JP2003534385A - 被験者の神経に有益な効果をもたらす方法および組成物 - Google Patents

被験者の神経に有益な効果をもたらす方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 被験者の神経に有益な効果、例えば被験者の神経の生存および／または再生を調節する効果をもたらす方法および組成物を提供する。医薬製剤および包装された製剤もまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連する出願 本出願は２０００年６月１日に受理された米国仮特許出願第６０／２０８，７
７８号に対する優先権を主張し、その全内容を参照として援用する。
【０００２】 発明の背景 末梢および中枢神経系の障害は広範囲に認められるが、これらの症状の多くに
ついて有効な治療は行われていない。
【０００３】 発明の概要 本発明は神経学的症状を有する被験者の神経に有益な効果をもたらす方法およ
び組成物を提供する；当該効果は被験者におけるニューロンの生存、軸索の生長
、ニューロンの再生、または神経学的機能の正常化の促進を含む。
【０００４】 一つの観点において本発明は、マクロファージ由来因子、例えばオンコモジュ
リンまたはＴＧＦ−βの治療有効量を被験者に投与すること、それにより被験者
の神経に有益な効果をもたらすことを含む方法を提供する。
【０００５】 他の態様において本発明の方法はさらに、ｃＡＭＰモジュレーターまたは軸索
形成因子を被験者に投与することを含む。 一つの観点において、本発明によれば、マクロファージ由来因子を被験者の中
枢神経系のニューロンに接触させることで、被験者に同因子を投与する。例えば
当該因子を脳室、腰椎領域、または大槽内に注入することにより、被験者の硬膜
下腔内スペースの髄液中に当該因子を投与することができる。このような環境下
で、マクロファージ由来因子を皮質ニューロンまたは網膜神経節細胞に局所的に
投与し、神経に有益な効果をもたらすことができる。
【０００６】 ある態様において、医薬的に受容可能な製剤は持続的投与を提供する、すなわ
ち医薬的に受容可能な製剤を被験者に最初に投与した後少なくとも１週間、また
は他の態様においては少なくとも１ヶ月間、マクロファージ由来因子の有効量を
被験者に提供する。本発明の製剤の持続的投与を達成する手段として、本発明の
因子もしくは他の治療化合物を分散する徐放性のポリマーカプセル、生体分解可
能なマトリクス、または注入ポンプの使用を含む。注入ポンプは皮下、頭蓋内、
または医学的に望ましい他の場所に埋め込むことができる。ある態様において本
発明の治療因子または組成物を髄液内、または局所投与の必要な部位、例えばニ
ューロン損傷部位もしくは神経変性部位のいずれかに、カテーテルを経由して注
入ポンプにより分配するものとする。
【０００７】 もう一つの観点において、本発明はマクロファージ由来因子の治療有効量を軸
索形成因子の治療有効量と合わせて被験者に投与すること、それにより被験者の
神経に有益な効果をもたらすことを含む方法を特徴とする。
【０００８】 さらなる観点において、本発明はマクロファージ由来因子の治療有効量を、軸
索形成因子の治療有効量およびｃＡＭＰモジュレーターの治療有効量と合わせて
被験者に投与すること、それにより被験者の神経に有益な効果をもたらすことを
含む方法を特徴とする。
【０００９】 なおもう一つの観点において、本発明はオンコモジュリンの治療有効量を被験
者に投与すること、それにより被験者の神経に有益な効果をもたらすことを含む
方法を特徴とする。
【００１０】 もう一つの観点において、本発明はオンコモジュリンの治療有効量をＡＦ−１
、ＡＦ−２またはイノシンの治療有効量と合わせて被験者に投与すること、それ
により被験者の神経に有益な効果をもたらすことを含む方法を特徴とする。
【００１１】 マクロファージ由来因子および医薬的に受容可能な担体を含む医薬組成物を、
被験者の神経に有益な効果をもたらすための医薬組成物の使用法の添付文書を添
えて包装することができる。一つの態様において、医薬組成物はｃＡＭＰモジュ
レーターおよび／または軸索形成因子、例えばＡＦ−１、ＡＦ−２またはプリン
例えばイノシンをさらに含むことができる。
【００１２】 本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項より明ら
かになることだろう。
【００１３】
【詳細な説明】
レンズ上に打つ眼内注射は、網膜神経節細胞内のマクロファージの浸潤、アス
トロサイトの刺激、および成長に関与するタンパク質ＧＡＰ−４３の発現増大を
含む、一組の細胞の変化を開始させる。これに続いて視神経の正常に抑制された
環境内で、網膜神経節細胞は生存の改善および前例のない高レベルの軸索の生長
を示す。同様の結果は、レンズの損傷の代わりにマクロファージ活性化物質ザイ
モサンを使用することでも得られた。マクロファージ由来因子、例えばオンコモ
ジュリンまたはＴＧＦ−βはまた、付加的な１つ以上の内因性または外因性の軸
索形成因子を組み合わせるかどうかにかかわりなく、軸索の生長を刺激すること
ができる。
【００１４】 当明細書で使用する場合“マクロファージ由来因子”という用語は、被験者の
神経に有益な効果をもたらす能力を持つマクロファージに由来するあらゆる因子
含む。マクロファージ由来因子はペプチド、例えばオンコモジュリンおよびＴＧ
Ｆ−βを含むがこれに限定されない。
【００１５】 当明細書で使用する場合“神経に有益な効果”は、神経系の一部または神経系
全体のニューロンの健康または機能に好ましい反応または結果を意味する。この
ような効果の例は、ニューロンまたは神経系の一部の傷害への抵抗、再生、好ま
しい機能の維持、成長または生存の能力の改善を含む。“神経に有益な効果をも
たらす”という用語は、このような反応または機能の改善または神経系の成分内
部の回復力を生じさせ、または影響を与えることを含む。例えば神経に有益な効
果をもたらす例として、ニューロン損傷後の軸索生長の刺激；アポトーシスに対
するニューロンの抵抗力を与えること；毒性化合物、例えばβ−アミロイド、ア
ンモニア、またはその他の神経毒に対するニューロンの抵抗力を与えること；加
齢に伴うニューロンの萎縮もしくは機能の喪失の反転；または加齢に伴うコリン
作用性神経支配の喪失の反転を含むものとする。
【００１６】 “軸索形成因子”という用語は、ニューロンからの軸索の再生を刺激する能力
を持つあらゆる因子を含む。軸索形成因子の例は、例えばSchwalb et al.(1996)
Neuroscience 72(4):901-10; Schwalb et al.、同上；および米国特許第：５
，８９８，０６６号（これらの内容を参照として援用する）に記載されているよ
うにＡＦ−１およびＡＦ−２を含む。軸索形成因子のその他の例として、例えば
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ/ＵＳ９８/０３００１号およびBenowitz et al. (1999) Pro
c.Natl.Acad.Sci. 96(23):13486-90（これらの内容を参照として援用する）に記
載されているように、プリン例えばイノシンを含む。
【００１７】 “ｃＡＭＰモジュレーター”という用語は、細胞内のｃＡＭＰの量、産生、濃
度、活性または安定性を調節するまたは、細胞のｃＡＭＰの医薬的活性を調節す
る能力を持つあらゆる化合物を含む。ｃＡＭＰモジュレーターはｃＡＭＰ産生を
導くシグナル伝達経路において、アデニル酸シクラーゼのレベル、アデニル酸シ
クラーゼの上流、またはアデニル酸シクラーゼの下流で、例えばｃＡＭＰ自体の
レベルで、作用することができる。サイクリックＡＭＰモジュレーターは細胞内
で、例えばＧタンパク質、例えばＧｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔのレベルで
、または細胞外で、例えば細胞外レセプター、例えばＧタンパク質とカップルす
るレセプターの膜外のレベルで作用することができる。サイクリックＡＭＰモジ
ュレーターは、アデニル酸シクラーゼ活性化物質、例えばフォルスコリン；８−
ブロモ−ｃＡＭＰ、８−クロロ−ｃＡＭＰ、またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ−
ｃＡＭＰ）を含む非加水分解性のｃＡＭＰ類似体；イソプロテノール；バソアク
ティブ・インテスティナル・ペプチド；カルシウムイオノホア；膜脱分極化物質
(membrane depolarization)；ｃＡＭＰを刺激するマクロファージ由来因子；マ
クロファージの活性化を刺激する物質、例えばザイモサンまたは ＩＮＦ−γ；
ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばペントオキシフィリンおよびテオフィリン
；特異的ホスホジエステラーゼＩＶ（ＰＤＥ ＩＶ）阻害剤；およびβ２−アド
レナリン受容体アゴニスト、例えばサルブタモールを含む。ｃＡＭＰモジュレー
ターという用語はまた、ｃＡＭＰの産生、機能、活性または安定性を阻害する化
合物、例えばホスホジエステラーゼ、例えばサイクリックヌクレオチドホスホジ
エステラーゼ３Ｂも含む。ｃＡＭＰの産生、機能、活性または安定性を阻害する
ｃＡＭＰモジュレーターは当該技術分野で知られており、例えばNano et al.(20
00) Pflugers Arch 439(5):547-54（この内容を参照して援用する）に記載され
ている。
【００１８】 “ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤”は、酵素ホスホジエステラーゼＩＶの活
性を阻害する物質をいう。ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤の例は当該技術分野
で知られており、４−アリールピロリジノン、例えばロリプラム、ニトラカゾン
、デンブフィリン、チベネラスト、ＣＰ−８０６３３、およびＣＰ−７７０５９
のようなキナゾリンジオン(quinazplinedione)を含む。
【００１９】 “ベータ−２アドレナリン受容体アゴニスト”はベータ−２アドレナリン受容
体を刺激する物質をいう。ベータ−２アドレナリン受容体アゴニストの例は当該
技術分野で知られており、サルメテロール、フェノテロール、およびイソプロテ
ネロールを含む。
【００２０】 被験者に“投与する”という用語は、被験者の所望の場所に活性化合物を投与
するため、適切な経路により被験者に医薬製剤中の活性化合物を分配、投与、充
当することを含み、非経口もしくは経口のいずれかによる投与、筋注、皮下注／
皮内注、静注、頬粘膜投与、経皮塗布および直腸、結腸、膣、鼻腔内または気道
経由による投与を含む。
【００２１】 当明細書で使用する場合“接触する”という言葉は、本発明の化合物がニュー
ロンに関する有益な効果をもたらすことのできるよう、ニューロンの近位に同化
合物を注入するin vivo またはin vitro 双方の方法を含むものとする。
【００２２】 当明細書で使用する場合“有効量”という用語は、所望の結果を得るために、
例えば被験者の神経に有益な効果をもたらすのに十分な、必要な投与量および投
与期間での有効な量を含む。当明細書で定義する活性化合物の有効量は様々な因
子、例えば被験者の症状、年齢ならびに体重、および被験者の体内で所望の反応
を誘発する活性化合物の能力により変わり得る。最適の治療反応を提供するよう
に投与計画を調整することができる。有効量はまた、活性化合物のいかなる毒性
または有害な影響も治療に有利な効果で相殺できる量でもある。
【００２３】 活性化合物の治療有効量または投与量は約０．００1から３０ｍｇ／ｋｇ体重
の範囲で変化し得るが、約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１から２０
ｍｇ／ｋｇ体重、約１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、２から９ｍｇ／ｋｇ体重、３か
ら８ｍｇ／ｋｇ体重、４から７ｍｇ／ｋｇ体重、そして５から６ｍｇ／ｋｇ体重
を含む、本発明の他の範囲もこれに含まれる。当業者は、ある種の因子は被験者
を有効に治療するために必要な投与量に影響し得ると理解するだろう。これらの
因子は病気または疾患の重症度、治療歴、被験者の全身の健康状態および／また
は年齢、および現在かかっている他の病気を含むがこれに限定されない。さらに
活性化合物の治療有効量による被験者の治療は、１回の治療または一連の治療を
含むことができる。一例として、被験者を約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の範
囲の活性化合物で、１週間に１回を約１から１０週間治療する、あるいは２から
８週間、約３から７週間、約４、５または６週間治療する。治療に用いる活性化
合物の有効投与量を、特定の治療コースを通して増減してよいことも理解できる
だろう。
【００２４】 “被験者”という用語は動物を含むものとする。特定の態様において、被験者
は哺乳類、すなわちヒトまたはヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ま
たはげっ歯類である。
【００２５】 “神経学的障害”は、被験者の神経系の正常な機能または解剖学的に直接また
は間接的に影響を及ぼす病気、疾患、または症状を含むものとする。本発明の化
合物および方法で有効に治療できる障害が影響を及ぼす神経系の要素は、中枢神
経系、末梢神経系、体神経系、自律神経系、交感神経系および副交感神経系の構
成成分、目、耳、鼻、口またはその他の器官内の神経感覚組織、さらにニューロ
ン細胞および構造に関与するグリア組織を含む。神経学的障害はニューロンの損
傷、例えば物理的損傷もしくは毒性化合物による損傷、ニューロンの異常な増殖
もしくは発育、またはニューロンの活動度のミスレギュレーション（例えばダウ
ンレギュレーションもしくはアップレギュレーション）に起因し得る。神経学的
障害は神経系の機能、例えば感覚機能（体内および外部環境の変化を知覚する能
力）；統合機能（変化を分析する能力）；および運動機能（運動の開始、例えば
筋肉の収縮または分泌腺からの分泌による解釈に応答する能力）に有害な影響を
及ぼす可能性がある。神経学的障害の例は、末梢神経もしくは頭部神経、脊髄も
しくは脳、頭部神経への外傷または毒物による障害、外傷性の脳損傷、発作、大
脳動脈瘤、および脊髄の損傷を含む。他の神経学的障害は認知障害および神経変
性障害、例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に関与する痴呆（例えばピ
ック病）、パーキンソン病およびその他の瀰漫性レウイ小体(Lewy diffuse body
) 病、老人性痴呆、ハンチントン病、トゥーレット症候群、多発性硬化症、筋萎
縮性外側性硬化症、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（シャルコーマリート
ゥース病）、糖尿病性ニューロパシー、進行性核上麻痺、癲癇、およびクロイツ
フェルトヤコブ病、を含む。自律神経機能障害はハイパーテンションおよび睡眠
障害を含む。神経精神医学的障害、例えば鬱病、精神***病、***感情症、コル
サコフ精神病、躁病、不安症、または恐怖症、学習もしくは記憶障害（例えば記
憶消失および加齢に伴う記憶喪失）注意力欠損障害、気分変調障害、主要な鬱病
、癲癇、強迫障害、精神活性物質使用による障害、不安症、恐怖症、パニック障
害、二極性情動障害、精神病発現薬性疼痛症候群、および摂食障害もまた、本発
明の化合物および方法で治療することができる。神経学的障害の他の例は、感染
症（例えば髄膜炎、様々な病因による高熱、ＨＩＶ，梅毒またはポリオ症候群の
後遺症）による神経系への損傷、および電気的（電気もしくは雷との接触、およ
び電気痙攣性の精神医学的治療の合併症を含む）による神経系への傷害を含む。
新生児および幼児初期と同様に妊娠中の多くの段階を通しての中枢神経系の発達
において、脳の発達は神経毒性の標的であり、本発明の方法は、神経学的な出生
障害を伴うものを含む、このような治療を必要とする子宮内の胚もしくは胎児、
未熟児、または幼児における神経学的欠損の予防または治療に使用することがで
きる。さらなる神経学的障害は、例えばHarrison's Principles of Internal Me
disine (Braunwald et al.,McGraw-Hill,2001)およびAmerican Psychiatric Ass
ociation's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV
(American Psychiatric Press,2000)に列記されているものを含み、双方を全内
容について参照として援用する。
【００２６】 “発作”という用語は当業者の理解するところであるが、脳の動脈の破裂また
は妨害（例えば血液凝固による）に起因する、意識、知覚および随意運動の突然
の減少または喪失を含むものとする。
【００２７】 “外傷性脳損傷”は当業者の理解するところであるが、頭部への外傷性殴打が
、しばしば頭蓋骨の貫通を伴わない場合にも脳または接続する脊髄へのダメージ
を引き起こす症状を含むものとする。通常、最初の外傷により血腫の拡大、クモ
膜下出血、大脳浮腫、頭蓋内圧の上昇、および大脳の低酸素を起こす可能性があ
り、それが今度は大脳の血流低下による重症の二次的障害をもたらすこともある
。
【００２８】 “生長”という用語は軸索または樹状突起がニューロンから伸長する突起を含
む。生長は新しい神経突起を突出し、またはすでに存在している細胞突起を拡大
することができる。軸索の生長は軸索突起の直線方向への５細胞直径以上の伸長
を含みうる。神経突起形成を含むニューロンの成長突起は、例えば免疫染色法で
検出できるＧＡＰ−４３の発現により証明することができる。“軸索の生長を調
節する”は、軸索の生長を刺激したり阻害したりして、標的の神経学的障害に有
益な効果をもたらすことを意味する。
【００２９】 “ＣＮＳニューロン”という用語は脳、大脳神経および脊髄のニューロンを含
むものとする。 本発明の様々な観点を以下のサブセクションでさらに詳細に説明する： 医薬的に受容可能な製剤 マクロファージ由来因子および医薬的に受容可能な担体を含む医薬組成物およ
び包装された製剤もまた、本発明により提供する。これらの医薬組成物はまた、
軸索形成因子および／またはｃＡＭＰモジュレーターを含むことができる。
【００３０】 本発明の方法において、マクロファージ由来因子は所望により軸索形成因子お
よび／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて、医薬的に受容可能な１つの製
剤として投与することができる。このような医薬的に受容可能な製剤は、マクロ
ファージ由来因子、さらに医薬的に受容可能な担体（複数）および／または添加
物（複数）を含むことができる。当明細書で使用する場合“医薬的に受容可能な
担体”という用語は、生理学的に適合できるあらゆるそしてすべての溶媒、分散
媒体、コーティング剤、抗菌ならびに抗真菌薬、等張剤ならびに吸収遅延物質等
を含む。例えば担体により髄液への注射に適するようにできる。添加物は医薬的
に受容可能な安定剤および錠剤分解物質を含む。本発明は、巨大分子複合体、ナ
ノカプセル、ミクロスフェア、またはビーズの形の合成または天然ポリマー、お
よび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、合成膜小胞、および再封入し
た赤血球を含む脂質ベースの製剤を含む、あらゆる医薬的に受容可能な製剤に関
連する。
【００３１】 一つの態様において、医薬的に受容可能な製剤はポリマーのマトリクスを含む
。“ポリマー”または“ポリマーの”という用語は当業者の理解するところであ
るが、標的の症状、例えば神経学的障害の治療を行うマクロファージ由来因子の
投与を可能にする、モノマーユニットの繰り返しを含む構造的枠組みを含む。こ
の用語はまた合成または天然に生成されるコポリマーおよびホモポリマーを含む
。直鎖ポリマー、分枝鎖ポリマー、および架橋したポリマーもまた含まれること
を意味する。
【００３２】 例えば本発明で使用する、医薬的に受容可能な製剤の形成に適したポリマーの
素材は、天然に由来するポリマー、例えばアルブミン、アルギン酸塩、セルロー
ス誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチンおよび多糖に加えて、合成ポリマ
ー、例えばポリエステル（ＰＬＡ、ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール、ポロ
キサマー、ポリ無水物、およびプルロニック(pluronic)も含む。これらのポリマ
ーは、中枢神経系を含む神経系と生体適合し(biocopmatible)、いかなる毒性分
解副生成物を生成することもなく中枢神経系内で生分解可能であり、ポリマーの
力学的特性を操作することで活性化合物の放出の方法および期間を調整できる能
力を有する。当明細書で使用する場合“生分解可能な”という用語は、被験者の
体内における酵素作用、加水分解作用および／または他の同様のメカニズムによ
り、ポリマーが時間を経て分解されることを意味する。当明細書で使用する場合
、“生体適合する”という用語は、ポリマーが毒性または有害となることなく、
そして免疫学的拒絶の原因となることなく、生きている組織または生きている器
官に適合することを意味する。ポリマーは当該技術分野に公知の方法を用いて製
造することができる。
【００３３】 ポリマー製剤は、米国特許第４，８８３，６６６号（これを参照として援用す
る）に記載されているように液化ポリマー中に活性化合物を分散させることによ
り、またはOdian G.,Principles of Polymerrization and ring opening polym
erization, 2nd ed.,John Wiley & Sons,New York, 1981(この内容を参照として
援用する)に記載されているように大量重合（bulk polymerization）、界面（in
terfacial）重合、溶液（solution）重合、および環状（ring）重合のような方
法より製造することができる。製剤の特性および特徴は、反応温度、ポリマーお
よび活性化合物の濃度、使用する溶媒のタイプ、および反応時間といったパラメ
ーターを様々に変化させることにより調節する。
【００３４】 活性治療化合物を１つ以上の医薬的に受容可能なポリマー内にカプセル化し、
本明細書で互換性を持って使用する用語であるミクロカプセル、ミクロスフェア
、またはミクロ粒子を形成させることができる。ミクロカプセル、ミクロスフェ
ア、およびミクロ粒子は従来、直径２ミリまたはそれ未満、通常は直径５００ミ
クロンまたはそれ未満の球状粒子からなる流動性の粉末をいう。１ミクロン未満
の粒子は従来、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェアという。大体のところミ
クロカプセルとナノカプセル、ミクロスフェアとナノスフェア、ミクロ粒子とナ
ノ粒子の違いはサイズである；一般に両者の内部構造にはほとんど差はない。本
発明の一つの観点において、直径の平均は約４５μｍ未満、好ましくは２０μｍ
、より好ましくは約０．１と１０μｍの間である。
【００３５】 もう一つの態様において、医薬的に受容可能な製剤は脂質ベースの製剤を含む
。本発明を実施する上で、公知のいかなる脂質ベースの薬剤投与システムを使用
することもできる。例えば多胞状リポソーム、多重膜リポソーム、および単膜リ
ポソームはすべて、カプセル化された活性化合物の持続的放出速度を確定できる
限り使用することができる。放出を調節できる多胞状リポソーム薬剤投与システ
ムの製造法はＰＣＴ出願第ＵＳ９６／１１６４２、ＵＳ９４／１２９５７および
ＵＳ９４／０４４９０に記載されており、これらの内容を参照として援用する。
【００３６】 合成膜小胞の組成は通常リン脂質の混合物質であり、通常ステロイド、特にコ
レステロールと組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質を使用してもよ
い。
【００３７】 合成膜小胞の製造に有用な脂質の例として、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン
、スフィンゴリピド、セレブロシド、およびガングリオシドを含み、好ましい態
様として卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジ
ステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイル(dioleoyl)ホスファチジルコ
リン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、およびジオレオイルホスフ
ァチジルグリセロールを含む。
【００３８】 活性化合物を含む脂質ベースの小胞の製造において、活性化合物カプセル化の
効率、活性化合物の変化、得られる小胞群の均一性およびサイズ、活性化合物と
脂質の比率、透過性、製剤の不安定性、および製剤の医薬的受容性といった様々
な要因を考慮しなければならない。
【００３９】 注入の前に、当該技術分野の多数の利用可能な技術のいずれかにより、例えば
ガンマ線放射または電子ビーム殺菌により当製剤を殺菌することができる。 医薬的に受容可能な製剤の投与 本発明の医薬的に受容可能な製剤は、活性化合物が被験者の神経系に接触し、
それにより神経に有益な効果をもたらすように投与する。本発明では、製剤の局
所投与および全身投与の双方を意図している。局所投与の所望の特徴は、活性化
合物が有効な局所濃度に達すること、さらに活性化合物の全身投与によるマイナ
スの副作用を避けることを含む。一つの態様において、活性化合物を被験者の脳
脊髄液に注入することにより投与する。本発明のある観点において、活性化合物
を脳室、腰椎領域、または大槽内に注入する。もう一つの観点において活性化合
物を局所的に、例えば神経もしくは脊髄損傷部位、疼痛もしくはニューロンの変
性部位、または網膜神経細胞に接触するよう眼内に注入する。
【００４０】 医薬的に受容可能な製剤を水性の媒質に懸濁させ、従来の皮下針によりまたは
注入ポンプを用いて注入することができる。 一つの態様において、本明細書に記載の活性化合物製剤を被験者にＣＮＳへの
損傷から一定時間内に、例えば損傷発生後約１００時間までに、例えば損傷時か
ら２４，１２または６時間以内に投与する。
【００４１】 本発明のもう一つの態様において、活性化合物製剤を被験者に硬膜下腔内に投
与する。当明細書で使用する場合“硬膜下腔内投与”という用語は、バーホール
(burrhole)もしくは大槽からの外側脳室への注射、または腰椎穿刺または同様の
方法（Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Application
s in Neurosurgery, 143-192 および Omaya et al.,Cancer Drug Delivery,1:16
9-179に記載されており、これらの内容を参照として援用する）を含む技術によ
り、活性化合物製剤を被験者の脳脊髄液中に直接投与することを含むものとする
。“腰椎領域”という用語は、第３および第４腰椎（背中下部）間の領域を含む
ものとする。“大槽”という用語は、後頭部の頭蓋骨末端と脊髄先端の間の領域
を含むものとする。“脳室”という用語は、脊髄の中心管に連なる脳の中空部分
を含むものとする。上述のあらゆる部位への活性化合物の投与は、活性化合物製
剤を直接注射する、または注入ポンプを使用することにより行うことができる。
埋め込み式または外付けのポンプ、およびカテーテルを使用できる。
【００４２】 注射用に本発明の活性化合物を液体溶液、好ましくは医薬的に適合するバッフ
ァー、例えばハンクス液またはリンガー液にて製剤化できる。加えて活性化合物
製剤を個体の形に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁させてもよい。凍結乾
燥の形態も含まれる。活性化合物製剤を例えばボーラスで（一度に）注入、また
は（例えば注入ポンプを使用して）持続的に注入することができる。
【００４３】 本発明の一つの態様において、活性化合物製剤を側脳室への注射により被験者
の脳に、好ましくは損傷（中枢神経系のニューロンの軸索の迷走性生長を特徴と
する症状に至る）発生時の１００時間以内（例えば損傷時の６，１２または２４
時間以内）に投与する。注射は例えば被験者の頭蓋骨に空けられたバーホールよ
り行うことができる。もう一つの態様において、製剤を被験者の脳室内に外科的
に挿入したシャントより、好ましくは損傷発生時の１００時間以内（例えば損傷
時の６，１２または２４時間以内）に投与する。例えばより小さい第３および第
４脳室にもできるが、より大きな側脳室に注射することができる。まだもう一つ
の態様において、活性化合物製剤を被験者の大槽または腰椎領域に注射すること
により、好ましくは損傷発生時の１００時間以内（例えば損傷時の６，１２また
は２４時間以内）に投与する。
【００４４】 頭蓋内への投与の付加的な手段として嗅上皮への本発明の化合物の投与を含み
、この場合化合物は続いて嗅球に伝送され、脳のより近位の部分に移送されるこ
とになる。このような投与は噴霧またはエアゾール製剤により行うことができる
。
【００４５】 本発明のもう一つの態様において活性化合物製剤を被験者の損傷部位に、好ま
しくは損傷発生時の１００時間以内（例えば損傷時の６，１２または２４時間以
内）に投与する。
【００４６】 投与の期間およびレベル 本発明の方法の好ましい態様において、神経に有益な効果をもたらす、例えば
軸索生長を有効に調整するために長期間、活性化合物を被験者に投与する。活性
化合物への持続的な接触は、例えば一定期間以上、例えば１週間、数週間、１ヶ
月またはそれ以上の間、活性化合物を繰り返し投与することにより達成できる。
より好ましくは活性化合物の投与に使用する医薬的に受容可能な製剤が持続的投
与、例えば被験者への活性化合物の“徐放”を提供することである。例えば医薬
的に受容可能な製剤を被験者に投与した後、少なくとも１，２，３、または４週
間、製剤が活性化合物を供与できるようにする。好ましくは、本発明にしたがっ
て治療する被験者は（繰り返し投与または持続的な投与システム使用のいずれか
により、またはその双方により）少なくとも３０日間、活性化合物による治療を
受ける。
【００４７】 本明細書で使用する場合“持続的投与”という用語は、投与後の一定期間、少
なくとも数日間、１週間、数週間、１ヶ月またはそれ以上の間にわたるin vivo
での活性化合物の連続的投与を含むものとする。活性化合物の持続的投与は、例
えば治療期間中の活性化合物の継続的な治療効果により示すことができる（例え
ばマクロファージ由来因子の持続的投与は、被験者の神経に有益な効果が継続的
に得られることより示すことができる）。あるいは活性化合物の持続的投与を、
治療期間中活性化合物の存在をin vivo で検出することにより示すことができる
。
【００４８】 持続的投与を得られる好ましい方法は、ポリマーカプセル、製剤を投与するミ
ニポンプ、生体分解可能な埋め込みタイプ、またはトランスジェニックした自己
由来細胞移植の使用(例えば、米国特許第6,214,622号に記載されている)を含む
。埋め込みのできる注入ポンプシステム（例えばInfusaid；例えばZierski,J.et
al.(1988) Acta Neurochem. Suppl.43:94-99; Kanoff,R.B.(1944) J.Am.Osteop
ath.Assoc.94:487-493 を参照のこと）および浸透ポンプ（Alza Corporation よ
り販売）は当該技術分野において入手可能である。投与のもう一つの方法は、埋
め込みができ、外部からプログラムできる注入ポンプである。適切な注入ポンプ
および貯蔵システムはまた、Blomquistによる米国特許第５，３６８，５６２号
および Doan による米国特許第４，７３１，０５８号にも記載され、Pharmacia
Deltec Inc.により開発されている。
【００４９】 投与量は、軽減すべき症状の重症度により様々に変化し得ることに注意しなけ
ればならない。さらにあらゆる特定の被験者のための特定の投与計画は、投与を
必要とする各個人、および活性化合物を投与しそれを監督する人の専門的判断に
より、治療期間を通して調整されなければならず、当明細書に設定した投与量の
範囲は典型例に過ぎず、本発明の請求の範囲または実践を限定することは意図し
ていないことを理解しなければならない。
【００５０】 本発明はもう一つの態様において、本質的にマクロファージ由来因子および医
薬的に受容可能な担体を含む医薬組成物、さらに同組成物を中枢神経系のニュー
ロンに接触させることにより軸索の生長を調整するためのその使用法を提供する
。“本質的に含む”という用語により、医薬組成物がその他のいかなるニューロ
ン成長モジュレーター、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）も含まないことを意味す
る。一つの態様において、本発明の医薬組成物を包装された製剤として提供する
ことができる。包装された製剤は、容器に入れた本発明の医薬組成物、および神
経学的障害を持つ被験者の神経に有益な効果をもたらすための同組成物の投与法
を印刷した添付文書を含むことができる。ニューロンの軸索の生長を調整するた
めの薬剤の製造におけるマクロファージ由来因子の使用もまた、本発明に包含さ
れる。
【００５１】 ＣＮＳニューロンの in vitro 治療 中枢または末梢神経系由来のニューロンをin vitroでマクロファージ由来因子
と（単独でまたは軸索形成因子および／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせ
て）接触させ、in vitroで軸索の生長を調整することができる。したがって当該
技術分野で公知の技術を用いて、被験者よりニューロンを単離してin vitroで成
長させ、その後本発明にしたがって治療し、軸索の生長を調整することができる
。手短には適切な基質(例えば培養皿)に付着する神経組織小片からニューロンを
遊走させることにより、または組織を例えば機械的にもしくは酵素によりばらば
らにしてニューロン懸濁液を作成することにより、ニューロンの培養を行うこと
ができる。例えば酵素はトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニ
ダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、またはそれらを様々に組み合
わせて使用することができる。ニューロン組織の単離、および組織をばらばらに
して単離細胞を得る方法はFreshney, Culture of Animal Cells, A Manual of B
asic Technique,Third Ed.,1994 に記載されており、その内容を参照として援用
する。
【００５２】 このような細胞を次にマクロファージ由来因子（単独でまたは軸索形成因子お
よび／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて）と、上述の量および期間で接
触させることができる。ニューロンにおける軸索の生長の調整が一度達成されれ
ば、これらの細胞を被験者に、例えば移植により再び投与できる。
【００５３】 スクリーニングアッセイ 被験者の神経に有益な効果をもたらすマクロファージ由来因子（単独でまたは
軸索形成因子および／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて）の能力は、公
知の様々な方法およびアッセイのいずれを用いても評価することができる。例え
ば損傷、例えば中枢神経系の損傷後、神経の接続および／または機能を再び確立
するマクロファージ由来因子（単独でまたは軸索形成因子および／またはｃＡＭ
Ｐモジュレーターと合わせて）の能力は、（神経組織の切片を作りニューロンの
分枝を見ることにより、または色素の細胞質の移動を示すことにより）組織学的
に決定することができる。損傷、例えば中枢神経系の損傷後、神経の接続および
／または機能を再び確立する本発明の化合物の能力はまた、網膜神経または視神
経の傷害後エレクトロレチノグラムを完全にもしくは部分的に回復する；または
傷害を受けた目の光に対する瞳孔の反応を完全にもしくは部分的に回復する、マ
クロファージ由来因子（単独でまたは軸索形成因子および／またはｃＡＭＰモジ
ュレーターと合わせて）の能力をモニターすることによっても評価することがで
きる。
【００５４】 被験者の神経に有益な効果をもたらすマクロファージ由来因子（単独でまたは
軸索形成因子および／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて）の能力を決定
するために使用できるその他の試験には、脊髄損傷のヒトの被験者または動物モ
デルにおける、標準的な神経学的機能検査（例えば標準的な反射検査、泌尿器科
学検査、尿力学検査、深部および表層部疼痛評価の検査、後足の固有受容の位置
認識、歩行、誘発電位検査）を含む。加えて神経に有益な効果をもたらす指標と
して、被験者の神経インパルス伝導、例えば伝導活動電位を測定することにより
測定することができる。
【００５５】 本発明のアッセイの使用に適する動物モデルは、部分的に神経を切断したラッ
トモデル（Weidner et al.(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3513-3518 に記
載）を含む。この動物モデルは、ほぼ完全に切断された脊髄のうちの損傷を受け
ずに残っているフラグメントの生存および生長を、化合物がいかに高めるかを検
査する。したがってマクロファージ由来因子（単独でまたは軸索形成因子および
／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて）投与後、これらの動物のある種の
機能の回復、例えばラットが前足で餌のペレットをいかにうまく扱えるか（この
動作に関連する脊髄は９７％切断されている）を評価する。
【００５６】 本発明のアッセイの使用に適するもう一つの動物モデルとして、ラットの発作
モデル（Kawamata et al.(1997) Proc,Natl.Acad.Sci.USA 94(15):8179-8184に
記載）を含む。同論文は、損傷後の前庭運動機能と同様に、四肢の知覚運動機能
の評価に使用できる様々な試験について詳細に記載している。これらの動物への
本発明の化合物の投与は、与えられた化合物、投与経路、または投与量が神経に
有益な効果、例えば試験動物における機能レベルの上昇、または機能獲得速度も
しくは機能保持の程度の増加を提供するかどうかの評価に使用することができる
。
【００５７】 発作後のヒトの患者の回復の評価に用いる標準的な神経学的評価もまた、被験
者の神経に有益な効果をもたらすマクロファージ由来因子（単独でまたは軸索形
成因子および／またはｃＡＭＰモジュレーターと合わせて）の能力の評価に用い
ることができる。このような標準的な神経学的評価は、医学技術分野の慣例的手
法、例えばMohrおよび Gautierによる"Guide to Clinical Neurobiology" (Chur
chill Livinrstone Inc.1995)に記載されている。
【００５８】 末梢神経系の機能を評価するための標準的な検査は、筋電図検査、神経伝導速
度測定、誘発電位の評価、体性感覚誘発電位の最小値／最大値を含む。筋電図検
査は筋中の電気的活動度を記録するもので、神経および筋肉の機能評価に利用で
きる。電極を筋中に挿入してその電気的活動度を記録する。挿入中、筋肉が弛緩
している間、および筋肉が収縮している間の活動度を記録する。神経伝導速度検
査は、電気的インパルスがどのくらい速く神経を通って伝播するかを記録するこ
とにより、末梢神経の健康度を評価する。末梢神経は脊髄および筋肉間の情報を
伝達する。多くの神経系疾患はこのインパルスの速度を低下させる可能性がある
。皮膚に固定した電極はインパルスが神経に沿って伝播した後の電気的なシグナ
ルを検出し記録する。第２の刺激電極は神経に沿って小さな電気的チャージを送
る；刺激および反応間の時間が記録され、どのくらい速く完全にインパルスが送
られるかを記録することになる。
【００５９】 脳神経機能の標準的な検査は、神経医学の技術分野で公知の顔面神経伝導検査
；眼輪筋反射検査(瞬き反応検査)；局所的顔面神経病変、ベル麻痺、三叉神経痛
および異型顔面神経疼痛に用いる三叉神経−顔面神経反射の評価；誘発電位の評
価；視覚、脳幹および聴覚誘発電位測定；熱診断小繊維試験(thermo-diagnostic
small fiber testing )およびコンピューターによる定量的知覚検査を含む。
【００６０】 本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、さらに限定するものと解釈す
べきではない。本出願を通して引用したすべての参考文献、特許および公開され
た特許出願の内容を参照として援用する。
【００６１】
【実施例】
以下の材料および方法を本明細書に記載した実施例において使用した。 視神経手術および眼内注射 外科的処置は先に記載した方法（Berry et al.,1996）に基づいて行い、the C
hileren's Hospital Animal Care and Usse Committeeより承認を得た。成体雄
フィッシャー(Fisher) ラット（Charles River Laboratories,Wilmington,MA）
２５０−３５０ｇは無菌の環境下で標準的なケージにて飼育し、自由に摂食させ
た。動物はメトキシフルラン吸入（Schering-Plough,Union,NJ）にて鎮静し、ケ
タミン（６０−８０ｍｇ／ｋｇ：Phoenix Pharmaceutical,St,Joseph,MO）およ
びキシラジン(１０−１５ｍｇ／ｋｇ：Bayer,Shawnee Mission,KA）の腹腔内注
射により麻酔した。頭部を剃毛後、ラットを定位の装置（Kopf Instruments,Tuj
unga,CA）に固定し、右側眼窩上部の皮膚を１−１．５ｃｍ切開した。顕微鏡照
明下で涙腺および外眼筋を切除し、３−４ｍｍの視神経を露出した。神経上膜に
長軸方向に沿ってスリットを入れて開き、眼動脈の損傷を避けるようにして、角
度をつけた宝石商摂子（Dumont ＃５）にて１０秒間、眼球の後方２ｍｍの神経
を挫傷させた。神経の損傷は挫傷部位がクリヤーに見えることにより証明し、一
方網膜の血管の完全性は眼底鏡検査により評価した。網膜の血管の完全性に疑問
があるケースは本研究から除外した。眼内注射のため眼球をモスキートースナッ
プ（mosquito snap）にて抑え、後方面を露出させた。一部のケースは、レンズ
を傷つけないようにしながら、視神経乳頭の上部１−２ｍｍに３０Ｇ針にて強膜
および網膜を貫通するように注射し、針の先端を神経軸索に直角に２ｍｍの深さ
まで挿入した（最も侵襲の少ない注射）；他のケースは、針の先端を９０°曲げ
て視神経乳頭の上２ｍｍの眼球に強膜に直角に挿入し、意図的にレンズ表面を穿
刺した。レンズの損傷は角膜を通して直接見て確認した；レンズの損傷のさらな
る証明は１週間以内に発症する混濁化にて行った。注入量は媒体として食塩水を
用いて５μｌとした；一部のケースでは、注入せずに穿刺の効果のみを観察した
。生存期間は１から４０日間とした。
【００６２】 各群は、手術しないコントロール（Ｎ＝３）、神経挫傷なしでレンズ穿刺の動
物（Ｎ＝１１）、神経挫傷および眼内手術なし（Ｎ＝２４）かまたはレンズ１回
穿刺（Ｎ＝２４）のいずれかの動物；神経挫傷および角膜縁で前方からのレンズ
１回穿刺（Ｎ＝４）または後方からのレンズ複数回穿刺（Ｎ＝３）の動物；神経
挫傷および１回注射（後方からのアプローチによる）で、注入液を組み換え体ラ
ットＣＮＴＦ（５μｇ／ｍｌ、Alamone Labs,Jerusalem,Israel,Ｎ＝５；または
１０μｇ／ｍｌ、Promega Labs,Ｎ＝５）、抗ラットＣＮＴＦポリクローナル抗
体（２０μｇ／ｍｌ、R&D Systems,Minneapolis,MN,Ｎ＝４）、塩基性繊維芽細
胞増殖因子（５μｇ／ｍｌ、Dr.Patricia D'Amore,Childre's Hospital Boston,
MA より供与:Ｎ＝３）、抗ウシ塩基性ＦＧＦ（１−５ｍｇ／ｍｌ、Upstate Biot
echnology,Lake Placid,NY,Ｎ＝４）、抗ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、マウスモノクロー
ナル、５ｍｇ／ｍｌ、Ｎ＝４）または０．９％ＮａＣｌ（Ｎ＝４）のいずれかと
する動物を含んだ。穿刺後硝子体内出血の兆候を示す動物は除外した。
【００６３】 坐骨神経の移植 予め変性させた末梢神経小片は、４頭のラットについて坐骨神経のひ骨分枝に
挫傷損傷を行うことにより得た。４日後ラットをケタミンおよびキシラジンを混
合した過剰投与によりと殺し、挫傷部位から遠位の神経部分を切除、摘出した。
既に報告された（Berry et al.,1996）ように、約１ｍｍ長の坐骨神経切片を上
述のように視神経手術を行ったホスト動物（Ｎ＝５）に移植した。小片は強膜を
通して小さな放射線のスリットの切り込みより挿入し、レンズの損傷を避けるよ
うに注意しながら１片の組織を硝子体に移植した。
【００６４】 組織学的調製 １から４０日間の生存期間で動物に致死量の過剰の麻酔薬を与え、ヘパリン（
１００ｍｌ中に１０，０００Ｕ）を含む氷で冷やしたＰＢＳで、次にＰＢＳ中の
４％パラホルムアルデヒド溶液（１００ｍｌ）にて心臓を通して灌流した。神経
小片を含む眼球を視神経交叉をつけたまま、結合組織から切除し、オーバーナイ
ト４％パラホルムアルデヒド溶液（１００ｍｌ）にて後固定し（４℃）、３０％
しょ糖溶液中に移し、一定の振とう下でオーバーナイト放置した（４℃）。凍結
切片（１５μｍ厚）はクリオスタットで垂直方向に切り出し、コートしたスライ
ドグラスにのせ（thaw-mounted）、使用時まで−８０℃にて保存した。
【００６５】 免疫組織学 切片を抗体で染色し、神経の成長に関与するタンパク質ＧＡＰ−４３；グリア
細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；単球系の活性化細胞のマーカーである
、ＥＤ−１；またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のいずれかを視覚化し
た。ＧＡＰ−４３はヒツジで調製した抗体のＩｇＧフラクション(Benowitz et a
l.)を用い、続いてビオチンまたは蛍光物質 のいずれかを結合させた第二抗体を
反応させた。前者のケースは、切片を１００％メタノール中の０．３％Ｈ2Ｏ2溶
液で予めインキュベーションしておき（３０分）、ＴＢＳ中の５％ウサギ血清溶
液、ｐＨ７．４でブロックし（１時間）、１：５０，０００希釈（３００ｍＭ
ＮａＣｌ，２％ＢＳＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ：ＴＢＳ2 Ｔ）の第１抗体中でオーバーナイト（４℃、一定の振とう）インキュベーショ
ンした。切片をすすぎ（ＴＢＳ2Ｔ中で４時間以上を３回）、ビオチン化したウ
サギ抗ヒツジＩｇＧ（１：２５０ ＴＢＳ2Ｔ溶液：Vector Labos,Burlingame,C
A）中でインキュベーションし、３回すすぎ、アビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合
体と１時間反応させ（メーカーのプロトコルに従って：Vector Labs.）、次にＮ
ｉＣｌ2（Vector Labs.）を加えたジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で処理した。
ＧＡＰ−４３を免疫蛍光法により視覚化するケースでは、第一抗体を１：２５０
０で希釈すること、および第二抗体を蛍光物質を結合したウサギより作製の抗ヒ
ツジＩｇＧ（１：５００Vector Labs.）とすることを除いて、同様の条件で行っ
た。ＧＡＰ−４３を他の抗原をと同時に視覚化するケ−スでは、マウスモノクロ
ーナル抗ＧＡＰ−４３抗体（クローン９−１Ｅ１２，１：２５０希釈、Boehring
er-Mannheim）を用い、続いて蛍光物質を結合したウマより作製の抗マウスＩｇ
Ｇ（Vector、１：５００）で処理した。
【００６６】 免疫蛍光法の切片はマウント媒体としてVectashield(Vector)を用いてカバー
した。ミュラー細胞の変化を視覚化させるため、ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Sigma
、１：７５００）およびビオチン化したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００）を用
いた。反応性のマクロファージはＥＤ−１抗体（Serotec、１：２００希釈）お
よびビオチン化したウマ抗マウスＩｇＧ（Vector、１：５００）にて検出した。
ミエリンはウサギ抗ＭＢＰ抗体（１：２５、Zymed Labs.）、次にテキサスレッ
ド(Texas red)を結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００、Vector）により視
神経中で視覚化させた。
【００６７】 軸索の生長の定量 軸索の生長は、１ケースあたり４切片について挫傷部位末端から０．５ｍｍお
よび１ｍｍ伸張している、ＧＡＰ−４３陽性軸索の数を数えることにより定量し
た。神経の横断面の幅は軸索数を数えた位置で測定し、これを用いて１ｍｍ神経
幅あたりの軸索数を計算した。軸索数／ｍｍの値を次に４切片について平均した
。Σａd、すなわち半径ｒの神経において距離ｄ伸張している軸索の総数を厚さ
ｔ（＝１５μｍ）のすべての切片を合計することにより算出した： Σａd＝πｒ2ｘ［平均軸索数／ｍｍ］／ｔ 順行性標識 順行性トレーサーとしてコレラ毒素Ｂ分画（ＣＴＢ）を用いて、遠位の視神経
で視覚化された軸索がＲＧＣ（網膜神経節細胞）由来であることを証明した。レ
ンズ穿刺を伴うまたは伴わない神経挫傷を行った動物に、最初の手術後２０日に
ＣＴＢ（２．５μｇ／μｌ ５μｌＰＢＳ溶液）を注射した。動物を安楽死させ
、翌日上述のように組織学的標本を作製した。スライドにのせた切片をＣＴＢ抗
体（ヤギより作製；List Biological Lab、１：４０，０００希釈）と反応させ
、次にウサギ抗ヤギ第二抗体（Vector、１：５００希釈）と反応させた。一部の
ケースは、マウスより作成したモノクローナル抗ＧＡＰ−４３抗体およびヤギ抗
ＣＴＢ抗体（１：２５０）を用い、続いて蛍光物質およびテキサスレッド（Vect
or、１：５００）を各々結合した適当な第二抗体と反応させることにより、ＧＡ
Ｐ−４３およびＣＴを共に調べた。
【００６８】 細胞の生存の定量 細胞の生存を調べるため、神経挫傷の７日前にフルオロゴールド（Fluorogold
）でＲＧＣを逆行的に標識した。ラットを上述のように麻酔し、頭皮の正中線切
開を行い後頭皮質上で骨弁を開いた。後頭皮質を吸引除去し、フルオロゴールド
（５μｌ／ｍｌ １％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ溶液、１注射あたり１μｌ）を上丘
内に複数回注射（深さ約１ｍｍ）した。同じフルオロゴールド溶液に浸したGelf
oam（１ｍｍ3、Upjohn）を上丘の上に挿入した。１週間後動物に、レンズ穿刺ま
たは最も侵襲の少ない眼内注射のいずれかを伴う視神経挫傷を行った。正常のコ
ントロール（Ｎ＝５）を標識し、ＲＧＣ密度のベースラインを得た。
【００６９】 神経挫傷および眼内注射後２１日（すなわちフルオロゴールド標識後２８日）
に、ケタミンおよびキシラジンを混合した過剰投与により安楽死させ、網膜を固
定せずに切除した。放射状にスリットを入れた後、各網膜を顕微鏡スライドに付
着させたナイロンフィルター上に置き、その上に４％パラホルムアルデヒド（Ｐ
ＢＳ溶液）に浸したペーパーフィルターをのせ、両端に重しをかけて１時間押さ
えた。網膜を次にフィルターからはずし、平らにスライドグラスにのせ、Vectas
hieldでカバーした。蛍光発光下（ｘ２００拡大）で視神経乳頭から１および２
ｍｍの放射状に分布する６領域について、１０ｘ１０グリッド（０．１６ｍｍ2
）を用いて標識したＲＧＣを数えた。数値を６領域で平均した。
【００７０】 ＧＡＰ−４３およびＧＦＡＰのウエスタンブロット法 視神経挫傷後１４日に、未固定の網膜を新たに切開し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサン
プルバッファー（O'Farrell,1975）１００μｌに２回つけた。各サンプルに含ま
れるタンパク質量を等しくして、ミニゲルにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Bio-Rad
）により分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（０．４５μｍポア、Millipore）
に移し、ＧＡＰ−４３またはＧＦＡＰのいずれかの抗体をプローブとして検出し
た。前者のケースでは染色のプロトコルは、モノクローナル抗ＧＡＰ−４３抗体
（Boehringer）の濃度が１：１０００であることを除き、組織で行った方法にほ
ぼ従った；ＧＦＡＰのケースは、第一抗体を１：５０００の濃度で使用した。第
二抗体はＨＲＰを結合させたものを用いた；免疫活性はＥＣＬ試薬（Amersham L
ife Science）およびフルオログラフィーにて検出した。
【００７１】 マクロファージの活性化 レンズ穿刺をせずに眼中のマクロファージを刺激するため、いくつかの方法を
試みた。これらは神経系を通して単球を活性化するのに十分な投与量（Sethna a
nd Lampson,1991）でインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ、GibcoBRL,５μｌ中に５
０００Ｕ；Ｎ＝５）；またはザイモサン（５μｌ中に６２５μｇ、Sigma；Ｎ＝
５）、酵母細胞壁製剤(Fitch et al.,1999; Lombard et al.,1994; Ross and Ve
tvicka,1993; Stewart and Weir,1989)を注入する方法を含む。また、記載され
ているように（Smith and Hale,1997）以下の方法によりドナー動物より得られ
た活性化マクロファージを注入した。まず０．０２５％トリプシンおよび２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む、Ｃａ2+およびＭｇ2+を除去したバッファーを腹腔内に注射し
、３分後に開腹し、液体を採取し、１％ウシ胎児血清（Gemini）を含むＤＭＥＭ
（Sigma）に加えた。遠心分離により細胞を集め、同じ培地に再度懸濁させ、培
養皿で平板培養し、４時間インキュベーションした。付着していない細胞を洗い
流した後、残った細胞を培地にトリプシンを加えて採取し、培養培地中に加え、
遠心分離で集め、食塩水で洗浄して得た。活性化マクロファージの存在は、ＥＤ
−１およびＯＸ−４２抗体（Serotec）での細胞染色により証明した。レンズを
損傷しないように注意しながら、約１０5個のマクロファージをホストの硝子体
に注入した（Ｎ＝４）。レンズ穿刺後マクロファージ活性を抑制するため、トリ
ペプチドＭＩＦ（推定眼内最終濃度５０μＭ；Sigma、Ｎ＝６）、シグリタゾン
（推定眼内最終濃度７５μＭ；BIomol,Plymouth Meetig,PA、Ｎ＝4）、またはプ
ロスタグランジンＪ２（推定眼内最終濃度８０μＭ；Calbiochem、Ｎ＝３）を使
用した。
【００７２】
【実施例】
実施例１：軸索の生長 成体の哺乳類において、ＲＧＣ（網膜神経節細胞）は視神経損傷後にその軸索
を再生することはできず、まもなくアポプトシス細胞死を起こす。しかし以下の
例で示すようにレンズへの穿刺の小さな傷は、ＲＣＧの生存を高め、これらの細
胞が視神経の正常な阻害的環境へと軸索を再生することを可能にした。視神経が
無傷の場合でさえも、レンズの損傷は眼内のマクロファージの浸潤、ミュラー細
胞の活性化、網膜全体の神経節細胞におけるＧＡＰ−４３の発現を増加を刺激し
た。反対に軸索切断は単独、あるいはレンズを損傷しない眼内注射を複合するい
ずれの場合も、ＲＧＣ内のＧＡＰ−４３発現はわずかな変化しか起こさず、他の
細胞のタイプの活性化もわずかに過ぎなかった。レンズ穿刺と神経の損傷の複合
では、ＲＧＣ生存の８倍増加、挫傷部位を超えて再生する軸索数の１００倍増加
をもたらした。レンズ穿刺の効果は、検査したいくつかの候補の成長因子のレベ
ルの変化では説明できなかった。しかしマクロファージの活性化が鍵となる役割
を演じていることが示された。なぜならザイモサン（イースト細胞壁製剤）の眼
内注射が、レンズの損傷がない場合にも単球を刺激し、ＲＧＣによる遠位への視
神経軸索の再生を誘発したからである。
【００７３】 ＲＧＣだけが軸索生長の間にＧＡＰ−４３を発現するため、このタンパク質に
対するプローブで生長段階にあるＲＧＣを視覚化できる（Berry et al.,1996; D
oster et al.,1991; Meiri et al.,1986; Moya et al.,1988; Schaden et al.,1
994）。レンズ穿刺を伴う神経挫傷の動物において、多数のＧＡＰ−４３陽性軸
索が損傷部位を越えて遠位の視神経にまで生長していた。コントロールの視神経
は全く染まらなかった。神経挫傷を伴い、眼内注射なしまたはレンズを損傷しな
い眼内注射を施した動物は、神経の近位領域（以下参照）および損傷部位に形成
された神経腫に、多少のＧＡＰ−４３免疫染色を示したが、この部分を超える成
長はほとんどなかった。定量的には、視神経挫傷のみの動物（Ｎ＝５）は、挫傷
部位を超えて０．５ｍｍ伸張している軸索は平均して４±３であり、１ｍｍ伸長
したものはなかった；神経を挫傷したが最も侵襲の少ない注射を受けた動物（Ｎ
＝７）では、わずかにより多く成長していたに過ぎなかった（０．５ｍｍでは軸
索２２±９、１ｍｍでは６±３）。後者の群と比較して、神経挫傷およびレンズ
穿刺を受けた動物はほぼ１００倍の成長の増加を示した（挫傷部位からの０．５
ｍｍ遠位で軸索１７９１±２３２、１ｍｍ遠位で軸索９３３±１６２：Ｎ＝６）
。後者の群と、神経挫傷プラス最も侵襲の少ない損傷を伴うコントロールとの差
は非常に有意であった（０．５および１．０ｍｍ双方においてｐ＜０．００１）
。
【００７４】 損傷部位を越えて０．５または１ｍｍに達する軸索数は、最初の３週間にわた
って継続して増加を示した。しかし４０日までにはその数は減少し、ＲＧＣにお
けるＧＡＰ−４３の発現が減少したか、または３週間で存在していた軸索の一部
が変性したことを示唆した。
【００７５】 コレラ毒素による順行性標識 順行性標識は、挫傷から遠位の軸索がＲＧＣから伸長していることを示す、よ
り厳密な方法を提供した。この研究のため、と殺の１日前に後眼房にＣＴＢを注
射し、次に視神経内のＣＴＢを免疫組織化学的に検出した。ＣＴＢ染色のパター
ンはＧＡＰ−４３の場合とほぼ類似していた。レンズ穿刺なしの神経挫傷後、Ｃ
ＴＢ陽性軸索が損傷部位から近位で検出されたが、これを超えることはなかった
；神経挫傷プラスレンズ穿刺を伴うものは、多数のＣＴＢ陽性軸索が遠位の神経
で認められた。二重標識は、挫傷部位を越えて成長する軸索の構成物質が双方の
抗原を含むことを明らかにし、一部のケースでは成長する網膜錘体に類似する構
造で、非常に強い二重標識が観察された。神経挫傷およびレンズ穿刺を行った４
頭のＣＴＢ標識した動物において、ＣＴＢ染色により０．５ｍｍで９０３±５４
の軸索が数えられたのに対し、同位置でのＧＡＰ−４３陽性軸索は１４２２±２
５９であった；１ｍｍでも同様の標識による比率が認められた。ＣＴＢおよびＧ
ＡＰ−４３の陽性軸索数の違いは、注射部位から遠位のＲＧＣがＣＴＢを取り込
まなかったことによると考えられる。
【００７６】 ＣＮＳミエリンは軸索の成長を阻害するが、ＲＧＣ軸索は、レンズ穿刺後、ミ
エリンの多い領域を通って再生するようである。このことは、成長している軸索
をＧＡＰ−４３抗体で標識し、ミエリンをＭＢＰ抗体で標識した、二重免疫染色
の切片において明らかである。ＭＢＰ染色パターンに間隙は認められなかったが
、１５μｍの切片は軸索より厚いため、軸索は神経内のミエリンのないゾーンを
通って成長した可能性も残されている。しかし挫傷後２１日の神経内のミエリン
染色パターンはまさに網状を呈しており、正常な視神経に認められる一定の縞状
の染色とは異なっていた。
【００７７】 正常なラットの網膜において、ＧＡＰ−４３免疫染色は内側の叢状層内のドパ
ミン作用性無軸索細胞突起に限定される（Kapfhammer et al.,1997）。ＲＧＣも
視神経内にあるそれらの軸索も染まらない。レンズの損傷を伴わない視神経挫傷
後２１日では、ＲＧＣは標識されないままであり、挫傷部位の近位の視神経にわ
ずかのＧＡＰ−４３陽性軸索が認められるにすぎなかった。反対に神経挫傷にレ
ンズ穿刺を伴う場合は、ＲＧＣの免疫染色、および上に横たわっている線維層内
のそれらの軸索、および挫傷部位近位の視神経に劇的な増加があった。挫傷部位
まで伸張しているＧＡＰ−４３陽性線維の数は、この位置を越えて伸張する数を
大きく上回っていた。驚いたことに神経の損傷がない場合でさえも、ＲＧＣ細胞
の軸索は損傷を受けていないという事実にもかかわらず、レンズ穿刺がＲＧＣを
刺激して、ＧＡＰ−４３を網膜全範囲に発現させたのである。同様に損傷のない
視神経の一部の正常な軸索も、レンズ穿刺後ＧＡＰ−４３の免疫染色を示した。
【００７８】 レンズ穿刺を伴う神経挫傷後２４時間では、ＲＧＣ中にＧＡＰ−４３は検出さ
れなかった（未記載）が、３日までに見えるようになり、７日までには強くなっ
た。２１日までにＧＡＰ−４３のレベルは網膜全体で高くなった。挫傷のみの動
物は７日でＧＡＰ−４３発現はわずかな一過性の増加を示すにとどまり、２１日
にはもはや検出することはできなかった。レンズ穿刺のみのＲＧＣへの効果は上
述のように７日で明らかであり、２１日でも高レベルを維持していた。
【００７９】 神経挫傷およびレンズ穿刺の複合の効果を、網膜および近位の視神経小片のウ
エスタンブロットにより検証した。これらの研究は手術後１４日に行ったが、こ
の時点で神経損傷のみによるＧＡＰ−４３発現の一過性のアップレギュレーショ
ンが殆ど静まっている（Doster et al.,1991;Wodarczyk et al.,1997）。ウエス
タンブロットでは、最も侵襲の少ない眼内注射を伴う神経挫傷後または神経挫傷
を伴わないレンズ損傷後１４日で、網膜ＧＡＰ−４３全体の明白な変化は認めら
れなかった。このことはおそらく、ＲＧＣ内のＧＡＰ−４３の変化があまり多く
なく、一方無軸索内でのレベルはかなり高くしかも変化しないという事実による
ものであろう。しかし神経挫傷およびレンズ穿刺を複合させた効果は網膜で明確
に示され、視神経ではさらにいっそう顕著であった。これらにおいてはＧＡＰ−
４３の唯一の供給源がＲＧＣ軸索であり、しかもこのタンパク質のレベルは急激
に変化していた。
【００８０】 網膜神経節細胞の生存 細胞の生存を評価するため、フルオロゴールドを用いて手術前１週間に逆行的
にＲＧＣを標識した。正常な本来の状態のままで視覚化すると、フルオロゴール
ドにより多数のＲＣＧが標識され、これらＲＧＣは直径１２−１５μｍの円形ま
たは楕円形細胞であることを特徴とする。定量によりＲＧＣの細胞密度は１８０
６±５４／ｍｍ2（Ｎ＝１４例）であることが明らかになり、過去に報告された
結果（Clarke et al.,1998; Koeberle and Ball,1998; Mansour-Robsey et al.,
1994; Mey and Thaanos,1993）と類似していた。神経挫傷のみ、または最も侵襲
の少ない眼球への注射を複合した神経挫傷の動物は、手術後３週間で非常にわず
かのＲＧＣしか残っていなかった；後者のケースでは、ＲＧＣ５９±２１／ｍｍ2 が計測され、すなわち本来の数の３％のみしかなかった（Ｎ＝７）。同時に多
数の小さな、明るく蛍光を発する、複数の突起を持つとげのある細胞が認められ
た。これら後者の細胞は、外傷性網膜において過去に記載されており、活性化ミ
クログリアである（Clarke et al.,1998;Koeberle and Ball,1998; Sawai et al
.,1996; Thanos et al.,1993）。神経挫傷がレンズ穿刺を伴うケースでは、ＲＣ
Ｇの生存は手術後３週間で残っていたオリジナルのＲＣＧ数の約８倍、すなわち
本来のＲＣＧ数の２４％に増加した（ＲＧＣ４３０±３８／ｍｍ2：Ｎ＝７）。
ミクログリアはまだ顕著であったが、その数はずっと少なく、形態学的にもまた
異なる視野面 に位置することからも、ＲＧＣと十分に識別できた。
【００８１】 神経膠星状細胞の反応 正常のラットでは、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）染色は網膜
の奥深い部分の神経膠星状細胞突起の濃密なネットワークに限られるが、神経挫
傷のみの場合、７日または２１日で容易に判断できるパターンの変化はなかった
。レンズを傷つけない最も侵襲の少ない注射は、針が通過した領域に制限された
非常に限定的なＧＦＡＰのアップレギュレーションをもたらした。しかしレンズ
穿刺は、神経を挫傷していない場合でさえも、網膜の全範囲にわたってミュラー
細胞内のＧＦＡＰ発現を刺激した。この変化は３日までに検出でき、７日までに
顕著となり、少なくとも３週間は持続していた。レンズ穿刺に加えての視神経の
挫傷は、レンズ穿刺のみにより誘発されたレベルを超えて、ミュラー細胞内のＧ
ＦＡＰの発現を増加することはなかった。これらの結果はウエスタンブロットに
おいて確認された：レンズ穿刺のみは網膜のＧＦＡＰレベル全体を高めたが、一
方神経挫傷のみではわずかな効果しか得られなかった。レンズ穿刺と神経挫傷を
複合させた効果は、レンズ穿刺のみの場合と同様であった。
【００８２】 マクロファージの反応 正常の網膜はＥＤ−１陽性マクロファージをほとんど示すことはなく、これは
神経挫傷のみでもレンズを傷つけない眼内注射でも、針が通過した周辺を除いて
は変化はなかった。反対にレンズ穿刺は神経挫傷の有無にかかわらず、網膜全体
に及ぶ広範囲なマクロファージの浸潤を引き起こした。この変化は初めに３日で
表れ、７日には増大した；レンズ穿刺を神経挫傷と複合させた場合も、レンズ穿
刺のみの場合とほぼ同レベルのマクロファージの浸潤を誘発した。このようにマ
クロファージ反応の開始は、ＲＧＣおよびミュラー細胞で認められた変化と相関
しており、３種の反応はすべてレンズ穿刺により強く誘発されたが、神経挫傷で
はわずかな変化に過ぎなかった。表Ｉに様々な実験条件後７−１４日に眼内で認
められた変化のパターンをまとめた。２１日では、網膜内のＧＡＰ−４３の発現
およびミュラー細胞中のＧＦＡＰの発現は高いままであったが、ＥＤ−１陽性細
胞の数はかなり減少していた。フルオロゴールド標識で示したように、特に神経
挫傷のみの後２１日に、網膜中にはまだ多数のミクログリアが存在していたが、
これらはＥＤ−１抗体では染色されなかった。
【００８３】
【表１】 ミエリンに対して動物を免疫することで、損傷後にラットの脊髄の後索を通し
て、損傷した皮質脊髄路軸索が再生することを可能にすることが最近報告された
（Huang et al.,1999）。レンズ穿刺は眼内に強い炎症反応を引き起こすため、
この炎症反応もまたＲＣＧの生存および軸索の再生の変化に寄与し得る免疫反応
を刺激するかどうかについて調べた。正常のコントロール、または最も侵襲の少
ない眼内への注射を伴う神経挫傷、もしくはレンズ穿刺を複合させた神経損傷（
各群Ｎ＝３）後７日の動物より血清を採取した。これらの血清を用いて、正常な
動物および神経挫傷後７日の動物由来の網膜および視神経からのタンパク質を、
ウエスタンブロット染色した。この結果は、異なる抗体から得られた染色パター
ンに違いがないことを示した。循環性の抗体が当研究で観察された再生に寄与し
ているのであれば、対側の視神経も損傷している場合には、レンズ穿刺は対側に
も影響を与える効果を持ち得ることも予測される。前記研究の結果は、両側の視
神経が傷害を受けた場合、レンズ穿刺を受けた片側眼球の対側の網膜または近位
の視神経では、ＧＡＰ−４３の増加は非常にわずかしか認められないことを示し
た；レンズ穿刺を伴う片側のみがＧＡＰ−４３レベルの上昇を示した。同様に、
視神経の損傷はあるが最も侵襲の少ない眼内注射しか受けなかった片側において
、損傷部位を越えての軸索の生長はないことが免疫組織化学的に明らかになった
。この結果は、ＧＡＰ−４３の誘発は全身性循環物質、例えば抗体よりむしろレ
ンズ穿刺に続発する局所的効果に関与することを示唆している。
【００８４】 神経内部において、損傷の７日以内に損傷部位周辺におびただしいマクロファ
ージが観察され、１４日までにはこれらの細胞が神経の長さに沿って拡散し；２
１日までにはこれらの分布は挫傷部位周辺に狭められていた。神経挫傷を伴わな
いレンズ穿刺は神経内のマクロファージの反応を誘発せず、神経挫傷とレンズ穿
刺との複合でも、神経挫傷のみ後に観察されたレベルを超えて反応が増大するこ
とはなかった。７日までに、すべてのケースで挫傷部位に大きな空洞が形成され
、軸索成長の巨大なバリアーを呈していた（Battisti et al.,1995; Fitch et a
l.,1999; McKeon et al.,1991）。
【００８５】 成長因子の明確化 眼球の後眼房への穿刺による傷は、ＣＮＴＦおよび塩基性ＦＧＦｍＲＮＡの選
択的誘発を引き起こした（Cao et al.,1997; Faktorovich et al.,1992; Wen et
al.,1995）。ＣＮＴＦは、解離細胞培養（Jo et al.,1999）においておよびin
vivoでの末梢神経の移植（Cui et al.,1999）によりＲＧＣの軸索の伸長を誘発
する。これらの研究を基に、ＲＧＣに関するレンズ穿刺の効果を仲介するＣＮＴ
Ｆの能力について調べた。最も侵襲の少ない注射でＣＮＴＦを１μｇ／ｍｌまで
の濃度、すなわち培養ラットでＲＧＣ軸索の生長を刺激するに必要なＥＤ50（Jo
et al.,1999; Meyer-Franke et al.,1995）の約１０００倍までの量を注入した
。軸索の生長は１４日に観察した。この時点はレンズ穿刺後の挫傷部位を越えて
の生長は明確であるが、但し１回の注射の効果が低下してくる可能性のあるより
は前にあたる。レンズを損傷しないＣＮＴＦの眼内注射は効果を示さなかった。
レンズ穿刺に起因するＲＧＣの変化が、抗ＣＮＴＦ抗体により低下し得るかどう
かについても調べた（R&D Systems、２０μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ
の活性を８０％中和するのに十分な量）。変化は観察されなかった。ＢＤＮＦま
たは塩基性ＦＧＦの中和抗体も同様に、レンズ穿刺後損傷部位から０．５または
１ｍｍで測定された軸索数を減少させることはできなかった。しかし抗ＢＤＮＦ
抗体処理により、損傷部位から遠位で測定した最長の再生軸索長さが２倍になっ
た（レンズ穿刺プラス神経挫傷を伴う場合に比べて：ｔ＝３．６７、ｐ＜０．０
１、ｄｆ＝８）。他の処理は軸索の長さを顕著に増加させることはなかった。
【００８６】 複数回穿刺 １回のレンズ損傷後に得られた再生の変化が、複数回の穿刺により増加し得る
かどうかについても調べた。これは神経損傷と同日に１０回穿刺するか、または
神経挫傷と同日から始めて３日おきに５回穿刺するかのいずれかにより検証した
。これらの処置は双方とも軸索の生長を減少させたに過ぎず、おそらく網膜への
全体的外傷によると考えられる。したがって、１回の穿刺は最初にレンズの非常
に小さな領域に影響を与えるという事実にもかかわらず、それが最大の反応を誘
発できるのである。
【００８７】 マクロファージ活性化はレンズ穿刺の効果を模倣する ＲＣＧの生存および軸索の再生に関するレンズ穿刺の効果を、マクロファージ
が仲介するのかどうかを決定するため、レンズを損傷せずにマクロファージを活
性化させるいくつかの方法を用いた。これらのうち最大の効果は、ザイモサン、
酵母菌壁製剤の注入により得られ、最も侵襲の少ない眼内注射後に起こる控えめ
のマクロファージの反応を増大させた。ザイモサンは眼内の広範囲のマクロファ
ージの反応を刺激し、この変化がそれに平行して、ミュラー細胞のＧＦＡＰおよ
びＲＧＣのＧＡＰ−４３のアップレギュレーションを高める；これらの条件下で
広範囲の軸索の再生が神経損傷部位を超えて観察された。
【００８８】 マクロファージ由来因子が神経の生存および軸索の成長の刺激要因であったこ
とを確認した後、クロマトグラフィーによる分離を行い、（複数の）活性分子を
単離した。１つの可能性のある因子を単離し、配列決定し、タンパク質オンコモ
ジュリンと一致することを発見した（例えばRitzler J.M.et al.(1992) Genomic
s 12:567-572）。培養して調べたところ、オンコモジュリンは網膜神経節細胞を
刺激し、その軸索を再生させた。もう一つのマクロファージ由来因子、ＴＧＦ−
βもまた培養において網膜神経節細胞の再生を刺激することを発見した。ＴＧＦ
−βの効果はＡＦ−１と相乗作用を示し、ｃＡＭＰを増加させた。
【００８９】 硝子体は炎症に対する高い阻害性がある（Osusky et al.,1996）。；この特性
と一致して、ＩＮＦ−γ注射により、または活性化した腹腔マクロファージの注
入により持続的なマクロファージの反応を誘発することはできなかった。単球活
性化の欠如に相関して、ＲＧＣにおけるＧＡＰ−４３アップレギューションの欠
如および神経挫傷部位を越えての軸索再生不能がみられた。しかしＩＮＦ−γは
ミュラー細胞内のＧＦＡＰ発現を刺激した。他方、使用した阻害物質（ＭＩＦ，
シグリタゾン、プロスタグランジンＪ２）はいずれも、レンズ穿刺後のマクロフ
ァージ活性を低下させることも、ＧＡＰ−４３の発現を変化させることもなかっ
た。
【００９０】 まとめ 成体の哺乳類において、ＲＧＣは損傷した軸索を再度成長させることはできず
、やがてアポトーシスに至る。これらのよく知られた事象はＣＮＳにおける再生
不全のパラダイムであり、変性疾患、例えば緑内障の根底にある病態生理学的後
遺症を模倣し得る。しかし当明細書に示したようにレンズの損傷がある場合には
、ＲＧＣは生存の増加および遠位の視神経内への軸索の再生を示す。
【００９１】 レンズ穿刺の親−再生効果は、活性化されたマクロファージを介して起こるよ
うである。レンズ穿刺を伴う神経挫傷の３日以内に、ＥＤ−１陽性の単球が網膜
全体に表れる。この変化がＲＧＣ内のＧＡＰ−４３およびミュラー細胞内のＧＦ
ＡＰのアップレギュレーションを平行して高める；これらの変化はすべて７日ま
で増大し、さらに１週間高レベルを持続する。マクロファージ活性はその後下降
するが、ミュラー細胞およびＲＧＣの変化は持続する。反対に神経損傷は、単独
または最も侵襲の少ない注射との複合のいずれでも、わずかなマクロファージ活
性を誘導するにとどまり、まもなく大量のＲＧＣの死を続発する。
【００９２】 マクロファージがＲＧＣの生存および再生を刺激する原因となる役割を担って
いるかどうかを調べるため、レンズを損傷せずに単球を刺激するいくつかの方法
を用いた。ＣＲ３β2−インテグリン受容体のマンノースおよびβ−グルカンレ
クチンとの結合部位を活性化するザイモサン、酵母細胞膜懸濁液は、眼内の大量
のマクロファージ浸潤をもたらした。この変化に伴って、ＲＧＣ内のＧＡＰ−４
３発現の激増および損傷部位を越えての軸索の再生が認められた。硝子体は正常
には炎症を抑制する；これは高レベルのヒアルロン酸およびＴＧＦ−βＩＩによ
るものである。したがってレンズ穿刺は、正常なら硝子体内に広く分布する抗炎
症効果を上回る物質を放出することができることになる。本研究の結果は、レン
ズ穿刺の効果およびマクロファージの活性化が局所的であり、循環性の抗体を介
していないことを示す。
【００９３】 活性化された単球は、グリアの刺激を経て直接または間接的にニューロンを刺
激できる、多くのサイトカインおよび成長因子を放出する（Giulian(1993) Glia
,7:102-110; Kreutzberg(1996) Trends Neurosci. 19:312-318）。ラットの線条
において、穿刺の傷はＢＤＮＦを発現するミクログリアを刺激し、ＧＤＮＦを発
現するマクロファージの浸潤を促進する；これら２つの成長因子は、穿刺の損傷
後に起こるドパミン作用性ニューロンの生存および生長に寄与するらしい（Batc
helor et al.(1999) J.Neurosci. 19:1708-1716）。ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦも
また軸索切断後のＲＧＣの生存に影響を与え（Di Polo et al.(1998) Pros.Natl
.Acad.Sci.USA 95:3978-3983; Koeberle and Ball(1998) Vision Res. 38:1505-
1515; Mansour-Robaey et al.(1994) Pros.Natl.Acad.Sci.USA 91: 1632-1636;
Mey and Thanos(1993) Brain Res. 602:304-317; Sawai et al.(1996) J.Neuro
sci. 16:3887-3894）本研究でも役割を担うことができる。しかし抗ＢＤＮＦ中
和抗体はレンズ損傷のプラスの効果を低下させなかったが、遠位の視神経内への
軸索成長の長さを増加させた。この予想外の軸索の長さの効果は、軸索の分枝に
関与するＢＤＮＦの効果を抑制した結果かもしれない（Cohen-Cory(1999) J.Neu
rosci. 19:9996-10003; Jo et al.(1999) Neuroscience 89:579-591; Lom and C
ohen-Cory (1999) J.Neurosci. 19:9928-9938; Mansour-Robaey et al.(1994) P
ros.Natl.Acad.Sci.USA 91:1632-1636; Sawai et al.(1996) J.Neurosci. 16:38
87-3894）。グリアの寄与という点から見れば、活性化されたミュラー細胞はＣ
ＮＴＦの発現を増加し（Ju et al.(1999) Neuroreport 10:419-422）、ＣＮＴＦ
はＲＧＣの生存（Mey and Thanos(1993) Brain Res. 602:304-317; Meyer-Frank
e et al.(1995) Neuron 15:805-819）および軸索の再生（Jo et al.(1999) Neur
oscience 89:579-591; Cui et al.(1999) Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 40: 760
-766）を刺激することがきる。しかしＣＮＴＦの眼内注射は、レンズ穿刺をしな
い場合の軸索の再生を刺激することはなく、また抗ＣＮＴＦ抗体はレンズ損傷の
効果を低下させることもなかった。眼への外傷性損傷はまたｂＦＧＦのｍＲＮＡ
を増加させる（Cao et al.(1997) Exp.Eye Res. 65:241-248; Faktorovich et a
l.(1992) J.Neurosai. 12: 3554-3567; Wen et al.(1995) J.Neurosci. 15: 73
77-7385）が、しかしこの場合もやはり、抗ｂＦＧＦ抗体はレンズ穿刺の効果を
低下させなかった。目の栄養因子に関する多数の研究により、コントロールの注
射がＲＧＣの生存を高めることが見出された（Koeberle and Ball(1998) Vision
Res. 38:1505-1515; Mansour-Robaey et al.(1994) Pros.Natl.Acad.Sci.USA 9
1:1632-1636）。これらの効果はレンズの損傷に起因し得る、なぜなら本研究に
おいて損傷を与えない眼内注射は、ＲＧＣにほとんど効果がなかったからである
。
【００９４】 均等範囲 当該技術分野の業者は、本明細書に記載された発明の特定の態様と多くの対応
特許を理解し、あるいは慣例的な実験のみを用いて確認することができるだろう
。このような均等範囲は特許請求の範囲に包含されるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 25/08 25/08 25/28 25/28 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C076 AA16 AA19 AA21 AA24 AA94 AA97 BB11 BB17 CC01 4C084 AA02 AA19 BA44 CA18 CA26 DA01 MA02 MA13 MA21 MA24 MA56 MA65 MA66 NA12 NA14 ZA012 ZA062 ZA162 ZC022 4C086 AA01 AA02 EA18 MA01 MA02 MA03 MA04 MA13 MA21 MA24 MA65 MA66 NA12 NA14 ZA01 ZA06 ZA16 ZC02 4C087 AA01 AA02 BB43 CA05 CA47 MA24 MA56 MA66 NA14 ZA01 ZA06 ZA16

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マクロファージ由来因子の治療有効量を被験者に投与し、それ
    により前記被験者の神経に有益な効果をもたらすことを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記マクロファージ由来因子がオンコモジュリン(oncomodulin
    )である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記マクロファージ由来因子がＴＧＦ−βである請求項１に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 前記被験者にｃＡＭＰモジュレーターをさらに投与することを
    含む請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ｃＡＭＰモジュレーターが非加水分解性のｃＡＭＰ類似体
    、アデニル酸シクラーゼ活性化物質、ｃＡＭＰを刺激するマクロファージ由来因
    子、マクロファージ活性化物質、カルシウムイオノホア、膜脱分極化物質、ホス
    ホジエステラーゼ阻害剤、特異的ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤、ベータ２−
    アドレナリン受容体阻害剤、または血管作動性腸管ペプチドである、請求項４に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記被験者に軸索形成因子(axogenic faotor)をさらに投与す
    る請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 軸索形成因子がＡＦ−１である請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 軸索形成因子がイノシンである請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ニューロンの生存を調節することにより、前記被験者の神経に
    有益な効果をもたらす請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ニューロンの再生を調節することにより、前記被験者の神経
    に有益な効果をもたらす請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ニューロンの軸索の生長(outgrowth)を調節することにより
    、前記被験者の神経に有益な効果をもたらす請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 中枢神経系ニューロンの軸索の生長を調節することにより、
    前記被験者の神経に有益な効果をもたらす請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 中枢神経系ニューロンが網膜神経節細胞である請求項１２に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 マクロファージ由来因子を注入することによりニューロン損
    傷領域に投与する請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 マクロファージ由来因子を被験者の髄液に注入する請求項１
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 マクロファージ由来因子を被験者の硬膜下腔内に注入する請
    求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 マクロファージ由来因子を被験者の脳室、腰椎領域、および
    大槽を含む群から選択される領域に注入する請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 マクロファージ由来因子を医薬的に受容可能な製剤で被験者
    投与する請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 医薬的に受容可能な製剤が分散システムである請求項１８に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】 医薬的に受容可能な製剤が脂質ベースの製剤を含む請求項１
    ８に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 医薬的に受容可能な製剤がリポソーム製剤を含む請求項２０
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 医薬的に受容可能な製剤が多胞状リポソーム製剤を含む請求
    項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 医薬的に受容可能な製剤がポリマーのマトリクスを含む請求
    項１８に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 医薬的に受容可能な製剤をミニポンプに内包する請求項１８
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 医薬的に受容可能な製剤を被験者に投与した後少なくとも１
    週間、医薬的に受容可能な製剤がマクロファージ由来因子の持続的投与を提供す
    る、請求項１８に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 医薬的に受容可能な製剤を被験者に投与後少なくとも１ヶ月
    間、医薬的に受容可能な製剤がマクロファージ由来因子の持続的投与を提供する
    、請求項１８に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 被験者が哺乳類である請求項１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 哺乳類がヒトである請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記被験者が神経学的障害をもつ請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記神経学的障害が脊髄損傷である請求項２９に記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 脊髄損傷が単麻痺、両側麻痺、対麻痺、片麻痺および四肢麻
    痺を特徴とする請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記神経学的障害が癲癇である請求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 癲癇が外傷後の癲癇である請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記神経学的障害がアルツハイマー病である請求項２９に記
    載の方法。
  35. 【請求項３５】 マクロファージ由来因子の治療有効量を軸索形成因子の治療
    有効量と合わせて被験者に投与し、それにより前記被験者の神経に有益な効果を
    もたらすことを含む方法。
  36. 【請求項３６】 マクロファージ由来因子の治療有効量を、軸索形成因子の治
    療有効量およびｃＡＭＰモジュレーターの治療有効量と合わせて被験者に投与し
    、それにより前記被験者の神経に有益な効果をもたらすことを含む方法。
  37. 【請求項３７】 オンコモジュリンの治療有効量を被験者に投与すること、そ
    れにより前記被験者の神経に有益な効果をもたらすことを含む方法。
  38. 【請求項３８】 オンコモジュリンの治療有効量をＡＦ−１の有効量と合わせ
    て被験者に投与し、それにより前記被験者の神経に有益な効果をもたらすことを
    含む方法。
  39. 【請求項３９】 前記被験者の神経に有益な効果をもたらすための医薬組成物
    の使用法の添付文書を添えて包装した、マクロファージ由来因子および医薬的に
    受容可能な担体を含む医薬組成物。
  40. 【請求項４０】 さらにｃＡＭＰモジュレーターを含む請求項３９に記載の医
    薬組成物。
  41. 【請求項４１】 さらに軸索形成因子を含む請求項３９に記載の医薬組成物。
  42. 【請求項４２】 軸索形成因子がＡＦ−１である請求項４１に記載の医薬組成
    物。
  43. 【請求項４３】 軸索形成因子がイノシンである請求項４１に記載の医薬組成
    物。
  44. 【請求項４４】 神経学的障害のある被験者にオンコモジュリンを投与し、そ
    れにより神経学的障害のある前記被験者を治療することを含む方法。
  45. 【請求項４５】 被験者にオンコモジュリンを投与する前に最初の神経系の機
    能の評価をすること、および被験者にオンコモジュリンを投与した後に２度目の
    神経系の機能の評価をすることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 神経系の機能が知覚機能、コリン作用性神経支配、または前
    庭運動機能である請求項４５に記載の方法。
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