JP2003525061A - 高効力組換え抗体およびその産生法 - Google Patents
高効力組換え抗体およびその産生法Info
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Abstract
Description
252号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれて
いる。
にこのような抗体を用いる方法に関する。
染性微生物によって引き起こされる疾病の予防および処置のために開発されてい
る。
ル抗体の開発である。この方法の一つの欠点は、マウスあるいはラットの抗体よ
りもヒト抗体を産生する必要があり、したがって、ヒト抗マウスあるいは抗ラッ
ト抗体応答の発生を最小限にしなければならず、その結果更なる免疫異常を引き
起こす可能性があるということであった。
ウス重鎖および軽鎖可変部をコード化する遺伝子がヒト重鎖および軽鎖定常部の
遺伝子と結合したヒト−マウスキメラ抗体を産生することである。例として、ヒ
ト化抗RSV抗体が調製され、現在販売されている(ジョンソン、アメリカ合衆
国特許番号5824307号参照)。
ヒト化”抗体を提供するために、同様の特異性を持ったヒト抗体から相対的に置
かれたアミノ酸に置換されるマウス枠組み構造アミノ酸(抗体の可変部内である
がCDRs以外のアミノ酸)のいくつかを伴って、ヒト定常部および枠組み構造
領域に移植される(例として、クィーン、アメリカ合衆国特許番号569376
1号および5693762号参照)。しかし、このような抗体は完全なマウスC
DR領域を含み、混合効果および107から108M−1より低い親和性の提示
が見出されている。
能力などの高い生物学的活性を持つ抗体)の産生は、より少ない量の抗体で望ま
しい臨床効果を得て、それにより費用を削減することを要求するより実践的な見
地からだけでなく、そのような抗体の中和能力の観点からも望ましいであろう。
数はしばしば、抗原抗体複合体解離の速度定数(“Koff”値と示す)に対す
る抗原抗体複合体形成の速度定数(“Kon”値)の割合によって算出される。
本発明にしたがって、抗体効力は、特異性に関係なくKon値の関数であると定
められている。したがって、本発明は、Kon値が高いほど抗体効力が高い高抗
体効力の獲得、それによる高効力抗体の産生およびそれを産生する方法の問題に
対する解決法を提供する。
体が提供される。もう一つの見地において、抗体の効力は、抗原抗体複合体形成
の速度定数(“Kon”値)の増加により強まる。
疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低2.5×105M−1s −1 、好ましくは最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5
×105M−1sec−1のKon値を持つ。この抗体はまた高い親和性(最低
約109M−1)を持つであろう。
的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低2.5×105M−1s−1 、好ましくは最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5×1
05M−1sec−1のKon値を持つ。この抗体はまた高い親和性(最低約1
09M−1)を持つであろう。
の抗原に対するKon値を増加させることにより中和抗体の効力を高める方法を
提供することである。
が既知の抗体の最低2から10倍であるように調製するための、抗体をスクリー
ニングする方法を提供することである。
×105M−1sec−1のKon値を持つ抗体を産生することである。
系の感染を引き起こすもの、最も特にはウイルスにより提示される一つあるいは
それ以上の抗原に対する高い特異性を持つ高親和性、高効力抗体を提供すること
である。
み構造領域(FR)を持つ(この抗体と同一の特異性を持つ)抗体を提供する。
しかしここで、そのポリペプチド構造は、一つあるいはそれ以上のCDRs(あ
るいは相補性決定領域)内に一つあるいはそれ以上の異なるアミノ酸を含む。一
つの好ましい実施例において、本発明の抗体は、L1、L2、L3、H1、H2
およびH3を含む一つまたはそれ以上のCDRsの配列においてのみ、図1また
は2の抗体(これ以降、“基本構造”あるいは“参照構造”)とは異なる。一つ
の好ましい配列は図3に示す。
ある。ここで前記抗体は薬理学的許容担体、希釈剤あるいは賦形剤中に懸濁され
る。
起こされるような疾病を予防およびまたは処置する方法を提供することである。
前記方法は、前記疾病の危険にある、あるいはそれに苦しむ患者に、治療上効果
的な量のここに開示された抗体を含む合成物を投与することより成る。
体が提供される。もう一つの見地において、抗体の効力は、その抗体のCDR配
列を高効力CDR配列と置き換えることによる抗原抗体複合体形成の速度定数の
増加により強まり、それは“Kon”値として示される。
疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低2.5×105M−1s −1 、好ましくは最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5
×105M−1sec−1のKon値を持つ。この抗体はまた高い親和性(最低
約109M−1)を持つであろう。
持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低2.5×105M−1s−1、好まし
くは最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5×105M− 1 sec−1のKon値を持つ。この抗体はまた高い親和性(最低約109M− 1 )を持つであろう。
×105M−1sec−1、最も好ましくは最低約7.5×105M−1s−1 のKon値を持つ中和あるいは非中和抗体を産生する方法に向けられる。
り、その活性断片を含む抗体を産生することが可能であり、それにより、抗体の
ポリペプチド構造中に見られる特異的なアミノ酸配列をコード化する遺伝子配列
を発生させることができる。これは、異なる種あるいは源由来の中和抗体に特有
の配列を持つ抗体の迅速な産生を可能にしてきた。
れる同様の全体的な3次元構造を持つ。ここで、通常その分子は、2本の軽(L
)アミノ酸鎖および2本の重(H)アミノ酸鎖から成る。両鎖は、構造において
相補的な抗原標的と相互作用可能な領域を持つ。標的と相互作用する領域は“可
変”あるいは“V”領域と示され、抗原特異性の異なる抗体とはアミノ酸配列が
異なるという特徴を持つ。
ノ酸配列を含む。これらの配列内には、特異性の異なる抗体間での極端な可変性
のために“超可変”と呼ばれる小配列がある。この超可変領域は、“相補性決定
領域”あるいは“CDR”領域と呼ばれる。これらのCDR領域は、特定の抗原
性決定構造に対する抗体の基本特異性をもたらす。
軽鎖可変部内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置は、免疫グロブリン構造のア
ミノ酸配列内において同様の位置をとることが知られている。すべての抗体の可
変重鎖および軽鎖がそれぞれ3つのCDR領域を持ち、重鎖および軽鎖それぞれ
において、その他(L1、L2、L3、H1、H2、H3と称す)のCDR領域
と非連続である。認識されたCDR領域は、カバット他、J.Biol.Che
m.252巻:6609−6616ページ(1977年)に示されている。番号
の付された配列表は図1から3に示され、CDRsは下線が引かれ、番号はカバ
ットの配列表に従う。
存された部位)および、CDRsおよびいわゆる“枠組み構造領域”の双方から
成る可変部を含み、枠組み構造領域は可変部内のCDRs以外のアミノ酸配列を
構成する。
体の特異性および親和性である。特異性は、抗体が強く、あるいは最も強く結合
する特定のリガンドすなわち抗原構造を示す。親和性は、特定のリガンドに対す
る抗体の結合の強さの量的な程度を示し、“親和定数”という用語で表示される
。この親和定数は、結合あるいは解離定数のどちらかとして測定することが可能
であり、抗体−リガンド複合体に対する遊離リガンドおよび遊離抗体の平衡濃度
の割合で示す。ここで用いられたように、親和性は結合定数として得られる。
数と、Koffとして示される解離の速度定数を用いた、抗原抗体複合体形成の
反応速度論により測定される。この定数の測定は、この分野における通常の知識
を有する者が十分に行うことができる。抗体および対応する抗原は、複合体を形
成するために以下のように結合する:
す:
モル濃度を表す。温度、圧力およびイオン強度などの特定の条件下では、反応物
質の濃度の積に対する複合体の濃度の割合は一定である。抗体あるいは抗原(リ
ガンド)が飽和状態に達しない間は、各結合物質の濃度の変化が、上記反応式(
サインKaが一定)により規定された量まで、複合体(Ab−Ag)の濃度を変
化させる。この相互作用は、質量作用の法則に従って作用する。
たがって、全体量もまた親和性の測定に関する。したがって、半分量に反応が起
こった場合には、二倍量の複合体が形成されるであろう。これは各反応物質(A
bおよびAg)が2倍濃度であり、それによりほとんど4倍の複合体が形成され
るためである。逆に、希釈によりAb−Ag複合体の濃度は大きく減少し得る。
一般的に、抗原抗体相互作用の反応速度論は、この分野における通常の知識を有
する者に十分に知られている。
こで親和定数は、複合体の形成および解離に対する個々の速度定数の割合として
測定することができる:
なわち単位:M−1sec−1で測定される複合体形成反応である。Koff値
は、Ab−Ag複合体の解離に対する速度定数あるいは特異的反応速度であり、
単位sec−1で測定される。
BIAcoreプロトコルおよび装置を用いて測定された。
を持つ部位、断片およびまたは分節を含み、最低2.5×105M−1s−1、
好ましくは最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5×10 5 M−1s−1のKon値を持つ。
ポリペプチドに関して用いられる場合には、アミノ酸残基などの残基の連続した
配列を示し、前記配列はより大きい配列の集合を形成する。例として、ポリペプ
チドが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン等などの一般的なエ
ンドペプチダーゼで処置された場合には、この処置で生じたオリゴペプチドは、
当初のポリペプチドの部位、分節あるいは断片を示すであろう。このプロテアー
ゼは通常、ここに開示されたような抗体の断片を産生するために用いられるが、
その断片は、現在では産生したい特定ポリペプチドの直接クローニングあるいは
合成により、より容易に産生することができる。
て用いられるにあたって、“高効力”という用語は、約6nM(ナノモルあるい
は10−9モル)以下のEC50(すなわち以下に開示された微小中和分析にお
いて、OD450において最低50%の減少を示す有効濃度)による影響を受け
る効力を示す。本発明にしたがった抗体は中和することができる(ウイルスなど
の標的種の破壊を引き起こし、それによりウイルスによる負担を減少させる)。
一つの用法において中和をしない抗体は、別の異なる用法において中和すること
ができる。
、前記微生物に結合することで、前記微生物を中和することができる。本発明に
したがって、前記微生物は、最も多くはウイルス、バクテリアあるいは菌類であ
り、特に呼吸器疾患を引き起こす生物、最も好ましくはウイルスである。ここに
示された実施例において用いられる一つの特異的な例は、呼吸器合胞体ウイルス
(RSV)であり、別の例はパラインフルエンザウイルス(PIV)である。
も持ち得る(しかし通常、非中和性のビタキシンなどの抗体を含まない)(参照
:ウー他、Proc.Natl.Acad.Sci.95巻:6037から60
42ページ(1998年))。本発明の抗体はまた、その他の非中和反応に対す
る抗体をも含む。
前記毒素の生体代謝により産生される産物を含むがこれに限定されない、毒素産
物に対する特性を持つ。例として、本発明の高効力抗体は、コカインなどの習慣
性薬物の影響を無効にするか、あるいはそうでなければ改善することにおいて有
益であり得る。
和性を持ち、そしてここで前記高親和性は前記抗体の親和定数(Ka)で表され
、前記親和定数(Ka)は最低109M−1、好ましくは最低約1010M−1 、最も好ましくは最低約1011M−1である。
合に、高効力を示す。この分析において、高効力はEC50値により測定され、
通常約6.0nM(ナノモルあるいは10−9M)以下、好ましくは約3.0n
M以下、もっとも好ましくは約1.0nM以下のEC50を持つ。通常、EC5 0 が低いほど、効力あるいは生物学的活性は高い。
記高効力は、枠組み構造領域(FR)および相補性決定領域(CDRs)を構成
するアミノ酸配列により決定する。これらの抗体あるいはその活性断片は、その
アミノ酸配列内に高効力相補性決定領域(CDR)を持つ。本発明の高効力中和
抗体は、最低2つの高効力CDRsあるいは3つの高効力CDRs、もしくはさ
らに4つの高効力CDRsあるいは5つの高効力CDRsより成り、そしてさら
に6つの高効力CDRsより成ることもあり得る。もちろん、後者の場合は、抗
体あるいはその活性断片の6つのCDRs全てが高効力CDRsである。これに
したがって、このような本発明の高効力中和抗体は、軽鎖CDRsL1(CDR
L1)、L2(CDRL2)、およびL3(CDRL3)と重鎖CDRsH1(
CDRH1)、H2(CDRH2)およびH3(CDRH3)それぞれのうちの
一つから成る高効力CDRsを持つ。
1については配列番号:11、12、13および56、CDRL2については配
列識別番号:14、15、16、17、18、19、20、21、22、57お
よび58、CDRL3については配列識別番号:23、CDRH1については配
列識別番号:24および25、CDRH2については配列識別番号:26、27
、28、29、30および55、CDRH3については配列識別番号:31、3
2、33および34から成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つ。
よび36から成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つ可変部重鎖および
軽鎖より成る。
列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造領域およびまたは相補性決定領域(
CDRs)を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含む組換
え抗体の産生、 (b)前記抗体が試験管内で、選択された抗原に反応した場合の高Kon値に
対する前記組換え抗体のスクリーニング、および、 (c)前記高Konを持つ抗体の選択 から構成される。
ち、後者は高生物学的活性をもたらす。特異的な実施例において、本発明に従っ
て産生された高効力抗体は、通常最低約2.5×105M−1s−1、好ましく
は最低約5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5×105M−1 s−1のKonを持つ。
の枠組み構造領域および最低2つあるいは3つのCDR領域、場合によっては全
6つのCDR領域の両方、もしくはCDR領域のみに限定されて存在する。
み構造領域および最低3つのCDR領域の両方、もしくはCDR領域のみに限定
されて存在する。
体の枠組み構造領域および最低4つのCDR領域の両方、もしくはCDR領域の
みに限定されて存在する。
量体構造、あるいは、単鎖抗体もしくはFabあるいはF(ab)2′断片など
の断片を含む前記抗体構造の断片であり得る。
ではなく、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)あるいはパラインフルエンザウイル
ス(PIV)などのウイルスが発現する抗原である。
ら得られた重鎖および軽鎖定常部と、枠組み構造領域およびまたは、最低1つの
CDRが、本来見られないアミノ酸配列を持つ高Kon(あるいは高効力)CD
Rである相補性決定領域(CDR)を含む重鎖および軽鎖可変部より構成される
組換え抗体を産生することより成る。ここで前記CDRの存在が、結果として高
Konを生じる。
こで組換え高Kon抗体は、最低2つの高KonCDRs、あるいは3つの高K on CDR、そしてさらには4つの高KonCDRs、および5つあるいは6つ
の高KonCDRsより成る。このCDR配列の存在が、結果として抗体あるい
は断片に高Konを示し、それにより高効力をもたらす。
た抗体の高結合定数は、最低約2.5×105M−1s−1、好ましくは最低約
5×105M−1s−1、最も好ましくは最低約7.5×105M−1s−1で
ある。
列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造領域およびまたは相補性決定領域(
CDRs)を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含む組換
え抗体の産生、 (b)前記抗体が試験管内で、選択された抗原に反応した場合の高効力および
高Konの両方に対する前記組換え抗体のスクリーニング、および、 (c)前記高効力および高Konの両方を持つ抗体の選択 から構成される。
よび高Konの両方を持つ高効力抗体を産生する。ここで親和定数は最低109 M−1、Konは最低2.5×105M−1s−1であり、特にここで前記親和
性は最低1010M−1、前記Konは最低2.5×105M−1s−1であり
、最も特には、前記親和定数は最低1011M−1、前記Konは最低2.5×
105M−1s−1である。超高親和定数およびKonを持つ最も好ましい実施
例においては、特にここで前記親和性は最低109M−1、前記Konは最低5
×105M−1s−1であり、最も特には、親和定数は最低1010M−1、K on は最低2.5×105M−1s−1である。最も特に好ましい実施例の一つ
は、高効力抗体を産生する本発明のプロセスであり、ここで親和定数は最低10 11 M−1、Konは最低7.5×105M−1s−1である。考慮すべきこと
は、高親和性はまた試みられ、前記親和性(Ka)および速度性結合(Kon)
値の任意の組み合わせが本発明中にあるということである。
組み構造領域およびCDR領域の両方、あるいはCDR領域のみに存在し、配列
識別番号:11から34および55から58より選択された前記配列が、1、2
、3、4、5あるいは全6つのCDR領域に存在し、個々のCDR配列がここに
開示された個々の配列より選択されるプロセスを含む。これを行う方法は、この
技術の属する分野における通常の知識を有する者の間でよく知られており、ここ
ではさらなる開示は行わない。
原性分子および構造物に無関係に産生される新規高親和性抗体を産生することに
限定されない。したがって、ここに開示された方法は、既知の抗体分子の構造に
対する選択的な修飾と、それにより前記抗体のKonの増加をもたらし生物学的
活性の増加を伴う方法を提供する。これは、ここに開示された高効力CDR配列
の選択的取り込みにより達成される。
高効力配列を産生するためのアミノ酸変換後に、より高いKon定数を持ち、前
記アミノ酸変換の結果、特に前記アミノ酸変換後のKon値は、(特定の親和定
数(ka)に関わらず)最低2.5×105M−1sec−1、特に最低約5×
105M−1s−1、最も特に最低約7.5×105M−1s−1である。
力を高めるために用いられるアミノ酸配列における前記変換、もしくは高効力抗
体あるいはその活性高効力断片を産生するための選択アミノ酸配列の使用が、高
Kon値の産生を通して、前記高効力あるいは効力の増加を獲得するということ
である。親和定数はKoffに対するKonの数値割合であるため、同一因子に
よりKoffが変換されなかった場合には、増加したKonは結果的に親和性の
増加となり得る。したがって、本方法にしたがって産生された抗体の高効力は、
Kon値の作用であり、ka値(親和定数)の作用ではない。例えば、抗体分子
のCDRsにおける選択アミノ酸配列の使用は、結合(Kon)および解離(K off )速度定数の両方において相当な増加を生じさせ、同一因子によって両方
が増加した場合には、その結果は、(より高いKonに起因する)高い、あるい
はより高い効力となるが、kaの増加とはならない(Koffに対するKonの
割合が同じであるため)。逆に、高効力抗体のCDRs内における前記前選択ア
ミノ酸配列の使用が、Koffを減少させるがKonは増加させない場合には、
その結果は、より高い親和性を伴うが効力がほとんど増加していないかあるいは
まったく増加していない抗体あるいはその活性断片となる。このように、Kof f 値が単独で変化するが、Kaにおける数的変化にも関わらずKonが一定のま
まである(KaはKoffに対するKonの割合であるため)状態で、効力がほ
とんど変換されないかあるいはまったく変換されないことが知られている。
はその活性断片の効力の測定に利用できる。そのような方法の一つはコットンラ
ットモデルを用い、その詳細は以下に提供された実施例に開示される。別の一つ
は、微小中和分析である(実施例2参照)。
され、前記プロセスは前記疾病の危険にある、あるいは前記疾病に苦しむ患者に
、治療上(あるいは予防上)効果的な量の、ここに開示された、あるいはここに
開示された方法に従って産生されたポリペプチド配列を持つ高効力抗体あるいは
その活性断片を投与することより成る。好ましい実施例において、前記疾病はウ
イルス、特に呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスのグルー
プから選択された一つにより引き起こされる。
列中でこれらを発現させることにより、適切な抗体遺伝子配列、すなわちアミノ
酸配列を産生することによって獲得される。望ましいヌクレオチド配列は、例と
して合衆国特許番号5264563および5523388(その開示は全体で引
用例としてここに組み込まれている。)に開示されたコドンベースの突然変異誘
発法を用いて産生することができる。前記方法は、オリゴヌクレオチド内の望ま
しいコドン部位に、任意のおよび全ての頻度のアミノ酸残基の産生が可能である
。これは、望ましい部位あるいはこれらの特異的なサブセット内への任意の20
アミノ酸の完全ランダム置換を含み得る。あるいはこのプロセスは、本発明した
がった新規CDR配列などのアミノ酸鎖内の望ましい部位に、特定のアミノ酸を
獲得するために実施することができる。要約すると、望ましいアミノ酸配列を発
現させるための適切なヌクレオチド配列は容易に獲得でき、前記方法を用いるこ
とで、本発明の新規CDR配列は複製することができる。これは、結果的に望ま
しいアミノ酸配列を持つ、抗体などのポリペプチドを合成する能力を生じさせる
。例として、現在、選択した抗体の望ましいドメインのアミノ酸配列を決定する
ことおよび、付随して、一連の置換類似体を得るために、他の望ましいアミノ酸
に置換された一つあるいはそれ以上のアミノ酸を伴う相同性鎖を調製することが
可能である。
、ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分的縮重オリゴヌクレオチド合成と
しての前記方法は、特定部位における特定アミノ酸残基に特性を持たせるコドン
の重複性を含むが、前記方法は、可能性のある全アミノ酸配列の親組を提供し、
これらを抗体構造体としての最適な機能あるいはその他の目的についてスクリー
ンするために用いることができるということである。前記方法は、スワ―ラ他、
Proc.Natl.Acad.Sci.87巻:6378から6382ページ
(1990年)およびデブリン他、サイエンス 249巻:404から406ペ
ージ(1990年)に開示されている。あるいは、前記抗体配列は、化学的に合
成することが可能であり、あるいはこの技術の属する分野における通常の技術を
有する者が十分に知っているその他の方法において産生することが可能である。
造体に、それぞれが増強した効力あるいは生物学的活性を生じさせる、ここに開
示された1つ、2つあるいはそれ以上の新規CDR配列(例として、配列識別番
号:11から34を参照)を結合させることにより産生することができる。この
方法において、複数の新規アミノ酸配列が、望ましい水準の生物学的活性を持つ
抗体を産生するために、一つの抗体中の同一あるいは異なるCDRsに結合する
ことが可能である。前記の望ましい水準は、しばしばKon値が最低約2.5×
105M−1sec−1の抗体を産生することより生じる。
た抗体は、ここに開示されたコットンラットプロトコルあるいは微小中和プロト
コルを用いて、効力あるいは生物学的活性についてスクリーンされ、ここで前記
抗体はRSVのF抗原などの特定の抗原構造に対して高親和性を示す。このよう
に全体的な結果は、着実な方法における種々の単一アミノ酸置換体の結合および
その結果生じた抗体の抗原親和性および効力についてのスクリーニングの反復プ
ロセスであり、それによって、望ましくは高い、あるいは最低でも最低限値の親
和性を犠牲にすることなく、確実に効力を増加する。
つ抗体を発見する試みにおいて、可能性のある全ての抗体構造の置換および結合
を産生しスクリーニングする時間と費用を回避し得る。逆に、単一10アミノ酸
残基CDRの完全無作為化は、事実上スクリーン不可能な数である、10兆以上
の変異体を産生し得る。
セスにおける2重および3重アミノ酸置換体を産生するために用いることができ
る。
なければならない。特定部位におけるある種の置換は有用あるいは有害であり得
る。加えて、特定の部位における特定の種類のアミノ酸の置換は、親和性に関し
て同様にプラスあるいはマイナスであり得る。例えば、特定の部位に可能性のあ
る全ての疎水性アミノ酸を試みることは、必要ないであろう。任意の疎水性アミ
ノ酸を試みる方が良いであろう。逆に、特定の部位における酸性あるいは塩基性
アミノ酸は、測定される親和性の大きな増加を提供し得る。したがって、前記置
換を行うことの“規定”を知ることはまた必要であるが、前記“規定”の決定は
、可能性のある全ての結合および置換についての研究を必要とせず、傾向は最大
数の置換より少数の置換を調べた後に明らかになるであろう。
DR領域内で行われるアミノ酸変換、あるいは完全新規に調製されたアミノ酸配
列および合成抗体ポリペプチドを決定する。しかし現在では、高親和性はしばし
ば治療上の使用において有益な抗体の特性である一方、前記抗体は前記使用にお
いて実施上利益をもたらす十分な効力を常に持つわけではないということが発見
されている。
測定される。例として、105M−1sec−1のKonおよび10−5sec −1 のKoffは、組み合わさって1010M−1の親和定数となる(表3の値
を参照)。しかし、前記高親和性を示す抗体は、有益な治療薬となるために必要
な効力を欠いたままである。本発明にしたがって、抗体効力は、抗体結合反応に
対するKon速度の値に依存する。したがって、抗体は、各抗原に対する親和性
とは無関係に効力の増加を示し(中和抗体など)、ここで前記抗体はkaあるい
はKoffとは無関係に、より高いKon値を持つ。
関係に、前記抗体の一つあるいはそれ以上のCDR領域中に存在する一つあるい
はそれ以上のアミノ酸の選択変換を通して獲得される。これは前記アミノ酸変換
が、好ましくは抗体親和性における増加を伴う、前記抗体に対するKonの増加
をもたらす効果を持つためである。親和性が変化しないあるいは多少減少したと
しても、より高い効力はより高いKon値を伴って獲得される。前記抗体は、適
切に処理された細胞内での合成を通した必要とされるポリペプチド鎖の合成によ
り、最も有益に産生される。前記細胞は、細胞中に、変換されたCDR分節を含
む望ましいポリペプチド鎖をコードした適切なヌクレオチド配列を組込まれたも
のである。また本発明の方法にしたがって、望ましい水準の効力あるいは生物学
的活性を持つ新規抗体は、ここに開示された遺伝子操作された細胞を用いて、あ
るいは完全に必要とされるポリペプチド鎖の化学合成と続いて起こる必要なジス
ルフィド結合の形成を通して、前記抗体ポリペプチド鎖のCDR領域内における
選択部位への選択アミノ酸の組込みにより新規に調製することができる。
あるいは単量体構造を持つ抗体であり得ることは、明確に意識すべきである。し
たがって、ここで用いられる“抗体”という用語は、L2H2、LH、Fab、
F(ab′)2およびその他の断片を含む部位および断片だけでなく、自然界に
通常見られるような4量体抗体分子全体も含み、前記構造体に必要なのは、ここ
に開示された分析およびプロトコルにより測定される生物学的活性を保持してい
ることだけである。
し、前記抗体は、それらが単一細胞型のクローンから得られるという意味におい
てのみモノクローナルである。しかし、これは、それらを特定の起源に限定する
ことを意味するのではない。前記抗体は、CHOあるいはCOS細胞などの通常
抗体を産生しない細胞中で容易に産生することができる。加えて、前記抗体は、
抗体産物を形成するポリペプチド軽鎖および重鎖を発現し組み立てるように細胞
を遺伝子操作することにより、その他の型の細胞、特に哺乳動物細胞そして更に
は植物細胞中でも産生される。加えて、前記鎖は化学的に合成することができる
が、それらは特定の抗原決定基に対して特異的であるため、その用語が用いられ
るところの特質としての、“モノクローナル”抗体を構成し得る。したがって、
ここで用いられたように、モノクローナル抗体という用語は、前記抗体の産生の
ために用いられる単なる機構に比べて、ここに開示された方法により産生された
抗体分子の方が特異性および精製度が高いことを示すことを意図する。
用いられた場合に、抗体濃度に対する抗体の効果の依存性を示すことを意図する
。したがって、効力は特定抗原に対する生物学的活性を意味する。限定しない例
として、効力あるいは生物学的活性もしくは生物学的効果は、方法の項で開示さ
れたようなコットンラット法あるいは微小中和方法により、抗RSV抗体に対し
て測定される。逆に、抗原に対する抗体の親和性は、単純にKoffに対するK on の割合の数字上での測定である。
て1010M−1の範囲内にある。例として、この範囲は1010M−1の上下
10倍、あるいは1010M−1より10倍以上大きく、あるいは更には数字上
1010M−1と同等であり得る。抗原に対する抗体の親和性はこの定数の値と
比例する(すなわち、定数が高いほど、複合体の濃度がより高いことにより親和
性はより高くなる−親和定数に対する反応式を参照)。前記定数は、(実施例1
に開示されたような)抗体反応に対する標準反応速度方法論により測定される。
抗体”という用語が活性部位、断片あるいは分節を意味する他に、本開示の目的
のための全てのものが抗体という用語の意味の中に含まれると考慮される)は、
通常哺乳動物、好ましくはヒトの定常部および可変部から成り、前記可変部は重
鎖および軽鎖枠組み構造領域と重鎖および軽鎖CDRsから成り、ここで重鎖お
よび軽鎖枠組み構造領域は哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体の特性を有する配
列を持ち、そしてここでCDR配列はヒト以外の種、好ましくはマウスの抗体の
CDR配列と類似する。ここで枠組み構造アミノ酸配列は、非ヒト枠組み構造ア
ミノ酸配列の特徴を持ち、後者は好ましくはマウスである。
を提供するためにここに開示されたようなKon値を持つ。
って本発明の方法の適用後、抗体は、ここに開示された方法の適用前のCDR配
列と同様の、しかし完全に同一ではない、CDR配列を持ち得る。ここで、抗体
がRSVなどのウイルスを中和するために用いられる場合には、前記抗体のCD
Rsの最低一つは、配列識別番号:11から34から選択された一つ等の高効力
アミノ酸配列を含み得る。
にしたがって開示された配列をより良く記載するために、効力が増加され得る抗
体あるいはその断片の軽鎖および重鎖可変部の基本配列あるいは開始配列が図1
A(軽鎖可変部−配列識別番号:1)および図1B(重鎖可変部−配列識別番号
:2)あるいは前記抗体のFab断片(例えば、図2aの配列(軽鎖可変部−配
列識別番号:3))および図2B(重鎖可変部−配列識別番号:4)に示される
。また本発明にしたがって、これらの開始配列のものとは異なる特異的アミノ酸
は、まず第一に、組換え細胞中に発現した場合に、前記アミノ酸配列を産生する
ように設計されたヌクレオチド配列を調製する組換え法により産生される。前記
細胞産物は、本発明のモノクローナル抗体である。代わりに、前記抗体は、本発
明の属する分野においてよく知られた合成法により遺伝子操作された細胞あるい
は組換え細胞を使用することなく産生することができる。
ウイルス(RSV)に対する中和抗体を用いて、高められる。前記Fab断片の
CDRs中に存在するアミノ酸は表3に示される(例えば、クローン5)。
の親和定数および反応速度定数を決定するために用いられる手法は、(本発明に
したがって)望ましい抗体鎖を発現する遺伝子に対するヌクレオチド配列を産生
し、これらを、標準プロトコルによりCOS−1細胞を形質転換させるために用
いられるベクターに挿入するためのものである。細胞はウェル中で成育され、上
清が抽出され、標準ELISA技術を用いて抗原結合について測定される。これ
らのポリヌクレオチドは、CDRsにおける一つあるいはそれ以上のアミノ酸置
換を提供するために設計され、前記CDRsはその後、親和性の増加のために選
択的に結合した有益な置換(これらがKon値の増加をもたらす)を伴う増加し
たKon値についてスクリーンされる。これらはその後続いて、基本構造あるい
は参照構造に対する、RSVのF抗原などの各々の抗原への結合親和性について
スクリーンされ、それにより、Kon値の増加の結果生じた親和性に大きな変化
が無いことを確認する。
された抗体に関し、ここでKonは、最低約2.5×105M−1sec−1、
好ましくは最低約5×105M−1sec−1、最も好ましくは最低約7.5×
105M−1sec−1である(その組み合わせの全てを含む)。
新規の抗体であり得る。したがって、本発明の方法にしたがって産生された抗体
は、自然発生哺乳動物抗体、自然発生ヒト抗体、自然発生マウス抗体、単一鎖抗
体、(一つの種の抗体の定常部および異なる種の抗体の可変部を持つ)キメラ抗
体、(一つの種の抗体のCDR領域と異なる種の抗体の定常部およびあるいは枠
組み構造領域を持つ)CDR移植抗体、ヒト化抗体(可変枠組み構造領域および
またはCDR領域の選択アミノ酸が、前記配列の大部分がマウスなどの異なる種
から得られたものであるにも関わらず、ヒト抗体と類似するように変換されてい
る)、好ましくはヒト化マウス抗体、好ましくはマウス、最も好ましくはヒトの
変換哺乳動物抗体(ここで、既存の抗体の選択アミノ酸は、通常基本となる抗体
構造と類似した抗体構造をもたらすための遺伝子操作技術を通して、ポリペプチ
ド鎖のいくつかの点で変換されている)、および完全合成新規抗体より成るグル
ープから選択された抗体を含む。後者は自然には存在しないものである。
、抗体の可変部内のアミノ酸の選択的変換より成る、(前記のように)前記の抗
体型の一つの効力を高める方法に関する。もちろん、Kon値は、同一のアミノ
酸変換に続く同一抗体と異なり得る。ここで反応は、異なる抗原あるいは抗原決
定基を用いて測定される。しかし、そのような場合において、親和性はまた、抗
原決定基の同一性が変換するにつれて変換する可能性がある。
たアミノ酸変換は、好ましくは抗体の可変部のCDR部位に限定されるが、これ
らは枠組み構造領域に対する変換も含み得る。
めることができる抗体の修飾クローンのスクリーニングにより同定されるけれど
も、前記高効力クローンは同定されると、その結果生じた抗体は、必要とされる
ヌクレオチド配列を設計するための遺伝子コードを利用して、望ましいアミノ酸
配列に一致する適切なDNA配列を含む適当なベクターの動物あるいは植物細胞
への導入に続き、このような細胞内での適当な重鎖および軽鎖ポリペプチドの合
成を通して、その後最も有益に産生される。この手法の結果として、高効力完全
新規抗体は、修飾するための既存抗体配列の選択を必要とすることなく、本発明
の方法により示されたアミノ酸配列同定を用いて最初から産生することができる
。したがって、ここに開示された方法は、完全新規構造の高効力抗体の産生を容
易にする。ここで前記高効力抗体のCDR配列は、前記抗体の予定された抗原標
的に対する特異性および親和性を損なうことなく、計画的に前記抗体のKon値
を増加させるためにここに開示された方法により決定されたように、高効力CD
Rsである。
とによりその効力を高めるために修飾される。好ましい実施例において、抗体は
、例えば最低約109M−1あるいは1010M−1の高親和性を伴う抗体であ
る。抗体は、前記抗体の重鎖およびまたは軽鎖ポリペプチド内へのアミノ酸変換
の導入のために、クローンあるいは遺伝子操作動物あるいは植物細胞を用いて産
生される。好ましくはここで、抗体効力の増加を伴って前記抗体の特定抗原に対
する結合についてのKon値を増加させるために、前記抗体変換は前記ポリペプ
チド鎖の相補性決定領域(CDRs)内へ導入される。したがって、本発明の方
法は、抗体分子を産生するために有益に用いられる。ここで、配列、好ましくは
前記配列の可変部、最も好ましくはCDR部位のアミノ酸変換を伴う前記抗体の
Kon値は、Kon値が同一抗原に対して測定された場合に、前記アミノ酸変換
前の前記抗体が示すKon値よりも高い。
、最低2倍、好ましくは最低5倍、そして最も好ましくは最低10倍増加され得
る。より特異的には、前記抗体のKon値は、最低約2.5×105M−1se
c−1、好ましくは最低5×105M−1sec−1、最も好ましくは最低7.
5×105M−1sec−1まで増加する。
有効であるため、本発明はまた、ポリペプチド配列が選択部位、特にCDR配列
内に選択アミノ酸を含む抗体を調製し、その後最低2.5×105M−1sec −1 のKon値を、あるいは最低5×105M−1sec−1あるいは更に7.
5×105M−1sec−1のKon値を持つことについて、前記抗体をスクリ
ーニングすることより成る、最低2.5×105M−1sec−1のKon値を
持つ抗体を産生する方法に関する。前記抗体は、一つあるいはそれ以上のここに
開示された高効力CDRsの存在の結果生じ得る。前記抗体は高Kon値につい
て容易に検査される。
力増加抗体の産生に対しても利用することができるが、前記抗原は、好ましくは
バクテリア、ウイルスあるいは菌類、好ましくはウイルス(例として、呼吸器合
胞体ウイルス(RSV))などの微生物に特有の抗原である。
しむ患者に、ここに開示された方法により調製された治療上有効な量の抗体を投
与することより成る、疾病を予防あるいは処置する方法に関する。したがって、
前記抗体は、本発明の方法の適用により増加した効力を持つ完全新規抗体あるい
は既知の臨床上有効な抗体であり得る。ここに開示された方法により調製された
抗体により予防あるいは処置された疾病は、通常バクテリアおよびウイルス、好
ましくはウイルス、そして最も好ましくはRSVなどの微生物により引き起こさ
れる疾病である。
も好ましくはマウスから得られた枠組み構造領域を持つ。
重鎖および軽鎖可変部(CDRsプラス枠組み構造領域))は、本発明の抗体の
新規CDR配列を産生するための“鋳型”として用いられ、後者はより高いKo n 値を与える。単一突然変異の6個のCDRライブラリーの特性を示し、そして
合成するための標準方法が用いられた(ウー他、Proc.Natl.Acad
.Sci.95巻:6037−6042ページ(1998年)参照、その開示は
全体で引用例としてここに組み込まれている)。標的CDRは、ヌクレオチドの
アニーリングの前に、最初に各ライブラリーから削除される。ライブラリーの合
成のために、参照抗体(図2参照)のCDRsは表1のように定義された。(上
記のように)本発明のCDR配列を産生するためのオリゴヌクレオチド合成のた
めにコドンベースの突然変異誘発が用いられた。
より最初にスクリーンされた。続いて、これらのクローンは更に、キャプチャー
ELISAの使用および固定抗原に対する滴定により特徴付けられた。前記スク
リーニングに続いて、抗体は個々のKon値についてスクリーンされ、その陽性
の効果はその後、効力の測定により測定される。図4および5は、ここで用いら
れる調製およびスクリーニング法に対する補助的な詳細を示す。
力の置換体の性質を確認するために配列決定された。スクリーニング後、前記置
換体の効果を最大にし、それにより高効力も示す高親和性抗体を産生するために
、抗体は、単一あるいは種々の組み合わせにおいて、高Konアミノ酸置換体に
ついて調製される。
の結果生じることが分かっている。したがって、ここに開示された高効力(すな
わち高Kon)中和抗体は、相補性決定領域L1(あるいはCDRL1)、L2
(あるいはCDRL2)、L3(あるいはCDRL3)、H1(あるいはCDR
H1)、およびH3(あるいはCDRH3)においてのみ[原文通り]、(例と
して、図1および2に示された)基本あるいは参照抗体とは異なるアミノ酸配列
を含む。
2に示された重鎖および軽鎖配列を持つ抗体の効力を増加させるための手段とし
て置換された。
)は、表2に示される(その全てが図2の枠組み構造配列を持つ)。ここで参照
クローンは、図2に示された重鎖および軽鎖可変部配列(軽鎖および重鎖配列そ
れぞれに対して配列識別番号:3および4)を持つクローンである。
る高KonCDRsのアミノ酸配列(標準アミノ酸一文字アルファベットコード
で表記された全配列)を示す。表2において、対応する表1のCDRsにおいて
なされた主要なアミノ酸置換の部位(すなわち、アミノ酸においてCDRsの異
なる部位)は、太文字および下線で示される。
合わせることにより、ここに開示された抗体の効力を大きく増加させることが可
能となった。
有益なあるいは高いKonCDRを持つ全てのより高いKon変異体を伴い、全
6個のCDRsが置換された変異体も含む。
109M−1および好ましくは最低1010M−1の親和性を伴うRSV中和抗
体であり、また重鎖および軽鎖についてのヒト定常部および枠組み構造を含むヒ
ト化抗体である。ここで少なくとも枠組み構造の一部分はヒト抗体から(あるい
はヒト抗体枠組み構造の共通配列から)得られる。
から得られる。
のCDRsにおける最低一つのアミノ酸が変換された非ヒト抗体から得られた一
つあるいはそれ以上のCDRsおよび枠組み構造の全てあるいは一部分がヒト抗
体(あるいはヒト抗体枠組み構造の共通配列)から得られたものを持つ移植抗体
である。
しい配列を持つ遺伝子は、組み立てられそして種々のベクターを用いて、機能的
4量体抗体分子の発現のために適切な細胞中に挿入することができる。これとす
でに開示された方法論の組み合わせにより、単一突然変異ライブラリーの組立て
が可能となる。ここで抗体は対応する移植抗体と同一の配列を所有し、それによ
り同一の構造および結合親和性を持つ。
ab断片などの活性断片において存在し得る。表3に示されたクローン1から1
5に対する効力データはFab断片に対するものであり、一方表3のクローン1
6および17に対するデータは完全抗体分子に対するものである(クローン16
は、ジョンソン他(1997年)に開示された配列を持つMEDI−493であ
る)。
5、47、49、51および53より成るグループから選択された重鎖配列(可
変部プラス定常部)を持ち、配列識別番号:38、40、42、44、46、4
8、50、52および54より成るグループから選択された軽鎖配列(可変部プ
ラス定常部)を伴う抗体分子を含む。
て、同じくウェル中であるいはプレート上で生育された細胞から抽出した上清と
して存在し得る。したがって本発明の抗体はまた、本発明の抗体より成る組成物
の形状として存在し得る。そしてここで前記抗体は、薬理学的許容希釈剤あるい
は賦形剤中に懸濁される。本発明の抗体は、濃縮された組成物あるいは、疾病の
処置あるいは予防(例として、感染に伴って発症するぜん息およびぜん鳴のより
高い発生率を伴うRSVの予防)において治療上あるいは薬理学上の有益な価値
を持つ量として存在し得る。前記抗体はまた、より希釈された状態の組成物とし
て存在し得る。
ルス感染を予防およびまたは処置する方法の提供に指向する。前記方法は、前記
疾病の危険のある患者あるいは前記疾病に苦しむ患者に、治療上有効な量のここ
に開示された抗体組成物を投与することより成る。
されたクローン15のCDRsを持つクローン15に対する配列識別番号:10
1および102)の配列を持つ。
和抗体から得られたCDR領域および非CDR領域から組み立てることができる
(そして組み立てられた抗体はここに開示された発明内の範囲内にある)一方、
本発明の抗体は、適切な遺伝子配列を、遺伝子操作された細胞による組み立てら
れた抗体分子の最終的な発現のために、処理後適切な細胞系列に形質移入される
ベクター内に、遺伝子操作することにより最も容易に調製されることは、考慮さ
れるべきである。実際、前記組換え方法は、ここに開示された抗体を調製するた
めに用いられる。加えて、高親和性抗体鎖の配列がここでの開示から公知である
ため、前記抗体はまた、適切な鎖の直接合成により組み立てることができ、その
後4量体抗体構造への自己組み立てが可能である。
可変部配列)である(ジョンソン他、J.Infect.Dis.、176巻、
1215から1224ページ(1997年);ベーラーとヴァン ウィック コ
ーリン、J.Virol.、63巻、2941から2950ページ(1989年
))。
合抑制分析において測定された。この分析は、細胞が抗体の添加前に4時間、R
SV(ロング)に感染されることを除いて、微小中和分析と同一である(テーラ
ー他、J.Gen.Virol.、73巻、2217から2223ページ(19
92年))。
に、BIAcoreバイオセンサー(BIAcore、ピスケータウェイ、ニュ
ージャージー)を用いて行われた(カールソン他、J.Immunol.メソッ
ズ、145巻、229から240ページ(1991年);ジョン、Mol.Bi
otechnol.、9巻、65から71ページ(1998年))。この分析の
ために用いられる抗原は、バキュロウイルスで発現する切端RSV(A2)Fタ
ンパク質(アミノ酸1から526)である。精製RSV Fタンパク質は、製造
プロトコルにしたがって、N−ヒドロキシスクシニミド/l−エチル−3−〔3
−ジメチルアミノプロピル〕−カルボジイミド−活性化CM5センサーチップと
共有結合し、未反応活性エステルグループは、1Mエタノールアミンで反応させ
た。1μMあるいは10μMのMEDI−493の初期注入の後に、HBSS洗
浄段階が続き、その後MEDI−493あるいはRHSZ19の2次注入が続く
。センサーグラムは、BIA数値算出ソフトウェアを用いて分析した。
より測定された(ワイズマン他、Anal.Biochem.、179巻、13
1から137ページ(1989年))。4.5μM RSV Fタンパク質の溶
液1.4mLが、26μM MEDI−493あるいはRSHZ19の5.5μ
Lの注入で滴定された。MAbの各注入後、結合の量と比例する熱放出量が測定
された。用いられた抗原は、ショウジョウバエ細胞中で発現するRSV(A2)
Fタンパク質切端(アミノ酸25−524)である。滴定は、ノイズに対する最
適シグナルを獲得するために44℃および55℃で行われた。これらの温度にお
けるMAbsおよびFタンパク質の熱安定性は、円偏光二色性変性実験により示
された。親和性は、生体内データとの比較のため、完全なファントホッフの式を
用いて37℃に調整された(ドイルとヘンスリー、メソッズ Enzymol.
、295巻、88から99ページ(1998年))。ファントホッフ調整は、熱
量測定により直接測定されたFタンパク質結合エンタルピー変化にのみ基づく。
MEDI−493およびRSHZ19に対する結合エンタルピー変化は非常に類
似していることが発見されたため、それらのKdsに対する温度調節はほぼ同一
であった。
irol.、55巻、517から520ページ(1985年))。コットンラッ
ト(Sigmodon hispidus、平均体重100グラム)は、メトキ
シフルランで麻酔され、放血され、投与量5、2.5、1.25、0.625m
g/kg体重の精製MAbあるいは5mg/kg体重のウシ血清アルブミン(B
SA)コントロールの0.1mLが、筋肉内注射(i.m.)により注入された
。24時間後、動物は再び麻酔され、血清MAb濃度測定のために放血され、1
05PFUのRSVのA(ロング)あるいはB(18537)変種の鼻腔内点滴
注入(i.n.)により、免疫有効性が試験された。4日後、動物は犠牲となり
、その肺は回収された。肺は、ハンクス調整塩溶液の10パーツ(wt/vol
)中でホモジネートされ、その結果生じた懸濁液は、プラーク分析による肺疾患
ウイルス力価を測定するために用いられた。免疫有効性試験時の血清抗体力価は
、抗ヒトIgG ELISAにより測定される。
応速度は、ファルマシアBIAcoreTMバイオセンサーを用いて、表面プラ
スモン共鳴により研究された。C末端切端Fタンパク質を発現する組換えバキュ
ロウイルスは、反応速度試験に対する抗原の豊富な源を提供した。分泌されたF
タンパク質を含む上清は、コンカナバリンAおよびQセファロースカラムでの連
続クロマトグラフィーにより、おおよそ20倍に濃縮された。プールされた分画
は、10mMクエン酸ナトリウム(pH5.5)に対して透析され、おおよそ0
.1mg/mlに濃縮された。典型的な実験において、Fタンパク質の一部(1
00ml)は、BIAcoreセンサーチップにアミン結合した。(合衆国特許
番号5824307(その開示は引用例としてここに組み込まれている)におい
て調製された)H1129あるいはH1308Fで飽和した場合において、固定
された量は、シグナルのおおよそ2000反応単位(Rmax)であった。これ
は、結合方法を伴うFタンパク質調製において、同数の“A”および“C”抗原
部位が存在することを示す。2つの関連のないMabs(RVFV 4D4およ
びCMV H758)は、固定されたFタンパク質と相互作用を示さなかった。
典型的な反応速度試験は、0.05%Tween−20を含むPBS緩衝液(P
BS/Tween)中の異なる濃度(25−300nM)での35mlのMab
の注入を伴う。流出速度は5ml/minに維持され、7分間の結合段階を与え
た。Mabの注入に続いて、解離速度を測定するために、流出は30分間PBS
/Tween緩衝液に変換された。センサーチップは、10mM HClの2分
間のパルスでのサイクル間で再生された。再生段階は、固定Fタンパク質の結合
能力の損失を最小限にした(サイクル当たり4%の損失)。この微量の減少は、
(それぞれKonおよびKoffとも呼ばれる)結合および解離の速度定数の算
定値を変化させなかった。
ク質は、EDC/NHS法(EDC=N−エチル−N′―〔3−ジエチルアミノ
プロピル〕−カルボジイミド)により直接固定された。要約すると、10mM
NaOAc、pH4.0におけるFタンパク質の4μg/mlは調製され、約3
0μl注入が、上記条件下で約500RU(反応単位)の固定Fタンパク質を生
じた。ブランク流出細胞(VnR固定CMデキストラン表面)は、反応速度分析
のために差し引かれた。カラムは100mM HCl(完全再生に必要な72秒
の一定時間を伴う)を用いて再生することができた。この処置は、固定抗原を損
傷させること無く完全に結合Fabを除去し、40超の再生に用いることができ
た。Kon測定に対して、Fab濃度は、12.5nM、25nM、50nM、
100nM、200nMおよび400nMであった。解離段階は、230秒(解
離段階の開始後30秒)から900秒まで分析された。反応速度は、1:1ラン
グミュアフィッティング(グローバルフィッティング)により分析された。測定
は、HBS−EP緩衝液(10mM HEPES、pH7.4、150mM N
aCl、3mM EDTA、0.005%(v/v)サーファクタントP20)
中で行われた。
びKoffは別々に測定された。Konは、単一突然変異クローンについての場
合と同一条件で測定され、同様に分析された。
た。要約すると、4100RUのFタンパク質は、ブランクとして用いられるC
M−デキストランに(上記のように)固定された。ここで、3000RUのFa
bが(装置誤差を相殺するには十分高い解離Fabで)結合した。HBSプラス
5nM Fタンパク質(KdissocあるいはKoff−解離平衡定数よりも
約350から2000倍高い)は、緩衝液として用いられた。解離段階は、5μ
l/minの流出速度で6から15時間であった。ここで用いられた条件下にお
いて、解離Fabの再結合は最小であった。更なる詳細については、バイオセン
サー付属の操作説明書を参照されたい。
に対する高親和性抗RSV抗体の結合は、結合についての二次次数速度定数に対
する解離についての一次次数速度定数の割合(Kd=Kdiss/Kassoc )から算出された。Kassocの値は、以下の速度式に基づいて算出された: dR/dt=Kassoc[Mab]Rmax−(Kassoc[Mab]+
Kdiss)R ここで、RおよびRmaxは、それぞれ時間tおよび無限大における反応単位で
ある。Rの関数としてのdr/dtのプロットは、(Kassoc[Mab]+
Kdiss)の傾きを与える。これらの傾きは[Mab]と比例の関係にあるた
め、Kassoc値は、傾き対[Mab]の再プロットから得ることができる。
新しい直線の傾きは、Kassocに等しい。Kdiss値は、Y切片から推定
することができるが、より正確な値がKdissの直接測定により測定された。
Mabの注入段階に続いて、PBS/Tween緩衝液は、センサーチップを横
断して流出する。この時点から[Mab]=0である。したがってdR/dtに
対する上記の式は、次のように縮小される: dr/dt=KdissR あるいは dR/R=Kdissdt この式の積分は次のようになる: In(R0/Rt)=Kdisst ここで(R0/Rt)は、それぞれ0時(解離段階の開始)およびt時における
反応単位である。最後に、tの関数としてのIn(R0/Rt)のプロッティン
グは、Kdissの傾きを与える。ここでの好ましい実施例において、前記抗体
変異種から得た数値は表3に示される。
列および表1に示されたCDRsを持つFab断片である。クローン1から15
は、図2の枠組み構造配列および、表2(ここで“X”は、高効力CDR(すな
わち、参照配列に対するその存在が、高い効力および参照Fabよりも高い効力
をもたらすCDR)を示す。)に表示されたクローン1から15のCDR結合を
持つFab断片である。ここで表2のCDRの項の次に“X”が無いものは、(
表1および図2の)参照Fabに相当する配列である。
較して50%の抑制を生じるμg/ml濃度)に関して、Fab断片と完全4量
体抗体分子を比較する。表のクローン16は、表2に開示されたCDRsを持つ
参照抗体である。
(1997年)に開示された定常部を持つ、事実上のモノクローナル抗体である
。これらの抗体の枠組み構造配列は、Fab断片がわずかに異なりうる。
力CDR配列を持つ4量体抗体分子である。抗体クローン21は、Fabクロー
ン9と同一のCDR配列を持ち、抗体クローン22は、Fabクローン10と同
一のCDR配列を持ち、抗体クローン23は、Fabクローン11と同一のCD
R配列を持ち、抗体クローン24は、Fabクローン12と同一のCDR配列を
持ち、抗体クローン25は、Fabクローン13と同一のCDR配列を持ち、そ
して抗体クローン26は、Fabクローン15と同一のCDR配列を持つ。表3
の抗体クローン18、19および20は、表2に特定されたCDR結合を伴う全
長4量体抗体である。これらの抗体の枠組み構造配列は、Fab断片がわずかに
異なり得る。
抗体の高効力CDRs内の主要部位に位置するアミノ酸残基を表す。例えば、よ
り高いKon値をもたらすことにより抗体の効力を高めるために、参照抗体につ
いての表1において、太文字および下線の残基としてここで示唆された主要部位
に位置するアミノ酸は、表2においてCDRsの下に表記された(そしてまた太
文字と下線の引かれた)アミノ酸により置換され得る。したがって、これらの一
文字コードは、効力を高めることができる参照抗体についての図2に示されるC
DRsの主要部位(あるいは決定的な部位)(表2の配列における太文字で示さ
れた残基)において、参照アミノ酸を置換するアミノ酸を表す。
よび42(軽鎖)により特定される全長配列を持ち、クローン19は、配列識別
番号:45(重鎖)および46(軽鎖)により特定される全長配列を持ち、クロ
ーン20は、配列識別番号:47(重鎖)および48(軽鎖)により特定される
全長配列を持ち、クローン21は、配列識別番号:51(重鎖)および52(軽
鎖)により特定される全長配列を持ち、クローン22は、配列識別番号:53(
重鎖)および54(軽鎖)により特定される全長配列を持ち、クローン23は、
配列識別番号:49(重鎖)および50(軽鎖)により特定される全長配列を持
ち、クローン24は、配列識別番号:43(重鎖)および44(軽鎖)により特
定される全長配列を持ち、クローン25は、配列識別番号:37(重鎖)および
38(軽鎖)により特定される全長配列を持ち、そしてクローン26は、配列識
別番号:39(重鎖)および40(軽鎖)により特定される全長配列を持つ。
sを持ち、クローン19(IgG)およびクローン29(Fab)は同一CDR
sを持ち、クローン20(IgG)およびクローン28(Fab)は同一CDR
sを持ち、クローン21(IgG)およびクローン9(Fab)は同一CDRs
を持ち、クローン22(IgG)およびクローン10(Fab)は同一CDRs
を持ち、クローン23(IgG)およびクローン11(Fab)は同一CDRs
を持ち、クローン24(IgG)およびクローン12(Fab)は同一CDRs
を持ち、クローン25(IgG)およびクローン13(Fab)は同一CDRs
を持ち、クローン26(IgG)およびクローン15(Fab)は同一CDRs
を持つ。したがって、表4のデータは、Fab断片の活性と完全抗体分子の活性
との関連性を示す。
配列識別番号:37、39、41、45、47、49、51および53より成る
グループから選択された重鎖アミノ酸配列および、配列識別番号:38、40、
42、44、46、48、50、52および54より成るグループから選択され
た軽鎖アミノ酸配列を持ち、好ましくはここで前記抗体は、クローン18−26
の抗体である。
、アンダーソン他により開示された方法(“酵素免疫測定法に基づく呼吸器合胞
体ウイルスに対する微小中和試験”、J.Clin.Microbiol.22
巻、1050から1052ページ(1985年)、その開示は全体で引用例とし
てここに組み込まれている)の改良法である。ここで用いられた方法は、ジョン
ソン他(J.インフェクシャス ディジージーズ、180巻、35から40ペー
ジ(1999年)、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている)に
開示されている。抗体希釈は、96ウェルプレートを用いた三つ組み中で行われ
た。呼吸器合胞体ウイルス(RSV−ロング株)の10TCID50は、96ウ
ェルプレートのウェル中で、37℃で2時間試験するために、種々の抗体(ある
いはFab)希釈濃度でインキュベートされた。RSV感受性HEp−2細胞(
2.5×104)が、その後各ウェル中に添加され、37℃、5%二酸化炭素濃
度で5日間培養された。5日後、培地は吸引され、細胞は洗浄され、80%メタ
ノールおよび20%PBSでプレートに固定された。RSV複製は、その後Fタ
ンパク質の発現により測定された。固定細胞は、ビオチン接合抗Fタンパク質モ
ノクローナル抗体(panFタンパク質、C部位特異的MAb 133−1H)
と共にインキュベートされ、洗浄された。そして西洋ワサビペルオキシダーゼ接
合アビジンが、ウェルに添加された。ウェルは、再び洗浄され、基質TMB(チ
オニトロ安息香酸)の代謝量は、450nmで測定された。中和力価は、450
nmの吸光度(OD450)において、ウイルス単独コントロール細胞に対して
最低50%の減少を引き起こす抗体濃度として表された。
モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変部のアミノ酸配列を示す図。参考とし
て、この抗体は、ジョンソン他、J.Infect.Dis.、176巻:12
15から1224ページ(1997年)に開示されたMEDI−493抗体配列
である。ここで、CDR領域は下線部であり、一方下線部以外の残基は、各ポリ
ペプチド構造の可変部の枠組み構造領域を形成する。この構造において、CDR
sはマウス抗体から得られ、一方枠組み構造領域はヒト抗体から得られる。定常
部(不図示)もまたヒト抗体から得られる。軽鎖および重鎖それぞれについて、
図1Aは軽鎖可変部(配列識別番号:1)を示し、図1Bは重鎖可変部(配列識
別番号:2)を示す。
を示す図。同様に、CDR領域は下線部である。この配列は軽鎖のCDR L1
の最初の4残基、軽鎖の残基103および重鎖の残基112が図1と異なる。本
発明の全ての高効力中和Fab構造(表2に示すCDR構造)が、この参照ある
いは基本構造の枠組み構造配列を用いる。図2Aは軽鎖(配列識別番号:3)可
変部を示し、図2Bは重鎖(配列識別番号:4)可変部を示す。
および軽鎖(配列識別番号:35)可変部を示す図。この好ましい抗体は、いく
つかの高KonCDR(あるいは高効力CDR)を持ち、図2の基本あるいは参
照抗体よりも高い結合速度定数(すなわちKon)を生じ、したがってより高い
効力を持つ。この好ましい抗体は図2の配列と同一の枠組み構造アミノ酸配列を
持ち、本開示に用いるにあたって、以下の表2および3において“クローン15
”と記された。これらの配列は、ここに開示された方法により容易に産生され、
その全てはこの分野における通常の知識を有する者が容易に知ることができる。
反応速度定数は実施例1の方法に従って測定され、効力は実施例2に示されたよ
うに測定された。
使用、および精製を容易にするためのヒスチジン タグ配列(6ヒスチジン残基
)の使用の模式図を示した図。
“SPE”は単一点ELISAを示す。“H3−3F4”は表2および3のクロ
ーン4の名称である。
Claims (57)
- 【請求項1】 免疫学的活性部位、断片あるいは分節を含有する、ビタキシ
ン以外の一つの高効力抗体であって、最低2.5×105M−1s−1のKon を持つ抗体。 - 【請求項2】 請求項1記載の高効力抗体であって、ここで前記Konが最
低約5×105M−1s−1であることを特徴とする抗体。 - 【請求項3】 請求項1記載の高効力抗体であって、ここで前記Konが最
低約7.5×105M−1s−1であることを特徴とする抗体。 - 【請求項4】 請求項1記載の高効力抗体であって、ここで前記抗体が中和
抗体であることを特徴とする抗体。 - 【請求項5】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が
微生物上に検出される抗原決定基に対して特異性を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項6】 請求項5記載の高効力中和抗体であって、ここで前記微生物
がウイルス、バクテリアおよび菌類より成るグループから選択されることを特徴
とする抗体。 - 【請求項7】 請求項5記載の高効力中和抗体であって、ここで前記微生物
がウイルスであることを特徴とする抗体。 - 【請求項8】 請求項7記載の高効力中和抗体であって、ここで前記ウイル
スが呼吸器合胞体ウイルス(RSV)およびパラインフルエンザウイルス(PI
V)より成るグループから選択されることを特徴とする抗体。 - 【請求項9】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が
ガン細胞上に検出される抗原に対して特異的であることを特徴とする抗体。 - 【請求項10】 請求項1記載の高効力抗体であって、ここで前記抗体が毒
性物質あるいは毒性物質の産物に対して特異的であることを特徴とする抗体。 - 【請求項11】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が最低約109M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項12】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が最低約1010M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項13】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が最低約1011M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項14】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が6.0nM以下のEC50を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項15】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が3.0nM以下のEC50を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項16】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が1.0nM以下のEC50を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項17】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が一つあるいはそれ以上の高効力相補性決定領域(CDR)より成ることを特徴
とする抗体。 - 【請求項18】 請求項17記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗
体が最低2つの高効力CDRsより成ることを特徴とする抗体。 - 【請求項19】 請求項18記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗
体が最低4つの高効力CDRsより成ることを特徴とする抗体。 - 【請求項20】 請求項19記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗
体が6つの高効力CDRsより成ることを特徴とする抗体。 - 【請求項21】 請求項19記載の高効力中和抗体であって、ここで前記高
効力CDRsが、軽鎖CDRsL1(CDRL1)、L2(CDRL2)、L3
(CDRL3)および重鎖CDRsH1(CDRH1)、H2(CDRH2)、
H3(CDRH3)それぞれのうちの一つより成ることを特徴とする抗体。 - 【請求項22】 請求項17記載の高効力中和抗体であって、ここで前記高
効力CDRsが、CDRL1に対しては配列識別番号:11、12、13および
56、CDRL2に対しては配列識別番号:14、15、16、17、18、1
9、20、21、22、57および58、CDRL3に対しては配列識別番号:
23、CDRH1に対しては配列識別番号:24および25、CDRH2に対し
ては配列識別番号:26、27、28、29、30および55、CDRH3に対
しては配列識別番号:31、32、33および34より成るグループから選択さ
れたアミノ酸配列を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項23】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が、配列識別番号:37、39、41、45、47、49、51および53より
成るグループから選択された重鎖アミノ酸配列および配列識別番号:38、40
、42、44、46、48、50、52および54より成るグループから選択さ
れた軽鎖アミノ酸配列を持つことを特徴とする。 - 【請求項24】 高効力中和抗体を産生するための一つのプロセスであって
、(a)前選択アミノ酸配列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造およびま
たは相補性決定領域(CDRs)を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学
的活性断片を含有する組換え抗体の産生、(b)前記抗体が試験管内で選択され
た抗原に反応した場合の高結合速度定数(Kon)に対する前記組換え抗体のス
クリーニング、および(c)前記高結合速度定数(Kon)を持つ抗体の選択、
より成るプロセス。 - 【請求項25】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記Konが
最低3×105M−1s−1であることを特徴とするプロセス。 - 【請求項26】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記Konが
最低106M−1s−1であることを特徴とするプロセス。 - 【請求項27】 請求項24記載のプロセスであって、ここで高Konをも
たらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低一つのCDR領
域の両方に存在することを特徴とするプロセス。 - 【請求項28】 請求項24記載のプロセスであって、ここで高Konをも
たらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低2つのCDR領
域の両方に存在することを特徴とするプロセス。 - 【請求項29】 請求項24記載のプロセスであって、ここで高Konをも
たらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低4つのCDR領
域の両方に存在することを特徴とするプロセス。 - 【請求項30】 請求項24記載のプロセスであって、ここで高Konをも
たらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および6つのCDR領域の
両方に存在することを特徴とするプロセス。 - 【請求項31】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、
段階(b)において最低109M−1の親和定数について更にスクリーンされる
ことを特徴とするプロセス。 - 【請求項32】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、
段階(b)において最低1010M−1の親和定数について更にスクリーンされ
ることを特徴とするプロセス。 - 【請求項33】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、
段階(b)において最低1011M−1の親和定数について更にスクリーンされ
ることを特徴とするプロセス。 - 【請求項34】 請求項24記載のプロセスであって、ここで前記高親和定
数が最低1010M−1であり前記高結合定数が最低5×105M−1s−1で
あることを特徴とするプロセス。 - 【請求項35】 高効力中和抗体を産生するための一つのプロセスであって
、枠組み構造領域およびまたは最低一つのCDRが高KonCDRであり、前記
CDRの存在が結果的に高Konをもたらす相補性決定領域(CDR)を包含す
る重鎖および軽鎖可変部より成る組換え抗体を産生することより成るプロセス。 - 【請求項36】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記組換え高
Kon抗体が最低2つの高KonCDRsを包含することを特徴とするプロセス
。 - 【請求項37】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記組換え高
Kon抗体が最低4つの高KonCDRsを包含することを特徴とするプロセス
。 - 【請求項38】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記組換え高
Kon抗体が6つの高KonCDRsを包含し、ここで前記高効力CDRsが軽
鎖CDRsL1(CDRL1)、L2(CDRL2)、L3(CDRL3)およ
び重鎖CDRsH1(CDRH1)、H2(CDRH2)、H3(CDRH3)
それぞれのうちの一つより成ることを特徴とするプロセス。 - 【請求項39】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記Konが
最低5×105M−1s−1であることを特徴とするプロセス。 - 【請求項40】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記Konが
最低7.5×105M−1s−1であることを特徴とするプロセス。 - 【請求項41】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記抗体がま
た最低109M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とするプロセス。 - 【請求項42】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記抗体がま
た最低1010M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とするプロセス。 - 【請求項43】 請求項35記載のプロセスであって、ここで前記抗体がま
た最低1011M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とするプロセス。 - 【請求項44】 抗体の効力を高めるための一つのプロセスであって、前記
抗体の測定されたKon値を増加させるために、抗体の可変部枠組み構造領域お
よびまたはCDR領域内の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を選択的に変換する
ことより成るプロセス。 - 【請求項45】 請求項44記載のプロセスであって、ここでアミノ酸変換
が前記可変部のCDR部位に限定されることを特徴とするプロセス。 - 【請求項46】 請求項44記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸
変換前の前記抗体の親和性が最低109M−1であることを特徴とするプロセス
。 - 【請求項47】 請求項44記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸
変換前の前記抗体の親和性が最低1010M−1であることを特徴とするプロセ
ス。 - 【請求項48】 請求項44記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸
変換前の前記抗体の親和性が最低1011M−1であることを特徴とするプロセ
ス。 - 【請求項49】 請求項44記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸
変換後のKon値が最低5×105M−1sec−1であることを特徴とするプ
ロセス。 - 【請求項50】 請求項44記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸
変換後のKon値が最低106M−1sec−1であることを特徴とするプロセ
ス。 - 【請求項51】 疾病を予防あるいは処置するための一つのプロセスであっ
て、前記疾病の危険にあるあるいは前記疾病に苦しむ患者に、治療上効果的な量
の請求項1、24、35および44の抗体より成るグループから選択された抗体
あるいはその断片を投与することより成るプロセス。 - 【請求項52】 請求項51記載のプロセスであって、ここで前記疾病がウ
イルスにより引き起こされることを特徴とするプロセス。 - 【請求項53】 請求項52記載のプロセスであって、ここで前記ウイルス
が呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより成るグループか
ら選択されることを特徴とするプロセス。 - 【請求項54】 請求項51記載のプロセスであって、ここで抗体あるいは
その活性断片が、配列識別番号35のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部および配列
識別番号36のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部を持つことを特徴とするプロセス
。 - 【請求項55】 請求項51記載のプロセスであって、ここで前記抗体がF
ab断片であることを特徴とするプロセス。 - 【請求項56】 請求項4記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体
が最低約109M−1の親和定数(Ka)を持つことを特徴とする抗体。 - 【請求項57】 最低一つの軽鎖および最低一つの重鎖を持つ高効力中和抗
体であって、ここで前記軽鎖が配列識別番号:38、40、42、44、46、
48、50、52および54より成るグループから選択され、前記重鎖が配列識
別番号:37、39、41、43、45、47、49、51および53より成る
グループから選択されることを特徴とする抗体。
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