture tag included in the DNA probe or RNA target allows the probe or target to be captured, attached, or coupled to a substrate. Such capture allows the probes and targets to be easily washed and handled, and all or part of the method to be automated. Capture tags can also be used with other specific components in certain aspects of the disclosed method.

【００４３】 基質上でのＤＮＡプローブまたはＲＮＡ標的の捕獲は、いくつかの方法によっ
て達成することができる。一態様では、捕獲ドックが、該基質と接着あるいはカ
ップリングされる。この捕獲ドックはプローブまたは標的上の捕獲タグと結合ま
たは相互作用することによってプローブまたは標的の接着を媒介する。基質上に
固定化された捕獲ドックは基質上のプローブまたは標的の捕獲を可能にする。こ
のような捕獲は、以後の工程を妨害するかもしれない反応成分を洗浄して除く簡
便な方法を提供する。The capture of DNA probe or RNA target on the substrate can be accomplished by several methods. In one aspect, the capture dock is adhered or coupled to the substrate. This capture dock mediates probe or target adhesion by binding or interacting with capture tags on the probe or target. The capture dock immobilized on the substrate allows capture of the probe or target on the substrate. Such capture provides a convenient way to wash away reaction components that may interfere with subsequent steps.

【００４４】 開示されている方法において使用するための基質は、アッセイの成分を接着ま
たはカップリングさせることが可能な任意の固形材料を含み得る。基質の例には
、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポ
リエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチ
レン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカルボナート、テフロン、
フルオロ炭素、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒドライド、ポリグリコー
ル酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、
グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸が含まれる。基質は薄いフィルムま
たは膜、ビーズ、ボトル、皿、ファイバー、織繊維、成型ポリマー、粒子および
微粒子を含む任意の有用な形態を有し得る。基質の好ましい形態はプレートおよ
びビーズである。ビーズの最も好ましい形態はマグネティックビーズである。Substrates for use in the disclosed methods can include any solid material capable of adhering or coupling the components of the assay. Examples of substrates include acrylamide, cellulose, nitrocellulose, glass, polystyrene, polyethylene vinyl acetate, polypropylene, polymethacrylate, polyethylene, polyethylene oxide, polysilicate, polycarbonate, Teflon,
Fluorocarbon, nylon, silicone rubber, polyanhydride, polyglycolic acid, polylactic acid, polyorthoester, polypropyl fumarate, collagen,
Glycosaminoglycans, and polyamino acids are included. The substrate can have any useful form including thin films or membranes, beads, bottles, dishes, fibers, woven fibers, molded polymers, particles and microparticles. Preferred forms of substrate are plates and beads. The most preferred form of beads is magnetic beads.

【００４５】 一態様では、捕獲ドックはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを
基質に固定およびカップリングする方法は十分に確立されている。例えば、適当
な結合方法は、Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026(
1994), および Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25:718-730(1991) に
よって記載されている。３’−アミンオリゴヌクレオチドをカゼインでコーティ
ングされたスライドガラスに固定化する方法は、Stimpson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92:6379-6383(1995) に記載されている。オリゴヌクレオチド
を固形基質に結合させる好ましい方法は、Guo et al., Nucleic Acids Res. 22:
5456-5465(1994) に記載されている。In one aspect, the capture dock is an oligonucleotide. Methods for immobilizing and coupling oligonucleotides to substrates are well established. For example, a suitable ligation method is Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (11): 5022-5026 (
1994), and Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25: 718-730 (1991). Methods for immobilizing 3'-amine oligonucleotides on casein-coated glass slides are described by Stimpson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 6379-6383 (1995). A preferred method of attaching oligonucleotides to solid substrates is Guo et al., Nucleic Acids Res. 22:
5456-5465 (1994).

【００４６】 別の態様では、捕獲ドックは、抗ハイブリッド抗体である。抗体を基質に固定
化する方法は十分に確立されている。固定化は、標準的固定化化学を用いる、例
えばアミノ化表面（surfaces）、カルボキシル化表面またはヒドロキシル化表面
への結合によって行うことができる。結合剤の例は、臭化シアン、スクシンイミ
ド、アルデヒド、トシルクロライド、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシ
ドおよびマレイミドである。好ましい結合剤はグルタルアルデヒドである。これ
らおよび他の結合剤、ならびに結合におけるその使用方法は、Protein immobili
zation: fundamentals and applications, Richard F. Taylor ed. (M.Dekker,
New York, 1991), Johnstone and Thorpe, Immunochemistry In Practice (Blac
kwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987) pages 209-216 and
241-242, および Immobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermanson et al.,
eds. (Academic Press, New York, 1992) に記載されている。抗体は、その抗
体上の遊離のアミノ基を基質内に存在する反応性側基に化学的に架橋することに
よって基質と結合させることができる。例えば抗体は、グルタルアルデヒドまた
はカルボジイミドを架橋剤として用いて遊離のアミノまたはカルボキシル基を含
有する基質と化学的に架橋することができる。この方法では、遊離の抗体を含有
する水溶液を、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固形基質と
インキュベートする。グルタルアルデヒドを用いる架橋に関して、反応物は、バ
ッファー溶液、例えば０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、２容量
％のグルタルアルデヒドとインキュベートすることができる。他の標準的固定化
化学は当業者に既知である。In another aspect, the capture dock is an anti-hybrid antibody. Methods for immobilizing antibodies on substrates are well established. Immobilization can be done using standard immobilization chemistries, for example by attachment to aminated surfaces, carboxylated surfaces or hydroxylated surfaces. Examples of binders are cyanogen bromide, succinimide, aldehydes, tosyl chloride, avidin-biotin, photocrosslinkers, epoxides and maleimides. The preferred binder is glutaraldehyde. These and other binders, and their use in conjugation, are described in Protein immobili
zation: fundamentals and applications, Richard F. Taylor ed. (M. Dekker,
New York, 1991), Johnstone and Thorpe, Immunochemistry In Practice (Blac
kwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987) pages 209-216 and
241-242, and Immobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermanson et al.,
eds. (Academic Press, New York, 1992). Antibodies can be attached to a substrate by chemically cross-linking free amino groups on the antibody to reactive side groups present in the substrate. For example, the antibody can be chemically cross-linked with a substrate containing free amino or carboxyl groups using glutaraldehyde or carbodiimide as a cross-linking agent. In this method, an aqueous solution containing free antibody is incubated with a solid substrate in the presence of glutaraldehyde or carbodiimide. For cross-linking with glutaraldehyde, the reaction can be incubated with 2% by volume glutaraldehyde in a buffer solution, for example 0.1 M sodium cacodylate (pH 7.4). Other standard immobilization chemistries are known to those of skill in the art.

【００４７】 方法 開示されている方法には、ＲＮＡストランドとハイブリダイズされたＤＮＡス
トランドのＴ４ＲＮＡリガーゼによるライゲーションを介する、核酸の検出、核
酸の増幅、または両者が関与する。これらの技術は、ＲＮＡ配列の検出および、
ＲＮＡ配列からの、あるいはＲＮＡ配列に依存する核酸の増幅に関して、特に有
用である。Methods The disclosed methods involve detection of nucleic acids, amplification of nucleic acids, or both via ligation of DNA strands hybridized with RNA strands by T4 RNA ligase. These techniques detect RNA sequences and
It is particularly useful for the amplification of nucleic acids from or dependent on RNA sequences.

【００４８】 多くの既知のライゲーションに基づく検出および増幅技術は、ＤＮＡストラン
ドまたはＤＮＡ末端に対して作用するＴ４ＲＮＡリガーゼの使用により改善され
る。このような技術には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Wiedmann et al., PCR M
ethods Appl. 3(4):S51-64(1994); Lee, Biologicals 24(3):197-199 (1996); L
affler et al., Ann Biol Clin (Paris) 51(9):821-826 (1993); U.S. Pat. No.
5,516,663 to Backman et al.）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わされ
たライゲーション（ＲＴＰＣＲ；U.S. Pat. No. 5,187,060 to Cerruti et al.
）、ライゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭＰＣＲ；Becker and Mah
ler, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9:313-319 (1999); Rodriguez and Ak
man, Electrophoresis 19:646-652 (1998)）、ポリメラーゼ連鎖反応／ライゲー
ション検出反応（ＰＣＲ／ＬＤＲ；Zirvi et al., Nucleic Acids Res. 27: e40
(1999); U.S. Pat. No. 6,027,889 to Barany et al.; U.S. Pat. No. 5,912,
148 to Eggerding）、ライゲーション依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＤ−ＰＣ
Ｒ；Park et al., Am J Pathol 149(5):1485-1491 (1996)）、オリゴヌクレオチ
ドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ；Tobe et al., Nucleic Acids Res. 24:372
8-3732 (1996); Gasparini et al., J. Med. Screen. 6:67-69 (1999)）、増幅
時ライゲーション（ＬＤＡ；Chen and Ruffner, Nucleic Acids Res. 26:1126-1
127 (1998)）、および、パドロックプローブ（Nilsson et al., Science 265:20
85-2088 (1994); Baner et al., Nucleic Acids Res. 26:5073-5078 (1998); Th
omas et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123:1170-1176 (1996)）、開環プロー
ブ（U.S. Patent No. 5,854,033 to Lizardi）、および他の環化可能プローブ（
Zhang et al., Gene 211:277-285 (1998)）のライゲーション、反復性ギャップ
ライゲーション（ＩＧＬ；Stewart et al., Nucleic Acids Res. 26:961-966 (1
998)）、およびライゲーションが関与する他の技術（Stefano et al., Mol. Cel
l Probes 11:407-426 (1997); U.S. Pat. No. 6,025,139 to Yager et al.; U.S
. Pat. No. 6,020,138 to Akhaven-Tafti; U.S. Pat. No. 5,998,175 to Akhave
n-Tafti; U.S. Pat. No. 5,962,223 to Whiteley et al.; U.S. Pat. No. 5,959
,095 to Martinelli et al.; U.S. Pat. No. 5,942,609 to Hunkapiller et al.
; U.S. Pat. No. 5,888,731 to Yager et al.; U.S. Pat. No. 5,871,914 to Na
than; U.S. Pat. No. 5,800,994 to Martinelli et al.; U.S. Pat. No. 5,770,
408 to Sato）が含まれる。Many known ligation-based detection and amplification techniques are improved by the use of T4 RNA ligase, which acts on DNA strands or ends. Such techniques include ligase chain reaction (LCR; Wiedmann et al., PCR M
ethods Appl. 3 (4): S51-64 (1994); Lee, Biologicals 24 (3): 197-199 (1996); L
affler et al., Ann Biol Clin (Paris) 51 (9): 821-826 (1993); US Pat. No.
5,516,663 to Backman et al.), Ligation combined with reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR; US Pat. No. 5,187,060 to Cerruti et al.
), Ligation-mediated polymerase chain reaction (LMPCR; Becker and Mah)
ler, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9: 313-319 (1999); Rodriguez and Ak
man, Electrophoresis 19: 646-652 (1998)), polymerase chain reaction / ligation detection reaction (PCR / LDR; Zirvi et al., Nucleic Acids Res. 27: e40.
(1999); US Pat. No. 6,027,889 to Barany et al .; US Pat. No. 5,912,
148 to Eggerding), ligation-dependent polymerase chain reaction (LD-PC)
R; Park et al., Am J Pathol 149 (5): 1485-1491 (1996)), oligonucleotide ligation assay (OLA; Tobe et al., Nucleic Acids Res. 24: 372.
8-3732 (1996); Gasparini et al., J. Med. Screen. 6: 67-69 (1999)), ligation during amplification (LDA; Chen and Ruffner, Nucleic Acids Res. 26: 1126-1).
127 (1998)) and padlock probe (Nilsson et al., Science 265: 20).
85-2088 (1994); Baner et al., Nucleic Acids Res. 26: 5073-5078 (1998); Th
omas et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123: 1170-1176 (1996)), ring-opening probe (US Patent No. 5,854,033 to Lizardi), and other cyclizable probes (
Zhang et al., Gene 211: 277-285 (1998)), repeated gap ligation (IGL; Stewart et al., Nucleic Acids Res. 26: 961-966 (1).
998)), and other techniques involving ligation (Stefano et al., Mol. Cel.
l Probes 11: 407-426 (1997); US Pat. No. 6,025,139 to Yager et al .; US
. Pat. No. 6,020,138 to Akhaven-Tafti; US Pat. No. 5,998,175 to Akhave
n-Tafti; US Pat. No. 5,962,223 to Whiteley et al .; US Pat. No. 5,959
, 095 to Martinelli et al .; US Pat. No. 5,942,609 to Hunkapiller et al.
US Pat. No. 5,888,731 to Yager et al .; US Pat. No. 5,871,914 to Na
than; US Pat. No. 5,800,994 to Martinelli et al .; US Pat. No. 5,770,
408 to Sato) is included.

【００４９】 Ａ．リガーゼ連鎖反応 ライゲーションが関与する標的増幅のための１機構はリガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ；Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3(4):S51-64(1994); Lee, Biologica
ls 24(3):197-199 (1996); Laffler et al., Ann Biol Clin (Paris) 51(9):821
-826 (1993)）として知られる。ＬＣＲでは、２プライマリープローブ（第一お
よび第二、両者同一のセンスを有する）および２セカンダリープローブ（第三お
よび第四、両者プライマリープローブに対して反対のセンスを有する）が過剰に
用いられる。第一のプローブを標的ストランドの第一のセグメントとハイブリダ
イズさせ、第二のプローブを標的ストランドの第二のセグメントとハイブリダイ
ズさせ、ここに第一および第二のセグメントは近接し、「上流」プローブの３’
ヒドロキシル末端が「下流」プローブの５’ホスフェート末端と隣接し、リガー
ゼはこの２つのプローブを共有結合によって連結させ、融合されたライゲーショ
ン生成物にすることができる。A. Ligase Chain Reaction One mechanism for target amplification involving ligation is the ligase chain reaction (LC
R; Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3 (4): S51-64 (1994); Lee, Biologica.
ls 24 (3): 197-199 (1996); Laffler et al., Ann Biol Clin (Paris) 51 (9): 821
-826 (1993)). In LCR, two primary probes (first and second, both having the same sense) and two secondary probes (third and fourth, both having the opposite sense to the primary probe) are used in excess. The first probe is hybridized with the first segment of the target strand and the second probe is hybridized with the second segment of the target strand, where the first and second segments are in close proximity and "upstream". 3'of the probe
The hydroxyl terminus is adjacent to the 5'phosphate terminus of the "downstream" probe and the ligase can covalently link the two probes into a fused ligation product.

【００５０】 同様に、ＬＣＲは上流および下流のセカンダリープローブを用いる。第三のプ
ローブ（下流セカンダリー）は第一のプローブ（上流プライマリー）と、第四の
プローブ（上流セカンダリー）は第二のプローブ（下流プライマリー）と同様の
接触様式によりハイブリダイズ可能である。プライマリープローブの融合された
ストランドは標的ストランドから分離された後、連結されて相補的なセカンダリ
ー融合生成物を形成できる第三および第四の（セカンダリー）プローブとハイブ
リダイズする。この融合生成物は、標的またはその成分のいずれかと機能的に当
価である。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの繰り返しサイクルに
より、標的配列の増幅を行う。ＬＣＲはＥＰ−Ａ−３２０ ３０８により完全に
記載されている。Similarly, LCR uses upstream and downstream secondary probes. The third probe (downstream secondary) can hybridize with the first probe (upstream primary) and the fourth probe (upstream secondary) with the same contact manner as the second probe (downstream primary). The fused strand of the primary probe is separated from the target strand and then hybridizes with a third and a fourth (secondary) probe that can be ligated to form complementary secondary fusion products. This fusion product is functionally equivalent to either the target or its components. Amplification of the target sequence is performed by repeated cycles of hybridization and ligation. LCR is fully described by EP-A-320 308.

【００５１】 修飾された形態のリガーゼ連鎖反応が U.S. Pat. No. 5,516,663 to Backman
に記載されている。修飾されたＬＣＲ法は、ＬＣＲ法において、３’末端修飾を
有し、その下流パートナーとのライゲーションが不可能である上流プローブを用
いることを含む。３’末端修飾は、その修飾プローブが標的配列とハイブリダイ
ズした場合にのみ矯正可能である。この修飾プローブは、存在するならば、その
標的とハイブリダイズし、修飾プローブ−鋳型複合体を形成する。この修飾はそ
の後、エンドヌクレアーゼＩＶを用いる標的依存様式で矯正され、３’ヒドロキ
シル末端を創出する。この矯正は矯正されたプローブがその下流パートナーと連
結されることを可能にする。この矯正されたプローブは次いでその下流パートナ
ーと連結され、増幅生成物を形成する。増幅された生成物は次いで標的から解離
され、ハイブリダイゼーション、矯正、およびライゲーションのサイクルが繰り
返されて標的配列を増幅する。A modified form of the ligase chain reaction is described in US Pat. No. 5,516,663 to Backman.
It is described in. The modified LCR method involves using an upstream probe in the LCR method that has a 3'end modification and is incapable of ligation with its downstream partner. The 3'end modification can only be corrected if the modified probe hybridizes to the target sequence. This modified probe, if present, hybridizes to its target, forming a modified probe-template complex. This modification is then corrected in a target-dependent manner using endonuclease IV, creating a 3'hydroxyl terminus. This correction allows the corrected probe to be coupled with its downstream partner. This straightened probe is then ligated with its downstream partner to form an amplification product. The amplified product is then dissociated from the target and the cycle of hybridization, correction, and ligation is repeated to amplify the target sequence.

【００５２】 リガーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ ＬＣＲプローブ（または末端のデオキシリボヌ
クレオチドを有するＬＣＲプローブ）、ＲＮＡ標的配列、およびＴ４ＲＮＡリガ
ーゼを用いて、プローブをＲＮＡ標的に連結することにより開示されている方法
に関して適合させることが可能である。ＬＣＲプローブはまた、ＲＮＡであって
よい。The ligase chain reaction is compatible with the disclosed method by linking the probe to the RNA target using a DNA LCR probe (or LCR probe with a terminal deoxyribonucleotide), an RNA target sequence, and T4 RNA ligase. It is possible to The LCR probe may also be RNA.

【００５３】 Ｂ．ライゲーションおよびポリメラーゼ連鎖反応 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；U.S. Pat. No. 5,187,060 to C
erruti et al.）は標的ＲＮＡ配列を検出するのに用いられる。これは、ＲＮＡ
とハイブリダイズされたバイナリープローブのライゲーションと組み合わせた後
に逆転写し、さらなる識別工程を加えることできる。ライゲーション依存性ＰＣ
Ｒ（ＬＤ−ＰＣＲ；Park et al., Am J Pathol 149(5):1485-1491(1996); Hsuih
et al., J Clin Microbiol 34(3):501-7(1996)）は標的ＲＮＡとハイブリダイ
ズされた２つの半プローブを用いる。この半プローブは、次いでリガーゼによっ
て連結され、ＰＣＲプライマーとして働く完全プローブを形成する。このＲＮＡ
とハイブリダイズされた捕獲プローブは単離に用いることができる。このハイブ
リッドは捕獲プローブのパラマグネティックビーズへの結合によって単離される
。B. Ligation and Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR; US Pat. No. 5,187,060 to C
erruti et al.) is used to detect target RNA sequences. This is RNA
Can be combined with ligation of a binary probe hybridized with and then reverse transcribed to add an additional discrimination step. Ligation-dependent PC
R (LD-PCR; Park et al., Am J Pathol 149 (5): 1485-1491 (1996); Hsuih.
et al., J Clin Microbiol 34 (3): 501-7 (1996)) uses two half-probes hybridized with a target RNA. This half-probe is then ligated by ligase to form a complete probe that acts as a PCR primer. This RNA
The capture probe hybridized with can be used for isolation. This hybrid is isolated by binding the capture probe to the paramagnetic beads.

【００５４】 ライゲーションが関与するＰＣＲおよびＲＴＰＣＲの形態は、連結されるスト
ランドに対するＤＮＡプローブ（または末端デオキシリボヌクレオチドを有する
プローブ）（例えば半プローブ）、ＲＮＡ標的配列、およびＴ４ＲＮＡリガーゼ
を用いて、プローブをＲＮＡ標的と連結することにより、開示されている方法に
対して適合させることができる。The forms of PCR and RTPCR that involve ligation include using a DNA probe (or a probe with terminal deoxyribonucleotides) (eg, a half probe) to the strand to be ligated, an RNA target sequence, and T4 RNA ligase to probe the RNA. By linking with a target, one can adapt to the disclosed method.

【００５５】 Ｃ．パドロックプローブ パドロックプローブは、各末端の配列が標的配列の隣接する領域と相補的であ
るハイブリダイゼーションプローブである。標的配列とのハイブリダイゼーショ
ン時に、パドロックプローブの末端は互いに連結され、これによりプローブは環
化され、このプローブは標的配列に対してトポロジー的にロックされる。連結さ
れていないプローブ（概してハイブリダイズしていないか、あるいは不完全にハ
イブリダイズしているプローブ）は洗浄して除去することができ、一方、連結さ
れたプローブは除去されない。パドロックプローブはハイブリダイゼーションと
ライゲーションを組み合わせて標的識別を増大させる。パドロックプローブおよ
びその使用は、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２２６２３に記載されている。パドロック
プローブの使用は、ＤＮＡパドロックプローブ（または末端デオキシリボヌクレ
オチドを有するパドロックプローブ）、ＲＮＡ標的配列、およびＴ４ＲＮＡリガ
ーゼを用いて、ＲＮＡ標的上でパドロックプローブを環化することによって、開
示されている方法に適合させることができる。C. Padlock Probes Padlock probes are hybridization probes in which the sequence at each end is complementary to the flanking regions of the target sequence. Upon hybridization with the target sequence, the ends of the padlock probe are ligated together, which circularizes the probe and topologically locks the probe to the target sequence. Unligated probe (generally unhybridized or incompletely hybridized probe) can be washed away, while ligated probe is not removed. Padlock probes combine hybridization and ligation to increase target discrimination. Padlock probes and their uses are described in PCT application WO 95/22623. The use of padlock probes is described in the disclosed method by circularizing the padlock probe on the RNA target with a DNA padlock probe (or a padlock probe with terminal deoxyribonucleotides), an RNA target sequence, and T4 RNA ligase. Can be adapted.

【００５６】 Ｄ．ローリングサークル増幅 好ましい技術は、標的核酸がＲＮＡである、開環プローブ（U.S. Patent No.
5,854,033 to Lizardi; これはパドロックプローブとして既知である；Nilsson
et al., Science 265:2085-2088(1994) を参照）の標的媒介性ライゲーションで
ある。これは次いで、連結された開環プローブのローリングサークル増幅（ＲＣ
Ａ）に付され、標的依存性の核酸増幅を生じさせることができる。指数関数的ロ
ーリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）はさらに多くの増幅を提供できる。D. Rolling Circle Amplification A preferred technique is a ring-opening probe (US Patent No.
5,854,033 to Lizardi; This is known as a padlock probe; Nilsson
et al., Science 265: 2085-2088 (1994)). This is followed by rolling circle amplification (RC) of the linked open probe.
Subject to A), target-dependent nucleic acid amplification can occur. Exponential rolling circle amplification (ERCA) can provide even more amplification.

【００５７】 ローリングサークル増幅は、ＤＮＡ開環プローブ（または末端デオキシリボヌ
クレオチドを有する開環プローブ）、ＲＮＡ標的配列、およびＴ４ＲＮＡリガー
ゼを用いて、ＲＮＡ標的上で開環プローブを環化することによって、開示されて
いる方法に適合させることができる。ローリングサークル複製は一般に、開環プ
ローブが完全にデオキシリボヌクレオチドから構成され、ＤＮＡ開環プローブの
使用がＲＣＡに影響しないことを必要とする。Rolling circle amplification is disclosed by circularizing an open ring probe on an RNA target with a DNA open probe (or open ring probe with terminal deoxyribonucleotides), an RNA target sequence, and T4 RNA ligase. Can be adapted to the method being used. Rolling circle replication generally requires that the open ring probe be composed entirely of deoxyribonucleotides and that the use of a DNA open ring probe does not affect RCA.

【００５８】 ＲＣＡにおいて、ローリングサークル複製プライマーは環状ＯＣＰまたはＡＴ
Ｃ分子とハイブリダイズし、その後、ストランド置換ＤＮＡポリメラーゼを用い
てＯＣＰまたはＡＴＣ分子がローリングサークル複製される。増幅は単一反応サ
イクルのローリングサークル複製時に生じる。ローリングサークル複製は、ＯＣ
ＰまたはＡＴＣ配列の直列型反復を含有する大きなＤＮＡ分子を生じさせる。こ
のＤＮＡ分子は直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称される。ローリングサー
クル増幅はまた、本明細書中において、単分子セグメント増幅（ＵＳＡ）と称さ
れる。用語、単分子セグメント増幅は、本明細書中においては総じて、目的の核
酸、例えば標的配列の個々のセグメントの増幅を強調するのに用いられる。In RCA, the rolling circle replication primer is circular OCP or AT.
It hybridizes to the C molecule, followed by rolling circle replication of the OCP or ATC molecule using strand displacement DNA polymerase. Amplification occurs during rolling circle replication in a single reaction cycle. Rolling circle replication is OC
This gives rise to large DNA molecules containing tandem repeats of P or ATC sequences. This DNA molecule is called tandem sequence DNA (TS-DNA). Rolling circle amplification is also referred to herein as unimolecular segment amplification (USA). The term unimolecular segment amplification is generally used herein to emphasize the amplification of a nucleic acid of interest, eg, an individual segment of a target sequence.

【００５９】 好ましい態様、ライゲーション媒介性ローリングサークル増幅（ＬＭ−ＲＣＡ
）法には、複製前のライゲーション操作が関与する。ライゲーション操作では、
ＯＣＰは、存在するならば、（ＲＮＡ標的中の）その同族標的核酸配列とハイブ
リダイズした後、ハイブリダイズされたＯＣＰの末端は連結され、共有結合によ
って閉環された単一ストランドのＯＣＰが形成される。ライゲーション後、ロー
リングサークル複製プライマーはＯＣＰ分子とハイブリダイズし、次いでストラ
ンド置換ＤＮＡポリメラーゼを用いて環状ＯＣＰ分子がローリングサークル複製
される。一般に、ＬＭ−ＲＣＡは以下の工程を含む： （ａ）開環プローブ（ＯＣＰ）を標的サンプルと混合し、ＯＣＰ−標的サンプル
混合物を生じさせ、開環プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションを
促進する条件下でこのＯＣＰ−標的サンプル混合物をインキュベートし、 （ｂ）リガーゼをＯＣＰ−標的サンプル混合物と混合し、ライゲーション混合物
を生じさせ、開環プローブのライゲーションを促進する条件下で、このライゲー
ション混合物をインキュベートし、増幅標的サークル（ＡＴＣ）を形成させ、 （ｃ）ローリングサークル複製プライマー（ＲＣＲＰ）をライゲーション混合物
と混合し、プライマー−ＡＴＣ混合物を生じさせ、増幅標的サークルとローリン
グサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で
このプライマー−ＡＴＣ混合物をインキュベートし、 （ｄ）ＤＮＡポリメラーゼをプライマー−ＡＴＣ混合物と混合し、ポリメラーゼ
−ＡＴＣ混合物を生じさせ、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でこのポ
リメラーゼ−ＡＴＣ混合物をインキュベートし、ここに増幅標的サークルの複製
は直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）形成を生じさせる。A preferred embodiment, ligation mediated rolling circle amplification (LM-RCA
) Method involves a ligation operation prior to replication. In the ligation operation,
The OCP, if present, hybridizes to its cognate target nucleic acid sequence (in the RNA target), after which the ends of the hybridized OCP are ligated to form a covalently closed single-stranded OCP. It After ligation, the rolling circle replication primer hybridizes to the OCP molecule and then the circular OCP molecule is rolling circle replicated using strand displacement DNA polymerase. In general, LM-RCA involves the following steps: (a) Mixing an open ring probe (OCP) with a target sample to generate an OCP-target sample mixture, allowing hybridization between the open ring probe and the target sequence. Incubating the OCP-target sample mixture under facilitating conditions, (b) mixing the ligase with the OCP-target sample mixture resulting in a ligation mixture, the ligation mixture under conditions that promote ligation of the open ring probe. To form an amplification target circle (ATC), and (c) a rolling circle replication primer (RCRP) is mixed with the ligation mixture to produce a primer-ATC mixture, between the amplification target circle and the rolling circle replication primer. Hybridization Incubating the primer-ATC mixture under advancing conditions, and (d) mixing the DNA polymerase with the primer-ATC mixture, resulting in a polymerase-ATC mixture, the polymerase-ATC under conditions that promote replication of the amplified target circle. The ATC mixture is incubated, where replication of the amplified target circle results in tandem sequence DNA (TS-DNA) formation.

【００６０】 開環プローブは、５’末端から３’末端にかけて、５’ホスフェート基、右標
的プローブ部分、プライマー相補部分、スペーサー領域、左標的プローブ部分、
および３’ヒドロキシ基を含む単一ストランドの直線状ＤＮＡ分子であり、ここ
に左標的プローブ部分は標的配列の５’領域と相補的であり、右標的プローブ部
分は標的配列の３’領域と相補的である。The ring-opening probe comprises a 5 ′ phosphate group, a right target probe portion, a primer complementary portion, a spacer region, a left target probe portion from the 5 ′ end to the 3 ′ end,
And a 3'-hydroxyl group, which is a single-stranded linear DNA molecule in which the left target probe portion is complementary to the 5'region of the target sequence and the right target probe portion is complementary to the 3'region of the target sequence. Target.

【００６１】 左および右標的プローブ部分は、１またはそれ以上のギャップオリゴヌクレオ
チドで充填される中央ギャップを有するか、あるいは有さない標的核酸配列の２
末端とハイブリダイズする。一般に、ギャップオリゴヌクレオチドを用いるＬＭ
−ＲＣＡは、ＬＭ−ＲＣＡ反応において、（１）５’領域と３’領域との間に位
置する中央領域を有する標的配列およびＯＣＰ（ここに、開環プローブの左標的
プローブ部分および開環プローブの右標的プローブ部分はいずれも標的配列の該
中央領域と相補的ではない）を用い、ならびに（２）１またはそれ以上のギャッ
プオリゴヌクレオチドを標的サンプルと混合し、ＯＣＰ−標的サンプル混合物に
開環プローブ、１またはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチド、および標的サ
ンプルを含有させる（ここに各ギャップオリゴヌクレオチドは、５’ホスフェー
ト基および３’ヒドロキシル基を含む単一ストランドの直線状ＤＮＡ分子から構
成され、各ギャップヌクレオチドは標的配列の中央領域のすべてまたは部分と相
補的である）ことによって行うことができる。The left and right target probe moieties are two of the target nucleic acid sequences, with or without a central gap filled with one or more gap oligonucleotides.
Hybridize with the ends. In general, LM using gap oligonucleotides
-RCA is (1) a target sequence having a central region located between the 5'region and the 3'region in the LM-RCA reaction and OCP (wherein the left target probe portion of the open probe and the open probe). None of the right target probe portions of the target sequence are complementary to the central region of the target sequence), and (2) one or more gap oligonucleotides are mixed with the target sample to open the OCP-target sample mixture. Contains a probe, one or more gap oligonucleotides, and a target sample, where each gap oligonucleotide is composed of a single-stranded linear DNA molecule containing a 5'phosphate group and a 3'hydroxyl group, each Gap nucleotides are complementary to all or part of the central region of the target sequence) It can be carried out.

【００６２】 １．ライゲーション操作 任意的に１またはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドの存在下で、開環プ
ローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下のＲＮＡを含有するサンプルと
インキュベートされ、次いでＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて連結され、共有結合に
よって閉環されたサークルが形成される。連結された開環プローブは増幅標的サ
ークルの一形態である。この操作は Nilsson et al., Science, 265:2085-2088(
1994) に記載されているパドロックプローブのライゲーションと同様である。こ
のライゲーション操作は、標的配列の存在に依存する以後の増幅を可能にする。
リガーゼおよびライゲーション条件は単一ストランド末端のライゲーション回数
を制限するよう最適化できる。このようなライゲーションイベントは標的配列の
存在に依存しない。1. Ligation procedure The ring-opening probe, optionally in the presence of one or more gap oligonucleotides, is incubated with a sample containing RNA under suitable hybridization conditions, then ligated with T4 RNA ligase and covalently linked. Form a closed circle. The linked open-ended probe is a form of amplification target circle. This operation is performed by Nilsson et al., Science, 265: 2085-2088 (
1994) and the ligation of the padlock probe. This ligation procedure allows subsequent amplification depending on the presence of the target sequence.
Ligase and ligation conditions can be optimized to limit the number of single-stranded end ligations. Such a ligation event does not depend on the presence of the target sequence.

【００６３】 ２．複製操作 特定のライゲーションおよび増幅標的サークルによって形成された環状開環プ
ローブは、ローリングサークル複製に関する基質として働く。この反応は以下２
つの試薬の添加を必要とする：（ａ）ＯＣＰまたはＡＴＣのプライマー相補性部
分と相補的であるローリングサークル複製プライマー、および（ｂ）ローリング
サークルＤＮＡポリメラーゼ。このＤＮＡポリメラーゼは、所望である限り進め
られる進行性ローリングサークルポリメライゼーション反応におけるプライマー
伸張およびストランド置換を触媒し、増幅標的サークルまたは開環プローブと相
補的な配列の約１０００までの直列型コピーを含有する１００，０００ヌクレオ
チドまで、またはそれ以上の分子を生じさせる。この直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−
ＤＮＡ）は、ＯＣＰの場合、標的配列およびスペーサー配列の繰り返しから構成
される。ＴＳ−ＤＮＡのスペーサー配列は、元の開環プローブ中の左標的プロー
ブと右標的プローブ間の配列の相補物であることに注意したい。好ましいローリ
ングサークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ２９のＤＮＡポリメ
ラーゼである。2. Replication Manipulation Circular ring-opening probes formed by specific ligation and amplification target circles serve as substrates for rolling circle replication. This reaction is 2
Requires the addition of one reagent: (a) a rolling circle replication primer that is complementary to the primer-complementary portion of OCP or ATC, and (b) a rolling circle DNA polymerase. This DNA polymerase catalyzes primer extension and strand displacement in a progressive rolling circle polymerization reaction that proceeds as long as desired and contains up to about 1000 tandem copies of sequences complementary to the amplification target circle or open probe. Giving rise to molecules of up to 100,000 nucleotides or more. This tandem array DNA (TS-
In the case of OCP, DNA) is composed of repeating target and spacer sequences. Note that the TS-DNA spacer sequence is the complement of the sequence between the left and right target probes in the original ring-opening probe. A preferred rolling circle DNA polymerase is the bacteriophage φ29 DNA polymerase.

【００６４】 ローリングサークル複製時には、この反応において製造されるＤＮＡをラベル
するために、放射能活性、または修飾されたヌクレオチド、例えばブロモデオキ
シウリジントリホスフェートをさらに含ませることができる。別法では、ビオチ
ニル化ヌクレオチド（Langer et al. (1981)）のような、結合部分を提供する適
当な前駆体を含ませてもよい。During rolling circle replication, radioactive or modified nucleotides such as bromodeoxyuridine triphosphate can be further included to label the DNA produced in this reaction. Alternatively, suitable precursors may be included that provide the binding moieties, such as biotinylated nucleotides (Langer et al. (1981)).

【００６５】 ローリングサークル増幅を操作して、複数連結されたＯＣＰまたはＡＴＣが関
与するアッセイにおいて種々の長さのＴＳ−ＤＮＡを生じさせることができる。
これは単一アッセイにおいて検出可能な異なる標的の数を増やすのに有用であり
得る。種々の長さのＴＳ−ＤＮＡはいくつかの方法で製造できる。一態様では、
種々のクラスのＯＣＰまたはＡＴＣのスペーサー領域の基本組成を特定のヌクレ
オチドに富むように設計できる。次いで、豊富化されたヌクレオチドと相補的な
少量のジデオキシヌクレオチドをローリングサークル増幅反応に含ませることが
できる。いくらか増幅した後、ジデオキシヌクレオチドは、その相補的ヌクレオ
チドに関して豊富化されたＯＣＰまたはＡＴＣのクラスのＴＳ−ＤＮＡ生成物の
伸張を終結させる。他のＯＣＰまたはＡＴＣは、その相補的ヌクレオチドに関し
て豊富化されていないので、終結させられる可能性は低く、平均してより長いＴ
Ｓ−ＤＮＡ生成物が生じる。Rolling circle amplification can be engineered to generate TS-DNA of varying lengths in assays involving multiple linked OCP or ATC.
This can be useful in increasing the number of different targets detectable in a single assay. TS-DNA of various lengths can be produced in several ways. In one aspect,
The basic composition of the spacer regions of various classes of OCP or ATC can be designed to be rich in specific nucleotides. A small amount of dideoxynucleotides complementary to the enriched nucleotides can then be included in the rolling circle amplification reaction. After some amplification, dideoxynucleotides terminate the elongation of the OCP or ATC class of TS-DNA products enriched for their complementary nucleotides. Other OCPs or ATCs are not enriched for their complementary nucleotides, so are unlikely to be terminated and, on average, longer T
An S-DNA product is produced.

【００６６】 別の態様では、２つの異なるクラスのＯＣＰまたはＡＴＣを異なるプライマー
相補性部分を有するように設計することができる。これらの異なるプライマー相
補性部分は異なるローリングサークル複製プライマーと相補的であるように設計
される。次いで、単一のローリングサークル増幅反応において、有意に異なる濃
度で２つの異なるローリングサークル複製プライマーをいっしょに用いる。高濃
度のプライマーは、好適な動力学のせいですぐにローリングサークル複製をプラ
イム化するが、一方、低濃度のプライマーは、好適でない動力学のせいでプライ
ム化において遅延する。したがって、高濃度のプライマーに関して設計されたＯ
ＣＰまたはＡＴＣのクラスのＴＳ−ＤＮＡ生成物は、より長い時間複製されるた
め、低濃度のプライマーに関して設計されたＯＣＰまたはＡＴＣのクラスのＴＳ
−ＤＮＡ生成物より長い。In another aspect, two different classes of OCPs or ATCs can be designed with different primer complementing moieties. These different primer complementing portions are designed to be complementary to different rolling circle replication primers. Two different rolling circle replication primers are then used together at significantly different concentrations in a single rolling circle amplification reaction. Higher concentrations of primer prime the rolling circle replication immediately due to favorable kinetics, while lower concentrations of primer delay in priming due to unfavorable kinetics. Therefore, the O
Since CP- or ATC-class TS-DNA products replicate for longer times, OCP- or ATC-class TS designed for lower concentrations of primer
-Longer than the DNA product.

【００６７】 ＲＣＡのさらなる形態はＰＣＴ出願ＷＯ９７／２０９４８に記載されている。[0067]   Further forms of RCA are described in PCT application WO 97/20948.

【００６８】 ３．開環プローブ 開環プローブ（ＯＣＰ）は、直線状単一ストランドのＤＮＡ分子であり、一般
に５０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは約６０〜１５０ヌクレオチド、最も
好ましくは約７０〜１００ヌクレオチドを含有する。ＯＣＰは５’ホスフェート
基および３’ヒドロキシル基を有する。これは、この末端がＤＮＡリガーゼを用
いて連結されること、またはギャップ充填操作において伸張されること可能にす
る。ＯＣＰの部分は、このＯＣＰをＲＣＡおよびＬＭ−ＲＣＡに関して有用にす
る特定の官能基を有する。これらの部分は標的プローブ部分、プライマー相補性
部分、スペーサー領域、検出タグ部分、セカンダリー標的配列部分、アドレスタ
グ部分、およびプロモーター部分として言及される。標的プローブ部分およびプ
ライマー相補性部分は開環プローブの必須の要素である。プライマー相補性部分
は、スペーサー領域の部分である。検出タグ部分、セカンダリー標的配列部分、
およびプロモーター部分は任意的であり、存在するならば、スペーサー領域の部
分である。アドレスタグ部分は任意的であり、存在するならば、スペーサー領域
の部分であり得る。一般に、開環プローブは単一ストランドの直線状ＤＮＡ分子
であり、５’末端から３’末端にかけて、５’ホスフェート基、右標的プローブ
部分、スペーサー領域、左標的部分、および３’ヒドロキシル基を含み、スペー
サー領域の部分として存在するプライマー相補性部分を有する。ＯＣＰの特異的
部分に対応しないスペーサー領域のセグメントは、任意に選択された配列であっ
てよい。ＯＣＰは自己相補的であるいかなる配列をも有さないのが好ましい。ミ
スマッチまたはギャップを伴わない６ヌクレオチド長より長い相補性領域が存在
しない場合に、この条件は適切であると考えられる。また、プロモーター部分を
含有するＯＣＰは、一連の８またはそれ以上のチミジンヌクレオチドのような転
写ターミネーターと類似するいかなる配列をも有さないのが好ましい。3. Ring-Opening Probes Ring-opening probes (OCPs) are linear, single-stranded DNA molecules that generally contain 50-1000 nucleotides, preferably about 60-150 nucleotides, and most preferably about 70-100 nucleotides. OCP has a 5'phosphate group and a 3'hydroxyl group. This allows the ends to be ligated with DNA ligase or extended in a gap filling operation. Portions of OCP have specific functional groups that make this OCP useful for RCA and LM-RCA. These moieties are referred to as target probe moieties, primer complement moieties, spacer regions, detection tag moieties, secondary target sequence moieties, address tag moieties, and promoter moieties. The target probe portion and the primer complementary portion are essential elements of the open ring probe. The primer complementary portion is a portion of the spacer region. Detection tag part, secondary target sequence part,
And the promoter portion is optional and, if present, is part of the spacer region. The address tag portion is optional and, if present, can be part of the spacer region. Generally, a ring-opening probe is a single-stranded linear DNA molecule that, from the 5'end to the 3'end, contains a 5'phosphate group, a right target probe portion, a spacer region, a left target portion, and a 3'hydroxyl group. , Having a primer complementary portion present as a portion of the spacer region. The segment of the spacer region that does not correspond to a specific portion of OCP may be any sequence of choice. The OCP preferably does not have any sequences that are self-complementary. This condition is considered appropriate if there are no complementary regions longer than 6 nucleotides in length with no mismatches or gaps. Also, the OCP containing promoter portion preferably does not have any sequences similar to the transcription terminator, such as a series of 8 or more thymidine nucleotides.

【００６９】 開環プローブは、連結され、複製された場合に、この開環プローブと相補的な
配列の複数の繰り返しを含有する長いＤＮＡ分子を生じさせる。この長いＤＮＡ
分子は、本明細書中において、直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称される。
ＴＳ−ＤＮＡは、標的プローブ部分、プライマー相補性部分、スペーサー領域、
ならびに、開環プローブ上に存在するならば、検出タグ領域、セカンダリー標的
配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター領域と相補的な配列を含有す
る。ＴＳ−ＤＮＡ中のこれらの配列は、標的配列（元の標的配列と適合する）、
プライマー配列（ローリングサークル複製プライマーと適合する）、スペーサー
配列（スペーサー領域と相補的である）、検出タグ、セカンダリー標的配列、ア
ドレスタグ、およびプロモーター配列として言及される。The ring-opening probe, when ligated and replicated, gives rise to a long DNA molecule containing multiple repeats of the sequence complementary to the ring-opening probe. This long DNA
The molecule is referred to herein as tandem sequence DNA (TS-DNA).
TS-DNA includes a target probe portion, a primer complementary portion, a spacer region,
And a sequence complementary to the detection tag region, secondary target sequence portion, address tag portion, and promoter region, if present on the open ring probe. These sequences in the TS-DNA are the target sequence (matches the original target sequence),
References are made to primer sequences (compatible with rolling circle replication primers), spacer sequences (complementary to spacer regions), detection tags, secondary target sequences, address tags, and promoter sequences.

【００７０】 特に好ましい態様は、２０ヌクレオチドの左標的プローブおよび２０ヌクレオ
チドの右標的プローブを含む、７０〜１００ヌクレオチドの開環プローブである
。左標的プローブおよび右標的プローブは、５ヌクレオチドのギャップから出発
する標的配列とハイブリダイズし、このギャップは単一のペンタヌクレオチドギ
ャップオリゴヌクレオチドによって充填される。[0070] A particularly preferred embodiment is a 70-100 nucleotide open-ring probe that includes a 20 nucleotide left target probe and a 20 nucleotide right target probe. The left and right target probes hybridize with the target sequence starting from a 5 nucleotide gap, which is filled by a single pentanucleotide gap oligonucleotide.

【００７１】 ａ．標的プローブ部分 各ＯＣＰ上には、このＯＣＰの両端の部分である２標的プローブ部分が存在す
る。この標的プローブ部分はそれぞれ、標的プローブと標的配列との間の特異的
かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであってよい。こ
の目的のため、各標的プローブ部分に関しては１０〜３５ヌクレオチド長が好ま
しく、１５〜２０ヌクレオチド長標的プローブ部分が最も好ましい。ＯＣＰの３
’末端の標的プローブ部分は左標的プローブと称され、ＯＣＰの５’末端の標的
プローブ部分は右標的プローブ部分と称される。これら標的プローブ部分はまた
、左および右標的プローブまたは左および右プローブと称される。この標的プロ
ーブ部分は、標的核酸配列と相補的である。A. Target probe portion On each OCP, there are two target probe portions that are the ends of this OCP. The target probe portions can each be of any length that supports specific and stable hybridization between the target probe and the target sequence. For this purpose, a length of 10 to 35 nucleotides is preferred for each target probe portion, and a target probe portion of 15 to 20 nucleotides long is most preferred. OCP 3
The target probe portion at the'end is referred to as the left target probe and the target probe portion at the 5'end of OCP is referred to as the right target probe portion. These target probe moieties are also referred to as left and right target probes or left and right probes. The target probe portion is complementary to the target nucleic acid sequence.

【００７２】 標的プローブ部分は標的配列と相補的であり、ハイブリダイズ時には、右標的
プローブ部分の５’末端および左標的プローブ部分の３’末端は標的配列中の隣
接するヌクレオチドと塩基対形成し、これらはライゲーションのための基質とし
て働くことが目標とされる。場合により、標的プローブ部分の５’末端および３
’末端は、これらがギャップスペースによって分離されるようにハイブリダイズ
することができる。この場合、ＯＣＰの５’末端および３’末端は、１またはそ
れ以上の追加のオリゴヌクレオチド（ギャップオリゴヌクレオチドと称される）
が用いられるか、あるいは、ギャップスペースがライゲーション操作中に充填さ
れる場合に連結され得るだけである。ギャップオリゴヌクレオチドはギャップス
ペース内で標的配列とハイブリダイズし、連続プローブ／標的ハイブリッドを形
成する。ギャップスペースは、所望の任意の長さであってよいが、一般に１０ヌ
クレオチドまたはそれ以下である。ギャップスペースは約３〜１０ヌクレオチド
長の範囲であるのが好ましく、４〜８ヌクレオチド長のギャップスペースが最も
好ましい。別法では、ギャップスペースは、ライゲーション操作中にＤＮＡポリ
メラーゼを用いて充填することができる。このようなギャップ充填操作を用いる
場合、３〜５ヌクレオチド長のギャップスペースが最も好ましい。さらに別の方
法では、ギャップスペースは１またはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドに
よって部分的に架橋され、ギャップの残りの部分はＤＮＡポリメラーゼを用いて
充填されることが可能である。The target probe portion is complementary to the target sequence and, when hybridized, the 5 ′ end of the right target probe portion and the 3 ′ end of the left target probe portion base pair with adjacent nucleotides in the target sequence, These are targeted to serve as substrates for ligation. Optionally, the 5'end and 3 of the target probe moiety
The'ends are capable of hybridizing so that they are separated by a gap space. In this case, the 5'and 3'ends of the OCP have one or more additional oligonucleotides (termed gap oligonucleotides)
Can be used or can only be linked if the gap space is filled during the ligation operation. The gap oligonucleotide hybridizes with the target sequence within the gap space to form a continuous probe / target hybrid. The gap space can be any desired length, but is generally 10 nucleotides or less. The gap spaces are preferably in the range of about 3-10 nucleotides in length, and most preferably 4-8 nucleotides in length. Alternatively, the gap spaces can be filled with DNA polymerase during the ligation procedure. When using such a gap filling operation, a gap space of 3-5 nucleotides in length is most preferred. In yet another method, the gap space can be partially bridged by one or more gap oligonucleotides and the rest of the gap filled with DNA polymerase.

【００７３】 ｂ．プライマー相補性部分 プライマー相補性部分は、開環プローブのスペーサー領域の部分である。プラ
イマー相補性部分はローリングサークル複製プライマー（ＲＣＲＰ）と相補的で
ある。各ＯＣＰは単一のプライマー相補的部分を有するべきである。これはロー
リングサークル複製が連結されたＯＣＰ上の単一部位で始まることを可能にする
。プライマー相補性部分および同族プライマーは、互いに相補的である限り、任
意の所望の配列を有し得る。一般に、プライマー相補物の配列はＯＣＰのいかな
る他の部分とも有意に類似していないように選択され得る。プライマー相補性部
分は、プライマー相補性部分とプライマー間の特異的かつ安定なハイブリダイゼ
ーションをサポートする任意の長さであり得る。この目的のため、１０〜３５ヌ
クレオチド長が好ましく、１６〜２０ヌクレオチド長のプライマー相補性部分が
最も好ましい。プライマー相補性部分は、ＯＣＰのスペーサー領域内の任意の場
所に位置し得る。このプライマー相補性部分は右標的プローブと隣接し、右標的
プローブ部分およびプライマー相補性領域が好ましくは３〜１０ヌクレオチド、
最も好ましくは６ヌクレオチドによって分離されているのが好ましい。この位置
は、ＤＮＡ複製時に連結されていない開環プローブから任意の他のスペーサー配
列、例えば検出タグおよびセカンダリー標的配列が生成されるのを防ぐ。B. Primer Complementary Portion The primer complementary portion is the portion of the spacer region of the open probe. The primer complement portion is complementary to the rolling circle replication primer (RCRP). Each OCP should have a single primer complement portion. This allows rolling circle replication to begin at a single site on the linked OCP. The primer complementing portion and the cognate primer can have any desired sequence so long as they are complementary to each other. In general, the sequence of the primer complement may be chosen so that it is not significantly similar to any other part of OCP. The primer complementary portion can be any length that supports specific and stable hybridization between the primer complementary portion and the primer. For this purpose, 10 to 35 nucleotides in length are preferred, and primer complements 16 to 20 nucleotides in length are most preferred. The primer complementary portion can be located anywhere within the spacer region of OCP. The primer complementary portion is adjacent to the right target probe, and the right target probe portion and the primer complementary region are preferably 3 to 10 nucleotides,
Most preferably they are separated by 6 nucleotides. This position prevents the generation of any other spacer sequences, such as detection tags and secondary target sequences, from the unopened open probe during DNA replication.

【００７４】 ｃ．検出タグ部分 検出タグ部分は開環プローブのスペーサー領域の部分である。検出タグ部分は
、検出プローブの相補性部分の配列と適合する配列を有する。これらの検出タグ
部分は、ローリングサークル複製中に増幅された場合、検出プローブの相補性部
分と相補的な検出タグ配列を有するＴＳ−ＤＮＡを生じさせる。ＯＣＰ上には、
存在するならば、１、２、３、または３以上の検出タグ部分が存在し得る。ＯＣ
Ｐは２、３、または４検出タグ部分を有するのが好ましい。最も好ましくは、Ｏ
ＣＰは３検出タグ部分を有する。一般に、ＯＣＰは６０検出タグ部分またはそれ
以下を有するのが好ましい。ＯＣＰのサイズ以外に、ＯＣＰ上に存在し得る検出
タグ部分の数に基本的な制限はない。複数の検出タグ部分が存在する場合、これ
らは同一の配列を有するか、あるいは種々の配列を有し、それぞれの種々の配列
は異なる検出プローブと相補的であってよい。ＯＣＰは、同一の配列を有し、す
べてが単一の検出プローブと相補的である検出タグ部分を含有するのが好ましい
。いくつかの複合検出方法に関しては、ＯＣＰは６までの検出タグ部分を含有し
、この検出タグ部分は、それぞれの検出タグ部分が異なる検出プローブと相補的
であるような種々の配列を有するのが好ましい。検出タグ部分はそれぞれ、検出
タグと検出プローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポー
トする任意の長さであってよい。この目的のため、１０〜３５ヌクレオチドの長
さが好ましく、１５〜２０ヌクレオチド長の検出タグ部分が最も好ましい。C. Detection Tag Part The detection tag part is the part of the spacer region of the ring-opening probe. The detection tag portion has a sequence that matches the sequence of the complementary portion of the detection probe. These detection tag moieties, when amplified during rolling circle replication, give rise to TS-DNA having a detection tag sequence complementary to the complementary portion of the detection probe. On the OCP,
If present, there may be 1, 2, 3, or 3 or more detection tag moieties. OC
P preferably has 2, 3 or 4 detection tag moieties. Most preferably O
CP has 3 detection tag moieties. Generally, it is preferred that the OCP has 60 detection tag moieties or less. Other than the size of the OCP, there is no fundamental limit to the number of detection tag moieties that can be present on the OCP. When multiple detection tag moieties are present, they may have the same sequence, or different sequences, each different sequence being complementary to a different detection probe. The OCP preferably contains a detection tag portion which has the same sequence and is all complementary to a single detection probe. For some combined detection methods, the OCP contains up to 6 detection tag moieties, each detection tag moiety having a different sequence such that each detection tag moiety is complementary to a different detection probe. preferable. Each detection tag portion can be any length that supports specific and stable hybridization between the detection tag and the detection probe. For this purpose, a length of 10-35 nucleotides is preferred, and a detection tag portion 15-20 nucleotides in length is most preferred.

【００７５】 ｄ．セカンダリー標的配列部分 セカンダリー標的配列部分は開環プローブのスペーサー領域の部分である。セ
カンダリー標的配列部分はセカンダリー開環プローブの標的プローブの配列に適
合する配列を有する。これらのセカンダリー標的配列部分は、ローリングサーク
ル複製時に増幅される場合、セカンダリー開環プローブの標的プローブと相補的
なセカンダリー標的配列を有するＴＳ−ＤＮＡを生じさせる。ＯＣＰ上には、存
在するならば、１、２、または２以上のセカンダリー標的配列部分が存在しても
よい。ＯＣＰは１または２セカンダリー標的配列部分を有するのが好ましい。最
も好ましくは、ＯＣＰは１セカンダリー標的配列部分を有する。一般に、ＯＣＰ
は５０セカンダリー標的配列部分またはそれ以下を有するのが好ましい。ＯＣＰ
のサイズ以外にはＯＣＰ上に存在し得るセカンダリー標的配列部分の数に基本的
な制限はない。複数のセカンダリー標的配列部分が存在する場合、これらは同一
の配列を有してもよく、あるいは種々の配列を有し、それぞれの種々の配列は異
なるセカンダリーＯＣＰと相補的であってよい。ＯＣＰは、すべてがセカンダリ
ーＯＣＰの単一標的プローブ部分と相補的である同一の配列を有するセカンダリ
ー標的配列部分を含有するのが好ましい。セカンダリー標的配列部分はそれぞれ
、セカンダリー標的配列とその同族ＯＣＰの標的配列プローブとの間の特異的か
つ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであってよい。この
目的のため、２０〜７０ヌクレオチド長が好ましく、３０〜４０ヌクレオチド長
のセカンダリー標的配列部分が最も好ましい。本明細書中で用いられるセカンダ
リー開環プローブは、標的プローブ部分が、別の開環プローブまたは増幅標的サ
ークル中のセカンダリー標的配列と適合するか、あるいは相補的である開環プロ
ーブである。セカンダリー開環プローブはそれ自身、別のセカンダリー開環プロ
ーブの標的プローブ部分と適合するか、あるいは相補的であるセカンダリー標的
配列を含有し得ることが考慮される。この様式において互いに関連するセカンダ
リー開環プローブは、本明細書中では、開環プローブ群と称される。D. Secondary Target Sequence Part The secondary target sequence part is the part of the spacer region of the open probe. The secondary target sequence portion has a sequence that matches the sequence of the target probe of the secondary open ring probe. These secondary target sequence portions, when amplified during rolling circle replication, give rise to TS-DNA having a secondary target sequence complementary to the target probe of the secondary open ring probe. There may be one, two, or more than one secondary target sequence portion, if present, on the OCP. The OCP preferably has one or two secondary target sequence portions. Most preferably, the OCP has one secondary target sequence portion. Generally, OCP
Preferably has 50 secondary target sequence portions or less. OCP
There is no fundamental limit to the number of secondary target sequence portions that may be present on the OCP other than the size of When multiple secondary target sequence portions are present, they may have the same sequence, or they may have different sequences, each different sequence being complementary to a different secondary OCP. The OCP preferably contains a portion of the secondary target sequence that has the same sequence that is all complementary to the single target probe portion of the secondary OCP. Each of the secondary target sequence portions can be of any length that supports specific and stable hybridization between the secondary target sequence and its cognate OCP target sequence probe. For this purpose, 20-70 nucleotides in length are preferred, and secondary target sequence portions of 30-40 nucleotides in length are most preferred. A secondary open ring probe, as used herein, is a ring open probe in which the target probe portion is compatible with or complementary to another open ring probe or a secondary target sequence in the amplification target circle. It is contemplated that a secondary open ring probe may itself contain a secondary target sequence that is compatible with or complementary to the target probe portion of another secondary open ring probe. Secondary open ring probes that are related to each other in this manner are referred to herein as a ring open probe group.

【００７６】 ｅ．アドレスタグ部分 アドレスタグ部分は、開環プローブの標的プローブ部分またはスペーサー領域
のいずれかの部分である。アドレスタグ部分はアドレスプローブの相補性部分の
配列に適合する配列を有する。このアドレスタグ部分はローリングサークル複製
時に増幅される場合、アドレスプローブの相補性部分と相補的なアドレスタグ配
列を有するＴＳ−ＤＮＡを生じさせる。ＯＣＰ上には、存在するならば、１、ま
たは１以上のアドレスタグ部分が存在し得る。ＯＣＰは１または２アドレスタグ
部分を有するのが好ましい。最も好ましくは、ＯＣＰは１アドレスタグ部分を有
する。一般に、ＯＣＰは５０アドレスタグ部分またはそれ以下を有するのが好ま
しい。ＯＣＰのサイズ以外には、ＯＣＰ上に存在し得るアドレスタグ部分の数に
基本的な制限はない。複数のアドレスタグ部分が存在する場合、これらは同一の
配列を有してもよく、あるいは種々の配列を有し、種々の配列のそれぞれが異な
るアドレスプローブと相補的であってよい。ＯＣＰは、すべてが単一のアドレス
プローブと相補的である同一の配列を有するアドレスタグ部分を含有するのが好
ましい。好ましくは、このアドレスタグ部分は標的プローブ部分のすべてまたは
部分、および任意の介在ギャップスペースのすべてと重複する。最も好ましくは
、アドレスタグ部分は左および右標的プローブ部分の両者のすべてまたは部分と
重複する。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異
的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであってよい。
この目的のため、１０〜３５ヌクレオチド長が好ましく、１５〜２０ヌクレオチ
ド長のアドレスタグ部分が最も好ましい。E. Address Tag Portion The address tag portion is either the target probe portion or the spacer region of the open ring probe. The address tag portion has a sequence that matches the sequence of the complementary portion of the address probe. This address tag portion, when amplified during rolling circle replication, gives rise to TS-DNA having an address tag sequence complementary to the complementary portion of the address probe. There may be one, or more than one, address tag portion on the OCP, if present. The OCP preferably has a 1 or 2 address tag portion. Most preferably, the OCP has a 1 address tag portion. In general, OCPs preferably have 50 address tag portions or less. Other than the OCP size, there is no fundamental limit to the number of address tag portions that can be present on the OCP. If multiple address tag moieties are present, they may have the same sequence, or they may have different sequences, each of the different sequences being complementary to a different address probe. The OCP preferably contains address tag moieties that all have the same sequence that is complementary to a single address probe. Preferably, this address tag portion overlaps all or part of the target probe portion and any intervening gap spaces. Most preferably, the address tag portion overlaps all or part of both the left and right target probe portions. The address tag portion can be any length that supports specific and stable hybridization between the address tag and the address probe.
For this purpose, 10-35 nucleotides in length are preferred, and address tag moieties 15-20 nucleotides in length are most preferred.

【００７７】 ｆ．プロモーター部分 プロモーター部分はＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列に対応する。プロ
モーター部分は開環プローブ内に含まれていてよく、これによりＴＳ−ＤＮＡか
ら転写物が生産可能になる。任意のプロモーターの配列を用いることができるが
、複雑な必要条件を要しないＲＮＡポリメラーゼ用の単純なプロモーターが好ま
しい。また、プロモーターは標的核酸配列を含有するサンプル中に存在し得るい
ずれのＲＮＡポリメラーゼによっても認識されないのが好ましい。好ましくは、
プロモーター部分はＴ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列に
対応する。Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼは特定のプロモーター配列に対
して高度に特異的である。この特徴を有するＲＮＡポリメラーゼに対して特異的
な他のプロモーター配列もまた好ましい。プロモーター配列は一般に特定のＲＮ
Ａポリメラーゼによって認識されるため、ＯＣＰのプロモーター部分に関する同
族のポリメラーゼが転写増幅に用いられるべきである。多数のプロモーター配列
が既知であり、適当なＲＮＡポリメラーゼに特異的な任意のプロモーターを用い
ることができる。プロモーター部分はＯＣＰのスペーサー領域内の任意の位置に
存在することができ、どちら向きであってもよい。好ましくはプロモーター部分
は左標的プローブにすぐ隣接し、開環プローブの３’末端方向への転写をプロモ
ートするように配向されている。この配向はＴＳ−ＤＮＡと相補的な転写物を生
じさせ、これによりＴＳ−ＤＮＡおよび転写物を独立して検出することを可能に
なり、転写物がローリングサークル複製を妨害するのを防ぐ。F. Promoter part The promoter part corresponds to the sequence of the RNA polymerase promoter. The promoter portion may be contained within the open ring probe, which allows the transcript to be produced from TS-DNA. Any promoter sequence can be used, but simple promoters for RNA polymerase that do not require complex requirements are preferred. Also, the promoter is preferably not recognized by any RNA polymerase that may be present in the sample containing the target nucleic acid sequence. Preferably,
The promoter portion corresponds to the sequence of the T7 or SP6 RNA polymerase promoter. T7 and SP6 RNA polymerases are highly specific for particular promoter sequences. Other promoter sequences specific for RNA polymerases having this characteristic are also preferred. Promoter sequences are generally specific RNs
The cognate polymerase for the promoter portion of OCP should be used for transcription amplification as it is recognized by the A polymerase. Many promoter sequences are known and any promoter specific for the appropriate RNA polymerase can be used. The promoter portion can be present at any position within the spacer region of OCP and can be in either orientation. Preferably, the promoter portion is immediately adjacent to the left target probe and is oriented to promote transcription towards the 3'end of the open ring probe. This orientation gives rise to transcripts complementary to TS-DNA, which allows independent detection of TS-DNA and transcripts, preventing transcripts from interfering with rolling circle replication.

【００７８】 ４．ギャップオリゴヌクレオチド ギャップオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされた開環プローブの末端の
間のギャップスペースをカバーする標的配列部分のすべておよび部分と相補的な
オリゴヌクレオチドである。ギャップオリゴヌクレオチドはその５’末端におい
てホスフェート基を有し、その３’末端においてヒドロキシル基を有する。これ
は、開環プローブまたは他のギャップオリゴヌクレオチドへのギャップオリゴヌ
クレオチドの連結を促進する。ハイブリダイズされた開環プローブの末端の間の
ギャップスペースは単一のギャップオリゴヌクレオチドで充填でき、あるいは複
数のギャップオリゴヌクレオチドで充填できる。例えば、２個の３ヌクレオチド
ギャップオリゴヌクレオチドを用いて、６ヌクレオチドギャップスペースを充填
でき、あるいは３ヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチドおよび４ヌクレオチ
ドギャップオリゴヌクレオチドを用いて７ヌクレオチドギャップスペースを充填
できる。ギャップオリゴヌクレオチドは、密接に関連した標的配列間の識別に関
して特に有用である。例えば、複数のギャップオリゴヌクレオチドを用いて、標
的配列の種々の対立変異体を増幅できる。開環プローブによって形成されたギャ
ップスペース中に変異が存在する標的配列の領域を配置することによって、単一
の開環プローブを用い、適当な組のギャップオリゴヌクレオチドを用いて個々の
各変異体を増幅できる。4. Gap Oligonucleotides Gap oligonucleotides are oligonucleotides that are complementary to all and part of the target sequence portion that covers the gap space between the ends of the hybridized open ring probe. The gap oligonucleotide has a phosphate group at its 5'end and a hydroxyl group at its 3'end. This facilitates ligation of the gap oligonucleotide to a ring-opening probe or other gap oligonucleotide. The gap space between the ends of the hybridized open ring probe can be filled with a single gap oligonucleotide or multiple gap oligonucleotides. For example, two 3-nucleotide gap oligonucleotides can be used to fill a 6-nucleotide gap space, or a 3-nucleotide gap oligonucleotide and a 4-nucleotide gap oligonucleotide can be filled to a 7-nucleotide gap space. Gap oligonucleotides are particularly useful for discriminating between closely related target sequences. For example, multiple gap oligonucleotides can be used to amplify different allelic variants of a target sequence. By placing the region of the target sequence where the mutation resides in the gap space formed by the open ring probe, a single open ring probe is used to separate each variant with an appropriate set of gap oligonucleotides. Can be amplified.

【００７９】 ５．増幅標的サークル 増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、一般に４０〜１０００ヌクレオチド、好まし
くは約５０〜１５０ヌクレオチド、および最も好ましくは約５０〜１００ヌクレ
オチドを含有する環状の単一ストランドＤＮＡ分子である。ＡＴＣの部分は、こ
のＡＴＣをローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に関して有用にする特定の機能を
有する。これらの部分は、プライマー相補性部分、検出タグ部分、セカンダリー
標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分として言及される。
プライマー相補性部分は増幅標的サークルの必須の要素である。検出タグ部分、
セカンダリー標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分は任意
的である。一般に、増幅標的サークルは、プライマー相補性部分を含む単一スト
ランドの環状ＤＮＡ分子である。ＡＴＣの特定の部分に対応しないＡＴＣのセグ
メントは任意に選択された配列であってよい。ＡＴＣは自己相補的ないかなる配
列をも有さないのが好ましい。この条件は、ミスマッチまたはギャップを伴わな
い６ヌクレオチド長以上の相補的領域が存在しない場合に適合することが考慮さ
れる。また、プロモーター部分を含有するＡＴＣは、一連の８またはそれ以上の
チミジンヌクレオチドのような転写ターミネーターに類似するいかなる配列をも
有さないのが好ましい。連結された開環プローブはＡＴＣの一形態であり、本明
細書中で用いられる用語、増幅標的サークルには、連結された開環プローブが含
まれる。ＡＴＣは、連結されたＯＣＰに関して本明細書中に記載される様式と同
じ様式において用いることができる。5. Amplification Target Circles Amplification target circles (ATCs) are circular, single-stranded DNA molecules that generally contain 40 to 1000 nucleotides, preferably about 50 to 150 nucleotides, and most preferably about 50 to 100 nucleotides. The portion of the ATC has specific functions that make this ATC useful for rolling circle amplification (RCA). These moieties are referred to as primer complement moieties, detection tag moieties, secondary target sequence moieties, address tag moieties, and promoter moieties.
The primer complement portion is an essential element of the amplification target circle. Detection tag part,
The secondary target sequence portion, address tag portion, and promoter portion are optional. In general, the amplification target circle is a single-stranded circular DNA molecule that contains a primer-complementary portion. The segment of the ATC that does not correspond to a particular portion of the ATC may be any sequence chosen. The ATC preferably does not have any self-complementary sequences. It is considered that this condition is met if there are no complementary regions of 6 nucleotides or more in length with no mismatches or gaps. Also, the ATC containing promoter portion preferably does not have any sequences similar to the transcription terminator, such as a series of 8 or more thymidine nucleotides. A ligated open ring probe is a form of ATC, and the term amplification target circle as used herein includes a ligated open ring probe. ATC can be used in the same manner as described herein for linked OCPs.

【００８０】 増幅標的サークルは、複製時に、増幅標的サークルと相補的な配列の複数の繰
り返しを含有する長いＤＮＡ分子を生じる。この長いＤＮＡ分子は、本明細書中
では、直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称される。ＴＳ−ＤＮＡはプライマ
ー相補性部分ならびに、増幅標的サークル上に存在するならば、検出タグ部分、
セカンダリー標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分と相補
的な配列を含有する。ＴＳ−ＤＮＡ中のこれらの配列は、プライマー配列（これ
はローリングサークル複製プライマーの配列と適合する）、スペーサー配列（ス
ペーサー領域と相補的である）、検出タグ、セカンダリー標的配列、アドレスタ
グ、およびプロモーター配列として言及される。増幅標的サークルは特異的な結
合分子に関するタグとして有用である。Upon amplification, the amplification target circle results in a long DNA molecule containing multiple repeats of sequences complementary to the amplification target circle. This long DNA molecule is referred to herein as tandem sequence DNA (TS-DNA). TS-DNA is a primer-complementary portion as well as a detection tag portion if present on the amplification target circle,
It contains a sequence complementary to the secondary target sequence portion, the address tag portion, and the promoter portion. These sequences in TS-DNA include primer sequences (which are compatible with the sequences of rolling circle replication primers), spacer sequences (complementary to the spacer region), detection tags, secondary target sequences, address tags, and promoters. Referred to as an array. The amplification target circle is useful as a tag for specific binding molecules.

【００８１】 ６．ローリングサークル複製プライマー ローリングサークル複製プライマー（ＲＣＲＰ）は、ＯＣＰまたはＡＴＣのプ
ライマー相補性部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配
列はＲＣＲＰの相補性部分として言及される。ＲＣＲＰの相補性部分および同族
プライマー相補性部分は互いに相補的である限り任意の所望の配列を有し得る。
一般に、ＲＣＲＰの配列はＯＣＰまたはＡＴＣのいかなる他の部分に対しても有
意に相補的でないように選択できる。ローリングサークル複製プライマーの相補
性部分は、プライマーとプライマー相補性部分との間の特異的かつ安定なハイブ
リダイゼーションをサポートする任意の長さであってよい。一般に、これは１０
〜３５ヌクレオチド長であるが、１６〜２０ヌクレオチド長であるのが好ましい
。6. Rolling Circle Replication Primer A rolling circle replication primer (RCRP) is an oligonucleotide having a sequence complementary to the primer complement portion of OCP or ATC. This sequence is referred to as the complementary part of RCRP. The complementary portion of RCRP and the cognate primer complementary portion can have any desired sequence so long as they are complementary to each other.
In general, the sequence of RCRP can be chosen so that it is not significantly complementary to OCP or any other part of ATC. The complementary portion of the rolling circle replication primer can be any length that supports specific and stable hybridization between the primer and the primer complementary portion. Generally this is 10
~ 35 nucleotides long, but preferably 16-20 nucleotides long.

【００８２】 ローリングサークル複製プライマーはまた、ＲＣＲＰの５’末端において、Ｏ
ＣＰまたはＡＴＣのいかなる部分とも相補的でないさらなる配列を含有するのが
好ましい。この配列はＲＣＲＰの非相補性部分と称される。ＲＣＲＰの非相補性
部分は、存在するならば、ＤＮＡ複製時のストランド置換を促進するように働く
。ＲＣＲＰの非相補性部分は任意の長さであってよいが、一般には１〜１００ヌ
クレオチド長、好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。ローリングサークル複
製プライマーはまた、修飾されたヌクレオチドを含み、エキソヌクレアーゼ消化
に対して耐性にされてもよい。例えばプライマーは、プライマーの５’末端にお
けるヌクレオチド間に３または４ホスホロチオエート結合を有し得る。このよう
なヌクレオチド耐性プライマーは、さもなければ検出プローブ、アドレスプロー
ブ、およびセカンダリーＯＣＰが増幅された核酸とハイブリダイゼーションする
のを妨害し得る過剰の未連結ＯＣＰおよびギャップオリゴヌクレオチドの選択的
分解を可能にする。ローリングサークル複製プライマーは、ストランド置換カス
ケード増幅における第三級ＤＮＡストランド置換プライマーとして使用され得る
。The rolling circle replication primer also contains an O at the 5'end of RCRP.
It preferably contains additional sequences which are not complementary to any part of CP or ATC. This sequence is referred to as the non-complementary portion of RCRP. The non-complementary portion of RCRP, if present, serves to facilitate strand displacement during DNA replication. The non-complementary portion of RCRP may be any length, but is generally 1-100 nucleotides long, preferably 4-8 nucleotides long. The rolling circle replication primer may also contain modified nucleotides to make it resistant to exonuclease digestion. For example, the primer can have 3 or 4 phosphorothioate linkages between the nucleotides at the 5'end of the primer. Such nucleotide-resistant primers allow selective degradation of excess unligated OCP and gap oligonucleotides that could otherwise interfere with hybridization of amplified probes, detection probes, address probes, and secondary OCP. To do. Rolling circle replication primers can be used as tertiary DNA strand displacement primers in strand displacement cascade amplification.

【００８３】 実施例 指数関数的ＲＣＡはＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて行われ、開環プローブを、合
成標的として用いられるＨＣＶ ＲＮＡ配列（４７ｎｔ）と連結する。用いられ
る成分の関係を図１に示す。プラスストランドＲＮＡ配列のみを示す。マイナス
ストランドＲＮＡ配列はプラスストランドに対して相補的である。図１はまた、
標的とアニーリングし、ニックを形成するパドロックアーム配列を示す。また、
ＥＲＣＡ反応において用いられるプライマー１およびサンライズ（ＳＲ）プライ
マー２の位置を示す。Example Exponential RCA was performed using T4 RNA ligase to ligate a ring-opening probe with an HCV RNA sequence (47 nt) used as a synthetic target. The relationship of the components used is shown in FIG. Only positive strand RNA sequences are shown. The minus strand RNA sequence is complementary to the plus strand. Figure 1 also shows
The padlock arm sequence that anneals to the target and forms a nick is shown. Also,
The positions of primer 1 and sunrise (SR) primer 2 used in the ERCA reaction are shown.

【００８４】 ＤＮＡパドロックの５’末端をγ−^３２Ｐでラベルした。ラベルされたパドロ
ック（１０ｎＭ）および合成ＲＮＡ標的（２０ｎＭ）を９５℃で変性させ、１×
Ｔ４ＲＮＡリガーゼバッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．８)、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ジチオスレイトール（dithiotreitol）、および１
ｍＭ ＡＴＰ）中で経時的にアニーリングさせた。このアニーリングされた混合
物（５０μＬ）を、種々の濃度のＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて、種々の時間、３
７℃でインキュベートした。この反応物を８％変性ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し
た。ＤＮＡパドロックは合成ＲＮＡ鋳型上で連結し、環状パドロックを形成させ
ることができる。パドロック形成は６０分まで増加した。一晩のライゲーション
では、６０分にわたって測定できるいかなる増加をももたらさなかった。適合し
たパドロック／ＲＮＡの組み合わせ（＋／＋および−／−）のみが任意のライゲ
ーションをもたらした。ミスマッチパドロック／ＲＮＡの組み合わせ（＋／−）
はいかなるライゲーションをも示さなかった。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２ユニット／
μＬでは、適合したパドロック／ＲＮＡの組み合わせ（＋／＋）は２０％のライ
ゲーションをもたらし、一方（−／−）パドロック／ＲＮＡの組み合わせは３％
のライゲーションしかもたらさなかった（図２）。したがって、Ｔ４ＲＮＡリガ
ーゼはＲＮＡストランドとハイブリダイズすると、効率的にＤＮＡパドロックを
連結した。The 5 ′ end of the DNA padlock was labeled with γ- ³² P. Labeled padlock (10 nM) and synthetic RNA target (20 nM) were denatured at 95 ° C. and 1 ×
T4 RNA ligase buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10
mM MgCl ₂ , 10 mM dithiotreitol, and 1
Annealed over time in mM ATP). This annealed mixture (50 μL) was treated with various concentrations of T4 RNA ligase at various times for 3 hours.
Incubated at 7 ° C. The reaction was electrophoresed on an 8% denaturing PAGE gel. DNA padlocks can ligate on synthetic RNA templates to form circular padlocks. Padlock formation increased to 60 minutes. Overnight ligation did not result in any measurable increase over 60 minutes. Only matched padlock / RNA combinations (+ / + and-/-) resulted in any ligation. Mismatch padlock / RNA combination (+/-)
Did not show any ligation. T4 RNA ligase 2 units /
In μL, the matched padlock / RNA combination (+ / +) resulted in 20% ligation, while the (− / −) padlock / RNA combination was 3%.
Ligation of (Fig. 2). Therefore, T4 RNA ligase efficiently linked DNA padlocks when hybridized with RNA strands.

【００８５】 ライゲーションは、^３２Ｐを用いるＤＮＡパドロックの末端ラベリングなしに
上記のように行った。１０分の１（one-tenth）ライゲーション反応を、２０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、２ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ_４、０．１％ トリトンＸ−１００（２５℃でｐＨ８．８）を含有するＥ
ＲＣＡ反応液（３０μＬ）中において用いた。さらに、反応物は４００ｕＭ デ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェート、８ユニットのＢｓｔＤＮＡポリメラ
ーゼおよび各１μＭのプライマー１およびＳＲプライマー２を含有した。リアル
タイムＥＲＣＡ反応はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００装置において６５℃で２時間
行った。図３に見られるように、適合するパドロック／ＲＮＡの組み合わせ（＋
／＋および−／−）の場合に特異的増幅が観察された。しかし、適合しないパド
ロック／ＲＮＡの組み合わせを用いた場合、非特異的シグナルが観察された。こ
のシグナルは特異的シグナルの数分後に生じた。Ligation was performed as above without end labeling of the DNA padlock with ³² P. 1 / 10th (one-tenth) ligation reaction, 20m
M Tris -HCl, 10mM KCl, 10mM (NH 4) 2 SO 4, 2mM M
E containing gSO ₄ , 0.1% Triton X-100 (pH 8.8 at 25 ° C.)
It was used in the RCA reaction solution (30 μL). In addition, the reaction contained 400 uM deoxyribonucleoside triphosphates, 8 units of Bst DNA polymerase and 1 μM each of primer 1 and SR primer 2. The real-time ERCA reaction was performed at 65 ° C. for 2 hours on the ABI PRISM 7700 apparatus. As can be seen in FIG. 3, matching padlock / RNA combinations (+
Specific amplification was observed for / + and-/-). However, non-specific signals were observed when using incompatible padlock / RNA combinations. This signal occurred a few minutes after the specific signal.

【００８６】 非特異的シグナルを減少させるため、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーシ
ョン反応に１０％ホルムアミドを含ませた。リアルタイムＥＲＣＡ反応は、これ
らのライゲーションを用いて上記のように行った。図４に示されるように、ライ
ゲーション反応に１０％ホルムアミドを加えると、適合しないパドロック／ＲＮ
Ａ（＋／＋）を用いて観察される非特異的シグナルが排除され、特異的シグナル
はそのままであった。To reduce non-specific signals, 10% formamide was included in the ligation reaction with T4 RNA ligase. Real-time ERCA reactions were performed as described above using these ligations. As shown in Figure 4, the addition of 10% formamide to the ligation reaction resulted in incompatible padlock / RN.
The non-specific signal observed with A (+ / +) was eliminated and the specific signal remained.

【００８７】 本明細書中および請求の範囲中で用いられる単数系 "a"、"an"、および "the"
には、特に明記しない限り、複数形表示が含まれることに注意しなければなら
ない。したがって、例えば、"a host cell" への言及には、そのような宿主細胞
の集団が含まれ、"the antibody" への言及は、１またはそれ以上の抗体および
当業者に既知のその当価物への言及である、などである。As used herein and in the claims, the singular system “a”, “an”, and “the”
It should be noted that includes a plural reference unless otherwise stated. Thus, for example, a reference to "a host cell" includes a population of such host cells, and a reference to "the antibody" includes one or more antibodies and their equivalents known to those of skill in the art. Refers to things, and so on.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１は、合成標的として用いられるＨＣＶ ＲＮＡのソースおよ
び配列（４７ｎｔ）を示す図である。プラスストランドＲＮＡ配列のみを示す。
マイナスストランドＲＮＡ配列はこのプラスストランドに対して相補的である。
また、標的にアニーリングして、ニックを形成する開環プローブの標的プローブ
部分の配列、プライマー１が開環プローブのスペーサー部分とハイブリダイズす
る位置、およびＥＲＣＡ反応に用いられるサンライズ（ＳＲ）プライマー２の配
列およびハイブリダイゼーション位置が示されている。FIG. 1 shows the source and sequence (47 nt) of HCV RNA used as a synthetic target. Only positive strand RNA sequences are shown.
The minus strand RNA sequence is complementary to this plus strand.
In addition, the sequence of the target probe portion of the ring-opening probe that anneals to the target to form a nick, the position at which primer 1 hybridizes with the spacer portion of the ring-opening probe, and the sunrise (SR) primer 2 used in the ERCA reaction. Sequences and hybridization positions are indicated.

【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、ライゲーションの進行（連結された分子の
パーセンテージで示される）の時間経過（分）を示すグラフである。2A and 2B are graphs showing the time course (in minutes) of the progress of ligation (indicated by the percentage of molecules linked).

【図３】 図３は、種々の組み合わせの標的、開環プローブ、およびプライ
マーを用いる場合の、ＥＲＣＡによって生じる蛍光を経時的（分）に示すグラフ
である。FIG. 3 is a graph showing the fluorescence generated by ERCA over time (minutes) when using various combinations of target, ring-opening probe, and primer.

【図４】 図４は、１０％ホルムアミドの存在下において、ＥＲＣＡによっ
て生じる蛍光を経時的（分）に示すグラフである。２アッセイの結果がグラフさ
れている：一方はＲＮＡ標的の存在下での結果であり、他方はＲＮＡ標的の不存
在下での結果である。FIG. 4 is a graph showing the fluorescence generated by ERCA over time (minutes) in the presence of 10% formamide. The results of the two assays are graphed: one in the presence of the RNA target and the other in the absence of the RNA target.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ52 QR08 QR20 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE, TR), OA (BF , BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, G M, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ , UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, B Z, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE , DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, I S, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK , LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, P T, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL , TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW F-term (reference) 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11                       HA11                 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ52 QR08                       QR20 QR55 QR62 QS25 QS34                       QS36 QX02

Claims (36)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の工程を含む、核酸を検出する方法： （ａ）右プローブ、左プローブ、標的サンプル、およびＴ４ＲＮＡリガーゼを接
触させ （ここに右プローブおよび左プローブは標的配列とハイブリダイズして、右プロ
ーブの５’末端および左プローブの３’末端が隣接し、連結可能であるように設
計されており、 右プローブの少なくとも５’末端ヌクレオチドおよび左プローブの少なくとも
３’末端ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであり、 標的配列はリボヌクレオチドから構成される）、 （ｂ）右プローブ、左プローブ、標的サンプル、およびＴ４ＲＮＡリガーゼを、
標的配列に対する右プローブおよび左プローブのハイブリダイゼーションを促進
し、ならびに右プローブと左プローブのライゲーションを促進する条件下でイン
キュベートする （ここに、右プローブおよび左プローブは標的配列が標的サンプル中に存在する
場合に連結される）。1. A method for detecting a nucleic acid comprising the steps of: (a) contacting a right probe, a left probe, a target sample, and T4 RNA ligase (where the right probe and the left probe hybridize with the target sequence). The 5'end of the right probe and the 3'end of the left probe are adjacent to each other and are designed so that they can be ligated. The target sequence is composed of ribonucleotides), (b) the right probe, the left probe, the target sample, and the T4 RNA ligase,
Incubate under conditions that promote hybridization of the right and left probes to the target sequence and facilitate ligation of the right and left probes (wherein the right and left probes have the target sequence present in the target sample). If concatenated). 【請求項２】 右プローブおよび左プローブが同一の開環プローブのそれぞ
れ５’末端および３’末端であり、ここに右プローブおよび左プローブのライゲ
ーションにより増幅標的サークルが形成される、請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the right probe and the left probe are the 5 ′ end and the 3 ′ end of the same ring-opening probe, respectively, and the amplification target circle is formed by ligation of the right probe and the left probe. The method described. 【請求項３】 さらに以下の工程を含む、請求項２に記載の方法： （ｃ）ローリングサークル複製プライマーおよび増幅標的サークルを接触させ、
ローリングサークル複製プライマーおよび増幅標的サークルを、増幅標的サーク
ルとローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進
する条件下でインキュベートし、ならびに、 （ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、増幅標的サークル、およびローリングサークル複製
プライマーを接触させ、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅標的サークル、およびローリ
ングサークル複製プライマーを、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でイ
ンキュベートする （ここに増幅標的サークルの複製により直列型配列ＤＮＡが形成される）。3. The method according to claim 2, further comprising the step of: (c) contacting a rolling circle replication primer with an amplification target circle,
Rolling circle replication primer and amplification target circle are incubated under conditions that promote hybridization between amplification target circle and rolling circle replication primer, and (d) DNA polymerase, amplification target circle, and rolling circle replication primer And the DNA polymerase, the amplification target circle, and the rolling circle replication primer are incubated under conditions that promote replication of the amplification target circle, where replication of the amplification target circle forms tandem sequence DNA. 【請求項４】 工程（ｄ）と同時か、あるいは工程（ｄ）の後に以下の工程
をさらに含む、請求項３に記載の方法： （ｅ）セカンダリーＤＮＡストランド置換プライマーおよび直列型配列ＤＮＡを
、（ｉ）直列型配列ＤＮＡとセカンダリーＤＮＡストランド置換プライマーとの
間のハイブリダイゼーション、および（ｉｉ）直列型配列ＤＮＡの複製を促進す
る条件下で接触させる （ここに直列型配列ＤＮＡの複製によりセカンダリー直列型配列ＤＮＡが形成さ
れる）。4. The method according to claim 3, further comprising the following steps simultaneously with step (d) or after step (d): (e) a secondary DNA strand displacement primer and a tandem sequence DNA, Contacting is carried out under conditions that promote (i) hybridization between the tandem sequence DNA and the secondary DNA strand displacement primer, and (ii) replication of the tandem sequence DNA (wherein the secondary tandem by replication of the tandem sequence DNA Type sequence DNA is formed). 【請求項５】 工程（ｄ）と同時か、あるいは工程（ｄ）の後に以下の工程
をさらに含む、請求項３に記載の方法： （ｅ）ＲＮＡポリメラーゼおよび直列型配列ＤＮＡを、直列型配列ＤＮＡの転写
を促進する条件下で接触させる （ここに直列型配列ＤＮＡの転写により直列型配列ＲＮＡが形成される）。5. The method according to claim 3, further comprising the following steps simultaneously with step (d) or after step (d): (e) RNA polymerase and tandem array DNA, tandem array Contact is made under conditions that promote transcription of DNA (where transcription of tandem sequence DNA forms tandem sequence RNA). 【請求項６】 ローリングサークル複製プライマーが、標的分子と結合する
特異的結合分子とカップリングされている、請求項３に記載の方法。6. The method of claim 3, wherein the rolling circle replication primer is coupled with a specific binding molecule that binds the target molecule. 【請求項７】 折りたたみプローブを直列型配列ＤＮＡと混合し、折りたた
みプローブと直列型配列ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件
下でインキュベートすることにより、直列型配列ＤＮＡが折りたたまれる、請求
項３に記載の方法。7. The tandem sequence DNA is folded by mixing the foldable probe with the tandem sequence DNA and incubating under conditions that promote hybridization between the fold probe and the tandem sequence DNA. The method according to 3. 【請求項８】 折りたたみプローブを直列型配列ＤＮＡと混合する前、ある
いは混合すると同時に、検出プローブを直列型配列ＤＮＡと混合し、検出プロー
ブと直列型配列ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でイン
キュベートすることをさらに含む、請求項７に記載の方法。8. Conditions under which the detection probe is mixed with the tandem sequence DNA before or at the same time as mixing the folding probe with the tandem sequence DNA to promote hybridization between the detection probe and the tandem sequence DNA. 8. The method of claim 7, further comprising incubating under. 【請求項９】 標的配列が５’領域、３’領域、および５’領域と３’領域
間に位置する中央領域を含み、 ここに右プローブおよび左プローブが、同一の標的配列の５’領域および３’
領域とそれぞれ相補的であり、 開環プローブの左プローブ部分および開環プローブの右プローブ部分がいずれ
も、標的配列の中央領域と相補的でなく、ならびに、 工程（ａ）が、１またはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドおよび右プロ
ーブ、左プローブ、標的サンプル、およびＴ４ＲＮＡリガーゼを接触させる（こ
こに各ギャップオリゴヌクレオチドが標的配列の中央領域のすべてまたは部分と
相補的である）ことをさらに含む、請求項２に記載の方法。9. The target sequence comprises a 5'region, a 3'region, and a central region located between the 5'region and the 3'region, wherein the right probe and the left probe are the 5'region of the same target sequence. And 3 '
Each of which is complementary to the region, neither the left probe portion of the open probe nor the right probe portion of the open probe is complementary to the central region of the target sequence, and step (a) comprises one or more Of GAP oligonucleotides and right probe, left probe, target sample, and T4 RNA ligase, wherein each gap oligonucleotide is complementary to all or part of the central region of the target sequence. The method described in 2. 【請求項１０】 右プローブまたは左プローブが基質とカップリングされて
いる、請求項１に記載の方法。10. The method of claim 1, wherein the right probe or the left probe is coupled to the substrate. 【請求項１１】 基質が、他のプローブがアレイとしてカップリングされて
いる表面である、請求項１０に記載の方法。11. The method of claim 10, wherein the substrate is a surface onto which other probes are coupled as an array. 【請求項１２】 基質がマグネティックビーズである、請求項１０に記載の
方法。12. The method of claim 10, wherein the substrate is magnetic beads. 【請求項１３】 右プローブ、左プローブ、または両者が検出ラベルとカッ
プリングされている、請求項１に記載の方法。13. The method of claim 1, wherein the right probe, the left probe, or both are coupled with a detection label. 【請求項１４】 右プローブが基質とカップリングされ、左プローブが検出
ラベルとカップリングされているか、あるいは左プローブが基質とカップリング
され、右プローブが検出ラベルとカップリングされており、 ここに左プローブと右プローブとのライゲーションにより、検出ラベルが基質
とカップリングされる、請求項１３に記載の方法。14. The right probe is coupled to the substrate and the left probe is coupled to the detection label, or the left probe is coupled to the substrate and the right probe is coupled to the detection label, wherein 14. The method of claim 13, wherein the detection label is coupled to the substrate by ligation of the left probe and the right probe. 【請求項１５】 基質が、他のプローブがアレイとしてカップリングされて
いる表面であるか、あるいは基質がビーズである、請求項１４に記載の方法。15. The method according to claim 14, wherein the substrate is a surface to which other probes are coupled as an array, or the substrate is a bead. 【請求項１６】 標的サンプルがｍＲＮＡのサンプルである、請求項１に記
載の方法。16. The method of claim 1, wherein the target sample is a sample of mRNA. 【請求項１７】 標的サンプルが固定化された核酸集団である、請求項１に
記載の方法。17. The method of claim 1, wherein the target sample is an immobilized nucleic acid population. 【請求項１８】 標的サンプルが、細胞、組織、体液、環境サンプル、また
はインビトロ核酸合成から得られた核酸サンプルである、請求項１に記載の方法
。18. The method of claim 1, wherein the target sample is a cell, tissue, body fluid, environmental sample, or nucleic acid sample obtained from in vitro nucleic acid synthesis. 【請求項１９】 核酸サンプルが細胞から得られたものである、請求項１８
に記載の方法。19. The nucleic acid sample is obtained from cells.
The method described in. 【請求項２０】 細胞がヒト由来である、請求項１９に記載の方法。20. The method of claim 19, wherein the cells are of human origin. 【請求項２１】 連結された左および右プローブがリガーゼ連鎖反応を用い
て増幅される、請求項１に記載の方法。21. The method of claim 1, wherein the ligated left and right probes are amplified using the ligase chain reaction. 【請求項２２】 連結された左および右プローブの増幅が以下の工程によっ
て行われる、請求項２１に記載の方法： （ｃ）左相補性プローブ、右相補性プローブ、連結された右および左プローブ、
およびリガーゼを接触させ（ここに左相補性プローブは左プローブと相補的であ
り、右相補性プローブは右プローブと相補的である）、 （ｄ）左相補性プローブ、右相補性プローブ、連結された右および左プローブ、
およびリガーゼを、連結された右および左プローブに対する左相補性プローブお
よび右相補性プローブのハイブリダイゼーションを促進し、ならびに左相補性プ
ローブおよび右相補性プローブのライゲーションを促進する条件下でインキュベ
ートし、 （ｅ）左プローブおよび右プローブ、連結された右および左相補性プローブ、左
相補性プローブおよび右相補性プローブ、および連結された右および左プローブ
を接触させ、 （ｆ）左プローブ、右プローブ、左相補性プローブ、右相補性プローブ、連結さ
れた右および左プローブ、連結された左および右相補性プローブ、およびリガー
ゼを、連結された右および左プローブに対する左相補性プローブおよび右相補性
プローブのハイブリダイゼーションを促進し、連結された右および左相補性プロ
ーブに対する左プローブおよび右プローブのハイブリダイゼーションを促進し、
左プローブおよび右プローブのライゲーションを促進し、ならびに左相補性プロ
ーブおよび右相補性プローブのライゲーションを促進する条件下でインキュベー
トし、 （ｇ）工程（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれ以上繰り返す。22. The method of claim 21, wherein amplification of the linked left and right probes is performed by the following steps: (c) left complementary probe, right complementary probe, linked right and left probe. ,
And ligase (where the left complementary probe is complementary to the left probe and the right complementary probe is complementary to the right probe), (d) the left complementary probe, the right complementary probe, ligated Right and left probe,
And ligase are incubated under conditions that promote hybridization of the left and right complementary probes to the ligated right and left probes and promote ligation of the left and right complementary probes, e) contacting the left and right probes, the linked right and left complementary probes, the left complementary and right complementary probes, and the linked right and left probes, (f) the left probe, the right probe, the left Complementary probes, right complementary probes, ligated right and left probes, ligated left and right complementary probes, and ligases to the left and right complementary probes for ligated right and left probes. Promotes hybridization, linked right and left complementarity To promote the hybridization of the left probe and the right probe for the robe,
Incubate under conditions that promote ligation of the left and right probes and promote ligation of the left and right complementary probes, and (g) repeat steps (e) and (f) one or more times. . 【請求項２３】 工程（ｃ）と（ｅ）および工程（ｄ）と（ｆ）が同時に行
われる、請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein steps (c) and (e) and steps (d) and (f) are performed simultaneously. 【請求項２４】 標的配列が目的のＲＮＡの部分であり、ここに、連結され
た右および左プローブを用いて目的のＲＮＡの逆転写をプライム化し、ｃＤＮＡ
を形成させ、このｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する、請求項１
に記載の方法。24. The target sequence is a portion of an RNA of interest, wherein the right and left probes are ligated to prime reverse transcription of the RNA of interest to produce a cDNA
And the cDNA is amplified using the polymerase chain reaction.
The method described in. 【請求項２５】 逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応が以下の工程によって
行われる、請求項２４に記載の方法： （ｃ）連結された左および右プローブ、目的のＲＮＡ、および逆転写酵素を、目
的のＲＮＡのｃＤＮＡ合成を促進する条件下でインキュベートし、 （ｄ）ｃＤＮＡ、右ＰＣＲプライマーおよび左ＰＣＲプライマー、および熱安定
ポリメラーゼを接触させ（ここに右および左ＰＣＲプライマーはｃＤＮＡの反対
のストランドと相補的であり、右および左ＰＣＲプライマーはｃＤＮＡの目的の
領域とフランキングしている）、 （ｅ）ｃＤＮＡ、右ＰＣＲプライマー左ＰＣＲプライマー、および熱安定ポリメ
ラーゼを、プライマーハイブリダイゼーション、核酸合成、およびストランド変
性のサイクルを促進する条件下でインキュベートする。25. The method of claim 24, wherein the reverse transcription and the polymerase chain reaction are carried out by the following steps: (c) the linked left and right probes, the RNA of interest, and the reverse transcriptase of interest. Incubated under conditions that promote cDNA synthesis of RNA, (d) contacting the cDNA, right and left PCR primers, and a thermostable polymerase (where the right and left PCR primers are complementary to opposite strands of the cDNA And the right and left PCR primers flank the region of interest of the cDNA), (e) cDNA, right PCR primer, left PCR primer, and thermostable polymerase, primer hybridization, nucleic acid synthesis, and strand denaturation. Incubate under conditions that accelerate the cycle of To 【請求項２６】 右プローブ、左プローブ、標的サンプル、およびＴ４ＲＮ
Ａリガーゼのインキュベーションが、ハイブリダイズされた核酸ストランドの融
解温度を変更する少なくとも１個の添加物の存在下で行われる、請求項１に記載
の方法。26. Right probe, left probe, target sample, and T4RN
The method according to claim 1, wherein the incubation of the A ligase is performed in the presence of at least one additive that modifies the melting temperature of the hybridized nucleic acid strands. 【請求項２７】 添加物がホルムアミドである、請求項２６に記載の方法。27. The method of claim 26, wherein the additive is formamide. 【請求項２８】 右プローブ、左プローブ、およびＴ４ＲＮＡリガーゼを含
むキットであって、 右プローブおよび左プローブが、標的配列とハイブリダイズして、右プローブ
の５’末端および左プローブの３’末端が隣接し、連結可能であるように設計さ
れ、 右プローブの少なくとも５’末端ヌクレオチドおよび左プローブの少なくとも
３’末端ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであり、 標的配列がリボヌクレオチドから構成される、キット。28. A kit comprising a right probe, a left probe, and a T4 RNA ligase, wherein the right probe and the left probe hybridize with a target sequence, and the 5 ′ end of the right probe and the 3 ′ end of the left probe are A kit designed to be contiguous and ligable, wherein at least the 5'terminal nucleotide of the right probe and at least the 3'terminal nucleotide of the left probe are deoxyribonucleotides and the target sequence is composed of ribonucleotides. 【請求項２９】 右プローブおよび左プローブが、開環プローブのそれぞれ
５’末端および３’末端である、請求項２８に記載のキット。29. The kit of claim 28, wherein the right probe and the left probe are the 5'end and 3'end of the open ring probe, respectively. 【請求項３０】 右プローブまたは左プローブが基質とカップリングされて
いる、請求項２８に記載のキット。30. The kit of claim 28, wherein the right probe or the left probe is coupled with the substrate. 【請求項３１】 基質が、他のプローブがアレイとしてカップリングされて
いる表面である、請求項３０に記載のキット。31. The kit of claim 30, wherein the substrate is a surface on which other probes are coupled as an array. 【請求項３２】 基質がマグネティックビーズである、請求項３０に記載の
キット。32. The kit of claim 30, wherein the substrate is magnetic beads. 【請求項３３】 右プローブまたは左プローブが検出ラベルとカップリング
されている、請求項２８に記載のキット。33. The kit according to claim 28, wherein the right probe or the left probe is coupled with a detection label. 【請求項３４】 検出ラベルが放射性同位体、蛍光分子、リン光性分子、酵
素、抗体、またはリガンドである、請求項３３に記載のキット。34. The kit according to claim 33, wherein the detection label is a radioisotope, a fluorescent molecule, a phosphorescent molecule, an enzyme, an antibody, or a ligand. 【請求項３５】 右プローブまたは左プローブのいずれかが基質とカップリ
ングされ、他方のプローブが検出ラベルとカップリングされている、請求項２８
に記載のキット。35. The method of claim 28, wherein either the right probe or the left probe is coupled to the substrate and the other probe is coupled to the detection label.
The kit described in. 【請求項３６】 右プローブ、左プローブ、標的サンプル、およびＴ４ＲＮ
Ａリガーゼを含む組成物であって、 右プローブおよび左プローブが、標的配列とハイブリダイズして、右プローブ
の５’末端および左プローブの３’末端が隣接し、連結可能であるように設計さ
れ、 右プローブの少なくとも５’末端ヌクレオチドおよび左プローブの少なくとも
３’末端ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであり、 標的配列がリボヌクレオチドから構成される、組成物。36. Right probe, left probe, target sample, and T4RN
A composition comprising A ligase, wherein the right probe and the left probe are designed to hybridize with a target sequence such that the 5'end of the right probe and the 3'end of the left probe are adjacent and ligable. A composition wherein at least the 5'terminal nucleotide of the right probe and at least the 3'terminal nucleotide of the left probe are deoxyribonucleotides and the target sequence is composed of ribonucleotides.