JP2003530086A - 心臓細胞特異的エンハンサー因子とその使用 - Google Patents
心臓細胞特異的エンハンサー因子とその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、インビトロとインビボで心臓細胞または心臓細胞前駆体に遺伝子産物を発現させるための試薬および方法に関する。また、Csx/Nkx2.5調節領域から誘導された心臓細胞特異的エンハンサー因子に関する。
【解決手段】(i)心臓細胞で遺伝子発現を調節し、(ii)幹細胞(例えば、胚幹細胞または骨髄幹細胞)を誘導して心筋細胞として分化させ、そして(iii)幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する因子を確認するに有用なエンハンサー因子を提供する。
Description
【0001】
本発明は、インビトロとインビボで心臓細胞または心臓細胞前駆体に遺伝子産
物を発現させるための試薬および方法に関する。
物を発現させるための試薬および方法に関する。
【0002】
哺乳動物成体の心筋細胞(cardiomyocyte)は、脱分化(de-differentiate)また
は***しない。細胞培養を始めると直ぐ新生児(neonatal)心筋細胞は***能力を
失うことになる。P19悪性奇形腫細胞(P19 teratocarcinoma cell)、胚性幹細
胞(embryonic stem cells:ES細胞と略する)、AT−1、H9c2、QCE−
6、10T1/2細胞などの細胞株(cell line)は、心筋細胞の分子的特性の一
部を保有している。しかし、これらの細胞は非常に操作し難く、心筋細胞の重要
な特徴も欠けている。こうした理由から、複数のラット(rat)やマウス(mouse)の
培養された新生児心筋細胞はトランスフェクト(transfect)し難く、一般に、ト
ランスフェクション率(transfection rate)0.1%未満で、長い操作過程が必要
であるにも関わらず、インビトロシステムでしばしば使用される。
は***しない。細胞培養を始めると直ぐ新生児(neonatal)心筋細胞は***能力を
失うことになる。P19悪性奇形腫細胞(P19 teratocarcinoma cell)、胚性幹細
胞(embryonic stem cells:ES細胞と略する)、AT−1、H9c2、QCE−
6、10T1/2細胞などの細胞株(cell line)は、心筋細胞の分子的特性の一
部を保有している。しかし、これらの細胞は非常に操作し難く、心筋細胞の重要
な特徴も欠けている。こうした理由から、複数のラット(rat)やマウス(mouse)の
培養された新生児心筋細胞はトランスフェクト(transfect)し難く、一般に、ト
ランスフェクション率(transfection rate)0.1%未満で、長い操作過程が必要
であるにも関わらず、インビトロシステムでしばしば使用される。
【0003】
最近、マウスの骨髄ストローマ細胞(ストローマ細胞)から不滅化した(immorta
lized)心筋芽細胞(cardiac myogenic cell、CMG)が分化され得ることが立証され
た。これは、心臓外器官の組織からも心筋細胞が生成され得るという証拠である
。
lized)心筋芽細胞(cardiac myogenic cell、CMG)が分化され得ることが立証され
た。これは、心臓外器官の組織からも心筋細胞が生成され得るという証拠である
。
【0004】
骨髄が循環する(circulating)心筋細胞前駆体(progenitor)のインビボソース
であるという可能性は以前から提示されてきた。ジストロフィマウス(Dystrophi
c mice)の心臓で移植された骨髄由来細胞の分布を観察した。これら細胞の分子
的特徴は同定されなかったが、心臓組織内分布位置はこれらの細胞が心筋細胞で
あることを意味する。これと共に、骨髄ストローマ細胞は、インビボで心筋細胞
の心臓外ソースであり、インビトロでは5−アザシチジンのような誘導物質を用
いて骨髄細胞の異種細胞集合体(heterogeneous population)から拍動する心筋細
胞を誘導できるものと知られた。
であるという可能性は以前から提示されてきた。ジストロフィマウス(Dystrophi
c mice)の心臓で移植された骨髄由来細胞の分布を観察した。これら細胞の分子
的特徴は同定されなかったが、心臓組織内分布位置はこれらの細胞が心筋細胞で
あることを意味する。これと共に、骨髄ストローマ細胞は、インビボで心筋細胞
の心臓外ソースであり、インビトロでは5−アザシチジンのような誘導物質を用
いて骨髄細胞の異種細胞集合体(heterogeneous population)から拍動する心筋細
胞を誘導できるものと知られた。
【0005】
脊椎動物で心臓細胞(および、一般に心臓)の発生を誘導する分子的機序は重要
な研究主題となってきた(Fishman and Chien, Cell 91:153-156, 1997; Olson a
nd Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。大部分の脊椎動物において心臓
組織は前後に位置した半月模様の中胚葉性構造として初期に発生する。心臓前方
(Precardiac)中胚葉は、胚芽の折畳によって腹部と尾の側で最も上側に位置し
た流入部位(inflow region)とともに単一ミッドライン心臓管を形成する。この
心臓管は、環(looping)を形成し、心臓の流入、心室、流出部分が成体心臓で見
られるような整列をなす。その後、心房/心室の区分が表され、弁膜は流出管だ
けでなく房室接合部(atrioventricular(AV) junction)で発生し、流出管その自
体は二つの大きい血管に分けられる。冠状動脈および心臓誘導システムが発生し
ながら付加的な細密な矯正過程が起こる。
な研究主題となってきた(Fishman and Chien, Cell 91:153-156, 1997; Olson a
nd Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。大部分の脊椎動物において心臓
組織は前後に位置した半月模様の中胚葉性構造として初期に発生する。心臓前方
(Precardiac)中胚葉は、胚芽の折畳によって腹部と尾の側で最も上側に位置し
た流入部位(inflow region)とともに単一ミッドライン心臓管を形成する。この
心臓管は、環(looping)を形成し、心臓の流入、心室、流出部分が成体心臓で見
られるような整列をなす。その後、心房/心室の区分が表され、弁膜は流出管だ
けでなく房室接合部(atrioventricular(AV) junction)で発生し、流出管その自
体は二つの大きい血管に分けられる。冠状動脈および心臓誘導システムが発生し
ながら付加的な細密な矯正過程が起こる。
【0006】
心臓発生は数多くの転写因子から来る信号だけでなく隣接した構造から来る誘
導信号や位置調節信号を含む複雑な信号等によって調節される(Fishman and Chi
en, Cell 91:153-156, 1997; Lyons, Curr. Opin. Genet. Dev. 6:454-460, 199
6; Mohun and Sparrow, Curr. Opin. Genet. Dev. 7:628-633, 1997;Olson and
Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。転写因子は多様な遺伝子を活性化さ
せる能力があるため、一般に器官発生時重要な調節因子として認識されている。
心臓中胚葉の特異化および分化の初期段階に重要な影響を及ぼす数多くの心臓転
写因子が同定された(Tanaka et al., Dev. Genet. 22:239-249, 1998). Csx/Nkx
2.5 (Komuro and Izumo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8145-8149, 1993; Li
ns et al., Development 119:419-431, 1993), MEF-2C (Edmondson et al., Dev
elopment 120:1251-1263, 1994), GATA4 (Heikinheimo et al., Dev. Biol. 164
: 361-373, 1994; Kelley et al., Development 118:817-827, 1993)およびdH
AND、eHANDなどが初期発生段階において心臓内で発現される全ての転写
因子の四つのクラス(class)に属するものである。これらの遺伝子の中からある
一つを特定的に除去する場合、心臓および心臓外形質発現に相当なる影響を与え
、発生E9.5〜E10.5の間に胚芽の死亡が起こる。
導信号や位置調節信号を含む複雑な信号等によって調節される(Fishman and Chi
en, Cell 91:153-156, 1997; Lyons, Curr. Opin. Genet. Dev. 6:454-460, 199
6; Mohun and Sparrow, Curr. Opin. Genet. Dev. 7:628-633, 1997;Olson and
Srivastava, Science 272:671-676, 1996)。転写因子は多様な遺伝子を活性化さ
せる能力があるため、一般に器官発生時重要な調節因子として認識されている。
心臓中胚葉の特異化および分化の初期段階に重要な影響を及ぼす数多くの心臓転
写因子が同定された(Tanaka et al., Dev. Genet. 22:239-249, 1998). Csx/Nkx
2.5 (Komuro and Izumo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8145-8149, 1993; Li
ns et al., Development 119:419-431, 1993), MEF-2C (Edmondson et al., Dev
elopment 120:1251-1263, 1994), GATA4 (Heikinheimo et al., Dev. Biol. 164
: 361-373, 1994; Kelley et al., Development 118:817-827, 1993)およびdH
AND、eHANDなどが初期発生段階において心臓内で発現される全ての転写
因子の四つのクラス(class)に属するものである。これらの遺伝子の中からある
一つを特定的に除去する場合、心臓および心臓外形質発現に相当なる影響を与え
、発生E9.5〜E10.5の間に胚芽の死亡が起こる。
【0007】
マウスCsx/Nkx2.5遺伝子は、E7.5に心臓前駆細胞で最初に発現
され、この段階では心臓と舌(脾臓、胃、肝、喉頭では小さい範囲)で主として
検出される。Csx/Nkx2.5の心臓外発現は出生の後著しく減少するのに
対して、成体では心臓にのみ発現が限定される。Csx/Nkx2.5遺伝子を
除去したマウスの場合、機能的な心臓を形成できず、E9.5〜11.5の間に
胚芽死亡が起こってしまう。
され、この段階では心臓と舌(脾臓、胃、肝、喉頭では小さい範囲)で主として
検出される。Csx/Nkx2.5の心臓外発現は出生の後著しく減少するのに
対して、成体では心臓にのみ発現が限定される。Csx/Nkx2.5遺伝子を
除去したマウスの場合、機能的な心臓を形成できず、E9.5〜11.5の間に
胚芽死亡が起こってしまう。
【0008】
大部分の組織特異的遺伝子発現は、転写段階でエンハンサー(enhancer)とリプ
レッサー(repressor)の配列にしたがって調節される。 一般に、厳格に発現が調
節されて起こるために、エンハンサーは多様な転写因子の共助を必要とする複雑
な調節機序を採択することになる。これら転写因子の結合部位は、遺伝子のプロ
モーター(promoter)から数キロベース(kb)に位置し、互いに離れて分布する。
レッサー(repressor)の配列にしたがって調節される。 一般に、厳格に発現が調
節されて起こるために、エンハンサーは多様な転写因子の共助を必要とする複雑
な調節機序を採択することになる。これら転写因子の結合部位は、遺伝子のプロ
モーター(promoter)から数キロベース(kb)に位置し、互いに離れて分布する。
【0009】
心臓細胞特異的方法で遺伝子を発現できるならば極めて好ましいと言える。
これは、例えば、損なわれた心臓組織を治療するために治療用タンパク質を暗号
化する遺伝子を特定的に発現させるに応用されることができる。また、幹細胞由
来性心筋細胞の効用性を極大化するために、例えば、ヒトとその他の動物の損な
われた心臓組織を治療するにおいて潜在的な異種細胞集合体から心臓細胞を迅速
に分離し得るならさらに好ましい。
これは、例えば、損なわれた心臓組織を治療するために治療用タンパク質を暗号
化する遺伝子を特定的に発現させるに応用されることができる。また、幹細胞由
来性心筋細胞の効用性を極大化するために、例えば、ヒトとその他の動物の損な
われた心臓組織を治療するにおいて潜在的な異種細胞集合体から心臓細胞を迅速
に分離し得るならさらに好ましい。
【0010】
したがって、本発明は、心臓細胞特異的遺伝子発現をなすための試薬および方
法を提供することにその目的がある。
法を提供することにその目的がある。
【0011】
第一に、本発明は、(a)SEQ ID No.:1またはSEQ ID N
o.:3に示される核酸分子のうち40個の連続したヌクレオチドと100%の
同一性;(b)SEQ ID No.:2に示される核酸分子のうち50個の連
続したヌクレオチドと少なくとも91%の同一性;(c)SEQ ID No.
:1またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち60個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも97%の同一性;または(d)SEQ ID No
.:1またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち70個の連続
したヌクレオチドと少なくとも95%の同一性;を有するエンハンサー因子を含
む精製された核酸分子を特徴とする。
o.:3に示される核酸分子のうち40個の連続したヌクレオチドと100%の
同一性;(b)SEQ ID No.:2に示される核酸分子のうち50個の連
続したヌクレオチドと少なくとも91%の同一性;(c)SEQ ID No.
:1またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち60個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも97%の同一性;または(d)SEQ ID No
.:1またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち70個の連続
したヌクレオチドと少なくとも95%の同一性;を有するエンハンサー因子を含
む精製された核酸分子を特徴とする。
【0012】
第二に、本発明は、ヒトから由来した心臓特異的エンハンサー因子を含む精製
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、SEQ ID No.:
1、SEQ ID No.2、またはSEQ ID No.:3に示される核酸
分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも60%の同一性を有する
。好ましくは、この因子は、SEQ ID No.:1、SEQ ID No.
2、またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち50個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも70%の同一性を有する。さらに好ましくは、SE
Q ID No.:1、SEQ ID No.2、またはSEQ ID No.
:3に示される核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと比較するとき、
少なくとも80%の同一性を有し、最も好ましくは、少なくとも90%の同一性
を有することを特徴とする。
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、SEQ ID No.:
1、SEQ ID No.2、またはSEQ ID No.:3に示される核酸
分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも60%の同一性を有する
。好ましくは、この因子は、SEQ ID No.:1、SEQ ID No.
2、またはSEQ ID No.:3に示される核酸分子のうち50個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも70%の同一性を有する。さらに好ましくは、SE
Q ID No.:1、SEQ ID No.2、またはSEQ ID No.
:3に示される核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと比較するとき、
少なくとも80%の同一性を有し、最も好ましくは、少なくとも90%の同一性
を有することを特徴とする。
【0013】
インビボで発現されるとき、エンハンサー因子は4個の心房/心室 (chamber)
全体で作用を表す。第一または第二特徴のエンハンサー因子は天然にまたは非天
然に生成されることができる。
全体で作用を表す。第一または第二特徴のエンハンサー因子は天然にまたは非天
然に生成されることができる。
【0014】
好ましくは、第一または第二特徴のエンハンサー因子は、Mef2、dHAN
D、GATA、TGF−β、CarG、E−BoxおよびCsx/Nkx2.5
などの結合部位を含むグループから選択された結合部位を含む。さらに好ましく
は、このエンハンサー因子が当該グループから選択された少なくとも2個の結合
部位を含む。さらに、このエンハンサー因子はSp−1結合部位を含むことが好
ましい。
D、GATA、TGF−β、CarG、E−BoxおよびCsx/Nkx2.5
などの結合部位を含むグループから選択された結合部位を含む。さらに好ましく
は、このエンハンサー因子が当該グループから選択された少なくとも2個の結合
部位を含む。さらに、このエンハンサー因子はSp−1結合部位を含むことが好
ましい。
【0015】
第三に、本発明は、Mef2、dHAND、GATA、TGF−β、CarG
、E−Box、およびCsx/Nkx2.5の結合部位から選択された少なくと
も3個の転写因子結合部位を含む非自然的に生成される精製された核酸分子を特
徴とする。この核酸分子は、少なくとも4個の転写因子結合部位を含むのが好ま
しく、前記グループ中5個の転写因子結合部位を含むのがさらに好ましい。プロ
モーターと機能的に連結される場合、この核酸分子は心臓細胞−特異的な方法で
少なくとも2倍までプロモーターの活性を増進させる。
、E−Box、およびCsx/Nkx2.5の結合部位から選択された少なくと
も3個の転写因子結合部位を含む非自然的に生成される精製された核酸分子を特
徴とする。この核酸分子は、少なくとも4個の転写因子結合部位を含むのが好ま
しく、前記グループ中5個の転写因子結合部位を含むのがさらに好ましい。プロ
モーターと機能的に連結される場合、この核酸分子は心臓細胞−特異的な方法で
少なくとも2倍までプロモーターの活性を増進させる。
【0016】
第四に、本発明は、(a)SEQ ID No.:6に示される核酸分子のう
ち50個の連続したヌクレオチドと100%の同一性;(b)SEQ ID N
o.:6に示される核酸分子のうち60個の連続したヌクレオチドと少なくとも
97%の同一性;(c)SEQ ID No.:6に示される核酸分子のうち7
0個の連続したヌクレオチドと少なくとも93%の同一性;または(d)SEQ
ID No.:6に示される核酸分子のうち100個の連続したヌクレオチド
と少なくとも90%の同一性を有するエンハンサー因子を含む精製された核酸分
子を特徴とする。
ち50個の連続したヌクレオチドと100%の同一性;(b)SEQ ID N
o.:6に示される核酸分子のうち60個の連続したヌクレオチドと少なくとも
97%の同一性;(c)SEQ ID No.:6に示される核酸分子のうち7
0個の連続したヌクレオチドと少なくとも93%の同一性;または(d)SEQ
ID No.:6に示される核酸分子のうち100個の連続したヌクレオチド
と少なくとも90%の同一性を有するエンハンサー因子を含む精製された核酸分
子を特徴とする。
【0017】
第五に、本発明は、ヒトから由来した心臓特異的エンハンサー因子を含む精製
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、SEQ ID No.:
6に示される核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも45%
の同一性を有する。この因子は、SEQ ID No.:6に示される核酸分子
のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも50%の同一性を有するのが
好ましい。さらに好ましくは、前記因子がSEQ ID No.:6に示される
核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも60%の同一性を有
し、最も好ましくは、SEQ ID No.:6に示される核酸分子のうち50
個の連続したヌクレオチドと少なくとも75%ないし90%までの同一性を有す
る。この因子は天然にまたは非天然に生成されることができる。
された核酸分子を特徴とし、このエンハンサー因子は、SEQ ID No.:
6に示される核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも45%
の同一性を有する。この因子は、SEQ ID No.:6に示される核酸分子
のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも50%の同一性を有するのが
好ましい。さらに好ましくは、前記因子がSEQ ID No.:6に示される
核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも60%の同一性を有
し、最も好ましくは、SEQ ID No.:6に示される核酸分子のうち50
個の連続したヌクレオチドと少なくとも75%ないし90%までの同一性を有す
る。この因子は天然にまたは非天然に生成されることができる。
【0018】
第六に、本発明は、SEQ ID No.:4またはSEQ ID.:5の核
酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも90%同一な配列を有
する50個の連続したヌクレオチドを含む精製された核酸分子を特徴とする。
酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも90%同一な配列を有
する50個の連続したヌクレオチドを含む精製された核酸分子を特徴とする。
【0019】
第七に、本発明は、第一、第二、第三、第四、および第五特徴を有する核酸分
子を含むDNAベクターを特徴とする。DNAベクターは、関心のある遺伝子と
機能的に連係されたプロモーターをさらに含むことができる。関心のある遺伝子
には、心臓形成(cardiogenic)関連遺伝子(例えば、BMP2、BMP4、GATA4、dHAND、
eHAND、MEF2C、IRX4、SRF、またはCsx/Nkx2.5などを暗号化する遺伝子)、レポー
ター遺伝子(例えば、GFP、β-gal、alkaline phosphatase、chloramphenicol ac
etyl transferaseまたはluciferaseなどを暗号化する遺伝子)、選別可能なマー
カーを暗号化する遺伝子(例えば、neomycin、kanamycin、またはhygromycinなど
に耐性のある遺伝子)、または治療用タンパク質を暗号化する遺伝子(例えば、成
長因子、サイトカイン、anti-apoptotic factor、pro-apoptotic factorまたは
心臓機能や再生を向上させるタンパク質)などがある。
子を含むDNAベクターを特徴とする。DNAベクターは、関心のある遺伝子と
機能的に連係されたプロモーターをさらに含むことができる。関心のある遺伝子
には、心臓形成(cardiogenic)関連遺伝子(例えば、BMP2、BMP4、GATA4、dHAND、
eHAND、MEF2C、IRX4、SRF、またはCsx/Nkx2.5などを暗号化する遺伝子)、レポー
ター遺伝子(例えば、GFP、β-gal、alkaline phosphatase、chloramphenicol ac
etyl transferaseまたはluciferaseなどを暗号化する遺伝子)、選別可能なマー
カーを暗号化する遺伝子(例えば、neomycin、kanamycin、またはhygromycinなど
に耐性のある遺伝子)、または治療用タンパク質を暗号化する遺伝子(例えば、成
長因子、サイトカイン、anti-apoptotic factor、pro-apoptotic factorまたは
心臓機能や再生を向上させるタンパク質)などがある。
【0020】
第八に、本発明は、心臓細胞になるように細胞を誘導する方法を特徴とする。
この方法は、(a)細胞やそれらの祖先細胞内に、(i)第一、第二、第三、第
四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii)前記
プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子などを含むDNAベクターを
導入し;(b)プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子を発現する条
件下で細胞を培養することを含む。さらに、心臓形成遺伝子の発現が心臓特異的
エンハンサー因子に結合することによって心臓形成遺伝子の発現をさらに向上さ
せることが好ましい。
この方法は、(a)細胞やそれらの祖先細胞内に、(i)第一、第二、第三、第
四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii)前記
プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子などを含むDNAベクターを
導入し;(b)プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子を発現する条
件下で細胞を培養することを含む。さらに、心臓形成遺伝子の発現が心臓特異的
エンハンサー因子に結合することによって心臓形成遺伝子の発現をさらに向上さ
せることが好ましい。
【0021】
第九に、本発明は、心臓細胞内で遺伝子を特異的に発現する方法を特徴とする
。この方法は、細胞やそれらの祖先細胞内に、(i)第一、第二、第三、第四お
よび第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii)前記プロ
モーターと機能的に連係された遺伝子を含むDNAベクターを導入する方法を含
む。好ましくは、前記方法は、核酸が心臓細胞内で遺伝子発現を可能にし、心臓
細胞でない少なくとも1個の細胞内では該当遺伝子を発現してはいけない。
。この方法は、細胞やそれらの祖先細胞内に、(i)第一、第二、第三、第四お
よび第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii)前記プロ
モーターと機能的に連係された遺伝子を含むDNAベクターを導入する方法を含
む。好ましくは、前記方法は、核酸が心臓細胞内で遺伝子発現を可能にし、心臓
細胞でない少なくとも1個の細胞内では該当遺伝子を発現してはいけない。
【0022】
第十に、本発明は、標的細胞を誘導して心臓細胞を生成するとか、心臓細胞に
なるようにする方法の効率性を決定する方法を特徴とする。この方法は、(a)
少なくとも1個の標的細胞、または、標的細胞の祖先細胞内に、(i)第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(
iii)プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベク
ターを導入し;(b)標的細胞で心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるように
潜在的に誘導する方法を行い;(c)レポーター遺伝子−陽性である細胞数とパ
ーセントを決定することを含む方法を特徴とする。前記(c)項において、細胞
数および含量が高いほど幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細胞になる
ように誘導する方法がさらに効率的であることが暗示されている。ここで、標的
細胞は骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。
なるようにする方法の効率性を決定する方法を特徴とする。この方法は、(a)
少なくとも1個の標的細胞、または、標的細胞の祖先細胞内に、(i)第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(
iii)プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベク
ターを導入し;(b)標的細胞で心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるように
潜在的に誘導する方法を行い;(c)レポーター遺伝子−陽性である細胞数とパ
ーセントを決定することを含む方法を特徴とする。前記(c)項において、細胞
数および含量が高いほど幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細胞になる
ように誘導する方法がさらに効率的であることが暗示されている。ここで、標的
細胞は骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。
【0023】
第十一に、本発明は、標的細胞で心臓細胞を生成するとか、心臓細胞になるよ
うに誘導する方法の有効性を決定する方法を特徴とする。この方法は、(a)少
なくとも1個の標的細胞(または、標的細胞の祖先細胞)内に、(i)第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(
iii)前記プロモーターと機能的に連係された選別可能なマーカーを暗号化す
る遺伝子を含むDNAベクターを導入し;(b)標的細胞で心臓細胞を生成する
とか、心臓細胞になるように潜在的に誘導する方法を行い;(c)薬物選択法を
行い;(d)以降に薬物選択法で細胞の生存を決定することを含む。前記(c)
項において、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子を発現する細胞は、薬物が
存在する状態でも生存することができ、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子
を発現しない細胞は、薬物が存在する状態では生存できなくなる。また、(d)
項では、細胞生存率が高いほど、幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細
胞になるように誘導する方法の有効性がさらに高いということが暗示されている
。この方法で、(b)段階は、(c)段階前または後に行われ得、また、標的細
胞は、骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。
うに誘導する方法の有効性を決定する方法を特徴とする。この方法は、(a)少
なくとも1個の標的細胞(または、標的細胞の祖先細胞)内に、(i)第一、第
二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(
iii)前記プロモーターと機能的に連係された選別可能なマーカーを暗号化す
る遺伝子を含むDNAベクターを導入し;(b)標的細胞で心臓細胞を生成する
とか、心臓細胞になるように潜在的に誘導する方法を行い;(c)薬物選択法を
行い;(d)以降に薬物選択法で細胞の生存を決定することを含む。前記(c)
項において、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子を発現する細胞は、薬物が
存在する状態でも生存することができ、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子
を発現しない細胞は、薬物が存在する状態では生存できなくなる。また、(d)
項では、細胞生存率が高いほど、幹細胞を心臓細胞として生成するとか、心臓細
胞になるように誘導する方法の有効性がさらに高いということが暗示されている
。この方法で、(b)段階は、(c)段階前または後に行われ得、また、標的細
胞は、骨髄幹細胞または胚幹細胞のような幹細胞が好ましい。
【0024】
第十二に、本発明は、心臓細胞を同定する方法を特徴とする。この方法は、(
a)細胞(または、細胞のそれらの祖先細胞)内に、(i)第一、第二、第三、
第四および第五特徴を有する核酸(ii)プロモーター、および(iii)前記
プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクターを導
入し(ここで、前記細胞が心臓細胞なら前記レポーター遺伝子を発現);(b)
レポーター遺伝子が心臓細胞内で発現され得るように充分な時間をおき;(c)
レポーター遺伝子の存在で心臓細胞を同定することを含む。本方法はインビトロ
で行うのが好ましい。
a)細胞(または、細胞のそれらの祖先細胞)内に、(i)第一、第二、第三、
第四および第五特徴を有する核酸(ii)プロモーター、および(iii)前記
プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクターを導
入し(ここで、前記細胞が心臓細胞なら前記レポーター遺伝子を発現);(b)
レポーター遺伝子が心臓細胞内で発現され得るように充分な時間をおき;(c)
レポーター遺伝子の存在で心臓細胞を同定することを含む。本方法はインビトロ
で行うのが好ましい。
【0025】
第十三に、本発明は、異種細胞集合体から心臓細胞を本質的に精製する方法を
特徴とするが、この方法は、(a)その細胞集合体(または、それら細胞の祖先
細胞)のうち少なくとも1種の芽細胞群(subset)内に、(i)第一、第二、第
三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii
)前記プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクタ
ーを導入し(ここで、前記細胞が心臓細胞ならレポーター遺伝子を発現);(b
)異種細胞集合体内細胞がレポーター遺伝子を発現するか否かを決定し;(c)
この細胞がレポーター遺伝子を発現すると異種細胞集合体からその細胞を精製す
ることを含む。
特徴とするが、この方法は、(a)その細胞集合体(または、それら細胞の祖先
細胞)のうち少なくとも1種の芽細胞群(subset)内に、(i)第一、第二、第
三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモーター、および(iii
)前記プロモーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクタ
ーを導入し(ここで、前記細胞が心臓細胞ならレポーター遺伝子を発現);(b
)異種細胞集合体内細胞がレポーター遺伝子を発現するか否かを決定し;(c)
この細胞がレポーター遺伝子を発現すると異種細胞集合体からその細胞を精製す
ることを含む。
【0026】
第十四に、本発明は、心臓細胞で治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を発現
する方法を特徴とする。この方法は、細胞(または、これら細胞の祖先細胞)に
、(i)第一、第二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモ
ーター、および(iii)前記プロモーターと機能的に連係された治療用タンパ
ク質を暗号化する心臓細胞で発現される遺伝子を含むDNAベクターを導入する
ことを含む。前記細胞は、心臓細胞であるか、または心臓細胞に分化される細胞
であり得る。この方法は、インビボまたはインビトロで行われる。また、この方
法がインビトロで行われると、前記細胞(または、その細胞の子孫細胞)は患者に
移植され得る。
する方法を特徴とする。この方法は、細胞(または、これら細胞の祖先細胞)に
、(i)第一、第二、第三、第四および第五特徴を有する核酸、(ii)プロモ
ーター、および(iii)前記プロモーターと機能的に連係された治療用タンパ
ク質を暗号化する心臓細胞で発現される遺伝子を含むDNAベクターを導入する
ことを含む。前記細胞は、心臓細胞であるか、または心臓細胞に分化される細胞
であり得る。この方法は、インビボまたはインビトロで行われる。また、この方
法がインビトロで行われると、前記細胞(または、その細胞の子孫細胞)は患者に
移植され得る。
【0027】
以上に述べた本発明の全ての特徴において、エンハンサー因子は核酸塩基配列
が存在することから、(i)エンハンサーと機能的に連係された遺伝子の発現が
心臓細胞内で少なくとも25%まで増加され、(ii)loopingに先だっ
て心臓管内で遺伝子発現が起こるようにし、(iii)4個の心房/心室内で遺
伝子発現が起こるようにし、(iv)心臓外発現に比べて心臓内発現が100%
さらに増加可能な核酸塩基配列として定義する。好ましくは、(i)において、
発現が少なくとも50%まで増加され、さらに好ましくは100%まで増加され
、最も好ましくは200%まで増加される。
が存在することから、(i)エンハンサーと機能的に連係された遺伝子の発現が
心臓細胞内で少なくとも25%まで増加され、(ii)loopingに先だっ
て心臓管内で遺伝子発現が起こるようにし、(iii)4個の心房/心室内で遺
伝子発現が起こるようにし、(iv)心臓外発現に比べて心臓内発現が100%
さらに増加可能な核酸塩基配列として定義する。好ましくは、(i)において、
発現が少なくとも50%まで増加され、さらに好ましくは100%まで増加され
、最も好ましくは200%まで増加される。
【0028】
ここで使用される“核酸”はDNAまたはRNAを意味する。“核酸分子”は
デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本
鎖の重合体である。特別な言及がない限り、一本鎖の核酸分子配列の左手方向は
5’末端(5’end)に、二本鎖核酸分子の左手方向は5’方向(5’direction)にす
る。
デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本
鎖の重合体である。特別な言及がない限り、一本鎖の核酸分子配列の左手方向は
5’末端(5’end)に、二本鎖核酸分子の左手方向は5’方向(5’direction)にす
る。
【0029】
“プロモーター”は解読開始コドンの上位(upstream)部分の核酸部位を意味し
、RNA重合酵素と転写を開始する様々なタンパク質の認識と結合が起こる部位
である。“ヒトプロモーター”はヒト細胞で転写を開始できるプロモーターであ
って、ヒト細胞から由来されても、そうでなくてもよい。“Csx/Nkx2.
5プロモーター”は、Csx/Nkx2.5遺伝子のプロモーター部位から由来
されたものであって、異種核酸分子と機能的に連係されている場合、心臓細胞内
の該当分子の転写を開始することができる(転写を支援できる転写培地(transcri
ption medium)状態下で)。
、RNA重合酵素と転写を開始する様々なタンパク質の認識と結合が起こる部位
である。“ヒトプロモーター”はヒト細胞で転写を開始できるプロモーターであ
って、ヒト細胞から由来されても、そうでなくてもよい。“Csx/Nkx2.
5プロモーター”は、Csx/Nkx2.5遺伝子のプロモーター部位から由来
されたものであって、異種核酸分子と機能的に連係されている場合、心臓細胞内
の該当分子の転写を開始することができる(転写を支援できる転写培地(transcri
ption medium)状態下で)。
【0030】
“エンハンサー因子”は、プロモーターの隣接部位に位置し、転写を支援でき
る転写培地状態下にある場合、エンハンサードメイン(enhancer domain)がない
ときのプロモーターによる転写活性と比較し、転写活性を増加させる核酸塩基配
列を意味する。
る転写培地状態下にある場合、エンハンサードメイン(enhancer domain)がない
ときのプロモーターによる転写活性と比較し、転写活性を増加させる核酸塩基配
列を意味する。
【0031】
“機能的に連係された”とは、適合な転写培地で核酸分子の転写を誘導するた
めの方式で2個以上の核酸分子(例えば、転写される核酸分子、プロモーター、
エンハンサー因子)が連結されていることを意味する。
めの方式で2個以上の核酸分子(例えば、転写される核酸分子、プロモーター、
エンハンサー因子)が連結されていることを意味する。
【0032】
“由来された”とは、核酸分子が2次核酸分子から作られるか、または形成さ
れた場合を意味し、誘導体に作られるか、形成された元来の核酸分子の重要な機
能的特徴を保持している。
れた場合を意味し、誘導体に作られるか、形成された元来の核酸分子の重要な機
能的特徴を保持している。
【0033】
“発現コンストラクト(expression construct)”は、転写を行い得る核酸分子
を意味する。本発明における発現コンストラクトは少なくとも心臓-特異的エン
ハンサー因子とプロモーターを含む。ここで述べたように、転写終結信号のよう
な付加的な因子等がさらに含まれることができる。
を意味する。本発明における発現コンストラクトは少なくとも心臓-特異的エン
ハンサー因子とプロモーターを含む。ここで述べたように、転写終結信号のよう
な付加的な因子等がさらに含まれることができる。
【0034】
“ベクター”または“発現ベクター”は、発現システム、核酸媒介体(vehicle
)、核酸輸送に好適な核酸分子、自律的な自家−複製原型DNA(例えば、プラ
スミド)を意味する。ベクターが宿主細胞内にある場合、ベクターは自律的な構
造として細胞***周期の間に安定的に細胞によって複製されるか、宿主細胞ゲノ
ム内に統合されるか、または宿主細胞の核または細胞質内で存在することができ
る。
)、核酸輸送に好適な核酸分子、自律的な自家−複製原型DNA(例えば、プラ
スミド)を意味する。ベクターが宿主細胞内にある場合、ベクターは自律的な構
造として細胞***周期の間に安定的に細胞によって複製されるか、宿主細胞ゲノ
ム内に統合されるか、または宿主細胞の核または細胞質内で存在することができ
る。
【0035】
“心臓細胞”は、分化された心臓細胞(例えば、心筋細胞)または心臓細胞を生
成するか、心臓細胞として分化されるように決定された細胞(例えば、心筋母細
胞または心筋芽細胞)を意味する。
成するか、心臓細胞として分化されるように決定された細胞(例えば、心筋母細
胞または心筋芽細胞)を意味する。
【0036】
“心臓-特異的エンハンサー因子”は、プロモーターと機能的に連係されて心
臓細胞内で遺伝子発現を誘導するものの、全ての組織や全ての細胞タイプで遺伝
子発現を誘導はしない因子を意味する。本発明における心臓-特異的エンハンサ
ーは、自然的にまたは非自然的に生成され得る。当該分野の専門家は、一般のオ
リゴヌクレオチド合成技術を用いて非自然的に表れるエンハンサーの合成が行え
ることを確認するはずである。
臓細胞内で遺伝子発現を誘導するものの、全ての組織や全ての細胞タイプで遺伝
子発現を誘導はしない因子を意味する。本発明における心臓-特異的エンハンサ
ーは、自然的にまたは非自然的に生成され得る。当該分野の専門家は、一般のオ
リゴヌクレオチド合成技術を用いて非自然的に表れるエンハンサーの合成が行え
ることを確認するはずである。
【0037】
“プラスミド”は、細胞内で複製できる自律的なDNA分子を意味し、発現の
ために考案されたプラスミドと核酸複製のために考案されたプラスミドのいずれ
もを含む。
ために考案されたプラスミドと核酸複製のために考案されたプラスミドのいずれ
もを含む。
【0038】
“異種の”とは、核酸分子が外部ソースから起源する場合、または同じソース
なら、元の形態から変形されたのを意味する。したがって、“異種プロモーター
”は本発明の複製されたエンハンサードメインと正常的に連係されないプロモー
ターである。これと同様に、元の形態から変形されたか、機能的に連係されたプ
ロモーターが由来されたソースとは異なるソースから由来された異種核酸分子が
誘導された。
なら、元の形態から変形されたのを意味する。したがって、“異種プロモーター
”は本発明の複製されたエンハンサードメインと正常的に連係されないプロモー
ターである。これと同様に、元の形態から変形されたか、機能的に連係されたプ
ロモーターが由来されたソースとは異なるソースから由来された異種核酸分子が
誘導された。
【0039】
“本質的に精製された核酸”は、本発明において核酸が誘導された有機体で自
然的に表れるゲノムのうち核酸側面の遺伝子がない核酸を意味する。したがって
、この用語は、例えば、ベクター内に;自律的に複製するプラスミドまたはウィ
ルス内に;または、原核細胞または真核細胞のゲノム核酸内に統合されるか、ま
たは他の塩基配列とは独立的に分離された分子(例えば、cDNAまたはPCR
や制限酵素切断によって生成されたゲノム断片またはcDNA断片)に存在する
組換え核酸(recombinant nucleic acid)を含む。また、これは、付加的なポリペ
プチド配列を暗号化する混成遺伝子の一部である組換え核酸を含む。
然的に表れるゲノムのうち核酸側面の遺伝子がない核酸を意味する。したがって
、この用語は、例えば、ベクター内に;自律的に複製するプラスミドまたはウィ
ルス内に;または、原核細胞または真核細胞のゲノム核酸内に統合されるか、ま
たは他の塩基配列とは独立的に分離された分子(例えば、cDNAまたはPCR
や制限酵素切断によって生成されたゲノム断片またはcDNA断片)に存在する
組換え核酸(recombinant nucleic acid)を含む。また、これは、付加的なポリペ
プチド配列を暗号化する混成遺伝子の一部である組換え核酸を含む。
【0040】
“形質転換遺伝子(transgene)”は、一時的または永久的に細胞内に挿入され
、 ゲノム内に統合されるか染色体外に存在する場合、有機体の一部になる核酸
分子(例えば、DNA)の単片を意味する。こうした形質転換遺伝子は、形質転換
有機体と部分的にまたは完全に異種(例えば、異物質)の遺伝子を含むこともあれ
ば、その有機体の内部遺伝子と同種の遺伝子を表すこともある。
、 ゲノム内に統合されるか染色体外に存在する場合、有機体の一部になる核酸
分子(例えば、DNA)の単片を意味する。こうした形質転換遺伝子は、形質転換
有機体と部分的にまたは完全に異種(例えば、異物質)の遺伝子を含むこともあれ
ば、その有機体の内部遺伝子と同種の遺伝子を表すこともある。
【0041】
“形質転換細胞(transgenic cell)”は、形質転換遺伝子を含む細胞を意味す
る。例えば、本発明で異種核酸分子と機能的に連係された発現ベクターを含むベ
クターに形質転換された幹細胞は形質的な特徴が変わった細胞群を形成すること
に利用され得る。
る。例えば、本発明で異種核酸分子と機能的に連係された発現ベクターを含むベ
クターに形質転換された幹細胞は形質的な特徴が変わった細胞群を形成すること
に利用され得る。
【0042】
本発明の他の特長は前述した内容に関する下記の詳細な説明を通じてさらに明
確になる。
確になる。
【0043】
本発明者らは、マウスでの形質転換遺伝子発現を誘導するために使用されると
き、内因性mCsx/Nkx2.5の発現様態を再現し、mCsx/Nkx2.
5とhCsx/Nkx2.5から心臓細胞エンハンサー(cardiac en
hancer)をクローニングした。hCsx/Nkx2.5エンハンサーコン
ストラクトの一つである7.5kb−hsp−lacZは、hsp68プロモー
ター−lacZ cassetteにhCsx/Nkx2.5(SEQ ID
No.:4)で7.5kbのゲノム部位が機能的に連係されて作製されたもので
あって、心臓発生が起こる最初の時点であるE7.5に活性化され、E9.5、
E10.5、E12.5に内因性 mCsx/Nkx2.5発現様態を再現する
。したがって、心臓の4個の心房/心室がE12.5に形成されるとき、このエ
ンハンサーは4個の心房/心室のいずれにおいても活性化される。今まで知られ
た哺乳動物心臓エンハンサーのうち、この7.5kbエンハンサーは4個の心房
/心室のいずれにおいても活性化される最初のエンハンサーである。さらに、こ
のエンハンサーはエクトピック(ectopic)発現を示さない。
き、内因性mCsx/Nkx2.5の発現様態を再現し、mCsx/Nkx2.
5とhCsx/Nkx2.5から心臓細胞エンハンサー(cardiac en
hancer)をクローニングした。hCsx/Nkx2.5エンハンサーコン
ストラクトの一つである7.5kb−hsp−lacZは、hsp68プロモー
ター−lacZ cassetteにhCsx/Nkx2.5(SEQ ID
No.:4)で7.5kbのゲノム部位が機能的に連係されて作製されたもので
あって、心臓発生が起こる最初の時点であるE7.5に活性化され、E9.5、
E10.5、E12.5に内因性 mCsx/Nkx2.5発現様態を再現する
。したがって、心臓の4個の心房/心室がE12.5に形成されるとき、このエ
ンハンサーは4個の心房/心室のいずれにおいても活性化される。今まで知られ
た哺乳動物心臓エンハンサーのうち、この7.5kbエンハンサーは4個の心房
/心室のいずれにおいても活性化される最初のエンハンサーである。さらに、こ
のエンハンサーはエクトピック(ectopic)発現を示さない。
【0044】
この7.5kb断片内で、本発明者らは2ヶ所の部位(ここでは、相同的ドメ
インA1 (HDA1;SEQ ID NO.:1)と相同的ドメインA2(H
DA2;SEQ ID NO.:2)で表示する)を分離したし、これらはhs
p68プロモーター−lacZ cassetteと機能的に連係される場合、
心臓−特異的方法で遺伝子発現を増進させ得る。
インA1 (HDA1;SEQ ID NO.:1)と相同的ドメインA2(H
DA2;SEQ ID NO.:2)で表示する)を分離したし、これらはhs
p68プロモーター−lacZ cassetteと機能的に連係される場合、
心臓−特異的方法で遺伝子発現を増進させ得る。
【0045】
既存のCMG細胞分離方法は、長い時間を必要とした上、細胞収得率も低かっ
た。一般に、心筋細胞は拍動によって確認される。一次的な骨髄幹細胞から拍動
する心筋細胞の発生比率は極めて低く、CMG細胞を不滅化させた後にも骨髄幹
細胞から由来された細胞の約70%は拍動しない。拍動する心筋細胞を高比率で
得るのが難しい理由は、5−アザシチジンによっては心筋細胞形質が完全に誘導
されないためである。CMG細胞を分離することに長い時間が必要なため、心筋
細胞誘導方法を向上させるのが従前では難しい問題であった。拍動は、心筋細胞
によって表される最終的な形質中の一つである。本発明は、心筋細胞を誘導する
さらに初期のマーカーを提供している。これは、 例えば、心筋細胞誘導方法を
最適化させるに有用である。実験にかかる時間を短縮させることによって所望の
細胞に誘導する効率をより迅速に向上させ得るのである。また、本発明は、例え
ば、Csx/Nkx2.5心臓細胞−特異的エンハンサーと機能的に連係された
レポーター遺伝子の発現によって分類することによって心筋細胞を増幅する方法
を提供する。この利用とその他の活用は実施例に基づきさらに詳細に説明する。
た。一般に、心筋細胞は拍動によって確認される。一次的な骨髄幹細胞から拍動
する心筋細胞の発生比率は極めて低く、CMG細胞を不滅化させた後にも骨髄幹
細胞から由来された細胞の約70%は拍動しない。拍動する心筋細胞を高比率で
得るのが難しい理由は、5−アザシチジンによっては心筋細胞形質が完全に誘導
されないためである。CMG細胞を分離することに長い時間が必要なため、心筋
細胞誘導方法を向上させるのが従前では難しい問題であった。拍動は、心筋細胞
によって表される最終的な形質中の一つである。本発明は、心筋細胞を誘導する
さらに初期のマーカーを提供している。これは、 例えば、心筋細胞誘導方法を
最適化させるに有用である。実験にかかる時間を短縮させることによって所望の
細胞に誘導する効率をより迅速に向上させ得るのである。また、本発明は、例え
ば、Csx/Nkx2.5心臓細胞−特異的エンハンサーと機能的に連係された
レポーター遺伝子の発現によって分類することによって心筋細胞を増幅する方法
を提供する。この利用とその他の活用は実施例に基づきさらに詳細に説明する。
【0046】
【実施例】実施例1. mCsx/Nkx2.5エンハンサー因子の特徴
Csx/Nkx2.5の調節部位を定義する初期過程であって、本発明者らは
3週となったマウスの心臓から全体RNAを得て5’RACEによってmCsx
/Nkx2.5転写体の5’末端を決定した。相異なる5’末端を除いて、長さ
がほぼ同一である3個の異なる転写体を確認した(転写体I、II、III)。
ゲノムDNA塩基配列との塩基配列比較は、一致するエクソン−イントロン結合
部位配列にしたがってエクソン−イントロン境界を示した。したがって、本発明
者らは最前方5’cDNA断片をexon 1a、最後方3’cDNA断片をe
xon 1b、中間に挟んでいるゲノム配列をintron 1と命名した。ま
た、開始コドンを含むエクソンをexon 1c、隣接した部位はintron
2、3と定め、その後にある最後のexonであるexon 2はホメオドメ
イン(HD)とTAG解読停止コドンを含む。
3週となったマウスの心臓から全体RNAを得て5’RACEによってmCsx
/Nkx2.5転写体の5’末端を決定した。相異なる5’末端を除いて、長さ
がほぼ同一である3個の異なる転写体を確認した(転写体I、II、III)。
ゲノムDNA塩基配列との塩基配列比較は、一致するエクソン−イントロン結合
部位配列にしたがってエクソン−イントロン境界を示した。したがって、本発明
者らは最前方5’cDNA断片をexon 1a、最後方3’cDNA断片をe
xon 1b、中間に挟んでいるゲノム配列をintron 1と命名した。ま
た、開始コドンを含むエクソンをexon 1c、隣接した部位はintron
2、3と定め、その後にある最後のexonであるexon 2はホメオドメ
イン(HD)とTAG解読停止コドンを含む。
【0047】
転写体Iはゲノム配列内に非連続的な最前方5’末端で2個のcDNA断片を
含む。転写体Iの最前方5’断片は、長さが46bp(exon 1a)であり
、二番目の非連続的断片から669bp上部に位置する。二番目の非連続的断片
は36bp長(exon 1bの一部)であり、解読開始コドンから3504b
p上部に位置する。転写体IIの場合、exon 1bが最も5’末端配列であ
り、転写体Iより5’がさらに延長されており、この場合は93bp長であり、
転写体Iで発見される36bp内部断片を含む。転写体IIIの場合、5’末端
の最初のエクソンであるexon 1cは転写体IとIIで重なった連続的なゲ
ノム配列の71bpを含む。
含む。転写体Iの最前方5’断片は、長さが46bp(exon 1a)であり
、二番目の非連続的断片から669bp上部に位置する。二番目の非連続的断片
は36bp長(exon 1bの一部)であり、解読開始コドンから3504b
p上部に位置する。転写体IIの場合、exon 1bが最も5’末端配列であ
り、転写体Iより5’がさらに延長されており、この場合は93bp長であり、
転写体Iで発見される36bp内部断片を含む。転写体IIIの場合、5’末端
の最初のエクソンであるexon 1cは転写体IとIIで重なった連続的なゲ
ノム配列の71bpを含む。
【0048】
新規のエクソンの存在を確認するために、本発明者らはプライマー伸長分析(p
rimer extension analysis)を実施した。成体マウス心臓のpoly(A) R
NAを用いて、転写体IIとIIIの大きさに相応する同一の2個のバンドを確
認した。転写体IIIを表すバンドがさらに強かったし、この事実は、これが開
始に重要な部位というのを意味する。プライマー伸長分析を通じて転写体Iに相
応するバンドを確認できなかったため、本発明者らは多くの組織で全体RNAサ
ンプルを用いてRT−PCRを行った。Exon 1a−とexon 1c−特
異的プライマー対でRT−PCTをして心臓と脾臓から予想された大きさ(11
2bp)の産物が得られた。腎臓のRNAではどんなバンドも増幅されなかった
が、腎臓はCsx/Nkx2.5を発現しない。サザンブロッティング法(South
ern blotting)でexon 1b−特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用し
てこの112bpバンドがexon 1bを含むということを確認した。
rimer extension analysis)を実施した。成体マウス心臓のpoly(A) R
NAを用いて、転写体IIとIIIの大きさに相応する同一の2個のバンドを確
認した。転写体IIIを表すバンドがさらに強かったし、この事実は、これが開
始に重要な部位というのを意味する。プライマー伸長分析を通じて転写体Iに相
応するバンドを確認できなかったため、本発明者らは多くの組織で全体RNAサ
ンプルを用いてRT−PCRを行った。Exon 1a−とexon 1c−特
異的プライマー対でRT−PCTをして心臓と脾臓から予想された大きさ(11
2bp)の産物が得られた。腎臓のRNAではどんなバンドも増幅されなかった
が、腎臓はCsx/Nkx2.5を発現しない。サザンブロッティング法(South
ern blotting)でexon 1b−特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用し
てこの112bpバンドがexon 1bを含むということを確認した。
【0049】
mCsx/Nkx2.5遺伝子のゲノム構造の特性をさらに詳細に描写するた
めに、本発明者らは8.6kbのゲノムDNAをサブクローニングし、塩基配列
化(sequencing)した。Exon 1aの3’末端はATGコドンから4265b
p上部に位置し、その次に、intron 1(668bp)、 exon 1
b(93bp)、intron 2(3179bp)、ATG解読開始部位を含
むexon 1c(655bp)とintron 3(1377bp)、そして
TAG停止コドンとpoly(A)添加信号があるexon 2(983bp)
がある。3個の推定上の転写開始位置周囲のゲノム塩基配列にはTATA bo
xがなく、これは、mCsx/Nkx2.5がTATA−less遺伝子という
のを表す。
めに、本発明者らは8.6kbのゲノムDNAをサブクローニングし、塩基配列
化(sequencing)した。Exon 1aの3’末端はATGコドンから4265b
p上部に位置し、その次に、intron 1(668bp)、 exon 1
b(93bp)、intron 2(3179bp)、ATG解読開始部位を含
むexon 1c(655bp)とintron 3(1377bp)、そして
TAG停止コドンとpoly(A)添加信号があるexon 2(983bp)
がある。3個の推定上の転写開始位置周囲のゲノム塩基配列にはTATA bo
xがなく、これは、mCsx/Nkx2.5がTATA−less遺伝子という
のを表す。
【0050】
5’ フランキング塩基配列の3.3kbと4kbは咽頭、甲状腺primor
dium、胃からだけでなく右心室の流出管(outflow tract)と
基底部(basal portion)でもLacZ発現を誘導する。
dium、胃からだけでなく右心室の流出管(outflow tract)と
基底部(basal portion)でもLacZ発現を誘導する。
【0051】
mCsx/Nkx2.5の主要転写体(転写体III)は、ATGコドンから
325bpで始まるため、本発明者らはexon 1cに直ぐ隣接した上部のゲ
ノム部位でエンハンサー因子を探してみた。Not IとATGコドンとの間に
ある5’ フランキング塩基配列の3.3kbをlacZレポーター遺伝子(Cs
xlacZ−1;図1)と結合させ、形質転換マウスを作るために、これをマウ
スの胚芽に注射した。実験した40個の胚芽の中で8個の胚芽が形質転換遺伝子
を持っていて、3個はβ−gal染色を示した。この胚芽においてE10.5に
lacZ発現を確認し、このとき、本発明者らは、この上部3.3kb部位が心
臓と心臓外組織でlacZ発現を誘導することを観察した。右心室の流出管と基
底部の心筋細胞でlacZの発現が強く表れたし、右心室の小柱(trabecular l
ayer)でも一部陽性反応を表す細胞があった。流出管でlacZ発現は心筋(my
ocardium)で強く発現されたが、大動脈嚢(aortic sac)や心臓内***(endoca
rdial cushion)ではlacZ発現が検出されなかった。
325bpで始まるため、本発明者らはexon 1cに直ぐ隣接した上部のゲ
ノム部位でエンハンサー因子を探してみた。Not IとATGコドンとの間に
ある5’ フランキング塩基配列の3.3kbをlacZレポーター遺伝子(Cs
xlacZ−1;図1)と結合させ、形質転換マウスを作るために、これをマウ
スの胚芽に注射した。実験した40個の胚芽の中で8個の胚芽が形質転換遺伝子
を持っていて、3個はβ−gal染色を示した。この胚芽においてE10.5に
lacZ発現を確認し、このとき、本発明者らは、この上部3.3kb部位が心
臓と心臓外組織でlacZ発現を誘導することを観察した。右心室の流出管と基
底部の心筋細胞でlacZの発現が強く表れたし、右心室の小柱(trabecular l
ayer)でも一部陽性反応を表す細胞があった。流出管でlacZ発現は心筋(my
ocardium)で強く発現されたが、大動脈嚢(aortic sac)や心臓内***(endoca
rdial cushion)ではlacZ発現が検出されなかった。
【0052】
E10.5にlacZの心臓外発現は、咽頭床(pharyngeal floor)、 甲状
腺原基(tyroid primordium)、胃(stomach)の末端部(distal part)のような内
因性mCsx/Nkx2.5が検出される部位でも観察された。胃において、l
acZ発現は間葉細胞(mesenchymal cells)で観察された。LacZのエクト
ピック発現は、鰓弓(pharyngeal floor)と咽頭気管溝(laryngotracheal groo
ve)の表面外胚葉(ectoderm)で観察された。心臓と心臓外組織でlacZ発現様
態は、1個の胚芽の舌咽神経節(glossopharyngeal ganglion)でのエクトピッ
ク発現を除いては3個のlacZ−陽性胚芽でいずれも本質的に同一であった。
腺原基(tyroid primordium)、胃(stomach)の末端部(distal part)のような内
因性mCsx/Nkx2.5が検出される部位でも観察された。胃において、l
acZ発現は間葉細胞(mesenchymal cells)で観察された。LacZのエクト
ピック発現は、鰓弓(pharyngeal floor)と咽頭気管溝(laryngotracheal groo
ve)の表面外胚葉(ectoderm)で観察された。心臓と心臓外組織でlacZ発現様
態は、1個の胚芽の舌咽神経節(glossopharyngeal ganglion)でのエクトピッ
ク発現を除いては3個のlacZ−陽性胚芽でいずれも本質的に同一であった。
【0053】
CsxlacZ−2コンストラクトは、同一な5’フランキング塩基配列の3
.3kbとintron 3塩基配列の1.4kbを含む(図1)。34個の胚
芽のうち6個の胚芽がCsxlacZ−2形質転換遺伝子を持っていたし、これ
らのうち3個はβ−gal陽性染色を表した。心臓内発現は、右心室基底部と流
出管で表れたし、心臓外発現は2個の胚芽で咽頭床(pharyngeal floor)、甲
状腺原基(tyroid primordium)および胃で観察された。1個の胚芽では咽頭床
(pharyngeal floor)でのみlacZ発現が表れ、他の部位では表れなかった。
かかる発現の欠乏は、形質転換遺伝子挿入部位の陰性効果から起因したものと考
えられる。
.3kbとintron 3塩基配列の1.4kbを含む(図1)。34個の胚
芽のうち6個の胚芽がCsxlacZ−2形質転換遺伝子を持っていたし、これ
らのうち3個はβ−gal陽性染色を表した。心臓内発現は、右心室基底部と流
出管で表れたし、心臓外発現は2個の胚芽で咽頭床(pharyngeal floor)、甲
状腺原基(tyroid primordium)および胃で観察された。1個の胚芽では咽頭床
(pharyngeal floor)でのみlacZ発現が表れ、他の部位では表れなかった。
かかる発現の欠乏は、形質転換遺伝子挿入部位の陰性効果から起因したものと考
えられる。
【0054】
CsxlacZ−1コンストラクトにintron 1とexon 1bの大
部分が含まれたのがCsxlacZ−3である(図1)。2個の胚芽はCsxl
acZ−3形質転換遺伝子に陽性であったし、1個は陽性β−gal染色を表し
た。LacZ発現は、流出管、右心室、咽頭、甲状腺原基(tyroid primordium
)、および胃で観察された。したがって、心臓内β−gal染色様態はCsxl
acZ−1、CsxlacZ−2、CsxlacZ−3コンストラクトで略同一
であった。心臓外発現様態もやはりエクトピック発現部位を除いてはほぼ同一だ
った。
部分が含まれたのがCsxlacZ−3である(図1)。2個の胚芽はCsxl
acZ−3形質転換遺伝子に陽性であったし、1個は陽性β−gal染色を表し
た。LacZ発現は、流出管、右心室、咽頭、甲状腺原基(tyroid primordium
)、および胃で観察された。したがって、心臓内β−gal染色様態はCsxl
acZ−1、CsxlacZ−2、CsxlacZ−3コンストラクトで略同一
であった。心臓外発現様態もやはりエクトピック発現部位を除いてはほぼ同一だ
った。
【0055】
CsxlacZ−4は、5’フランキング塩基配列の6kbを含む。注射した
22個の胚芽を分析した結果、これらのうち10個の胚芽がCsxlacZ−4
形質転換遺伝子をもっていた。おもしろいことに、いずれのCsxlacZ−4
形質転換胚芽においても心臓と心臓外組織の両方でβ−gal染色を示さなかっ
た。この結果は、強力な陰性調節因子がexon 1c 5’から6kbと4k
bの間に存在することを表すものである(図2)。
22個の胚芽を分析した結果、これらのうち10個の胚芽がCsxlacZ−4
形質転換遺伝子をもっていた。おもしろいことに、いずれのCsxlacZ−4
形質転換胚芽においても心臓と心臓外組織の両方でβ−gal染色を示さなかっ
た。この結果は、強力な陰性調節因子がexon 1c 5’から6kbと4k
bの間に存在することを表すものである(図2)。
【0056】
右心室と左心室のmedial wallとinner trabeculae
内でmCsx/Nkx2.5の発現のためのcis−調節因子が5’フランキン
グ塩基配列の14 kbから6 kbの間に存在する。 レポーター遺伝子を発現する5’フランキング塩基配列の14kb(Csxl
acZ−5)を利用するとき、lacZはCsxlacZ−1を利用するときよ
り心臓でさらに広く発現された。β−gal染色は外壁(lateral wall)の小層
(compact layer)を除いては右心室と左心室全体で観察された。心房では心臓
間溝(interatrial groove)でlacZ−陽性心筋細胞塊が観察されたし、これ
は、以降に心房中隔(atrial septum)の上部である。β−gal染色はまた、C
sxlacZ−1でのように流出管でも観察された。心臓内染色はβ−gal陽
性染色を有する4個の全ての形質転換胚芽で類似していた。
内でmCsx/Nkx2.5の発現のためのcis−調節因子が5’フランキン
グ塩基配列の14 kbから6 kbの間に存在する。 レポーター遺伝子を発現する5’フランキング塩基配列の14kb(Csxl
acZ−5)を利用するとき、lacZはCsxlacZ−1を利用するときよ
り心臓でさらに広く発現された。β−gal染色は外壁(lateral wall)の小層
(compact layer)を除いては右心室と左心室全体で観察された。心房では心臓
間溝(interatrial groove)でlacZ−陽性心筋細胞塊が観察されたし、これ
は、以降に心房中隔(atrial septum)の上部である。β−gal染色はまた、C
sxlacZ−1でのように流出管でも観察された。心臓内染色はβ−gal陽
性染色を有する4個の全ての形質転換胚芽で類似していた。
【0057】
CsxlacZ−5の心臓外発現は4個の全体のCsxlacZ−5形質転換
胚芽の咽頭床(pharyngeal floor)と甲状腺原基(tyroid primordium)で観察
された。CsxlacZ−1、−2、−3コンストラクトを有する形質転換胚芽
の胃では強いβ−gal染色を有するに対し、CsxlacZ−5胚芽では4個
のうち唯1個でのみ胃で弱いβ−gal染色を示した。いずれのCsxlacZ
−5胚芽でもエクトピック発現が表れなかったし、これは、組織特異的な方法で
mCsx/Nkx2.5の発現を制限する抑制因子があるということを暗示する
。
胚芽の咽頭床(pharyngeal floor)と甲状腺原基(tyroid primordium)で観察
された。CsxlacZ−1、−2、−3コンストラクトを有する形質転換胚芽
の胃では強いβ−gal染色を有するに対し、CsxlacZ−5胚芽では4個
のうち唯1個でのみ胃で弱いβ−gal染色を示した。いずれのCsxlacZ
−5胚芽でもエクトピック発現が表れなかったし、これは、組織特異的な方法で
mCsx/Nkx2.5の発現を制限する抑制因子があるということを暗示する
。
【0058】
右心室で作用するエンハンサーは3’フランキング塩基配列の6kb内に位置す
る。 mCsx/Nkx2.5を暗号化する塩基配列下部(downstream)のcis−調
節因子を確認するために、本発明者らはCsxlacZ−1コンストラクトに3
’フランキング塩基配列の6kbを連結してCsxlacZ−6を作製した(図
1)。実験した38個の胚芽の中で12個の胚芽がCsxlacZ−6形質転換
遺伝子を有していたし、6個はlacZ陽性であるのを確認した。3個の形質転
換胚芽は外壁(lateral wall)の小層(compact layer)を含めて右心室全体に
β−gal染色された。残り3個の胚芽では心臓内に染色されなかったが、心臓
外で弱い染色があった。6個の胚芽全体において心臓外染色は胃、咽頭、甲状腺
原基(tyroid primordium)で表れた。
る。 mCsx/Nkx2.5を暗号化する塩基配列下部(downstream)のcis−調
節因子を確認するために、本発明者らはCsxlacZ−1コンストラクトに3
’フランキング塩基配列の6kbを連結してCsxlacZ−6を作製した(図
1)。実験した38個の胚芽の中で12個の胚芽がCsxlacZ−6形質転換
遺伝子を有していたし、6個はlacZ陽性であるのを確認した。3個の形質転
換胚芽は外壁(lateral wall)の小層(compact layer)を含めて右心室全体に
β−gal染色された。残り3個の胚芽では心臓内に染色されなかったが、心臓
外で弱い染色があった。6個の胚芽全体において心臓外染色は胃、咽頭、甲状腺
原基(tyroid primordium)で表れた。
【0059】
成体形質変換マウスでレポーター遺伝子の異なる発現様態
前述した一時的な形質転換胚芽の評価の外に、形質転換マウスのライン(lines
)を作ったし、発生過程の異なる時間帯別にF1形質転換マウスを評価した。
)を作ったし、発生過程の異なる時間帯別にF1形質転換マウスを評価した。
【0060】
3.3kb 5’ フランキング塩基配列を含む形質転換CsxlacZ−1
ラインでE7.5にβ−gal染色は観察されなかった。E9.5に心臓と心臓
外lacZ発現様態は一時的な形質転換胚芽で表れたものと同一だった。また、
E15.5にlacZ発現は脾臓で観察されたが、舌では観察されなかった。E
15.5に甲状腺での形質転換遺伝子の発現は依然として強い反面、心臓でla
cZ発現は減少されたが、右心室流出管部分では観察された。面白いことに、同
一の形質転換CsxlacZ−1ラインの成体を分析する時、心臓でβ−gal
染色は全くなかった。
ラインでE7.5にβ−gal染色は観察されなかった。E9.5に心臓と心臓
外lacZ発現様態は一時的な形質転換胚芽で表れたものと同一だった。また、
E15.5にlacZ発現は脾臓で観察されたが、舌では観察されなかった。E
15.5に甲状腺での形質転換遺伝子の発現は依然として強い反面、心臓でla
cZ発現は減少されたが、右心室流出管部分では観察された。面白いことに、同
一の形質転換CsxlacZ−1ラインの成体を分析する時、心臓でβ−gal
染色は全くなかった。
【0061】
14kb 5’ フランキング塩基配列を含む形質転換CsxlacZ−5ラ
インで、β−gal 染色はE7.5に心臓半月(cardiac crescent)で、E8.
25に一般心室と流出管で、E9.5に右心室、左心室、中隔(septum)、および
流出管で観察された。E15.5に心臓内β−gal染色は房室結節(AV juncti
on)と心室中隔(interventricular septum)での斑点型(patchy)発現を除いては有
意に減少された。また、E15.5に脾臓は染色されたが、舌は染色されなかった。
成体CsxlacZ−5形質転換マウス分析で右心室の管腔表面(luminal surf
ace)に沿って、特に、心室中隔表面に沿って斑点型β−gal染色が観察され
た。また、β−gal染色は左心室低部の小さい部分と房室結節部で観察された
。
インで、β−gal 染色はE7.5に心臓半月(cardiac crescent)で、E8.
25に一般心室と流出管で、E9.5に右心室、左心室、中隔(septum)、および
流出管で観察された。E15.5に心臓内β−gal染色は房室結節(AV juncti
on)と心室中隔(interventricular septum)での斑点型(patchy)発現を除いては有
意に減少された。また、E15.5に脾臓は染色されたが、舌は染色されなかった。
成体CsxlacZ−5形質転換マウス分析で右心室の管腔表面(luminal surf
ace)に沿って、特に、心室中隔表面に沿って斑点型β−gal染色が観察され
た。また、β−gal染色は左心室低部の小さい部分と房室結節部で観察された
。
【0062】
mCsx/Nkx2.5発現の自家調節
転写因子の組織特異的発現を表す作用機序の一つは、MyoD遺伝子に示され
るように自分のプロモーターを陽性的に自家調節することである。mCsx/N
kx2.5 プロモーターはCsx/Nkx2.5 蛋白の結合部位である多様
なNKE因子を含む(Chen and Schwartz, J. Biol. Chem. 270:15628-15633, 19
95)。mCsx/Nkx2.5の陽性的自家調節の存在有無を確認するために、
本発明者らは同種組換えによって生成されたmCsx/Nkx2.5のホモ接合
無変異(homozygous null mutant)マウスでのlacZ発現を 検査した。lac
Z発現が変異(mutant)胚芽でmCsx/Nkx2.5の5’と3’調節部位の
調節下にあるため、mCsx/Nkx2.5による陽性調節が存在する場合、β−gal染
色は同形接合無変異胚芽で弱くなるか、欠如されるはずである。案外にもβ−g
al染色は同時に染色された異種接合変異胚芽でより同形接合変異胚芽で遥かに
強かった。同形接合変異体心臓でβ−gal染色の強度が異形接合変異体心臓で
より2倍以上強かったため、かかる資料は直接或いは間接的にmCsx/Nkx
2.5の負のフィードバック(negative feedback)が存在することを表す。こ
のような結果を確証するためにE9.5に異形接合と同形接合変異胚芽の心臓か
ら抽出したRNAを利用した準定量(semi-quantitative)RT−PCRを実施
した。α−心臓アクチン(cardiac actin)の比較的過多な転写を用いて調整し
た後、ホモ接合変異(homozygous mutant)心臓でのlacZ転写量はヘテロ接
合変異(heterozygous mutant)心臓でより約8倍であった。 前述した結果は次の材料と方法によって得られたものである。
るように自分のプロモーターを陽性的に自家調節することである。mCsx/N
kx2.5 プロモーターはCsx/Nkx2.5 蛋白の結合部位である多様
なNKE因子を含む(Chen and Schwartz, J. Biol. Chem. 270:15628-15633, 19
95)。mCsx/Nkx2.5の陽性的自家調節の存在有無を確認するために、
本発明者らは同種組換えによって生成されたmCsx/Nkx2.5のホモ接合
無変異(homozygous null mutant)マウスでのlacZ発現を 検査した。lac
Z発現が変異(mutant)胚芽でmCsx/Nkx2.5の5’と3’調節部位の
調節下にあるため、mCsx/Nkx2.5による陽性調節が存在する場合、β−gal染
色は同形接合無変異胚芽で弱くなるか、欠如されるはずである。案外にもβ−g
al染色は同時に染色された異種接合変異胚芽でより同形接合変異胚芽で遥かに
強かった。同形接合変異体心臓でβ−gal染色の強度が異形接合変異体心臓で
より2倍以上強かったため、かかる資料は直接或いは間接的にmCsx/Nkx
2.5の負のフィードバック(negative feedback)が存在することを表す。こ
のような結果を確証するためにE9.5に異形接合と同形接合変異胚芽の心臓か
ら抽出したRNAを利用した準定量(semi-quantitative)RT−PCRを実施
した。α−心臓アクチン(cardiac actin)の比較的過多な転写を用いて調整し
た後、ホモ接合変異(homozygous mutant)心臓でのlacZ転写量はヘテロ接
合変異(heterozygous mutant)心臓でより約8倍であった。 前述した結果は次の材料と方法によって得られたものである。
【0063】
ゲノムクローンの分離と塩基配列化
mCsx/Nkx2.5コーディングとフランキング塩基配列を含む2個のλ
phageゲノムDNAクローンは、λ DASH IIの129匹マウスゲノム
ライブラリから分離された。クローン1は、mCsx/Nkx2.5コーディン
グ部位の一部および5’ フランキング部位14kbを含む。クロン2は、5‘
フランキング部位6kbとmCsx/Nkx2.5コーディング部位および3’
フランキング部位6kbを含んだ。また、mCsx/Nkx2.5コーディン
グ配列および5‘と3’ フランキング塩基配列10kb以上を含むマウスP1
クローン(Genome Systems, St. Louis, MO)が分離された。一般の手法を用いて
制限酵素マッピングと一連のサザンブロッティング法を実施した。
phageゲノムDNAクローンは、λ DASH IIの129匹マウスゲノム
ライブラリから分離された。クローン1は、mCsx/Nkx2.5コーディン
グ部位の一部および5’ フランキング部位14kbを含む。クロン2は、5‘
フランキング部位6kbとmCsx/Nkx2.5コーディング部位および3’
フランキング部位6kbを含んだ。また、mCsx/Nkx2.5コーディン
グ配列および5‘と3’ フランキング塩基配列10kb以上を含むマウスP1
クローン(Genome Systems, St. Louis, MO)が分離された。一般の手法を用いて
制限酵素マッピングと一連のサザンブロッティング法を実施した。
【0064】
mRNA 5’末端の定義
前述した方法をやや変形して5‘レースを実施した(Reecy et al., Dev. Biol
. 188:295-311, 1997)。第一cDNA鎖の合成反応は3週となったマウスの心臓
から得た層RNA 5μgと50mM Tris−HCl (pH 8.3)、
75mM KCl、3mM MgCl2、10uM DTT、40U RNas
e inhibitor(Promega)、各0.5mM deoxynuc
leotide、200U M−MLV逆転写酵素(Life technologies、Gaithe
rsburg、MD)を含む40μl溶液内に含まれた100ngランダムプライマー(Pr
omega、Madison、WI)を使用して37℃で90分間実施した。cDNAは5μg
RNase A(Ambion、Austin、TX)と培養した後、QIAQUICK(登録
商標)PCR精製カラム(QIAGEN、Santa Clara、CA)を使用して精製した。Ligat
ion-anchored PCRはAli Ansari-Lari et al.(BioTechniques 21:34-36, 1996
)が発表したものを一部 変形して実施した。最初に3nmolの3’amino-modified 5
’phosphorylated anchor primer(5’-TCT CTA CTC CGA ATT CCG TCG TCC ACA C
CT-3’; SEQ ID NO:7)は 50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1mM hexamine
cobalt chloride、20uM ATP、 25% PEG 800の含まれた50μl反応液で20U T4
RNA ligase(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いて精製された第一cDN
A鎖の半分までend ligateして、16℃で24時間培養した。Anchor-ligated
cDNAはQUIAQUICK PCR精製カラムを使用してさらに精製した。
第一PCRは精製されたanchor-ligated cDNA 10分の1とanchor特異的
プライマー(5’-AGG TGT GGA CGA CGG AAT TCG GAG TAG AGA-3’; SEQ ID NO:8)
、およびCsx/Nkx2.5特異的プライマー(5’-GGG GGC GGC TGG GAA AGC AGG AGA G
CA CTT-3’; SEQ ID NO:9)を使用して実施した。PCR条件は次のようである:
94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリング、72℃で2分間伸長を30
周期施したし、30周期が終わると、72℃で5分間追加培養した。次のPCR
反応はPCR産物各々5μlとnested anchor primer(5’-CGA CGG AAR TCG GAG
TAG AGA-3’;SEQ ID NO:10)およびCsx/Nkx2.5特異的プライマーs(5’-TTG AAG
GCG GCC AGC ATG CAG GAG GCA-3’(SEQ ID NO:11)または5’-ACA GGA GCG ACG G
GC AGT TCT GCG T-3’ (SEQ ID NO:12)のうち一つを使用して前記と同一なPC
R条件で実施した。PCR産物はethidium bromideが含有された2%寒天ゲル上
で確認されたし、その次にサブクローニングして塩基配列化した。
. 188:295-311, 1997)。第一cDNA鎖の合成反応は3週となったマウスの心臓
から得た層RNA 5μgと50mM Tris−HCl (pH 8.3)、
75mM KCl、3mM MgCl2、10uM DTT、40U RNas
e inhibitor(Promega)、各0.5mM deoxynuc
leotide、200U M−MLV逆転写酵素(Life technologies、Gaithe
rsburg、MD)を含む40μl溶液内に含まれた100ngランダムプライマー(Pr
omega、Madison、WI)を使用して37℃で90分間実施した。cDNAは5μg
RNase A(Ambion、Austin、TX)と培養した後、QIAQUICK(登録
商標)PCR精製カラム(QIAGEN、Santa Clara、CA)を使用して精製した。Ligat
ion-anchored PCRはAli Ansari-Lari et al.(BioTechniques 21:34-36, 1996
)が発表したものを一部 変形して実施した。最初に3nmolの3’amino-modified 5
’phosphorylated anchor primer(5’-TCT CTA CTC CGA ATT CCG TCG TCC ACA C
CT-3’; SEQ ID NO:7)は 50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1mM hexamine
cobalt chloride、20uM ATP、 25% PEG 800の含まれた50μl反応液で20U T4
RNA ligase(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いて精製された第一cDN
A鎖の半分までend ligateして、16℃で24時間培養した。Anchor-ligated
cDNAはQUIAQUICK PCR精製カラムを使用してさらに精製した。
第一PCRは精製されたanchor-ligated cDNA 10分の1とanchor特異的
プライマー(5’-AGG TGT GGA CGA CGG AAT TCG GAG TAG AGA-3’; SEQ ID NO:8)
、およびCsx/Nkx2.5特異的プライマー(5’-GGG GGC GGC TGG GAA AGC AGG AGA G
CA CTT-3’; SEQ ID NO:9)を使用して実施した。PCR条件は次のようである:
94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリング、72℃で2分間伸長を30
周期施したし、30周期が終わると、72℃で5分間追加培養した。次のPCR
反応はPCR産物各々5μlとnested anchor primer(5’-CGA CGG AAR TCG GAG
TAG AGA-3’;SEQ ID NO:10)およびCsx/Nkx2.5特異的プライマーs(5’-TTG AAG
GCG GCC AGC ATG CAG GAG GCA-3’(SEQ ID NO:11)または5’-ACA GGA GCG ACG G
GC AGT TCT GCG T-3’ (SEQ ID NO:12)のうち一つを使用して前記と同一なPC
R条件で実施した。PCR産物はethidium bromideが含有された2%寒天ゲル上
で確認されたし、その次にサブクローニングして塩基配列化した。
【0065】
プライマー伸長によるexons 1bおよび1c検出
マウス心臓poly(A) RNA 5μgサンプルを2×104 cpm end-labeled、gel-purif
ied oligonucleotide probe(5’-CGG AGC ACC AGG GGC AGA AGA GGC-3’;SEQ ID
NO:13)でcoprecipitateした。サンプルはアニーリング・バッファ(0.1M NaCl、
0.01M、pH 8.0、0.001M EDTA)10μlに再懸濁して、85℃で5分間加熱した
し、37℃で2時間培養した。20μl逆転写バッファ(10mM DTT、16mM MgCl2
、1mM dNTP、1U/μl RNasin、0.1M Tris、pH 8.0)および20U Supers
cript(登録商標)逆転写酵素(Life Technologies)を各々のサンプルに加
えた。逆転写は40℃で1時間進行されるようにし、各サンプル7.5μlを同
量のformamide loading バッファと混合した。95℃で5分間変性の後、各サン
プル7μlを8% denaturing polyacrylamideゲル上にロード(load)させた。
電気泳動の後にゲルを乾燥した後、フィルムに露出させた。
ied oligonucleotide probe(5’-CGG AGC ACC AGG GGC AGA AGA GGC-3’;SEQ ID
NO:13)でcoprecipitateした。サンプルはアニーリング・バッファ(0.1M NaCl、
0.01M、pH 8.0、0.001M EDTA)10μlに再懸濁して、85℃で5分間加熱した
し、37℃で2時間培養した。20μl逆転写バッファ(10mM DTT、16mM MgCl2
、1mM dNTP、1U/μl RNasin、0.1M Tris、pH 8.0)および20U Supers
cript(登録商標)逆転写酵素(Life Technologies)を各々のサンプルに加
えた。逆転写は40℃で1時間進行されるようにし、各サンプル7.5μlを同
量のformamide loading バッファと混合した。95℃で5分間変性の後、各サン
プル7μlを8% denaturing polyacrylamideゲル上にロード(load)させた。
電気泳動の後にゲルを乾燥した後、フィルムに露出させた。
【0066】
RT−PCRによるexon 1aの検出
製造プロトコルにしたがってrTth DNAポリメラーゼ(rTth RT-RNA PCR
kit; Perkin Elmer、Branchburg、NJ)を使用してRT−PCRを実施した。Exo
n 1c特異的プライマー(5’-ACA GGA GCG ACG GGC AGT TCT GCG T-3’; SEQ ID N
O:14)を用いて逆転写を実施したし、製造instructionにしたがってaxon 1a特異
的プライマー(5’-GAG TGC TCT GCC TGA TGA TC-3’;SEQ ID NO:15)をRT反応に
加えて順次的なPCR反応を実施した。PCR反応は95℃で10秒間変性と5
5℃で15秒間アニーリング/伸長を35周期施し、35周期が終わると55℃
で7分追加最終伸長で構成された。PCR産物はethidium bromideで3%寒天ゲ
ル上で表され、32P end-labeled exon 1b特異的プライマー(5’-CCA GTC TAG
AAG CGG TGA TCG CCA-3’;SEQ ID NO:16)を用いてSouthern analysisを実施した
。
kit; Perkin Elmer、Branchburg、NJ)を使用してRT−PCRを実施した。Exo
n 1c特異的プライマー(5’-ACA GGA GCG ACG GGC AGT TCT GCG T-3’; SEQ ID N
O:14)を用いて逆転写を実施したし、製造instructionにしたがってaxon 1a特異
的プライマー(5’-GAG TGC TCT GCC TGA TGA TC-3’;SEQ ID NO:15)をRT反応に
加えて順次的なPCR反応を実施した。PCR反応は95℃で10秒間変性と5
5℃で15秒間アニーリング/伸長を35周期施し、35周期が終わると55℃
で7分追加最終伸長で構成された。PCR産物はethidium bromideで3%寒天ゲ
ル上で表され、32P end-labeled exon 1b特異的プライマー(5’-CCA GTC TAG
AAG CGG TGA TCG CCA-3’;SEQ ID NO:16)を用いてSouthern analysisを実施した
。
【0067】
レポーター遺伝子コンストラクトsの製造、形質変換マウスの生成および分析
pnlacFからのXba I -Pst I lacZ cassette (Bonnerot et al., Proc. Natl Ac
ad. Sci. USA 84: 6795-6799, 1987)を pBluescript SK-(Stratagene)の Xba I
と Pst I 部位にサブクローニングし、遺伝子mCsx/Nkx2.5 DNA部位はlacZ ca
ssette 5’または3’にクローニングした。CsxlacZ-1 コンストラクトはNot I s
iteとATGコドンの間にあるintron 2の大部分とexon 1cの始めを含む遺伝子配
列3.3kbを含んだ(図1)。CsxlacZ-2 コンストラクトを製造するためにexon 1cの
一部、intron 3、およびexon 2の一部を含めているXho I -Pst I 断片をCsxlacZ
-1内lacZ 遺伝子の3’にサブクローニングした (図 1)。CsxlacZ-3 コンストラ
クトは Csx/Nkx2.5の Spe I siteとATG コドンの間の4kb fragmentを含み、
intron 1の 一部と exon 1b、 intron 2およびexon 1cの一部を含む(図 1)。Csx
lacZ-4およびCsxlacZ-5はlacZ遺伝子の上部とcloneされたCsx/Nkx2.5 genom
ic 塩基配列の5’ 上部の6kbと14kbを各々含む。CsxlacZ-6を製造する
ために6kb長さの3’下部ゲノム断片をCsxlacZ-1のlacZ 遺伝子3’に融合し
た(図1)。
ad. Sci. USA 84: 6795-6799, 1987)を pBluescript SK-(Stratagene)の Xba I
と Pst I 部位にサブクローニングし、遺伝子mCsx/Nkx2.5 DNA部位はlacZ ca
ssette 5’または3’にクローニングした。CsxlacZ-1 コンストラクトはNot I s
iteとATGコドンの間にあるintron 2の大部分とexon 1cの始めを含む遺伝子配
列3.3kbを含んだ(図1)。CsxlacZ-2 コンストラクトを製造するためにexon 1cの
一部、intron 3、およびexon 2の一部を含めているXho I -Pst I 断片をCsxlacZ
-1内lacZ 遺伝子の3’にサブクローニングした (図 1)。CsxlacZ-3 コンストラ
クトは Csx/Nkx2.5の Spe I siteとATG コドンの間の4kb fragmentを含み、
intron 1の 一部と exon 1b、 intron 2およびexon 1cの一部を含む(図 1)。Csx
lacZ-4およびCsxlacZ-5はlacZ遺伝子の上部とcloneされたCsx/Nkx2.5 genom
ic 塩基配列の5’ 上部の6kbと14kbを各々含む。CsxlacZ-6を製造する
ために6kb長さの3’下部ゲノム断片をCsxlacZ-1のlacZ 遺伝子3’に融合し
た(図1)。
【0068】
CsxlacZ-1,-2,-3,および~6のmicroinjectionのために各コンストラクトのlacZ
cassette部分とともにmCsx/Nkx2.5 ゲノム塩基配列をXho I とNot Iを用いてベ
クターから切り取って、ゲル電気泳動と Geneclean III(Bio101、 Vista、 CA)
で精製した。Microinjectionを準備のために、CsxlacZ-4とCsxlacZ-5をXho I に線形化(linearize)した後、前述した方法で精製した。形質転換マウスの製作
は標準化された方法(Hogan et al. (1994) Manipulating the マウス Embryo. C
old Spring Harbor Laboratory Press、 New York)を用いて行った。
cassette部分とともにmCsx/Nkx2.5 ゲノム塩基配列をXho I とNot Iを用いてベ
クターから切り取って、ゲル電気泳動と Geneclean III(Bio101、 Vista、 CA)
で精製した。Microinjectionを準備のために、CsxlacZ-4とCsxlacZ-5をXho I に線形化(linearize)した後、前述した方法で精製した。形質転換マウスの製作
は標準化された方法(Hogan et al. (1994) Manipulating the マウス Embryo. C
old Spring Harbor Laboratory Press、 New York)を用いて行った。
【0069】
一時的な形質転換を分析するために、 F0胚芽をE10.5に解剖した。順
次的なgenotypingは卵黄嚢 (yolk sac)から分離された染色体DNAをPCRし
て施した。形質転換検出に使用されたPCRプライマー対は次のようである: Cs
xlacZ-1、 -2、 -3には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)
と 5’-TCT GCT CTT CGT TGG CTG ATG-3’ (SEQ ID NO:18) ; および CsxlacZ-4
、 -5には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)と5’-TTA AGT
TGG GTA ACG CCA GGG-3’ (SEQ ID NO:19) ; およびCsxlacZ-6には5’-AAC TTG
CTA GGT AGA CTA GGC TGG C-3’ (SEQ ID NO:20)と5’-TCT GCT CTT CGT TGG C
TG ATG-3’ (SEQ ID NO:18)である。
次的なgenotypingは卵黄嚢 (yolk sac)から分離された染色体DNAをPCRし
て施した。形質転換検出に使用されたPCRプライマー対は次のようである: Cs
xlacZ-1、 -2、 -3には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)
と 5’-TCT GCT CTT CGT TGG CTG ATG-3’ (SEQ ID NO:18) ; および CsxlacZ-4
、 -5には5’-CCG TCC GAT GAA AAA CAG GAG-3’ (SEQ ID NO:17)と5’-TTA AGT
TGG GTA ACG CCA GGG-3’ (SEQ ID NO:19) ; およびCsxlacZ-6には5’-AAC TTG
CTA GGT AGA CTA GGC TGG C-3’ (SEQ ID NO:20)と5’-TCT GCT CTT CGT TGG C
TG ATG-3’ (SEQ ID NO:18)である。
【0070】
Whole-mount β−gal染色はSchlaeger et al.方法によって実施した。(Dev
elopment 121 : 1089-1098, 1995)。Whole mountsの写真撮影の後に、胚芽をgra
dedエタノールとxyleneを用いて脱水し、パラフィンに陥没(embed)した後、断片
化(sectioned)して、Nuclear Fast Red (ベクター Laboratories、 Burlingame
、 CA)で対照染色した。
elopment 121 : 1089-1098, 1995)。Whole mountsの写真撮影の後に、胚芽をgra
dedエタノールとxyleneを用いて脱水し、パラフィンに陥没(embed)した後、断片
化(sectioned)して、Nuclear Fast Red (ベクター Laboratories、 Burlingame
、 CA)で対照染色した。
【0071】
CsxlacZ-1とCsxlacZ-5を有するマウス linesの製造(generation)
CsxlacZ-1とCsxlacZ-5のために、マウスの形質転換linesを確立した。各々の
形質転換遺伝子を有するF0マウスはFVBマウスと逆交配させたし、lacZ 発
現のためにF1 胚芽を実験した。各々のコンストラクトのために形質転換マウ
スの1世代(1 line)を同定し、E7.5、E8.25、E9.5、E15.5と成体を 含む他の時間
帯別にこれらを分析した。
形質転換遺伝子を有するF0マウスはFVBマウスと逆交配させたし、lacZ 発
現のためにF1 胚芽を実験した。各々のコンストラクトのために形質転換マウ
スの1世代(1 line)を同定し、E7.5、E8.25、E9.5、E15.5と成体を 含む他の時間
帯別にこれらを分析した。
【0072】
Csx/Nkx2.5 knock-outとlacZ knock-in マウスの製造 (generation)
mCsx/Nkx2.5の全体コーディング部分は標準化された方法 (Hogan et al., sup
ra)で相同組換え(homologous recombination)によってlacZ- neomycin抵抗性遺
伝子 (Neo)cassetteで交替された。
ra)で相同組換え(homologous recombination)によってlacZ- neomycin抵抗性遺
伝子 (Neo)cassetteで交替された。
【0073】
In situ hybridization
In situ hybridizationは前述した方法の通り実施した(Tanaka et al., Dev.
Genet. 22 : 239-249,1998).要するに、胚芽は4℃で一晩中4% formaldehydeで固
定させ、パラフィンに陥没させた。組織断片を55℃で35S-labeled Csx/Nkx2.5
cRNA probeとhybridizeし、洗浄した後、RNase Aで処理した。Emulsion autora
diographyした後に、断片をhematoxylinとeosinで対照染色した。
Genet. 22 : 239-249,1998).要するに、胚芽は4℃で一晩中4% formaldehydeで固
定させ、パラフィンに陥没させた。組織断片を55℃で35S-labeled Csx/Nkx2.5
cRNA probeとhybridizeし、洗浄した後、RNase Aで処理した。Emulsion autora
diographyした後に、断片をhematoxylinとeosinで対照染色した。
【0074】実施例2: hCsx/Nkx2.5プロモーターと心臓-特異的因子の分離
本発明者らは、radiolabel hCsx/Nkx2.5 cDNA probesを用いてλ FIX II
ゲノムライブラリ(Stratagene)からhCsx/Nkx2.5の一番目のexonとintronの一部
だけでなく、約17kb上部のフランキング塩基配列を含む略20kb長さのゲ
ノムクローンをクローニングした。Cardiac enhancerを狭めていくために、20
kbクローンの上部フランキング塩基配列の諸部位をlacZレポーターの結合され
たhsp68プロモーターであるhsp68-lacZ (Kothary et al., Development 105:707
-714 1989)に融合した (図3〜5、図16)。このようなコンストラクトの発現
様態は心臓特異性を有するエンハンサー部位を定義するために形質転換マウスを
用いてテストした。
ゲノムライブラリ(Stratagene)からhCsx/Nkx2.5の一番目のexonとintronの一部
だけでなく、約17kb上部のフランキング塩基配列を含む略20kb長さのゲ
ノムクローンをクローニングした。Cardiac enhancerを狭めていくために、20
kbクローンの上部フランキング塩基配列の諸部位をlacZレポーターの結合され
たhsp68プロモーターであるhsp68-lacZ (Kothary et al., Development 105:707
-714 1989)に融合した (図3〜5、図16)。このようなコンストラクトの発現
様態は心臓特異性を有するエンハンサー部位を定義するために形質転換マウスを
用いてテストした。
【0075】
各々のコンストラクトはサブクローニングされたフランキング塩基配列の5’
末端で直ぐ線形化されたし、フェノール:クロロホルム(1:1)とクロロホル
ムで各々一度ずつ抽出して、アルコールに沈殿させ、脱イオン水で再浮遊させた
後、0.22μm孔径のマイクロフィルタユニット(Eppendorf 5 prime、Boulder、C
O)を用いてろ過した。一時的な形質転換分析のために、F0胚芽は各々E9.5
またはE10.5に集めて、ホルムアルデヒドで固定させ、PBSで洗浄した後
、β-ガラクトシダーゼ発現を検査した。Genotypingは卵黄嚢から分離したchrom
osomal DNAをPCRして確認した。全身胚芽はX−galを含むバッファで
30℃で12〜14時間培養した後、lacZ陽性胚芽の写真を撮った。最終的
にlacZ染色陽性胚芽はパラフィン陥没、断片化して、ヌクレアファストレッ
ド(Nuclear fast Red)を利用して対照染色した。形質転換マウスの一部は全体胚
芽で(E7.5日とE12.5日)または心臓(出生後3日)で確認された(図1
7〜図19)。
末端で直ぐ線形化されたし、フェノール:クロロホルム(1:1)とクロロホル
ムで各々一度ずつ抽出して、アルコールに沈殿させ、脱イオン水で再浮遊させた
後、0.22μm孔径のマイクロフィルタユニット(Eppendorf 5 prime、Boulder、C
O)を用いてろ過した。一時的な形質転換分析のために、F0胚芽は各々E9.5
またはE10.5に集めて、ホルムアルデヒドで固定させ、PBSで洗浄した後
、β-ガラクトシダーゼ発現を検査した。Genotypingは卵黄嚢から分離したchrom
osomal DNAをPCRして確認した。全身胚芽はX−galを含むバッファで
30℃で12〜14時間培養した後、lacZ陽性胚芽の写真を撮った。最終的
にlacZ染色陽性胚芽はパラフィン陥没、断片化して、ヌクレアファストレッ
ド(Nuclear fast Red)を利用して対照染色した。形質転換マウスの一部は全体胚
芽で(E7.5日とE12.5日)または心臓(出生後3日)で確認された(図1
7〜図19)。
【0076】
前述したコンストラクトを利用した形質転換研究結果、胚芽発生の間E7.5に心
臓半月で、E9.5に第一鰓弓(first branchial arch)と心臓で、E12.5日
に流出管を含む心臓の4個の心室/心房でmCsx/Nkx2.5と非常に類似した発現様態
を表す約7.5kb長さのエンハンサー塩基配列を同定した。また、E12.5
に胃部位でlacZの弱い発現があった。しかし、3日となったマウスでhCsx/N
kx2.5の7.5kb上部フランキング塩基配列のエンハンサー活性は内因性マウス遺伝
子で観察されたものと異なる発現パターンを見せた。7.5kb hCsx/Nkx2.5 エンハ
ンサー-hsp68プロモーター-lacZは右心室で活性があるが、心房や左心室では活
性がない。
臓半月で、E9.5に第一鰓弓(first branchial arch)と心臓で、E12.5日
に流出管を含む心臓の4個の心室/心房でmCsx/Nkx2.5と非常に類似した発現様態
を表す約7.5kb長さのエンハンサー塩基配列を同定した。また、E12.5
に胃部位でlacZの弱い発現があった。しかし、3日となったマウスでhCsx/N
kx2.5の7.5kb上部フランキング塩基配列のエンハンサー活性は内因性マウス遺伝
子で観察されたものと異なる発現パターンを見せた。7.5kb hCsx/Nkx2.5 エンハ
ンサー-hsp68プロモーター-lacZは右心室で活性があるが、心房や左心室では活
性がない。
【0077】
本発明者らはhCsx/Nkx2.5の7.5kbエンハンサー部位を塩基配列化したし、(図
6〜12)マウスとヒトCsx/Nkx2.5エンハンサーの間に高い塩基配列相同性部位
を発見した(図3〜5、図13、図14)。hCsx/Nkx2.5心臓エンハンサーの相同
性ドメイン(homology domains A1、A2)が各々分離されているとき、いずれの部
分でもエンハンサー活性を示さなかった。しかし、中間に挟んでいる非相同性塩
基配列を除去して再接合(relegate)する場合、心臓エンハンサー活性は回復され
、これは、相同性部位のいずれも心臓エンハンサー活性に必要であるというのを
意味する。このような類似した塩基配列でGATA4、MEF2C、dHAND
、SRE、E−box、Sp−1、TGF−b反応因子およびCsx/Nkx2.5結合部
位のような心臓発生に重要な幾つかの推定転写因子結合部位を発見した。
6〜12)マウスとヒトCsx/Nkx2.5エンハンサーの間に高い塩基配列相同性部位
を発見した(図3〜5、図13、図14)。hCsx/Nkx2.5心臓エンハンサーの相同
性ドメイン(homology domains A1、A2)が各々分離されているとき、いずれの部
分でもエンハンサー活性を示さなかった。しかし、中間に挟んでいる非相同性塩
基配列を除去して再接合(relegate)する場合、心臓エンハンサー活性は回復され
、これは、相同性部位のいずれも心臓エンハンサー活性に必要であるというのを
意味する。このような類似した塩基配列でGATA4、MEF2C、dHAND
、SRE、E−box、Sp−1、TGF−b反応因子およびCsx/Nkx2.5結合部
位のような心臓発生に重要な幾つかの推定転写因子結合部位を発見した。
【0078】実施例3. 幹細胞から心臓細胞への分化および精製への心臓特異的エンハンサー 因子の利用
幹細胞(例、胚芽幹(ES)細胞および骨髄幹細胞)は心臓細胞に分化が誘導
され得る。マウスES細胞が心臓細胞に分化されるとき、内因性mCsx/Nkx2.5が
発現される。したがって、本発明のエンハンサー因子また心臓細胞に分化される
全種類の幹細胞で活性を表すものである(図20)。
され得る。マウスES細胞が心臓細胞に分化されるとき、内因性mCsx/Nkx2.5が
発現される。したがって、本発明のエンハンサー因子また心臓細胞に分化される
全種類の幹細胞で活性を表すものである(図20)。
【0079】
心臓細胞への誘導最適化
前述した如く、最近の、幹細胞から心臓細胞への分化を誘導する方法は効率が
低い。かかる側面から、本発明は、心臓細胞誘導の効率を最適化する方法を特徴
とする。例えば、幹細胞グループはプロモーターおよび心臓特異的エンハンサー
と機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクターによって変換され
る(例えば、GFP、β-ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼを暗
号化する遺伝子)。その後、心臓細胞分化は一つ以上の誘導方法によって誘導さ
れる。レポーター遺伝子発現は適切な時間に測定される:多数或いは高い比率の
レポーター陽性細胞を得る方法が心臓細胞を誘導する好適な方法として定義され
る。レポーター遺伝子発現は心臓細胞誘導を確認するが、最近使用される拍動表
現形質に先行されるため、現在の方法は以前の方法よりさらに短期間で、そして
低廉なコストで実施されることができる。
低い。かかる側面から、本発明は、心臓細胞誘導の効率を最適化する方法を特徴
とする。例えば、幹細胞グループはプロモーターおよび心臓特異的エンハンサー
と機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクターによって変換され
る(例えば、GFP、β-ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼを暗
号化する遺伝子)。その後、心臓細胞分化は一つ以上の誘導方法によって誘導さ
れる。レポーター遺伝子発現は適切な時間に測定される:多数或いは高い比率の
レポーター陽性細胞を得る方法が心臓細胞を誘導する好適な方法として定義され
る。レポーター遺伝子発現は心臓細胞誘導を確認するが、最近使用される拍動表
現形質に先行されるため、現在の方法は以前の方法よりさらに短期間で、そして
低廉なコストで実施されることができる。
【0080】
心臓細胞の選択または分類
幹細胞から分化される心臓細胞の数が極少ないため、本発明はまた、心臓細胞
を選択する方法(非心臓細胞の除去)を特徴とする。この方法の一例として、選別
可能なマーカー(例えば、ネオマイシン)を暗号化する遺伝子は心臓細胞エンハン
サー-プロモーターコンストラクトと機能的に連係されている。このようなコン
ストラクトは幹細胞に導入されるか、または幹細胞を分離した動物から形質転換
動物(例えば、形質転換マウスまたは豚)を生産するに使用され得る。心臓細胞分
化誘導の後適切な時間に選択(selection)を実施する。選択過程で、非心臓細胞
は死ぬことになり、結果的に心臓細胞は多くなる。さらに、幹細胞の一部は誘導
前にCsx/Nkx2.5を発現することもできる。これら細胞は心臓細胞を生産する可能
性がさらに高い。したがって、他の一例で前述した選択過程は誘導段階前に実施
する。
を選択する方法(非心臓細胞の除去)を特徴とする。この方法の一例として、選別
可能なマーカー(例えば、ネオマイシン)を暗号化する遺伝子は心臓細胞エンハン
サー-プロモーターコンストラクトと機能的に連係されている。このようなコン
ストラクトは幹細胞に導入されるか、または幹細胞を分離した動物から形質転換
動物(例えば、形質転換マウスまたは豚)を生産するに使用され得る。心臓細胞分
化誘導の後適切な時間に選択(selection)を実施する。選択過程で、非心臓細胞
は死ぬことになり、結果的に心臓細胞は多くなる。さらに、幹細胞の一部は誘導
前にCsx/Nkx2.5を発現することもできる。これら細胞は心臓細胞を生産する可能
性がさらに高い。したがって、他の一例で前述した選択過程は誘導段階前に実施
する。
【0081】
かかる側面から、本発明は、心臓細胞または心臓細胞生産可能性が高い幹細胞
を分離する方法を特徴とする。この例で、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝
子は生きている細胞の同定を可能にするレポーター遺伝子(例えば、GFP)と代替
されるのを除いて、このコンストラクトは前述におけると同様である。レポータ
ー遺伝子陽性細胞は適切な方法(例えば、蛍光標示式細胞分取)を用いてレポータ
ー遺伝子陰性細胞と区分して同定することができる。前述した法でのように分類
段階は誘導段階の前や後に実施され得る。
を分離する方法を特徴とする。この例で、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝
子は生きている細胞の同定を可能にするレポーター遺伝子(例えば、GFP)と代替
されるのを除いて、このコンストラクトは前述におけると同様である。レポータ
ー遺伝子陽性細胞は適切な方法(例えば、蛍光標示式細胞分取)を用いてレポータ
ー遺伝子陰性細胞と区分して同定することができる。前述した法でのように分類
段階は誘導段階の前や後に実施され得る。
【0082】
心臓細胞分化増大
幾つかの遺伝子(例えば、BMP2/4、Wnt family of genes、dHAND、eHAND、MEF-
2C、GATA4、SRF、p300、IRX4およびCsx/Nkx2.5)は心臓形成と関連している。か
かる心臓形成遺伝子の一部はCsx/Nkx2.5より先に発現されるに対し、他のものは
Csx/Nkx2.5と同時にまたは後で発現される。これらの一時的な発現に関わらず、
ここで言及する心臓特異的エンハンサーの制御下で前述した遺伝子のうち一つの
発現は、心臓細胞分化を増大させる(つまり、心臓細胞の分化促進、心臓細胞含
量増加、またはその両方とも)。したがって、本発明は、心臓特異的エンハンサ
ー因子の調節下で心臓形成遺伝子の発現による幹細胞群からの心臓細胞分化の増
大方法を特徴とする。この方法も、心臓細胞分化が誘導される段階を含む(例え
ば、5-アザシチジンの誘導による)。
2C、GATA4、SRF、p300、IRX4およびCsx/Nkx2.5)は心臓形成と関連している。か
かる心臓形成遺伝子の一部はCsx/Nkx2.5より先に発現されるに対し、他のものは
Csx/Nkx2.5と同時にまたは後で発現される。これらの一時的な発現に関わらず、
ここで言及する心臓特異的エンハンサーの制御下で前述した遺伝子のうち一つの
発現は、心臓細胞分化を増大させる(つまり、心臓細胞の分化促進、心臓細胞含
量増加、またはその両方とも)。したがって、本発明は、心臓特異的エンハンサ
ー因子の調節下で心臓形成遺伝子の発現による幹細胞群からの心臓細胞分化の増
大方法を特徴とする。この方法も、心臓細胞分化が誘導される段階を含む(例え
ば、5-アザシチジンの誘導による)。
【0083】実施例4. 遺伝子治療のための心臓特異的エンハンサー因子の利用
治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を心臓細胞に導入する遺伝子治療法の利
用は、インビボまたはex vivoで施され得る。したがって、かかる側面から、本
発明は、本発明の心臓特異的エンハンサーと機能的に連係された治療用タンパク
質を暗号化する遺伝子を含むDNAベクターを心臓細胞に導入することによって
インビボで患者の心臓細胞を変形する方法を提供する。核酸分子は溶液またはそ
の他の薬理学的に適合な投与形態に提供される。DNAベクターは心臓に直接投
与するのがより好ましいが、全身投与してもよい。
用は、インビボまたはex vivoで施され得る。したがって、かかる側面から、本
発明は、本発明の心臓特異的エンハンサーと機能的に連係された治療用タンパク
質を暗号化する遺伝子を含むDNAベクターを心臓細胞に導入することによって
インビボで患者の心臓細胞を変形する方法を提供する。核酸分子は溶液またはそ
の他の薬理学的に適合な投与形態に提供される。DNAベクターは心臓に直接投
与するのがより好ましいが、全身投与してもよい。
【0084】
細胞の核酸吸収を向上させるための様々な運搬方法が知られている。有用な運
搬システムは仙台ウィルスリポソーム(Sendai virus-liposome)運搬システム(Ra
paport and Shai, J. Biol. Chem. 269: 15124-15131,1994)、陽イオンリポソー
ム(cationic liposomes)、polymeric運搬ゲルまたはマトリック(matrices)、多
孔性風船カテーテル(Shi et al., Circulation 90:955-951,1994;およびShi et
al., Gene Therapy 1:408-414,1994)、管腔内圧力(PCT/US96/06271、参考文献参
照)、レトロウイルス発現ベクター(retrovirus expression vector)などを含む
。
搬システムは仙台ウィルスリポソーム(Sendai virus-liposome)運搬システム(Ra
paport and Shai, J. Biol. Chem. 269: 15124-15131,1994)、陽イオンリポソー
ム(cationic liposomes)、polymeric運搬ゲルまたはマトリック(matrices)、多
孔性風船カテーテル(Shi et al., Circulation 90:955-951,1994;およびShi et
al., Gene Therapy 1:408-414,1994)、管腔内圧力(PCT/US96/06271、参考文献参
照)、レトロウイルス発現ベクター(retrovirus expression vector)などを含む
。
【0085】
運搬媒介体としてリポソームを利用するのは、関心を引いている特別な方法の
一つである。リポソームは目標部位の細胞と融和されて内容物を細胞内に運搬す
る。上述の如く、リポソームは同定および結合剤のような多様な方法を用いて融
和のための充分なる時間の間細胞と接触状態を保持する。リポソームは仙台ウィ
ルスまたはインフルエンザウィルスなどのような膜の融和を媒介する精製された
タンパク質やペプチドとともに準備され得る。脂質は、例えば、ホスファチジル
コリンのような陽イオン脂質を含む脂質を形成する公知のリポソームの有用な組
合であり得る。残余脂質は、普通、コレステロール、 ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロールのような中性脂質である。
一つである。リポソームは目標部位の細胞と融和されて内容物を細胞内に運搬す
る。上述の如く、リポソームは同定および結合剤のような多様な方法を用いて融
和のための充分なる時間の間細胞と接触状態を保持する。リポソームは仙台ウィ
ルスまたはインフルエンザウィルスなどのような膜の融和を媒介する精製された
タンパク質やペプチドとともに準備され得る。脂質は、例えば、ホスファチジル
コリンのような陽イオン脂質を含む脂質を形成する公知のリポソームの有用な組
合であり得る。残余脂質は、普通、コレステロール、 ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロールのような中性脂質である。
【0086】
リポソームはKato et al. (J. Biol. Chem. 266:3361,1991)が記述した方法で
用意できる。この方法は、高分子量の分子、特に、1キロベース対以上の核酸を
ルーメン内に統合させ得るようにする。このような方法でDNAベクターが効率
的に細胞に流入され得る。
用意できる。この方法は、高分子量の分子、特に、1キロベース対以上の核酸を
ルーメン内に統合させ得るようにする。このような方法でDNAベクターが効率
的に細胞に流入され得る。
【0087】
他の側面から、細胞群(または、器官)は患者や供与動物から除去して、生体外
(ex vivo)でDNAベクターを挿入して変形した後、患者に再移植するか、他
の受容者に移植することができる。例えば、心臓組織に細胞を移植する方法はP
CT WO 98/54301に記述されている。一例に、幹細胞を患者から得
、培養して数を増やした後、ここに述べた通り、心臓細胞への分化を誘導するこ
とになる。この方法を行っているいずれの時にも、治療用遺伝子を暗号化する遺
伝子を含めたDNAベクターは細胞内に導入され得る。これらの細胞は患者に移
植されるか、同種または異種の他の受容者に移植され得る。
(ex vivo)でDNAベクターを挿入して変形した後、患者に再移植するか、他
の受容者に移植することができる。例えば、心臓組織に細胞を移植する方法はP
CT WO 98/54301に記述されている。一例に、幹細胞を患者から得
、培養して数を増やした後、ここに述べた通り、心臓細胞への分化を誘導するこ
とになる。この方法を行っているいずれの時にも、治療用遺伝子を暗号化する遺
伝子を含めたDNAベクターは細胞内に導入され得る。これらの細胞は患者に移
植されるか、同種または異種の他の受容者に移植され得る。
【0088】
供与種は、受容種と同種であって、異種であって可能であり、適合な細胞(例
えば、心臓細胞に分化できる幹細胞)を提供できる種であればいい。供与者は受
容者の同種や異種になり得る。できるなら受容者は霊長類のような哺乳動物の方
がいい。また、受容者はヒトが最も好ましく。ヒトが受容者の場合、供与者とし
ては豚(異種)やヒト(同種)のいずれでもよく、また、他の哺乳類(例えば、牛ま
たは非ヒト霊長類)もいい。例えば、豚大動脈内皮細胞(PAEC)やその祖先細胞は
、ヒト需要者に移植するために、治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を効果を
示す水準に発現するように操作され得る。
えば、心臓細胞に分化できる幹細胞)を提供できる種であればいい。供与者は受
容者の同種や異種になり得る。できるなら受容者は霊長類のような哺乳動物の方
がいい。また、受容者はヒトが最も好ましく。ヒトが受容者の場合、供与者とし
ては豚(異種)やヒト(同種)のいずれでもよく、また、他の哺乳類(例えば、牛ま
たは非ヒト霊長類)もいい。例えば、豚大動脈内皮細胞(PAEC)やその祖先細胞は
、ヒト需要者に移植するために、治療用タンパク質を暗号化する遺伝子を効果を
示す水準に発現するように操作され得る。
【0089】
異種DNAは単一細胞段階や初期桑実胚段階で動物や動物の祖先細胞(ancesto
r)に挿入され得る。この過程は2細胞期と8細胞期の間で起こってもいいが、単
一細胞段階の方がさらにいい。これによって形質転換動物が作製され、これらは
異種DNAを子孫に伝えるものとなる。
r)に挿入され得る。この過程は2細胞期と8細胞期の間で起こってもいいが、単
一細胞段階の方がさらにいい。これによって形質転換動物が作製され、これらは
異種DNAを子孫に伝えるものとなる。
【0090】
また、遺伝子伝達は、移植前細胞の生体外(ex vivo)形質導入を使用する同
種移植の時、または豚変換(transgenesis)が形成された異種移植で施行され得る
。形質転換豚を準備する方法は、Loganが発表した論文(Curr. Opin. Immunol. 1
2: 563-568,2000)と本発明で引用した参考文献によく記載されている。全ての形
質転換動物が本発明に利用され得る;豚は、特にヒト受容者に異種移植させ易い
ので特に好適である。形質転換豚は同種組換えと野生形遺伝子機能を破壊する技
術などで生産できる。例えば、形質前変換豚は所望のタンパク質を発現する形質
転換動物を生産する同種組換え技術を用いて生産され得る。
種移植の時、または豚変換(transgenesis)が形成された異種移植で施行され得る
。形質転換豚を準備する方法は、Loganが発表した論文(Curr. Opin. Immunol. 1
2: 563-568,2000)と本発明で引用した参考文献によく記載されている。全ての形
質転換動物が本発明に利用され得る;豚は、特にヒト受容者に異種移植させ易い
ので特に好適である。形質転換豚は同種組換えと野生形遺伝子機能を破壊する技
術などで生産できる。例えば、形質前変換豚は所望のタンパク質を発現する形質
転換動物を生産する同種組換え技術を用いて生産され得る。
【0091】
遺伝子伝達のために多様なベクターやプラスミドが有用である(Maniatis et a
l. (1989) Molecular cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.
Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publi
shing Associates, New York, V. 1&2 1996; Harlow and Lane Antibodies, A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998、参考文献に利用)。
ここに記述された一般のベクターは一時的または安定的に普通、少なくとも1日
、さらに一般には少なくとも数日以上平滑筋細胞で保持される。
l. (1989) Molecular cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.
Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publi
shing Associates, New York, V. 1&2 1996; Harlow and Lane Antibodies, A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998、参考文献に利用)。
ここに記述された一般のベクターは一時的または安定的に普通、少なくとも1日
、さらに一般には少なくとも数日以上平滑筋細胞で保持される。
【0092】
レトロウィルスベクター(例えば、レンチウイルス(lentivirus))と、特にレト
ロウィルス複製に要求される一つ以上のgag、pol、env塩基配列が不足な複製欠
損レトロウィルスベクターは文献を通じてよく知られており、内皮細胞や他の哺
乳類細胞を形質転換するために使用され得る。PA317細胞やhelper-freeウィルス
ベクターを生産する他の生産細胞(producer cell)ラインは文献によく記述され
ている。代表的なレトロウィルスコンストラクトは、少なくとも一つのウィルス
末端の長い反復配列(viral long terminal repeat)と治療物質のヌクレオチド塩
基配列の上部プロモーター塩基配列および少なくとも一つのウィルス末端の長い
反復配列と塩基配列の下部のポリアデニル化信号(polyadenylation signal)で構
成される。
ロウィルス複製に要求される一つ以上のgag、pol、env塩基配列が不足な複製欠
損レトロウィルスベクターは文献を通じてよく知られており、内皮細胞や他の哺
乳類細胞を形質転換するために使用され得る。PA317細胞やhelper-freeウィルス
ベクターを生産する他の生産細胞(producer cell)ラインは文献によく記述され
ている。代表的なレトロウィルスコンストラクトは、少なくとも一つのウィルス
末端の長い反復配列(viral long terminal repeat)と治療物質のヌクレオチド塩
基配列の上部プロモーター塩基配列および少なくとも一つのウィルス末端の長い
反復配列と塩基配列の下部のポリアデニル化信号(polyadenylation signal)で構
成される。
【0093】
アデノウィルス、つまりヒトに上気道疾患を誘発し、霊長類で潜状感染時に存
在するウィルスから由来したベクターは当該分野で公知のものであり、本発明で
有用である。低い周囲温度でアデノウィルスの細胞付着能は、組織と器官を冷凍
(cold)保存する間遺伝子伝達を促進する移植条件において有利である。また、形
質導入還流による血管や器官へのアデノウィルス媒介遺伝子伝達もインビボで細
胞を操作する手段である。
在するウィルスから由来したベクターは当該分野で公知のものであり、本発明で
有用である。低い周囲温度でアデノウィルスの細胞付着能は、組織と器官を冷凍
(cold)保存する間遺伝子伝達を促進する移植条件において有利である。また、形
質導入還流による血管や器官へのアデノウィルス媒介遺伝子伝達もインビボで細
胞を操作する手段である。
【0094】
受容種への移植に先立って、処理された細胞はコンストラクトを含み、発現す
る変形細胞のためにスクリーンされ得る。こういう目的からDNAベクターにも
選別可能なマーカー物質に耐性を表す発現物質を暗号化する2次ヌクレオチド塩
基配列が提供される。スクリーニングのための好適な選別マーカーはネオマイシ
ンやネオマイシンアナログであるG418耐性を表すネオ遺伝子(neo-gene)を
含む。全ての哺乳類細胞は遺伝子挿入のための標的になり得るが、操作(manipul
ation)のために選好される細胞は幹細胞である。
る変形細胞のためにスクリーンされ得る。こういう目的からDNAベクターにも
選別可能なマーカー物質に耐性を表す発現物質を暗号化する2次ヌクレオチド塩
基配列が提供される。スクリーニングのための好適な選別マーカーはネオマイシ
ンやネオマイシンアナログであるG418耐性を表すネオ遺伝子(neo-gene)を
含む。全ての哺乳類細胞は遺伝子挿入のための標的になり得るが、操作(manipul
ation)のために選好される細胞は幹細胞である。
【0095】
ここで言及された全ての資料(publications)は参考文献として含まれている。
【図1】
形質転換実験で使用されたマウスのCsx/Nkx2.5(mCsx/Nkx2.5)遺伝子座(locus)
コンストラクト(construct)の構造を表す図である。Open boxとshaded boxは各
々解読されなかった塩基配列およびコーディング塩基配列を表す。2種のλ pha
ge clonesの多様なsubfragmentsは形質転換遺伝子の製造に使用された(CsxlacZ-
1〜CsxlacZ-6)。
コンストラクト(construct)の構造を表す図である。Open boxとshaded boxは各
々解読されなかった塩基配列およびコーディング塩基配列を表す。2種のλ pha
ge clonesの多様なsubfragmentsは形質転換遺伝子の製造に使用された(CsxlacZ-
1〜CsxlacZ-6)。
【図2】
実験したmCsx/Nkx2.5コンストラクトを有する心臓でのLacZ発現様態を表
す図。
す図。
【図3】
ヒトCsx/Nkx2.5(hCsx/Nkx2.5)とmCsx/Nkx2.5の配列図であって、exon 1のAT
Gから5’側に約9kb程度の塩基配列である。Shaded areaは相同的(homology
)ドメインA1(上)とA2の位置を表す。また、転写因子結合部位の位置も表
されている。
Gから5’側に約9kb程度の塩基配列である。Shaded areaは相同的(homology
)ドメインA1(上)とA2の位置を表す。また、転写因子結合部位の位置も表
されている。
【図4】
exon 1のATGから5’側に約3kb程度のmCsx/Nkx2.5とhCsx/Nkx2.5塩基配
列の配列図である。この配列内には相同的ドメインB(SEQ ID NO.:
6)がある。
列の配列図である。この配列内には相同的ドメインB(SEQ ID NO.:
6)がある。
【図5】
mCsx/Nkx2.5とhCsx/Nkx2.5のゲノム構造を表す図である。相同的ドメインA−
Dが表されている。相同的ドメインA内にヒト塩基配列はmCsx/Nkx2.5と同一性
のない塩基配列によって中間が切れてある。
Dが表されている。相同的ドメインA内にヒト塩基配列はmCsx/Nkx2.5と同一性
のない塩基配列によって中間が切れてある。
【図6】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜7.5kb、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列(続きあり)を表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列(続きあり)を表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図7】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜7.5kb、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図8】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜7.5kb、SEQ ID No.:4のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図9】 hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜7.5kb、SEQ ID No.:4のヌクレ
オチド塩基配列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
オチド塩基配列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図10】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜6.8kb、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列(続きあり)を表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列(続きあり)を表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図11】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜6.8kb、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図12】
hCsx/Nkx2.5ゲノム配列の〜6.8kb、SEQ ID No.:5のヌクレオチド塩基配
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
列の続きを表し、ゲノム位置は図16に表されている。
【図13】
mCsx/Nkx2.5相同的ドメインA1(SEQ ID No.:1)とA2(SEQ ID NO.:2)のヌク
レオチド塩基配列を表す。
レオチド塩基配列を表す。
【図14】
hCsx/Nkx2.5相同的ドメインA1とA2のヌクレオチド塩基配列およびmCsx/Nk
x2.5と対応される部分のない部位の塩基配列を表す。
x2.5と対応される部分のない部位の塩基配列を表す。
【図15】
hCsx/Nkx2.5相同的ドメインB(SEQ ID No.:6)のヌクレオチド塩基配列を表す
。
。
【図16】
心臓特異的発現のために実験されたhCsx/Nkx2.5エンハンサー因子の形質転換
コンストラクトを表す図である。また、SEQ ID No.:4とSEQ ID No.:5の位置も表
されている。
コンストラクトを表す図である。また、SEQ ID No.:4とSEQ ID No.:5の位置も表
されている。
【図17】
hCsx/Nkx2.5エンハンサー因子の形質転換遺伝子分析を要約した表である。こ
れと相応するコンストラクトは図16に表されている。
れと相応するコンストラクトは図16に表されている。
【図18】
表示されたエンハンサー-hsp68-lacZコンストラクトによってマウスで形質転
換遺伝子が発現するのを表す一連の写真である。
換遺伝子が発現するのを表す一連の写真である。
【図19】
7.5kbエンハンサー-hsp68-lacZコンストラクトによってマウスで形質転換遺伝
子が発現するのを表す一連の写真である。
子が発現するのを表す一連の写真である。
【図20】
心臓細胞の生産および精製を促進するために心臓特異的エンハンサー因子の多
様な利用を示す図である。
様な利用を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/50 C12N 5/00 B
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK
,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,
GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J
P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ
,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
Fターム(参考) 2G045 AA40 BA13 BA14 BB03 BB20
BB22 BB24 CB01 CB26 DA12
DA13 DA14 FB05
4B024 AA01 AA11 BA21 CA03 EA04
FA02 FA06 FA10 HA17
4B063 QA20 QQ08 QQ13 QQ44 QR33
QR77 QR80 QS38
4B065 AA90X AA91X AB01 BA02
BA25 CA24 CA44 CA46
Claims (43)
- 【請求項1】 下記のエンハンサー因子を含む本質的に精製された核酸分子
: (a)SEQ ID NO.:1またはSEQ ID NO.:3に示される
核酸分子のうち40個の連続したヌクレオチドと100%の同一性を有するもの
; (b)SEQ ID NO.:2に示される核酸分子のうち50個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも91%の同一性を有するもの; (c)SEQ ID NO.:1またはSEQ ID NO.:3に示される
核酸分子のうち60個の連続したヌクレオチドと少なくとも97%の同一性を有
するもの;または (d)SEQ ID NO.:1またはSEQ ID NO.:3に示される
核酸分子のうち70個の連続したヌクレオチドと少なくとも95%の同一性を有
するもの。 - 【請求項2】 前記因子が天然に生成される、請求項1に記載の核酸分子。
- 【請求項3】 前記因子が非天然に生成される、請求項1に記載の核酸分子
。 - 【請求項4】 前記核酸分子が、Mef2、dHAND、GATA、TGF
−β、CarG、E−box、およびCsx/Nkx2.5結合部位からなる群
から選択された結合部位を含む、請求項1に記載の核酸分子。 - 【請求項5】 前記核酸分子が、前記群から選択された少なくとも2個の結
合部位を含む、請求項4に記載の核酸分子。 - 【請求項6】 前記核酸分子がSp−1結合部位をさらに含んでなる、請求
項4に記載の核酸分子。 - 【請求項7】 前記核酸分子が、プロモーターと機能的に連係されるとき心
臓細胞特異的方法でプロモーターの活性を少なくとも2倍以上増加させる、請求
項1に記載の核酸分子。 - 【請求項8】 ヒト由来の本質的に精製された核酸分子において、該核酸分
子は、SEQ ID No.:1、SEQ ID NO.:2、またはSEQ
ID NO.:3に示される核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少
なくとも60%の同一性を有する心臓特異的エンハンサー因子を含む核酸分子。 - 【請求項9】 前記因子が、SEQ ID NO.:1、SEQ ID N
O.:2、またはSEQ ID NO.:3に示される核酸分子のうち50個の
連続したヌクレオチドと少なくとも70%の同一性を有する、請求項8に記載の
核酸分子。 - 【請求項10】 前記因子が、SEQ ID NO.:1、SEQ ID
NO.:2、またはSEQ ID NO.:3に示される核酸分子のうち50個
の連続したヌクレオチドと少なくとも80%の同一性を有する、請求項8に記載
の核酸分子。 - 【請求項11】 前記因子が、SEQ ID NO.:1、SEQ ID
NO.:2、またはSEQ ID NO.:3に示される核酸分子のうち50個
の連続したヌクレオチドと少なくとも95%の同一性を有する、請求項8に記載
の核酸分子。 - 【請求項12】 前記因子が天然に生成される、請求項8に記載の核酸分子
。 - 【請求項13】 前記因子が非天然に生成される、請求項8に記載の核酸分
子。 - 【請求項14】 前記核酸分子が、Mef2、dHAND、GATA、TG
F−β、CarG、E−box、およびCsx/Nkx2.5結合部位からなる
群から選択された結合部位を含む、請求項8に記載の核酸分子。 - 【請求項15】 前記核酸分子が前記群から選択された少なくとも2個の結
合部位を含む、請求項14に記載の核酸分子。 - 【請求項16】 前記核酸分子がSp−1結合部位をさらに含むことを特徴
とする請求項14に記載の核酸分子。 - 【請求項17】 Mef2、dHAND、GATA、TGF−β、CarG
、E−box、およびCsx/Nkx2.5結合部位から選択された少なくとも
3個の転写因子結合部位を含む、本質的に精製された非天然に生成された核酸分
子。 - 【請求項18】 前記核酸分子が、Mef2、dHAND、GATA、TG
F−β、CarG、E−box、およびCsx/Nkx2.5結合部位から選択
された少なくとも4個の転写因子結合部位を含む、請求項17に記載の核酸分子
。 - 【請求項19】 前記核酸分子が、Mef2、dHAND、GATA、TG
F−β、CarG、E−box、およびCsx/Nkx2.5結合部位から選択
された少なくとも5個の転写因子結合部位を含む、請求項17に記載の核酸分子
。 - 【請求項20】 前記核酸分子が、プロモーターと機能的に連係されるとき
心臓細胞特異的方法でプロモーターの活性を少なくとも2倍以上増加させる、請
求項17に記載の核酸分子。 - 【請求項21】 下記のエンハンサー因子を含む本質的に精製された核酸分
子: (a)SEQ ID NO.:6に示される核酸分子のうち50個の連続した
ヌクレオチドと100%の同一性を有するもの; (b)SEQ ID NO.:6に示される核酸分子のうち60個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも97%の同一性を有するもの; (c)SEQ ID NO.:6に示される核酸分子のうち70個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも93%の同一性を有するもの;または (d)SEQ ID NO.:6に示される核酸分子のうち100個の連続し
たヌクレオチドと少なくとも90%の同一性を有するもの。 - 【請求項22】 ヒト由来の本質的に精製された核酸分子において、該核酸
分子は、SEQ ID No.:6に示される核酸分子のうち50個の連続した
ヌクレオチドと少なくとも45%の同一性を有する心臓特異的エンハンサー因子
を含む核酸分子。 - 【請求項23】 前記因子が、SEQ ID NO.:6に示される核酸分
子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも50%の同一性を有する、
請求項22に記載の核酸分子。 - 【請求項24】 前記因子が、SEQ ID NO.:6に示される核酸分
子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも60%の同一性を有する、
請求項22に記載の核酸分子。 - 【請求項25】 前記因子が、SEQ ID NO.:6に示される核酸分
子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも75%の同一性を有する、
請求項22に記載の核酸分子。 - 【請求項26】 前記因子が、SEQ ID NO.:6に示される核酸分
子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも90%の同一性を有する、
請求項22に記載の核酸分子。 - 【請求項27】 前記因子が天然に生成される請求項22に記載の核酸分子
。 - 【請求項28】 前記因子が非天然に生成される請求項22に記載の核酸分
子。 - 【請求項29】 SEQ ID NO.:4またはSEQ ID NO.:
5核酸分子のうち50個の連続したヌクレオチドと少なくとも90%同一な塩基
配列を有する50個の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、本質的に
精製された核酸分子。 - 【請求項30】 請求項1、8、21、22、または29の核酸分子を含む
DNAベクター。 - 【請求項31】 関心のある遺伝子と機能的に連係されたプロモーターをさ
らに含む請求項30に記載のDNAベクター。 - 【請求項32】 前記関心のある遺伝子が、心臓形成遺伝子、レポーター遺
伝子、選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子、または治療用タンパク質を暗号
化する遺伝子である、請求項31に記載のDNAベクター。 - 【請求項33】 前記心臓形成遺伝子が、BMP2、BMP4、GATA4
、dHAND、eHAND、MEF2C、SRFまたはCsx/Nkx2.5で
ある、請求項32に記載のDNAベクター。 - 【請求項34】 前記レポーター遺伝子が、GFP、lacZ、アルカリ・
ホスホターゼ、クロランフェニコル・アセチル・トランスフェラーゼ、またはル
シフェラーゼである、請求項32に記載のDNAベクター。 - 【請求項35】 前記選別可能なマーカーが、ネオマイシン、カナマイシン
、またはハイグロマイシンである、請求項32に記載のDNAベクター。 - 【請求項36】 前記治療用タンパク質が、成長因子、サイトカイン、アン
チ・アポトーシス因子、プロ・アポトーシス因子、または心臓の機能や再生を向
上させるタンパクである、請求項32に記載のDNAベクター。 - 【請求項37】 下記を含む、細胞を心筋細胞に誘導する方法: (a) 該細胞やその祖先細胞(ancestor)内に、(i)請求項1、8、21、22、ま
たは29の核酸分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロモーターと機
能的に連係された心臓形成遺伝子を含むDNAベクターを導入する;そして、 (b) 該プロモーターと機能的に連係された心臓形成遺伝子の発現を誘導する条件
下で、該心臓形成遺伝子の発現を心臓特異的エンハンサー因子と結合させて心臓
形成遺伝子発現を増大させることによって該細胞を培養する。 - 【請求項38】 心臓細胞で特異的に遺伝子を発現させる方法において、該
方法が、該細胞やその祖先細胞に、(i)請求項1、8、21、22、または29
の核酸分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロモーターと機能的に連
係された遺伝子を含むDNAベクターを導入することを含み、これにより、心臓
細胞では該遺伝子が発現され、心臓細胞でない細胞では該遺伝子が発現されない
ようにする方法。 - 【請求項39】 下記を含む、幹細胞から心臓細胞を生成するか、または心
臓細胞になるように誘導する方法の効率性を測定する方法: (a)該幹細胞の一つまたはその祖先細胞内に、(i)請求項1、8、21、2
2、または29の核酸分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロモ
ーターと機能的に連係された遺伝子であるレポーター遺伝子を含むDNAベクタ
ーを導入し; (b)該幹細胞の少なくとも一部が心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるよう
に潜在的に誘導する方法を行う;そして (c)レポーター遺伝子−陽性である細胞の数や含量を測定するが、ここで、数
や含量が高いほど、幹細胞が心臓細胞を生成するか、または心臓細胞になるよう
に誘導する方法の効率性がさらに高くなる。 - 【請求項40】 下記を含む、幹細胞から心臓細胞を生成するか、または心
臓細胞になるように誘導する方法の効率性を測定する方法: (a)該幹細胞の一つまたはその祖先細胞内に、(i)請求項1、8、21、2
2、または29の核酸分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロモ
ーターと機能的に連係された選別可能なマーカーを暗号化する遺伝子を含むDN
Aベクターを導入し; (b)該幹細胞の少なくとも一部が心臓細胞を生成するか、心臓細胞になるよう
に潜在的に誘導する方法を行い; (c)薬物の選択を実施するが、ここで、該選別可能なマーカーを暗号化する遺
伝子を発現する細胞は該薬物の存在下にて生存する可能性があり、該選別可能な
マーカーを暗号化する遺伝子を発現しない細胞は該薬物の存在下にて生存する可
能性はない;そして、 (d)薬物選択の後、細胞の生存を測定すが、ここで、生存率が高いほど、幹細
胞から心臓細胞が生成されるか、または心臓細胞になるように誘導する方法の効
率性がさらに高くなる。 - 【請求項41】 細胞を心臓細胞として同定する方法において、該方法は、
該細胞やその祖先細胞内に、(i)請求項1、8、21、22、または29の核酸
分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロモーターと機能的に連係され
たレポーター遺伝子を含むDNAベクターを導入することを含むが、ここで、該
細胞が心臓細胞ならこの細胞は該レポーター遺伝子を発現させ、該細胞が心臓細
胞でなければ、該細胞は該レポーター遺伝子を発現させない方法。 - 【請求項42】 前記細胞がイン・ビトロである、請求項41に記載の方法
。 - 【請求項43】 下記を含む、異種細胞集合体から心臓細胞を本質的に精製
する方法: (a)該細胞集合体やその祖先細胞の最小細胞芽集団に、(i)請求項1、8、
21、22または29の核酸分子、(ii)プロモーター、および(iii)該プロ
モーターと機能的に連係されたレポーター遺伝子を含むDNAベクターを導入し
、これにより、該細胞が心臓細胞ならば該細胞は該レポーター遺伝子を発現させ
、該細胞が心臓細胞でなければ該細胞は該レポーター遺伝子を発現させることは
ない;そして、 (b)異種細胞集合体で細胞が該レポーター遺伝子を発現するか否かを決定する
が、ここで、該細胞が該レポーター遺伝子を発現するならば、該細胞は該異種細
胞集合体から精製される。
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