JP2003529774A - 遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法 - Google Patents

遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法

Info

Publication number
JP2003529774A
JP2003529774A JP2001573038A JP2001573038A JP2003529774A JP 2003529774 A JP2003529774 A JP 2003529774A JP 2001573038 A JP2001573038 A JP 2001573038A JP 2001573038 A JP2001573038 A JP 2001573038A JP 2003529774 A JP2003529774 A JP 2003529774A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
microarray
target molecule
polynucleotide
probe
silane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001573038A
Other languages
English (en)
Inventor
ロウ，デービッド，ジー．
ジェームズ，シー．，ジュニア． マースターズ
ロビー，エドワード，ピー．，
スミス，ヴィクトリア
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of JP2003529774A publication Critical patent/JP2003529774A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
    • C03C17/34—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions
    • C03C17/3405—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions with at least two coatings of organic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00378—Piezo-electric or ink jet dispensers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00385—Printing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00427—Means for dispensing and evacuation of reagents using masks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B01J2219/00529—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00677—Ex-situ synthesis followed by deposition on the substrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Abstract

(57)【要約】 核酸マイクロアレイ分析における検出感度を向上させる組成物及び方法が開示され、核酸を精製する方法、蛍光ＤＮＡプローブを合成する方法、ハイブリダイゼーションの方法、並びに標識分子結合のための基板を活性化する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） この発明は、遺伝子の研究と診断への応用のために核酸マイクロアレイを使用
して遺伝子の発現、遺伝子の多型又は遺伝子の変異を検出し定量するための構成
物及び方法に関する。
【０００２】 （背景） しばしば何千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、例えば同一の型の
正常な組織に対しての病変組織での遺伝子の発現の差異を特定するために有用で
ある。核酸マイクロアレイを使用して、試験及びコントロール組織からの試験及
びコントロールｍＲＮＡを逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを産生する。つ
いで、固体支持体上に固定化した核酸のアレイにプローブをハイブリダイズさせ
る。アレイは、アレイの各メンバーの位置と配列が既知であるように構成される
。例えば、ある種の疾患状態で発現される可能性がある遺伝子の選択物を固体支
持体上に配列できる。特定のアレイメンバーとの標識プローブのハイブリダイゼ
ーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現していることを示して
いる。病変組織の遺伝子発現の差異の分析は貴重な情報を提供しうる。例えば、
試験（病変組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションがコントロール
（正常組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションよりも大であると、
病変組織において発現された遺伝子又は遺伝子群が潜在的な薬物標的の重要な診
断指標となりうる。
【０００３】 検出感度は、疾患を伴う遺伝子発現、遺伝子多型、又は遺伝子変異が認識され
うるように試験試料対コントロール試料を効果的に分析するための制限要因であ
る。ＤＮＡマイクロアレイを使用するヒト遺伝子の研究では、多くの疾患状態の
成功裏の分析には限られた試料量で高感度の検出が可能になることが要求される
。
【０００４】 （概要） 本発明は、正常な組織に対する病変組織、異なった発達段階の組織間、個体間
、及び類似の比較においての遺伝子の発現、遺伝子の多型、又は遺伝子の突然変
異のような遺伝子の差異の検出がここに開示した構成物と方法によって改善され
るという発見に関する。本構成物と方法は、支持体表面上の標的分子と成分（又
はその等価物）との間に形成された特定の複合体の量を決定することにより、細
胞の成分の相対量を定量するために有用であり、ここで成分とは核酸（ポリヌク
レオチドＤＮＡ又はＲＮＡを含む）、ポリペプチド、タンパク質、抗体等々であ
る。例えば、成分が第一の生物学的試料と第二の生物学的試料からのポリヌクレ
オチドの混合物であり、標的分子が既知の又は知ることができる核酸配列である
場合、複合体は標的分子と第一及び／又は第二のポリヌクレオチドの間のハイブ
リダイゼーション複合体である。成分は、複合体が互いに区別可能で、複合体の
相対量が第二の生物学的試料に対して第一の生物学的試料中に存在する成分の量
の測定値として決定されうるように検出可能なプローブとして標識されるのが好
ましい。
【０００５】 一側面では、本発明はマイクロアレイに関する。本発明のマイクロアレイは、
固体支持体基板上の、支持体基板上のアレイ内の既知か、知ることができるか又
は決定可能な位置にある別個のスポットに配列された標的分子を含む。スポット
とは、標的分子を含む溶液を基板に接触させた結果、支持体基板に結合される標
的分子の領域を意味する。好ましくは、各スポットはそれらが複合体形成の検出
の際に互いに区別可能なように基板上のそれぞれの他のスポットとは十分に分離
している。本発明のマイクロアレイは少なくとも１スポット／ｃｍ２、２０スポ
ット／ｃｍ２、５０スポット／ｃｍ２、１００スポット／ｃｍ２、及び少なくと
も３００スポット／ｃｍ２、１０００スポット／ｃｍ２、３０００スポット／ｃ
ｍ２、１００００スポット／ｃｍ２、３００００スポット／ｃｍ２、１００００
０スポット／ｃｍ２、３０００００スポット／ｃｍ２又は利用できる技術が可能
になれば更に多くのものを含む更に大なる密度を含む。好ましくは、本発明のマ
イクロアレイは少なくとも２０００スポット／ｃｍ２から２５０００スポット／
ｃｍ２を含む。
【０００６】 一実施態様では、本発明は固体支持体基板上のバイオポリマーのマイクロアレ
イに関し、ここで基板はシラン処理され、シラン処理は溶媒としてのトルエン中
で、アセトン又はアルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、
ブタノール等々）の不在下でシラン処理剤を用いてなされる。好適な実施態様で
は、シラン処理剤はオルガノシランであり、溶媒トルエンは実質的に無水（ドラ
イ）であり、ここで無水化は当該分野で知られている標準的な技術による。オル
ガノシランは、ケイ素原子とバイオポリマー又は本発明において有用な他のリン
カー分子上の官能性と共有結合を形成可能な反応性官能基との間にアルキル又は
アリールリンカーを有する任意のオルガノシランでありうる。好ましくは、オル
ガノシランのアルキル又はアリールリンカーは１から２０炭素原子長、好ましく
は１から１５、最も好ましくは２から６炭素原子である。関連した実施態様では
、オルガノシランは直接に又は他のリンカー分子を介して間接にバイオポリマー
に共有結合により結合可能な官能基を含む。オルガノシラン上の官能基は例えば
エポキシド、ハライド、チオール、又は第１級アミンでありうる（例えば米国特
許第６０４８６９５号；米国特許第５７６０１３０号；国際公開第０１／０６０
１１号；２０００年１１月２３日公開の国際公開第００／７００８８号を参照）
。本発明を実施するために有用なオルガノシランは、例えば３-アミノプロピル
トリエトキシシラン（ＡＰＳ）である（例えば、国際公開第０１／０６０１１号
；国際公開第００／４０５９３号；米国特許第５７６０１３０号；及びWeiler等
, Nucleic Acids Research 25(14):2792-2799 (1997)を参照のこと）。この実施
態様では、本発明は基板に共有結合的に結合したバイオポリマーを含むマイクロ
アレイに関し、ここで基板はシラン処理剤でシラン処理され、基板はアセトン又
はアルコール、例えばメタノールの不在下でトルエン中のシラン処理剤と反応さ
せられる。
【０００７】 他の実施態様では、本発明は、基板へのバイオポリマーの共有結合は間接的で
あり、例えばリンカー分子を介するマイクロアレイに関する。よって、この実施
態様では、本発明はシラン処理基板に結合したバイオポリマーを含むマイクロア
レイに関し、ここでマイクロアレイは基板結合シランとバイオポリマーの間にリ
ンカー分子を含む。関連した実施態様では、マイクロアレイはバイオポリマー、
シラン処理剤、多官能性リンカー試薬及び基板を含み、ここでバイオポリマーは
多官能性リンカー試薬に結合され、多官能性リンカー試薬はバイオポリマーとシ
ラン処理剤に結合され、シラン処理剤はアセトン又はアルコールの不在下でトル
エン中の反応によって基板に結合される。好ましくは、バイオポリマーと多官能
性リンカー試薬の間の結合は共有的である。好ましくは、多官能性リンカー試薬
とシラン処理剤との間の結合は共有的である。好ましくは、基板はガラスであり
、シラン処理剤と基板の間の反応が共有結合を形成する。好適な実施態様では、
結合は、共有的であろうと非共有的であろうと、複合体形成、洗浄工程、及びマ
イクロアレイ分析の検出工程の間にアレイ内のその元のスポットにバイオポリマ
ーが残るように十分に強い。アレイハイブリダイゼーション反応における核酸と
オリゴヌクレオチドの非共有結合の例については、例えば国際公開第０１／０６
０１１号を参照のこと。
【０００８】 関連した実施態様では、本発明のマイクロアレイは、アセトン又はアルコール
の不在下でトルエン中のシラン処理剤でガラスのような基板をシラン処理し、つ
いで基板に結合したシラン処理剤の反応性官能基をバイオポリマーと反応させて
基板に結合したバイオポリマーを産生することを含む方法によって作製される。
好ましくは、バイオポリマーは基板結合シラン処理剤との反応前には未修飾であ
る。あるいは、バイオポリマーは、基板結合シラン処理剤の官能基と反応する反
応性官能基で修飾される。
【０００９】 関連した実施態様では、本発明のマイクロアレイは、アセトン又はアルコール
の不在下でトルエン中のシラン処理剤でガラスのような基板をシラン処理し、つ
いで基板に結合したシラン処理剤を、多官能性リンカー試薬とその官能基の一つ
で反応させ、ついで官能基の他のものをバイオポリマーと反応させることを含む
方法によって作製される。好ましくは、バイオポリマーは基板-シラン処理剤-多
官能性リンカー試薬結合の多官能性リンカー試薬との反応前には未修飾である。
場合によっては、バイオポリマーは、基板-シラン処理剤-多官能性リンカー試薬
結合の多官能性リンカー試薬の反応性官能基と反応する反応性官能基で修飾され
る。バイオポリマーは対象のバイオポリマーに適した任意の方法によって修飾さ
れてもよい。例えば、バイオポリマーがポリヌクレオチドである場合は、反応性
官能基はその合成中かそれが合成された後にポリヌクレオチド中に導入されうる
。ここに開示された非限定的な例では、第１級アミンが、誘導体化核酸プライマ
ーとしてポリヌクレオチド中に導入される反応性官能基である。好ましくは、多
官能性リンカー試薬は基板表面上で対応する官能基と供給結合を形成するように
適合化され、標的分子上で対応する官能基と共有結合を形成するように適合化さ
れた二以上のペンダント化学反応性基（官能基）を有している。
【００１０】 関連した実施態様では、マイクロアレイスライドの基板表面は、シラン処理剤
で、また場合によっては標的分子を固定化するためのマイクロアレイスライドを
活性化させる多官能性リンカー試薬で、誘導体化され、ここで、活性化は、（１
）好ましくはアセトン又はアルコール（例えばメタノール）の不在下で、トルエ
ンに入ったオルガノシランで表面をシラン処理し、ここでオルガノシランは多官
能性リンカー試薬と反応性の官能性を有し、活性化が、多官能性リンカー試薬の
第一のペンダント反応性基とオルガノシランの反応性官能基を共有結合的に反応
させることによって、シラン処理された表面上へ多官能性リンカー試薬を固定化
することをさらに含み；（２）固定化された多官能性リンカー試薬の第二のペン
ダント反応性基と反応性の一又は複数の官能基を有する標的分子を含む溶液を提
供し；（３）活性化された基板表面に標的分子を接触させ、固定化された多官能
性リンカー試薬の第二のペンダント反応性基と標的分子の官能基が共有結合を形
成するようにすることにより、標的分子を基板表面に結合させることを含む。
【００１１】 本発明の一実施態様では、マイクロアレイの標的分子は、核酸、例えばＲＮＡ
のポリヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、ペプ
チド核酸（ＰＮＡ）で骨格がリボース又はデオキシリボース骨格よりもむしろポ
リペプチド骨格であるもの、ポリペプチド、タンパク質、抗体、レセプター、リ
ガンド、又は他の分子と複合体を形成するその能力によって検出可能な類似の分
子、検出可能な複合体形成剤である。ポリヌクレオチドは５ヌクレオチド長から
１０ｋｂまでで１０ｋｂを含みうる。好ましくは、ポリヌクレオチドは約１００
ｂｐから５ｋｂ、より好ましくは０．３ｋｂから３ｋｂ、更により好ましくは約
０．５ｋｂから２ｋｂである。標的ポリヌクレオチドがＰＣＲ増幅二本鎖ＤＮＡ
である実施態様では、長さは好ましくは０．５から約２ｋｂである。標的ポリヌ
クレオチドが化学的に合成されたオリゴヌクレオチドである実施態様では、長さ
は好ましくは約５０−１０００ヌクレオチド、５０−５００ヌクレオチド、５０
−２００ヌクレオチド、５０−１００ヌクレオチドである。
【００１２】 他の実施態様では、本発明は結合標的分子が修飾ポリヌクレオチドであり修飾
が天然ポリマーに対するアミンの付加である本発明のマイクロアレイに関する。
好ましくは、アミンは第１級アミンであり、好ましくはポリヌクレオチドの５’
末端にあるが、ポリヌクレオチドの調製の制約条件又はマイクロアレイアッセイ
の必要性に応じて、他の場所に導入してもよい。反応性基、例えば第１級アミン
がポリヌクレオチドの５’末端にあることが好ましい場合には、第１級アミンは
第１級アミン修飾ポリヌクレオチドを産生するように酵素的に伸展させられるプ
ライマーの一部でありうる。 更に他の実施態様では、本発明のマイクロアレイの基板表面は、ポリマー材料
、ガラス、セラミック、天然繊維、ナイロン及びニトロセルロース膜、ゲル、シ
リコン、金属、及びその複合体からなる群から選択される材料を含む。好ましく
は、基板はガラス、より好ましくはガラススライドである。好ましくは、マイク
ロアレイ基板はこれらの材料の少なくとも一つを含む少なくとも一つの平坦な平
面を有する。場合によっては、基板は繊維、シート、フィルム、ゲル、膜、ビー
ズ、プレート、及び類似の構造体の形態である。
【００１３】 他の実施態様では、本発明のマイクロアレイは、 プリンティング、キャピラ
リーデバイスコンタクトプリンティング、マイクロフルイドチャンネルプリンテ
ィング、マスクへの付着、及び電気化学的プリンティングからなる群からの技術
によって活性化された基板に標的分子を接触させることによって作製され、ここ
で、接触が基板上に離散した標的分子含有スポットを作り出す（特定のアレイ形
成方法については例えば米国特許第５７００６３７号、米国特許第５４４５９３
４号及び米国特許第５８０７５２２号を、アレイ製作の検討についてはCheung,
V. G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照のこと）。様々な更
なる接触技術が当該分野でよく知られており、あるいは固体支持体へ標的分子を
付着させるために開発されてもよい。好ましくは、正確で、効率的で使用者にと
って経済的である技術が選択される。標的分子が修飾又は未修飾のポリヌクレオ
チドである好適な実施態様では、標的ポリヌクレオチドは溶液中で基板に接触さ
せられ、ここで溶液中の標的ポリヌクレオチドの濃度は好ましくは０．１μｇ／
μｌから３μｇ／μｌまでで３μｇ／μｌを含む範囲である。溶液のｐＨは約ｐ
Ｈ６−１０、好ましくは約ｐＨ６．５−９．７、より好ましくは約ｐＨ７−９．
４の範囲にある。好ましくは、標的ポリヌクレオチド溶液は更に５００ｍＭの塩
化ナトリウム、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．３を含む。好ましくは
、標的バイオポリマーが本発明に係る条件下で基板に接触させられると、反応は
速やかで、好ましくは１時間以内、３０分以内、１０分以内、又は５分以内であ
る。標的ポリヌクレオチドが活性化スライドとより長い間反応するようにすると
検出感度が改善されることをが本発明の一部として発見された。例えば、標的ポ
リヌクレオチドが第１級アミン官能基を有する二本鎖又は一本鎖ｃＤＮＡであり
、活性化されたスライドが本発明によって作製される場合、スポッティングされ
たスライドは、ハイブリダイゼーション及び検出手順の準備のために、未反応標
的分子と他のスポッティング溶液成分を除去するべくスライドを洗浄する前に、
１−２４時間、好ましくは約５−１８時間、より好ましくは約１０−１６時間、
更により好ましくは約１２−１４時間、周囲温度と湿度に放置される。
【００１４】 実施態様では、本発明はまた表面上の未反応の活性官能基（例えば未反応シラ
ン処理剤及び／又は未反応多官能性リンカー試薬）をブロックすることを含む。
本発明で有用なブロック反応は水でスライドを洗浄することを含む。 他の側面では、本発明はまた活性化されたマイクロアレイスライドに関し、こ
こで「スライド」という用語は少なくとも一つの実質的に平坦な表面を有する固
体支持体を意味し、「活性化された」なる用語は本発明に係る修飾又は未修飾の
標的バイオポリマーと反応して標的バイオポリマーを表面上に、例えば共有又は
非共有結合によって、固定化させることが可能なスライド上の反応性基の存在を
意味する。好ましくは、活性化されたスライドは、シラン処理がアセトン又は例
えばメタノールのようなアルコールの不在下でトルエン中でなされるシラン処理
表面を含む。
【００１５】 好適な実施態様では、活性化されたスライドは標的バイオポリマーに表面結合
シラン処理剤を結合させることが可能な多官能性リンカー試薬を更に含み、これ
によってマイクロアレイスライド上に標的バイオポリマーを固定化することがで
きる。好ましくは、多官能性リンカー試薬は最初にシラン処理剤上の反応性官能
基と反応して多官能性リンカー試薬上に標的分子の官能基と結合を形成可能な少
なくとも一つのペンダント反応性基を残し、ここで結合は、標的分子がアレイの
その元の位置に結合したままである限り、非共有的又は共有的である。好適な実
施態様では、表面は、多官能性リンカー試薬を固定化するための多官能性リンカ
ー試薬の少なくとも一つのペンダント反応性基と反応性である少なくとも一つの
反応性官能基を有するオルガノシランで、アセトン又はアルコールの不在下でト
ルエン中でシラン処理を行うことによって前処理されたガラスを有する。
【００１６】 好適な実施態様では、標的分子はポリヌクレオチドであり、標的分子の官能性
基はヒドロキシル基、エポキシド又はアミンである。標的ポリヌクレオチド上の
官能基がアミンである場合、それは好ましくは第１級アミンである。場合によっ
ては、第１級アミンは好ましくはポリヌクレオチドの５’末端にある。他の好適
な実施態様では、シランはアミノシランであり、ここでアミノ基は多官能性試薬
又はバイオポリマーと反応性である。 更に他の好適な実施態様では、シランは多官能性試薬又はバイオポリマーと反
応性の反応性基を有するオルガノシランであり、ここで、オルガノシランはアル
キルシランであり、アルキル部分はエチル-、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、
ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ノニル-、及びデシルアルキル部分からなる
群から選択され、オルガノシランの反応性官能基はアルキル部分に共有的に結合
する。アルキル部分は環状部分を含む。オルガノシランはまたシランに反応性官
能基を結合させるアリール部分を含んでいてもよい。シランと標的バイオポリマ
ー上の反応性基が第１級アミンである場合、多官能性リンカー試薬上の反応性基
は好ましくは第１級アミンと反応性のチオシアネート基である。
【００１７】 従って、本発明の一実施態様は、アセトン又はアルコールの不在下でトルエン
中のアミノシランと、シランに結合した多官能性リンカー試薬とで表面をシラン
処理することにより作製されたシラン処理された表面を有する活性化されたマイ
クロアレイスライドに関し、ここで多官能性リンカー試薬の少なくとも一つのペ
ンダント反応性基は未修飾ポリヌクレオチド又はその５’末端に第１級アミンを
導入することにより修飾されたポリヌクレオチドと反応可能なチオシアネート部
分である。 更に他の側面では、本発明は、核酸アレイの製作において核酸が結合される固
体支持体マトリックスを作製する方法に関する。本発明によれば、トルエンがＰ
ＤＩＴＣ化学によるシラン系の修飾における溶媒として使用される。本発明はこ
こで開示された発見から、未修飾のＤＮＡがガラススライドのような活性化され
たガラス固体支持体になおも結合することを導く。本発明の利点は、溶媒として
アセトンではなくガラスのシラン処理の溶媒としてトルエンを使用することによ
り、蛍光バックグラウンドが低減され、信号対雑音比が改善されることにある。
加えて、本発明の方法によって得られたガラススライドの修飾表面が、改善され
た核酸スポット形態、例えば密に充填されたマイクロアレイスライド上の隣接ス
ポットとのオーバーラップの低減、及びスポット領域を有する表面上の核酸の均
一な分布を示すマイクロアレイの作製を促進する。
【００１８】 他の側面では、本発明は、基板の表面に標的分子を結合させる方法に関し、該
方法は活性化されたマイクロアレイスライドを提供することを含み、ここで活性
化されたスライドは、アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のオルガノ
シランでシラン処理し、バイオポリマーをスライドの表面に共有的又は非共有的
に結合させる条件下で活性化されたスライドの表面と修飾又は未修飾バイオポリ
マーを接触させることにより作製されるシラン処理表面を含む。 一実施態様では、本発明は、多官能性リンカー試薬がシランに（共有的又は非
共有的に）結合し、修飾又は未修飾バイオポリマーと反応することができる少な
くとも一つの反応性基を多官能性リンカー試薬上に残すようにオルガノシラン上
の反応性基と多官能性リンカー試薬を反応させることを含む。好ましくは、多官
能性リンカー試薬のシランへの結合は共有的である。好ましくは、多官能性リン
カー試薬上の反応性基はリンカーと修飾又は未修飾バイオポリマーとの間の反応
が立体的に阻害されない点でペンダントである。
【００１９】 一実施態様では、本発明は基板の表面に標的分子を結合させる方法に関し、該
方法は少なくとも一つの実質的に平坦な平面を有する固体支持体表面を最初に提
供することを含む。ついで、固体支持体表面はアセトン又はアルコールの不在下
でトルエン中のシラン処理剤でシラン処理され、ここでシラン処理剤は標的バイ
オポリマーと反応性の反応性官能基を有する。ついで、標的バイオポリマーは、
標的バイオポリマーを表面上のシラン処理剤に結合させる条件下で表面に接触さ
せられ、表面上に標的バイオポリマーを固定化させる。バイオポリマーが未修飾
である場合、シラン処理剤上の反応性基はバイオポリマー上の天然に生じる官能
基と反応性である。標的バイオポリマーが修飾されている場合、支持体のシラン
処理表面上の官能基と反応し、それと結合を形成可能な反応性基で修飾されるの
が好ましい。
【００２０】 関連した実施態様では、基板の支持体表面に標的バイオポリマーを結合させる
方法に関し、該方法は、表面のシラン処理後に、多官能性リンカー試薬がシラン
に結合され、ついで標的バイオポリマーが多官能性リンカーに結合される点を除
いてちょうど記載したものと同様である。好ましくは、多官能性リンカー試薬は
シラン上の官能基と反応する第一の反応性基と標的バイオポリマー上の官能基と
反応する第二の反応性基を含む。シラン、多官能性リンカー試薬及び場合によっ
ては修飾されたバイオポリマーの反応性基は表面への分子の効果的な反応と結合
を可能にするように選択される。好ましくは、シランはアミノシランであり、リ
ンカーはジイソチオシアネート化合物であり、バイオポリマーは修飾されている
場合は５’第１級アミンで修飾されている。好適な実施態様では、シランはオル
ガノシラン、例えば３-アミノプロピルトリエトキシシランである。他の好適な
実施態様では、多官能性リンカー試薬はフェニレンジイソチオシアネートである
。場合によっては、標的バイオポリマーはシラン又はリンカー試薬との反応前に
は未修飾である。
【００２１】 他の側面では、本発明は組織試料からの核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の改善され
た精製方法に関する。該方法は、例えば組織又は細胞培養物からの核酸調製物に
有用な修飾塩化セシウム精製を部分的に含む。本発明により高度に精製されたＲ
ＮＡは、例えば、出発ＲＮＡ材料の大幅な喪失を引き起こすポリＡ＋精製工程を
伴わないでＲＮＡから直接プローブを製造するために有用である。該方法はまた
検出感度を改善するために市販のＲＮＡｓを再精製するために有用である。 一側面では、本発明は、少量の核酸、特にリボイ核酸から蛍光的に標識された
ｓＤＮＡプローブを産生するための改善された方法に関する。哺乳動物組織では
、例えば全ＲＮＡの約１％がメッセンジャーＲＮＡ／ポリＡ＋ＲＮＡである。ｍ
ＲＮＡ／ポリＡ＋ＲＮＡはＤＮＡプローブの合成のための最初の鋳型を提供する
材料であるので、非メッセンジャーＲＮＡｓ（リボソームＲＮＡ、トランスファ
ーＲＮＡ等々）の複合バックグラウンドに対して非常に少量で利用できる。従っ
て、ＤＮＡプローブ合成のための本発明の方法は、本方法により鋳型として有用
なＲＮＡの量が過去に知られている方法において有用な量より１００−１０００
倍少ないので、有利である。
【００２２】 この側面では、本発明は標的分子と検出可能な複合体を形成可能な核酸プロー
ブを調製する方法に関し、該方法は生物学的試料から所定量のＲＮＡを単離し；
検出可能に標識されたデオキシリボヌクレオチドの存在下で単離されたＲＮＡに
相補的な検出可能に標識されたｃＤＮＡプローブの混合物を合成し；リボ核酸を
ＲＮａｓｅで分解し；調製物中の標識されたｃＤＮＡプローブの平均長を約０．
５ｋｂから約２ｋｂまでになるように制限ＤＮａｓｅ切断によって減少させ；標
識されたｃＤＮＡプローブを単離することを含む。本発明によれば、単離された
ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを含む全細胞性である。好ましくは、生物学的試
料は細胞、組織試料、体液試料、及び合成オリゴヌクレオチドの混合物からなる
群から選択される。
【００２３】 一実施態様では、本発明は、少量の全細胞ＲＮＡを用いて蛍光的に標識された
ｓＤＮＡプローブを産生する方法に関し、ここでその量はナノグラム又はピコグ
ラムである。そのような少量の全ＲＮＡは細胞性メッセンジャーＲＮＡの低ピコ
グラム又はフェムトグラム量に等価であり、ここでｍＲＮＡはｓＤＮＡへの逆転
写のための実際の鋳型である。本発明の更なる実施態様には、組織又は細胞培養
物中の細胞のような、細胞から単離されたＲＮＡから蛍光的に標識されたＤＮＡ
プローブを産生することが含まれる。細胞が病変ヒト組織のような組織からのも
のである場合、腫瘍細胞は病変組織中の非腫瘍細胞のそばで顕微解剖される。全
ＲＮＡが単離される組織には非病変及び病変組織が含まれ、更には新鮮組織、凍
結組織、及びホルマリン-固定パラフィン-包埋組織が含まれる。本発明によれば
、単離された全細胞ＲＮＡの量は約０．０１ｐｇから約１０ｍｇで約１０ｍｇを
含み、１ｐｇから１０μｇまでで１０μｇを含み、１００ｐｇから１００ｎｇま
でで１００ｎｇを含み、５００ｐｇから１０ｎｇまでで１０ｎｇを含むものであ
る。
【００２４】 ｃＤＮＡプローブを調製する方法の一実施態様では、本発明は単離された全細
胞ＲＮＡ中のメッセンジャーＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し、続いて、二本鎖
ＤＮＡに相補的なＲＮＡを合成する更なる工程を含む。細胞ＤＮＡは生物学的試
料から単離され、本発明に係るＤＮＡ又はｃＲＮＡプローブのための出発材料と
して使用することができる。 他の実施態様では、ｃＤＮＡプローブを調製する方法は検出可能に標識された
デオキシリボヌクレオチドを導入することによって合成されたｃＤＮＡプローブ
を標識することを含む。好ましくは、標識されたデオキシリボヌクレオチドはｄ
ＵＴＰである。関連した実施態様では、標識されたｃＤＮＡプローブの合成は標
識及び未標識ｄＵＴＰの存在下でｄＴＴＰの不在下で実施される。 好ましくは、検出可能な標識は蛍光分子であり、検出は蛍光発色による。放射
性同位元素標識化及び検出、並びに質量スペクトル法を含むが、これらに限定は
されない他の方法を使用することができる（例えば、Marshall A. 及びHodgson,
J., Nature Biotechnology 16:27-31 (1998)を参照のこと）。
【００２５】 好ましくは、生物学的試料が細胞培養物又は組織試料である場合は、培養物又
は組織からの対象の細胞は、組織又は培養物の近くに存在する異なった病変状態
又は異なったタイプの周りの細胞とは一般的に独立の生物学的試料から特に抽出
される。好ましくは、コントロール試料（例えば正常組織の試料）は、レーザキ
ャプチュア顕微解剖により細胞源から除去された細胞を含み、ここで細胞源は、
未処理組織、凍結組織、パラフィン包埋組織、染色組織及び細胞培養物から選択
される。好ましくは、試験試料（例えば病変組織の試料）は、レーザキャプチュ
ア顕微解剖により細胞源から除去された細胞を含み、ここで細胞源は、未処理組
織、凍結組織、パラフィン包埋組織、染色組織及び細胞培養物から選択される。
【００２６】 他の側面では、本発明は少量の全細胞ＲＮＡから蛍光的に標識されたｃＤＮＡ
プローブを産生する方法に関し、ここでその量はナノグラム又はピコグラムであ
る。そのような少量の全ＲＮＡは細胞性メッセンジャーＲＮＡの低ピコグラム又
はフェムトグラム量に等価であり、ここでｍＲＮＡはｃＲＮＡに対する転写が続
く二本鎖ＤＮＡの産生のための実際の鋳型である。本発明の更なる実施態様には
、最終的には組織又は細胞培養物中の細胞のような、細胞から単離されたＲＮＡ
から蛍光的に標識されたｃＲＮＡプローブを産生することが含まれる。細胞が病
変ヒト組織のような組織からのものである場合、腫瘍細胞は病変組織中の非腫瘍
細胞のそばで顕微解剖される。全ＲＮＡが単離される組織には非病変及び病変組
織が含まれ、更には新鮮組織、凍結組織、及びホルマリン-固定パラフィン-包埋
組織が含まれる。
【００２７】 一実施態様では、本発明は標的分子と検出可能な複合体を形成可能な核酸プロ
ーブを調製する方法に関し、ここで該方法は生物学的試料から所定量のＲＮＡを
単離し；単離されたＲＮＡ中のメッセンジャーＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し
、続いて検出可能に標識されたリボヌクレオチドの存在下で二本鎖ＤＮＡに相補
的なＲＮＡを合成することによって検出可能に標識された相補的ＲＮＡプローブ
の混合物を合成し；標識されたｃＲＮＡプローブを単離することを含む。場合に
よっては、ｓＤＮＡは、蛍光デオキシヌクレオチドの不在下において二本鎖ＤＮ
Ａに相補的なｃＲＮＡを合成し、続いて標識された蛍光標識デオキシヌクレオチ
ドの存在下でランダムプライマーを使用してｃＲＮＡからｓＤＮＡプローブを合
成することにより調製される。ランダムプライマーはｓＤＮＡプローブの長さを
制御する。好ましくは、標識されたｓＤＮＡプローブの平均長は約０．５ｋｂか
ら約３ｋｂ、好ましくは約０．５ｋｂから約２ｋｂである。ｃＤＮＡプローブに
対しては、平均長は必要ならば穏やかなＤｎａｓｅでの消化により変えられる。
ｃＲＮＡプローブに対しては、標識されたプローブの平均長は穏やかなＲＮａｓ
ｅでの消化又は４０ｍＭのトリス-アセテート、ｐＨ８．１、１００ｍＭの酢酸
カリウム、３０ｍＭの酢酸マグネシウム中に沈殿した標識ｃＲＮＡプローブを再
懸濁させ、７０℃で１０分間加熱することによる制限された断片化によって減じ
られる。好ましくは、単離されたＲＮＡは全細胞ＲＮＡである。好ましくは、生
物学的試料は細胞、組織試料、体液試料、及び合成オリゴヌクレオチドの混合物
からなる群から選択される。
【００２８】 他の実施態様では、ｃＲＮＡプローブを調製する方法は検出可能に標識された
リボヌクレオチドを導入することにより合成されたｃＲＮＡプローブを標識する
ことを含む。好ましくは、リボヌクレオチドはＵＴＰである。好ましくは、検出
可能な標識は蛍光分子である。関連する実施態様では、標識されたｃＲＮＡプロ
ーブの合成は標識及び未標識ＵＴＰの存在下で実施される。 他の側面では、本発明は少量の全細胞ＲＮＡから蛍光的に標識されたｓＤＮＡ
（センスストランドＤＮＡ）を産生する方法に関し、その量はナノグラム又はピ
コグラムである。そのような少量の全ＲＮＡは細胞性メッセンジャーＲＮＡの低
ピコグラム又はフェムトグラム量に等価であり、ここでｍＲＮＡは、増幅工程と
してｃＲＮＡへの転写が続き、ｃＲＮＡ中の標識の導入がない、二本鎖ＤＮＡの
産生のための実際の鋳型である。標識ｓＤＮＡプローブを産生するためにはｃＲ
ＮＡは蛍光ヌクレオチド、好ましくはｄＵＴＰヌクレオチドの存在下で逆転写さ
れる。
【００２９】 更に他の側面では、本発明は増幅なしに全細胞ＲＮＡから蛍光標識ｓＤＮＡプ
ローブを産生する方法に関する。本発明によれば、全細胞ＲＮＡは第一のストラ
ンドＤＮＡの合成のための出発材料として使用された。標識されたｓＤＮＡプロ
ーブはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ酵素を使用する第一のストランドからの
第二のストランドＤＮＡの直接の合成によって調製される。 本発明によれば、プローブ（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ又はｓＤＮＡプローブ）の合
成に対して有用な単離ＲＮＡの量は約．０１ｐｇから約１０ｍｇまででこれを含
み、．５ｐｇから１ｎｇまででこれを含み、１ｐｇから５００μｇまででこれを
含み、１０ｐｇから１０μｇまででこれを含み、１００ｐｇから１００ｍｇまで
でこれを含み、５００ｐｇから１０μｇまででこれを含むものである。
【００３０】 核酸プローブを調製する方法において、本発明は、類似の組織型、組織由来、
発達段階等の試料の単一又はプール混合物を有するコントロール試料からの全細
胞ＲＮＡからコントロール核酸プローブを取り出すことを含む。例えば、コント
ロール試料は異なったドナーからの、又は同じもしくは異なったドナーからの同
じ組織型から取り出される同じ器官の正常組織の試料を含む。例えば、一実施態
様では、本発明は、試験癌のコピー数又は発現と比較してコピー数又は遺伝子発
現を検出する際に使用するためにコントロール核酸プローブが取り出されるコン
トロール試料として複数の上皮組織をプールすることを含む。関連した実施態様
では、コントロール試料は一又は複数の細胞培養物からの細胞の混合物であり、
ここで細胞は全細胞ＲＮＡの単離の前にプールされる。プールされた細胞培養物
から産生されたコントロール核酸プローブは標的分子と複合化するその能力につ
いて試験核酸プローブと比較される。本発明では、また試験核酸プローブは試験
組織細胞試料又は試験細胞培養試料の混合物から取り出されうる。
【００３１】 他の側面では、本発明はマイクロアレイパターンの核酸の利用のためのガラス
スライドを作製する方法に関し、本方法は、スライドを洗浄剤とアルカリで洗浄
し；アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のオルガノシランでスライド
をシラン処理し；場合によっては標的分子とオルガノシランの官能基と反応可能
な多官能性リンカー試薬とオルガノシランを反応させ；続いて、標的分子を共有
又は非共有結合によって表面に結合させる条件下で活性化表面（表面に結合した
反応性オルガノシラン、又は存在するならばオルガノシランに結合した多官能性
リンカー試薬を有する）を接触させることを含む。本方法はまたトルエン、メタ
ノール、水、及びメタノールを含む溶媒中でシラン処理スライドを洗浄して未反
応化合物を除去し、オルガノシラン、多官能性リンカー試薬及び標的分子の結合
後にスライドを乾燥させる工程を含む。 一実施態様では、トルエンはシラン処理工程において溶媒の少なくとも５０％
、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好まし
くは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であり、最も好ま
しくはトルエンがシラン処理反応混合物中において溶媒の少なくとも９９％であ
り、標準的な方法で乾燥され、本発明に係る続く検出工程の間において効果的な
シラン処理反応とバックグラウンド蛍光の最小化に適した標準的な純度である。
【００３２】 他の実施態様では、本発明はマイクロアレイ固体支持体に修飾標的ポリヌクレ
オチドを結合させる方法であって、ここで該方法は、リンカーによってその５'
末端に共有的に結合した反応性基を有する核酸プライマーを取得し、ここでプラ
イマーは標的ポリヌクレオチドの外側の配列に相補的であり；ポリメラーゼ連鎖
反応によって標的ポリヌクレオチドを増幅させて反応性基を有する修飾標的ポリ
ヌクレオチドをつくり；修飾された標的ポリヌクレオチド反応性基と反応可能な
表面反応性基を表面上に有する活性化されたマイクロアレイを得て、ここで、マ
イクロアレイ固体支持体は、トルエン中のオルガノシランで表面をシラン処理し
；マイクロアレイ固体支持体と修飾標的ポリヌクレオチドを接触させることによ
って作製され、それによって修飾標的ポリヌクレオチド反応性基と表面反応性基
が修飾標的ポリヌクレオチドをマイクロアレイ固体支持体に共有的に結合させる
方法に関する。好ましくは、修飾された標的ポリヌクレオチド反応性基は第１級
アミンを含み、表面反応性基はイソチオシアネート部分を含む。
【００３３】 他の側面では、本発明はマイクロアレイ上のバイオポリマー標的を分析する方
法であって、アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中に入れたオルガノシ
ランでシラン処理することによって作製されたシラン処理基板表面に結合した標
的バイオポリマーを有するマイクロアレイスライドを提供し；検出可能な複合体
の形成を可能とする条件下で標的分子と検出可能な複合体を形成可能な薬剤に、
結合された標的分子を接触させ；検出可能な複合体の形成を検出し；形成された
検出可能な複合体の量を測定する、ことを含む方法に関する。
【００３４】 一実施態様では、検出可能な複合体を形成可能な薬剤は、（１）第一の検出可
能な標識を有する核酸プローブのコントロール混合物であって、プローブがコン
トロール試料から単離された核酸から調製されたものと、（２）第二の検出可能
な標識を有する核酸プローブの試験混合物であって、プローブが試験試料から単
離された核酸から調製されたものとを含み、ここで、第一及び第二の検出可能な
標識と、それらが結合した核酸分子は、その存在の決定を容易にするために、ま
た場合によってはマイクロアレイ上の特定の標的分子と複合体を形成するコント
ロール及び試験プローブの量又は混合物中のプローブの相対量の決定を容易にす
るために互いに区別することができる。本方法は更にコントロールプローブと試
験プローブをプールし；コントロールプローブ又は試験プローブの間の特異的検
出可能複合体の形成を可能にする条件下で本発明によって作製されたマイクロア
レイスライド上で標的分子とプールされたプローブを接触させ；そして標的分子
と試験プローブの間に形成された複合体の量に対して、標的分子とコントロール
プローブの間に形成された検出可能な複合体の量を比較することに更に関する。
個々のプローブは、他の単一にハイブリダイズされた又はプールされたプローブ
でハイブリダイズされたマイクロアレイからのデータと比較することができる定
量発現データを作り出すためにマイクロアレイに単一にハイブリダイズさせるこ
ともできる。好ましくは、標的分子は、標的ポリヌクレオチドであり、プローブ
はｃＤＮＡプローブかｃＲＮＡプローブの何れか、あるいはｓＤＮＡプローブ、
又はこれらの組み合わせである。好ましくは、標識は例えば蛍光発光のように光
学的に検出可能である。好ましくは、標的分子とプローブの間の複合体の形成は
洗浄剤の不在下で生じるが、次の洗浄工程が場合によっては洗浄剤を含む溶液を
含む。本発明の一実施態様では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が、複合体
が標的分子とプローブの間に形成されているハイブリダイゼーション溶液から除
去される。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションはアルキルアンモニ
ウム塩、ＤＭＳＯ及びホルムアミドの存在下で実施されて複合体形成が更に改善
される。
【００３５】 他の側面では、本発明は、支持体表面上の標的ポリヌクレオチドに検出可能な
ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる方法であって、（ａ）洗浄剤の不在下
において、支持体表面上の変性標的ポリヌクレオチドとプローブを接触させ；（
ｂ）標的ポリヌクレオチドと検出可能に標識されたポリヌクレオチドプローブの
間の複合体の形成を検出する、ことを含む方法に関する。本発明の一実施態様で
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がハイブリダイゼーション工程から除去
される。本発明の他の実施態様では、ハイブリダイゼーション効率は、ホルムア
ミドとアルキルアンモニウムクロリド（好ましくはテトラメチルアンモニウムク
ロリド又はテトラエチルアンモニウムクロリド、又は両方）及びジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）の一又は複数を含有するハイブリダイゼーション溶液を使用
することによって改善される。 本発明では、試験試料とコントロール試料は、発達状態、疾患状態、罹患前の
状態、細胞型、試料供給源、及び実験処理条件の一又は複数において互いに異な
る。場合によっては、本発明では、コントロール試料は、発達状態、疾患状態、
細胞型、試料供給源、及び実験処理条件の一又は複数において試験試料とは異な
る試料の混合物を含む。場合によっては、本発明では、試験試料は、発達状態、
疾患状態、細胞型、試料供給源、及び実験処理条件の一又は複数においてコント
ロール試料とは異なる試料の混合物を含む。
【００３６】 本発明のある実施態様では、標的分子はポリヌクレオチドであり、試験試料及
びコントロール試料から単離された核酸はＲＮＡであり、比較は、コントロール
試料中の標的ポリヌクレオチドの発現に対する試験試料中の標的ポリヌクレオチ
ドの発現の測定値をもたらす。好ましくは、標的ポリヌクレオチドの発現の相対
測定値が試験組織試料中の疾患状態を示し、疾患状態は、癌、心疾患、神経疾患
、炎症、及び非疾患状態に対して遺伝子発現の変化によって特徴づけられうる任
意の疾患の全ての形態からなる群から選択される。関連した実施態様では、標的
ポリヌクレオチドの発現の相対的測定値が試験組織試料中の罹患前の状態を示し
ている。他の関連した実施態様では、標的分子がポリヌクレオチドであり、試験
試料とコントロール試料から単離された核酸がＤＮＡであり、比較は、コントロ
ール試料中の標的ポリヌクレオチドコピーに対する試験試料の細胞中の標的ポリ
ヌクレオチドのコピー数の測定値をもたらし、標的ポリヌクレオチドのコピーの
数が試験組織試料の疾患状態又は罹患前の状態を示している。
【００３７】 実施態様の説明 （定義） ここで用いられているように、「接着した」、「接着」、「結合した」等の用
語は、少なくとも２つの分子の物理的又は化学的結合を指す。例えば、 接着が
標的分子と基質表面の間の場合、接着は好ましくは共有化学結合である。接着が
基質表面上に固定化されるべき標的分子と表面上の活性リンカー試薬の間である
場合、接着は好ましく共有結合性である。静電気、疎水性、親水性、又は他の非
共有化学結合が接着を形成する可能性があるが、しかしながら、これは、そのよ
うな非共有結合が、支持体表面上の接触点からの標的分子の移動を妨げる場合で
ある。結合が標的分子とその標的分子と複合体化することが可能な薬剤（プロー
ブ）の間の複合物内である場合、この結合は、好ましくは静電気、疎水性、親水
性、又は非共有結合である。
【００３８】 ここで用いられているように、「バイオポリマー」という用語は、バイオポリ
マーの構造に適した手法によって、基質に接着し得る対象の標的分子を指す。選
択的には、このバイオポリマーは核酸配列であり、一本鎖又は二重鎖ポリヌクレ
オチドを含み、そのポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡ（ヌクレオ
チド骨格がペプチド骨格である、ペプチド核酸）であってよい。バイオポリマー
がタンパク質、例えばリガンド、レセプター、抗体、細胞表層タンパク質等であ
る場合、プローブは、例えば、レセプター、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド
、或いは他のバイオポリマー又はより小さな分子で、標的タンパク質と複合体を
形成することができるものである。好ましくは、このバイオポリマーは、知られ
ている、理解でき、確定でき、又はさもなければ特定可能である。
【００３９】 ここで用いられているように、「界面活性剤」という用語は、ハイブリダイゼ
ーションの間に支持体表面の湿りを促進すると同時に、標的分子の変性を生じさ
せる又は促進するために有用な表面活性物質である。界面活性剤の制限のない例
には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ-４０、及びＴｗｅｅｎ-２０が含まれる。 ここで用いられているように、標的分子及び被験プローブによって形成される
複合体に対する、コントロールプローブを伴う標的分子によって形成される複合
体の検出に関しては、「識別可能な」又は「区別可能な」という用語は、直接視
覚検出又は検出装置の利用を介する補助的検出による被験複合体とは異なる、コ
ントロール複合体を検出する能力を指す。例えば、最初の蛍光色素で標識された
コントロールプローブを含む複合体は、二番目の蛍光色素で標識された被験プロ
ーブを含む複合体から識別可能であり、この一番目と二番目の色素は異なる波長
を放つ。
【００４０】 ここで用いられているように、「疾患の状態」という文句は、細胞又は組織の
異常な状態を指し、生存している動物又は植物の異常な状態は、結局は病気又は
疾患となる。疾患状態の細胞又は組織の限定されない例には、すべての形態の癌
、心臓疾患、神経疾患、炎症、そして疾患ではない状態と比較した遺伝子発現の
変化によって特徴付けられ得る任意の疾患が含まれる。 ここで用いられているように、「色素４８８」という用語はｄＵＴＰ-又はＵ
ＴＰ-誘導体化蛍光色素を指し、この蛍光発色団は４８８ｎｍで励起し、５３０
ｎｍの波長ピーク周辺で放射する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素（Molecu
lar Probes，Inc. ）は、そのような色素の例である。広く用いられているフル
オレセイン色素も、可視スペクトルの緑色域であるこの波長で放射し、本発明で
は有用である。本発明で用いるのに好ましい色素は、使用者にとって入手可能な
最も強烈に放射する発色団であり、その発色団はフルオレセインよりも光安定性
があり、マイクロアレイハイブリダイゼーション分析で使用されるｐＨ領域の変
化（例えば，ｐＨ４から１０）によって相対的に影響を受けない。色素５４６と
の蛍光相互作用の減少を生じるより狭い放射スペクトルを有し、それによって信
号対雑音比の向上が可能となることから、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素は
有益である。
【００４１】 ここで用いられているように、「色素５４６」という用語はｄＵＴＰ-又はＵ
ＴＰ-誘導体化蛍光色素を指し、蛍光発色団は５４６ｎｍの波長で励起し、５９
０ｎｍの波長ピーク周辺で放射する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６色素（Mole
cular Probes，Inc. ）は、そのような色素の例である。広く用いられているＣ
ｙ３色素とテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ及びＴＡＭＲＡ）も、可視スペ
クトル領域であるこの波長で放射し、本発明において有用である。本発明におい
て使用するために好ましい色素は、使用者にとって入手可能な最も強烈に放射す
る発色団である。 ここで用いられるように、マイクロアレイの固体支持体に関する「ガラススラ
イド」とは、マイクロアレイの調製及び続くマイクロアレイ分析の間にスライド
の簡便な操作を可能にするシリカを基礎とするカラス平板の一片の大きさ、形、
そして厚さを指す。
【００４２】 ここで用いられているように、「多機能リンカー試薬」とは、その他の分子、
ポリマー、又は表面と結合することができて、更にその他の分子、ポリマー、又
は表面とも結合することができる分子を指す。例えば、リンカー分子は、少なく
とも２つ又はそれより多い他の分子と結合することができる２つの反応性基を含
む。本発明によると、リンカー分子の例には、アルコキシシリル部分を介して表
面（例えば、カラス表面）と結合することができ、そして標的分子又はその他の
リンカー分子と反応することができる有機シランが含まれる。その他のリンカー
分子は、非修飾又は修飾された標識分子と反応することができるだけでなく、表
面に結合した有機シラン上の反応性官能基と反応することができる二官能性試薬
であってよい。
【００４３】 ここで用いられているように、「正常な組織」という用語は、標準的な診断法
によって識別可能な疾患が観察されない或いは、少なくとも被験試料の疾患状態
がコントロールの正常組織試料に存在しない組織を指す。 ここで用いられているように、「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシド又は
リボヌクレオシド、或いは一本鎖又は二本鎖型の何れかのデオキシリボヌクレオ
チド又はリボヌクレオチドを指す。この用語には、更に、例えばペプチド核酸の
ような天然ヌクレオチドの非天然類似体を含まれる。 ここで用いられている「オリゴヌクレオチド」という用語は、２−１０００ヌ
クレオチド長、１０−７５０ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、５０−
４００ヌクレオチド、又は５０−２００ヌクレオチド長を含む一本鎖核酸配列を
指す。オリゴヌクレオチドは、核酸合成の分野における標準的技術によって化学
的に合成され得る。マイクロアレイスライドへの接着前の固相からのオリゴヌク
レオチドの遊離が後に続く固相合成、そしてマイクロアレイスライド上での固相
合成に限定されるものではないが、そのような技術が含まれる（例えば、米国特
許第５，４４５，９３４号を参照せよ）。
【００４４】 ここで用いられているように、「疾病状態前」という文句は、細胞又は組織の
異常な状態を指し、生存する動物又は植物のその異常な状態は検出可能ではない
。しかしながら、動物の疾病前状態は、動物を疾病状況の究極的な進行へ傾かせ
る。疾病前の状況の限定されない例には、遺伝子コピー数のような遺伝物質の異
常なレベル、疾病関連多型のような遺伝物質の異常な配列、頻繁に疾病状態に先
行する遺伝子発現の変化、そして同じく腫瘍サブタイプの遺伝的増殖が含まれる
（例えば、Hacia, J. G., Nature Genetics 21(Suppl): 42-47(1999); Heiskane
n, M. A.ら., Cancer Research 60: 41-46(2000); Pollack, Jら., Nature Gene
tics 23: 41-46(1999); DeRisij,ら., Nature Genetics 14:457-460(1996); Ber
ns, A., Nature 403: 491-492(2000); 及びAlizadeh, A. A.ら., Nature 403: 5
03-511(2000); Marx., J., Science 289: 1670-1672(2000)）。
【００４５】 ここで用いられているように、「プローブ」という用語は、薬剤、好ましく検
出可能に標識されていて、表面に固定されている標的分子と複合体を形成するこ
とができる薬剤を指す。標的分子がポリヌクレオチドである場合、プローブはそ
の他のポリヌクレオチド、核酸特異的結合タンパク質又は抗体、或いは他の核酸
結合分子である。例えば、プローブは、ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはペプチド核酸（
ＰＮＡ、ペプチド骨格を有する核酸）のようなその他のポリヌクレオチドである
。標的分子がリガンド、レセプター、抗体、細胞表面タンパク質等のようなタン
パク質である場合、プローブは、例えば、標的タンパク質と複合体を形成するこ
とができるレセプター、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、或いは他のバイオ
ポリマー又は小分子である。好ましくは、標的分子と薬剤の間で形成された複合
体は特異的であり、、マイクロアレイでの他の標的分子との複合体形成から検出
可能に識別できる。「プローブ」という用語が時折、マイクロアレイ表面に結合
している固定化されたバイオポリマーを示すのに用いられることが知られている
。本開示の目的のためには、「プローブ」という用語は、支持体の表面上の固定
化分子（ここでは「標的」として用いられている）と複合体を形成することがで
きる標識分子を指すために用いられる。 ここで用いられているように、ポリヌクレオチドの「５’末端の反応性官能基
」という文句は、リンカーを介して直接又は間接的に結合している反応性官能基
（化学化合物の化学的に反応性部分）を指し、その結合部位は、核酸配列の５’
末端の５０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ又は２ｂｐ内にある。好ましくは、反応性
官能基は、ヌクレオチド塩基又はデオキシリボースの何れかの５’末端ヌクレオ
チド内にある。
【００４６】 ここで用いられているように、活性化マイクロアレイスライドに関する「シラ
ン処理」という用語は、シランが基板の表面に結合するようにシランを基板と反
応させることを指す。本発明によると、マイクロアレイ基板の表面をシラン処理
することは、シランが表面のシロキシ基と反応する反応を指す。本発明によると
、シラン処理はトルエン、及びアセトン又はアルコールが無い場合に起こる。シ
ラン処理反応のトルエンは、好ましくは十分に乾燥している（例えば、商業的に
入手可能な試薬のグレードのトルエン）。本発明によると、アセトン又はアルコ
ールは、他の非シラン処理反応又は洗浄の間、マイクロアレイスライドと接触し
得るが、アセトンとの接触は、好ましくは３時間又はより少なく、好ましくは２
時間又はより少なく制限され、その後にアセトンを除去するための徹底した乾燥
が続く。好ましくは、表面はシリカを含む。より好ましくは、表面はシリカを基
礎とするガラスである。本発明によると、このシリカは、少なくとも一つの反応
性基がシランと表面との結合を生じせしめる表面との反応が可能である、好まし
くは多数の反応性官能基（又は反応性基）、並びに少なくとも標的分子の反応性
官能基と反応することができる他の反応性官能基を含み、標的分子をシランへ、
最終的には基板の表面へ結合させる。随意的には、標的分子は多機能リンカー試
薬と結合し、次には、多機能リンカー及びシランの反応性官能基を介してシラン
と結合する。リンカー試薬が、多数のリンカー試薬単量体を含み得ることが知ら
れている。
【００４７】 ここで用いられているように、マイクロアレイ基板の表面上に標的分子を沈着
させることに関する「スポッティング」又は「タッピング」という用語は、標的
分子が表面に沈着し、マイクロアレイの表面と接触するように標的分子を含んで
いるマイクロアレイプリンティングピンのような装置とその表面を接触させるこ
とを指す。好ましくは、このスポッティング及びタッピングは、容量が１μｌ又
はより少ない、１００ｎｌ又はより少ない、１０ｎｌ又はより少ない、５ｎｌ又
はより少ない、２ｎｌ又はより少ない、１ｎｌ又はより少ない、或いは５ｎｌ又
はより少ない、表面の標的分子を含む小容量の溶液を溶着することができるキャ
ピラリー又は他のチューブ（例えば、プリンティングピン）を介する。好ましく
は、表面に標的分子溶液を溶着させることで形成させたスポットは、隣接又はす
ぐ近くのスポットの反応によって逆の作用を受けないようにマイクロアレイ上の
他のスポットから分離されている。好ましくは、このスポットは、直径で、５０
−５００ミクロン、７５−３００ミクロン、又は１００−１５０ミクロンである
。
【００４８】 ここで用いられているように、「基板」という用語は、本発明によると、一つ
又は複数のリンカー分子を基板、最終的には標的分子へカップリングさせること
によって、直接又は間接的の何れかで、標的分子が結合した固体支持体を指す。
本発明による限定されない基板の例には、高分子材料、カラス、セラミック、天
然繊維、シリコン、金属、及びその混合物が含まれる。この基板は、十分に平ら
な少なくとも一つの表面を有する。ここで用いられているように、基板表面に関
する「十分に平ら」という文句は、二次元アレイでの標的分子のより簡便な用途
ための巨視的に平面な表面を指す。あるいは、この基板は、標的分子が結合する
球面又は不規則な表面を有し、その標的分子では、そのような複合体の検出のた
めにプローブが複合化し得る。
【００４９】 ここで用いられているように、本発明の標的ポリヌクレオチドのような標的バ
イオポリマーに関して用いられている「無修飾」という用語は、ポリヌクレオチ
ドの合成、単離、又は他の調製の間に、ポリヌクレオチドへ添加又は取り込まれ
た反応性官能基を欠くポリヌクレオチドを指す。一般的には、本発明によると、
バイオポリマーを修飾するものの付加である、バイオポリマーの反応性官能基は
、マイクロアレイ基板へのバイオポリマーの結合を可能にするものである。一方
において、無修飾バイオポリマーは、リンカー分子を介して直接又は間接的に表
面へ標的バイオポリマーを結合させる目的で加えられたそのような官能基を欠く
。その他の方法で言うと、無修飾バイオポリマーは、分子に存在する官能基（反
応性又は別に）が天然発生様バイオポリマー原産である、天然状態の一つである
。無修飾標的バイオポリマーがマイクロアレイスライドへ共有結合的に結合する
場合、無修飾バイオポリマーは、天然発生バイオポリマーに典型的な官能基で結
合する、又は細胞から単離されたバイオポリマーとして結合する。無修飾バイオ
ポリマーが、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＰＮＡのような無修飾ポリヌクレオチドである
場合、天然発生の核酸塩基、ポリヌクレオチド骨格、又はポリペプチド骨格に典
型的な官能基で、無修飾ポリヌクレオチドは基板と結合する。
【００５０】 実施例 下記の実施例は例示によって示されているおり、限定することによって示され
るものではない。実施例は、本発明の化合物、組成物、及び方法をいかに作成し
使用するかに関する完璧な開示及び説明を当該分野に熟練している者へ提供する
ためのものであり、本発明に関して発明者が考慮する範囲を限定することを意図
しているものではない。用いられている数字（例えば、量、温度など）に関する
正確さを確かなものにする努力が成されているが、幾つかの実験的誤り及び逸脱
は釈明されるべきである。。特に示さない限り、温度は摂氏度（℃）である。明
細書中のすべての引用例は、参考文献としてここに明白に取り入れられている。
【００５１】 実施例１： マイクロアレイ分析のための核酸調製 本発明は、すべての核酸の混合物における核酸の存在を検出するために有用で
ある。しかしながら、本発明には、組織試料、遺伝子発現の検出がこれまで明確
な課題であった培地での遺伝子発現の検出及び定量化において、好ましい用途が
見出される。本発明は、この課題を、組織試料での遺伝子発現に関する検出限界
を向上させる方法を示すことによって解決する。
【００５２】 コントロール又は試験試料のための細胞収集： マイクロアレイ分析は、細胞
、組織、体液等の試験及びコントロール試料の間の細胞の状態の直接比較を可能
にする。試験又はコントロール試料が独占的又は実質的に対象の細胞のみを含む
場合に、そのような比較は最適化される。例えば、癌組織のような疾患組織は、
頻繁に正常細胞の領域に浸潤した癌牲細胞を含む。従って、癌牲組織の試料は、
しばしば正常及び疾患細胞の混合物を含み、癌に対する炎症及び免疫応答に関連
する細胞のような、組織に見出された、或いは癌に関連した細胞型をも含み得る
。好ましくは、試料は、分析にとって重要である細胞のみを含む。本発明による
と、試験試料が細胞型又は他の所望する状態によって特異的に収集される細胞の
コレクションを含み、異なる型又は状態の細胞による試料の混入が除外されるこ
とは好ましい。
【００５３】 レーザー捕獲マイクロダイセクション（ＬＣＭ）の技術は、細胞収集にとって
好ましい（例えば、Emmert-Buck, M.R.ら., Science 274:998-1001(1996); Simo
ne, N. L.ら., Trends in Genetics 14: 272-276(1998); Glasow, A.ら., Endoc
rine Research 24: 857-862(1998); WO 002892(優先日１９９８年１１月５日);
Luoら., Nature Medicine 5: 117-122(1999); 及びArcturus Engineering, Inc.
, www.arctur.com, 最後に参照したのは２００１年３月２０日）。ＬＣＭは、直
接視覚化の下、組織切片の特異的顕微領域から純粋な細胞の総数を得るための方
法を提供する（Simone, N.L.ら., 上掲）。本発明及び本実施例の目的のために
、収集した細胞のＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質のの整合性を維持する技術で
あるレーザーパルスによって、対象の細胞を活性化させたポリマーフィルムへ移
した。後に続くコントロール核酸及び試験核酸プローブの調製での用途のために
、移した細胞を全細胞性ＲＮＡの単離に用いた。ここで開示した実施例のために
使用したＬＣＭ装置は、Arcturus Engineering, Inc., (マウンテンビュー，カ
リフォルニア，アメリカ）からのもである。
【００５４】 生物試料からの核酸の単離と精製： 本発明の核酸調製方法には、塩化セシウ
ム密度勾配が含まれる。この方法は、限定された大きさの組織試料、並びに限定
されるものではないが上皮起源を含む種々の組織ソースからＲＮＡとＤＮＡの両
方を収集することに有用である。この方法によって得られたＲＮＡは、ＲＮＡか
らのプローブを直接合成することを可能にするほど十分に純粋であり、改良した
プローブ標識を可能にする。この方法は、混入する炭水化物が豊富な肝臓又は胎
児心臓のような組織からＲＮＡを単離することにとって特に有用であることが見
出された。加えて、本発明の方法は、商業的に得られたＲＮＡを精製することに
とって有用であり、それによって改良されたプローブの合成、及び商業的ソース
からのＲＮＡを標識することが可能である。 組織試料の核酸の精製については、本発明の方法の一例として、そしてその有
用性が示されている。正常細胞（又は正常組織のプール）からの組織試料は、こ
こでは「コントロール組織」又は「コントロール試料」と命名されている。腫瘍
組織のような疾病組織からの組織試料は、「被験組織」又は「被験試料」とここ
で命名されている。特に示さない限り、コントロール及び被験試料の調製は、本
実施例と同じである。
【００５５】 被験又はコントロール組織の何れかである組織を液体窒素で粉末状に細かくし
、続いて組織可溶化液を提供するために、少なくとも１０倍容量の溶解バッファ
ー（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％
Ｎ-ラウリルサルコシン）で８−１０回のダウンス（dounce）によるホモジュナ
イズ（douncing）をおこなった。例えば、およそ１００ｍｇの組織に対して、お
よそ１−２ｍｌの溶解バッファーを加えた。その溶解物を１０分間にわたってＳ
Ｓ３４ローター（およそ１２，１００ｘｇ；Beckman Instruments, USA）で１２
，０００ｒｐｍで遠心分離し、不溶解物質を取り除いた。次いで、この透明な可
溶化液を、１：２．２５＝ＣｓＣｌ：可溶化液の容量：容量比で５．７Ｍ 塩化
セシウム／５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８（利便性のために「ＣｓＣｌ」と命名）の
頂点に層にして配した。 ＣｓＣｌ：可溶化液調製物を、１５０，０００ｘｇで、少なくとも１２時間遠
心分離して懸濁液からＲＮＡを沈殿させた。ＳＷ５５ローター（Beckman Instru
ments, USA）と適合する試験管で、３．５ｍｌの可溶化液を１．５ｍｌ ＣｓＣ
ｌの上へ層にして配し、全容量を５ｍｌとした。ＴＬＳ５５ローター（Beckman
Instruments, USA）をより少量の試料である５０−２００ｍｇの組織のために使
用した場合、１．４ｍｌ 可溶化液を６００μｌ ＣｓＣｌの上へ層にして配し、
遠心分離した。
【００５６】 可溶化液を取り除き、ＤＮＡ精製のために保持した。ＲＮＡのペレットは、遠
心分離用試験管の底でガラス状の沈殿物として確認した。遠心分離試験管から塩
化セシウムを取り除き、高純度の精製水でペレットを洗浄した後、ＲＮＡペレッ
トを、ペレットを再懸濁するために十分な容量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８−８．５）に再懸濁した。再懸濁はゆっくりでよく、小
容量に大きなペレットを再懸濁させるために１２又はそれより長い時間を必要と
する。 再懸濁したＲＮＡを、標準的なフェノール：クロロホルム抽出技術によって抽
出した。０．１倍容量（水層に対しての相対比）の３Ｍ 酢酸ナトリウム、並び
に３倍容量のエタノールによってＲＮＡを沈殿させた。この沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、続いて９５％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させ、強
力な脱イオン水等のような高度に精製した水に再懸濁した。 試料が培養液中の細胞である場合、核酸を精製する方法は、次のように修正し
た。１０ｃｍ培養プレート又は１５ｃｍプレートから収集した細胞へ、それぞれ
２ｍｌ又は３．５ｍｌの可溶化バッファーを加えた。可溶化液は、１８標準規格
注射針を備えた注射器を用いて収集した。培養細胞可溶化液の調製にためには、
ＳＳ３４ローターによる１２，０００ｒｐｍでの低速遠心分離を省いても良い。
可溶化液の収集に後では、培養細胞からの核酸精製の手法は、組織試料からの培
養細胞からの核酸精製の手法と同じであった。
【００５７】 保持されたＤＮＡ含有可溶化液は、容量では、高度の精製水の２倍であった。
材料を、標準フェノール：クロロホルム抽出技術によって抽出し、ＤＮＡを水層
に分離した。０．７倍容量のイソプロパノールによってＤＮＡを沈殿させた。例
えば、この沈殿物をＳＳ３４（Beckman Instruments）による１３，００ｒｐｍ
でペレット化し、最小量のＴＥを混ぜることによってペレットを再懸濁した。 精製及び再懸濁ＲＮＡ及びＤＮＡは、マイクロアレイ分析のためのプローブの
調製にとって有用である。組織試料から高純度でＲＮＡとＤＮＡの両方を単離す
る能力は、例えば遺伝子コピー数（ＤＮＡとして）と発現のレベル（ＲＮＡとし
て）の間の相関性及び比較を可能にするために特に有用である。
【００５８】 実施例２：マイクロアレイプローブの調製： ここで開示されたマイクロアレイプローブの調製のためのプロトコールは、プ
ローブ合成のための開始材料として極めて少ない量のＲＮＡを分析するために有
用である。このプロトコールは、例えばレーザー捕獲マイクロダイセクションに
よって異種腫瘍組織から単離した腫瘍細胞からのｃＤＮＡプローブ又はｓＤＮＡ
プローブの混合物を生成するために特に重要である。従って、単離された腫瘍細
胞の数は、通常は非常に少なく、さらに僅か１００細胞、ちょうど１０細胞、及
び僅か一つの細胞が、本発明の組成物及び方法を用いて利用できる驚くべき感受
性による遺伝子発現分析のためのＲＮＡの十分なソースである。本方法は、顕微
解剖されていない細胞から単離されたＲＮＡを使用したプローブ合成にとっても
有用であるが、一般的には、全くそれだけではないが、ＲＮＡの数量が限られて
いる場合に最も有用である。ＲＮＡ開始材料の量が極めて少ない場合に、本発明
の方法によって作成されたプローブは確実に敏感である。例えば、本発明は、僅
か２ｐｇ−１０ｎｇの単離された全細胞性ＲＮＡから合成されたプローブに関し
、このＲＮＡは、およそ２０ｆｇ−１００ｐｇのメッセンジャーＲＮＡを表し、
この量は、現在利用できる技術によって分析できる量よりもおよそ１０００倍低
い。
【００５９】 本発明によると、プローブ合成に関する２つの変法が開示され、この変法は、
利用可能な単離された全細胞性ＲＮＡの量に依存する。５００ｎｇから５μｇを
含む全ＲＮＡの量に関しては、直接標識化プロトコールを用いる。全ＲＮＡの５
００ｐｇ−１０ｎｇほどのＲＮＡの量に関しては、プローブは、インビトロ転写
による増幅の一回限りによって作成される。極めて少量の全細胞性ＲＮＡ（例え
ば、０．０１−１０ｐｇの全細胞性ＲＮＡ、好ましくは約１−１０ｐｇ、より好
ましくは約１−２ｐｇで、単一細胞の全ＲＮＡに等量）に関しては、インビトロ
転写による初期増幅は記載のようにおこなわれ、或いは長期のインキュベーショ
ン期間（例えば、１２時間）にわたっておこなわれ、或いはｓＤＮＡプローブ又
はｃＲＮＡプローブ合成のために十分な材料が作成されるように二度おこなわれ
た。本発明の各実施例に関しては、ｃＤＮＡプローブ、ｓＤＮＡプローブ、又は
ｃＲＮＡプローブ合成には、蛍光色素の取り込みが含まれる。 ｃＤＮＡプローブ、ｓＤＮＡプローブ、又はｃＲＮＡプローブ合成の前には、
ＲＮＡをマイクロ-ＣｓＣｌ遠心分離によって、或いは定量化されていない核酸
の直接沈殿によって精製され得る。例えば、顕微解剖された組織試料で研究をお
こなう場合に、これら精製プロトコールは特に有用であった。
【００６０】 この実施例では、実施例１に開示された方法によって精製された単離済みのＲ
ＮＡの逆転写で直接に調製されたｃＤＮＡプローブに基づく、２色又は１色マイ
クロアレイ分析における商業的に入手可能な修正蛍光色素（Alexaシリーズの蛍
光色素、Molecular Probes, Inc., ユージン，オレゴン，アメリカ合衆国）の用
途を開示する。同様に、ｃＲＮＡプローブ及びｓＤＮＡプローブは、単離された
ＲＮＡからの二重鎖ＤＮＡ合成の中間段階、これに続く転写、ｓＤＮＡプローブ
が所望されるならば、逆転写酵素、標識デオキシリボヌクレオチド、及びランダ
ムプライマーを用いて標識ＤＮＡプローブの合成によって調製された。この実施
例に開示されたプローブ調製の方法は、健全で感度が高く、使用者が僅か５００
ｐｇ−１０ｎｇの全ＲＮＡで開始することを可能にする。
【００６１】 標識ＤＮＡプローブの調製： 下記の手法は、本発明で使用される検出可能な標識ＤＮＡプローブを調製する
方法の限定されない例が開示される。プローブ合成の各実施例では、開始材料は
、組織試料から単離された全細胞性ＲＮＡであった。これら実施例が示している
ように、ｃＤＮＡプローブは、ＲＮＡから中間増幅がなしに、又は単に１又は２
回の増幅で調製されたので、ｓＤＮＡプローブは、非標識ｃＲＮＡから逆転写酵
素によって調製された。また、ｓＤＮＡプローブは、標識の取り込みによる直接
の二番目の鎖の合成によって、より大量の開始の全細胞性ＲＮＡから調製された
。ｃＲＮＡプローブは、ｃＤＮＡから調製された。
【００６２】 標識核酸プローブの改良方法の開発において解決される問題： 検出感度は、部分的に、ＤＮＡ／発色団複合体の溶解性の限度を超えない、最
大に標識された（「ホット」）プローブを作成する能力に依存する。ＤＮＡ／発
色団複合体の溶解性は、プローブ標識化密度及びプローブの長さによって影響を
受ける。標識化密度とは、特定のＤＮＡ断片長あたり発色団の数で定義される。
標識化密度は、本発明の一部として、全標識化効率に相関し、それ故に標識プロ
ーブの非標識プローブに対する比に相関することが見出された。この比は、核酸
シークエンシングゲル上の視覚化されたプローブ強度によって容易に推定される
。この技術は、おおよその標識化密度、分子量又は断片長に関するプローブを評
価するために有用である。関連する知見としては、プローブの溶解性は、反比例
的に標識化効率に相関すること、すなわち蛍光色素の数がプローブに取り込まれ
ると、その溶解性が減少したことが見出された。従って、シークエンシングゲル
上の標識化効率の視覚化も、プローブ溶解性の間接的な推定及び予測を示した。
【００６３】 従って、プローブの長さ及び分子量は、穏和なDNase消化によって制御された
。好ましくは、DNase消化は、一定の時間にわたって、消化後に、５ｋｂより短
く、より好ましくは０．５ｋｂから２ｋｂを含む範囲内の平均プローブ長を産す
る条件下でおこなった。ゲル電気泳動を、プローブ消化の程度を評価するために
用いてよい。DNaseによる再消化は、平均プローブ長が標的平均長より長い場合
におこなうことができる。
【００６４】 ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（Appplied Biosystems, Inc., アメリカ
合衆国）、或いは他のホスホイメージング又は蛍光イメージング装置上で、標識
化密度に関してプローブを評価した。各色素の異なる放射波長が、各色素の標識
化密度の個々の検出を可能にしたために、フルオレセイン-及びローダミン-関連
色素の使用が有用であった。標識化密度は、標識化密度は、標識プローブの非標
識プローブに対する比の相関によって推定され、シークエンシングゲル上のプロ
ーブ混合物の蛍光強度は、標識化密度の徴候を示すほどである。当然ながら、他
の色素は、本発明の方法において有用である。好ましくは、この色素は、直接に
は重なり合わずに、そしてプローブ／マイクロアレイ複合体の発色団の個々及び
定量的な検出を可能にしない放射最大値を有する。 標識プローブの溶解性は、電荷結合画像装置（「ＣＣＤイメージャー」）を直
接に使用して決定することができる。標識の取り込みの量の増大がプローブの蛍
光強度を増すが、不溶性をも増すので、溶解性は、また、標識化密度との相関（
例えば、標識プローブの非標識プローブに対する比）によって予測された。ＡＢ
Ｉ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（光電子増倍管の電圧設定が７５０−７８０ボ
ルト）上でのアクリルアミドゲル電気泳動によって算定された適切なプローブ強
度には、０．５％の標識プローブ及び５％の５４６-標識プローブの負荷で、非
飽和であるが、可視の蛍光シグナル（GeneScan ソフトウエアパッケージによる
１００−４０００蛍光単位，Applied Biosystem）が含まれる。
【００６５】 検出感度も、プローブ標識化を最大にするために、発色団及びテンプレート核
酸化学両論を調節することに依存する。本発明の一部分として、逆転写酵素によ
るテンプレートＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の間、反応混合液の非標識ｄＮＴＰに
は、標準的手法では通常は必要とされているｄＴＴＰに代わって、非標識ｄＵＴ
Ｐが含まれるべきことが見出された。非標識ｄＴＴＰよりもより低い効率で非標
識ｄＵＴＰが逆転写酵素による取り込みを巡って競合し、それによってプローブ
に取り込まれる発色団の数が増加するために、ｄＴＴＰをｄＵＴＰで置き換える
ことは、ｍＲＮＡ標識化反応の効率を向上させる。 検出感度を向上させるその他の方法としては、本発明では、広く用いられてい
るアルカリではなく、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を用いて親ｍＲＮＡ鎖を
分解することが考慮されている。これは、アルカリが、本発明において有用な発
色団の一つである色素４８８の蛍光発光を減少させるために、ｍＲＮＡ分解にお
けるアルカリの排除が一助となるとして，本発明の一部として見出された。
【００６６】 標識ＤＮＡプローブの調製： 本実施例がＲＮＡからのＤＮＡの調製のための方法を開示する一方で、ＲＮＡ
又はＤＮＡからのＤＮＡプローブが、関連する又は代替用途のためにここで提供
されている開示に基づいて調製され得ることも考慮されている。 本発明によると、ＲＮＡ鎖の伸張は、ｃＤＮＡプローブ合成の初期段階であっ
た。ＲＮＡ鎖伸張に関する基本技術は、ディファレンシャルディスプレイ逆転写
酵素ＰＣＲ（ＤＤＲＴ-ＰＣＲ）によって入手可能である。その技術では、全細
胞性ＲＮＡを、オリゴ-ｄＴ及び４つのデオキシヌクレオチドのうちの任意の２
つからなるアンカープライマーによって、第一ストランド逆転写でプライム化し
た（ＤＤＲＴ-ＰＣＲ；Liang及びPardee, Science, 257: 967-971(1992)，及びR
ussell, D. W.及び１９９９年１月１９日に発行のThigpen, A. E., ＵＳＲＮ５
，８６１，２４８）。本発明の一つ実施態様では、ＲＮＡ鎖伸張では、ｄＡＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、及び発色団標識ｄＵＴＰ、並びに下記に開示
の他の成分の存在下でのマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ-ＲＴ）等
の逆転写酵素による伸張のためのオリゴ-ｄＴＶＮプライマーを用いる。しかし
ながら、増幅がない、或いはＲＮＡ又はｃＤＮＡの１回の増幅のみがおこなわれ
るという点で、本方法はＤＤＲＴ-ＰＣＲとは異なる。ここで開示されたこの方
法は、そのような驚く程までに検出感度を向上させることから、遺伝子発現の検
出及び定量化は、ＰＣＲを基礎とする、又はＴ７を基礎とする増幅を必要としな
い、或いは１回のみのリニア増幅をともなう極めて少量のｍＲＮＡ試料において
おこなわれる。結果として、既存の方法に比べると、この方法は迅速で、利便性
があり、感度がよい。
【００６７】 ｓＤＮＡプローブの調製： 検出可能に標識されたｓＤＮＡプローブを、１ｐｇ−１０ｎｇの全ＲＮＡから
作成した。初発材料の量が少ないために、本実施例には、下記の方法に開示して
いるように、発色団の取り込みの前に１回の増幅が含まれる。「ｓＤＮＡ」とい
う用語は、核酸配列を増幅するための１回（又は随意的に２回）のｃＲＮＡ合成
が後に続き、検出可能に標識したｄＮＴＰの存在下でｃＲＮＡの逆転写によるｓ
ＤＮＡ合成が後に続く、第一及び第二ストランドｃＤＮＡ合成によって全細胞性
ＲＮＡから作成されたＤＮＡを指す。
【００６８】 第一ストランド合成： 各試料の反応へバイアルを加えた：１０ｎｇ 精製全
細胞性ＲＮＡ（実施例１に従って単離）；２μｇ オリゴ-ｄＴＶＮ-Ｔ７プライ
マー（オリゴ-ｄＴは、ｍＲＮＡのpoly-Aテールに相補的な１８ｄＴ残基のオリ
ゴマーを指す；Ｖは、ｄＡ、ｄＣ、及びｄＧを指す；Ｎは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、
及びｄＴを指し、「Ｔ７」は、オリゴが、オリゴの５’末端において、Ｔ７プロ
モーター配列である５'-GAATTCTAAT CGACTCACTATAGT１８-３'（配列番号：１）
を含むことを示す）；そして０．８μｌ ｄＮＴＰ混合物（５００μＭの各ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）。この試料を６５℃で３分間加熱し
、氷上で冷却し、プライマーが全細胞性ＲＮＡ混合物中のｍＲＮＡへアニールす
るように１０分間室温に置いた。各試料へ４μｌの５Ｘ反応バッファー（２５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）；０．５μｌ RNase Block；Superscript II；及び２０μｌの最終容量に２０
０Ｕ Superscript 逆転写酵素（Life Technologies, マディソン，ウィスコンシ
ン，アメリカ合衆国）を添加した。第一ｃＤＮＡストランドを伸張させるために
、この試料を４２℃で１時間インキュベートした。
【００６９】 第二ストランド合成： 第一ストランド合成反応の各試料バイアルへ、次の試
薬を添加した：９１μｌ ＤＥＰＣ水；３０μｌ ５Ｘ反応バッファー、上掲；３
μｌ１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ；１μｌ 大腸菌ＤＮＡリガーゼ；４μｌ大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ；及び１μｌ大腸菌RNaseH。この試料を、１６℃で２時間インキュ
ベートした。 関連する手法では、反応容量を減じ、二重鎖ＤＮＡ及びそれに続くｓＤＮＡプ
ローブの向上した産出のために、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ酵素を用いる
。第一ストランド合成反応の各試料バイアルへ、次の試薬を添加した：１８．１
μｌ ＤＥＰＣ水；１０μｌ ５Ｘ第二スタンダードバッファー（Life Technolog
ies）；１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ；０．３μｌ 大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１０
Ｕ／μｌ）；０．３μｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ酵素（５０Ｕ／μ
ｌ）；及び０．３μｌ大腸菌RNaseH（２Ｕ／μｌ）で、全容量が５０μｌ。この
試料を、１２℃で２時間インキュベートした。 結果として生じた二重鎖ｃＤＮＡは、フェノール：クロロフォルム抽出によっ
て部分精製された。次いで、８５μｌの７．５Ｍ 酢酸アンモニウム、及び６５
０μｌの冷エタノール（およそ０℃）、並びに沈殿のための核酸担体である１μ
ｌ リニアポリアクリルアミド（Ambion, Inc.）の添加によって、このｃＤＮＡ
を沈殿させた。上記に開示したようなより少量の反応のために、２９μｌ ７．
５Ｍ酢酸アンモニウム、及び２２０μｌ 冷エタノール（およそ０℃）、並びに
１μｌ リニアポリアクリルアミドを加えてこの容量を調整した。ｃＤＮＡペレ
ットを、標準技術で洗浄し、そして乾燥させた。
【００７０】 ｃＤＮＡからの転写による増幅： 少量の全細胞のみが入手可能な場合、単一
回のリニア増幅が好ましい。上記の第一及び第二ストランド合成により作成した
二重鎖ｃＤＮＡからの転写ｍＲＮＡによって、増幅が達成された。極めて少量の
全細胞性ＲＮＡが生物試料から入手可能な場合（例えば、１−２０ｐｇの全ＲＮ
Ａ）、反応を記載のように随意的におこない，又は転写反応を続け、或いは２回
のリニア増幅をおこなった。次の手順は、リニア増幅の単発回を示している。 二重鎖ｃＤＮＡを、２０μｌの１Ｘ Ｔ７転写反応バッファー（Ambion, オー
スチン，テキサス，アメリカ合衆国；T7 Megascript（商品名），カタログ番号
１３３７）に再懸濁した。再懸濁ｃＤＮＡへは、次の成分を添加した：８μｌ
ＤＥＰＣ水；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの７５μM溶液をそれぞれ２μｌ
；２μｌ１０Ｘバッファー（Megascript（商品名）キット、Ambion, Inc.）；２
μｌ １０Ｘ Ｔ７ポリメラーゼ。この試料を、３７℃で５時間インキュベートし
た。これらの条件下での終夜にわたるインキュベーションによって産出量が増し
た。反応を、１５μｌ酢酸ナトリウム終止バッファー（７．５Ｍ 酢酸ナトリウ
ム）と１１５μｌＤＥＰＣの添加によって止め、フェノール：クロロホルムで抽
出した。
【００７１】 蛍光発色団の取り込み： 細胞性ＲＮＡが５００ｎｇ−５μｇ又はそれより多
く入手可能ならば、その中のｍＲＮＡから直接に合成されたｃＤＮＡに標識が取
り込まれ得る。全細胞性ＲＮＡからの直接的なｃＤＮＡ合成のためには、次の蛍
光発色団の取り込み手順が有用である。５００ｎｇよりも少ない全細胞性ＲＮＡ
が入手可能であった場合、上記に開示したリニア増幅が好まれる。 増幅後のプローブ合成のために、５ｎｇ−１００ｎｇのｃＲＮＡペレットを、
上記の１Ｘ第一ストランド反応バッファーに懸濁させた。この再懸濁した核酸へ
、次の成分を添加した：１μｇランダム六量体；０．８μｌヌクレオチド混合物
（それぞれ１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及び７ｍＭ ｄＵＴＰ）
；及び容量を１３．５μｌにするＤＥＰＣ水。この核酸を変性させ、試料を３分
間６５℃に、氷上で冷やし、そして室温で１０分間アニーリングすることで、こ
の六量体をアニール化した。随意的には、１００ｎｇから１０μｇのランダム六
量体を反応へ添加した。
【００７２】 次に、蛍光発色団を以下のようにして取り込ませた：各バイアルへは、次の物
が添加された：４μｌ RNase Block；何れかのｄＵＴＰ-フルオロファ（６−１
２μＭ Alexa 546-dUTP又は２５−４０μＭ Alexa488-dUTP）；及び１μｌＭＭ
ＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ）。この反応を、暗所において４２℃で１時間インキ
ュベートした。コントロール及び被験試料から作成したｓＤＮＡプローブを、異
なる、検出可能で識別できる発色団で標識した。例えば、コントロールプローブ
を色素５４６で標識し、被験プローブを色素４８８で標識した。 次のプロトコールによるRNase消化によって、親ＲＮＡ鎖をｓＤＮＡプローブ
混合物から取り除いた。各反応バイアルは、１分間９５℃へ加熱し、続いてＤＮ
Ａ及びＲＮＡ鎖を変性させるために氷上で冷やした。各反応バイアルへ、１μｌ
希釈RNase（５００μｇ／ｍｌで、水で１：５０に希釈；Boehringer-Mannheim）
を添加した。このRNase消化は、３７℃で１５分間続けられた。次いで、次のス
テップをおこなう前までに、反応バイアルを氷上に配した。 本発明の側面として、平均ｓＤＮＡプローブ長は、ｃＲＮＡに対するランダム
六量体プライマーの化学両論によって制御され、平均プローブ長は、０．５−２
ｋｂであった。ｃＲＮＡに対するランダムプライマーの比率が増すにつれて、平
均プローブ長（平均プローブ分子量に関連）は減少した。
【００７３】 全細胞性ＲＮＡから標識ｃＤＮＡプローブの直接的な調製： その他の側面で
は、本発明には、上記にて開示した第一ストランド合成方法による、第一ストラ
ンド合成のための反応混合物へ検出可能な標識ｄＮＴＰを取り込ませることによ
って、全細胞性ＲＮＡから直接に標識ｃＤＮＡプローブを調製する方法が含まれ
る。 この方法によると、直接の標識取り込みによる第一ストランドｃＤＮＡ合成は
、次のようにおこなわれた。各試料へ，反応バイアルを加えた：１−１０μｇ精
製全細胞性ＲＮＡ（実施例１によって単離）；２μｇオリゴ-ｄＴＶＮ-Ｔ７プラ
イマー（オリゴ-ｄＴは、ｍＲＮＡのpoly-Ａテールに対して相補的な１８ｄＴ残
基のオリゴマーを指す；Ｖは、ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、及びｄＧを指す；Ｎは
、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴを指し、「Ｔ７」は、オリゴが、オリゴの５’末
端において、Ｔ７プロモーター配列である５'-GAATTCTAATCGACTCACTATAGT１８-
３'（配列番号：１）を含むことを示す）；そして０．８μｌ ｄＮＴＰ混合物（
５００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）。この試料を６
５℃で３分間加熱し、氷上で冷却し、プライマーが全細胞性ＲＮＡ混合物中のｍ
ＲＮＡへアニールするように１０分間室温に置いた。各試料へ４μｌの５Ｘ反応
バッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）；０．５μｌ RNase Block；Superscript II；及び２０
μｌの最終容量に２００Ｕ Superscript 逆転写酵素（Life Technologies, マデ
ィソン，ウィスコンシン，アメリカ合衆国）を添加した。第一ｃＤＮＡストラン
ドを伸張させるために、この試料を４２℃で１時間インキュベートした。
【００７４】 次に、DNaseによる限定消化によって、平均ｃＤＮＡプローブ長を調製した。
各バイアル中のｃＤＮＡ反応容量を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で５０μｌに調製し
、氷上で冷やした。希釈DNaseＩ溶液は、１の割合のDNaseＩ（１０，０００Ｕ／
ｍｌ；Boehringer-Mannheim）を含む５０００の割合の２０ｍＭ Trisバッファー
、ｐＨ８．０で調製した。DNaseＩの最終希釈は、およそ２Ｕ／ｍｌであった。
希釈DNaseI（２Ｕ／ｍｌ）の２μｌアリコートを、色素５４６で標識されたｃＤ
ＮＡプローブを含む各バイアルへ添加し、希釈DNaseＩを、色素４８８で標識し
たｃＤＮＡプローブを含むバイアルへ添加した。異なる発色団及び投入ｃＤＮＡ
へ適合する必要から、DNaseの条件は変化し得る。このバイアルは、３０分間に
わたって１２℃でインキュベートされた。次に、各バイアルへ５μｌの２５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加えた。各バイアルを６５℃で１５分間加熱すること
で、DNaseＩを不活性化させた。標識されたｃＤＮＡは、標準フェノール：クロ
ロホルム抽出と、それに続くＧ５０スピンカラム（Pharmacia）での抽出した水
層の精製によってタンパク質から分離した。スピンカラムから溶出された各水溶
液へ、３μｌアリコートの１０ＸＳＳＣ溶液を加えた。ｃＤＮＡプローブペレッ
トを乾燥させ、暗所において、少なくとも３−４時間にわたって室温で５０：５
０のホルムアルデヒド：水の溶液の６μｌアリコートに再懸濁した。一度、蛍光
発色団がプローブへ取り込まれると、そのプローブは、使用する準備ができるま
で、好ましくは暗所において０℃又はそれより低い温度で保持された。再懸濁さ
れた標識ｃＤＮＡプローブは、ここで開示されているように、マイクロアレイと
のハイブリダイゼーションにとって有用である。
【００７５】 第一ストランドｃＤＮＡからの直接的な標識ｓＤＮＡプローブの調製： その
他の側面では、中間のｃＲＮＡ合成なしで、ｃＤＮＡから直接に標識ｓＤＮＡプ
ローブを調製する方法が含まれる（増幅無しで）。このプローブは、標識の同時
取り込みをともなう第二ストランドｓＤＮＡ合成によって調製される。平均プロ
ーブ長は、最後の標識段階におけるランダムプライマーの使用によって調節され
る。この方法は、下記の方法による標識ｃＤＮＡプローブの調製の方法に類似し
ている。このプローブ標識化には、上記に開示した二重鎖ｃＤＮＡ調製が含まれ
、その後には、蛍光性デオキシヌクレオチド及びランダムプライマーを使用した
センス鎖ＤＮＡ（ｓＤＮＡ）の標識化が続く。非標識第一ストランドＤＮＡは、
ビオチン標識プライマーを用いて合成し、ハイブリダイゼーションでの競合を避
けるために、ストレプトアビジンを用いて取り除くことができる。本方法の限定
されない例が後に続く。
【００７６】 試料からのＲＮＡの単離： ＲＮＡを凍結組織、レーザー捕獲マイクロダイセ
クション（ＬＣＭ）によって単離した試料、又はＲＮＡレイター試薬（Ambion,
オースチン，テキサス，又はQiagen, バレンシア，カリフォルニア）で貯蔵した
組織から、ＲＮＡを調製した。RNeasy Mini又はMidi RNA精製キット（Qiagen,
バレンシア，カリフォルニア）のＲＬＴバッファーで、ローター-ステータ組織
ホモジナイザー（IKA labortechnik, シュタウフェン, ドイツ，又はBrinkman I
nstruments, ウェストベリー, ニューヨーク）によって試料をホモジナイズした
。精製ＲＮＡは、ＵＶ分光光度計（Shimadzu, プレザントン, カリフォルニア）
によって２６０ｎｍの光学吸収を測定することによって定量化した。少量の組織
から精製したＲＮＡ（＜１μｇの組織、又はＬＣＭ組織試料）に関しては、Ribo
Green RNA 定量化アッセイ（Molecular Probes, ユージーン，オレゴン）を、蛍
光マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, サニーベール, カリフォル
ニア）とともに用いた。
【００７７】 第一ストランドｃＤＮＡ合成： 第一ストランドｃＤＮＡを、Ｖ＝Ｇ，Ａ，又
はＣ、そしてＣ及びＮ＝Ｇ，Ａ，Ｔ又はＣである５'-ビオチン標識（ｄＴ）１８ ＶＮを用いて、製造者（Life Technologies, ロックビル，メリーランド）によ
って示されたように、Superscript 逆転写酵素を使用して０．５−５μｇの全Ｒ
ＮＡから合成した。次いで、ＲＮＡを、１０ｎｇのRNaseＡフリーのDNase（Roch
e Molecular Biochemicals, インディアナポリス，インディアナ）で３７℃で１
５分間にわたって消化した。この反応は、水飽和フェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（４９：４９：２）で抽出した。リニアアクリルアミドは、
最終濃度が１８ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。３Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ４．
８の３分の１容量を添加し、等容量の氷冷イソプロパノールを加えることによっ
てｃＤＮＡを沈殿させた。試料を、２０分間−２０℃でインキュベートし、４℃
で２０分間にわたって１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして透明なペレット
から上澄みを吸引して、そのペレットを真空乾燥させた。
【００７８】 蛍光発光団取り込みの第二ストランドｃＤＮＡ合成： 第二ストランドｃＤＮ
Ａは、最終濃度を１００ｍＭとする、２ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片（Life Technologies, ロックビル，メリーランド）、１から５０μｇ
のp(dN)６（Life Technologies, ロックビル，メリーランド）又は７から９塩基
の他のランダム配列オリゴヌクレオチド、１００μＭの各ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、
及びｄＡＴＰ、そしてｄＴＴＰとAlexa488-ｄＵＴＰ（Molecular Probes, ユー
ジーン，オレゴン）の組み合わせを使用した２０μｌ反応液で合成した。ｄＴＴ
ＰのAlexa488-ｄＵＴＰに対する比率は、１００：１ｄＴＴＰ対Alexa488-ｄＵＴ
Ｐから１００％Alexa488-ｄＵＴＰまで変動する。Alexa594-ｄＵＴＰも、このプ
ロトコールによって用いられる。標準作動濃度の５０ｍＭに加えて、ＮａＣｌを
添加してもよく、それによって濃度がおよそ１５０ｍＭまで増加する。この反応
には、酵素の供給元（Life Technologies, ロックビル，メリーランド）によっ
て供給された反応バッファー成分が含まれた。反応は、最初に、５分間にわたっ
て反応混合液を９５℃までに加熱することによって開始され、次いで氷上で急冷
し、続いてクレノウ酵素を添加した。この反応を、１時間から１８時間、１２℃
から３７℃の温度範囲でインキュベートした。反応は、ＥＤＴＡを２５ｍＭとな
るまで添加し、５分間にわたって９５℃で加熱し、そして氷上で急冷することに
よって停止させた。ビオチン-タグ（−）ストランドｃＤＮＡは、ストレプトア
ビジン-常磁性粒子（ＳＡ-ＰＭＰ）（Promega, マディソン，ウィスコンシン）
を使用してランダム-プライム（＋）-ストランド標準標識ｃＤＮＡから分離する
。ＳＡ-ＰＭＰは、０．５Ｘ ＳＳＣで３回、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．５で１回洗浄することで調製した。標識ｃＤＮＡ反応は、１０分間
、室温でＳＡ-ＰＭＰとインキュベートし、磁気スタンド上のＳＡ-ＰＡＰから上
澄みを取り除いた。結果として生じた標識（＋）ストランドｃＤＮＡを、水飽和
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：４９：２）で抽出し
、Ｇ-５０スピンカラム（Pharmacia）で精製し、そしてハイブリダイゼーション
反応に使用する前に真空乾燥した。
【００７９】 標識ｃＲＮＡプローブの調製： 本発明に従い、蛍光発光団で標識したリボヌ
クレオチドをＲＮＡへ直接に取り込ませて、続いて平均プローブ長を整えること
によって、標識ｃＲＮＡプローブの調製をおこなった。この方法は、以下の修飾
による標識ｃＤＮＡプローブの調製方法と類似している。ｃＲＮＡプローブ合成
は、上掲に開示したように、二重鎖標準ｃＤＮＡ調製の段階から始まる。 調製した二重鎖標準ｃＤＮＡを、２０μｌの１Ｘ Ｔ７転写反応バッファー（A
mbion, オースチン，テキサス，アメリカ合衆国；T7 Megascript（商品名）キッ
ト，カタログ番号１３３７）に再懸濁した。この再懸濁ｃＤＮＡへは、次の成分
を添加した：８μｌ ＤＥＰＣ水；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの３．７５
ｍM溶液をそれぞれ２μｌ；２μｌ１０Ｘバッファー（Megascript（商品名）キ
ット、Ambion, Inc.）；２μｌ １０Ｘ Ｔ７ポリメラーゼ。各バイアルへは、次
のものを添加した：４μｌ RNase Block；何れかのｄＵＴＰ-フルオロファ（６
０μＭ Alexa 546-dUTP（好ましくは、３０から１２０μＭを含む範囲）又は３
００μＭ Alexa 488-UTP（好ましくは、２００から４００μMを含む範囲））。
この試料を、３７℃で５時間インキュベート、又はさらに産生を向上させるため
に一晩インキュベートした。この反応を１５μｌ酢酸ナトリウム終止バッファー
（７．５Ｍ 酢酸ナトリウム）と１１５μｌＤＥＰＣの添加によって止め、フェ
ノール：クロロホルムで抽出した。核酸は、等容量のイソプロパノールによって
沈殿させた。この方法を用いて、ｃＲＮＡプローブをコントロール及び被験試料
から作成し、異なる検出可能で識別可能な発色団で標識した。例えば、コントロ
ールプローブを色素５４６で標識し、被験プローブを色素４８８で標識した。
【００８０】 好ましい平均ｃＲＮＡプローブは、０．５ｋｂから３ｋｂを含む範囲である。
平均プローブ長及びｃＲＮＡプローブの標識密度は、ＡＢＩ３７３Ａゲル（Appl
ied Biosystems, アメリカ合衆国）のようなシークエンシングゲル上に観察され
たプローブによって推定された。標識密度は、標識密度の増加と標識ｃＲＮＡプ
ローブの非標識ｃＲＮＡプローブに対する比率の間に観察された相関によって推
定された。 平均長が減じられるべきと判定されたならば、沈殿した、標識ｃＲＮＡプロー
ブを４０ｍＭ tris-酢酸、ｐＨ８．１、１００ｍＭ 酢酸カリウムに再懸濁する
ことによって，標識ｃＲＮＡプローブ長を調整した。この再懸濁した、標識ｃＲ
ＮＡプローブを、７０℃で１０分間インキュベートした。随意的には、ｃＲＮＡ
プローブの平均長を減じるために、穏和なRNase消化を用いてもよい。反応条件
が変化し、開始の平均プローブ長及び標識密度によって容易に調整されることが
知られている。一度蛍光発光団がプローブへ取り込まれると、このプローブは、
使用されるまで、好ましくは暗所で０℃又はそれより低い温度で保存される。再
懸した標識ｃＤＮＡプローブは、本発明のマイクロアレイとのハイブリダイゼー
ションにとって有用である。
【００８１】 好ましい平均ＤＮＡプローブ、ｓＤＮＡプローブ、又はｃＲＮＡプローブ長は
、０．５ｋｂから３ｋｂを含む、好ましくは０．５ｋｂから約２ｋｂを含んでい
た。平均プローブ長及びｓＤＮＡプローブの標識密度は、ＡＢＩ３７３Ａゲル（
Applied Biosystems, アメリカ合衆国）のようなシークエンシングゲル上に観察
されたプローブによって推定された。標識密度は、標識密度の増加と標識ｃＲＮ
Ａプローブの非標識ｃＲＮＡプローブに対する比率の間に観察された相関によっ
て推定された。ｃＤＮＡプローブの平均長は、好ましくは，ここで開示の穏和な
Dnase消化によって調整させる。
【００８２】 マイクロアレイ分析のためのコントロールの分析： 本実施例では、癌腫、上
皮組織の癌は、非癌性組織と対比させて遺伝子発現について研究された。この目
的に関しては、適合した非癌性組織（すなわち「正常」組織）は，利用が限られ
ている。「普遍的な」上皮コントロールは、肝臓、腎臓、及び肺を含む上皮起源
の非癌牲組織をプールすることによって調製された。プールした組織から単離し
たＲＮＡは、これら組織から発現された遺伝子産物の混合物を表す。「コントロ
ール」試料として以下に示したプールコントロールは、腫瘍組織及び腫瘍形成細
胞株の相対的遺伝子発現研究に関する効果的なコントロールであった。プールし
たコントロール試料を用いたマイクアレイハイブリダイゼーション実験によって
、ここに開示した２色分析でのリニアプロットを作成した。被験及びコントロー
ル試料が少量のレベルの遺伝子発現を有することから、コントロール及び被験プ
ローブと複合体を形成するすべての標的分子に関する密度データのプロットは、
データのリニアなクラスター形成を産した。２色分析において、これらデータと
適合した傾斜線は、次いで、各実験における被験のコントロールに対する比率を
標準化するために使用された。種々の実験からの標準化比率は、次いで、遺伝子
発現のクラスター形成、並びに多くの異なる組織試料にまたがる、正常組織に対
して疾病組織で差次的に発現している遺伝子を同定するために比較され、使用さ
れた。従って、プール化された「普遍的な」コントロール試料は、単純な２色比
較における効果的な相対遺伝子発現の確定を可能にするだけでなく、幾つかの実
験にまたがる多試料比較をも可能にする。
【００８３】 実施例３：マイクロアレイスライド調製 核酸マイクロアレイ調製における標的分子ポリヌクレオチドの結合のための活
性化ガラススライドは、一般的に、ポリリジン（例えば、米国特許第５，７６０
，５２２号を参照せよ）又はオルガノシラン（例えば、ＷＯ０１／０６０１１；
ＷＯ００／４０５９３；米国特許第５，７６０，１３０号；及びWeilerら., Nuc
liec Acids Research 25(14): 2792-2799(1997)）。本発明の目的に関しては、
ここに開示しているように、核酸上の共有結合している一級アミンを介する特定
核酸配列末端の結合が可能であるために、ガラススライドのオルガノシランを基
礎とする処理が好まれた。そのような特定の結合は、マイクロアレイスライド上
での核酸配列の特異的ポジショニングにとって有益であり、それによって、それ
が自由にプローブの相補的配列とハイブリダイズすることが可能となる一方で、
核酸の結合を確かなものにする。 被修飾核酸（例えば、標的核酸）でさえも、３-アミノプロパルトリエチルオ
キシレン（ＡＰＳ）で処理し、フェニレンジイソチオシアン酸 を結合させたガ
ラススライドと結合することができることが、本発明の一部分として見出され、
このことは、また、核酸が機能基を非修飾ＤＮＡへ結合させ得ることを示唆して
いる（例えば、ＰＣＲによって配列させるために核酸を増幅するために使用した
非修飾プロモーターの５’末端において、又は非修飾ＤＮＡ塩基上のアミン）。
従って、本発明には、本発明の活性化マイクロアレイスライドへの非修飾ポリヌ
クレオチドの結合が含まれる。
【００８４】 本発明では、ガラススライドのシラン処理に使用した溶剤が、マイクロアレイ
分析において観察された蛍光バックグランドに対して顕著な影響を有することも
見出された。ガラススライド処理の間にシランを溶解させるために広く使用され
ている溶剤であるアセトンは、画像化の間、高い及び／又は非均一な蛍光バック
グラウンドを生じた。メタノールは、時折、シラン処理化のための溶剤として使
用された（例えば、<http://sgio2.biotec.psu.edu/protocols/silanize.html>
（最後に参照したのは２００１年３月１３日）を参照せよ。メタノール中に存在
する水がシラン処理反応を止め、ガラスマイクロアレイアッセイスライドの効果
的な被膜を限定してしまうため、メタノールは有益ではない。シラン処理のため
の他の方法の例における、トルエン以外の溶剤としては、ＷＯ０１／０６０１１
；ＷＯ００／４０５９３；米国特許第５，７６０，１３０号；及びWeilerら., (
1997), 上掲を参照せよ）。最大の信号対雑音比及び最も高い感度のためには効
果的なシラン処理と低いバックグラウンドが好まれるために、代替溶剤が求めら
れていた。高い蛍光バックグラウンドを避ける一方で、より長いガラス処理が最
適被膜を確かにするために使用できることから、トルエンがシラン処理にとって
優れた溶剤であることが見出された。アセトンは、本発明のガラススライド処理
方法においてなお有用であるが、その用途は、好ましくは、アセトンとの接触が
比較的に短い期間である乾燥の段階に限定される。
【００８５】 活性化マイクロアレイスライド： 本発明の方法によると、ガラススライドは、それらを核酸マイクロアレイスラ
イドの作成に使用するために調製する以下のプロトコールを使用して処理される
。
【００８６】 ガラススライドの洗浄： ガラスマイクロスコープスライド（標準サイズ）を
本実験のために使用した。この方法を通して、スライドを溶剤を通さない手袋を
はめた手で扱った。３０のスライドをクリーンな金属ラックに負荷し、そのラッ
クを、例えば逆浸透（「ＳＱ水」と命名；MilliQ（商品名）システム，Millipor
e Corp., ベッドフォード，マサチューセッツ）によって、高純水中の１％Liqui
nox（商品名）（Alconox, ニューヨーク，ニューヨーク）で満たしたきれいな超
音波洗浄器チャンバーに沈めた。Liquinox溶液を、スライドを浸す前に、超音波
洗浄器クリナーの中でおよそ５０℃まで加熱した。このスライドは、超音波的に
５０℃で３０分間洗浄した。Liquinoxの同じ溶液を、およそバッチあたり３０ス
ライドの４バッチ洗浄するために使用してもよい。洗浄後、このスライドを脱イ
オン水で満たしたプラスチック容器に移した。このプラスチック容器は、外部の
物質によるスライドの汚染を避けるために、好ましくは、洗浄されたスライドを
すすぎ洗いするためのみに使用した。スライドを流水中の脱イオン水によって３
回洗浄し、次いでシェーカーに廃した。すすぎ洗い及び振盪の段階を６回繰り返
して十分にすすぎ洗いしたことを確認した。最後のすすぎ洗いは、ＳＱ水であっ
た。このスライドは、使用するまでＳＱ水の中で貯蔵した。
【００８７】 本発明による好ましい洗浄方法では、スライドをラックあたり２０スライドで
あるカラスラックに負荷し、例えば逆浸透（「ＳＱ水」と命名；MilliQ（商品名
）システム，Millipore Corp., ベッドフォード，マサチューセッツ）によって
、高純水中の３％ＧＬＰＣ-酸（商品名）で満たしたきれいな超音波クリーナー
チャンバーで、６５℃で２０分間洗浄した。洗浄の後、このスライドを脱イオン
水で徹底的に洗浄した。次いで、このスライドを、０．５％水酸化ナトリウム、
５０％エタノールを含有する超音波クリーナーチャンバーに配し、６５℃で１０
分間処理した。このスライドを脱イオン水によってかなり徹底的にすすぎ洗いし
、最終のすすぎ洗いをＳＱ水でおこなった。このスライドは、翌日の使用までＳ
Ｑ水中で貯蔵した。 スライドのシラン処理に続くすべての方法は、よく換気されたヒューム・フー
ド内でおこなわれた。
【００８８】 乾燥スライド： きれいなスライドを金属ラック中のガラスチャンバーへ移し
た。このスライドはアセトンで覆われ、短く振盪し、そしてアセトンを除いた。
スライドから水気を切り、そしてヒューム・フードで乾燥させる。このスライド
は、フード中のガラスチャンバーの後ろに配し、及び／又はアセトンを除いた後
にガラスチャンバーに戻して配し、そのチャンバーを乾燥することによって、ヒ
ューム・フードに汲み出され得るほこりっぽい空気に曝されることから保護され
た。水とアセトンに問題があるため、スライドは、乾燥し、これら溶剤が無くな
るまでガラスチャンバーの中にとどめた：水はシラン処理を妨害し、アセトンは
高い蛍光バックグラウンドを生じた。
【００８９】 シラン化ガラススライド： スクリュー-キャップコプリンジャーを完璧に洗
浄し、乾燥した。好ましくは、乾燥は乾燥オーブンでおこなう。このきれいなス
ライドを、スライドを角でのみ取り扱うことによって、手袋を着けた手とピンセ
ットを使用して乾燥染色ジャーへ移した。トルエン中の１０％ ３-アミノプロピ
ルトリエトキシシランの溶液（実質上は、Burdick 及びjacksonから購入したよ
うに無水）は、シランをトルエンへ添加し、回旋して混ぜることによって調製し
た。混合した直後に、このシラン溶液を各ジャーのスライドへ注いだ。およそ５
５０ｍｌのシラン溶液が６のジャーを満たした。このジャーを素早くスクリュー
-キャップで覆い、各ジャーから空気と湿気を排除してスライド上のシランの沈
殿を避けた。このスライドを、一晩にわたってシラン処理した。 本発明によるガラススライドをシラン処理する好ましい方法では、トルエン（
試薬グレード）中の２％ ３-アミノプロピルトリエトキシシランは、シランをト
ルエンへ添加し、回旋して混ぜることによって調製した。混合した直後に、この
シラン溶液を各ジャーのスライドへ注いだ。ガラスチャンバーを、完全に最上層
の端まで満たし、ふたを最上層に配した。このスライドを、室温で、１−４時間
にわたってシラン処理した。好ましくは、５％ＮａＯＨ、５％エタノールで洗浄
したガラススライドへ、２％シラン処理方法を適用した（上掲に開示）。
【００９０】 シラン化スライドの洗浄： シラン処理の後、スライドを以下の方法によって
洗浄した。スライドラックを含むガラス洗浄チャンバーをトルエンで満たした。
１０スライドを保持するガラスチャンバーを２５０ｍｌトルエンで満たし、２０
スライドを保持するチャンバーは、およそ４００ｍｌトルエンを必要とする。シ
ラン化スライドを、移す間にスライドを乾燥させずに、ピンセットを使用してス
ライドを角でのみ取り扱うことによって、シラン処理溶液からガラスチャンバー
中のトルエンに浸したラックに移した。その他の洗浄方法、及びシラン処理期間
の最後では、シラン処理チャンバーを空にして、そしてトルエンで満たし、スラ
イドのラック覆った。 これら洗浄方法の何れかにおけるこの時点では、きれいなガラスふたをチャン
バーの最上層に配し、このチャンバーを２−６分間撹拌した。トルエンを、チャ
ンバーから廃した。トルエン洗浄を，繰り返し２度おこなった。洗浄の間は、ス
ライドを乾燥しなかった。
【００９１】 三度目のトルエンを廃し、チャンバーのドレイン排出をおこない、そしてチャ
ンバーへメタノールを添加した。スライドをメタノールへ浸し、およそ５分間撹
拌した。スライドを、一回の洗浄あたり５分間のＳＱ水中での撹拌を二度おこな
うことで洗浄した。次いで、このスライドを、およそ４−５分間の撹拌によるメ
タノールで洗浄をした。 最後の洗浄段階として、スライドを、アセトンで１分からスピード乾燥した。
このスライドは、ヒューム・フード内で完全に乾燥させた。洗浄段階で使用する
空のガラスチャンバーにこのスライドを配することで、スライドをちりから保護
した。この段階では、スライドは、およそ１時間安定であった。アセトン洗浄に
続くその他の方法では、スライドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）ですすぎ洗
いした。次いで、このＤＭＦは、チャンバーで，ドレイン排出した。これら洗浄
方法の後、二機能性リンカー試薬の結合のために、スライドを調製した。
【００９２】 シラン処理化スライドへのＰＤＩＴＣの結合： ガラススライドの一つの末端
上のシラン、並びに他の末端上のアミノ誘導化マイクロアレイＤＮＡと反応する
ことが可能な二機能性架橋結合剤（Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniqu
es, Academic Press(1996)）である、１，４-フェニレンジイソチオシアネート
を使用して、シラン処理化スライドの表面を隣架橋した。マイクロアレイＤＮＡ
は、従って、ガラス表面と堅く結合した。このＰＤＩＴＣ結合は、しかしながら
、水感受性である。結果として、標的ポリヌクレオチドのような標的分子の結合
の後まで、このスライドは無水でなければならない。 ＰＤＩＴＣ溶液は、次のようにして調製した。９０％ジメチルホルムアルデヒ
ド（ＤＭＦ）及び１０％ピリジンの溶液に対して、固体ＰＤＩＴＣの適量を添加
して０．２０−０．２５％ＰＤＩＴＣの濃度とし、所望の通りに、この溶液は黄
色であった。その反応性のために、固体ＰＤＩＴＣは迅速に扱われ、そしてアル
ゴンの下に貯蔵された。
【００９３】 このＰＤＩＴＣ溶液は、ヒューム・フード内のガラスチャンバーにまだあるシ
ラン処理されたスライドから溢れ出て、そしてチャンバーは完全に満たされた。
ガラスふたをチャンバーの上に配し、各チャンバーはフォイルで覆われて光りに
曝されることからブロックされた。このスライドは、２時間にわたってＰＤＩＴ
Ｃ中でインキュベートされた。 インキュベーションに続き、ＰＤＩＴＣ溶液を除いた。ＤＭＦをチャンバーへ
添加し、スライドを３−５分間撹拌した。このＤＭＦ洗浄を、一回の洗浄につき
およそ５分間撹拌することによって、さらに２回繰り返した。 次いで、このスライドを二度、メタノールによって３−５分間撹拌することで
洗浄した。このスライドを、一回の洗浄あたり３−５分間のアセトンによる撹拌
を３回おこなうことで洗浄した。次いで、このスライドをヒューム・フード内で
完全に乾燥させ、ちりから保護した。ＰＤＩＴＣ-処理スライドは、次に乾燥キ
ャビネットで貯蔵した。このスライドは、これら条件下では少なくとも３ヶ月に
わたって安定であった。
【００９４】 実施例４ 活性化マイクロアレイスライドへの標的分子の結合： マイクロアレイは、使用者によって調製されるか、又は商業的に購入されると
理解される。スライドガラスへのマイクロアレイの描画は、例えば、米国特許第
6,040,138号に記載されている。一般的に、スライドガラス上のＤＮＡマイクロ
アレイは、少なくとも１００、好ましくは少なくとも４００又はそれ以上の、少
なくとも部分的に知られた配列のＤＮＡサンプルを、スライド上の知られた位置
に、１平方センチメートル当たり少なくとも６０オリゴヌクレオチド配列の密度
で含んでいる。マイクロアレイ配列は、５−１００ヌクレオチド長であってもよ
く、又は配列は５０ｎｔから１０ｋｂ長、又は全長遺伝子配列であってもよい。
各配列の十分な部分が他の配列から識別可能な程度に知られており、標識された
プローブに使用する条件下でハイブリダイズするために十分な長さでなければな
らない。
【００９５】 標的核酸配列の調製： この実施例では対象とする核酸配列（「標的配列」、「標的ポリヌクレオチド
」又は「標的」）は、全長又は一部のｃＤＮＡクローンから生成された。場合に
よっては、標的は、取り扱いやすくするためにベクターにクローニングした。標
的配列（即ち、対象とする非-ベクター核酸配列）は、「Klentaq GC melt」DNA
ポリメラーゼ」（Clontech）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
増幅した。この酵素は、均一な収率で、長さ（０．２５−４ｋｂ）及びヌクレオ
チド組成の両方で変化するテンプレート範囲に渡って、ＤＮＡ挿入物の増幅の高
い成功率を与えた。
【００９６】 ここに開示されるように、非修飾ポリヌクレオチドは、トルエン中のオルガノ
シランでシラン化され、次いで非修飾ポリヌクレオチドと反応することのできる
多官能性リンカー試薬との反応によって調製された活性化されたスライドガラス
に直接結合する。この実施例において開示するように、オルガノシランはＡＰＳ
であり、多官能性リンカー試薬はＰＤＩＴＣであってよい。
【００９７】 あるいは、標的分子は反応性基の標的分子内への導入により修飾してもよく、
その反応性基は、本発明の活性化されたマイクロアレイスライドの多官能性リン
カー試薬の官能基と反応性である。本発明のこの代替的方法及び同時に起こる標
的配列の増幅により、増幅された標的は修飾され、マイクロアレイの固体支持体
への共有結合を包含した。同時の増幅及び修飾を達成するために、ＰＣＲプライ
マーは少なくとも２つの特徴を有していた。第１に、ＰＣＲプライマーは標的Ｄ
ＮＡが挿入されるベクター配列と相補的であり、それにより完全な標的配列の増
幅を確実にした。さらに、修飾された一本鎖標的ＤＮＡが生成されるプライマー
は、反応性部分：プライマーの５'末端にリンカー、好ましくは-(ＣＨ２)６-リ
ンカー等のアルキルリンカーを介して結合した第１級アミンを有していた。この
実施例の目的のために、そのようなプライマーは以下の一般構造を有していた：
５'ＮＨ２-(ＣＨ２)６-ｄＮｘ３'、但し、ＮＨ２は第１級アミン基、(ＣＨ２)６ はメチレンリンカー、ｄＮｘはヌクレオチド配列、好ましくは、標的ＤＮＡ が
挿入されたベクターの一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列（この実施例のＤ
ＮＡ）である（プライマーは、ジェネンテック、インク、サン フランシスコ,
カリフォルニア，アメリカ合衆国で調製した）。好ましくは、ｄＮｘ配列は標的
挿入物の近傍のベクター配列にハイブリダイズし、標的配列に隣接する２つのベ
クター特異的プライマーを用いてプライマーの標的配列への酵素駆動伸長がなさ
れる。核酸合成は、標的配列に相補的な二本鎖核酸配列の形成をもたらし、その
相補的領域は少なくとも１０ヌクレオチド塩基の長さである。よって、ＰＣＲ増
幅に従って、各標的配列は５'末端に第１級アミン基を有し、そのアミン基は活
性化されたスライド上の反応性基と反応できる。例えば、ここに非限定的な例に
よって開示されるように、ポリヌクレオチドに導入された第１級アミンは、活性
化されたスライドガラス上でのポリヌクレオチドの固定化を可能にする。本発明
によれば、スライドガラスはオルガノシランでのトルエン中のシラン化により活
性化され、次いでそれは多官能性リンカー試薬と反応する。多官能性リンカー試
薬は、ガラス表面上のオルガノシラン及び上記した修飾ポリヌクレオチドの第１
級アミンの両方と反応性である。
【００９８】 活性化スライドへの固定化に先立って、ＰＣＲ増幅された二本鎖標的ＤＮＡ配
列は、ガラスファイバーフィルター（Qiagen, バレンシア, カリフォルニア）を
用いて精製された。精製された配列の一部をアガロースゲル電気泳動により正し
い分子量、精度（例えば、クローン又は遺伝子の混合物ではなく単一の生成物を
示す一本のバンド）及びＤＮＡのおよその収率（標準的手法に従う臭化エチジウ
ムでの蛍光染色で見積もった）について分析した。
【００９９】 第１級アミン修飾標的配列は、修飾標的ＤＮＡとＰＤＩＴＣ誘導されたシラン
化ガラス表面との反応を促進し、標的ＤＮＡのスライドガラスへの共有結合をも
たらすアレイ化バッファー（500mM塩化ナトリウム、100mMホウ酸ナトリウム、pH
9.3）中に懸濁した。スライドは、本発明に従う使用準備が整っており、スライ
ドを環境温度及び湿度において暗中で終夜、約１０−１６時間放置した場合に、
増大した結合及び向上した検出が達成された。少なくとも０．１μg/μlの修飾
標的配列の増度は、活性化スライドガラスへの良好な共有結合、良好なスポット
モルホロジー、及び十分な量の共有結合した標的配列の数を与え、それは続くハ
イブリダイゼーション反応の間に適用される蛍光標識ｃＤＮＡプローブに対して
過剰量であった。このことにより、プローブハイブリダイゼーションの後に得ら
れた絶対的な蛍光シグナルの定量的測定が可能となった。
【０１００】 この実施例では、本発明に従って調製されたシラン化、ＰＤＩＴＣ処理スライ
ドガラスへの、遺伝子配列等の核酸の結合のために２工程プロトコールが使用さ
れた。本発明に従ってアセトン又はアルコールの不在下でシラン化工程がトルエ
ン中で実施される限り、工程数が少なくても多くてもよいと理解される。
【０１０１】 上記で開示されたように、スライドは最初にトルエン中の３-アミノプロピル
トリエトキシシラン（ＡＰＳ）でシラン化された。このスライドは、次いで、Ｐ
ＤＩＴＣ（１,４-フェニレンジイソチオシアネート）という２つのアミン反応性
イソチオシアネート基を有する多官能性リンカー試薬で処理された。イソチオシ
アネート基の一方はオルガノシランのアミン基と反応する。第２のイソチオシア
ネート基は修飾標的ＤＮＡの５'末端に存在する第１級アミン（実施例１参照）
と反応でき、それによりＤＮＡのマイクロアレイへのスポット中に標的ＤＮＡを
スライドガラスへの結合手段を提供する。修飾標的配列を結合させた後、スライ
ドを0.2%ＳＤＳを含む水で１回洗浄し、次いでＳＱ水で３回洗浄し、最後にエタ
ノールに浸漬して乾燥させた。本発明の方法に従って洗浄し、シラン化し、ＰＤ
ＩＴＣ処理したスライドは、蛍光バックグラウンドが最小化され、整列された標
的ＤＮＡの過剰結合を最小にすることによってハイブリダイゼーションが促進さ
れ、それにより従来の方法を越える検出レベルの驚くべき向上をもたらしたこと
から、核酸マイクロアレイにとって優れた基質であった。
【０１０２】 一本鎖標的オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ 一本鎖標的オリゴヌクレオチドを含む改善されたマイクロアレイは本発明に包
含される。アレイ及びその作製方法の非-限定的な例を以下に示す。 アレイ製造のための一本鎖標的ＤＮＡは、３'-Ｃ７アミノリンカー（Glenn Re
search, スターリング, バージニア）での標準的な固相法により、合成ＤＮＡの
３'-末端とＣ７リンカーとの間に導入されるヘキシレングリコールスぺーサー（
Ｓ１８）（Glenn Research, スターリング, バージニア）有又は無で合成した。
【０１０３】 一本鎖ＤＮＡ分子、例えば化学的に合成された約５０から１００ヌクレオチド
長のオリゴヌクレオチドは、本発明の活性化マイクロアレイスライド（例えば、
トルエン中アミノシラン／ＰＤＩＴＣ処理ガラス）上に、標準的なマイクロアレ
イ印刷技術によって固定化した。印刷溶液は、0.1Mホウ酸塩中１０μMまでの濃
度のオリゴヌクレオチド、0.5MのＮａＣｌ、pH9.3を含んでいた。スライドは、
２０℃、環境湿度において終夜乾燥させた。本発明の一部として、終夜の乾燥が
、本発明のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするときに向上した蛍光
シグナルを与えることが見出された。 向上した検出シグナルは、上記したような相補的蛍光標識１００ｍｅｒ一本鎖
ＤＮＡ断片の一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーショ
ンにより示され、ハイブリダイゼーションシグナルの強度が固定化されたＤＮＡ
長に依存し、ＤＮＡ鎖が長いと、より強いシグナルを与えることが明らかになっ
た。さらに、Ｓ１８リピートの数を０から６に変化させることにより、鎖長の増
加に伴うシグナル強度の増大が明らかになった。１００ヌクレオチド一本鎖標的
ＤＮＡ分子と６−Ｓ１８リピート及びＣ７アミノリンカーとの組合せが、最も高
いハイブリダイゼーションシグナル強度を与えた。従って、一本鎖標的ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを含む本発明のマイクロアレイは、固体表面からオリゴヌク
レオチドまでの距離及びＤＮＡ鎖長が増加した場合に改善される。
【０１０４】 標的分子の活性化スライドへのスポット ３８４ウェルプレート中の、100mMホウ酸ナトリウムpH9.3、500mM塩化ナトリ
ウム５−１０μｌ中の標的ＤＮＡ（修飾又は非修飾）を、本発明の活性化マイク
ロアレイスライドへの標的DNAのアレイ化に使用した。アレイスライドへの標的
分子のアレイ化（印刷又はスポットとも言う）は、内幅８０ミクロンを有する印
刷ピンを備えた自動化マイクロアレイ装置（TeleChem International, Inc., モ
デルno.CMP2、「Chipmaker 2 Microspotting Pins」）を用いて実施した。約０
．５−１nlの標的溶液を、印刷ピンを用いて各アレイ要素に沈積させた（スポッ
ト又は配置）。スポットサイズは、チップサイズ及び本発明に従って調製される
スライド上に生成される表面の性質によって１００−１４０ミクロンの径に調節
した。印刷に使用するバッファー及び本発明のスライドの反応性により、核酸分
子は更なる操作をすることなく即座に結合する。本発明の一部として、印刷した
スライドを環境条件で終夜放置することにより、同様のケースのマイクロアレイ
への標的ＤＮＡの結合が増加することが見出された。 スポットに続いて、スライドをガラス棚に配置し、0.2%ＳＤＳで洗浄し、次い
でＳＱ水で３回洗浄し、次いでエタノールでリンスした。この洗浄手法により、
未結合の標的ＤＮＡを除去し、未反応のチオシアネート官能基を修飾する。印刷
され、洗浄されたスライドは、乾燥させ、暗中、環境条件下でスライドボックス
内に保存した。
【０１０５】 実施例５ マイクロアレイ分析のためのハイブリダイゼーション法 ここに開示するマイクロアレイハイブリダイゼーション法は、改善されたハイ
ブリダイゼーションのための促進された核酸相互作用及びより高感度の検出のた
めの高いシグナル対ノイズ比をもたらす。組織サンプル等のサンプルが小さく限
られている場合に、より高い感度が有用である。
【０１０６】 本発明によると、蛍光標識されたＤＮＡプローブはこれらの極性有機溶媒への
溶解性が大きいので、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを懸濁するために
ホルムアミド及び／又はジメチルスルホキシドが使用される。好ましくは、ハイ
ブリダイゼーション溶液中の極性有機溶媒の量は、５０％、４０％、３０％、２
５％又は２０％未満である。本発明によると、ＤＭＳＯの比率は０％から５０％
まで、０％から４０％まで、０％から３０％まで、０％から２５％まで、及び０
％から２０％までである。同様に、ホルムアルデヒドの比率は０％から５０％ま
で、０％から４０％まで、０％から３０％まで、０％から２５％まで、及び０％
から２０％までである。即ち、本発明によると、極性溶媒（ＤＭＳＯ又はホルム
アルデヒド）の全量は５０％を越えず、例えば、ホル未アルデヒドに対するＤＭ
ＳＯの早退比率は、これらの有機溶媒の比率の合計がこの実施例において５０％
を越えないように変化する。
【０１０７】 さらに、本発明者等により、洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、
例えばハイブリダイゼーション条件から除外することにより検出を向上させるこ
とが見出された。ＳＤＳは、コロイド；蛍光標識ＤＮＡプローブとの複合体の形
成を生じ、プローブを溶液からの析出を起こし、検出を制限し、及び／又は望ま
れない検出変動、及び／又は極めて高い非特異的蛍光バックグラウンドを生じる
ことが見出された。ＳＤＳの固体表面の濡れ能力を失うことは、ハイブリダイゼ
ーションにホルムアミドを使用し、ここに開示するガラス表面処理をすることに
より克服できた。
【０１０８】 本発明のマイクロアレイハイブリダイゼーション法は以下のプロトコールを含
む。プローブを適用する前に、マイクロアレイを９５℃に２分間置くことにより
変性させた。次いでマイクロアレイを冷エタノール（約２０℃）中に浸漬して即
座に室温に戻し、アレイ内の配列の変性状態を維持させた。プローブは最終濃度
５ｘＳＳＣ、50%ホルムアミド中に再懸濁した。再懸濁は、少なくとも３時間、
そして終夜（約１０−１６時間）まで暗中で続けた。コントロール及び試験プロ
ーブをプールし、９５−１００℃に４５秒間加熱し、熱いうちに、約５０℃のス
ライド加熱器上の変性マイクロアレイスライドの表面に１０μｌのアリコートと
して適用した。プローブの適用に続いて、清浄なカバーガラスを、アレイを覆う
ように注意深く配置した。ハイブリダイゼーションチャンバーは気密の化学的に
不活性な任意の容器でよい。例えば、この実施例で使用されるハイブリダイゼー
ションチャンバーは、気密性プラスチック蓋を有し、その中に、５０：５０のホ
ルムアルデヒド：水でしめらせたペーパータオル等の吸収性材料を入れたもので
あった。チャンバーの内部は、少なくとも使用前３０分間、３７℃に平衡させて
おいた。
【０１０９】 アルキルアンモニウム塩、ＤＭＳＯ、及びホルムアミドおけるハイブリダイゼ
ーション 本発明の一部として、マイクロアレイハイブリダイゼーションバッファー中の
アルキルアンモニウム塩、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びホルムアミ
ドが検出感度を向上させることが見出された。 アレクサ(Alexa)染料（Molecular Probes, Eugene, OR）標識プローブで、＋
又は−鎖のものを、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドアレイにpH8.0で50mMＴｒ
ｉｓ（Sigma）、2mMＥＤＴＡ（Sigma）を含む2.4MＴＥＡＣｌ（Alfa Aesar, ワ
ードヒル, マサチューセッツ）又は3.0MＴＥＡＣｌ（Sigma, St Louis, MO）中
でハイブリダイズさせてもよい。極性溶媒ホルムアミド（Life Technologies,
ロックビル, メリーランド）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma）
も、ＤＭＳＯ及びホルムアミドの最終全濃度２５％(v/v)μで変化する比率でア
レイハイブリダイゼーション溶液に含ませた。言い換えれば、ホルムアミド及び
ＤＭＳＯ濃度は、２５％(v/v)ホルムアミド及び０％(v/v)ＤＭＳＯから０％(v/v
)ホルムアミド及び２５％(v/v)ＤＭＳＯまで変化してよく、例えば、２０％(v/v
)ホルムアミド、５％(v/v)ＤＭＳＯである。本発明の一部として、蛍光標識され
たポリヌクレオチドの、ここに開示されたようなオリゴヌクレオチドアレイへの
ハイブリダイゼーションが、ＴＥＡＣｌ及びＤＭＳＯがハイブリダイゼーション
バッファーにある場合に促進されることが見出された。
【０１１０】 例えば、５０％(v/v)ホルムアミド、５ｘSSCバッファーを含む第１のハイブリ
ダイゼーションバッファー（バッファー１）を使用したシグナル強度を、2.4MＴ
ＥＡＣｌ、50mMＴｒｉｓ、2mMＥＤＴＡ、pH8.0と共に２０％ホルムアミド／５％
(v/v)ＤＭＳＯを含む第２のハイブリダイゼーションバッファー（バッファー２
）と比較した。別々の(−)鎖標識ｃＤＮＡプローブ混合物を、Ａｌｅｘａ４８８
-ｄＵＴＰ又はＡｌｅｘａ５４６-ｄＵＴＰ（Molecular Probes, Eugene, OR）と
ともに、ここに開示した同時標識導入を伴う第２の鎖合成により調製した。標識
された各プローブ混合物を等量のアリコートに分けて真空乾燥させた。サンプル
を、５０％(v/v)ホルムアミド、５ｘSSCバッファー（バッファー１）あるいは2.
4MＴＥＡＣｌ、50mMＴｒｉｓ、2mMＥＤＴＡ、pH8.0、及び２０％ホルムアミド／
５％(v/v)ＤＭＳＯ（バッファー２）のいずれかに再懸濁させた。４８８及び４
５６標識プローブをプールし、異なるプローブプール各々をマイクロアレイ複製
の一つにハイブリダイズさせた。結果は、ＴＥＡＣｌ及びＤＭＳＯの添加の結果
として、バッファー１に比較してバッファー２における各ラベルについて、蛍光
シグナル強度が増大したことを示した。2.4MＴＥＡＣｌ、50mMＴｒｉｓ、2mMＥ
ＤＴＡ、pH8.0、及び２０％ホルムアミド／５％(v/v)ＤＭＳＯで見られたハイブ
リダイゼーションシグナルは、ＴＥＡＣｌ及びＤＭＳＯを欠くハイブリダイゼー
ションバッファーで得られたシグナルより３−５倍増大した。
【０１１１】 ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイスライドをチャンバーから取り
だした。カバースリップを注意深く取り外し、スライドを２ｘＳＳＣ、0.2%ＳＤ
Ｓで２−５分間洗浄し、次いで０．２ｘＳＳＣ、0.2%ＳＤＳで２−５分間洗浄し
た。スライドを新たな清浄なカバーガラスで覆い、最後の洗浄液でアレイ領域を
湿った状態に維持したままハイブリダイズしたアレイの画像化を実施した。湿っ
た状態でのスライドの画像化は、発色団の消光を回避し、よって絶対シグナル及
びシグナルの定量性の両方を向上させる。スライドの上部及び下部は乾燥したま
まに保った。画像化は、発色団を漂白せず、ハイブリダイズしたマイクロアレイ
は再画像化のために少なくとも６０日間暗中に保存し得る。
【０１１２】 実施例６ 検出方法 標識されたハイブリダズしたプローブの検出方法は当業者に良く知られている
。蛍光標識プローブが密に整列した核酸配列に適用される本実施例では、検出は
好ましくは蛍光画像化により実施される。あるいは、ＣＣＤカメラ画像化システ
ムを使用した。例えば、蛍光分光法を用いる発色団の励起は、ハイブリダイズし
たスライドを蛍光レーザー又は他の光源に所望の励起波長に特異的なフィルター
を通して曝露することにより起こる。蛍光発光は、各発色団についての不連続な
発光波長において検出した。試験及びコントロールプローブの相対的発光は、各
プローブタイプに導入した発色団及びプローブがハイブリダイズしたマイクロア
レイの特異的メンバーに従って分析した。分析は、疾患組織における遺伝子の相
対的発現に関する定量的情報を与えた。自動化検出及び分析が望まれる場合は、
検出及び相対的ハイブリダイゼーションの定量化のための自動化システムが、例
えば米国特許第5,143,854号に見られ、その手法をここに参考として取り入れる
ものとする。
【０１１３】 試験及びコントロールプローブの混合物とハイブリダイズしたマイクロアレイ
スライドを、４８８ｎｍ及び５４６ｎｍでの蛍光励起及び適当に対応する波長（
例えば、各々５３０ｎｍ及び５９０ｎｍ）での検出のために構成された画像化装
置を用いて眺めた。装置は、アレイスポットの発光強度の二次元電子画像を生成
する画像蛍光測定器であった。このような検出に有用な装置は、例えば、ArrayW
oRx(商品名)マイクロアレイスキャナー（Applied Precision, Inc., イサクアー
, ワシントン, アメリカ合衆国）である。検出過程の詳細な説明は、供給者から
入手可能である（例えば、<www.appliedprecision.com>、最終更新2000年3月23
日）。簡単に言えば、光を励起フィルターを通して制御し、ハイブリダイズした
サンプルに選択した単色光を当てる。蛍光発光は、高分解能を有するＣＣＤに焦
点を合わせる。収集した検出データは同時に又は続いて分析されて報告される。
好ましくは、各発光色は表示目的のために別々に示される。
【０１１４】 この分野で知られた代替的装置及び手法は、コントロール及び試験プローブと
本発明の標的ポリヌクレオチドとの相対的な複合体形成の検出及び分析のために
有用である。他の有用な手法は、例えば、WO 00/32824（2000年6月8日発行）、W
O 00/04188（2000年1月27日発行）に見出される。
【０１１５】 Ｆｉｇ．１−４は、マイクロアレイ実験結果の例であり、ここに開示した本発
明の方法に従ってマイクロアレイが調製され処理された（即ち、ＲＮＡ精製、ス
ライド調製、プローブ合成、及びプローブハイブリダイゼーション）。Ｆｉｇ．
１は、腫瘍組織から微量切除された非常に少量の腫瘍細胞から合成したプローブ
でハイブリダイズしたマイクロアレイの写真である。シグナル対ノイズは高く、
ハイブリダイズしたプローブの改善された検出が可能となった。Ｆｉｇ．２Ａ及
び２Ｂは、新鮮な凍結された肝臓に対してパラフィン包埋肝臓から合成したプロ
ーブについての検出が匹敵するものであることを示す。Ｆｉｇ．２Ｃ及び２Ｄは
、同一患者からのパラフィン包埋大腸組織に対する新鮮凍結のものにおける遺伝
子発現の検出を示している。Ｆｉｇ．２Ｄの散乱プロットに示した２つの異なる
保存組織からの検出データの線形集団は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織
に対する新鮮凍結から得た定量的遺伝子発現が極めて類似することを示している
。Ｆｉｇ．３Ａ及び３Ｂは、プールした上皮組織を含むコントロール組織におけ
る遺伝子発現に対する大腸組織での遺伝子発現の比較を示す。発色団の発光波長
における各スポットの発光強度は、疾患及び健常組織における正確な相対遺伝子
発現を決定するために比較され分析される。Ｆｉｇ．４Ａ−４Ｃは、卵巣癌細胞
系からのＲＮＡ出発材料が限られる場合、アレイにハイブリダイズしたプローブ
の検出は、２００ｐｇ（Ｆｉｇ．４Ａ）、２０ｐｇ（Ｆｉｇ．２Ｂ）及び２ｐｇ
（Ｆｉｇ．４Ｃ）から合成したｓＤＮＡプローブについて、ここに記載したよう
に、５時間の反応におけるｃＲＮＡ逆転写による標識ｓＤＮＡへの１ラウンドの
増幅のみで可能である。蛍光強度の１色分析を示される。
【０１１６】 以上の明細書の記載は、当業者が本発明を実施することができるのに十分であ
ると考えられる。実施態様は本発明の或る態様の例示を意図しており、機能的に
等価な全ての実施態様は本発明の範囲内であるので、本発明は提供した実施例に
よって範囲を制限されない。ここでの実施例の提示は、ここに含まれる説明が、
ベストモードを含む本発明の任意の態様を実施するために不十分であるとの承認
を構成するものではなく、請求の範囲を代表する特定の例示に限定するとして考
えるものでもない。実際に、ここに示し記載したものに加える本発明の変形は、
上記の説明から当業者に明らかになり、添付する請求の範囲の範囲内にある。明
細書中の全ての引用文献の開示は、出典明示してここに参考として取り入れるも
のとする。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】 顕微解剖した結腸腫瘍細胞の１−５ｎｇの全ＲＮＡから、本
発明の方法によって合成したフルオロプローブを用いて作成したマイクロアレイ
イメージの写真。
【Ｆｉｇ．２（１）及び（２）】 Ｆｉｇ．２Ａは、ホルマリン固定パラフィ
ン包埋肝臓組織より単離した５μｇの全ＲＮＡから、本発明の方法によって合成
したフルオロプローブを用いて作成したマイクロアレイイメージの写真。Ｆｉｇ
．２Ｂは、新鮮な凍結成人肝臓より単離した５μｇの全ＲＮＡから、本発明の方
法によって合成したフルオロプローブを用いて作成したマイクロアレイイメージ
の写真。パラフィン包埋染色材料から作成したプローブは、検出感度において、
新鮮凍結組織から作成したプローブと比較可能であった（Ｆｉｇ．２Ａ及びＦｉ
ｇ．２Ｂを比較）。Ｆｉｇ．２Ｃは、４μｇの全細胞性ＲＮＡ染色材料である、
ホルマリン固定パラフィン包埋結腸腫瘍のマイクロアレイ分析の画像。Ｆｉｇ．
２Ｄは、同じ患者から単離した結腸腫瘍ＲＮＡのマイクロアレイ分析の蛍光強度
のスキャッタープロットで、新鮮凍結試料（Ｘ軸）対ホルマリン固定パラフィン
包埋試料（Ｙ軸）。
【Ｆｉｇ．３】 Ｆｉｇ．３Ａは、***腫瘍ＲＮＡから合成したプローブのハ
イブリダイゼーションを示すマイクロアレイの写真。Ｆｉｇ．３Ｂは、上皮組織
ＲＮＡプールの参考試料から合成したプローブのハイブリダイゼーションを示す
。一般的に、遺伝子発現は、試験対コントロール試料に関して、各スポットから
発せられる強度と波長の比較によって定量化する。
【Ｆｉｇ．４】 Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃは、卵巣癌腫細胞株の全細胞性Ｒ
ＮＡ染色材料の種々の量から合成されたハイブリッドｓＤＮＡプローブの成功し
た検出を示す。この図面は、全細胞性ＲＮＡ染色材料の量が２００ｐｇ（Ｆｉｇ
．４Ａ）、２０ｐｇ（Ｆｉｇ．４Ｂ）、及び２ｐｇ（Ｆｉｇ．４Ｃ）に限定され
た場合に、本発明のマイクロアレイ上で達成した蛍光強度の１-色分析の結果を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロビー，エドワード，ピー．， アメリカ合衆国 カリフォルニア 94114， サン フランシスコ，ハートフォード ス トリート 203 (72)発明者 スミス，ヴィクトリア アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲーム，ドゥワイト ロード 19 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 FB16 GC15 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA14 HA19 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03 CC08 FA03 FA15 4B063 QA17 QQ02 QQ03 QQ15 QQ42 QQ52 QQ53 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims (104)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のシランでシ
    ラン処理された表面と標的分子を有するマイクロアレイであって、標的分子がシ
    ランを介して表面に結合されているマイクロアレイ。
  2. 【請求項２】 アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のシランでシ
    ラン処理された表面とリンカーと標的分子を有するマイクロアレイであって、標
    的分子がリンカーを介して表面に結合されているマイクロアレイ。
  3. 【請求項３】 標的分子がポリヌクレオチドである請求項２に記載のマイク
    ロアレイ。
  4. 【請求項４】 ポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、増幅さ
    れたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ及びｍＲ
    ＮＡからなる群から選択される請求項３に記載のマイクロアレイ。
  5. 【請求項５】 ポリヌクレオチドが、約３ｂｐから１０ｋｂの範囲の長さを
    有している請求項４に記載のマイクロアレイ。
  6. 【請求項６】 長さが約１００ｂｐから５ｋｂの範囲である請求項５に記載
    のマイクロアレイ。
  7. 【請求項７】 長さが約０．３ｋｂから３ｋｂの範囲である請求項６に記載
    のマイクロアレイ。
  8. 【請求項８】 長さが約０．５ｋｂから２ｋｂの範囲である請求項７に記載
    のマイクロアレイ。
  9. 【請求項９】 ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌク
    レオチドが２５−１０００ｂｐ、２５−５００、３０−２００、及び５０−１０
    ０ｂｐ長である請求項４に記載のマイクロアレイ。
  10. 【請求項１０】 標的分子がポリヌクレオチドであってアミンを含む請求項
    ２に記載のマイクロアレイ。
  11. 【請求項１１】 アミン基が第１級アミンである請求項１０に記載のマイク
    ロアレイ。
  12. 【請求項１２】 第１級アミンがポリヌクレオチドの５’末端にある請求項
    １１に記載のマイクロアレイ。
  13. 【請求項１３】 第１級アミンがポリヌクレオチドの５’末端にリンカーを
    介して結合され、リンカーが１−２０の炭素原子の一又は複数のモノマーを含み
    、モノマーが炭素の線形鎖又は環又は双方を含む、請求項１１に記載のマイクロ
    アレイ。
  14. 【請求項１４】 ポリヌクレオチドが、その５’末端に第１級アミンを有す
    る核酸プライマーを伸展させることにより調整される請求項１２に記載のマイク
    ロアレイ。
  15. 【請求項１５】 基板表面が、ポリマー材料、ガラス、セラミック、天然繊
    維、ナイロン、ニトロセルロース、シリコン、金属、及びその複合体からなる群
    から選択される請求項２に記載のマイクロアレイ。
  16. 【請求項１６】 基板表面が平坦である請求項１５に記載のマイクロアレイ
    。
  17. 【請求項１７】 基板が、繊維、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、プ
    レート、及び類似構造体の形態である請求項１５に記載のマイクロアレイ。
  18. 【請求項１８】 基板表面がガラスである請求項１５に記載のマイクロアレ
    イ。
  19. 【請求項１９】 基板がガラススライドである請求項１８に記載のマイクロ
    アレイ。
  20. 【請求項２０】 標的分子が、プリンティング、キャピラリーデバイスコン
    タクトプリンティング、マイクロフルイドチャンネルプリンティング、マスクへ
    の付着、及び電気化学的プリンティングからなる群から選択される技術によって
    表面に標的分子を接触させた後に結合される請求項２に記載のマイクロアレイ。
  21. 【請求項２１】 標的分子が接触前に修飾されていない請求項２０に記載の
    マイクロアレイ。
  22. 【請求項２２】 標的分子が接触前にアミンを含むように修飾される請求項
    ２１に記載のマイクロアレイ。
  23. 【請求項２３】 アミンが第１級アミンである請求項２２に記載のマイクロ
    アレイ。
  24. 【請求項２４】 標的分子がポリヌクレオチドであり、第１級アミンがポリ
    ヌクレオチドの５’末端にある請求項２３に記載のマイクロアレイ。
  25. 【請求項２５】 （ａ）マイクロアレイ基板の表面上で官能基と反応可能で
    標的分子と反応可能な二以上の反応性基を含む多官能性リンカー試薬を提供し；
    （ｂ）アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のシランで表面をシラン処
    理することによって、標的分子を固定化するための基板表面を活性化し、ここで
    シランは多官能性リンカー試薬と反応性の官能性を有し、活性化が、リンカー試
    薬の第一の反応性基とシランの反応性基を介してシランへ多官能性リンカー試薬
    を結合させることによって、シラン処理された表面上への多官能性リンカー試薬
    を固定化することをさらに含み； （ｃ）固定化された多官能性リンカー試薬の第二の反応性基と反応性の一又は複
    数の官能基を有する標的分子を含む溶液を提供し； （ｄ）固定化された多官能性リンカー試薬への標的分子の結合を促進する条件下
    で、活性化された基板表面に標的分子を接触させることにより基板表面に標的分
    子を結合させることを含む、方法によって調製されるマイクロアレイ。
  26. 【請求項２６】 標的分子がポリヌクレオチドであり、工程（ｄ）の接触が
    、活性化された基板表面上にポリヌクレオチドをスポッティングすることにより
    実施される請求項２５に記載のマイクロアレイ。
  27. 【請求項２７】 ポリヌクレオチドが未修飾である請求項２６に記載のマイ
    クロアレイ。
  28. 【請求項２８】 ポリヌクレオチドがアミン基で修飾されている請求項２６
    に記載のマイクロアレイ。
  29. 【請求項２９】 アミン基がポリヌクレオチドの５’末端の第１級アミンで
    ある請求項２８に記載のマイクロアレイ。
  30. 【請求項３０】 ポリヌクレオチドが表面上に約０．１μｇ／μｌから約３
    μｇ／μｌまでで約３μｇ／μｌを含む範囲の濃度でスポッティングされる請求
    項２６に記載のマイクロアレイ。
  31. 【請求項３１】 工程（ｄ）の結合が、ｐＨ６からｐＨ１０まででｐＨ１０
    を含むｐＨ範囲で生じる請求項２５に記載のマイクロアレイ。
  32. 【請求項３２】 ｐＨ範囲がｐＨ６．５からｐＨ９．７まででｐＨ９．７を
    含む請求項３１に記載のマイクロアレイ。
  33. 【請求項３３】 ｐＨ範囲がｐＨ７からｐＨ９．４まででｐＨ９．４を含む
    請求項３２に記載のマイクロアレイ。
  34. 【請求項３４】 ｐＨが９．３である請求項３３に記載のマイクロアレイ。
  35. 【請求項３５】 結合が、１分から２４時間までで２４時間を含む期間の間
    生じるようにされる請求項２５に記載のマイクロアレイ。
  36. 【請求項３６】 期間が１−２４時間である請求項３５に記載のマイクロア
    レイ。
  37. 【請求項３７】 期間が５−１８時間である請求項３６に記載のマイクロア
    レイ。
  38. 【請求項３８】 期間が１０−１６時間である請求項３７に記載のマイクロ
    アレイ。
  39. 【請求項３９】 期間が１２−１４時間である請求項３８に記載のマイクロ
    アレイ。
  40. 【請求項４０】 マイクロアレイを調製する方法が、工程（ｄ）の後に、未
    反応の反応性基をブロックすることを更に含む請求項２５に記載のマイクロアレ
    イ。
  41. 【請求項４１】 シランが結合せしめられた基板表面を有する活性化された
    スライドであって、シラン処理が、アセトン又はアルコールの不在下で、トルエ
    ン中で行われ、結合したシランが基板表面上に化合物を固定化する化合物と反応
    可能な少なくとも１つの反応性官能基を含むスライド。
  42. 【請求項４２】 化合物が、修飾された標的分子、未修飾の標的分子及び多
    官能性リンカー試薬からなる群から選択される請求項４１に記載の活性化された
    スライド。
  43. 【請求項４３】 化合物が、基板上に標的分子を固定する標的分子と反応可
    能な少なくとも１つの反応性基を含む多官能性リンカー試薬である請求項４２に
    記載の活性化されたスライド。
  44. 【請求項４４】 標的分子が、シランの反応性官能基と反応可能な天然反応
    性基を含む未修飾のポリヌクレオチドである請求項４３に記載の活性化されたス
    ライド。
  45. 【請求項４５】 標的分子が、多官能性リンカー試薬の反応性基と反応可能
    な天然の反応性基を含む未修飾のポリヌクレオチドである請求項４２に記載の活
    性化されたスライド。
  46. 【請求項４６】 標的分子が、多官能性リンカー試薬の反応性基と反応可能
    な非天然の反応性基を含む修飾されたポリヌクレオチドである請求項４３に記載
    の活性化されたスライド。
  47. 【請求項４７】 標的分子がポリヌクレオチドであり、非天然反応性基がア
    ミンである請求項４６に記載の活性化されたスライド。
  48. 【請求項４８】 アミンが第１級アミンである請求項４７に記載の活性化さ
    れたスライド。
  49. 【請求項４９】 第１級アミンがポリヌクレオチドの５’末端にある請求項
    ４８に記載の活性化されたスライド。
  50. 【請求項５０】 シランがアルキルシランであり、アルキル部分がエチル-
    、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ノニル
    -、及びデシルアルキル部分からなる群から選択され、シランの反応性官能基が
    アミン、ヒドロキシル部分、エポキシド、チオール、及びハライドからなる群か
    ら選択され、反応性官能基がアルキル部分に共有結合している請求項４１に記載
    の活性化されたスライド。
  51. 【請求項５１】 シランの反応性官能基がアルキル部分上の第１級アミンで
    あり、多官能リンカー試薬の少なくとも１つの反応性基がチオシアネート部分で
    あり、多官能性リンカー試薬がシラン処理された表面のシランの第１級アミンと
    の共有結合反応により固定化されている請求項５０に記載の活性化されたスライ
    ド。
  52. 【請求項５２】 標的分子を固定化するためのガラススライドを活性化させ
    る方法であって、アセトン又はアルコールの不在下でトルエン中のシランでスラ
    イドをシラン処理することを含み、ここでシランはアルキルシランであり、アル
    キル部分は、エチル-、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-
    、オクチル-、ノニル-、及びデシルアルキル部分からなる群から選択され、シラ
    ンの反応性官能基がアミン、ヒドロキシル部分、エポキシド、チオール、及びハ
    ライドからなる群から選択され、反応性官能基がアルキル部分に共有結合してい
    る方法。
  53. 【請求項５３】 シランと反応可能な少なくとも１つの反応性基と標的分子
    を固定化するために標的分子と反応可能な少なくとも１つの反応性基を有する多
    官能性リンカー試薬とシランを反応させることを更に含み、シランの反応性官能
    基がアルキル部分上の第１級アミンであり、多官能性リンカー試薬の少なくとも
    １つの反応性基がチオシアネート部分であり、多官能性リンカー試薬がシラン処
    理された表面のシランの第１級アミンとの共有結合反応により固定化される請求
    項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 シランはアルキルシランであり、アルキル部分は、エチル
    -、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ノニ
    ル-、及びデシルアルキル部分からなる群から選択され、シランの反応性官能基
    がアミン、ヒドロキシル部分、エポキシド、チオール、及びハライドからなる群
    から選択され、反応性官能基がアルキル部分に共有結合している請求項５２に記
    載の方法。
  55. 【請求項５５】 マイクロアレイを調製する方法において、 （ａ）シランが結合せしめられた基板表面を有する活性化されたスライドを提供
    し、ここで、シラン処理はアセトン又はアルコールの不在下でトルエン中でなさ
    れ、結合されたシランは基板表面上に標的分子を固定化するために反応可能な少
    なくとも１つの反応性官能基を有し； （ｂ）標的分子を固定化させる条件下で標的分子と活性化されたスライド表面を
    反応させ、ここで、標的分子は核酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ
    、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリペプチド
    、タンパク質、抗体、レセプター、及びリガンドからなる群から選択される、方
    法。
  56. 【請求項５６】 工程（ａ）後に、表面上に多官能性リンカー試薬を固定化
    させるためにシランと反応可能な少なくとも２つの反応性基を有する多官能性リ
    ンカー試薬と活性化されたスライド表面を反応させること更に含み、ここで活性
    化された表面は、表面上に標的分子を固定化するように標的分子と反応可能な多
    官能性リンカー試薬を有する、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 標的分子が、核酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、一本鎖Ｄ
    ＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、又はペプチド核酸である請求項５５
    に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 標的分子が、核酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、一本鎖Ｄ
    ＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、又はペプチド核酸であり、多官能性
    リンカー試薬反応性基はイソチオシアネートであり、リンカーは１から２０の炭
    素原子を有する請求項５６に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 多官能性リンカー試薬が複数のリンカーモノマーを有する
    請求項５８に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 標的分子が未修飾である請求項５５に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 標的分子が修飾されてアミンを有している請求項５６に記
    載の方法。
  62. 【請求項６２】 アミンが、標的分子の５’末端の第１級アミンである請求
    項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 シランが３-アミノプロピルトリエトキシシランである請
    求項５５に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 多官能性リンカー試薬が１,４-フェニレンジイソシアネー
    トである請求項５６に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 マイクロアレイ表面上に固定化された標的分子と検出可能
    な複合体を形成可能な検出可能に標識されたｓＤＮＡプローブを調製する方法で
    あって、 （ａ）生物学的試料から全細胞ＲＮＡの所定量を単離し； （ｂ）検出可能に標識されたｓＤＮＡプローブの混合物を合成し、ここでｓＤＮ
    Ａの合成は、工程（ａ）の単離ＲＮＡから第一のストランドｃＤＮＡを合成し、
    ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ酵素と第一のストランドｃＤＮＡを鋳型として
    用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いてｃＲＮＡを
    合成し、ｃＲＮＡを鋳型として使用して検出可能に標識されたデオキシリボヌク
    レオチドの存在下で逆転写酵素を使用してｓＤＮＡを合成することを含み、 （ｃ）標識されたｓＤＮＡプローブを単離する、ことを含む方法。
  66. 【請求項６６】 全細胞ＲＮＡの量が０．０１から１０ｐｇのメッセンジャ
    ーＲＮＡを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 全細胞ＲＮＡが１−５ｐｇである請求項６６に記載の方法
    。
  68. 【請求項６８】 全細胞ＲＮＡの量が．５−２ｐｇである請求項６７に記載
    の方法。
  69. 【請求項６９】 ｓＤＮＡの合成は、ｓＤＮＡプローブが０．５−２ｋｂの
    平均長を持つようにさせる条件下でヘキサマープライマーの存在下でなされる請
    求項６５に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 マイクロアレイ表面上に固定化された標的分子と検出可能
    な複合体を形成可能な、検出可能に標識されたｃＤＮＡプローブを調製する方法
    であって、 （ａ）生物学的試料から全細胞ＲＮＡの所定量を単離し； （ｂ）検出可能に標識されたｃＤＮＡプローブの混合物を合成し、ここでｃＤＮ
    Ａの合成は、検出可能に標識されたデオキシヌクレオチドの存在下で工程（ａ）
    の単離されたＲＮＡから第一のストランドｃＤＮＡを合成することを含み； （ｃ）標識されたｓＤＮＡプローブを単離する、ことを含む方法。
  71. 【請求項７１】 マイクロアレイ表面上に固定化された標的分子と検出可能
    な複合体を形成可能な、検出可能に標識されたｓＤＮＡプローブを調製する方法
    であって、 （ａ）生物学的試料から全細胞ＲＮＡの所定量を単離し； （ｂ）検出可能に標識されたｓＤＮＡプローブの混合物を合成し、ここでｓＤＮ
    Ａの合成は、工程（ａ）の単離されたＲＮＡからビオチン結合第一ストランドｃ
    ＤＮＡを合成し；検出可能に標識されたデオキシヌクレオチドの存在下でＤＮＡ
    ポリメラーゼＩのクレノウ酵素と第一ストランドｃＤＮＡを鋳型として使用して
    第二ストランドＤＮＡ（ｓＤＮＡ）を合成することを含み； （ｃ）ビオチン結合第一ストランドｃＤＮＡをストレプトアビジンに接触させ、
    標識されたｓＤＮＡからビオチン-第一ストランドｃＤＮＡ／ストレプトアビジ
    ン複合体を除去し；及び （ｃ）標識されたｓＤＮＡプローブを単離する、ことを含む方法。
  72. 【請求項７２】 マイクロアレイ表面上に固定化された標的分子と検出可能
    な複合体を形成可能な、検出可能に標識されたｃＲＮＡプローブを調製する方法
    であって、 （ａ）生物学的試料から全細胞ＲＮＡの所定量を単離し； （ｂ）検出可能に標識されたｃＲＮＡプローブの混合物を合成し、ここでｃＲＮ
    Ａの合成は、工程（ａ）の単離されたＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを合成
    し、検出可能に標識されたリボヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩの
    クレノウ酵素と第一ストランドｃＤＮＡを鋳型として使用して第二ストランドｃ
    ＤＮＡを合成し、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてｃＲＮＡを合成することを含み；
    （ｃ）標識されたｓＤＮＡプローブを単離する、ことを含む方法。
  73. 【請求項７３】 工程（ｃ）の後に、ｃＲＮＡプローブの平均長が０．５ｋ
    ｂから３ｋｂまでに調節される条件下でＲＮａｓｅでｃＲＮＡプローブを分解す
    ることを更に含む請求項７２に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 第二のストランドＤＮＡの合成工程が、標識されたｓＤＮ
    Ａプローブの平均長が約０．５ｋｂから約２ｋｂまでとなるような条件下でヘキ
    サマープライマーの存在下でなされる請求項７１に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 工程（ｂ）の後に、標識されたｃＤＮＡプローブの平均長
    を０．５ｋｂから２ｋｂまでになるように減少させることを更に含む請求項７０
    に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 減少が、制限ＤＮａｓｅ切断による請求項７５に記載の方
    法。
  77. 【請求項７７】 生物学的試料が、細胞、組織試料、体液試料、及び合成オ
    リゴヌクレオチドの混合物からなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 全細胞ＲＮＡの量が０．５ｐｇから１０ｍｇまでで１０ｍ
    ｇを含む請求項６５に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 全細胞ＲＮＡの量が１ｐｇから１０μｇまでで１０μｇを
    含む請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 全細胞ＲＮＡの量が１ｐｇから１００ｎｇまでで１００ｎ
    ｇを含む請求項７９に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 全細胞ＲＮＡの量が１ｐｇから１０ｎｇまでで１０ｎｇを
    含む請求項８０に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 検出可能に標識されたデオキシヌクレオチドが標識された
    ｄＵＴＰであり、標識されたｄＵＴＰの存在下での合成が未標識ｄＴＴＰの不在
    下でなされる請求項６５に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 検出可能な標識が蛍光発色団である請求項６５に記載の方
    法。
  84. 【請求項８４】 マイクロアレイに結合した標的分子を分析する方法であっ
    て、 （ａ）請求項１に記載のマイクロアレイを提供し； （ｂ）検出可能な複合体の形成を可能とする条件下で標的分子と検出可能な複合
    体を形成可能な薬剤に、結合された標的分子を接触させ； （ｃ）検出可能な複合体の形成を検出し； （ｄ）形成された検出可能な複合体の量を測定する、ことを含む方法。
  85. 【請求項８５】 検出可能な複合体を形成可能な薬剤が、 第一の検出可能な標識を有するｓＤＮＡプローブのコントロール混合物であっ
    て、プローブがコントロール試料から単離された全細胞ＲＮＡから調製されたも
    のと、 第二の検出可能な標識を有するｓＤＮＡプローブの試験混合物であって、プロ
    ーブが試験試料から単離された全細胞ＲＮＡから調製されたものとを含み、 第一及び第二の検出可能な標識が区別可能であり、 （１）コントロールｓＤＮＡプローブと試験ｓＤＮＡプローブをプールし； （２）請求項８４に記載の工程（ａ）−（ｄ）を実施し；及び （３）標的分子と試験プローブの間に形成された複合体の量に対して、標的分
    子とコントロールプローブの間に形成された検出可能な複合体の量を比較する、
    ことを更に含む請求項８４に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 標識が光学的に検出可能である請求項８４に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 標識が蛍光である請求項８６に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 工程（ｂ）の接触が洗浄剤の不在下でなされる請求項８４
    に記載の方法。
  89. 【請求項８９】 工程（ｂ）の接触が、ホルムアミド及びジメチルスルホキ
    シド（ＤＭＳＯ）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣｌ）、及びテ
    トラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣｌ）の存在下でなされる請求項８８
    に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 工程（ｂ）の接触が、ホルムアミド、ＤＭＳＯ及びＴＭＡ
    Ｃｌ又はＴＥＡＣｌの存在下でなされ、ホルムアミドとＤＭＳＯの割合の合計が
    ５０％を越えない請求項８９に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 ホルムアミドとＤＭＳＯの割合の合計が２５％を越えない
    請求項９０に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 接触工程に続いて洗浄工程を更に含み、洗浄溶液が洗浄剤
    を含む請求項８８に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 支持体表面上の標的ポリヌクレオチドに検出可能なポリヌ
    クレオチドをハイブリダイズさせる方法であって、 （ａ）ＤＭＳＯ又はホルムアミド又は双方を含有するハイブリダイゼーション溶
    液中で、洗浄剤の不在下において、支持体表面上の変性標的ポリヌクレオチドと
    プローブを接触させ； （ｂ）標的ポリヌクレオチドと検出可能に標識されたポリヌクレオチドプローブ
    の間の複合体の形成を検出する、ことを含む方法。
  94. 【請求項９４】 ＤＭＳＯとホルムアミドの割合の合計が５０％を越えず、
    ハイブリダイゼーション溶液が更にＴＭＡＣｌ又はＴＭＥＣｌ又は双方を含む請
    求項９３に記載の方法。
  95. 【請求項９５】 ＤＭＳＯとホルムアミドの割合の合計が２５％を越えず、
    ハイブリダイゼーション溶液が更にＴＭＡＣｌ又はＴＭＥＣｌ又は双方を含む請
    求項９４に記載の方法。
  96. 【請求項９６】 コントロール試料が、レーザキャプチュア顕微解剖により
    細胞源から除去された細胞を含み、細胞源が、未処理組織、凍結組織、パラフィ
    ン包埋組織、染色組織及び細胞培養物からなる群から選択される請求項８５に記
    載の方法。
  97. 【請求項９７】 試験試料が、レーザキャプチュア顕微解剖により細胞源か
    ら除去された細胞を含み、細胞源が、未処理組織、凍結組織、パラフィン包埋組
    織、染色組織及び細胞培養物からなる群から選択される請求項８５に記載の方法
    。
  98. 【請求項９８】 試験試料及びコントロール試料が、発達状態、疾患状態、
    罹患前の状態、細胞型、試料供給源、及び実験処理条件の一又は複数において異
    なる請求項８５に記載の方法。
  99. 【請求項９９】 標的分子がポリヌクレオチドであり、試験試料及びコント
    ロール試料から単離された核酸がＲＮＡであり、工程（ｃ）の比較が、コントロ
    ール試料中の標的ポリヌクレオチドの発現に対する試験試料中の標的ポリヌクレ
    オチドの発現の測定値をもたらす請求項８５に記載の方法。
  100. 【請求項１００】 標的ポリヌクレオチドの発現の相対測定値が試験組織試
    料中の疾患状態を示している請求項９９に記載の方法。
  101. 【請求項１０１】 疾患状態が腫瘍、心疾患、炎症性疾患、内分泌疾患から
    なる群から選択される請求項１００に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 標的ポリヌクレオチドの発現の相対的測定値が試験組織
    試料中の罹患前の状態を示している請求項１００に記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 標的分子がポリヌクレオチドであり、試験試料とコント
    ロール試料から単離された核酸がＤＮＡであり、工程（ｃ）の比較が、コントロ
    ール試料中の標的ポリヌクレオチドコピーに対する試験試料の細胞中の標的ポリ
    ヌクレオチドのコピー数の測定値をもたらす請求項８４に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 標的ポリヌクレオチドのコピーの数の相対測定値が試験
    組織試料の疾患状態又は罹患前の状態を示している請求項１０３に記載の方法。
JP2001573038A 2000-03-31 2001-03-30 遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法 Withdrawn JP2003529774A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19376700P 2000-03-31 2000-03-31
US60/193,767 2000-03-31
PCT/US2001/010482 WO2001075166A2 (en) 2000-03-31 2001-03-30 Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003529774A true JP2003529774A (ja) 2003-10-07

Family

ID=22714917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001573038A Withdrawn JP2003529774A (ja) 2000-03-31 2001-03-30 遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法

Country Status (7)

Country Link
US (5) US20020081597A1 (ja)
EP (1) EP1276702A2 (ja)
JP (1) JP2003529774A (ja)
AU (1) AU2001249727A1 (ja)
CA (1) CA2402525A1 (ja)
IL (1) IL151865A0 (ja)
WO (1) WO2001075166A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009229398A (ja) * 2008-03-25 2009-10-08 Toyo Kohan Co Ltd 蛍光標識された生体関連分子の検出方法

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104426A1 (en) * 2001-06-18 2003-06-05 Linsley Peter S. Signature genes in chronic myelogenous leukemia
CA2633171C (en) 2001-06-20 2012-11-20 Genentech, Inc. Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides
CA2457474A1 (en) * 2001-08-21 2003-03-06 Mcw Research Foundation, Inc. Method and apparatus for three label microarrays
US6835064B2 (en) * 2001-11-09 2004-12-28 Ivoclar Vivadent Ag Light hardening device and method for hardening a polymerizable mass for dental applications
US20040181344A1 (en) * 2002-01-29 2004-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for providing diagnostic services
AU2003247806B2 (en) * 2002-07-08 2009-11-12 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP2277532A1 (en) 2002-09-11 2011-01-26 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
US20040054160A1 (en) * 2002-09-16 2004-03-18 Santona Pal Nucleic-acid ink compositions for arraying onto a solid support
US7364846B2 (en) * 2002-10-11 2008-04-29 Molecular Devices Corporation Gene expression profiling from FFPE samples
US20040076964A1 (en) * 2002-10-22 2004-04-22 Leproust Eric M. Methods for in situ generation of nucleic acid arrays
CA2503125C (en) 2002-10-25 2013-04-30 Hilary Clark Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
EP1578367A4 (en) * 2002-11-01 2012-05-02 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
JP4606879B2 (ja) * 2002-11-15 2011-01-05 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ陽性癌の遺伝子発現プロファイリング
JP2008500009A (ja) 2003-03-03 2008-01-10 ジェネンテック・インコーポレーテッド 全身性エリテマトーデスの治療のための組成物と方法
EP1613734A4 (en) * 2003-04-04 2007-04-18 Agilent Technologies Inc VISUALIZATION OF EXPRESSION DATA ON CHROMOSOMIC GRAPHIC SCHEMES
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2494571C (en) 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
US20050136413A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Briggs Michael W. Reagent systems for biological assays
CA2566806A1 (en) * 2004-05-25 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
CN101035912A (zh) 2004-08-06 2007-09-12 健泰科生物技术公司 使用生物标志的测定法和方法
CA2575755C (en) 2004-08-06 2014-04-08 Genentech, Inc. Assays and methods using biomarkers
CA2586201A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-11 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
US20070092890A1 (en) 2005-08-05 2007-04-26 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting autoimmune disorders
EP1915626B1 (en) 2005-08-16 2011-11-09 Genentech, Inc. Apoptosis sensitivity to apo2l/trail by testing for galnac-t14 expression in cells/tissues
EP1979489B1 (en) * 2005-12-29 2010-04-07 Industrial Cooperation Agency One step diagnosis by dna chip
JP2009522576A (ja) * 2006-01-03 2009-06-11 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 低分子プリンティング
US20070207483A1 (en) * 2006-03-02 2007-09-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. BUFFERS FOR DETECTION OF mRNA SEPARATED IN A MICROFLUIDIC DEVICE
AU2007244868B2 (en) 2006-04-24 2013-11-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting autoimmune disorders
KR100791335B1 (ko) * 2006-07-17 2008-01-07 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 및 이의 제조 방법
WO2008124467A1 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 Macrocyclics Bifunctional hydroxamic acid ligands and method of synthesis
EP2162459B1 (en) 2007-05-01 2017-10-04 University of Miami Transcriptomic biomarkers for individual risk assessment in new onset heart failure
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
CN101910414B (zh) 2007-11-07 2016-01-13 健泰科生物技术公司 用于评估b细胞淋巴瘤对抗cd40抗体治疗的响应性的方法和组合物
MX364200B (es) 2008-04-09 2019-04-16 Genentech Inc Composiciones y metodos novedosos para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la inmunidad.
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CN102265157B (zh) 2008-12-23 2014-11-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于癌症患者中诊断用途的方法和组合物
MX2011010938A (es) 2009-04-18 2012-01-12 Genentech Inc Metodos para determinar la sensibilidad de linfoma de celula b al tratamiento con anticuerpos anti-cd40.
US20120142544A1 (en) 2009-06-02 2012-06-07 University Of Miami Diagnostic transcriptomic biomarkers in inflammatory cardiomyopathies
MX2012000620A (es) 2009-07-13 2012-01-27 Genentech Inc Metodos diagnostico y composiciones para tratamiento de cancer.
US20110021362A1 (en) * 2009-07-20 2011-01-27 Constellation Pharmaceuticals Agents for stimulating activity of methyl modifying enzymes and methods of use thereof
KR20120059553A (ko) 2009-08-14 2012-06-08 제넨테크, 인크. Ｖｅｇｆ 길항제에 대한 환자 반응을 모니터링하기 위한 생물학적 마커
US20110064732A1 (en) 2009-09-17 2011-03-17 Sanne Lysbet De Haas Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients
MX2012007379A (es) 2009-12-23 2012-08-31 Genentech Inc Anticuerpos anti-bv8 y usos de los mismos.
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
KR101810593B1 (ko) 2010-06-16 2017-12-22 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 Ｔｌｒ7 및／또는 ｔｌｒ9 억제제를 사용하는 치료 방법
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
MX2013005759A (es) 2010-11-24 2013-07-05 Hoffmann La Roche Metodos para detectar bajo grado de inflamacion.
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
TW201310016A (zh) * 2011-08-26 2013-03-01 Chin-Feng Wan 生物檢測晶片及其製造方法
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
TWM426766U (en) * 2011-10-13 2012-04-11 Chin-Feng Wan Microfluidic chip
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
WO2013101771A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
KR20140114415A (ko) 2012-01-13 2014-09-26 제넨테크, 인크. Vegf 길항제로의 치료를 위한 환자를 확인하기 위한 생물학적 마커
US9522943B2 (en) 2012-03-02 2016-12-20 Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner Treating human immunodeficiency virus infections
BR112014024219A8 (pt) 2012-03-30 2017-07-25 Genentech Inc Métodos de determinação, de otimização da eficácia terapêutica, de monitoramento, de seleção de terapia e de diagnóstico de distúrbio e kit
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US9297756B2 (en) * 2013-02-01 2016-03-29 Battelle Memorial Institute Capillary absorption spectrometer and process for isotopic analysis of small samples
JP6669500B2 (ja) 2013-02-25 2020-03-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 薬物耐性ａｋｔ変異体を検出し治療するための方法及び組成物
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
US20160067307A1 (en) 2013-05-01 2016-03-10 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer
AU2014268519A1 (en) 2013-05-23 2015-11-05 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer
HRP20211563T1 (hr) 2013-07-11 2022-01-07 Modernatx, Inc. Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe
PL3021869T3 (pl) 2013-07-16 2020-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworu z użyciem antagonistów wiązania osi PD-1 i inhibitorów TIGIT
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015061441A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 Genentech, Inc. Methods of diagnosing and treating eosinophilic disorders
US9574232B2 (en) * 2014-02-25 2017-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices and methods for controlling reversible chemical reactions at solid-liquid interfaces by rapid preconcentration and phase replacement
SG11201610074YA (en) 2014-06-06 2016-12-29 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2017523776A (ja) 2014-07-14 2017-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 膠芽腫の診断方法及びその治療用組成物
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
WO2016046640A2 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Medical Prognosis Institute A/S Methods for predicting drug responsiveness
US20160168640A1 (en) 2014-11-10 2016-06-16 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for il-33-mediated disorders
US10760182B2 (en) * 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
RU2739942C2 (ru) 2014-12-24 2020-12-30 Дженентек, Инк. Терапевтические, диагностические и прогностические способы для рака мочевого пузыря
WO2016196065A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for assessing responsiveness of cancers to bet inhibitors
MY188049A (en) 2015-05-29 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof
JP6812364B2 (ja) 2015-06-03 2021-01-13 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 癌診断用抗ｇｉｔｒ抗体
WO2017007271A1 (ko) * 2015-07-09 2017-01-12 주식회사 넥스모스 앱타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
KR20200087283A (ko) 2015-09-25 2020-07-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 이의 이용 방법
EP3365372A1 (en) 2015-10-22 2018-08-29 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
EA201891121A1 (ru) 2015-11-19 2018-12-28 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитела к глюкокортикоид-индуцированному рецептору фактора некроза опухоли (gitr) и их применения
US11278629B2 (en) 2016-11-02 2022-03-22 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-CD37 immunoconjugate therapy
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018187191A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Jounce Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of cancer
WO2018213297A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer with anti-gitr agonist antibodies
CA3088557C (en) 2018-02-09 2024-02-27 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
GB201905181D0 (en) * 2019-04-11 2019-05-29 Arrayjet Ltd Method and apparatus for substrate handling and printing
WO2021146303A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Jounce Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of cancer
WO2022200485A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Hybridization buffer formulations

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022544A (en) * 1983-01-24 2000-02-08 The John Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of oligomeric forms of antigen of controlled chemistry
US5681930A (en) * 1985-12-20 1997-10-28 Bristol-Myers Squibb Company Anti-oncostatin M monoclonal antibodies
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5871928A (en) * 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5527681A (en) * 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
ZA909842B (en) * 1989-12-08 1991-09-25 Oncogen Proteins with oncostatin m activity and process for their preparation
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
WO1993009668A1 (en) * 1991-11-22 1993-05-27 Affymax Technology N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5631734A (en) * 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
US5578832A (en) * 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5861248A (en) * 1996-03-29 1999-01-19 Urocor, Inc. Biomarkers for detection of prostate cancer
US5741772A (en) * 1997-02-03 1998-04-21 Amgen Inc. Neurotrophic factor NNT-1
US5760130A (en) * 1997-05-13 1998-06-02 Molecular Dynamics, Inc. Aminosilane/carbodiimide coupling of DNA to glass substrate
US6169194B1 (en) * 1997-10-16 2001-01-02 Michael Thompson High surface density covalent immobilization of oligonucleotide monolayers using a 1-(thiotrifluoroacetato)-11-(trichlorososilyl)-undecane linker
US5958442A (en) * 1997-10-24 1999-09-28 Bristol-Myers Squibb Company Oncostatin M for treating inflammation
US6101946A (en) * 1997-11-21 2000-08-15 Telechem International Inc. Microarray printing device including printing pins with flat tips and exterior channel and method of manufacture
DE69825722T2 (de) * 1998-02-04 2005-08-25 Corning Inc. Substrat zum Drucken einer Matrize
US5997961A (en) * 1998-03-06 1999-12-07 Battelle Memorial Institute Method of bonding functional surface materials to substrates and applications in microtechnology and antifouling
US6048695A (en) * 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
US6324479B1 (en) * 1998-05-08 2001-11-27 Rosetta Impharmatics, Inc. Methods of determining protein activity levels using gene expression profiles
WO2000052204A2 (en) * 1999-02-22 2000-09-08 Orntoft Torben F Gene expression in bladder tumors
US6864050B2 (en) * 1999-07-30 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Single-phase amplification of nucleic acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009229398A (ja) * 2008-03-25 2009-10-08 Toyo Kohan Co Ltd 蛍光標識された生体関連分子の検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1276702A2 (en) 2003-01-22
AU2001249727A1 (en) 2001-10-15
WO2001075166A3 (en) 2002-05-02
US20020081597A1 (en) 2002-06-27
IL151865A0 (en) 2003-04-10
US20110182889A1 (en) 2011-07-28
WO2001075166A2 (en) 2001-10-11
US20090232802A1 (en) 2009-09-17
CA2402525A1 (en) 2001-10-11
US20070037148A1 (en) 2007-02-15
US20030190660A1 (en) 2003-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003529774A (ja) 遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法
JP4146239B2 (ja) オリゴヌクレオチド修飾粒子をベースとするバイオバーコード
JP7372927B6 (ja) 遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法
JP4860869B2 (ja) 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
US20170354967A1 (en) Lab-on-chip system for analyzing nucleic acid
WO1998053103A1 (en) Nucleic acid arrays
JP2005502346A (ja) 核酸配列の非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするための方法
JP6182300B2 (ja) 標的核酸の検出方法
EP3971282A1 (en) Array and method for detecting spatial information of nucleic acids
US20060199181A1 (en) Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP2007506404A (ja) 核酸分子を検出するための迅速な方法
JP2003528315A (ja) 離散的アッセイ末端としての混合ポリヌクレオチド配列
EP1479783A2 (en) PCR amplification method, pcr primer set, pcr amplification product, and method for detection of nucleic acid using the amplification method
JP2005500051A (ja) 比率に基づくオリゴヌクレオチドプローブの選択
US20170306393A9 (en) Method for Detecting Target Nucleic Acid
US10501779B2 (en) Oligonucleotide trapping
JP2003329685A (ja) プローブ分子が固定された検出具の処理方法及び水性処理液
JP2007300829A (ja) Ｄｎａマイクロアレイ等に供する検体の調製方法
RU2286798C2 (ru) Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
JP2003248000A (ja) 生体高分子固定化担体を用いた分析方法、および生体高分子固定化担体
JP3857075B2 (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具
EP1256805B1 (en) Biological material chip
JPWO2003019199A1 (ja) リガンド固定基体
JP2006340651A (ja) Ｒｎａの調整方法
JP2002360246A (ja) 核酸固定化物

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080331

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080404

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20080404

A072 Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A072

Effective date: 20091110