JP2003530086A

JP2003530086A - 心臓細胞特異的エンハンサー因子とその使用

Info

Publication number: JP2003530086A
Application number: JP2001551430A
Authority: JP
Inventors: ダブリューリーイケ; イズモセイゴ
Original assignee: ベスイスラエルディーコネスメディカルセンター
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2003-10-14
Also published as: KR20030032912A; US20040260079A1; WO2001051006A2; US6818757B2; EP1250349A4; CA2396348A1; EP1250349A2; WO2001051006A3; AU2001234470A1; US20020022259A1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、インビトロとインビボで心臓細胞または心臓細胞前駆体に遺伝子産物を発現させるための試薬および方法に関する。また、Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５調節領域から誘導された心臓細胞特異的エンハンサー因子に関する。【解決手段】（ｉ）心臓細胞で遺伝子発現を調節し、（ｉｉ）幹細胞（例えば、胚幹細胞または骨髄幹細胞）を誘導して心筋細胞として分化させ、そして（ｉｉｉ）幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する因子を確認するに有用なエンハンサー因子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、インビトロとインビボで心臓細胞または心臓細胞前駆体に遺伝子産
物を発現させるための試薬および方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

哺乳動物成体の心筋細胞(cardiomyocyte)は、脱分化(de-differentiate)また
は***しない。細胞培養を始めると直ぐ新生児(neonatal)心筋細胞は***能力を
失うことになる。Ｐ１９悪性奇形腫細胞(P19 teratocarcinoma cell)、胚性幹細
胞(embryonic stem cells：ＥＳ細胞と略する)、ＡＴ−１、Ｈ９ｃ２、ＱＣＥ−
６、１０Ｔ１／２細胞などの細胞株(cell line)は、心筋細胞の分子的特性の一
部を保有している。しかし、これらの細胞は非常に操作し難く、心筋細胞の重要
な特徴も欠けている。こうした理由から、複数のラット(rat)やマウス(mouse)の
培養された新生児心筋細胞はトランスフェクト(transfect)し難く、一般に、ト
ランスフェクション率（transfection rate）0.1%未満で、長い操作過程が必要
であるにも関わらず、インビトロシステムでしばしば使用される。

【０００３】最近、マウスの骨髄ストローマ細胞(ストローマ細胞)から不滅化した(immorta
lized)心筋芽細胞(cardiac myogenic cell、CMG)が分化され得ることが立証され
た。これは、心臓外器官の組織からも心筋細胞が生成され得るという証拠である
。

【０００４】骨髄が循環する(circulating)心筋細胞前駆体(progenitor)のインビボソース
であるという可能性は以前から提示されてきた。ジストロフィマウス(Dystrophi
c mice)の心臓で移植された骨髄由来細胞の分布を観察した。これら細胞の分子
的特徴は同定されなかったが、心臓組織内分布位置はこれらの細胞が心筋細胞で
あることを意味する。これと共に、骨髄ストローマ細胞は、インビボで心筋細胞
の心臓外ソースであり、インビトロでは５−アザシチジンのような誘導物質を用
いて骨髄細胞の異種細胞集合体(heterogeneous population)から拍動する心筋細
胞を誘導できるものと知られた。

【０００５】脊椎動物で心臓細胞(および、一般に心臓)の発生を誘導する分子的機序は重要
な研究主題となってきた(Fishman and Chien, Cell 91:153-156, 1997; Olson a
nd Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。大部分の脊椎動物において心臓
組織は前後に位置した半月模様の中胚葉性構造として初期に発生する。心臓前方
（Precardiac）中胚葉は、胚芽の折畳によって腹部と尾の側で最も上側に位置し
た流入部位(inflow region)とともに単一ミッドライン心臓管を形成する。この
心臓管は、環(looping)を形成し、心臓の流入、心室、流出部分が成体心臓で見
られるような整列をなす。その後、心房／心室の区分が表され、弁膜は流出管だ
けでなく房室接合部(atrioventricular(AV) junction)で発生し、流出管その自
体は二つの大きい血管に分けられる。冠状動脈および心臓誘導システムが発生し
ながら付加的な細密な矯正過程が起こる。

【０００６】心臓発生は数多くの転写因子から来る信号だけでなく隣接した構造から来る誘
導信号や位置調節信号を含む複雑な信号等によって調節される(Fishman and Chi
en, Cell 91:153-156, 1997; Lyons, Curr. Opin. Genet. Dev. 6:454-460, 199
6; Mohun and Sparrow, Curr. Opin. Genet. Dev. 7:628-633, 1997;Olson and
Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。転写因子は多様な遺伝子を活性化さ
せる能力があるため、一般に器官発生時重要な調節因子として認識されている。
心臓中胚葉の特異化および分化の初期段階に重要な影響を及ぼす数多くの心臓転
写因子が同定された(Tanaka et al., Dev. Genet. 22:239-249, 1998). Csx/Nkx
2.5 (Komuro and Izumo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8145-8149, 1993; Li
ns et al., Development 119:419-431, 1993), MEF-2C (Edmondson et al., Dev
elopment 120:1251-1263, 1994), GATA4 (Heikinheimo et al., Dev. Biol. 164
: 361-373, 1994; Kelley et al., Development 118:817-827, 1993)およびｄＨ
ＡＮＤ、ｅＨＡＮＤなどが初期発生段階において心臓内で発現される全ての転写
因子の四つのクラス(class)に属するものである。これらの遺伝子の中からある
一つを特定的に除去する場合、心臓および心臓外形質発現に相当なる影響を与え
、発生Ｅ９．５〜Ｅ１０．５の間に胚芽の死亡が起こる。

【０００７】マウスＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５遺伝子は、Ｅ７．５に心臓前駆細胞で最初に発現
され、この段階では心臓と舌（脾臓、胃、肝、喉頭では小さい範囲）で主として
検出される。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５の心臓外発現は出生の後著しく減少するのに
対して、成体では心臓にのみ発現が限定される。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５遺伝子を
除去したマウスの場合、機能的な心臓を形成できず、Ｅ９．５〜１１．５の間に
胚芽死亡が起こってしまう。

【０００８】大部分の組織特異的遺伝子発現は、転写段階でエンハンサー(enhancer)とリプ
レッサー(repressor)の配列にしたがって調節される。一般に、厳格に発現が調
節されて起こるために、エンハンサーは多様な転写因子の共助を必要とする複雑
な調節機序を採択することになる。これら転写因子の結合部位は、遺伝子のプロ
モーター(promoter)から数キロベース(kb)に位置し、互いに離れて分布する。

【０００９】心臓細胞特異的方法で遺伝子を発現できるならば極めて好ましいと言える。
これは、例えば、損なわれた心臓組織を治療するために治療用タンパク質を暗号
化する遺伝子を特定的に発現させるに応用されることができる。また、幹細胞由
来性心筋細胞の効用性を極大化するために、例えば、ヒトとその他の動物の損な
われた心臓組織を治療するにおいて潜在的な異種細胞集合体から心臓細胞を迅速
に分離し得るならさらに好ましい。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

したがって、本発明は、心臓細胞特異的遺伝子発現をなすための試薬および方
法を提供することにその目的がある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】

第一に、本発明は、（ａ）ＳＥＱＩＤＮｏ．：１またはＳＥＱＩＤＮ
ｏ．：３に示される核酸分子のうち４０個の連続したヌクレオチドと１００％の
同一性；（ｂ）ＳＥＱＩＤＮｏ．：２に示される核酸分子のうち５０個の連
続したヌクレオチドと少なくとも９１％の同一性；（ｃ）ＳＥＱＩＤＮｏ．
：１またはＳＥＱＩＤＮｏ．：３に示される核酸分子のうち６０個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも９７％の同一性；または（ｄ）ＳＥＱＩＤＮｏ
．：１またはＳＥＱＩＤＮｏ．：３に示される核酸分子のうち７０個の連続
したヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性；を有するエンハンサー因子を含
む精製された核酸分子を特徴とする。

【００１２】第二に、本発明は、ヒトから由来した心臓特異的エンハンサー因子を含む精製
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：
１、ＳＥＱＩＤＮｏ．２、またはＳＥＱＩＤＮｏ．：３に示される核酸
分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも６０％の同一性を有する
。好ましくは、この因子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：１、ＳＥＱＩＤＮｏ．
２、またはＳＥＱＩＤＮｏ．：３に示される核酸分子のうち５０個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有する。さらに好ましくは、ＳＥ
ＱＩＤＮｏ．：１、ＳＥＱＩＤＮｏ．２、またはＳＥＱＩＤＮｏ．
：３に示される核酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと比較するとき、
少なくとも８０％の同一性を有し、最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性
を有することを特徴とする。

【００１３】インビボで発現されるとき、エンハンサー因子は４個の心房／心室 (chamber)
全体で作用を表す。第一または第二特徴のエンハンサー因子は天然にまたは非天
然に生成されることができる。

【００１４】好ましくは、第一または第二特徴のエンハンサー因子は、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮ
Ｄ、ＧＡＴＡ、ＴＧＦ−β、ＣａｒＧ、Ｅ−ＢｏｘおよびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５
などの結合部位を含むグループから選択された結合部位を含む。さらに好ましく
は、このエンハンサー因子が当該グループから選択された少なくとも２個の結合
部位を含む。さらに、このエンハンサー因子はＳｐ−１結合部位を含むことが好
ましい。

【００１５】第三に、本発明は、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧＦ−β、ＣａｒＧ
、Ｅ−Ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の結合部位から選択された少なくと
も３個の転写因子結合部位を含む非自然的に生成される精製された核酸分子を特
徴とする。この核酸分子は、少なくとも４個の転写因子結合部位を含むのが好ま
しく、前記グループ中５個の転写因子結合部位を含むのがさらに好ましい。プロ
モーターと機能的に連結される場合、この核酸分子は心臓細胞−特異的な方法で
少なくとも２倍までプロモーターの活性を増進させる。

【００１６】第四に、本発明は、（ａ）ＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子のう
ち５０個の連続したヌクレオチドと１００％の同一性；（ｂ）ＳＥＱＩＤＮ
ｏ．：６に示される核酸分子のうち６０個の連続したヌクレオチドと少なくとも
９７％の同一性；（ｃ）ＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子のうち７
０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９３％の同一性；または（ｄ）ＳＥＱ
ＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子のうち１００個の連続したヌクレオチド
と少なくとも９０％の同一性を有するエンハンサー因子を含む精製された核酸分
子を特徴とする。

【００１７】第五に、本発明は、ヒトから由来した心臓特異的エンハンサー因子を含む精製
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：
６に示される核酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも４５％
の同一性を有する。この因子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子
のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも５０％の同一性を有するのが
好ましい。さらに好ましくは、前記因子がＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される
核酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも６０％の同一性を有
し、最も好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子のうち５０
個の連続したヌクレオチドと少なくとも７５％ないし９０％までの同一性を有す
る。この因子は天然にまたは非天然に生成されることができる。

【００１８】第六に、本発明は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：４またはＳＥＱＩＤ．：５の核
酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％同一な配列を有
する５０個の連続したヌクレオチドを含む精製された核酸分子を特徴とする。

【００１９】第七に、本発明は、第一、第二、第三、第四、および第五特徴を有する核酸分
子を含むＤＮＡベクターを特徴とする。ＤＮＡベクターは、関心のある遺伝子と
機能的に連係されたプロモーターをさらに含むことができる。関心のある遺伝子
には、心臓形成(cardiogenic)関連遺伝子(例えば、BMP2、BMP4、GATA4、dHAND、
eHAND、MEF2C、IRX4、SRF、またはCsx/Nkx2.5などを暗号化する遺伝子)、レポー
ター遺伝子(例えば、GFP、β-gal、alkaline phosphatase、chloramphenicol ac
etyl transferaseまたはluciferaseなどを暗号化する遺伝子)、選別可能なマー
カーを暗号化する遺伝子(例えば、neomycin、kanamycin、またはhygromycinなど
に耐性のある遺伝子)、または治療用タンパク質を暗号化する遺伝子(例えば、成
長因子、サイトカイン、anti-apoptotic factor、pro-apoptotic factorまたは
心臓機能や再生を向上させるタンパク質)などがある。

【００２０】第八に、本発明は、心臓細胞になるように細胞を誘導する方法を特徴とする。
この方法は、（ａ）細胞やそれらの祖先細胞内に、（ｉ）第一、第二、第三、第
四および第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）前記
プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子などを含むＤＮＡベクターを
導入し；（ｂ）プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子を発現する条
件下で細胞を培養することを含む。さらに、心臓形成遺伝子の発現が心臓特異的
エンハンサー因子に結合することによって心臓形成遺伝子の発現をさらに向上さ
せることが好ましい。

【００２１】第九に、本発明は、心臓細胞内で遺伝子を特異的に発現する方法を特徴とする
。この方法は、細胞やそれらの祖先細胞内に、（ｉ）第一、第二、第三、第四お
よび第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）前記プロ
モーターと機能的に連係された遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入する方法を含
む。好ましくは、前記方法は、核酸が心臓細胞内で遺伝子発現を可能にし、心臓
細胞でない少なくとも１個の細胞内では該当遺伝子を発現してはいけない。

【００２２】第十に、本発明は、標的細胞を誘導して心臓細胞を生成するとか、心臓細胞に
なるようにする方法の効率性を決定する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）
少なくとも１個の標的細胞、または、標的細胞の祖先細胞内に、（ｉ）第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモーター、および（
ｉｉｉ）プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡベク
ターを導入し；（ｂ）標的細胞で心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるように
潜在的に誘導する方法を行い；（ｃ）レポーター遺伝子−陽性である細胞数とパ
ーセントを決定することを含む方法を特徴とする。前記（ｃ）項において、細胞
数および含量が高いほど幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細胞になる
ように誘導する方法がさらに効率的であることが暗示されている。ここで、標的
細胞は骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。

【００２３】第十一に、本発明は、標的細胞で心臓細胞を生成するとか、心臓細胞になるよ
うに誘導する方法の有効性を決定する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）少
なくとも１個の標的細胞（または、標的細胞の祖先細胞）内に、（ｉ）第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモーター、および（
ｉｉｉ）前記プロモーターと機能的に連係された選別可能なマーカーを暗号化す
る遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入し；（ｂ）標的細胞で心臓細胞を生成する
とか、心臓細胞になるように潜在的に誘導する方法を行い；（ｃ）薬物選択法を
行い；（ｄ）以降に薬物選択法で細胞の生存を決定することを含む。前記（ｃ）
項において、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子を発現する細胞は、薬物が
存在する状態でも生存することができ、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子
を発現しない細胞は、薬物が存在する状態では生存できなくなる。また、（ｄ）
項では、細胞生存率が高いほど、幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細
胞になるように誘導する方法の有効性がさらに高いということが暗示されている
。この方法で、（ｂ）段階は、（ｃ）段階前または後に行われ得、また、標的細
胞は、骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。

【００２４】第十二に、本発明は、心臓細胞を同定する方法を特徴とする。この方法は、（
ａ）細胞（または、細胞のそれらの祖先細胞）内に、（ｉ）第一、第二、第三、
第四および第五特徴を有する核酸（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）前記
プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクターを導
入し（ここで、前記細胞が心臓細胞なら前記レポーター遺伝子を発現）；（ｂ）
レポーター遺伝子が心臓細胞内で発現され得るように充分な時間をおき；（ｃ）
レポーター遺伝子の存在で心臓細胞を同定することを含む。本方法はインビトロ
で行うのが好ましい。

【００２５】第十三に、本発明は、異種細胞集合体から心臓細胞を本質的に精製する方法を
特徴とするが、この方法は、（ａ）その細胞集合体（または、それら細胞の祖先
細胞）のうち少なくとも１種の芽細胞群（subset）内に、（ｉ）第一、第二、第
三、第四および第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ
）前記プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクタ
ーを導入し（ここで、前記細胞が心臓細胞ならレポーター遺伝子を発現）；（ｂ
）異種細胞集合体内細胞がレポーター遺伝子を発現するか否かを決定し；（ｃ）
この細胞がレポーター遺伝子を発現すると異種細胞集合体からその細胞を精製す
ることを含む。

【００２６】第十四に、本発明は、心臓細胞で治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を発現
する方法を特徴とする。この方法は、細胞（または、これら細胞の祖先細胞）に
、（ｉ）第一、第二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、（ｉｉ）プロモ
ーター、および（ｉｉｉ）前記プロモーターと機能的に連係された治療用タンパ
ク質を暗号化する心臓細胞で発現される遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入する
ことを含む。前記細胞は、心臓細胞であるか、または心臓細胞に分化される細胞
であり得る。この方法は、インビボまたはインビトロで行われる。また、この方
法がインビトロで行われると、前記細胞(または、その細胞の子孫細胞)は患者に
移植され得る。

【００２７】以上に述べた本発明の全ての特徴において、エンハンサー因子は核酸塩基配列
が存在することから、（ｉ）エンハンサーと機能的に連係された遺伝子の発現が
心臓細胞内で少なくとも２５％まで増加され、（ｉｉ）ｌｏｏｐｉｎｇに先だっ
て心臓管内で遺伝子発現が起こるようにし、（ｉｉｉ）４個の心房／心室内で遺
伝子発現が起こるようにし、（ｉｖ）心臓外発現に比べて心臓内発現が１００％
さらに増加可能な核酸塩基配列として定義する。好ましくは、（ｉ）において、
発現が少なくとも５０％まで増加され、さらに好ましくは１００％まで増加され
、最も好ましくは２００％まで増加される。

【００２８】ここで使用される“核酸”はＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。“核酸分子”は
デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本
鎖の重合体である。特別な言及がない限り、一本鎖の核酸分子配列の左手方向は
５’末端(5’end)に、二本鎖核酸分子の左手方向は５’方向(5’direction)にす
る。

【００２９】 “プロモーター”は解読開始コドンの上位(upstream)部分の核酸部位を意味し
、ＲＮＡ重合酵素と転写を開始する様々なタンパク質の認識と結合が起こる部位
である。“ヒトプロモーター”はヒト細胞で転写を開始できるプロモーターであ
って、ヒト細胞から由来されても、そうでなくてもよい。“Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．
５プロモーター”は、Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５遺伝子のプロモーター部位から由来
されたものであって、異種核酸分子と機能的に連係されている場合、心臓細胞内
の該当分子の転写を開始することができる(転写を支援できる転写培地(transcri
ption medium)状態下で)。

【００３０】 “エンハンサー因子”は、プロモーターの隣接部位に位置し、転写を支援でき
る転写培地状態下にある場合、エンハンサードメイン(enhancer domain)がない
ときのプロモーターによる転写活性と比較し、転写活性を増加させる核酸塩基配
列を意味する。

【００３１】 “機能的に連係された”とは、適合な転写培地で核酸分子の転写を誘導するた
めの方式で２個以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、
エンハンサー因子)が連結されていることを意味する。

【００３２】 “由来された”とは、核酸分子が２次核酸分子から作られるか、または形成さ
れた場合を意味し、誘導体に作られるか、形成された元来の核酸分子の重要な機
能的特徴を保持している。

【００３３】 “発現コンストラクト(expression construct)”は、転写を行い得る核酸分子
を意味する。本発明における発現コンストラクトは少なくとも心臓-特異的エン
ハンサー因子とプロモーターを含む。ここで述べたように、転写終結信号のよう
な付加的な因子等がさらに含まれることができる。

【００３４】 “ベクター”または“発現ベクター”は、発現システム、核酸媒介体(vehicle
)、核酸輸送に好適な核酸分子、自律的な自家−複製原型ＤＮＡ（例えば、プラ
スミド）を意味する。ベクターが宿主細胞内にある場合、ベクターは自律的な構
造として細胞***周期の間に安定的に細胞によって複製されるか、宿主細胞ゲノ
ム内に統合されるか、または宿主細胞の核または細胞質内で存在することができ
る。

【００３５】 “心臓細胞”は、分化された心臓細胞(例えば、心筋細胞)または心臓細胞を生
成するか、心臓細胞として分化されるように決定された細胞(例えば、心筋母細
胞または心筋芽細胞)を意味する。

【００３６】 “心臓-特異的エンハンサー因子”は、プロモーターと機能的に連係されて心
臓細胞内で遺伝子発現を誘導するものの、全ての組織や全ての細胞タイプで遺伝
子発現を誘導はしない因子を意味する。本発明における心臓-特異的エンハンサ
ーは、自然的にまたは非自然的に生成され得る。当該分野の専門家は、一般のオ
リゴヌクレオチド合成技術を用いて非自然的に表れるエンハンサーの合成が行え
ることを確認するはずである。

【００３７】 “プラスミド”は、細胞内で複製できる自律的なＤＮＡ分子を意味し、発現の
ために考案されたプラスミドと核酸複製のために考案されたプラスミドのいずれ
もを含む。

【００３８】 “異種の”とは、核酸分子が外部ソースから起源する場合、または同じソース
なら、元の形態から変形されたのを意味する。したがって、“異種プロモーター
”は本発明の複製されたエンハンサードメインと正常的に連係されないプロモー
ターである。これと同様に、元の形態から変形されたか、機能的に連係されたプ
ロモーターが由来されたソースとは異なるソースから由来された異種核酸分子が
誘導された。

【００３９】 “本質的に精製された核酸”は、本発明において核酸が誘導された有機体で自
然的に表れるゲノムのうち核酸側面の遺伝子がない核酸を意味する。したがって
、この用語は、例えば、ベクター内に；自律的に複製するプラスミドまたはウィ
ルス内に;または、原核細胞または真核細胞のゲノム核酸内に統合されるか、ま
たは他の塩基配列とは独立的に分離された分子(例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲ
や制限酵素切断によって生成されたゲノム断片またはｃＤＮＡ断片)に存在する
組換え核酸(recombinant nucleic acid)を含む。また、これは、付加的なポリペ
プチド配列を暗号化する混成遺伝子の一部である組換え核酸を含む。

【００４０】 “形質転換遺伝子(transgene)”は、一時的または永久的に細胞内に挿入され
、ゲノム内に統合されるか染色体外に存在する場合、有機体の一部になる核酸
分子(例えば、ＤＮＡ)の単片を意味する。こうした形質転換遺伝子は、形質転換
有機体と部分的にまたは完全に異種(例えば、異物質)の遺伝子を含むこともあれ
ば、その有機体の内部遺伝子と同種の遺伝子を表すこともある。

【００４１】 “形質転換細胞(transgenic cell)”は、形質転換遺伝子を含む細胞を意味す
る。例えば、本発明で異種核酸分子と機能的に連係された発現ベクターを含むベ
クターに形質転換された幹細胞は形質的な特徴が変わった細胞群を形成すること
に利用され得る。

【００４２】本発明の他の特長は前述した内容に関する下記の詳細な説明を通じてさらに明
確になる。

【００４３】

【発明の実施の形態】

本発明者らは、マウスでの形質転換遺伝子発現を誘導するために使用されると
き、内因性ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の発現様態を再現し、ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．
５とｈＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５から心臓細胞エンハンサー（ｃａｒｄｉａｃｅｎ
ｈａｎｃｅｒ）をクローニングした。ｈＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５エンハンサーコン
ストラクトの一つである７．５ｋｂ−ｈｓｐ−ｌａｃＺは、ｈｓｐ６８プロモー
ター−ｌａｃＺｃａｓｓｅｔｔｅにｈＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５（ＳＥＱＩＤ
Ｎｏ．：４）で７．５ｋｂのゲノム部位が機能的に連係されて作製されたもので
あって、心臓発生が起こる最初の時点であるＥ７．５に活性化され、Ｅ９．５、
Ｅ１０．５、Ｅ１２．５に内因性ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５発現様態を再現する
。したがって、心臓の４個の心房／心室がＥ１２．５に形成されるとき、このエ
ンハンサーは４個の心房／心室のいずれにおいても活性化される。今まで知られ
た哺乳動物心臓エンハンサーのうち、この７．５ｋｂエンハンサーは４個の心房
／心室のいずれにおいても活性化される最初のエンハンサーである。さらに、こ
のエンハンサーはエクトピック(ectopic)発現を示さない。

【００４４】この７．５ｋｂ断片内で、本発明者らは２ヶ所の部位（ここでは、相同的ドメ
インＡ１（ＨＤＡ１；ＳＥＱＩＤＮＯ．：１）と相同的ドメインＡ２（Ｈ
ＤＡ２；ＳＥＱＩＤＮＯ．：２）で表示する）を分離したし、これらはｈｓ
ｐ６８プロモーター−ｌａｃＺｃａｓｓｅｔｔｅと機能的に連係される場合、
心臓−特異的方法で遺伝子発現を増進させ得る。

【００４５】既存のＣＭＧ細胞分離方法は、長い時間を必要とした上、細胞収得率も低かっ
た。一般に、心筋細胞は拍動によって確認される。一次的な骨髄幹細胞から拍動
する心筋細胞の発生比率は極めて低く、ＣＭＧ細胞を不滅化させた後にも骨髄幹
細胞から由来された細胞の約７０％は拍動しない。拍動する心筋細胞を高比率で
得るのが難しい理由は、５−アザシチジンによっては心筋細胞形質が完全に誘導
されないためである。ＣＭＧ細胞を分離することに長い時間が必要なため、心筋
細胞誘導方法を向上させるのが従前では難しい問題であった。拍動は、心筋細胞
によって表される最終的な形質中の一つである。本発明は、心筋細胞を誘導する
さらに初期のマーカーを提供している。これは、例えば、心筋細胞誘導方法を
最適化させるに有用である。実験にかかる時間を短縮させることによって所望の
細胞に誘導する効率をより迅速に向上させ得るのである。また、本発明は、例え
ば、Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５心臓細胞−特異的エンハンサーと機能的に連係された
レポーター遺伝子の発現によって分類することによって心筋細胞を増幅する方法
を提供する。この利用とその他の活用は実施例に基づきさらに詳細に説明する。

【００４６】

【実施例】実施例１．ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５エンハンサー因子の特徴Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５の調節部位を定義する初期過程であって、本発明者らは
３週となったマウスの心臓から全体ＲＮＡを得て５’ＲＡＣＥによってｍＣｓｘ
／Ｎｋｘ２．５転写体の５’末端を決定した。相異なる５’末端を除いて、長さ
がほぼ同一である３個の異なる転写体を確認した（転写体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）。
ゲノムＤＮＡ塩基配列との塩基配列比較は、一致するエクソン−イントロン結合
部位配列にしたがってエクソン−イントロン境界を示した。したがって、本発明
者らは最前方５’ｃＤＮＡ断片をｅｘｏｎ１ａ、最後方３’ｃＤＮＡ断片をｅ
ｘｏｎ１ｂ、中間に挟んでいるゲノム配列をｉｎｔｒｏｎ１と命名した。ま
た、開始コドンを含むエクソンをｅｘｏｎ１ｃ、隣接した部位はｉｎｔｒｏｎ
２、３と定め、その後にある最後のｅｘｏｎであるｅｘｏｎ２はホメオドメ
イン（ＨＤ）とＴＡＧ解読停止コドンを含む。

【００４７】転写体Ｉはゲノム配列内に非連続的な最前方５’末端で２個のｃＤＮＡ断片を
含む。転写体Ｉの最前方５’断片は、長さが４６ｂｐ（ｅｘｏｎ１ａ）であり
、二番目の非連続的断片から６６９ｂｐ上部に位置する。二番目の非連続的断片
は３６ｂｐ長（ｅｘｏｎ１ｂの一部）であり、解読開始コドンから３５０４ｂ
ｐ上部に位置する。転写体ＩＩの場合、ｅｘｏｎ１ｂが最も５’末端配列であ
り、転写体Ｉより５’がさらに延長されており、この場合は９３ｂｐ長であり、
転写体Ｉで発見される３６ｂｐ内部断片を含む。転写体ＩＩＩの場合、５’末端
の最初のエクソンであるｅｘｏｎ１ｃは転写体ＩとＩＩで重なった連続的なゲ
ノム配列の７１ｂｐを含む。

【００４８】新規のエクソンの存在を確認するために、本発明者らはプライマー伸長分析(p
rimer extension analysis)を実施した。成体マウス心臓のｐｏｌｙ（Ａ）Ｒ
ＮＡを用いて、転写体ＩＩとＩＩＩの大きさに相応する同一の２個のバンドを確
認した。転写体ＩＩＩを表すバンドがさらに強かったし、この事実は、これが開
始に重要な部位というのを意味する。プライマー伸長分析を通じて転写体Ｉに相
応するバンドを確認できなかったため、本発明者らは多くの組織で全体ＲＮＡサ
ンプルを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｅｘｏｎ１ａ−とｅｘｏｎ１ｃ−特
異的プライマー対でＲＴ−ＰＣＴをして心臓と脾臓から予想された大きさ（１１
２ｂｐ）の産物が得られた。腎臓のＲＮＡではどんなバンドも増幅されなかった
が、腎臓はＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５を発現しない。サザンブロッティング法(South
ern blotting)でｅｘｏｎ１ｂ−特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用し
てこの１１２ｂｐバンドがｅｘｏｎ１ｂを含むということを確認した。

【００４９】ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５遺伝子のゲノム構造の特性をさらに詳細に描写するた
めに、本発明者らは８．６ｋｂのゲノムＤＮＡをサブクローニングし、塩基配列
化(sequencing)した。Ｅｘｏｎ１ａの３’末端はＡＴＧコドンから４２６５ｂ
ｐ上部に位置し、その次に、ｉｎｔｒｏｎ１（６６８ｂｐ）、ｅｘｏｎ１
ｂ（９３ｂｐ）、ｉｎｔｒｏｎ２（３１７９ｂｐ）、ＡＴＧ解読開始部位を含
むｅｘｏｎ１ｃ（６５５ｂｐ）とｉｎｔｒｏｎ３（１３７７ｂｐ）、そして
ＴＡＧ停止コドンとｐｏｌｙ（Ａ）添加信号があるｅｘｏｎ２（９８３ｂｐ）
がある。３個の推定上の転写開始位置周囲のゲノム塩基配列にはＴＡＴＡｂｏ
ｘがなく、これは、ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５がＴＡＴＡ−ｌｅｓｓ遺伝子という
のを表す。

【００５０】５’ フランキング塩基配列の３．３ｋｂと４ｋｂは咽頭、甲状腺ｐｒｉｍｏｒ
ｄｉｕｍ、胃からだけでなく右心室の流出管（ｏｕｔｆｌｏｗｔｒａｃｔ）と
基底部（ｂａｓａｌｐｏｒｔｉｏｎ）でもＬａｃＺ発現を誘導する。

【００５１】ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の主要転写体（転写体ＩＩＩ）は、ＡＴＧコドンから
３２５ｂｐで始まるため、本発明者らはｅｘｏｎ１ｃに直ぐ隣接した上部のゲ
ノム部位でエンハンサー因子を探してみた。ＮｏｔＩとＡＴＧコドンとの間に
ある5’ フランキング塩基配列の３．３ｋｂをｌａｃＺレポーター遺伝子（Ｃｓ
ｘｌａｃＺ−１；図１）と結合させ、形質転換マウスを作るために、これをマウ
スの胚芽に注射した。実験した４０個の胚芽の中で８個の胚芽が形質転換遺伝子
を持っていて、３個はβ−ｇａｌ染色を示した。この胚芽においてＥ１０．５に
ｌａｃＺ発現を確認し、このとき、本発明者らは、この上部３．３ｋｂ部位が心
臓と心臓外組織でｌａｃＺ発現を誘導することを観察した。右心室の流出管と基
底部の心筋細胞でｌａｃＺの発現が強く表れたし、右心室の小柱（trabecular l
ayer）でも一部陽性反応を表す細胞があった。流出管でｌａｃＺ発現は心筋（my
ocardium）で強く発現されたが、大動脈嚢（aortic sac）や心臓内***（endoca
rdial cushion）ではｌａｃＺ発現が検出されなかった。

【００５２】Ｅ１０．５にｌａｃＺの心臓外発現は、咽頭床（pharyngeal floor）、甲状
腺原基（tyroid primordium）、胃(stomach)の末端部(distal part)のような内
因性ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５が検出される部位でも観察された。胃において、ｌ
ａｃＺ発現は間葉細胞（mesenchymal cells）で観察された。ＬａｃＺのエクト
ピック発現は、鰓弓（pharyngeal floor）と咽頭気管溝（laryngotracheal groo
ve）の表面外胚葉(ectoderm)で観察された。心臓と心臓外組織でｌａｃＺ発現様
態は、１個の胚芽の舌咽神経節（glossopharyngeal ganglion）でのエクトピッ
ク発現を除いては３個のｌａｃＺ−陽性胚芽でいずれも本質的に同一であった。

【００５３】ＣｓｘｌａｃＺ−２コンストラクトは、同一な５’フランキング塩基配列の３
．３ｋｂとｉｎｔｒｏｎ３塩基配列の１．４ｋｂを含む（図１）。３４個の胚
芽のうち６個の胚芽がＣｓｘｌａｃＺ−２形質転換遺伝子を持っていたし、これ
らのうち３個はβ−ｇａｌ陽性染色を表した。心臓内発現は、右心室基底部と流
出管で表れたし、心臓外発現は２個の胚芽で咽頭床（pharyngeal floor）、甲
状腺原基（tyroid primordium）および胃で観察された。１個の胚芽では咽頭床
（pharyngeal floor）でのみｌａｃＺ発現が表れ、他の部位では表れなかった。
かかる発現の欠乏は、形質転換遺伝子挿入部位の陰性効果から起因したものと考
えられる。

【００５４】ＣｓｘｌａｃＺ−１コンストラクトにｉｎｔｒｏｎ１とｅｘｏｎ１ｂの大
部分が含まれたのがＣｓｘｌａｃＺ−３である（図１）。２個の胚芽はＣｓｘｌ
ａｃＺ−３形質転換遺伝子に陽性であったし、１個は陽性β−ｇａｌ染色を表し
た。ＬａｃＺ発現は、流出管、右心室、咽頭、甲状腺原基（tyroid primordium
）、および胃で観察された。したがって、心臓内β−ｇａｌ染色様態はＣｓｘｌ
ａｃＺ−１、ＣｓｘｌａｃＺ−２、ＣｓｘｌａｃＺ−３コンストラクトで略同一
であった。心臓外発現様態もやはりエクトピック発現部位を除いてはほぼ同一だ
った。

【００５５】ＣｓｘｌａｃＺ−４は、５’フランキング塩基配列の６ｋｂを含む。注射した
２２個の胚芽を分析した結果、これらのうち１０個の胚芽がＣｓｘｌａｃＺ−４
形質転換遺伝子をもっていた。おもしろいことに、いずれのＣｓｘｌａｃＺ−４
形質転換胚芽においても心臓と心臓外組織の両方でβ−ｇａｌ染色を示さなかっ
た。この結果は、強力な陰性調節因子がｅｘｏｎ１ｃ５’から６ｋｂと４ｋ
ｂの間に存在することを表すものである(図２)。

【００５６】右心室と左心室のｍｅｄｉａｌｗａｌｌとｉｎｎｅｒｔｒａｂｅｃｕｌａｅ
内でｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の発現のためのｃｉｓ−調節因子が５’フランキン
グ塩基配列の１４ｋｂから６ｋｂの間に存在する。レポーター遺伝子を発現する５’フランキング塩基配列の１４ｋｂ（Ｃｓｘｌ
ａｃＺ−５）を利用するとき、ｌａｃＺはＣｓｘｌａｃＺ−１を利用するときよ
り心臓でさらに広く発現された。β−ｇａｌ染色は外壁（lateral wall）の小層
（compact layer）を除いては右心室と左心室全体で観察された。心房では心臓
間溝（interatrial groove）でｌａｃＺ−陽性心筋細胞塊が観察されたし、これ
は、以降に心房中隔(atrial septum)の上部である。β−ｇａｌ染色はまた、Ｃ
ｓｘｌａｃＺ−１でのように流出管でも観察された。心臓内染色はβ−ｇａｌ陽
性染色を有する４個の全ての形質転換胚芽で類似していた。

【００５７】ＣｓｘｌａｃＺ−５の心臓外発現は４個の全体のＣｓｘｌａｃＺ−５形質転換
胚芽の咽頭床（pharyngeal floor）と甲状腺原基（tyroid primordium）で観察
された。ＣｓｘｌａｃＺ−１、−２、−３コンストラクトを有する形質転換胚芽
の胃では強いβ−ｇａｌ染色を有するに対し、ＣｓｘｌａｃＺ−５胚芽では４個
のうち唯１個でのみ胃で弱いβ−ｇａｌ染色を示した。いずれのＣｓｘｌａｃＺ
−５胚芽でもエクトピック発現が表れなかったし、これは、組織特異的な方法で
ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の発現を制限する抑制因子があるということを暗示する
。

【００５８】右心室で作用するエンハンサーは３’フランキング塩基配列の６ｋｂ内に位置す
る。ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５を暗号化する塩基配列下部(downstream)のｃｉｓ−調
節因子を確認するために、本発明者らはＣｓｘｌａｃＺ−１コンストラクトに３
’フランキング塩基配列の６ｋｂを連結してＣｓｘｌａｃＺ−６を作製した（図
１）。実験した３８個の胚芽の中で１２個の胚芽がＣｓｘｌａｃＺ−６形質転換
遺伝子を有していたし、６個はｌａｃＺ陽性であるのを確認した。３個の形質転
換胚芽は外壁（lateral wall）の小層（compact layer）を含めて右心室全体に
β−ｇａｌ染色された。残り３個の胚芽では心臓内に染色されなかったが、心臓
外で弱い染色があった。６個の胚芽全体において心臓外染色は胃、咽頭、甲状腺
原基（tyroid primordium）で表れた。

【００５９】成体形質変換マウスでレポーター遺伝子の異なる発現様態前述した一時的な形質転換胚芽の評価の外に、形質転換マウスのライン(lines
)を作ったし、発生過程の異なる時間帯別にＦ１形質転換マウスを評価した。

【００６０】３．３ｋｂ５’ フランキング塩基配列を含む形質転換ＣｓｘｌａｃＺ−１
ラインでＥ７．５にβ−ｇａｌ染色は観察されなかった。Ｅ９．５に心臓と心臓
外ｌａｃＺ発現様態は一時的な形質転換胚芽で表れたものと同一だった。また、
Ｅ１５．５にｌａｃＺ発現は脾臓で観察されたが、舌では観察されなかった。Ｅ
１５．５に甲状腺での形質転換遺伝子の発現は依然として強い反面、心臓でｌａ
ｃＺ発現は減少されたが、右心室流出管部分では観察された。面白いことに、同
一の形質転換ＣｓｘｌａｃＺ−１ラインの成体を分析する時、心臓でβ−ｇａｌ
染色は全くなかった。

【００６１】１４ｋｂ５’ フランキング塩基配列を含む形質転換ＣｓｘｌａｃＺ−５ラ
インで、β−ｇａｌ染色はＥ７．５に心臓半月(cardiac crescent)で、Ｅ８．
２５に一般心室と流出管で、Ｅ９．５に右心室、左心室、中隔(septum)、および
流出管で観察された。Ｅ１５．５に心臓内β−ｇａｌ染色は房室結節(AV juncti
on)と心室中隔(interventricular septum)での斑点型(patchy)発現を除いては有
意に減少された。また、E15.5に脾臓は染色されたが、舌は染色されなかった。
成体ＣｓｘｌａｃＺ−５形質転換マウス分析で右心室の管腔表面（luminal surf
ace）に沿って、特に、心室中隔表面に沿って斑点型β−ｇａｌ染色が観察され
た。また、β−ｇａｌ染色は左心室低部の小さい部分と房室結節部で観察された
。

【００６２】ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５発現の自家調節転写因子の組織特異的発現を表す作用機序の一つは、ＭｙｏＤ遺伝子に示され
るように自分のプロモーターを陽性的に自家調節することである。ｍＣｓｘ／Ｎ
ｋｘ２．５プロモーターはＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５蛋白の結合部位である多様
なＮＫＥ因子を含む(Chen and Schwartz, J. Biol. Chem. 270:15628-15633, 19
95)。ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の陽性的自家調節の存在有無を確認するために、
本発明者らは同種組換えによって生成されたｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５のホモ接合
無変異(homozygous null mutant)マウスでのｌａｃＺ発現を検査した。ｌａｃ
Ｚ発現が変異（mutant）胚芽でｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の５’と３’調節部位の
調節下にあるため、mCsx/Nkx2.5による陽性調節が存在する場合、β−ｇａｌ染
色は同形接合無変異胚芽で弱くなるか、欠如されるはずである。案外にもβ−ｇ
ａｌ染色は同時に染色された異種接合変異胚芽でより同形接合変異胚芽で遥かに
強かった。同形接合変異体心臓でβ−ｇａｌ染色の強度が異形接合変異体心臓で
より２倍以上強かったため、かかる資料は直接或いは間接的にｍＣｓｘ／Ｎｋｘ
２．５の負のフィードバック（negative feedback）が存在することを表す。こ
のような結果を確証するためにＥ９．５に異形接合と同形接合変異胚芽の心臓か
ら抽出したＲＮＡを利用した準定量（semi-quantitative）ＲＴ−ＰＣＲを実施
した。α−心臓アクチン（cardiac actin）の比較的過多な転写を用いて調整し
た後、ホモ接合変異（homozygous mutant）心臓でのｌａｃＺ転写量はヘテロ接
合変異（heterozygous mutant）心臓でより約８倍であった。前述した結果は次の材料と方法によって得られたものである。

【００６３】ゲノムクローンの分離と塩基配列化ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５コーディングとフランキング塩基配列を含む２個のλ
ｐｈａｇｅゲノムＤＮＡクローンは、λ ＤＡＳＨ IIの１２９匹マウスゲノム
ライブラリから分離された。クローン１は、ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５コーディン
グ部位の一部および５’ フランキング部位１４ｋｂを含む。クロン２は、５‘
フランキング部位６ｋｂとｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５コーディング部位および３’
フランキング部位６ｋｂを含んだ。また、ｍＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５コーディン
グ配列および５‘と３’ フランキング塩基配列１０ｋｂ以上を含むマウスＰ１
クローン(Genome Systems, St. Louis, MO)が分離された。一般の手法を用いて
制限酵素マッピングと一連のサザンブロッティング法を実施した。

【００６４】ｍＲＮＡ５’末端の定義前述した方法をやや変形して５‘レースを実施した(Reecy et al., Dev. Biol
. 188:295-311, 1997)。第一ｃＤＮＡ鎖の合成反応は３週となったマウスの心臓
から得た層ＲＮＡ５μｇと５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｕＭＤＴＴ、４０ＵＲＮａｓ
ｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、各０．５ｍＭｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ、２００ＵＭ−ＭＬＶ逆転写酵素(Life technologies、Gaithe
rsburg、MD)を含む４０μｌ溶液内に含まれた１００ｎｇランダムプライマー(Pr
omega、Madison、WI)を使用して３７℃で９０分間実施した。ｃＤＮＡは５μｇ
ＲＮａｓｅＡ(Ambion、Austin、TX)と培養した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録
商標）ＰＣＲ精製カラム(QIAGEN、Santa Clara、CA)を使用して精製した。Ligat
ion-anchored ＰＣＲはAli Ansari-Lari et al.(BioTechniques 21:34-36, 1996
)が発表したものを一部変形して実施した。最初に3nmolの3’amino-modified 5
’phosphorylated anchor primer(5’-TCT CTA CTC CGA ATT CCG TCG TCC ACA C
CT-3’; SEQ ID NO:7)は 50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl２、1mM hexamine
cobalt chloride、20uM ATP、 25% PEG 800の含まれた５０μｌ反応液で20U T4
RNA ligase(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いて精製された第一ｃＤＮ
Ａ鎖の半分までend ligateして、１６℃で２４時間培養した。Anchor-ligated
ｃＤＮＡはＱＵＩＡＱＵＩＣＫＰＣＲ精製カラムを使用してさらに精製した。
第一ＰＣＲは精製されたanchor-ligated ｃＤＮＡ１０分の１とanchor特異的
プライマー(5’-AGG TGT GGA CGA CGG AAT TCG GAG TAG AGA-3’; SEQ ID NO:8)
、およびCsx/Nkx2.5特異的プライマー(5’-GGG GGC GGC TGG GAA AGC AGG AGA G
CA CTT-3’; SEQ ID NO:9)を使用して実施した。ＰＣＲ条件は次のようである：
９４℃で１分間変性、６０℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長を３０
周期施したし、３０周期が終わると、７２℃で５分間追加培養した。次のＰＣＲ
反応はＰＣＲ産物各々５μｌとnested anchor primer(5’-CGA CGG AAR TCG GAG
TAG AGA-3’;SEQ ID NO:10)およびCsx/Nkx2.5特異的プライマーs(5’-TTG AAG
GCG GCC AGC ATG CAG GAG GCA-3’(SEQ ID NO:11)または5’-ACA GGA GCG ACG G
GC AGT TCT GCG T-3’ (SEQ ID NO:12)のうち一つを使用して前記と同一なＰＣ
Ｒ条件で実施した。ＰＣＲ産物はethidium bromideが含有された２％寒天ゲル上
で確認されたし、その次にサブクローニングして塩基配列化した。

【００６５】プライマー伸長によるｅｘｏｎｓ１ｂおよび１ｃ検出マウス心臓poly(A) RNA 5μgサンプルを2×10^４ cpm end-labeled、gel-purif
ied oligonucleotide probe(5’-CGG AGC ACC AGG GGC AGA AGA GGC-3’;SEQ ID
NO:13)でcoprecipitateした。サンプルはアニーリング・バッファ(0.1M NaCl、
0.01M、pH 8.0、0.001M EDTA)１０μｌに再懸濁して、８５℃で５分間加熱した
し、３７℃で２時間培養した。２０μｌ逆転写バッファ(10mM DTT、16mM MgCl２
、1mM dNTP、1U/μl RNasin、0.1M Tris、pH 8.0)および２０ＵＳｕｐｅｒｓ
ｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素(Life Technologies)を各々のサンプルに加
えた。逆転写は４０℃で１時間進行されるようにし、各サンプル７．５μｌを同
量のformamide loading バッファと混合した。９５℃で５分間変性の後、各サン
プル７μｌを８％ denaturing polyacrylamideゲル上にロード(load)させた。
電気泳動の後にゲルを乾燥した後、フィルムに露出させた。

【００６６】ＲＴ−ＰＣＲによるｅｘｏｎ１ａの検出製造プロトコルにしたがってｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ(rTth RT-RNA PCR
kit; Perkin Elmer、Branchburg、NJ)を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。Exo
n 1c特異的プライマー(5’-ACA GGA GCG ACG GGC AGT TCT GCG T-3’; SEQ ID N
O:14)を用いて逆転写を実施したし、製造instructionにしたがってaxon 1a特異
的プライマー(5’-GAG TGC TCT GCC TGA TGA TC-3’;SEQ ID NO:15)をRT反応に
加えて順次的なＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は９５℃で１０秒間変性と５
５℃で１５秒間アニーリング／伸長を３５周期施し、３５周期が終わると５５℃
で７分追加最終伸長で構成された。ＰＣＲ産物はethidium bromideで３％寒天ゲ
ル上で表され、^３２P end-labeled exon 1b特異的プライマー(5’-CCA GTC TAG
AAG CGG TGA TCG CCA-3’;SEQ ID NO:16)を用いてSouthern analysisを実施した
。

【００６７】レポーター遺伝子コンストラクトｓの製造、形質変換マウスの生成および分析 pnlacFからのXba I -Pst I lacZ cassette (Bonnerot et al., Proc. Natl Ac
ad. Sci. USA 84: 6795-6799, 1987)を pBluescript SK-(Stratagene)の Xba I
と Pst I 部位にサブクローニングし、遺伝子mCsx/Nkx2.5 ＤＮＡ部位はlacZ ca
ssette 5’または3’にクローニングした。CsxlacZ-1 コンストラクトはNot I s
iteとＡＴＧコドンの間にあるintron 2の大部分とexon 1cの始めを含む遺伝子配
列3.3kbを含んだ(図１)。CsxlacZ-2 コンストラクトを製造するためにexon 1cの
一部、intron 3、およびexon 2の一部を含めているXho I -Pst I 断片をCsxlacZ
-1内lacZ 遺伝子の３’にサブクローニングした (図 1)。CsxlacZ-3 コンストラ
クトは Csx/Nkx2.5の Spe I siteとＡＴＧコドンの間の4kb fragmentを含み、
intron 1の一部と exon 1b、 intron 2およびexon 1cの一部を含む(図 1)。Csx
lacZ-4およびCsxlacZ-5はｌａｃＺ遺伝子の上部とcloneされたCsx/Nkx2.5 genom
ic 塩基配列の５’ 上部の６ｋｂと１４ｋｂを各々含む。CsxlacZ-6を製造する
ために６ｋｂ長さの３’下部ゲノム断片をCsxlacZ-1のlacZ 遺伝子３’に融合し
た（図１）。

【００６８】 CsxlacZ-1,-2,-3,および~6のmicroinjectionのために各コンストラクトのlacZ
cassette部分とともにmCsx/Nkx2.5 ゲノム塩基配列をXho I とNot Iを用いてベ
クターから切り取って、ゲル電気泳動と Geneclean III(Bio101、 Vista、 CA)
で精製した。Microinjectionを準備のために、CsxlacZ-4とCsxlacZ-5をXho I に線形化(linearize)した後、前述した方法で精製した。形質転換マウスの製作
は標準化された方法(Hogan et al. (1994) Manipulating the マウス Embryo. C
old Spring Harbor Laboratory Press、 New York)を用いて行った。

【００６９】一時的な形質転換を分析するために、Ｆ０胚芽をＥ１０．５に解剖した。順
次的なgenotypingは卵黄嚢 (yolk sac)から分離された染色体ＤＮＡをＰＣＲし
て施した。形質転換検出に使用されたＰＣＲプライマー対は次のようである: Cs
xlacZ-1、 -2、 -3には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)
と 5’-TCT GCT CTT CGT TGG CTG ATG-3’ (SEQ ID NO:18) ; および CsxlacZ-4
、 -5には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)と5’-TTA AGT
TGG GTA ACG CCA GGG-3’ (SEQ ID NO:19) ; およびCsxlacZ-6には5’-AAC TTG
CTA GGT AGA CTA GGC TGG C-3’ (SEQ ID NO:20)と5’-TCT GCT CTT CGT TGG C
TG ATG-3’ (SEQ ID NO:18)である。

【００７０】 Whole-mount β−ｇａｌ染色はSchlaeger et al.方法によって実施した。(Dev
elopment 121 : 1089-1098, 1995)。Whole mountsの写真撮影の後に、胚芽をgra
dedエタノールとxyleneを用いて脱水し、パラフィンに陥没(embed)した後、断片
化(sectioned)して、Nuclear Fast Red (ベクター Laboratories、 Burlingame
、 CA)で対照染色した。

【００７１】 CsxlacZ-1とCsxlacZ-5を有するマウス linesの製造(generation) CsxlacZ-1とCsxlacZ-5のために、マウスの形質転換linesを確立した。各々の
形質転換遺伝子を有するＦ０マウスはＦＶＢマウスと逆交配させたし、lacZ 発
現のためにＦ１胚芽を実験した。各々のコンストラクトのために形質転換マウ
スの1世代(1 line)を同定し、E7.5、E8.25、E9.5、E15.5と成体を含む他の時間
帯別にこれらを分析した。

【００７２】 Csx/Nkx2.5 knock-outとlacZ knock-in マウスの製造 (generation) mCsx/Nkx2.5の全体コーディング部分は標準化された方法 (Hogan et al., sup
ra)で相同組換え(homologous recombination)によってlacZ- neomycin抵抗性遺
伝子 (Neo)cassetteで交替された。

【００７３】 In situ hybridization In situ hybridizationは前述した方法の通り実施した(Tanaka et al., Dev.
Genet. 22 : 239-249,1998).要するに、胚芽は4℃で一晩中4% formaldehydeで固
定させ、パラフィンに陥没させた。組織断片を55℃で３５S-labeled Csx/Nkx2.5
cRNA probeとhybridizeし、洗浄した後、RNase Aで処理した。Emulsion autora
diographyした後に、断片をhematoxylinとeosinで対照染色した。

【００７４】実施例２: hCsx/Nkx2.5プロモーターと心臓-特異的因子の分離本発明者らは、radiolabel hCsx/Nkx2.5 ｃＤＮＡ probesを用いてλ FIX II
ゲノムライブラリ(Stratagene)からhCsx/Nkx2.5の一番目のexonとintronの一部
だけでなく、約１７ｋｂ上部のフランキング塩基配列を含む略２０ｋｂ長さのゲ
ノムクローンをクローニングした。Cardiac enhancerを狭めていくために、２０
ｋｂクローンの上部フランキング塩基配列の諸部位をlacZレポーターの結合され
たhsp68プロモーターであるhsp68-lacZ (Kothary et al., Development 105:707
-714 1989)に融合した (図３〜５、図１６)。このようなコンストラクトの発現
様態は心臓特異性を有するエンハンサー部位を定義するために形質転換マウスを
用いてテストした。

【００７５】各々のコンストラクトはサブクローニングされたフランキング塩基配列の5’
末端で直ぐ線形化されたし、フェノール：クロロホルム（１：１）とクロロホル
ムで各々一度ずつ抽出して、アルコールに沈殿させ、脱イオン水で再浮遊させた
後、0.22μｍ孔径のマイクロフィルタユニット(Eppendorf 5 prime、Boulder、C
O)を用いてろ過した。一時的な形質転換分析のために、Ｆ０胚芽は各々Ｅ９．５
またはＥ１０．５に集めて、ホルムアルデヒドで固定させ、ＰＢＳで洗浄した後
、β-ガラクトシダーゼ発現を検査した。Genotypingは卵黄嚢から分離したchrom
osomal ＤＮＡをＰＣＲして確認した。全身胚芽はＸ−ｇａｌを含むバッファで
３０℃で１２〜１４時間培養した後、ｌａｃＺ陽性胚芽の写真を撮った。最終的
にｌａｃＺ染色陽性胚芽はパラフィン陥没、断片化して、ヌクレアファストレッ
ド(Nuclear fast Red)を利用して対照染色した。形質転換マウスの一部は全体胚
芽で（Ｅ７．５日とＥ１２．５日）または心臓(出生後３日)で確認された(図１
７〜図１９)。

【００７６】前述したコンストラクトを利用した形質転換研究結果、胚芽発生の間E7.5に心
臓半月で、Ｅ９．５に第一鰓弓(first branchial arch)と心臓で、Ｅ１２．５日
に流出管を含む心臓の４個の心室/心房でmCsx/Nkx2.5と非常に類似した発現様態
を表す約７．５ｋｂ長さのエンハンサー塩基配列を同定した。また、Ｅ１２．５
に胃部位でｌａｃＺの弱い発現があった。しかし、３日となったマウスでhCsx/N
kx2.5の7.5kb上部フランキング塩基配列のエンハンサー活性は内因性マウス遺伝
子で観察されたものと異なる発現パターンを見せた。7.5kb hCsx/Nkx2.5 エンハ
ンサー-hsp68プロモーター-lacZは右心室で活性があるが、心房や左心室では活
性がない。

【００７７】本発明者らはhCsx/Nkx2.5の7.5kbエンハンサー部位を塩基配列化したし、(図
６〜１２)マウスとヒトCsx/Nkx2.5エンハンサーの間に高い塩基配列相同性部位
を発見した(図３〜５、図１３、図１４)。hCsx/Nkx2.5心臓エンハンサーの相同
性ドメイン(homology domains A1、A2)が各々分離されているとき、いずれの部
分でもエンハンサー活性を示さなかった。しかし、中間に挟んでいる非相同性塩
基配列を除去して再接合(relegate)する場合、心臓エンハンサー活性は回復され
、これは、相同性部位のいずれも心臓エンハンサー活性に必要であるというのを
意味する。このような類似した塩基配列でＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ｄＨＡＮＤ
、ＳＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、Ｓｐ−１、ＴＧＦ−ｂ反応因子およびCsx/Nkx2.5結合部
位のような心臓発生に重要な幾つかの推定転写因子結合部位を発見した。

【００７８】実施例３. 幹細胞から心臓細胞への分化および精製への心臓特異的エンハンサー因子の利用幹細胞(例、胚芽幹（ＥＳ）細胞および骨髄幹細胞）は心臓細胞に分化が誘導
され得る。マウスＥＳ細胞が心臓細胞に分化されるとき、内因性mCsx/Nkx2.5が
発現される。したがって、本発明のエンハンサー因子また心臓細胞に分化される
全種類の幹細胞で活性を表すものである(図２０)。

【００７９】心臓細胞への誘導最適化前述した如く、最近の、幹細胞から心臓細胞への分化を誘導する方法は効率が
低い。かかる側面から、本発明は、心臓細胞誘導の効率を最適化する方法を特徴
とする。例えば、幹細胞グループはプロモーターおよび心臓特異的エンハンサー
と機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクターによって変換され
る(例えば、ＧＦＰ、β-ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼを暗
号化する遺伝子)。その後、心臓細胞分化は一つ以上の誘導方法によって誘導さ
れる。レポーター遺伝子発現は適切な時間に測定される:多数或いは高い比率の
レポーター陽性細胞を得る方法が心臓細胞を誘導する好適な方法として定義され
る。レポーター遺伝子発現は心臓細胞誘導を確認するが、最近使用される拍動表
現形質に先行されるため、現在の方法は以前の方法よりさらに短期間で、そして
低廉なコストで実施されることができる。

【００８０】心臓細胞の選択または分類幹細胞から分化される心臓細胞の数が極少ないため、本発明はまた、心臓細胞
を選択する方法(非心臓細胞の除去)を特徴とする。この方法の一例として、選別
可能なマーカー(例えば、ネオマイシン)を暗号化する遺伝子は心臓細胞エンハン
サー-プロモーターコンストラクトと機能的に連係されている。このようなコン
ストラクトは幹細胞に導入されるか、または幹細胞を分離した動物から形質転換
動物(例えば、形質転換マウスまたは豚)を生産するに使用され得る。心臓細胞分
化誘導の後適切な時間に選択(selection)を実施する。選択過程で、非心臓細胞
は死ぬことになり、結果的に心臓細胞は多くなる。さらに、幹細胞の一部は誘導
前にCsx/Nkx2.5を発現することもできる。これら細胞は心臓細胞を生産する可能
性がさらに高い。したがって、他の一例で前述した選択過程は誘導段階前に実施
する。

【００８１】かかる側面から、本発明は、心臓細胞または心臓細胞生産可能性が高い幹細胞
を分離する方法を特徴とする。この例で、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝
子は生きている細胞の同定を可能にするレポーター遺伝子(例えば、GFP)と代替
されるのを除いて、このコンストラクトは前述におけると同様である。レポータ
ー遺伝子陽性細胞は適切な方法(例えば、蛍光標示式細胞分取)を用いてレポータ
ー遺伝子陰性細胞と区分して同定することができる。前述した法でのように分類
段階は誘導段階の前や後に実施され得る。

【００８２】心臓細胞分化増大幾つかの遺伝子(例えば、BMP2/4、Wnt family of genes、dHAND、eHAND、MEF-
2C、GATA4、SRF、p300、IRX4およびCsx/Nkx2.5)は心臓形成と関連している。か
かる心臓形成遺伝子の一部はCsx/Nkx2.5より先に発現されるに対し、他のものは
Csx/Nkx2.5と同時にまたは後で発現される。これらの一時的な発現に関わらず、
ここで言及する心臓特異的エンハンサーの制御下で前述した遺伝子のうち一つの
発現は、心臓細胞分化を増大させる(つまり、心臓細胞の分化促進、心臓細胞含
量増加、またはその両方とも)。したがって、本発明は、心臓特異的エンハンサ
ー因子の調節下で心臓形成遺伝子の発現による幹細胞群からの心臓細胞分化の増
大方法を特徴とする。この方法も、心臓細胞分化が誘導される段階を含む(例え
ば、5-アザシチジンの誘導による)。

【００８３】実施例４. 遺伝子治療のための心臓特異的エンハンサー因子の利用治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を心臓細胞に導入する遺伝子治療法の利
用は、インビボまたはex vivoで施され得る。したがって、かかる側面から、本
発明は、本発明の心臓特異的エンハンサーと機能的に連係された治療用タンパク
質を暗号化する遺伝子を含むＤＮＡベクターを心臓細胞に導入することによって
インビボで患者の心臓細胞を変形する方法を提供する。核酸分子は溶液またはそ
の他の薬理学的に適合な投与形態に提供される。ＤＮＡベクターは心臓に直接投
与するのがより好ましいが、全身投与してもよい。

【００８４】細胞の核酸吸収を向上させるための様々な運搬方法が知られている。有用な運
搬システムは仙台ウィルスリポソーム(Sendai virus-liposome)運搬システム(Ra
paport and Shai, J. Biol. Chem. 269: 15124-15131,1994)、陽イオンリポソー
ム(cationic liposomes)、polymeric運搬ゲルまたはマトリック(matrices)、多
孔性風船カテーテル(Shi et al., Circulation 90:955-951,1994;およびShi et
al., Gene Therapy 1:408-414,1994)、管腔内圧力(PCT/US96/06271、参考文献参
照)、レトロウイルス発現ベクター(retrovirus expression vector)などを含む
。

【００８５】運搬媒介体としてリポソームを利用するのは、関心を引いている特別な方法の
一つである。リポソームは目標部位の細胞と融和されて内容物を細胞内に運搬す
る。上述の如く、リポソームは同定および結合剤のような多様な方法を用いて融
和のための充分なる時間の間細胞と接触状態を保持する。リポソームは仙台ウィ
ルスまたはインフルエンザウィルスなどのような膜の融和を媒介する精製された
タンパク質やペプチドとともに準備され得る。脂質は、例えば、ホスファチジル
コリンのような陽イオン脂質を含む脂質を形成する公知のリポソームの有用な組
合であり得る。残余脂質は、普通、コレステロール、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロールのような中性脂質である。

【００８６】リポソームはKato et al. (J. Biol. Chem. 266:3361,1991)が記述した方法で
用意できる。この方法は、高分子量の分子、特に、１キロベース対以上の核酸を
ルーメン内に統合させ得るようにする。このような方法でＤＮＡベクターが効率
的に細胞に流入され得る。

【００８７】他の側面から、細胞群(または、器官)は患者や供与動物から除去して、生体外
（ex vivo）でＤＮＡベクターを挿入して変形した後、患者に再移植するか、他
の受容者に移植することができる。例えば、心臓組織に細胞を移植する方法はＰ
ＣＴＷＯ９８／５４３０１に記述されている。一例に、幹細胞を患者から得
、培養して数を増やした後、ここに述べた通り、心臓細胞への分化を誘導するこ
とになる。この方法を行っているいずれの時にも、治療用遺伝子を暗号化する遺
伝子を含めたＤＮＡベクターは細胞内に導入され得る。これらの細胞は患者に移
植されるか、同種または異種の他の受容者に移植され得る。

【００８８】供与種は、受容種と同種であって、異種であって可能であり、適合な細胞(例
えば、心臓細胞に分化できる幹細胞)を提供できる種であればいい。供与者は受
容者の同種や異種になり得る。できるなら受容者は霊長類のような哺乳動物の方
がいい。また、受容者はヒトが最も好ましく。ヒトが受容者の場合、供与者とし
ては豚(異種)やヒト(同種)のいずれでもよく、また、他の哺乳類(例えば、牛ま
たは非ヒト霊長類)もいい。例えば、豚大動脈内皮細胞(PAEC)やその祖先細胞は
、ヒト需要者に移植するために、治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を効果を
示す水準に発現するように操作され得る。

【００８９】異種ＤＮＡは単一細胞段階や初期桑実胚段階で動物や動物の祖先細胞(ancesto
r)に挿入され得る。この過程は２細胞期と８細胞期の間で起こってもいいが、単
一細胞段階の方がさらにいい。これによって形質転換動物が作製され、これらは
異種ＤＮＡを子孫に伝えるものとなる。

【００９０】また、遺伝子伝達は、移植前細胞の生体外（ex vivo）形質導入を使用する同
種移植の時、または豚変換(transgenesis)が形成された異種移植で施行され得る
。形質転換豚を準備する方法は、Loganが発表した論文(Curr. Opin. Immunol. 1
2: 563-568,2000)と本発明で引用した参考文献によく記載されている。全ての形
質転換動物が本発明に利用され得る；豚は、特にヒト受容者に異種移植させ易い
ので特に好適である。形質転換豚は同種組換えと野生形遺伝子機能を破壊する技
術などで生産できる。例えば、形質前変換豚は所望のタンパク質を発現する形質
転換動物を生産する同種組換え技術を用いて生産され得る。

【００９１】遺伝子伝達のために多様なベクターやプラスミドが有用である(Maniatis et a
l. (1989) Molecular cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.
Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publi
shing Associates, New York, V. 1&2 1996; Harlow and Lane Antibodies, A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998、参考文献に利用)。
ここに記述された一般のベクターは一時的または安定的に普通、少なくとも１日
、さらに一般には少なくとも数日以上平滑筋細胞で保持される。

【００９２】レトロウィルスベクター(例えば、レンチウイルス(lentivirus))と、特にレト
ロウィルス複製に要求される一つ以上のgag、pol、env塩基配列が不足な複製欠
損レトロウィルスベクターは文献を通じてよく知られており、内皮細胞や他の哺
乳類細胞を形質転換するために使用され得る。PA317細胞やhelper-freeウィルス
ベクターを生産する他の生産細胞(producer cell)ラインは文献によく記述され
ている。代表的なレトロウィルスコンストラクトは、少なくとも一つのウィルス
末端の長い反復配列(viral long terminal repeat)と治療物質のヌクレオチド塩
基配列の上部プロモーター塩基配列および少なくとも一つのウィルス末端の長い
反復配列と塩基配列の下部のポリアデニル化信号(polyadenylation signal)で構
成される。

【００９３】アデノウィルス、つまりヒトに上気道疾患を誘発し、霊長類で潜状感染時に存
在するウィルスから由来したベクターは当該分野で公知のものであり、本発明で
有用である。低い周囲温度でアデノウィルスの細胞付着能は、組織と器官を冷凍
(cold)保存する間遺伝子伝達を促進する移植条件において有利である。また、形
質導入還流による血管や器官へのアデノウィルス媒介遺伝子伝達もインビボで細
胞を操作する手段である。

【００９４】受容種への移植に先立って、処理された細胞はコンストラクトを含み、発現す
る変形細胞のためにスクリーンされ得る。こういう目的からＤＮＡベクターにも
選別可能なマーカー物質に耐性を表す発現物質を暗号化する２次ヌクレオチド塩
基配列が提供される。スクリーニングのための好適な選別マーカーはネオマイシ
ンやネオマイシンアナログであるＧ４１８耐性を表すネオ遺伝子（neo-gene）を
含む。全ての哺乳類細胞は遺伝子挿入のための標的になり得るが、操作(manipul
ation)のために選好される細胞は幹細胞である。

【００９５】ここで言及された全ての資料(publications)は参考文献として含まれている。

【図面の簡単な説明】

【図１】形質転換実験で使用されたマウスのCsx/Nkx2.5(mCsx/Nkx2.5)遺伝子座(locus)
コンストラクト(construct)の構造を表す図である。Open boxとshaded boxは各
々解読されなかった塩基配列およびコーディング塩基配列を表す。２種のλ pha
ge clonesの多様なsubfragmentsは形質転換遺伝子の製造に使用された(CsxlacZ-
1〜CsxlacZ-6)。

【図２】実験したmCsx/Nkx2.5コンストラクトを有する心臓でのＬａｃＺ発現様態を表
す図。

【図３】ヒトCsx/Nkx2.5(hCsx/Nkx2.5)とmCsx/Nkx2.5の配列図であって、exon 1のＡＴ
Ｇから５’側に約９ｋｂ程度の塩基配列である。Shaded areaは相同的(homology
)ドメインＡ１（上）とＡ２の位置を表す。また、転写因子結合部位の位置も表
されている。

【図４】 exon 1のＡＴＧから５’側に約３ｋb程度のmCsx/Nkx2.5とhCsx/Nkx2.5塩基配
列の配列図である。この配列内には相同的ドメインＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：
６）がある。

【図５】 mCsx/Nkx2.5とhCsx/Nkx2.5のゲノム構造を表す図である。相同的ドメインＡ−
Ｄが表されている。相同的ドメインＡ内にヒト塩基配列はmCsx/Nkx2.5と同一性
のない塩基配列によって中間が切れてある。

【図６】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜７．５ｋｂ、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列（続きあり）を表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図７】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜７．５ｋｂ、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図８】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜７．５ｋｂ、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図９】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜７．５ｋｂ、SEQ ID No.:4のヌクレ
オチド塩基配列の続きを表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図１０】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜６．８ｋｂ、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列（続きあり）を表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図１１】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜６．８ｋｂ、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図１２】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜６．８ｋｂ、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図１６に表されている。

【図１３】 mCsx/Nkx2.5相同的ドメインＡ１(SEQ ID No.:1)とＡ２(SEQ ID NO.:2)のヌク
レオチド塩基配列を表す。

【図１４】 hCsx/Nkx2.5相同的ドメインＡ１とＡ２のヌクレオチド塩基配列およびmCsx/Nk
x2.5と対応される部分のない部位の塩基配列を表す。

【図１５】 hCsx/Nkx2.5相同的ドメインＢ(SEQ ID No.:6)のヌクレオチド塩基配列を表す
。

【図１６】心臓特異的発現のために実験されたhCsx/Nkx2.5エンハンサー因子の形質転換
コンストラクトを表す図である。また、SEQ ID No.:4とSEQ ID No.:5の位置も表
されている。

【図１７】 hCsx/Nkx2.5エンハンサー因子の形質転換遺伝子分析を要約した表である。こ
れと相応するコンストラクトは図１６に表されている。

【図１８】表示されたエンハンサー-hsp68-lacZコンストラクトによってマウスで形質転
換遺伝子が発現するのを表す一連の写真である。

【図１９】 7.5kbエンハンサー-hsp68-lacZコンストラクトによってマウスで形質転換遺伝
子が発現するのを表す一連の写真である。

【図２０】心臓細胞の生産および精製を促進するために心臓特異的エンハンサー因子の多
様な利用を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BA14 BB03 BB20 BB22 BB24 CB01 CB26 DA12 DA13 DA14 FB05 4B024 AA01 AA11 BA21 CA03 EA04 FA02 FA06 FA10 HA17 4B063 QA20 QQ08 QQ13 QQ44 QR33 QR77 QR80 QS38 4B065 AA90X AA91X AB01 BA02 BA25 CA24 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のエンハンサー因子を含む本質的に精製された核酸分子
: （ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：１またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される
核酸分子のうち４０個の連続したヌクレオチドと１００％の同一性を有するもの
；（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：２に示される核酸分子のうち５０個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも９１％の同一性を有するもの；（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：１またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される
核酸分子のうち６０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９７％の同一性を有
するもの；または（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：１またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される
核酸分子のうち７０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有
するもの。
【請求項２】前記因子が天然に生成される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】前記因子が非天然に生成される、請求項１に記載の核酸分子
。
【請求項４】前記核酸分子が、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧＦ
−β、ＣａｒＧ、Ｅ−ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５結合部位からなる群
から選択された結合部位を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】前記核酸分子が、前記群から選択された少なくとも２個の結
合部位を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】前記核酸分子がＳｐ−１結合部位をさらに含んでなる、請求
項４に記載の核酸分子。
【請求項７】前記核酸分子が、プロモーターと機能的に連係されるとき心
臓細胞特異的方法でプロモーターの活性を少なくとも２倍以上増加させる、請求
項１に記載の核酸分子。
【請求項８】ヒト由来の本質的に精製された核酸分子において、該核酸分
子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：１、ＳＥＱＩＤＮＯ．：２、またはＳＥＱ
ＩＤＮＯ．：３に示される核酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少
なくとも６０％の同一性を有する心臓特異的エンハンサー因子を含む核酸分子。
【請求項９】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ．：２、またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される核酸分子のうち５０個の
連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有する、請求項８に記載の
核酸分子。
【請求項１０】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ．：２、またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される核酸分子のうち５０個
の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項８に記載
の核酸分子。
【請求項１１】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ．：２、またはＳＥＱＩＤＮＯ．：３に示される核酸分子のうち５０個
の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する、請求項８に記載
の核酸分子。
【請求項１２】前記因子が天然に生成される、請求項８に記載の核酸分子
。
【請求項１３】前記因子が非天然に生成される、請求項８に記載の核酸分
子。
【請求項１４】前記核酸分子が、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧ
Ｆ−β、ＣａｒＧ、Ｅ−ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５結合部位からなる
群から選択された結合部位を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１５】前記核酸分子が前記群から選択された少なくとも２個の結
合部位を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】前記核酸分子がＳｐ−１結合部位をさらに含むことを特徴
とする請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１７】Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧＦ−β、ＣａｒＧ
、Ｅ−ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５結合部位から選択された少なくとも
３個の転写因子結合部位を含む、本質的に精製された非天然に生成された核酸分
子。
【請求項１８】前記核酸分子が、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧ
Ｆ−β、ＣａｒＧ、Ｅ−ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５結合部位から選択
された少なくとも４個の転写因子結合部位を含む、請求項１７に記載の核酸分子
。
【請求項１９】前記核酸分子が、Ｍｅｆ２、ｄＨＡＮＤ、ＧＡＴＡ、ＴＧ
Ｆ−β、ＣａｒＧ、Ｅ−ｂｏｘ、およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５結合部位から選択
された少なくとも５個の転写因子結合部位を含む、請求項１７に記載の核酸分子
。
【請求項２０】前記核酸分子が、プロモーターと機能的に連係されるとき
心臓細胞特異的方法でプロモーターの活性を少なくとも２倍以上増加させる、請
求項１７に記載の核酸分子。
【請求項２１】下記のエンハンサー因子を含む本質的に精製された核酸分
子: （ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分子のうち５０個の連続した
ヌクレオチドと１００％の同一性を有するもの；（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分子のうち６０個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも９７％の同一性を有するもの；（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分子のうち７０個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも９３％の同一性を有するもの；または（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分子のうち１００個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有するもの。
【請求項２２】ヒト由来の本質的に精製された核酸分子において、該核酸
分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．：６に示される核酸分子のうち５０個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも４５％の同一性を有する心臓特異的エンハンサー因子
を含む核酸分子。
【請求項２３】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分
子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも５０％の同一性を有する、
請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分
子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも６０％の同一性を有する、
請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分
子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を有する、
請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２６】前記因子が、ＳＥＱＩＤＮＯ．：６に示される核酸分
子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２７】前記因子が天然に生成される請求項２２に記載の核酸分子
。
【請求項２８】前記因子が非天然に生成される請求項２２に記載の核酸分
子。
【請求項２９】ＳＥＱＩＤＮＯ．：４またはＳＥＱＩＤＮＯ．：
５核酸分子のうち５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％同一な塩基
配列を有する５０個の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、本質的に
精製された核酸分子。
【請求項３０】請求項１、８、２１、２２、または２９の核酸分子を含む
ＤＮＡベクター。
【請求項３１】関心のある遺伝子と機能的に連係されたプロモーターをさ
らに含む請求項３０に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３２】前記関心のある遺伝子が、心臓形成遺伝子、レポーター遺
伝子、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子、または治療用タンパク質を暗号
化する遺伝子である、請求項３１に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３３】前記心臓形成遺伝子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＡＴＡ４
、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＳＲＦまたはＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５で
ある、請求項３２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３４】前記レポーター遺伝子が、ＧＦＰ、ｌａｃＺ、アルカリ・
ホスホターゼ、クロランフェニコル・アセチル・トランスフェラーゼ、またはル
シフェラーゼである、請求項３２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３５】前記選別可能なマーカーが、ネオマイシン、カナマイシン
、またはハイグロマイシンである、請求項３２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３６】前記治療用タンパク質が、成長因子、サイトカイン、アン
チ・アポトーシス因子、プロ・アポトーシス因子、または心臓の機能や再生を向
上させるタンパクである、請求項３２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３７】下記を含む、細胞を心筋細胞に誘導する方法: (a) 該細胞やその祖先細胞(ancestor)内に、(ｉ)請求項１、８、２１、２２、ま
たは２９の核酸分子、(ｉｉ)プロモーター、および(ｉｉｉ)該プロモーターと機
能的に連係された心臓形成遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入する；そして、 (b) 該プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子の発現を誘導する条件
下で、該心臓形成遺伝子の発現を心臓特異的エンハンサー因子と結合させて心臓
形成遺伝子発現を増大させることによって該細胞を培養する。
【請求項３８】心臓細胞で特異的に遺伝子を発現させる方法において、該
方法が、該細胞やその祖先細胞に、(ｉ)請求項１、８、２１、２２、または２９
の核酸分子、(ｉｉ)プロモーター、および(ｉｉｉ)該プロモーターと機能的に連
係された遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入することを含み、これにより、心臓
細胞では該遺伝子が発現され、心臓細胞でない細胞では該遺伝子が発現されない
ようにする方法。
【請求項３９】下記を含む、幹細胞から心臓細胞を生成するか、または心
臓細胞になるように誘導する方法の効率性を測定する方法: （ａ）該幹細胞の一つまたはその祖先細胞内に、（ｉ）請求項１、８、２１、２
２、または２９の核酸分子、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）該プロモ
ーターと機能的に連係された遺伝子であるレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクタ
ーを導入し；（ｂ）該幹細胞の少なくとも一部が心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるよう
に潜在的に誘導する方法を行う；そして（ｃ）レポーター遺伝子−陽性である細胞の数や含量を測定するが、ここで、数
や含量が高いほど、幹細胞が心臓細胞を生成するか、または心臓細胞になるよう
に誘導する方法の効率性がさらに高くなる。
【請求項４０】下記を含む、幹細胞から心臓細胞を生成するか、または心
臓細胞になるように誘導する方法の効率性を測定する方法: （ａ）該幹細胞の一つまたはその祖先細胞内に、（ｉ）請求項１、８、２１、２
２、または２９の核酸分子、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）該プロモ
ーターと機能的に連係された選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子を含むＤＮ
Ａベクターを導入し；（ｂ）該幹細胞の少なくとも一部が心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるよう
に潜在的に誘導する方法を行い；（ｃ）薬物の選択を実施するが、ここで、該選別可能なマーカーを暗号化する遺
伝子を発現する細胞は該薬物の存在下にて生存する可能性があり、該選別可能な
マーカーを暗号化する遺伝子を発現しない細胞は該薬物の存在下にて生存する可
能性はない；そして、（ｄ）薬物選択の後、細胞の生存を測定すが、ここで、生存率が高いほど、幹細
胞から心臓細胞が生成されるか、または心臓細胞になるように誘導する方法の効
率性がさらに高くなる。
【請求項４１】細胞を心臓細胞として同定する方法において、該方法は、
該細胞やその祖先細胞内に、(ｉ)請求項１、８、２１、２２、または２９の核酸
分子、(ｉｉ)プロモーター、および(ｉｉｉ)該プロモーターと機能的に連係され
たレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入することを含むが、ここで、該
細胞が心臓細胞ならこの細胞は該レポーター遺伝子を発現させ、該細胞が心臓細
胞でなければ、該細胞は該レポーター遺伝子を発現させない方法。
【請求項４２】前記細胞がイン・ビトロである、請求項４１に記載の方法
。
【請求項４３】下記を含む、異種細胞集合体から心臓細胞を本質的に精製
する方法: （ａ）該細胞集合体やその祖先細胞の最小細胞芽集団に、（ｉ）請求項１、８、
２１、２２または２９の核酸分子、(ｉｉ)プロモーター、および(ｉｉｉ)該プロ
モーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡベクターを導入し
、これにより、該細胞が心臓細胞ならば該細胞は該レポーター遺伝子を発現させ
、該細胞が心臓細胞でなければ該細胞は該レポーター遺伝子を発現させることは
ない；そして、（ｂ）異種細胞集合体で細胞が該レポーター遺伝子を発現するか否かを決定する
が、ここで、該細胞が該レポーター遺伝子を発現するならば、該細胞は該異種細
胞集合体から精製される。