JP2003528029A - Adenovirus formulations for gene therapy - Google Patents

Adenovirus formulations for gene therapy

Info

Publication number
JP2003528029A
JP2003528029A JP2000565112A JP2000565112A JP2003528029A JP 2003528029 A JP2003528029 A JP 2003528029A JP 2000565112 A JP2000565112 A JP 2000565112A JP 2000565112 A JP2000565112 A JP 2000565112A JP 2003528029 A JP2003528029 A JP 2003528029A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hsa
composition
formulation
virus
formulations
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Abandoned
Application number
JP2000565112A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
シャン ジュン シン
カレン アール マクグレノン
デューイ ムーディ
Original Assignee
アヴェンティス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アヴェンティス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド filed Critical アヴェンティス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
Publication of JP2003528029A publication Critical patent/JP2003528029A/en
Abandoned legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス粒子及びウイルスベクターの保存を許容する配合物であって、生物に直接注射可能な配合物に関する。より詳細には、組換えアデノウイルスベクターの力価を最適に増強し、又は、冷蔵若しくは冷凍温度下で前記ベクターを安定化させる組換えアデノウイルスベクター保存用配合物に関する。本発明は、組換えアデノウイルスベクター及び水の凍結温度より高い温度下でアデノウイルスベクターを安定化し、又はＨＳＡ不在下若しくは水性バッファーかでの力価と比較してアデノウイルスベクターの力価を増強させるのに有効な濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む組成物に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a formulation allowing the storage of viral particles and viral vectors, which formulation is directly injectable into an organism. More particularly, it relates to a formulation for storing a recombinant adenovirus vector that optimally enhances the titer of the recombinant adenovirus vector or stabilizes said vector under refrigerated or frozen temperatures. The present invention stabilizes the adenovirus vector at temperatures above the freezing temperature of the recombinant adenovirus vector and water, or enhances the titer of the adenovirus vector compared to that in the absence of HSA or in an aqueous buffer Composition comprising human serum albumin (HSA) at a concentration effective to cause

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 この出願は、1998年８月14日提出の同時係属仮出願60/096,600の利益を請求し
、その開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。This application claims the benefit of co-pending provisional application 60 / 096,600, filed August 14, 1998, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０００２】発明の分野 本発明は、直接生体内へ注射できるウイルス粒子及びウイルスベクターの保存
用の配合物に関する。更に詳細には、本発明は、ベクター力価を最適に高めるか
、又はベクターを冷蔵庫若しくは室温で安定化するか、又は両方を果たす組換え
型アデノウイルスベクターの配合物に関する。本発明は、組換え型アデノウイル
スベクターと、水性緩衝液中で、該アデノウイルスベクターを、水の凝固点以上
の温度で安定化するか、又はヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)が無い場合の力価と比
較してアデノウイルスベクターの力価を高めるか、又はその両方に有効な濃度の
ＨＳＡとを含有する組成物に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to formulations for storage of viral particles and viral vectors that can be injected directly into the body. More particularly, the present invention relates to formulations of recombinant adenovirus vectors that either optimally enhance vector titer or stabilize the vector in the refrigerator or at room temperature, or both. The present invention relates to a recombinant adenovirus vector and a titer in the aqueous buffer solution in which the adenovirus vector is stabilized at a temperature above the freezing point of water or in the absence of human serum albumin (HSA). It relates to a composition containing a concentration of HSA effective to increase the titer of adenovirus vector in comparison, or both.

【０００３】発明の背景 細胞及び遺伝子治療、並びに輸血又は骨髄移植において遭遇する主な問題の１
つは、生体物質の保存の問題である。生体物質を生存度の良い条件下、工業規模
の生産及び貯蔵に適合可能な十分に長い期間保存でき、かつ特有の試験の遂行を
可能にすることが実に重要である。最も一般的に用いられる保存方法は、物質を
冷凍することから成る。しかし、生体物質の冷凍及び解凍の際、生存度及び／又
は感染力が減少しうる。[0003] BACKGROUND cell and gene therapy, and the major problem encountered in blood transfusion or bone marrow transplantation invention 1
The first is the problem of preservation of biological materials. It is indeed important that the biological material can be stored under viable conditions for a long enough period to be compatible with industrial scale production and storage, and to be able to carry out specific tests. The most commonly used storage method consists of freezing the material. However, during freezing and thawing of biological material, viability and / or infectivity can be reduced.

【０００４】 ヒト血清アルブミンは、585個のアミノ酸の非グリコシル化単量体タンパク質
で、分子量６６kDである。その球状構造は、１７個のジスルフィド架橋で維持さ
れ、９個の二重ループの配列系を生成している(Brown,J.R.,1997)。(「アルブミ
ンの構造、機能及び利用」、Rosenoer,V.M.ら(eds.),Pergamon Press,Oxford,pp
.27-51）。ＨＳＡをコードする遺伝子は、高度に多形性であることが知られてお
り、３０以上の明らかに異なる遺伝子変異体が、種々の条件下で電気泳動分析に
よって同定されている(Weitkamp,L.R.ら,1973,Ann.Hum.Genet.,37:219-226)。Ｈ
ＳＡ遺伝子は、１５個のエキソンと１４個のイントロンを含み、想定される「キ
ャップ形成」部位からポリ(Ａ)の付加の第１部位までの16,961個のヌクレオチド
を含有する。Human serum albumin is a non-glycosylated monomeric protein of 585 amino acids with a molecular weight of 66 kD. Its globular structure is maintained by 17 disulfide bridges, creating a 9 double loop sequence system (Brown, JR, 1997). ("Structure, function and utilization of albumin", Rosenoer, VM et al. (Eds.), Pergamon Press, Oxford, pp.
.27-51). The gene encoding HSA is known to be highly polymorphic, and more than 30 distinctly different gene variants have been identified by electrophoretic analysis under various conditions (Weitkamp, LR et al. , 1973, Ann.Hum. Genet., 37: 219-226). H
The SA gene contains 15 exons and 14 introns and contains 16,961 nucleotides from the putative "capping" site to the first site of addition of poly (A).

【０００５】 ヒトアルブミンは、肝臓の肝細胞内で合成されて、末梢血液中に分泌される。
この合成は、第１例では、分泌経路内の新生ポリペプチドを方向づける１８個の
アミノ酸のシグナル配列を含む前駆体、プレプロ−ＨＳＡを導く。 ＨＳＡは、血清１リットルにつき約４０グラムの濃度を有する、最も豊富な血
液タンパク質である。従って、人体内で１回に約160グラムのアルブミンが循環
する。ＨＳＡの最も重要な役割は、血液の正常な浸透圧を維持することである。
また、それは種々の物質に対して優れた結合能力を有し、かつステロイドや胆汁
酸塩のような疎水性分子の内因性輸送、及び種々の治療用物質の輸送の両方で役
割を果たし、それらの関連する作用部位に輸送されうる。更に、ＨＳＡは、最近
プロスタグランジンの分解に関係があるとされている。Human albumin is synthesized in hepatocytes of the liver and secreted into peripheral blood.
This synthesis leads, in a first example, to a precursor, prepro-HSA, which contains a signal sequence of 18 amino acids that directs nascent polypeptides within the secretory pathway. HSA is the most abundant blood protein with a concentration of about 40 grams per liter of serum. Therefore, about 160 grams of albumin circulate in the human body at one time. The most important role of HSA is to maintain the normal osmotic pressure of blood.
It also has an excellent binding capacity for various substances and plays a role both in the endogenous transport of hydrophobic molecules such as steroids and bile salts, and in the transport of various therapeutic substances. Can be transported to the relevant sites of action of. Furthermore, HSA has recently been implicated in the degradation of prostaglandins.

【０００６】 ＨＳＡは、タンパク質抗原、及びヘミンのような小有機分子を含むタンパク質
の溶液を安定化することが、以前に示されている(Paige,A.G.ら,1995,Pharmaceu
tical Res.12:1883-1888;Chang,A.-C.及びR.K.Gupta,J.1996。Pharm.Sci.,85:12
9-132;Niemeijer,N.R.ら,1996。Ann.Allergy Asthma Immunol.,76:535-540;及び
Cannon,J.B.ら,1995。PDA:J.Pharm.Sci.&Tech.,49:77-82)。ＨＳＡは、ヒト血清
の物質源から精製され、又は組換え型細胞(細菌、酵母、又は哺乳類細胞)の発酵
によるか、若しくは特に哺乳類組織由来の遺伝子導入動物における発現による遺
伝子工学から得ることができる。また、ＨＳＡは、冷凍用生体物質の保存にも使
用されている(WO97/33975)。しかし、この使用は、アデノウイルスの室温保存及
び貯蔵については記載されていない。HSA has been previously shown to stabilize solutions of proteins containing protein antigens and small organic molecules such as hemin (Paige, AG et al., 1995, Pharmaceu.
tical Res. 12: 1883-1888; Chang, A.-C. and RK Gupta, J. 1996. Pharm.Sci., 85:12
9-132; Niemeijer, NR et al., 1996. Ann.Allergy Asthma Immunol., 76: 535-540; and
Cannon, JB et al., 1995. PDA: J.Pharm.Sci. & Tech., 49: 77-82). HSA can be purified from a source of human serum or obtained by fermentation of recombinant cells (bacteria, yeast, or mammalian cells) or by genetic engineering, especially by expression in transgenic animals of mammalian tissue origin. . HSA is also used for preservation of biological materials for freezing (WO97 / 33975). However, this use is not described for room temperature storage and storage of adenovirus.

【０００７】 臨床用途のアデノウイルスの保存は、段階II、究極的には制御承認への臨床試
験の進歩として重大な問題になってきた。現在、配合物１(実施例１、後述)のよ
うなアデノウイルス配合物は、安定性を維持するために−７０℃での貯蔵を必要
とする。これら温度でウイルス性ベクターの調製品を保持するための要求は、−
７０℃の温度を維持するフリーザーを臨床医が取得することを必要とする。他の
厄介な問題は、製造箇所からクリニックへのベクターの輸送の際に生じる。本発
明までは、アデノウイルスベクターが、標準的なフリーザー(−２０℃)、冷蔵庫
(４℃)、又は室温(２０℃)の温度で感染力を保存したまま、安定的な貯蔵のため
に配合物できるという望みはほとんどなく、可能性さえ低かった。[0007] Storage of adenoviruses for clinical use has become a major problem as clinical trials progress to Phase II, ultimately regulatory approval. Currently, adenovirus formulations such as Formulation 1 (Example 1, infra) require storage at -70 ° C to maintain stability. The requirement to maintain a viral vector preparation at these temperatures is:
It requires the clinician to obtain a freezer that maintains a temperature of 70 ° C. Another complication is the transportation of the vector from the manufacturing site to the clinic. Until the present invention, the adenovirus vector was stored in a standard freezer (-20 ° C), refrigerator.
There was little or even no hope of being able to formulate for stable storage while preserving infectivity at temperatures of (4 ° C) or room temperature (20 ° C).

【０００８】 後述の実施例で示すように、本発明は、これらの技術的な欠点に焦点を当てか
つ克服し、予想外にも、初めて今までに達成されていたよりも高温でアデノウイ
ルスベクターの長期的な安定性を与える配合物を提供する。 ここで引用するいずれの参照文献も、このような参照文献が本出願の「先行技
術」として利用可能であるという承認として理解すべきではない。As shown in the Examples below, the present invention focuses on and overcomes these technical drawbacks and, unexpectedly, for the first time adenovirus vectors at higher temperatures than previously achieved. Provide formulations that provide long-term stability. None of the references cited herein should be understood as an admission that such references are available as "prior art" to the present application.

【０００９】発明の概要 本発明は、組換え型ウイルスベクター、特にかつ好ましくはアデノウイルスベ
クターの保存及び／又は貯蔵用の配合物であって、ベクター力価を最適に高め、
又は該ベクターを冷蔵庫若しくは室温で安定化し、又はその両者を果たす配合物
を提供する。従って、第１実施形態では、本発明は、組換え型アデノウイルスベ
クターと、アデノウイルスベクターを安定化するのに有効なｐＨの水性緩衝液中
で、アデノウイルスベクターを水の凝固点以上の温度で安定化するか、又は血清
アルブミンが無い場合の力価と比較してアデノウイルスベクターの力価を高める
か、又はその両者に有効な濃度の血清アルブミンとを含有する組成物を提供する
。特有の実施形態では、該血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)であ
る。特有の実施形態では、ＨＳＡの濃度は、約0.01％〜２５％(w/v)である。好
ましくは、ＨＳＡの濃度は約0.1％〜約１５％である。更に好ましくは、ＨＳＡ
の濃度は約１％〜約１０％である。最も好ましくは、ＨＳＡの濃度は約５％であ
る。ＨＳＡは、天然源から精製でき、又は更に好ましくは遺伝子工学によって得
られる。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a formulation for the storage and / or storage of recombinant viral vectors, particularly and preferably adenoviral vectors, which optimizes the vector titer,
Alternatively, a formulation is provided that stabilizes the vector in the refrigerator or at room temperature, or both. Therefore, in the first embodiment, the present invention provides a recombinant adenovirus vector and an adenovirus vector at a temperature equal to or higher than the freezing point of water in an aqueous buffer solution having a pH effective for stabilizing the adenovirus vector. Compositions are provided that contain a concentration of serum albumin that is either stabilized or enhances the titer of the adenovirus vector relative to its titer in the absence of serum albumin, or both. In a specific embodiment, the serum albumin is human serum albumin (HSA). In a specific embodiment, the concentration of HSA is about 0.01% -25% (w / v). Preferably, the concentration of HSA is about 0.1% to about 15%. More preferably, HSA
Is about 1% to about 10%. Most preferably, the concentration of HSA is about 5%. HSA can be purified from natural sources, or more preferably obtained by genetic engineering.

【００１０】 このような配合物の利点は、その溶液を、貯蔵温度から取り出して、更に何ら
の操作も必要とせずに、即座に投与するために利用できるという事実によって生
じる。そして、それは、クリニックで直接貯蔵状態から取り出すことを可能にし
、それによって貯蔵と使用との間の時間を短くでき、無菌配合物形態に常に維持
できるので、外部からのコンタミネーションの危険を最少に減ずることができる
。The advantage of such formulations results from the fact that the solution can be taken from storage temperature and used for immediate administration without any further manipulation. And it allows the clinic to remove directly from storage, thereby reducing the time between storage and use and always maintaining a sterile formulation to minimize the risk of external contamination. Can be reduced.

【００１１】 本発明のさらなる実施形態では、組成物のｐＨは、5.0以上かつ9.0以下である
。好ましくは、ｐＨは7.5より高い。従って、ｐＨは、7.6、7.7、7.8、又は7.9
でありうる。更に好ましくは、ｐＨは8.0より高く、例えば8.1、8.2、8.3、8.4
、8.5、8.6、8.7、8.8、又は8.9である。特有の実施形態では、ｐＨは8.2である
。別の実施形態では、ｐＨは8.4である。好ましくは、本発明の組成物のｐＨが8
.0より高い場合、ＨＳＡの濃度は、１％〜１０％であり；更に好ましくは５％で
ある。特有の実施形態では、ｐＨが8.2の場合、ＨＳＡの濃度が５％である。別
の特有の実施形態では、ｐＨが8.4の場合、ＨＳＡの濃度が５％である。In a further embodiment of the invention, the pH of the composition is 5.0 or higher and 9.0 or lower. Preferably the pH is above 7.5. Therefore, the pH is 7.6, 7.7, 7.8, or 7.9.
Can be More preferably, the pH is higher than 8.0, for example 8.1, 8.2, 8.3, 8.4
, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, or 8.9. In a specific embodiment, the pH is 8.2. In another embodiment, the pH is 8.4. Preferably, the composition of the present invention has a pH of 8
When higher than 0.0, the concentration of HSA is 1% to 10%; more preferably 5%. In a specific embodiment, at a pH of 8.2, the concentration of HSA is 5%. In another specific embodiment, at a pH of 8.4, the concentration of HSA is 5%.

【００１２】 本発明の水性緩衝液は、決して限定するものではないが、リン酸緩衝液、トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、Hepes緩衝液等のような生理緩衝液である。本発明で使用す
るのに好適な緩衝液は、製薬的に許容可能、すなわちインビトロ送達に適合する
。下記で例示する実施形態では、緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液である。緩衝液
は、アデノウイルスベクターを安定化するｐＨに設定される。本発明で用いる水
性緩衝液は、塩、例えば塩化カルシウム(ＣａＣｌ2)、塩化マグネシウム(ＭｇＣ
ｌ2)、及び塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)を含む。例えば、緩衝液は、約2.0mMのＭ
ｇＣｌ2と１５０mMのＮａＣｌを含みうる。特有の実施形態では、水性緩衝液は
、生理的濃度の塩を含む。The aqueous buffer of the present invention is a physiological buffer such as, but not limited to, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, Hepes buffer and the like. Buffers suitable for use in the present invention are pharmaceutically acceptable, i.e. compatible with in vitro delivery. In the embodiment illustrated below, the buffer is Tris-HCl buffer. The buffer is set to a pH that stabilizes the adenovirus vector. Aqueous buffers used in the present invention include salts such as calcium chloride (CaCl 2 ) and magnesium chloride (MgC).
1 2 ) and sodium chloride (NaCl). For example, the buffer solution is about 2.0 mM M
It may contain gCl 2 and 150 mM NaCl. In a specific embodiment, the aqueous buffer comprises physiological concentrations of salt.

【００１３】 更に、本発明の組成物又は配合物は、組換え型アデノウイルスを更に安定化す
るためにＨＳＡに加え、付加成分を含むことができる。このような成分の例とし
ては、限定するものではないが、例えば５％濃度で炭水化物及びブドウ糖、蔗糖
、グルコース等のような糖；例えば１０％濃度で、グリセロール、ポリエチレン
グリコール等のような長鎖ポリオールに対する溶媒；他のタンパク質；アミノ酸
；核酸；キレート剤；タンパク質分解インヒビター；保存剤；及び他の成分が挙
げられる。好ましくは、本発明の組成物のいずれの構成成分も製薬的に許容可能
である。In addition, the composition or formulation of the invention may include additional components in addition to HSA to further stabilize the recombinant adenovirus. Examples of such components include, but are not limited to, carbohydrates and sugars such as glucose, sucrose, glucose, etc. at 5% concentration; eg, long chain such as glycerol, polyethylene glycol, etc. at 10% concentration. Solvents for polyols; other proteins; amino acids; nucleic acids; chelating agents; protein degradation inhibitors; preservatives; and other ingredients. Preferably, any component of the composition of the present invention is pharmaceutically acceptable.

【００１４】 本発明の組成物は、遺伝子治療用の組換え型アデノウイルスの配合物に特に好
適である。従って、好ましい実施形態では、組換え型アデノウイルスは、非相同
的タンパク質を発現する。非相同的タンパク質の例としては、限定するものでは
ないが、ｐ５３のような癌抑制タンパク質；単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ(ＨＳＶ−ｔｋ)のような自殺遺伝子；酸性線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)のよ
うな成長因子；ＦＧＦ又は血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)のような血管原性因子；
神経成長因子(ＮＧＦ)のような栄養性因子；神経栄養性因子−３(ＮＴ−３)、Ｎ
Ｔ−４、グリア由来神経栄養性因子(ＧＤＮＦ)、及び繊毛神経栄養性因子(ＣＮ
ＴＦ)；等が挙げられる。本発明に従って配合されるベクターで発現する非相同
的タンパク質の更に完全な系列については後述する。特有の実施形態では、非相
同的タンパク質はｐ５３である。他の特有の実施形態では、非相同的タンパク質
はＨＳＶ−ＴＫである。The composition of the present invention is particularly suitable for the formulation of recombinant adenovirus for gene therapy. Thus, in a preferred embodiment, the recombinant adenovirus expresses a heterologous protein. Examples of non-homologous proteins include, but are not limited to, tumor suppressor proteins such as p53; suicide genes such as herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk); acid fibroblast growth factor (FGF). Such growth factors; angiogenic factors such as FGF or vascular endothelial growth factor (VEGF);
Trophic factors such as nerve growth factor (NGF); neurotrophic factor-3 (NT-3), N
T-4, glial-derived neurotrophic factor (GDNF), and ciliated neurotrophic factor (CN
TF); and the like. A more complete series of heterologous proteins expressed in vectors formulated according to the invention is described below. In a specific embodiment, the heterologous protein is p53. In another specific embodiment, the heterologous protein is HSV-TK.

【００１５】 当然に、本発明は、更に、組換え型アデノウイルスベクターと、水性緩衝液中
で、アデノウイルスベクターを水の凝固点以上の温度で安定化するか、又はＨＳ
Ａが無い場合の力価と比較してアデノウイルスベクターの力価を高めるか、又は
その両者に有効な濃度のＨＳＡとの混合物を調製する工程を含む、組換え型アデ
ノウイルスベクター配合物の調製方法を提供する。一実施形態では、該温度は４
℃以上かつ３７℃以下である。さらなる実施形態では、温度は２０℃以上である
。好ましくは、温度が４℃より高い場合、特に温度が２０℃より高い場合、ＨＳ
Ａの濃度は５％、混合物のｐＨは8.0より高く、又は両方である。Of course, the present invention further provides that the recombinant adenovirus vector is stabilized with the recombinant adenovirus vector in an aqueous buffer at a temperature above the freezing point of water or HS.
Preparation of a recombinant adenovirus vector formulation comprising the step of increasing the titer of the adenovirus vector relative to the titer in the absence of A or preparing a mixture with HSA in concentrations effective for both. Provide a way. In one embodiment, the temperature is 4
The temperature is not lower than 37 ° C and not higher than 37 ° C. In a further embodiment, the temperature is 20 ° C. or higher. Preferably, if the temperature is above 4 ° C, especially above 20 ° C, HS
The concentration of A is 5%, the pH of the mixture is higher than 8.0, or both.

【００１６】 さらなる観点では、本発明は、約５％〜１５％のグリセロール、約0.25〜２０
mM ＣａＣｌ2、及び0.1〜1.0mM ＭｇＣｌ2のダルベッコのリン酸緩衝食塩水の水
性組成物中でアデノウイルスベクターの混合物を調製することによって、約２０
℃でアデノウイルスベクターを安定化する方法を提供する。 本発明は、図面及び詳細な説明で更に説明される。In a further aspect, the invention provides about 5% to 15% glycerol, about 0.25 to 20.
By preparing a mixture of adenovirus vectors in an aqueous composition of mM CaCl 2 and 0.1-1.0 mM MgCl 2 Dulbecco's phosphate buffered saline, about 20
A method of stabilizing an adenovirus vector at ° C is provided. The present invention is further illustrated in the drawings and detailed description.

【００１７】発明の詳細な説明 本発明は、組換え型ウイルスベクター力価を最適に高めるか、又は冷蔵庫若し
くは室温で該ベクターを安定化するか、又は両方を果たす配合物を用いて、ウイ
ルスベクター、特にアデノウイルスベクターの保存を可能にする新しいタイプの
溶媒を提供する。 後述する特有の例では、種々の配合物について、−７０℃で貯蔵される対照に
対する、8.5ヶ月間までアデノウイルスベクター調製品を安定化する能力を試験
した。１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.2、５％ＨＳＡ、５％蔗糖、2.0mM ＭｇＣ
ｌ2、150mM ＮａＣｌを含有する配合物が非常に安定であり、かつ比較的高温(４
℃及び２０℃)で、６ヶ月間までベクターの感染力を保存し、又は高めることさ
えあることがわかった。さらなる実験で、アデノウイルスベクターの安定性のた
めの最適なｐＨは、ｐＨ8.0以上であることを立証した。更に、溶液中のＨＳＡ
の存在が、ウイルス力価を高めることがわかった(プラーク分析で測定されるよ
うに)。更に、１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.4、５％ＨＳＡ、５％蔗糖、2.0mM
ＭｇＣｌ2、150mM ＮａＣｌを含有する第２配合物について、−７０℃で貯蔵さ
れる対照に対する、少なくとも8.5ヶ月間のアデノウイルスベクター調製品を安
定化する能力を試験した。この１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.4、５％ＨＳＡ、
５％蔗糖、2.0mM ＭｇＣｌ2、150mM ＮａＣｌ配合物も非常に安定であり、＋４
℃で少なくとも8.5ヶ月間ウイルス粒子の統合性及び感染力(力価)を保存し、か
つ＋２０℃で少なくとも8.5ヶ月間ウイルス粒子の統合性を保存することがわか
った。従って、アデノウイルスベクターを保存するための配合物についての重要
な変量は、ＨＳＡ及びｐＨであり；蔗糖も安定性を高めることがわかった。[0017] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention, or optimally enhance recombinant viral vector titer, or refrigerator or at room temperature or stabilizes the vector, or using Formulation fulfill both viral vectors In particular, it provides a new type of solvent that enables the storage of adenovirus vectors. In the specific examples described below, various formulations were tested for their ability to stabilize adenovirus vector preparations for up to 8.5 months relative to controls stored at -70 ° C. 10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 5% HSA, 5% sucrose, 2.0 mM MgC
Formulations containing l 2 , 150 mM NaCl are very stable and at relatively high temperatures (4
It was found that at 6 ° C and 20 ° C) it could preserve or even increase the infectivity of the vector for up to 6 months. Further experiments demonstrated that the optimum pH for stability of the adenovirus vector was pH 8.0 and above. In addition, HSA in solution
Was found to increase the virus titer (as measured by plaque analysis). Furthermore, 10 mM Tris-HCl, pH 8.4, 5% HSA, 5% sucrose, 2.0 mM
A second formulation containing MgCl 2 , 150 mM NaCl was tested for its ability to stabilize adenovirus vector preparations for at least 8.5 months relative to controls stored at -70 ° C. This 10 mM Tris-HCl, pH 8.4, 5% HSA,
5% sucrose, 2.0 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl formulation is also very stable, +4
It was found to preserve the integrity and infectivity (titer) of the viral particles for at least 8.5 months at ° C and the integrity of the viral particles for at least 8.5 months at + 20 ° C. Therefore, important variables for formulations for storing adenovirus vectors were HSA and pH; sucrose was also found to enhance stability.

【００１８】 このような配合物の利点は、その溶液を、貯蔵温度から取り出して、更に何ら
の操作も必要とせずに、即座に投与するために利用できるという事実によって生
じる。そして、それは、クリニックで直接貯蔵状態から取り出すことを可能にし
、それによって貯蔵と使用との間の時間を短くでき、無菌配合物形態に常に維持
できるので、外部からのコンタミネーションの危険を最少に減ずることができる
。この配合物は、いかなる毒性物質も無く、かつ生体に直接投与することができ
る。The advantage of such a formulation results from the fact that the solution can be taken from storage temperature and used for immediate administration without the need for any further manipulation. And it allows the clinic to remove directly from storage, thereby reducing the time between storage and use and always maintaining a sterile formulation to minimize the risk of external contamination. Can be reduced. This formulation is free of any toxic substances and can be administered directly to the body.

【００１９】 上述したように、本発明は、水性緩衝液中で、水の凝固点以上の温度でアデノ
ウイルスベクターを安定化するか、ＨＳＡが無い場合と比較してアデノウイルス
ベクターの力価を高めるか、又は両方を果たす配合物を提供する。好ましくは、
本発明は、組換え型アデノウイルスベクターと、水性緩衝液中で、アデノウイル
スベクターを水の凝固点以上の温度で安定化するか、又はＨＳＡが無い場合の力
価と比較してアデノウイルスベクターの力価を高めるか、又はその両者に有効な
濃度のＨＳＡとを含有する組成物を提供する。更に、上述したように、組成物の
ｐＨは、5.0以上かつ9.0以下であり、好ましくは、ｐＨは7.5より高い。特有の
実施形態では、ｐＨが8.2であり、かつＨＳＡの濃度が５％である。第２の特有
の実施形態では、ｐＨが8.4であり、かつＨＳＡの濃度が５％である。As described above, the present invention stabilizes an adenovirus vector in an aqueous buffer at a temperature above the freezing point of water, or increases the titer of an adenovirus vector as compared to the absence of HSA. Either or both are provided. Preferably,
The present invention provides a recombinant adenovirus vector and adenovirus vector stabilized in an aqueous buffer at a temperature above the freezing point of water, or compared to the titer in the absence of HSA. Compositions are provided that contain a concentration of HSA that increases the potency or both. Furthermore, as mentioned above, the pH of the composition is 5.0 or higher and 9.0 or lower, preferably the pH is higher than 7.5. In a specific embodiment, the pH is 8.2 and the concentration of HSA is 5%. In a second particular embodiment, the pH is 8.4 and the concentration of HSA is 5%.

【００２０】 本発明の種々の観点は、ウイルス粒子及びウイルスベクターを保存するための
適切な溶媒及び配合物に関する以下のセクションで更に詳細に述べられる。この
種々のセクション内の編成は、本発明の理解を容易にすることを意図したもので
あり、いかなる場合にもそれらの限定を意図するものではない。Various aspects of the invention are described in further detail in the following sections relating to suitable solvents and formulations for storing viral particles and viral vectors. The organization within this various sections is intended to facilitate an understanding of the present invention and is not intended to be a limitation thereof in any way.

【００２１】定義 以下に定義する用語を本件明細書において使用するが、これは、本発明の範囲
及びプラクティスを理解する助けとなるであろう。 特定の態様において、用語「約」又は「およそ」は、所定の値又は範囲の２０
％以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内を意味する。 用語「対応する」は、本件明細書において、類似又は相同配列を意味するため
に使用し、類似性及び相同性が測定される分子との正確な位置は同一であっても
異なっていてもよい。核酸又はアミノ酸配列の整列はスペースを含んでいてもよ
い。従って、用語「対応する」は、配列の類似性を意味し、アミノ酸残基又はヌ
クレオチド塩基の番号付けを意味する訳ではない。Definitions The terms defined below are used herein to aid in understanding the scope and practice of the present invention. In certain embodiments, the term “about” or “approximately” includes 20 of a given value or range.
%, Preferably within 10%, and more preferably within 5%. The term "corresponding" is used herein to mean a similar or homologous sequence, the exact position of which the similarity and homology is measured with the molecule may be the same or different. . The alignment of nucleic acid or amino acid sequences may include spaces. Thus, the term "corresponding" refers to sequence similarity and not to amino acid residue or nucleotide base numbering.

【００２２】 「配合物」は、ウイルス粒子及びウイルスベクターの保存用水性又は溶液媒体
を意味し、それは、組織に直接注入可能である。それは、より具体的には、ベク
ターの力価を最適に強化し又は冷蔵庫で又は室温で又はその両方でベクターを安
定化する組換えアデノウイルスベクターについての配合物に関連する。それは、
また、組換えアデノウイルスベクターを含む組成物、及び水の凝固点より高い温
度でアデノウイルスベクターを安定化するのに有効な又はＨＳＡのない場合の力
価と比較してアデノウイルスベクターの力価を強化するのに有効な又はその両方
に有効な水性バッファー中におけるＨＳＡ濃度に関連する。水性バッファーは、
塩又は糖又はその両方をほぼ等張濃度で含むであろう。 「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを意味し
、 ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸を含む。“Formulation” means an aqueous or solution medium for preservation of viral particles and viral vectors, which can be directly injected into the tissue. It more particularly relates to formulations for recombinant adenovirus vectors which optimally enhance the titer of the vector or stabilize the vector in the refrigerator or at room temperature or both. that is,
Also, the composition containing the recombinant adenovirus vector and the titer of the adenovirus vector compared to the titer effective in stabilizing the adenovirus vector at temperatures above the freezing point of water or in the absence of HSA. It is related to the concentration of HSA in the aqueous buffer that is effective in potentiating or both. The aqueous buffer is
It will include salt or sugar or both in approximately isotonic concentrations. “Gene” refers to an assembly of nucleotides that encode a polypeptide and includes cDNA and genomic DNA nucleic acids.

【００２３】 「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」は、６６ｋＤの分子量を有する、５８
５個のアミノ酸の非グリコシル化モノマータンパクを意味する。その球状構造は
、１７個のジスルフィド結合により維持され、それは、一連の９つのダブルルー
プを生じる(Brown, J. R., 1977)。「アルブミン構造の機能及び使用」Rosenoer
, V. M.ら(eds.), Pergamon Press, Oxford, pp. 27-51)。ＨＳＡをコードする
遺伝子は、非常に多型であることが知られており、３０より多くの明らかに異な
る遺伝子変異体が変動条件下での電気泳動分析により確認されている(Weitkamp,
L. R.ら, 1973. Ann. Hum. Genet., 37:219-226)。ＨＳＡ遺伝子は、１５個の
エクソン及び１４個のイントロンを含み、それは、予想される「キャッピング」
部位からポリ（Ａ）の付加の第１部位までに１６９６１個のヌクレオチドを含む
。“Human serum albumin” or “HSA” has a molecular weight of 66 kD, 58
By non-glycosylated monomeric protein of 5 amino acids. Its globular structure is maintained by 17 disulfide bonds, which give rise to a series of 9 double loops (Brown, JR, 1977). "Functions and uses of albumin structure" Rosenoer
, VM et al. (Eds.), Pergamon Press, Oxford, pp. 27-51). The gene encoding HSA is known to be highly polymorphic and more than 30 distinctly different gene variants have been identified by electrophoretic analysis under varying conditions (Weitkamp,
LR et al., 1973. Ann. Hum. Genet., 37: 219-226). The HSA gene contains 15 exons and 14 introns, which is the expected "capping".
It contains 16961 nucleotides from the site to the first site of addition of poly (A).

【００２４】 用語「製薬的に許容可能な」は、特定の濃度での分子の存在、及び生理学的に
許容可能であり、典型的には、ヒト又はヒト以外の動物に投与した場合に異常亢
進、発熱、めまい等のアレルギー性又は類似の有害反応を生じない組成物を意味
する。好ましくは、本件明細書において使用する用語“製薬的に許容可能な”は
、合衆国又は州政府の規制局により承認され、又はヒト又はヒト以外の動物にお
ける使用について米国薬局方又は他の一般的に認められている薬局方において挙
げられていることを意味する。 「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的処置、即ち、遺伝子工学的処置を受け
たＤＮＡ分子である。 「被験体」は、本発明の組成物中に配合されたベクターを受け入れ可能なヒト
又はヒト以外の動物である。The term “pharmaceutically acceptable” refers to the presence of a molecule at a particular concentration, and physiologically acceptable, typically hyperabsorption when administered to a human or non-human animal. , A composition that does not cause allergic or similar adverse reactions such as fever, dizziness and the like. Preferably, the term "pharmaceutically acceptable" as used herein is approved by the U.S. or state government regulatory agency, or for use in humans or non-human animals in the United States Pharmacopeia or other generally Means what is listed in the recognized pharmacopoeias. A "recombinant DNA molecule" is a DNA molecule that has undergone a molecular biological treatment, ie, a genetic engineering treatment. A "subject" is a human or non-human animal capable of receiving the vector formulated in the composition of the present invention.

【００２５】 「ベクター」は、宿主細胞へ核酸を移行させるための手段を意味する。ベクタ
ーは、結合されたセグメントの複製が生じるように他のＤＮＡセグメントが結合
していてもよいレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、インビボでＤＮ
Ａ複製の自律(autonomous)単位として機能する、即ち、自己の制御下で複製可能
である遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、クロモソーム、ウ
イルス等）である。本件明細書において使用する用語「ベクター」は、具体的に
は、インビトロで、エキソビボで又はインビボで細胞内に核酸を導入するウイル
ス性手段である。ウイルス性手段は、以下により詳細に記載するような、レトロ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、水痘、バキュロウイルス、ワクシニア、ヘルペ
ス、シンプレックス、ＥＢ及びアデノウイルスベクターを含む。核酸は、対象の
遺伝子のコード領域を含む。発現ベクターにおいて、コード領域は、発現制御配
列、例えばプロモーターと作業可能に関連している。ベクターは、また、１以上
の制御領域、及び／又は核酸の移行結果（組織への移行、発現期間等）を選択、
測定及びモニターするのに有用な選択可能なマーカーを含んでいてもよい。“Vector” means a means for transferring a nucleic acid into a host cell. The vector may be a replicon to which other DNA segments may be attached so that replication of the attached segment occurs. “Replicon” is DN in vivo
A genetic element (eg, plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus, etc.) that functions as an autonomous unit of A replication, that is, is capable of replication under its own control. The term "vector" as used herein is specifically a viral means for introducing nucleic acid into cells in vitro, ex vivo or in vivo. Viral means include retrovirus, adeno-associated virus, varicella, baculovirus, vaccinia, herpes, simplex, EB and adenovirus vectors, as described in more detail below. The nucleic acid comprises the coding region of the gene of interest. In an expression vector, the coding region is operably associated with expression control sequences, such as a promoter. The vector also selects one or more control regions and / or nucleic acid transfer results (transfer to tissues, expression period, etc.),
It may include a selectable marker useful for measuring and monitoring.

【００２６】 ヒト血清アルブミン 本発明の構成において使用されるHSAは、天然起源(精製HSA)のもの、または組
換えによるもの(rHSA)何れであってもよい。本発明は、主としてヒト血清アルブミ
ンに関連して説明されるが、後に、他の種由来の血清アルブミンも同様に有効で
あることが分かってきた。従って、この用語「HSA」とは、任意の血清アルブミン、例
えばウシ血清アルブミン(BSA)及びマウス血清アルブミン(MSA)をも包含するもの
と考えるべきである。当然、遺伝子療法用の、インビボ処方物を分配するためには
、オートロガス血清アルブミンを使用することが好ましい。かくして、ヒトの遺伝
子療法にとっては、ヒト血清アルブミンが望ましく、かつ好ましい。 組換えまたは天然起源のHSAが、有利に使用でき、これは幾つかの性能基準(例
えば、均質性、純度、安定性)を満たす。従って、薬局方は該血漿アルブミン溶液に関
する幾つかのパラメータ、即ちpH、タンパク含量、ポリマー及び凝集物含量、アルカ
リンホスファターゼ含量及びあるタンパクの組成を設定している。薬局方は、更に
ある吸光度、無菌性のテスト、発熱物質のテスト、及び毒性のテストについての
許容度に関しても制約が課せられている(これについては、"Albumini Humai Solu
tio", European Pharmacopoeia (1984), 255を参照のこと)。これら基準を満たす
アルブミンの使用は、本質的ではないが、特に好ましい。Human Serum Albumin The HSA used in the composition of the invention may be of natural origin (purified HSA) or recombinant (rHSA). Although the present invention is described primarily in the context of human serum albumin, it has later been found that serum albumins from other species are equally effective. Therefore, the term "HSA" should be considered to also include any serum albumin, such as bovine serum albumin (BSA) and mouse serum albumin (MSA). Of course, it is preferred to use autologous serum albumin for dispensing in vivo formulations for gene therapy. Thus, human serum albumin is desirable and preferred for human gene therapy. Recombinant or naturally occurring HSA can advantageously be used, which fulfills several performance criteria (eg homogeneity, purity, stability). Therefore, the Pharmacopoeia sets several parameters for the plasma albumin solution: pH, protein content, polymer and aggregate content, alkaline phosphatase content and the composition of certain proteins. The Pharmacopoeia is also constrained in terms of tolerance for certain absorbance, sterility testing, pyrogen testing, and toxicity testing (see "Albumini Humai Solu
tio ", European Pharmacopoeia (1984), 255). The use of albumin meeting these criteria is not essential, but is particularly preferred.

【００２７】 有利には、本発明の組成物は、精製ヒト血漿アルブミンまたは組換えヒトアルブ
ミン、好ましくは真核宿主内で生成されたものを含む。また、用語「HSA」は、本発
明の目的にとっては、このタンパクの多型性により生じる、ヒトアルブミンの、任
意の天然の変異体を含む。また、HSA等価物、即ちHSAの上記諸特性を保存する任意
のHSA誘導体を使用することもできる。これら誘導体は、特にHSAのアミノ(N-)末端
フラグメントであり得る。天然HSAの精製： 天然HSAは、一般的にヒト起源の生物学的物質から精製すること
により製造される。特に、これは血液提供者から得た血漿を分画するための、従来
の方法によって (Cohn等, 1946, J. Am. Chem. Soc., 68:459)、あるいはJ. Liau
traud等によって記載された技術(1973、第13回国際IABS会議(13th International
IABS Conference)、ブダペスト、「タンパクの精製、生物学的基準の進展(Purifica
tion of Proteins. Development of biological standard)」, Karger(編), Bale
, 27:107)に従って、該ヒト血漿からの抽出により得られる。好ましくは、本発明
の構成において使用するこの精製アルブミンは、血漿アルブミンである。最も具体
的には、市販の血漿アルブミンを使用することができる。Advantageously, the composition of the invention comprises purified human plasma albumin or recombinant human albumin, preferably produced in a eukaryotic host. The term "HSA" also includes, for the purposes of the present invention, any naturally occurring variant of human albumin caused by a polymorphism in this protein. It is also possible to use HSA equivalents, ie any HSA derivative which preserves the above properties of HSA. These derivatives may especially be the amino (N-) terminal fragment of HSA. Purification of Natural HSA : Natural HSA is generally produced by purification from biological material of human origin. In particular, this is by conventional methods for fractionating plasma obtained from blood donors (Cohn et al., 1946, J. Am. Chem. Soc., 68: 459), or J. Liau.
techniques (1973 described by traud like, 13th International IABS Conference (13 th International
IABS Conference), Budapest, “Protein Purification, Advances in Biological Standards (Purifica
Development of biological standard), Karger (ed), Bale
27: 107), and is obtained by extraction from the human plasma. Preferably, this purified albumin used in the context of the present invention is plasma albumin. Most specifically, commercially available plasma albumin can be used.

【００２８】組換えHSAの製造： 遺伝子組み替え技術及び新たな抽出並びに精製技術の開発は、
低コストで、より高い純度を持ち、より高い安定性を持つ改良された製品を、汚染
の危険性なしに製造することを可能とした(例えば、B型肝炎、C型肝炎HIV、または
感染性プリオン)。このHSA市場の重大性が与えられたので、組換え経路でこのタン
パクを製造する可能性が、広く検討されている。従って、多くの発現系が、この組換
えHSAの調製のために研究されている。HSAの醗酵： より具体的には、該バクテリア宿主に関連して、遺伝子組み替えは、宿
主生物としてのバクテリア、例えばE.コリ内で達成できる。欧州特許EP236,210、EP
200,590またはEP198,745は、種々の発現ベクター、種々の転写プロモータ及び種
々の分泌シグナルを利用して、E.コリ内でHSAを製造する方法を記載している。引
き続き、バチルスズブチリス(Bacillus subtilis)内のHSAの分泌をも実施した(Sa
unders等, 1987, J. Bacteriol., 169:2917)。真核宿主に関連して、HSAの製法は、
宿主生物として酵母を使用して開発された。かくして、サッカロミセスセレビシ
アエ(Saccharomyces cerevisiae)内で、キレーチン(chelatin)プロモータの制御
下での、HSAの製造の可能性を立証することが可能となった(Etcheverry等, 1986,
Bio/Technology, 4:726)。このHSAの製造は、後醗酵法を利用して、ビールを製造
する際に、ビール醸造所酵母についても記載されている(EP201,239)。極最近、特許
出願EP361,991は、宿主生物として、プラスミドpKD1由来のベクターで形質転換し
た、酵母クリベロマイセス(Kluyveromyces)を利用した、特に効率的な系を記載し
ている。該培地中に分泌される特に高濃度のHSAは、この系について得ることがで
きた。最後に、この組換えHSAの製造は、Pichia pastoris (EP344 450)に記載され
ている。更に、HSAの精製も記載されている(EP319,067)。 Production of recombinant HSA: Development of genetic recombination technology and new extraction and purification technology
It has made it possible to produce improved products with lower cost, higher purity and higher stability without risk of contamination (e.g. hepatitis B, hepatitis C HIV or infectious Prion). Given the importance of this HSA market, the possibility of producing this protein by recombinant routes has been widely investigated. Therefore, many expression systems have been studied for the preparation of this recombinant HSA. Fermentation of HSA: More specifically, in relation to the bacterial host, genetic recombination can be accomplished in bacteria as the host organism, eg E. coli. European Patents EP236,210, EP
200,590 or EP 198,745 describe methods for producing HSA in E. coli utilizing different expression vectors, different transcriptional promoters and different secretion signals. Subsequently, HSA was secreted in Bacillus subtilis (Sa
unders et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 2917). In connection with eukaryotic hosts, the HSA manufacturing process is
Developed using yeast as the host organism. Thus, it was possible to demonstrate the feasibility of producing HSA in Saccharomyces cerevisiae under the control of the chelatin promoter (Etcheverry et al., 1986,
Bio / Technology, 4: 726). The production of this HSA is also described for brewery yeast when producing beer using the post-fermentation method (EP201,239). Most recently, the patent application EP 361,991 describes a particularly efficient system which utilizes yeast Kluyveromyces transformed with a vector derived from the plasmid pKD1 as host organism. A particularly high concentration of HSA secreted into the medium could be obtained for this system. Finally, the production of this recombinant HSA is described in Pichia pastoris (EP344 450). Furthermore, purification of HSA has been described (EP319,067).

【００２９】 種々の特許及び科学的な刊行物が、トランスジェニック動物、最適には反芻性
の哺乳動物の乳腺中で、異種遺伝子、特にHSAを発現する方法を記載している。こ
のような技術は、該哺乳動物ミルク内で異種タンパクを生成するのに有効である。
トランスジェニック動物内でヒト血清アルブミンを製造する例は、1998年7月14日
付けで、Karatzas等に付与された米国特許第5,780,009号に記載されており、この
特許は、該反芻動物乳腺への直接的な遺伝子の転写を意図している。1989年10月1
0日付けで、Maeda等に付与された米国特許第4,873,316号は、トランスジェニック
哺乳動物のミルクから、外因性組換えタンパクの単離を意図しており、該哺乳動物
のカゼインプロモータを含む発現系を提供し、これはトランスジェニックに哺乳
動物に組み込んだ際に、該哺乳動物種の雌が、そのミルクと共にまたはその中に所
定の組換えタンパクを生成することを可能とする。HSAのトランスジェニック発現
用の好ましい構築物は、1997年7月15日付けでHurwitz等に付与された米国特許第5
,648,243号に記載されており、これはヒト血清アルブミン発現構築物を意図して
おり、その開示全体を本発明の参考とする。この特許に記載されているように、HSA
の効率的な発現は、該ヒト血清アルブミン配列が、該HSAタンパクをコードする天
然産の遺伝子におけるイントロンの全てではないが、少なくとも一つを含む場合
に、好ましくは該DNA構築物が、トランスジェニック動物のミルク中でのHSAの発現
及び分泌に導く、5'制御配列を含む場合に、達成される。これらの特許は、トランス
ジェニック発現に関する、特にHSA発現に関する科学的並びに特許文献由来の付随
的な参考文献にも言及している。これら各々の開示事項全体を本発明の参考とす
る。Various patents and scientific publications describe methods for expressing heterologous genes, especially HSA, in the mammary gland of transgenic animals, optimally ruminant mammals. Such techniques are effective in producing heterologous proteins in the mammalian milk.
An example of producing human serum albumin in a transgenic animal is described in U.S. Pat.No. 5,780,009 issued to Karatzas et al. On July 14, 1998, which patent is directed to the ruminant mammary gland. Intended for direct gene transcription. October 1989 1
U.S. Pat. Which, when transgenically incorporated into a mammal, allows a female of said mammalian species to produce a given recombinant protein with or in its milk. A preferred construct for transgenic expression of HSA is described in US Pat.
, 648,243, which is intended for human serum albumin expression constructs, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. As stated in this patent, HSA
Efficient expression of the human serum albumin sequence is not all of the introns in the naturally occurring gene encoding the HSA protein, but preferably when the DNA construct is a transgenic animal. Is achieved when it contains a 5'regulatory sequence which leads to the expression and secretion of HSA in the milk of. These patents also make reference to scientific and patent-derived ancillary references to transgenic expression, and in particular to HSA expression. The entire disclosure of each of these is referred to as the present invention.

【００３０】 本発明の特定の態様においては、本発明の組換えHSAは、リコンブミン（Recombu
minTM）(センテオン（Centeon）)である。リコンブミンは、酵母由来の組換えヒト
アルブミンであり、これは構造的には血漿由来のヒトアルブミンと同一である。リ
コンブミンは、ヒト血清アルブミンをコードするcDNAと結合したハイブリッド分
泌リーダー配列を使用して製造される。このcDNA配列は、EP0,073,646に記載され
ており、また該リーダー配列は、米国特許第5,302,697号に記載されている。このリ
ーダー配列を、米国特許第5,637,504号に記載されている崩壊ベクター内の発現カ
セットにクローニングする。リコンブミンを製造するのに使用した、宿主酵母細胞
は、種々の変異体、例えば酵母アスパルチルプロテアーゼ遺伝子の遺伝子崩壊(WO
95/23857)及び熱衝撃タンパク150遺伝子の遺伝子崩壊(US 5,783,423)等を含む。
HSA処方 本発明の処方物は、種々の方法で調製できる。種々の成分を混合し、次にこの混
合物に、ウイルス粒子またはベクターを添加する。これら成分の1種または数種を
該ウイルス粒子またはベクターと混合し、次いで残りの成分に添加することも可
能である。好ましくは、これら成分全てを含む処方物を調製し、これに該ウイルス
粒子またはベクターを添加する。本発明の処方物の調製及び該ウイルス粒子また
はベクターの添加は、無菌条件下で行われる。In a particular embodiment of the present invention, the recombinant HSA of the present invention comprises recombumin (Recombumin).
min TM ) (Centeon). Recombumin is yeast-derived recombinant human albumin, which is structurally identical to plasma-derived human albumin. Recombumin is produced using a hybrid secretory leader sequence linked to a cDNA encoding human serum albumin. This cDNA sequence is described in EP 0,073,646 and the leader sequence is described in US Pat. No. 5,302,697. This leader sequence is cloned into the expression cassette in the disruption vector described in US Pat. No. 5,637,504. The host yeast cells used to produce the recombumin have various mutants, such as the gene disruption of the yeast aspartyl protease gene (WO
95/23857) and the gene disruption of 150 heat shock protein genes (US 5,783,423).
HSA Formulation The formulations of the present invention can be prepared in a variety of ways. The various components are mixed and then to this mixture viral particles or vectors are added. It is also possible to mix one or several of these components with the viral particle or vector and then add to the remaining components. Preferably, a formulation containing all of these components is prepared, to which the viral particle or vector is added. Preparation of the formulation of the present invention and addition of the virus particle or vector are carried out under aseptic conditions.

【００３１】 本発明による媒体成分の各割合は、使用すべき該ウイルス粒子またはベクター
に応じて、当業者が調節することができる。実施例に示すように、ある範囲の濃度
が好ましいが、これら割合は変更することができる。 本発明の処方物は、アデノウイルスの保存に関連して、発見された。しかし、この
処方物は、他のウイルスを保存するためにも極めて有用であり得る。 ウイルス粒子及びベクター より一層本発明に関連深い該ウイルス粒子及びベクターは、遺伝子療法におい
て使用できるものである。多数のウイルスが、一方では変性されたゲノムを有し、
結果としてその増殖能力を失い、一方でその感染性を維持しており、また他方では
、治療対象の核酸配列にそのゲノムを挿入して、該感染細胞内で発現されることに
なる。これらウイルスとしては、より具体的には、アデノウイルス、アデノ関連ウイ
ルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス等である。 ウイルス粒子またはベクターを比較的高温で保存するための本発明の処方物は
、アデノウイルスベクターを保存するために特別に開発されたものである。しかし
、本発明では、特に該好ましいpH範囲を持つ該HSA処方物は、他のベクターの感染
性を安定化し、または増強する、もしくは該感染性を安定化し、かつ増強すること
をも可能とする。The respective proportions of the medium component according to the invention can be adjusted by the person skilled in the art depending on the virus particle or vector to be used. As shown in the examples, a range of concentrations is preferred, but these ratios can vary. The formulations of the present invention have been discovered in the context of adenovirus storage. However, this formulation may also be extremely useful for preserving other viruses. Viral Particles and Vectors The viral particles and vectors more relevant to the present invention can be used in gene therapy. Many viruses have a degenerated genome on the one hand,
As a result, it loses its proliferative capacity, while maintaining its infectivity, and, on the other hand, will have its genome inserted into the nucleic acid sequence to be treated and expressed in the infected cell. More specifically, these viruses include adenovirus, adeno-associated virus (AAV), retrovirus, herpes virus and the like. The formulations of the present invention for storing virus particles or vectors at relatively high temperatures are specifically developed for storing adenovirus vectors. However, in the present invention, especially the HSA formulation having the preferred pH range also makes it possible to stabilize or enhance the infectivity of other vectors or to stabilize and enhance the infectivity. .

【００３２】アデノウイルスベクター： 好ましい一態様に於いて、該ベクターはアデノウイル
スベクターである。アデノウイルスは、真核DNAウイルスであって、これを変性して
種種の型の細胞に対して、本発明の核酸を効率的に放出することができる。これら
の血清型の中で、本発明の範囲において有利なものは、タイプ２及びタイプ５ヒト
アデノウイルス(Ad2またはAd5)または動物起源のアデノウイルス(WO94/26914を
参照のこと)であり、これらを使用する。本発明において使用可能な動物起源のこ
れらアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス(例えば、Mav1、Beard等, Virology, 199
0, 75:81)、ヒツジ、ブタ、鳥類、及びサル(例えば、SAV)起源のアデノウイルスを包
含する。好ましくは、これら動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、よ
り好ましくはCAV2アデノウイルス(例えば、マンハッタン(Manhattan)またはA26/6
1株(ATCC VR-800))である。 好ましくは、本発明の複製欠陥アデノウイルスベクターは、ITRs、包膜配列及び
対象とする核酸を含む。より一層好ましくは、該アデノウイルスベクターの少なく
とも該E1領域は、非-機能性である。該E1領域における欠損は、好ましくはAD5アデ
ノウイルスの該配列(PvuII-BgIIIフラグメント)の、ヌクレオチド455〜3329領域
または382〜3446(HinfII- Sau3Aフラグメント)にまで及ぶ。その他の領域、特にE
3領域(WO95/02697)、E2領域(WO94/28938)、E4領域(WO94/28152,WO94/12649及びWO9
5/02697)または後期遺伝子L1-L5の何れかを変性することができる。 Adenovirus vector: In a preferred embodiment, the vector is an adenovirus vector. Adenovirus is a eukaryotic DNA virus, which can be denatured to efficiently release the nucleic acid of the present invention to various types of cells. Among these serotypes, advantageous within the scope of the invention are type 2 and type 5 human adenoviruses (Ad2 or Ad5) or adenoviruses of animal origin (see WO94 / 26914), To use. These adenoviruses of animal origin that can be used in the present invention include dogs, cows, mice (e.g., Mav1, Beard et al., Virology, 199).
0, 75:81), sheep, pigs, birds, and adenoviruses of monkey (eg, SAV) origin. Preferably, these adenoviruses of animal origin are canine adenoviruses, more preferably CAV2 adenoviruses (e.g. Manhattan or A26 / 6).
1 share (ATCC VR-800)). Preferably, the replication defective adenovirus vector of the present invention comprises ITRs, an envelope sequence and a nucleic acid of interest. Even more preferably, at least said E1 region of said adenovirus vector is non-functional. The deletion in the E1 region preferably extends to the nucleotides 455-3329 region or 382-3446 (HinfII-Sau3A fragment) of the sequence of AD5 adenovirus (PvuII-BgIII fragment). Other areas, especially E
3 regions (WO95 / 02697), E2 region (WO94 / 28938), E4 region (WO94 / 28152, WO94 / 12649 and WO9
5/02697) or the late genes L1-L5 can be modified.

【００３３】 好ましい一態様に於いては、このアデノウイルスベクターは、該E1領域(Ad1.0)
に欠損を持つ。E1-欠損アデノウイルスの例は、EP185,573に記載されており、その
内容を本発明の参考とする。もう一つの好ましい態様に於いては、該アデノウイル
スベクターは、該E1及びE4領域に欠損を持つ(Ad3.0)。E1/E4-欠損アデノウイルス
の例は、WO95/02697及びWO96/22378に記載されている。これらの内容を本発明の参
考とする。更に別の好ましい態様では、このアデノウイルスベクターは、該E1領域
に欠損を有し、該領域中には該E4領域及び該核酸配列が挿入されている(例えば、F
R94/13355を参照のこと、その内容を本発明の参考とする)。 本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者には周知の任意の技術
によって調製できる(Levrero等、Gene, 1991, 101:195; EP 185 573; Graham, E
MBO J., 1984, 3:2917)。特に、これらはアデノウイルスと、特に対象とするDNA配
列を担持するプラスミドとの間の、相同組換えにより調製できる。この相同組換え
は、適当な細胞系への、該アデノウイルス及びプラスミドの、同時トランスフェ
クションによって行われる。使用する該細胞系は、好ましくは(i) 該エレメントに
より形質転換可能なものであり、かつ(ii) 該複製欠損アデノウイルスのゲノム領
域の一部を補足することができる、好ましくは一体化された形状にある該配列を
含み、組換えの可能性を回避するものであるべきである。使用可能な細胞系の例は
、そのゲノムに組み込まれたAd5アデノウイルス(12％)の該ゲノムの左側部分を含
む、ヒト胚腎臓細胞系293(Graham等, J. Gen. Viol., 1977, 36:59)、及びWO94/26
914及びWO95/02697に記載されたような、該E1及びE4機能を補足することのできる
、細胞系である。組換えアデノウイルスは、当業者には周知の標準的な生物学的技
術を利用して、回収し、かつ精製することができる。In a preferred embodiment, the adenovirus vector comprises the E1 region (Ad1.0)
Have a defect. Examples of E1-deficient adenovirus are described in EP 185,573, the contents of which are incorporated herein by reference. In another preferred embodiment, the adenovirus vector has a deletion in the E1 and E4 regions (Ad3.0). Examples of E1 / E4-deficient adenoviruses are described in WO95 / 02697 and WO96 / 22378. These contents are used as a reference for the present invention. In yet another preferred embodiment, the adenovirus vector has a deletion in the E1 region, in which the E4 region and the nucleic acid sequence are inserted (for example, F
See R94 / 13355, the content of which is a reference for the present invention). The replication-defective recombinant adenovirus according to the invention can be prepared by any technique known to the person skilled in the art (Levrero et al., Gene, 1991, 101: 195; EP 185 573; Graham, E.
MBO J., 1984, 3: 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between adenovirus and a plasmid carrying the DNA sequence of interest. This homologous recombination is carried out by co-transfection of the adenovirus and the plasmid into a suitable cell line. The cell line used is preferably (i) transformable by the element and (ii) capable of complementing, preferably integrated, part of the genomic region of the replication defective adenovirus. It should contain the sequence in a different shape and avoid the possibility of recombination. An example of a cell line that may be used is the human embryonic kidney cell line 293 (Graham et al., J. Gen. Viol., 1977, which contains the left part of the genome of Ad5 adenovirus (12%) integrated into its genome. 36:59), and WO94 / 26
A cell line capable of complementing the E1 and E4 functions as described in 914 and WO95 / 02697. Recombinant adenovirus can be recovered and purified using standard biological techniques well known to those of skill in the art.

【００３４】 その他のベクター他のウイルスベクター： これらアデノ関連ウイルス(AAV)は、比較的小さなサイ
ズのDNAウイルスであり、これらは安定かつサイト特異的な様式で、感染すべき細
胞内のゲノムに組み込むことができる。これらウイルスは、細胞成長、形態、分化
に対して何の作用も誘発せずに、広範な細胞を感染することができ、またこれら
ウイルスは、ヒトの病理に関与しているとは考えられない。このAAVゲノムは、クロ
ーニングされ、配列決定され、かつ特徴付けされている。これは、約4700個の塩基を
包含し、また各末端に約145塩基からなる反転された末端反復体(ITR)領域を含み、
これはこのウイルス複写の起点として機能する。このゲノムの残りは、2つの基本
的な領域に分割され、これらは包膜機能を持ち、該ウイルス遺伝子のウイルス複製
及び発現に関与するrep遺伝子を含む該ゲノムの左側部分、及び該ウイルスのカプ
シドタンパクをコードするcap遺伝子を含む、該ゲノムの右側部分である。Other Vectors Other viral vectors: These adeno-associated viruses (AAV) are DNA viruses of relatively small size that integrate in a stable and site-specific manner into the genome of the cell to be infected. be able to. These viruses can infect a wide range of cells without inducing any effects on cell growth, morphology, or differentiation, and these viruses are not considered to be involved in human pathology. . This AAV genome has been cloned, sequenced and characterized. It contains about 4700 bases and contains an inverted terminal repeat (ITR) region of about 145 bases at each end,
This serves as the starting point for this virus copy. The rest of the genome is divided into two basic regions, which have envelope functions and contain the rep gene involved in viral replication and expression of the viral gene, the left part of the genome, and the capsid of the virus. The right part of the genome, which contains the cap gene encoding the protein.

【００３５】 インビボ及びインビトロで遺伝子を伝達するための、このAAV由来のベクターの
使用は、例えばWO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368; US 5,139,941; EP 488
528に記載されている。これら刊行物は、種々のAAV-由来の構築物及びインビトロ(
培養細胞内)またはインビボ(生物に直接)で対象とする該遺伝子を伝達するため
のこれら構築物の使用について記載しており、そこではrep及び/またはcap遺伝子
が欠損し、及び対象とする遺伝子によって置換されている。本発明の複製欠損組換
えAAVsは、2つのAAV反転末端反復体(ITR)領域に隣接する、対象とする核酸配列を
含むプラスミド、及び該AAV包膜遺伝子(rep及びcap遺伝子)を担持するプラスミド
を、ヒトヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)で感染された細胞系に、同時
にトランスフェクションすることにより調製できる。生成される該AAV組換え体は
、次いで標準的な方法で精製される。The use of this AAV-derived vector for gene transfer in vivo and in vitro is described, for example, in WO91 / 18088; WO93 / 09239; US 4,797,368; US 5,139,941; EP 488.
528. These publications include various AAV-derived constructs and in vitro (
It describes the use of these constructs to transfer the gene of interest (in culture cells) or in vivo (directly to the organism), where the rep and / or cap genes are defective and depending on the gene of interest. Has been replaced. The replication-defective recombinant AAVs of the present invention include a plasmid containing a nucleic acid sequence of interest adjacent to two AAV inverted terminal repeat (ITR) regions, and a plasmid carrying the AAV envelope gene (rep and cap genes). Can be prepared by co-transfecting a cell line infected with a human helper virus (eg, adenovirus). The AAV recombinant produced is then purified by standard methods.

【００３６】 もう一つの態様に於いては、該遺伝子は、例えばAnderson等の米国特許第5,399,
346号；Mann等, Cell, 1983, 33:153; Temin等, US 4,650,764; Temin等, US 4,
980,289; Markowitz等, J. Virol., 1988, 62:1120; Temin等, US 5,124,263; E
P 453242, EP 178220; Bernstein等, Genet. Eng., 1985, 7:235; McCormick, B
io Technology, 1985, 3:689; 1995年3月16日付けで公開され、Dougherty等に付
与された国際特許公開WO 95/07358; Kuo等, Blood, 1993, 82:845に記載されて
いるように、レトロウイルスベクター内に導入することができる。これらレトロウ
イルスは、個々の細胞を感染する組換えウイルスである。該レトロウイルスゲノム
は、2つのLTR、包膜配列及び3つのコード領域(gag、pol及びenv)を含む。組換えレト
ロウイルスベクターにおいて、該gag、pol及びenv遺伝子が、一般的に全体としてま
たは部分的に欠損を受け、また対象とする異種の核酸配列で置換される。これらベ
クターは、種々の型のレトロウイルス、例えばHIV、MoMuLV(マウスモロニーロイケ
ミアウイルスMSV(マウスモロニーザルコーマウイルス)、HaSV(ハーベイザルコー
マウイルス)、SNV(脾臓壊死ウイルス)、RSV(ラウスザルコーマウイルス)及びフレ
ンドウイルスから構築することができる。欠損レトロウイルスベクターは、WO95/0
2697に記載されている。[0036] In another embodiment, the gene is described in Anderson et al., US Pat. No. 5,399,
346; Mann et al., Cell, 1983, 33: 153; Temin et al., US 4,650,764; Temin et al., US 4,
980,289; Markowitz et al., J. Virol., 1988, 62: 1120; Temin et al., US 5,124,263; E.
P 453242, EP 178220; Bernstein et al., Genet. Eng., 1985, 7: 235; McCormick, B
io Technology, 1985, 3: 689; International Patent Publication WO 95/07358 issued to Mar. 16, 1995 and granted to Dougherty et al., as described in Kuo et al., Blood, 1993, 82: 845. In addition, it can be introduced into a retroviral vector. These retroviruses are recombinant viruses that infect individual cells. The retroviral genome contains two LTRs, an envelope sequence and three coding regions (gag, pol and env). In recombinant retroviral vectors, the gag, pol and env genes are generally wholly or partially defective and are replaced with a heterologous nucleic acid sequence of interest. These vectors include various types of retroviruses, such as HIV, MoMuLV (mouse Moloney leukemia virus MSV (mouse Moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (Rousse monkey). (Coma virus) and Friend virus.The defective retrovirus vector is WO95 / 0.
2697.

【００３７】調節領域： 本発明のベクター由来のポリペプチド発現は、任意の調節領域、即ち当
分野では公知のプロモータ/エンハンサーエレメントにより調節できるが、これ
ら調節エレメントは、発現のために選択された、宿主細胞、例えばターゲット腫瘍
内で機能性である必要がある。 これら調節領域は、該宿主細胞における機能的転写のためのプロモータ領域並
びに対象とする遺伝子の3'に位置する領域を含むことができ、これは転写終了及
びポリアデニル化サイトのシグナルを特定する。これら全てのエレメントは、発現
カセットを構成する。 本発明において使用可能なプロモータは、構成的プロモータ及び調節的(誘発性
)プロモータ両者を含む。このプロモータは、当然該核酸の発現に関与する。これは
異種の起源由来のものであってもよい。特に、これは真核またはウイルス遺伝子の
プロモータ配列であり得る。例えば、感染することが望まれる細胞のゲノム由来の
、プロモータ配列であり得る。同様に、使用する該アデノウイルスを含むウイルス
のゲノム由来のプロモータ配列であってもよい。この点に関連して、例えばEIA、ML
P、CMV及びRSV遺伝子等のプロモータを例示することができる。 Regulatory regions: Polypeptide expression from the vectors of the invention can be regulated by any regulatory region, ie promoter / enhancer elements known in the art, which regulatory elements have been selected for expression. It must be functional within the host cell, eg the target tumor. These regulatory regions can include promoter regions for functional transcription in the host cell as well as regions located 3'to the gene of interest, which specify signals for transcription termination and polyadenylation sites. All these elements make up the expression cassette. Promoters usable in the present invention include constitutive promoters and regulatory (inducible) promoters.
) Including both promoters. This promoter is naturally involved in the expression of the nucleic acid. It may be of different origin. In particular, this may be the promoter sequence for eukaryotic or viral genes. For example, it may be a promoter sequence derived from the genome of the cell desired to be infected. Similarly, it may be a promoter sequence derived from the genome of a virus including the adenovirus used. In this regard, for example EIA, ML
Examples thereof include promoters such as P, CMV and RSV genes.

【００３８】 更に、プロモーターは、活性化又は制御配列若しくは組織特異的又は優勢的発
現を許容する配列（エノラーゼ及びＧＦＡＰプロモーター等）の添加によって変
性することができる。更に、核酸がプロモーター配列を含まない場合には、それ
は、かかる配列の下流でウイルスゲノム中などに挿入されていてもよい。 本発明の実施に有用ないくつかのプロモーターは、偏在するプロモーター（例
えば、HPRT、ビメンチン(vimentin)、アクチン、チューブリン）、中間フィラメ
ントプロモーター(例えば、デスミン(desmin)、ニューロフィラメント、ケラチ
ン、GFAP)、治療的遺伝子プロモーター(例えば、MDR型、CFTR、因子VIII)、組織
特異的プロモーター(例えば、平滑筋細胞におけるクチンプロモーター)、***細
胞で優先的に活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター(例えば
、ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター)、テトラサイクリ
ン制御転写モデュレーター、サイトメガロウイルス最初期(immediate early)レ
トロウイルスLTR、メタロチオネイン(metallothionein)、SV-40、Ela及びMLPプ
ロモーターである。テトラサイクリン制御転写モデュレーター及びサイトメガロ
ウイルスプロモーターは、WO96/01313、米国特許第5,168,062号及び同5,385,839
号明細書に記載されており、これらの文献の内容をここに参考として導入する。Furthermore, the promoter may be modified by the addition of activating or regulatory sequences or sequences which allow tissue-specific or predominant expression (such as the enolase and GFAP promoters). Furthermore, if the nucleic acid does not contain a promoter sequence, it may be inserted downstream of such sequence, such as in the viral genome. Some promoters useful in the practice of the invention include ubiquitous promoters (eg HPRT, vimentin, actin, tubulin), intermediate filament promoters (eg desmin, neurofilament, keratin, GFAP). , Therapeutic gene promoters (e.g. MDR type, CFTR, factor VIII), tissue specific promoters (e.g. Kutin promoter in smooth muscle cells), promoters preferentially activated in dividing cells, promoters responsive to stimulation (e.g. Examples are steroid hormone receptors, retinoic acid receptors), tetracycline regulated transcriptional modulators, cytomegalovirus immediate early retrovirus LTRs, metallothionein, SV-40, Ela and MLP promoters. Tetracycline regulated transcription modulators and cytomegalovirus promoters are described in WO96 / 01313, US Pat. Nos. 5,168,062 and 5,385,839.
The contents of these documents are incorporated herein by reference.

【００３９】 従って、遺伝子発現をコントロールするのに使用することのできるプロモータ
ーには、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターや、SV-40早期プロモーター領
域(Benoist 及び Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウスサルコーマウ
イルスの3'長末端繰り返しに含まれるプロモーター(Yamamoto, et al., 1980, C
ell 22:787-797)、 ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター (Wagner et al., 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子
の制御配列 (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42)；原核発現ベクター、
例えば、b-ラクタマーゼプロモーター (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)、又はtac プロモーター (DeBoer, et
al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:21-25); "Useful proteins fro
m recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94も参照さ
れたい;酵母や他の菌類のプロモーター要素、例えば、Gal 4 プロモーター、 AD
C (アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、 PGK (ホスホグリセロールキナ
ーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター; 更には、動物の転
写制御領域（これは、組織特異性があり、トランスジェニック動物に利用されて
きたものである）: 膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼ（elastase）
I 遺伝子制御領域 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646;Accordingly, promoters that can be used to control gene expression include the cytomegalovirus (CMV) promoter and the SV-40 early promoter region (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310). , A promoter contained in the 3'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto, et al., 1980, C
ell 22: 787-797), herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), regulatory sequences of metallothionein gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); prokaryotic expression vector,
For example, the b-lactamase promoter (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), or tac promoter (DeBoer, et
al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25); "Useful proteins fro
See also "m recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; promoter elements of yeast and other fungi, such as the Gal 4 promoter, AD.
C (alcohol dehydrogenase) promoter, PGK (phosphoglycerol kinase) promoter, alkaline phosphatase promoter; and also animal transcriptional control regions, which are tissue-specific and have been used in transgenic animals: Elastase active in pancreatic acinar cells
I gene regulatory region (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646;

【００４０】 Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; M
acDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 膵臓ベータ細胞において活性である
インスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ細胞
において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域 (Grosschedl et al., 1984,
Cell 38:647-658; Adamcs et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et
al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣や、***、リンパ、マスト細
胞において活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域 (Leder et al., 1986,
Cell 45:485-495)、肝臓において活性であるアルフミン遺伝子制御領域 (Pinker
t et al., 1987, Genes 及び Devel. 1:268-276)、Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; M
acDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); insulin gene regulatory region active in pancreatic beta cells (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), immunoglobulin gene regulatory region active in lymphocytes (Grosschedl et al., 1984,
Cell 38: 647-658; Adamcs et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et
al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), a mouse mammary tumor virus regulatory region active in testis, breast, lymph, and mast cells (Leder et al., 1986,
Cell 45: 485-495), an alhumin gene regulatory region active in the liver (Pinker
t et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276),

【００４１】 肝臓で活性であるアルファフェトプロテイン（alpha-fetoprotein）遺伝子制御
領域 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al.
, 1987, Science 235:53-58)、肝臓で活性であるアルファ1-アンチトリプシン遺
伝子制御領域 （Kelsey et al., 1987. Genes 及び Devel. 1:161-171)、ミエロ
イド細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域 (Mogram et al., 1
985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94)、脳におけ
るオリゴデンドログリア細胞で活性であるミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域
(Readhead et al. , 1987, Cell 48:703-712)、骨格筋において活性であるミオ
シン軽鎖2遺伝子制御領域 (Sani, 1985, Nature 314:283-286)、視床下部で活性
である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域 (Mason et al., 1986, Science 23
4:1372-1378)が含まれるが、これらに限定されるものではない。Alpha-fetoprotein gene regulatory region active in liver (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al.
, 1987, Science 235: 53-58), the active region of alpha 1-antitrypsin gene in the liver (Kelsey et al., 1987. Genes and Devel. 1: 161-171), beta active in myeloid cells. Globin gene regulatory region (Mogram et al., 1
985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94), a myelin basic protein gene regulatory region active in oligodendroglial cells in the brain.
(Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712), myosin light chain 2 gene regulatory region active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-286), gonadal stimulation active in the hypothalamus Release hormone gene regulatory region (Mason et al., 1986, Science 23
4: 1372-1378), but is not limited to these.

【００４２】 治療効果のある遺伝子： ベクターによって発現される異種タンパク質の例とし
ては、p53のような腫瘍サプレッサータンパク質; 単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ(HSV-tK)のような自殺遺伝子; 酸性線維芽細胞増殖因子(FGF)のよう
な増殖因子; FGF又は血管内皮成長因子(VEGF)のような血管形成誘導因子; 神経
成長因子(NGF)、神経親和性因子-3(NT-3)、NT-4、グリア由来神経親和性因子(GD
NF)、及び繊毛神経親和性因子(CNTF)のような栄養因子等が挙げられるがこれら
に限定されない。第1実施態様においては、異種タンパク質はp53である。第2実
施態様においては、異種タンパク質はHSV-TKである。 勿論、本発明は、更に、組換えアデノウイルス配合物の調製方法であって、組
換えアデノウイルスと水の氷点より高い温度でアデノウイルスベクターを安定化
するのに有効なHSAの濃縮物又はHSAの存在しないときの力価に比べてアデノウイ
ルスベクターの力価を高めるのに有効なHSAの濃縮物、又はその双方の混合物を
緩衝水溶液中で調製する工程を含む、前記方法を提供する。実施態様においては
、温度は、4℃以上で37℃未満である。他の実施態様においては、温度は20℃以
上である。好ましくは、温度が4℃より高い場合、特に温度が20℃より高い場合
、HSAの濃度は5％であるか、混合物のpＨは8.0より高いか、又はその双方である
。Genes with therapeutic effect: Examples of heterologous proteins expressed by the vector are tumor suppressor proteins such as p53; suicide genes such as herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tK); acidic fibroblast proliferation. Growth factor such as factor (FGF); angiogenic factor such as FGF or vascular endothelial growth factor (VEGF); nerve growth factor (NGF), neurotrophic factor-3 (NT-3), NT-4, Glial-derived neurotrophic factor (GD
NF), and trophic factors such as ciliary nerve affinity factor (CNTF), but are not limited thereto. In a first embodiment, the heterologous protein is p53. In a second embodiment, the heterologous protein is HSV-TK. Of course, the present invention further provides a method of preparing a recombinant adenovirus formulation, wherein the concentrate or HSA of HSA effective to stabilize the adenovirus vector above the freezing point of the recombinant adenovirus and water. The method comprises the step of preparing a concentrate of HSA, or a mixture of both, effective in increasing the titer of an adenovirus vector relative to its titer in the absence of a. In an embodiment, the temperature is 4 ° C or higher and less than 37 ° C. In another embodiment, the temperature is above 20 ° C. Preferably, when the temperature is above 4 ° C, especially above 20 ° C, the concentration of HSA is 5%, the pH of the mixture is above 8.0, or both.

【００４３】 他の態様においては、本発明は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水、約5％〜1
5％グリセロール、約0.25〜2.0mM CaCl2、及び約0.1〜1.0mM MgCl2の水性組成物
中でアデノウイルスベクターの混合物を調製することにより約20℃においてアデ
ノウイルスベクターを安定化する方法を提供する。個々の実施態様においては、
グリセロールの濃度は10％であり、CaCl2の濃度は約1.0mMであり、MgCl2の濃度
は約0.5mMである。 本発明の配合物の使用は、遠心分離又は洗浄段階を含めずに、良好な生存度を
もって及び/又は生物体の感受性細胞に感染させる能力に影響させずに、ウイル
ス粒子又はウイルスベクターを保存することを可能にするとともに被検者に直接
投与することを可能にする。In another embodiment, the invention provides a Dulbecco's phosphate buffered saline solution, about 5% to 1%.
Provided is a method for stabilizing an adenovirus vector at about 20 ° C. by preparing a mixture of adenovirus vectors in an aqueous composition of 5% glycerol, about 0.25-2.0 mM CaCl 2 , and about 0.1-1.0 mM MgCl 2. To do. In particular embodiments,
The concentration of glycerol is 10%, the concentration of CaCl 2 is about 1.0 mM, and the concentration of MgCl 2 is about 0.5 mM. The use of the formulations of the invention preserves viral particles or viral vectors without involving centrifugation or washing steps, with good viability and / or without affecting the ability of the organism to infect susceptible cells. It is possible to directly administer to a subject.

【００４４】 これを目的として、本発明は、また、本発明の保存配合物及びウイルス粒子又
はウイルスベクターを含有する標品、及びウイルス粒子又はウイルスベクターの
貯蔵方法に関する。ウイルス粒子又はウイルスベクターは、本発明の配合物へ直
接パッケージされてもよい。ウイルスについては、本明細書に記載されたように
予め精製される(例えば、塩化セシウム勾配での遠心分離、カラムクロマトグラ
フィー、プラーク精製等による)。101〜1015粒子/ml、好ましくは105〜1010、又
は更に好ましくは109〜1013の割合でパッケージされることができる。次に、ウ
イルス粒子又はウイルスベクターは、適切な容器内の本発明の配合物にパッケー
ジされることができる。アンプル、チューブ、特にクリオチューブ、バッグ、バ
イアル、フラスコ等でもよい。容器は、予め滅菌され、パッケージング操作は無
菌状態で行われる。 本発明の培地又は配合物は、良好な生存度を保存する条件下でウイルス粒子又
はウイルスベクターの貯蔵及び保存を可能にする。本発明の配合物は、特に、水
の氷点より高い温度で粒子又はベクターの貯蔵を可能にする。好適実施態様にお
いては、本発明の培地は、緩衝水溶液中で、水の氷点より高い温度で組換えアデ
ノウイルスベクターの貯蔵を可能にすることができ、HSAの存在しないときの力
価に比べてアデノウイルスベクターの力価を高めることを可能にすることができ
、その双方もできる。To this end, the invention also relates to a preparation containing the preservation formulation of the invention and a virus particle or virus vector, and a method of storing a virus particle or virus vector. Viral particles or viral vectors may be packaged directly into the formulations of the invention. For viruses, it is prepurified as described herein (eg, by centrifugation on a cesium chloride gradient, column chromatography, plaque purification, etc.). It can be packaged at a rate of 10 1 to 10 15 particles / ml, preferably 10 5 to 10 10 , or more preferably 10 9 to 10 13 . The viral particle or viral vector can then be packaged in a formulation of the invention in a suitable container. Ampules, tubes, especially cryotubes, bags, vials, flasks and the like may be used. The container is sterilized in advance and the packaging operation is performed aseptically. The medium or formulation of the invention allows storage and storage of viral particles or viral vectors under conditions that preserve good viability. The formulations of the present invention allow the storage of particles or vectors, especially at temperatures above the freezing point of water. In a preferred embodiment, the medium of the present invention is capable of allowing storage of the recombinant adenovirus vector in buffered aqueous solution at temperatures above the freezing point of water, compared to its titer in the absence of HSA. It may be possible to increase the titer of the adenovirus vector, or both.

【００４５】医薬組成物： 本発明の使用については、ウイルスベクターか又はウイルス粒子
の形のベクターは、好ましくは、注射用配合物の薬学的に許容しうる担体の1種
以上と混合される。『担体』という用語は、希釈剤、補助剤、補形剤、又は賦形
剤を意味し、それと共に化合物が投与される。その医薬担体は、水や油のような
滅菌した液体であり得る。石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、落花
生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が含まれる。水又は水溶液、塩類溶液、又はデキ
ストロース又はグリセロール水溶液が担体として、特に注射用液剤に好ましく用
いられる。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる『レミントンの薬学』に記載
されている。特に等張液、滅菌液、塩類液(リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナ
トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウ
ム等又はそのような塩の混合物)、又は場合によっては、滅菌水又は生理的食塩
水の添加時に注射用液剤の構成を可能にする乾燥した、特に凍結乾燥した組成物
であってもよい。 Pharmaceutical composition: For use according to the invention, the viral vector or the vector in the form of viral particles is preferably mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers of injectable formulations. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or excipient with which the compound is administered. The pharmaceutical carrier can be a sterile liquid such as water or oil. Those of petroleum, animal, plant or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like are included. Water or an aqueous solution, a saline solution, or an aqueous dextrose or glycerol solution is preferably used as a carrier, particularly for an injectable solution. Suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmacy" by EW Martin. Particularly isotonic solution, sterile solution, saline solution (monosodium phosphate or disodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride or magnesium chloride, etc. or a mixture of such salts), or in some cases sterile water or It may be a dried, especially freeze-dried composition, which allows the formation of an injectable solution upon addition of saline.

【００４６】 好ましい無菌注射用配合物は、非毒性の非経口的に許容しうる溶媒又は希釈剤
中に溶解したもの又は懸濁したものであり得る。薬学的に許容しうる担体の例は
、緩衝食塩水、等張食塩水(例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、又
はそのような塩の混合物)、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセ
ロール、エタノール、及びその組合わせである。1,3-ブタンジオールや滅菌不揮
発油は、溶媒又は懸濁媒質として便利に用いられる。合成モノ又はジグリセリド
を含む無刺激不揮発油も使用し得る。オレイン酸のような脂肪酸も注射剤の調製
に用いられる。 本明細書に用いられる『治療的に有効な量』という語は、被検者の活動、機能
及び応答の臨床上重要な欠損を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、
更に好ましくは少なくとも90％だけ減少させるのに十分な量、最も好ましくは予
防するのに十分な量を意味する。また、治療的に有効な量は、被検者の臨床上重
要な症状の改善をもたらすのに十分な量である。Preferred sterile injectable formulations may be dissolved or suspended in a non-toxic parenterally acceptable solvent or diluent. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include buffered saline, isotonic saline (e.g., monosodium phosphate or disodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride or magnesium chloride, or salts thereof). Mixture), Ringer's solution, dextrose, water, sterile water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. 1,3-Butanediol and sterile fixed oils are conveniently used as the solvent or suspending medium. Bland fixed oils containing synthetic mono- or diglycerides may also be used. Fatty acids such as oleic acid are also used in the preparation of injectables. The term "therapeutically effective amount" as used herein refers to a clinically significant loss of activity, function and response in a subject of at least about 15%, preferably at least 50%,
More preferably it means an amount sufficient to reduce by at least 90%, most preferably an amount sufficient to prevent. Also, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to effect amelioration of clinically important symptoms in the subject.

【００４７】組成物の投与： 本発明によれば、本発明の組成物は、非経口的に又は経粘膜的
に、例えば、経口的に、経鼻的に、又は直腸的に、又は経皮的に加えることがで
きる。好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内注射による投与であり、動脈内
、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内投与が含まれるがこれらに
限定されない。がんの遺伝子治療については、組成物の投与は、腫瘍又は腫瘍の
周りの組織に注入することにより加えることができる。 腫瘍に対する好ましい投与経路は、腫瘍に直接注射することによるものである
。磁気共鳴イメージング又はコンピュータ援助断層撮影法のような当該技術にお
いて利用できる手法のいずれかを用いて腫瘍が画像化され、例えば、定位注射に
よって治療用組成物が投与され得る。また、腫瘍標的が特定の抗原を特徴とする
場合には、本発明のベクターの標的を上記抗原にし、全身的に又は局所的に適す
るように、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、脳室内等に投与され得る。 投与に用いられるウイルス投与量は、種々のパラメーターの関数として、特に
考慮される投与部位、注射回数、発現すべき遺伝子又は所望される治療期間の関
数として適応させ得る。一般的には、本発明の組換えアデノウイルスは、104〜1
014pfu、好ましくは105〜1011pfuの投与量として処方及び投与される。pfu(プラ
ーク形成単位)という用語は、ウイルス溶液の感染力に対応し、適切な細胞培養
液に感染させ、通常は15日以内に感染した細胞のプラーク数を測定することによ
り求められる。p53アデノウイルスやHSV-TKアデノウイルスについては、典型的
には、プラーク数は7日目に計数される。他のウイルスについては、12〜14日目
に評価される。ウイルス溶液のpfu力価を求める手法は、文献に十分証明されて
いる。 Administration of Compositions: According to the invention, the compositions of the invention are administered parenterally or transmucosally, eg orally, nasally, or rectally, or transdermally. Can be added as desired. Preferred is parenteral administration, eg, administration by intravenous injection, including, but not limited to, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, intraventricular, and intracranial administration. For cancer gene therapy, administration of the composition can be added by injection into the tumor or the tissue surrounding the tumor. The preferred route of administration for tumors is by direct injection into the tumor. Tumors may be imaged using any of the techniques available in the art such as magnetic resonance imaging or computer assisted tomography and the therapeutic composition may be administered, for example, by stereotactic injection. In addition, when the tumor target is characterized by a specific antigen, the vector of the present invention is targeted to the above-mentioned antigen so that it is suitable systemically or locally, for example, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, brain. It can be administered indoors or the like. The viral dosage used for administration can be adapted as a function of various parameters, in particular as regards the site of administration, the number of injections, the gene to be expressed or the desired duration of treatment. Generally, the recombinant adenovirus of the present invention comprises 10 4 -1
It is formulated and administered as a dose of 14 pfu, preferably 10 5 to 10 11 pfu. The term pfu (plaque forming unit) corresponds to the infectivity of a viral solution and is determined by measuring the plaque number of infected cells, which are usually infected within 15 days, by infecting an appropriate cell culture. For p53 and HSV-TK adenoviruses, plaque numbers are typically counted on day 7. For other viruses, they are evaluated on days 12-14. Techniques for determining pfu titers of viral solutions are well documented in the literature.

【００４８】 従って、本発明の組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、肺動脈内、又
は皮下投与経路によって送達し得る。また、適切に処方された組成物は、経鼻又
は経口投与によって投与し得る。ウイルス粒子又はウイルスベクターの一定の供
給は、必要な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月等に治療的に有効な量(即ち、被
検者の代謝の変化を誘導するのに有効な量)を与えることにより確保し得る。こ
れらのパラメーターは、治療される病状の重さ、実施される食事の変更のような
他の作用、被検者の体重、年齢、及び性別、及び他の基準に依存し、これらは当
業者が良好な標準的医薬実施に従って容易に求めうるものである。 本発明の範囲内のウイルス粒子又はウイルスベクターの投与が投与される被検
者は、好ましくはヒトであるが、動物であり得る。従って、当業者によって容易
に理解され得るように、本発明の方法及び医薬組成物は、動物、特に哺乳動物へ
の投与に特に適し、ネコ又はイヌのような家庭内動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツ
ジ、又はブタのような農場動物、野生動物(野生も動物園も)、マウス、ラット、
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等の研究用動物、ニワトリ、シチメン
チョウ、鳴き鳥等の鳥類、即ち、動物薬使用のためのものが含まれるがこれらに
限定されない。 本発明は、本発明の具体例として示される下記の限定されない実施例によって
良く理解することができる。Accordingly, the compositions of the present invention may be delivered by the intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonary, or subcutaneous routes of administration. Also, properly formulated compositions may be administered by nasal or oral administration. A constant supply of viral particles or viral vectors provides a therapeutically effective amount (i.e., an amount effective to induce a metabolic change in a subject) at the required intervals, for example, daily, weekly, monthly, etc. It can be secured by giving. These parameters will depend on the severity of the condition being treated, other effects such as changes in the diet being carried out, the weight, age, and sex of the subject, and other criteria, which are known to those of ordinary skill in the art. It is readily determinable according to good standard pharmaceutical practice. The subject to which the administration of viral particles or viral vectors within the scope of the invention is administered is preferably a human but can be an animal. Thus, as will be readily appreciated by those skilled in the art, the methods and pharmaceutical compositions of the present invention are particularly suitable for administration to animals, especially mammals, domestic animals such as cats or dogs, cattle, horses, goats. , Farm animals such as sheep, or pigs, wild animals (both wild and zoo), mice, rats,
It includes, but is not limited to, research animals such as rabbits, goats, sheep, pigs, dogs, cats, and birds such as chickens, turkeys, and songbirds, that is, those for veterinary use. The invention can be better understood by the following non-limiting examples, which are given as an illustration of the invention.

【００４９】実施例 一般分子生物学 本発明によれば、当該技術の範囲内の現在の分子生物学、微生物学、及び組換
えDNA技術を用いることができる。そのような技術は、文献に十分に説明されて
いる。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Sec. Ed.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr
ing Harbor, ニューヨーク(本明細書では『Sambrookら, 1989』); DNA Cloning:
A Practical Approach, Vol. I & II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleoti
de Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames
& S.J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames &
S.J. Higgins, eds.(1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed.(1986
)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press,(1986)]; B. Perbal, A Pract
ical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubelら(eds.), Current Pro
tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994)を参照されたい
。[0049] According to the embodiment generally Molecular Biology present invention can be used current molecular biology within the skill of the art, microbiology, and recombinant DNA techniques. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Sec. Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr
ing Harbor, New York (Sambrook et al., 1989); DNA Cloning:
A Practical Approach, Vol. I & II (DN Glover ed. 1985); Oligonucleoti
de Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [BD Hames
& SJ Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [BD Hames &
SJ Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [RI Freshney, ed. (1986
)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Pract
ical Guide To Molecular Cloning (1984); FM Ausubel et al. (eds.), Current Pro
See tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

【００５０】実施例１：前記凍結温度でのアデノウイルス配合物の安定性試験 最初に、アデノウイルス調製物を、最長期間の安定性をもたらすよう、緩衝グ
リセロール溶液中で-70℃で貯蔵した。-70℃貯蔵は、臨床状況では使用できない
ので、ウイルスを-20℃またはそれ以上の温度で保存する配合物が必要である。 Example 1 Stability Testing of Adenovirus Formulations at the Freezing Temperature Initially, adenovirus preparations were stored at -70 ° C in buffered glycerol solution to provide the longest stability. Since -70 ° C storage cannot be used in the clinical setting, formulations requiring storage of the virus at temperatures of -20 ° C or above are required.

【００５１】 本実施例では、5種の貯蔵温度で試験した配合物に関する6ヶ月データをまとめ
ている。本試験は、-20℃で凍結保存、又は+4℃もしくは-20℃の貯蔵温度で液体
として保存した場合に少なくとも1年の安定性を達成する、アデノウイルスベク
ターの最適配合物を決定するためにデザインした。陽性対照は、ダルベッコのリ
ン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、10％グリセロール、1.0mM CaCl2、及び0.5mM MgCl2 中に、-70℃で貯蔵したウイルスからなった。This example summarizes 6 month data for formulations tested at 5 storage temperatures. This study is intended to determine the optimal formulation of adenovirus vectors that achieves at least 1 year stability when stored frozen at -20 ° C or stored as a liquid at + 4 ° C or -20 ° C storage temperatures. Designed to. Positive controls consisted of virus stored in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), 10% glycerol, 1.0 mM CaCl 2 , and 0.5 mM MgCl 2 at -70 ° C.

【００５２】 4種全ての配合物の被験試料は、バッファー交換のために、セファデックスG25
カラムを通した。3つ組ウイルス試料及び陽性対照を、1ヶ月間隔で連続3ヶ月間
、その後は1ヶ月半毎に試験した。プラーク形成単位(pfu)のウイルス力価を、29
3個の細胞を用いたプラーク分析により決定した。分析用HPLC法を用い、260nmで
の光学濃度(OD)のピーク面積から、ウイルス粒子／mlの測定値を決定した。ウイ
ルス粒子は、HSA非含有配合物のUV測定値から決定した。生体活性分析を、選択
された時点でのウイルス活性に関する追加試験として用いた。Test samples of all four formulations were treated with Sephadex G25 for buffer exchange.
Passed through the column. Triplicate virus samples and positive controls were tested at 1-month intervals for 3 consecutive months, then every 11/2 months. The virus titer of plaque forming units (pfu) was determined to be 29
Determined by plaque analysis with 3 cells. Viral particle / ml measurements were determined from the peak area of optical density (OD) at 260 nm using an analytical HPLC method. Viral particles were determined from UV measurements of HSA-free formulations. The bioactivity assay was used as an additional test for viral activity at selected time points.

【００５３】方法 ウイルス試料の調製： これらの実験では、サイトメガロウイルスプロモーターの
制御下にあるp53遺伝子を有する5型アデノウイルスAd5CMVp53（国際公開公報第U
S95/04898号に開示されている）で、10mlバイアルにはいった、10％グリセロー
ルを加えたDPBS中のろ過した0.2μmを使用した。ウイルス力価は、1.38 x 1011
pfu/ml及び3.44 x 1012 粒子／mlであった。試験初日に、Ad5CMVp53のバイアル1
3個を室温で解凍し、かつプールした。プールした物質について、260nmでOD測定
を行い、当初の粒子／mlとした。次にプール13mlを、各配合物用のバッファー交
換のために、セファデックスG25カラム（200ml；ファルマシア社、カタログ番号
17-0033-01、ロット番号241586）を通した。バッファー交換は、試験に適した配
合物にウイルスを混合するために行った。表1のように定義した4種の配合物を試
験した。配合物2、3及び4には、バッファー交換時には、0.5％HSAのみが存在し
た。[0053] methods Virus Sample preparation: In these experiments, the cytomegalovirus promoter adenovirus type 5 with p53 gene under the control of Ad5CMVp53 (International Publication No. U
S95 / 04898) and used 0.2 μm filtered in DPBS with 10% glycerol in 10 ml vials. Virus titer is 1.38 x 1011
pfu / ml and 3.44 x 1012 particles / ml. Vial 1 of Ad5CMVp53 on the first day of testing
Three were thawed at room temperature and pooled. The pooled material was OD measured at 260 nm to give the initial particles / ml. Then, 13 ml of the pool was used for Sephadex G25 column (200 ml; Pharmacia, Catalog No.) for buffer exchange for each formulation.
17-0033-01, lot number 241586). Buffer exchange was done to mix the virus into the appropriate formulation for testing. Four formulations, defined as in Table 1, were tested. Formulations 2, 3 and 4 had only 0.5% HSA when buffer exchanged.

【００５４】 表１ 被験配合物 Table 1 Test formulations

【００５５】 バッファー交換後、OD測定を260nmで行い、この交換過程で生じた粒子希釈度を
決定した。粒子希釈度は％収率で報告した。バッファー交換及びOD測定を完了し
た後、HSAを適当な配合物に添加した。試料のバッファー交換及びHSA添加による
希釈は、下記式により計算した：（カラム希釈）×（％収率）×（HSA希釈）。
全ての試料を、最終希釈物が、当初のプール濃度の3.2倍になるように希釈した
。最終希釈後、全ての試料を+4℃で一晩貯蔵し、かつ翌日アリコートに分け試験
した。4種全てのウイルス配合物試料を、ラベルをつけたアンバーガラスバイア
ル(キンブル社#203)に各0.42mlで等分し、かつ適当な温度、-20℃（VWRサイエン
ティフィック社の冷凍庫）、-4℃（LabLine Ambi Hilo チャンバー）、+4℃（VW
Rサイエンティフィック社のツードア冷蔵庫モデルGDM-49）、+20℃及び+37℃（
クイーンシステム社、セルスターインキュベータモデル（WJ8000ABS）で貯蔵し
た。-20℃貯蔵用試料は、-20℃で貯蔵する前に、制御された速度の冷凍庫で-40
℃に冷凍した。温度-4℃、+20℃及び+37℃は、温度を上昇させて用い、これによ
り-20℃のウイルス配合物の「促進された」安定性を決定した。After the buffer exchange, OD measurements were performed at 260 nm to determine the particle dilution that occurred during this exchange process. Particle dilution was reported as% yield. After completing the buffer exchange and OD measurements, HSA was added to the appropriate formulation. The sample buffer exchange and dilution by HSA addition was calculated by the following formula: (column dilution) x (% yield) x (HSA dilution).
All samples were diluted so that the final dilution was 3.2 times the original pool concentration. After the final dilution, all samples were stored overnight at + 4 ° C and aliquoted and tested the next day. Samples of all four virus formulations were aliquoted into labeled amber glass vials (Kimble # 203) at 0.42 ml each, and at an appropriate temperature, -20 ° C (VWR Scientific Freezer), -4 ℃ (LabLine Ambi Hilo chamber), + 4 ℃ (VW
R Scientific two-door refrigerator model GDM-49), + 20 ° C and + 37 ° C (
The sample was stored in a Cellstar incubator model (WJ8000ABS) manufactured by Queen System. Samples for storage at -20 ° C should be stored at -40 ° C in a controlled rate freezer prior to storage at -20 ° C.
Frozen to ℃. Temperatures -4 ° C, + 20 ° C and + 37 ° C were used at elevated temperatures, which determined the "facilitated" stability of the virus formulation at -20 ° C.

【００５６】ポジティブコントロール試料の調製： 被験試料をバッファー交換のために除去し
た後の当初のウイルスプールの残量を、3.2倍に希釈し、前述の被験試料の希釈
度と合致させた。対照は、現行のAd5CMVp53配合物を模倣するように、DBPS、10
％グリセロール、1.0mM CaCl2、及び0.5mM MgCl2で希釈した。対照ウイルスを、
クリオバイアル（ナルゲン社、No.5000-0020、ロット番号072381）1個につき0.4
2mlに等分し、かつ-70℃で貯蔵した（バイオフリーザー、フォルマサイエンティ
フィック社、モデル8328）。配合物の分析： 4種の配合物全てを、異なる温度で貯蔵した0、1、2、3、4.5及び
6ヵ月後に、表2に示したいくつかのパラメータに関して分析した。しかし、更な
る分析が不要であることを示す結果が先に得られた場合があるので、各時点で、
全ての温度を試験したわけではない。Preparation of positive control sample: The initial residual amount of the virus pool after removing the test sample for buffer exchange was diluted 3.2 times to match the dilution of the test sample described above. Controls used DBPS, 10 to mimic the current Ad5CMVp53 formulation.
Diluted with% glycerol, 1.0 mM CaCl 2 , and 0.5 mM MgCl 2 . Control virus
0.4 for each cryovial (Nalgen, No. 5000-0020, lot number 072381)
Aliquots into 2 ml and stored at -70 ° C (Biofreezer, Forma Scientific, Model 8328). Formulation Analysis: All four formulations were stored at different temperatures 0, 1, 2, 3, 4.5 and
After 6 months, some parameters shown in Table 2 were analyzed. However, at some point, at each time point, the results were obtained first, indicating that no further analysis was necessary.
Not all temperatures tested.

【００５７】プラーク分析の解析： ウイルス力価を、剪断した(sheared)ヒトAd5 DNA(相補的E
1領域)で形質転換されたヒト胚腎細胞の293個の細胞のプラーク分析により決定
した。所定の時点で、3つ組の試料及び3つ組の陽性対照を、プラーク形成単位に
ついて試験した。試験の2日前に、293個の細胞（ATCC（登録商標）カタログ番号
CRL1573）を、6cmの組織培養皿上に播種した。試験当日に、ウイルス試料及び陽
性対照を、MEM+0.5％HEPESにより順次希釈した。測定可能なプラークを生じると
予想される2回以上の希釈を用い、293細胞を感染した。293細胞の3個の集密な6c
m皿を、ウイルス試料及び陽性対照の希釈物各々0.5mlで感染した。 Analysis of plaque analysis: Viral titers were sheared on human Ad5 DNA (complementary E
1 region) was determined by plaque analysis of 293 cells of human embryonic kidney cells transformed. At predetermined time points, triplicate samples and triplicate positive controls were tested for plaque forming units. 2 days before testing, 293 cells (ATCC® Catalog Number
CRL1573) was seeded on a 6 cm tissue culture dish. On the day of testing, virus samples and positive controls were serially diluted in MEM + 0.5% HEPES. 293 cells were infected with two or more dilutions that would yield measurable plaques. 3 confluent 6c of 293 cells
m dishes were infected with 0.5 ml each of the virus sample and positive control dilutions.

【００５８】 これらの皿を、37℃、5.0％CO2及び相対湿度95％で2時間、15分毎に揺らしなが
らインキュベーションした。インキュベーション後、試料を吸引除去し、皿を05
％シーケム（SeaKem）アガロースで被覆し、MEM、7.5％FBSを積層した。その後
これらの皿を、37℃、5.0％CO2及び相対湿度95％でインキュベーションした。The dishes were incubated at 37 ° C., 5.0% CO 2 and 95% relative humidity for 2 hours with rocking every 15 minutes. After incubation, aspirate the sample and remove the dish
% SeaKem agarose was coated and MEM, 7.5% FBS was laminated. The dishes were then incubated at 37 ° C., 5.0% CO 2 and 95% relative humidity.

【００５９】 表2 6ヶ月の配合物分析のまとめ Table 2 Summary of 6 Month Formulation Analysis

【００６０】 5日間インキュベーションした後、皿を、MEM中の0.1％ニュートラルレッドで一
晩37℃で染色した。翌日、染色液を吸引除去し、プラーク数を数えた。各希釈物
の力価を、下記式により、プラーク形成単位／ml(pfu/ml)の形で決定した：[（
平均カウント×希釈）／容量]。試料のpfu/ml力価は、各希釈物のpfu/mlの平均
を出し決定した。3つ組試料の平均を、各時点で決定した。結果を、更に分析す
るために、マイクロソフトエクセル（Microsoft EXCEL）を使ってプロットした
。After incubation for 5 days, dishes were stained with 0.1% Neutral Red in MEM overnight at 37 ° C. The next day, the stain was removed by suction and the number of plaques was counted. The titer of each dilution was determined in the form of plaque forming units / ml (pfu / ml) according to the formula: [(
Average count x dilution) / volume]. The pfu / ml titer of the sample was determined by averaging the pfu / ml of each dilution. The average of triplicate samples was determined at each time point. The results were plotted using Microsoft EXCEL for further analysis.

【００６１】HPLC分析： 試料及び陽性試料の間で、HPLCピーク面積の比較を行い、バイアルあ
たりのウイルス濃度を決定した。各々3つ組の試料及び陽性試料は、ウォーター
ス（Waters）分析用HPLCシステム上でミレニアム（Millennium）ソフトウェアを
用いて試験した。簡単に述べると、試料及び陽性試料100μlを、Resource Q 1ml
、6.4 x 30 mmカラム（ファルマシア社、カタログ番号17-1177-01）に注入し、
流量1ml／分を用いた。試料は、走行全体を通じて、ウォータース自動試料採取
装置において2〜8℃で貯蔵した。 HPLC analysis: HPLC peak area comparisons were made between samples and positive samples to determine virus concentration per vial. Each triplicate sample and positive samples were tested using Millennium software on a Waters analytical HPLC system. Briefly, 100 μl of sample and positive sample were added to Resource Q 1 ml.
, 6.4 x 30 mm column (Pharmacia, Catalog No. 17-1177-01),
A flow rate of 1 ml / min was used. Samples were stored at 2-8 ° C in a Waters autosampler throughout the run.

【００６２】 流す勾配(running gradient)は、ラインA：バッファーA（50mM Tris、pH7.5）、
ラインB：バッファーB（50mM Tris＋1M NaCl、pH7.5）、ラインC：バッファーC
（0.5N NaOH、洗浄液、各ウイルス走行後にカラムの洗浄に使用）、及びラインD
：D（水）であった。無傷のアデノウイルスが、走行開始後18〜22分後に溶出し
た。全勾配で溶出された単ピークの各々のピーク面積が、ミレニアムソフトウェ
アにより示された。18〜22分の範囲で単ピークとして溶出したアデノウイルスピ
ークのみ、ウイルス粒子濃度の指標として使用した。各ウイルスピークのピーク
面積の積分が、ミレニアムソフトウェアにより示された。データは、マイクロソ
フトエクセルを使ってプロットしかつ分析した。The running gradient is: Line A: buffer A (50 mM Tris, pH 7.5),
Line B: Buffer B (50 mM Tris + 1M NaCl, pH 7.5), Line C: Buffer C
(0.5N NaOH, washing solution, used to wash the column after running each virus), and line D
: It was D (water). Intact adenovirus eluted 18-22 minutes after the start of running. The peak area of each of the single peaks eluted with all gradients was indicated by Millennium software. Only the adenovirus peak, which eluted as a single peak in the range of 18 to 22 minutes, was used as an index of virus particle concentration. The integral of the peak area of each virus peak was shown by Millennium software. Data were plotted and analyzed using Microsoft Excel.

【００６３】UV分析による光学濃度： 濃度ウイルス粒子／mlを、陽性対照及びHSA非含有の配
合物1試料について決定した。HSA含有配合物は、5％HSAが測定を妨害する（デー
タは示さず）ので、OD粒子について試験しなかった。簡単に述べると、1％SDSの
50μl及び試料50μlを、室温で20分間インキュベーションし、その後脱イオン水
で1:10希釈した。試料を、260nm及び280nmで測定した。260/280の比を計算し、
純度とした。OD280吸光係数I = 1012粒子／ml を用いて、試料及び陽性試料のウ
イルス粒子／mlを算出した。データはマイクロソフトエクセルを使ってプロット
しかつ分析した。 Optical Density by UV Analysis: Concentration virus particles / ml were determined for the positive control and one sample of formulation without HSA. Formulations containing HSA were not tested for OD particles as 5% HSA interferes with the measurement (data not shown). Simply put, 1% SDS
50 μl and 50 μl of sample were incubated for 20 minutes at room temperature and then diluted 1:10 with deionized water. The sample was measured at 260 nm and 280 nm. Calculate the 260/280 ratio,
Purity The OD280 extinction coefficient I = 1012 particles / ml was used to calculate the viral particles / ml of the sample and the positive sample. Data were plotted and analyzed using Microsoft Excel.

【００６４】生体活性分析： p50導入遺伝子発現を、骨原性肉腫の肺転移に由来するヒト腫瘍
細胞株Saos-LM2細胞の増殖阻害により決定した。この試験においては、DMEM-高
ブドウ糖(HG)＋10％FBS-熱失活(HI)の96ウェル力価測定用プレート上に、3 x 10
3 Saos-LM2細胞／ウェルを播種し、3日後にDMEM-HG＋10％FES-HI中に様々な感染
多重度(MOI、10、20、40、80及び160)に希釈したウイルス試料により感染した。
感染細胞を、37℃で4日間インキュベーションし、その後細胞増殖の指標である
アラマーブルー(alamar blue)で染色し、8時間インキュベーションした。アラマ
ーブルーの入ったプレートを、570nm及び595nmで測定し、ODを決定した。光学密
度を、下記式を用いて算出した：OD＝吸光度570nm−吸光度595nm。増殖阻害は、
マイクロソフトエクセルを使って、アラマーブルーの減少率(％)としてプロット
しかつ更に分析した。統計解析： 3つ組の試料について、平均及び標準偏差を算出した。 Bioactivity analysis: p50 transgene expression was determined by growth inhibition of human tumor cell line Saos-LM2 cells derived from lung metastases of osteogenic sarcoma. In this test, 3 x 10 5 DMEM-High Glucose (HG) + 10% FBS-Heat Inactivated (HI) 96 well titer plates were used.
3 Saos-LM2 cells / well were seeded and after 3 days infected with virus samples diluted in DMEM-HG + 10% FES-HI at various multiplicities of infection (MOI, 10, 20, 40, 80 and 160).
Infected cells were incubated at 37 ° C for 4 days, then stained with alamar blue, an indicator of cell proliferation, and incubated for 8 hours. Plates with Alamar Blue were measured at 570 nm and 595 nm to determine OD. Optical density was calculated using the following formula: OD = absorbance 570 nm-absorbance 595 nm. Growth inhibition is
Using Microsoft Excel, was plotted as percent reduction of Alamar Blue and further analyzed. Statistical analysis: Mean and standard deviation were calculated for triplicate samples.

【００６５】結果 プラーク分析の結果： 4℃及び20℃におけるアデノウイルス安定性に関するプラ
ーク分析の結果は、図1及び2に示した。-20℃で、被験配合物は全て、6ヶ月間安
定していた（データ省略）。4℃及び20℃では、配合物4が、全ての時点で安定性
の増大を示した（図1及び2）。驚くべきことに、-4℃では、配合物4は、他の配
合物と同じpfu活性を示した（データは示さず）。37℃では、全ての配合物が不
安定であった（データは示さず）。 Results Results of Plaque Analysis : The results of plaque analysis for adenovirus stability at 4 ° C and 20 ° C are shown in Figures 1 and 2. At -20 ° C, all tested formulations were stable for 6 months (data not shown). At 4 ° C. and 20 ° C., formulation 4 showed increased stability at all time points (FIGS. 1 and 2). Surprisingly, at -4 ° C, formulation 4 showed the same pfu activity as the other formulations (data not shown). At 37 ° C all formulations were unstable (data not shown).

【００６６】 +4℃での貯蔵は、様々な配合物間で安定性が異なることが決定された。4℃で1ヶ
月間の貯蔵後、配合物1は、配合物2及び3よりも優れていたが、3ヶ月の時点でpf
u/mlは1 log以上まで、有意に低下していた（図1）。4℃で貯蔵した場合、配合
物1は、全ての時点で、配合物4と同等の性能は示さなかった（図1）。4℃で貯蔵
した場合、配合物2及び3は、1ヶ月で、力価の最初の低下を示した（図1）。+4℃
で、配合物4は、最大3ヶ月まで本質的に変化せずに残り、かつ活性喪失は4.5ヵ
月後から示し始めた（図1）。Storage at + 4 ° C. was determined to have different stability among various formulations. After storage for 1 month at 4 ° C, formulation 1 was superior to formulations 2 and 3, but at 3 months the pf
u / ml was significantly reduced to 1 log or more (Fig. 1). When stored at 4 ° C, Formulation 1 did not perform as well as Formulation 4 at all time points (Figure 1). When stored at 4 ° C, Formulations 2 and 3 showed an initial drop in titer at 1 month (Figure 1). + 4 ° C
Thus, formulation 4 remained essentially unchanged for up to 3 months, and loss of activity began to show after 4.5 months (Figure 1).

【００６７】 +20℃での貯蔵も、配合物間で安定性が異なることが決定された。配合物1及び4
は、+20℃で6ヶ月間ウイルス活性の最良の保持を示した（図2）。配合物4は、6
ヶ月間にわたって最低の減少を示し（図3）、これは、わずかに0.33 logであっ
た。配合物1は、わずかに2 logの減少であったので、明らかに2番目に優れた配
合物であった。図2の「カウントするには余りにも多い」(tntc)データポイント
は、真の力価が、報告された値よりも高いことを示している。開始1ヶ月で、配
合物2及び3は、+20℃で貯蔵した場合に、力価の低下を示し（図2）、このことは
、HPLC及び生体活性の両方で裏付けられた。配合物2及び3は、長期安定性に関し
ては、配合物1及び4よりも好ましくなものであった。Storage at + 20 ° C. was also determined to have different stability between formulations. Formulations 1 and 4
Showed the best retention of viral activity at + 20 ° C for 6 months (Figure 2). Formulation 4 is 6
It showed the lowest decrease over months (Figure 3), which was only 0.33 log. Formulation 1 was clearly the second best formulation, with only a 2 log reduction. The "too many to count" (tntc) data point in Figure 2 indicates that the true titer is higher than the reported value. In the first month starting, Formulations 2 and 3 showed a decrease in titer when stored at + 20 ° C (Figure 2), which was confirmed by both HPLC and bioactivity. Formulations 2 and 3 were more preferable than Formulations 1 and 4 in terms of long-term stability.

【００６８】 表3 ウイルス力価のまとめ：プラーク分析の結果 Table 3 Summary of virus titers: Results of plaque analysis

【００６９】 注１：Log=は、次式により計算した：（Log T=6 pfu/ml）−（Log T=0 pfu/ml）
。A(-)＝喪失、a(+)結果＝獲得 注２：-4℃及び+37℃で貯蔵した試料は、T=1ヶ月で活性を4 log以上喪失したの
で、試験計画を中止した。Note 1: Log = was calculated by the following formula: (Log T = 6 pfu / ml) − (Log T = 0 pfu / ml)
. A (-) = loss, a (+) result = acquisition Note 2: The sample stored at -4 ° C and + 37 ° C lost 4 log or more activity at T = 1 month, so the test plan was discontinued.

【００７０】 4種全ての配合物について、1ヶ月間の-4℃及び+37℃での貯蔵は、活性の劇的喪
失を示した（データは示さず）。-4℃及び+37℃試料の減少した活性は、HPLC及
びOD分析の結果から裏付けられた。-4℃で貯蔵した試料は全て液体であり、凍結
していなかった。これは、-4℃での完全な凍結を防止する配合物中の大量の賦形
剤が原因であろう。従って、-4℃で貯蔵した試料は、氷の結晶が損傷を引き起こ
し得るような、液体と固体の間の遷移相であろう。加えて、-4℃の試料は凍結し
なかったので、-20℃の凍結貯蔵に関する促進された製品寿命の計算には使用す
ることができなかった。-4℃及び37℃試料は、1ヶ月で試験を中止した。For all four formulations, storage at −4 ° C. and + 37 ° C. for 1 month showed a dramatic loss of activity (data not shown). The reduced activity of -4 ° C and + 37 ° C samples was confirmed by the results of HPLC and OD analysis. All samples stored at -4 ° C were liquid and not frozen. This may be due to the large amount of excipients in the formulation that prevent complete freezing at -4 ° C. Therefore, samples stored at -4 ° C would be a transitional phase between liquid and solid, where ice crystals could cause damage. In addition, the -4 ° C sample did not freeze, and therefore could not be used in the accelerated product life calculations for -20 ° C frozen storage. The -4 ° C and 37 ° C samples were discontinued at 1 month.

【００７１】 まとめると、6ヶ月のウイルス力価のデータは、配合物4が、特に+20℃で、ウイ
ルス安定性及び活性（感染性）を保持するのに好ましいウイルス配合物を代表す
ることを示している。HPLC結果： ウイルス粒子について、HPLCピーク面積を定量化した。HPLC分析の変
動は、±3％で決定することとした。HPLCピーク面積の標準偏差は小さいために
、時点間のあらゆる小さい変動は、統計学的に有意である。HPLCピーク面積を、
4種全ての配合物について、温度別に時間経過でプロットしたところ、先に示し
たpfu/ml結果と良く相関していた。Taken together, the 6 month viral titer data show that formulation 4 represents a preferred viral formulation to retain viral stability and activity (infectivity), especially at + 20 ° C. Shows. HPLC results: HPLC peak area was quantified for virus particles. Fluctuations in HPLC analysis were determined to be ± 3%. Due to the small standard deviation of the HPLC peak areas, any small variation between time points is statistically significant. HPLC peak area
All four formulations were plotted against temperature over time and correlated well with the pfu / ml results shown above.

【００７２】 0時点で、4種全ての配合物は同様のウイルス粒子／mlを示していた。ピーク面積
値は統計学的に有意な変動を示したにもかかわらず、0時点での4種の配合物間の
差異は、7％未満であった。この低い％変動は、4種の配合物間に、アリコート及
び希釈における大きい変動が生じないことを示している。 -20℃では、4種全ての配合物は、経時的に余り変化しなかった（データ省略）。At time 0, all four formulations showed similar virus particles / ml. Despite the statistically significant variation in peak area values, the difference between the four formulations at time 0 was less than 7%. This low% variation indicates that there are no large variations in aliquots and dilutions between the four formulations. At -20 ° C, all four formulations did not change significantly over time (data not shown).

【００７３】 +4℃では、配合物4以外の4種全ての配合物は、1〜6ヶ月で、ウイルス粒子の有意
な喪失を示した。配合物4は、ウイルス粒子濃度を4.5ヶ月目まで維持し、この時
点でそのピーク面積は、配合物1、2及び3のレベルと同様のレベルに低下した（
データ省略）。+20℃で、配合物2及び3のみが、1〜6ヶ月で、ウイルス粒子の一
貫した喪失を示し、他方配合物1及び4は、そのウイルス粒子の殆どを維持してい
た（データ省略）。At + 4 ° C., all four formulations except Formulation 4 showed significant loss of viral particles from 1-6 months. Formulation 4 maintained the viral particle concentration up to 4.5 months, at which time its peak area dropped to a level similar to that of Formulations 1, 2 and 3 (
Data omitted). At + 20 ° C, only formulations 2 and 3 showed consistent loss of viral particles from 1-6 months, while formulations 1 and 4 maintained most of their viral particles (data not shown). .

【００７４】 プラーク分析データと同様に、-4℃及び37℃で貯蔵された配合物について、4種
の配合物全てが、1ヶ月目に、HPLCピーク面積の劇的低下を示した（データは示
さず）。 まとめると、HPLC結果は、各配合物に関して、プラーク分析結果と安定性に関し
て同様の傾向を示した。4種全ての配合物が、-4℃及び37℃で貯蔵された場合に
、丁度1ヶ月後に、有意なウイルス力価の減少を、有意なウイルス粒子の減少と
ともに示した。Similar to the plaque analysis data, for the formulations stored at -4 ° C and 37 ° C, all four formulations showed a dramatic decrease in HPLC peak area at 1 month (data not shown). Not shown). In summary, the HPLC results showed a similar trend for plaque analysis results and stability for each formulation. All four formulations showed a significant reduction in virus titer with significant reduction in viral particles after just one month when stored at -4 ° C and 37 ° C.

【００７５】生体活性分析結果： これらの配合物を、MOI20で経時的に温度別にプロットした
。結果を、細胞増殖阻害％として記録した。ウイルス感染により増大した細胞死
は、非感染細胞と比較した場合の感染細胞におけるアラマーブルーの低下により
決定されるように、細胞増殖阻害の上昇を引き起こした。 生体活性のデータは、pfu及びHPLC分析から得られた安定性の結果も裏付けてい
る。+4℃で6ヶ月間、配合物4は、＞50％の細胞増殖阻害を維持し、このことはこ
の製品の臨床上の特性(specification)である。-20℃で全ての配合物は同様の性
能を示した（データ省略）。配合物1は、2ヵ月後の性能が劣っていたが、3及び6
ヵ月後にはそうではなく、このことは2ヵ月後のデータが変則的であることを示
している（データ省略）。 Bioactivity analysis results: These formulations were plotted by temperature at MOI 20 over time. Results were recorded as% cell growth inhibition. Increased cell death due to viral infection caused an increase in cell growth inhibition as determined by a decrease in Alamar Blue in infected cells as compared to uninfected cells. The bioactivity data also supports the stability results obtained from pfu and HPLC analysis. Formulation 4 maintained> 50% cell growth inhibition for 6 months at + 4 ° C., which is a clinical specification of this product. At -20 ° C all formulations showed similar performance (data not shown). Formulation 1 had poor performance after 2 months, but 3 and 6
Not after months, this indicates that the data after two months is anomalous (data not shown).

【００７６】 +4℃で、2及び3ヶ月目に、配合物1、2及び3は、生体活性の保持に関して、配合
物4と同様の性能を有さなかった（図3）。このデータは、配合物4が2及び3ヶ月
時点で陽性対照に類似した生体活性を保持し、6ヶ月目に喪失したことを示した
。これらのデータは、先に示したプラーク分析及びHPLCの結果と良好に相関して
いた。At + 4 ° C., at months 2 and 3, Formulations 1, 2 and 3 did not perform as well as Formulation 4 in terms of retention of bioactivity (FIG. 3). The data showed that formulation 4 retained bioactivity similar to the positive control at 2 and 3 months and was lost at 6 months. These data correlated well with the plaque analysis and HPLC results presented above.

【００７７】 +20℃で、プラーク分析の結果に示されたように、配合物1及び4は両方共、陽性
対照と類似の生体活性を、3ヶ月まで保持していて、6ヶ月目に活性喪失を示し始
めた（図4）。配合物4は、依然全配合物中で最良の生体活性をもたらしている。
配合物2及び3は、2又は3ヶ月貯蔵した後、性能は良好ではなかった（図4）。At + 20 ° C., as shown in the results of plaque analysis, both formulations 1 and 4 retained similar bioactivity to the positive control for up to 3 months and were active at 6 months. It began to show loss (Figure 4). Formulation 4 still provides the best bioactivity in all formulations.
Formulations 2 and 3 performed poorly after storage for 2 or 3 months (Figure 4).

【００７８】 考察 この検討結果は、解析した４種の配合物の全てが、-20℃に保存した場合に３
ヶ月の期間にわたってウイルス力価（pfu/ml）を有意に減少させないことを示す
ものである。生物学的活性データはこの結論を支持する。４種の全ての配合物は
−20℃において６か月間安定であることが分かった。 配合物１、２及び３は＋４℃に保存した場合にウイルス力価を２logを越えて
減少させ、HPLCピーク面積による測定では53％より大きく減少させた。＋4℃保
存では、配合物４は３か月間の保存に亘って最も安定であり、このことはプラー
ク分析及び粒子/mlのHPLCピーク面積測定（14.8％減少しただけである）によっ
て証明された。これらの結論は、生物学的活性分析結果によって支持された。従
って、配合物４は＋４℃において３か月間最も安定であることが証明された。 DISCUSSION The results of this study show that all of the four formulations analyzed were 3 when stored at -20 ° C.
It shows that the virus titer (pfu / ml) is not significantly reduced over the period of months. Biological activity data support this conclusion. All four formulations were found to be stable at -20 ° C for 6 months. Formulations 1, 2 and 3 reduced virus titers by more than 2 logs when stored at + 4 ° C., greater than 53% as determined by HPLC peak area. At + 4 ° C storage, Formulation 4 was the most stable over 3 months of storage, as evidenced by plaque analysis and HPLC peak area measurement of particles / ml (only 14.8% reduction). These conclusions were supported by the biological activity assay results. Therefore, Formulation 4 proved to be the most stable at + 4 ° C for 3 months.

【００７９】 配合物１及び４に関するウイルス力価は、+20℃にて保存した場合に分析間変
動内で３か月間安定に保たれたが、配合物１の力価は２log減少し、配合物４の
力価は３〜６ヶ月の間に0.3 log減少した。HPLCピーク面積によるウイルス粒子
測定は３ヶ月までに配合物１については僅かに11.1％の減少を示し、配合物４に
ついては23.8％の減少を示したが、４〜６ヶ月では配合物１については15％、配
合物４については８％の減少を示した。配合物２及び３中に保存されたウイルス
はウイルス力価が有意に低下した：３ヶ月で２logを越えた。mlあたりのウイル
ス粒子数は、HPLCによる測定では30％を越えて減少した。生物学的活性の低下は
これらの結果と相関していた。このように、配合物４は＋20℃で６か月間の間最
も安定であることが証明された。The virus titers for Formulations 1 and 4 remained stable within the inter-assay variability for 3 months when stored at + 20 ° C., but the titer of Formulation 1 decreased by 2 logs. The titer of Article 4 decreased by 0.3 log in 3 to 6 months. Viral particle measurements by HPLC peak area showed a slight 11.1% decrease for Formulation 1 and a 23.8% decrease for Formulation 4 by 3 months, but between 4 and 6 months for Formulation 1 15% and 8% for Formulation 4. The virus stored in Formulations 2 and 3 had significantly reduced virus titers:> 2 logs at 3 months. The number of virus particles per ml was reduced by more than 30% as determined by HPLC. Decreased biological activity correlated with these results. Thus, Formulation 4 proved to be the most stable at + 20 ° C for 6 months.

【００８０】 ４種全ての配合物は-4℃で保存された場合は不安定であり、１ヶ月で４logを
越えるウイルス力価の減少を生じさせ、HPLCピーク面積測定では71％よりも大き
な粒子損失を生じさせた。更に、4種類全ての配合物の37℃における１か月間の
保存は５logを越えるウイルス力価の減少を生じさせ、HPLCピーク面積による測
定では85％を越える粒子損失を生じさせた。このように、解析した配合物のいず
れも−４℃又は＋37℃では安定でないことが分かった。All four formulations were unstable when stored at −4 ° C., resulting in a viral titer reduction of more than 4 logs per month, and particles larger than 71% by HPLC peak area measurement. Caused a loss. In addition, storage of all four formulations for 1 month at 37 ° C resulted in greater than 5 logs reduction in virus titer and greater than 85% particle loss as measured by HPLC peak area. Thus, none of the formulations analyzed were stable at -4 ° C or + 37 ° C.

【００８１】 この研究によれば、配合物４、pH8.2の10mM Trisバッファー、５％HSA、５％
蔗糖、2mM MgCl2及び150mM NaClが長期のウイルス保存に最も好ましかった。プ
ラーク分析、HPLC粒子/ml測定、生物学的活性分析の結果は互いによく相関して
おり、配合物４は-20℃及び＋20℃で保存した場合に６ヶ月間ウイルス活性を維
持することが示唆された。これらのデータはまた、元々のDPBS、10％グリセロー
ル、1.0mM CaCl2及び0.5mM MgCl2の配合物（配合物１）が-20℃及び＋20℃にお
いて３ヶ月間その活性の大部分を維持したことを示唆するものである。長期に亘
ると、配合物１は＋４℃で保存された場合にウイルス力価及び粒子/mlの両方を
減少させた。配合物４は活性及びウイルス粒子の損失を３か月後から示し始めた
。According to this study, Formulation 4, 10 mM Tris buffer, pH 8.2, 5% HSA, 5%
Sucrose, 2 mM MgCl 2 and 150 mM NaCl were most preferred for long-term virus storage. The results of plaque assay, HPLC particle / ml assay and biological activity assay correlate well with each other, suggesting that formulation 4 retains viral activity for 6 months when stored at -20 ° C and + 20 ° C. Was done. These data also indicate that the original DPBS, 10% glycerol, 1.0 mM CaCl 2 and 0.5 mM MgCl 2 formulation (Formulation 1) retained most of its activity for 3 months at -20 ° C and + 20 ° C. It suggests that. Over time, Formulation 1 reduced both virus titer and particles / ml when stored at + 4 ° C. Formulation 4 started showing activity and loss of viral particles after 3 months.

【００８２】実施例２．ウイルス力価を維持するための配合物の-20℃スクリーニング これらの実験は、-20℃で保存された場合に、プラーク分析よるウイルス活性
を維持する能力について幾つかの配合物をスクリーニングするものである。これ
らの実験は、種々のバッファー及び賦形剤の-20℃におけるウイルス力価への影
響について試験したものである。バッファーの型、塩濃度、二価カチオンの存在
、-20℃における時間の長さ（１日対９日）については、プラーク分析によるウ
イルス力価に相違は全く見られなかった。しかしながら、蔗糖及び／又はヒト血
清アルブミン(HSA)の添加は、対照に比較して予想外のウイルス感染性の増大を
明らかにした。 Example 2. -20 ° C Screening of Formulations to Maintain Viral Titers These experiments screen several formulations for their ability to maintain viral activity by plaque assay when stored at -20 ° C. is there. These experiments tested the effect of various buffers and excipients on virus titers at -20 ° C. No difference was observed in virus titer by plaque analysis with respect to buffer type, salt concentration, presence of divalent cations and length of time at -20 ° C (1 day vs 9 days). However, the addition of sucrose and / or human serum albumin (HSA) revealed an unexpected increase in viral infectivity compared to controls.

【００８３】 方法 ウイルス試料配合物の調製： p53遺伝子をサイトメガロウイルス(CMV)プロモー
ターの制御下に有する５型アデノウイルス、Ad5CMVp53をこれらの実験に使用し
た。この材料を種々の試験配合物に希釈し、凍結、融解し、プラーク分析によっ
て解析した。保存ウイルスを表４に提示した種々の試験配合物に100培希釈した
。バッファー組成は10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.2又は10mM Tris緩衝
生理食塩水pH7.5とした。追加のバッファー補助剤には50mM、150mM又は300mMのN
aCl、二価カチオン（1mM CaCl2及び0.5mM MgCl2）、５％蔗糖、及び１％、５％
、又は10％HSAが含まれる。試料を実施例１に記載したように小分けした。凍結
１日及び９日後、試料を融解し、標準的なプラーク分析によりウイルス活性を試
験した。[0083] process for the preparation of virus samples Formulation: Adenovirus type 5 with p53 gene under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter, the Ad5CMVp53 were used in these experiments. This material was diluted in various test formulations, frozen, thawed and analyzed by plaque analysis. Stock virus was diluted 100 fold into various test formulations presented in Table 4. The buffer composition was 10 mM phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 or 10 mM Tris buffered saline pH 7.5. 50 mM, 150 mM or 300 mM N for additional buffer supplements
aCl, divalent cation (1 mM CaCl 2 and 0.5 mM MgCl 2 ), 5% sucrose, and 1%, 5%
, Or 10% HSA is included. Samples were aliquoted as described in Example 1. After 1 and 9 days of freezing, samples were thawed and tested for viral activity by standard plaque analysis.

【００８４】コントロールウイルス試料の調製： 上述の試験配合配合物に使用したAd5CMVp53
を標準バッファー（DPBS、0.5mM MgCl2、1mM CaCl2及び10％グリセロール、pH7.
2）で希釈し、上述したように試験試料に対して個別に処理した。プラーク分析： ウイルスプラーク分析は実施例１に記載したように行った。各希
釈に対する２つのプレートの計測値を平均した。pfu/mlに関する計算値は、試験
バッファーへの100培希釈を含み、実施例１に記載したように計算した。統計： 統計解析のためデータをSystat Ver.5ソフトウエアに移した。直線回帰及
びｔ−検定を行い、α値p=0.05を用いて各群間の相違を決定した。 Control virus sample preparation: Ad5CMVp53 used in the test formulation formulation described above.
Standard buffer (DPBS, 0.5 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 and 10% glycerol, pH 7.
Diluted in 2) and treated individually for test samples as described above. Plaque analysis: Viral plaque analysis was performed as described in Example 1. The measurements on the two plates for each dilution were averaged. Calculated values for pfu / ml were calculated as described in Example 1, including 100 culture dilutions in test buffer. Statistics: Data were transferred to Systat Ver.5 software for statistical analysis. Linear regression and t-test were performed to determine the difference between each group using the α value p = 0.05.

【００８５】 表４ 試験配合物 Table 4 Test formulations

【００８６】 結果と考察 -20℃におけるバッファー、塩及び二価カチオンのウイルス力価に対する影響
： バッファー、塩濃度及び／又は二価カチオン添加のウイルス力価に対する影
響を決定するために配合物１〜12を解析した。配合物１〜12について、-20℃に
おける保存後１日及び９日後のプラーク分析の結果を表５に示した。無結霜フリ
ーザーからの試料を第１日の試験に使用した。 このデータから、大きな相違は見られなかったことが明らかである。実際、全
ての配合粒を併せることによって得られる、各々の日についての変動の全体的な
信頼性(CV＝(SD/mean)ｘ100％)は、分析間結果の変動について実験内で各反復に
ついてほぼ同じである。 Results and Discussion Effect of buffer, salt and divalent cation on virus titer at -20 ° C .: Formulations 1 to determine the effect of buffer, salt concentration and / or addition of divalent cation on virus titer. Twelve were analyzed. The results of plaque analysis 1 and 9 days after storage at -20 ° C for formulations 1-12 are shown in Table 5. Samples from the frost-free freezer were used for day 1 testing. From this data it is clear that no significant difference was seen. In fact, the overall reliability of the variability for each day (CV = (SD / mean) x 100%), obtained by combining all the blends, was It is almost the same.

【００８７】 表５ -20℃におけるプラーク分析結果（pfu/ml） Table 5 Results of plaque analysis at -20 ° C (pfu / ml)

【００８８】 バッファー、塩濃度、二価カチオンの存在に対するウイルス力価（pfu/ml）に
ついて、-20℃曝露１日対９日に対して多重回帰分析を行ったが、有意な相違は
見られなかった（データ省略）。PBS及びTrisバッファーについては、相違は見
られなかった（p=0.784）。50mMから150mMで塩濃度の効果には関連性がなく（p=
0.322）、二価カチオンの存在は全く効果が無かった（p=0.801）。加えて、-20
℃における保存の長さ、１日対９日、も全く相違を示さなかった（p=0.643）。Multiple regression analyzes were performed on buffer, salt concentration, and virus titer (pfu / ml) in the presence of divalent cations for 1 day vs. 9 days of -20 ° C. exposure, but significant differences were seen. There was not (data omitted). No difference was found for PBS and Tris buffer (p = 0.784). There is no relevance to the effect of salt concentration from 50 mM to 150 mM (p =
0.322), the presence of divalent cations had no effect (p = 0.801). In addition, -20
The length of storage at C, 1 day vs. 9 days also showed no difference (p = 0.643).

【００８９】-20℃におけるHSA及び蔗糖の効果： PBSへのHSA及び蔗糖添加のウイルス力価に
対する影響を決定するため配合物13〜18を解析した。第９日のプラーク分析の結
果を表６に示す。HSAと蔗糖のウイルス力価に対する組合せ効果を図５に示した
。 HSA単独及びHSA＋蔗糖の添加によるウイルス力価の増大があった。HSA＋蔗糖
配合物を対照と比較すると、有意な差が見られた（p=0.04）。対照と比較してHS
Aを含む全ての試料についても有意な差が見られた（p=0.004）。この単一データ
点実験における最良の効果は、５％蔗糖又は０％蔗糖の何れにおいても、５％HS
Aで見られた。良好な効果は５％蔗糖、１％HSAについても見られた。 Effect of HSA and sucrose at -20 ° C: Formulations 13-18 were analyzed to determine the effect of HSA and sucrose addition to PBS on virus titer. The results of the plaque analysis on day 9 are shown in Table 6. The combined effect of HSA and sucrose on virus titer is shown in FIG. There was an increase in virus titer with the addition of HSA alone and HSA + sucrose. A significant difference was seen when the HSA + sucrose formulation was compared to the control (p = 0.04). HS compared to control
A significant difference was also seen for all samples containing A (p = 0.004). The best effect in this single data point experiment was 5% HS with either 5% sucrose or 0% sucrose.
Seen in A. A good effect was also seen with 5% sucrose and 1% HSA.

【００９０】 表６ −20℃においてHSA及び蔗糖がウイルス力価に与える影響 Table 6 Effect of HSA and sucrose on virus titer at -20 ° C

【００９１】実施例３： ＋２−１０℃保存用配合物スクリーニング 将来における臨床研究のために、ウイルスを−２０℃以上の温度で保存するの
が好ましい。これらの実験は実施例２の実験の続きであり、＋２−１０℃保存用
の多くの配合物をスクリーニングするよう設計される。実施例１に記載したよう
に、及びこの実施例で測定したように、＋２−１０℃で保存したときHAS含有配
合物は全ウイルス活性を保存したが、HASを含有しない配合物は、種々の量の活
性を失った。この実施例に記載した実験により、＋２−１０℃で保存したときの
ウイルス力価に与える影響について、種々のバッファー及び賦形剤を試験した。 Example 3 Screening Formulations for Storage at + 2-10 ° C. For future clinical studies it is preferable to store the virus at temperatures above −20 ° C. These experiments are a continuation of the experiments of Example 2 and are designed to screen many formulations for storage at + 2-10 ° C. As described in Example 1 and as measured in this example, the HAS-containing formulation preserved total viral activity when stored at + 2-10 ° C, while the HAS-free formulation contained various formulations. Lost the amount of activity. The experiments described in this example tested various buffers and excipients for their effect on virus titer when stored at + 2-10 ° C.

【００９２】 方法ウイルス試料配合物の調製： 本研究では、実施例２に記載の配合物、Ad5CMVp53
保存ウイルス及び希釈液を使用した。配合物は表４に記載した。本研究用に調製
した配合物試料を、冷蔵庫中で＋２−１０℃で保存した。１４日後、これらの試
料を出して標準プラーク分析によりウイルス活性を試験した。実施例１に記載し
たようにしてウイルスプラーク分析を行い、ウイルス力価を計算した。 統計値：この実験について、プラーク値が小さく、この希釈液だけが所望の範
囲内でバラツキない数のプラークを製造したので、一つの希釈液（3.3×10-8）
からのプラーク値を分析に使用した。統計的分析用にデータをシスタット（Syst
at）バージョン５ソフトウェアに移した。直線回帰及びｔ−試験を行い、α値p=
0.05を使用し、グループ間の差を求めた。Methods Preparation of viral sample formulations: In this study, the formulation described in Example 2, Ad5CMVp53.
Stock virus and dilutions were used. The formulations are listed in Table 4. Formulation samples prepared for this study were stored in the refrigerator at + 2-10 ° C. After 14 days, these samples were removed and tested for viral activity by standard plaque analysis. Virus plaque analysis was performed as described in Example 1 and virus titers were calculated. Statistics: For this experiment, one dilution (3.3 x 10 -8 ) because the plaque values were small and only this dilution produced a consistent number of plaques within the desired range.
Plaque values from were used for analysis. Data for statistic analysis (Syst
at) Moved to version 5 software. Linear regression and t-test were performed and α value p =
Differences between groups were determined using 0.05.

【００９３】 結果及び考察＋２−１０℃における保存の影響： ＋２−１０℃において１４日間保存後のプラ
ーク分析の結果を図６に示す。図６における値は各試料の一つの分析希釈液から
得た。各条件について複数回実験を行っていないため、エラーバーは示していな
い。 図６に示したように、ウイルス活性の明確なグループが存在した。配合物１〜
１０のウイルス力価はほとんどバラツキがない一方、配合物１１及び１２（300m
M NaCl含有Trisバッファー含有）のウイルス力価は非常に低かった。配合物１３
〜１８は、HSAを含有するものであるが、HSAを含有しない配合物と比較してウイ
ルス活性が増加した。Results and Discussion Effect of storage at + 2-10 ° C : The results of plaque analysis after storage at + 2-10 ° C for 14 days are shown in Figure 6. The values in Figure 6 were obtained from one analytical dilution of each sample. The error bar is not shown because multiple experiments were not performed for each condition. As shown in Figure 6, there were distinct groups of viral activity. Formulation 1
The virus titers of 10 showed almost no variation, while those of formulations 11 and 12 (300 m
The virus titer of Tris buffer containing M NaCl was very low. Formulation 13
~ 18 contained HSA but had increased viral activity compared to formulations without HSA.

【００９４】HSAの影響： HSAの影響は、図７により明確に理解される。「タンパク質を含有し
ない」グループは、ｎ＝８の試料サイズの配合物を含有し、HSAグループは、ｎ
＝６の試料サイズの配合物を含有した。３００ｍＭ塩を含有する配合物は、この
比較には含まれていない。エラーバーは標準偏差１に等しい。 上述したように、HSAを添加することにより、分析において観察されたプラー
ク数は有意に増加した（p<0.001）。この理由は分からない。ウイルス性タンパ
ク質発現を測定するフローサイトメーターベース分析でも観察されたことから、
ウイルスの伝染力が事実上増加したものと思われる。３つの配合物（＃14、16、18
）についてHSA濃度を増加させて試験した：1％、5％及び10％。これらの３つの
結果は全て分析内変形の範囲内であり、最適HSA濃度は広い範囲で変化する。 Impact of HSA : The impact of HSA is clearly understood by FIG. The "protein-free" group contains a formulation with a sample size of n = 8, the HSA group contains n
= 6 sample size formulations were included. Formulations containing 300 mM salt are not included in this comparison. Error bars equal 1 standard deviation. As mentioned above, the addition of HSA significantly increased the number of plaques observed in the assay (p <0.001). I don't know the reason for this. Since it was also observed in a flow cytometer-based analysis that measures viral protein expression,
It seems that the infectivity of the virus has increased substantially. Three formulations (# 14, 16, 18
) Was tested at increasing HSA concentrations: 1%, 5% and 10%. All three of these results are within intra-assay variation and the optimum HSA concentration varies over a wide range.

【００９５】二価カチオンの影響： ＋２−１０℃で１４日間保存後に二価カチオンがウイルス
力価に与える影響について、NaCl 300mM未満、HSA無添加の試料を分析した。
実験回数は少ないものの、二価カチオンを含有する試料とカチオンを含有しない
試料とを比較したところ、有意な差異は観察されなかった。＋２−１０℃で試験
した試料の数が限られているため（各グループについてｎ＝４）、二価カチオン
の添加により、ウイルス活性が減少することが分かった（p=0.09、データは示し
ていない）。多くの文献源がアデノウイルス配合物中で二価カチオンを使用する
ことを要求しているため、これは予期しない知見である（Huyghe et al., Human
Gene Therapy 6: 1403-1416, 1995）。 Effect of divalent cations: The effect of divalent cations on virus titers after storage at + 2-10 ° C for 14 days was analyzed in samples with less than 300 mM NaCl and no HSA.
Although the number of experiments was small, no significant difference was observed when comparing the sample containing the divalent cation with the sample containing no cation. Due to the limited number of samples tested at + 2-10 ° C (n = 4 for each group), addition of divalent cations was found to reduce viral activity (p = 0.09, data shown). Absent). This is an unexpected finding as many literature sources require the use of divalent cations in adenovirus formulations (Huyghe et al., Human
Gene Therapy 6: 1403-1416, 1995).

【００９６】−２０℃参照配合物試料との比較： 実施例２において、同一の配合物試料を−２
０℃において同じような時間の長さで保存しており、この結果を比較に使用する
ことができる。これらを表７に比較した。一般的に、HSAを含有しない試料（配
合物１〜１２）は、−２０℃で保存したときと比較して＋４℃で比較したときに
ウイルス力価の減少を示した。対照的に、HSAを含有する配合物（１３〜１８）
は、＋４℃でウイルス活性の減少を全く示さなかった。また、二価カチオンを含
有する試料（＃1、3、5、7、9）は、カチオンを含有しない試料（＃2、4、6、7、10）（
−20℃において保存したものの66％）よりも、＋４℃において保存後にウイルス
力価が減少した（−20℃において保存したものの２７％）。 アデノウイルス配合物を＋２−１０℃で１４日間保存したところ、高NaCl（30
0mM）濃度はウイルス力価に悪影響を与えたものの、バッファーを選択（Tris又
はPBS）してもウイルス力価に影響を与えなかった。 Comparison with −20 ° C. Reference Formulation Sample: In Example 2, the same formulation sample was −2
It has been stored at 0 ° C. for a similar length of time and this result can be used for comparison. These are compared in Table 7. In general, samples containing no HSA (Formulations 1-12) showed a reduction in virus titer when compared at + 4 ° C compared to when stored at -20 ° C. In contrast, formulations containing HSA (13-18)
Showed no reduction in viral activity at + 4 ° C. Samples containing divalent cations (# 1, 3, 5, 7, 9) were samples containing no cations (# 2, 4, 6, 7, 10) (
The virus titer was decreased after storage at + 4 ° C (66% of that stored at -20 ° C) (27% of that stored at -20 ° C). When the adenovirus formulation was stored at + 2-10 ° C for 14 days, high NaCl (30
0 mM) concentration had a negative effect on virus titer, but selection of buffer (Tris or PBS) did not affect virus titer.

【００９７】 表７ −２０℃及び＋４℃における組成物１〜１８の比較 Table 7 Comparison of compositions 1-18 at -20 ° C and + 4 ° C

【００９８】実施例４：Ad5CMVp53組成物スクリーニング：pH研究 Ad5CMVp53組成物を用いた上記実施例は実施例１の組成物４を除き、全て生理
学的pHにおいて行った。この実施例における実験は、-40℃、+20℃及び+37℃に
おける広範囲に渡るウイルス活性へのpHの効果を調べるための短期間研究として
行われた。また他の成分の添加についても、極端なpHに対する保護効果に関して
分析を行った。pH5.0及びpH9.0の両極端におけるバッファー塩溶液に対しては、
ウイルス活性の明らかな喪失が見られた。ウイルス安定性はpH値6〜約8の間にお
いて増大し、pH8.2付近で最大の安定性を示した。HSA＋蔗糖存在下では、この効
果は無効であった。更に、以前に観察されたように、HSA+蔗糖の存在はプラーク
分析におけるウイルスの感染力を増大させるようであった。 Example 4: Ad5CMVp53 Composition Screening: pH Study The above examples using the Ad5CMVp53 composition were all performed at physiological pH except composition 4 of Example 1. The experiments in this example were conducted as a short-term study to investigate the effect of pH on a wide range of viral activities at -40 ° C, + 20 ° C and + 37 ° C. The addition of other components was also analyzed for their protective effect against extreme pH. For buffer salt solutions at the extremes of pH 5.0 and pH 9.0,
A clear loss of viral activity was seen. Viral stability increased between pH values 6 and 8 and showed maximum stability around pH 8.2. This effect was ineffective in the presence of HSA + sucrose. Moreover, as previously observed, the presence of HSA + sucrose appeared to increase the infectivity of the virus in plaque assay.

【００９９】方法 ウイルス試料の調製： 上記実施例１〜３において述べたように、Ad5CMVp53をこ
れらの実験に用いた。このウイルス原料を異なるpHの組成物により希釈し、異な
る保存条件で処理し、実施例１において述べたようにプラーク分析によりウイル
スの力価を試験した。コントロールウイルス試料の調製： PBS+グリセロール中で-70℃において保存し
、分析当日に解凍した点以外は、上記ウイルス試料の調製において用いたものと
同じ出発ウイルス原料を用いた。 Methods Viral Sample Preparation: Ad5CMVp53 was used in these experiments as described in Examples 1-3 above. The virus stock was diluted with compositions of different pH, treated under different storage conditions and tested for virus titer by plaque analysis as described in Example 1. Control virus sample preparation: The same starting viral material was used as in the above virus sample preparation except that it was stored at −70 ° C. in PBS + glycerol and thawed on the day of analysis.

【０１００】配合物の調製： 第一の実験において、同じ塩（150mM NaCl）及び二価カチオン濃
度(2mM MgCl2)を含む多数の10mM Trisバッファー溶液を調製し、特定のpH値に調
整し、pH5.0〜pH9.0に変化させた。バッファー以外に5％HSA及び5％蔗糖を含む
他のセットを作製した。一つの実験では、ウイルスを様々な組成物中に希釈し、
-40℃に速度調節フリーザー中で凍結した(-40℃における保存時間は5〜30分間の
間で変化させた)。 Preparation of formulations: In the first experiment, a number of 10 mM Tris buffer solutions containing the same salt (150 mM NaCl) and divalent cation concentration (2 mM MgCl 2 ) were prepared and adjusted to a specific pH value, The pH was changed to 5.0 to 9.0. In addition to the buffer, another set containing 5% HSA and 5% sucrose was prepared. In one experiment, the virus was diluted in various compositions,
Frozen to -40 ° C in a rate-controlled freezer (storage time at -40 ° C varied between 5 and 30 minutes).

【０１０１】 これらを次に解凍し、プラーク分析による活性測定の前1時間にわたり、37℃の
水浴中でインキュベートした。第二の実験では、ウイルスは組成物４（表１参照
）中に希釈し、特定のpH値に調整し、pHをpH6.6〜pH8.8の間で変化させた。これ
らのウイルス組成物は、室温（RT=20℃）または37℃のいずれかにおいて、プラ
ーク分析の活性測定前１週間にわたり保存した。ウイルスプラーク分析を実施例
１に記載したように行った。These were then thawed and incubated in a 37 ° C. water bath for 1 hour before activity measurement by plaque analysis. In the second experiment, the virus was diluted in composition 4 (see Table 1), adjusted to a specific pH value and the pH varied between pH 6.6 and pH 8.8. These viral compositions were stored at either room temperature (RT = 20 ° C.) or 37 ° C. for 1 week prior to plaque assay activity measurement. Viral plaque analysis was performed as described in Example 1.

【０１０２】統計値： 二つの希釈及び二つの複製(replicates)からの各プラーク分析データを
結合させた。平均値、標準偏差及びCVを計算した。スチューデントｔ検定をExce
l5.0を用いて行った。 Statistics: Each plaque analysis data from two dilutions and two replicates was combined. Mean value, standard deviation and CV were calculated. Exce Student t-test
It was carried out using l5.0.

【０１０３】結果及び考察 第一の実験においてpH5.0〜pH9.0に変化させた各pHの二つの複製をプラーク分
析において試験し、その後-40℃で短期間保存し1時間37℃でインキュベートした
。HSA+蔗糖を添加した配合物の第二セットについてもこの実験で試験した。平均
からの標準偏差は二つの複製の二つの希釈から平均した。HSA+蔗糖を含まない第
一の群では、pHの上端及び下端ではウイルス力価は低下した。pH5.0及びpH9.0配
合物試料はコントロール群（コントロール、pH6.0、pH7.0及びpH8.0）の平均よ
り明らかに低下した（各々p＜0.001及びp=0.008）(データ省略)。様々なpHレベ
ルにおいてHSA+蔗糖が存在する場合には、pHの効果は見られなかった（データ省
略）。 Results and Discussion Two replicates of each pH varied from pH 5.0 to pH 9.0 in the first experiment were tested in the plaque assay and then stored at -40 ° C for a short period of time and incubated at 37 ° C for 1 hour. did. A second set of formulations supplemented with HSA + sucrose was also tested in this experiment. Standard deviation from the mean was averaged from two dilutions of two replicates. In the first group, which did not contain HSA + sucrose, the virus titer decreased at the upper and lower pH. The pH 5.0 and pH 9.0 formulation samples were significantly lower than the average of the control group (control, pH 6.0, pH 7.0 and pH 8.0) (p <0.001 and p = 0.008 respectively) (data not shown). No effect of pH was seen in the presence of HSA + sucrose at various pH levels (data not shown).

【０１０４】 更に、HSA+蔗糖を含む群の平均はそれらの成分を含まないコントロール群の平均
と比較して明らかに上昇した（p＜0.001）。以上のように、HSA＋蔗糖の存在に
より極端なpHからウイルス力価が保護され、上述した研究(実施例１〜３)におけ
るように、分析中のウイルス感染力を増大させるようであった。従って、バッフ
ァー塩配合物ではAd5CMVp53に対する最適pH範囲はpH6.0〜pH8.0である。Furthermore, the mean of the group containing HSA + sucrose was significantly increased compared to the mean of the control group without those components (p <0.001). As described above, the presence of HSA + sucrose appeared to protect the virus titer from extreme pH, increasing viral infectivity during the assay, as in the studies described above (Examples 1-3). Therefore, in the buffer salt formulation, the optimum pH range for Ad5CMVp53 is pH 6.0-pH 8.0.

【０１０５】 ＨＳＡ＋蔗糖を添加すると、この範囲の上又は下のｐＨ値からウイルスを保護
することができる。 別の実験では、ウイルスを、ｐＨ6.6〜8.8にわたる各特定のｐＨ値の配合物４
で調製し、室温又は３７℃で１週間保存し、そして、プラーク分析で試験した。
結果を、図８に示す。 一般に、8.0〜8.6のｐＨの配合物は、１週間室温で保存した後、最大（highes
t）レベルの活性を維持し、ｐＨ8.2のウイルス試料は、最高(most)の活性を保持
した（図８）。「カウントできないほど多い(too numerous to count)」(tntc)
の表示は、これらの試料に対するプラークカウントが、カウントの上限を超えて
いたことを示す。従って、カウントの限界である300プラークの値は、これらの
「tntc」試料を規定し、図８で報告されている力価を計算するのに使用された。
実際の力価は、この規定値よりも幾分高い。37℃で１週間保存すると、8.0、8.4
及び8.6のｐＨ値を有する配合物4は、ウイルス安定性の最良の保存を示した(図
８)。総括すると、室温及び３７℃での短期間のｐＨ研究から得られた安定性デ
ータによれば、ｐＨ8.0〜8.6の範囲で調整されたｐＨを有する配合物４が、ウイ
ルス活性（感染性）を保存するための最も好ましい配合物であることが分かる。The addition of HSA + sucrose can protect the virus from pH values above or below this range. In another experiment, the virus was treated with formulation 4 at each specific pH value ranging from pH 6.6 to 8.8.
Prepared in, stored at room temperature or 37 ° C for 1 week, and tested by plaque analysis.
The results are shown in Fig. 8. In general, formulations with a pH of 8.0-8.6 have a maximum (highes) after storage at room temperature for 1 week.
The t) level of activity was maintained and the pH 8.2 virus sample retained the most activity (Figure 8). "Too numerous to count" (tntc)
Indicates that the plaque counts for these samples were above the upper count limit. Therefore, a count limit of 300 plaque values was used to define these "tntc" samples and calculate the titers reported in FIG.
Actual titers are somewhat higher than this specified value. Stored at 37 ℃ for 1 week, 8.0, 8.4
And Formulation 4, which had a pH value of 8.6 and 8.6, showed the best preservation of virus stability (Figure 8). In summary, stability data obtained from short-term pH studies at room temperature and 37 ° C show that formulation 4 with a pH adjusted in the range of pH 8.0-8.6 showed viral activity (infectivity). It turns out to be the most preferred formulation for storing

【０１０６】 実施例５：ウシ血清アルブミン及び組換えヒトアルブミンは、天然ＨＳＡと同様
の効果を提供する。 この実施例における研究の目的は、別の源からのアルブミンが、実施例２のＨ
ＳＡで観察された同一の安定性及びウイルス力価上昇を提供できるかどうかを決
定することであった。これらの研究は、市販のＨＳＡ中の他の成分（0.02Ｍアセ
チルトリプトファン及び0.02Ｍカプリル酸ナトリウム（マイルズ（Miles）イン
ク））がＨＳＡをベースとするウイルス配合物における安定性及び力価上昇に貢
献する可能性を検討するためにも行われた。これらの研究では、ウシ血清アルブ
ミン(BSA、試薬級材料、粉末形態)及び組換えヒトアルブミン(rHA)を、異なる条
件の下で異なる研究で試験した。使用した組換えヒトアルブミンは、Recombinan
tTM25であり、これは、センテオン(Centeon)による酵母発現系で産生されかつ上
記に記載されたものである。Example 5: Bovine Serum Albumin and Recombinant Human Albumin Provide Similar Effects to Native HSA. The purpose of the study in this example was that albumin from another source
It was to determine if it could provide the same stability and virus titer increase observed with SA. These studies demonstrate that other components in commercial HSA (0.02M acetyltryptophan and 0.02M sodium caprylate (Miles Inc.)) contributed to increased stability and titer in HSA-based viral formulations. It was also done to examine the possibilities. In these studies, bovine serum albumin (BSA, reagent grade material, powder form) and recombinant human albumin (rHA) were tested in different studies under different conditions. The recombinant human albumin used was Recombinan
t TM 25, which was produced in a yeast expression system by Centeon and is described above.

【０１０７】方法 ウイルス試料の調製： 他の実施例で使用したAd5CMVp53を、これらの実験でも使
用した。ＢＳＡ及びリコンブミン（RecombuminTM）研究の両方に対して、保存ウ
イルスを1:100で希釈して、試験配合物とし、異なる期間、種々の温度で保存し
、実施例1に記載したプラーク分析を使用して、ウイルス力価(感染性)について
試験した。配合物の調製： ＢＳＡ研究において、以下の３種類のウイルス配合物を調製し
た。 コントロール配合物：DPBS+10%グリセロール+0.5mM MgCl2+1.0mM CaCl2 ＨＳＡ配合物：DPBS+5%ＨＳＡ+0.5mM MgCl2+1.0mM CaCl2 ＢＳＡ配合物：DPBS+5%ＢＳＡ+0.5mM MgCl2+1.0mM CaCl2 [0107] methods Virus Sample preparation: The Ad5CMVp53 used in other examples, were used in these experiments. For both BSA and Recombumin ™ studies, stock virus was diluted 1: 100 into test formulations and stored at different temperatures for different periods of time using the plaque assay described in Example 1. And tested for virus titer (infectivity). Formulation Preparation: In the BSA study, the following three virus formulations were prepared. Control formulation: DPBS + 10% Glycerol + 0.5 mM MgCl 2 +1.0 mM CaCl 2 HSA formulation: DPBS + 5% HSA + 0.5 mM MgCl 2 +1.0 mM CaCl 2 BSA formulation: DPBS + 5% BSA + 0.5 mM MgCl 2 +1.0 mM CaCl 2

【０１０８】 この研究で使用したＢＳＡは、試薬級の材料であり、粉末形態であった。ウイル
ス原料は、1:100で希釈して各配合物とし、各2つのバイアルに分割した。1つの
バイアルは、2時間室温(20℃)で保存し、他のバイアルは、速度調節したフリー
ザー内で、−40℃で凍結させ、次いで解凍させ、そして、2時間、37℃で保存し
た。ウイルスプラーク試験は、実施例１に記載した用に行った。The BSA used in this study was a reagent grade material and was in powder form. The viral stock was diluted 1: 100 into each formulation and divided into two vials each. One vial was stored at room temperature (20 ° C) for 2 hours, the other vial was frozen at -40 ° C in a rate controlled freezer, then thawed and stored at 37 ° C for 2 hours. Viral plaque tests were performed as described in Example 1.

【０１０９】 リコンブミン研究では、以下の３種類の配合物を調製した。 コントロール配合物：DPBS+10%グリセロール ＨＳＡ配合物：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋5%ＨＳＡ(w/v)+5％蔗糖+150mM NaCl+2.0mM
MgCl2 (pH 8.2) リコンブミン配合物：10mMＴｒｉｓ＋5%リコンブミン(w/v) +5％蔗糖+150mM NaC
l +0.5mM MgCl2+2.0mM MgCl2 (pH 8.2)In the recombumin study, the following three formulations were prepared. Control formulation: DPBS + 10% Glycerol HSA formulation: 10 mM Tris + 5% HSA (w / v) + 5% sucrose + 150 mM NaCl + 2.0 mM
MgCl 2 (pH 8.2) Recombumin formulation: 10 mM Tris + 5% recombumin (w / v) + 5% sucrose + 150 mM NaC
l + 0.5mM MgCl 2 + 2.0mM MgCl 2 (pH 8.2)

【０１１０】 ウイルス原料は、１：１００に希釈して、各配合物とし、各３つのバイアルに
分割し、７日間、３７℃で保存した。ウイルスプラーク試験は、実施例１に記載
したように行った。結果及び検討 ＢＳＡ研究の結果から、ＢＳＡ配合物が、コントロール配合物のウイルス力価
と比較して、ＨＳＡ配合物で観察されたと同様に、ウイルス力価を増大したこと
が分かる（図９）。更に、同様な結果が、ＢＳＡ又はＨＳＡの代わりに、マウス
血清アルブミンを貯蔵配合物に使用した場合に、観察された（データ省略）。デ
ータは、また、ＨＳＡ、ＢＳＡ及びコントロール配合物が、凍結融解及び３７℃
で２時間までの貯蔵に付したウイルスに対して保護効果を有する考えられること
を示す（図９参照）。The viral stock was diluted 1: 100 into each formulation, divided into 3 vials each and stored at 37 ° C. for 7 days. The virus plaque test was performed as described in Example 1. Results and Discussion The results of the BSA study show that the BSA formulation increased virus titer as compared to that of the control formulation, similar to that observed with the HSA formulation (Figure 9). Moreover, similar results were observed when mouse serum albumin was used in the storage formulation instead of BSA or HSA (data not shown). The data also show that HSA, BSA and control formulations were freeze thawed and 37 ° C.
Shows that it may have a protective effect against viruses stored for up to 2 hours (see FIG. 9).

【０１１１】 リコンブミン研究の結果から、リコンブミン及びＨＳＡ配合物が、３７℃で１
週間保存したウイルスに対するウイルス力価への類似の保護効果を示すことが分
かる（図１０）。この保護効果は、４ logのウイルス力価減少が観察されたコン
トロール配合物では観察されなかった（図１０）。 この実施例の結果は、他の源（ウシ及び組換えヒト）からのアルブミンを含有
する配合物が、天然ＨＳＡ配合物で観察されるものと同一の安定性及びウイルス
力価増大を有することを示している。これらの研究は、また、市販ＨＳＡにおけ
る他の成分（0.02Ｍアセチルトリプトファン及び0.02Ｍカプリル酸ナトリウム）
が、ＨＳＡをベースとするウイルス配合物における安定性及び力価増大に貢献し
ないことを示す。From the results of the recombumin study, the recombumin and HSA formulations were
It can be seen that it shows a similar protective effect on virus titers against viruses stored for weeks (FIG. 10). This protective effect was not observed in the control formulation where a 4 log reduction in virus titer was observed (Figure 10). The results of this example show that formulations containing albumin from other sources (bovine and recombinant human) have the same stability and viral titer increase as observed with the native HSA formulation. Shows. These studies also show that other components in commercial HSA (0.02M acetyltryptophan and 0.02M sodium caprylate)
Do not contribute to the stability and titer increase in HSA-based viral formulations.

【０１１２】 実施例６：ＨＳＡ／蔗糖配合物における、−７０℃、−２０℃、＋４℃及び＋２
０℃におけるアデノウイルスの長期安定性 上記の実施例１〜５の結果は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する液体
配合物が、他の賦形剤を含有する配合物に比べて、アデノウイルスベクターに対
する優れた安定化を提供することを示している。この実施例の目的は、8.5箇月
まで各種の温度で保存した場合に、10mMＴｒｉｓHCl+5％ＨＳＡ+5％蔗糖+150mM
NaCl+2mM MgCl2(ｐＨ8.4)におけるアデノウイルスベクターの安定性を決定する
ことであった。単純ヘルペスウイルスタイプチミジンキナーゼ遺伝子(AV1.0HSVT
K)を含有するアデノウイルスベクターをこの実施例で使用した。Example 6: -70 ° C, -20 ° C, + 4 ° C and +2 in HSA / sucrose formulation.
Long-Term Stability of Adenovirus at 0 ° C. The results of Examples 1-5 above demonstrate that liquid formulations containing human serum albumin (HSA) are compared to formulations containing adenovirus compared to formulations containing other excipients. It is shown to provide excellent stabilization for the vector. The purpose of this example is 10 mM TrisHCl + 5% HSA + 5% sucrose + 150 mM when stored at various temperatures for up to 8.5 months.
It was to determine the stability of the adenovirus vector in NaCl + 2 mM MgCl 2 (pH 8.4). Herpes simplex virus type thymidine kinase gene (AV1.0HSVT
The adenovirus vector containing K) was used in this example.

【０１１３】 この実施例は、10mＭTris HCl+5％ＨＳＡ+5％蔗糖+150mM NaCl+2mM MgCl2(ｐ
Ｈ8.4)を含有する配合物（配合物９）が、０（２日）、1.5、3.5及び8.5箇月、
４種類の保存温度でアデノウイルスベクターを保存する効率を要約する。この研
究は、−２０℃で凍結保存した場合、又は液体として＋４℃又は＋２０℃の保存
温度において、少なくとも１年の安定性を達成するアデノウイルスベクターの最
適配合物を決定するように企画したものである。This example demonstrates that 10 mM Tris HCl + 5% HSA + 5% sucrose + 150 mM NaCl + 2 mM MgCl 2 (p
The formulation containing H8.4) (Formulation 9) was 0 (2 days), 1.5, 3.5 and 8.5 months,
The efficiency of storing adenovirus vectors at four storage temperatures is summarized. This study was designed to determine the optimal formulation of adenovirus vector that achieves at least 1 year stability when stored frozen at -20 ° C or at + 4 ° C or + 20 ° C storage temperature as a liquid. Is.

【０１１４】方法 ウイルス試料の調製： DPBS+10%グリセロール、0.2μmフィルターにおける、サ
イトメガロウイルスプロモーターの制御下でのHSV-TK遺伝子を含有するタイプ5
アデノウイルス、AV1.0HSVTK(フランス特許出願番号FR93/13772に記載されてい
る)をこれらの試験において使用した。ウイルス力価は、1.6×1012粒子/mlと見
積もられた。研究の第1日目において、それぞれ、4.5mlの全量に対して、約200
〜250μl/バイアル含有する、AV1.0HSVTKの22種のバイアルを室温で解凍し、プ
ールした。OD測定を260nmで、プールした材料に対して行い、初めの粒子/mlを測
定した。 Methods Virus sample preparation: Type 5 containing the HSV-TK gene under control of the cytomegalovirus promoter in DPBS + 10% glycerol, 0.2 μm filter.
The adenovirus, AV1.0HSVTK (described in French Patent Application No. FR93 / 13772) was used in these studies. The virus titer was estimated to be 1.6 × 10 12 particles / ml. On the first day of the study, approximately 200 for each 4.5 ml total volume
Twenty-two vials of AV1.0HSVTK containing ˜250 μl / vial were thawed at room temperature and pooled. OD measurements were made at 260 nm on the pooled material to determine the initial particles / ml.

【０１１５】 AV1.0HSVTKウイルスプール原料を、リソース・キュー・カラム(Resource Q co
lumn)(バッファー交換について8mlのソース・キュー(Source Q)15;ファルマシア
カタログ番号17-0947-01、ロット11/21/97で調製し、10mMＴｒｉｓHCl、5％ＨＳ
Ａ、5％蔗糖、150mM NaCl、2mM MgCl2(ｐＨ8.4)に再配合した)(配合19)を通過さ
せた。このバッファー交換工程で使用した全ての溶液は、インラインデガッサー
で脱ガスし、ウイルス溶液は、充填前にアルゴンでパージした。材料は、ポリプ
ロピレンクリオバイアルにアリコートし、アルゴンでフラッシュして、バッファ
ーのヘッド空間から酸素を除去した。AV1.0HSVTK virus pool raw material was loaded into the resource queue column (Resource Q co
lumn) (8 ml Source Q for buffer exchange 15; Pharmacia Catalog No. 17-0947-01, prepared in lot 11/21/97, 10 mM TrisHCl, 5% HS
A, 5% sucrose, 150 mM NaCl, re-formulated in 2 mM MgCl 2 (pH 8.4)) (formulation 19). All solutions used in this buffer exchange step were degassed with an in-line degasser and virus solutions were purged with argon before filling. Material was aliquoted into polypropylene cryovials and flushed with argon to remove oxygen from the buffer headspace.

【０１１６】 試料は、次いで、-20℃(VWRサイエンティフィック・フリーザー)、+4℃(VWRサ
イエンティフィック・ツー・ドアー・デリーケースモデルGDM-49)、室温(+20℃)
及び-70℃(コントロール群)に置いた。3個の(triplicate)バイアルを、HPLCによ
り粒子一体性(particle integrity)について、及び8.5箇月までの特定の時期に
おけるプラーク分析によって活性について試験した。最終の希釈及び充填の後、
全ての試料を、2日間各所望の温度で保存し、T=0時点として試験して、ベースラ
イン情報を得た。-20℃貯蔵に対する試料は、調節された速度のフリーザーにお
いて-40℃で凍結してから-20℃で貯蔵した。+20℃の温度は、高温として使用し
、この温度で、+4℃に対するウイルス配合物の「加速」安定性を調べた。3個の
ウイルス試料及びポジティブコントロールは、0(2日間)、1.5、3.5及び8.5箇月
の間隔で、-20℃、+4℃及び+20℃において、ウイルス粒子一体性及びウイルス感
染性について試験した。プラーク形成単位(pfu)におけるウイルス力価は、293個
の細胞を使用するプラーク分析によって測定した。分析HPLC法を使用して、260n
mにおける光学濃度(OD)のピ.―ク面積によって、ウイルス粒子/ml測定値を決定
した。Samples were then -20 ° C (VWR Scientific Freezer), + 4 ° C (VWR Scientific Two Door Delhi Case Model GDM-49), room temperature (+ 20 ° C).
And placed at -70 ° C (control group). Triplicate vials were tested for particle integrity by HPLC and for activity by plaque assay at specific times up to 8.5 months. After the final dilution and filling
All samples were stored for 2 days at each desired temperature and tested as T = 0 time point to obtain baseline information. Samples for -20 ° C storage were frozen at -40 ° C in a controlled rate freezer and then stored at -20 ° C. A temperature of + 20 ° C was used as an elevated temperature at which the "accelerated" stability of the virus formulation to + 4 ° C was investigated. Three virus samples and positive controls were tested for virus particle integrity and virus infectivity at -20 ° C, + 4 ° C and + 20 ° C at 0 (2 days), 1.5, 3.5 and 8.5 months intervals. . Viral titers in plaque forming units (pfu) were determined by plaque analysis using 293 cells. 260n using analytical HPLC method
Viral particle / ml measurements were determined by the peak area of the optical density (OD) at m.

【０１１７】ポジティブコントロールウイルス配合物 コントロールのウイルスを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％ ＨＳＡ、５％ 蔗糖、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．４（配合物１９
）中で希釈して試験サンプル配合物を模倣し、これを０．４ｍｌ／クリオバイア
ル（cryovial）（Nalgene No. 5000-0020, ロット072381）に等分し、−７０℃
（BioFreezer, Forma Scientific Model No. 8328）で保存した。三重のウイル
スサンプル及びポジティブコントロールを、ウイルス粒子の完全性及びウイルス
感染性に関して、−７０℃下での０（２日間）、１．５、３．５及び８．５月間
の間隔で試験した。プラーク形成単位（ｐｆｕ）におけるウイルス力価を、２９
３細胞を使用したプラーク分析により決定した。分析用ＨＰＬＣ法を使用し、吸
光度（ＯＤ）２６０ｎｍにおけるピーク面積により、ウイルス粒子／ｍｌ測定値
を決定した。 Positive Control Virus Formulation Control virus was treated with 10 mM Tris-HCl, 5% HSA, 5% sucrose, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , pH 8.4 (Formulation 19).
)) To mimic the test sample formulation and aliquot this into 0.4 ml / cryovial (Nalgene No. 5000-0020, lot 072381) at -70 ° C.
(BioFreezer, Forma Scientific Model No. 8328). Triplicate virus samples and positive controls were tested for integrity of virus particles and viral infectivity at intervals of 0 (2 days), 1.5, 3.5 and 8.5 months under -70 ° C. The virus titer in plaque forming units (pfu) was determined to be 29
Determined by plaque analysis using 3 cells. Analytical HPLC method was used to determine virus particle / ml measurements by peak area at absorbance (OD) 260 nm.

【０１１８】プラーク分析の解析 ウイルス力価は、２９３個の細胞、剪断したヒトＡｄ５ ＤＮＡ（相補的Ｅ１
領域）で形質転換したヒト胚性腎細胞についてのプラーク分析により決定した。
指定した時点で、三重の試験サンプル及びポジティブコントロールを、実施例１
と同様にしてプラーク形成単位について試験した。 Analysis of plaque analysis The virus titer was 293 cells, sheared human Ad5 DNA (complementary E1
Region) and determined by plaque analysis on human embryonic kidney cells transformed.
At designated time points, triplicate test samples and positive controls were run in Example 1
And tested for plaque forming units.

【０１１９】ＨＰＬＣ分析 ＨＰＬＣピーク領域の比較を行い、サンプルとポジティブコントロールとの間
のウイルス粒子の点からのウイルス濃度を決定した。それぞれの三重サンプル及
びポジティブコントロールを、実施例１と同様にしてミレニウム・ソフトウェア
を用いたウォータース分析用ＨＰＬＣシステムにおいて試験した。 HPLC analysis A comparison of the HPLC peak areas was performed to determine the virus concentration in terms of virus particles between the sample and the positive control. Each triplicate sample and positive control were tested in a Waters analytical HPLC system using Millenium software as in Example 1.

【０１２０】結果と考察 プラーク分析の結果 −７０℃、−２０℃、＋４℃及び＋２０℃におけるアデノウイルスＡＶ１．０
ＨＳＶＴＫの安定性についてのプラーク分析の結果を図１１に示す。ＡＶ１．０
ＨＳＶＴＫのウイルス活性を、０（２日間）、１．５、３．５及び８．５ヶ月間
の保存の後に、実施例１に記載のプラーク形成分析を使用して測定した。保存温
度＋４℃及び−２０℃のサンプルはともに、全ての試験した時点において、−７
０℃のポジティブコントロールと比較して同様のウイルス活性を維持した（図１
１）。室温条件下での結果は、対数で約２の有意な低下（ｐ＝０．０２）を示し
た。その他全ての保存条件は、分析の誤差限度（対数で±０．５）の範囲内のウ
イルス活性を維持した。 Results and Discussion Results of plaque analysis Adenovirus AV1.0 at -70 ° C, -20 ° C, + 4 ° C and + 20 ° C.
The results of plaque analysis for HSVTK stability are shown in FIG. AV 1.0
The viral activity of HSVTK was measured using the plaque formation assay described in Example 1 after storage for 0 (2 days), 1.5, 3.5 and 8.5 months. Samples at storage temperatures + 4 ° C and -20 ° C were both -7
Similar viral activity was maintained compared to the 0 ° C. positive control (FIG. 1
1). Results at room temperature showed a significant log reduction of about 2 (p = 0.02). All other storage conditions maintained viral activity within the analytical error limits (± 0.5 log).

【０１２１】ＨＰＬＣの結果 ＨＰＬＣピーク領域は、ウイルス粒子の定量化を提供する。ＨＰＬＣ分析の変
動は±３％であると決定した。ＨＰＬＣピーク領域における標準偏差は小さいた
め、測定時点間の小さい変動は統計学的に有意であろう。全４つの保存温度につ
いて、ＨＰＬＣピーク領域を時間に対してプロットした。粒子の完全性について
ＨＰＬＣによる分析を行った後、試験及びコントロールサンプルを０（２日間）
、１．５、３．５及び８．５ヶ月間保存した。結果は、−２０℃、＋４℃及び＋
２０℃の保存条件はすべて、−７０℃で８．５ヶ月間の保存と同様のウイルス粒
子を維持した（データ省略）。 HPLC Results The HPLC peak area provides quantification of viral particles. The HPLC analysis variation was determined to be ± 3%. Since the standard deviation in the HPLC peak area is small, small variations between measurement time points will be statistically significant. The HPLC peak areas were plotted against time for all four storage temperatures. Test and control samples were tested for 0 (2 days) after analysis by HPLC for particle integrity.
, 1.5, 3.5 and 8.5 months. The results are -20 ° C, + 4 ° C and +
All the storage conditions of 20 ° C maintained the same virus particles as those stored at -70 ° C for 8.5 months (data not shown).

【０１２２】 要約すると、ＨＰＬＣの結果は、各保存温度についてのプラーク分析と同様の
安定性傾向を示した。配合物１９は、−７０℃、−２０℃、＋４℃及び＋２０℃
で保存したとき、アデノウイルスの力価を少なくとも８．５ヶ月間維持した。興
味深いことに、ＨＰＬＣの結果は、プラーク分析の結果によって実証された８．
５ヶ月後における室温条件下での活性の喪失を示唆しなかった（図１１）。 この研究結果は、配合物１９（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５
％ ＨＳＡ、５％ 蔗糖、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が、ウ
イルスの活性及び粒子の完全性を、４つの保存温度下、測定した８．５ヶ月の間
適切に維持するのに有効であることを明確に証明している。プラーク分析（図１
１）及びＨＰＬＣデータはこの結論を支持している。粒子の完全性についての試
験及び活性の力価から得られた結果は、凍結（−２０℃）及び冷蔵（＋４℃）条
件下で少なくとも８．５ヶ月間までウイルス安定性が維持されることを示してい
る。In summary, the HPLC results showed a stability trend similar to the plaque analysis for each storage temperature. Formulation 19 is -70 ° C, -20 ° C, + 4 ° C and + 20 ° C.
Adenovirus titers were maintained for at least 8.5 months when stored at. Interestingly, the HPLC results were substantiated by the results of plaque analysis 8.
There was no suggestion of loss of activity under room temperature conditions after 5 months (Fig. 11). The results of this study show that formulation 19 (10 mM Tris-HCl, pH 8.4, 5,
% HSA, 5% sucrose, 2 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl) is effective in maintaining virus activity and particle integrity adequately under the four storage temperatures for the measured 8.5 months. Is clearly proved. Plaque analysis (Fig. 1
1) and HPLC data support this conclusion. The results obtained from the tests for particle integrity and activity titers show that viral stability is maintained under frozen (-20 ° C) and refrigerated (+ 4 ° C) conditions for at least 8.5 months. Shows.

【０１２３】 しかしながら、配合物１９中、室温下で保存したとき、ウイルス活性は低下した
。一方、ウイルスの完全性は低下しなかった。それゆえ、５％ ヒト血清アルブ
ミン及び５％ 蔗糖を含むｐＨ８．４の配合物１９は、アデノウイルス粒子の完
全性及びウイルス活性を、冷蔵条件下で少なくとも８．５ヶ月の間効果的に維持
及び安定化する。However, the virus activity was reduced in formulation 19 when stored at room temperature. On the other hand, the integrity of the virus was not reduced. Therefore, formulation 19 at pH 8.4 containing 5% human serum albumin and 5% sucrose effectively maintained the integrity and viral activity of adenovirus particles under refrigerated conditions for at least 8.5 months. Stabilize.

【０１２４】 本発明の範囲は、明細書に記載した特定の態様によって限定されるものではな
い。実際、本明細書及び図面の記載から、本明細書の記載に加えて種々の修飾が
できることが当業者にとって明らかであろう。そのような修飾も請求の範囲に含
まれることが意図される。 更に核酸又はポリペプチドについて与えられた全ての塩基の大きさ、アミノ酸
の大きさ及び全ての分子量が概算値であり、それが明細書に記載されていること
が理解されるだろう。 本明細書で引用した種々の刊行物及びその開示内容の全体が、参照することに
より組み込まれる。The scope of the invention is not limited by the particular embodiments described herein. In fact, it will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification and the drawings that various modifications can be made in addition to the description of the present specification. Such modifications are also intended to fall within the scope of the claims. It will be further understood that all base sizes, amino acid sizes and all molecular weights given for nucleic acids or polypeptides are approximate and are described in the specification. The various publications cited herein and their disclosures in their entireties are incorporated by reference.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 プラーク分析４種の配合物の＋４℃貯蔵。[Figure 1]   Plaque analysis + 4 ° C storage of 4 formulations.

【図２】 プラーク分析４種の配合物の＋２０℃貯蔵。[Fig. 2]   Plaque analysis + 20 ° C storage of 4 formulations.

【図３】 生理活性分析４種の配合物の＋４℃生理活性。[Figure 3]   Bioactivity analysis + 4 ° C bioactivity of 4 formulations.

【図４】 生理活性分析４種の配合物の＋２０℃生理活性。[Figure 4]   Bioactivity analysis + 20 ° C bioactivity of 4 formulations.

【図５】 −２０℃におけるウイルス力価に及ぼすＨＳＡ及び蔗糖の効果。[Figure 5]   Effect of HSA and sucrose on virus titer at -20 ° C.

【図６】 ＋２〜１０℃におけるウイルス力価に及ぼす緩衝液、塩及び／又はカチオンの
効果。FIG. 6: Effect of buffers, salts and / or cations on virus titers at + 2-10 ° C.

【図７】 ＋２〜１０℃におけるウイルス力価に及ぼすＨＳＡの効果。[Figure 7]   Effect of HSA on virus titer at + 2-10 ° C.

【図８】 種々のｐＨで１週間貯蔵した配合物４のＡｄＣＭＶｐ５３の活性。[Figure 8]   AdCMVp53 activity of Formulation 4 stored for 1 week at various pH.

【図９】 ウイルス配合物におけるＨＳＡとＢＳＡの比較。[Figure 9]   Comparison of HSA and BSA in virus formulations.

【図１０】 種々の配合物における３７℃で１週間の安定性。[Figure 10]   One week stability at 37 ° C in various formulations.

【図１１】 −７０℃、−２０℃、＋４℃、及び＋２０℃で、1.5、3.5、及び8.5ヶ月間貯
蔵した配合物１９のＡＶ1.0ＨＳＶＴＫの安定性。FIG. 11: AV 1.0 HSVTK stability of Formulation 19 stored at −70 ° C., −20 ° C., + 4 ° C., and + 20 ° C. for 1.5, 3.5, and 8.5 months.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 マクグレノン カレン アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94089 サニーヴェイル レイクウッド ドライヴ 827 (72)発明者 ムーディ デューイ アメリカ合衆国 ワシントン州 98119− 3419 シアトル トゥエンティシックスス アベニュー ウェスト 2520 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 DA20 EA02 HA17 4C076 AA12 BB11 CC29 DD38 DD67 FF36 4C084 AA02 AA13 BA22 CA36 MA02 MA05 MA17 NA03 ZA01 ZA36 ZB26 4C087 AA01 BB64 BB65 BC83 CA12 MA02 MA05 MA66 NA03 ZA01 ZA36 ZB26 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 25/00 A61P 35/00 35/00 A61K 35/76 C12N 15/09 C12N 15/00 A // A61K 35/76 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, B , BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD , SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor McGlennon Karen Earl, USA 94089 Sunnyvale Lake Wood Drive 827 (72) Inventor Moody Dewey Washington, USA 98119-3419 Seattle Twenty Sixth Avenue West 2520 F Term (Reference) 4B024 AA01 BA80 CA01 DA20 EA02 H A17 4C076 AA12 BB11 CC29 DD38 DD67 FF36 4C084 AA02 AA13 BA22 CA36 MA02 MA05 MA17 NA03 ZA01 ZA36 ZB26 4C087 AA01 BB64 BB65 BC83 CA12 MA02 MA05 MA66 NA03 ZA01 ZA36 ZB26

Claims (33)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 組換えアデノウイルスベクターとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を含む組成物であって、ＨＳＡの濃度が、水性バッファー中、水の凝固点より高
い温度で前記アデノウイルスベクターを安定化させるか、アデノウイルスベクタ
ーの力価をＨＳＡの不存在下の力価と比較して高めるか、あるいはその両者に有
効な濃度である組成物。1. A recombinant adenovirus vector and human serum albumin (HSA)
The composition of claim 1, wherein the concentration of HSA stabilizes the adenovirus vector in an aqueous buffer at a temperature above the freezing point of water, or the titer of the adenovirus vector becomes Compositions that are effective in comparison, either at elevated levels or both. 【請求項２】 ＨＳＡの濃度が約０．０１％〜約２５％（ｗ／ｖ）である、請求
項１記載の組成物。2. The composition of claim 1, wherein the concentration of HSA is about 0.01% to about 25% (w / v). 【請求項３】 ＨＳＡの濃度が約０．１％〜約１５％である、請求項２記載の組
成物。3. The composition of claim 2, wherein the concentration of HSA is about 0.1% to about 15%. 【請求項４】 ＨＳＡの濃度が約１％〜約１０％である、請求項３記載の組成物
。4. The composition of claim 3, wherein the concentration of HSA is about 1% to about 10%. 【請求項５】 ＨＳＡの濃度が約５％である、請求項４記載の組成物。5. The composition of claim 4, wherein the concentration of HSA is about 5%. 【請求項６】 ｐＨが５．０以上９．０以下である、請求項１記載の組成物。6. The composition according to claim 1, which has a pH of 5.0 or more and 9.0 or less. 【請求項７】 ｐＨが７．５より高い、請求項６記載の組成物。7. The composition of claim 6 having a pH of greater than 7.5. 【請求項８】 ｐＨが８．０より高い、請求項７記載の組成物。8. The composition according to claim 7, wherein the pH is higher than 8.0. 【請求項９】 ｐＨが８．２である、請求項８記載の組成物。9. The composition of claim 8 having a pH of 8.2. 【請求項１０】 ｐＨが８．４である、請求項８記載の組成物。10. The composition of claim 8 having a pH of 8.4. 【請求項１１】 ｐＨが８．０より高い、請求項４記載の組成物。11. The composition according to claim 4, wherein the pH is above 8.0. 【請求項１２】 ｐＨが８．２である、請求項５記載の組成物。12. The composition according to claim 5, having a pH of 8.2. 【請求項１３】 ｐＨが８．４である、請求項５記載の組成物。13. The composition of claim 5 having a pH of 8.4. 【請求項１４】 バッファーがTris-HClバッファーである、請求項１記載の組成
物。14. The composition of claim 1, wherein the buffer is Tris-HCl buffer. 【請求項１５】 バッファーがTris-HClバッファーである、請求項１１記載の組
成物。15. The composition of claim 11, wherein the buffer is Tris-HCl buffer. 【請求項１６】 バッファーがTris-HClバッファーである、請求項１２記載の組
成物。16. The composition of claim 12, wherein the buffer is Tris-HCl buffer. 【請求項１７】 バッファーがTris-HClバッファーである、請求項１３記載の組
成物。17. The composition of claim 13, wherein the buffer is Tris-HCl buffer. 【請求項１８】 更に、約５％蔗糖、約２．０ｍＭＭｇＣｌ2及び約１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む、請求項１記載の組成物。18. Further, about 5% sucrose, about 2.0 mM MgCl 2 and about 150 mM.
The composition of claim 1 comprising NaCl. 【請求項１９】 更に、約５％蔗糖、約２．０ｍＭＭｇＣｌ2及び約１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む、請求項１５記載の組成物。19. Further, about 5% sucrose, about 2.0 mM MgCl 2 and about 150 mM.
16. The composition of claim 15, comprising NaCI. 【請求項２０】 更に、約５％蔗糖、約２．０ｍＭＭｇＣｌ2及び約１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む、請求項１６記載の組成物。20. Further, about 5% sucrose, about 2.0 mM MgCl 2 and about 150 mM.
17. The composition of claim 16, comprising NaCI. 【請求項２１】 更に、約５％蔗糖、約２．０ｍＭＭｇＣｌ2及び約１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む、請求項１７記載の組成物。21. Further, about 5% sucrose, about 2.0 mM MgCl 2 and about 150 mM.
18. The composition of claim 17, comprising NaCI. 【請求項２２】 組換えアデノウイルスが異種蛋白質を発現する、請求項１記載
の組成物。22. The composition of claim 1, wherein the recombinant adenovirus expresses a heterologous protein. 【請求項２３】 異種蛋白質がｐ５３である、請求項２２記載の組成物。23. The composition of claim 22, wherein the heterologous protein is p53. 【請求項２４】 異種蛋白質がＨＳＶ−ＴＫである、請求項２２記載の組成物。24. The composition of claim 22, wherein the heterologous protein is HSV-TK. 【請求項２５】 水の凝固点より高い温度でアデノウイルスベクターを安定化さ
せるか、又はアデノウイルスベクターの力価をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の
不存在下の力価と比較して高めるのに有効な濃度のＨＳＡを含む水性バッファー
に組換えアデノウイルスを懸濁する工程を含む、安定化された組換えアデノウイ
ルス配合物を製造する方法。25. Effective for stabilizing an adenovirus vector at temperatures above the freezing point of water, or for increasing the titer of an adenovirus vector relative to its titer in the absence of human serum albumin (HSA). A method of producing a stabilized recombinant adenovirus formulation comprising suspending the recombinant adenovirus in an aqueous buffer containing various concentrations of HSA. 【請求項２６】 温度が、４℃以上３７℃より低い、請求項２５記載の方法。26. The method of claim 25, wherein the temperature is 4 ° C or higher and lower than 37 ° C. 【請求項２７】 温度が、２０℃以上である、請求項２５記載の方法。27. The method according to claim 25, wherein the temperature is 20 ° C. or higher. 【請求項２８】 ＨＳＡの濃度が５％である、請求項２６記載の方法。28. The method of claim 26, wherein the concentration of HSA is 5%. 【請求項２９】 混合物のｐＨが８．０より高い、請求項２６記載の方法。29. The method of claim 26, wherein the pH of the mixture is above 8.0. 【請求項３０】 混合物のｐＨが８．２である、請求項２６記載の方法。30. The method of claim 26, wherein the pH of the mixture is 8.2. 【請求項３１】 混合物のｐＨが８．４である、請求項２６記載の方法。31. The method of claim 26, wherein the pH of the mixture is 8.4. 【請求項３２】 ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水、約５％〜１５％のグリ
セロール、約０．２５〜２．０ｍＭＣａＣｌ2及び約０．１〜１．０ｍＭＭｇＣ
ｌ2を含む水性組成物とアデノウイルスベクターの混合物を製造する工程を含む
、約２０℃でアデノウイルスベクターを安定化する方法。32. Dulbecco's phosphate buffered saline, about 5% to 15% glycerol, about 0.25 to 2.0 mM CaCl 2 and about 0.1 to 1.0 mM MgC.
comprising the step of preparing a mixture of an aqueous composition and an adenoviral vector comprising a l 2, a method for stabilizing the adenoviral vector at about 20 ° C.. 【請求項３３】 グリセロール濃度が約１０％、ＣａＣｌ2濃度が約１．０ｍＭ
、及びＭｇＣｌ2濃度が約０．５ｍＭである請求項３２記載の方法。33. Glycerol concentration of about 10%, CaCl 2 concentration of about 1.0 mM
33. and the concentration of MgCl 2 is about 0.5 mM.
JP2000565112A 1998-08-14 1999-08-13 Adenovirus formulations for gene therapy Abandoned JP2003528029A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9660098P 1998-08-14 1998-08-14
US60/096,600 1998-08-14
PCT/US1999/018515 WO2000009675A1 (en) 1998-08-14 1999-08-13 Adenovirus formulations for gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003528029A true JP2003528029A (en) 2003-09-24

Family

ID=22258141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000565112A Abandoned JP2003528029A (en) 1998-08-14 1999-08-13 Adenovirus formulations for gene therapy

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1109896A4 (en)
JP (1) JP2003528029A (en)
AU (1) AU748523B2 (en)
CA (1) CA2340682A1 (en)
MX (1) MXPA01001727A (en)
WO (1) WO2000009675A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012529440A (en) * 2009-06-09 2012-11-22 デフィルス、インコーポレイテッド Interferon administration to prevent or treat pathogen infection

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040101964A1 (en) * 2000-05-10 2004-05-27 Shigemitsu Takashima Method of preparing virus vector
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US7229774B2 (en) 2001-08-02 2007-06-12 Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
WO2003057916A2 (en) 2002-01-09 2003-07-17 Riken Cancer profiles
JP2007516693A (en) 2003-06-09 2007-06-28 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cancer
JP2008505853A (en) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド Non-natural ribonuclease complex as a cytotoxic agent
US7858323B2 (en) 2004-06-09 2010-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Phage microarray profiling of the humoral response to disease
JP2008546387A (en) 2005-06-13 2008-12-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
CA2814598A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 The Regents Of The University Of Michigan Recurrent gene fusions in prostate cancer
US8652467B2 (en) 2005-10-14 2014-02-18 The Regents Of The University Of Michigan Dek protein compositions and methods of using the same
US7794951B2 (en) 2005-10-18 2010-09-14 University Of Massachusetts Medical School SREBP2gc transcription factors and uses thereof
JP5368798B2 (en) 2005-10-31 2013-12-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
EP2044097A4 (en) 2006-06-23 2010-10-06 Quintessence Biosciences Inc Modified ribonucleases
US8298801B2 (en) 2006-07-17 2012-10-30 Quintessence Biosciences, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
US20090324596A1 (en) 2008-06-30 2009-12-31 The Trustees Of Princeton University Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers
US10745701B2 (en) 2007-06-28 2020-08-18 The Trustees Of Princeton University Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers
CA2814246A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Solute carrier family 45 member 3 (slc45a3) and erg family gene fusions in prostate cancer
WO2009026152A1 (en) 2007-08-16 2009-02-26 The Regents Of The University Of Michigan Metabolomic profiling of prostate cancer
US8193151B2 (en) 2008-04-25 2012-06-05 Northwestern University Methods for treating atrial or ventricular arrhythmias
US8518884B2 (en) 2008-04-25 2013-08-27 Northwestern University Methods for treating atrial or ventricular arrhythmias by administering a G-protein alpha inhibitor
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
US8551789B2 (en) 2010-04-01 2013-10-08 OncoMed Pharmaceuticals Frizzled-binding agents and their use in screening for WNT inhibitors
US8029782B2 (en) 2008-10-01 2011-10-04 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic ribonucleases
JP2012514475A (en) 2009-01-09 2012-06-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Reproducible gene fusions in cancer
TWI535445B (en) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Wnt antagonists and methods of treatment and screening
EP3450979A3 (en) 2010-03-17 2019-04-24 The Regents of The University of Michigan Using phage epitopes to profile the immune response
WO2013001372A2 (en) 2011-06-30 2013-01-03 University Of Oslo Methods and compositions for inhibition of activation of regulatory t cells
EP2729173B1 (en) 2011-07-06 2016-06-15 Sykehuset Sorlandet HF Egfr targeted therapy
BR112014019431A8 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Global Bio Therapeutics Usa Inc COMPARTMENTALIZED METHOD OF DELIVERY OF NUCLEIC ACID AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP2911691B1 (en) 2012-10-23 2018-10-10 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
EA037709B1 (en) 2012-12-21 2021-05-13 Сюкехюсе Сёрланне Хф Method for treatment of neurological pain
JP2016510411A (en) 2013-02-04 2016-04-07 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Methods and monitoring of treatment with WNT pathway inhibitors
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
PT3436593T (en) 2016-03-28 2023-01-31 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Methods of heat inactivation of adenovirus
US11091795B2 (en) 2016-07-11 2021-08-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
WO2018140630A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Northwestern University Autophagy inducers for treatment of cns conditions
WO2019103967A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cancer
CN110960484A (en) * 2019-11-05 2020-04-07 深圳市天达康基因工程有限公司 Recombinant adenovirus sustained-release preparation, preparation method and application thereof
CN110772477A (en) * 2019-11-05 2020-02-11 深圳市天达康基因工程有限公司 Recombinant adenovirus sustained-release hydrogel, preparation method and application thereof
AU2021324670A1 (en) 2020-08-11 2023-02-02 Musculoskeletal Transplant Foundation Method for treating cardiac conditions with placenta-derived compositions

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3783098A (en) * 1971-08-10 1974-01-01 Cornell Res Foundation Inc Highly potent,viable and stable cellfree virus preparations from cells infected with cell-associated viruses and method for obtaining the same
US4000256A (en) * 1975-04-30 1976-12-28 Merck & Co., Inc. Varicella vaccine and process for its preparation
US4824668A (en) * 1987-03-09 1989-04-25 Sterwin Laboratories Inc. Attenuated infectious bursal disease virus strain and vaccine therefrom
DE3919393A1 (en) * 1989-06-14 1990-12-20 Hoechst Ag METHOD FOR STABILIZING SOLUBLE-IMMOBILIZED BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES
US5994314A (en) * 1993-04-07 1999-11-30 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung
JP3770333B2 (en) * 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 Recombinant DNA virus and method for producing the same
CA2184132C (en) * 1995-09-21 2011-03-15 Kristina J. Hennessy An adjuvanted vaccine which is substantially free of non-host albumin

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012529440A (en) * 2009-06-09 2012-11-22 デフィルス、インコーポレイテッド Interferon administration to prevent or treat pathogen infection

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000009675A9 (en) 2000-08-03
MXPA01001727A (en) 2001-11-27
AU5485899A (en) 2000-03-06
CA2340682A1 (en) 2000-02-24
WO2000009675A1 (en) 2000-02-24
EP1109896A1 (en) 2001-06-27
AU748523B2 (en) 2002-06-06
EP1109896A4 (en) 2005-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003528029A (en) Adenovirus formulations for gene therapy
JP7479068B2 (en) Prescription of Neuregulin Preparations
JP5597271B2 (en) VEGF antagonist preparation suitable for intravitreal administration
KR101752508B1 (en) Factor viii formulations
US20100183560A1 (en) Angiogenesis-modulating compositions and uses
JP6181375B2 (en) Method for reducing aggregation of IL-1ra
US20070191273A1 (en) Modulation of angiogenesis
US20060287234A1 (en) Wound healing
JP6078129B2 (en) Stable MIA / CD-RAP formulation
ES2770073T3 (en) Therapeutic use of bone morphogenetic proteins
JP2005515245A (en) Stabilized formulation of adenovirus
US7846428B2 (en) Articular cartilage gene therapy with recombinant vector encoding BMP-7
TW201438763A (en) Recombinant VWF formulations
KR20220139456A (en) Stabilized liquid and lyophilized adamts13 formulations
CN114728049A (en) Adeno-associated virus vector pharmaceutical compositions and methods
BR112019014004A2 (en) METHOD OF SUPPLYING TRANSGENE, TABLET OR CAPSULE, METHOD OF PREPARING VIRAL PARTICLES AND PRODUCT
PT2720710E (en) Freeze-dried formulations of fgf-18
JP2002507546A (en) Therapeutic use of keratinocyte growth factor-2
CN115554418B (en) Pharmaceutical composition of recombinant adeno-associated virus vector and application thereof
CZ20013813A3 (en) Use of defective recombinant adenovirus vector containing nucleic acid encoding angiogenic factor for preparing a medicament intended for treating lung hypertension
CA3101688A1 (en) Pharmaceutical compositions for treating acid sphingomyelinase deficiency
US20030220253A1 (en) Inhibitors for use in hemostasis
CN115297838A (en) Formulations of anti-endothelial lipase antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060627

A762 Written abandonment of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762

Effective date: 20071019

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20071019