JP2003533226A - 神経細胞のセリンスレオニンプロテインキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は局所的な虚血の後遺症の発症に関与する、遺伝子およびそのコードされたタンパク質に関する。新規タンパク質はセリンスレオニンプロテインキナーゼであり、卒中の予防および治療に新たな治療研究法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、セリンスレオニンプロテインキナーゼ、このキナーゼをコードする
核酸、ならびに神経細胞および腫瘍性疾患の診断および治療における、これらの
使用に関する。

【０００２】 卒中は、発作、脳卒中および卒中発作としても知られており、全死亡数の約15
％に関与し、男性および女性が等しく患っている。症状は、意識障害から昏睡ま
でにわたり、しばしば中枢性運動および感覚喪失の最も異種の症状である痙攣性
の半側麻痺、ならびに局所性および全身性痙攣も含むことが多い。卒中の各例で
は、酸素欠乏に関連する局所的な脳領域における循環障害が含まれる。2つの基
礎的な機構が引き金として作用する。第1に、15％の症例に関与する大量の脳内
出血であり、これは通常限定的な脳領域の破壊の結果である血管破裂に続いて、
レンズ核線条体動脈で生じる。この機構は高い致死率を招く。原疾患は、異議が
唱えられているが、特に高血圧症、動脈硬化症、頭蓋内動脈瘤、およびさらに稀
であるが、肺病質性凝固障害である。脳梗塞、脳軟化症は第2の機構として関係
し、症例の85％の原因であると考えられている。壊死は、一般にこの連結部で形
成される。これの原因には動脈血栓症、血栓塞栓症または、例えば血圧の急降下
に続く、血管開放に関連する機能的虚血などがある。脳梗塞「虚血性壊死」は、
症例の約70％〜80％で卒中の原因になる。動脈硬化症は、しばしば基礎随時疾患
に相当する。稀な緩除に進行する脳軟化症の症状を「進行性卒中」と称する。組
織損傷の形成を伴わない神経喪失の一時的な症状（「一過性虚血発作」）は、脳
梗塞の初期徴候であると考えるべきである。一時的な狭窄または微小塞栓症が引
き起こす、限定的循環障害が原因であると考えられる。診断法には、一般的およ
び神経学的試験のみならず、頭蓋内コンピューター断層撮影法、脳血管ドップラ
ー超音波試験、脊髄穿刺、動的脳スキャニング、EEGおよびスピン共鳴断層撮影
法も含まれる。

【０００３】 虚血の分子原理および関連する後遺症は、現在のところ実質的には知られてい
ない。しかしながら、卒中を生じるまでに一連の複合された生化学的過程が必要
であるとみなされる。

【０００４】 本発明は、局所性酸素欠乏に続く卒中の進行に関係する遺伝子を同定する、技
術的問題に取り組み、従って卒中の予防および処置の新規研究法を開拓すること
を意図する。本発明はさらに、卒中の進行に関係するタンパク質を同定する、技
術的問題に取り組むことを意図する。

【０００５】 技術的問題は、セリンスレオニンプロテインキナーゼをコードする核酸により
解決され、その核酸は以下より選択される： a）配列番号1〜4に記載の配列の1つを有する核酸、および配列番号5〜8の1つに
記載の配列を有するタンパク質をコードする核酸； b）a）記載の核酸とハイブリダイズする核酸； c）遺伝コードの変性を考慮に入れて、a）記載の核酸とハイブリダイズする核酸
； d）1つまたは複数の塩基の置換、付加、逆位および/または欠失により得られる
、a）〜c）記載の核酸の誘導体；および e）a）〜d）記載の核酸に相補的な核酸。

【０００６】 例えば、配列番号5〜8に記載のタンパク質の誘導体では、アルギニンラジカル
がリジンラジカルにより、バリンラジカルがイソロイシンラジカルにより、アス
パラギン酸ラジカルがグルタミン酸ラジカルにより置換されており、置換された
アミノ酸および置換されるべきアミノ酸は非常に類似する物理化学的特性を有す
る（例えば空間充填度、アルカリ度、疎水性）。しかしながら、1つまたは複数
のアミノ酸をその配列内で置換、付加もしくは除去することもできるか、または
これらの単位のいくつかを互いに組み合わせることができる。配列番号5〜8に関
してこのように改変したタンパク質は、アルトシュル（Altschul）ら、J.Mol.Bi
ol.、215、403-410（1990）のアルゴリズムに従って算出した場合、配列番号5〜
8の配列と少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なく
とも90％の配列同一性を有する。単離されたタンパク質およびその機能的変種を
哺乳類、例えばヒト（Homo Sapiens）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ま
たはマウス（Mus musculus）から有利に単離できる。「機能的変種」という用語
はまた、別の哺乳類由来の相同体を意味すると理解されるべきである。

【０００７】 本発明に記載の配列番号1〜4に記載の核酸は、それぞれマウス（配列番号1お
よび2）またはヒト（配列番号3および4）から単離された核酸を示し、配列番号2
および配列番号4に記載の核酸は、それぞれ配列番号1および配列番号3のより長
いスプライス変種である。配列番号1〜4によりコードされるタンパク質の1つに
少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、および特に好ましくは少なくとも
90％の同一性を示すタンパク質をコードする核酸もまた本発明に従うと考えられ
る。

【０００８】 本発明に従う前記の核酸の「誘導体」、例えば対立遺伝子変種は、1つ以上の
塩基の置換、付加、逆位および/または欠失により、配列番号1〜4に記載の該核
酸と異なっているが、キナーゼ活性は保持されている。本発明の核酸配列の1つ
またはその断片とのハイブリダイゼーションによる現行の方法により、相同体ま
たは配列上関連のある核酸配列のような誘導体を、ヒトを含む哺乳類種から単離
することができる。

【０００９】 「機能的に等価」という用語は、配列番号1〜4に記載の核酸配列の相同体、例
えば別の哺乳類からの相同体、短縮した配列、一本鎖DNAもしくはRNAまたはコー
ディングおよび非コーディング核酸配列のPNAを意味することも、理解すべきで
ある。この種類の機能的等価物は、配列番号1〜4の核酸に基づいて、例えば標準
的なハイブリダイゼーション法またはPCR技術により、別の脊椎動物、例えば哺
乳類から単離できる。当業者が公知の方法で決定できる保存領域由来のオリゴヌ
クレオチドを、ハイブリダイゼーションに有利に使用できる。しかしながら、本
発明に従う核酸のより長い断片または全配列も、ハイブリダイゼーションに使用
することができる。使用した核酸、すなわちオリゴヌクレオチド、長い断片もし
くは全長配列により、またはどの核酸型すなわちDNAもしくはRNAをハイブリダイ
ゼーションに使用するかにより、ハイブリダイゼーションの標準条件は変化する
。従って、例えばDNA：DNAハイブリッドの溶融温度は、同じ長さのDNA-RNAハイ
ブリッドよりもおよそ10℃低い。

【００１０】 「標準条件」という用語は、例えば核酸温度に依存して、0.1〜5×SSC（1×SS
C＝0.15M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2）の濃度の水性緩衝溶液中
、またはさらに50％ホルムアミドの存在下、42〜58℃の間、例えば5×SSC、50％
ホルムアミド中42℃を意味すると理解すべきである。有利なことに、DNA：DNA
ハイブリッドに関するハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよびおよそ20
℃〜45℃の温度、好ましくはおよそ30℃〜45℃である。DNA：RNAハイブリッドに
関しては、ハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよびおよそ30℃〜55℃の
間の温度、好ましくは45℃〜55℃であるのが有利である。これらの具体的なハイ
ブリダイゼーション温度は、例えばおよそ100ヌクレオチドの長さであり、かつG
+C含量が50％であり、ホルムアミドの非存在下の核酸に関して算出された溶融温
度の値である。DNAハイブリダイゼーションに関する実験条件は、適当な遺伝参
考書に記載されており、例えばサムブルック（Sambrook）ら「分子クローニング
（Molecular Cloning）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（198
9）に記載されており、当業者に公知の式により、例えば核酸の長さ、ハイブリ
ッドの特性またはG+C含量に依存して算出できる。当業者は、ハイブリダイゼー
ションに関するさらなる情報を以下の参考書から得ることができる：オースベル
（Ausubel）ら（編）、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in
Molecular Biology）」（1985）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニュー
ヨーク；ヘイムズ（Hames）およびヒギンズ（Higgins）（編）、「核酸ハイブリ
ダイゼーション：実践的研究法（Nucleic Acids Hybridization：A Practial Ap
proach）」（1985）、オックスフォード・ユニバーシティ・プレスのIRLプレス
、オックスフォード；ブラウン（Brown）（編）、「必須分子生物学：実践的研
究法（Essential Molecular Biology：A Practial Approach）」（1991）、オッ
クスフォード・ユニバーシティ・プレスのIRLプレス、オックスフォード（1991
）。

【００１１】 本発明に従う配列番号1〜4に記載の配列の「誘導体」という用語は、本発明に
従う配列のコーディング領域の上流のプロモーター変種を意味するとも理解すべ
きである；これらは、プロモーター特性、特にプロモーター強度、および誘導能
力が損なわれていない、挿入、付加および/または欠失による1つまたは複数のヌ
クレオチド置換により改変されていてよい。しかしながら「誘導体」という用語
はまた、本発明の配列に基づいて単数または複数のヌクレオチド置換による活性
が強化されているプロモーター変種も含む。

【００１２】 「腫瘍性疾患」は、細胞の異常な成長挙動、細胞内阻害機構の喪失等を伴う疾
患である。これには例えば、内皮細胞の異常増殖のような癌腫、リンパ腫瘍性疾
患、黒色腫等がある。

【００１３】 好ましい核酸は、配列番号5〜8の1つに記載の配列を有するタンパク質、また
は該配列の1つに少なくとも60％の同一性を示すタンパク質をコードする。

【００１４】 好ましい態様では、核酸は配列番号1〜4の1つに記載の配列の、1つのコーディ
ング部分に少なくとも60％同一である。

【００１５】 さらに好ましい態様では、核酸は配列番号5〜8の1つに記載のタンパク質配列
をコードし、配列番号7をコードする核酸が特に好ましい。

【００１６】 本発明に従う核酸は、好ましくはDNAであるが；RNAまたはPNAもまた考慮され
る。

【００１７】 本発明に従う核酸の断片は、宿主細胞に組み込まれた後、プロモーターに対し
てアンチセンスの方向でセリンスレオニンプロテインキナーゼの発現を阻害する
のに適したものが、とりわけ好ましい。このような断片は少なくとも10ヌクレオ
チド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも200ヌ
クレオチドの長さである。

【００１８】 本発明に従う構築物は、本発明に従う核酸配列またはその断片を別の配列と組
み合わせて含み、これらは通常宿主細胞のゲノムには結合されない。このような
「外来性配列」は好ましくは、遺伝調節エレメントおよび転写翻訳シグナルであ
る（「発現調節エレメント」またはベクター由来の配列とも称される）。本発明
に従う配列は、これらのエレメントに機能的に結合している。

【００１９】 この結合により、望まれる適用に依存して、遺伝子発現の増加または減少をも
たらすことができる。宿主生物を、このように作製した組換え核酸構築物で形質
転換することができる。これらの調節配列に加えて、実際の構造遺伝子のこれら
の配列の天然の調節は依然として存在でき、適当な場合に、天然の調節が排除さ
れ、遺伝子発現が増大されるように、遺伝的に改変されうる。しかしながら、遺
伝子構築物をより単純に構築することもでき、すなわちさらなる調節シグナルを
配列の上流に挿入せず、それを調節する天然のプロモーターを除去しない。代わ
りに天然の調節配列をさらに調節しないように変異させることができ、遺伝子発
現を増加させる。さらに有利な調節エレメントを、本発明に従う核酸配列の3'末
端に挿入することもできる。配列番号1〜4に記載の核酸配列、および/または対
応するタンパク質をコードする配列番号5〜8に記載の配列は、遺伝子構築物中1
個以上のコピーとして存在できるか、または別の遺伝子構築物に位置することが
できる。有利な調節配列は、例えばプロモーター、例えばcos、tac、trp、tet、
trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、l-PR
またはl-PLプロモーターに存在し、これは好ましくはグラム陰性細菌において用
いられる。別の有利な調節配列は、例えばグラム陽性プロモーター、例えばamy
およびSPO2、酵母プロモーター、例えばADC1、MFa、AC、P-60、CYC1およびGAPDH
、または哺乳類プロモーター、例えばCaMキナーゼII、CMV、ネスチン（Nestin）
、L7、BDNF、NF、MBP、NSE、βグロブリン、GFAP、GAP43、チロシンヒドロキシ
ラーゼ、カイニン酸塩受容体サブユニット1、およびグルタミン酸塩受容体サブ
ユニットBに存在する。原則として前記で引用した調節配列を有する天然のプロ
モーターを全て使用することができる。さらに、合成プロモーターを有利に用い
ることができる。これらの調節配列は、標的化された核酸配列の発現およびタン
パク質発現を可能にすることを目的とする。これは例えば宿主生物に依存して、
遺伝子が誘導後にのみ発現もしくは過剰発現されるか、または即座に発現および
/もしくは過剰発現されることを意味し得る。調節配列または因子は、この点に
ついては好ましくは陽性に影響し、それにより発現を増加させる。従って、調節
エレメントの強化は、プロモーターおよび/または「エンハンサー」として用い
られている、強力な転写シグナルにより転写レベルで生じるのが有利である。し
かしながら、さらに例えば、mRNAの安定性の改善による翻訳の強化もまた可能で
ある。「エンハンサー」という用語は、例えばRNAポリメラーゼおよびDNA間の相
互作用の改善により発現が増強されるDNA配列を意味することを理解すべきであ
る。引用し得る別の調節配列には、例えば、「遺伝子座調節領域」、「サイレン
サー」、またはいずれかのそのサブ配列などがある。これらの配列を組織特異的
発現に使用するのが有利である。好ましい態様は、本発明に従う核酸と「上流」
に位置するプロモーター5'との組み合わせである。別の調節シグナル、例えば3'
に位置するターミネーターまたはポリアデニル化シグナルまたはエンハンサーを
、核酸構築物において機能的に用いることができる。用語はまた完全なベクター
構築物をも意味すると理解すべきである。これらのベクター構築物またはベクタ
ーを、適当な宿主生物における発現目的で使用する。本発明に従う核酸および/
またはSer/Thrプロテインキナーゼの遺伝子を宿主特異的ベクターに有利なよう
に挿入し、これにより選択した宿主において最適な遺伝子発現が可能になる。ベ
クターは当業者に公知であり、例えば書籍「クローニングベクター（Cloning Ve
ctors）」（ポウエルズ P.H.（Powels, P.H.）ら編、エルセビア、アムステルダ
ム-ニューヨーク-オックスフォード、ISBN 0 444 904018（1985））から収集す
ることができる。「ベクター」という用語は、プラスミドに加えて、当業者に公
知のその他の全てのベクター、例えばファージ、ウイルス例えばSV40、CMV、バ
キュロウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス、トランスポゾン、ISエ
レメント、ファスミド、ファージミド（Phagemid）、コスミド、直鎖状または環
状DNAを意味すると理解すべきである。これらのベクターは、宿主生物で自動的
に複製されるか、または染色体的に複製され得る。哺乳類の組み込みに関しては
、直鎖状DNAを用いるのが有利である。本発明に従う核酸配列または組換え核酸
構築物の発現は、遺伝子コピーの数を増加させることにより、および/または遺
伝子発現に陽性に影響する調節因子を強化することにより、有利に増加させるこ
とができる。従って調節配列の強化は、より強力な転写シグナル、例えばプロモ
ーターおよびエンハンサーを使用することにより、転写レベルで行うことができ
るのが好ましい。しかしながら、さらに例えば、mRNAの安定性を改善するかまた
はリボソームに対するこのmRNAのスキャン効率を増強することにより、翻訳の強
化が可能である。遺伝子コピー数を増加させるために、核酸配列または相同体遺
伝子を、例えば好ましくはそれぞれの遺伝子に割り当てられた調節遺伝子配列か
または類似の効果を有するプロモーター活性を含む、核酸断片またはベクターに
組み込むことができる。特に、遺伝子発現を強化する調節配列を使用する。本発
明に従う核酸配列を、個々のベクターにおいて相互作用タンパク質をコードする
配列と共にクローニングし、次いで望ましい生物で発現させることができる。あ
るいは、相互作用する可能性のある核酸配列、およびm30をコードする配列のそ
れぞれを個々のベクターに配置し、常法、例えば形質転換、トランスフェクショ
ン、形質導入、エレクトロポレーション、または粒子ガンにより、該生物に別個
に組み込むこともできる。さらに、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う
核酸を、治療用または診断用に適した断片の形態で発現させることもできる。組
換えタンパク質を作製するために、特異的ヌクレオチド配列により核酸または核
酸構築物を伸長し、従って精製をより簡単にする目的で提供される改変ポリペプ
チドをコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することができる
。例えば、ヘキサヒスチジンアンカーまたは様々な抗体の抗原として認識され得
るエピトープが、文献においてこの種の「タグ」として公知である（スタディヤ
ー（Studier）ら、Meth.Enzymol.185、60-89（1990）およびオースベル（Ausube
l）ら編、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Bi
ology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）。

【００２０】 本発明に従う核酸、その対立遺伝子変種、その機能的等価物もしくは誘導体、
または組換え核酸構築物の発現が可能である全ての細胞は、原則として宿主細胞
として適している。「宿主細胞」という用語は、例えば細菌、カビ、酵母、植物
または動物細胞を意味すると理解すべきである。好ましい宿主細胞/生物は細菌
、例えば大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、バ
チラス（Bacillus）またはシュードモナス（Pseudomonas）、真核微生物、例え
ばサッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス
（Aspergillus）、ヒトまたは動物由来の高等真核細胞、例えばCOS、Hela、HEK2
93、Sf9またはCHO細胞である。宿主生物およびベクターの組み合わせは、生物（
例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージ）に適しており、例えばRNAポリ
メラーゼ/プロモーター系を有するプラスミド、ファージI、Muまたはその他の鋳
型ファージもしくはトランスポゾン、および/または発現系由来のその他の有利
な調節配列生物などである。「発現系」という用語は、哺乳類細胞に適している
、例えばCHO細胞のような哺乳類細胞、例えばおよびpcDNA3neoベクターのような
ベクター、またはHEK293細胞、およびCMVベクターの組み合わせを意味するのが
好ましいと理解すべきである。しかしながら細胞を含まないインビトロ発現系も
また考慮される。

【００２１】 哺乳類組織、哺乳類器官またはトランスジェニック哺乳類もまた、本発明に従
う核酸を発現するための本発明に従う宿主として考慮される。好ましくは、該宿
主は野生型と比較して、本発明に従うタンパク質を改変された量で含むか、また
は本発明に従うプロテインキナーゼの新規タンパク質変種を含むという点で、野
生型とは異なる。しかしながら、本発明に従うタンパク質をコードする、天然に
存在する核酸が転写不活性であるように、完全にまたは部分的に除去または改変
されている、宿主生物も含まれる。

【００２２】 好ましくは、該生物は野生型で見出されるような天然の位置には適合しないゲ
ノムの位置で組み込まれた、本発明に従う核酸または本発明に従う断片または本
発明に従う構築物を含む。

【００２３】 好ましくは、マウス、ラット、ヒツジ、ウシまたはブタはトランスジェニック
哺乳類として考慮されるが、哺乳類以外の生物、例えば植物もまた、本発明に従
う配列の受容体として考慮される。トランスジェニック生物はノックアウト動物
として知られているものでもよい。この点については、トランスジェニック動物
は、本発明に従う機能的もしくは非機能的核酸配列、または機能的もしくは非機
能的核酸構築物を含有できる。前記したトランスジェニック動物に関する本発明
に従う別の取り合わせは、その生殖細胞または体細胞の全てもしくは一部で、本
発明に従うヌクレオチド配列が遺伝子工学により改変されているか、あるいはDN
Aエレメントの導入により中断されている、トランスジェニック動物である。ヌ
クレオチド配列またはその一部の使用の別の可能性は、トランスジェニックもし
くはノックアウトもしくは条件付きもしくは領域特異的ノックアウト動物、また
は遺伝的に改変された動物の特異的変異の作製である（オースベル（Ausubel）
ら（編）、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular B
iology）」（1998）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、およ
びトレス（Torres）ら編、「条件付き遺伝子標的化のための実験プロトコル（La
boratory protocols for conditional gene targeting）」、オックスフォード
大学プレス、オックスフォード（1997））。胚幹細胞における、同種組換えによ
るトランスジェニック過剰発現または遺伝的変異（ゼロ変異または特異的欠失、
挿入または改変）により、卒中の病因に関するさらなる情報を供給できる動物モ
デルを作製することができる。このようにして作製された動物モデルは、新規治
療薬を評価するための必須の試験系を提示し得る。

【００２４】 好ましくは、考慮されている無傷の細胞を含む発現系を用いて、適当な発現系
に本発明に従う核酸の1つを発現させることにより、本発明に従うタンパク質を
得ることができる。本発明に従うタンパク質は、好ましくは配列番号5〜8に記載
の配列の1つを有するタンパク質、または少なくとも60％、好ましくは少なくと
も70％、特に好ましくは少なくとも90％、該配列と同一であるタンパク質から選
択されるタンパク質であり、アルトシュル（Altschul）ら、J.Mol.Biol.250，40
3-410（1990）のアルゴリズムに従って算出される、配列番号5〜8に記載の配列
と「同一性％」を有する。しかしながら、本発明に従うタンパク質およびその機
能的変種を哺乳類、例えば、ヒト（Homo Sapiens）、ドブネズミ（Rattus norve
gicus）、またはマウス（Mus musculus）の脳から単離することもできる。本発
明に従うタンパク質はまた、アミノ酸交換によりプロテインキナーゼ活性が本質
的に変化していない配列番号5〜8の1つに記載のタンパク質に由来し得るもので
ある。例えば、配列番号5〜8に記載の出発タンパク質のアミノ酸を、類似の物理
化学的特性（例えば空間充填度、アルカリ度、疎水性等）を有するものと置換す
ることができる。例えば、アルギニンラジカルをリジンラジカルで置換でき、バ
リンラジカルをイソロイシンラジカルで、またはアスパラギン酸ラジカルをグル
タミン酸ラジカルで置換できる。しかしながら、1つまたは複数のアミノ酸をそ
の配列内で転位、付加または除去できるか、または該機構のいくつかを互いに組
み合わせることができる。特定のアミノ酸配列を望ましい配列に改変するための
手段は、当業者に公知である。

【００２５】 本発明のタンパク質と反応する本発明に従う抗体の産生は、当業者に公知であ
る。この目的のために、当業者は、例えばポリクローナル抗血清の産生、または
モノクローナル抗体産生のためのハイブリドーマ技術にも頼り得る。

【００２６】 本発明に従う阻害剤は、本発明のタンパク質のプロテインキナーゼ活性を選択
的に阻害または完全に排除できる、低分子またはタンパク質様物質である。適当
な阻害剤の同定および生成は、物質をスクリーニングするために慣用されるプロ
テインキナーゼアッセイの使用により、当業者にとって事実上可能である。適当
なスクリーニング法およびプロテインキナーゼアッセイを以下に記載する。コン
ピューター支援薬物開発（CAD）（例えばボーム（Bohm）、クレベ（Klebe）、ク
ビニー（Kubinyi）、「添加剤設計（Wirkstoffdesign）」（1996）、スペクトラ
ム・フェアラグ、ハイデルベルグ参照）の使用により、望ましい結合親和性を有
する適当な物質をもまた同定できる。このように同定された本発明に従うプロテ
インキナーゼの阻害剤は、例えば発作およびその他の神経学的（特に神経変性）
または腫瘍性疾患の予防および/または治療に適している。該低分子物質の場合
、本発明に従うプロテインキナーゼ阻害剤と特異的に相互作用し得るペプチドお
よびタンパク質もまた、阻害剤として考慮される。このようなペプチドまたはタ
ンパク質阻害剤を、例えばツーハイブリッド系または他のアッセイさえも用いて
同定することができる。これらのアッセイにより、他の相互作用パートナーとの
特異的相互作用を担う、アミノ酸の限界決定が可能になる。さらに、本発明に従
うタンパク質およびそのプロテインキナーゼ活性を、試験すべき物質の存在下で
タンパク質の活性を測定する試験系で、簡単に試験できる。好ましくは多くの被
験物質の迅速な測定が可能になる簡単な試験方法（比色、照度測定、蛍光に基づ
く技術、または放射活性技術）が含まれる（例えばボーム（Bohm）、クレベ（Kl
ebe）、クビニー（Kubinyi）、「添加剤設計（Wirkstoffdesign）」（1996）、
スペクトラム・フェアラグ、ハイデルベルグ参照）。上記の試験系により、本発
明に従うタンパク質に及ぼす阻害効果または活性効果さえも有する物質の、化学
ライブラリーを検索することが可能になる。虚血において誘導され、かつ本発明
に従うタンパク質を介して進行するシグナル伝達連鎖をこれらの阻害剤で阻害で
きる。これにより虚血後遺症の阻害または予防が可能になる。

【００２７】 本発明に従うプロテインキナーゼの細胞内生理学的相互作用パートナー、例え
ばリン酸化基質、およびキナーゼ活性を調節する細胞内相互作用パートナーを、
前記したツーハイブリッド選択系により同定できる。

【００２８】 配列番号5〜8の配列を有するタンパク質の量および活性（例えば特異的リン酸
化）も、抗体を用いて決定できる。従って、本発明の別の目的は配列番号5〜8の
配列の1つを有するタンパク質の、タンパク質活性を定量するための方法である
。配列番号5〜8に記載のアミノ酸配列に基づいて、抗体産生のための抗原として
用いられる合成ペプチドを作製することができる。抗体産生のためにポリペプチ
ドまたはその断片を使用することも可能である。「抗体」という用語は、ポリク
ローナル、モノクローナル、ヒトもしくはヒト化、もしくは組換え抗体、または
その断片、一本鎖抗体または合成抗体さえも意味することを理解すべきである。
「本発明に従う抗体またはその断片」という用語は、原則として全ての免疫グロ
ブリンクラス、例えばIgM、IgG、IgD、IgE、IgAもしくはサブクラス、例えばIgG
のサブクラスまたはその混合物を意味することを理解すべきである。IgGおよび
そのサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgGMが好ましい
。IgGサブクラスIgG1/kまたはIgG2/kが、特に好ましい。抗原に相補的な1つまた
は2つの結合部位を有する、全ての短縮された、または改変された抗体断片、例
えば抗体、例えば、Fv、FabまたはF（ab'）2断片または一本鎖断片に相当する、
軽鎖および重鎖から形成された結合部位を有する抗体部分を、断片として引用で
きる。短縮された二本鎖断片、例えば、Fv、FabまたはF（ab'）2断片が好ましい
。例えば、抗体のFc部分を酵素、例えばパパインまたはペプシンにより切断する
ことにより、酵素的に、化学的酸化により、または抗体遺伝子の遺伝子操作によ
り、これらの断片を得ることができる。遺伝子操作された短縮されていない断片
もまた、有利に用いることができる。抗体または断片を単独でまたは混合して使
用することができる。遺伝子操作のための抗体遺伝子を当業者に公知の方法で、
例えばハイブリドーマ細胞（ハーロウE.（Harlow，E.）およびレーンD.（Lane,D
.）「抗体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）」（1988）、
コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク；オースベル（Ausube
l）ら編、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Bi
ology）」（1998）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）から
単離することができる。この目的で、抗体産生細胞を抜き取り、公知の方法でチ
オシアン酸グアニジンで細胞を溶解し、酢酸ナトリウムで酸性にし、フェノール
、クロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ
、エタノールで洗浄することにより、十分な光学密度の細胞からmRNAを単離する
。次いでmRNAからのcDNAを、逆転写酵素を用いて合成する。合成したcDNAを直接
または遺伝子操作の後に、例えば「部位特異的変異誘発」、挿入の導入、逆位、
欠失または塩基交換により、適当な動物、真菌、細菌またはウイルスベクターに
挿入し、対応する宿主生物に発現させることができる。細菌または酵母ベクター
、例えばpBR322、pUC18/19、pACYC184、λ、または酵母muベクターが、遺伝子の
クローニングおよび細菌、例えば大腸菌（E.coli）における、または酵母、例え
ばサッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）における発現に好
ましい。本発明に従うタンパク質に対する特異的抗体は診断試薬、および本発明
に従うタンパク質が異常病態生理学的に重要である疾患の治療薬の双方として、
適することができる。

【００２９】 本発明に従う診断キットは、本発明に従う核酸の1つ、その断片もしくはこれ
を含む構築物、本発明に従うタンパク質および/または本発明に従うタンパク質
に特異的な抗体、ならびに通常診断キットの一部を形成する別の試薬をも含む。
これには適当な緩衝溶液およびその他の検出試薬などがある。

【００３０】 卒中の危険性の診断または脳梗塞の経過の評価のために、本発明に従う方法を
用いて、患者の試料を本発明に従う核酸と接触させ、患者の試料中でそれとハイ
ブリダイズする核酸を決定する。本発明に従う核酸とハイブリダイズする核酸レ
ベルの上昇は、卒中の発生の危険性が増加していることの指標である。患者試料
中の核酸を検出する代わりに、本発明に従うタンパク質の量を卒中の危険性の指
標として決定することもできる。例えば、本発明に従う抗体をタンパク質検出に
用いることができる。調査される患者の試料中のタンパク質レベルの上昇はまた
、卒中の危険性の上昇の指標でもある。健常者からの物質を示す陰性対照を用い
て、これらのアッセイを簡単に定量的に実施することもできる。

【００３１】 さらに、本発明に従う核酸およびそれからコードされるタンパク質、またはそ
のオリゴヌクレオチドおよびペプチドならびにそれを標的とする抗体を、別の疾
患、特に神経疾患または心臓血管性疾患または免疫疾患または腫瘍性疾患に用い
ることもできる。これらの物質をさらに特定の神経疾患、腫瘍性疾患、心臓血管
性疾患および免疫学的疾患に対する遺伝的素質の診断に用いることができる。さ
らに、これらの物質を用いて該疾患の処置をモニタリングすることができる。

【００３２】 生物学的試料中の、本発明に従う核酸の定性的かつび定量的な検出方法は、以
下の工程を含む：a）本発明に従う既知量の核酸、または本発明に従う核酸の増
幅のためのプライマーに適している、既知量のオリゴヌクレオチドと生物学的試
料とのインキュベーション、b）特異的ハイブリダイゼーションまたはPCR増幅に
よる、本発明に従う核酸の検出、c）ハイブリダイズする核酸またはPCR増幅によ
り得られる核酸の量と定量標準との比較。本発明に従うタンパク質ヘテロマーま
たは生物学的試料中の本発明のタンパク質の定性的および定量的検出方法は、以
下の工程：a）タンパク質ヘテロマーまたは本発明に従うタンパク質で特異的に
標的化された抗体と、生物学的試料とのインキュベーション、b）抗体/抗原複合
体の検出、c）抗体/抗原複合体と定量標準との比較。健常生物からの生物学的試
料は通常、標準として取り除かれる。特に以下に示すような、配列番号1〜4に記
載の核酸の異常病態生理学的刺激、例えば脳虚血に従って上方制御される特性を
本明細書で用いることができる。これは、例えば、疾患の経過の評価（例えば発
作）、治療上の成功の評価、および疾病の重篤度の等級付けに関わる。

【００３３】 本発明に従う薬学的組成物は、本発明に従う核酸、その断片、これを含む構築
物、該要素を含む宿主細胞、本発明に従うタンパク質、それを標的化された抗体
、および/または本発明に従う阻害剤を、慣用される賦形剤および担体と共に適
切に含む。

【００３４】 本発明に従う要素の治療適用は、内因性タンパク質のリン酸化に関係する過程
の調整に関わる。これには以下の生理学的または異常病態生理学的過程：免疫学
的活性化過程（例えば単球、T細胞の活性化）の影響；細胞死過程、例えば細胞
死に至るカスケード、または無制限な成長に至る過程の影響などが含まれる。処
置できる細胞型にはとりわけ神経細胞、腫瘍細胞および免疫系の細胞などがある
。最後に、プロテインキナーゼが関与する細胞相互作用、例えば細胞分割、細胞
分化、可塑性および再生性は、本発明に従う物質に影響され得る。

【００３５】 本発明に従う核酸またはその断片およびこれを含む構築物、対応する宿主細胞
および本発明に従うタンパク質、本発明に従う抗体および/または本発明に従う
阻害剤を、特に神経疾患、特に神経変性疾患の予防および/または治療に使用す
ることができる。これには特に、発作、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、ヘテロ変性運動失調、ハンチントン病、神経障害、およびてんか
んなどがある。

【００３６】 腫瘍性疾患もまた、それにより優先的に診断/処置することができる。このよ
うな腫瘍性疾患の例としては、結腸癌腫、横紋筋肉腫および気管支癌腫などがあ
る。

【００３７】 自己免疫疾患、アトピー、および/またはHIV感染を含む免疫学的疾患、ならび
に同時感染は、本発明に従うプロテインキナーゼを有する他の向免疫性ウイルス
、ならびに/または急性および/もしくは慢性リンパ性白血病、ならびに/または
急性および/もしくは慢性骨髄性白血病、ならびに/または原発性慢性多発性関節
炎ならびに/またはクローン病、ならびに/または潰瘍性大腸炎によってもまた、
診断/処置することができる。

【００３８】 哺乳類、特にヒトにおける遺伝子治療の一部として、本発明に従う核酸を使用
することもできる。遺伝子治療では、例えばアンチセンス技術により、本発明に
従う配列を身体またはその一部のいずれかに導入するか、または内因性物質の発
現を調節することができる。例えば、アンチセンス方向のオリゴヌクレオチドま
たは本発明に従う配列の断片を含むハイブリッドRNA-DNAオリゴヌクレオチドを
この目的で使用することができる。さらに、本発明に従う配列を含むウイルス構
築物を用いることができる。最後に、本発明に従う核酸を含む裸のDNAまたはそ
の一部を用いることができる。

【００３９】 本発明に従う核酸で同定されたSNPもまた、ヒト遺伝性疾患の研究における診
断に有用である。本発明に従う核酸を用いて、相同性スクリーニングによる常法
で、マウスおよびヒトゲノムにおいて相同なmRNAに関するさらなる遺伝子を単離
および特徴づけし、ヒト遺伝性疾患に関する既知のマーカーでそれらを相関させ
ることができる。これにより特定の遺伝性疾患の原因としてさらなる遺伝子を同
定することが可能になる。

【００４０】 9B5のタンパク質配列 マウスタンパク質配列（配列番号5および6）は5'末端が不完全である。配列番
号7および8に記載のヒト配列の場合は、全長のクローンが含まれている。これは
また、相同性プロテインキナーゼのアラインメントからも生じる。

【００４１】 h9B5（配列番号7）の場合、752アミノ酸を有するタンパク質（分子量82.5kD；
pH9.7で等電点）をコードするオープン・リーディング・フレームが生じる。プ
ログラムPSORT IIからは顕著なシグナル配列は得られず、膜貫通領域は予測され
ない。カイト・ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）疎水性プロット（図9）はまた
、親水性領域を高比率で示し、かつ比較的疎水性の高い領域を1つだけ示すが（
約240〜250アミノ酸）、これは膜貫通領域としては十分な疎水性ではないと思わ
れる（指標＞-3）。しかしながら、多くの関連タンパク質の報告された膜結合位
置は、この点で興味深い。

【００４２】 分子量75.3kDaおよびpH9.8が等電点である、688アミノ酸のオープン・リーデ
ィング・フレームは、配列h9B5_b（配列番号8）から生じる。エクソン16の挿入
の結果、翻訳停止がより早くなるフレームシフトが起こる。

【００４３】 9B5の分類 既知プロテインキナーゼとの比較により、本発明に従うタンパク質をハンクス
（Hanks）（http：//www.sdsc.edu/Kinases/pkr/pk catalytic/pk hanks seq al
ign long.html）（ハンクス（Hanks）およびリンドバーグ（Lindberg）、Method
s Enzymol、200，525-532（1991）；ハンクス（Hanks）およびハンター（Hunter
）、Faseb J.9，576-96（1995）参照）によるサブグループ「CaMK群II」に分類
することが可能になる。ドレワーズ（Drewers）ら、（ドレワーズ（Drewers）ら
、Cell 89、297-308（1997））はMARK1/MARK2およびp78が、既に定義されている
CaMKII群のSNF1/AMPKサブグループの新規サブグループであることを既に仮定し
ていた。最も高度な相同性タンパク質（9B5、Par1、cTAK1/p78、MARK1、EMK）お
よび進化系統樹（図7）のアラインメントに基づいて、9B5が新規サブクラスを定
義する可能性がある。カルボキシ末端で、9B5は他のプロテインキナーゼから明
確に派生する。この群のキナーゼは、配列「ELKL」で終止する高度に保存された
カルボキシ末端ドメインにより特徴づけされる。従って、EMKは「ELKLモチーフ
キナーゼ」とも称されている。カルボキシ末端で9B5に類似し、相同性スクリー
ニングにより同定され得るプロテインキナーゼが、依然として存在することを想
定すべきである。EMBLヌクレオチドデータベースに対するプログラム「tblastn
」を用いる検索では、今までのところカルボキシ末端領域で既知の相同体の証拠
は得られていない。

【００４４】 標的配列KXGSおよび/またはKVGSを有するタンパク質は、本発明に従うタンパ
ク質の生理学的基質を形成し得る。従って、タウタンパク質またはタンパク質MA
P1および2は、本発明に従うプロテインキナーゼの生理学的基質を表し得る。

【００４５】 触媒ドメイン：9B5のサブドメインは、セリンスレオニンプロテインキナーゼで
ある 重要な触媒性サブドメインは、他のプロテインキナーゼとの比較により明確に
定義できる（図6参照）。活性化部位も同様に示すことができる（リン酸化され
得るスレオニンおよびセリン；h9B5の211位および215位、図6）。これらのアミ
ノ酸の、例えばアラニンへの変異体により、構造的に不活性化される。サブドメ
インII（図6参照）のリジンラジカル（ATP結合）の変異によっても、同様に不活
性化される。この知見を別の実験、例えば優性阻害効果に利用することができる
。211位（Ser）および215位（Thr）のグルタミン酸塩またはアルパラギン酸塩へ
の変異により、負に荷電した基がリン酸化を模倣するため、構造的に活性化され
るはずである（ファング（Huang）およびエリクソン（Erikson）、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 91，8960-3（1994））。これらの変異体は、細胞またはトランスジ
ェニック動物における特異的キナーゼ活性の過剰発現を利用できる。

【００４６】 サブドメインIは、ATPの転移不可能なリン酸基をつなぎ止める、一種の留め金
として作用することが知られている。この点で、9B5のペプチド配列 は共通モチーフ とよく適合する（ハンクス（Hanks）およびハンター（Hunter）、Faseb J.9，57
6-96（1995））。サブドメインIIでは、主にリジン（図6の標識された「A」）が
重要であり；これは、ATPのαおよびβリン酸塩をつなぎ止めて指向させ、かつ
酵素機能に必須である。サブドメインVIbは共通配列 により特徴づけられる。これは9B5で非常によく保存されている：

【００４７】 アスパラギン酸塩（D）は、この点で恐らくリン酸転移反応中のヒドロキシル
基を攻撃するための、プロトン受容体である（ハンクス（Hanks）およびハンタ
ー（Hunter）、Faseb J.9，576-96（1995））。サブドメインVIIはMg2+イオンと
共にγリン酸塩を封入するキレート複合体を形成し、このようにしてこの基を指
向させて転移させる。配列DFGは実際的には不変である。サブドメインVIIIの保
存配列APEは、同様に保持される。このドメインは、ペプチド認識に寄与する。
阻害剤ペプチドもまた、ここで結合できる。多くのプロテインキナーゼは、この
サブドメイン内でのリン酸化により活性化される。このドメインはEMK、p78およ
びMARK1において十分に保存されている。MARK1の場合、これは既に直接配列決定
によりスレオニン（T）およびセリン（S）をリン酸化でき、それによりMARK1が
活性化されることが示されている。この保存のために、9B5もまたこれらの部位
でリン酸化され、従って調節され得る可能性が非常に高いと考えられる。恐らく
自己リン酸化を生じ；別のキナーゼによる活性化もまた考えられる。このドメイ
ンではチロシン（Y）もまた、恐らくリン酸化部位である（例えばErk1/2の場合
のように）。サブドメインIXもまたペプチド結合に関与する（疎水性相互作用）
。

【００４８】 この構造の進展のために、9B5が活性なプロテインキナーゼ（セリンスレオニ
ンキナーゼ）であることが確実であると考えられる。

【００４９】 9B5の組織発現 9B5の組織発現がマウスおよびヒトにおいて調査されている。マウスでは「多
重組織ノーザン」を様々な組織で実施した（図2）。マウスcDNAの3'領域からの
断片を試料として用いた。この場合、発現は脳、精巣および肺で起きた。

【００５０】 ヒトの場合、最初に2つの異なるプローブで「多重組織ノーザン」（クロンテ
ック）を実施した（3'および5'領域より）。しかしながら、明確なシグナルは得
られず、これはヒトにおいて9B5の発生率が低いためである。従って、ライトサ
イクラー（LightCycler）（ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム）を
用いて定量的PCRを実施した。4つの異なるハウスキーピング遺伝子で定量的に標
準化した、8個のヒト組織のcDNA試料を使用した（クロンテックにより製造）。
ヒト9B5-cDNAの増幅された断片に含まれるプラスミドh9B5-663を、対照として使
用した。タッチダウンプロトコルをPCRプログラムとして選択した。組織試料に
おいて、融点90℃で生成物を増幅し；これは調節PCRと一致した。続く断片のゲ
ル分析により、およそ660bpの、すなわち予測された大きさの生成物が生成され
た。ヒトにおいては、9B5は実際にはそれほど強く発現されない；ライトサイク
ラーでおよそサイクル32の増幅で可視化される。以下のプライマーを使用した： 定量分析（図3）により脳および肺、肝臓、腎臓および膵臓において高濃度の、
比較的汎在性の組織分布が示される。

【００５１】 限局性脳虚血、発作モデルによる調節 限局性脳虚血後のマウス虚血脳半球において、示差調節遺伝子（RMDD）のクロ
ーニングのための方法により、本発明に従うセリンスレオニンキナーゼ9B5を同
定した。限局性脳虚血の動物モデルは、ヒト虚血性発作の妥当な動物モデルを表
わす。限局性脳虚血をもたらすために、コーティングしたナイロン糸を内頸動脈
から中大脳動脈の末端まで通し、虚血性発作を誘起する、いわゆる糸モデルを使
用した（クラーク（Clark）ら、Neurol.Res.19、641-648（1997））。脳虚血で
は、遺伝子発現の調節が神経細胞損傷の過程および程度において、重大な役割を
果たす（コイスチナホ（Koistinaho）およびホックフェルト（Hokfelt）、Neuro
report、8、i-viii（1997）；シュナイダー（Schneider）ら、Nat.Med.5、554-9
（1999））。特に、「前初期遺伝子」（アトキンス（Atkins）ら、Stroke 27、1
682-1687（1996））、例えばcox-2（ノガワ（Nogawa）ら、J.Neurosci.17、2746
-2755（1997））がここで役割を果たす。

【００５２】 限局性脳虚血の後の9B5発現を3つの時間スケールで調査した：第1に2回の再灌
流期間（虚血が90分、再灌流が2時間および6時間）の後に一過性の虚血、第2に2
4時間の永続的な虚血（図4）。脳幹および小脳を含まない3〜4個の脳の、2個の
半球の半分からRNAを抽出した（ファストトラック・キット、インビトロゲン）
。ライトサイクラー（商標）システム（ロシュ・ダイアグノスティックス、マン
ハイム）を用いて、定量的PCRを実施した。試料中のcDNA含量をシクロフィリン
およびS20の発現に対して標準化した（シュナイダー（Schneider）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 92、4447-51（1995））。シクロフィリンの増幅に使用したプラ
イマーは： であり、かつマウス9B5の増幅に使用したプライマーは： であった（これらのプライマーは、マウスcDNAの3'末端に位置する556bpのアン
プリマーを増幅する）。

【００５３】 実際には、脳の虚血している半分（左）上の7〜8個の因子による、9B5-RNAの
明確な上方制御が虚血の2時間後に現れ（中大脳動脈閉塞が90分および再灌流が2
時間；（図4）；エラーバーは標準偏差を示す（これらは3回の連続希釈したcDNA
試料を用いた測定値から生じ、このようにして測定結果の信頼性を反映する）。
一方、24時間後（永続的モデルにおいて）には、もはや検出可能な差異はなかっ
た。

【００５４】 マウス9B5-cDNAの3'領域からの1.6kbの長さのプローブを用いて、インサイチ
ューハイブリダイゼーションも実施した（センスおよびアンチセンスのそれぞれ
の場合で）。これに採用した方法は本質的には、ロスナー（Rossner）ら（Mol.C
ell Neurosci.9、460-475（1997））による、改変後のロシュ・ダイアグノステ
ィックス社のプロトコル（ジゴキシゲニン系）と同様であった。虚血側（左）、
特に海馬領域および皮質の神経細胞において明確な誘導が認められ、視床では少
なかった（図5）。9B5が神経細胞において優性に発現され、そこで調節を受ける
ことも明らかになった。

【００５５】 これにより、9B5が発作の病因において重要な役割を果たし、9B5の上方制御が
、例えば公知のセリンスレオニンキナーゼ（例えばJNK、p38）の上方制御に類似
の役割を果たすことが示される。

【００５６】 多くのセリンスレオニンキナーゼは細胞死過程に関与する（例えばASK1（トビ
ウメ（Tobiume）ら、Biochem. Biophys.Res.Commun.239、905-10（1997）；ベレ
ステツカヤ（Berestetskaya）ら、J.Biol.Chem.273、27816-23（1998）；チェン
（Chen）ら、Oncogene 18、173-180（1999））、DAP（インバル（Inbal）ら、Na
ture、 390、180-4（1997）；レビー・ストランフ（Levy-Strumpf）およびキム
チ（Kimchi）、Oncogene、 17、3331-40（1998））、DRAK（サンジョウ（Sanjo
）ら、J.Biol.Chem.273、29066-71（1998））、ZIP（カワイ（Kawai）ら、Mol.C
ell Biol.18、1642-51（1998））、DRP-1（インバル（Inbal）ら、Mol.Cell Bio
l、20、1044-54（2000））。

【００５７】 この上方制御は、プロテインキナーゼの新規の転写調節機構の証拠であり、今
までのところ、哺乳類系において公知の唯一の実例である。興味深いことに、い
くつかのMAPキナーゼの上方制御は、酵母トランスクリプトームの系統的な研究
において、ごく最近に見出されたもののみである（ロバーツ（Roberts）ら、Sci
ence 287、873-80（2000））。これはプロテインキナーゼ調節に関する、新規な
一般的な機構を表しているのかもしれない。

【００５８】 神経疾患、腫瘍性疾患およびその他の疾患における、9B5の薬理学的重要性 膜に基づく受容体の「下流」のシグナル伝達経路を阻害/影響する研究法が、
薬理学的研究において最近重要性を増してきている。これらの研究法は、将来恐
らくヒト疾患、特に今までのところうまく処置できないかまたは処置不能であっ
た疾患の場合において、重要な役割を果たすと考えられる（クレトサス（Kletsa
s）およびパパバシリオウ（Papavassiliou）、Exp.Opin.Invest.Drugs 8、737-7
46（1999））。これらの研究法の利点は、これが第1に、いくつかの刺激により
もたらされることができ、共通の最終節を有する事象に影響を及ぼすことができ
；第2に細胞性事象が一時的な誘発刺激に続き、従ってより長期の介入に対して
門戸を開くということである。

【００５９】 このようなシグナルカスケードにおける介入の成功例としては、刺激を誘発し
た後さらに長期のアポトーシス過程を遮断できる、カスケードの阻害剤などがあ
る。転写因子NF-κBおよびこれらの活性化過程もまた、特に関心を集めている。
例えばl-κBキナーゼのクローニングはNF-κB媒介遺伝子転写の特異的阻害剤を
見出す目的で追求されている。示差転写プロファイリングが薬物のための可能な
新規出発点を同定するための医薬的研究において、最近重要性を増してきている
。転写調節、すなわち細胞の遺伝子におけるmRNA量の調節が、刺激に加えてタン
パク質リン酸化、タンパク質分解等に対する細胞応答の必須の段階である。前記
で示したように、9B5は明らかに転写活性化により非常に迅速な調節に供される
。この種の迅速に調節される遺伝子は、しばしば細胞過程の重大な位置に関係す
る。

【００６０】 9B5に及ぼす薬理学的影響は以下の方法で可能である：1. 細胞における転写量
に及ぼす影響、例えば病因過程に続く迅速な上方制御の抑制（例えばアンチセン
ス技術による）；2. 9B5の酵素活性、特にキナーゼ活性の阻害（例えばキナーゼ
インヒビーターによる）；3. 1つまたは複数の別の分子、例えば下流のプロテイ
ンキナーゼ、またはアダプターとの相互作用の阻害。

【００６１】 多くのMAPプロテインキナーゼの特異的阻害剤が最近開発されている。一例を
挙げると、MEK1の阻害剤であるPD98059である。これはβアミロイドでの刺激に
よりタウのリン酸化を防ぐ。これはアルツハイマー病の処置に重要である可能性
を有する。

【００６２】 抗腫瘍薬UCN-01はcdc25cリン酸化の阻害剤である（グレイブス（Graves）ら、
J.Biol.Chem.275、5600-5（2000））。

【００６３】 本発明に従うプロテインキナーゼの阻害剤は、従来のプロテインキナーゼアッ
セイにより簡単に同定され、脳虚血の後遺症の調節を有効に促進することができ
る。

【００６４】 9B5に関する実験データにより、神経細胞死、興奮、可塑性および神経発生に
関連する過程における中心的な併発が明確にされる。本発明に従うタンパク質は
、限局性虚血の後遺症の阻害または低減のための、重要な標的分子に相当する。
限局性虚血の結果としての卒中の進行における中心的な役割に加えて、本発明に
従うタンパク質は、腫瘍性疾患、例えば癌の処置における重要な標的分子でもあ
る。この場合、本発明のタンパク質またはその遺伝子が、抗癌剤の標的分子にも
相当し得る。多くの共通する機構が虚血により引き起こされる疾患に関して存在
するような、心血管性疾患の診断および処置においても、遺伝子は同様に重要な
役割を果たし得る。

【００６５】 本発明に従う特に好ましい態様では、本発明に従うプロテインキナーゼのレベ
ルまたは活性は、発作の予防および治療のために低下される。これは例えば、阻
害もしくは低減されている、対応する核酸の発現/翻訳により発現レベルで、ま
たは適当な阻害剤により低減もしくは阻害されている、プロテインキナーゼ活性
によりタンパク質活性のレベルで生じ得る。

【００６６】 本発明に従う核酸およびそれからコードされるタンパク質により、新規治療研
究法が開かれる。従って、例えば内因性核酸は、その転写に直接影響することに
よるか、またはむしろ本発明に従うタンパク質への翻訳に影響することにより、
影響され得る。これに関しては、例えば共抑制またはアンチセンス技術により、
内因性転写物の翻訳が低減される遺伝子治療研究法が考慮されている。本発明に
従うタンパク質による、タンパク質活性のレベルでの新規研究法もまた出現して
おり、例えば医学上活性な物質の標的分子に相当する。従って、卒中の機構にお
ける調節法で介入するために、本発明に従うプロテインキナーゼの活性を薬学的
に活性な物質により改変できる。前記したプロテインキナーゼ阻害剤は、このよ
うな薬学的に活性な物質のクラスに相当する。原則的には、本発明に従う核酸ま
たは本発明に従うタンパク質の提供により、発作の予防または治療の全く新たな
研究法もまた開拓される。

【００６７】 以下の実施例により本発明を説明する：

【００６８】 実施例 実施例1 9B5の分子クローニング マウスにおける糸モデルの誘導 c57/bl6マウスにおいて限局性脳虚血を誘導するために、3か月齢マウスを使用
した。麻酔薬（70％ N₂O、30％ O₂、0.8〜1％ ハロタン）吸入の誘導後、0.1％
ポリ-L-リジンでコーティングした5-0プロレン糸（エチコン社により製造）を内
頸動脈から中大脳動脈の末端まで通した。糸の正確な位置はレーザー・ドップラ
ー・シグナル（ペリメッド社）の出発シグナルの10〜20％までの急激な低下によ
り示される。この操作の実施、かつ適当な場合、さらなる生理学的パラメーター
の決定（血圧、脈拍、血中ガス、血中グルコース）の後、マウスを麻酔から覚醒
させる。特定の閉塞期間の後、マウスを再度麻酔に供し、糸を抜き取る。それに
より組織の再灌流が起こる。特定の再灌流期間の後、頸部骨折によりマウスを屠
殺し、脳を即座に調製し、ドライアイスで凍結させる。

【００６９】 本ケースの場合、再灌流は実施せず、90分または24時間の閉塞のみ行った。

【００７０】 脳からのmRNAの調製 インビトロゲンにより製造されたmRNA調製キット（ファストトラック）をこの
目的で使用した。

【００７１】 RMDDプロトコルの実施（図1も参照） 採用した方法は本質的には欧州特許第0743367 A2号；米国特許第5,876,932号
のとおりであり、ポリA-RNA 2μgを第1鎖合成に使用するという修正を加えた。
第1鎖、第2鎖合成の後、Mbol制限、アダプターとのライゲーションを実施する。
プライマーの組み合わせのサブセットを用いて、2つの連続PCR反応を続ける。次
いでPCR反応物を変性ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ナイロン膜（GATCによ
り製造）でブロットする。ビオチン標識バンドを通常のストレプトアビジンペル
オキシダーゼ反応を用いて可視化する。虚血および対側半球のPCR試料を一緒に
ゲルに適用した（右および左で24時間のMCAOならびに右および左で90分のMCAO）
。右または左半球で異なる強度のバンドを切り取り、対応するPCR産物の再増幅
を実施する。得られた増幅産物をTOPO TAベクターpcDNA2.1（インビトロゲンに
より製造）にクローニングし、T7およびM13revプライマーで配列決定する（ABI
3700キャピラリー電気泳動シークエンサー）。

【００７２】 9B5のクローニング この方法の実施中に、虚血側で90分後に配列が上方制御されるように見えるこ
とに注目した。これを9B5と称する。ライトサイクラー分析により、MCAO後の迅
速な調節を確認した（90分間のMCAO、および2時間の再灌流）（図4）。

【００７３】 単離された3'に位置するPCR断片を用いて、マウス脳バンクをハイブリダイズ
し、ここでは配列番号1および配列番号2の一部の配列を含むいくつかのクローン
があった。5'領域からのマウス試料を用いて、λZapII（ストラタジーン）ヒト
胎児脳バンクをスクリーニングした。この点で、2個の異なる配列もいくつかの
クローンから得られ、これは恐らくいくつかのクローンから得られた同一遺伝子
（配列番号3および4）のスプライス変種に相当する。

【００７４】 用いたヒトcDNAライブラリーの詳細な作製については以下に示す：

【００７５】 ヒトcDNAライブラリーの作製 ストラタジーン社により製造されたcDNA合成キットを用いて、対応するcDNAラ
イブラリーをヒト胎児脳mRNA（クロンテックにより製造）2μgおよびmRNA 5μg
に基づいて、本質的に製造者の詳細な説明に従うように適応させた方法で成熟マ
ウス脳から作製した。第1鎖cDNAを合成するために、製造者の詳細な説明に従っ
てオリゴdTプライマーを用いた。クローニング適合（EcoRI/XhoI）二本鎖cDNA断
片を大きさで選択し（製造者の詳細な説明に従う/ストラタジーン）、プラスミ
ドベクターpBluescript SKII（ストラタジーン）にライゲーションした。大腸菌
（E.coli）（DH10B、ギブコ）中でのエレクトロポレーションによりライゲーシ
ョンを形質転換し、LBアンピシリン寒天プレートで増幅した。プラスミドDNAを
アルカリ性溶解およびイオン交換クロマトグラフィー（QIAフィルターキット、
キアゲンにより製造）により単離した。

【００７６】 個々のクローンの複雑度は、胎児ヒト脳cDNAバンクの400万であった。各cDNA
バンクから、24の個々のクローンを挿入物の大きさによって無作為に分析し、80
0bp〜4.5kBの大きさの分布が示された；cDNA挿入物の平均の長さは、ヒトバンク
でおよそ1.2kBであった。

【００７７】 実施例2 レポーター遺伝子アッセイの実施 得られた9B5の配列を用いて、シグナル伝達カスケードにおけるタンパク質の
取り合わせに関する情報を得ることができる。この目的で、遺伝子のオープン・
リーディング・フレームを本発現ベクター（例えばpCMV-タグ、ストラタジーン
により製造）にクローニングする。この構築物を真核細胞中、他の構築物と一緒
にトランスフェクトできる（例えばリン酸カルシウム法による、オースベル（Au
subel）ら、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular
Biology）」、ニューヨーク（1997）参照）。例えば、これらはレポーター構築
物、例えば転写因子NF-kappaBまたはAP-1のための、いくつかの結合部位を有す
る最小プロモーターの調節下にある、ルシフェラーゼ遺伝子でよい。細胞からの
抽出物を、次いで照度計（例えばバートルド社（Bertold）により製造）での測
定に供することができる。ルシフェラーゼ値の増加は、結果的に特異的転写因子
を活性化する、シグナル伝達経路の影響を示している。別の遺伝子の発現構築物
（例えばMAPキナーゼ）との組み合わせは、シグナルカスケードにおける9B5の正
確な位置に関する情報を提供できる。これらのレポーターアッセイを、影響され
ているアッセイの原理を伴わない別のシステム、例えばlacZまたはクロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ（CATアッセイ）でも実施できる。

【００７８】 同じ方法で既製のキット（例えばクロンテックにより製造されたマーキュリー
インビボキナーゼアッセイキット）を用いることもでき、Tetリプレッサーはリ
ン酸化標的（転写因子、例えばJun）のトランスアクチベータードメインと共に
、融合時に発現される。Tetリプレッサーエレメントの調節下でのルシフェラー
ゼ構築物は、トランスアクチベータードメインの特異的リン酸化がキナーゼ（例
えば9B5）により生じる場合にのみ活性化される。このように、細胞シグナル伝
達経路における取り合わせが可能である。

【００７９】 実施例3 キナーゼアッセイ プロテインキナーゼは生化学的に非常によく特徴づけされている。9B5のオー
プン・リーディング・フレームをエピトープタグ（例えばpcDNA-myc-his）を有
する発現ベクターにクローニングし、真核細胞（例えばCos細胞）でトランスフ
ェクトすることにより、9B5のキナーゼ活性を示すことができる。48時間後、こ
れらの細胞から抽出物を得て、myc特異的抗体およびプロテインAビーズで免疫沈
降を実施できる。γ-³²P-ATPの存在下、キナーゼ緩衝液中でキナーゼ反応を実施
する。次いでタンパク質を変性させ、SDS-PAGEゲルで分離する。次いでオートラ
ジオグラフィーを実施する。標識ビーズは、9B5のキナーゼ活性を示す。キナー
ゼ自体の自己リン酸化がしばしば同様に生じる。潜在的な標的、例えばこれもま
たタグと共に提供され、免疫沈降されうる種々のMAPキナーゼとの、共トランス
フェクションにより、可能なリン酸化標的もまた提示される。

【００８０】 また、インビトロ（例えばプロメガ社により製造されたT7網状赤血球系）で転
写/翻訳されている9B5を用いて、キナーゼアッセイを実施できる。大腸菌（E.co
li）で発現されているタンパク質、例えばGST融合タンパク質またはHISタグ化構
築物も使用することができる。この点に関して、これらのタグをタンパク質の精
製に使用することができる。次いで精製されたタンパク質を、可能性のある物質
と共にキナーゼ緩衝液中でインキュベートできる。Ser/Thrキナーゼに非特異的
に頻繁にリン酸化されるMBP（ミエリン塩基性タンパク質）を、本明細書ではし
ばしば使用する。

【００８１】 プロテインキナーゼのキナーゼドメインは、非常によく定義されている。リン
酸塩転移ドメインの個々のアミノ酸の変異はしばしばタンパク質機能の喪失に十
分である（例えば、ASK1の場合のK709M（チャン（Chang）ら、Science 281、186
0-3（1998））；DRAK1のK90A、DRAK2のK62A（サンジョウ（Sanjo）ら、J.Biol.C
hem.273、29066-71（1998））；NIKのKK429-430AA（サンジョウ（Sanjo）ら、J.
Biol.Chem.273、29066-71（1998））；TAK1のK63W（ニノミヤ-ツジ（Ninomiya-T
suji）ら、Nature 398、252-6（1999）））。これらの不活性キナーゼは、しば
しば細胞経路の評価にとって、例えば共トランスフェクション実験およびキナー
ゼアッセイにおいて優性阻害剤として非常に重要である（ニノミヤ-ツジ（Ninom
iya-Tsuji）ら、Nature 398、252-6（1999））。この種の変異を9B5でも実施で
きる。標的タンパク質の特異的リン酸化を、リン酸化特異的抗体、例えばクロン
テック社により製造されたホスホSerTher/Tyrモノクローナル抗体、マウスIgG2b
で表すこともできる。

【００８２】 技術分野で一般に使用されるキナーゼアッセイの別の例は、例えば書籍「タン
パク質リン酸化、実践的研究法（Protein Phosphorylation, A practical appro
ach）」D.G.ハーディー（Hardie）編、第2版、オックスフォード（1999）、特に
第9章および第10章から収集することができる。

【００８３】 実施例4 9B5のリン酸化標的の同定 9B5のリン酸化標的を、例えば相互作用スクリーニングにより同定できる。こ
の点に関して、λバクテリオファージの幾分古典的なペプチド発現バンク（最も
よく用いられる系はベクターλgt11であり、オースベル（Ausubel）ら「分子生
物学の最新プロトコル（Current protocols in molecular biology）」（1997）
、ニューヨーク参照）を用いることができる。1つの研究法は、9B5を精製タグ（
例えばポリヒスチジンまたはGST）およびプロテインキナーゼAの共通リン酸化部
位（配列RRASV）を組み込んだ細菌発現ベクターにクローニングすることである
。従って、標準的な方法に従って9B5を細菌中で発現および精製することができ
る。このようにプロテインキナーゼAと共にインキュベートすることにより、9B5
をスカベンジャーとして³³Pまたは³²Pで標識することができる。次いで、発現バ
ンクを標識9B5と共にインキュベートすることができる。オートラジオグラムに
曝露した後、標準的な方法により陽性クローンを同定し、単離し、配列決定する
ことができる。この技術を以下の方法に適用することもできる：9B5の自己リン
酸化特性を利用して単純なインキュベーションにより³³P-γATPで9B5を標識する
ことができる。発現バンクを精製された9B5および³³P-γATPと共にリン酸化条件
下（リン酸化緩衝液等）でインキュベートし、発現されたペプチドは9B5により
能動的に標識されるように方法を改変することもできる。しかしながら、この方
法は前記した方法よりも不安定である。配列決定されたペプチドを用いて共通認
識およびリン酸化配列を処方することができる。これによりバイオインフォマテ
ィックな方法で可能性のある基質の同定が可能になる。候補物質を発現および9B
5とのインキュベーションにより確認することができる。発現スクリーニングの
これらの形態の実施の成功例は、以下に含まれる：（モックリー-ローゼン（Moc
hly-Rosen）およびゴードン（Gordon）、Faseb.J.12、35-42（1998）；ブラナー
（Blanar）およびラッター（Rutter）、Science 256、1014-8（1992）；チャプ
リン（Chapline）ら、J.Biol.Chem.268、6858-61（1993）；チャプリン（Chapli
ne）ら、J.Biol.Chem.271、6417-22（1993）；カエリン（Kaelin）ら、Cell 70
、351-64（1996）；ソンヤン（Songyang）ら、Curr.Biol.4、973-982（1994））
。

【００８４】 9B5のリン酸化標的を酵母ツーハイブリッドスクリーニングでも同定すること
ができる（フィールズ（Fields）およびソング（Song）、Nature 340、245-6（1
989））。例えば、Rasおよびc-Raf（Ser/Thrキナーゼ）の相互作用が酵母ツーハ
イブリッド系で見出された（フィールズ（Fields）およびソング（Song）、Natu
re 340、245-6（1989））。Ser/ThrキナーゼSNF1とSNF4の相互作用は、実質的に
は酵母ツーハイブリッド系のプロトタイプである（フィールズ（Fields）および
ソング（Song）、Nature 340、245-6（1989））。原則的には酵母スクリーニン
グと同等な方法で、哺乳類系も使用できる（フィールズ（Fields）およびソング
（Song）、Nature 340、245-6（1989））。酵母ツーハイブリッドスクリーニン
グの場合、9B5のオープン・リーディング・フレームを、GAL4結合ドメインを有
するいわゆる「ベイトベクター」（例えば、pGBT10、クロンテックにより製造）
にクローニングする。いくつかの最新のプロトコルに従って、相互作用するタン
パク質に関して、酵母株のいわゆる「プレイライブラリー」を検索できる。これ
は、しばしばより安定した方法でリン酸化標的と相互作用するので、この点でキ
ナーゼ陰性変異体を使用するのはしばしば有用である。特異的リン酸化をよりう
まく実施できるように、合成経路におけるセリンスレオニンキナーゼをアダプタ
ー分子により空間的に近位にすることができる（チャン（Chang）ら、Science 2
81、1860-3（1998））、（ヤスダ（Yasuda）ら、Mol.Cell Biol.19、7245-54（1
999）；ウィットマーシュ（Whitmarsh）およびデイビス（Davis）、Trends Bioc
hem.Sci.23、481-5（1998）；ウィットマーシュ（Whitmarsh）ら、Science 281
、1671-4（1998））。従って、第1にアダプタータンパク質をクローニングし、
これを「ベイト」として特異的標的分子を見出すことにより、酵母ツーハイブリ
ッド系の2つの工程を介して、リン酸化標的に遭遇することも可能である。概し
て、相互作用ドメインに関するマッピング実験を酵母ツーハイブリッド系で実施
することもできる。

【００８５】 9B5発現ベクターでトランスフェクトした細胞からの共免疫沈降を使用して、
それらに結合するタンパク質を精製し、タンパク質配列決定法により遺伝子を同
定することもできる（例えばMALDI）。

【００８６】 次のキナーゼアッセイによる、細胞抽出物からの免疫沈降後、リン酸化バンド
を精製し、これらを配列決定することも可能である。

【００８７】 技術分野で一般に用いられるプロテインキナーゼ基質同定の別の例は、例えば
書籍「タンパク質リン酸化、実践的研究法（Protein Phosphorylation, A pract
ical approach）」D.G.ハーディー（Hardie）編、第2版、オックスフォード（19
99）から収集できる。

【００８８】 実施例5 アポトーシスアッセイ 非常に多くの、以前に同定されたセリンスレオニンキナーゼが、アポトーシス
過程に関与している。例えばASK1（ジャン（Zhang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 96、8511-5（1999））、（イチジョウ（Ichijo）ら、Science 275、90-4（199
7））、DRAK（ジャン（Zhang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96、8511-5（1999
））、（イチジョウ（Ichijo）ら、Science 275、90-4（1997））。真核細胞に
おいて発現構築物を9B5でトランスフェクトすることにより、アポトーシスカス
ケードにおける9B5の関与をさらに調査でき、次いでアポトーシスの誘導を調査
できる。これは、例えばカスパーゼ-3の活性の形態を認識する抗体により（ニュ
ーイングランド・バイオラボズにより製造）、またはDNA-ヒストン断片を認識す
るELISAにより（細胞死イライザ、ロシュ・ダイアグノスティックス）、アネキ
シン（ロシュ・ダイアグノスティックスにより製造）で染色することにより行う
ことができる。このアポトーシスの誘導は細胞型特異的でよく、それでいくつか
の細胞系および1次細胞を調査しなければならない。アポトーシスの誘導はまた
刺激特異的でもよく、それでいくつかのストレス環境、例えば熱ショック、低酸
素条件、サイトキシン処置（例えばIl-1、Il-6、TNF-α）、H₂O₂処置がこの疑問
を解くのに役立つ。細胞型ではいくつかの慣用される系、例えばCos細胞、NEK細
胞、PC12細胞、THP-1細胞および1次細胞、例えば神経細胞および星状細胞が、別
の不死化および1次細胞系と同様に、必要であると考えられる。

【００８９】 実施例6 9B5の阻害剤を同定するための高速大量スクリーニングアッセイ 9B5を用いてその相互作用パートナー（例えばアダプター分子）との相互作用
の阻害剤を見出すことができる。例えば、FRET（周波数共鳴エネルギー転移）系
で融合時に発現され、GFP（緑色蛍光タンパク質）で精製された、9B5およびBFP
（青色蛍光タンパク質）を伴うその相互作用パートナーにより、これを実施でき
る。細胞を含まない系では、複合化学物質バンクを検索する場合に、BFPの放射
の減少を阻害剤の存在の指標として用いることができる。

【００９０】 しかしながら、検出されたプロテインキナーゼを治療用に開発する主要な目的
は、第1にプロテインキナーゼ活性を排除することであり、これは最も容易に実
施できる。原則的に、酵素特性そのものを指標として容易に使用できるため、プ
ロテインキナーゼはそれ自体を、タンパク質のキナーゼ特性の阻害剤（小型分子
阻害剤）を同定するための高速大量アッセイの実施に提供する（実施例3のキナ
ーゼアッセイも参照）。

【００９１】 リューター（Reuter）らの濾過アッセイ法（リューター（Reuter）ら、Method
s in Enzymology 255：245（1995））により、非特異的基質として用いられてい
るMBPで9B5のHTS系を簡便に実施できる。これをイライザ（ELISA：酵素結合免疫
吸着検定）に適した96穴プレート（例えばフラッシュプレート、NENライフ・サ
イエンス・プロダクツ、またはヌンク）に適用する。反応緩衝液（3×キナーゼ
反応緩衝液は以下を含む：60mM HEPES（pH7.5）、30mM MgAc、0.15mM γATP、3m
M DTT、0.03mM オルトバナジン酸Na）を添加する。0.25μCi 33P-γATPおよび前
記したキナーゼを、1μg/ml以下の濃度で添加する（最初に滴定を実施すべきで
ある）。可能性のある阻害剤（例えば化学物質バンクからの小型分子）（例えば
10μM）の存在下、反応物を30℃で1時間インキュベートする。全反応物容量は10
0μlである。EDTA（pH7）を最終濃度80mMまで加えることにより反応を停止させ
る。次いで試料を遠心分離し、上澄50μlをp81陽イオン交換紙（ワットマンによ
り製造）に適用する。次いでフィルターを180mMリン酸200mlで3回（5分毎）、96
％エタノール200mlで1回洗浄する。空気乾燥した後、フィルターの放射活性をシ
ンチレーションカウンターにより決定する。＞＝50％（10μMで）までキナーゼ
活性を低減させる物質が、組み込みにおける＞50％低減の結果として顕著である
。滴定により、およびアッセイにおいて別のキナーゼと置換することにより、可
能な阻害剤の特異性および感受性を決定し、IC50を決定する。従って、他のキナ
ーゼに及ぼす阻害効果の相対比較により特異性の測定が可能になる。

【００９２】 キナーゼ阻害剤においてスクリーニングを実施するために、シンチレーション
近接アッセイ（SPA）を有する、より近代的な系（アマシャム・ライフ・サイエ
ンスにより製造、MAPキナーゼSPA；（ジャン（Zhang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 96、8511-5（1999））、（イチジョウ（Ichijo）ら、Science 275、90-4（1
997）））もまた提供される。マクドナルド（McDonald）は、カスケード全体の
阻害剤を同定できるRaf/MEK/ERKカスケードのために設定されたアッセイについ
て、記載している。³³Pでリン酸化した後、アビジンコーティングしたSPAビーズ
に結合できるビオチン化ペプチドを本明細書で使用する。ここではMAPカスケー
ドはインビトロで再構成され、大腸菌（E.coli）中GST融合タンパク質として個
々の成分と共に発現されるか、またはcRAF1の場合、バキュロウイルス（Baculov
irus）系から生成される。カスケード（MAP-KKK）の第1のエレメントは、この点
で常に活性化されて確実に阻害剤をスクリーニングできなければならない。この
場合、これはバキュロウイルス系のsrcの共発現により達成された。cRafのras類
似活性化がそれにより達成される。リン酸化によるMAPキナーゼを活性化する別
の方法もまた原則的に考えられる。MAPキナーゼの構造的活性化の別の可能性は
リン酸化されるべきアミノ酸の変異にある。これは、例えばMEK1の場合に、グル
タミン酸塩によるセリンSer218およびSer222の置換により可能であった（ジャン
（Zhang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96、8511-5（1999））、（イチジョウ（
Ichijo）ら、Science 275、90-4（1997））。9B5の場合、相互作用スクリーニン
グ（例えば酵母ツーハイブリッド系）を第1に実施して、リン酸化標的または基
質として直接使用したMBP（ミエリン塩基性タンパク質）を同定することができ
る。次いで、標的配列からペプチドをビオチンアンカーで合成できる。これは、
アマシャムにより製造されたアビジン結合SPAビーズに結合できる。精製された
（例えば細菌により生成された）9B5タンパク質およびγ-32P-ATPを反応中にさ
らに添加する。これはマイクロタイタースケールで行うことができる。正常な条
件下では、標的ペプチドはリン酸化され、シンチレーション応答を引き起こす。
標的ペプチドを添加する前に、化学物質のライブラリー由来のものを反応物と共
にここで予備インキュベートする。標的ペプチドの添加に続いて、次いでシンチ
レーション応答を測定できる。応答の低下は阻害剤が存在する可能性を示してい
る。検索されたライブラリーは、できる限り複雑で、多くの異なるクラスの物質
を含むべきである。プロテインキナーゼ（p38）の物質クラス特異的阻害剤の実
例は、例えば米国特許第5,945,418号に見出すことができる。プロテインキナー
ゼを阻害できる別の物質クラスは、例えばビス単環式、二環式またはヘテロ環式
アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導
体（国際公開公報第94/14808号）、1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米
国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル
-置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、特定のキナゾリン誘導体（欧
州特許出願第0566266 A1号）、セレノイドールおよびセレナイド（国際公開公報
第94/03427号）三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、
およびベンジルホスホン酸（国際公開公報第91/15495号）などである。

【００９３】 アッセイの具体的な本質は、記載したSer/Thrキナーゼの同定により単独で決
定される。種々の物質を使用することができる。これらを前記したアッセイ原理
の種々の形態において使用することができる。しかしながら、これの本質的な点
は、常にスクリーニングを目的として9B5キナーゼ活性を使用することである。
例えば、基質は前記したように遊離の溶液で、および相に結合させて生じること
ができる。しかしながら、基質は細胞表面に提示されても、細胞内に存在しても
よい。これは基盤となるアッセイ原理には影響しない。

【００９４】 実施例7 トランスジェニックおよびノックアウトマウスの作製 9B5の配列に関する知見を用いて、遺伝的に改変されたマウス（または別の動
物）を作製する。この目的で、例えば9B5の構造的に不活性な変異体を、例えば
神経細胞のNSEプロモーター、乏突起膠細胞のMBPプロモーター等を伴って、トラ
ンスジェニックマウスにおいて発現する。これは、優性阻害効果を有し、9B5の
阻害を模倣するはずである。これは、インビボにおける阻害剤の可能な薬理学的
効果の、貴重な指標となり得る。構造的に活性なキナーゼを発現することもでき
る。

【００９５】 ノックアウト動物の作製もまた阻害剤効果の指標となり得る。これらの遺伝的
に改変されたマウスまたはその他の動物は、当業者に公知の標準的な方法に従っ
て作製される。

【００９６】 次いで遺伝的に改変された動物を様々な疾患モデル（例えば実験的に誘導され
た発作、MCAO）または腫瘍モデルにおいて調べることができる。

【００９７】 実施例8 増殖アッセイ 以前から知られていた多くのセリンスレオニンキナーゼは、腫瘍性過程に関与
する。細胞の成長、細胞周期および腫瘍形成性の形質転換における9B5の関与は
、真核細胞において9B5を有する発現構築物をトランスフェクトし、次いで例え
ば軟寒天試験（ジャン（Zhang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96、8511-5（199
9））、（イチジョウ（Ichijo）ら、Science 275、90-4（1997））において、腫
瘍形成性の誘導を調べることによりさらに調べることができる。細胞型、いくつ
かの慣用される系、例えばCos細胞、HEK細胞、PC12細胞、THP-1細胞および1次細
胞、例えば神経細胞および星状細胞が、その他の不死化および1次細胞系と同様
に必要であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 制限媒介示差ディスプレイ（RMDD）法の原理を示す。

【図２】 ラットにおける本発明に従うタンパク質の組織分布： 上方の図は、配列番号1の3'領域から、マウスプローブを用いて得られたノー
ザンブロットを示す。下方の図は、上部で示したRNAゲルの臭化エチジウム染色
を示す。試料の単一のバンドが検出される。脳では本発明に従うタンパク質の発
現が圧倒的に多いことが明らかであり、；明確な転写は精巣および肺でも存在す
るが、その他の組織では非常に弱いバンドしか表示されない。

【図３】 ヒトにおける本発明のタンパク質の組織分布を示す。 これはライトサイクラー系を用い、クロンテック社のMTC（多組織cDNA）キッ
トを使用した定量的PCRを示す。最も強い発現は脳および肺および腸の器官に位
置する。

【図４】 局所性脳虚血による、本発明に従うタンパク質の誘導を示す。 これはライトサイクラー系を用いた、マウスにおける局所性脳虚血後の9B5 m
RNAの定量を示す。本発明に従う核酸は虚血症状の発現後2時間、上方制御される
。虚血後6時間では、この誘導はもはや検出されない。

【図５】 局所性脳虚血による本発明に従うタンパク質の誘導を示す（マウ
ス脳のインサイチューハイブリダイゼーション）。 これは、マウスにおいて局所性脳虚血を誘導した後の、9B5のインサイチュー
ハイブリダイゼーションを示す。本発明に従う核酸は、虚血症状の発現後2時間
、上方制御される（左＝虚血＝誘導側）。9B5が神経細胞で発現されるのも明ら
かである。特異的誘導は皮質および海馬領域において見出される。

【図６】 配列番号7の触媒領域を示し、ここで記号は以下の意味を有する
：1＝リン酸アンカー、Vlb＝触媒領域、VII〜VIII＝活性化ループ、V〜XI＝サブ
ドメインを有する触媒ドメイン（HanksおよびHunter、FASEB J.9，576-596（19
95）による）；^＊＝活性化部位、A＝ATP結合部位；C＝活性中心。

【図７】 相同性プロテインキナーゼの生理学的系統樹を示す。H9B5は系統
発生論的に最も若いタンパク質であり、P78/c-TAK1に最も密接に関係している。
C.エレガンス（C.elegans）タンパク質Par-1の初期の切断も示されている。

【図８】 9B5のドメイン構造を示す。

【図９】 カイト・ドゥーリトルに従う疎水性ブロットである。

【図１０】 ヒトにおける9B5のゲノム構造を示す。 これは9B5遺伝子の18エクソンを示す。エクソン16を示差スプライシングに供
する。変種9B5はエクソン16を伴わずに形成される；変種9B5Aはエクソン16を含
む。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年７月１０日（２００２．７．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ６１Ｋ 39/395 ４Ｃ０８４ 38/00 Ｄ ４Ｃ０８５ 39/395 Ｐ ４Ｃ０８６ 45/00 ４Ｃ０８７ 48/00 ４Ｈ０４５ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 48/00 19/02 Ａ６１Ｐ 1/04 21/00 19/02 25/00 21/00 25/08 25/00 25/14 25/08 25/16 25/14 31/12 25/16 31/18 31/12 35/00 31/18 35/02 35/00 37/06 35/02 37/08 37/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/40 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 9/12 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/99 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フィーシェル アヒム ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ ラー メンガッセ 16 (72)発明者 ニューツェラ ディーター ドイツ連邦共和国 ドッセンハイム シャ ウエンバーグシュトラーセ ７エー (72)発明者 ゲッツ ベルンハルト ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ ラン ゲワン 20 (72)発明者 ロスナー モーリッツ ドイツ連邦共和国 シュヴェトジンゲン ツァールンゲルシュトラーセ 41 (72)発明者 アイゼンハード ギーゼラ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ エマ ーツグルンドパサージュ 23 (72)発明者 クナー ロヒーニ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ トゥ ルナーシュトラーセ ５ (72)発明者 トルッツェル アンニーテ ドイツ連邦共和国 フランケンタル テー オドーア−ケルナー−シュトラーセ ９ (72)発明者 カマンデル ビルジッタ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ ツェ ーリンガー シュトラーセ 71 (72)発明者 ジョマナ ナイム ステファニー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ イム ブッシュゲワン 29 (72)発明者 シュヴァーニンガー マルクス ドイツ連邦共和国 ハイデルベルグ ルタ ーシュトラーセ 44 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB03 BB20 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA05 CA06 CA07 CA09 DA02 DA06 DA12 EA04 FA02 GA11 GA18 GA19 HA03 HA08 HA12 HA14 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ20 QQ44 QR07 QR38 QR41 QR42 QR48 QR57 QR67 QR82 QS12 QS16 QX07 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA20 BA22 BA23 CA53 NA14 ZA02 ZA06 ZA68 ZA96 ZB02 ZB13 ZB26 ZB27 ZB33 ZC20 ZC55 4C085 AA13 AA14 BB31 CC21 DD88 EE01 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA06 ZA68 ZA96 ZB02 ZB13 ZB26 ZB27 ZB33 ZC20 ZC55 4C087 AA01 BB63 BC01 BC11 CA12 NA14 ZA02 ZA06 ZA68 ZA96 ZB02 ZB13 ZB26 ZB27 ZB33 ZC20 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA86 DA89 EA21 EA22 EA25 EA28 EA29 EA50 FA72 FA74 GA26

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a）配列番号1〜4に記載の配列の1つを有する核酸、および配
   列番号5〜8の1つに記載の配列を有するタンパク質をコードする核酸； b）a）記載の核酸とハイブリダイズする核酸； c）遺伝子コードの変性を考慮に入れて、a）記載の核酸とハイブリダイズする核
   酸； d）1つまたは複数の塩基の置換、付加、逆位および/または欠失により得られる
   、a）〜c）記載の核酸の誘導体；ならびに e）a）〜d）記載の核酸に相補的な核酸 から選択される、神経細胞のセリンスレオニンプロテインキナーゼをコードする
   核酸。
2. 【請求項２】 配列番号5〜8を有する配列の1つと、少なくとも60％の同一
   性を示すタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項1記載の核酸。
3. 【請求項３】 配列番号1〜4の1つに記載の配列のコード部分と、少なくと
   も60％同一であることを特徴とする、請求項1または2のいずれか一項記載の核酸
   。
4. 【請求項４】 配列番号5〜8の1つに記載のタンパク質配列をコードするこ
   とを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の核酸。
5. 【請求項５】 DNAであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記
   載の核酸。
6. 【請求項６】 プロモーターに対してアンチセンスの方向で、宿主細胞内の
   セリンスレオニンプロテインキナーゼの発現を阻害できることを特徴とする、請
   求項1〜5のいずれか一項記載の核酸の断片。
7. 【請求項７】 少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも50個
   のヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも200個のヌクレオチドを含むことを
   特徴とする、請求項6記載の断片。
8. 【請求項８】 請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸、および/または請求
   項6または7のいずれか一項記載の断片を、好ましくは発現調節エレメントの調節
   下で含む構築物。
9. 【請求項９】 核酸または断片が調節エレメントに対してアンチセンスの方
   向であることを特徴とする、請求項8記載の構築物。
10. 【請求項１０】 プラスミドに存在することを特徴とする、請求項1〜9のい
    ずれか一項記載の構築物。
11. 【請求項１１】 請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸、および/または請
    求項6または7のいずれか一項記載の断片、および/または請求項8〜9のいずれか
    一項記載の構築物を含む、宿主細胞。
12. 【請求項１２】 細菌、酵母細胞、および哺乳類細胞から選択されることを
    特徴とする、請求項11記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】 請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸、および/または請
    求項6または7のいずれか一項記載の断片、および/または請求項8〜10のいずれか
    一項記載の構築物を含む、哺乳類組織、器官、および/またはトランスジェニッ
    ク哺乳類。
14. 【請求項１４】 核酸または断片または構築物が、その天然の位置に対応し
    ないゲノムの位置に組み込まれていることを特徴とする、請求項1〜13のいずれ
    か一項記載の宿主細胞、および/または哺乳類組織、および/または哺乳類器官、
    および/またはトランスジェニック哺乳類。
15. 【請求項１５】 発現系、好ましくは宿主細胞において、請求項1〜4のいず
    れか一項記載の核酸を発現させることにより得られるタンパク質。
16. 【請求項１６】 配列番号5〜8に記載の配列の1つを有するタンパク質、お
    よび該タンパク質の1つと少なくとも60％同一であるタンパク質から選択される
    ことを特徴とする、請求項15記載のタンパク質。
17. 【請求項１７】 請求項15または16のいずれか一項記載のタンパク質と反応
    する抗体。
18. 【請求項１８】 請求項15または16のいずれか一項記載のタンパク質の、プ
    ロテインキナーゼ活性の阻害剤。
19. 【請求項１９】 請求項15または16のいずれか一項記載のタンパク質の、プ
    ロテインキナーゼ活性のリン酸化基質。
20. 【請求項２０】 酵母ツーハイブリッド選択系または免疫沈降を用いて得ら
    れる、請求項15〜16のいずれか一項記載のタンパク質の、細胞内タンパク質相互
    作用パートナー。
21. 【請求項２１】 請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸、および/または請
    求項6または7のいずれか一項記載の断片、および/または請求項8〜10のいずれか
    一項記載の構築物、および/または請求項15および16のいずれか一項記載のタン
    パク質、および/または請求項17記載の抗体を含む、診断用キット。
22. 【請求項２２】 患者試料における、請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸
    の発現レベル、または請求項15もしくは16のいずれか一項記載のタンパク質の量
    を決定する段階を含む、卒中の危険性を診断するための方法。
23. 【請求項２３】 患者試料を、請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸、およ
    び/または請求項17記載の抗体と接触させることを特徴とする、請求項22記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 請求項15または16のいずれか一項記載のタンパク質のプロ
    テインキナーゼ活性を、被験物質の存在下または非存在下で決定し、かつ適当で
    あると同定された物質を単離することを特徴とする、プロテインキナーゼ阻害剤
    を同定および/または単離する方法。
25. 【請求項２５】 調べられるプロテインキナーゼが、請求項15または16のい
    ずれか一項記載のタンパク質を含むことを特徴とする、プロテインキナーゼアッ
    セイ。
26. 【請求項２６】 請求項1〜18のいずれか一項記載の核酸、断片、構築物、
    宿主細胞、タンパク質、抗体、および/または阻害剤を含む、薬学的組成物。
27. 【請求項２７】 発作、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化
    症、ヘテロ変性運動失調、ハンチントン病、神経障害、およびてんかんを含む、
    神経疾患、ならびに/または腫瘍性疾患、特に癌腫、ならびに/または自己免疫疾
    患、アトピー、ならびに/またはHIV感染および/もしくは他の向免疫性（immunot
    ropic）ウイルスによる感染、ならびに/または急性および/もしくは慢性のリン
    パ性白血病、ならびに/または急性および/もしくは慢性の骨髄性白血病、ならび
    に/または原発性慢性多発性関節炎、ならびに/またはクローン病、ならびに/ま
    たは潰瘍性大腸炎などの免疫学的疾患の、予防および/または治療のための、請
    求項1〜18のいずれか一項記載の核酸、核酸の断片、構築物、宿主細胞、タンパ
    ク質、抗体、および/または阻害剤の使用。
28. 【請求項２８】 プロテインキナーゼ阻害剤を同定するための、請求項1〜1
    7のいずれか一項記載の核酸、断片、構築物、宿主細胞、タンパク質、および/ま
    たは抗体の使用。
29. 【請求項２９】 神経疾患および/または腫瘍性疾患の予防および/または治
    療のための、請求項15または16のいずれか一項記載のタンパク質のプロテインキ
    ナーゼ活性の阻害剤の使用。
30. 【請求項３０】 薬学的に活性な物質に対する攻撃点としての、請求項1〜2
    9のいずれか一項記載の核酸および/またはタンパク質の使用。