JP2003528581A - プロテアーゼ阻害物質様の新規ヒトタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 療法、診断および薬理遺伝学的用途に使用できる新規ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 １．発明の分野 本出願は、米国仮出願６０／１５６，１０１（１９９９年９月２４日出願）の
優先権を主張する。この全体を本明細書に援用する。

【０００２】 本発明は、哺乳動物トリプシン阻害物質との配列類似性をもつタンパク質をコ
ードする新規ヒトポリヌクレオチドの知見、同定および解明に関する。本発明は
、本明細書に記載するポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパ
ク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質
およびペプチドに対する抗体、ならびに遺伝子工学的に処理された、開示遺伝子
を欠如または過剰発現する動物、それらのタンパク質のアンタゴニストおよびア
ゴニスト、ならびに開示遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性
を調節する他の化合物であって、診断、薬物スクリーニング、臨床試験モニタリ
ング、および生理的障害の処置その他、生活の質に寄与するために使用できる化
合物を包含する。

【０００３】 ２．発明の背景 プロテアーゼは、ポリペプチド配列のタンパク質分解性開裂を仲介する酵素で
ある。逆にプロテアーゼ阻害物質はタンパク質分解活性を阻止または妨害する。
多様な細胞機能および疾患におけるタンパク質分解の重要性のため、プロテアー
ゼ阻害物質は殊に感染性疾患、特にウイルス性疾患の発症抑制、細胞プロセス調
節、および阻止に関与することが証明された。

【０００４】 ３．発明の概要 本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド、および対応するこ
れらのタンパク質のアミノ酸配列の知見、同定および解明に関する。本明細書に
初めて記載したこれらの新規ヒトタンパク質（ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ；ＮＨＰ）は、動物トリプシン阻害タンパク質と構造類似性をもつ。し
たがって新規遺伝子は、門および広範な種にわたる広範な相同体およびオーソロ
グ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をもつ新規タンパク質群である。

【０００５】 本明細書に記載する新規ヒト核酸配列は、長さ４９７アミノ酸のタンパク質／
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号：２を参照）をコードする
。

【０００６】 本発明は下記のものをも包含する：前記ＮＨＰのアゴニストおよびアンタゴニ
スト（天然ＮＨＰと競合する、小型分子、大型分子、変異ＮＨＰ、またはその一
部が含まれる）、ＮＨＰペプチド、および抗体、ならびに前記ＮＨＰの発現を阻
害するために使用できるヌクレオチド配列（たとえばアンチセンス分子およびリ
ボザイム分子、ならびに遺伝子または調節配列の置換構築体）、または前記ＮＨ
Ｐ配列の発現を高めるために使用できるヌクレオチド配列（たとえば、前記遺伝
子を強力なプロモーター系の制御下におく発現構築体）、ならびにＮＨＰトラン
スジーンを発現するトランスジェニック動物、または機能性ＮＨＰを発現しない
”ノックアウト体”（条件付きであってもよい）。

【０００７】 さらに本発明は、ＮＨＰ発現および／またはＮＨＰ生成物活性を調節する化合
物、すなわちそのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定
方法であって、前記ＮＨＰおよび／またはＮＨＰ生成物の精製物、あるいはそれ
を発現する細胞を使用する方法にも関する。それらの化合物は、生物学的障害ま
たは平衡異常を伴う多様な症状の処置のための療法薬として使用できる。

【０００８】 ４．配列表および図面の説明 配列表に、前記ＮＨＰアミノ酸配列をコードするトリプシン阻害物質様ＯＲＦ
の配列を示す。

【０００９】 ５．発明の詳細な記述 本明細書に初めて記載するＮＨＰは、特にヒト細胞系、ならびにヒト前立腺、
胎児脳、小脳、脊髄、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、気管、肺、腎臓、胎児肝臓
、甲状腺、副腎、胃、小腸、結腸、筋肉、心臓、子宮、胎盤、乳腺および精巣の
細胞に発現する新規タンパク質である。前記配列は、遺伝子トラップしたｃＤＮ
Ａおよびヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーより単離したクローンならびにヒト胎盤
ｃＤＮＡ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州ガイザースバーグ
）からコンパイルされた。本発明は下記のものを包含する：配列表に示すヌクレ
オチド配列、それらのヌクレオチドを発現する宿主細胞、それらのヌクレオチド
の発現生成物、ならびに（ａ）前記遺伝子の哺乳動物相同体（具体的に記載した
ＮＨＰおよびＮＨＰ生成物を含む）をコードするヌクレオチド；（ｂ）ＮＨＰの
機能性ドメイン（活性ドメインの新規領域が含まれるが、これらに限定されない
）に対応する１以上の部分をコードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレオ
チド配列により特定されるポリペプチド生成物；（ｃ）前記ＮＨＰの少なくとも
１つのドメインの全部または一部が欠失または変化した遺伝子工学的に形成した
変異体または天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌクレ
オチド配列により特定されるポリペプチド生成物；シグナル配列の全部または一
部が欠失した可溶性タンパク質およびペプチドが含まれるが、これらに限定され
ない；（ｄ）ＮＨＰまたはそのドメインの１つ（たとえば受容体／リガンド結合
ドメイン、アクセサリータンパク質／自己会合ドメインなど）が他のペプチドま
たはポリペプチドに融合したキメラ融合タンパク質をコードする、ＮＨＰコード
領域の全部または一部を含有するヌクレオチド；あるいは（ｅ）前記ポリヌクレ
オチドの療法用または診断用誘導体、たとえば本明細書の配列表に初めて開示し
た配列を含むオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム
、ｄｓＲＮＡまたは遺伝子療法構築体。

【００１０】 前記のように、本発明には下記のものが含まれる：（ａ）配列表に示したヒト
ＤＮＡ配列（およびそれらを含むベクター）；さらに、配列表に示したＤＮＡ配
列の相補配列に高緊縮条件下で［たとえば０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合Ｄ
ＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、
６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，お
よびＪｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）
］ハイブリダイズする連続したＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
をもち、機能的に均等な遺伝子生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列
も考慮される。さらに、配列表に示したアミノ酸配列をコードおよび発現するＤ
ＮＡ配列の相補配列に中等度緊縮条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，前掲）
］ハイブリダイズし、なおかつ機能的に均等なＮＨＰ生成物をコードする、いか
なるヌクレオチド配列も考慮される。ＮＨＰの機能均等物には、他の種に存在す
る天然ＮＨＰ、および天然の、または工学的に作成した（部位特異的変異誘発、
遺伝子シャッフリング、指向性進化：たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８に記載
）変異ＮＨＰが含まれる。本発明には、開示したＮＨＰポリヌクレオチド配列の
縮重核酸バリアントも含まれる。

【００１１】 さらに、ＮＨＰ ＯＲＦを含むポリヌクレオチド、または配列番号：１の対応
する領域に約９９％、９５％、９０％もしくは約８５％類似する（たとえばデフ
ォルト設定を採用したＧＣＧ配列分析パッケージを用いるＢＬＡＳＴ配列比較分
析により測定して）ポリヌクレオチド配列を含む、それらの機能均等物が考慮さ
れる。

【００１２】 本発明には、前記ＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、した
がってその相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含まれる。そのよ
うなハイブリダイゼーション条件は、前記のように高緊縮であってもよく、また
は緊縮度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（”ＤＮ
Ａオリゴ体”）である場合、それらの分子は本明細書の配列表に初めて開示した
配列の連続領域を含む、一般に約１６〜約１００塩基、約２０〜約８０塩基、ま
たは約３４〜約４５塩基の長さのもの、またはそこに示すサイズの任意の変更ま
たは組合わせである。それらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの単離
、ならびにクローニング鋳型および配列決定用鋳型の調製などを行うことができ
る。

【００１３】 あるいは、そのようなＮＨＰオリゴヌクレオチドを、ライブラリーのスクリー
ニングおよび遺伝子発現パターンの評価のためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いることができる（特にマイクロアレイまたはハイスループット”チ
ップ”方式を用いて）。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド配列また
はその相補配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を提示することがで
きる。一般に長さ約１６〜約４０（またはこの範囲のうちの任意の自然数）ヌク
レオチドのオリゴヌクレオチドが互いに部分的にオーバーラップしてもよく、お
よび／またはオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用いてＮＨＰ配列を提
示することもできる。したがって前記ＮＨＰポリヌクレオチド配列は一般に、そ
れぞれ本明細書の配列表に初めて開示した、少なくとも約１８、好ましくは少な
くとも約２５ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチド配列を少なくとも
約２つまたは３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、配列
表中の配列内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列に対して
センス（５’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで進行して
もよい。

【００１４】 オリゴヌクレオチドプローブに関して、高緊縮条件とは、たとえば６×ＳＳＣ
／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、
４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、
および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。これらの核酸分子
は、たとえばＮＨＰ遺伝子調節に有用なＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子を含み、
またはそれらの分子として作用することができる（ＮＨＰ遺伝子核酸配列の増幅
反応におけるアンチセンスプライマーを得るために、および／またはアンチセン
スプライマーとして）。ＮＨＰ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用いて生
物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮＨＰ
遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用
できる。

【００１５】 さらに、阻害性のアンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記を含
めた群（これらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分
を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロ
ウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシ
トシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチル
アミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル
、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６
−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２
−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシ
トシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチ
ルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベー
タ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、
５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオ
シン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、
４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエス
テル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−
（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、
および２，６−ジアミノプリン。

【００１６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノー
ス、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選
択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。

【００１７】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデー
ト、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
およびホルムアセタール、またはその類似体よりなる群から選択される少なくと
も１個の修飾リン酸主鎖を含む。

【００１８】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオ
リゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位
と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮ
Ａと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。あるいは二本鎖ＲＮＡを用いてターゲットＮＨ
Ｐの発現および機能を撹乱することができる。

【００１９】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば
自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。一例として、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９）により合成でき、メチルホスホ
ネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる
（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。

【００２０】 低緊縮条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個
々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引き
については、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（およびその定期的改訂版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９
８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓおよび
Ｗｉｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク。

【００２１】 あるいは、適切な緊縮条件を採用し、またはＰＣＲにより、適切に標識したＮ
ＨＰヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングす
ることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性（ヌクレオチ
ド反復配列、マイクロサテライト対立遺伝子、一ヌクレオチド多型、またはコー
ディング一ヌクレオチド多型が含まれるが、これらに限定されない）の確認、特
定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の設計に有用で
ある。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エキソン境界に隣接する領域に由来す
る配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス部位（たとえばスプライス
アクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出するための増幅ア
ッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理遺伝学に使用でき
る。

【００２２】 さらに、本明細書に開示するＮＨＰ生成物内のアミノ酸配列に基づいて設計し
た２つの縮重または”ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）”オリゴヌクレオチドプライマー
プールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＨＰ遺伝子相同
配列を単離できる。反応の鋳型は、ＮＨＰ配列の対立遺伝子を発現することが分
かっているかまたは推測される、たとえばヒトまたは非ヒト細胞系または組織（
たとえば前立腺、直腸、結腸または副腎）から調製したｍＲＮＡの逆転写により
得られる全ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡであってよい。増幅配列が
目的ＮＨＰ遺伝子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成物をサブクロ
ーニングして配列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグメントを用い
て多様な方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅フラグメント
を標識し、ｃＤＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメントを用いて、
ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することがで
きる。

【００２３】 ＰＣＲ法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標
準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＨＰ遺伝子を発現するこ
とが分かっているかまたは推測されるもの、たとえば精巣）からＲＮＡを単離で
きる。最も５’末端の増幅フラグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーを第１鎖合成のプライミングに用いて、ＲＮＡについて逆転写（ＲＴ）反応を
行うことができる。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準的なター
ミナルトランスフェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブリッドをＲ
Ｎａｓｅ Ｈで消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプライミング
することができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列を単離で
きる。使用できるクローニング方式の概説については、たとえばＳａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（前掲）を参照されたい。

【００２４】 変異ＮＨＰ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離でき
る。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有すると推定され
る個体において発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離し
たｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新
たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常遺伝子の５’
末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、このｃＤＮＡ
の第２鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲによ
り増幅させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方
法でＤＮＡ配列分析を行う。変異ＮＨＰ対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＮＨＰ
対立遺伝子のものと比較することにより、変異ＮＨＰ配列生成物の機能の喪失ま
たは変化に関与する変異（１以上）を確認できる。

【００２５】 あるいは、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分か
っている個体（すなわちＮＨＰ関連表現型、たとえば肥満症、高血圧症などを発
現している者）から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築することがで
き、または変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているかもしくは推測
される組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築することができる
。次いで、正常なＮＨＰ配列、またはそのいずれか適切なフラグメントを標識し
てプローブとして用い、そのようなライブラリー中の対応する変異ＮＨＰ対立遺
伝子を同定することができる。次いで、当業者に周知の方法で変異ＮＨＰ遺伝子
配列を含むクローンを精製し、配列分析することができる。

【００２６】 さらに、たとえば変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは
分かっている個体の、そのような変異対立遺伝子を発現することが分かっている
かまたは推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、
発現ライブラリーを構築できる。この方法で、後記のように、推定変異組織が形
成した遺伝子生成物を発現させ、正常ＮＨＰ生成物に対して産生された抗体と組
み合わせた標準抗体スクリーニング法を用いてスクリーニングすることができる
（スクリーニング法については、たとえばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ
編，１９８８，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプ
リング・ハーバー，参照）。

【００２７】 さらに、標識ＮＨＰ融合タンパク質、たとえばアルカリ性ホスファターゼ−Ｎ
ＨＰまたはＮＨＰ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質を用いてスクリー
ニングすることによりスクリーニングを行うことができる。ＮＨＰ変異により機
能の変化した遺伝子生成物が発現する場合（たとえばミスセンス変異またはフレ
ームシフト変異の結果）、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体が対応する変異Ｎ
ＨＰ遺伝子生成物と交差反応する可能性がある。それらとそのような標識抗体と
の反応により検出されるライブラリークローンを当技術分野で周知の方法で精製
し、配列分析することができる。

【００２８】 本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＨＰコード配列および／また
はその相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（
ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前記ＮＨ
Ｐコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（たとえばＵＳＰ５，８６９
，３３６に記載のバキュロウイルス；本明細書に援用する）；（ｃ）宿主細胞に
おけるコード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前記Ｎ
ＨＰコード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処理した宿主細胞；ならびに
（ｄ）外から導入された調節要素の制御下に（すなわち遺伝子の活性化）内因性
ＮＨＰ遺伝子を発現する、遺伝子工学的に処理した宿主細胞。本明細書中で用い
る調節要素には、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレ
ーター、ならびに発現を誘発および調節することが当業者に知られている他の要
素が含まれるが、これらに限定されない。それらの調節要素には、下記のものが
含まれるが、これらに限定されない：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極
初期遺伝子、調節可能なウイルス要素（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター
）、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ
系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター
領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐ
ＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−
接合因子のプロモーター。

【００２９】 本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ
フラグメントが含まれる）、ＮＨＰのアンタゴニストおよびアゴラスト、ならび
にＮＨＰ遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子
阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配
列置換構築体）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド構
築体（たとえばＮＨＰコード配列が機能可能な状態でプロモーター、プロモータ
ー／エンハンサーなどの発現制御要素と結合した発現構築体）。

【００３０】 前記ＮＨＰまたはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチ
ド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために変異Ｎ
ＨＰまたは不適正発現したＮＨＰを検出するのに使用できる。ＮＨＰタンパク質
またはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列、宿主細胞発
現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、ならびに遺伝子工学的に処理した細
胞および動物は、身体における正常なＮＨＰ機能の撹乱の症候性発現または表現
型発現を処置するのに有効な薬物のスクリーニング（またはコンビナトリアルラ
イブラリーのハイスループットスクリーニング）にも使用できる。遺伝子工学的
に処理した宿主細胞および／または動物の使用は、それらの系によりＮＨＰの内
因性受容体に結合する化合物を同定できるだけでなく、ＮＨＰ仲介による信号伝
達を誘発する化合物をも同定できるという点で、有利である。

【００３１】 最終的に、ＮＨＰ生成物を療法薬として使用できる。たとえばＮＨＰの可溶性
誘導体、ＮＨＰに対応するペプチド／ドメイン、ＮＨＰ融合タンパク質生成物（
特にＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰまたはＮＨＰド
メインの融合体）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメン
トが含まれる）、アンタゴニストまたはアゴニスト（信号伝達を調節し、ＮＨＰ
仲介信号伝達経路における下流ターゲットに作用する化合物が含まれる）を用い
て、そのような疾病または障害を直接に処置することができる。たとえば、有効
量の可溶性ＮＨＰ、またはＮＨＰを模倣したＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タンパク質も
しくは抗イディオタイプ抗体（またはそのＦａｂ）の投与により、内因性ＮＨＰ
受容体を活性化するか、またはそれと効果的に拮抗させることができる。そのよ
うなＮＨＰ生成物をコードするヌクレオチド構築体を用いて、そのような生成物
をインビボで発現するように宿主細胞を遺伝子工学的に処理することができる；
遺伝子工学的に処理したこれらの細胞は体内で”バイオリアクター”として作用
し、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチドまたはＮＨＰ融合タンパク質を身体に連続的に供給
する。機能性ＮＨＰ、変異ＮＨＰ、ならびにアンチセンス分子およびリボザイム
分子をコードするヌクレオチド構築体は、ＮＨＰ発現を調節する”遺伝子療法”
方式にも使用できる。したがって本発明は、生物学的障害を処置するための医薬
配合物および方法をも包含する。

【００３２】 開示したＮＨＰのオーソログをコードするネズミ遺伝子のノックアウトＥＳ細
胞クローンを作成した。 本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載す
る。

【００３３】 ５．１ ＮＨＰ配列 前記ＮＨＰのｃＤＮＡ配列（配列番号：１および３）および対応する推定アミ
ノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。ＮＨＰ遺伝子は、ヒト精巣および胎
盤のｃＤＮＡライブラリーから、ヒト遺伝子トラップ配列タグより生成したプロ
ーブおよび／またはプライマーを用いて得られた。発現分析により、前記ＮＨＰ
はたとえばヒト精巣、前立腺および遺伝子トラップしたヒト細胞において発現し
うることが証明された。トリプシン阻害物質をコードする遺伝子のほかに、前記
ＮＨＰは多様な癌病原性タンパク質、***糖タンパク質および分泌タンパク質と
有意の類似性をもつ。

【００３４】 前記オープンリーディングフレームは、配列番号：１の塩基８１に対応するＣ
からＴへの変移、配列番号：１の塩基９６５に対応するＧからＣへの変換（セリ
ンからトレオニンに変化）および配列番号：３の５’ＵＴＲの塩基１６５に対応
するＣからＧへの変換を含めた、幾つかの多型をも含むことができる。配列番号
：３に、５’側および３’側フランキング配列を含む全長ＯＲＦを記載する。

【００３５】 ５．２ ＮＨＰおよびＮＨＰポリペプチド ＮＨＰ、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、変異形、トランケート形もし
くは欠失形のＮＨＰ、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様な用途のた
めに調製することができる。これらの用途には、抗体産生、診断アッセイにおけ
る試薬としての用途、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定のための用
途、精神的、生物学的または医学的な障害および疾病の療法処置に有用な医薬と
して使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての
用途が含まれるが、これらに限定されない。

【００３６】 配列表に、前記ＮＨＰ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を開示する。前
記ＮＨＰはそれぞれ翻訳開始部位に一致するＤＮＡ配列コンテクストにイニシエ
ーターメチオニンをもち、さらに分泌タンパク質に特徴的な疎水性リーダー配列
特性をもつ。

【００３７】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列には、配列表に示したアミノ酸配列、ならびにそ
の類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の種に由来する対応するＮＨＰ相
同配列も本発明に包含される。事実、配列表に示したアミノ酸配列の全部または
いずれかの新規部分をコードする新規ポリヌクレオチド配列と同様に、前記ＮＨ
Ｐヌクレオチド配列がコードするいかなるＮＨＰタンパク質も本発明の範囲に含
まれる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示した各アミ
ノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン（または
多くの場合、コドン類）の一般的代表例である。したがって、本明細書で意図す
るように、配列表に示したアミノ酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８６，Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌら編
，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏ
ｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨーク；本明細書に参考として援用）を合わせて
考慮すると、そのようなアミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の変形およ
び組合わせすべてのうちの一般的代表例である。

【００３８】 本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して本明細書に記載したヌクレオ
チド配列がコードするＮＨＰに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これら
の基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＨＰの基質を結
合および開裂する能力；同一または補足的な下流信号伝達経路に影響を及ぼす能
力；細胞代謝（たとえばタンパク質分解活性、イオンフラックス、チロシンリン
酸化など）を変化させる能力。そのような機能的に均等なＮＨＰタンパク質には
、前記ＮＨＰヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付
加体または置換体であって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に
均等な遺伝子生成物を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミ
ノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／また
は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）ア
ミノ酸残基にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニ
ルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグ
ルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンお
よびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸お
よびグルタミン酸が含まれる。

【００３９】 多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発
現させることができる。本発明の場合のようにＮＨＰペプチドまたはポリペプチ
ドが可溶性分子または分泌分子であると考えられるならば、ペプチドまたはポリ
ペプチドを培地から回収できる。そのような発現系には、ＮＨＰまたはその機能
均等物をｉｎ ｓｉｔｕで、すなわち細胞膜に結合した状態で発現する工学的に
処理した宿主細胞も包含される。そのような発現系からのＮＨＰの精製または富
化は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業者に周知の方法を用い
て行うことができる。しかし、ＮＨＰの構造特性および機能特性を維持するだけ
でなく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおいて生物学的活性を評価する
ことが重要である場合、そのような工学的に処理した宿主細胞自体を使用できる
。

【００４０】 本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定
されない：ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、た
とえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵
母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃ
ｈｉａ））；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロ
ウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコ
モザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベク
ター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細
胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）
もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後
期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）を含む組換え
発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９
、３Ｔ３など）。

【００４１】 細菌系では、発現するＮＨＰ生成物について意図する用途に応じて、多数の発
現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＨＰの医薬組成物またはＮＨＰ含有
医薬組成物を調製するために、あるいはＮＨＰに対する抗体を産生させるために
、そのようなタンパク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパ
ク質生成物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのよう
なベクターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：大腸菌発現ベ
クターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．
，２：１７９１）、この場合、ＮＨＰコード配列を個々に、融合タンパク質が産
生されるようにｌａｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクター中にライゲ
ートさせる；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈ
ｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチド
をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発
現させることもできる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解
細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの
存在下での溶離によって、容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターがトロンビンま
たはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、これにより、クローン
化したターゲット遺伝子の生成物をＧＳＴ部分から放出させることができる。

【００４２】 昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロー
シスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ａ
ｃＮＰＶ）を外来遺伝子発現のためのベクターとして用いる。このウイルスをＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖させる。ＮＨＰ遺伝子
コード配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へ
クローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）
の制御下におく。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺
伝子が不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換え
ウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをも
たないウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入遺伝子
を発現させる（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。

【００４３】 哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイ
ルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配
列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三
部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。
次いでこのキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイル
スゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ
３）に挿入すると、感染宿主においてＮＨＰ遺伝子生成物を発現しうる生存可能
な組換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９
参照）。挿入したＮＨＰヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナ
ルが必要なこともある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配
列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＨＰ遺伝子また
はｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必
要ないかもしれない。しかしＮＨＰコード配列の一部のみを挿入する場合、外因
性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給しなければな
らない。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的コ
ード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル
および開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであって
よい。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませるこ
とにより、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４参
照）。

【００４４】 さらに、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子生成物を目的とする特定の様
式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク
質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たと
えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タン
パク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾について特徴的かつ
特異的な機序をもつ。発現した外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシング
を確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このため
に、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン
酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿
主細胞にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、
３Ｔ３、ＷＩ３８、特にヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

【００４５】 組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たと
えば前記ＮＨＰ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成することができる。
ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要素
（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニ
ル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択性マーカーで、宿主細胞を
形質転換することができる。この外来ＤＮＡの導入後、工学的に処理した細胞を
富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミ
ド内の選択性マーカーが選択に対する耐性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞
の染色体に安定に組み込むことができ、増殖してフォーカスを形成する。次いで
これをクローン化し、細胞系に拡張することができる。この方法は、ＮＨＰ生成
物を発現する細胞系を工学的に作成するのに有利に使用できる。このような工学
的に作成した細胞系は、ＮＨＰ生成物の内因活性に影響を与える化合物のスクリ
ーニングおよび評価に特に有用である。

【００４６】 多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．
，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９
６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、お
よびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，１
９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-また
はａｐｒｔ^-細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎
として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を
与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミ
コフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９
８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎ
ｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒ
ｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。

【００４７】 あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、い
かなる融合タンパク質も容易に精製できる。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが記
載した系は、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製で
きる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝
子をその遺伝子のオープンリーディングフレームが６ヒスチジン残基からなるア
ミノ末端タグに翻訳時融合するように、ワクシニア組換えプラスミド内へサブク
ローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮ
ｉ²⁺・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付きタンパク
質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。

【００４８】 ５．３ ＮＨＰ生成物に対する抗体 １以上のＮＨＰのエピトープ、またはＮＨＰの保存変異体のエピトープ、また
はＮＨＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含され
る。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂
フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イデ
ィオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フラグ
メントが含まれるが、それらに限定されない。

【００４９】 本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したがって
患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後判定法の一部として使
用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法と組み合わせて
、後記のようにＮＨＰ遺伝子生成物の発現および／または活性に対する被験化合
物の作用を評価するのにも利用できる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と
組み合わせて用い、たとえば正常および／または工学的に処理したＮＨＰ発現細
胞を患者に導入する前に評価することができる。そのような抗体をさらに、異常
なＮＨＰ活性の阻害手段として使用できる。したがって、そのような抗体を処置
方法の一部として利用できる。

【００５０】 抗体産生のためには、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（たとえばＮＨＰの機能性ドメ
インに対応するもの）、トランケート形ＮＨＰポリペプチド（１以上のドメイン
を欠失したＮＨＰ）、ＮＨＰの機能均等物、またはＮＨＰの変異バリアントを注
射することにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると
、そのような宿主動物にはブタ、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットが含まれる
が、これらに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々の
アジュバントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全
）、無機塩、たとえば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、界面活性
物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチ
ド、油エマルション、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣ
Ｇ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。あるい
は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、破
傷風毒素、ジフテリア毒素、卵アルブミン、コレラ毒素、またはそのフラグメン
トなどの分子との組合わせおよび／または結合により、免疫応答を高めることが
できる。ポリクローナル抗体は免疫化動物の血清から得られる不均一な抗体分子
集団である。

【００５１】 特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培
養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。
これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４
９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブリ
ンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビト
ロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生で
きるので、これは現在好ましい産生方法である。

【００５２】 さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５
４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの
遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシング
することによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に
由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部
をもつものである。そのような方法はＵＳＰ６，０７５，１８１および５，８７
７，３９７に記載されており、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。

【００５３】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７
７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−５４６）を、ＮＨＰ遺伝子生成物に対する一本
鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ
鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させて一本鎖ポリペプチドにすることに
より形成される。

【００５４】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。
たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製でき
るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィ
ド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これら
に限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、目的
とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定す
ることができる。

【００５５】 次いでＮＨＰに対する抗体を使用し、当業者に周知の方法を用いて、そのＮＨ
Ｐを”模倣”した抗イディオタイプ抗体を産生させることができる（たとえばＧ
ｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３
７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
４７（８）：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＨＰドメインに結合して
ＮＨＰがそのコグネイト受容体に結合するのを競合阻害する抗体を用いて、ＮＨ
Ｐを”模倣”する、したがって受容体に結合および活性化または中和する、抗イ
ディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような抗イディオタイプ抗体
またはそのような抗イディオタイプ抗体のフラグメントは、ＮＨＰ信号伝達経路
を伴う療法に使用できる。

【００５６】 本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの
態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方
法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載し
たもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載および添付の図面からから当業
者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 31/00 48/00 31/12 Ａ６１Ｐ 31/00 43/00 １１１ 31/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ターナー，シー・アレキサンダー，ジュニ ア アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ウインター・ウイート・プレ イス 67 (72)発明者 ワットラー，フランク ドイツ国82131 ストックドルフ，ベンノ シュトラーセ 11ア (72)発明者 ネールス，ミヒャエル ドイツ国82131 ストックドルフ，ポール −ケラー−シュトラーセ ６ (72)発明者 フレドリッチ，グレン アメリカ合衆国テキサス州77004，ヒュー ストン，ハーマン・ドライブ 2207，ブレ ランド・アンド・ブレランド (72)発明者 ザンブロウィッチ，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアーツォーン・プレイ ス 18 (72)発明者 サンズ，アーサー・ティー アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ブリストール・ベンド・サー クル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 GA11 HA12 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 CA18 NA14 ZB322 ZB332 ZC202 4C085 AA13 AA14 AA15 AA16 AA19 BB11 BB41 BB43 CC02 CC03 CC21 CC22 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB32 ZB33 ZC20 4H045 AA10 CA40 DA56 EA20 EA50 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に記載の新規ＮＨＰ遺伝子中の少なくとも２４連
   続塩基のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハ
   イブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチ
   ド配列を含む発現ベクター。