JP2003532430A

JP2003532430A - ヒトにおける成長ホルモン異形の検出方法、上記異形及びそれらの使用

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Publication number: JP2003532430A
Application number: JP2001582581A
Authority: JP
Inventors: ネイルクーパー，デービッド; マリープロクター，アニー; グレゴリー，ジョン; スチュアートミラー，デービッド
Original assignee: ユニバーシティオブウェールズカレッジオブメディスン
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2003-11-05
Also published as: AU2007201232A1; WO2001085993A2; US20020081605A1; NZ522583A; AU5649901A; BR0110756A; CA2409510A1; CN1444661A; WO2001085993A3; AU2001256499B2; IL152706A0; US20040137510A1

Abstract

(57)【要約】個体のＧＨ機能不全の指標としての役割を果たすのに有効なｉＧＨ１の異形の検出方法であって、この方法は、上記個体からのヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプルを、ヒトＧＨ１遺伝子の標準配列として知られる配列と比較するステップを含む。ここで前記試験配列と標準配列の異いは、前記個体から得られる試験サンプル内の特徴的なＧＨ機能不全の指標として有効な異形の存在を示す（以下ＧＨ１変異型）。前記試験サンプルを、以下の基準：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762 (1970))上にプロットした時に、前記個体の両親の身長に基づく前記個体の推定目標成人身長の外側にその推定が上記個体についての成人身長が予測される成長パターン（一連の身長測定により線引き：Brook CDG (Ed) Clinical Paediatric Endocrinology3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwell Science)）と定義される成長不足、を示す個体から得る。前記方法により検出される突然変異、並びに成長ホルモン異常についての患者のスクリーニング又はそのような異常の治療に好適な変異体タンパク質の製造へのそれらの使用をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は天然の成長ホルモン突然変異の検出方法；検出された突然変異、並び
に成長ホルモン異常に関する患者のスクリーニングへの又は上述の異常の治療に
好適な変異型タンパク質の製造のためのそれらの使用に関する。

【０００２】ヒトの身長が遺伝的な要因により影響を受けていることは１世紀以上前に分か
っていた。通常の劣性形式の遺伝を伴う家族性低身長症症は早くも１９１２年に
は認識されていたが、このような家族が科学文献に厳密に記録されるようになっ
たのはさらに四半世紀前であった。劣性遺伝性低身長症症が孤立性成長ホルモン
（ＧＨ）欠損に一般に関係することの認識はようやく１９６６年になってからで
あった。

【０００３】ＧＨ欠損症に関係する低身長症症は、１／４０００〜１／１００００生児出生
の発生率で起こると推定されている。これらの症例の大部分は散発的であり、か
つ特発性であるが、しかし５〜３０％がこの症状についての遺伝子原因論に一致
する、罹患した第１親等の血族を持つ。ＧＨ欠損症の遺伝子原因論の確認は家族
性低身長症の分子遺伝学的分析及び罹患個体の下垂体発現性成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子中の突然変異病変の早期証明によりもたらされた。家族性低身長症は
多くの他の遺伝子（例えばＰＯＵ１Ｆ１、ＰＲＯＰ１及びＧＨＲＨＲ）内の突然
変異により引き起こされもし、そしてこれらの異なる形態の症状を識別すること
が重要である。

【０００４】成長ホルモン（ＧＨ）はさまざまな作用を通して骨格及び軟組織の出生後の成
長を促す多機能ホルモンである。ＧＨの直接的及び間接的作用の相対的な貢献に
ついては議論が残る。一方で、ＧＨの直接的な効果はさまざまな組織及び臓器で
証明され、そしてＧＨレセプターが多くの細胞型で記録されている。これに反し
て、かなりのデータが、ＧＨの効果の主要部分がＧＨ依存性インシュリン様成長
因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の作用を通して仲介されることを示している。ＩＧＦ−１
は多くの組織、主に肝臓で産生され、そして骨、軟骨及び骨格筋を含む多くの組
織の増殖及び成熟を促すそれ自身のレセプターを通して作用する。組織の成長の
促進に加え、ＧＨは乳腺刺激、糖尿病誘発、脂肪分解性及びタンパク質同化効果
、並びにナトリウム及び水の保持を含むさまざまな他の生物学的効果の発揮を示
しもする。

【０００５】十分量のＧＨが正常な成長を維持するために幼児期を通して必要とされる。Ｇ
Ｈ欠損症を有する新生児は通常、正常な丈及び体重である。ある者は年齢ととも
に次第に遅滞となる低くリニアな出生後成長に合わせて小陰茎症又は空腹時性低
血糖を有する。通常、孤立性成長ホルモン欠損症（ＩＧＨＤ）の患者で、彼らの
身長の抑制に関係する骨格の成熟が遅延する。体幹肥満、暦年齢について予想さ
れるよりも若い容貌、及び第二生歯の遅延がしばしば見られる。早期老化に見ら
れるものに類似する皮膚の変化が罹患した成人に見られる。

【０００６】家族性ＩＧＨＤは遺伝の特徴的な形式を持ついくつかの異なる障害を含む。ＧＨ１遺伝子座での欠陥に関連することが知られるＩＧＨＤのそれらの形態をこれ
まで検出された基本的な病変の異なる型と一緒に表１に示す。

【０００７】

【表２】

【０００８】これらの病変の特徴づけは、ＩＧＨＤのこれらの形態の間の臨床的重症度、遺
伝形式、及び外因性の投与ＧＨに対する応答による抗体形成傾向の違いについて
の説明を提供する助けとなる。大部分のケースは散発的であり、かつ、脳水腫を
含む脳の傷害又は欠陥、染色体異形、組織球増殖症、感染、放射線、中隔−視覚
異形成症、外傷、あるいは視床下部又は下垂体に影響を及ぼす癌に起因すると考
えられる。磁気共鳴映像法の実験はＩＧＨＤを持つ患者の約１２％で視床下部又
は下垂体異常を検出する。

【０００９】低身長症症、遅延した「身長伸長速度（ｈｅｉｇｈｔｖｅｌｏｃｉｔｙ）」
又は成長速度、及び遅延した骨格成熟は全てＧＨ欠損症と一緒に見られるが、こ
れらはこの障害に限られたものではない；他の全身性疾患が上述の症状をもたら
す。当該明細書の全体に渡り、「身長伸長速度」及び成長速度は両方とも、例え
ば１年当たりのセンチメートルで計測される対象又は患者の身長の変化速度を意
味すると解釈されるべきである。

【００１０】ＧＨ欠損症を証明するための刺激試験はＬ−Ｄｏｐａ、インシュリン誘発性低
血糖、アルギニン、インシュリン−アルギニン、クロニジン、グルカゴン又はプ
ロプラノロールを用いる。不十分なＧＨピーク応答（通常＜７〜１０ng／mL）は
試験間で異なる。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ及びＡＣＴＨの同時欠損に関する試験を
下垂体機能不全の程度を決定し、そして最適の治療を計画するために実施すべき
である。

【００１１】組み換え誘導ＧＨが世界中で入手可能であり、そして皮下注入により投与され
る。最適な結果を得るために、ＩＧＨＤの子供は彼らの診断が明らかになり次第
、通常代償療法を開始する。組み換えＧＨの初回用量は体重又は表面積に基づく
が、使用される実際の量及び投与頻度はさまざまなプロトコールの間で変化する
。思春期の間、前記用量は体重増加に伴い最大まで増加する。故に、ＧＨ処置を
、患者のＧＨ分泌能力を見直す間、一時的に中断すべきである。確認されたＧＨ
欠損症患者は成年期の間低用量の外因性ＧＨを受ける。

【００１２】ＧＨにより治療される症状は、（ｉ）その有効性が証明されている症状、及び
（ii）その利用が報告されているが、しかし標準的技法として許容されない、い
ろいろな他の症状を含む。ＧＨ治療が有効性を証明されている障害は孤立性か又
は下垂体ホルモン欠損（ＣＰＨＤ）及びターナー症候群の組み合わせに関連する
かのいずれかのＧＨ欠損症を含む。初めに２の障害を有する個体のＧＨ代償療法
に対する臨床的応答は以下の各項に依存して変化する：（ｉ）ＧＨ欠損症の重さ
及び成長に対するその不利な効果、治療を始めた年齢、出生時の体重、最近の体
重及びＧＨの用量；並びに（ii）関連欠損、例えば甲状腺ホルモン欠損の治療に
対する認識及び応答；並びに（iii ）どの治療が抗ＧＨ抗体の発生により難しく
されているか。ターナー症候群にかかっている個体に対する治療の成果は彼らの
低身長症症の重症度、彼らの染色体総数及び治療を始めた年齢により変化する。

【００１３】ＧＨの使用が報告されているさらなる障害は、一部の骨格形成異常、例えば軟
骨形成不全症、プラーダー−ヴィリ症候群、外因性ステロイドのために二次的に
生じるか又は慢性炎症疾患、例えばリウマチ様関節炎に関係する成長抑制、慢性
腎不全、極度な特発性低身長症症、ラッセル−シルバー症候群、並びに子宮内成
長遅延の治療を含む。

【００１４】分子遺伝学レベルでの家族性ＩＧＨＤの特徴づけはいくつかの理由に関して重
要である。関与する遺伝子座の同定は、可能性のある成長遅延の重症度を示すだ
けでなく、さらに重要なことに、現在利用可能なさまざまな治療計画の妥当性又
はその他やり方を示す。さらに、内在する遺伝子病変の検出は前記症状の遺伝学
的原因論の確認に役立つ。それは、（ｉ）成長遅延の重症度、並びにＧＨ治療に
続く抗ＧＨ抗体形成の可能性の予測において前兆となる値を持つこともある。あ
る場合に、症理学的な病変の知識は前記障害の遺伝の異常な形式を説明するため
の助けとなり得、従って罹患家族のカウンセリングのために必須である。最後に
、（非機能性と対照的に）機能障害ＧＨ分子を表すＩＧＨＤの症状を引き起こす
突然変異病変の特徴づけは、ＧＨ構造及び機能に新しい洞察をもたらしうる。

【００１５】細胞レベルで、１のＧＨ分子は、２のＧＨレセプター分子（ＧＨＲ）に結合し
それらの二量体化を引き起こす。２のＧＨ結合ＧＨＲ分子の二量体化はチロシン
・キナーゼＪＡＫ−２に関係するシグナル伝達に必須であると考えられる。ＧＨ
のさまざまな効果が、異なる細胞質内ドメイン又は異なる組織内のリン酸化部位
を持ちうる１の型のＧＨＲ分子により仲介されることを示している。ＪＡＫ−２
により活性化された場合、これらの異なる細胞質内ドメインは一方が成長効果に
関し、そして他方がさまざまな代謝効果に関する別個のリン酸化経路をもたらし
うる。

【００１６】ＧＨは下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞により分泌される２２kDa のタンパ
ク質である。Ｘ線結晶学の研究はＧＨがｕｐ−ｕｐ−ｄｏｗｎ−ｄｏｗｎ様式で
配置された２対の平行なアルファ・ヘリックスのコアを含むことが明らかになっ
ている。この構造は２の分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ５３−Ｃｙｓ１６５及
びＣｙｓ１８２−Ｃｙｓ１８９）により安定化されている。２の成長ホルモン・
レセプター（ＧＨＲ）分子は、前記ＧＨ分子上の２の構造的に別個の部位に、最
初に部位１にそして次に部位２にＧＨＲが結合することで連続的に進む過程で結
合する。ＧＨへのＧＨＲの結合はそのＧＨＲ分子の二量体化を可能にする。

【００１７】ＧＨ分子の走査型突然変異誘発の研究は、ＧＨとそのレセプターの間の結合相
互作用の像をもたらし、それに対して特定部位突然変異誘発は特定の残基の機能
を調べるために使用されている。よって、Ａｒｇによる（ヒトＧＨの第３アルフ
ァ・ヘリックス中の）Ｇｌｙ１２０の置換は部位２へのＧＨＲ結合の喪失をもた
らし、それによりＧＨＲの二量体化を妨害する。同様に、ヒトＧＨタンパク質の
Ｐｈｅ４４残基はプロラクチン・レセプターの結合のために重要である。最後に
、残基Ａｓｐ１１５、Ｇｌｙ１１９、Ａｌａ１２２及びＬｅｕ１２３がマウスＧ
Ｈ分子の成長促進能力に重要であることが明らかになっている。

【００１８】二量体化したＧＨＲの細胞内チロシン・タンパク質キナーゼＪＡＫ２との相互
作用は、下流シグナル伝達分子のチロシン・リン酸化、マイトジェン活性化タン
パク質（ＭＡＰ）キナーゼの刺激、並びにシグナル・トランスデューサー及び転
写のアクチベーター（ＳＴＡＴタンパク質）の惹起をもたらす。このように、Ｇ
Ｈは多数の異なるシグナル経路を通して複数の遺伝子の発現を促しうる。いくつ
かの異なるＧＨアイソフォームはＧＨ１遺伝子の発現から産み出される（ＧＨ１基準配列を図５に示す）。ＧＨ１転写産物の９％で、第２エクソンは第３エクソ
ン内の選択的アクセプター・スプライス部位４５bpにつなぎ合わされ、これによ
り第３２〜４６アミノ酸残基が欠失され、そして正常な２２kDa のタンパク質に
代えて２０kDa のアイソフォームが産み出される。この２０kDa のアイソフォー
ムは成長及び分化の刺激能力があるように見える。選択的アクセプター・スプラ
イス部位選択に関与する因子は今だに特徴づけされていないが、明らかに複雑な
性質である。第３エクソンによりコードされる第３２〜７１コドンの不存在がも
たらす１７．５kDa のアイソフォームは下垂体癌組織中に微量に検出されもする
。第３及び４エクソン又は第２、３及び４エクソンをともに欠くスプライシング
産物が下垂体組織において報告されているが、しかしこれらは不活性タンパク質
産物をコードするようである。ＧＨの２４kDa のグリコシル化変異型が説明され
もしている。主要な２２kDa アイソフォームのアミノ酸配列を、前記ＧＨ１遺伝
子コード領域のヌクレオチド配列及び２６のアミノ酸のリーダー・ペプチドを含
むそのタンパク質のアミノ酸配列を示す図６中に示す。横の番号はアミノ酸残基
番号を言及する。垂直の矢印の傍にある太字の数字はエクソン境界を指示する。
終止コドンをアスタリスクにより印を付けた。

【００１９】下垂体成長ホルモン（ＧＨ１）をコードする遺伝子は、クロモソーム１７ｑ２
３上の５の関連遺伝子の集団の中に位置する（図１）。この６６．５kbの集団は
ここでその全体の配列決定をされている（Chen et al. Genomics 4 479-497 (19
89) 及び図５も参照のこと）。前記成長ホルモン遺伝子集団内に存在する他の遺
伝子座は、２の絨毛性乳腺刺激ホルモン遺伝子（ＣＳＨ１及びＣＳＨ２）、絨毛
性乳腺刺激ホルモン偽遺伝子（ＣＳＨＰ１）、及び成長ホルモン遺伝子（ＧＨ２
）である。これらの遺伝子は、６〜１３kbの長さの遺伝子間領域により分けられ
、同じ転写配向内に位置し、胎盤で発現され、そして下流組織特異的エンハンサ
ーの制御下にある。前記ＧＨ２座は、１３のアミノ酸残基でＧＨ１誘導された成
長ホルモンと異なるタンパク質をコードする。５の遺伝子の全てが、短いイント
ロン、ＧＨ１の場合長さが２６０bp、２０９bp、９２bp、及び２５３bpにより同
じ位置で遮られた５のエクソンを持つ非常に類似した構造を共有する（図２）。

【００２０】ＧＨ遺伝子の第１エクソンは、６０bpの５’非翻訳配列（しかしながら、選択
的翻訳開始部位が−５４に存在する）、第−２６〜−２４コドン、並びに２６ア
ミノ酸のリーダー配列の開始に対応する第−２３コドンの最初のヌクレオチドを
含む。第２エクソンは前記リーダー・ペプチドの残り及び成熟ＧＨの最初の３１
アミノ酸をコードする。第３〜５エクソンはそれぞれ第３２〜７１、第７２〜１
２６、及び第１２７〜１９１アミノ酸をコードする。第５エクソンはポリアデニ
ル化部位で終わらせる１１２bpの３’非翻訳配列をコードしもする。Ａｌｕ反復
配列成分が３’〜ＧＨ１ポリアデニル化部位まで１００bp存在する。５の関連し
た遺伝子がそれらの５’フランキング及びコード領域を通して高い相同性を有す
るが、それらはその３’フランキング領域により分けられる。

【００２１】前記ＧＨ１とＧＨ２遺伝子はそれらのｍＲＮＡスプライシング・パターンの点
で異なる。前述のとおり、ＧＨ１転写産物の９％で、第２エクソンが第３エクソ
ン内の選択的アクセプター・スプライス部位４５bpにつなぎ合わされて、正常な
２２kDa の代わりに２０kDa のアイソフォームを生じる。前記ＧＨ２遺伝子はこ
の様式で選択的につなぎ合わされない。ＧＨ１の第３エクソンによりコードされ
る４０のアミノ酸を欠く第３の１７．５kDa の変異型が報告されてもいる。

【００２２】前記ＣＳＨ１及びＣＳＨ２座は同一の配列のタンパク質をコードし、そしてＤ
ＮＡレベルでＧＨ１配列に対して９３％の相同性がある。前記ＣＳＨ遺伝子配列
との比較により、前記ＣＳＨＰ１偽遺伝子は、その「エクソン」内の２５のヌク
レオチド置換に加えその発現を部分的に不活性化する第２イントロンの供与スプ
ライス部位の絶対＋１位におけるＧ→Ａ転位を含む。

【００２３】多くの両対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）の制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）
がＧＨ遺伝子領域において報告されている。これら５つ（ＢｇｌIIで２、Ｍｓｐ
Ｉで２、ＨｉｎｃＩで１）が白人及び黒人において生じ、これに対しさらにＢａ
ｍＨＩ多型が黒人において広く生じる。強い連鎖不均衡はその遺伝子集団の比較
的新しい進化上の起源と一致するこれらの多型の間に観察されている。前記Ｈｉ
ｎｃII及びＢａｍＨＩ多型は５’直後のＧＨ１遺伝子に生じる。ＲｓａＩ多型はＧＨ１プロモーター領域に生じ−７５ヌクレオチドでのＡ／Ｇ二形性をもたらす
、これに対して比較的頻繁なＳｐｈＩ多型は完全に特徴づけされるべきである。
高度な情報を与える（８３％異型接合性）可変反復多型はＧＨ１遺伝子に対して
３’の約１９kbに位置している；ＰＣＲ用に形式化された、この多型の１８の別
個の対立遺伝子は断片サイズ（２０１〜２５３bp）により区別されうる。最後に
、ＧＨ１遺伝子プロモーター／５’非翻訳領域は５７０bpの配列内に１７の変異
型ヌクレオチドを有する非常に高いレベルの配列多型を示すことが知られている
（第２Ａ）：

【００２４】

【表３】

【００２５】 −１、＋３及び＋５９位での多型は、ＧＨ１遺伝子プロモーターのこの領域に
よりコードされると考えられているＧＨＤＴＡタンパク質内にアミノ酸置換を引
き起こすと予測される（以下を参照のこと）。前記配列変異型のいくつかは、ＧＨ１遺伝子が他の胎盤で発現される遺伝子と異なる位置と同じ位置で起こり、そ
のメカニズムが遺伝子転換かもしれないこと及び胎盤遺伝子が上記転換された配
列の供与体として供給されていることを示唆する。

【００２６】ＧＨ機能不全症の思春期前の低身長症児の研究において、Hasegawa et al (J. Clin. Endocrinol Metab 85 1290-1295 (2000) はＧＨ１遺伝子内の３の多型（
ＩＶＳ４Ｃ→Ｔ１１０１（本明細書中以下の表７Ａ及び７Ｂ中でも報告され
る）、Ｔ／Ｇ−２７８、及びＴ／Ｇ−５７）とＧＨ分泌及び身長の両者との関係
を報告した。

【００２７】最初のＧＨ１遺伝子欠失が報告されて以来、さまざまなより捕えにくい病変が
記載されている。いくつかの症例において、これらの病変は独特な型のＧＨ欠損
症に関係しており、ＧＨ構造及び機能に新たな洞察を得るための手段として重要
かもしれない。

【００２８】成長ホルモン（ＧＨ１）をコードする遺伝子が、クローンされた最初のヒト遺
伝子の１つであり、そして遺伝性成長ホルモン欠損の原因となる最初の著しい遺
伝子欠失（６．７kb型）が、サザン・ブロッティングによりすぐに検出された。
重度の（ＩＡ型）欠損をもたらすＧＨ遺伝子に関する著しい欠失の全てが、ＧＨ
の全体欠如により特徴づけられた。特徴づけされたＧＨ１遺伝子の欠失の約７０
％が６．７kbの長さであり、これに対して残りの大部分は７．６kb又は７．０kb
である（表２Ｂ−ＧＨ欠損症及び低身長症症を引き起こすＧＨ１遺伝子に関する
又はＧＨ１遺伝子付近の著しい欠失）。

【００２９】

【表４】

【００３０】

【表５】

【００３１】加えて、さらにまれな欠失のいくつかの例が報告されている。近年、突然変異
スクリーニング手段としてサザン・ブロッティングから離れＰＣＲベースのアプ
ローチに向かうためのさまざまな試みがなされている。ホモ接合体ＧＨ１遺伝子
欠失はＧＨ１遺伝子のＰＣＲ増幅によりかなり容易に検出されており、そしてフ
ランキング領域は得られたＰＣＲ産物の制限酵素消化により理解される。このア
プローチは潜在的に危険な状態にある妊娠におけるＧＨ１遺伝子欠失についての
ホモ接合性を排除するために有効に使用されているが、しかしながら遺伝子欠失
に関するヘテロ接合性と野生型に関するホモ接合性を見分けることは不可能であ
る。ＧＨ１遺伝子のみを除去する比較的短い６．７、７．０及び７．６kbの欠失
以外の欠失を検出できないこともある。

【００３２】ＧＨ１遺伝子のすぐ側面の、そして対照ＤＮＡサンプルから７９０bpの断片を
生じるＰＣＲプライマーを設計した。この断片の存在はＧＨ遺伝子欠失の指標で
あると考えられるが、しかしＰＣＲ増幅についての内部対照としての「非特異的
ＰＣＲ断片」の使用はこの方法の信頼度を少々疑わしいものにするであろう。

【００３３】著しい欠失と同時に、ＧＨ１遺伝子の３の微小欠失が報告されている；これら
の患者の内の２は６．７kb ＧＨ１遺伝子欠失に関するヘテロ接合体でもある（
表３）。

【００３４】

【表６】

【００３５】異なる−塩基対置換は７種類だけがＧＨ１遺伝子のコード領域内から報告され
ている（表４）。

【００３６】

【表７】

【００３７】これらの一塩基置換の内の２は、シグナル・ペプチド内のアミノ酸残基Ｔｒｐ
−７及びＧｌｕ−４を終止コドンに転換するナンセンス変異である。これらの突
然変異は遺伝子欠失でなくＩＡ型欠損を引き起こすことが唯一知られているＧＨ１遺伝子病変である。これらの病変は前記シグナル・ペプチド内での翻訳停止を
予言するために、それらは機能的なＧＨ分子の産生に矛盾する。他の５の一塩基
対置換（巨人症の治療に関するＥＰＡ７９０３０５に開示された第７７コドン
でのＲ→Ｃを含む）は機能不全の成長ホルモン分子の産生をもたらすミスセンス
変異である。前述の天然の変異は、人工的に誘発した突然変異よりも非常に多く
の情報を提供し、原則的に前者はその臨床的表現型、つまり問題となっている患
者の身長に直接関係しうる。

【００３８】病理的な意義を疑われるプロモーター領域内の一塩基対置換は、ＩＧＨＤＩ
Ａを患う３人の中国人患者及び２人の対照におけるＧＨ１遺伝子のプロモーター
領域（−６０〜＋７０は転写開始部位に関連する）の配列決定により最初に捜し
出された。いくつかの相異点が指摘されたが、しかしこれらは多型の問題であり
、そしてさらに特徴づけされることはなかった。前記のとおり、ＧＨ１遺伝子の
プロモーター領域が、５７０bpの配列内に１７の変異型ヌクレオチドを有する非
常に高レベルの配列多型を提示することを示している（図３）。しかしながら、
これらの配列変異型は、対照に比べて患者において過度に表現されることはなか
った。

【００３９】ＧＨ１プロモーター異形が独立して調査されもし、そして主に一塩基対置換の
合計２２の変異型多型部位を検出した：これらの内の１７種類がＡＴＧ開始コド
ンの５’領域の５５０bp内に発生し、３種類がＡＴＧの５’の−１０７５位付近
に発生し、そして２種類がそれぞれ７６位及び２１９位で第１イントロン（ＩＶ
Ｓ１）内に発生する（Wagner et al, Eur J Endocrinol 137 474-81 (1997)）。
４のこれらの変異型を除く全てが対照において記録されもしたが、しかしこれら
４の変異型は成長ホルモン欠損の原因であると考えられなかった。たった１つの
変異型部位が、転写因子結合部位に相同な配列の中に生じた：潜在的な（しかし
証明されていない）ＮＦ−１結合部位内の−３３３における選択的なＣＣＡＧＡ
とＧＡＧＡＧ配列の存在。

【００４０】それ故に、これまで病理学的に重要な突然変異が、ＧＨ１遺伝子プロモーター
中には報告されていない。

【００４１】ｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす一塩基対置換がＧＨ１遺伝子内で記載
されてもいる。大部分がＧＨ欠損症の比較的希な優性形態に関係する（表５）。

【００４２】

【表８】

【００４３】第４イントロンの供与体スプライス部位内のトランスバージョンが第４エクソ
ン供与体スプライス部位の５’、７３bpの第４エクソン内の隠れたスプライス部
位の活性化のために形質移入された細胞のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現分析
により明らかにされた。これは、第４エクソンによりコードされる第１０３〜１
２６アミノ酸を欠く異常なスプライス産物の産生、並びにリーディング・フレー
ム・シフトの結果として通常翻訳されないＧＨ１遺伝子の３’非コード領域の読
み通しによる２９を含む９４の新規アミノ酸の組み込みを予見させる。

【００４４】第４及び第５エクソンによりコードされるＧＨタンパク質の領域は分泌顆粒に
対するこのタンパク質の正確な標的化に重要であると考えられるので、この異常
タンパク質が正常に分泌されないであろうことが予測される。しかしながら、外
因性ＧＨに対する抗体はＩＢ型ＧＨ欠損症の患者において記録されていない。よ
って、免疫不寛容の回避は、少なくともいくつかの異常タンパク質産物が分泌さ
れ、そしてそれが代謝中で部分的に安定でありうることを示している。ＩＶＳ３
内の７種類の既知のスプライシング突然変異（表５）は、罹患した家族を通して
常染色体優性遺伝を明らかにしたII型欠損状態に関係する。

【００４５】切り詰めたＧＨ１突然変異又はホモ接合体遺伝子欠失を有するＧＨ欠損症患者
はＧＨ処置に対する抗ＧＨ抗体を発生するかなりの危険にさらされている。それ
に反して、我々はスプライス部位内でのミスセンス変異又は一塩基対置換のいず
れかを有する患者において同種異系抗体の形成を記載するどのような報告も知ら
ない。

【００４６】これまで、突然変異遺伝子型と臨床的表現型の間の他の相関関係は報告されて
いない。刊行された文献中の必要なデータはまばらであり、かつ、質的に変わり
やすいが、しかし我々は彼らの臨床的な、そして表現型の後遺症に関して著しい
遺伝子欠失を有する患者がスプライス部位突然変異を有する患者と異なるかどう
か評価する手段として粗メタ分析を試みた。スプライシング変異を有する患者に
ついて５．４ＳＤ未満の年齢調整平均値の平均（ｎ＝１７）に比べて、ＧＨ１欠
失を有する患者の身長は平均７．３ＳＤ未満の年齢調整平均値（ｎ＝２９）であ
ることが分かった。前記欠失患者において骨年齢遅延は大きく、そして成長速度
は低いが、前述の発見を説明することは非常に難しい。なぜなら、それらは確認
法（ａｓｃｅｒｔａｉｎｍｅｎｔ）の偏りの影響を受けやすいからである。

【００４７】これまでに記載してきた家族性ＧＨ欠損症症の大部分の症例は常染色体劣性形
質として遺伝されるので、前記の遺伝した欠損状態のいくつかの例は小さな家族
サイズが原因で認識されていない可能性がある。同様に、ＧＨ遺伝子のデノボ変
異の結果として生じるＧＨ欠損症症の症例は散発性として分類され、そしてその
障害についての遺伝的な説明は受け入れられも追求されもしなかった。最後に、
欠損状態の定義のために使用された基準に依存するため、ＧＨ欠損症の表現型的
及び遺伝型的範囲両者の全体の広さは臨床的認識まで及んでいない。これらの理
由により、ＧＨ欠損症症の罹患率の現在の評価は不正確であり、そしてこのため
人口中の真の罹患率をひどく過小評価している。

【００４８】ＩＧＨＤの定義を、（ａ）重度の成長遅延、多くの場合−前述のとおり−身長
の＜−４．５ＳＤの定義される；（ｂ）刺激／誘発に対するＧＨ応答の低下（つ
まり、＜４ng／mlの血清ＧＨレベル）；並びに（ｃ）他ならない成長遅延の原因
の多様な組み合わせにより支持した。研究（Shalet SM et al. Endocrine Rev 1 9 203-223 (1998)）のための患者選びにおいて、ＧＨ欠損症症を構成するものの
形式的な定義の厳密な順守、並びにこれらの基準、特に基準（ｂ）の完全に一様
な採用は、記載されたＧＨ突然変異の範囲が完全なものに遠いだけでなく、より
広い突然変異の範囲の代表でもない。よって、ＳＤスコアを著しく小さくするか
又はＧＨレベルを低く下げる（例えば遺伝子のコード領域内のミスセンス変異又
はプロモーター変異）ＧＨ欠損症状態は臨床的認識にまで及び可能性がより少な
い。実際、これは、２０年間近くの分子レベルで研究されたかなり一般的な障害
について事実上前例がない発見が、なぜＧＨ１遺伝子においてこれまでにたった
５つの異なるミスセンス変異しか報告されていないのかを説明するためのいくつ
かの方法に及ぶ（The Human Gene Mutation Database ; Krawczak et al. Hum M
utation 15, 45-51 (2000)）。

【００４９】ＧＨの完全な不存在は容易な認識及び広範囲にわたって研究されている重い臨
床的表現型を生み出す。患者の表現型が重症でない、並びに患者の選択基準が実
質的に一致する報告された研究において、患者確認法ストラテジーは、成長不足
の診断的指標として彼らの年齢についての平均身長からの個人の身長の偏差を一
般敵に用いている。

【００５０】前記の基準（ａ）及び（ｂ）を用いた患者の選択は、重度のＩＧＨＤ関連成長
不足を有する患者の定義に役立つであろう。我々は、研究のための患者の選択に
適用される前記基準を抑えることは成長不足がＧＨ欠損症症範囲の異なる部分の
兆候であり、それ故に潜在的な突然変異病変の新しい集合を生じうる患者の包含
を導くと思われる。これらの新しい病変のいくつかは、正常な免疫学的反応性を
示すが、しかし生物学的活性をわずか又は全く示さない安定な、けれども機能不
全のＧＨ分子の増大をもたらす。放射性免疫試験の結果に基づき、機能不全ＧＨ
分子は正常であるとして誤って認識される。前述の機能不全変異型が一般的であ
ることが分かった場合、次にＧＨ欠損症症が放射性免疫アッセイベースのＧＨ「
機能試験」への我々の現在の依存の結果としてＧＨ欠損症症が十分に診断されて
いないことを理解するであろう。さらに、それは真に機能的な診断アッセイの開
発の早急な必要性を証明している。

【００５１】我々は身長伸長速度は、絶対身長の計測よりも成長不足のより高感度の指標で
あると考える。骨年齢遅延の評価（遅れた骨の成熟もＧＨ欠損症症による）、及
び他の正常な可変部と組み合わせた身長伸長速度の使用は、表現型を有する患者
の単一化した群の発見を我々にもたらし、上記表現型はＧＨを持たない伝統的な
ＩＧＨＤ患者の表現型よりも重症度は低いが、しかし彼らは身長計測だけに基づ
いて選ばれた患者よりもＧＨ１遺伝子の病変を有する可能性が高い。他の重要な
指標は低身長症及び／又は身長伸長速度の低下及び／又は骨年齢遅延により達成
されるかもしれない成長不足である。

【００５２】従って、本発明は個体のＧＨ機能不全の指標としての役割を果たすのに有効なＧＨ１の異形の検出法を提供し、上記検出法は以下のステップを含む：（ａ）上記個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプル
を得、そして（ｂ）上記試験サンプルから得た配列をヒトＧＨ１遺伝子の標準配列として知
られる標準配列と比較する、ここで上記試験配列と標準配列の間の違いは上記個
体から得られる上記試験サンプルにおいて特徴づけられるＧＨ機能不全の指標と
して有効な異形（以下「ＧＨ１変異型」）の存在を示し、上記個体は以下の基準
：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762 (19
70 )）上にプロットした時、上記個体の推定目標成人身長範囲の外側に上記個体
成人身長が予測する（一連の身長計測により画された；Brook CDG (Ed) Clinica
l Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwell Scie
nce)）成長パターンと定義される成長不足（ここで、上記推定は上記個体の両親
の身長に基づく）を示す。

【００５３】故に、本発明は本願発明の前記方法により検出されるか又は検出されうるＧＨ１変異型をさらに提供する。

【００５４】本発明はＧＨ１変異型の転写産物、例えばＧＨ１変異型によりコードされるア
ミノ酸配列を含むタンパク質（以下ＧＨ変異体）をも提供し、ここで上記ＧＨ１変異型は本願発明の前記方法により検出されるか又は検出されうるものである。

【００５５】（用語「患者」と「個体」は本願発明の文中において互換性をもって使用され
る）。

【００５６】基準（ｉ）に関する文献として有用なものは Tanner and Whitehouse Arch Di
s Child 51 170-179 (1976) である。患者の目標成人身長範囲は性別依存性の、
両親の平均身長（ＭＰＨ）に対して１０〜９０％の範囲を有するＭＰＨとして計
算される：ＭＰＨ、男性の場合＝〔父親の身長＋（母親の身長＋１３）〕／２＋又は−６
〜８cm、通常７．５cmの範囲内；及びＭＰＨ、女性の場合＝〔（父親の身長−１３）＋母親の身長〕／２＋又は−６
〜８cm、通常６cmの範囲内。

【００５７】これらはヒト成長の分野で使用されている標準的な試験及び計測であり、そし
てあらゆる他の許容される方法が成長不足を測定するために使用されうるが、し
かしながら目標身長範囲の限度を予測するために適用する前記の式に関するＢｒ
ｏｏｋ（前記、1996）中の記載、並びに標準身長チャートに関するＴａｎｎｅｒ
（前記、1970）中の記載に基づく前記方法は本願発明により好ましい。

【００５８】それ故に、これはＧＨ機能不全患者の決定にこれまで使用されたものと実質的
に異なる基準であり、そして彼らの両親が達した身長に基づく患者の（将来的な
）成人身長の予測に関する。

【００５９】好ましくは、本願発明の検出方法において、前記試験サンプルは、前記（ｉ）
に加え、はっきり言えば以下のさらなる基準の１以上を示す個体から得られる：（ii）年齢に対して２５％未満の身長伸長速度；及び／又は（iii ）暦年齢と比べた場合に、Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅスケー
ルによる少なくとも２年の骨年齢遅延；及び／又は（iv）前記基準（ｉ）〜（iii ）に含まれる原因として知られる他の障害の不
存在。

【００６０】好ましくは、（ii）、（iii ）及び（iv）の各々は特定の個体／患者について
満足させなくてはならないため、前記基準（ii）〜（iv）は累積的に適用される
。

【００６１】前記基準（ii）〜（iv）に関して、各基準は、以下にさらに詳細に述べられて
いる、すでに利用可能な、そして本技術分野で確立されている既知の方法及びパ
ラメーターにより評価される：（ii）Tanner JM, Whitehouse RH Atlas of Children's Growth (1982, Londo
n : Academic Press）；及びButler et al Ann Hum Biol 17 177-198 (1990) が
、最初の基準、つまり患者の身長伸長速度が患者の年齢に対して２５％未満であ
ることの決定に統計的な有効性を与えるための出典である。

【００６２】（iii ）骨年齢遅延の年を評価するためのＴａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓ
ｅ等級はTanner JM, Whitehouse RH Cameron N et al により Assessment of Sk
eletal Maturity and Prediction of Adult Hight (1983, London : Academic P
ress）中に記載されている。本願発明の方法において、好ましくは個体は（暦年
齢と比べた場合に）約３．５〜４年の骨年齢遅延を示す。患者における骨年齢遅
延の評価は、異形の大きなレベルを対象とし、１度以上実施した場合に、より若
い個体、従って例えば２歳の子供の複数評価は＋／−６ヶ月変わる骨年齢を生じ
るが、しかし３歳で＋／−４ヶ月変わり、以下同様に変わる。

【００６３】（iv）低身長症症はＧＨ機能不全以外の症状に従属的でありもするため、前述
の障害を患う患者からの試験サンプルは本発明の方法から除かれる。ＧＨ機能不
全に類似した症状を生じる他の障害を患っている患者をベースライン調査により
決定する。

【００６４】それ故に、「ベースライン調査」は、特に甲状腺機能不全症；偽副甲状腺機能
不全症；吸収不良症候群、例えばツェリアキー症；腎及び肝疾患；血液病、例え
ば貧血；並びにクロモソーム疾患、例えばターナー症候群を調べるための核型が
成長不足の原因でないことを除くための試験を含む。前記患者は、成長不足の他
の原因、例えば先天的な心疾患を含む心疾患；慢性的な自己免疫症状、例えばリ
ウマチ様関節炎及び炎症性腸管疾患；慢性呼吸器疾患、例えば重度の喘息又は嚢
胞性線維症；並びに骨格問題、例えば軟骨形成不全症を除くための十分な臨床実
験を受けもする。先に確認された身体的障害のみならず幼児期の成長不足の他の
十分に認識された原因である心理社会学的損失の除去を助けるために全ての病歴
をも得、そして臨床実験の補足に使用しうる。

【００６５】場合により、（ｖ）前記患者は１以上の成長ホルモン機能試験を受ける必要が
ある。前記用記「成長ホルモン機能試験」は成長ホルモン分泌の試験、例えば本
明細書中で先に触れた刺激試験、特にインシュリン誘発低血糖試験（ＩＳＴ）に
関する。

【００６６】ＧＨ機能試験は、低身長症であり；臨床的に評価され、そして彼らの身長が１
回以上の内分泌科医院への通院を通して観察され；彼らの成長不足に関して他の
検出可能な原因を持たず；そしてそれ故に適当な刺激、例えば静中インシュリン
の投与によりもたらされる血中グルコースの深刻な低下に続く彼らの下垂体から
の成長ホルモン分泌物の産生能力の評価を受けるに値する患者に通常実施される
。好ましくは、本願発明による方法において、その個体の成長ホルモン機能試験
の結果は正常である。

【００６７】故に、本願発明による検出方法において、前記の基準を適用するために現在の
身長を計測するが、これは、それ自体によりこの方法における患者の選択のため
に使用される基準ではない。前記のとおり、従来技術の方法は、患者の選択基準
として「正常な」身長（つまり、絶対成長）からの標準偏差を基にする。本発明
は前述の基準の含有を必要とせず、そのため本発明は絶対身長を選択基準から除
くであろう検出方法を提供する。

【００６８】ＧＨ１突然変異の範囲の幅の増大は分子遺伝学用語における遺伝性ＧＨ欠損症
症の再定義を必ず導く。さらに、低身長症症の新しい型の認識は疾患自体として
ＧＨ欠損症症の再分類を最終的には必要とする。これは、成長ホルモン療法が有
益であろう低身長症症の個体のスクリーニング及び決定のために重要な意味あい
を明らかに持つ。

【００６９】本発明の検出方法において患者から得られた試験サンプルは、標準法により患
者リンパ球、例えば頬側塗抹標本、血液サンプル又は毛髪から抽出されたゲノム
ＤＮＡを好ましくは含む。ＧＨ１遺伝子分析は制限されることなくキャピラリー
電気泳動質量分析及びピロシークエンシングを含む遺伝子配列決定又は多型検出
のためのいずれかの標準的方法によりしかる後に実施される。それは以下のステ
ップにより好ましくは実施される：１（ａ）．ＧＨ１遺伝子特異性を確保するように設計されたプライマーを用い
たより小さい重複成分断片のｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲが続くその構成成分（プロモ
ーター、コード領域の５のエクソン、イントロン、及び非翻訳領域）内にＧＨ１遺伝子を含む３．２kb断片の増幅、好ましくはＰＣＲ増幅。６の既知のプライマ
ーの使用と同様に、新規ＧＨ１特異的プライマーの設計がパラロガスで切り離せ
ない、そして高い相同性を有するＧＨ２、ＣＳＨ１及びＣＳＨ２遺伝子、並びに
ＣＳＨＰ１偽遺伝子の不慮のＰＣＲ増幅からの交差汚染拡大を避けるために必須
であることが分かっている。従って、本発明の方法は、その配列がＧＨ１群内の
前記４の他のパラロガス（非ＧＨ１）遺伝子中に見られないＧＨ１遺伝子独特のＧＨ１遺伝子特異的断片、並びにＧＨ１群内の上記４の他のパラロガス（非ＧＨ１）遺伝子中のフランキング領域に結合しえない１以上のＧＨ１遺伝子特異的プ
ライマーを用いた、個体又は機能不全のＧＨを持つ疑いのあるあらゆる個体のＧＨ１遺伝子のＰＣＲ増幅を含む。好ましくは、ＧＨ遺伝子全体が増幅され；及び
／又は１（ｂ）．前記患者のＧＨ１遺伝子の上流約１５kbの遺伝子座制御領域（超高
感度部位Ｉ及びII）に及ぶ全てのゲノムＤＮＡ又はその断片の増幅、好ましくは
ＰＣＲ増幅（Jones et al Mol Cell Biol 15 7010-21 (1995））。前記遺伝子座
制御領域（ＬＣＲ）は、ＧＨ１転写のレベル及び時期に影響するエンハンサー領
域である。前記ＬＣＲはＧＨ１遺伝子の５’の〜１４kbに位置し、そしてＧＨ遺
伝子群内の遺伝子の連係発現を担う。ＰＣＲ増幅を、同一患者における（実施例
５）２の重複断片（２５４bp及び２５８bp）に対する新規オリゴヌクレオチド・
プライマーを用いて実施し；そして１．９kb ＬＣＲ断片を全ての患者において
実施し（実施例５Ａ）；そして２．場合により、しかし好ましくは、ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＷＡＶＥ（商標
）Ｓｙｓｔｅｍ（O'Donovan et al Genomics 52 44-49 (1998)）を用いた変性高
速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によりＧＨ１遺伝子全体又はその断片
の変異スクリーニングする。このスクリーニング方法を使用のために選択した、
なぜならそれは非常に速く、安価で、高感度及び再現性があり、我々の手で少な
くとも＞９５％の検出効率を示すからである。ＤＨＰＬＣにより検出される「バ
ンド・シフト」は潜在的なＤＮＡ配列変異型を示し（さもなければ、ＤＨＰＬＣ
ステップなしにＰＣＲ断片含有３．２kb ＧＨ１遺伝子の直接ＤＮＡ配列決定を
適用しもする）；そして３．ＤＮＡ配列決定（自動又は手動法のいずれかにより）によるいずれかの前
述の変異型の特徴づけ；そして場合により、好ましくはそれも、４．機能不全の推定されるメカニズム及び病変の位置に適用するための方法論
を用いたＧＨ１遺伝子病変の機能上の特徴づけ。

【００７０】故に、本発明は、前記又は本実施例中に記載されたＧＨ１のアッセイに使用す
るための新規ＧＨ１特異的プライマーをさらに提供し、上記プライマーは以下の
ものを含む：前記ＤＨＰＬＣステップにおける使用に好適な新規プライマー（さらなる詳細
については実施例３、表６を参照のこと）：

【００７１】

【化４】

【００７２】そして、ＬＣＲステップにおける使用に好適なプライマー（全て５’→３’）、
実施例５及び５Ａも参照のこと

【００７３】

【化５】

【００７４】ＧＨ１遺伝子全体のＰＣＴ増幅（実施例５Ｄを参照のこと）に使用するための
他の新規プライマーは以下を含む：

【００７５】

【化６】

【００７６】本発明の検出法、並びにそれにより同定又は検出しうるＧＨ１の変異型は以下
のさらなる利点を生じうる：１．新しい病変の同定及び特徴づけによるＧＨ１遺伝子変異型の既知の範囲の
拡大。

【００７７】２．低身長症症の原因論におけるＧＨ１遺伝子変異型の役割の評価。

【００７８】３．新しいＧＨ１遺伝子病変の遺伝形式の同定。

【００７９】４．突然変異遺伝子型と臨床的表現型の関係の説明。これはＧＨ欠損症症の早
期検出と適当な臨床処置のために必須であると考えられる。

【００８０】５．ＧＨ分子の構造及び機能へのＧＨ１突然変異の影響の評価。これは低身長
症症の臨床的範囲のより軽い側の臨床的表現型を持つような子供の評価のために
特に重要である。この群の患者において、免疫学的に活性であり、そしてそれ故
にＧＨ機能試験において正常な範囲内に収まる機能不全ＧＨが産生される。

【００８１】６．遺伝性ＧＨ欠損症症についての迅速なＤＮＡ診断試験の開発。

【００８２】７．ＧＨ欠損症症が集団においてこれまで十分に診断されなかった及び過小評
価された我々の必要条件の評価。

【００８３】故に、さらなる天然ＧＨ１病変の特徴づけが、ＧＨ構造、機能及び発現の研究
に対する大きな意義となることを約束する。新しいコード配列変異型の研究はＧ
Ｈ機能だけでなくＧＨとそのレセプター（ＧＨＲ）との相互作用、並びにＧＨＲ
仲介シグナル伝達の我々の理解を高めるはずである。得られた洞察は、新型の治
療剤の理論的設計に関係しうる。同様に、プロモーター領域内の天然ＧＨ１病変
の研究はＧＨ１遺伝子発現の制御に新たな洞察を提供するはずである。よって、
突然変異病変の幅広い範囲は、ＧＨ欠損症症における変異体の遺伝子型と臨床的
表現型との関係に対する我々の理解を必然的に高めることが理解される。明らか
に、これらの研究は家族性ＧＨ欠損症症の早期検出及び適当な臨床処置のために
必須である。

【００８４】故に、本発明は、ＧＨ１と異なり、かつ、本発明による方法により検出される
が、しかしこれまで使用されてきた方法、例えば主に身長又は他の基準、あるい
はそれらの組み合わせに基づく患者選択基準に依存するものにより検出されないＧＨ１変異型をさらに提供する。前述の本発明のＧＨ１変異型は以下の実施例６
及び特に表７Ｂに特徴づけられるものを含む。

【００８５】前記に示されるとおり、ＧＨ分泌を評価するための最新の試験は、多く、そし
て変化しており、かつ単独ではない今日利用可能な調査が理想的である。ヒトＧ
Ｈの分泌がパルス状であり、そしてＧＨパルスの振幅及び振動数が大きく変化し
うるため（睡眠、運動、ストレス及び関係する個体の思春期の段階を含む複数の
内因性及び外因性因子により影響されている）、最良の情報を得るこれらの試験
は、専用の調査病棟内での患者の周到な処置を必要とする。故に、前記試験は時
間を消費し、高価であり、そして患者及びその家族に対して大きなストレス及び
苦痛を引き起こす。インシュリン誘発性低血糖試験（ＩＳＴ）は特に注意がいる
；前述のとおり、これはＧＨ分泌の評価のために多くの医師により使用されるが
、しかしその十分な遂行の欠くことのできない必要条件として患者に誘発された
低血糖に対して必要な処置がもとで死亡している。故に、調査、例えばＩＳＴの
実施のための決定は、低身長症児の評価における地位が与えられる前に最も注意
深く考えられることが最も重要である。故に、低身長症患者のスクリーニングに
使用するためのＤＮＡ試験の開発は、現在利用可能な他の試験を上回る多くの利
点を有する。

【００８６】従って、本発明は、ＧＨ機能不全を持つ疑いのある患者をスクリーニングする
ためのスクリーニング方法を提供し、このスクリーニング方法は以下のステップ
：（ａ）患者からのヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプルを
得；そして（ｂ）上記試験サンプルから得られた配列の領域を所定の配列の対応の領域と
比較する、ここで上記所定の配列はそれが本発明の前記方法により検出されうるＧＨ１変異型から選ばれることにより特徴づけられる、を含む。

【００８７】より特に、本発明のスクリーニング方法は、所定の配列がＧＨ１遺伝子の変異
型の領域に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、上記領域が野
生型配列の対応領域と比較した時、少なくとも１の異形を組み込むことにより特
徴づけられている。

【００８８】特に好ましいのは、前記異形が本発明の検出方法により検出されうる、例えば
以下の実施例６及び表７に定められたもののいずれかの場合である。

【００８９】好ましくは、ゲノムＤＮＡを含む試験サンプルは従来法により抽出される。

【００９０】故に、本発明は以下を含むＧＨ機能不全検出のためのスクリーニング方法をさ
らに提供する：（ａ）ＧＨ機能不全が疑われる個体から第１の試験サンプルを得；そして（ｂ）上記第１の試験サンプル中のＧＨ１遺伝子又はＧＨ１転写物、あるいは
それらからの断片（例えばｃＤＮＡ）を、以下の基準：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch. Dis. Child 45 755-762 (
1970））上にプロットした時に（上記個体の両親の身長に基づき）上記個体の推
定目標成人身長範囲の外側にある上記個人の推定成人身長が予測する（一連の身
長測定により線引きした；Brook CDG (Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwell Science)）成長パターンと定義さ
れる成長不足；及び／又は（ii）年齢に対して２５％未満の患者の身長伸長速度；及び／又は（iii ）暦年齢と比較した場合に、Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ等級
により少なくとも２年の骨年齢遅延；及び／又は（iv）前記基準（ｉ）〜（iii ）への包含を引き起こすことが知られる他の障
害の不存在、を示す個体由来の第２の試験サンプルから得られうるＧＨ１変異型
の対応の遺伝子、転写物又は断片と比較する。

【００９１】好都合なことに、本発明はＧＨ機能不全の疑いのある個体を選別するためのス
クリーニング方法を提供し、上記スクリーニング方法は以下のステップ：（ａ）個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプルを得
；そして（ｂ）上記試験サンプルから得られた配列の領域を、所定の配列の対応の領域
と比較する、ここで上記所定の配列は本願発明による検出方法により同定される
か又は同定されうるＧＨ１変異型から選ばれる。

【００９２】好ましくは、所定の配列は、野生型配列と比較した場合に、領域が少なくとも
１の異形を組み込むＧＨ１遺伝子変異型の領域に対応する核酸配列を有するヌク
レオチドである。

【００９３】好ましくは、本願発明のスクリーニング方法における第１の試験サンプル又は
試験サンプルはゲノムＤＮＡを含む。

【００９４】本発明のスクリーニング方法において、前記比較ステップは従来の形式、例え
ば特に比較的少ない突然変異が検出／比較されるべき場合に、ＧＨ１遺伝子の適
当な領域の配列決定により実施される。比較的多数の突然変異が含まれる場合、
ＤＮＡチップ技術が利用される、例えばここで固形支持体上に固定された突然変
異特異的オリゴヌクレオチドプローブのマイクロ・アレイへの標識サンプルＤＮ
Ａ（上記患者由来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）のハイブリダイゼーションによ
り、小型の並列分析デバイスである上記チップを、複数の既知の突然変異か又は
全ての見込みのある突然変異のいずれかについての同時選別のために使用する（
Southern, Trends Genet 12 110-115 (1996)）。

【００９５】現行の試験を上回る本発明によるＤＮＡスクリーニング方法の利点は以下を含
む：１．患者に対して、それは医院で実施しうる一回の血液検査だけを必要とする
。故に、これらは関連費用、専門家の時間の使用、及び試験される各々の患者に
生じる苦痛を減少させるであろう。

【００９６】２．患者の機能的なＧＨ欠損症症のより早期の診断が可能になるであろう。前
記ＤＮＡスクリーンが容易に実施されうることは、患者の処置において別な方法
の場合よりも先にこの調査を医師に検討させる。最近、ＧＨ分泌についての試験
につきものの前記問題のために、医師は、子供をＩＳＴの対象とする前に、長期
、多くの場合数年にわたり外来で子供を評価する。ＧＨ欠損症症についての遺伝
子原因論の早期診断は、それによりそれほど重症ではない表現型を持つ個体にお
ける月ごと又は毎年の患者の適当な治療の機会を提案するＧＨによる早期治療を
可能にする。

【００９７】３．より多くの患者をＧＨ機能不全について試験しうる。前記ＤＮＡ試験の容
易さは、全ての低身長症患者の最初の評価の一部として、彼らの内分泌科の初診
の時に医師にそれを実施させる。これは、重度の成長問題を引き起こすＧＨ１遺
伝子の病変を持つ患者、並びに軽い病変（例えばコード領域内にミスセンス変異
）を持つ患者をも明らかにする可能性がある。これらの患者は、これまで臨床的
注目に到らなかった。なぜなら彼らの臨床的／表現型の問題はＩＳＴを許可する
ためには十分な重症度ではなかったためである。とは言うものの、彼らはＧＨに
よる治療から利益を受けるかもしれない。

【００９８】４．ＧＨによる生涯の治療を必要とする患者の早期識別が可能となる。これら
の患者を識別し、そしてＧＨ分泌についての最初の試験又は再試験、あるいは彼
らの経過を評価するためのＧＨなしの期間（「無処置試験」）の使用なしに適切
に治療しうる。

【００９９】５．ＧＨ機能不全の家族の容易で、そして早期の識別は可能になる。一旦、成
長問題の原因である遺伝子病変が個体に同定されれば、同じ病変について他の家
族を評価すること、及び彼らもＧＨによる治療から利益を受けるかどうか確認す
ることが比較的容易である。

【０１００】６．診断の精度が上がるはずである。ＧＨ分泌についての試験は、実験室内及
び実験室間の両方でアッセイ結果の再現性に関してそれらの変わりやすさで有名
である。ＤＮＡスクリーニングはこの問題を過去のものにする。加えて、ＧＨ分
泌試験結果は特定の状況において判断することが非常に困難になりうる、例えば
その患者が甲状腺機能低下でもあるか又は遅れた思春期である場合である。ＤＮ
Ａスクリーニングはこの疑いを取り除き、そしてその使用が利益になるであろう
患者に対するＧＨ療法の開始の遅れを回避する。

【０１０１】従って、本発明は、本発明のスクリーニング方法の実施への使用に好適なキッ
トをさらに提供し、ここで上記キットは以下を含む：（ａ）対応の野生型配列との少なくとも１の違いを組み込んだ、変異型ＧＨ１遺伝子の領域に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；及び（ｂ）（ａ）に指定した領域内の野生型配列に対応する核酸配列を持つオリゴ
ヌクレオチド；そして場合により（ｃ）上記患者のＤＮＡの所望の領域を増幅するためのＰＣＲ実施のために好
適な１以上の試薬。

【０１０２】前述の試薬は、例えばＧＨ１遺伝子のエクソンに対応するＰＣＲプライマー、
及び／又は本明細書中で触れたプライマー、特に本明細書中で先に触れた新しい
プライマー；並びに／あるいはＰＣＲに使用する他の試薬、例えばＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼを含む。

【０１０３】好ましくは、前記キット中のオリゴヌクレオチドは、２０〜２５塩基対、例え
ば前記変異型配列に対して２０塩基対、そしてその変異が一塩基対置換の場合は
野生型に対して２０又はその変異が５塩基対欠失の場合は２５塩基対の範囲に含
まれる。いずれの場合においても、前記オリゴヌクレオチドは選択された領域に
対して独特であり、かつ、そのゲノム中の他の場所で繰り返されないように選ば
れなくてはならない。

【０１０４】当然、複数の異形、例えば１５〜２０超の範囲についての選別が望まれる状況
において、これは最大４０オリゴヌクレオチド超を含むキットを必要とする。故
に、代替のスクリーニング方法において、ＤＮＡチップ技術の使用により、本発
明は固形支持体に固定した前記キット部品（ａ）に定めた複数のオリゴヌクレオ
チドを提供する。

【０１０５】他のヌクレオチド検出方法、例えばナノテクノロジーの先駆けであるシグナル
増幅方法（例えばＱ−Ｄｏｔｓ）を使用しうる。また、シグナル分子検出方法を
利用しうる（例えばＳＴＭ）。この場合、本願発明によるキットは前述の代替方
法に使用するための１以上の試薬を含む。

【０１０６】あるいは、本願発明によるスクリーニング方法及び対応のキットは、ＧＨ１変
異型又はＧＨ変異体の存在を示すか又は関連する、いわゆる「代替マーカー」、
例えばタンパク質／アミノ酸配列例えばＧＨ１変異型（ｖａｒｉａｎｔｏｆＧＨ１）又はＧＨ変異体（ＧＨｖａｒｉａｎｔ）に対して特異的な抗体の１以
上に基づく。前述の「代替マーカー」は以下の：（ａ）いずれかの生物分子（制限されることなく、ヌクレオチド、タンパク質
、糖及び脂質を含む）；（ｂ）化合物（制限されることなく、薬剤、それらの代謝産物及び他の化合物
）；及び／又は（ｃ）身体特性、を含み、患者におけるそれらの存在、不存在又は量は、ＧＨ変異体又はＧＨ１変
異型の存在を測定することができ、そしてそれに関連する。

【０１０７】本願発明によるさらなる好適な代替スクリーニング方法は、従来のタンパク質
配列決定法（質量分析、マイクロ・アレイ分析、パイロシークエンシング（ｐｙ
ｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等を含む）、及び／又は抗体に基づく検出方法（例
えばＥＬＩＳＡ）により判定されるＧＨ変異体（すなわちｈＧＨの異形、例えば
本願発明の方法により検出されるＧＨ１変異型によりコードされるものを含むタ
ンパク質／ペプチド配列）を含む試験サンプルの獲得、並びに１以上の上述のタ
ンパク質配列決定方法の実施をさらに含む。

【０１０８】この代替ケースにおいて、本願発明によるキットは前述の代替法に使用するた
めに１以上の試薬を含む。

【０１０９】本願発明の検出方法により検出しうるＧＨ１変異型は、ＧＨ機能不全に関する
スクリーニング試験において標準物質としてさらに使用される。例えば、その変
異がＧＨ１遺伝子のプロモーター領域内に存在するもの以外の変異が患者の治療
に使用される。ここで、例えば下垂体巨人症又は末端肥大症の場合に、ＧＨ産生
が過度に刺激される。

【０１１０】本発明はさらに以下を提供する：（ａ）いずれの成長ホルモンも全く産生しない、及び従来の診断技術により古
典的なＧＨＤに分類される患者の判定のための２の終止変異を含む１以上のＧＨ
変異体又はＧＨ１変異型の使用；（ｂ）成長ホルモン・レセプター又はその結合タンパク質（すなわち、インビ
トロにおけるＧＨに対する担体）へのＧＨの修飾された結合に導くＧＨ変異体又
はＧＨ１変異型。なぜならその結合タンパク質への結合により下垂体からの変異
体ＧＨの輸送はその組織レセプターへの向かう途中の非結合タンパク質の分解の
誘導を弱めるか又は阻害するからである；（ｃ）下垂体中のＧＨタンパク質の亜鉛二量体保存形態の形成を中断させうる
ＧＨ変異体又はＧＨ１変異型；（ｄ）ＧＨレセプターにアンタゴニスト特性を持つタンパク質であり、そして
そのレセプター結合定数が変異タンパク質の能力及び阻害作用を克服するための
患者の治療に必要な外来ＧＨの量（用量）を決定するＧＨ１変異型により発現さ
れたＧＨ変異体；すなわち、上記変異タンパク質はそのレセプターへの結合で野
生型と競合する；（ｅ）治療、診断又は検出方法のための本発明によるＧＨ変異体又はＧＨ１変
異型の使用；（ｆ）個体の疾患に対する感受性の判定のための本発明によるＧＨ変異体又はＧＨ１変異型の使用；（ｇ）糖尿病、肥満症又は感染症に対する感受性の判定のための本発明による
ＧＨ変異体又はＧＨ１変異型の使用；（ｈ）結合欠陥及び／又は下垂体保存欠陥の判定のための本発明によるＧＨ変
異体又はＧＨ１変異型の使用；（ｉ）末端肥大症におけるアンタゴニスト療法の診断に用いる用量の判定のた
めの本発明によるＧＨ変異体又はＧＨ１変異型の使用；（ｊ）臨床的処置への使用のための本発明によるＧＨ変異体又はＧＨ１変異型
の使用；（ｋ）遺伝子治療への使用のための本発明によるＧＨ１変異型の使用；（ｌ）疾病状態に関係する１以上の多型の判定のための本発明によるＧＨ変異
体又はＧＨ１変異型の使用；並びに（ｍ）治療用組成物、診断用組成物若しくはキット、又は検出キットの調製の
ための本発明によるＧＨ変異体又はＧＨ１変異型の使用。

【０１１１】従って、本発明は、その医薬として許容される担体と結合させたＧＨ変異体、
特に本願発明の検出方法により検出される変異体及び本明細書中で特定する変異
体を含む組成物をさらに提供する。

【０１１２】さらに、本発明は以下を提供する：（ａ）ＧＨ変異体をコードする核酸配列；（ｂ）配列（ａ）に対して実質的に相同であるか又はストリンジェント条件下
で配列（ａ）にハイブリダイズする配列；又は（ｃ）遺伝子コドンの縮重を別にすれば、上記配列（ａ）若しくは（ｂ）に対
して実質的に相同であるか又はストリンジェント条件下で上記配列（ａ）若しく
は（ｂ）にハイブリダイズする配列；あるいは（ｄ）上記配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかに特異的なオリゴヌクレ
オチド。

【０１１３】同様に提供されるものは以下である：（ａ）前記核酸配列を含むベクター；（ｂ）上記ベクター（ａ）を包含する宿主細胞、例えば細菌宿主細胞；及び（ｃ）以下の：（ｉ）上記宿主細胞（ｂ）を培養し；そして（ii）それにより産生されたＧＨ１変異型を培地から回収する、を含むＧＨ１変異型の調製工程。

【０１１４】（ｄ）先に定めた配列、ベクター又は細胞によりコードされるか、あるいは培
地中に発現されるタンパク質又はアミノ酸配列。

【０１１５】本発明は以下の実施例を参照することでここに説明される。

【０１１６】実施例１−患者の選択患者の起源 Cardiff の総合大学、Wales 大学医学部のRegional Paediatric Growth, Endo
crine and Diabetes Serviceへの委託を通じ、そして他の同様の英国のセンター
（すなわちNewport, Birmingham, Bristol, Wrexham, Liverpool, Stoke-on-Tre
nt, Portsmouth及び Southampton）との共同研究により低身長症の子供を確認し
た。家族の病歴、家系、成長パラメーターの資料及び先に実施した内分泌系の調
査を含めた全ての病歴を取得した。正確な成長学（ａｕｘｏｌｏｇｙ）を初発症
例、患者及び兄弟について可能な限り記録した。分子遺伝学的分析のための血液
サンプルを初発症例及び適当な近親者から取得した。さらに家族がJohn A. Phil
lips III教授（Nashville, TN, USA), Mohamad Maghnie医師（Pavia, Italy）及
びTamas Niederland医師（Gyor, Hungary ）により調べられた。今日まで、６９
のＧＨ欠損症症の家族からのサンプルを集めた。

【０１１７】使用した基準全ての患者の選択のために使用した基準は以下のとおりである：（ｉ）本発明に従い基準（ｉ）により先に定められた目標身長範囲の下限の％
を下回る成長；（ii）成長速度＜２５パーセント；（iii）少なくとも２歳の骨年齢遅延、例えば患者１の場合、暦年齢と比較し
た時に３．５〜４歳である；（iv）他の調査の全てが正常；並びに（ｖ）成長ホルモン分泌試験が正常。

【０１１８】表５Ｂにおいて： *ＧＨＦＴ：ピーク：１以上の標準的な成長ホルモン試験
における活性の単位（IU／Ｌ）を表す。「ランダム」はランダムに行ったＧＨ計
測を意味する。ＮＤは「試験行わず」を意味する。前記身長パーセントは、下記
の表７Ｂに提供されたデータによる証明に含まれ、上記パーセントを十分に下回
る身長を有することが必須の選択基準ではない；我々は、十分に低い身長を有さ
ない患者においてでさえ生じるＧＨ／ＧＨ１の異形を発見した。

【０１１９】

【表９】

【０１２０】実施例２−ＧＨ１特異的断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅３．２kbのＧＨ１特異的断片のＰＣＲ増幅を６５の血縁関係を持たない患者に
対して実施した。ゲノムＤＮＡを標準法により患者のリンパ球から抽出した。

【０１２１】Ｅｘｐａｎｄ（商標）高忠実度システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いてヒトＧＨ１遺
伝子を含む３．２kbの単一ゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために、オリゴヌク
レオチド・プライマーＧＨ１Ｆ（5' GGGAGCCCCAGCAATGC 3' ; -615〜-599）及びＧＨ１Ｒ（5' TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3' ; +2598〜+2616）をＧＨ１特異的配列に
対応して設計した。

【０１２２】２の別個の薄壁の０．６５ml ＰＣＲチューブを各反応に用いた。第１チュー
ブは、滅菌水により終量２５μｌに適量した、５００ナノグラム（ng）の各プラ
イマー（ＧＨ１Ｆ及びＧＨ１Ｒ）、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ
及びｄＧＴＰ並びに２００ngの患者ゲノムＤＮＡを含んだ。第２チューブは、滅
菌水により２４．２５μｌの終量に適量した５μｌの１０×反応バッファーを含
んだ。両チューブを５分間氷上に置いた。その後、０．７５μｌのＥｘｐａｎｄ
（商標）ポリメラーゼ・ミックスを第２チューブに添加し、その内容物を混合し
、そして第１チューブに移した。このチューブを３０秒間遠心分離し、そしてこ
の反応混合物を３０μｌの軽油（Ｓｉｇｍａ）で覆った。次にこの反応混合物を
９５℃に合わせた４８０又は９７００ＰＣＲプログラム可能サーマル・サイクラ
ー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にセットした。

【０１２３】次に、前記反応混合物を以下の条件：９５℃２分間、続けて３０サイクルの９
５℃３０秒間、５８℃３０秒間、そして６８℃２分間の下で増幅した。最後の２
０サイクルについて、６８℃での伸長ステップをサイクルにつき５秒ずつ増やし
た。これに６８℃７分間のさらなるインキュベーションが続き、そして次にこの
反応物をさらなる分析に先立ち４℃まで冷却した。各反応物について、ブランク
（陰性対照）をも設けた。このブランク反応物はゲノムＤＮＡを除いた全ての試
薬を含み、そして汚染された試薬のないことを裏付けるために使用した。ｎｅｓ
ｔｅｄ−ＰＣＲを実施する前にＰＣＲ増幅が成功しているかどうか評価するため
に１０分の１量（５μｌ）を１．５％アガロース・ゲルを用いて分析した。うま
くＰＣＲ増幅されたそれらのサンプルを次にｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲに使用する前
に１００倍に希釈した。

【０１２４】実施例３−Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲいずれの場合にも、共にＧＨ１遺伝子全体に広がる７の重複従属断片を製造す
るために実施例２で製造した断片を用いてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを実施した。加
えて、３の患者を除く全員で、遺伝子座制御領域（Loucus Control Region ）が
ＰＣＲ増幅されている（実施例５を参照のこと）。

【０１２５】最初の３．２kb ＰＣＲ産物の７の重複従属断片をＴａｑＧｏｌｄＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲ増幅した。これらの
反応に使用したオリゴヌクレオチドを、ＧＨ１遺伝子標準配列から決定したそれ
らの配列の位置と共に表６に一覧する。

【０１２６】希釈した長（３．２kb）ＰＣＲ産物の１μｌアリコートを薄壁の０．２ml Ｐ
ＣＲチューブ又は９６ウェル・マイクロタイター・プレートの１ウェル中に入れ
た。これに５μｌの１０×反応バッファー、５００ngの適当なプライマー対（例
えばＧＨ１ＤＦとＧＨ１ＤＲ）、２００μＭの終濃度までｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、４９．８μｌの容量の滅菌水、続いて０．２μｌのＴａ
ｑＧｏｌｄポリメラーゼを添加した。

【０１２７】次に、前記チューブ又はマイクロタイター・プレートをＰｒｉｍｕｓ９６サー
マル・サイクラー（MWG Biotech ）にセットし、そして以下のとおり：９５℃１
２分間、続いて３２サイクルの９５℃３０秒間、５８℃３０秒間、そして７２℃
２分間を循環させた。続いてこれをさらに７２℃で１０分間インキュベートし、
そして次にこの反応物をさらなる分析の前に４℃まで冷却した。

【０１２８】ＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡ断片分析システム（Transgenomic Inc. Crewe, Chesh
ire, UK ）を用いて変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を実施する
前に、前記反応がうまくいっていたか確認するために、前記反応混合物の１０分
の１量（５μｌ）を０．８％アガロースゲルを用いて分析した。ヘテロ２本鎖形
成を促進するために、前記ＰＣＲ産物を９５℃で５分間変性させ、続いて４５分
間にわたり５０℃まで緩やかに再アニーリングさせた。産物をＤＮＡｓｅｐカラ
ム（Transgenomic Inc. ）に流し、そして０．９ml／分の一定の流速での０．１
Ｍトリエチルアミン酢酸バッファー（ＴＥＡＡ pH７．０）中、２％／分の線形
アセトニトリル（ＢＤＨＭｅｒｃｋ）グラジエントを用いて溶出した。ＰＣＲ
産物のサイズに従って前記グラジエントの始点及び終点を調節した。分析は、カ
ラムの再生及び平衡化に必要な時間を含めて増幅サンプル当たり６．５〜８．５
分を要する。サンプルをＤＨＰＬＣＭｅｌｔソフトウェア（http://insertion.s tanford.edu/melt.html ）を用いて決定したメルト濃度（ＴＭ）で分析し、そし
て表６に一覧した。溶出したＤＮＡ断片をＵＶ−Ｃ検出器（Transgenomic Inc.
）により検出した。

【０１２９】

【表１０】

【０１３０】実施例４−ＧＨ１特異的長ＰＣＲ断片のクローニング及びＤＮＡ配列決定クローニングＤＨＰＬＣ分析は推定ＤＮＡ配列変化を含むＤＮＡの同定をもたらす。推定配
列変化を持つ対立遺伝子を決定するために、ＧＨ１特異的長（３．２kb）ＰＣＲ
断片をＰＣＲプラスミド・クローニング・ベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Promega ）内
にクローンした。１０μｌの終量に１×反応バッファー及び１μｌ（３単位）Ｔ
４ＤＮＡリガーゼの存在中、１０ngのｐＧＥＭ−Ｔに５０ngのＧＨ１特異的長Ｐ
ＣＲ断片を添加することによりクローニングを達成した。この反応物を１０℃で
１６時間インキュベートした。この反応混合物全部を１．５mlチューブに移し、
そして氷上で冷却した。５０μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Life Technolog
ies ）を添加し、そしてこのチューブを３０分間氷上に静置した。次に、この混
合物を３７℃で２０秒間ヒート・ショックを与え、そして２分間氷上にもどした
。その後、０．９５mlのＹＴ×２培地（水１ｌ当たり１６ｇのトリプトン、１０
ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ）を添加し、そしてこの混合物を振とうしなが
ら３７℃で１時間インキュベートした。次に、この混合物を、あらかじめ暖めて
おいた、５０μｇ／mlのアンピシリン、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌ含有アガロース
・プレート上に播種し、そしてシングル・コロニを生育させるために３７℃で１
６時間インキュベートした。

【０１３１】各プレートから８の白色コロニーを取り出し、そして第２のマス目入りのプレ
ートに移した。前記ＧＨ１特異的長ＰＣＲ断片がうまくクローンされているか確
認するためにプライマーＧＨ１Ｆ及びＧＨ１Ｒ（実施例３、表６を参照のこと）
、並びに先に記載した条件を用いたＰＣＲ増幅を行った。

【０１３２】ＧＨ１特異的長ＰＣＲ断片を含むクローンを２ml ＹＴ×２培地中で培養し；
プラスミドＤＮＡを、製造業者の説明書に従いＱｉａｇｅｎｓｐｉｎｍｉｎ
ｉｐｒｅｐキットを用いて細菌から抽出した。こうして抽出したＤＮＡを、２６
０nmでその吸光度を計測することにより定量し、そして回収されたクローンのサ
イズを確認するために０．８％アガロース・ゲルにより電気泳動を行った。次に
、これらのクローンの４つを配列決定した。

【０１３３】自動ＤＮＡ配列決定前記ＧＨ１特異的長ＰＣＲ断片を含むクローンを、Ｐｒｉｍｕｓ９６（ＭＷＧ
）又は９７００（Perkin Elmer）ＰＣＲサーマル・サイクラーにより、０．２ml
チューブか又は９６ウェル・マイクロタイター・プレートのいずれかの中で、Ｂ
ｉｇＤｙｅ配列決定キット（Perkin Elmer）を用いて配列決定した。配列決定に
使用したオリゴヌクレオチド・プライマーは以下の：

【０１３４】

【化７】

【０１３５】であった。

【０１３６】１μｇのクローンＤＮＡを、２０μｌの終量中の３．２pmolの適当なプライマ
ー及び４μｌのＢｉｇＤｙｅ配列決定ミックスを用いて配列決定した。次に、前
記チューブ又はマイクロタイター・プレートを前記サーマル・サイクラーにセッ
トし、そして以下のとおり：９６℃２分間、続いて３０サイクルの９６℃３０秒
間、５０℃１５秒間、そして６０℃４分間循環させた。次に、精製前にこの反応
物を４℃まで冷却した。

【０１３７】前記の完了した配列決定反応物に８０μｌの７５％イソプロパノールを添加す
ることにより精製を実施した。次に、これを混合し、そして室温で３０分間放置
した。次に、この反応物を室温で２０分間１４，０００rpm で遠心分離した。次
に上清を除去し、そして２５０μｌの７５％イソプロパノールを沈殿物に添加し
た。このサンプルを混合し、そして室温で５分間１４０００rpm で遠心分離した
。上清を除去し、そしてこのペレットを７５℃で２分間乾燥させた。

【０１３８】次に、サンプルをＡＢＩＰｒｉｓｍ３７７又は３１００ＤＮＡシークエンサ
ーを用いて分析した。

【０１３９】実施例５−成長ホルモン遺伝子座制御領域の分析ヒトＧＨ１遺伝子の上流約１４．５kbのＤＮＡ領域は、ＧＨ１遺伝子転写の組
織特異的及び発育制御に関与することが知られている（Jin et al Mol Endocrin
ol 13 1249-1266 (1990)）。これは遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）として知られ、
そしてこのＤＮＡ配列をＧｅｎｅＢａｎｋから入手した（受託番号：ＡＦ０１０
２８０）。ヌクレオチドの番号付けはＧＨＬＣＲ標準配列（図４）に基づく。

【０１４０】第１１９２位での多型部位を太字及び下線により明らかにする。この領域の一
部をＰＣＲ及びＤＨＰＬＣにより分析した。

【０１４１】約４００bpに及ぶ２の重複ＰＣＲ断片を、前記の入手可能なＤＮＡ配列を参照
することにより設計した以下の新しいオリゴヌクレオチド・プライマーの使用を
通して製造した：

【０１４２】

【化８】

【０１４３】ＰＣＲをＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを用いて実施した：１μｌの患者ゲノ
ムＤＮＡを薄壁の０．２ml ＰＣＲチューブ又は９６ウェル・マイクロタイター
・プレートの１ウェル中に入れた。これに５μｌの１０×反応バッファー、５０
０ngの適当なプライマー対（例えばＧＨ１ＦとＧＨ１Ｒ）、２００μＭの終濃度
までのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、４９．８μｌの容量の滅菌
水、続いて０．２μｌのＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを添加した。次に、前記
チューブ又はマイクロタイター・プレートをＰｒｉｍｕｓ９６サーマル・サイク
ラー（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ）にセットし、そして以下のとおり：９５℃で１
２分間、続いて３２サイクルの９５℃３０秒間、５８℃３０秒間、そして７２℃
２分間を循環させた。続いて、これをさらに７２℃で１０分間インキュベートし
、そして次にこの反応物をさらなる分析の前に４℃まで冷却した。

【０１４４】変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を実施する前に前記反応がう
まくいっていたか確認するために、１０分の１量（５μｌ）を１．５％アガロー
ス・ゲルを用いて分析した。ＤＨＰＬＣによる分析を、６１℃のメルト温度を用
いて実施例３に記載のとおり実施した。

【０１４５】実施例５Ａ−成長ホルモン遺伝子座制御領域のさらなる分析４０の対照個体及び４０の遺伝性ＧＨ欠損症症の患者からの６００ngのＤＮＡ
を、以下の新しいプライマー：ＬＣＲ５Ａ（5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3'）；及びＬＣＲ３．０（5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3'；図４を参照のこと）、５mM ｄＮＴＰｓ、並びにRoche のＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメ
ラーゼを用いた１．９kb ＬＣＲ断片のＰＣＲ増幅に使用した。反応条件は９８
℃×２分間、９４℃×１５秒間、５８℃×３０秒間、７２℃×１分間×１０サイ
クル、５８℃×３０秒間、７２℃×１分間＋連続したサイクルごとに５秒を加算
×２０サイクルであった。ＰＣＲ反応産物を２％アガロース・ゲルを用いて分離
し、そしてＬＣＲ断片に対応するバンドを外科用メスを用いて切り取った。ゲル
抽出によりアガロースを除去し、そしてＤＮＡを配列決定のために溶出した。前
記１．９kb ＬＣＲ断片を、以下の新しいプライマーを用いたＡＢＩ３１００自
動シークエンサーにより配列決定した：ＬＣＲ５．０（5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3'）；ＬＣＲ３．１（5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3'）；ＬＣＲ３．２（5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3'）；及びＬＣＲ３．３（5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3'）を前記領域を覆うために使用
した。

【０１４６】実施例５Ｂ−ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子によるＧＨ１プロモーター・ハプロタイプ及び推定プロモーター変位の特徴づけｐＧＬ３−ＧＨ１構築物内に特異配列変位を組み込むためにＱｕｉｋＣｈａ
ｎｇｅ（商標）特定部位突然変異誘発キットを使用した。このストラテジーは、
野生型構築物の逆の鎖に対する所望の変異をそれぞれ含む２の相補的オリゴヌク
レオチド・プライマーのアニーリングが関係している。次に、このプライマーを
高忠実度ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、低レベルのランダム突然変
異効率を持つ高度に特異的な突然変異をもたらす。最後に、ｄａｍメチル化され
た親ＤＮＡを、突然変異含有プラスミドについて選択するためにメチル化又はヘ
ミ−メチル化ＤＮＡに特異的な制限酵素ＤｐｎＩを用いて消化した。

【０１４７】その容易さと効率から、ラットＧＨ３及びヒトＨｅＬａ細胞内へのＤＮＡ移行
のためにリポソーム仲介形質移入を選んだ。ＧＨ３細胞の一過性の形質移入のた
めに使用した試薬はＴｆｘ（商標）−５０であった。これは、合成カチオン性脂
質分子（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）−２，３−ジ（オレオイルオキシ）−１，４−ブタンジアンモニウム・
ヨウ化物）及びＬ−ジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ
）から成る混合物を含んでいた。水による水和により、これらの脂質は、核酸と
結合し、そして細胞内へのそれらの移行を容易にする多重膜小胞を形成する。細
胞を９６ウェル・プレート様式を用いて播種した。集密な細胞を培養フラスコか
ら除き、新しい培地により希釈し、そしてウェル当たり１６０％集密の細胞密度
まで培養した。希釈した細胞の２００μｌの量を各ウェルに分配し、そしてこの
プレートを、湿った紙を入れた箱の存在下、３７℃で一晩インキュベートした。
これは昨日に形質移入する場合に約８０％集密である細胞をもたらす。

【０１４８】形質移入混合物は無血清培地、ＤＮＡ（ｐＧＬ３−ＧＨ１及びｐＲＬ−ＣＭＶ
）及びＴｆｘ（商標）−５０試薬を含んでいた。０．２５μｇのｐＧＬ３構築物
、２ngのｐＲＬ−ＣＭＶ、及び０．５μｌのＴｆｘ（商標）−５０試薬（これは
Ｔｆｘ（商標）−５０試薬対求められるＤＮＡの最適化された３：１の比を提供
した）を含むウェル当たり９０μｌの総量を準備した。培地とＤＮＡをまず混合
し、続いてＴｆｘ（商標）−５０試薬を混合した。この溶液をすぐにボルテック
スにかけ、そして室温で２０分間インキュベートした。１５分の段階で、培養ウ
ェルをインキュベーターから取り出し、そして培地を除去した。前記Ｔｆｘ（商
標）−５０試薬／ＤＮＡ混合物を軽くボルテックスにかけた後、９０μｌを各ウ
ェルに添加した。このプレートを、インキュベーターに戻し１時間後に前もって
暖めておいた（３７℃）２００μｌの完全培地を各ウェルに添加した。この細胞
を、インキュベーターに戻したさらに２４時間後にレポーター・アッセイのため
に溶解する。ＨｅＬａ細胞の形質移入をＧＨ３細胞と基本的に同様であった。違
いは、Ｔｆｘ（商標）−５０の代わりにＴｆｘ（商標）−２０を用いたこと、１
ngのｐＲＬ−ＣＭＶを同時形質移入したこと、及びその細胞をウェル当たり６０
％集密の細胞密度に計算したことである。

【０１４９】培養した形質移入細胞を３７℃インキュベーターから取り出し、そして培地を
除去し、その後に５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の添加が続く。こ
のプレートを緩やかに回し、その後にこのリンス溶液を除去した。確実に前記細
胞単層を完全に覆う、２０μｌ容量の受動溶解バッファーを各培養ウェルに添加
した。このプレートを回転テーブル上に置き、そして室温で３０分間放置し、そ
の後に−７０℃で保存する。前記プレートを解凍し、そして６０００rpm で２０
秒間遠心した。マイクロプレート・ルミノメーターを、各々のレポーター・アッ
セイに対して２秒間の前計測、遅れて１０秒間の計測時間を続けて行うように調
整した。５０μｌ容量のルシフェラーゼ・アッセイ試薬II（Dual Luciferase Re
porter Assay System (Promega製、UK）より）を第１ウェル中に直接注入し、そ
してこの蛍ルシフェラーゼ活性を計測及び記録した。次に、５０μｌ容量のＳｔ
ｏｐ＆Ｇｌｏ（商標）試薬を注入し、そしてウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ル
シフェラーゼ活性を記録した。この手順を各々の細胞ライセートに対して繰り返
した。

【０１５０】実施例５Ｃ−ＧＨ変異体のシグナル伝達活性のアッセイＨＫ２９３細胞クローンを我々のバイオアッセイにより研究するためのＧＨ変
異体に対する標的として選んだ。なぜならこの細胞はＧＨレセプターの高められ
た発現を示すからである。アッセイの２４時間前に、この細胞を２４ウェル・プ
レートに移し（１ウェル当たり１００，０００細胞）、次にＳＴＡＴ５−応答性
ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子構築物により同時形質移入し、そして形質移
入効率の是正を可能にするβ−Ｇａｌプラスミド（ＣＭＶプロモーター）を構成
的に発現した。一晩の形質移入の後、この細胞を洗浄し、そして既知の標準的な
範囲の濃度に希釈した変異体及び野生型ＧＨと一緒に６時間インキュベートした
。この間、ＧＨレセプターの活性化がＳＴＡＴ５活性化及びルシフェラーゼ発現
を引き起こす。よって、本アッセイにおけるルシフェラーゼの発現はＧＨレセプ
ター活性化の程度、すなわち細胞に適用されたＧＨの生物学的活性の計測を提供
する。６時間のインキュベーション期間の後、この細胞を溶解し、そして標準法
を用いてプレート・リーディング・ルミノメーターによりルシフェラーゼを計測
した（Molec Endocrin 11 265-73 (1997) 中Ross RJM et alの方法によるアッセ
イ；キットはPromega UK Ltdにより供給された）。

【０１５１】実施例５Ｄ−インビトロ・スプライシング・アッセイ適当なプライマーの５’末端に付加されたＫｐｎＩ（ＧＨ１Ｇ５）又はＸｈｏ
Ｉ（ＧＨ１Ｇ３）のいずれかに対する制限酵素認識部位を持つ１４６７bp断片を
増幅するために、以下の新しいオリゴヌクレオチド・プライマー：ＧＨ１Ｇ５（5' GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3'）；及びＧＨ１Ｇ３（5' CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3'）を用いてヒトＧＨ１遺伝子全体をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅条件は以下のとお
りであった：１０サイクルの９５℃４５秒間、５８℃４５秒間、６８℃２分間、
続いて２０サイクルの９５℃４５分間、６８℃２分間でサイクルおきに５秒追加
。

【０１５２】次に、増幅した断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを用いて消化し、そして
同じ制限酵素を用いて消化したプラスミド・ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Invitr
ogen）内にクローンした。エラーについて確認するために、一旦クローンした前
記断片を配列決定した。次に、組み換えプラスミドをラット下垂体前葉ＧＨ３細
胞内に形質移入した。形質移入に続き、細胞を２４時間放置した。次に、ＲＮＡ
ｚｏｌＢ（Biogenesis）を用いてＲＮＡを抽出した。

【０１５３】次に、このＲＮＡを、以下の新しいプライマー：ＢＧＨ３（5' TAGAAGGCACAGTCGAGG 3'）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（Life Technologies ）を用いて逆転写に使用し
た。５μｇの全ＲＮＡを１２μｌの終量中の５００ng ＢＧＨ３に添加し、そし
て７０℃で１５分間加熱した。次に、サンプルを氷上で冷却し、その後に４μｌ
の５×バッファー、２μｌの０．１ＭＤＴＴ及び１μｌの１０mMｄＮＴＰ’ｓの
添加が続いた。このサンプルを４２℃まで加熱し、２００Ｕ（１μｌ）のＳｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔIIを添加し、そしてこのサンプルをこの温度で５０分間放置し
た。次に、１５分間７０℃まで加熱することにより前記Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ
IIを不活化した。

【０１５４】次に、逆転写したＲＮＡをＰＣＲに使用した。以下のＰＣＲサイクル：１０サ
イクルの９５℃４５秒間、５８℃４５秒間、６８℃２分間、続いて２０サイクル
の９５℃４５秒間、５８℃４５秒間、６８℃２分間でサイクルおきに５秒追加を
用いた６５４bpの断片の増幅のために、以下の新しいオリゴヌクレオチド・プラ
イマー：ＧＨ１Ｒ５（5' ATGGCTACAGGCTCCCGG 3'）；及びＧＨ１Ｒ３（5' CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3'）を用いたＰＣＲ反応に４μｌの逆転写混合物を使用した。次にＰＣＲ産物を１．
５％アガロース・ゲルを用いて電気泳動し、精製し、そして配列決定した。

【０１５５】実施例６−ＧＨ１遺伝子変異型及び遺伝子多型これまで、本発明による選択特徴は、以下に示した異なるタイプの徴候の根拠
として、低身長症症の原因論に関与するＧＨ１遺伝子内の約５４の異なる、及び
新しい変異型（「突然変異」−表７Ｂ）の特徴づけ及び同定をもたらした。これ
らの新しい病変は、３１の異なるミスセンス変異、プロモーター／５’非翻訳領
域内の２１の異なる突然変異、並びに２のスプライス部位突然変異を含む。加え
て、我々は、ＧＨ遺伝子領域内に７１の遺伝子多型を検出した（表７Ａ）。

【０１５６】

【表１１】

【０１５７】

【表１２】

【０１５８】

【表１３】

【０１５９】表７Ｂにおいて、ヌクレオチドの番号付けは図５に示したＧＨ１標準配列に基
づき、ここでヒトＧＨ１コード領域の５のエクソンを大文字で示し；翻訳開始（
ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示し；ポリ（アデニル化）シグナル
を太字及び下線で示し；３’ＵＴＲ境界は第＋１６４２位であり；そして＋１＝
転写開始部位である。（遺伝子座制御領域を除く；図４を参照のこと）本明細書
中に関する全ての突然変異病変、遺伝子多型及びオリゴヌクレオチド・プライマ
ーの番号付けは、このＧＨ１標準配列に関連しうる。

【０１６０】

【表１４】

【０１６１】

【表１５】

【０１６２】

【表１６】

【０１６３】

【表１７】

【０１６４】

【表１８】

【０１６５】

【表１９】

【０１６６】

【表２０】

【０１６７】前記ＧＨ１標準配列はＣｈｅｎｅｔａｌ．（１９８９）由来であり、その
配列をＧｅｎｅｂａｎｋを通して入手した（受託番号：Ｊ０３０７１）。これま
で分析した６８の患者について、突然変異をそれらのうちの４７に発見した。検
出された全ての突然変異を、患者３０，３７，５０及び５２（ホモ接合性）、患
者３０，３１，４４，５０，５２，５５，５６，５７，６０，６６及び６７（ｔ
ｒａｎｓ型の同一でない病変に関する複合ヘテロ接合性）（すなわち異なる対立
遺伝子上）、並びにｃｉｓ型の２以上の突然変異を持つ患者、７，２３，３０，
３１，３２，３６，４７，４８，５０，５２及び７０（すなわち同じ対立遺伝子
上）を除くヘテロ接合性の状態で発見された。

【０１６８】（ａ）ミスセンス変異合計３１の新しい一塩基対置換が、コードされるアミノ酸の変更を与えるＧＨ１遺伝子のコード領域内に認められている。これらのミスセンス変異の病理学的
な関連の証拠は４の情報源によってもたらされる：（ｉ）対照集団の調査、（ii
）問題の残基のアミノ酸置換の性質及び進化上の保存の頻度、（iii ）分子モデ
リング、並びに（iv）それらのシグナル伝達活性のインビトロ・アッセイ。

【０１６９】（ｉ）対照のＧＨ１コード配列変異型の調査白人系の合計８０の健康な英国人の対照を、ＧＨ１遺伝子のコード領域内の変
異について選別した。１人の患者で発見されたサイレント置換５例を認めた（Ｇ
ＡＣ→ＧＡＴＡｓｐ２６で、ＴＣＧ→ＴＣＣＳｅｒ８５で、ＴＣＧ→ＴＣＡＳｅｒ８５で、ＡＣＧ→ＡＣＡＴｈｒ１２３で、及びＡＡＣ→ＡＡＴＡｓ
ｎ１０９で）。加えて、２のミスセンス変異を認め（ＡＡＣ→ＧＡＣ，Ａｓｎ４
７→Ａｓｐ；ＧＴＣ→ＡＴＣ，Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ４／１６０対立遺伝子）
；Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ置換だけが我々の患者調査において発見された（患者６
６名）。分子モデリングは、この置換がＧＨの構造に有害な影響を与えることを
示した；Ｖａｌ１１０は第３ヘリックスのＮ末端で疎水性コアの一部を形成し、
そして長い側鎖を持つＩｌｅによる置き換えが立体障害を引き起こす。よって、
Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ置換は対照及び患者集団の両方で比較的頻繁に発生してい
るにもかかわらず、それは成長に影響を及ぼすことができる可能性がある。それ
にもかかわらず、対照集団内のミスセンス変異の相対的な少なさは、患者集団内
で発見された病変の信頼性を支持して証明される。

【０１７０】（ii）関連の残基のアミノ酸置換の性質及び進化上の保存ミスセンス変異が臨床上の注目に達する可能性は、問題の遺伝子の配列構造、
アミノ酸置換の重要性、タンパク質分子内の置換された残基の正確な位置及び周
囲の環境、並びにそれがもたらすタンパク質の構造及び機能への影響を含む多く
の要因に依存する（Wacey et al Hum Genet 94 594-608 (1994))。検出されたミ
スセンス変異が病理学的に意味を持ちうるかどうか評価するために、その変更の
生物物理学的特性を個別に調査した（表７Ｃ）。ほどんどの場合、前記変更は置
換されたアミノ酸と著しく異なるアミノ酸の置換は保存されなかった、このため
それらは病理学的に意味があるという議論を支持する。

【０１７１】病理へのミスセンス変異の関与についての証拠は進化上の保存のデータからも
たらされうる。なぜなら、進化上で保存されたアミノ酸残基は生物学的機能を持
つ可能性があるからである。反対に、進化上で保存されなかった残基は機能的に
意味がある可能性が低い。それ故に、病理学的な病変は進化上で保存された残基
に生じる傾向があるのに対して中立多型又は希な変異体にはない（Wacey et al
、前記）。それ故に、ミスセンス変異に関与することが分かっているヒトＧＨ残
基を、１９の他の脊椎動物のオルソロガスなＧＨタンパク質配列との比較を通し
てその進化上の保存に関して調査した（表７Ｃ）。ミスセンス変異により影響を
受ける残基の大部分が高度に、ある時は厳密に保存されていることが分かり、改
めてこれらの病変が病理学的な意味を持つという見解を支持した。（表７Ｃが続く）

【０１７２】

【表２１】

【０１７３】

【表２２】

【０１７４】比較したオルソロガスなＧＨタンパク質（括弧内、％一致、％ヒトに対する保存的変更）マウス（６６，７７）、ラット（６４，７５）、ウサギ（６６，７７）、クジ
ラ、イヌ（６７，７８）、ブタ（６７，７８）、ヒツジ（６６，７６）、ウシ（
６６，７６）、シチメンチョウ（５５，７４）、ニワトリ（５６，７３）、アヒ
ル（５５，７２）、カメ、カエル（４５，６８）、サメ、タイ、メバル、サケ、
コイ（３８，５７）、キンギョ（３７，５７）。

【０１７５】（iii ）分子モデリングにより提示された場合に推定上の機能的重要性を有す
るミスセンス変異分子モデリング調査は、ミスセンス変異が、多くの場合ＧＨレセプターと相互
作用するか、又はＧＨ−ＧＨレセプター相互作用に影響するＧＨ分子の領域内に
位置することを示した。ヒト成長ホルモンのＸ線結晶学構造内の適当なアミノ酸
残基の簡単な置き換えによりミスセンス変異をモデル化した。次に、野生型及び
変異体「構造」を、静電的相互作用、水素結合、疎水的相互作用、及び表面露出
量に関して比較した。ミスセンス変異の大部分は機能的な混乱よりＧＨ分子の構
造的な歪みに起因するように思える。前述のアミノ酸置換は、分子の誤った折り
畳み又は不安定化を招く。しかしながら、以下の８のミスセンス変異は、単なる
構造的な重要性とは対照的に機能的重要性を持つアミノ酸置換に関する適当な候
補であるように思える：Ｉｌｅ４Ｖａｌ：Ｎ末端、第２部位内。アラニン走査突然変異誘発（ＡＳＭ）
がＩｌｅ４の置き換えがＧＨＲ二量体化に影響することを既に証明してる。

【０１７６】Ｇｌｎ２２Ａｒｇ：第１ヘリックス。Ａｒｇの導入はＡｓｐ２６との水素結合
の喪失をもたらす。それはヘリックスの同じ側への２の陽性荷電の導入をももた
らす。ヘリックス形成が不安定化するか又はＧＨＲのＡｒｇ２１７との好ましく
ない相互作用を生み出すであろう。

【０１７７】Ｌｙｓ４１Ａｒｇ：第１ループ。利用しやすいＬｙｓ４１解決法。オルソロガ
スな遺伝子は多くの場合相同的な位置にＡｒｇを持つ。Ｌｙｓ４１のＮξはＧＨ
残基Ｔｙｒ２８及びＧｌｕ３２と一緒に水素結合を形成し、そしてＧＨＲＧｌ
ｕ１２７Ｏε２とイオン的相互作用を示す。ＡＳＭによると、Ｌｙｓ４１はＧ
ＨＲ結合に関与する。Ａｒｇの導入は、おそらくＧＨＲに対するＧＨの親和性を
高めない。微妙な変更は病理学的に重要ではない。患者においては正常なＧＨレ
ベル。

【０１７８】Ｇｌｕ５６Ｇｌｙ：Ｇｌｕ５６は第１ヘリックスと第２ヘリックスの間の、か
つ、第１結合部位の一部を含むループ領域内に存在する。Ｇｌｕ５６はＧＨＲの
Ａｒｇ７１と相互作用する。Ｇｌｕ５６は、ＧＨ−ＧＨＲ複合体の結合エネルギ
ー・ホットスポットの一部を形成するＬｙｓ１６８と内部で相互作用しもする。

【０１７９】Ａｒｇ６４Ｇｌｙ：第２ループ。利用しやすいＡｒｇ６４解決法。Ａｒｇ又は
Ｌｙｓがこの位置に保存された。ＡＳＭによると、Ａｒｇ６４はＧＨＲ結合に関
与する。塩基性Ａｒｇ側鎖はＧＨＲＡｓｐ１６４と塩橋及び水素結合を形成す
る。Ａｒｇ６４はＧＨＲのＴｒｐ１６９と疎水的相互作用をも示す。Ｇｌｙによ
る置き換えはＧＨＲ結合を弱め、そして、ヘリックスを不安定にする。患者にお
いては正常なＧＨレベル。

【０１８０】Ｌｙｓ１６８Ａｒｇ：第４ヘリックス。ＧＨＲのＬｙｓ１６８とＴｒｐ１０４
の間で疎水的相互作用。予測される不都合な相互作用はない。患者においては正
常高値。

【０１８１】Ｌｙｓ１６８Ｇｌｕ：Ｌｙｓ１６８はＧＨＲのＴｒｐ１０４との大規模な疎水
的相互作用を示す。荷電は、好ましい分子内静電的相互作用の形成によりＧＨの
活性構造を安定化させる。Ｇｌｕによる置換は活性に重大な影響を与えない。

【０１８２】Ｔｈｒ１７５Ａｌａ：第４ヘリックス。ＡＳＭによると、Ｔｈｒ１７５はＧＨ
Ｒ結合に関与する；Ｔｈｒ１７５はＧＨのＡｓｐ１７１並びにＧＨＲのＴｒｐ１
６９及びＡｒｇ４３と水素結合を形成する。Ａｌａの導入はヘリックスを不安定
化し、それによりレセプター結合を減少させる。

【０１８３】前述のミスセンス変異は、−もし、本発明により適用された選択基準がなけれ
ば−知られることのなかった天然の成長ホルモン阻害剤の存在の徴候を提供した
かもしれない。

【０１８４】（iv）ＧＨ変異体のシグナル伝達活性アッセイＧＨ変異体のシグナル伝達活性（生物学的活性）をアッセイするために、ルシ
フェラーゼ・レポーター遺伝子アッセイ系（Molec Endocrin 11 265-73 (1997）
中Ross RJM et alの方法による）を使用した。生物学的に活性な成長ホルモンに
ついて、それを２のＧＨレセプターに結合させ、レセプターの二量体化を引き起
こす必要がある。次に、これがＪＡＫ２として知られる細胞内チロシン・キナー
ゼの活性化を引き起こす。今度はＪＡＫ２がリン酸化を行ない、そしてそれによ
り転写因子ＳＴＡＴ５を活性化する。リン酸化したＳＴＡＴ５は二量体化し、核
に移動し、そしてＳＴＡＴ５応答性プロモーターに結合し、それによりＧＨ応答
性遺伝子の発現を開始させる。我々が使用してきたＧＨの生物学的活性のアッセ
イは有効なこの経路の全ての段階を必要とする。いくつかの変異体、例えばＱ２
２Ｒ、Ｋ４１Ｒ、Ｗ８６Ｒ及びＳ１０８ＲがＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路
を活性化する劇的に低下した能力に関連することが表７Ｄから理解されうる。変
異体Ｅ３０Ｇ、患者６９は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する有
意に高められた能力を持ち、それにより、スーパー・アゴニスト（super-agonis
t)として作用する（データを図８に示した、ここでＲＬＵは相対的な光量単位（
Relative Light Units）を意味する）。

【０１８５】

【表２３】

【０１８６】結果は、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子アッセイにおいて１nMの用量で野
生型と比較した時の％活性として表した（１nM＝本アッセイにおいて約ＥＤ５０
の野生型ＧＨ）。ｐは、観察されたものと野生型に起こるものの間の違いが有意
であることの確率を示す。ＮＳは「有意でない」ことを示す。

【０１８７】１種類のミスセンス変異が、その内の３人が異なるハプロタイプ背景を有する
４人の非血縁患者に見られた。これはこの部位での反復突然変異（すなわち独立
した突然変異事件）に一致する。−１位でのＩＶＳ２Ｇ→Ａ転移の突然変異を
、８の明らかな非血縁患者における合計８の対立遺伝子中に見つけ出した；２の
別個のハプロタイプが明らかであるため、この病変の少なくとも２例は反復する
可能性があるが、その一方で、残りは家系で一致するであろう。プロモーター遺
伝子変換事件の３例がこの患者サンプルで記録されもした。さまざまな他の病変
の複数の例が記録されもした（Ａ→Ｇ−１７７（３）、Ａ→Ｇ−２４８（２）、
Ｌｅｕ−１１Ｐｒｏ（４）、Ｓｅｒ１０８Ａｒｇ（２）、Ｌｙｓ１６８Ｇｌｕ
（２）、Ｐｈｅ１７６Ｓｅｒ（２）、及びＬｅｕ１６３Ｐｒｏ（２））。合計で
、３２／７５（４３％）変異体対立遺伝子に対応する１０の反復突然変異が我々
の患者サンプル内に見つかった。これが、ＧＨ１遺伝子内の頻繁な病理学的病変
の素早い検出の可能性に関して大いに後押ししている。

【０１８８】（ｂ）プロモーター・ハプロタイプ我々の研究において、１５／１７のＧＨ１遺伝子プロモーター内の既知の多型
ヌクレオチドが変化することを発見した。これら１５の位置での異形を我々の患
者及び対照（１５７人の白人系の英陸軍新兵）の集団の合計４０の異なるハプロ
タイプに割り当てた。これらのハプロタイプは、０．３３９（ハプロタイプ１）
〜、〜０．００３３（ハプロタイプ２５〜３６）、〜０（ハプロタイプ３７〜４
０、それらは患者集団に見られ対照集団には見られず患者特異的であった）の頻
度（表７Ｆ）で変化した。

【０１８９】我々は、これらのプロモーター・ハプロタイプがレポーター遺伝子アッセイに
おけるルシフェラーゼ遺伝子発現を促進するそれらの能力に関して違いがあるこ
とを発見した。４０のハプロタイプの内の２７がこれまでにラット下垂体ＧＨ３
細胞を用いて研究されている。各ハプロタイプについて、６の反復を３の異なる
実験において実施した（すなわち合計１８の反復）。ルシフェラーゼ・レポータ
ー遺伝子発現の有意に減少したレベル（最も一般的なハプロタイプ（ｎｏ．１）
のそれの＜６２％）に関係する（そして、それ故にインビボにおけるＧＨ１遺伝
子発現の減少したレベルに関係する）それらのハプロタイプを、我々の患者及び
対照集団内のそれらの個別の頻度と一緒に表７Ｅに一覧する。

【０１９０】これらの発見は、〜１５％の正常集団中の個体が、（少なくともインビトロに
おいて）大部分の一般的なハプロタイプの所持に関係するよりも低いＧＨ合成の
レベル＞４０％に関係するＧＨ１プロモーター・ハプロタイプに関してヘテロ接
合体でありうることを示唆している。さらに、正常集団の約２％が、２の前述の
低発現ハプロタイプを所持し（一致か又は不一致のいずれか）、そして直接的な
結果として、平均ＧＨレベルよりも有意な低値を示しうる。インビトロにおける
研究がこの主張を支持した場合、次に、診断上のスクリーニング法は、突然変異
検出と同様にプロモーター・ハプロタイプ検出を組み込むべきである。

【０１９１】

【表２４】

【０１９２】

【表２５】

【０１９３】

【表２６】

【０１９４】（ｃ）プロモーター突然変異さまざまな新しいプロモーター突然変異（１８の一塩基対置換、２の微小欠失
、及び１の広範な遺伝子変換事件）を我々の患者集団において検出した。これら
の病変の信頼性に関する証拠を以下の方法により捜した：（ｉ）健康な対照にお
けるＧＨ１プロモーター領域の研究、（ii）哺乳動物の種の違いに影響されたそ
のヌクレオチドの進化上の保存の程度の研究、並びに（iii ）ルシフェラーゼ・
レポーター遺伝子アッセイを用いたインビトロにおけるＧＨ１プロモーター機能
へのそれらの効果の測定。

【０１９５】（ｉ）対照におけるＧＨ１プロモーター変異型ＧＨ１プロモーター領域を、１５７人の白人系の健康な英国人対照において突
然変異について選別した。患者サンプルで発見された突然変異に対応することが
指摘された唯一の配列変更は−４８でのＧ→Ａ変換であり、それは２人に検出さ
れた。前記対照サンプルに特異的な３のさらなる置換を１人に発見した（＋６２Ａ→Ｇ、−１２３Ｔ→Ｃ、及び−３７３Ｇ→Ａ）。最後に、遺伝子変換事
件（最小−５７〜−３１、最大−１６８〜−６）を１人に認め、これも対照サン
プル特有であった。よって、患者よりもずっと少ない変更が患者において検出さ
れ、所見は病理的に意味のある患者の突然変異に一致した。

【０１９６】（ii）進化上の保存ＧＨ１遺伝子の転写開始部位の１３０bp上流に対応するＤＮＡ配列を１０の哺
乳動物種から入手した。確認が可能であった場合には、患者において突然変異し
ていることが発見されたヌクレオチドは、７／１０ケースで進化上保存されてい
た（＋３１Ｔ→Ｃ、−１８Ｃ→Ｔ、−２４Ａ→Ｇ、−３０Ｔ→Ｃ、Δ５
Ｇ −５７〜−６１、ΔＧ −５７〜−６１、及び−１０８Ｃ→Ｔ）。この発
見は、我々の患者集団において突然変異していることが発見されたヌクレオチド
の機能的重要性と一致する。

【０１９７】（iii ）ＧＨ１プロモーター突然変異のルシフェラーゼ・リポーター遺伝子分
析さまざまな推定プロモーター突然変異を、レポーター遺伝子アッセイにおける
ルシフェラーゼ遺伝子発現を促進するそれらの能力について比較した（表７Ｇ）
。各ハプロタイプについて、ラット下垂体ＧＨ３細胞及びヒトＨｅＬａ細胞の両
者において、６の反復を３の異なる実験で実施した（すなわち合計１８の反復）
。正常な発現レベルよりも有意な低値を、ＨｅＬａ細胞におけるＴ→Ｃ−３０変
換及びΔ５Ｇ −５７〜−６１欠失について認めた（傾向はＧＨ３細胞において
認められもした）。よって、レポーター遺伝子発現アッセイはこれら２の病変の
病理学的関与を支持した。

【０１９８】

【表２７】

【０１９９】（ｄ）ｍＲＮＡスプライシングに影響を与える突然変異スプライス部位内に２の新しい変異型、１つは第３エクソンの供与体スプライ
ス部位内のＴ→Ｃ変換、他方は第２エクソンのアクセプター・スプライス部位の
絶対ＡＧジヌクレオチド内の一般的な一塩基対変異を認めた。後者の突然変異は
インビトロ・スプライシング・アッセイの手法によりさらに特徴づけられる；そ
の病原性の根拠は、アッセイ条件下で、それがＧＨ１ｍＲＮＡ転写産物からの
第３エクソンの「読み飛ばし」（除外）を生じることの観察によってもたらされ
る。

【０２００】（ｅ）ヒトＧＨ１遺伝子における遺伝子多型一連の我々の研究の間に、約７１の異なる推定多型をＧＨ１遺伝子のエクソン
、イントロン又は３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）内に同定した。大部分は１度だ
け発生し、かつ、希な変異型でありうる。Ｈａｓｅｇａｗａｅｔａｌ（前記
）により報告されたＩＶＳ４Ｔ→Ａ１１６９多型を除く全てが新規である。
ＩＶＳ１〜４はイントロンの位置を意味する。

【０２０１】（ｆ）遺伝子座制御領域の遺伝子多型合計１１の推定遺伝子多型を遺伝子座制御領域内に発見した。これらは、１５
４Ｇ→Ａ、１５４Ｇ→Ｃ、４５７Ｇ→Ａ、５０５Ｇ→Ｔ、５０７Ｔ→
Ｇ、６６１Ｃ→Ｔ、１０５５Ｃ→Ｔ、１４２９Ｃ→Ｇ、１５６８Ｔ→Ｇ
、１６１５−１６２０ ΔＧＧＴＧＧＴ、及び１９３４Ｔ→Ｃであった。番号
付けは図４の標準配列に従う。まとめて考えると、対立遺伝子頻度における有意
な違いは患者群と対照群の間で認められなかった。しかしながら、５０５Ｇ→
Ｔ、１０５５Ｃ→Ｔ及び１９３４Ｔ→Ｃ置換は患者特有であり、それ故に、
これらの個体のＧＨ１遺伝子発現に影響を及ぼしうる。

【手続補正書】

【提出日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】から選ばれる１以上のプライマーの使用をさらに含む、請求項１〜１２のいずれ
か１項に記載の検出方法。

【表１】の、表７Ｂ中の「成長ホルモン欠損症；ＧＨ１遺伝子遺伝子突然変異及び多型」
の中の患者番号１０、１２、２０、３０、３２、３３、３６、３７、５０、５３
、６２、６３、及び６６に規定されるものから選ばれるか又はそれをコードするＧＨ１変異型。

【化２】から選ばれる、ヒトＧＨ変異体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/61 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/61 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プロクター，アニーマリーイギリス国，カーディフシーエフ14 ４エックスエヌ，ヒースパーク，ユニバーシティオブウェールズカレッジオブメディスン，デパートメントオブメディカルジェネティクス (72)発明者グレゴリー，ジョンイギリス国，カーディフシーエフ14 ４エックスエヌ，ヒースパーク，ユニバーシティオブウェールズカレッジオブメディスン，デパートメントオブメディカルジェネティクス (72)発明者ミラー，デービッドスチュアートイギリス国，カーディフシーエフ14 ４エックスエヌ，ヒースパーク，ユニバーシティオブウェールズカレッジオブメディスン，デパートメントオブメディカルジェネティクスＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA03 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA07 QA12 QA17 QA19 QQ45 QR32 QR36 QR55 QS25 QS33 QS34 4B064 AG13 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA702 ZB322 ZC022 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA31 EA27 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】個体のＧＨ機能不全の指標として作用するために有効なＧＨ１の異形の検出方法であって、以下のステップ：（ａ）上記個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプル
を得；そして（ｂ）上記試験サンプルから得た配列を、ヒトＧＨ１遺伝子の標準配列として
知られる配列と比較する、ここで上記試験配列と標準配列の違いは、ＧＨ機能不
全の指標として作用するために有効な異形（以下「ＧＨ１変異型」）の存在を示
す、を含み、ここで上記試験サンプルは、以下の基準：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762 (19
70 )）上にプロットした時、上記個体の推定目標成人身長範囲の外側にある上記
個体の成人身長が予測する（一連の身長測定により画される；Brook CDG (Ed) C
linical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwel
l Science)）成長パターンと定義される成長不足（ここで、上記推定は上記個体
の両親の身長に基づく）を示す個体から得られる、上記方法。
【請求項２】前記試験サンプルが、以下のさらなる基準：（ii）年齢に対して２５％未満の患者の身長伸長速度；及び／又は（iii ）暦年齢と比較したときに、Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ等級
に従う少なくとも２歳の骨年齢遅延；及び／又は（iv）前記基準（ｉ）〜（iii ）への包含を引き起こすことが知られる他の障
害の不存在、の少なくとも１を示す個体から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記骨年齢遅延が、暦年齢と比較したとき、２〜４歳の範囲
内にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記個体が、標準的な成長ホルモン機能試験において正常な
結果を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記検出方法が、個体のＧＨ１遺伝子の配列を決定するため
のいずれかの配列決定法を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】前記検出方法が、（ａ）その配列がＧＨ群内の４の他のパラ
ロガス（非ＧＨ１）遺伝子内に存在しないＧＨ１遺伝子にユニークな、ＧＨ１遺
伝子特異的断片、及び（ｂ）ＧＨ群内の上記４の他のパラロガス（非ＧＨ１）遺
伝子内のホモロガス・フランキング領域に結合しえない１以上のＧＨ１遺伝子特
異的プライマー、を用いた上記個体のＧＨ１遺伝子のＰＣＲ増幅を含む、請求項
１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記検出方法が、前記個体のＧＨ１遺伝子全体のＰＣＲ増幅
、及び前記個体のＧＨ１遺伝子の重複構成断片のｎｅｓｔｅｄＰＣＲを含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】前記検出方法が、前記ＧＨ１遺伝子の遺伝子座制御領域にわ
たるゲノムＤＮＡの全体又は断片のＰＣＲ増幅を含む、請求項１〜７のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項９】前記検出方法が、ＤＨＰＬＣによる前記個体のＧＨ１遺伝子
の全体又は断片の突然変異スクリーニングを含む、請求項１〜８のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項１０】個体のＧＨ機能不全の指標として作用するために有効なＧＨ１の異形の検出のための検出方法であって、以下のステップ：（ａ）上記個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプル
を得、そして（ｂ）上記試験サンプルから得た配列を、ヒトＧＨ１遺伝子の標準配列として
知られる標準配列と比較する、ここで上記試験配列と標準配列の違いは、ＧＨ機
能不全の指標として作用するために有効な異型（以下「ＧＨ１変異型」）の存在
を示す、を含み、さらに以下の（ｃ）（Ａ）その配列がＧＨ群内の４の他のパラロガス（非ＧＨ１）遺伝子内
に存在しないＧＨ１遺伝子にユニークなＧＨ１遺伝子特異的断片、及び（Ｂ）Ｇ
Ｈ群内の上記４の他のパラロガス（非ＧＨ１）遺伝子内のホモロガス・フランキ
ング領域に結合しえない１以上のＧＨ１遺伝子特異的プライマー、を用いた上記
個体のＧＨ１遺伝子のＰＣＲ増幅、を含む上記方法。
【請求項１１】前記検出方法が以下の：【化１】から選ばれる１以上のプライマーの使用をさらに含む、請求項１〜１０のいずれ
か１項に記載の検出方法。
【請求項１２】ＧＨ１と異なり、かつ、請求項１〜１１のいずれか１項に
記載の方法により検出されるか又は検出されることができるが、しかしこれまで
使用された方法、例えば絶対身長に主に基づく患者の選択基準に依存する方法に
よっては検出できなかった、ＧＨ１変異型。
【請求項１３】表７Ｂ中の「成長ホルモン欠損症；ＧＨ１遺伝子突然変異
及び多型」において未刊行であるとして特徴づけられるものから選ばれるＧＨ１変異型。
【請求項１４】ミスセンス変異を含む、請求項１２又は１３に記載のＧＨ１変異型。
【請求項１５】シグナル・ペプチドの活性に影響を及ぼすサイレント変異
を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型。
【請求項１６】以下の：【表１】のＧＨ１プロモーター突然変異の中の１以上を含むＧＨ１変異型。
【請求項１７】請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型に
よりコードされたタンパク質又はアミノ酸配列。
【請求項１８】その変異が、野生型／ＧＨに対して以下のアミノ酸置換：【化２】から選ばれる、ヒトＧＨ変異体。
【請求項１９】野生型ｈＧＨに対して規定される、以下の（括弧内はｈＧ
Ｈ上の遺伝子座）：【化３】の中の１以上から選ばれる、ヒトＧＨ変異体。
【請求項２０】その変異が野生型ｈＧＨに対して以下のアミノ酸置換：Ｇｌｕ→Ｇｌｙ３０（図７、配列番号．．）を含む、ヒトＧＨ変異体。
【請求項２１】ＧＨ機能不全の疑われる個体の選別のためのスクリーニン
グ方法であって、以下のステップ：（ａ）上記個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験サンプル
を得；そして（ｂ）上記試験サンプルから得られた配列の領域を所定の配列の対応の領域と
比較する、を含み、ここで上記所定の配列が請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型から選ばれる上記方法。
【請求項２２】前記試験サンプルがゲノムＤＮＡを含む、請求項２１に記
載のスクリーニング方法。
【請求項２３】ＧＨ機能不全の疑われる個体の選別のためのスクリーニン
グ方法であって、以下のステップ：（ａ）上記個体からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列又はそれによりコー
ドされるアミノ酸配列を含む試験サンプルを得；そして（ｂ）ＧＨ１変異型又はＧＨ変異体の存在について、あるいは、ＧＨ１変異型
又はＧＨ変異体の存在を示すか又は関係する１以上の代替マーカーの存在につい
て試験サンプルを分析する、を含み、ここで上記ＧＨ１変異型又はＧＨ変異体が、野生型ｈＧＨ配列と比較し
た場合に少なくとも１の異形を示し、そして以下の基準：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762 (19
70 )）上にプロットした時、上記個体の推定目標成人身長範囲の外側にある上記
個体の成人身長が予測する（一連の身長測定により画される；Brook CDG (Ed) C
linical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwel
l Science)）成長パターンと定義される成長不足（ここで、上記推定は上記個体
の両親の身長に基づく）を示す個体由来の第２の試験サンプルから得られる、上
記方法。
【請求項２４】以下のステップ：（ａ）個体から第１の試験サンプルを得；そして（ｂ）上記第１の試験サンプル中のＧＨ１遺伝子又はＧＨ１転写物、あるいは
それらからの断片（例えばｃＤＮＡ）を以下の基準：（ｉ）標準的な身長チャート（Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762 (19
70 )）上にプロットした時、上記個体の推定目標成人身長範囲の外側にある上記
個体の成人身長が予測する（一連の身長測定により画される；Brook CDG (Ed) C
linical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141 (1995, Blackwel
l Science)）成長パターンと定義される成長不足（ここで、上記推定は上記個体
の両親の身長に基づく）を示す個体由来の第２の試験サンプルから得られるＧＨ１変異型の対応の遺伝子、転写物又は断片と比較する、を含む請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】前記第２の試験サンプルを少なくとも１の以下のさらなる
基準：（ii）年齢に対して２５％未満の患者の身長伸長速度；及び／又は（iii ）暦年齢と比較したときに、Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ等級
に従う少なくとも２歳の骨年齢遅延；及び／又は（iv）前記基準（ｉ）〜（iii ）への包含を引き起こすことが知られる他の障
害の不存在、を示す個体から得ることができる、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】複数の既知の突然変異か又は全ての見込まれる突然変異の
いずれかに関してＤＮＡ（個体由来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）の標識サンプ
ルの固形支持体に固定した突然変異特異的オリゴヌクレオチド・プローブのマイ
クロ・アレイへのハイブリダイゼーションにより同時スクリーンを使用する、請
求項２１〜２５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】チップ技術が使用され、ここで上記チップが小型並列分析
デバイスである、請求項２６に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】以下の：（ａ）その領域が対応の野生型ｈＧＨ遺伝子配列からの少なくとも１の異形を
組み込むＧＨ１変異型の対応の領域の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；及
び／又は（ｂ）（ａ）に定められている領域内の野生型ｈＧＨ遺伝子配列に対応する核
酸配列を有するオリゴヌクレオチド；そして場合により（ｃ）上記個体のＤＮＡの所望の領域を増幅するためのＰＣＲを実施するため
に好適な１以上の試薬、を含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法の実施へ
の使用に好適なキット。
【請求項２９】前記ＧＨ１変異型が、請求項１２〜１６のいずれか１項に
記載の変異型の少なくとも１を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】キット部品（ａ）が、固形支持体上に固定された複数個の
前記オリゴヌクレオチドを含む、請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３１】前記変異型が、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の
変異型の少なくとも１である検出方法の実施への使用に好適なキット。
【請求項３２】ＧＨ機能不全の疑いのある個体の選別のためのスクリーニ
ング方法であって、以下のステップ：（ａ）上記個体のヒトＧＨ１遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を含む試
験サンプルを得；そして（ｂ）上記試験サンプルをＧＨ変異体の存在について分析する、を含み、ここで上記ＧＨ変異体が請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のもの
から選ばれる上記方法。
【請求項３３】前記分析ステップ（ｂ）が、従来のタンパク質配列決定法
（例えば質量分析、マイクロ・アレイ分析、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等）及び／又は抗体ベースの検出法（例えばＥＬＩＳＡ
）の１以上から選ばれる、請求項３２に記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】以下の：（ａ）請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型を含むか又は請
求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＧＨ変異体をコードする配列、（ｂ）上記配列（ａ）に実質的に相同であるか又はストリンジェント条件下で
上記配列（ａ）にハイブリダイズする配列；又は（ｃ）遺伝子コドンの縮重に関する配列以外の、上記配列（ａ）又は（ｂ）に
実質的に相同であるか又はストリンジェント条件下で上記配列（ａ）又は（ｂ）
にハイブリダイズする配列；あるいは（ｄ）上記配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかに特異的なオリゴヌクレ
オチド、から選ばれる単離された精製又は組み換え核酸配列。
【請求項３５】請求項３４に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項３６】請求項３５に記載のベクターを含む、例えば細菌宿主細胞
であるところの宿主細胞。
【請求項３７】以下の：（ｉ）請求項３６に記載の宿主細胞を培養し、そして（ii）それにより産生されたＧＨ１変異型を上記培地から回収する、工程を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型の作製方法
。
【請求項３８】請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の配列、ベクター
又は細胞によりコードされるか、あるいは培地中に発現されるアミノ酸配列。
【請求項３９】そのための医薬として許容される担体に結合した、それぞ
れ請求項１２〜１６又は１７〜２０に記載のＧＨ１変異型又はＧＨ変異体を含む
組成物。
【請求項４０】治療、診断又は検出方法のための、それぞれ請求項１２〜
１６又は１７〜２０に記載のＧＨ１変異型又はＧＨ変異体の使用。
【請求項４１】以下の、結合異常の判定；下垂体記憶異常の判定；疾患、
例えば糖尿病、肥満症又は感染症に対する感受性の判定；乳腺刺激、糖尿病誘発
、脂肪分解及びタンパク質同化作用に関係する末端肥大症又は巨人症の症状の治
療；ナトリウム及び水の維持に関する調整；代謝症候群；気分及び睡眠障害；並
びにＧＨ機能不全の診断の１以上から選ばれる、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】遺伝子治療における請求項１２〜１６のいずれか１項に記
載の変異型の１以上の請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】タンパク質治療における請求項１７〜２０のいずれか１項
に記載の変異体の１以上の請求項４０に記載の使用。
【請求項４４】薬剤、診断組成物又はキット、あるいは検出キットの製造
への、それぞれ請求項１２〜１６又は１７〜２０のいずれか１項に記載のＧＨ１変異型又はＧＨ変異体の使用。