JP2003530092A - Human FAP-α-specific antibody - Google Patents

Human FAP-α-specific antibody

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質α(FAPα)に特異的に結合する抗体タンパク質に関する。本発明は更に、診断及び治療目的での該抗体の使用、更には該抗体の調製法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to an antibody protein that specifically binds to fibroblast activation protein α (FAPα). The invention further relates to the use of said antibodies for diagnostic and therapeutic purposes, as well as to methods for preparing said antibodies.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質α(FAPα)と特異的に結合する抗体タ
ンパク質に関する。本発明は更に、診断及び治療目的での該抗体の使用に加え、
該抗体調製法に関する。[0001] The present invention relates to an antibody protein that specifically binds to fibroblast activation protein α (FAPα). The invention further provides for the use of said antibody for diagnostic and therapeutic purposes,
It relates to the antibody preparation method.

【０００２】 （発明の背景） 上皮細胞癌の塊状増殖は、周囲のストローマ細胞の多くの特徴的細胞及び分子
の変化に関連している。多種の上皮細胞癌の反応性ストローマの高度に一貫した
特徴のひとつは、当初モノクローナル抗体F19として同定された、反応性ストロ
ーマの繊維芽細胞の細胞表面分子である、繊維芽細胞活性化タンパク質α(以後
、FAPα又はFAPと称す)の誘導である(Garin-Chesa P.、Old L.J.及びRettig W.J
.、Proc Natl. Acad. Sci. 87: 7235(1990))。FAPは多くの上皮細胞癌腫のスト
ローマにおいて選択的に発現されるので、この癌腫の部位及び組織学的種類とは
かかわりなく、上皮細胞癌及び他の多くの症候群の造影法、診断及び治療を可能
にするためにFAPα標的分子に関する治療概念を開発することが望まれた。この
目的のために、FAPに特異的に結合するF19と称されるマウスのモノクローナル抗
体が開発された。この抗体は、米国特許第5,059,523号及び国際公開公報第93/05
804号に開示されており、これらはその全体が本願明細書に参照として組入れら
れている。ヒトにおけるin vivo用途で非-ヒト抗体を使用する場合には、重大な
問題が生じ、すなわちこれらは外来抗原に対して迅速に免疫応答を誘起する。最
悪の場合、このような使用された抗体に対する免疫応答は、アナフィラキシーシ
ョックの引き金となることがある。これは、患者における該抗体の効能を劇的に
低下し、かつ更なる使用に対する有害作用を有するかもしくは更なる使用を不可
能にする。BACKGROUND OF THE INVENTION Bulk growth of epithelial cell carcinoma is associated with many characteristic cellular and molecular alterations of the surrounding stromal cells. One of the highly consistent features of reactive stroma of various epithelial cell carcinomas is the cell surface molecule of reactive stromal fibroblasts, originally identified as monoclonal antibody F19, fibroblast activating protein α ( (Hereinafter referred to as FAPα or FAP) (Garin-Chesa P., Old LJ and Rettig WJ
., Proc Natl. Acad. Sci. 87: 7235 (1990)). FAP is selectively expressed in the stroma of many epithelial cell carcinomas, allowing imaging, diagnosis and treatment of epithelial cell carcinoma and many other syndromes, regardless of the site and histological type of the carcinoma In order to achieve this, it was desired to develop a therapeutic concept for the FAPα target molecule. To this end, a mouse monoclonal antibody designated F19 has been developed that specifically binds to FAP. This antibody is described in US Pat. No. 5,059,523 and WO 93/05.
No. 804, which is incorporated herein by reference in its entirety. The use of non-human antibodies for in vivo applications in humans poses a significant problem, ie they elicit a rapid immune response against foreign antigens. In the worst case, such an immune response against the used antibody may trigger an anaphylactic shock. This dramatically reduces the efficacy of the antibody in patients and has a deleterious effect on further use or renders further use impossible.

【０００３】 非-ヒト抗体のヒト化は、通常2種の方法のうちのひとつにより実行される： (1)非-ヒト可変領域がヒト定常領域に結合されているような非-ヒト/ヒトキメラ
抗体の構築による(Boulianne G.L.、Hozumi N.及びShulman, M.J.、 Nature、31
2: 643(1984))、又は (2)ヒト可変領域内の相補性決定領域(CDR)の、非-ヒト可変領域のそれとの交換
、その後の新たに形成されたヒト化された可変領域のヒト定常領域との結合によ
る(Riechmann L.、Clark M.、Waldmann H.及びWinter G.、Nature、332: 323 (1
988))。Humanization of non-human antibodies is usually performed by one of two methods: (1) a non-human / human chimera in which the non-human variable region is linked to a human constant region. By antibody construction (Boulianne GL, Hozumi N. and Shulman, MJ, Nature, 31
2: 643 (1984)), or (2) the complementarity determining region (CDR) within the human variable region, exchanged for that of the non-human variable region, followed by the newly formed humanized variable region. By binding to human constant regions (Riechmann L., Clark M., Waldmann H. and Winter G., Nature, 332: 323 (1
988)).

【０００４】 キメラ抗体は、非-ヒト抗体よりも少ない外来タンパク質配列からなり、その
結果、より少ない異種抗原能を有する。しかしながら、この種のキメラ抗体は、
ヒトにおける非-ヒトV-領域に対する免疫反応の引き金となり得る(LoBuglio A.F
.、Wheeler R.H.、Trang J.、Haynes A.、Roger K.、Harvey E.B.、Sun L.、Ghr
ayeb J.及びKhazaeli M.B.、Proc.Natl.Acad.Sci.、86: 4220(1989))。CDRが伝
達された又は新たに形成されたヒト化された抗体は、広く認められたこととして
、V-領域により少ない外来タンパク質配列を含むが、これらのヒト化された抗体
は依然、ヒトにおける免疫応答の引き金となることが可能である。国際公開公報
第99/57151 A2号は、ヒト化が対応するF19マウス抗体からの6種全てのCDR領域(3
種は軽鎖、3種は重鎖)の移動(transfer)により実現されるようなこの種のFAPα-
特異性ヒト化抗体を開示している。これらの抗体は依然、マウスのフレームワー
ク領域の一部を含んでいる。 本発明の課題は、先行技術の前述の欠点を克服するような、改善されたFAPα-
特異抗体を提供することである。Chimeric antibodies consist of less foreign protein sequences than non-human antibodies and, as a result, have less heterologous antigenic potency. However, this type of chimeric antibody
Can trigger an immune response in humans to non-human V-regions (LoBuglio AF
., Wheeler RH, Trang J., Haynes A., Roger K., Harvey EB, Sun L., Ghr
ayeb J. and Khazaeli MB, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4220 (1989)). CDR-transduced or newly formed humanized antibodies, which are widely accepted, contain fewer foreign protein sequences in the V-region, although these humanized antibodies are still immunogenic in humans. It is possible to trigger a response. WO 99/57151 A2 shows that all six CDR regions (3
FAPα-of this species as realized by the transfer of a light chain and three heavy chains.
Disclosed are specific humanized antibodies. These antibodies still contain part of the mouse framework regions. The object of the present invention is to provide an improved FAPα-, which overcomes the aforementioned drawbacks of the prior art.
It is to provide a specific antibody.

【０００５】 （発明の説明） この課題は、本発明の「特許請求の範囲」及び明細書の範囲内で解決されてい
る。 「特許請求の範囲」又は明細書における単数形又は複数形の使用は、限定を意
図する意味は全くなく、かつその他の形も含むものである。DESCRIPTION OF THE INVENTION This problem has been solved within the scope of the claims and the description of the invention. Use of the singular or plural in the claims or in the specification is in no way meant to be limiting, and also includes the other forms.

【０００６】 本発明は、繊維芽細胞活性化タンパク質α(FAPα)に特異的に結合する新規の
ヒト又はヒト化抗体タンパク質に関し、かつこれは完全にヒトであるかもしくは
モノクローナル抗体F19(ATCC寄託番号HB 8269)の1個を超えないマウスの相補性
決定領域(CDR領域)を含むかのいずれかである。本発明の抗体は、顕著に低下さ
れた異種抗原能を有し、その結果先行技術において公知の抗体よりもヒトにおけ
る使用により適しているという驚く程有利な特性を有する(下記、本発明の方法
の説明も参照のこと)。本発明の抗体は有利なことに、マウスのアミノ酸配列を
含まないか、もしくはごくわずかな部分を有し、すなわち、多くとも1個のCDR領
域である。同じく本発明の抗体の可変領域のフレームワーク領域(FR)は、全体が
ヒトアミノ酸配列に相当している。わずかなマウスの成分にもかかわらず、本発
明の抗体は、しかしながら標的抗原FAPに対し驚く程高い特異性がある。The present invention relates to a novel human or humanized antibody protein that specifically binds to fibroblast activating protein alpha (FAPα), which is either fully human or monoclonal antibody F19 (ATCC Deposit No. HB 8269) or a mouse complementarity determining region (CDR region) that does not exceed one. The antibodies of the present invention have the surprisingly advantageous property of having significantly reduced heterologous antigenic potency and, as a result, are more suitable for use in humans than the antibodies known in the prior art (below, the method of the present invention. (See also the explanation of). The antibodies of the present invention advantageously do not contain or have a minor portion of the mouse amino acid sequence, ie at most one CDR region. Similarly, the entire framework region (FR) of the variable region of the antibody of the present invention corresponds to the human amino acid sequence. Despite the few mouse components, the antibodies of the invention are surprisingly highly specific for the target antigen FAP.

【０００７】 本発明の範囲内において、用語「抗体」は、本願明細書において説明された1
種以上のポリペプチド(複数)を意味する。これは更に、断片、対立遺伝子変異体
、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、本発明の抗体タンパク質との
融合タンパク質、本発明の抗体タンパク質のキメラ誘導体又はグリコシル化変異
体から選択されたヒト抗体タンパク質も含む。 先行技術において公知の調製法は、本発明のヒト抗体を得るためには適してい
ない。下記の実施例においてより完全に説明及び例証されるような本発明の方法
により、低下された異種抗原性を有する本発明のヒト又はヒト化抗体を得ること
が可能である。好ましい本発明の調製法において、例えば、下記の工程が実行さ
れる：Within the scope of the present invention, the term “antibody” refers to 1 as described herein.
By more than one polypeptide is meant. It is further derived from fragments, allelic variants, functional variants, variants based on the degenerate nucleic acid code, fusion proteins with the antibody proteins of the invention, chimeric derivatives or glycosylation variants of the antibody proteins of the invention. Also included are selected human antibody proteins. The preparation methods known in the prior art are not suitable for obtaining the human antibodies of the invention. By the methods of the present invention as more fully described and illustrated in the Examples below, it is possible to obtain human or humanized antibodies of the present invention having reduced xenoantigenicity. In the preferred preparation method of the present invention, for example, the following steps are carried out:

【０００８】1)ヒトVL-及びVH-レパートリーのPCR増幅 ： a)VH及びVLレパートリーを調製するために、様々なV-遺伝子ファミリーが、cDNA
から、PCRにより、各ファミリーに特異的なプライマーを用い、個別に増幅され
る(実施例1参照)。 b)VH-及びVL-PCR増幅のための全てのForward/3'-プライマーは、定常免疫グロブ
リンドメイン(IgG、IgD、IgM、κ、λ)の遺伝子配列に対し相補性がある。これ
は、ごくわずかな3'-プライマーによるV領域の効率的アイソタイプ-特異的増幅
を可能にする。対照的に、先行技術において公知の方法では、V領域のJ-セクシ
ョンに相補的な複数の異なる3'-プライマーが使用される(Marksら、J. Mol. Bio
l.、222:581(1991))。 1) PCR amplification of human VL- and VH-repertoires : a) For the preparation of VH and VL repertoires, various V-gene families have cDNAs.
From the above, PCR is performed to individually amplify using a primer specific to each family (see Example 1). b) All Forward / 3'-primers for VH- and VL-PCR amplifications are complementary to the gene sequences of the constant immunoglobulin domain (IgG, IgD, IgM, kappa, lambda). This allows efficient isotype-specific amplification of the V region with very few 3'-primers. In contrast, methods known in the prior art use multiple different 3'-primers complementary to the J-section of the V region (Marks et al., J. Mol. Bio
L., 222: 581 (1991)).

【０００９】2)ヒトVH-レパートリーの調製及びクローニング ： 先行技術において、現在まで、ある種のリンパ系組織のみが、Vレパートリー
の給源として、ごくわずかな異なるドナーにより説明されている(例えば、Vaugh
anら、Nature Biotechnology、14:309(1996))。本発明の抗体調製の基本として
高度の多様性を伴う多数のクローンからなるヒトV-レパートリーを得るために(
詳細については実施例1参照)、なるかに多い様々なドナーが使用され、すなわち
、先行技術において推奨されるものよりも約10倍多くが、明確でない方法で、問
題のリンパ系器官についてのみならず、胎児肝及び胸腺についてもVレパートリ
ーの給源として使用される。更に、大きいレパートリー多様性を達成するために
、IgM及びIgGレパートリーに加え、IgDレパートリーも増幅される(実施例1参照)
。 2) Preparation and cloning of the human VH-repertoire : In the prior art, to date only certain lymphoid tissues have been described as sources of the V repertoire by very few different donors (eg Vaugh.
an et al., Nature Biotechnology, 14: 309 (1996)). To obtain a human V-repertoire consisting of a large number of clones with a high degree of diversity as the basis of antibody preparation of the present invention (
(See Example 1 for details), more or less different donors are used, i.e. about 10 times more than recommended in the prior art, but in an unclear way, only for the lymphoid organ in question. However, it is also used as a source of V repertoire for fetal liver and thymus. Furthermore, in addition to the IgM and IgG repertoires, the IgD repertoire is also amplified to achieve large repertoire diversity (see Example 1).
.

【００１０】3) ヒトVHレパートリー及び様々なヒトFAP-特異性VL領域からなる組合せレパー
トリーの調製 ： 本発明の抗体を得るために、例えばモノクローナル性FAP-特異性マウス抗体F1
9由来の公知のVH領域を用い、かつ適当なヒトFAP-特異性VL領域を、ガイド付き
選択法及びファージディスプレー法を用い選択することができる。その後、該ヒ
トVL領域をガイド構造として使用し、例えば、ヒトFAP-特異性VH領域を選択する
ことができる。存在するFAP-特異性scFv(例えば、マウスのハイブリドーマ株F19
由来のscFv、又はヒトVL及びF19 VHを伴うキメラ抗-FAP scFv)をコードしている
ファージミドベクターによる組合せレパートリーのDNA夾雑の技術的問題点が生
じることがある。ガイド付き選択は、下記実施例において説明されている。 組合せレパートリーは、遺伝子操作による、Vレパートリーの対応する相補的V
-配列との組合せを意味する(VHに関してVLに対する相補性、又はその逆)。この
組合せに使用されたV-配列は、ひとつのV-配列、多くの異なるV-配列又はVレパ
ートリーからなることができる。 3) A combinatorial reper consisting of a human VH repertoire and various human FAP-specific VL regions
Preparation of Trees: To obtain the antibodies of the invention, for example, the monoclonal FAP-specific mouse antibody F1
Known VH regions from 9 can be used, and appropriate human FAP-specific VL regions can be selected using the guided selection method and the phage display method. The human VL region can then be used as a guide structure to select, for example, the human FAP-specific VH region. FAP-specific scFv present (e.g., mouse hybridoma strain F19
There may be technical problems with DNA contamination of the combinatorial repertoire with the scFv of origin or the phagemid vector encoding the chimeric anti-FAP scFv with human VL and F19 VH). Guided selection is described in the examples below. A combinatorial repertoire is a genetically engineered V repertoire of corresponding complementary V
-Means a combination with a sequence (complementarity to VL with respect to VH or vice versa). The V-sequences used in this combination can consist of one V-sequence, many different V-sequences or V repertoires.

【００１１】 好ましくは、本発明の抗体タンパク質は、免疫グロブリンクラスIgMの重鎖(VH )を含む点を特徴としている。 好ましくは本発明の抗体タンパク質は、免疫グロブリンクラスIgGの重鎖(VH)
も含む点を特徴としている。これらの限定的でない例は、完全なヒト抗体scFv #
13及びscFv #46である(実施例参照)。 好ましくは、本発明の抗体タンパク質は、同じくクラスIgDの重鎖(VH)を含む
点を特徴としている。この限定的でない例は、本発明のヒト抗体scFv #50である
(同じく実施例参照)。この抗体において、VH-配列は、ヒトIgDを起源としており
、かつ1個のアミノ酸交換した点以外は生殖細胞系列の配列と同じである。これ
は有利なことに、ヒトにおけるこのVH領域に対する同種免疫応答の確率を低下す
る。Preferably, the antibody protein of the invention is characterized in that it comprises a heavy chain (V H ) of immunoglobulin class IgM. Preferably, the antibody protein of the present invention is an immunoglobulin class IgG heavy chain (V H ).
It is characterized by including. A non-limiting example of these is the fully human antibody scFv #
13 and scFv # 46 (see Examples). Preferably, the antibody protein of the present invention is characterized in that it also contains a heavy chain (V H ) of class IgD. A non-limiting example of this is the human antibody scFv # 50 of the present invention.
(See also Example). In this antibody, the VH-sequence is identical to the germline sequence except that it originates from human IgD and has a single amino acid exchange. This advantageously reduces the probability of an alloimmune response against this VH region in humans.

【００１２】 同じく好ましくは、本発明の抗体タンパク質は、それがラムダ(λ)型の軽鎖(VL )を含むことを特徴としている。 同じく好ましくは、本発明の抗体タンパク質は、それがカッパ(κ)型の軽鎖(VL )を含むことを特徴としている(実施例、例えばIII25、III43参照)。 本発明の抗体の多くの用途に関して、最小の可能性のある抗原-結合、すなわ
ちFAP-結合ユニットを有することが望ましい。従って別の好ましい実施態様にお
いて、本発明の抗体タンパク質は、Fabフラグメント(抗原結合性フラグメント＝
Fab)である。本発明のこれらのFAP-特異抗体タンパク質は、隣接する定常領域に
より互いに保持されているような両鎖の可変領域からなる。これらは、通常の抗
体から、例えばパパインなどによる、プロテアーゼ消化により形成することがで
きるが、一方では類似のFabフラグメントは、遺伝子操作によっても作成するこ
とができる。別の好ましい実施態様において、本発明の抗体タンパク質は、F(ab
')2フラグメントであり、これはペプシンによるタンパク質分解性切断により調
製することができる。Also preferably, the antibody protein of the invention is characterized in that it comprises a lambda (λ) type light chain (V L ). Also preferably, the antibody protein of the invention is characterized in that it comprises a kappa (κ) type light chain ( VL ) (see Examples eg III25, III43). For many uses of the antibodies of the present invention, it is desirable to have a minimal potential antigen-binding, or FAP-binding unit. Therefore, in another preferred embodiment, the antibody protein of the invention comprises a Fab fragment (antigen-binding fragment =
Fab). These FAP-specific antibody proteins of the invention consist of the variable regions of both chains which are held together by the adjacent constant regions. These can be formed from conventional antibodies by protease digestion, eg with papain, while similar Fab fragments can also be generated by genetic engineering. In another preferred embodiment, the antibody protein of the invention is F (ab
') 2 fragment, which can be prepared by proteolytic cleavage with pepsin.

【００１３】 遺伝子操作法を用い、重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域からのみなるような短
縮された抗体断片を作出することが可能である。これらは、Fvフラグメント(フ
ラグメント可変部＝可変部分の断片)と称される。別の好ましい実施態様におい
て、本発明のFAP-特異抗体分子は、このようなFvフラグメントである。これらの
Fvフラブメントは定常鎖のシステインによるこれら2本の鎖の共有結合を欠いて
いるので、これらのFvフラグメントは安定化されることが多い。短いペプチド断
片、例えば10〜30個のアミノ酸、好ましくは15個のアミノ酸により、重鎖及び軽
鎖の可変領域を連結することは利点である。この方法において、ペプチドリンカ
ーにより連結された、VH及びVLからなる単ペプチド鎖が得られる。この種の抗体
タンパク質は、単-鎖-Fv(scFv)として公知である。先行技術において公知である
この種のscFv-抗体タンパク質の例は、Hustonらの論文(PNAS、16: 5879-5883 (1
988))に説明されている。従って、別の好ましい実施態様において、本発明のFAP
-特異抗体タンパク質は単-鎖-Fvタンパク質(scFv)である。Using genetic engineering techniques, it is possible to produce truncated antibody fragments that consist only of the variable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains. These are referred to as Fv fragments (fragment variable part = fragment of variable part). In another preferred embodiment, the FAP-specific antibody molecule of the present invention is such an Fv fragment. these
These Fv fragments are often stabilized because Fv fragments lack the covalent attachment of these two chains by the constant chain cysteines. It is an advantage to link the variable regions of the heavy and light chains by short peptide fragments, eg 10-30 amino acids, preferably 15 amino acids. In this way, a single peptide chain consisting of V H and V L linked by a peptide linker is obtained. This type of antibody protein is known as single-chain-Fv (scFv). Examples of this type of scFv-antibody protein known in the prior art can be found in the article by Huston et al. (PNAS, 16: 5879-5883 (1
988)). Therefore, in another preferred embodiment, the FAP of the invention
-The specific antibody protein is a single-chain-Fv protein (scFv).

【００１４】 近年、多量体誘導体としてのscFv調製に関する様々な戦略が開発されている。
これは、特に改善された薬物速度論及び生体分布特性に加え、増大した結合力も
伴うような組換え抗体につながることが意図されている。scFvの多量体化を実行
するために、scFvが、多量体化ドメインを伴う融合タンパク質として調製された
。多量体化ドメインは、例えばIgGのCH3領域又はロイシン-ジッパードメインの
ようなコイルドコイル構造(ヘリックス構造)であることができる。しかし、scFv
のVH/VL領域間の相互作用を多量体化に使用する(例えば、二-、三-及び五重特異
性抗体)ような戦略もある。従って、別の好ましい実施態様において、本発明の
抗体タンパク質は、FAP-特異性二重特異抗体断片である。当業者は、二重特異性
抗体の意味を、二価ホモ二量体scFv誘導体としている(Huら、PNAS、16: 5879-58
83 (1996))。scFv分子内のリンカーの5〜10個アミノ酸への短縮は、内側-鎖VH/V
L-重複(superimposition)が生じているようなホモ二量体の形成につながる。二
重特異抗体は、ジスルフィド橋の組込みにより、更に安定化され得る。先行技術
の二重特異性抗体タンパク質の例は、Perisicらの論文(Structure、2: 1217-122
6 (1994))に見ることができる。In recent years, various strategies have been developed for preparing scFv as multimeric derivatives.
This is intended to lead to recombinant antibodies that are associated with increased avidity, as well as particularly improved pharmacokinetic and biodistribution properties. In order to carry out scFv multimerization, scFv was prepared as a fusion protein with a multimerization domain. The multimerization domain can be, for example, a CH3 region of IgG or a coiled coil structure (helix structure) such as a leucine-zipper domain. But scFv
There are also strategies such as using the interaction between the VH / VL regions of E. coli for multimerization (eg bi-, tri- and penta-specific antibodies). Thus, in another preferred embodiment, the antibody protein of the invention is a FAP-specific bispecific antibody fragment. Those skilled in the art refer to bispecific antibodies as bivalent homodimeric scFv derivatives (Hu et al., PNAS, 16: 5879-58.
83 (1996)). Shortening of the linker in the scFv molecule to 5-10 amino acids results in inner-chain VH / V
This leads to the formation of homodimers with L-superimposition occurring. Bispecific antibodies can be further stabilized by the incorporation of disulfide bridges. Examples of prior art bispecific antibody proteins are found in the article by Perisic et al. (Structure, 2: 1217-122.
6 (1994)).

【００１５】 当業者にとって、ミニボディは、二価のホモ二量体scFv誘導体を意味する。こ
れは、ヒンジ領域(例えば、IgG1にも由来)及びリンカー領域を介してscFvに連結
されているような二量体化領域として、免疫グロブリン、好ましくはIgG、最も
好ましくはIgG1のCH3領域を含む融合タンパク質からなる。このヒンジ領域のジ
スルフィド橋は、主として高等細胞において形成され、原核細胞においては形成
されない。別の好ましい実施態様において、本発明の抗体タンパク質は、FAP-特
異性ミニボディ抗体断片である。先行技術のミニボディ-抗体タンパク質の例は
、Huらの論文(Cancer Res.、56: 3055-61 (1996))に見られる。To the person skilled in the art, a minibody means a divalent homodimeric scFv derivative. This includes the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, most preferably IgG1, as a dimerization region as linked to the scFv via a hinge region (e.g. also derived from IgG1) and a linker region. It consists of a fusion protein. This disulfide bridge in the hinge region is mainly formed in higher cells and not in prokaryotic cells. In another preferred embodiment, the antibody protein of the invention is a FAP-specific minibody antibody fragment. Examples of prior art minibody-antibody proteins can be found in the article by Hu et al. (Cancer Res., 56: 3055-61 (1996)).

【００１６】 当業者にとって、三重特異抗体は、三価のホモ三量体scFv誘導体を意味する(K
orttら、Protein Engineering、10: 423-433 (1997))。VH-VLがリンカー配列を
伴わずに直接融合されたscFv誘導体は、三量体形成につながる。 当業者は、二-、三-又は四価の構造を有し、かつscFvに由来するような、いわゆ
るミニ抗体も周知である。この多量体化は、二-、三-又は四量体コイルドコイル
構造により実行される(Packら、Biotechnology、11: 1271-1277(1993)；Lovejoy
ら、Science、259: 1288-1293(1993)；Packら、J. Mol. Biol.、246: 28-34(199
5))。 従って別の好ましい実施態様において、本発明の抗体タンパク質は、前述の抗
体断片を基にした、FAP-特異性多量体化された分子であり、かつ例えば、三重特
異抗体、四価のミニ抗体又は五重特異抗体であることができる。To the person skilled in the art, trispecific antibody means a trivalent homotrimeric scFv derivative (K
ortt et al., Protein Engineering, 10: 423-433 (1997)). A scFv derivative in which VH-VL was directly fused without a linker sequence leads to trimerization. Those skilled in the art are also familiar with so-called mini-antibodies, which have a di-, tri- or tetravalent structure and are derived from scFv. This multimerization is carried out by di-, tri- or tetrameric coiled-coil structures (Pack et al., Biotechnology, 11: 1271-1277 (1993); Lovejoy
Et al., Science, 259: 1288-1293 (1993); Pack et al., J. Mol. Biol., 246: 28-34 (199).
Five)). Therefore, in another preferred embodiment, the antibody protein of the present invention is a FAP-specific multimerized molecule based on the aforementioned antibody fragment, and, for example, a trispecific antibody, a tetravalent mini antibody or It can be a penta-specific antibody.

【００１７】 特に好ましくは、本発明の抗体タンパク質は全体的にヒトである。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：1(VH13)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：2(VH46)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：3(VH50)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：4(VLIII25)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：5(VH13)又はそれらの断片もしくはそれらの縮重変異体によりコー
ドされることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：6(VH46)又はそれらの断片もしくはそれらの縮重変異体によりコー
ドされることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：7(VH50)又はそれらの断片もしくはそれらの縮重変異体によりコー
ドされることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、軽鎖(VL)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：8(VLIII25)又はそれらの断片もしくはそれらの縮重変異体によりコ
ードされることを特徴としている。Particularly preferably, the antibody protein of the invention is wholly human. Another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (VH13). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 (VH46). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 (VH50). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the light chain ( VL ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 (VLIII25). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) is encoded by nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 (VH13) or fragments thereof or degenerate variants thereof. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) is encoded by nucleotide sequence SEQ ID NO: 6 (VH46) or fragments thereof or degenerate variants thereof. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) is encoded by nucleotide sequence SEQ ID NO: 7 (VH50) or a fragment thereof or a degenerate variant thereof. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the light chain ( VL ) is encoded by nucleotide SEQ ID NO: 8 (VLIII25) or a fragment thereof or a degenerate variant thereof.

【００１８】 特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域がアミノ酸配列
番号：1(VH13)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域がアミノ酸配列番号：4(VLIII25
)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域のコード配
列がヌクレオチド配列番号：5(VH13)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域のコード
配列がヌクレオチド配列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域がアミノ酸
配列番号：2(VH46)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域がアミノ酸配列番号：4(VLI
II25)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域のコード配
列がヌクレオチド配列番号：6(VH46)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域のコード
配列がヌクレオチド配列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域がアミノ酸
配列番号：3(VH50)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域がアミノ酸配列番号：4(VLI
II25)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域のコード配
列がヌクレオチド配列番号：7(VH50)を含み、及び軽鎖(VL)の可変領域のコード
配列がヌクレオチド配列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴としている。In a particularly preferred antibody protein of the present invention, the variable region of the heavy chain (V H ) comprises amino acid SEQ ID NO: 1 (VH13) and the variable region of the light chain (V L ) comprises amino acid SEQ ID NO: 4 ( VLIII25
) Is included. Another particularly preferred antibody protein of the invention has a heavy chain (V H ) variable region coding sequence comprising nucleotides SEQ ID NO: 5 (VH13), and a light chain (V L ) variable region coding sequence comprising nucleotides It is characterized by containing SEQ ID NO: 8 (VLIII25). Another particularly preferred antibody protein of the invention has the variable region of the heavy chain (V H ) comprising amino acid SEQ ID NO: 2 (VH46) and the variable region of the light chain (V L ) amino acid SEQ ID NO: 4 (VLI).
II25) is included. Another particularly preferred antibody protein of the invention has the heavy chain (V H ) variable region coding sequence comprising nucleotide SEQ ID NO: 6 (VH46), and the light chain (V L ) variable region coding sequence comprises nucleotides It is characterized by containing SEQ ID NO: 8 (VLIII25). Another particularly preferred antibody protein of the invention has the heavy chain (V H ) variable region comprising amino acid SEQ ID NO: 3 (VH50) and the light chain (V L ) variable region comprising amino acid SEQ ID NO: 4 (VLI).
II25) is included. Another particularly preferred antibody protein of the invention has a heavy chain (V H ) variable region coding sequence comprising nucleotide SEQ ID NO: 7 (VH50), and a light chain (V L ) variable region coding sequence comprising nucleotides It is characterized by containing SEQ ID NO: 8 (VLIII25).

【００１９】 特に好ましくは、本発明の抗体タンパク質は、ヒト化されている。本発明のヒ
ト化抗体タンパク質は、下記の好ましい実施態様において説明されるように、マ
ウスF19の6種のCDR領域全ては含まないが、ただ1個のマウスのCDR領域を含むよ
うな先行技術において公知のFAPα-特異抗体タンパク質に勝る利点を有する。こ
の本発明の抗体タンパク質は、有利なことに、先行技術において公知の抗体タン
パク質よりも少ない異種抗原能を有する。驚くべきことに、本発明者らは、ヒト
化を成功するには少なくとも2個のマウスCDR領域が必要であるという支配的意見
(Raderら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95: 8910(1998))に対抗し、わずかに1
個のマウスCDR領域を含む抗体分子を作出することに成功した。 ヒト化されたscFv 34及びscFv 18の場合の別の驚くべき特性は、これらのscFv
が、例えばscFv F19(EC50 20nM)のような当該技術分野において公知のFAP-特異
抗体よりも高いFAP+細胞に対する見かけの結合親和力を示す(EC50 6nM)ことであ
る。Particularly preferably, the antibody protein of the present invention is humanized. The humanized antibody protein of the present invention, as described in the preferred embodiment below, does not contain all six CDR regions of mouse F19, but in the prior art such that it contains only one mouse CDR region. It has advantages over known FAP α-specific antibody proteins. This antibody protein of the invention advantageously has less heterologous antigenic capacity than the antibody proteins known in the prior art. Surprisingly, we have a dominant opinion that at least two mouse CDR regions are required for successful humanization.
(Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910 (1998)) and only 1
We have succeeded in producing an antibody molecule containing mouse CDR regions. Another surprising property of humanized scFv 34 and scFv 18 is that these scFv
Shows a higher apparent binding affinity for FAP + cells (EC 50 6 nM) than FAP-specific antibodies known in the art, eg scFv F19 (EC 50 20 nM).

【００２０】 本発明のヒト化抗体を調製する本発明の好ましい方法は、例えば下記の工程に
より説明することができる：1)HCDR3を維持するガイド付き選択法によるscFv F19のヒト化 本発明者らの経験は、「ガイド付き選択(Guided selection)」法を用いること
により、親マウスのAbとは異なるエピトープ特異性を有するヒトAbを選択するこ
とができることを示した。先行技術のこの欠点を克服するために、有利なことに
、scFv F19のヒト化のためのガイド付き選択法において、更には最終ヒト化産物
において、HCDR3 F19は維持された。先行技術(Raderら、PNAS、95: 8910(1998))
は、親マウスAbのLCDR3及び更にHCDR3の両方が維持されているような、「ガイド
付き選択」によりヒト化された抗体のみを説明している(実施例1参照)。A preferred method of the invention for preparing a humanized antibody of the invention can be illustrated, for example, by the following steps: 1) Humanization of scFv F19 by a guided selection method that maintains HCDR3 . Have shown that by using the "Guided selection" method, human Abs with different epitope specificities than the Ab of the parental mouse can be selected. To overcome this drawback of the prior art, HCDR3 F19 was advantageously retained in a guided selection method for the humanization of scFv F19, as well as in the final humanized product. Prior art (Rader et al., PNAS, 95: 8910 (1998))
Describe only antibodies that have been humanized by "guided selection" such that both LCDR3 and also HCDR3 of the parental mouse Ab are maintained (see Example 1).

【００２１】2)ヒトVH-遺伝子セグメントレパートリーのマウスHCDR3(F19)との組合せ 可能な限り複雑な組合せレパートリーを作成するために、全て公知のヒトVHフ
ァミリーのVHセグメントが、HCDR3 F19と組合せられる。有利なことに、これは
アミノ酸レベルでのコードを変更することなく、例えばHCDR3 F19中に制限酵素P
fl23IIの切断部位を組入れることにより行われることが好ましい。PCR-増幅した
ヒトVH-遺伝子セグメントの組合せについて、下記のAb-配列区分を含むファージ
ディスプレーベクターが開発された：Pfl23II切断部位を伴うHCDR3 F19、F19に
対応する領域に対し高い相同性を有するヒトVH FR4領域、更には様々に選択され
たヒト抗-FAP VL領域(実施例1の概略図参照)。VH-遺伝子セグメントレパートリ
ーのPCR増幅のためのプライマーは、実施例1に示されている。 2) Combining the human VH-gene segment repertoire with mouse HCDR3 (F19) All known human VH family VH segments are combined with HCDR3 F19 to create the most complex combinatorial repertoire possible. Advantageously, this does not change the code at the amino acid level, for example in the HCDR3 F19 the restriction enzyme P
It is preferably carried out by incorporating the cleavage site of fl23II. For the PCR-amplified human VH-gene segment combination, a phage display vector was developed containing the following Ab-sequence segments: HCDR3 F19 with a Pfl23II cleavage site, humans with high homology to the region corresponding to F19. VH FR4 region, as well as various selected human anti-FAP VL regions (see schematic in Example 1). Primers for PCR amplification of the VH-gene segment repertoire are shown in Example 1.

【００２２】 この好ましい方法は、VH-遺伝子セグメントレパートリーの限定されたCDR3領
域との組合せに関する下記の先行技術に勝る利点を有する：Schierら、J. Mol. Biol.、255: 28(1996) ：この先行技術において、制限切断部
位(BssHII)は、VH FR3の3'領域に組込まれている。しかし、この切断部位のPCR
による組込みは、様々なVH-遺伝子ファミリーの変更されたアミノ酸配列につな
がっている。この理由については、Schierらの論文に記されている。一部のVH-
遺伝子ファミリーのみが、この組合せレパートリーに含まれ得る。PCR重複伸長、Raderら、1998 ：この方法実際にその組合せ中に全てのVH-遺伝子
ファミリーを含むことを可能にしているが、その欠点は、低い連鎖効率及び高い
エラー率である。これは、不活性scFv突然変異体及び特に破壊されたscFvリーデ
ィングフレームを持つクローンの確率を増大し、遺伝的に不安定な組合せレパー
トリーにつながる。This preferred method has the advantage over the following prior art on the combination of the VH-gene segment repertoire with the restricted CDR3 region: Schier et al., J. Mol. Biol., 255: 28 (1996) : In this prior art, the restriction cleavage site (BssHII) is integrated in the 3'region of VH FR3. However, PCR of this cleavage site
Has led to altered amino acid sequences of various VH-gene families. The reason for this is described in the paper by Schier et al. Some VH-
Only gene families can be included in this combinatorial repertoire. PCR overlap extension, Rader et al., 1998 : This method actually allows to include the entire VH-gene family in the combination, but its drawbacks are low linkage efficiency and high error rate. This increases the probability of inactive scFv mutants and especially clones with disrupted scFv reading frames, leading to a genetically unstable combinatorial repertoire.

【００２３】3)様々なヒトFAP-特異性VL領域のガイド構造としての使用 F19に類似したScFvの選択確率を増大するために、ヒトVHレパートリー(項2参
照)を、様々なヒトFAP-特異性VL領域の配列と組合せた(前掲のヒト抗体と同様に
実施)。4)ファージディスプレー選択におけるストリンジェントな洗浄工程 この手法を用い、選択過程において、低-親和性抗体及び多反応性抗体を除去
した(方法については下記参照)。 3) Use of various human FAP-specific VL regions as guide structures To increase the selection probability of ScFvs similar to F19, human VH repertoire (see Section 2) was added to various human FAP-specific. Combined with the sequence of the sex VL region (performed in the same manner as the human antibody described above). 4) Stringent washing step in phage display selection Using this technique, low-affinity antibodies and polyreactive antibodies were removed in the selection process (see below for method).

【００２４】5)選択されたヒト化scFvの同定のための効率的スクリーニング法の使用 「HCDR3を維持するガイド付き選択法」の間に、非常に多数のクローンが濃縮
された。有利なことに、scFv #34及び#18は、Mersmannらの論文(J. Immunol. Me
thods, 220: 51(1998))に記されたスクリーニング法により同定することができ
る。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)
のマウスCDR1を含む点を特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)
のマウスCDR2を含む点を特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)
のマウスCDR3を含む点を特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)
のマウスCDR1を含む点を特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)
のマウスCDR2を含む点を特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)
のマウスCDR3を含む点を特徴としている。 5) Use of Efficient Screening Method for Identification of Selected Humanized scFvs During the "Guided Selection Method to Maintain HCDR3", a very large number of clones were enriched. Advantageously, scFv # 34 and # 18 were found in the article by Mersmann et al. (J. Immunol. Me
thods, 220: 51 (1998)). Another preferred antibody protein of the invention is the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR1. Another preferred antibody protein of the invention is the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR2. Another preferred antibody protein of the invention is the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR3. Another preferred antibody protein of the invention is the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR1. Another preferred antibody protein of the invention is the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR2. Another preferred antibody protein of the invention is the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19.
It is characterized by including mouse CDR3.

【００２５】 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：9(VH34)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：10(VH18)を含むことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：11(VLIII43)を含むことを特徴としている。Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 (VH34). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 10 (VH18). Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the light chain ( VL ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 11 (VLIII43).

【００２６】 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：12(VH34)又はそれらの断片もしくは縮重変異体でコードされている
ことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：13(VH18)又はそれらの断片もしくは縮重変異体でコードされている
ことを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、軽鎖(VL)の可変領域が、ヌクレオチ
ド配列番号：14(VLIII43)又はそれらの断片もしくは縮重変異体でコードされて
いることを特徴としている。Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain (V H ) is encoded by nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 (VH34) or a fragment or degenerate variant thereof. There is. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) is encoded by nucleotide sequence SEQ ID NO: 13 (VH18) or a fragment or degenerate variant thereof. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the variable region of the light chain ( VL ) is encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 14 (VLIII43) or a fragment or degenerate variant thereof.

【００２７】 特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配
列番号：9(VH34)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：11(VL
III43)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域のコード配
列が、ヌクレオチド配列番号：12(VH34)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコー
ド配列が、ヌクレオチド配列番号：14(VLIII43)を含むことを特徴としている。
別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸
配列番号：10(VH18)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：11
(VLIII43)を含むことを特徴としている。 別の特に好ましい本発明の抗体タンパク質は、重鎖(VH)の可変領域のコード配
列が、ヌクレオチド配列番号：13(VH18)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコー
ド配列が、ヌクレオチド配列番号：14(VLIII43)を含むことを特徴としている。In a particularly preferred antibody protein of the present invention, the variable region of the heavy chain (V H ) contains amino acid sequence number: 9 (VH34), and the variable region of the light chain (V L ) has amino acid sequence number: SEQ ID NO: 11 (VL
It is characterized by including III43). Another particularly preferred antibody protein of the present invention is that the coding sequence for the variable region of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 12 (VH34), and the coding sequence for the variable region of the light chain (V L ) is , Nucleotide sequence number: 14 (VLIII43).
Another particularly preferred antibody protein of the present invention is that the variable region of the heavy chain (V H ) comprises amino acid SEQ ID NO: 10 (VH18) and the variable region of the light chain (V L ) comprises amino acid SEQ ID NO: 11
(VLIII43) is included. Another particularly preferred antibody protein of the present invention has a heavy chain (V H ) variable region coding sequence comprising nucleotide sequence number: 13 (VH18) and a light chain (V L ) variable region coding sequence. , Nucleotide sequence number: 14 (VLIII43).

【００２８】 別の特に好ましい本発明の実施態様は、本発明の抗体タンパク質をコードして
いる核酸を含む。好ましくは、同じく、本発明の核酸は、それが、5'又は3'もし
くは5'及び3'非翻訳領域を含むことも特徴としている。本発明の核酸は、上流及
び／又は下流に別の非翻訳領域を含んでも良い。非翻訳領域は、例えば転写開始
ユニット(プロモーター)又はエンハンサーのような、調節エレメントを含むこと
ができる。該プロモーターは、例えば、構成的、誘導的又は発生-制御された(de
velopment-controlled)プロモーターであることができる。他の公知のプロモー
ターを除外するものではないが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)及びラウス肉
腫ウイルス(RSV)の構成的プロモーター、更にはシミアンウイルス40(SV40)及び
単純ヘルペスプロモーターが好ましい。本発明の誘導的プロモーターは、抗生物
質耐性プロモーター、熱ショックプロモーター、ホルモン誘導性「乳癌ウイルス
プロモーター」及びメタロチオネインプロモーターを含む。好ましくは同じく、
本発明の核酸は、本発明の抗体タンパク質の断片をコードしていることも特徴と
している。これは、本発明のポリペプチドの一部を意味する。Another particularly preferred embodiment of the invention comprises a nucleic acid encoding the antibody protein of the invention. Preferably, also the nucleic acid of the invention is characterized in that it comprises 5'or 3'or 5'and 3'untranslated regions. The nucleic acid of the present invention may contain another untranslated region upstream and / or downstream. The untranslated region can include regulatory elements such as transcription initiation units (promoters) or enhancers. The promoter may be, for example, constitutive, inducible or developmentally regulated (de
velopment-controlled) promoter. Although not excluding other known promoters, constitutive promoters of human cytomegalovirus (CMV) and Rous sarcoma virus (RSV), as well as the simian virus 40 (SV40) and herpes simplex promoters are preferred. Inducible promoters of the present invention include antibiotic resistance promoters, heat shock promoters, hormone inducible "breast cancer virus promoters" and metallothionein promoters. Preferably also
The nucleic acid of the present invention is also characterized in that it encodes a fragment of the antibody protein of the present invention. This means part of the polypeptide of the invention.

【００２９】 好ましくは同じく、本発明の核酸は、本発明の抗体タンパク質の機能性変異体
をコードしていることも特徴としている。これは、本発明の抗体タンパク質と大
部分同一でありかつ本発明の抗体タンパク質と同じ生物学的活性を有するか又は
本発明の抗体タンパク質に対する阻害作用を有するようなポリペプチドを意味す
る。本発明の抗体タンパク質の変異体は、1個以上のアミノ酸、好ましくは1〜10
個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、本発明の抗体タンパク質と異なって
も良い。Also preferably, the nucleic acid of the present invention is characterized in that it encodes a functional variant of the antibody protein of the present invention. This means a polypeptide which is largely identical to the antibody protein of the invention and which has the same biological activity as the antibody protein of the invention or has an inhibitory effect on the antibody protein of the invention. Variants of antibody proteins of the invention include one or more amino acids, preferably 1-10.
It may differ from the antibody protein of the present invention by the substitution, deletion or addition of individual amino acids.

【００３０】 好ましくは同じく、本発明の核酸は、本発明の抗体タンパク質の対立遺伝子変
異体をコードしていることも特徴としている。好ましくは同じく、本発明の核酸
は、核酸の縮重コードを基に、本発明の抗体タンパク質の変異体をコードしてい
ることも特徴としている。好ましくは同じく、核酸は、ストリンジェントな条件
下でそれが本発明の核酸にハイブリダイズすることができることも特徴としてい
る。ストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、かつ特に、Sambrookら
の著書「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版(Cold Spring Harbor
Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989))に記
されている。Preferably also, the nucleic acid of the invention is characterized in that it encodes an allelic variant of the antibody protein of the invention. Also preferably, the nucleic acid of the present invention is also characterized in that it encodes a variant of the antibody protein of the present invention based on the degenerate code of the nucleic acid. Also preferably, the nucleic acid is also characterized in that it can hybridize under stringent conditions to the nucleic acid according to the invention. Stringent conditions are known to those skilled in the art, and in particular, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

【００３１】 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：15のアミノ酸配列
又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体
タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：16のアミノ酸配列
又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体
タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：17のアミノ酸配列
又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体
タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：18のアミノ酸配列
又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体
タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：19のアミノ酸配列
又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体
タンパク質を含む。Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, or a part thereof or a functional variant thereof.

【００３２】 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：20のヌクレオチド
配列又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体によりコードされているこ
とを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：21のヌクレオチド
配列又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体によりコードされているこ
とを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：22のヌクレオチド
配列又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体によりコードされているこ
と特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：23のヌクレオチド
配列又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体によりコードされているこ
と特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：24のヌクレオチド
配列又はそれらの一部もしくはそれらの機能性変異体によりコードされているこ
とを特徴とする、抗体タンパク質を含む。Another particularly preferred embodiment of the present invention provides an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 20 or a part thereof or a functional variant thereof. Including. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 21, or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 22 or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 23, or a part thereof or a functional variant thereof. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 24, or a part thereof or a functional variant thereof.

【００３３】 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：15のアミノ酸配列
に相当することを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：16のアミノ酸配列
に相当することを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：17のアミノ酸配列
に相当することを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：18のアミノ酸配列
に相当することを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：19のアミノ酸配列
に相当することを特徴とする、抗体タンパク質を含む。Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.

【００３４】 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：20のヌクレオチド
配列によりコードされていることを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：21のヌクレオチド
配列によりコードされていることを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：22のヌクレオチド
配列によりコードされていることを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：23のヌクレオチド
配列によりコードされていることを特徴とする、抗体タンパク質を含む。 別の特に好ましい本発明の実施態様は、それが、配列番号：24のヌクレオチド
配列によりコードされていることを特徴とする、抗体タンパク質を含む。Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 20. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 21. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 22. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 23. Another particularly preferred embodiment of the invention comprises an antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 24.

【００３５】 配列番号は、配列リストの<400>の次に指定した番号を意味し、例えば配列番
号：24のヌクレオチド配列は、<400> 24として表される。 別の本発明の態様は、本発明の核酸を含む組換えDNAベクターに関する。例と
しては、ワクシニア、セムリキ森林熱ウイルス及びアデノウイルスなどのウイル
スベクターなどがある。COS-細胞において使用するためのベクターは、SV40複製
起点を有し、かつプラスミドの高コピー数が達成可能である。昆虫細胞において
使用するためのベクターは、例えば、E. coli運搬ベクターであり、かつプロモ
ーターとして、例えばポリヘドリンをコードしているDNAを含む。 本発明の別の態様は、発現ベクターであるような本発明の組換えDNAベクター
に関する。The SEQ ID NO means the number specified next to <400> in the sequence list, and for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 is represented as <400> 24. Another aspect of the present invention relates to a recombinant DNA vector containing the nucleic acid of the present invention. Examples include viral vectors such as vaccinia, semliki forest virus and adenovirus. Vectors for use in COS-cells have the SV40 origin of replication and high plasmid copy numbers are achievable. Vectors for use in insect cells are, for example, E. coli delivery vectors and contain as a promoter, for example, DNA encoding polyhedrin. Another aspect of the invention relates to the recombinant DNA vector of the invention, which is an expression vector.

【００３６】 更に別の本発明の態様は、本発明のベクターを含む宿主である。 別の本発明の宿主は、真核宿主細胞である。本発明の真核宿主細胞は、真菌、
例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces、
Trichodermaなど、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現システムを伴う、Sp
odoptera frugiperda Sf-9)、植物細胞、例えば、Nicotiana tabacumなど、哺乳
類細胞、例えば、COS細胞、BHK、CHO又は骨髄腫細胞を含む。Yet another aspect of the present invention is a host containing the vector of the present invention. Another host of the invention is a eukaryotic host cell. The eukaryotic host cell of the present invention is a fungus,
For example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces,
Insect cells, such as Trichoderma (e.g., with a baculovirus expression system, Sp
odoptera frugiperda Sf-9), plant cells such as Nicotiana tabacum, and mammalian cells such as COS cells, BHK, CHO or myeloma cells.

【００３７】 抗体タンパク質がヒト体内でも形成されるような免疫系の細胞の子孫において
、本発明の抗体タンパク質は特によくフォールディングされかつグリコシル化さ
れている。従って、本発明の好ましい宿主は、哺乳類細胞である。 特に好ましい本発明の宿主は、BHK、CHO又はCOS細胞である。 別の本発明の宿主は、バクテリオファージである。 別の本発明の宿主は、原核宿主細胞である。原核宿主細胞の例は、Escherichi
a coli、Bacillus subtilis、Streptomyces又はProteus mirabilisである。The antibody proteins of the invention are particularly well folded and glycosylated in the progeny of cells of the immune system in which they are also formed in the human body. Therefore, the preferred host of the present invention is a mammalian cell. Particularly preferred hosts according to the invention are BHK, CHO or COS cells. Another host of the invention is a bacteriophage. Another host of the invention is a prokaryotic host cell. An example of a prokaryotic host cell is Escherichi
a coli, Bacillus subtilis, Streptomyces or Proteus mirabilis.

【００３８】 本発明は、本発明の抗体タンパク質を調製する方法に関し、これは下記の工程
を含む：前述の本発明の宿主を、該抗体タンパク質が、該宿主細胞により発現さ
れるような条件下で培養する工程、及び該抗体タンパク質を単離する工程。 本発明の抗体タンパク質は、前述の宿主のいずれかにおいて発現することができ
る。 Escherichia coli、Bacillus subtilis、Streptomyces又はProteus mirabilis
のような原核発現システムの調製は、Fab-、F(ab')2-、scFvフラグメント、ミニ
ボディ、二重特異抗体及び該断片の多量体のような、本発明の抗体断片に特に適
している。本発明の抗体タンパク質は、例えば封入体内のような細胞内において
、例えばProteus mirabilisのような細胞壁のない細菌への分泌により、もしく
はこの目的に適したベクターを用いるグラム-陰性菌への細胞周辺腔への分泌の
いずれかにより、本発明の方法に従い調製される。実施例2において、原核細胞
における本発明の抗体タンパク質の調製が、例証を目的として説明されている。
scFv-抗体タンパク質の調製に関する先行技術の例は、Rippmannらの論文(Appl.
Environ. Microbiol.、64: 4862-4869(1998))に記載されている。その他の例は
当業者に公知である。 本発明の抗体タンパク質は、細胞内発現又は分泌をもたらすベクターにより、
例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces、
Trichodermaなどの真菌においても本発明の方法で調製することができる。The present invention relates to a method of preparing an antibody protein of the invention comprising the steps of: subjecting a host of the invention as described above to conditions under which the antibody protein is expressed by the host cell. And a step of isolating the antibody protein. The antibody protein of the present invention can be expressed in any of the aforementioned hosts. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces or Proteus mirabilis
The preparation of prokaryotic expression systems such as is particularly suitable for antibody fragments of the invention, such as Fab-, F (ab ') 2-, scFv fragments, minibodies, bispecific antibodies and multimers of said fragments. There is. The antibody proteins of the present invention may be expressed in cells such as inclusion bodies, by secretion into cell-free bacteria such as Proteus mirabilis, or into the periplasmic space of Gram-negative bacteria using vectors suitable for this purpose. Is prepared according to the methods of the present invention. The preparation of the antibody protein of the invention in prokaryotic cells is described in Example 2 for purposes of illustration.
Prior art examples for the preparation of scFv-antibody proteins are described in Rippmann et al. (Appl.
Environ. Microbiol., 64: 4862-4869 (1998)). Other examples are known to those skilled in the art. The antibody protein of the present invention is a vector that brings about intracellular expression or secretion,
For example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces,
Fungi such as Trichoderma can also be prepared by the method of the present invention.

【００３９】 本発明の抗体タンパク質を調製する方法は、例えば、一過性又は安定した発現
システムもしくはバキュロウイルス発現システムとして、昆虫細胞によっても実
施することができる。ここで、例えばSf-9昆虫細胞は、例えば、Autographa cal
ifornica核多角体病ウイルス(AcNPV)又は関連ウイルスによって感染される。そ
こには哺乳類にとっての病原体であるようなウイルスとの夾雑のリスクはなく、
その結果、本発明の治療用抗体は昆虫細胞において有利に調製することができる
。前述のE. coli運搬ベクターは、例えば、プロモーターとして、ポリヘドリン
をコードしているDNAを含み、その後本発明の抗体をコードしているDNAがクロー
ニングされる。E. coliにおける正確な運搬ベクタークローンの同定後、これは
、不完全なバキュロウイルスDNAと共に、昆虫細胞へトランスフェクションされ
、バキュロウイルスDNAにより組換えられ、その結果、生存能のあるバキュロウ
イルスが作出される。強力な昆虫細胞プロモーターを使用し、本発明の方法にお
いて、大量の本発明の抗体タンパク質が産生され、これは例えば真核細胞シグナ
ル配列との融合により、培地へと分泌される。抗体タンパク質の機能停止発現(d
ie expression)のための昆虫細胞発現システムは、市販されている。昆虫細胞発
現システムは、本発明のscFvフラグメント及びFab又はF(ab')2フラグメント並び
にエフェクター分子に融合された抗体タンパク質又はそれらの断片に特に適して
いるが、完全な抗体分子についても適している。The method of preparing the antibody protein of the present invention can also be carried out by insect cells, for example as a transient or stable expression system or a baculovirus expression system. Here, for example, Sf-9 insect cells are, for example, Autographa cal
Infected by ifornica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) or related viruses. There is no risk of contamination with viruses that are pathogens for mammals,
As a result, the therapeutic antibody of the present invention can be advantageously prepared in insect cells. The aforementioned E. coli delivery vector contains, for example, a DNA encoding polyhedrin as a promoter, and then the DNA encoding the antibody of the present invention is cloned. After identification of the correct delivery vector clone in E. coli, it was transfected into insect cells with incomplete baculovirus DNA and recombined with baculovirus DNA, resulting in the production of viable baculovirus. To be done. Using the strong insect cell promoter, the method of the invention produces large amounts of the antibody protein of the invention, which is secreted into the medium, for example by fusion with a eukaryotic signal sequence. Non-functional expression of antibody protein (d
Insect cell expression systems for ie expression) are commercially available. The insect cell expression system is particularly suitable for scFv and Fab or F (ab ') 2 fragments of the invention and antibody proteins or fragments thereof fused to effector molecules, but also for complete antibody molecules. .

【００４０】 哺乳類発現システムの利点のひとつは、例えばCOS-細胞のような一過性の発現
システム、又はBHK、CHO、骨髄腫細胞などのような安定した発現システムにおい
て、これらは、非常に良好なグリコシル化及びフォールディングの条件を生じる
ことである(同じく実施例2参照)。哺乳類細胞は、例えば、ワクシニア、セムリ
キ森林熱ウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス発現システムと共に使用す
ることもできる。ウシ、ヤギ及びマウスのようなトランスジェニック動物も、本
発明の方法に適している。Nicotiana tabacum(タバコ)のようなトランスジェニ
ック植物も、本発明の方法における使用に適している。これらは、本発明の抗体
断片の調製に特に適している。シグナル配列に融合された本発明の抗体タンパク
質をコードしている本発明の核酸のゲノム組込み後に、該抗体タンパク質の間質
空隙への分泌を実現することができる。One of the advantages of mammalian expression systems is that they are very good in transient expression systems such as COS-cells or stable expression systems such as BHK, CHO, myeloma cells etc. Glycosylation and folding conditions (see also Example 2). Mammalian cells can also be used with viral expression systems such as vaccinia, semliki forest virus and adenovirus. Transgenic animals such as cows, goats and mice are also suitable for the method of the invention. Transgenic plants such as Nicotiana tabacum (tobacco) are also suitable for use in the method of the invention. These are particularly suitable for the preparation of the antibody fragments of the invention. After genomic integration of a nucleic acid of the invention encoding an antibody protein of the invention fused to a signal sequence, secretion of the antibody protein into the interstitial space can be achieved.

【００４１】 本発明は特に、該宿主が哺乳類細胞、好ましくはCHO又はCOS細胞であるような
、本発明の方法に関する。 本発明は特に、該宿主細胞が、軽鎖又は重鎖についての発現ユニットを保持す
るような2個のプラスミドにより同時にトランスフェクションされるような本発
明の方法に関する。 本発明の抗体タンパク質は、FAP抗原へと治療用物質を導くことに高い-特異性
のある物質である。従って、別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該抗体タ
ンパク質が治療用物質に結合されることを特徴としている。The invention especially relates to the method of the invention, wherein said host is a mammalian cell, preferably a CHO or COS cell. The invention especially relates to the method of the invention wherein the host cell is co-transfected with two plasmids carrying the expression units for the light or heavy chains. The antibody protein of the present invention is a substance with high specificity for guiding a therapeutic substance to the FAP antigen. Therefore, another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that the antibody protein is bound to a therapeutic substance.

【００４２】 この本発明の抗体タンパク質は、更に治療用物質又はエフェクター分子に遺伝
子操作により結合され得ることも好ましい。本発明において、この種の治療用物
質は、サイトカインであり、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL
-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、
IL-18などのインターロイキン(IL)、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、
IFNω又はIFNτ、腫瘍壊死因子(TNF)であるTNFα及びTNFβ、TRAIL、免疫変調又
は免疫賦活タンパク質、もしくはアポトーシス-又はネクローシス-誘導性タンパ
ク質がある。従って、本発明の抗体-エフェクター分子複合体は、抗体-サイトカ
イン融合タンパク質を含み、かつ更に二重特異抗体誘導体及び抗体-スーパー抗
原融合タンパク質を含む。これらは、好ましくは、生体自身の抗-腫瘍防御機構
の活性化に使用され、その結果治療的用途に適している。別の好ましい本発明の
FAP-特異抗体タンパク質は、それが体細胞遺伝子治療に使用されることを特徴と
している。例えば、これは、抗体毒素-融合タンパク質として(例えば他の標的に
ついては、Chenらの論文、Nature、385:78-80 (1997)に記されている)、もしく
は本発明の抗体及びT-細胞受容体又はFc-受容体からなる融合タンパク質として(
膜貫通領域及び細胞内領域、例えばWelsらの論文、Gene、159:73-80 (1995)を参
照のこと)使用することにより実現することができる。体細胞遺伝子治療の使用
は、更にシャトルベクター、遺伝子プローブ又は宿主細胞における、本発明の核
酸の発現によっても実行することができる。It is also preferred that the antibody protein of the present invention can be further linked to a therapeutic substance or effector molecule by genetic engineering. In the present invention, this type of therapeutic substance is a cytokine, for example, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL.
-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17,
Interleukins (IL) such as IL-18, interferon (IFN) α, IFNβ, IFNγ,
There are IFNω or IFNτ, tumor necrosis factor (TNF) TNFα and TNFβ, TRAIL, immunomodulatory or immunostimulatory proteins, or apoptosis- or necrosis-inducible proteins. Thus, the antibody-effector molecule complex of the present invention comprises an antibody-cytokine fusion protein and further comprises a bispecific antibody derivative and an antibody-superantigen fusion protein. They are preferably used for the activation of the body's own anti-tumor defense mechanisms, so that they are suitable for therapeutic use. Another preferred invention
The FAP-specific antibody protein is characterized in that it is used in somatic gene therapy. For example, this can be as an antibody toxin-fusion protein (e.g., for other targets, see Chen et al., Nature, 385: 78-80 (1997)), or with antibodies of the invention and T-cells. As a fusion protein consisting of receptor or Fc-receptor (
Transmembrane region and intracellular region, for example, see Wels et al., Gene, 159: 73-80 (1995)). The use of somatic gene therapy can also be carried out by expression of the nucleic acids of the invention in shuttle vectors, gene probes or host cells.

【００４３】 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該治療用物質が、放射性同位体、毒
素又は免疫毒素、トキソイド、融合タンパク質、例えば遺伝子操作された融合タ
ンパク質、炎症性物質及び化学療法剤並びにホウ素のような中性子捕獲反応を可
能にする元素(ホウ素-中性子捕獲反応、BNC)から選択されることを特徴としてい
る。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該放射性同位体が、β線放出する放
射性同位体であることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該放射性同位体が、治療用物質とし
て本発明の抗体に連結するのに特に適していることが証明されているような、18 6 レニウム、188レニウム、131ヨウ素及び90イットリウムから選択されることを
特徴としている。本発明の抗体の放射性ヨウ素標識法は、国際公開公報第93/058
04号に開示されている。In another preferred antibody protein of the present invention, said therapeutic substance is a radioisotope, a toxin or an immunotoxin, a toxoid, a fusion protein such as a genetically engineered fusion protein, an inflammatory substance and a chemotherapeutic agent and boron. It is characterized by being selected from the elements (boron-neutron capture reaction, BNC) that enable the neutron capture reaction such as. Another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that the radioisotope is a β-emitting radioisotope. Another preferred antibody proteins of the invention, the radioisotopes, such as to be particularly suitable for coupling to the antibodies of the present invention has been demonstrated as a therapeutic substance, 18 6 rhenium, 188 rhenium, 131 It is characterized by being selected from iodine and 90 yttrium. The radioactive iodine labeling method of the antibody of the present invention is described in WO 93/058.
It is disclosed in No. 04.

【００４４】 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、これが標識されていることを特徴と
している。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、これが検出可能なマーカーで標識さ
れていることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、検出可能なマーカーが、酵素、色素
、放射性同位体、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジン及びビオチンから選択さ
れることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、これが造影可能な物質と結合されて
いることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、造影可能な物質が、放射性同位体で
あることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該放射性同位体がγ線-放出する放
射性同位体であることを特徴としている。 別の好ましい本発明の抗体タンパク質は、該放射性同位体が125ヨウ素である
ことを特徴としている。Another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that it is labeled. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that it is labeled with a detectable marker. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the detectable marker is selected from enzymes, dyes, radioisotopes, digoxigenin, streptavidin and biotin. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that it is linked to an imageable substance. Another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that the imageable substance is a radioisotope. Another preferred antibody protein of the present invention is characterized in that said radioisotope is a γ-ray emitting radioisotope. Another preferred antibody protein of the invention is characterized in that the radioisotope is 125 iodine.

【００４５】 別の重要な本発明の態様は、本発明の抗体タンパク質及び1種以上の医薬とし
て許容できる担体物質を含有する医薬調製物に関する。本発明において医薬とし
て許容できる担体又はアジュバントは、例えば、本発明の抗体タンパク質の吸収
を安定化又は改善するような生理的に許容できる化合物である。このような生理
的に許容できる化合物は、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランの
ような糖類、アスコルビン酸又はグルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤
、低分子量化合物もしくは他の安定剤又はアジュバントである(同じく「Remingt
on's Pharmaceutical Sciences」、18版、編集Mack Publ., Easton.参照)。当業
者は、医薬として許容できる担体の選択が、例えば、化合物の投与経路によって
決まることを知っている。該医薬組成物は、遺伝子治療のための本発明のベクタ
ーも含むことができ、かつ加えて医薬組成物の標的化された投与のために、アジ
ュバントとしてコロイド分散システム又はリポソームを含むことができる。本発
明のベクターを含む宿主又は宿主細胞も、例えば遺伝子治療のために、本発明の
範囲内の医薬組成物において使用することができる。Another important aspect of the invention relates to a pharmaceutical preparation containing the antibody protein of the invention and one or more pharmaceutically acceptable carrier substances. The pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant in the present invention is, for example, a physiologically acceptable compound that stabilizes or improves the absorption of the antibody protein of the present invention. Such physiologically acceptable compounds are, for example, sugars such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight compounds or other stabilizers or adjuvants ( Similarly, "Remingt
on's Pharmaceutical Sciences ", 18th edition, edited by Mack Publ., East on.). Those skilled in the art will know that the choice of pharmaceutically acceptable carrier will depend, for example, on the route of administration of the compound. The pharmaceutical composition may also include a vector of the invention for gene therapy and may additionally include a colloidal dispersion system or liposomes as an adjuvant for targeted administration of the pharmaceutical composition. Hosts or host cells containing the vectors of the invention can also be used in pharmaceutical compositions within the scope of the invention, eg, for gene therapy.

【００４６】 別の重要な本発明の態様は、腫瘍の治療又は造影のための本発明の医薬調製物
の使用に関し、ここで該腫瘍は、活性化されたストローマ繊維芽細胞に関連して
いる。 この本発明の使用は、特に、該腫瘍が、下記の種類の癌又はそれらを基本とし
た形のひとつに分類される場合に関連し、かつその結果結腸直腸癌、非小細胞肺
癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵癌及び転移性脳腫瘍から選択さ
れる。Another important aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical preparation of the invention for the treatment or imaging of tumors, wherein the tumor is associated with activated stromal fibroblasts. . This use of the present invention is particularly relevant when the tumor is classified into one of the following types of cancer or a form based on them, and as a result: colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, It is selected from head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, bladder cancer, pancreatic cancer and metastatic brain tumor.

【００４７】 更に別の重要な本発明の態様は、癌治療のための医薬調製物の調製のための本
発明の抗体タンパク質の使用に関する。 更に別の重要な本発明の態様は、活性化されたストローマ繊維芽細胞の造影の
ための本発明の抗体タンパク質の使用に関する。 本発明の追加の態様は、活性化された繊維芽細胞を含む可能性があるプローブ
が、本発明の抗体タンパク質と、該抗体タンパク質とその抗原の複合体の形成に
適した条件下で接触され、並びに該複合体の形成、及びその結果としての創傷治
癒、炎症過程又は腫瘍における活性化されたストローマ繊維芽細胞の存在が検出
されることを特徴とする、創傷治癒、炎症過程又は腫瘍において、活性化された
ストローマ繊維芽細胞を検出する方法である。Yet another important aspect of the invention relates to the use of the antibody protein of the invention for the preparation of a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer. Yet another important aspect of the invention relates to the use of the antibody protein of the invention for imaging activated stromal fibroblasts. An additional aspect of the invention is that a probe, which may comprise activated fibroblasts, is contacted with an antibody protein of the invention under conditions suitable for the formation of a complex of said antibody protein and its antigen. And the formation of said complex and the resulting detection of the presence of activated stromal fibroblasts in the wound healing, inflammatory process or tumor, in wound healing, inflammatory process or tumor, This is a method for detecting activated stromal fibroblasts.

【００４８】 前段で説明された本発明の方法は、特に該腫瘍が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌
、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵癌及び転移性脳腫瘍から選択され
る点を特徴としている。 本発明は更に、適当なプローブが、抗体-抗原複合体を形成するのに適した条
件下で、本発明の抗体タンパク質と接触され、こうして形成された複合体が検出
され、かつこうして形成された複合体の存在が腫瘍ストローマの存在と相関して
いるような、腫瘍ストローマの検出法を含む。 前段で説明された本発明の方法は特に、該抗体が検出可能なマーカーで標識さ
れることを特徴としている。 下記実施例は、本発明の理解を補助することを意図し、いかなる意味において
も発明の範囲を限定するものではない。The method of the invention as described in the preceding paragraph, in particular that the tumor is selected from colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, bladder cancer, pancreatic cancer and metastatic brain tumors. It is characterized by The invention further provides that a suitable probe is contacted with an antibody protein of the invention under conditions suitable to form an antibody-antigen complex, the complex thus formed is detected and thus formed Including methods of detecting tumor stroma, such that the presence of the complex correlates with the presence of tumor stroma. The method of the invention described in the preceding paragraph is particularly characterized in that the antibody is labeled with a detectable marker. The following examples are intended to aid the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

【００４９】実施例1 1. ガイド付き選択法のためのヒトVHレパートリーのクローニング A) 完全なヒトV領域を伴う抗-FAP抗体の開発 調製法： 1. F19 VHのクローニング 2. ヒトV-レパートリーの調製 ・Perssonらの方法(PNAS、88:2432(1991))の改善された方法での、末梢血リンパ
球由来のヒトVL(λ、κ)レパートリーの逆転写、PCR増幅。 ・ファージディスプレーベクター(pSEX81、DKFZ、Heidelberg；Breitlingら、Ge
ne、104:147(1991))における、VLレパートリーのクローニング。 レパートリーのサイズ：VL 107個クローン ・末梢血リンパ球、胸腺、脾、骨髄、扁桃腺、リンパ節、胎児肝由来のヒトVH(I
gG, IgD, IgM)レパートリーの逆転写、PCR増幅(Perssonらの方法(PNAS、88:2432
(1991))の改善された方法)。 ・方法の改善：IgD及び様々なリンパ系組織の使用 ・ファージディスプレーベクター(pSEX81、DKFZ、Heidelberg；Breitlingら、Ge
ne、104:147(1991))におけるVHレパートリーのクローニング レパートリーサイズ：VH 3x108個クローン 3. VL F19を機能的に交換するヒトVL領域の選択： ・ファージディスプレー選択及びガイド構造としてのVH F19によるガイド付き選
択戦略 (改善されたMcCaffertyらの法(Nature、348: 552(1990))及びJespersらの方法(B
io/Technology、12: 899(1994)) ＝＞ヒトFAP-特異性VL領域の単離 (VL：III5、III10、III25、III43として公知) 4. VH F19を機能的に交換するか又はFAP-特異性を付与するようなヒトVH領域の
選択： ・ガイド構造としての様々なVLによるファージディスプレー選択及びガイド付き
選択戦略 (改善されたMcCaffertyらの法(Nature、348: 552(1990))及びJespersらの方法(B
io/Technology、12: 899(1994)) ＝＞下記のヒトFAP-特異性scFvの単離： scFv #13: VH #13, IgG； VL III25 scFv #46: VH #46, IgG； VL III25 scFv #50: VH #50, IgD, VL III25 選択されたVH及びVL領域の配列：(図参照) Example 1 1. Cloning of human VH repertoire for guided selection A) Development of anti-FAP antibody with complete human V region Preparation: 1. Cloning of F19 VH 2. Human V-repertoire Preparation of the method: Reverse transcription, PCR amplification of human VL (λ, κ) repertoire from peripheral blood lymphocytes by an improved method of the method of Persson et al. (PNAS, 88: 2432 (1991)).・ Phage display vector (pSEX81, DKFZ, Heidelberg; Breitling et al., Ge
ne, 104: 147 (1991)), cloning of the VL repertoire. Repertoire size: VL 10 7 clones ・ Human VH (I) derived from peripheral blood lymphocytes, thymus, spleen, bone marrow, tonsils, lymph nodes, fetal liver
Reverse transcription of the gG, IgD, IgM) repertoire, PCR amplification (Persson et al. (PNAS, 88: 2432
(1991)) improved method). -Improved method: use of IgD and various lymphoid tissues-Phage display vector (pSEX81, DKFZ, Heidelberg; Breitling et al., Ge
ne, 104: 147 (1991)) VH repertoire cloning Repertoire size: VH 3x10 8 clones 3. Selection of human VL region functionally exchanging VL F19: by VH F19 as phage display selection and guide structure Guided selection strategies (improved McCafferty et al. (Nature, 348: 552 (1990)) and Jespers et al. (B
io / Technology, 12: 899 (1994)) => Isolation of human FAP-specific VL region (known as VL: III5, III10, III25, III43) 4. Functional replacement of VH F19 or FAP- Selection of human VH regions to confer specificity: Phage display selection with various VL as guide structures and guided selection strategies (improved McCafferty et al. Method (Nature, 348: 552 (1990)) and Jespers. Et al. Method (B
io / Technology, 12: 899 (1994)) => Isolation of the following human FAP-specific scFv: scFv # 13: VH # 13, IgG; VL III25 scFv # 46: VH # 46, IgG; VL III25 scFv # 50: VH # 50, IgD, VL III25 Sequence of selected VH and VL regions: (see figure)

【００５０】 抗原結合特性 ・ELISA：ヒトFAPの抗原特異性の検出 ・cF19による抗原結合の競合(scFv #13の検出) ・FAP+ 細胞への結合の研究： scFv #13(ミニボディ構成体における二価として) EC50：8〜12nM(下記参照) scFv #50(ミニボディ構成体における二価として) EC50：32nM ・腫瘍生検標本のFAP-特異性免疫組織学的染色 (ミニボディ構成体中のscFv #13について検出)Antigen binding properties-ELISA: Detection of antigen specificity of human FAP-Competition of antigen binding by cF19 (detection of scFv # 13) -Study of binding to FAP + cells: scFv # 13 (2 in minibody constructs) EC 50 : 8-12 nM (see below) scFv # 50 (as bivalent in minibody constructs) EC 50 : 32 nM FAP-specific immunohistological staining of tumor biopsy specimens (minibody constructs) (Detected in scFv # 13 inside)

【００５１】1)ヒトVL-及びVHレパートリーのPCR増幅 ： a)VH及びVLレパートリーを調製するために、様々なV-遺伝子ファミリーを、適当
なファミリー-特異性プライマーを用い、PCRにより、cDNAから個別に増幅する(
下記参照)。 b)VH-及びVL-PCR増幅のための全てのforward/3'-プライマーは、定常免疫グロブ
リンドメイン(IgG、IgD、IgM、κ、λ)の遺伝子配列に対して相補的である。こ
れは、非常にわずかな3'-プライマーによる、V領域の効率的アイソタイプ-特異
性増幅を可能にする。対照的に、Marksらの方法(J. Mol. Biol.、222: 581(1991
))は、V領域のJ-セクションに相補的な複数の異なる3'-プライマーを使用する。 1) PCR amplification of human VL- and VH repertoires : a) To prepare VH and VL repertoires, various V-gene families were cloned from cDNA by PCR using appropriate family-specific primers. Amplify individually (
See below). b) All forward / 3'-primers for VH- and VL-PCR amplifications are complementary to the gene sequences of the constant immunoglobulin domain (IgG, IgD, IgM, kappa, lambda). This allows efficient isotype-specific amplification of the V region with very few 3'-primers. In contrast, the method of Marks et al. (J. Mol. Biol., 222: 581 (1991).
)) Uses multiple different 3'-primers complementary to the J-section of the V region.

【００５２】2)ヒトVHレパートリーの調製及びクローニング： 多様性の高い多数のクローン(3x108)からなるヒトVHレパートリーの、調製及
びクローニング(方法については下記参照)。 a)高い多様性を確実にするために、新たに単離した末梢血リンパ球に加え、非常
に多数のドナー由来の様々なリンパ系組織由来の市販のcDNA/RNAを、VHレパート
リーのための出発材料として使用した。骨髄及び胎児肝を使用することにより、
ナイーブVレパートリーが得られ、その結果自己抗原単離の前提条件が形成され
る。 2) Preparation and cloning of human VH repertoire: Preparation and cloning of human VH repertoire consisting of a large number of highly diverse clones (3x10 8 ) (see method below). a) To ensure high diversity, in addition to freshly isolated peripheral blood lymphocytes, commercially available cDNAs / RNAs from a variety of lymphoid tissues from a large number of donors were used for the VH repertoire. Used as starting material. By using bone marrow and fetal liver,
A naive V repertoire is obtained, which forms the precondition for autoantigen isolation.

【００５３】 リンパ系組織(ドナー数)： I)市販のcDNA： −末梢血リンパ球、PBL(550ドナー) −脾(5ドナー) −胸腺(7ドナー) −骨髄(51ドナー) −リンパ節(59ドナー) −扁桃腺(5ドナー) −胎児肝(32ドナー) II)市販のRNA、これはその後実験室においてcDNA中に限局化(circumscribed)し
た。(方法については実施例1, A 1.2参照) −リンパ節(25ドナー) III)新鮮な「バッフィコート」からのPBL(10ドナー)(方法については下記参照)Lymphoid tissue (number of donors): I) Commercially available cDNA: -peripheral blood lymphocytes, PBL (550 donors) -spleen (5 donors) -thymus (7 donors) -bone marrow (51 donors) -lymph nodes ( 59 donors) -Tonsils (5 donors) -Fetal liver (32 donors) II) Commercial RNA, which was subsequently circumscribed in the cDNA in the laboratory. (See Example 1, A 1.2 for method) -Lymph nodes (25 donors) III) PBL from fresh'buffy coat '(10 donors) (see below for method)

【００５４】 先行技術において、下記のリンパ系組織のみが、これまでのところVレパート
リーの給源として説明されている。(組織及びドナー数の組合せを示す)： −PBL(15ドナー)、骨髄(4ドナー)、扁桃腺(4ドナー) (Vaughanら、Nature Biote
chnology、14: 309(1996)) −脾(3ドナー)及びPBL(2ドナー)(Sheetsら、PNAS、95: 6157(1998)) −骨髄(Williamsonら、PNAS、90:4141(1993)) −リンパ節(1ドナー) (Clarkら、Clin. Exp. Immunol.、109: 166(1997))In the prior art, only the following lymphoid tissues have been described so far as sources of the V repertoire. (Shows the combination of tissue and donor number):-PBL (15 donors), bone marrow (4 donors), tonsils (4 donors) (Vaughan et al. Nature Biote
chnology, 14: 309 (1996))-spleen (3 donors) and PBL (2 donors) (Sheets et al., PNAS, 95: 6157 (1998))-bone marrow (Williamson et al., PNAS, 90: 4141 (1993))- Lymph node (1 donor) (Clark et al., Clin. Exp. Immunol., 109: 166 (1997))

【００５５】 b)更に、大きいレパートリー多様性を得るために、IgM及びIgGレパートリーに加
え、IgDレパートリーを追加的に増幅した。このために、IgD-特異性PCRプライマ
ーを開発した(下記参照)。 c)制限酵素による処理後、アガロースゲル上での、ヒトVHレパートリーのPCR断
片の精製は、非常に重要であることが証明された。それに続くこのレパートリー
のファージディスプレーベクターへのクローニングにおいて、その結果機能性sc
Fv発現カセットを伴うクローンの非常に高い割合を達成することが可能である。
これは、遺伝的に安定したファージディスプレーレパートリーを得るための、必
須の前提条件である(方法については実施例1, A 1.4参照)。3)ヒトVHレパートリー及び様々なヒトFAP-特異性VL領域からなる組合せレパート リーの調製 ：B) Furthermore, in addition to the IgM and IgG repertoires, the IgD repertoire was additionally amplified in order to obtain large repertoire diversity. For this, IgD-specific PCR primers were developed (see below). c) Purification of the PCR fragment of the human VH repertoire on agarose gel after treatment with restriction enzymes proved to be very important. Subsequent cloning of this repertoire into phage display vectors resulted in functional sc
It is possible to achieve a very high proportion of clones with Fv expression cassettes.
This is an essential prerequisite for obtaining a genetically stable phage display repertoire (see Example 1, A 1.4 for method). 3) Preparation of combination repertoire consisting of human VH repertoire and various human FAP- specificity VL regions:

【００５６】 組合せレパートリーの定義： 遺伝子操作による対応する相補的V-配列を伴うVレパートリーの組合せ(VHに関
しVLに対する相補性、及びその逆)。この組合せに使用したV-配列は、ひとつのV
-配列、複数の異なる配列又はVレパートリーからなることができる。 a)クローニング戦略：ファージディスプレーベクターにおいて、ヒトVHレパート
リーは、定義された非-FAP-特異性VL領域(ダミー-VL)と組合せた。このダミー-V
L領域は、制限切断部位を使用し、FAP-特異性VL領域により非常に効率的に交換
することができる。これは、機能性クローンを非常に高い割合(＞95％)で含む多
様な組合せレパートリーを保証するために(scFvリーディングフレームの完全性
に関連)、先に試験されたヒトVHレパートリーと特異性ヒトVLとの効果的組合せ
のための条件を作成した(方法については下記参照)。Definition of a combinatorial repertoire: A combination of V repertoires with the corresponding complementary V-sequences by genetic engineering (complementarity to VL with respect to VH and vice versa). The V-array used for this combination is one V
-Can consist of sequences, multiple different sequences or V repertoire. a) Cloning strategy: In the phage display vector, the human VH repertoire was combined with a defined non-FAP-specific VL region (dummy-VL). This dummy-V
The L region uses the restriction cleavage site and can be very efficiently replaced by the FAP-specific VL region. This was compared to previously tested human VH repertoires and Conditions were created for effective combination with VL (see below for method).

【００５７】 b) F19に類似した完全なヒトscFvの選択の確立を増大するために、ヒトVHレパー
トリーを、様々なヒトFAP-特異性VL領域の配列(VL：III10、III25、III5、III43
)と組合せた。これらのヒトVL領域は、ヒトFAP-特異性VH選択のためのガイド構
造として利用した。FAP-特異性ヒトVLはそれ自身、F19 VHによる先行する「ガイ
ド付き選択」工程において、ヒトVLレパートリーから単離されている。B) In order to increase the establishment of the selection of a complete human scFv similar to F19, the human VH repertoire was sequenced with various human FAP-specific VL region sequences (VL: III10, III25, III5, III43).
). These human VL regions served as guide structures for human FAP-specific VH selection. FAP-specific human VL has itself been isolated from the human VL repertoire in a preceding "guided selection" step with F19 VH.

【００５８】 c) 組合せレパートリーの、存在するFAP-特異性scFv(例えば、ハイブリドーマ株
F19由来のマウスのscFv又はヒトVL及びF19 VHとのキメラ抗-FAP scFv)をコード
しているファージミドベクターとのDNA夾雑は、技術上重大な問題点である。こ
れを克服するために、下記の戦略が必要であることが証明されている：ガイド構
造としてのマウスのF19 VHによるヒト抗-FAP VL-配列の「ガイド付き選択」工程
後、このVH-配列を伴わないヒトVL-配列が、最初にプラスミド(pUCBM21)におい
てサブ-クローニングされる。次にこのヒトVL領域は、制限酵素を用いて切断さ
れ、かつ既にファージディスプレーベクター内に存在するヒトVHレパートリーと
組合せられる。これは、関連するガイド構造のVL-配列と離れて、FAP-特異性V領
域が組合せレパートリーへ導入されることを妨げる(方法については下記参照)。C) a combination repertoire of existing FAP-specific scFvs (eg hybridoma strains)
DNA contamination with a phagemid vector encoding F19-derived mouse scFv or human VL and chimeric anti-FAP scFv with F19 VH is a serious technical problem. To overcome this, the following strategy has been demonstrated to be necessary: after the "guided selection" step of human anti-FAP VL-sequence with mouse F19 VH as guide structure, this VH-sequence The human VL-sequence without is first sub-cloned in the plasmid (pUCBM21). This human VL region is then cleaved with restriction enzymes and combined with the human VH repertoire already present in the phage display vector. This prevents the FAP-specific V regions from being introduced into the combinatorial repertoire apart from the VL-sequence of the relevant guide structure (see below for method).

【００５９】4)ファージディスプレー選択 ： FAP-特異性ヒトV領域のファージディスプレー選択は、交差反応性scFvの蓄積
を防止するために、選択洗浄法の開発を必要としている(方法については下記参
照)。 4) Phage display selection : Phage display selection of FAP-specific human V regions requires the development of selective washing methods to prevent accumulation of cross-reactive scFv (see below for method). .

【００６０】B)マウスのHCDR3 F19を含むヒト抗-FAP抗体の開発(HCDR3を維持するガイド付き
選択) ： 調製法： 1. F19 VHのクローニング 2. ヒトV-レパートリーの調製 ・末梢血リンパ球由来のヒトVL(λ、κ)レパートリーの逆転写、PCR増幅(変更さ
れたPerssonらの方法(PNAS、88:2432(1991))。 ・ファージディスプレーベクター(pSEX81、DKFZ、Heidelberg；Breitlingら、Ge
ne、104:147(1991))における、VLレパートリーのクローニング。レパートリーの
サイズ：VL 107個クローン ・末梢血リンパ球由来のヒトVHレパートリーの逆転写、PCR増幅(改善されたPers
sonらの方法(PNAS、88:2432(1991)))、FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3からなるVHセグメ
ントのPCR増幅。 ・ファージディスプレーベクター(pSEX81, DKFZ, Heidelberg； Breitlingら、G
ene、104:147(1991))におけるVHセグメント(FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3)からなるレ
パートリーのクローニング、レパートリーのサイズ：VH 4x107個クローン B) Development of human anti-FAP antibody containing mouse HCDR3 F19 (guided to maintain HCDR3
Selection) : Preparation method: 1. Cloning of F19 VH 2. Preparation of human V-repertoire-Reverse transcription of human VL (λ, κ) repertoire derived from peripheral blood lymphocytes, PCR amplification (modified Persson et al. PNAS, 88: 2432 (1991)) Phage display vector (pSEX81, DKFZ, Heidelberg; Breitling et al., Ge
ne, 104: 147 (1991)), cloning of the VL repertoire. Repertoire size: VL 10 7 clones ・ Reverse transcription of human VH repertoire derived from peripheral blood lymphocytes, PCR amplification (improved Pers
Son et al. (PNAS, 88: 2432 (1991))), PCR amplification of VH segment consisting of FR1 + CDR1 + FR2 + CDR2 + FR3.・ Phage display vector (pSEX81, DKFZ, Heidelberg; Breitling et al., G
ene, 104: 147 (1991)) cloning of repertoire consisting of VH segment (FR1 + CDR1 + FR2 + CDR2 + FR3), repertoire size: VH 4x10 7 clones

【００６１】 3. VL F19を機能的に交換するヒトVL領域の選択：(項A)3参照) 4. F19由来のHCDR3を含みかつVH F19を機能的に交換するようなヒトVH領域の選
択： ・ガイド構造として、VL III43又はVL III5及びHCDR3 F19＋ヒトFR4による、HCD
3を維持するガイド付き選択戦略 (本発明者らの方法の開発は、McCaffertyらの方法(Nature、348: 552(1990))及
びJespersらの方法(Bio/Technology、12: 899(1994)及びRaderらの方法、PNAS、
95: 8910(1998)を改善した。) ＝＞マウスのHCDR3 F19を含む、下記ヒトFAP-特異性scFvの単離： scFv #34: VH #34, IgG； VL III43 scFv #18: VH #18, IgG； VL III433. Selection of human VL region functionally exchanging VL F19: (see Section A) 3) 4. Selection of human VH region containing HCDR3 derived from F19 and functionally exchanging VH F19 HCD with VL III43 or VL III5 and HCDR3 F19 + human FR4 as a guide structure
A guided selection strategy that maintains 3 (the development of our method was McCafferty et al. (Nature, 348: 552 (1990)) and Jespers et al. (Bio / Technology, 12: 899 (1994) and Rader's method, PNAS,
95: 8910 (1998) was improved. ) => Isolation of the following human FAP-specific scFv containing mouse HCDR3 F19: scFv # 34: VH # 34, IgG; VL III43 scFv # 18: VH # 18, IgG; VL III43

【００６２】 構造（図参照） 抗原結合特性 ・ELISA：ヒトFAPの抗原特異性の検出 ・cF19及びmAb F19による抗原結合の競合 ・FAP+ 細胞への結合の研究： scFv #34及び#18(一価) EC50：約6nM ・腫瘍生検標本のFAP-特異性免疫組織学的染色 (scFv #34ミニボディとして)Structure (see figure) Antigen binding properties-ELISA: Detection of antigen specificity of human FAP-Competition of antigen binding by cF19 and mAb F19-Study on binding to FAP + cells: scFv # 34 and # 18 (monovalent) ) EC 50 : about 6 nM ・ FAP-specific immunohistological staining of tumor biopsy specimens (as scFv # 34 minibody)

【００６３】1.1 RNA単離 使用したmRNA給源は、合計10個のバッフィコートの新鮮なリンパ球からの総RN
Aを単離した。 バッフィコートからのリンパ球の単離のために、Ficoll (LYMPHOPREP社)15ml
を、50ml Falcon Tube中に入れ周囲温度に放置し、RPMI培地で1:4希釈したバッ
フィコート30mlで被覆した。700gで30分間遠心した後、中間相(interphase)を除
去し、かつRPMI培地40mlを添加した後、700gで5分間遠心した。その後細胞ペレ
ットを、RPMI培地で再度、及びPBSで1回洗浄した。これらの細胞を、最終洗浄工
程後に遠心し、106個細胞につきRNA-Clean(登録商標)溶液(AGS社、ハイデルベル
グ)200μlを添加した。変性液の添加直後、細胞を太い(coarse)カニューレ(サイ
ズ1)及び次に細いカニューレ(サイズ18)を繰り返し上下に通過させることにより
、ホモジナイズした。薄い液体溶解物を、1/10容量クロロホルム(p.a.)と混合し
、激しく振盪し、氷上で5分間インキュベーションした。遠心後(12000gで15分間
)、上清をざっと除去し、かつ等量のイソプロパノールと混合し、4℃で45分間イ
ンキュベーションし、その後12000gで45分間遠心した。上清を慎重に注ぎ捨て、
かつペレットを氷冷した70％エタノールで洗浄した。その後RNA-Quick-Prep(Pha
rmacia社)の成分で、RNAペレットを再洗浄した。これを実行するために、ペレッ
トを、抽出緩衝液 113 μl、LiCl溶液263μl及びCs-トリフルオロ酢酸375μlの
混合液中に溶解し、完全に混合し(Vortex)かつエッペンドルフ遠心管に入れ遠心
した(12000g)。RNAペレットを再度、70％エタノールで洗浄し、10分間風乾し、
濃度1μg/μlになるようH20で調節した。 1.1 RNA isolation The mRNA source used was total RNs from a total of 10 buffy coat fresh lymphocytes.
A was isolated. Ficoll (LYMPHOPREP) 15 ml for isolation of lymphocytes from buffy coat
Were placed in a 50 ml Falcon Tube, left at ambient temperature and coated with 30 ml of buffy coat diluted 1: 4 in RPMI medium. After centrifuging at 700 g for 30 minutes, the interphase was removed, and 40 ml of RPMI medium was added, followed by centrifugation at 700 g for 5 minutes. The cell pellet was then washed again with RPMI medium and once with PBS. These cells were centrifuged after the final washing step, and 200 μl of RNA-Clean (registered trademark) solution (AGS, Heidelberg) was added to 10 6 cells. Immediately after the addition of the denaturing solution, the cells were homogenized by repeatedly passing them up and down a coarse cannula (size 1) and then a thin cannula (size 18). The thin liquid lysate was mixed with 1/10 volume chloroform (pa), shaken vigorously and incubated on ice for 5 minutes. After centrifugation (15 minutes at 12000g
), The supernatant was roughly removed and mixed with an equal volume of isopropanol, incubated at 4 ° C. for 45 minutes and then centrifuged at 12000 g for 45 minutes. Carefully pour off the supernatant,
And the pellet was washed with ice-cold 70% ethanol. Then RNA-Quick-Prep (Pha
The RNA pellet was rewashed with the components of rmacia. To do this, the pellet was dissolved in a mixture of 113 μl extraction buffer, 263 μl LiCl solution and 375 μl Cs-trifluoroacetic acid, mixed thoroughly (Vortex) and placed in an Eppendorf centrifuge tube and centrifuged ( 12000g). Wash the RNA pellet again with 70% ethanol, air dry for 10 minutes,
The concentration was adjusted with H 2 0 to 1 μg / μl.

【００６４】 あるいは、総RNAを、QIAGEN社(Midi)製造のRNA単離カラムを、製造業者の指示
に従って用いて単離した。 mRNAを、総RNAから、QIAGEN社が製造したOligotex-Kit(Midi)を調製した。使
用した方法は、製造業者の指示に従った。単離したmRNAを、1/10容量の2.5M RNA
se-非含有酢酸カリウム(pH5.2)と混合し、かつ2.5容量のエタノールp.a.を-20℃
で2時間又は一晩かけて添加し、沈殿した。遠心(45分、13000g、4℃)後、mRNAを
、氷冷した70％エタノールで2回洗浄し(12000g、4℃で5分間の遠心)、かつ短時
間風乾した後、RNAse-非含有H20の10〜20μl中に溶解した。mRNAの濃度を概算す
るために、総RNA標準希釈液シリーズと比較した。これを実行するために、測定
されるべき試料1μlを、臭化エチジウム溶液(1μg/ml)10μlと一緒にし、フィル
ム上に垂らし、かつUVランプを用い標準化された濃度と比較した。このmRNAをcD
NA 合成のために直接使用し、かつ-80℃で貯蔵するために凍結した。Alternatively, total RNA was isolated using an RNA isolation column manufactured by QIAGEN (Midi) according to the manufacturer's instructions. From the total RNA, Oligotex-Kit (Midi) manufactured by QIAGEN was prepared. The method used followed the manufacturer's instructions. Isolate isolated mRNA in 1/10 volume of 2.5M RNA
Mix with se-free potassium acetate (pH 5.2) and add 2.5 volumes of ethanol pa at -20 ° C.
At room temperature for 2 hours or overnight and precipitated. After centrifugation (45 min, 13000 g, 4 ° C), the mRNA was washed twice with ice-cold 70% ethanol (12000 g, 5 min centrifugation at 4 ° C) and briefly air-dried, then RNAse-free H It was dissolved in 2 0 10~20μl. The total RNA standard dilution series was compared to estimate the concentration of mRNA. To do this, 1 μl of the sample to be measured was combined with 10 μl of ethidium bromide solution (1 μg / ml), hung on a film and compared with a standardized concentration using a UV lamp. This mRNA is cD
Used directly for NA synthesis and frozen for storage at -80 ° C.

【００６５】1.2 ヒトVH領域のcDNA合成 IgG、IgM及びIgD特異性VH-cDNAは、Boehringer-Mannheim and Amersham社製の
cDNA合成キットを用い、mRNAにより調製した。第一のcDNA鎖は、IgGライブラリ
ーのためのIg-特異性プライマーHuIgG1-4RT、IgMライブラリーのためのHuIgM-RT
又はIgDライブラリーのためのHuIgDeltaにより合成した。任意に、オリゴ(dT)及
びオリゴ-ヘキサ-ヌクレオチドを用いた。cDNA合成は、製造業者の指示に従いmR
NA 100ngにより実行し；二次構造を切り離す(detach)ために、使用直前に、mRNA
を70℃で10分間加熱した。cDNAは、混合物20μl中で、AMV-逆転写酵素により、4
2℃のThermocyclerで60分間かけて合成した。このcDNAの品質は、例を挙げると
、プライマー対HuIgGFOR及びHuVHB1を使用するPCR増幅によりチェックした。こ
の目的のために、cDNAの10n倍の希釈を鋳型として用い、かつ36サイクル後に、
アガロースゲル上でPCR産物の特異性バンドが依然検出可能であるような最大希
釈を決定した。 1.2 cDNA synthesis of human VH region IgG, IgM and IgD specific VH-cDNAs were produced by Boehringer-Mannheim and Amersham.
Prepared with mRNA using a cDNA synthesis kit. The first cDNA strand is Ig-specific primer HuIgG1-4RT for IgG library, HuIgM-RT for IgM library.
Alternatively, it was synthesized by HuIgDelta for IgD library. Optionally oligo (dT) and oligo-hexa-nucleotides were used. For cDNA synthesis, follow the manufacturer's instructions.
Performed with 100 ng NA; mRNA was depleted immediately before use to detach secondary structure.
Was heated at 70 ° C. for 10 minutes. The cDNA was labeled with AMV-reverse transcriptase in 4 μl in 20 μl of the mixture.
Synthesis was carried out in a Thermocycler at 2 ° C for 60 minutes. The quality of this cDNA was checked by PCR amplification using the primer pair HuIgGFOR and HuVHB1 by way of example. For this purpose, a 10 n- fold dilution of cDNA was used as template and after 36 cycles,
The maximum dilution was determined such that the specific band of the PCR product was still detectable on the agarose gel.

【００６６】1.3 ヒトVHレパートリーのPCR増幅 各ヒトリンパ系器官のcDNAを、VH領域のPCR増幅のための鋳型として個別に用
いた。6個の個別のPCRバッチを、各リンパ系器官から準備し、6種のVH-特異性5'
プライマー(HuVHB1からHuVHB6)のひとつを、アイソタイプ-特異性3'プライマーH
uIgGFOR、HuIgMFOR又はHuIgDFORのひとつと組合せた。増幅を、鋳型cDNA(200pg)
1μl、25mM MgCl2 、Goldstar反応緩衝液5μl、各200μMのdNTP(Pharmacia社)及
び各プライマー25pmolを含む、50μlの反応混合液中で実行した。95℃で10分後
、Goldstar-ポリメラーゼ0.6Uを添加し、かつこの調製物をPCRワックスで被覆し
た。36回の増幅サイクルを実行したが、各々94℃で15秒の変性、52〜55℃で30秒
の結合(addition)、及び72℃で30秒の伸長であった。最後の増幅工程が終了後、
追加の伸長を72℃で15分間行った。 1.3 PCR amplification of the human VH repertoire The cDNA of each human lymphoid organ was used individually as a template for PCR amplification of the VH region. Six individual PCR batches were prepared from each lymphoid organ and six VH-specific 5 '
Use one of the primers (HuVHB1 to HuVHB6) as the isotype-specific 3'primer H
Combined with one of uIgGFOR, HuIgMFOR or HuIgDFOR. Amplification, template cDNA (200pg)
It was carried out in 50 μl of reaction mixture containing 1 μl, 25 mM MgCl 2 , 5 μl Goldstar reaction buffer, 200 μM each dNTP (Pharmacia) and 25 pmol of each primer. After 10 minutes at 95 ° C, 0.6 U of Goldstar-polymerase was added and the preparation was coated with PCR wax. Thirty-six amplification cycles were carried out, each with 15 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds of addition at 52-55 ° C, and 30 seconds of extension at 72 ° C. After the final amplification step,
An additional extension was performed at 72 ° C for 15 minutes.

【００６７】 制限切断部位NcoI及びHindIIIを増幅されたVH領域の上に導入するために、第
二のPCR増幅を、制限切断部位により伸長されたプライマーにより行った(HuIgGF
ORHINDIII、HuIgMFORHINDIII、HuIgDHINDIIIを3'プライマーとして、及びHuVHB1
NCOIからHuVHB6NCOIを5'プライマーとして)。最初のPCR混合液の反応液1μlを鋳
型として用いた。第二のPCR増幅を、15サイクル行い、各場合に94℃で15秒の変
性、65℃で30秒の結合、及び72℃で30秒の伸長であった。最後の増幅工程が終了
後、再度追加の伸長工程を72℃で5分間行った。同じアイソタイプを基本にした
増幅された材料は一緒にし、かつ容量を減らすために、1/10容量の酢酸ナトリウ
ム(pH5.2)、及び2.5容量のエタノールp.a.の添加により、-20℃で2時間かけて沈
殿し、かつTE緩衝液に溶解した。これらのプライマーを除去するために、沈殿し
たPCR断片を、1.5％アガロースゲル上で分離し、かつVH領域の400bp断片を切り
出した。この断片を、QIAGEN社(ヒルデン)により製造されたQIA ExII-Kitを製造
業者の指示に従い使用し、単離した。溶離は、予め加熱した溶離緩衝液により、
50℃で5分間かけて行った。In order to introduce the restriction cleavage sites NcoI and HindIII above the amplified VH region, a second PCR amplification was performed with primers extended by the restriction cleavage sites (HuIgGF
ORHINDIII, HuIgMFORHINDIII, HuIgDHINDIII as 3'primer, and HuVHB1
NCOI to HuVHB6NCOI as 5'primer). 1 μl of the reaction solution of the first PCR mixture was used as a template. The second PCR amplification was carried out for 15 cycles, in each case with denaturation at 94 ° C. for 15 seconds, binding at 65 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 30 seconds. After the last amplification step was completed, another extension step was performed again at 72 ° C. for 5 minutes. Amplified materials based on the same isotype were combined and added to 1/10 volume of sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 volumes of ethanol pa to reduce the volume for 2 hours at -20 ° C. It was precipitated over time and dissolved in TE buffer. To remove these primers, the precipitated PCR fragments were separated on a 1.5% agarose gel and the 400 bp fragment of the VH region was cut out. This fragment was isolated using the QIA ExII-Kit manufactured by QIAGEN (Hilden) according to the manufacturer's instructions. Elution was performed with preheated elution buffer
It was performed at 50 ° C. for 5 minutes.

【００６８】1.4 PCR-増幅したVH領域の制限酵素による消化 ゲル精製したVH領域(3種のアイソタイプ)を、最初に緩衝液B中にHindIII 70U
を含む混合液100μl中で2時間かけて消化し、その後緩衝液Hの20μl、 NcoI 60U
を添加し更に2時間インキュベーションし、200μlとした。あらゆる消化した突
出末端(overhang)を、QIA-Quick PCR-Kitを用いて除去し、かつこれらの断片を
、予め加熱したEB緩衝液により溶離した。溶離液は、再度1％アガロースゲル上
で精製し、かつEB緩衝液25μl中のQIA ExII Kitで溶離した。この追加のゲル精
製工程は、ベクターへのライゲーション後の機能性挿入断片の割合を顕著に増加
したことがわかった。消化されたPCR断片は、アリコートに分け、かつ-20℃で貯
蔵した。 1.4 Digestion of PCR-amplified VH region with restriction enzyme Gel purified VH region (3 isotypes) was first prepared in buffer B with HindIII 70U.
Digest for 2 hours in 100 μl of the mixture containing 20 μl of buffer H, NcoI 60U
Was added and the mixture was further incubated for 2 hours to make 200 μl. Any digested overhangs were removed using the QIA-Quick PCR-Kit and these fragments were eluted with preheated EB buffer. The eluent was again purified on a 1% agarose gel and eluted with the QIA ExII Kit in 25 μl EB buffer. This additional gel purification step was found to significantly increase the percentage of functional inserts after ligation into the vector. The digested PCR fragment was aliquoted and stored at -20 ° C.

【００６９】1.5 ヒトVHレパートリーのファージミドベクターへのライゲーション 既にハプテン-特異性AbのヒトVL-配列(ダミーVL-配列)を含むファージディス
プレーベクターpSEX81を用い、PCR-増幅したVHレパートリーにクローニングした
。 ベクターpSEX81(VH&VLphox社)20μgを、緩衝液Hを溶媒とするNcoI (Boehringe
r-Mannheim社)40U及びHindIII(Boehringer-Mannheim社)60μlの総容量125μlで
、37℃で2時間かけて消化した。6-倍濃縮した負荷緩衝液(30％グリセロール、30
mM EDTA)30μlの添加後、この消化混合物を65℃で10分間加熱し、かつ周囲温度
まで徐々に冷却した。1％アガロースゲルにおいて、ベクターDNAを、挿入断片か
ら分離し、QIAGENゲル溶離キットを用い単離した。各回溶離緩衝液50μl(50℃に
予め加熱)で5分間の溶離を2回行った。これらの溶離画分を一緒にし、切断した
ベクターDNAを、1/10容量の酢酸ナトリウム(pH5.2)、及び2.5容量のエタノールp
.a.の添加により、-20℃で2時間かけて沈殿した。必要ならば、こうして切断し
たベクターDNAも、-20℃で貯蔵することができる。30分の遠心(13000g、4℃)及
び-20℃に冷却した70％エタノールによる洗浄後、DNAを乾燥し、かつ10mM TRIS(
pH7.9)の50μl中に溶解した。 1.5 Ligation of Human VH Repertoire to Phagemid Vector The phage display vector pSEX81, which already contains the human VL-sequence of the hapten-specific Ab (dummy VL-sequence), was cloned into a PCR-amplified VH repertoire. 20 μg of vector pSEX81 (VH & VLphox) was added to NcoI (Boehringe
r-Mannheim) 40 U and HindIII (Boehringer-Mannheim) 60 μl in a total volume of 125 μl was digested at 37 ° C. for 2 hours. 6-fold concentrated loading buffer (30% glycerol, 30%
After the addition of 30 μl of mM EDTA), the digestion mixture was heated at 65 ° C. for 10 minutes and gradually cooled to ambient temperature. Vector DNA was separated from the insert on a 1% agarose gel and isolated using the QIAGEN gel elution kit. Elution was performed twice with 50 μl of elution buffer (preheated to 50 ° C.) for 5 minutes each time. These elution fractions were combined and the digested vector DNA was treated with 1/10 volume of sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 volumes of ethanol p.
Addition of .a. caused precipitation at -20 ° C over 2 hours. If necessary, the vector DNA thus cut can also be stored at -20 ° C. After centrifugation for 30 minutes (13000g, 4 ° C) and washing with 70% ethanol cooled to -20 ° C, the DNA is dried and 10mM TRIS (
It was dissolved in 50 μl of pH 7.9).

【００７０】 それに続くライゲーションの正確な量を概算するために、該ベクターDNAの2μ
lを、標準化されたDNA断片(High-Mass Ladder、Gibco Life Technologies社)と
比較した。直接比較のために、実施例 1, A 1.4で調製したVH-PCR断片を、同じ
ゲル上で、低分子量の標準化されたDNA断片と比較した(Low-Mass Ladder、Gibco
Life Technologies社)。 挿入断片のベクターに対する比が等モルであるようなライゲーション混合物が
理想的であることが証明された。最終容量40μlにおいて、ベクターDNAの500ng
及び挿入DNAの50ngを、リガーゼ1μl及びライゲーション緩衝液4μlと共にイン
キュベーションした。このライゲーションは、Boehringer Mannheim社により製
造されたT4 DNA-リガーゼを用い、16℃で一晩実行した。このライゲーション反
応を、TE緩衝液60μlの添加により停止した。このタンパク質を、クロロホルム/
フェノール混合液(1:1)100μlの添加により除去し、短時間混合し(Vortex)かつ
引き続き13000gで遠心した。水相を除去し、かつ再度クロロホルムで抽出し、フ
ェノールを完全に除去した。ベクターDNA溶液90μlを、3M酢酸ナトリウム(pH5.2
)9μl、エタノールp.a. 225μl及び担体としてのグリコーゲン1μl(Boehringer
Mannheim社)の添加により、-20℃で2時間かけて沈殿した。12000g(4℃)で遠心し
氷冷した70％エタノールで洗浄後、このDNAを風乾し、かつ水25μl中に溶解した
。 ベクター調製時の不充分な制限消化は、未切断又は1回切断されたベクターDNA
につながり、その結果としてVHレパートリークローニングにおいて、レパートリ
ーサイズが不完全に切断されたベクターの再ライゲーションにより変造される。
制限消化の完全性を早期にモニタリングするために、調製したベクターを、VH挿
入断片を伴う又は伴わずに、少しライゲーションし、E. coliにおいて形質転換
し、かつクローン数を決定した。このベクターの効率的制限消化により、挿入断
片を伴わないベクター試料中のクローン数は、VH挿入断片を伴うベクターが使用
されるような混合物と比較して、＜1％であった。To estimate the exact amount of subsequent ligation, 2 μl of the vector DNA
l was compared to a standardized DNA fragment (High-Mass Ladder, Gibco Life Technologies). For direct comparison, the VH-PCR fragment prepared in Example 1, A 1.4 was compared to a low molecular weight standardized DNA fragment on the same gel (Low-Mass Ladder, Gibco.
Life Technologies). A ligation mixture such that the insert to vector ratio was equimolar proved ideal. 500 ng of vector DNA in a final volume of 40 μl
And 50 ng of insert DNA was incubated with 1 μl of ligase and 4 μl of ligation buffer. The ligation was performed overnight at 16 ° C. using T4 DNA-ligase manufactured by Boehringer Mannheim. The ligation reaction was stopped by the addition of 60 μl TE buffer. Chloroform /
Phenol mixture (1: 1) was removed by addition of 100 μl, mixed briefly (Vortex) and subsequently centrifuged at 13000 g. The aqueous phase was removed and again extracted with chloroform to completely remove the phenol. 90 μl of vector DNA solution was added to 3M sodium acetate (pH5.2
) 9 μl, ethanol 225 μl and glycogen 1 μl as carrier (Boehringer
(Mannheim) added to precipitate at -20 ° C for 2 hours. After centrifuging at 12000 g (4 ° C) and washing with ice-cold 70% ethanol, the DNA was air-dried and dissolved in 25 µl of water. Insufficient restriction digestion during vector preparation is caused by uncut or once-cut vector DNA.
And consequently in VH repertoire cloning, repertoire size is altered by religation of the incompletely cleaved vector.
The prepared vectors were lightly ligated, transformed in E. coli and the number of clones determined, with or without VH inserts, for early monitoring of the integrity of the restriction digests. Due to efficient restriction digestion of this vector, the number of clones in the vector sample without insert was <1% compared to the mixture where the vector with VH insert was used.

【００７１】2.様々なヒトFAP-特異性VLとヒトVH-レパートリーの組合せによる、ヒトFAP-特
異性VL領域のサブクローニング scFv遺伝子ライブラリーの構築において存在するFAP特異性DNA-配列とのDNA夾
雑を避けるために、選択されたヒトVL-鎖は、最初に発現ベクターpUCBM21 (Boeh
ringer-Mannheim社)においてクローニングした。これを行うために、FAP-特異性
VL-鎖を、各々、MluI及びNotI (Boehringer-Mannheim社)による選択のために使
用したファージミドベクター(pSEX 81)から切り出し、かつ対応する切断pUCBM21
へと再クローニングした。E. coliにおける形質転換後、クローンを各VL-鎖につ
いて採取し、LBAT-培地において増殖し、かつこのベクターDNAを、Nucleobond K
it (Macherey & Nagel社)を用いて単離した。ヒトVL鎖は、MluI(60U)及びNotI(6
0U)を含む150μlの制限混合液においてpUC-プラスミド15μgから切出し、かつ1
％アガロースゲルにおいて単離した。これらのヒトFAP-特異性VLは、VHレパート
リーを含む対応する切断したファージディスプレーベクターにクローニングした
。VH領域のクローニングに使用した方法は、先に説明されている。この様々なVL
領域との組合せバンクは分離したままとした。これらの組合せバンクのアリコー
トを凍結し、かつ完全なヒトFAP特異性scFvの選択に使用した。 2. Human FAP-specificity by combining various human FAP-specific VL and human VH-repertoires.
Subcloning of the heterologous VL region To avoid DNA contamination with the FAP-specific DNA-sequences present in the construction of the scFv gene library, the selected human VL-chain was first expressed in the expression vector pUCBM21 (Boehb
ringer-Mannheim). To do this, FAP-specificity
The VL-chain was excised from the phagemid vector (pSEX 81) used for selection with MluI and NotI (Boehringer-Mannheim), respectively, and the corresponding cut pUCBM21.
Re-cloned into. After transformation in E. coli, clones were picked for each VL-chain, grown in LB AT -medium and the vector DNA was cloned into Nucleobond K
It was isolated using it (Macherey & Nagel). Human VL chain has MluI (60U) and NotI (6
15 μg of pUC-plasmid in 150 μl of restriction mixture containing
Isolated on a% agarose gel. These human FAP-specific VLs were cloned into the corresponding truncated phage display vector containing the VH repertoire. The method used to clone the VH region has been previously described. This various VL
The combination bank with the region was kept separate. Aliquots of these combination banks were frozen and used for selection of fully human FAP-specific scFv.

【００７２】3.ファージディスプレー選択 ファージ-会合したscFvの作成 ： パニングの第一ラウンドにおける様々なVL-鎖に関する増殖利点の可能性を避
けるために、異なるヒトVL領域を含む(ポイント2参照)様々な組合せバンクのフ
ァージ-会合したscFvを、互いに独立して作成した。これを行うために、シケイ
ン付き(chicane)振盪フラスコ内の2YTAT培地10mlに、VL/VH組合せバンクの1アリ
コートを接種し、OD 0.4とし、かつ37℃でOD 0.8となるまで攪拌(180rpm)培養し
た。1012個のヘルパーファージ(New England Biolabs社)で感染した後、攪拌せ
ずに37℃で15分間インキュベーションを行った。引き続き攪拌しながら37℃でイ
ンキュベーションし、細菌を遠心(4000gで5分)で除去し、かつこのペレットを、
カナマイシン(65μg/ml)を含有するグルコース-非含有2YTAT培地50ml中に再懸濁
した。ファージ-会合したscFvを、30℃で一晩激しく攪拌し(200rpm)作成した。
これらのファージを収集するために、細菌を遠心(9000g)により除去し、かつ上
清をPEGと混合し、かつ氷上で1時間インキュベーションし、これを沈殿した。引
き続き4℃で9000g、30分間遠心した後、沈殿したファージを、4℃の冷PBS 45ml
中に再懸濁し、かつ5x PEGの5mlと混合した。更に数時間氷上でインキュベーシ
ョンした後、この混合物を再度9000gで遠心し、かつファージペレットを、PBS 5
ml中に再懸濁した。これらのファージを、0.45μmフィルターを通して濾過し、
かつ各ファージ調製物500μlを一緒にし、かつPBS中の4％乳粉懸濁液(MPBS)2ml
と15分間混合した。このファージ懸濁液を、ベンチ遠心分離器において14000gで
2回の遠心により、透明化した。こうして予備吸着したファージは、その日のう
ちに使用することとした。 3. Phage Display Selection Generation of Phage-Associated scFvs : Different human VL regions were included (see point 2) to avoid potential growth benefits for different VL-chains in the first round of panning. Different combination banks of phage-associated scFv were generated independently of each other. To do this, 10 ml of 2YT AT medium in a chicane shake flask was inoculated with one aliquot of the VL / VH combination bank to OD 0.4 and agitated at 37 ° C until OD 0.8 (180 rpm). Cultured. After infection with 10 12 helper phages (New England Biolabs), incubation was carried out at 37 ° C for 15 minutes without stirring. Following incubation with agitation at 37 ° C., the bacteria are removed by centrifugation (5 min at 4000 g) and the pellet is
Resuspended in 50 ml glucose-free 2YT AT medium containing kanamycin (65 μg / ml). Phage-associated scFv were made by vigorous agitation (200 rpm) at 30 ° C. overnight.
To collect these phages, the bacteria were removed by centrifugation (9000 g) and the supernatant was mixed with PEG and incubated on ice for 1 hour, which was precipitated. After subsequent centrifugation at 4 ° C for 9000g for 30 minutes, the precipitated phages were treated with 45 ml of cold PBS at 4 ° C.
Resuspended in and mixed with 5 ml of 5x PEG. After a further incubation on ice for several hours, the mixture was centrifuged again at 9000 g and the phage pellet was washed with PBS 5
Resuspended in ml. These phage were filtered through a 0.45 μm filter,
And combine 500 μl of each phage preparation, and 2 ml of 4% milk powder suspension (MPBS) in PBS
And mixed for 15 minutes. This phage suspension at 14000 g in a bench centrifuge.
It was clarified by centrifugation twice. The phage thus preadsorbed was to be used within the day.

【００７３】抗原-特異性scFvの選択 ： 選択には、前日のうちに5〜30μgのCD8-FAPを固定したイムノチューブ(Nunc-M
axi-Sorb-Immunotubes、3.5ml)を使用した。この固定化は、PBS中で4℃で一晩か
けて行い、その後チューブをPBSで2回洗浄し、かつ非特異的結合部位を、ROTI-B
lock (Roth社)で1時間かけてブロックした。ファージディスプレー選択の特異性
を調べるために、固定した抗原を伴わないイムノチューブを対照のために使用し
た。PBSで3回洗浄した後、MPBS中に予め吸着したファージ-会合したscFvを、抗
原-被覆した試験チューブ又は対照試験チューブ中に入れ、かつローラー上で2時
間インキュベーションした。 Selection of antigen-specific scFv : For selection, immunotubes (Nunc-M) immobilized with 5 to 30 μg of CD8-FAP the day before were selected.
axi-Sorb-Immunotubes, 3.5 ml) were used. This immobilization was done in PBS overnight at 4 ° C, then the tubes were washed twice with PBS and the non-specific binding sites were labeled with ROTI-B.
Blocked at lock (Roth) for 1 hour. To test the specificity of phage display selection, immunotubes without immobilized antigen were used as controls. After washing 3 times with PBS, the phage-associated scFvs pre-adsorbed in MPBS were placed in antigen-coated test tubes or control test tubes and incubated on rollers for 2 hours.

【００７４】 播種細菌の調製のために、1混合物あたり2YTtetの20mlを、XL-1-Blueの一晩培
養物の1アリコートで接種し、OD 0.0125とし、かつ攪拌(180rpm)しながら37℃で
培養した。3時間インキュベーションした後、播種細菌はOD 0.8となり、従って
この時点で溶離したファージによる感染に使用することができた。For the preparation of inoculated bacteria, 20 ml of 2YTtet per mixture was inoculated with 1 aliquot of an overnight culture of XL-1-Blue to an OD of 0.0125 and at 37 ° C. with stirring (180 rpm). Cultured. After 3 hours of incubation, the inoculated bacteria had an OD of 0.8 and could therefore be used for infection by the phage eluted at this point.

【００７５】 感染の1時間前に、ファージ懸濁液を、イムノチューブから空にした。その後
イムノチューブを洗浄し、あらゆる非特異的及び交差反応性のscFvを除去した。
パニングの第一ラウンドにおいて、この調製物を、10x TPBS(0.1％Tween20)で及
び次に10x PBSで洗浄した。ストリンジェンシーは、パニングの第二及び第三ラ
ウンドに、洗浄工程を15x TBBS(パニングの第二ラウンド)及び20x TPBS (パニン
グの第三ラウンド)に拡大することに加え、Tween20 の濃度を0.5％に増加するこ
とより、上昇した。更にストリンジェンシーを上昇するために、パニングの最後
の2ラウンドにおいて、洗浄液をより完全に混合するために、TPBS洗浄時に、短
時間ボルテックスを用いた。One hour before infection, the phage suspension was emptied from the immunotube. The immunotubes were then washed to remove any non-specific and cross-reactive scFv.
In the first round of panning, the preparation was washed with 10x TPBS (0.1% Tween 20) and then 10x PBS. In addition to extending the wash steps to 15x TBBS (second round of panning) and 20x TPBS (third round of panning) in the second and third rounds of panning, stringency increased the concentration of Tween20 to 0.5%. Rising rather than increasing. To further increase stringency, a brief vortex was used during the TPBS wash to more thoroughly mix the wash in the last two rounds of panning.

【００７６】 最終洗浄液を廃棄し、かつこのイムノチューブに1M TEA(トリエチルアミン)1m
lを添加した。回転インキュベーターにおいて5分間インキュベーションした後、
溶離したファージを、1M TRIS(pH7.4)0.5mlで中和し、かつ感染のために播種細
菌20mlに直接添加した。 攪拌せずに37℃で15分間インキュベーションした後、細菌を45分間攪拌し、か
つ3000gで10分間の遠心により除去した。細菌は、2YT培地500μl中に再懸濁し、
かつ大きいSOBGATプレート(15cm)上で一晩37℃でインキュベーションした。収集
のために、細胞をLBAT 培地の入ったプレートからこすり取り、最終濃度25％と
なるようグリセロールと混合し、かつアリコートにおいて-80℃で凍結し、増幅
の別のラウンドの接種に使用した。Discard the final wash solution and add 1M TEA (triethylamine) 1m to this immunotube.
l was added. After 5 minutes of incubation in a rotating incubator,
Eluted phage were neutralized with 0.5 ml of 1 M TRIS (pH 7.4) and added directly to 20 ml of inoculated bacteria for infection. After a 15 minute incubation at 37 ° C without agitation, the bacteria were agitated for 45 minutes and removed by centrifugation at 3000g for 10 minutes. Bacteria were resuspended in 500 μl of 2YT medium,
And incubated on a large SOBGAT plate (15 cm) overnight at 37 ° C. For harvesting, cells were scraped from plates containing LBAT medium, mixed with glycerol to a final concentration of 25% and frozen in aliquots at -80 ° C and used for another round of inoculation of amplification.

【００７７】 各パニングラウンドのファージ力価は、感染した播種細菌の0.01〜10μlの滴
定により決定した。特異濃度を決定するために、各選択ラウンドにおいて、イム
ノチューブに固定されたCD8-FAPから溶離されたファージ数を、抗体を伴わない
対応する対照イムノチューブの数と比較した。抗原-被覆したイムノチューブか
ら溶離したファージの量に対する非被覆のイムノチューブの量の比は、濃度因子
をもたらした。 連続増幅ラウンド後の濃度因子の増加は、特異的に結合しているファージの濃
度を示した。The phage titer of each panning round was determined by titrating 0.01-10 μl of infected inoculated bacteria. To determine the specific concentration, the number of phage eluted from the CD8-FAP immobilized on the immunotubes was compared to the number of the corresponding control immunotubes without antibody in each selection round. The ratio of the amount of uncoated immunotubes to the amount of phage eluted from the antigen-coated immunotubes gave a concentration factor. The increase in concentration factor after successive rounds of amplification indicated the concentration of specifically bound phage.

【００７８】実施例2 ヒトFAP-特異性scFv誘導体の発現 ファージディスプレー-選択されたscFv評価のための微量定量スケールでのスク
リーニング法 pSEX81を用い発現されたscFv-pIII-融合タンパク質を、「スクリーニング」、
すなわち試料採取のため、及びファージディスプレーバンクから選択されたscFv
クローンの分析の両方のために使用することができる。 Example 2 Expression of Human FAP-Specific scFv Derivatives Phage Display- Screen on a microquantitative scale for evaluation of selected scFvs.
ScFv-pIII-fusion protein expressed using the leaning method pSEX81, "screening",
ScFv selected for sampling and from phage display banks
It can be used for both analysis of clones.

【００７９】微量定量スケールでのscFv-pIII-融合タンパク質の細菌産生 2YTGATのアリコート300μlを、LBGATプレート上に個別に置いたコロニーに接
種し、かつ96-ウェルマイクロタイタープレート(Beckman社)中で37℃及び300rpm
で攪拌しながら、一晩インキュベーションした。分析されるコロニーが凍結保存
されない場合は、これは最初にU-型96-ウェル組織培養プレート(Greiner社)にお
いてインキュベーションを行った。翌朝、これらの一晩培養物の10μlアリコー
トを、新鮮な2YT 100μlへ移し、かつ再度、攪拌しながら、U-型96-ウェル組織
培養プレートにおいて加湿したチャンバー内37℃でインキュベーションした。Be
ckmanマイクロタイタープレート中に残ったこれらの培養物の残渣は、グリセロ
ールと20％で混合し、かつ-80℃で凍結することができた。培養物100μlの増殖
は、必要ならば、フィルター波長630nmでELISA Readerを用いチェックした。約6
〜8時間後、培養物を、1200rpm(5分、RT)で遠心し、かつ上清をマルチチャネル
ピペットで除去した。ペレット化された細菌を、50μM IPTGを含有する2YTATの
アリコート100μl(グルコース非含有)中に再懸濁し、及び加湿したチャンバーに
おいて30℃及び300rpmで攪拌しながら一晩インキュベーションした。一晩インキ
ュベーション後、これらの培養物を、各々、0.5％Tween 25μlと混合し、部分溶
解を達成するために更に3〜4時間攪拌しながらインキュベーションした。最後に
培養物を、1200rpmで10分間遠心し、かつ上清を慎重に除去した。これらは、ウ
ェスタンブロット分析に直接使用するか、もしくは予備球着後ELISAにおいて使
用した。 Bacterial production of scFv-pIII-fusion proteins on a microquantitative scale 300 μl aliquots of 2YT GAT were inoculated into colonies placed individually on LB GAT plates and in 96-well microtiter plates (Beckman). At 37 ° C and 300 rpm
Incubate overnight with agitation. If the colonies to be analyzed were not stored frozen, they were first incubated in U-type 96-well tissue culture plates (Greiner). The following morning, 10 μl aliquots of these overnight cultures were transferred to 100 μl of fresh 2YT and again incubated at 37 ° C. in a humidified chamber in U-type 96-well tissue culture plates with agitation. Be
The residue of these cultures left in the ckman microtiter plate could be mixed with glycerol at 20% and frozen at -80 ° C. Growth of 100 μl cultures was checked using an ELISA Reader with filter wavelength 630 nm, if necessary. About 6
After -8 hours, the culture was centrifuged at 1200 rpm (5 minutes, RT) and the supernatant removed with a multichannel pipette. The pelleted bacteria were resuspended in 100 μl aliquots of 2YT AT containing 50 μM IPTG (without glucose) and incubated overnight in a humidified chamber with agitation at 30 ° C. and 300 rpm. After overnight incubation, each of these cultures was mixed with 25 μl of 0.5% Tween and incubated for an additional 3-4 hours with agitation to achieve partial lysis. Finally the culture was centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes and the supernatant was carefully removed. These were used directly for Western blot analysis or in pre-sphered ELISA.

【００８０】scFv-pIII-融合タンパク質のmlスケールでの産生 わずかに少数のクローンのみを、それらの発現について及び／又は発現された
scFv-pIII-融合タンパク質の機能性について調べるならば、細菌の一晩の予備培
養に加え主培養を、約200rpmで攪拌しながら、試験管又は50ml PP-試験管内で容
量3〜10mlで行った。細菌増殖がその対数期(O.D.600nm、約0.7)に到達したなら
ば、培養物を遠心(2500rpm、5分、RT)し、かつ誘導のために50μM-IPTGを含む新
鮮なSBAT又は2YTAT等量中で再懸濁した。25〜30℃で一晩インキュベーションし
た後、いずれかの培養物を、Tween20(ad 0.1％)と混合し、かつ更に3 時間イン
キュベーションした後、上清を除去した。しかし、融合タンパク質の濃度を増加
するために、細菌ペレットを更に利用(opene up)した(下記参照)。 Production of scFv-pIII-fusion proteins on ml scale Only a few clones were expressed and / or expressed
To investigate the functionality of the scFv-pIII-fusion protein, overnight pre-cultures of bacteria plus main cultures were performed in tubes or 50 ml PP-tubes with a volume of 3-10 ml with agitation at about 200 rpm. . Once the bacterial growth reached its exponential phase (OD600nm, about 0.7), the culture was centrifuged (2500 rpm, 5 min, RT) and fresh SB AT or 2YT AT containing 50 μM-IPTG for induction. Resuspend in volume. After overnight incubation at 25-30 ° C, either culture was mixed with Tween 20 (ad 0.1%) and incubated for a further 3 hours before removing the supernatant. However, the bacterial pellet was further opened up to increase the concentration of the fusion protein (see below).

【００８１】 これらのscFv-gIII-融合タンパク質を使用し、scFv-コード領域のリーディン
グフレームの完全性を明らかにし(ウェスタンブロット)、及び固定されたFAP上
でELISAにおいて又はFAP+細胞に対するセルアナライザーにおいて選択されたscF
vのFAP特異性を調べた。ペルオキシダーゼ-又はアルカリホスファターゼ-結合検
出抗体と組合せた抗-gIII-特異性モノクローナル抗体を用い(ウェスタンブロッ
ト及びELISA)、scFv-gIII-融合タンパク質を検出した。セルアナライザーにおい
てscFv-gIIIタンパク質との細胞結合試験を行う場合、FITC-標識検出抗体を用い
た。These scFv-gIII-fusion proteins were used to reveal the integrity of the reading frame of the scFv-coding region (Western blot) and to select on immobilized FAP in an ELISA or in a cell analyzer for FAP + cells. ScF
The FAP specificity of v was investigated. ScFv-gIII-fusion proteins were detected using anti-gIII-specific monoclonal antibodies in combination with peroxidase- or alkaline phosphatase-coupled detection antibodies (Western blot and ELISA). FITC-labeled detection antibody was used when performing a cell binding test with scFv-gIII protein in a cell analyzer.

【００８２】原核細胞発現： 培地 全てのデータは、最終容量1Lに関するものであり、pHは7.0に調節した。下記
の培地への添加物は、濾過滅菌し、かつ任意にオートクレーブにかけた培地に添
加した。G：100mMグルコース(保存液:2M)、A：アンピシリン100μg/ml、T：テト
ラサイクリン12.5μg/ml、K：カナマイシン50μg/ml Prokaryotic Expression: Medium All data are for a final volume of 1 L and pH adjusted to 7.0. The following media additives were added to media that had been filter sterilized and optionally autoclaved. G: 100 mM glucose (preservative: 2M), A: ampicillin 100 μg / ml, T: tetracycline 12.5 μg / ml, K: kanamycin 50 μg / ml

【００８３】 細菌培養のための液体培地： BHI Brain Heart Infusion (DIFCO) 35g 酵母抽出物 5g dYT ペプトン 17g 酵母抽出物 10g NaCl 5g LB ペプトン 10g 酵母抽出物 10g NaCl 5g SB ペプトン 30g 酵母抽出物 10g MOPS 10g SOC ペプトン 20g 酵母抽出物 5g NaCl 10mM KCl 2.5mM オートクレーブ処理した後、滅菌したMgCl2及びMgSO4を各々ad 10mM、更には
滅菌したグルコースad 20mM添加した。Liquid medium for bacterial culture: BHI Brain Heart Infusion (DIFCO) 35g yeast extract 5g dYT peptone 17g yeast extract 10g NaCl 5g LB peptone 10g yeast extract 10g NaCl 5g SB peptone 30g yeast extract 10g MOPS 10g SOC peptone 20 g Yeast extract 5 g NaCl 10 mM KCl 2.5 mM After autoclaving, ad 10 mM each of sterilized MgCl 2 and MgSO 4 and further ad 20 mM sterilized glucose were added.

【００８４】寒天皿 BHI (ペトリ皿1個当りの量) BHI(酵母非含有) 30ml アガーアガー 1％ スクロース(60％) 0.5ml ウマ血清 2.5ml 酵母抽出物(20％) 1ml グルコース(20％) 0.5ml スクロース、血清、酵母抽出物、グルコースは全て滅菌添加した。 Agar plate BHI (amount per petri dish) BHI (without yeast) 30 ml agar agar 1% sucrose (60%) 0.5 ml horse serum 2.5 ml yeast extract (20%) 1 ml glucose (20%) 0.5 ml sucrose, serum, yeast extract and glucose were all sterilized.

【００８５】 LB LB培地＋1.5％(w/v)アガーアガー SOB ペプトン 20g 酵母抽出物 5g NaCl 0.5g アガーアガー 15g オートクレーブ処理した後、滅菌したMgCl2をad 10mM添加した。他の略号：G
：グルコース、A：アンピシリン、T：テトラサイクリン、K：カナマイシンLB LB medium + 1.5% (w / v) agar agar SOB peptone 20 g yeast extract 5 g NaCl 0.5 g agar agar 15 g After autoclaving, sterilized MgCl 2 was added to ad 10 mM. Other abbreviations: G
: Glucose, A: Ampicillin, T: Tetracycline, K: Kanamycin

【００８６】E. coliにおけるscFvの細菌発現： pOPEベクター及びこれから得られた誘導体を、E. coliにおける、cmyc-及びHI
S6-Tagを伴う、単純な可溶性scFv誘導体の調製に使用した(Dubelら、Gene、128:
97-101(1993))。E. coliにおけるscFv発現及びそれらの精製は、Moosmayerらの
方法に従い実行した(Ther. Immunol.、2: 31-40(1995))。 Bacterial expression of scFv in E. coli: The pOPE vector and the derivatives obtained from it were transformed into cmyc- and HI in E. coli.
Involving S 6 -Tag, was used for the preparation of simple soluble scFv derivative (Dubel et al., Gene, 128:
97-101 (1993)). Expression of scFv in E. coli and their purification were performed according to the method of Moosmayer et al. (Ther. Immunol., 2: 31-40 (1995)).

【００８７】 scFvを、容量3〜100mlのE.coli XL1-Blueにおいて作出した。インキュベーシ
ョンは、LB又は2YT培地中で、約200rpmで攪拌しながら試験管又は50ml PP-試験
管において、180rpmでシケイン付き三角フラスコのいずれかにおいて、行った。
培地を、1/10容量MOPS(pH7)で緩衝し、かつ菌株XL1-Blueについてテトラサイク
リン(12.5μg/ml)と混合した。ScFv were produced in E. coli XL1-Blue in a volume of 3-100 ml. Incubations were performed in either LB or 2YT medium in test tubes or 50 ml PP-test tubes with agitation at about 200 rpm, at 180 rpm in Erlenmeyer flasks with chicane.
The medium was buffered with 1/10 volume MOPS (pH 7) and mixed with tetracycline (12.5 μg / ml) for strain XL1-Blue.

【００８８】 2YTGAT又はLBGATに、LBGATプレート上で分離されたコロニーを接種し、予備培
養物を形成し、かつ攪拌により37℃で一晩インキュベーションした。翌日、主培
養物をその上に1:50で接種し、かつ37℃でインキュベーションした。誘導のため
に、遠心した細菌(2500rpm、1000 x g、10分、RT)を、50μM-IPTGを含む等容量
の培地(グルコース非含有)に取り、かる2〜3時間22〜25℃及び220rpmで攪拌した
。細菌ペレットを、1000 x g(10分、RT)で遠心した後に収集し、かつ以下のよう
に破壊した。収集した誘導E.coli培養物のペレットを、1/20〜1/30容量の氷冷し
たPBS中に入れ、かつ完全に再懸濁し、約30分間氷上でインキュベーションし、
場合によっては液体窒素又はエタノールとドライアイスの混合物中で混合及び瞬
間凍結した。次に凍結した試料を-80℃で貯蔵した。試料を破壊するために、こ
れをゆっくり解凍し、均質かつ透明になるまで超音波処理を施した(氷水で冷却
しながら25〜30サイクル)。細菌タンパク質の全体が可溶化した画分を得るため
に、試料を、13000rpmで20分間遠心し、上清を慎重に除去し、かつペレットを廃
棄した。比較的長期の貯蔵については、望ましいならば、上清を、BSA(ad 1％)
と混合し、瞬間凍結し、かつ-80℃で貯蔵した。 E. coliにおけるscFv F19の調製において、過剰に豊富な(SB培地)又は緩衝し
ていない培養培地を使用した場合には、組換えタンパク質の機能の劇的な劣化が
得られた。2YTG AT or LB GAT were inoculated with the colonies separated on LB GAT plates to form precultures and incubated overnight at 37 ° C. with agitation. The next day, the main culture was inoculated thereon 1:50 and incubated at 37 ° C. For induction, the centrifuged bacteria (2500 rpm, 1000 xg, 10 min, RT) are taken up in an equal volume of medium (without glucose) containing 50 μM-IPTG for 2 to 3 hours at 22 to 25 ° C and 220 rpm. It was stirred. Bacterial pellets were collected after centrifugation at 1000 xg (10 min, RT) and disrupted as follows. The harvested pellet of induced E. coli culture was placed in 1/20 to 1/30 volume ice-cold PBS and completely resuspended and incubated on ice for about 30 minutes,
Mixing and flash freezing optionally in liquid nitrogen or a mixture of ethanol and dry ice. The frozen sample was then stored at -80 ° C. To break the sample, it was slowly thawed and sonicated until homogeneous and clear (25-30 cycles with ice water cooling). Samples were centrifuged for 20 minutes at 13000 rpm, the supernatant was carefully removed and the pellet discarded, in order to obtain a fraction of total solubilization of bacterial proteins. For relatively long-term storage, if desired, decant the supernatant with BSA (ad 1%).
Were mixed, flash frozen and stored at -80 ° C. A dramatic deterioration of the function of the recombinant protein was obtained when an over-rich (SB medium) or unbuffered culture medium was used in the preparation of scFv F19 in E. coli.

【００８９】Proteus mirabilis (LVI)におけるscFv誘導体の発現 ： 単量体scFvに加え二量体scFv(ミニボディ)を、Proteus mirabilisにおいて発
現した。この発現及び精製法は、本発明者らが可溶性一価のscFvに関して既に公
表したものに類似していた(Rippmannら、Applied and Environmental Microbiol
ogy、64: 4862-4869(1998))。 Expression of scFv Derivatives in Proteus mirabilis (LVI) : Monomeric scFv plus dimeric scFv (minibodies) were expressed in Proteus mirabilis. This expression and purification method was similar to what we previously published for soluble monovalent scFv (Rippmann et al., Applied and Environmental Microbiol).
ogy, 64: 4862-4869 (1998)).

【００９０】P. mirabilis LVIにおけるプラスミドDNAの形質転換 ： P. mirabilis LVIのインキュベーションを、三角フラスコ(シケインなし)中で
＞200rpmで行った。LVI細菌の形質転換のために、定常増殖期(OD550、6以下であ
った)。これを行うために、BHIK培養液20mlに、4℃の培養物を1:20で接種し、か
つ攪拌しながら37℃で一晩インキュベーションした。一晩培養物の100μl毎に、
調製したプラスミド20μl及びPEG(0.4M-スクロース含有)150μlを混合し、かつ
氷上で10分間放置した。この温度ショックを、時折ゆっくり攪拌しながら、37℃
の水浴中で、5分間継続した。形質転換されたLVI-細菌を、BYS培地(1ml BHI、0.
5％酵母抽出物、1％スクロース)1ml中にとり、かつ小さい急勾壁を持つ容器内で
37℃で激しく攪拌しながら3時間インキュベーションした。各形質転換体混合物1
00μlを、BHIKプレート上に播種した。24〜48時間インキュベーション(37℃)し
た後、顕著に大きいコロニーを、滅菌したスパーチュラを用いて採取し、かつBH
IK培地20mlへ移した。一晩増殖及びL-型細菌の存在の鏡検後、この培養物を、凍
結培地と混合し、かつ-80℃で凍結した。凍結されなかった形質転換されたP. mi
rabilis培養物は、4℃で貯蔵した場合に、少なくとも4週間は生存し続けた。 Transformation of plasmid DNA in P. mirabilis LVI: Incubation of P. mirabilis LVI was performed at> 200 rpm in Erlenmeyer flasks (without chicane). Due to transformation of LVI bacteria, stationary growth phase (OD550, <6). To do this, 20 ml of BHI K medium were inoculated 1:20 with a 4 ° C. culture and incubated overnight at 37 ° C. with stirring. Every 100 μl of overnight culture,
20 μl of the prepared plasmid and 150 μl of PEG (containing 0.4 M-sucrose) were mixed and left on ice for 10 minutes. This temperature shock is kept at 37 ° C with occasional gentle stirring.
In a water bath for 5 minutes. The transformed LVI-bacteria was transformed into BYS medium (1 ml BHI, 0.
5% yeast extract, 1% sucrose) in 1 ml and in a container with a small steep wall
Incubated at 37 ° C for 3 hours with vigorous stirring. Each transformant mixture 1
00 μl was plated on BHI K plates. After 24-48 hours incubation (37 ° C), significantly larger colonies were picked using a sterile spatula and BH
Transferred to 20 ml of I K medium. After overnight growth and microscopic examination for the presence of L-type bacteria, the culture was mixed with freezing medium and frozen at -80 ° C. Non-frozen transformed P. mi
The rabilis cultures survived for at least 4 weeks when stored at 4 ° C.

【００９１】 形質転換されたP. mirabilis の発現を誘導するために、2種の連続する一晩又
は11〜12時間の予備培養物を接種し(各20ml)、かつ4℃培養物からの第一のもの
を30℃でインキュベーションした。達成された予備培養物の密度及び引き続きの
培養物のインキュベーションの長さに応じて、これは常に 1:10又は1:20と過剰
に接種した。BHIK誘導培養物(0.5mM-IPTG含有)は、容量20〜50mlを有し、かつ同
じく接種し、その後30℃で少なくとも11時間、攪拌しながらインキュベーション
した。この細菌の収集前に、OD550(≧4)、pH(7.5〜8.5)及び光学的外観L型が、
顕微鏡下で検証された。この発現培養物を遠心し(5000rpm、3800 x g、4℃)、か
つペレットを廃棄した。上清は、直接ELISA又はウェスタンブロット分析に用い
るか、もしくは精製することができる。To induce the expression of transformed P. mirabilis, two consecutive overnight or 11-12 h precultures were inoculated (20 ml each) and the first from 4 ° C. cultures. One was incubated at 30 ° C. Depending on the density of the preculture achieved and the length of subsequent culture incubations, this was always inoculated in excess of 1:10 or 1:20. BHI K induction cultures (containing 0.5 mM-IPTG) had a volume of 20-50 ml and were also inoculated and then incubated at 30 ° C. for at least 11 hours with agitation. Prior to collection of this bacterium, OD 550 (≧ 4), pH (7.5-8.5) and optical appearance L-form
It was verified under a microscope. The expression culture was centrifuged (5000 rpm, 3800 xg, 4 ° C) and the pellet discarded. The supernatant can be used directly for ELISA or Western blot analysis or purified.

【００９２】 本研究において、これらのミニボディは、IMAC(固定型金属親和性クロマトグ
ラフィー)により精製した。これのためには、Pharmacia Biotech社が製造した1m
lのHiTrapカラムを使用した。ゲルクロマトグラフィーを、第二の精製工程とし
て行った。In the present study, these minibodies were purified by IMAC (immobilized metal affinity chromatography). For this, 1m manufactured by Pharmacia Biotech
l HiTrap column was used. Gel chromatography was performed as the second purification step.

【００９３】 誘導上清を適用する前に、冷PBS(pH8)5Lに対して完全に透析し、次に少なくと
も30分間超遠心した(113000 x g、4℃、ローター：Beckman 45 Ti)。各精製の前
に、カラムは、Zn2+イオンで帯電した：使用した溶液は、粒子の凝集を防止する
ために、事前に滅菌濾過した。金属イオンの残渣は、50mM EDTA 5mlにより除去
した。H20bid 10mlですすいだ後、100mM ZnSO4 10mlで帯電させた。再度H20bid
20mlですすいだ後、カラムをPBS(pH8)10mlで平衡化した。上清を、蠕動ポンプ(1
.5ml/分)を用いてカラムに流し、引き続き洗浄工程 (5〜20mMイミダゾールを含
有するPBS 10ml)を行った。溶離を、300mM イミダゾールを含有するPBS 10mlに
より、1ml画分で行った。溶離画分を氷上で貯蔵した。Prior to applying the induction supernatant, it was thoroughly dialyzed against 5 L of cold PBS (pH 8) and then ultracentrifuged for at least 30 minutes (113000 xg, 4 ° C, rotor: Beckman 45 Ti). Prior to each purification, the column was charged with Zn 2+ ions: the solution used was pre-sterilized to prevent agglomeration of particles. The metal ion residue was removed with 5 ml of 50 mM EDTA. After rinsing with 10 ml H 2 0 bid , it was charged with 10 ml 100 mM ZnSO 4 . Again H 2 0 bid
After rinsing with 20 ml, the column was equilibrated with 10 ml PBS (pH 8). Transfer the supernatant to a peristaltic pump (1
0.5 ml / min), followed by a washing step (10 ml PBS containing 5-20 mM imidazole). Elution was performed with 10 ml of PBS containing 300 mM imidazole in 1 ml fractions. The eluted fractions were stored on ice.

【００９４】 ゲルクロマトグラフィーについては、Pharmacia Biotech社が製造したSuperde
x 200カラム(10/30)を用いた。同一製造業者が製造したFPLC装置と連結した。IM
AC-精製した試料を、5分間遠心し(13000rpm、4℃)、その後注入した。 ポンプシステム及びカラムを選択された溶離緩衝液(PBS、pH8)で平衡化した後、
IMAC-精製したMB #34の500μl(0.75〜1mgに相当)を、このシステムへ注入し、流
量0.5ml/分でポンプで流し、UV-検出器で検出し、かつ自動的に500μl画分を収
集した。For gel chromatography, Superde manufactured by Pharmacia Biotech
A x200 column (10/30) was used. It was connected to an FPLC device manufactured by the same manufacturer. IM
The AC-purified sample was centrifuged for 5 minutes (13000 rpm, 4 ° C) and then injected. After equilibrating the pump system and column with the selected elution buffer (PBS, pH 8),
500 μl of IMAC-purified MB # 34 (corresponding to 0.75 to 1 mg) was injected into this system, pumped at a flow rate of 0.5 ml / min, detected by UV-detector and automatically 500 μl fractions were collected. Collected.

【００９５】組換えヒト抗体の構造 ヒト組換え抗-FAP-抗体の原核及び真核細胞発現は、一価のscFv及び二価のscF
v(いわゆるミニボディ)として行った。作成されたこれらのミニボディの構造及
びこの目的に使用した発現カセットは、Huらの論文(Cancer Res. 56: 3055-61(1
996))に記載されたものと同等である。加えて、本発明者らが調製したミニボデ
ィは、C-末端に免疫学的検出のためのc-mycドメイン(モノクローナル抗体9E10に
よる)及びクロマトグラフィー精製のためのHIS6ドメインを有した。これらのcmy
c-及びHIS6-コード配列は、pOPE 101由来のものに相当している(S. Dubel、ハイ
デルベルグ大学)。 ミニボディの構造： N-シグナル配列-scFv(VH-リンカー-VL)-ヒンジ-リンカー-CH3-cmyc-HIS6-C Structure of Recombinant Human Antibodies Prokaryotic and eukaryotic expression of human recombinant anti-FAP-antibodies was determined by monovalent scFv and divalent scF.
I went as v (so-called mini body). The structure of these minibodies created and the expression cassette used for this purpose was described by Hu et al. (Cancer Res. 56: 3055-61 (1
996)). In addition, the minibodies prepared by us had a c-myc domain at the C-terminus for immunological detection (by monoclonal antibody 9E10) and a HIS 6 domain for chromatographic purification. These cmy
The c- and HIS 6 -coding sequences correspond to those from pOPE 101 (S. Dubel, University of Heidelberg). Minibody structure: N-signal sequence-scFv (VH-linker-VL) -hinge-linker-CH3-cmyc-HIS 6 -C

【００９６】本発明の抗体タンパク質の原核細胞発現 ： 使用した発現ベクター並びに一価のscFv誘導体のE. coli(Moosmayerら、Ther.
Immunol.、2: 31-40(1995))及びProteus mirabilis LVI (Rippmannら、Applied
and Environmental Microbiology、64: 4862-4869(1998))における発現及び精
製のための方法は、先行技術から公知である。ベクターpACK02scKan及びRippman
nらの論文(1998)からの方法も、Proteus mirabilis LVIにおいてミニボディを調
製しかつ精製するために使用した。 Prokaryotic Expression of Antibody Proteins of the Invention : The expression vector used and the monovalent scFv derivative E. coli (Moosmayer et al., Ther.
Immunol., 2: 31-40 (1995)) and Proteus mirabilis LVI (Rippmann et al., Applied.
and Environmental Microbiology, 64: 4862-4869 (1998)), methods for expression and purification are known from the prior art. Vector pACK02scKan and Rippman
The method from n et al. (1998) was also used to prepare and purify minibodies in Proteus mirabilis LVI.

【００９７】本発明の抗体タンパク質の真核細胞発現 ： 説明したミニボディは同じく、哺乳類細胞においても調製した。ミニボディ発
現カセットに使用した発現ベクターは、下記のものである：pAD-CMV-1及びpg1d1
05誘導体。 Eukaryotic Expression of Antibody Proteins of the Invention : The minibodies described were also prepared in mammalian cells. The expression vectors used for the minibody expression cassette are: pAD-CMV-1 and pg1d1
05 derivative.

【００９８】COS細胞における一過性発現 ： COS7細胞のトランスフェクションのために、前記発現ベクターを、最初にE. c
oli (XL1-Blue)において増幅し、次に精製した。ベクターDNAは、滅菌条件下で
濃度1μg/μlに調節し、かつ-20℃で貯蔵した。 トランスフェクションの前日、5x105個のCOS7細胞を、DEMEM 10％FCSが入った細
胞培養ペトリ皿(直径8cm、Greiner社)中に播種し、かつCO2加熱しているカップ
ボード内で、37℃で16時間インキュベーションした。トランスフェクション当日
、ペトリ皿1個当りOptiMEM (Gibco社)1ml、リポフェクタミン35μl(Gibco Life
Science社)及び発現ベクターDNA 10μlを含む懸濁液を調製した。周囲温度で45
分間インキュベーションした後、更なるOptMEM 4mlを添加し、かつ懸濁液を慎重
に先にPBSで洗浄した細胞上にピペットで移した。この溶液を、緩やかに傾け一
面に分布させ、かつ37℃で5時間インキュベーションした。このペトリ皿を、予
め加熱したDEMEM 20％FCS 5mlで満たし、かつ37℃で16時間インキュベーション
した。その後、このインキュベーション培地を慎重に吸引濾過し、OptiMEM 10ml
と交換した。更に37℃で 48時間インキュベーションした後、上清を収集のため
に取除き、かつ細胞を700gで遠心し除去した。更なる12000gでの遠心工程は、残
留する細胞断片をペレット化した。上清は、30分の超遠心(60000 xgで30分)、次
にIMACカラムへの添加(Amersham-Pharmacia社)、もしくは30kDa分離閾値を有す
る遠心濃縮装置(Fugisept-Midi又はMaxiRohrchen、Intersept社)における容量1/
40〜1/80への蒸発除去のいずれかを行った。この遠心は、6000gで製造業者の指
示に従い行い、かつ通常6時間を要した。濃縮したタンパク質溶液を、1％ BSAと
混合し、100μlアリコートへ分割し、かつN2中で瞬間凍結した後、-80℃で貯蔵
した。 Transient expression in COS cells : For transfection of COS7 cells, the expression vector was first transformed into E. c.
Amplified in oli (XL1-Blue) and then purified. Vector DNA was adjusted to a concentration of 1 μg / μl under sterile conditions and stored at -20 ° C. The day before transfection, 5x10 5 COS7 cells were seeded in a cell culture Petri dish (8 cm diameter, Greiner) containing DEMEM 10% FCS and incubated at 37 ° C in a CO 2 heated cupboard. And incubated for 16 hours. On the day of transfection, 1 ml OptiMEM (Gibco), 35 μl Lipofectamine (Gibco Life) per Petri dish.
A suspension containing 10 μl of expression vector DNA was prepared. 45 at ambient temperature
After a minute of incubation, another 4 ml of OptMEM was added and the suspension was pipetted carefully onto the cells previously washed with PBS. The solution was gently tilted and distributed over the entire surface, and incubated at 37 ° C. for 5 hours. The petri dish was filled with 5 ml of preheated DEMEM 20% FCS and incubated at 37 ° C for 16 hours. The incubation medium is then carefully filtered by suction and OptiMEM 10 ml
I replaced it with. After a further 48 hours incubation at 37 ° C, the supernatant was removed for collection and the cells were removed by centrifugation at 700g. An additional centrifugation step at 12000 g pelleted the remaining cell fragments. The supernatant was ultracentrifuged for 30 minutes (30 minutes at 60000 xg), then added to an IMAC column (Amersham-Pharmacia), or a centrifugal concentrator with a 30 kDa separation threshold (Fugisept-Midi or Maxi Rohrchen, Intersept). Capacity at 1 /
Either by evaporation to 40 to 1/80. This centrifugation was performed at 6000 g according to the manufacturer's instructions and usually took 6 hours. The concentrated protein solution was mixed with 1% BSA, divided into 100 μl aliquots and snap frozen in N 2 before storage at −80 ° C.

【００９９】CHO細胞における安定した発現 ： CHO DG44の安定したトランスフェクタントを、FAP-特異性ミニボディの発現の
ために調製した。 トランスフェクション： 第1日目：2x105個細胞を、6-ウェルプレートのひとつのウェルに播種した。 第2日目：細胞培養物上清を慎重に吸引濾過し、引き続きCHO-SFM II培地 800μl
＋HT補助物質(Gibco BRL社)を添加する。 トランスフェクション懸濁液の調製：リポフェクタミン6μl＋HT補助物質を含
むCHO-SFM II 200μl＋発現ベクター3μl(3μg)。この懸濁液を混合し、細胞へ
慎重に添加した。 第3日目：培地の交換：HT補助物質を含まないCHO-SFM IIの添加。 Stable expression in CHO cells : Stable transfectants of CHO DG44 were prepared for expression of FAP-specific minibodies. Transfection: Day 1: 2x10 5 cells were seeded in one well of a 6-well plate. Day 2: Carefully aspirate the cell culture supernatant followed by 800 μl CHO-SFM II medium.
+ Add HT auxiliary (Gibco BRL). Preparation of transfection suspension: 6 μl lipofectamine + 200 μl CHO-SFM II with HT auxiliary + 3 μl expression vector (3 μg). This suspension was mixed and added carefully to the cells. Day 3: Medium change: CHO-SFM II without HT supplement.

【０１００】 培地の交換は、定期的に繰り返した。遺伝子増幅及び外来遺伝子の発現の増大
のために、トランスフェクション後10〜14日の期間、メトトレキセートを培地に
添加した。メトトレキセート濃度を漸増し；この濃度は、10〜1000nMの間であっ
た。 これらのミニボディは、T-培養フラスコ又はバイオリアクター内で作出した。The medium exchange was repeated periodically. Due to gene amplification and increased expression of foreign genes, methotrexate was added to the medium for a period of 10-14 days post transfection. The methotrexate concentration was titrated; this concentration was between 10 and 1000 nM. These minibodies were produced in T-culture flasks or bioreactors.

【０１０１】組換え抗-FAP抗体の見かけの細胞結合親和性の決定 FAP+細胞を、様々な濃度の一価又は二価scFv誘導体と共に、並行バッチにおい
てインキュベーションした。これらの組換え抗体の結合は、セルアナライザー(C
oulter社)においてFITC-標識検出抗体を用いて決定した。結合シグナルの最大飽
和の半値に達するscFv誘導体の濃度を、見かけの親和性の測定値として選択した
。 Determination of Apparent Cell Binding Affinity of Recombinant Anti-FAP Antibodies FAP + cells were incubated in parallel batches with various concentrations of monovalent or divalent scFv derivatives. Binding of these recombinant antibodies was performed using a cell analyzer (C
oulter) using a FITC-labeled detection antibody. The concentration of scFv derivative that reaches half maximal saturation of the binding signal was chosen as a measure of apparent affinity.

【０１０２】実施例3：配列 ここで、例としての配列を示す。比較的小さい突然変異、例えば1個又は数個
のアミノ酸又はそれらをコードしているヌクレオチドの置換も、本発明に含まれ
ている。 Example 3: Sequence An example sequence is shown here. Smaller mutations, eg substitutions of one or several amino acids or the nucleotides encoding them, are also included in the invention.

【０１０３】 例えば、ミニボディベクターにおいて認めることができるような、VH13タンパク 質配列 。最初のアミノ酸は、E(グルタミン酸)であってもよい。 QVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVSGISASGGYIDYADSVKGRVTISR
DNSKNMAY LQMSSLRAEDTALYYCAKGGNYQMLLDHWGQGTLVTVSSASTKGPKL[0103] For example, as can be seen in the mini body vector, VH13 protein sequence. The first amino acid may be E (glutamic acid). QVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVSGISASGGYIDYADSVKGRVTISR
DNSKNMAY LQMSSLRAEDTALYYCAKGGNYQMLLDHWGQGTLVTVSSASTKGPKL

【０１０４】VH13に対応するヌクレオチド配列 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTAT
TAGTGCTA GTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA
TGGCATAT CTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATG
CTATTGGA CCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTT Nucleotide sequence corresponding to VH13 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTAT
TAGTGCTA GTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA
TGGCATAT CTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATG
CTATTGGA CCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTT

【０１０５】VH 46 タンパク質配列 QVQLVQSGAEVKKDGASVKVSCKATGGTFSGHAISWVRQAPGQRLEWMGEISPMFGTPNYAQSFQGRVTITA
DESTSYME VSSLRSEDTATYYCARGANYRALLDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL 例えば、ミニボディにおいて生じるようなVH46に対応するヌクレオチド配列。
この6番目のヌクレオチドは、Gの代わりにAであってもよい-サイレント突然変異
、ここでは該アミノ酸配列に対する作用は持たない。 VH 46 protein sequence QVQLVQSGAEVKKDGASVKVSCKATGGTFSGHAISWVRQAPGQRLEWMGEISPMFGTPNYAQSFQGRVTITA
DESTSYME VSSLRSEDTATYYCARGANYRALLDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL Nucleotide sequence corresponding to VH46 , such as occurs in minibodies .
This 6th nucleotide may be A instead of G-silent mutation, here with no effect on the amino acid sequence.

【０１０６】 CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGGATGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
ACTGGAGG CACTTTCAGCGGTCACGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAAGACTTGAGTGGATGGGGGAGAT
CAGCCCTA TGTTTGGAACACCAAACTACGCACAGAGCTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCTACGAGTT
ACATGGAG GTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCGAGAGGTGCGAACTACCGGGCCCTCCTT
GATTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTTCAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGGATGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
ACTGGAGG CACTTTCAGCGGTCACGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAAGACTTGAGTGGATGGGGGAGAT
CAGCCCTA TGTTTGGAACACCAAACTACGCACAGAGCTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCTACGAGTT
ACATGGAG GTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCGAGAGGTGCGAACTACCGGGCCCTCCTT
GATTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTT

【０１０７】 ミニボディにおいて生じるようなVH50タンパク質配列。再度、VH13と同じものを
適用：最初のアミノ酸はEであっても良い。 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISR
DNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGSLCTDGSCPTIGPGPNWGQGTLVTVSSAPTKAPKL VH50 protein sequence as it occurs in a minibody . Again, apply the same as VH13: the first amino acid may be E. QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISR
DNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGSLCTDGSCPTIGPGPNWGQGTLVTVSSAPTKAPKL

【０１０８】 例えば、ミニボディにおいて生じるようなVH50に対応するヌクレオチド配列。 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGTAACTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACAT
AAAGCAAG ATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT
CACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTCACTCTGTACTGAT
GGTAGCTG CCCCACCATAGGGCCTGGGCCAAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCACCCACCAAGGC
TCCGAAGC TTFor example, a nucleotide sequence corresponding to VH50 as occurs in a minibody . CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGTAACTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACAT
AAAGCAAG ATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT
CACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTCACTCTGTACTGAT
GGTAGCTG CCCCACCATAGGGCCTGGGCCAAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCACCCACCAAGGC
TCCGAAGC TT

【０１０９】VLIII25 タンパク質 DIQMTQSPSSLSASTGDRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFT
LTITSLQS EDFATYYCQQYYIYPPTFGQGTRVEIKRTVAAPSVFAA VLIII25 protein DIQMTQSPSSLSASTGDRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFT
LTITSLQS EDFATYYCQQYYIYPPTFGQGTRVEIKRTVAAPSVFAA

【０１１０】VLIII25 に対応するヌクレオチド配列 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGG
GCGAGTCA AGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGC
AACCACTT TACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACGTCCC
TGCAGTCT GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTG
GAAATCAA ACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC[0110] The nucleotide sequence GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGG corresponding to VLIII25
GCGAGTCA AGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGC
AACCACTT TACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACGTCCC
TGCAGTCT GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTG
GAAATCAA ACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１１１】 下記を含むCH1の最初の8個のアミノ酸を伴うタンパク質VH34： QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTHTINWVRQAPGQGLEWMGGIAPMFGTANYAQKFQGRVTITA
DKSTSTAY MEMSSLRSDDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL Protein VH34 with the first 8 amino acids of CH1 including: QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTHTINWVRQAPGQGLEWMGGIAPMFGTANYAQKFQGRVTITA
DKSTSTAY MEMSSLRSDDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL

【０１１２】VH34 に対応する核酸配列： CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGG CACCTTCAGCACCCATACTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGAT
CGCCCCTA TGTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACAATTACCGCGGACAAATCCACGAGCA
CAGCCTAC ATGGAGATGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGGCCAAA
GCTT[0112] VH34 to the corresponding nucleic acid sequence: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGG CACCTTCAGCACCCATACTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGAT
CGCCCCTA TGTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACAATTACCGCGGACAAATCCACGAGCA
CAGCCTAC ATGGAGATGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGGCCAAA
GCTT

【０１１３】 CH1の一部のアミノ酸を伴うVH18： QVQLVQSGAELKKPGSSMKVSCKASGDTFSTYSINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR
DTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL[0113] with a part of the amino acid of CH1 VH18: QVQLVQSGAELKKPGSSMKVSCKASGDTFSTYSINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR
DTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKL

【０１１４】VH18 に対応する核酸配列： CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGATGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGA CACCTTCAGCACCTATTCTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAAT
CAACCCTA GTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCA
CAGTTTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAA
GCTTNucleic acid sequence corresponding to VH18 : CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGATGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGA CACCTTCAGCACCTATTCTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAAT
CAACCCTA GTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCA
CAGTTTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAA
GCTT

【０１１５】VL鎖 III43 DIQMTQSPSSLSASTGDRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFT
LTISSLQA EDVAVYYCQQYYRTPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFAA VL chain III43 DIQMTQSPSSLSASTGDRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFT
LTISSLQA EDVAVYYCQQYYRTPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFAA

【０１１６】III43 に対応する核酸配列： GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGG
GCGAGTCA AGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGC
AACCACTT TACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC
TGCAGGCT GAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGTTTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGTTG
GAGATCAA ACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC[0116] III43 to the corresponding nucleic acid sequence: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGG
GCGAGTCA AGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGC
AACCACTT TACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC
TGCAGGCT GAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGTTTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGTTG
GAGATCAA ACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１１７】 ミニボディに生じるような、総抗体タンパク質のVH 13 YOL VL III25タンパク質
配列： QVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVSGISASGGYIDYADSVKGRVTISR
DNSKNMAY LQMSSLRAEDTALYYCAKGGNYQMLLDHWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSSLSAST
GDRVTITC RASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYCQQYYIYP
PTFGQGTR VEIKRTVAAPSVFAA VH 13 YOL VL III25 protein sequence of total antibody protein, as occurs in minibodies : QVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVSGISASGGYIDYADSVKGRVTISR
DNSKNMAY LQMSSLRAEDTALYYCAKGGNYQMLLDHWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSSLSAST
GDRVTITC RASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYCQQYYIYP
PTFGQGTR VEIKRTVAAPSVFAA

【０１１８】VH 13 YOL VL III25 に対応するヌクレオチド配列： CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTAT
TAGTGCTA GTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA
TGGCATAT CTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATG
CTATTGGA CCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTTGAAGAAGGTGA
ATTTTCAG AAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGT CGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTG
ATGTCTGG AGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC
CATCACGT CCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAG
GGACCAGG GTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCNucleotide sequence corresponding to VH 13 YOL VL III 25 : CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTAT
TAGTGCTA GTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA
TGGCATAT CTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATG
CTATTGGA CCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTTGAAGAAGGTGA
ATTTTCAG AAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGT CGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTG
ATGTCTGG AGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC
CATCACGT CCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAG
GGACCAGG GTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１１９】 例えば、ミニボディにおいて生じるような総抗体タンパク質のVH46 YOL VL III2 5 タンパク質配列 QVQLVQSGAEVKKDGASVKVSCKATGGTFSGHAISWVRQAPGQRLEWMGEISPMFGTPNYAQSFQGRVTITA
DESTSYME VSSLRSEDTATYYCARGANYRALLDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSSLSASTGD
RVTITCRA SQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYCQQYYIYPPT
FGQGTRVE IKRTVAAPSVFAAFor example, the VH46 YOL VL III2 5 protein sequence QVQLVQSGAEVKKDGASVKVSCKATGGTFSGHAISWVRQAPGQRLEWMGEISPMFGTPNYAQSFQGRVTITA of the total antibody protein as occurs in minibodies.
DESTSYME VSSLRSEDTATYYCARGANYRALLDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSSLSASTGD
RVTITCRA SQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYCQQYYIYPPT
FGQGTRVE IKRTVAAPSVFAA

【０１２０】VH46 YOL VL III25 に対応するヌクレオチド配列 CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGGATGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
ACTGGAGG CACTTTCAGCGGTCACGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAAGACTTGAGTGGATGGGGGAGAT
CAGCCCTA TGTTTGGAACACCAAACTACGCACAGAGCTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCTACGAGTT
ACATGGAG GTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCGAGAGGTGCGAACTACCGGGCCCTCCTT
GATTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTC
AGAAGCAC GCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTT
GTCGGGCG AGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCT
GGAGCAAC CACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAC
GTCCCTGC AGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCA
GGGTGGAA ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCNucleotide sequence corresponding to VH46 YOL VL III25 CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGGATGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
ACTGGAGG CACTTTCAGCGGTCACGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAAGACTTGAGTGGATGGGGGAGAT
CAGCCCTA TGTTTGGAACACCAAACTACGCACAGAGCTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCTACGAGTT
ACATGGAG GTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCGAGAGGTGCGAACTACCGGGCCCTCCTT
GATTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTC
AGAAGCAC GCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTT
GTCGGGCG AGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCT
GGAGCAAC CACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAC
GTCCCTGC AGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCA
GGGTGGAA ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１２１】 例えば、ミニボディにおいて生じるような総抗体タンパク質のVH 50 YOL VL III 25 タンパク質配列(可能性のある変種については、前記VH50参照) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISR
DNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGSLCTDGSCPTIGPGPNWGQGTLVTVSSAPTKAPKLEEGEFSEARVDIQMTQSP
SSLSASTG DRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYC
QQYYIYPP TFGQGTRVEIKRTVAAPSVFAAFor example, the VH 50 YOL VL III 25 protein sequence of the total antibody protein as it occurs in minibodies (see VH50 above for potential variants) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISR
DNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGSLCTDGSCPTIGPGPNWGQGTLVTVSSAPTKAPKLEEGEFSEARVDIQMTQSP
SSLSASTG DRVTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQSEDFATYYC
QQYYIYPP TFGQGTRVEIKRTVAAPSVFAA

【０１２２】VH 50 YOL VL III25 に対応するヌクレオチド配列 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGTAACTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACAT
AAAGCAAG ATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT
CACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTCACTCTGTACTGAT
GGTAGCTG CCCCACCATAGGGCCTGGGCCAAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCACCCACCAAGGC
TCCGAAGC TTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCAT
CTACAGGA GACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCC
GGGAAAGC CCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC
TGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCACGTCCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTT
ACCCTCCG ACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCNucleotide sequence corresponding to VH 50 YOL VL III 25 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC
TCTGGATT CACCTTTAGTAACTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACAT
AAAGCAAG ATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT
CACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTCACTCTGTACTGAT
GGTAGCTG CCCCACCATAGGGCCTGGGCCAAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCACCCACCAAGGC
TCCGAAGC TTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCAT
CTACAGGA GACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCC
GGGAAAGC CCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC
TGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCACGTCCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTT
ACCCTCCG ACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１２３】 総抗体タンパク質のVH34YOLIII43タンパク質配列： QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTHTINWVRQAPGQGLEWMGGIAPMFGTANYAQKFQGRVTITA
DKSTSTAY MEMSSLRSDDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSS
LSASTGDR VTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ
YYRTPFTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFAA VH34YOLIII43 protein sequence of total antibody protein: QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTHTINWVRQAPGQGLEWMGGIAPMFGTANYAQKFQGRVTITA
DKSTSTAY MEMSSLRSDDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSS
LSASTGDR VTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ
YYRTPFTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFAA

【０１２４】VH34YOLIII43 に対応するヌクレオチド配列： CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGG CACCTTCAGCACCCATACTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGAT
CGCCCCTA TGTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACAATTACCGCGGACAAATCCACGAGCA
CAGCCTAC ATGGAGATGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGGCCAAA
GCTTGAAG AAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAG
GAGACAGA GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAA
GCCCCTCA TCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAC
AGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGT
TTACTTTT GGCCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC[0124] VH34YOLIII43 to the corresponding nucleotide sequence: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGG CACCTTCAGCACCCATACTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGAT
CGCCCCTA TGTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACAATTACCGCGGACAAATCCACGAGCA
CAGCCTAC ATGGAGATGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGGCCAAA
GCTTGAAG AAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAG
GAGACAGA GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAA
GCCCCTCA TCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAC
AGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGT
TTACTTTT GGCCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１２５】 総抗体タンパク質のVH18 YOL III43タンパク質配列： QVQLVQSGAELKKPGSSMKVSCKASGDTFSTYSINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR
DTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSS
LSASTGDR VTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ
YYRTPFTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFAA VH18 YOL III43 protein sequence of total antibody protein: QVQLVQSGAELKKPGSSMKVSCKASGDTFSTYSINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR
DTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVDIQMTQSPSS
LSASTGDR VTITCRASQDISSYLAWYQQAPGKAPHLLMSGATTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ
YYRTPFTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFAA

【０１２６】VH18 YOL III43 に対応するヌクレオチド配列： CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGATGAAGGTCTCCTGCAAGGCT
TCTGGAGA CACCTTCAGCACCTATTCTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAAT
CAACCCTA GTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCA
CAGTTTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAA
GCTTGAAG AAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAG
GAGACAGA GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAA
GCCCCTCA TCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAC
AGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGT
TTACTTTT GGCCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCNucleotide sequence corresponding to VH18 YOL III43 : CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGATGAAGGTCTCCTGCAAGGCT.
TCTGGAGA CACCTTCAGCACCTATTCTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAAT
CAACCCTA GTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCA
CAGTTTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGAAGAATCGCGTACGGT
TACGACGA GGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAA
GCTTGAAG AAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAG
GAGACAGA GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAA
GCCCCTCA TCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAC
AGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATCGTACTCCGT
TTACTTTT GGCCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC

【０１２７】実施例4 材料及び方法 V-遺伝子ライブラリーの構築 総RNAは、2名のナイーブドナーの末梢血リンパ球(バフィーコート)から単離し
た。mRNAを、mRNA単離キット(Qiagen社、独国)により調製した。cDNAは、オリゴ
dT-プライミングにより合成した。 Example 4 Materials and Methods V-Gene Library Construction Total RNA was isolated from peripheral blood lymphocytes (buffy coat) of two naive donors. mRNA was prepared by mRNA isolation kit (Qiagen, Germany). cDNA is oligo
Synthesized by dT-priming.

【０１２８】 κ及びλ軽鎖の増幅のために、Marksらの論文(1991)に「ヒトVκ及びVλBack
プライマー」として説明された5'-オリゴヌクレオチド、並びにWelschofらの論
文(1995)に定常κ及び定常λプライマーとして説明された3'-オリゴヌクレオチ
ドを適用する、一次PCRを用いた。56℃でアニーリングする30サイクルを選択し
た。二次PCR(最大14サイクル)を利用し、第一の増幅体に、VL 5'側クローニング
部位MluI及び3'側部位NotIを追加した。ここで、5'側伸長TAC AGG ATC CAC GCG T Aを利用し、5'側クローニング部位MluIをBackプライマーに追加し、かつ5'側伸
長TGA CAA GCT TGC GGC CGCでNotI部位を定常VLプライマーに追加した。得られ
た二次PCR VL増幅物を、アガロースゲル上を流し、かつQiaExキット(Qiagen社、
独国)により精製した。VLレパートリーをクローニングするために、ファージミ
ドベクターpSEX 81(本質的に、Breitlingらの論文(1991)に記されたもの)を、Ml
uI及びNotIにより過剰消化した。この制限されたDNAを、QiaQuick(Qiagen社、独
国)を用いて精製し、かつ同じエンドヌクレアーゼで過剰消化されたVL PCR産物
と一晩ライゲーションした。エタノール-沈殿によるライゲーションを用い、E.
coli XL1-Blue (Stratagene社、カリフォルニア)に形質転換した。形質転換体を
、100mM-グルコース、100μg/mlアンピシリン、12.5μg/mlテトラサイクリンを
含有する2YTプレート上に配置し、かつ30℃で一晩増殖した。クローニングされ
たライブラリーの多様性は、PCR-増幅したV領域のBstNI-消化及びポリアクリル
アミドゲル上での分析により試験した。For amplification of kappa and lambda light chains, Marks et al. (1991) reported in "human V kappa and V lambda Back.
Primary PCR was used, applying 5'-oligonucleotides described as "primers" and 3'-oligonucleotides described as constant kappa and constant lambda primers in Welschof et al. (1995). Thirty cycles of annealing at 56 ° C were selected. Secondary PCR (maximum 14 cycles) was used to add a VL 5'side cloning site MluI and a 3'side site NotI to the first amplicon. Here, using 5'extended TAC AGG ATC C AC GCG T A, added 5'side cloning site MluI to Back primer, and 5'extended TGA CAA GCT T GC GGC CGC Added to L primer. The resulting secondary PCR VL amplificate was run on an agarose gel, and the QiaEx kit (Qiagen,
Purified by Germany. To clone the V L repertoire, the phagemid vector pSEX 81 (essentially described in Breitling et al. (1991)) was cloned into Ml.
Overdigested with uI and NotI. The restricted DNA was purified using QiaQuick (Qiagen, Germany) and ligated overnight with VL PCR product overdigested with the same endonuclease. Using ethanol-precipitation ligation, E.
E. coli XL1-Blue (Stratagene, California) was transformed. Transformants were plated on 2YT plates containing 100 mM-glucose, 100 μg / ml ampicillin, 12.5 μg / ml tetracycline and grown overnight at 30 ° C. The diversity of the cloned library was tested by BstNI-digestion of PCR-amplified V regions and analysis on polyacrylamide gels.

【０１２９】 重鎖の増幅については、VHのN-末端についてMarksらの論文(1991)に「ヒトVHB
ackプライマー」として既に説明された5'-オリゴヌクレオチドを、並びに機能的
に再編成された遺伝子セグメントファミリー内のFR3領域のC-末端については下
記の3'-オリゴヌクレオチドを適用する、一次PCRを用いた： HU VG VH1/3/4: TCT CGC ACA GTA ATA CAC GGC HU VG VH2: TCT GTG TGC ACA GTA ATA TCT GGC HU VG VH5: TCT CGC ACA GTA ATA CAT GGC HU VG VH6: TCT TGC ACA GTA ATA CAC AGCFor amplification of the heavy chain, the N-terminus of V H was described in Marks et al. (1991) “Human V H B
The 5'-oligonucleotide already described as `` ack primer '', as well as the 3'-oligonucleotide below for the C-terminus of the FR3 region within the functionally rearranged gene segment family, primary PCR, Used: HU VG VH1 / 3/4: TCT CGC ACA GTA ATA CAC GGC HU VG VH2: TCT GTG TGC ACA GTA ATA TCT GGC HU VG VH5: TCT CGC ACA GTA ATA CAT GGC HU VG VH6: TCT TGC ACA GTA ATA CAC AGC

【０１３０】 アニーリング温度55〜58℃で、30サイクルで実行した。二次PCR(最大14サイク
ル)を利用し、VH 5'側クローニング部位NcoI及び3'側部位SplIを追加し、後者は
、FR1の親(patental)HCDR3を伴うFR3遺伝子セグメントへの結合を促進する。2、
3μlの一次PCRを前述のプライマーの鋳型として使用し、下記の5'配列を追加し
た：5' プライマー：GAA TAG GCC ATG GCG；3' プライマー：GGG GGC GGG CGT A CG CGA TTC TTC T。新たなSplI部位を、そのコードセンスの変更を伴わないPCR
により、親HCDR3へ挿入した。この部位は、機能的に再編成されることがわかっ
ているような全てのVH-遺伝子セグメントファミリーのクローニングを可能にし
た(図9)。The annealing temperature was 55-58 ° C. and 30 cycles were performed. Utilizing secondary PCR (up to 14 cycles), and add the V H 5 'side cloning site NcoI and 3' site SplI, the latter, promotes binding to FR3 gene segments with parent (patental) HCDR3 of FR1 To do. 2,
3 μl of primary PCR was used as template for the above primers and the following 5 ′ sequences were added: 5 ′ primer: GAA TAG G CC ATG G CG; 3 ′ primer: GGG GGC GGG CGT A CG CGA TTC TTC T. PCR of a new SplI site without changing its codesense
Was inserted into the parent HCDR3. This site allowed cloning of all V H -gene segment families that were found to be functionally rearranged (Figure 9).

【０１３１】ファージの調製及び選択 ファージ会合した抗体(phabs)を得るために、指数関数的に増殖しているE. co
liの過剰感染を、Schierの論文(1996)に従い行った。30℃で一晩増殖後、細菌を
ペレット化し、かつファージを、2.5M-NaClを溶媒とする20％ポリエチレングリ
コールにより2回沈殿した。選択のために、FAP 1〜20μgを回転しているMaxisor
bイムノチューブ(Nunc社)内に一晩かけ4℃で被覆した。PBSで2回洗浄後、この被
覆したチューブを、PBS中の3％脂肪非含有乾燥ミルク又はRoti-Block(Roth社、
独国)でブロックした。パニング直前に、チューブをPBSで2回洗浄した。6％脂肪
非含有乾燥ミルク(作業濃度)中で、 1010〜1012 cfuを予備吸着させ、かつ室温
で2時間かけたタンブラー(tumbling)選択に使用した。選択ラウンド1及び2にお
いて、PBSによる10〜15回の洗浄工程、その後の同じ回数のPBS-Tween 20(0.1％)
による線上工程を行った。後者のラウンドにおいて、洗浄は、最大25回のPBS-Tw
een及び同じ回数の純粋なPBSにまで増加した。洗浄時のストリンジェンシーを高
くするために、Tween濃度を0.5％に上昇し、かつイムノチューブにかなりの渦巻
きを導入した。ファージの溶離を、100mM-トリエチルアミン又は0.1M-HCl(pH2.2
)のいずれかにより行った。溶離したファージを、直ぐにTrisにより中和し、か
つXL-1 Blueの感染に使用した。一晩30℃で増殖した後、この細菌を寒天プレー
トから掻取、かつ更なる選択又はグリセロール凍結のいずれかのラウンドに使用
した。 Phage preparation and selection To obtain phage-associated antibodies (phabs), exponentially growing E. co
li superinfection was performed according to Schier's paper (1996). After overnight growth at 30 ° C., the bacteria were pelleted and the phage were precipitated twice with 20% polyethylene glycol in 2.5M NaCl. Maxisor spinning 1-20 μg FAP for selection
b Coated in immunotube (Nunc) overnight at 4 ° C. After washing twice with PBS, the coated tube was treated with 3% fat-free dry milk in PBS or Roti-Block (Roth,
Blocked in Germany. Immediately before panning, the tube was washed twice with PBS. 10 10 to 10 12 cfu was pre-adsorbed in 6% fat-free dry milk (working concentration) and used for tumbling selection for 2 hours at room temperature. In selection rounds 1 and 2, 10-15 washing steps with PBS followed by the same number of PBS-Tween 20 (0.1%)
Was performed. In the latter round, wash up to 25 times with PBS-Tw
een and up to the same number of pure PBS. To increase the stringency of the wash, the Tween concentration was raised to 0.5% and a significant swirl was introduced into the immunotube. Elution of phage was performed using 100 mM triethylamine or 0.1 M HCl (pH 2.2).
). Eluted phage were immediately neutralized with Tris and used to infect XL-1 Blue. After growing overnight at 30 ° C., the bacteria were scraped from agar plates and used for either rounds of further selection or glycerol freezing.

【０１３２】特異的ファージのスクリーニング この選択されたphabsのスクリーニングを、別に記したように行った(Mersmann
ら、1998)。簡単に述べると、本発明者らは、完全なファージを作出することな
く、scFv-pIII融合タンパク質の発現を誘導した。これらの融合タンパク質は、
精製したFAP及び無関係なAgについてELISAにおいて試験した。FAP-特異性である
ことを明らかにする結合剤を、様々な量の親F19のキメラ二価構築体を同期競合
に利用するような、競合的ELISAで分析した。DNA-配列決定を、蛍光ジデオキシ
ヌクレオチド及びALFexpress (Amersham Pharmacia社、スウェーデン)を使用す
るか、もしくは商業的サービスにより行った。 Screening for Specific Phage This screening of selected phabs was performed as described elsewhere (Mersmann.
Et al., 1998). Briefly, we induced expression of the scFv-pIII fusion protein without producing intact phage. These fusion proteins are
Purified FAP and irrelevant Ag were tested in an ELISA. Binders that revealed FAP-specificity were analyzed in a competitive ELISA, utilizing varying amounts of the chimeric bivalent construct of the parental F19 for synchronous competition. DNA-sequencing was performed using fluorescent dideoxynucleotides and ALFexpress (Amersham Pharmacia, Sweden) or by commercial service.

【０１３３】親和性測定 Ab構築体の機能的親和性を概算するために、それらの最大飽和濃度の半値を、
FAPを過剰発現している繊維肉腫細胞(HT1080)について決定した。105個のFAP+細
胞又は対照細胞を、連続希釈したAb構築体と共に90分間インキュベーションした
。検出は、抗-c-myc Ab 9E10により、その後FITC標識したヤギ抗-マウス特異血
清(scFvの場合)又はFITC標識したヤギ抗-ヒト特異性血清(Mbの場合)により行っ
た。インキュベーション及び洗浄を、標識したAbについては室温で行った以外は
、氷上で行った。結合したAb構築体(contruct)を、FACStar(Becton Dickinson社
)又はEPICSフローサイトメーター(Coulter社)により検出した。各希釈物中の104 個細胞について、平均蛍光を測定した。適用したAb誘導体の濃度を、SDS-PAGE及
びウェスタンブロットにおいて使用したscFv又はMb標準に対し繰り返し概算する
ことにより決定した。 Affinity measurements To estimate the functional affinities of Ab constructs, half of their maximum saturating concentrations were calculated :
It was determined for fibrosarcoma cells overexpressing FAP (HT1080). 10 5 FAP + cells or control cells were incubated with serially diluted Ab constructs for 90 minutes. Detection was performed with anti-c-myc Ab 9E10 followed by FITC-labeled goat anti-mouse specific serum (for scFv) or FITC-labeled goat anti-human specific serum (for Mb). Incubations and washes were performed on ice except for labeled Abs at room temperature. The bound Ab construct (contruct) was labeled with FACStar (Becton Dickinson
) Or EPICS flow cytometer (Coulter). Mean fluorescence was measured for 10 4 cells in each dilution. The concentration of Ab derivative applied was determined by iterative approximation to the scFv or Mb standards used in SDS-PAGE and Western blot.

【０１３４】ミニボディ(Mb)のクローニング、発現及び精製 選択されたクローン18及び34のscFvカセットを、NcoI/NotIによる制限により
、scFv発現ベクターpOPE101(Dubelら、1992)から切断し、かつ公開されたベクタ
ーpACK02scKan-(Packら、1993)の誘導体である、同等に調製したMb-ベクターpD1
へ挿入した。Rippmannらの論文(1998)に従い、通常のようにE. coli XL1-Blueを
形質転換し、引き続きProteus mirabilisの細胞壁及び外膜欠損株LVIを、形質転
換し、かつ一晩かけて発現を誘導した。PBSに対して透析した後、Mbを超遠心し(
113,000 x g、4℃、30分)、及びZn2+負荷したHiTrapカラム(Pharmacia社、スウ
ェーデン)でのIMACにより精製した。画分を、SDS-PAGE及びそれに続くクーマシ
ー染色により試験した。 Cloning, Expression and Purification of Minibodies (Mb) The scFv cassettes of selected clones 18 and 34 were cut from the scFv expression vector pOPE101 (Dubel et al., 1992) by restriction with NcoI / NotI and published. Equivalently prepared Mb-vector pD1 which is a derivative of vector pACK02scKan- (Pack et al., 1993).
Inserted into. According to a paper by Rippmann et al. (1998), E. coli XL1-Blue was transformed as usual, followed by transformation of Proteus mirabilis cell wall and outer membrane deficient strain LVI, and expression was induced overnight. . After dialysis against PBS, ultracentrifuge Mb (
Purified by IMAC on HiTrap column (Pharmacia, Sweden) loaded with Zn 2+ (113,000 xg, 4 ° C, 30 minutes). Fractions were tested by SDS-PAGE followed by Coomassie staining.

【０１３５】Mbの安定性アッセイ 5％FCSを含有するRPMI培地におけるMb #34の熱安定性を、精製し新たに解凍し
たMbを、37℃で最大72時間インキュベーションすることにより調べた。 インキ
ュベーション後、この溶液を遠心し(20,000 x g、4℃、10分)、かつ固定したFAP
上でのELISAに使用した。先行する実験を用い、各Mb調製物について識別できる
が飽和ではないようなELISAシグナルに達するのに適当な希釈を決定した。 Mb Stability Assay The thermostability of Mb # 34 in RPMI medium containing 5% FCS was examined by incubating purified freshly thawed Mb at 37 ° C. for up to 72 hours. After incubation, the solution was centrifuged (20,000 xg, 4 ° C, 10 minutes) and fixed with FAP.
Used in the ELISA above. Previous experiments were used to determine the appropriate dilution to reach a discriminating but not saturated ELISA signal for each Mb preparation.

【０１３６】免疫組織化学 腫瘍組織のアセトン固定した新鮮な凍結切片を使用した。この組織切片を、組
換え抗体(10μg/ml)と共に4℃でインキュベーションし(16時間)、引き続き抗-cm
yc Mab 9E10と共に室温で1時間インキュベーションした。その後、ビオチン化し
たウマの抗-マウス血清を適用した。アビジン-ビオチンイムノペルオキシダーゼ
法により、Ag/Ab複合体の検出を行った。陰性対照として、切片をビオチン化し
た血清抗体によってのみ処理し、その後呈色反応させた。Harrisヘマトキシリン
を切片の対比染色に使用した。 Immunohistochemistry Fresh frozen sections of tumor tissue fixed with acetone were used. The tissue sections were incubated with recombinant antibody (10 μg / ml) at 4 ° C (16 hours), followed by anti-cm2.
Incubated with yc Mab 9E10 for 1 hour at room temperature. Then, biotinylated horse anti-mouse serum was applied. The Ag / Ab complex was detected by the avidin-biotin immunoperoxidase method. As a negative control, sections were treated only with biotinylated serum antibody, followed by color reaction. Harris hematoxylin was used for counterstaining the sections.

【０１３７】結果 1.ヒトVLの選択 ： scFv構成体を基にしたガイド付き選択法を、最初にFAP特異抗体F19のマウスの
VLの置換、その後のF19 VHのヒト化のために選択した。ベクターpSEX81を使用し
、ここでナイーブヒトドナー由来のVLレパートリーを、 VH F19と組合せ、約3 x
106個の異なるクローンのコンビナトリアルライブラリーを得た。 Results 1. Selection of human VL : A guided selection method based on scFv constructs was first performed on mice of FAP-specific antibody F19.
VL substitutions were selected for subsequent F19 V H humanization. Using the vector pSEX81, wherein the V L repertoires from naïve human donors, combined with V H F19, about 3 x
A combinatorial library of 10 6 different clones was obtained.

【０１３８】 このライブラリーは、ヒトVL F19アナログを単離するための、固定されたFAP
上で選択されたファージディスプレーであった。3ラウンド選択後、ELISAによる
結合剤のスクリーニングにより、いくつかのFAP結合クローンを得た。これらの
単離されたキメラscFv(マウスのVH/ヒトVL)の多様性を確認するために、それら
のファージミドDNAを、制限酵素により分析しかつ配列決定した。親scFv F19の
ガイドVH及び件別にされた(itemized)ヒトVLからなる、様々なキメラscFv(ここ
では短くVLにちなんで呼ぶ)を同定した(III5、III10、III25、III43)。表1は、
交換したVL F19と比較した、選択した軽鎖III5及びIII43のアミノ酸配列相同性
を示す。Kabat (http://immuno.bme.nwu.edu/)に従いヒトVLサブグループκIに
属する列記したVL、及び密接な相同性を伴う生殖細胞系列遺伝子の両方が、サブ
グループVκ1ファミリー(III5：Ve；III43：Ve)のメンバーである。アミノ酸配
列に注目すると、クローンIII5は、親F19と比較しFR位置について64％もの同一
性を有し、かつCDR位置について59％の同一性を有した。III43は、F19と比較し
、FR位置について69％の同一性を、更にCDR位置について59％の同一性を有した
。加えて、III5及びIII43は、それらの推定生殖細胞系列遺伝子と比較して高度
の突然変異を示した。III5は、最も近い生殖細胞系列の配列と14個のアミノ酸位
置が異なり、III43は、17個の差異を示している(ImMunoGeneTicsデータベース：
http://imgt.cnusc.fr:8104；及び、Coxらの論文、1994)。This library contains immobilized FAP for the isolation of human V L F19 analogs.
The phage display selected above. After 3 rounds of selection, screening of binders by ELISA yielded several FAP binding clones. To confirm the diversity of these isolated chimeric scFvs (mouse V H / human V L ), their phagemid DNA was analyzed by restriction enzymes and sequenced. Is to guide the V H and matter another parent scFv F19 (itemized) consisting of human V L, were identified various chimeric scFv (referred in short V L NICHINAN here) (III5, III10, III25, III43). Table 1 shows
Amino acid sequence homology of selected light chains III5 and III43 compared to the exchanged VLF19. Kabat both germline genes with V L listed belonging to human V L subgroup κI accordance (http://immuno.bme.nwu.edu/), and a close homology, subgroup Vκ1 family (III5 : Ve; III43: Ve). Focusing on the amino acid sequence, clone III5 had as much as 64% identity in the FR position and 59% identity in the CDR position compared to the parental F19. III43 had 69% identity for the FR position and 59% identity for the CDR position compared to F19. In addition, III5 and III43 showed a high degree of mutation compared to their putative germline genes. III5 differs from the closest germline sequence by 14 amino acid positions and III43 shows 17 differences (ImMunoGeneTics database:
http://imgt.cnusc.fr:8104; and Cox et al., 1994).

【０１３９】 結合特性については、キメラscFvは、FAPに高い特異性がある(図7)。ELISAに
おけるcF19との結合競合は、F19可変断片及びヒト定常ドメインを含むキメラ二
価抗体は、選択されたキメラscFv及び親Abの共通のエピトープ特異性を明らかに
した(図8)。選択されたscFvの機能的親和性を評価するために、結合の最大飽和
の半値(SC50)をもたらす濃度を、検出にc-mycタグを使用するサンドイッチELISA
により決定した(表2)。このアッセイを用い、親scFv F19は、機能的親和性20nM
を、scFv III5は45nMを、及びscFv III43は20nMを有した。これは、実行されたVL のガイド付き選択が、エピトープ特異性を維持し及びナノモル範囲の機能的親
和性を伴うキメラscFvを生じることを示唆している。Regarding the binding properties, the chimeric scFv is highly specific for FAP (Figure 7). Binding competition with cF19 in the ELISA revealed that the chimeric bivalent antibody containing the F19 variable fragment and the human constant domain exhibited a common epitope specificity of the selected chimeric scFv and parental Ab (FIG. 8). To assess the functional affinity of selected scFvs, a sandwich ELISA using the c-myc tag to detect the concentration that results in half-maximal saturation of binding (SC 50 ).
(Table 2). Using this assay, the parental scFv F19 has a functional affinity of 20 nM.
, ScFv III5 had 45 nM and scFv III43 had 20 nM. This suggests that the guided selection of V L carried out results in a chimeric scFv with retention of epitope specificity and with functional affinities in the nanomolar range.

【０１４０】2.ヒト化したVHの選択： 先に報告(Watzkaら、1998)されたガイド付き選択によるVHのヒト化時のエピト
ープシフトを避けるために、マウスのmAb F19の親HCDR3を、その後の選択のため
に維持した。この方法のために、HCDR3 F19、ヒトFR4(KabatサブグループI、II
及びIIIにおいて認められる)、及び新たな制限部位を含むファージミドベクター
を構築し、これを、アミノ酸配列を変更することなく、HCDR3に導入した(図9)。
このベクターにおいて、選択されたVL III5及びVL III43を、各々、挿入し、特
異性ガイド付き構造をコードした。次の工程において、FR1からFR3までの重鎖セ
グメントを範囲とし、全ての公知のVH生殖細胞系列ファミリーの再編成された配
列を対象とするようなVHセグメントライブラリー由来のcDNAを、ファージミドに
組込んだ。得られるVHセグメントライブラリー(サイズ：4 x 107個クローン)を
、VL III5又はVL III43のいずれかと一緒にし、及び固定したFAP上でファージデ
ィスプレーを選択した。 2. Selection of humanized VH: To avoid the epitope shift during humanization of VH by the guided selection previously reported (Watzka et al., 1998), the parental HCDR3 of mouse mAb F19 was Retained for subsequent selection. For this method, HCDR3 F19, human FR4 (Kabat subgroup I, II
(Recognized in III and III), and a new restriction site were constructed and introduced into HCDR3 without changing the amino acid sequence (FIG. 9).
In this vector, the V L III5 and V L III43 selected, respectively, inserted, and encodes the specificity of guided structure. In the next step, cDNA from a V H segment library covering the rearranged sequences of all known V H germline families spanning the FR1 to FR3 heavy chain segments was cloned into a phagemid. Built in. Resulting V H segment library: (size 4 x 10 7 cells clones), and with either V L III5 or V L III43, and were selected phage display on a fixed FAP.

【０１４１】 ファージ会合型におけるscFvの選択は、強力な非特異的結合と頻繁に関連し、
その結果複雑なデータ解析となり、様々な選択戦略が適用された(データは示さ
ず)。パニング工程時の高いストリンジェンシーでの洗浄条件のみが、5個の連続
する選択ラウンド後に、2種の高度に抗原特異性のFAP-結合クローンの単離をも
たらした。表3において、VHクローン#18及びVHクローン#34のアミノ酸配列を、
親VH F19及びVH OS4(F19のCDRグラフトした変種)と比較した。FR1から3までの遺
伝子セグメント領域との比較を確認し、選択されたクローン#18は、FR中のscFv
F19のアミノ酸配列と66％の同一性を、並びにCDR1及び2において50％の同一性を
示した。選択されたクローン#34について、FR同一性は67％であり、かつCDR1＋2
について55％であった。Kabatに従い、両方の単離されたVH鎖は、補体としてVL
III43を使用し、かつヒトVHサブグループIに属する。両方のVHについて、最も近
い生殖細胞系列遺伝子セグメントは、VH1セグメントファミリーが属することを
示し、これは全ヒトVH-遺伝子セグメントの約12％を表している(Guigouら、1990
；Brezinschekら、1995)。VH1ファミリー(#18：DP-7、#34：DP-88)と比較し、VH
#18及び#34は、各々、10個及び9個のアミノ酸の差異を示した。Selection of scFvs in the phage-associated form is often associated with strong non-specific binding,
The result was a complex data analysis, and various selection strategies were applied (data not shown). Only high stringency wash conditions during the panning step resulted in the isolation of two highly antigen-specific FAP-binding clones after 5 consecutive selection rounds. In Table 3, the amino acid sequences of VH clone # 18 and VH clone # 34,
Compared to the parent V H F19 and V H OS4 (CDR grafted variants of F19). Confirming the comparison with the gene segment regions from FR1 to FR3, the selected clone # 18 was scFv in FR.
It showed 66% identity with the amino acid sequence of F19 and 50% identity in CDR1 and CDR2. For selected clone # 34, the FR identity is 67% and CDR1 + 2
About 55%. According to Kabat, both isolated V H chains are VL as complement.
III43 is used and belongs to human V H subgroup I. For both V H, the closest germline gene segments, indicates that the VH1 segment family belongs, this is all human V H - represents about 12% of the gene segments (Guigou et al, 1990
Brezinschek et al., 1995). Compared to the VH1 family (# 18: DP-7, # 34: DP-88), VH
# 18 and # 34 showed differences of 10 and 9 amino acids, respectively.

【０１４２】 図10は、ELISAにおけるヒト化されたscFv#18及び#34の厳密なFAP-特異性を示
している。しかし選択されたヒトscFvの可能性のある臨床用途を考慮すると、そ
れらの天然の細胞膜に発現されたFAPへの結合特性は、特に重要である。フロー
サイトメトリーにより、本発明者らは、scFv #18及び#34が、FAPを発現している
ヒト繊維肉腫細胞株HT1080へ親scFv F19と同様の方法で結合していることを明ら
かにすることができた(図11)。飽和試験は、scFv #18及びscFv #34の各々につい
て、6nMの機能的細胞結合親和性(SC50)を生じた。並行アッセイにおいて、親scF
v F19及びそのCDRグラフト誘導体であるscFv OS4についてのSC50は、各々、20nM
及び4.6nMであることがわかり、これは、当初のAbと比較して、選択されたscFv
のより高い親和性を示している(表2)。更に、scFv #18及び#34のcF19との結合競
合は、ELISA(データは示さず)において及びフローサイトメトリーにより測定し
たFAPを過剰発現している細胞について、用量依存型であり、これは選択されたs
cFvsのエピトープ特異性が維持されていることを示している(図12)。FIG. 10 shows the strict FAP-specificity of humanized scFv # 18 and # 34 in ELISA. However, given the potential clinical use of selected human scFvs, their binding properties to native cell membrane expressed FAPs are of particular importance. By flow cytometry, we show that scFv # 18 and # 34 bind to the human fibrosarcoma cell line HT1080 expressing FAP in a manner similar to the parental scFv F19. (Fig. 11). Saturation studies yielded a functional cell binding affinity (SC 50 ) of 6 nM for each of scFv # 18 and scFv # 34. Parental scF in parallel assay
The SC 50 for vF19 and its CDR-grafted derivative scFv OS4 is 20 nM each.
And 4.6 nM, which is the selected scFv compared to the original Ab.
Showing a higher affinity for (Table 2). Furthermore, the binding competition of scFv # 18 and # 34 with cF19 was dose-dependent for cells overexpressing FAP measured in ELISA (data not shown) and by flow cytometry, which was selective. Was done
It is shown that the epitope specificity of cFvs is maintained (Fig. 12).

【０１４３】 可能性のある臨床用途を考慮し、選択されたscFvは、Proteus mirabilisのL-
型株LVIを用い、ミニボディ(Mb)として発現された(Gumpert及びTaubeneck、1983
)。このAb構成体は、その二価特性、高い腫瘍取り込み及び迅速な血中クリアラ
ンスのために、腫瘍の標的化に利点があり、腫瘍における選択的蓄積を生じる(H
uら、1996)。予想されるように、Mb #18及びMb #34は、高い抗原特異性を示し、
かつ抗原結合アッセイ及びcF19との競合において示されたように(データは示さ
ず)、F19エピトープ特異性を保持している。更に、アフィニティークロマトグラ
フィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの後、FAP-過剰発現細胞上のMb #34の
機能的親和性は、2nMである(図13)と決定され、これはCDRグラフトscFv OS4のミ
ニボディ種(Mb OS4)について評価された親和性と全く等しい。更に、Mb #34は、
血清含有培地中で37℃で高い安定性を示すようになり；72時間のインキュベーシ
ョン後、結合活性の喪失はわずかに20％であった(図14)。Given the potential clinical use, the scFv selected was L- from Proteus mirabilis.
Expressed as a minibody (Mb) using type strain LVI (Gumpert and Taubeneck, 1983
). This Ab construct is advantageous for tumor targeting due to its bivalent properties, high tumor uptake and rapid blood clearance, resulting in selective accumulation in tumors (H
u et al., 1996). As expected, Mb # 18 and Mb # 34 show high antigen specificity,
And retains F19 epitope specificity as shown in the antigen binding assay and competition with cF19 (data not shown). Furthermore, after affinity and size exclusion chromatography, the functional affinity of Mb # 34 on FAP-overexpressing cells was determined to be 2 nM (Fig. 13), which is a minibody of CDR-grafted scFv OS4. Exactly equal to the affinity evaluated for the species (Mb OS4). Furthermore, Mb # 34
It became highly stable at 37 ° C. in serum-containing medium; after 72 hours of incubation, there was only a 20% loss of binding activity (FIG. 14).

【０１４４】 様々なヒト腫瘍の凍結-切片上のMb #34による免疫組織学的分析は、乳癌、肺
癌及び結腸癌中の腫瘍ストローマの特異的染色をもたらした。更に、類腱腫の悪
性細胞及び悪性繊維性組織球腫は、Mb #34により特異的に検出することができる
(図15)。こうして、上皮腫瘍及び間葉起源の腫瘍の両方について、このヒトMbは
、F19 及びMb OS4からは識別不可能である免疫組織学的染色パターンを示す。Immunohistochemical analysis with Mb # 34 on cryo-sections of various human tumors resulted in specific staining of tumor stroma in breast, lung and colon cancers. Furthermore, malignant cells of tendonoma and malignant fibrous histiocytoma can be specifically detected by Mb # 34
(Figure 15). Thus, for both epithelial tumors and tumors of mesenchymal origin, this human Mb exhibits an immunohistological staining pattern that is indistinguishable from F19 and MbOS4.

【０１４５】[0145]

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【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 HCDR3-維持するガイド付き選択。Figure 1: HCDR3-guided selection to maintain.

【図２】 組込まれたSplIを伴う HCDR3配列(Pfl23II)の概略図。FIG. 2: Schematic representation of the HCDR3 sequence (Pfl23II) with integrated SplI.

【図３】 scFv #13(ミニボディ構成体)のFAP+細胞への結合(FACS分析)。FIG. 3: Binding of scFv # 13 (minibody construct) to FAP + cells (FACS analysis).

【図４】 ヒトVレパートリーのPCR増幅に使用したプライマー。FIG. 4: Primers used for PCR amplification of human V repertoire.

【図５】 「HCDR3-維持するガイド付き選択」法に関する、ヒトVH-遺伝子
セグメントレパートリー増幅のためのプライマーFIG. 5: Primers for human VH-gene segment repertoire amplification for the “HCDR3-maintaining guided selection” method.

【図６】 選択されたヒトFAP-特異性VL領域の配列FIG. 6 Sequences of selected human FAP-specific VL regions

【図７】 選択されたキメラscFvのAg特異性。ELISAウェルは、FAP又は無関
係のAgで被覆した。TTX：破傷風毒素；BSA：ウシ血清アルブミン；HSA：ヒト血
清アルブミン；TF：トランスフェリン；CHY：キモトリプシノーゲン；LYS：リゾ
チーム；検出は、9E10及びPOD-標識したヤギ抗-マウス血清により行った。デー
タは3つ組の値から誘導した。FIG. 7. Ag specificity of selected chimeric scFv . ELISA wells were coated with FAP or irrelevant Ag. TTX: Tetanus toxin; BSA: Bovine serum albumin; HSA: Human serum albumin; TF: Transferrin; CHY: Chymotrypsinogen; LYS: Lysozyme; Detection was performed with 9E10- and POD-labeled goat anti-mouse serum. Data were derived from triplicate values.

【図８】 選択されたキメラscFvのエピトープ特異性。様々な濃度の競合物
質を、各scFvと混合し、かつFAPで被覆したELISAウェルに添加した。使用した競
合物質は以下のものである：cF19(キメラF19、マウスの可変領域及びヒト定常領
域を含む)；hu IgG (非特異的ヒトIgG血清)。検出は、図1のように行った。デー
タは、2つ組の値から得た。FIG. 8. Epitope specificity of selected chimeric scFv . Various concentrations of competitor were mixed with each scFv and added to FAP-coated ELISA wells. The competitors used were: cF19 (including chimeric F19, mouse variable region and human constant region); hu IgG (non-specific human IgG serum). The detection was performed as shown in FIG. Data were obtained from duplicate values.

【図９】 維持されたHCDR3 F19によるヒトVH-遺伝子セグメントライブラリ ーの構築 。VH、リンカー、VL及びファージタンパク質gpIIIの最終構築体の概略
図。新たな制限部位の作成により、VHセグメントレパートリーは、予め存在する
HCDR3 F19にライゲーションし、その後選択されたヒトVLへ連結することができ
る。9 sustained HCDR3 F19 by construction of a human VH- gene segment library. Schematic of the final construct of V H , linker, V L and phage protein gpIII. Due to the creation of new restriction sites, the V H segment repertoire already exists
It can be ligated to HCDR3 F19 and then ligated to selected human V L.

【図１０】 選択されたヒト化scFvのAg特異性。ELISAウェルの被覆及び検
出は、図1のように行った。PLA：プラスチックFIG. 10. Ag specificity of selected humanized scFv . Coating and detection of ELISA wells was performed as in Figure 1. PLA: Plastic

【図１１】 フローサイトメトリーにより分析されたヒト化scFv及びMbの細 胞表面に結合したFAPへの結合 。A)scFv #18及び#34のFAP+細胞への結合。細胞は
、E. coli抽出物由来のscFv 100〜200nMと共にインキュベーションした。B)Mb #
18及び#34のFAP+細胞への結合。20 nM MBを含有するP. mirabilis LVIの上清。C
) scFv F19(IMACにより精製)のFAP+細胞への対照結合。FAP-対照細胞への結合面
積は灰色で示す。scFvは9E10及びFITC-標識したFc-特異性抗-マウス血清で、Mb
はFITC-標識したFc-特異性抗-ヒト血清により検出した。各曲線は、予め定義及
び測定した5,000事象でのサイトメーター値を示す。[11] coupled to the flow cytometer FAP bound to the humanized scFv and Mb of cell surface analyzed by cytometry. A) Binding of scFv # 18 and # 34 to FAP + cells. Cells were incubated with scFv 100-200 nM from E. coli extract. B) Mb #
Binding of 18 and # 34 to FAP + cells. Supernatant of P. mirabilis LVI containing 20 nM MB. C
) Control binding of scFv F19 (purified by IMAC) to FAP + cells. The binding area to FAP-control cells is shown in grey. scFv is 9E10 and FITC-labeled Fc-specific anti-mouse serum, Mb
Was detected by FITC-labeled Fc-specific anti-human serum. Each curve represents a pre-defined and measured cytometer value at 5,000 events.

【図１２】 細胞結合したFAPに関するヒト化scFvのエピトープ特異性。様
々な濃度の競合物質を、各scFvと混合し、かつFAP+細胞へ添加した。cF19：キメ
ラF19(キメラF19、マウスの可変領域及びヒトの定常領域)；hu IgG：非特異的ヒ
トIgG血清。9E10及びFITC-標識したFc-特異性抗-マウス血清により検出。データ
は、予め定義及び測定した10,000事象でのサイトメーター値を示す。FIG. 12. Epitope specificity of humanized scFv for cell-bound FAP . Various concentrations of competitor were mixed with each scFv and added to FAP + cells. cF19: chimeric F19 (chimeric F19, murine variable region and human constant region); hu IgG: non-specific human IgG serum. Detected by 9E10 and FITC-labeled Fc-specific anti-mouse serum. The data represent cytometer values at 10,000 events that were previously defined and measured.

【図１３】 FAP+細胞上のMb #34の見かけの親和性の評価。Mb #34は、IMAC
及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。データは、FITC-標識したF
c-特異性抗-ヒト血清による検出後の、各Ab濃度についての予め定義及び測定し
た10,000事象でのサイトメーター値に由来する。FIG. 13. Evaluation of apparent affinity of Mb # 34 on FAP + cells . Mb # 34 is IMAC
And purified by size exclusion chromatography. Data are FITC-labeled F
Derived from cytometer values at 10,000 events defined and measured for each Ab concentration after detection with c-specific anti-human serum.

【図１４】 Mb #34の37℃での長期安定性。10倍容量のRPMI(5％FCS)中での
0〜42時間のインキュベーション後、IMAC精製したMbを希釈し、かつ抗-FAP ELIS
Aにおいて使用した。検出は、POD-標識した抗-ヒト血清により行った。データは
、3つ組の値を基にしている。FIG. 14 Long-term stability of Mb # 34 at 37 ° C. In 10 times the capacity of RPMI (5% FCS)
After 0-42 h incubation, dilute IMAC purified Mb and anti-FAP ELIS
Used in A. Detection was performed with POD-labeled anti-human serum. The data are based on triplicate values.

【図１５】 Mb #34によるFAP+腫瘍切片からの生検標本材料の免疫組織学的 染色 。A)乳癌、B)結腸癌、C)肺癌、D)類腱腫、E)悪性繊維性組織球腫の凍結-切
片を、Mb #34で染色した。結合したMbを、引き続き切片の抗-c-myc mAb (9E10)
、ビオチン化したウマ抗-マウス血清及びアビジン-ビオチンイムノペルオキシダ
ーゼ複合体による処理により検出した。陰性対照として、F)凍結-切片を、検出
抗体及びアビジン-ビオチンイムノペルオキシダーゼ複合体でのみ処理した。FIG. 15. Immunohistological staining of biopsy specimen material from FAP + tumor sections with Mb # 34 . Cryo-sections of A) breast cancer, B) colon cancer, C) lung cancer, D) tendonoma, E) malignant fibrous histiocytoma were stained with Mb # 34. Bound Mb was subsequently sectioned with anti-c-myc mAb (9E10)
, Biotinylated horse anti-mouse serum and avidin-biotin immunoperoxidase complex. As a negative control, F) freeze-sections were treated only with detection antibody and avidin-biotin immunoperoxidase complex.

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 7/00 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/574 5/00 Ｂ Ａ６１Ｋ 49/02 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＥ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＺ， ＥＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 フィーツェンマイアー クラウス ドイツ連邦共和国 75223 ティーフェン ブロン セーハウスシュトラーセ ７ (72)発明者 モースマイヤー ディーター ドイツ連邦共和国 10179 ベルリン ハ インリッヒ−ハイネ−シュトラッセ 24 (72)発明者 メルスマン ミヒャエル ドイツ連邦共和国 38118 ブラウンシュ ヴァイヒ アムゼルシュトラーセ ９ (72)発明者 シュミット アレクセイ ドイツ連邦共和国 71229 レオンベルク ヴェンゲルトガッセ 29 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA41 BA44 BA61 CA04 CA07 DA02 DA06 DA11 EA03 EA04 GA01 GA11 HA08 4B064 AG26 AG27 CA02 CA05 CA10 CA19 CA20 CC24 CE07 DA05 DA14 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AA98X AB01 AB02 AB08 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C085 AA26 KA03 KA04 KB18 LL18 4H045 AA11 AA20 AA30 BA09 BA41 BA51 BA63 BA71 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C07K 19/00 C12N 7/00 C12N 1/15 C12P 21/02 C 5/10 G01N 33/574 A 7 / 00 D C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/574 5/00 B A61K 49/02 Z (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB , GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE, TR), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AU, BG, BR, CA, CN, CO, CZ, EE, HR, HU, ID, IL, IN, JP, KR, LT, LV, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, A, US, UZ, VN, YU, ZA (72) Inventor Fiezen Meier Klaus, Federal Republic of Germany 75223 Tiefenbronn Saehausstraße 7 (72) Inventor, Mossmeier Dieter, Federal Republic of Germany 10179 Berlin Heinrich-Heine-Strasse 24 (72) Inventor Melsmann Michael Germany 38118 Braunschweig Amselstraße 9 (72) Inventor Schmid Alexei Germany 71229 Leonberg Wengertgasse 29 F term (reference) 4B024 AA01 AA11 AA12 BA41 BA44 BA61 CA04 CA07 DA02 DA06 DA11 EA03 EA04 GA01 GA11 HA08 4B064 AG26 AG27 CA02 CA05 CA10 CA19 CA20 CC24 CE07 DA05 DA14 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AA98X AB01 AB02 AB08 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C085 AA26 KA03 KA04 KB18 LL18 4H045 AA11 AA20 AA30 BA09 BA41 BA51 BA63 BA71 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74

Claims (100)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 完全にヒトであるか、もしくはモノクローナル抗体F19(ATCC
寄託番号HB 8269)の1個を超えないマウスの相補性決定領域(CDR領域)を含むこと
のいずれかを特徴とする、繊維芽細胞活性化タンパク質α(FAPα)に特異的に結
合する、ヒト又はヒト化された抗体タンパク質。1. A fully human or monoclonal antibody F19 (ATCC
Deposited number HB 8269), characterized in that it contains one or more mouse complementarity determining regions (CDR regions), specifically binds to fibroblast activating protein α (FAPα), human Or a humanized antibody protein. 【請求項２】 クラスIgMの重鎖(VH)を含むことを特徴とする、請求項１記
載の抗体タンパク質。2. The antibody protein according to claim 1, which comprises a heavy chain (V H ) of class IgM. 【請求項３】 クラスIgGの重鎖(VH)を含むことを特徴とする、請求項１又
は２記載の抗体タンパク質。3. The antibody protein according to claim 1, which comprises a heavy chain (V H ) of class IgG. 【請求項４】 クラスIgDの重鎖(VH)を含むことを特徴とする、請求項１〜
３のいずれか１項記載の抗体タンパク質。4. A heavy chain of class IgD (V H ), characterized in that it comprises:
The antibody protein according to any one of 3 above. 【請求項５】 λ型の軽鎖(VL)を含むことを特徴とする、請求項１〜４のい
ずれか１項記載の抗体タンパク質。5. The antibody protein according to any one of claims 1 to 4, which comprises a λ-type light chain ( VL ). 【請求項６】 κ型の軽鎖(VL)を含むことを特徴とする、請求項１〜５のい
ずれか１項記載の抗体タンパク質。6. The antibody protein according to any one of claims 1 to 5, which comprises a kappa type light chain ( VL ). 【請求項７】 Fabフラグメントであることを特徴とする、請求項１〜６の
いずれか１項記載の抗体タンパク質。7. The antibody protein according to any one of claims 1 to 6, which is a Fab fragment. 【請求項８】 F(ab')2フラグメントであることを特徴とする、請求項１〜
７のいずれか１項記載の抗体タンパク質。8. The method according to claim 1, which is a F (ab ′) 2 fragment.
7. The antibody protein according to any one of 7. 【請求項９】 1本鎖-Fvタンパク質(scFv)であることを特徴とする、請求項
１〜８のいずれか１項記載の抗体タンパク質。9. The antibody protein according to claim 1, which is a single chain-Fv protein (scFv). 【請求項１０】 二重特異抗体断片であることを特徴とする、請求項１〜９
のいずれか１項記載の抗体タンパク質。10. A bispecific antibody fragment, which is characterized in that:
The antibody protein according to any one of 1. 【請求項１１】 ミニボディ抗体断片であることを特徴とする、請求項１〜
10のいずれか１項記載の抗体タンパク質。11. A minibody antibody fragment, which is characterized in that
10. The antibody protein according to any one of 10. 【請求項１２】 多量体化された抗体断片であることを特徴とする、請求項
１〜11のいずれか１項記載の抗体タンパク質。12. The antibody protein according to claim 1, which is a multimerized antibody fragment. 【請求項１３】 完全にヒトであることを特徴とする、請求項１〜12のいず
れか１項記載の抗体タンパク質。13. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, characterized in that it is completely human. 【請求項１４】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：1(VH13)を含
むことを特徴とする、請求項１〜13のいずれか１項記載の抗体タンパク質。14. The antibody protein according to any one of claims 1 to 13, wherein the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence number: 1 (VH13). 【請求項１５】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：2(VH46)を含
むことを特徴とする、請求項１〜14のいずれか１項記載の抗体タンパク質。15. The antibody protein according to any one of claims 1 to 14, wherein the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence number: 2 (VH46). 【請求項１６】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：3(VH50)を含
むことを特徴とする、請求項１〜15のいずれか１項記載の抗体タンパク質。16. The antibody protein according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence number: 3 (VH50). 【請求項１７】 軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：4(VLIII25)を
含むことを特徴とする、請求項１〜16のいずれか１項記載の抗体タンパク質。Variable region of 17. The light chain (V L) comprises the amino acid SEQ ID NO: 4, characterized in that it comprises a (VLIII25), set forth in any one antibody protein of claim 1 to 16. 【請求項１８】 重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：5(VH13)
もしくはその断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする、請
求項１〜17のいずれか１項記載の抗体タンパク質。18. The variable region of the heavy chain (V H ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 (VH13).
Alternatively, the antibody protein according to any one of claims 1 to 17, which is encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項１９】 重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：6(VH46)
もしくはその断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする、請
求項１〜18のいずれか１項記載の抗体タンパク質。19. The variable region of the heavy chain (V H ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 6 (VH46).
Alternatively, the antibody protein according to any one of claims 1 to 18, which is encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項２０】 重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：7(VH50)
もしくはその断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする、請
求項１〜19のいずれか１項記載の抗体タンパク質。20. The variable region of the heavy chain (V H ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7 (VH50).
Alternatively, the antibody protein according to any one of claims 1 to 19, which is encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項２１】 軽鎖(VL)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：8(VLIII2
5)もしくはその断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする、
請求項１〜20のいずれか１項記載の抗体タンパク質。21. The variable region of the light chain ( VL ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 8 (VLIII2
5) or characterized by being encoded by a fragment or degenerate variant thereof,
The antibody protein according to any one of claims 1 to 20. 【請求項２２】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：1(VH13)を含
み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：4(VLIII25)を含むことを特
徴とする、抗体タンパク質。22. The variable region of the heavy chain (V H ) contains the amino acid sequence number: 1 (VH13), and the variable region of the light chain (V L ) contains the amino acid sequence number: 4 (VLIII25). An antibody protein characterized by: 【請求項２３】 重鎖(VH)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配列番
号：5(VH13)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配
列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。23. The variable region coding sequence of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 5 (VH13), and the variable region coding sequence of the light chain (V L ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 8. (VLIII25) is contained, The antibody protein characterized by the above-mentioned. 【請求項２４】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：2(VH46)を含
み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：4(VLIII25)を含むことを特
徴とする、抗体タンパク質。24. The variable region of the heavy chain (V H ) contains amino acid sequence number: 2 (VH46), and the variable region of the light chain (V L ) contains amino acid sequence number: 4 (VLIII25). An antibody protein characterized by: 【請求項２５】 重鎖(VH)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配列番
号：6(VH46)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配
列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。25. The coding sequence for the variable region of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 6 (VH46) and the coding sequence for the variable region of the light chain (V L ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 8. (VLIII25) is contained, The antibody protein characterized by the above-mentioned. 【請求項２６】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：3(VH50)を含
み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：4(VLIII25)を含むことを特
徴とする、抗体タンパク質。26. The variable region of the heavy chain (V H ) comprises amino acid sequence number: 3 (VH50) and the variable region of the light chain (V L ) comprises amino acid sequence number: 4 (VLIII25). An antibody protein characterized by: 【請求項２７】 重鎖(VH)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配列番
号：7(VH50)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配
列番号：8(VLIII25)を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。27. The coding sequence for the variable region of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 7 (VH50) and the coding sequence for the variable region of the light chain (V L ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 8. (VLIII25) is contained, The antibody protein characterized by the above-mentioned. 【請求項２８】 ヒト化されていることを特徴とする、請求項１〜12及び14
〜21のいずれか1項記載の抗体タンパク質。28. The method according to claims 1 to 12 and 14, characterized in that it is humanized.
22. The antibody protein according to any one of 21 to 21. 【請求項２９】 モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)のマウスCDR1を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28のいずれか１項記載の抗体タンパ
ク質。29. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28, which comprises mouse CDR1 of the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３０】 モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)のマウスCDR2を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28〜29のいずれか１項記載の抗体タ
ンパク質。30. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28 to 29, which comprises mouse CDR2 of the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３１】 モノクローナル抗体F19の軽鎖(VL)のマウスCDR3を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28〜30のいずれか１項記載の抗体タ
ンパク質。31. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28 to 30, which comprises mouse CDR3 of the light chain (V L ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３２】 モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)のマウスCDR1を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28〜31のいずれか１項記載の抗体タ
ンパク質。32. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28 to 31, which comprises mouse CDR1 of the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３３】 モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)のマウスCDR2を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28〜32のいずれか１項記載の抗体タ
ンパク質。33. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28 to 32, characterized in that it comprises mouse CDR2 of the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３４】 モノクローナル抗体F19の重鎖(VH)のマウスCDR3を含むこ
とを特徴とする、請求項1〜12、14〜21又は28〜33のいずれか１項記載の抗体タ
ンパク質。34. The antibody protein according to any one of claims 1 to 12, 14 to 21 or 28 to 33, characterized in that it comprises mouse CDR3 of the heavy chain (V H ) of monoclonal antibody F19. 【請求項３５】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：9(VH34)を含
むことを特徴とする、請求項１〜34のいずれか１項記載の抗体タンパク質。35. The antibody protein according to any one of claims 1 to 34, wherein the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence number: 9 (VH34). 【請求項３６】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：10(VH18)を含
むことを特徴とする、請求項１〜35のいずれか１項記載の抗体タンパク質。36. The antibody protein according to any one of claims 1-35, characterized in that the variable region of the heavy chain ( VH ) comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 10 (VH18). 【請求項３７】 軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：11(VLIII43)
を含むことを特徴とする、請求項１〜36のいずれか１項記載の抗体タンパク質。37. The variable region of the light chain ( VL ) has the amino acid sequence SEQ ID NO: 11 (VLIII43).
The antibody protein according to any one of claims 1 to 36, which comprises: 【請求項３８】 重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：12(VH34)
もしくはそれらの断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする
、請求項１〜37のいずれか１項記載の抗体タンパク質。38. The variable region of the heavy chain ( VH ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 (VH34).
Alternatively, the antibody protein according to any one of claims 1 to 37, characterized by being encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項３９】 重鎖(VH)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：13(VH18)
もしくはそれらの断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴とする
、請求項１〜38のいずれか１項記載の抗体タンパク質。39. The variable region of the heavy chain (V H ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 13 (VH18).
Alternatively, the antibody protein according to any one of claims 1 to 38, characterized by being encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項４０】 軽鎖(VL)の可変領域が、ヌクレオチド配列番号：14(VLIII
43)もしくはそれらの断片又は縮重変異体によりコードされていることを特徴と
する、請求項１〜39のいずれか１項記載の抗体タンパク質。40. The variable region of the light chain ( VL ) has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 14 (VLIII
43) or an antibody protein according to any one of claims 1 to 39, characterized in that it is encoded by a fragment or a degenerate variant thereof. 【請求項４１】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：9(VH34)を含
み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：11(VLIII43)を含むことを
特徴とする、抗体タンパク質。41. The variable region of the heavy chain (V H ) comprises amino acid sequence number: 9 (VH34), and the variable region of the light chain (V L ) comprises amino acid sequence number: 11 (VLIII43). An antibody protein characterized by: 【請求項４２】 重鎖(VH)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配列番
号：12(VH34)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配
列番号：14(VLIII43)を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。42. The coding sequence for the variable region of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 12 (VH34) and the coding sequence for the variable region of the light chain (V L ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 14 (VLIII43) is contained, The antibody protein characterized by the above-mentioned. 【請求項４３】 重鎖(VH)の可変領域が、アミノ酸配列番号：10(VH18)を含
み、かつ軽鎖(VL)の可変領域が、アミノ酸配列番号：11(VLIII43)を含むことを
特徴とする、抗体タンパク質。43. The variable region of the heavy chain (V H ) comprises amino acid sequence number: 10 (VH18), and the variable region of the light chain (V L ) comprises amino acid sequence number: 11 (VLIII43). An antibody protein characterized by: 【請求項４４】 重鎖(VH)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配列番
号：13(VH18)を含み、かつ軽鎖(VL)の可変領域のコード配列が、ヌクレオチド配
列番号：14(VLIII43)を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。44. The coding sequence for the variable region of the heavy chain (V H ) comprises nucleotide SEQ ID NO: 13 (VH18), and the coding sequence for the variable region of the light chain (V L ) comprises nucleotide sequence SEQ ID NO: 14 (VLIII43) is contained, The antibody protein characterized by the above-mentioned. 【請求項４５】 請求項１〜44のいずれか１項記載の抗体タンパク質をコー
ドしていることを特徴とする、核酸。45. A nucleic acid, which encodes the antibody protein according to any one of claims 1 to 44. 【請求項４６】 請求項45記載の核酸を含むことを特徴とする、組換えDNA
ベクター。46. Recombinant DNA comprising the nucleic acid according to claim 45.
vector. 【請求項４７】 発現ベクターであることを特徴とする、請求項46記載の組
換えDNAベクター。47. The recombinant DNA vector according to claim 46, which is an expression vector. 【請求項４８】 請求項46又は47記載のベクターを含むことを特徴とする、
宿主。48. A vector comprising the vector according to claim 46 or 47,
Host. 【請求項４９】 真核宿主細胞であることを特徴とする、請求項48記載の宿
主。49. The host according to claim 48, which is a eukaryotic host cell. 【請求項５０】 哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項48又は49記載
の宿主。50. The host according to claim 48 or 49, characterized in that it is a mammalian cell. 【請求項５１】 BHK、CHO又はCOS細胞であることを特徴とする、請求項48
〜50のいずれか１項記載の宿主。51. A BHK, CHO or COS cell, which is characterized in that
51. The host according to any one of 50 to 50. 【請求項５２】 バクテリオファージであることを特徴とする、請求項48記
載の宿主。52. The host according to claim 48, characterized in that it is a bacteriophage. 【請求項５３】 原核宿主細胞であることを特徴とする、請求項48記載の宿
主。53. The host according to claim 48, characterized in that it is a prokaryotic host cell. 【請求項５４】 下記の工程を含むことを特徴とする、請求項1〜44のいず
れか１項記載の抗体タンパク質を調製する方法： 請求項48〜51のいずれか１項記載の宿主を、該抗体タンパク質が該宿主細胞によ
り発現されるような条件下で培養する工程、及び該抗体タンパク質を単離する工
程。54. A method for preparing the antibody protein according to any one of claims 1 to 44, characterized in that it comprises the following steps: The host according to any one of claims 48 to 51, Culturing under conditions such that the antibody protein is expressed by the host cell, and isolating the antibody protein. 【請求項５５】 前記宿主が、哺乳類細胞、好ましくはCHO又はCOS細胞であ
ることを特徴とする、請求項54記載の方法。55. The method according to claim 54, characterized in that the host is a mammalian cell, preferably a CHO or COS cell. 【請求項５６】 前記宿主細胞が、軽鎖又は重鎖のための発現ユニットを保
持する2種のプラスミドにより同時トランスフェクションされることを特徴とす
る、請求項54又は55記載の方法。56. The method according to claim 54 or 55, characterized in that the host cell is cotransfected with two plasmids carrying expression units for the light or heavy chains. 【請求項５７】 前記抗体タンパク質が治療用物質と組合わせられているこ
とを特徴とする、請求項1〜44のいずれか１項記載の抗体タンパク質。57. The antibody protein according to any one of claims 1 to 44, characterized in that the antibody protein is combined with a therapeutic substance. 【請求項５８】 前記治療用物質が、放射性同位体、毒素、トキソイド、ホ
ウ素、融合タンパク質、炎症性物質及び化学療法剤から選択されることを特徴と
する、請求項57記載の抗体タンパク質。58. The antibody protein according to claim 57, wherein the therapeutic substance is selected from radioisotopes, toxins, toxoids, boron, fusion proteins, inflammatory substances and chemotherapeutic agents. 【請求項５９】 前記放射性同位体が、β線-放出する放射性同位体である
ことを特徴とする、請求項57又は58記載の抗体タンパク質。59. The antibody protein according to claim 57 or 58, wherein the radioisotope is a β-ray-emitting radioisotope. 【請求項６０】 前記放射性同位体が、186レニウム、188レニウム、131ヨ
ウ素及び90イットリウムから選択されることを特徴とする、請求項59記載の抗体
タンパク質。60. The antibody protein according to claim 59, characterized in that said radioisotope is selected from 186 rhenium, 188 rhenium, 131 iodine and 90 yttrium. 【請求項６１】 標識されていることを特徴とする、請求項1〜44のいずれ
か１項記載の抗体タンパク質。61. The antibody protein according to any one of claims 1 to 44, which is labeled. 【請求項６２】 検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする、
請求項61記載の抗体タンパク質。62. Labeled with a detectable marker,
62. The antibody protein of claim 61. 【請求項６３】 検出可能なマーカーが、酵素、色素、放射性同位体、ジゴ
キシゲニン、ストレプトアビジン及びビオチンから選択されることを特徴とする
、請求項61又は62記載の抗体タンパク質。63. The antibody protein according to claim 61 or 62, characterized in that the detectable marker is selected from enzymes, dyes, radioisotopes, digoxigenin, streptavidin and biotin. 【請求項６４】 造影可能な物質と結合されていることを特徴とする、請求
項１〜44のいずれか１項記載の抗体タンパク質。64. The antibody protein according to any one of claims 1 to 44, which is bound to an imageable substance. 【請求項６５】 造影可能な物質が放射性同位体であることを特徴とする、
請求項64記載の抗体。65. The imageable substance is a radioisotope,
The antibody according to claim 64. 【請求項６６】 前記放射性同位体が、γ線-放出する放射性同位体である
ことを特徴とする、請求項64又は65記載の抗体。66. The antibody according to claim 64 or 65, wherein the radioactive isotope is a γ-ray emitting radioactive isotope. 【請求項６７】 前記放射性同位体が、125ヨウ素であることを特徴とする
、請求項66記載の抗体タンパク質。67. The antibody protein of claim 66, wherein the radioisotope is 125 iodine. 【請求項６８】 請求項1〜44のいずれか１記載の抗体タンパク質及び1種以
上の医薬として許容できる担体物質を含むことを特徴とする、医薬調製物。68. A pharmaceutical preparation, characterized in that it comprises an antibody protein according to any one of claims 1 to 44 and one or more pharmaceutically acceptable carrier substances. 【請求項６９】 請求項57〜60のいずれか１記載の抗体タンパク質及び1種
以上の医薬として許容できる担体物質を含むことを特徴とする、医薬調製物。69. A pharmaceutical preparation, characterized in that it comprises an antibody protein according to any one of claims 57 to 60 and one or more pharmaceutically acceptable carrier substances. 【請求項７０】 請求項64〜67のいずれか１記載の抗体タンパク質及び1種
以上の医薬として許容できる担体物質を含むことを特徴とする、医薬調製物。70. A pharmaceutical preparation, characterized in that it comprises an antibody protein according to any one of claims 64-67 and one or more pharmaceutically acceptable carrier substances. 【請求項７１】 腫瘍の治療又は造影に使用し、ここで該腫瘍が活性化され
たストローマ繊維芽細胞に関連していることを特徴とする、請求項68〜70のいず
れか1項記載の医薬調製物の使用。71. The method according to any one of claims 68 to 70, characterized in that it is used in the treatment or imaging of a tumor, wherein the tumor is associated with activated stromal fibroblasts. Use of pharmaceutical preparations. 【請求項７２】 前記腫瘍が、直腸結腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌
、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵癌及び転移性脳腫瘍から選択される、請求項71記載
の使用。72. The use according to claim 71, wherein the tumor is selected from colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, bladder cancer, pancreatic cancer and metastatic brain tumor. 【請求項７３】 癌の治療のための医薬調製物を調製するための、請求項1
〜44のいずれか１項記載の抗体タンパク質の使用。73. For preparing a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer, 1.
44. Use of an antibody protein according to any one of -44. 【請求項７４】 癌の治療のための医薬調製物を調製するための、請求項57
〜60のいずれか１項記載の抗体タンパク質の使用。74. For preparing a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer, 57.
Use of the antibody protein according to any one of -60. 【請求項７５】 活性化されたストローマ繊維芽細胞の造影のための、請求
項64〜67のいずれか１項記載の抗体タンパク質の使用。75. Use of an antibody protein according to any of claims 64-67 for imaging activated stromal fibroblasts. 【請求項７６】 活性化された繊維芽細胞を含む可能性のあるプローブを、
請求項1〜44又は61〜64のいずれか１項記載の抗体タンパク質と、該抗体タンパ
ク質からその抗原との複合体を形成するのに適した条件下で接触させ、並びに該
複合体の形成及びその結果としての創傷治癒、炎症過程又は腫瘍における活性化
されたストローマ繊維芽細胞の存在を検出することを特徴とする、創傷治癒、炎
症過程又は腫瘍において活性化されたストローマ繊維芽細胞を検出する方法。76. A probe, which may comprise activated fibroblasts,
65. Contacting the antibody protein of any one of claims 1 to 44 or 61 to 64 under conditions suitable to form a complex from the antibody protein with its antigen, and formation of said complex and Detecting activated stroma fibroblasts in wound healing, inflammatory process or tumor, characterized by detecting the presence of activated stromal fibroblasts in wound healing, inflammatory process or tumor Method. 【請求項７７】 前記腫瘍が、直腸結腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌
、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵癌及び転移性脳腫瘍から選択されることを特徴とす
る、請求項76記載の方法。77. The tumor according to claim 76, wherein the tumor is selected from colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, bladder cancer, pancreatic cancer and metastatic brain tumor. The method described. 【請求項７８】 前記抗体タンパク質が、請求項61〜63のいずれか１項記載
のタンパク質であることを特徴とする、請求項76〜77記載の方法。78. The method according to claim 76 to 77, characterized in that the antibody protein is the protein according to any one of claims 61 to 63. 【請求項７９】 適当なプローブを、請求項1〜44のいずれか１項記載の抗
体タンパク質と、抗体-抗原複合体の形成に適した条件下で接触し、こうして形
成された複合体を検出し、並びにこうして形成された複合体の存在を腫瘍ストロ
ーマの存在と相関させることを特徴とする、腫瘍ストローマを検出する方法。79. A suitable probe is contacted with the antibody protein according to any one of claims 1 to 44 under conditions suitable for forming an antibody-antigen complex, and the complex thus formed is detected. And a method of detecting tumor stroma, characterized by correlating the presence of the complex thus formed with the presence of tumor stroma. 【請求項８０】 前記抗体が検出可能なマーカーで標識されていることを特
徴とする、請求項79記載の方法。80. The method of claim 79, wherein the antibody is labeled with a detectable marker. 【請求項８１】 配列番号：15のアミノ酸配列もしくはそれらの一部又はそ
れらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。81. An antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８２】 配列番号：16のアミノ酸配列もしくはそれらの一部又はそ
れらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。82. An antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８３】 配列番号：17のアミノ酸配列もしくはそれらの一部又はそ
れらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。83. An antibody protein, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８４】 配列番号：18のアミノ酸配列もしくはそれらの一部又はそ
れらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。84. An antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８５】 配列番号：19のアミノ酸配列もしくはそれらの一部又はそ
れらの機能性変異体を含むことを特徴とする、抗体タンパク質。85. An antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８６】 配列番号：20のヌクレオチド配列もしくはそれらの一部又
はそれらの機能性変異体によりコードされることを特徴とする、抗体タンパク質
。86. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８７】 配列番号：21のヌクレオチド配列もしくはそれらの一部又
はそれらの機能性変異体によりコードされることを特徴とする、抗体タンパク質
。87. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８８】 配列番号：22のヌクレオチド配列もしくはそれらの一部又
はそれらの機能性変異体によりコードされることを特徴とする、抗体タンパク質
。88. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項８９】 配列番号：23のヌクレオチド配列もしくはそれらの一部又
はそれらの機能性変異体によりコードされることを特徴とする、抗体タンパク質
。89. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項９０】 配列番号：24のヌクレオチド配列もしくはそれらの一部又
はそれらの機能性変異体によりコードされることを特徴とする、抗体タンパク質
。90. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 or a part thereof or a functional variant thereof. 【請求項９１】 配列番号：15のアミノ酸配列に相当することを特徴とする
、抗体タンパク質。91. An antibody protein, which corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. 【請求項９２】 配列番号：16のアミノ酸配列に相当することを特徴とする
、抗体タンパク質。92. An antibody protein, which corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. 【請求項９３】 配列番号：17のアミノ酸配列に相当することを特徴とする
、抗体タンパク質。93. An antibody protein, which corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. 【請求項９４】 配列番号：18のアミノ酸配列に相当することを特徴とする
、抗体タンパク質。94. An antibody protein, which corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 【請求項９５】 配列番号：19のアミノ酸配列に相当することを特徴とする
、抗体タンパク質。95. An antibody protein, which corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 【請求項９６】 配列番号：20のヌクレオチド配列によりコードされること
を特徴とする、抗体タンパク質。96. An antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20. 【請求項９７】 配列番号：21のヌクレオチド配列によりコードされること
を特徴とする、抗体タンパク質。97. An antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21. 【請求項９８】 配列番号：22のヌクレオチド配列によりコードされること
を特徴とする、抗体タンパク質。98. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22. 【請求項９９】 配列番号：23のヌクレオチド配列によりコードされること
を特徴とする、抗体タンパク質。99. An antibody protein, characterized in that it is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23. 【請求項１００】 配列番号：24のヌクレオチド配列によりコードされるこ
とを特徴とする、抗体タンパク質。100. An antibody protein characterized by being encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
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