JP2003524612A - Immunomodulation methods using carbohydrate antigens - Google Patents

Immunomodulation methods using carbohydrate antigens

Info

Publication number
JP2003524612A
JP2003524612A JP2000584900A JP2000584900A JP2003524612A JP 2003524612 A JP2003524612 A JP 2003524612A JP 2000584900 A JP2000584900 A JP 2000584900A JP 2000584900 A JP2000584900 A JP 2000584900A JP 2003524612 A JP2003524612 A JP 2003524612A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lnnt
agent
ige
hsa
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000584900A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ドナルド・エイ・ハーン
光博 岡野
Original Assignee
プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ filed Critical プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Publication of JP2003524612A publication Critical patent/JP2003524612A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 免疫応答、詳細にはＩｇＥ応答をモジュレートする方法が提供される。該方法は、免疫応答をモジュレートする多価ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む作用剤に細胞を接触させることを含む。該方法は、非特異的ポリクローナルＩｇＥの産生促進、抗原特異的ＩｇＥ応答の発生阻害、サイトカイン産生誘導、ならびに脾臓細胞増殖刺激に有用である。好ましい具体例において、本発明は、インビボにおける抗原（例えば、アレルゲン）に対する免疫応答をモジュレートする方法を提供する。本発明の作用剤を含む、免疫応答をモジュレートするための医薬組成物も提供される。   (57) [Summary] Methods are provided for modulating an immune response, particularly an IgE response. The method comprises contacting the cell with an agent comprising polyvalent lacto-N-neotetraose (LNnT) that modulates an immune response. The method is useful for promoting the production of non-specific polyclonal IgE, inhibiting the generation of an antigen-specific IgE response, inducing cytokine production, and stimulating spleen cell proliferation. In a preferred embodiment, the invention provides a method of modulating an immune response to an antigen (eg, an allergen) in vivo. Also provided is a pharmaceutical composition for modulating an immune response, comprising an agent of the present invention.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】発明の背景 ぜん虫感染は、ヒトおよび実験動物において大量の血清ＩｇＥ産生に強く関連
している（King, CL. et al., (1993), J. Immunol. vol. 150 pp. 1873-1880;
Ogilvie BM, Nature 1964 204. 91-92; Sadun, EH. et al. (1970) Exp. Parasi
tol. vol. 28 pp. 435-449）。感染した宿主中の血清ＩｇＥの大部分は非特異的
かつポリクローナルである（Dessaint, JP. et al. (1975) Clin. Exp. Immunol
. vol. 20 pp. 427-436; Jarret, et al. (1976) Clin. Exp. Immunol. vol. 24
pp. 346-351）。かかるＩｇＥはぜん虫寄生体に対する免疫においていくつかの
役割を果たしている。Ａｇ（抗原）−特異的ＩｇＥ、特に、抗−成虫抗原は感染
に対する抵抗（Hagan, P. et al. (1991) Nature vol. 349 pp. 243-245; Viana
, IRC. et al. (1995) Parasite Immunol. vol. 17 pp. 297-304）および寄生体
に対する細胞により媒介される細胞毒性（Capron, A. et al. (1980) Am. J. Tr
op. Med. Hyg. vol. 29 pp. 849-857; Gounni, AS. et al. (1994) Nature vol.
367 pp. 183-186; Cutts, L. et al. (1997) Parasite Immunol. vol. 19 pp.
91-102）に関与している。一方、非特異的なポリクローナルＩｇＥは、エフェク
ター細胞上の利用可能なＥｃεＲｓを飽和させることにより寄生体抗原に対する
潜在的に致命的なアナフィラキシー反応の危険性を減じるので宿主および寄生体
の両方にとり有益であるが、ＩｇＥは住血吸虫の初期感染において宿主に対して
悪影響を及ぼす（Hagan, P. (1993) Parasite Immunol. vol. 15 p. 14; Pritch
ard, DI. (1993) Parasite Immunol. vol. 15 pp. 5-9; Amiri, P. et al. (199
3) J. Exp. Med. vol.180 pp. 43-51）。[0001] background helminth infection of the invention, are strongly associated with large amounts of serum IgE production in humans and experimental animals (King, CL. Et al. , (1993), J. Immunol. Vol. 150 pp. 1873 -1880;
Ogilvie BM, Nature 1964 204. 91-92; Sadun, EH. Et al. (1970) Exp. Parasi
tol. vol. 28 pp. 435-449). The majority of serum IgE in infected hosts is non-specific and polyclonal (Dessaint, JP. Et al. (1975) Clin. Exp. Immunol.
.vol. 20 pp. 427-436; Jarret, et al. (1976) Clin. Exp. Immunol. vol. 24
pp. 346-351). Such IgE plays several roles in immunity against helminth parasites. Ag (antigen) -specific IgE, particularly anti-adult antigens, are resistant to infection (Hagan, P. et al. (1991) Nature vol. 349 pp. 243-245; Viana.
, IRC. Et al. (1995) Parasite Immunol. Vol. 17 pp. 297-304) and cell-mediated cytotoxicity against parasites (Capron, A. et al. (1980) Am. J. Tr.
op. Med. Hyg. vol. 29 pp. 849-857; Gounni, AS. et al. (1994) Nature vol.
367 pp. 183-186; Cutts, L. et al. (1997) Parasite Immunol. Vol. 19 pp.
91-102). On the other hand, non-specific polyclonal IgE is beneficial to both host and parasite because it saturates the available EcεRs on effector cells thereby reducing the risk of potentially lethal anaphylactic reactions to parasite antigens. However, IgE adversely affects the host during the initial infection with schistosomiasis (Hagan, P. (1993) Parasite Immunol. Vol. 15 p. 14; Pritch
ard, DI. (1993) Parasite Immunol. vol. 15 pp. 5-9; Amiri, P. et al. (199
3) J. Exp. Med. Vol.180 pp. 43-51).

【０００２】 住血吸虫抗原中のいくつかのアレルギー性成分は、感染の種々の段階において
ヒトおよび齧歯類のＩｇＥと反応することが報告されている（Damonneville, M.
et al. (1984) Int. Arch. Allergy appl. Immunol. vol. 73 pp. 248-255; Ow
hashi, M. et al. (1986) Int. Arch. Allergy appl. Immunol. vol. 81 pp. 12
9-135）。しかしながら、宿主からのポリクローナルＩｇＥ産生を誘導する分子
についてはほとんど知られていない。トキソカラ・カニス（Toxocara canis）成
虫抗原は、増殖ならびにＩｇＧおよびＩｇＥ産生を誘導するＢ細胞***促進物質
活性を有するが、アレルギー性分子は未決定のままである（Wang, MQ. et al. (
1995) Parasite Immunol. vol. 17 pp. 609-615.Yamashita, U. et al. (1993)
Jap. J. Parasitol. vol. 42 pp. 211-219）。回虫（Ascaris）の体液もＢ細胞
***促進物質を含有しているが、この***促進物質は、ポリクローナルＩｇＥ産
生を誘導する他の因子により誘導体化されたＩＬ−４の助けを必要とする（McGi
bbon, AM. et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol. vol. 39 pp. 163-172; Le
e, TDG. et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. vol. 95 pp. 124-1254.Lee
, TDG. et al. (1993) Int. Arch. Allergy Immunol. vol. 102 pp. 185-190）
。２種の組み換えフィラリア蛋白はインビトロにおいてポリクローナルＩｇＥの
産生を誘導することができるが、それらは抗原特異的ＩｇＥも誘導する（Garrud
, O. et al. (1995) J. Immunol. vol. 155 pp. 131-1325）。[0002] Several allergic components in the schistosomiasis antigen have been reported to react with human and rodent IgE at various stages of infection (Damonneville, M.).
et al. (1984) Int. Arch. Allergy appl. Immunol. vol. 73 pp. 248-255; Ow
hashi, M. et al. (1986) Int. Arch. Allergy appl. Immunol. vol. 81 pp. 12
9-135). However, little is known about the molecules that induce polyclonal IgE production from the host. Adult Toxocara canis antigen has B cell mitogen activity that induces proliferation and IgG and IgE production, but allergenic molecules remain undetermined (Wang, MQ. Et al.
1995) Parasite Immunol. Vol. 17 pp. 609-615. Yamashita, U. et al. (1993)
Jap. J. Parasitol. Vol. 42 pp. 211-219). Ascaris fluid also contains B cell mitogens, which require the help of IL-4 derivatized with other factors that induce polyclonal IgE production (McGi
bbon, AM. et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol. vol. 39 pp. 163-172; Le
e, TDG. et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. vol. 95 pp. 124-1254.Lee
, TDG. Et al. (1993) Int. Arch. Allergy Immunol. Vol. 102 pp. 185-190)
. Two recombinant filarial proteins can induce the production of polyclonal IgE in vitro, but they also induce antigen-specific IgE (Garrud
, O. et al. (1995) J. Immunol. Vol. 155 pp. 131-1325).

【０００３】 シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）はポリラクトサミン糖含有
糖蛋白を合成する（Srivastan, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. vol. 267 pp
. 14730-14737; Van Dam, GJ. et al. (1994) Eur. J. Biochem. vol. 225 pp.
467-482）。エス・マンソニの成虫および卵に見出されたラクト−Ｎ−フコペン
タオースIII（ＬＮＦIII）は抗原決定基であることがわかている（KO, AI. et a
l. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 87 pp. 4159-4163）。ＬＮＦIII
は寄生体感染マウスの脾臓Ｂ細胞を刺激して増殖させ、Ｔｈ１免疫応答をダウン
レギュレーションするサイトカインＩＬ−１０を産生させる（W Velupillai, P.
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 91 pp. 18-22; Palanivel, V. et a
l. (1996) Exp. Parasitol. vol. 84 pp. 168-177; Velupillai, P. et al. (19
97) J. Immunol. vol. 158 pp. 338-344）。さらに、この糖は、それが物理的に
結合する蛋白に対する抗体（Ａｂ）およびサイトカインの両方の産生におけるＴ
ｈ２免疫反応の誘導においてアジュバント効果を有することがわかっている。 免疫応答の調節方法の開発において、免疫応答を特定のサイトカインプロファ
イルに偏向させる分子に関するさらなる洞察が重要であろう。詳細には、ポリク
ローナルＩｇＥの合成を誘導する分子の同定がアレルギー治療において極めて有
益であろう。Schistosoma mansoni synthesizes polylactosamine sugar-containing glycoproteins (Srivastan, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. Vol. 267 pp.
. 14730-14737; Van Dam, GJ. Et al. (1994) Eur. J. Biochem. Vol. 225 pp.
467-482). Lacto-N-fucopentaose III (LNFIII) found in S. mansoni adults and eggs has been found to be an antigenic determinant (KO, AI. Et a.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 87 pp. 4159-4163). LNFIII
Stimulates spleen B cells from parasite-infected mice to proliferate and produce the cytokine IL-10, which down-regulates Th1 immune responses (W Velupillai, P. et al.
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 91 pp. 18-22; Palanivel, V. et a
l. (1996) Exp. Parasitol. vol. 84 pp. 168-177; Velupillai, P. et al. (19
97) J. Immunol. Vol. 158 pp. 338-344). Furthermore, this sugar is a T in the production of both antibodies (Abs) and cytokines to the protein to which it physically binds.
It has been found to have an adjuvant effect in inducing the h2 immune response. Further insight into the molecules that bias the immune response towards specific cytokine profiles will be important in the development of methods to modulate the immune response. In particular, the identification of molecules that induce the synthesis of polyclonal IgE would be of great benefit in the treatment of allergies.

【０００４】発明の概要 本発明は、免疫応答を調節するための新規方法を提供する。本発明は、少なく
とも一部には、成虫におけるα１−３フコシルトランスフェラーゼによりＬＮＦ
IIIに変換されるＬＮＦIIIの未フコシル化ホモログＬＮｎＴの機能的特徴を見出
したことに基づく。多価ＬＮｎＴは、腹腔内（ＩＰ）接種によるマウスからのポ
リクローナルＩｇＥおよびサイトカイン産生を誘導する。この分子を用いて、エ
フェクター細胞上のＦｃεＲｓを飽和させることにより、寄生体抗原のみならず
環境アレルゲンに対するＩｇＥ応答をモジュレートすることができる。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides new methods for modulating the immune response. The present invention relates, at least in part, to LNF due to α1-3 fucosyltransferase in adults.
It is based on the finding of the functional characteristics of LNnT, an unfucosylated homolog of LNFIII that is converted to III. Multivalent LNnT induces polyclonal IgE and cytokine production from mice by intraperitoneal (IP) inoculation. This molecule can be used to saturate FcεRs on effector cells to modulate the IgE response to environmental antigens as well as to parasitic antigens.

【０００５】発明の詳細な説明 本発明は、免疫応答（例えば、非特異的ポリクローナルＩｇＥ産生、免疫細胞
有糸***誘発、または細胞による１種またはそれ以上のサイトカインの産生）を
モジュレートする作用剤に細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を接触させる、免疫モ
ジュレーション方法を提供する。本発明は、少なくとも一部には、ぜん虫寄生体
Schistosoma mansoniにより発現されると推定される炭水化物である多価ラクト
−Ｎ−ネオトレハロース（ＬＮｎＴ）で動物を免疫した場合において、ヒト血清
アルブミンに結合した多価ＬＮｎＴ（ＬＮｎＴ−ＨＳＡ）で２回腹腔内免疫され
た後に、ＢＡＬＢ／ＣおよびＣＢＡ／Ｊマウスの両方が、セイラインまたはＨＳ
Ａのみで免疫した群と比較して有意に多い量の全血清ＩｇＥを産生することを見
出したことに基づく。興味深いことに、当該炭水化物または担体蛋白に対する特
異的ＩｇＥはＥＬＩＳＡにおいて検出されず、多価ＬＮｎＴによるインビボにお
けるポリクローナルな非特異的ＩｇＥ産生の誘導が示唆された。そのうえ、この
新たな糖蛋白は炭水化物または担体蛋白のいずれに対しても有為なＩｇＧ産生を
促進しなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのみが、ＬＮｎＴ−ＨＳＡでの３回の免
疫の後に全血清ＩｇＥの上昇を示し、ＬＮｎＴ−ＨＳＡに対する株−依存的反応
が反映されていた。ＬＮｎＴ−ＨＳＡで免疫されたマウス由来の脾臓細胞はイン
ビトロにおいて、対照と比較して有意な量のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１
０ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。さらに、培養されたＢ２２０
＋細胞はＢ７−２（ＣＤ８６）の発現増加を示したが、Ｂ７−１（ＣＤ８０）の
発現増加を示さず、Ｂ７−２発現がＩｇＥのポリクローナルな産生に強く関連し
ていることが示唆された。さらに、ＩＬ−４遺伝子欠損ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、
ＬＮｎＴ−ＨＳＡでの免疫後にポリクローナルＩｇＥを産生しなかった。これら
のマウスからの脾臓細胞は、野生型と比較して低いが有意な量のＩＬ−５および
ＩＬ−１０を産生し、野生型と同量のＩＦＮ−γを産生し、ぜん虫寄生体により
本来的に発現される多価炭水化物により誘導されるポリクローナルＩｇＥ産生の
促進にＩＬ−４が重要であることが示唆された。[0005] The invention relates to immune response (e.g., non-specific polyclonal IgE production, immune cell mitogenesis, or one or more of the production of cytokines by cells) modulating acting agent A method of immune modulation is provided by contacting cells (eg, human immune cells) with the cells. The present invention is, at least in part, a helminth parasite.
When animals were immunized with polyvalent lacto-N-neotrehalose (LNnT), which is a carbohydrate putatively expressed by Schistosoma mansoni, it was intraperitoneally twice injected with polyvalent LNnT bound to human serum albumin (LNnT-HSA). Both BALB / C and CBA / J mice were challenged with saline or HS after being immunized internally.
Based on the finding that it produces significantly higher amounts of total serum IgE compared to the group immunized with A alone. Interestingly, no specific IgE to the carbohydrate or carrier protein was detected in the ELISA, suggesting induction of polyclonal non-specific IgE production in vivo by polyvalent LNnT. Moreover, this new glycoprotein did not stimulate significant IgG production against either carbohydrates or carrier proteins. Only C57BL / 6 mice showed elevated total serum IgE after 3 immunizations with LNnT-HSA, reflecting a strain-dependent response to LNnT-HSA. Spleen cells from mice immunized with LNnT-HSA have significant amounts of IL-4, IL-5 and IL-1 in vitro compared to controls.
0 and IL-2 and IFN-γ were produced. In addition, cultured B220
+ Cells showed increased expression of B7-2 (CD86) but not B7-1 (CD80), suggesting that B7-2 expression is strongly associated with polyclonal production of IgE. It was Furthermore, IL-4 gene-deficient BALB / C mice
No polyclonal IgE was produced after immunization with LNnT-HSA. Spleen cells from these mice produced lower but significant amounts of IL-5 and IL-10 compared to wild type, IFN-γ in the same amount as wild type, and by helminth parasites. It was suggested that IL-4 is important in promoting polyclonal IgE production induced by naturally expressed polyvalent carbohydrates.

【０００６】 さらなる実験により、デキストランに結合したＬＮｎＴもポリクローナルＩｇ
Ｅ応答を刺激し、抗原で免疫する前における多価ＬＮｎＴ（例えば、デキストラ
ンに結合したＬＮｎＴ）での前処理は抗原特異的ＩｇＥ応答を抑制することが示
された。多価ＬＮｎＴにより刺激されたポリクローナルＩｇＥの上昇したレベル
は維持される（例えば、少なくとも７０日間継続する）。ＩＬ−４のほかに、Ｔ
ｈ２型サイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１３の産生も、デキストランに結合
したＬＮｎＴにより刺激されるが、Ｔｈ１型サイトカインインターフェロンガン
マのレベルはデキストランに結合したＬＮｎＴでの処理により抑制される。Further experiments show that LNnT bound to dextran also shows polyclonal Ig
Pretreatment with multivalent LNnT (eg, LNnT conjugated to dextran) prior to stimulating the E response and immunizing with antigen was shown to suppress the antigen-specific IgE response. Elevated levels of polyclonal IgE stimulated by multivalent LNnT are maintained (eg, lasting at least 70 days). In addition to IL-4, T
The production of the h2 type cytokines IL-10 and IL-13 is also stimulated by LNnT bound to dextran, while the levels of the Th1 type cytokine interferon gamma are suppressed by treatment with LNnT bound to dextran.

【０００７】 よって、本発明の方法は、ＩｇＥ産生のモジュレーション（例えば、非特異的
ＩｇＥの刺激および／または抗原特異的ＩｇＥの阻害）ならびにサイトカイン産
生のモジュレーションを可能にする。したがって、本発明の免疫モジュレーショ
ン方法は、免疫応答を特定のサイトカイン分泌プロファイル、例えばＴｈ２応答
に向けることができる。本発明の免疫モジュレーション方法を用いた場合の、非
特異的ポリクローナルＩｇＥの産生に影響を及ぼす能力を、寄生体感染に対する
損傷性宿主反応の防止に使用でき、エフェクター細胞上のＦｃεＲｓを飽和させ
ることによる環境アレルゲンに対する防御に適用することもできる。そのうえ、
本発明の免疫モジュレーション方法を用いた場合の、例えばＴｈ２応答の発生に
対する影響能を、癌、感染性疾患（例えば、ＨＩＶおよび結核）、アレルギーお
よび自己免疫疾患を包含する種々の疾病の治療に適用することもできる。Thus, the methods of the invention allow for modulation of IgE production (eg, stimulation of non-specific IgE and / or inhibition of antigen-specific IgE) as well as modulation of cytokine production. Thus, the immunomodulation methods of the invention can direct the immune response to a particular cytokine secretion profile, eg Th2 response. The ability to influence the production of non-specific polyclonal IgE using the immunomodulation methods of the invention can be used to prevent damaging host responses to parasitic infections by saturating FcεRs on effector cells. It can also be applied to protection against environmental allergens. Besides,
The ability of the immunomodulation method of the invention to influence the development of, for example, Th2 responses is applied to the treatment of various diseases including cancer, infectious diseases (eg HIV and tuberculosis), allergies and autoimmune diseases. You can also do it.

【０００８】 本発明をより容易に理解するために、先ず、特定の用語を定義する。糖に関す
る標準的な略号を本明細書に使用する。 本明細書の用語「ラクト−Ｎ−ネオテトラオース」（ＬＮｎＴ）は、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースIIIの未フコシル化ホモログであるポリラクトサミン糖を
いい、少なくとも寄生体Schistosoma mansoniにおいて見出される。 本明細書の用語「多価ラクト−Ｎ−ネオテトラオース」（多価ＬＮｎＴ）は、
複数のＬＮｎＴ炭水化物が担体分子に結合されている形態のごとき、複数の炭水
化物部分を含むＬＮｎＴの形態をいう。 本明細書の用語「ＬＮｎＴを含む作用剤」は、ＬＮｎＴ炭水化物部分を含む分
子（複数も可）をいう。特定の具体例において、作用剤はＬＮｎＴを含むが、該
作用剤がエス・マンソニ（S. mansoni）由来の抗原またはトキソカラ・カニス（
Toxocara canis）に由来する抗原でなく、あるいは回虫体液でなく、あるいはポ
リクローナルＩｇＥを誘導可能なフィラリア蛋白でないことを条件とする。 本
明細書の用語「ルイスｙオリゴ糖」は、構造：｛Ｆｕｃ（α１−２）Ｇａｌ（β
１−４）［Ｆｕｃ（α１−３）］ＧｌｃＮａｃ｝を含むラクトII型炭水化物をい
う。 本明細書の用語「ヒト免疫細胞」は、サイトカインを産生しうるヒト免疫系の
細胞を包含する。ヒト免疫細胞の例はヒトＴ細胞、ヒトマクロファージおよびヒ
トＢ細胞を包含する。 本明細書の用語「Ｔ細胞」（すなわち、Ｔリンパ球）は、哺乳動物（例えば、
ヒトまたはマウス）の胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞等を包含するＴ細胞
系に属するすべての細胞を包含する。 本明細書の用語「Ｔヘルパータイプ２応答」（Ｔｈ２応答）は、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１またはそれ以上のサイトカ
インの産生により特徴づけられ、Ｔｈ２細胞により提供される有効なＢ細胞の「
援助」（例えば、ＩｇＧ１および／またはＩｇＥの産生促進）に関連している、
ＣＤ４＋Ｔ細胞による応答をいう。 本明細書の用語「Ｔｈ２応答の発生を調節するサイトカイン」は、Ｔｈ２応答
の開始および／または進行に影響するサイトカイン、詳細には、Ｔｈ２応答の発
生を促進するサイトカインを包含する。本発明の方法により産生される好ましい
サイトカインはＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０である。 本明細書の用語「モジュレーション」は、刺激（例えば、特定の応答または活
性の増加またはアップレギュレーション）ならびに阻害（例えば、特定の応答ま
たは活性の減少またはダウンレギュレーション）を包含する。 本明細書の用語「接触」（すなわち、作用剤を細胞と接触させること）は、イ
ンビトロにおいて作用剤と細胞とを一緒にしてインキュベーションすること（例
えば、作用剤を培養中の細胞に添加し）、ならびに作用剤を対象に投与して作用
剤と対象細胞とをインビボにおいて接触させることを包含する。 本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。In order to more easily understand the present invention, first, certain terms are defined. Standard abbreviations for sugars are used herein. As used herein, the term "lacto-N-neotetraose" (LNnT) refers to lacto-.
A polylactosamine sugar that is an unfucosylated homolog of N-fucopentaose III and is found at least in the parasite Schistosoma mansoni. As used herein, the term “multivalent lacto-N-neotetraose” (multivalent LNnT) refers to
A form of LNnT containing multiple carbohydrate moieties, such as a form in which multiple LNnT carbohydrates are attached to a carrier molecule. As used herein, the term "LNnT-comprising agent" refers to a molecule or molecules that comprises a LNnT carbohydrate moiety. In certain embodiments, the agent comprises LNnT, wherein the agent is an antigen from S. mansoni or Toxocara canis (
Toxocara canis) is not an antigen derived from Toxocara canis), is not roundworm body fluid, or is not a filamentous protein capable of inducing polyclonal IgE. As used herein, the term "Lewis y oligosaccharide" has the structure: {Fuc (α1-2) Gal (β
1-4) A lactoII type carbohydrate containing [Fuc (α1-3)] GlcNac}. As used herein, the term "human immune cell" includes cells of the human immune system that are capable of producing cytokines. Examples of human immune cells include human T cells, human macrophages and human B cells. The term “T cell” (ie, T lymphocyte) as used herein refers to a mammal (eg,
It includes all cells belonging to the T cell line, including human or mouse thymocytes, immature T cells, mature T cells and the like. The term “T helper type 2 response” (Th2 response) herein refers to IL-4, I.
Efficient B cell “provided by Th2 cells characterized by the production of one or more cytokines selected from L-5, IL-6 and IL-10.
Is associated with "assistance" (eg, promoting production of IgG1 and / or IgE),
Refers to the response by CD4 + T cells. The term “cytokine that regulates the development of a Th2 response” as used herein includes cytokines that influence the initiation and / or progression of a Th2 response, and in particular cytokines that promote the development of a Th2 response. Preferred cytokines produced by the methods of the invention are IL-4, IL-5 and IL-10. As used herein, the term “modulation” includes stimulation (eg, an increase or upregulation of a particular response or activity) as well as inhibition (eg, a decrease or downregulation of a particular response or activity). As used herein, the term “contacting” (ie, contacting an agent with a cell) means incubating the agent and the cell together in vitro (eg, adding the agent to cells in culture). , And administering the agent to a subject to bring the agent into contact with the cells of interest in vivo. Various aspects of the invention are described in further detail in the following subsections.

【０００９】 Ｉ．免疫モジュレーション作用剤 本発明の免疫モジュレーション方法において、インビトロまたはインビボにお
いて、細胞（例えば、ヒト免疫細胞、マクロファージ細胞またはＴ細胞）を作用
剤と接触させて免疫応答をモジュレーションする。好ましくは、後で詳細に説明
するように、作用剤それ自体がＬＮｎＴを含むものである。１の具体例において
、作用剤は、細胞による少なくとも１種のサイトカイン（例えば、Ｔｈ２応答の
発生を調節するサイトカイン）の産生を刺激する。もう１つの具体例において、
作用剤はＩＬ−４の産生を刺激する。もう１つの具体例において、作用剤は細胞
増殖（例えば、Ｂ細胞増殖）を刺激する。さらなる具体例において、作用剤は非
特異的ポリクローナルＩｇＥの産生を刺激する。I. Immune Modulation Agent In the method of immune modulation of the present invention, cells (eg, human immune cells, macrophage cells or T cells) are contacted with the agent in vitro or in vivo to modulate the immune response. Preferably, the agent itself comprises LNnT, as described in detail below. In one embodiment, the agent stimulates production by the cell of at least one cytokine (eg, a cytokine that regulates the development of a Th2 response). In another embodiment,
The agent stimulates the production of IL-4. In another embodiment, the agent stimulates cell proliferation (eg, B cell proliferation). In a further embodiment, the agent stimulates production of non-specific polyclonal IgE.

【００１０】 Ａ．作用剤 本発明の作用剤は、細胞によるサイトカイン産生を刺激し、細胞による非特異
的ポリクローナルＩｇＥの産生を刺激し、そして／あるいは細胞の増殖を刺激す
る。したがって、１の具体例において、作用剤はＬＮｎＴを含む化合物の刺激性
形態である。「ＬＮｎＴを含む化合物の刺激性形態」とは、典型的には、炭水化
物構造（例えば、ＬＮｎＴ）が多価かつ架橋された形態で存在している形態をい
う。好ましい具体例において、ＬＮｎＴを含む化合物の刺激性形態は、担体分子
と多価炭水化物分子（例えば、ＬＮｎＴ）との結合体である。例えば、炭水化物
分子をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のごとき蛋白担体に結合させることができ
る。糖−担体蛋白結合体を対象に投与する場合、担体蛋白に対する免疫学的反応
が対象内で刺激されないように担体蛋白を選択すべきである（例えば、ヒト担体
蛋白をヒト対象に使用すべきである等）。担体蛋白以外にも、多価ＬＮｎＴを他
の担体分子に結合させることもでき、例えば、インプラントおよび微小カプセル
デリバリーシステムを包含する除放性処方のごとき、身体からの迅速な除去から
化合物を防御する担体に結合させることもできる。ビニル酢酸エチル、ポリ無水
物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のご
とき生分解性で生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる処方の製造
方法は当業者に明らかであろう。Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals
, Inc.から市販材料を得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対
するモノクローナル抗体を含有し、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を
医薬上許容される担体として用いることもできる。これらを、当業者に知られた
方法、例えば米国特許第４５２２８１１号に記載された方法により製造すること
ができる。 他の好ましい担体は、炭水化物または多糖ポリマーのごときポリマーを包含す
る。好ましい炭水化物ポリマーはデキストランである。A. Agents Agents of the invention stimulate cytokine production by cells, stimulate non-specific polyclonal IgE production by cells, and / or stimulate cell proliferation. Thus, in one embodiment, the agent is a stimulatory form of a compound containing LNnT. "Stimulatory form of a compound containing LNnT" typically refers to the form in which the carbohydrate structure (eg, LNnT) exists in a multivalent and crosslinked form. In a preferred embodiment, the stimulatory form of the compound comprising LNnT is a conjugate of a carrier molecule and a polyvalent carbohydrate molecule (eg LNnT). For example, a carbohydrate molecule can be attached to a protein carrier such as human serum albumin (HSA). When a sugar-carrier protein conjugate is administered to a subject, the carrier protein should be selected so that the immunological response to the carrier protein is not stimulated in the subject (eg, human carrier proteins should be used in human subjects). There is). In addition to carrier proteins, polyvalent LNnT can also be conjugated to other carrier molecules to protect the compound from rapid elimination from the body, such as time-release formulations that include implants and microcapsule delivery systems. It can also be bound to a carrier. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethyl vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. It will be apparent to those skilled in the art how to make such formulations. Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals
Commercial materials can also be obtained from Inc. Liposomal suspensions, including monoclonal antibodies to viral antigens, including liposomes that target infected cells, can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be produced by methods known to those skilled in the art, such as the method described in US Pat. No. 4,522,811. Other preferred carriers include polymers such as carbohydrate or polysaccharide polymers. A preferred carbohydrate polymer is dextran.

【００１１】 結合体の刺激能の程度は担体に結合した糖の密度に影響される。好ましくは、
糖分子は結合体の少なくとも１０重量％であり、より好ましくは、結合体の少な
くとも１５重量％であり、さらに好ましくは、結合体の少なくとも２０重量％で
あり、さらに好ましくは、結合体の少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量
％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、あるいは少なくとも４５重
量％である。特定の具体例において、糖分子は結合体の約１０〜２５重量％、約
１５〜２５重量％、あるいは約２０〜２５重量％、あるいは約３０〜３５重量％
、あるいは約３５〜４０重量％、あるいは約４０〜４５重量％である。好ましい
具体例において、ＬＮｎＴを含む化合物の刺激性形態は多価炭水化物分子の結合
体である。より好ましくは、結合体は、結合体１個あたり１０〜１１、１２〜１
３、１４〜１５、１６〜１７、１８〜１９または２０個またはそれ以上の糖を含
む。本発明の方法に使用する作用剤は購入することができるか、あるいは標準的
方法により精製または合成することができる。ＬＮｎＴおよび担体蛋白（例えば
ＨＳＡ）の結合体はAccurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury
, NYから入手可能である。 上記のＬＮｎＴ含有結合体のほかに、別の形態のＬＮｎＴ含有刺激性作用剤は
、刺激活性に適した形態のＬＮｎＴを本来的に発現する単離蛋白である。The degree of stimulatory capacity of the conjugate is influenced by the density of sugars bound to the carrier. Preferably,
The sugar molecule is at least 10% by weight of the conjugate, more preferably at least 15% by weight of the conjugate, even more preferably at least 20% by weight of the conjugate, even more preferably at least 25% of the conjugate. %, At least 30%, at least 35%, at least 40%, or at least 45%. In certain embodiments, the sugar molecule is about 10-25%, about 15-25%, or about 20-25%, or about 30-35% by weight of the conjugate.
Or about 35 to 40% by weight, or about 40 to 45% by weight. In a preferred embodiment, the stimulatory form of the compound containing LNnT is a conjugate of polyvalent carbohydrate molecules. More preferably, the conjugate is 10-11, 12-1 per conjugate.
It contains 3, 14-15, 16-17, 18-19 or 20 or more sugars. The agents used in the methods of the invention can be purchased or can be purified or synthesized by standard methods. Conjugates of LNnT and carrier proteins (eg HSA) are available from Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury.
, Available from NY. In addition to the LNnT-containing conjugates described above, another form of LNnT-containing stimulatory agent is an isolated protein that inherently expresses a form of LNnT suitable for stimulatory activity.

【００１２】 免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激する本発明の作用剤の能力を、実施例
記載のごときインビトロ培養系を用いて評価することができる。選択された細胞
の培養に適した培地中において評価すべき作用剤の存在下で細胞を培養する。一
定時間（例えば、２４、４８、７２また１２０時間）後、培養上清中のサイトカ
インレベルを調べることによりサイトカイン産生を評価する。好ましくは、アッ
セイすべきサイトカインはＩＬ−４である。さらに、あるいは別法として、ＩＬ
−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および／またはＩＦＮ−γのレベルを
アッセイすることもできる。サイトカインに特異的に結合するモノクローナル抗
体を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のごとき標準的方法により
培養上清中のサイトカインレベルを測定することができる。サイトカイン産生を
刺激する作用剤の能力は、作用剤なしで培養された細胞上清中のサイトカインレ
ベルと比較して、作用剤存在下で培養された細胞上清中のサイトカイン（例えば
ＩＬ−４）の高いレベルにより明らかとなる。The ability of the agents of the invention to stimulate cytokine production by immune cells can be assessed using an in vitro culture system as described in the Examples. The cells are cultured in the presence of the agent to be evaluated in a medium suitable for culturing the selected cells. After a period of time (eg 24, 48, 72 or 120 hours), cytokine production is assessed by examining cytokine levels in the culture supernatant. Preferably, the cytokine to be assayed is IL-4. Additionally or alternatively, IL
Levels of -2, IL-5, IL-10, IL-13 and / or IFN-γ can also be assayed. Cytokine levels in culture supernatants can be measured by standard methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal antibodies that specifically bind to cytokines. The ability of an agent to stimulate cytokine production is compared to cytokine levels in cell supernatants cultured in the absence of the agent as compared to cytokines in cell supernatants cultured in the presence of the agent (eg IL-4). Higher levels of will become apparent.

【００１３】 細胞（例えば、免疫細胞）による非特異的ポリクローナルＩｇＥ産生を刺激す
る本発明の作用剤の能力を、実施例記載の方法のごとき方法を用いてインビトロ
において評価することができる。例えば、対象から単離された血清を、全ＩｇＥ
ならびに抗原特異的ＩｇＥの存在に関してサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析す
ることができる。簡単に説明すると、プレートを抗−ＩｇＥ抗体でコーティング
し、十分に洗浄し、プレートに対する試薬の非特異的吸着を防止するためにブロ
ックし、次いで、対象から単離された血清試料とともにインキュベーションする
。標識抗体（例えば、ビオチン化抗−ＩｇＥ抗体）を用いて、例えばペルオキシ
ダーゼ結合ストレプトアビジンを用いる検出により、抗原を検出することができ
る。その後、例えば、テトラメチル−ベンジジン基質を用いて反応物を発色させ
ることができる。さらにかかる方法は、１次抗体（例えば、プレートの最初のコ
ーティングに使用する抗体）の特異性を変化させることにより、例えば、抗原特
異的ＩｇＧ、ＨＳＡ特異的ＩｇＥ、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ特異的ＩｇＥならびに特異
的ＩｇＧサブタイプの検出に有用である。 実施例記載のごとき方法をインビトロにおいて用いて、細胞の増殖（例えば、
増殖応答）を刺激する本発明の作用剤の能力を評価することができる。例えば、
殺したマウスから脾臓細胞を単離し、適当な培地にてインビトロで培養し、次い
で、ＤＮＡ複製のインジケーターして３Ｈ−チミジンで標識することができる。The ability of the agents of the invention to stimulate non-specific polyclonal IgE production by cells (eg, immune cells) can be assessed in vitro using methods such as those described in the Examples. For example, serum isolated from a subject can be used to convert whole IgE
And can be analyzed by sandwich ELISA for the presence of antigen-specific IgE. Briefly, plates are coated with anti-IgE antibody, washed extensively, blocked to prevent non-specific adsorption of reagents to the plates, and then incubated with serum samples isolated from the subject. The antigen can be detected using a labeled antibody (eg biotinylated anti-IgE antibody), for example by detection using peroxidase conjugated streptavidin. The reaction can then be developed with, for example, a tetramethyl-benzidine substrate. In addition, such methods can be used, for example, by changing the specificity of the primary antibody (eg, the antibody used to initially coat the plate), eg, antigen-specific IgG, HSA-specific IgE, LNnT-HSA-specific IgE as well as specific. Useful for the detection of specific IgG subtypes. In vitro methods such as those described in the Examples were used to grow cells (eg,
The ability of the agents of the invention to stimulate a proliferative response) can be assessed. For example,
Spleen cells can be isolated from killed mice, cultured in vitro in a suitable medium and then labeled with 3 H-thymidine as an indicator of DNA replication.

【００１４】 ＩＩ．医薬組成物 本発明のもう１つの態様は、本発明の作用剤（例えば、刺激性作用剤）の医薬
組成物に関するものである。典型的には、本発明の医薬組成物は本発明の作用剤
および医薬上許容される担体を含む。本明細書の用語「医薬上許容される担体」
は、生理学的に許容されるいずれかおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング
、抗細菌および抗真菌作用剤、等張剤および吸収遅延剤等を包含する。意図され
た投与経路に基づいて担体のタイプを選択することができる。種々の具体例にお
いて、担体は静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経皮または経口投与に適したもの
である。好ましい具体例において、腹腔内投与に適するように組成物を処方する
。医薬上許容される担体は、滅菌済み水溶液または分散物、ならびに即座に注射
用滅菌済み溶液または分散物を調製するための滅菌済み粉末を包含する。医薬上
活性のある物質のためのかかる媒体および作用剤の使用は当該分野においてよく
知られている。慣用的な媒体または作用剤が活性化合物に適合しない場合を除き
、本発明の組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物を組
成物中に含有させることもできる。II. Pharmaceutical Compositions Another aspect of the invention pertains to pharmaceutical compositions of agents (eg, stimulatory agents) of the invention. Typically, the pharmaceutical composition of the present invention comprises the agent of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier"
Includes any and all physiologically acceptable solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The type of carrier can be selected based on the intended route of administration. In various embodiments, the carrier is suitable for intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, transdermal or oral administration. In a preferred embodiment, the composition is formulated to be suitable for intraperitoneal administration. Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions as well as sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile solutions or dispersions for injection. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Their use in the compositions of the present invention is contemplated, unless the conventional vehicle or agent is not compatible with the active compound. Supplementary active compounds can also be included in the compositions.

【００１５】 典型的には、治療組成物は滅菌されたものであり、製造および保存条件下で安
定なものでなくてはならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソ
ーム、または高い薬剤濃度に適した他の秩序ある構造として処方することができ
る。担体は溶液または分散媒であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオー
ル（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレング
リコール等）、ならびに適当なそれらの混合物であってもよい。例えば、レシチ
ンのごときコーティング剤を使用することにより、分散物の場合には所望粒子サ
イズを維持することにより、あるいは界面活性剤を使用することにより、正しい
流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニト
ール、ソルビトールのごとき多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物中
に含有させることが好ましいであろう。吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノ
ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含ませることにより注射可能組成物
の延長された吸収を実現することができる。そのうえ、モジュレーターを除放処
方として、例えば、除放性ポリマーを含有する組成物として投与することもでき
る。インプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリーシステムを包含する制
御放出処方のように、急速な放出から化合物を防御する担体とともに活性化合物
を調製することができる。ビニル酢酸エチレン、ポリ無水物、ポリグリコール酸
、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸
コポリマー（ＰＬＧ）のごとき生分解性で生体適合性のポリマーを用いることが
できる。かかる処方を調製するための多くの方法が特許され、あるいは当業者に
広く知られている。[0015] Typically, the therapeutic composition must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The composition can be formulated as a solution, microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration. The carrier can be a solution or dispersion medium, such as water, ethanol, polyols (such as glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol), and suitable mixtures thereof. Correct fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the desired particle size in the case of dispersion or by the use of surfactants. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, mannitol, polyhydric alcohols such as sorbitol, or sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by including in the composition an agent that delays absorption, for example, monostearate salts and gelatin. Moreover, the modulator may be administered as a sustained release formulation, for example, a composition containing a sustained release polymer. The active compounds can be prepared with carriers that will protect the compound against rapid release, such as a controlled release formulation, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, polylactic acid and polylactic acid polyglycolic acid copolymer (PLG) can be used. Many methods for preparing such formulations are patented or well known to those skilled in the art.

【００１６】 上記成分の１つまたは組み合わせを含有する適当な溶媒に必要量の活性化合物
を含ませることにより滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、
基本的な分散媒および上記した必要な他の成分を含有する滅菌済み担体中に活性
化合物を含ませることにより分散物を調製する。滅菌済み注射可能溶液を調製す
るための滅菌済み粉末の場合には、好ましい製造方法は、前以て滅菌濾過された
溶液から有効成分およびさらなる所望成分を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥
である。Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the active compound in the required amount in an appropriate solvent with one or a combination of the above ingredients. In general,
Dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile carrier which contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of manufacture are vacuum drying and freeze-drying, which yields the active ingredient and further desired ingredients from a previously sterile-filtered solution.

【００１７】 投与経路に応じて、作用剤を不活性化させる可能性のある酵素、酸および他の
自然条件から作用剤を防御する材料中に作用剤を被覆してもよい。例えば、酵素
阻害剤と同時投与される適当な担体または希釈剤に入れて、あるいはリポソーム
のごとき適当な担体に入れて、作用剤を対象に投与することができる。医薬上許
容される希釈剤はセイラインおよびバッファー水溶液を包含する。酵素阻害剤は
膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）および
トラシロールを包含する。リポソームは水中油中水エマルジョンならびに慣用的
なリポソームを包含する（Strejan, et al., (1984) Ｊ. Neuroimmunol 7: 27）
。グリセロール中、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、お
よび油中に分散物を調製することもできる。通常の保存および使用条件下におい
て、これらの調合品は微生物の増殖を防止する保存料を含んでいてもよい。Depending on the route of administration, the agent may be coated in a material that protects the agent from enzymes, acids and other natural conditions that can inactivate the agent. For example, the agent can be administered to the subject in a suitable carrier or diluent that is co-administered with the enzyme inhibitor, or in a suitable carrier such as a liposome. Pharmaceutically acceptable diluents include saline and aqueous buffer solutions. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropylfluorophosphate (DEP) and trasilol. Liposomes include water-in-oil-in-water emulsions as well as conventional liposomes (Strejan, et al., (1984) J. Neuroimmunol 7:27).
. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols, and mixtures thereof, and in oils. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations may contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

【００１８】 好ましくは、治療上有効量の活性作用剤（例えば、本発明の刺激性作用剤）を
組成物中に処方する。「治療上有効量」は、例えば、必要な用量を必要な期間投
与する場合において、十分なレベルの非特異的ポリクローナルＩｇＥを産生させ
ることにより特定の疾病状態の治療コースに影響を及ぼすような所望の治療結果
を得るのに十分な量をいう。活性作用剤の治療上有効量は、個体の疾病状態、年
齢、性別、および体重、ならびに個体において所望応答を誘発する作用剤の能力
のごとき因子により変更されうる。投与規則を調節して最適治療応答を得てもよ
い。治療上有効量は、作用剤の毒性または損傷性効果よりも治療上の有益な効果
が優っている量でもある。 もう１つの具体例において、予防上有効量の活性作用剤を組成物中に処方する
。「予防上有効量」は、例えば、必要な用量を必要な期間投与する場合において
、予防を目的として十分なレベルの非特異的ポリクローナルＩｇＥを産生させる
ことに影響を及ぼすような所望の予防結果を得るのに十分な量をいう。典型的に
は、疾病前または疾病初期において予防的な量が対象に使用されるので、予防上
有効量は治療上有効量よりも少量であろう。[0018] Preferably, a therapeutically effective amount of the active agent (eg, a stimulatory agent of the invention) is formulated in the composition. A "therapeutically effective amount" is desired to affect the course of treatment of a particular disease state by producing sufficient levels of non-specific polyclonal IgE, for example when the required dose is administered for the required period. A sufficient amount to obtain the therapeutic result of. A therapeutically effective amount of an active agent can be modified by factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual, and the ability of the agent to elicit the desired response in the individual. Dosage regima may be adjusted to provide the optimum therapeutic response. A therapeutically effective amount is also one in which any toxic or damaging effects of the agent are outweighed by the therapeutically beneficial effects. In another embodiment, a prophylactically effective amount of the active agent is formulated in the composition. A "prophylactically effective amount" is, for example, when a desired dose is administered for a necessary period of time, a desired prophylactic result that affects the production of a sufficient level of non-specific polyclonal IgE for the purpose of prevention is obtained. An amount sufficient to obtain. Typically, a prophylactically effective amount will be less than a therapeutically effective amount, as a prophylactic amount will be used in the subject before or during the early stages of the disease.

【００１９】 本発明の刺激性または阻害性作用剤の治療上または予防上有効な量に関する非
限定的な範囲は０．０１ｎＭ〜２０ｍＭである。改善すべき症状の重さに応じて
投与量を変更してもよいことに注意すべきである。特定の患者に関しては、個々
の必要性ならびに組成物を投与し、投与を管理するプロフェッショナルの判断に
応じて特別な投与規則を経時的に調節すべきであり、本明細書に示した用量範囲
は例示であって本発明の組成物の範囲および実施を限定するものではないことが
、さらに理解されるべきである。A non-limiting range for a therapeutically or prophylactically effective amount of a stimulatory or inhibitory agent of the invention is 0.01 nM to 20 mM. It should be noted that the dose may be changed depending on the severity of symptoms to be improved. For a particular patient, specific dosing regimens should be adjusted over time depending on the individual need as well as the administration of the composition and the discretion of the professional managing the administration, and the dose ranges provided herein are It should be further understood that it is illustrative and not limiting the scope and practice of the compositions of the present invention.

【００２０】 組成物中の活性化合物量を、個体の疾病状態、年齢、性別、および体重のごと
き因子に応じて変更してもよい。例えば、１回のボーラスを投与してもよく、数
回に別けて投与してもよく、あるいは治療状況の緊急性により示されるように投
与量を減少または増加させてもよい。投与容易性および投与均一性のために、非
経口組成物を用量単位形態として処方することが特に有利である。本明細書の用
語「用量単位形態」は、治療すべき哺乳動物に１単位として与えるのに適した、
物理的に別個の単位をいう。各単位は、必要な医薬担体に関連して所望治療効果
が得られるように計算された、予め決められた量の活性化合物を含む。本発明の
用量単位形態に関する詳細は、（ａ）活性化合物に特有の特性および達成すべき
個々の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性を治療するための活性化合
物のごとき配合の当該分野に固有の制限により決定され、依存する。The amount of active compound in the composition may vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered, or the dose may be reduced or increased as indicated by the exigencies of the therapeutic situation. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. The term “dosage unit form” herein is suitable to be given as one unit to the mammal to be treated,
A physically distinct unit. Each unit contains a predetermined quantity of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the required pharmaceutical carrier. Details regarding the dosage unit forms of the invention are specific to the art of (a) unique properties of the active compound and the particular therapeutic effect to be achieved, and (b) formulation of the active compound for treating susceptibility in an individual. Determined by the limits of and depend on.

【００２１】 本発明の作用剤を、該作用剤が唯一の活性化合物である医薬組成物中に処方す
ることができる。別法として、医薬組成物がさらなる活性化合物を含んでいても
よい。例えば、２種またはそれ以上の作用剤を組み合わせて使用してもよい。そ
のうえ、本発明の作用剤を、免疫モジュレーション特性を有する１種またはそれ
以上の他の作用剤と組み合わせてもよい。例えば、刺激性作用剤を、１種または
それ以上のサイトカインまたはアジュバントと組み合わせてもよい。The agents of the invention can be formulated in pharmaceutical compositions where the agent is the only active compound. Alternatively, the pharmaceutical composition may comprise further active compounds. For example, two or more agents may be used in combination. Moreover, the agents of the invention may be combined with one or more other agents that have immunomodulating properties. For example, the stimulatory agent may be combined with one or more cytokines or adjuvants.

【００２２】 刺激性または阻害性の作用剤を含む本発明の医薬組成物を対象に投与して、対
象における免疫応答（例えば、非特異的ポリクローナルＩｇＥの産生）をモジュ
レートすることができる。本明細書の用語「対象」は、免疫応答を誘発すること
のできる生きた生物、例えば、哺乳動物を包含する。対象の例はヒト、イヌ、ネ
コ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種を包含する。 特定の投与経路に適合するように本発明の医薬組成物を処方することができる
。例えば、種々の具体例において、本発明の医薬組成物は注射、吸入またはガス
注入（口または鼻のいずれかから）に適したものとすることができ、あるいは鼻
腔内、粘膜、経口、ほほ側、非経口、直登、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮
下デリバリーに適したものとすることができる。 特定の具体例において、免疫応答をモジュレートするような特定の目的に、ア
レルギー反応をモジュレートまたは自己免疫疾患をモジュレートするためのアジ
ュバントとして使用するために本発明の医薬組成物を使用する場合の説明書を添
付して、本発明の医薬組成物を包装することができる。A pharmaceutical composition of the invention containing a stimulatory or inhibitory agent can be administered to a subject to modulate an immune response (eg, production of non-specific polyclonal IgE) in the subject. As used herein, the term "subject" includes a living organism, such as a mammal, that is capable of eliciting an immune response. Examples of subjects include humans, dogs, cats, mice, rats, and transgenic species thereof. The pharmaceutical composition of the invention may be formulated to suit a particular route of administration. For example, in various embodiments, the pharmaceutical compositions of the invention may be suitable for injection, inhalation or insufflation (either from the mouth or nose), or intranasally, mucosally, orally, or on the cheek. It can be suitable for parenteral, direct climbing, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous delivery. In a particular embodiment, the use of a pharmaceutical composition of the invention for use as an adjuvant to modulate an allergic reaction or an autoimmune disease for a particular purpose such as modulating an immune response. The pharmaceutical composition of the present invention can be packaged together with the instructions.

【００２３】 ＩＩＩ．免疫応答のモジュレーション 本発明は、種々の免疫応答をモジュレートするのに使用できる免疫モジュレー
ション方法を提供する。本発明の方法において、細胞を作用剤（例えば、ＬＮｎ
Ｔを含む作用剤）と接触させて細胞の免疫応答をモジュレートする（すなわち、
刺激する）。本発明の方法をインビトロまたはインビボにおいて実施することが
できる。本発明の方法をインビトロで実施するために、標準的方法により対象か
ら細胞を得て、インビトロにおいて本発明の作用剤とともにインキュベーション
（すなわち、培養）して、例えば、サイトカイン産生、非特異的ポリクローナル
ＩｇＥの産生、免疫細胞（例えば、脾臓細胞）の増殖、あるいはＴｈ２応答の発
生をモジュレートすることができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を対
象から得て、例えばFicoll/Hypaqueを用いる密度勾配遠心分離により単離するこ
とができる。標準的な方法を用いて、特定の細胞集団を枯渇または豊富化させる
ことができる。例えば、プラスチックへの付着により単球／マクロファージを単
離することができる。例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞表面マーカーを用いる陽性お
よび／または陰性選択により、例えば、特異的なマウスモノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）とともに細胞をインキュベーションし、次いで、抗−マウス−Ｉｇで被覆
した磁性ビーズを用いてｍＡｂに結合する細胞を単離することにより、Ｔ細胞ま
たはＢ細胞を豊富化または枯渇させることができる。細胞表面マーカーに対する
モノクローナル抗体は市販されている。III. Modulation of Immune Responses The present invention provides immunomodulation methods that can be used to modulate various immune responses. In the method of the present invention, cells are treated with an agent (eg, LNn
A T-containing agent) to modulate the immune response of the cell (ie,
stimulate). The method of the present invention can be performed in vitro or in vivo. To perform the method of the invention in vitro, cells are obtained from a subject by standard methods and incubated (ie, cultured) with an agent of the invention in vitro to produce, for example, cytokine production, non-specific polyclonal IgE. Production, proliferation of immune cells (eg, spleen cells), or development of a Th2 response can be modulated. For example, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) can be obtained from a subject and isolated by density gradient centrifugation using, for example, Ficoll / Hypaque. Standard methods can be used to deplete or enrich a particular cell population. For example, monocytes / macrophages can be isolated by attachment to plastic. For example, by positive and / or negative selection using T cell or B cell surface markers, for example, specific mouse monoclonal antibodies (m
T cells or B cells can be enriched or depleted by incubating the cells with Ab) and then isolating cells that bind the mAb using magnetic beads coated with anti-mouse-Ig. Monoclonal antibodies against cell surface markers are commercially available.

【００２４】 本発明の方法をインビボにおいて実施するために、例えば、対象におけるサイ
トカイン産生、非特異的ポリクローナルＩｇＥ産生、免疫細胞増殖、またはＴｈ
２応答発生をモジュレートするような、あるいは寄生体感染に対する損傷性宿主
反応を防止するような、あるいは対象におけるエフェクター細胞上のＦｃεＲｓ
を飽和させることにより環境アレルゲンに対して防御するような、あるいは対象
における疾病または疾患（例えば、アレルギーまたは自己免疫疾患）を抑制する
ような所望効果を達成するに十分な量の作用剤を医薬上許容される担体に入れて
対象に投与する。所望免疫モジュレーション効果を達成するに適したいすれの投
与経路であっても本発明により企図される。作用剤に関する１の好ましい投与経
路は腹腔内である。もう１つの好ましい投与経路は経口である。さらにもう１つ
の好ましい投与経路は静脈内である。疾病状態の治療への本発明の方法の適用は
、症状の治癒、長期または短期にわたる症状に関連した徴候のタイプまたは数の
減少（すなわち症状の改善）、あるいは対象に対する単なる一時的な有益な効果
をもたらす可能性がある。To perform the methods of the invention in vivo, for example, cytokine production, non-specific polyclonal IgE production, immune cell proliferation, or Th in a subject.
FcεRs on the effector cells in a subject, such as modulating the development of a 2-response or preventing a damaging host response to a parasitic infection
Pharmaceutically to provide a sufficient amount of the agent to achieve a desired effect such as protection against environmental allergens by saturating the drug or suppressing a disease or disorder (eg, allergy or autoimmune disease) in the subject. It is administered to the subject in an acceptable carrier. Any route of administration suitable for achieving the desired immune modulation effect is contemplated by the present invention. One preferred route of administration for the agent is intraperitoneal. Another preferred route of administration is oral. Yet another preferred route of administration is intravenous. Application of the method of the invention to the treatment of a disease state may result in a cure of symptoms, a reduction in the type or number of symptoms associated with symptoms over a long or short term (ie improvement of symptoms), or merely a temporary beneficial effect on the subject. Could bring.

【００２５】 優勢なＴｈ２型応答に関連した多くの疾病状態が確認されており、疾病状態に
かかっている個体で生じている当該タイプの応答をモジュレートすることにより
利益が得られるであろう。本発明の免疫モジュレーション方法の適用例は癌、感
染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、および炎症性の腸疾患のごとき疾患であ
る。上記疾病状態のほかに、本発明の免疫モジュレーション方法は他の目的にも
有用である。例えば、本発明の方法（すなわち、刺激性作用剤を用いる方法）を
用いてインビトロでのサイトカイン（ＩＬ−４のごとき）産生を刺激して、これ
らのサイトカインを商業的に製造することができる（例えば、インビトロにおい
て細胞を刺激性作用剤とともに培養してＩＬ−４産生を刺激し、ＩＬ−４を培養
上清から回収し、必要ならばさらに精製し、市販用に包装することができる）。 限定的と解すべきでない下記実施例により本発明をさらに説明する。本願にお
いて引用されているすべての文献、特許および公開特許出願を、出典明示により
本明細書に一体化させる。Many disease states have been identified associated with a predominant Th2-type response, and it would be beneficial to modulate the type of response occurring in individuals with the disease state. Application examples of the immunomodulation method of the present invention are diseases such as cancer, infectious diseases, allergies, autoimmune diseases, and inflammatory bowel diseases. In addition to the above disease states, the immunomodulation methods of the invention are useful for other purposes as well. For example, in vitro cytokine (such as IL-4) production can be stimulated using the methods of the invention (ie, methods that use stimulatory agents) to produce these cytokines commercially ( For example, cells can be cultured in vitro with a stimulatory agent to stimulate IL-4 production, IL-4 can be recovered from the culture supernatant, further purified if necessary, and packaged commercially). The invention is further described by the following examples which should not be construed as limiting. All documents, patents and published patent applications cited in this application are incorporated herein by reference.

【００２６】 実施例 実施例において使用した材料および方法動物 若い成体（生後７〜９週）ＣＢＡ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ＣおよびＣ５７ＢＬ／６株
のメスのマウスをHarlan（Indianapolis, IN）から購入した。メスのＣＢＡ／Ｃ
ａＪ ｘｉｄおよび生後日数をマッチさせた対照のメスＣＢＡ／ＣａＪマウスをJ
ackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した。記載されたようにして（
）ＩＬ−４欠損ＢＡＬＢ／Ｃマウスを得た。この欠損マウスは、Harvard Medica
l Area Research Committeeにより示された指針に沿ってHarvard School of Pub
lic Healthにおいて飼育され維持された。EXAMPLES Materials and Methods Used in the Examples Animals Young adult (7-9 weeks old) CBA / J, BALB / C and C57BL / 6 strain female mice were purchased from Harlan (Indianapolis, IN). Female CBA / C
Control female CBA / CaJ mice matched for aJ xid and postnatal days
Purchased from ackson Laboratory (Bar Harbor, ME). As described (
) IL-4-deficient BALB / C mice were obtained. This deficient mouse is the Harvard Medica
l Harvard School of Pub according to the guidelines given by Area Research Committee
Raised and maintained at lic Health.

【００２７】抗原および接種 多価炭水化物用担体蛋白としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を選択した。な
ぜなら、ＨＳＡは単純蛋白であり、炭水化物モチーフを含まないからである。Ac
curate Chemical and Corporation (NY)により多価ＬＮｎＴまたはルイスγがＨ
ＳＡと結合させられた（ＬＮｎＴ−ＨＳＡおよびＬｅｙ−ＨＳＡ）。両方の新規
糖蛋白において、１３分子の糖が１分子のＨＳＡに結合していた。対照として、
ＨＳＡ（Sigma Chemical Co., MO）、アラムに吸着したＨＳＡ（Intergen Compa
ny, NY; HSA-アラム）、またはDulbeccoのＰＢＳ（Gibco BRL, NY）を調製して
免疫用とした。抗原（１０μｇのＨＳＡ）またはセイラインを用いて４〜６匹の
マウスからなる群を腹腔内または皮下免疫した。それぞれ２週間後および３週間
後に同じ方法で１回目および２回目の追加免疫を行った。ビシンコニン酸（ＢＣ
Ａ）アッセイ（Pierce, IL）により蛋白濃度を調べた。Human serum albumin (HSA) was selected as the carrier protein for the antigen and inoculum polyvalent carbohydrate. This is because HSA is a simple protein and contains no carbohydrate motif. Ac
Polyvalent LNnT or Lewis γ is H by curate Chemical and Corporation (NY)
It was allowed to bind to the SA (LNnT-HSA and Le y -HSA). In both novel glycoproteins, 13 molecules of sugar were bound to 1 molecule of HSA. As a control
HSA (Sigma Chemical Co., MO), HSA adsorbed on alum (Intergen Compa
ny, NY; HSA-alum) or Dulbecco's PBS (Gibco BRL, NY) was prepared for immunization. Groups of 4-6 mice were immunized intraperitoneally or subcutaneously with antigen (10 μg HSA) or saline. The first and second boosts were given in the same manner after 2 and 3 weeks, respectively. Bicinchoninic acid (BC
A) Protein concentration was examined by assay (Pierce, IL).

【００２８】血清Ａｂ力価の決定 １次免疫、１回目の追加免疫、２回目の追加免疫からそれぞれ１０、６、５日
目に、免疫されたマウスの尾から採血した。サンドイッチＥＬＩＳＡにより全Ｉ
ｇＥおよびＨＳＡ特異的ＩｇＥを調べた。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレー
ト（Corning Inc., NY）を、炭酸塩−重炭酸塩バッファー，ｐＨ９．６中５μｇ
／ｍｌのラット抗−マウスＩｇＥ １００μｌで４℃において一晩被覆した。０
．０５％ツイン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した後、１０％
ＦＣＳおよび０．３％ツイン２０を含有する２００μｌのＰＢＳでプレートを
３７℃において２時間ブロックした。上記のごとく洗浄した後、系列希釈した血
清または標準マウスＩｇＥｍＡｂ（Pharmingen, CA）の１００μｌの試料をウェ
ルに添加し（２系）、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、１００
μｌのビオチン化抗−マウスＩｇＥ ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ，Pharmingen）
またはビオチン化ＨＳＡ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、全ＩｇＥおよびＨＳＡ−
特異的ＩｇＥをそれぞれ検出した。３７℃で２時間インキュベーション後、プレ
ートを洗浄し、１／１０００に希釈された１００μｌのペルオキシダーゼ結合ス
トレプトアビジン（Sigma）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベー
ションした。最後に、プレートを８回洗浄し、テトラメチル−ベンジジン基質（
Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を添加することによ
り反応物を発色させ、リン酸（０．４Ｍ）を添加することにより発色を停止させ
た。UVMax自動プレートリーダー（Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA）
にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。ビオチン化には、重炭酸ナトリウムバッフ
ァーｐＨ８．５中のＨＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）をビオチン（ロングアーム）Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル（Vector Lab., CA）とともに室温で２時間イ
ンキュベーションし、５μｌのエタノールアミンを添加することにより反応を停
止し、次いで、ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウムを用いて一晩透析した。 抗原特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを調べた。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレ
ートを、炭酸塩−重炭酸塩バッファー中の抗原（２μｇ／ｍｌ）１００μｌで４
℃において一晩被覆し、上記のごとくブロックした。次いで、２倍きざみで１０
０回系列希釈した個体血清由来の試料とともに、３７℃で２時間プレートをイン
キュベーションし、次いで、ヤギ抗−マウスＩｇＧ ｍＡｂ−ペルオキシダーゼ
結合体（Boehringer-Mannheim, IN）とともに３７℃で１時間インキュベーショ
ンした。その後、上記のごとくプレートを発色させ、発色を停止させた。最後に
、UVMax自動プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を終点
力価として表し、終点は、バックグラウンド吸光度の２倍よりも高い吸光度が得
られる最終血清希釈倍率とした。抗−マウスＩｇＧ ｍＡｂ−セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ−標識結合体の最適希釈倍率は１／１０００と決定された。被覆
抗原としてＬＮｎＴ−ＨＳＡ（２μｇ／ｍｌ）を用い、ビオチン化抗−マウスＩ
ｇＥｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ，Pharmingen）、次いで、アビジンペルオキシダーゼ
結合体（Sigma）を検出Ａｂとして用いて、これと同じ方法でＬＮｎＴ−ＨＳＡ
に特異的な血漿ＩｇＥも試験した。 ＥＬＩＳＡにより血清全ＩｇＧイソタイプも調べた。プレートを、２μｇ／ｍ
ｌのラット抗−マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３ ｍＡ
ｂ（Pharmingen）１００μｌで４℃において一晩被覆した。上記のごとく洗浄し
、ブロックした後、系列希釈した血清または標準マウスＩｇＧイソタイプ（Phar
mingen）の試料１００μｌをウェルに添加し（２系）、３７℃で２時間インキュ
ベーションした。その後、１／１０００に希釈された１００μｌのペルオキシダ
ーゼ−結合ポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇ（Pharmingen）を添加し、３７℃
で１時間インキュベーションした。洗浄後、上記のごとく反応物を発色させ、次
いで、発色を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。Determination of Serum Ab Titers Immunized mice were bled on the 10th, 6th, and 5th days after the primary immunization, the first booster, and the second booster, respectively. All by sandwich ELISA
The gE and HSA-specific IgE were examined. Briefly, ELISA plates (Corning Inc., NY) were loaded with 5 μg in carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6.
/ Ml rat anti-mouse IgE 100 μl coated overnight at 4 ° C. 0
． After washing 4 times with PBS containing 05% Twin 20 (PBS-T), 10%
Plates were blocked with 200 μl PBS containing FCS and 0.3% Twin 20 for 2 hours at 37 ° C. After washing as above, 100 μl samples of serially diluted serum or standard mouse IgEmAb (Pharmingen, CA) were added to the wells (2 lines) and incubated for 2 hours at 37 ° C. Then 100
μl biotinylated anti-mouse IgE mAb (0.5 μg / ml, Pharmingen)
Alternatively, biotinylated HSA (1 μg / ml) was added to add total IgE and HSA-
Each specific IgE was detected. After incubation at 37 ° C for 2 hours, the plate was washed, 100 µl of peroxidase-conjugated streptavidin (Sigma) diluted 1/1000 was added to each well, and incubated at 37 ° C for 1 hour. Finally, the plate was washed 8 times and the tetramethyl-benzidine substrate (
Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) was added to develop the reaction, and phosphoric acid (0.4 M) was added to stop the development. UVMax Automated Plate Reader (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA)
The absorbance at 450 nm was measured at. For biotinylation, HSA (2 mg / ml) in sodium bicarbonate buffer pH 8.5 was incubated with biotin (long arm) N-hydroxysuccinimide ester (Vector Lab., CA) for 2 hours at room temperature and 5 μl of ethanol was added. The reaction was stopped by adding amine, then dialyzed against PBS / 0.05% sodium azide overnight. Antigen-specific IgG ELISA was examined. Briefly, ELISA plates were plated with 100 μl of antigen (2 μg / ml) in carbonate-bicarbonate buffer.
Coated overnight at ° C and blocked as above. Next, double the size to 10
Plates were incubated at 37 ° C. for 2 hours with samples from 0 times serial dilutions of individual serum, followed by 1 hour incubation at 37 ° C. with goat anti-mouse IgG mAb-peroxidase conjugate (Boehringer-Mannheim, IN). Thereafter, the plate was developed as described above and the development was stopped. Finally, the absorbance at 450 nm was measured with a UVMax automatic plate reader. The results were expressed as end point titers, where the end point was the final serum dilution factor that gave an absorbance greater than twice background absorbance. The optimal dilution of anti-mouse IgG mAb-horseradish peroxidase-labeled conjugate was determined to be 1/1000. LNnT-HSA (2 μg / ml) was used as a coating antigen, and biotinylated anti-mouse I was used.
LNnT-HSA was obtained in the same manner using gEmAb (1 μg / ml, Pharmingen) followed by avidin peroxidase conjugate (Sigma) as detection Ab.
Plasma IgE specific for the was also tested. Serum total IgG isotype was also examined by ELISA. Plate 2 μg / m
1 rat anti-mouse IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 mA
b (Pharmingen) 100 μl coated overnight at 4 ° C. After washing and blocking as above, serially diluted serum or standard mouse IgG isotype (Phar
mingen) sample (100 µl) was added to the wells (2 systems) and incubated at 37 ° C for 2 hours. Then, 100 μl of peroxidase-conjugated polyclonal goat anti-mouse Ig (Pharmingen) diluted 1/1000 was added, and the mixture was incubated at 37 ° C.
And incubated for 1 hour. After washing, the reaction was allowed to develop color as described above, then color development was stopped and the absorbance at 450 nm was measured.

【００２９】脾臓細胞の増殖応答 ２回目の追加免疫から５日後に二酸化炭素によりマウスの群を殺した。無菌的
に脾臓を取り、以前記載されたように（Velupilla, P. et al. (1997) J. Immun
ol. vol. 158, pp. 338-344）増殖アッセイを行った。簡単に説明すると、１０
％ ＦＣＳ（Gibco）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプト
エタノール、１００ユニット／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレ
プトマイシン（Sigma）を補足したＲＰＭＩ １６４０中に細胞懸濁液を調製した
。Boyleの溶液中でインキュベーションすることにより赤血球を除去し、１ｍｌ
あたり２．５ｘ１０６個の細胞を９６ウェル平底組織培養プレート（Corning）
に添加し（３系）、２μｇ／ｍｌ ＣｏｎＡ（Vector）、１０μｇ／ｍｌ ＨＳＡ
またはＬＮｎＴ−ＨＳＡとともに空気中５％ ＣＯ２、３７℃で７２時間インキ
ュベーションした。最後の８時間において、細胞を１μＣｉの３Ｈチミジン（Am
ersham Life Science Inc., IL）とともにインキュベーションし、次いで、濾紙
上に集めてシンチレーション計数用とした。 Proliferative Response of Spleen Cells A group of mice was killed with carbon dioxide 5 days after the second boost. Aseptically remove the spleen and as previously described (Velupilla, P. et al. (1997) J. Immun.
ol. vol. 158, pp. 338-344) proliferation assay was performed. Briefly, 10
Cell suspensions were prepared in RPMI 1640 supplemented with% FCS (Gibco), 2 mM L-glutamine, 5x10 -5 M 2-mercaptoethanol, 100 units / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin (Sigma). Remove red blood cells by incubating in Boyle's solution, 1 ml
2.5x10 6 cells per 96-well flat bottom tissue culture plate (Corning)
(3 lines), 2 μg / ml ConA (Vector), 10 μg / ml HSA
Alternatively, it was incubated with LNnT-HSA for 72 hours at 37 ° C. in air with 5% CO 2 . In the last 8 hours, cells were incubated with 1 μCi of 3 H thymidine (Am
ersham Life Science Inc., IL) and then collected on filter paper for scintillation counting.

【００３０】サイトカインアッセイ 平底２４ウェル培養プレート（Corning）中で、１ｍｌあたり２．５ｘ１０６
個の細胞を、ＣｏｎＡとともにあるいは再刺激なしで、上記のごとく補足ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地中で３７℃にて培養し、２４、７２および１２０時間後に細胞
培養物を遠心分離し、培養上清を集め、アッセイするまで保存（−８０℃）した
。ペレット化細胞を再懸濁し、次いで、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合されたｍＡｂ
で免疫蛍光染色用に染色した。ＣｏｎＡにより刺激されたあるいは刺激されなか
った脾臓細胞から得た上清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およ
びＩＦＮ−γレベルを捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に説明すると、Maxi
sorpマイクロタイタープレート（Nunc Laboratories Ltd., Denmark）を、炭酸
塩−重炭酸塩バッファー中２．０μｇ／ｍｌ（Pharmingenから得たラット抗−マ
ウスＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γならびにEndogen, MAから得たラッ
ト抗−マウスＩＬ−４）の捕捉抗体５０μｌとともに４℃で一晩インキュベーシ
ョンすることにより被覆した。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＰＢ
Ｓ中１０％ ＦＣＳを添加することによりブロック（２時間、３７℃）した。そ
の後、５０μｌの培養上清および適当な組み換え標準物質を個々のウェルに添加
した（２系）。標準曲線用に、組み換えＩＬ−５（０ないし５０００ｐｇ／ｍｌ
）、ＩＬ−１０（０ないし２５０００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（０ないし２０
０００ｐｇ／ｍｌ）（Pharmingen, CA）およびＩＬ−４（０ないし１５００ｐｇ
／ｍｌ）（Endogen, MA）を使用した（２系）。４℃で一晩インキュベーション
した後、ウェルを洗浄し、適当なビオチン化検出抗体（Pharmingenから得たラッ
ト抗−マウスＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γならびにEndogen, MAから
得たラット抗−マウスＩＬ−４）（１μｇ／ｍｌ）をウェル１個あたり５０μｌ
添加した。結合ビオチン化抗体の検出には、５０μｌのストレプトアビジン−ア
ルカリ性ホスファターゼ結合体（１／２０００，Pharmingen）を各ウェルに４５
分間添加し、次いで、洗浄した。グリシンバッファー中のリン酸ｐ−ニトロフェ
ニル（Sigma）を用いてウェル中のサイトカインレベルを可視化した。UVMax自動
マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。 Cytokine Assay 2.5 × 10 6 per ml in flat bottom 24-well culture plates (Corning)
Individual cells with ConA or without restimulation as above supplemented RPM
I was cultured in I 1640 medium at 37 ° C and after 24, 72 and 120 hours the cell culture was centrifuged and the culture supernatant was collected and stored (-80 ° C) until assayed. Resuspend pelleted cells, then mAb conjugated to FITC or PE
Were stained for immunofluorescence staining. IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-γ levels in supernatants obtained from spleen cells stimulated or not with ConA were measured by capture ELISA. In short, Maxi
Sorp microtiter plates (Nunc Laboratories Ltd., Denmark) were loaded with 2.0 μg / ml in carbonate-bicarbonate buffer (rat anti-mouse IL-5, IL-10 and IFN-γ and Endogen, obtained from Pharmingen). Coat by incubation overnight at 4 ° C. with 50 μl of capture antibody of rat anti-mouse IL-4) obtained from MA. The wells were then washed 4 times with PBS-T and PB
Blocked (2 h, 37 ° C.) by adding 10% FCS in S. Afterwards, 50 μl of culture supernatant and the appropriate recombinant standards were added to individual wells (2 system). Recombinant IL-5 (0 to 5000 pg / ml) for standard curve
), IL-10 (0 to 25,000 pg / ml), IFN-γ (0 to 20)
000 pg / ml) (Pharmingen, CA) and IL-4 (0-1500 pg)
/ Ml) (Endogen, MA) was used (2 lines). After overnight incubation at 4 ° C., the wells were washed and the appropriate biotinylated detection antibody (rat anti-mouse IL-5, IL-10 and IFN-γ from Pharmingen and rat anti-mouse from Endogen, MA). Mouse IL-4) (1 μg / ml) 50 μl per well
Was added. For detection of bound biotinylated antibody, 50 μl of streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (1/2000, Pharmingen) was added to each well by 45.
Add for minutes, then wash. Cytokine levels in the wells were visualized with p-nitrophenyl phosphate (Sigma) in glycine buffer. Absorbance at 405 nm was measured using a UVMax automated microplate reader.

【００３１】免疫蛍光染色 再刺激なしでインビトロ培養後、脾臓細胞を再懸濁し、以下のｍＡｂとともに
氷上で１５分間インキュベーションした：抗−ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−
６Ｂ２）、抗−Ｂ７−１（１６−１０Ａ１）、および抗−Ｂ７−２（ＧＬ−１）
またはイソタイプを合わせた対照。すべてのｍＡｂはＦＩＴＣまたはＰＥ結合体
であった（Pharmingen）。０．０５％アジ化ナトリウムを含有するHankのバラン
ス塩溶液（Gibco）で洗浄後、FACSCaliburフローサイトメーターおよびCell Que
stソフトウェア（Becton Dickinson, CA）を用いることによりフローサイトメト
リー分析を行った。ヨウ化プロピジウム（Molecular Probes, OR）染色に基づい
て死細胞を分析から排除した。前方および側方散乱の物理的特徴によりリンパ球
を通過させ、少なくとも１００００イベントを獲得した。 Immunofluorescent staining After in vitro culture without restimulation, spleen cells were resuspended and incubated with the following mAbs for 15 minutes on ice: anti-CD45R / B220 (RA3-
6B2), anti-B7-1 (16-10A1), and anti-B7-2 (GL-1).
Or an isotype-matched control. All mAbs were FITC or PE conjugates (Pharmingen). FACSCalibur flow cytometer and Cell Que after washing with Hank's balanced salt solution (Gibco) containing 0.05% sodium azide
Flow cytometric analysis was performed by using st software (Becton Dickinson, CA). Dead cells were excluded from analysis based on propidium iodide (Molecular Probes, OR) staining. The physical characteristics of forward and side scatter passed the lymphocytes and acquired at least 10,000 events.

【００３２】統計学的分析 Studentのｔ検定を用いて統計学的分析を行った。ｐ＜０．０５の値を有意と
みなした。[0032] Statistical analysis was performed using the t-test statistical analysis Student. Values of p <0.05 were considered significant.

【００３３】実施例１ ：多価ＬＮｎＴによるインビボでのポリクローナルＩｇＥの誘導 ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いた最初の追加ＩＰ免疫後、ＢＡＬＢ/Ｃマウスは、セイ
ライン、ＨＳＡ、Ｌｅｙ-ＨＳＡおよびＨＳＡ-アラム（Alum）を用いてＩＰ免疫
したものよりもかなり高量の血清総ＩｇＥを産生した（図１ａ）。血清ＩｇＥは
二次免疫の後で有意にかなり高まった。この上昇は一次接種の後では見られず、
血清ＩｇＥの高い上昇は、ＬＮｎＴを用いた二次ＩＰ免疫の後、少なくとも８週
間続いた（図１ｂ）。セイラインまたはＨＳＡ単独を用いて免疫したものと比較
して、血清ＩｇＧ１も、多価ＬＮｎＴを用いてＩＰ免疫したマウスにおいても有
意に増加し、一方、他のイソタイプの量は有意には異ならなかった（図１ｃ）。 Example 1 Induction of Polyclonal IgE In Vivo by Polyvalent LNnT After the first booster IP immunization with LNnT-HSA, BALB / C mice were injected with saline, HSA, Ley-HSA and HSA-alum. ) Produced significantly higher amounts of serum total IgE than those immunized with IP (Fig. 1a). Serum IgE was significantly and significantly elevated after secondary immunization. This increase was not seen after the primary inoculation,
The high elevation of serum IgE lasted at least 8 weeks after secondary IP immunization with LNnT (Fig. 1b). Serum IgG1 was also significantly increased in mice IP-immunized with polyvalent LNnT compared to those immunized with saline or HSA alone, while the amount of other isotypes was not significantly different. (Fig. 1c).

【００３４】 ＨＳＡ-特異的ＩｇＥおよびＩｇＧを、ＨＳＡ-アラムを用いてＩＰ免疫したマ
ウスの血清において測定した。他方、ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いてＩＰ免疫したマ
ウスにおいてこれらのシグナルは検出されず、ＨＳＡ単独、Ｌｅｙ-ＨＳＡまた
はセイラインで免疫した対照群とは統計学的に全く異ならなかった（図２ａ、ｂ
）。ＬＮｎＴ-ＨＳＡに対してＡｂ力価で同様の所見を認めた。ＬＮｎＴ-ＨＳＡ
を用いてＩＰ免疫したマウスは、対照と比較して有意な量の、ＬＮｎＴ-ＨＳＡ
に対して特異的なＩｇＧまたはＩｇＥを産生しなかった（図２ｃ、ｄ）。さらに
、ＬＮｎＴの成分であるＧａｌ（β１-４）ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ（β１-４
）Ｇｌｃに対する特異的シグナルは、特異的ＩｇＥ ＥＬＩＳＡにおいてビオチ
ン化ＨＳＡの代わりにビオチン化Ｇａｌ（β１-４）ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ
（β１-４）Ｇｌｃ（Glcotech,MD)をそれぞれ用いた場合に検出されなかった。
これらの結果により、多価ＬＮｎＴが追加免疫の後のＢＡＬＢ/Ｃマウスにおい
て、ＩｇＥの非特異的ポリクローナル産生を誘導することが示唆された。HSA-specific IgE and IgG were measured in the sera of mice IP-immunized with HSA-alum. On the other hand, these signals were not detected in mice IP-immunized with LNnT-HSA, which was not statistically different from the control group immunized with HSA alone, Le y -HSA or saline (Fig. 2a, b).
). Similar findings were observed in Ab titer against LNnT-HSA. LNnT-HSA
Mice IP-immunized with LNnT-HSA showed significant amounts of LNnT-HSA compared to controls.
It did not produce IgG or IgE specific for (Fig. 2c, d). Furthermore, Gal (β1-4) GlcNAc and Gal (β1-4) which are components of LNnT.
) The specific signal for Glc is biotinylated Gal (β1-4) GlcNAc and Gal instead of biotinylated HSA in the specific IgE ELISA.
It was not detected when (β1-4) Glc (Glcotech, MD) was used, respectively.
These results suggested that multivalent LNnT induces non-specific polyclonal production of IgE in BALB / C mice after boosting.

【００３５】多価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥの誘導の特異性 ＢＡＬＢ/Ｃ株の場合と同様に、ＣＢＡ／Ｊマウスは、ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用い
た１回目の追加ＩＰ免疫後、対照群と比較して、血清ＩｇＥの有意な上昇を示し
た(図３ａ）。他方、Ｃ５７ＢＬ/６マウスはＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いた１回目の
ＩＰ免疫後、血清ＩｇＥの増加を示さなかった。しかし、この株は二次ＩＰ免疫
の後、血清ＩｇＥの増加を誘導した（図３ｂ）。両株は、ＨＳＡに対してＩｇＥ
もＩｇＧも誘導しなかった。これらの結果により、多価ＬＮｎＴによるポリクロ
ーナルＩｇＥの誘導は遺伝的に影響を受けることが示唆される。 Specificity of Induction of Polyclonal IgE by Polyvalent LNnT As in the BALB / C strain, CBA / J mice were compared to the control group after the first booster IP immunization with LNnT-HSA. , Showed a significant increase in serum IgE (Fig. 3a). On the other hand, C57BL / 6 mice showed no increase in serum IgE after the first IP immunization with LNnT-HSA. However, this strain induced an increase in serum IgE after secondary IP immunization (Fig. 3b). Both strains have IgE against HSA
Neither IgG was induced. These results suggest that the induction of polyclonal IgE by polyvalent LNnT is genetically affected.

【００３６】 血清総ＩｇＥの上昇は、追加免疫後でさえも、ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いたＳＣ
免疫において認められなかった（図３ｃ）。ＬＮｎＴ-ＨＳＡは、鼻腔内感作後
にはかかる血清ＩｇＥの上昇を誘導しないことがすでに示唆されており、多価Ｌ
ＮｎＴの接種経路が非特異的ＩｇＥの誘導に重要であることを意味する。不完全
なＣＤ５＋ Ｂ-１細胞であるＣＢＡ/ＣａＪ ｘｉｄマウスは、セイラインまたは
ＨＳＡでＩＰ免疫したものと比較して、その量は対照ＣＢＡ/ＣａＪマウスより
も有意に低かったが、ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いたＩＰ免疫後に有意に高い量のＩ
ｇＥを示した（図３ｄ）。この結果は、腹腔の特異成分の一つであるＢ-１細胞
が、多価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥの誘導に決定的ではないが部分的
に関与することを示唆する。Elevated serum total IgE was observed in SC with LNnT-HSA even after boosting.
Not observed in immunity (Fig. 3c). It has already been suggested that LNnT-HSA does not induce such elevation of serum IgE after intranasal sensitization, and polyvalent L
It means that the inoculation route of NnT is important for the induction of non-specific IgE. Deficient CD5 + B-1 cells, CBA / CaJ xid mice, had significantly lower amounts than control CBA / CaJ mice, but not LNnT-HSA, compared to those immunized IP with saline or HSA. Significantly higher amount of I after IP immunization used
It showed gE (Fig. 3d). This result suggests that B-1 cells, one of the specific components of the abdominal cavity, are not critical but partially involved in the induction of polyclonal IgE by polyvalent LNnT.

【００３７】多価ＬＮｎＴに対する増殖応答 ＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓細胞を、セイライン、ＨＳＡまたはＬＮｎＴ-ＨＳ
Ａを用いた二次追加ＩＰ免疫の５日後に調製した。ＨＳＡまたはセイラインでＩ
Ｐ免疫したマウスは、ＨＳＡまたは非再刺激と比較して、穏やかではあるが有意
なＬＮｎＴ-ＨＳＡに対する増殖応答をインビトロで示し、ＬＮｎＴが未処理の
脾臓細胞において増殖応答を誘導することが示唆される。ＬＮｎＴ-ＨＳＡでＩ
Ｐ免疫したマウスは再刺激しない場合においてさえ、対照マウスと比較して有意
な応答を示した（図４）。加えて応答はＬＮｎＴ-ＨＳＡの再刺激を用いて有意
に高められた。ＣｏｎＡ刺激において、ＬＮｎＴ誘導マウスも対照より有意に応
答した。これらの結果は、ＬＮｎＴ-ＨＳＡに特異的な脾臓細胞が多価ＬＮｎＴ
を用いたＩＰ免疫後に自発的に活性化されることを示唆する。 Proliferative response to polyvalent LNnT Spleen cells of BALB / C mice were tested for saline, HSA or LNnT-HS.
Prepared 5 days after the secondary booster immunization with A. I with HSA or Sayline
P-immunized mice showed a mild but significant proliferative response to LNnT-HSA in vitro compared to HSA or unrestimulated, suggesting that LNnT induces a proliferative response in naive spleen cells. It I in LNnT-HSA
P-immunized mice showed a significant response compared to control mice even when not restimulated (Figure 4). In addition, the response was significantly enhanced using LNnT-HSA restimulation. In ConA stimulation, LNnT-induced mice also responded significantly more than controls. These results show that spleen cells specific for LNnT-HSA are multivalent LNnT
It is suggested that it is activated spontaneously after IP immunization with.

【００３８】ＬＮｎＴ接種マウスによるサイトカイン産生 ＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いてＩＰ免疫したマウスの脾臓細胞は、再刺激なしでも
サイトカインを誘導した。ＩＬ-２、ＩＬ-４およびＩＬ-５の有意量が、再刺激
を行わない培養物上清中でのインキュベーション２４時間目に検出された。ＩＬ
-１０およびＩＦＮ-γはインキュベーション７２時間目に検出された。結果を次
の表１にまとめる。興味深いことに、ＣｏｎＡに応答して、ＬＮｎＴ-ＨＳＡで
ＩＰ免疫したマウスの脾臓細胞はセイラインまたはＨＳＡでＩＰ免疫したものと
比較して有意に多いＩＬ４、ＩＬ-５およびＩＬ-１０を産生したが、ＩＦＮ−γ
は多くなく、ＣｏｎＡ刺激に応答して、ＬＮｎＴが脾臓細胞を分極したＴｈ２応
答に偏向させたことが示唆される。 Cytokine Production by LNnT-Inoculated Mice Spleen cells of mice IP-immunized with LNnT-HSA induced cytokines without restimulation. Significant amounts of IL-2, IL-4 and IL-5 were detected at 24 hours of incubation in culture supernatant without restimulation. IL
-10 and IFN-γ were detected at 72 hours of incubation. The results are summarized in Table 1 below. Interestingly, in response to ConA, spleen cells of mice IP-immunized with LNnT-HSA produced significantly more IL4, IL-5 and IL-10 compared to those IP-immunized with saline or HSA. , IFN-γ
Not abundant, suggesting that LNnT biased spleen cells into a polarized Th2 response in response to ConA stimulation.

【００３９】[0039]

【表１】 [Table 1]

【００４０】ＬＮｎＴ-接種マウスのＢ２２０+細胞における選択的インビトロＢ７-２（ＣＤ
８６）発現 Ｂ２２０陽性脾臓細胞における同時刺激分子Ｂ７-１およびＢ７-２の発現につ
いても調べた。Ｂ７-１およびＢ２２０両分子に関して陽性である細胞のパーセ
ンテージは、セイライン、ＨＳＡおよびＬＮｎＴ-ＨＳＡでＩＰ免疫したマウス
においてそれぞれ１．０２±０．０８、０．９５±０．０７および０．８８±０
．０６であった（ｎ＝６）。Ｂ７-２およびＢ２２０両分子に関して陽性である
細胞のパーセンテージは、セイライン、ＨＳＡおよびＬＮｎＴ-ＨＳＡそれぞれ
でＩＰ免疫したマウスにおいて０．５９±０．０４、０．５９±０．０５および
、０．５６±０．０４であり、新たに単離した脾臓細胞におけるこれらの分子の
発現の違いは全く示唆されなかった。Ｂ７-１発現は、培養脾臓細胞において変
化しなかった（図５ａ、ｃ、ｅ）。しかし、再刺激なしのインビトロでの２４時
間培養後、Ｂ７-２分子を発現しているＢ２２０陽性細胞は、ＬＮｎＴ-ＨＳＡで
ＩＰ免疫したマウスにおいて、セイラインまたはＨＳＡで免疫した対照マウスと
比較して増加した（図５ｂ、ｄ、ｆ）。この増加は６時間のインキュベーション
後に見られ、Ｂ２２０陽性細胞におけるＢ７-１の発現は観察期間中変化しなか
ったが、少なくとも１２０時間続いた（図５ｇ、ｈ）。 Selective in vitro B7-2 (CD) in B220 + cells of LNnT-inoculated mice
86) Expression The expression of costimulatory molecules B7-1 and B7-2 in B220-positive spleen cells was also examined. The percentage of cells positive for both B7-1 and B220 molecules was 1.02 ± 0.08, 0.95 ± 0.07 and 0.88 ± in mice immunized IP with saline, HSA and LNnT-HSA, respectively. 0
． It was 06 (n = 6). The percentage of cells positive for both B7-2 and B220 molecules was 0.59 ± 0.04, 0.59 ± 0.05 and 0.56 in mice immunized IP with saline, HSA and LNnT-HSA respectively. ± 0.04, indicating no difference in expression of these molecules in freshly isolated spleen cells. B7-1 expression was unchanged in cultured splenocytes (Fig. 5a, c, e). However, after 24-hour culture in vitro without restimulation, B220-positive cells expressing the B7-2 molecule were compared to control mice immunized with saline or HSA in LNnT-HSA IP-immunized mice. Increased (Fig. 5b, d, f). This increase was seen after 6 hours of incubation and the expression of B7-1 in B220 positive cells was unchanged during the observation period but lasted for at least 120 hours (Fig. 5g, h).

【００４１】多価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥ産生の誘導にはＩＬ-４が必要である Ｔｈ-２サイトカイン、特にＩＬ-４はＩｇＥ産生に関与しているので、インビ
ボでの多価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥ産生の誘導に関するＩＬ-４の
役割を、ＩＬ-４遺伝子欠損マウスを用いて調べた。ＩＬ-４欠損マウスは、ＬＮ
ｎＴ-ＨＳＡを用いた反復ＩＰ免疫の後、ポリクローナルＩｇＥの産生を誘導し
なかった。この実験において、全血清ＩｇＥ．ＩＬ-４欠損マウスまたは野生型
ＢＡＬＢ／．Ｃマウスをセイライン、ＨＳＡまたはＬＮｎＴ-ＨＳＡで免疫した
。２回目の追加免疫後、野生型またはＩＬ-４欠損マウスからの１ｍｌあたり２
．５×１０６個の脾臓細胞をさらなる刺激をすることなく培養し、インキュベー
ション開始から２４、７２および１２０時間目にＩＮＦ−γを測定した。興味深
いことに、ＬＮｎＴ-ＨＳＡでの免疫を用いたＩＬ-４欠損マウスからの脾臓細胞
は、再刺激なしでＩＬ-５、ＩＬ-６およびＩＦＮ-γを産生した。しかし、ＩＬ-
５およびＩＬ-６の量は野生型ＢＡＬＢ／Ｃマウスよりも有意に低かった（図６
ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。セイラインまたはＨＳＡを用いてＩＰ免疫したＩＬ-４欠損
マウスにおいてこれらのサイトカインが検出され、ＩＬ-４が多価ＬＮｎＴによ
るポリクローナルＩｇＥの産生に必要であることが示された。 IL-4 is Required for Induction of Polyclonal IgE Production by Polyvalent LNnT Since Th-2 cytokines, particularly IL-4 are involved in IgE production, polyvalent LNnT production of polyclonal IgE in vivo was performed. The role of IL-4 in the induction of IL-4 was investigated using IL-4 gene-deficient mice. IL-4 deficient mice have LN
After repeated IP immunization with nT-HSA, it did not induce the production of polyclonal IgE. In this experiment, whole serum IgE. IL-4 deficient mice or wild type BALB /. C mice were immunized with saline, HSA or LNnT-HSA. 2 per ml from wild type or IL-4 deficient mice after the second boost
． 5 × 10 6 spleen cells were cultured without further stimulation, and INF-γ was measured at 24, 72, and 120 hours after the start of incubation. Interestingly, splenocytes from IL-4-deficient mice using immunization with LNnT-HSA produced IL-5, IL-6 and IFN-γ without restimulation. But IL-
5 and IL-6 levels were significantly lower than in wild type BALB / C mice (FIG. 6).
b, c, d, e). These cytokines were detected in IL-4-deficient mice IP-immunized with saline or HSA, indicating that IL-4 is required for the production of polyclonal IgE by polyvalent LNnT.

【００４２】実施例２ 多価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥの産生を示すさらなる実験を次に記
載するように行った。 第一シリーズの実験では、デキストラン単独、ＲＰＭ１培地またはデキストラ
ンに結合したＬＮｎＴのセイライン溶液（ＬＮｎＴ-デキストラン）を２回また
は３回腹腔内注射した。糖結合体はＬＮｎＴ３５と称すこととし、ここで、３５
は各デキストラン分子におけるＬＮｎＴ置換の程度を言う。マウスで誘導したＩ
ｇＥの全量を測定した。結果を表６に示し、ここで、ＬＮｎＴの後の数（即ち、
２００、１００または５０）は注射された量（デキストラン重量）をいう。結果
により、ＬＮｎＴ-デキストラン構築物が大量の総ＩｇＥをインビボで生じさせ
ることができることが示される。 Example 2 Further experiments demonstrating the production of polyclonal IgE by polyvalent LNnT were performed as described below. In the first series of experiments, dextran alone, RPM1 medium or saline solution of LNnT conjugated to dextran (LNnT-dextran) were injected intraperitoneally two or three times. The sugar conjugate will be referred to as LNnT35, where 35
Refers to the degree of LNnT substitution in each dextran molecule. I induced in mouse
The total amount of gE was measured. The results are shown in Table 6, where the number after LNnT (ie,
200, 100 or 50) refers to the amount injected (dextran weight). The results show that the LNnT-dextran construct is capable of producing large amounts of total IgE in vivo.

【００４３】 もう１つのシリーズの実験において、抗原特異的ＩｇＥの産生に対する多価Ｌ
ＮｎＴを用いた前処理の効果を調べた。マウスにオボアルブミンを（特異抗原と
して）用いて注射した後オボアルブミンの２回目の注射を行うか、または、デキ
ストラン結合ＬＮｎＴ４５を用いて注射した後、オボアルブミンを注射するかの
いずれかで注射を行った。対照は、ＲＰＭＩまたはデキストランを投与した後オ
ボアルブミンを投与したマウスとした。図７はマウスにおける全ＩｇＥを示し、
図８はマウスにおけるオボアルブミン特異的ＩｇＥを示す。図７はマウスにおけ
る全ＩｇＥのレベルに顕著な違いがなかったことを示す。しかしながら、図８は
、ＬＮｎＴデキストラン結合物を用いた前処理が実際にＯＶＡ-特異的ＩｇＥの
量を４０〜５０％減じることを示す。つまり、ＬＮｎＴ結合体はアレルゲン特異
的ＩｇＥをインビボで減じるように機能する。In another series of experiments, multivalent L for production of antigen-specific IgE
The effect of pretreatment with NnT was investigated. Mice were injected with ovalbumin (as a specific antigen) followed by a second injection of ovalbumin, or with dextran-conjugated LNnT45 followed by ovalbumin. went. The control was a mouse to which ovalbumin was administered after administration of RPMI or dextran. Figure 7 shows total IgE in mice,
FIG. 8 shows ovalbumin-specific IgE in mice. FIG. 7 shows that there was no significant difference in total IgE levels in mice. However, FIG. 8 shows that pretreatment with the LNnT dextran conjugate actually reduced the amount of OVA-specific IgE by 40-50%. Thus, LNnT conjugates function to reduce allergen-specific IgE in vivo.

【００４４】 もう一つの実験において、非特異的ＩｇＥレベルが多価ＬＮｎＴを用いた処理
の後に高まったままである時間の長さを調べた。ＬＮｎＴ-ＨＳＡを結合物とし
て用い、セイラインおよびＨＳＡを単独で対照として用いた。結果を図９に示し
、これにより、ＬＮｎＴ-ＨＳＡで処理したマウスが高レベルの非特異的ＩｇＥ
を少なくとも７０日間（研究において最も長い時間）示したことが示される。つ
まり、多価ＬＮｎＴを用いた処理は非-特異的ＩｇＥの維持を誘導する。In another experiment, the length of time that non-specific IgE levels remained elevated after treatment with multivalent LNnT was investigated. LNnT-HSA was used as the conjugate and saline and HSA alone were used as controls. The results are shown in Figure 9, which shows that mice treated with LNnT-HSA had high levels of non-specific IgE.
Was shown for at least 70 days (the longest time in the study). Thus, treatment with multivalent LNnT induces maintenance of non-specific IgE.

【００４５】 もう一つの実験において、ＬＮｎＴ-デキストランを用いた処理の、Ｔｈ２-型
サイトカインまたはＴｈ１-型サイトカインのいずれかの産生に対する効果を試
験した。ＬＮｎＴ-デキストランを用いてマウスを腹腔内免疫し、全脾臓細胞を
採取し、ＣｏｎＡで刺激した後、培養４８または７２時間でサイトカインの測定
を行った。Ｔｈ２-型サイトカインに関する結果を図１０に示し、これにより、
ＬＮｎＴ-デキストラン処理が担体（デキストラン）免疫対照と比較して、ＩＬ-
１０、ＩＬ-４およびＩＬ-１３のレベルを培養７２時間で有意に高めることが示
される。Ｔｈ１型サイトカインインターフェロン-ガンマに関する結果を図１１
に示し、これにより、ＬＮｎＴ-デキストラン処理が、４８および７２時間で、
インターフェロン-ガンマのレベルを減じることが示される。In another experiment, the effect of treatment with LNnT-dextran on the production of either Th2-type or Th1-type cytokines was tested. Mice were immunized intraperitoneally with LNnT-dextran, whole spleen cells were collected and stimulated with ConA, and then cytokine was measured at 48 or 72 hours of culture. Results for Th2-type cytokines are shown in FIG.
LNnT-dextran treatment compared to carrier (dextran) immune controls IL-
It is shown that the levels of 10, IL-4 and IL-13 are significantly increased at 72 hours of culture. FIG. 11 shows the results regarding the Th1-type cytokine interferon-gamma.
Which shows that LNnT-dextran treatment at 48 and 72 hours
It is shown to reduce the levels of interferon-gamma.

【００４６】 議論 これらの実施例により、多価ＬＮｎＴが反復ＩＰ免疫によってインビボでマウ
スにおいてポリクローナルＩｇＥ産生が誘導されることが分かる。いくつかの報
告は、マウスおよびヒトにおいてインビボおよびインビトロにて寄生体からの抽
出物によるポリクローナルＩｇＥの産生を示しているが、寄生体によるポリクロ
ーナルＩｇＥ産生を促進するメカニズムは未だ明らかではない(Wang, MQ. et al
. (1995) Parasite Immunol. vol. 17pp. 609-615; McGibbon, AM. et al.(1990
) Mol. Biochem. Parasitol. vol. 39pp. 163-172; Lee, TDG. et al. (1995) J
Allergy Clin. Immunol vol. 95pp. 124-1254Yamashita, T. et al. (1993) Im
munology vol. 79pp. 185-195. Yamashita, U. et al. (1993) Jap J. Parasito
l vol. 42 pp. 211-219)。実際、Ｂ細胞は寄生体感染宿主において非特異的に活
性化される(Fisher, E. et al. (1981) Clin. Exp. Immunol. vol. 46pp. 89-97
)。シストソーマ・ジャポニカム（Schistosoma japonicum）卵抗原における炭水
化物部分は住血吸虫でプライムされたＢ細胞だけでなく、未処理のＢ細胞をも活
性化することが報告されている(Yamashita, T et al. (1993) Immunology vol.
79pp. 185-195)。それゆえ、住血吸虫抗原、特に炭水化物部分は、Ｂ細胞に対し
て非特異的活性化を誘導する有糸***促進効果を有すると思われる。実際、線虫
からの抽出物が、非特異的Ｂ細胞の活性化を調節してポリクローナルＩｇＥの産
生を誘導するＢ細胞有糸***促進物質を含むことが報告されている(Wang, MQ. e
t al. (1995) Parasite Immunol. vol. 17pp. 609-615; Lee, TDG. et al. (199
5) J Allergy Clin. Immunol. vol. 95pp. 124-1254)。しかし、Ｂ細胞***促進
活性は、ポリクローナルＩｇＥ産生を促進するのには十分ではない。Discussion These examples show that multivalent LNnT induces polyclonal IgE production in mice in vivo by repeated IP immunization. Several reports have shown the production of polyclonal IgE by extracts from parasites in mice and humans in vivo and in vitro, but the mechanism that promotes polyclonal IgE production by parasites is not yet clear (Wang, MQ. Et al
(1995) Parasite Immunol. Vol. 17pp. 609-615; McGibbon, AM. Et al. (1990
) Mol. Biochem. Parasitol. Vol. 39pp. 163-172; Lee, TDG. Et al. (1995) J
Allergy Clin. Immunol vol. 95pp. 124-1254 Yamashita, T. et al. (1993) Im
munology vol. 79pp. 185-195. Yamashita, U. et al. (1993) Jap J. Parasito
l vol. 42 pp. 211-219). In fact, B cells are nonspecifically activated in parasite-infected hosts (Fisher, E. et al. (1981) Clin. Exp. Immunol. Vol. 46pp. 89-97.
). The carbohydrate moiety in the Schistosoma japonicum egg antigen has been reported to activate not only schistosomiasis primed B cells, but also untreated B cells (Yamashita, T et al. 1993) Immunology vol.
79pp. 185-195). Therefore, schistosomiasis antigens, especially carbohydrate moieties, appear to have a mitogenic effect on non-specific activation of B cells. Indeed, it has been reported that extracts from C. elegans contain B cell mitogens that regulate nonspecific B cell activation and induce the production of polyclonal IgE (Wang, MQ. E.
t al. (1995) Parasite Immunol. vol. 17pp. 609-615; Lee, TDG. et al. (199
5) J Allergy Clin. Immunol. Vol. 95pp. 124-1254). However, B cell mitogenic activity is not sufficient to promote polyclonal IgE production.

【００４７】 ＩＬ-４が、Ｂ細胞がマウスにおいて、インビボおよびインビトロでポリクロ
ーナルＩｇＥ産生細胞の発生を誘導することが知られている(Coffman, RL. et a
l(1986) J. Immunol. vol. 136pp. 949-954; Finkelman FD et al. (1990) Annu
Rev Immunol. vol. 8pp. 303-333; Tepper. RI et al. (1990) Cell vol. 62 p
p. 457; Snapper, CM. et al. (1991)J. Immunol vol. 147pp. 1163-1170; Naka
nishi, K. et al. (1995) Int. Immunol vol. 7pp. 259-268)。それゆえ、Ｔ細
胞（ＮＫ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）、好酸球および肥満細胞／好塩基球系の細胞のご
ときＩＬ-４産生細胞から誘導されるＩＬ-４の援助が必要とされる可能性がある
(Coffman, RL. et al. (1997)J. Exp. Med. vol. 185pp. 373-375; Sabin, EA.
et al. (1996) J. Exp. Med. vol. 184pp. 1871-1878)。つまり、寄生体抗原に
おける少なくとも２つの因子が、ポリクローナルＩｇＥ産生：Ｂ細胞有糸***促
進活性およびＩＬ-４産生を誘導するために必要とされる可能性がある。Leeらは
、１回の単一皮下注射により回虫の体液がマウスの全ＩｇＥレベルを増加するこ
とができることを示した(McGibbon, AM. et al. (1990) Mol Biochem. Parasito
l. vol. 39pp. 163-172; Lee, TDG. et al. (1995) J Allergy Clin. Immunol v
ol. vol. 95pp. 124-1254; Lee, TDG. et al. (1993) Int. Atch Allergy Immun
ol. vol. 102pp. 185-190)。しかし、彼らは、ＩｇＥの産生を誘導する分子を単
離しなかったが、精製した回虫の主要アレルゲンＡＢＡ−１が全ＩｇＥの増加を
誘導しないことを示した。つまり彼らは、線虫によるポリクローナルＩｇＥ誘導
のモデルを示唆したのであり、線虫生成物はポリクローナル的にＢ細胞を活性化
するＢ細胞***促進物質を含有するものであり、他の因子により活性化されたＩ
Ｌ−４またはＩＬ−４様分子の影響下にこれらの刺激されたＢ細胞が置かれた場
合に、Ｂ細胞応答はポリクローナルなＩｇＥ応答に変わる。IL-4 is known to induce the development of polyclonal IgE producing cells in vivo and in vitro by B cells in mice (Coffman, RL. Et a.
l (1986) J. Immunol. vol. 136pp. 949-954; Finkelman FD et al. (1990) Annu
Rev Immunol. Vol. 8pp. 303-333; Tepper. RI et al. (1990) Cell vol. 62 p
p. 457; Snapper, CM. et al. (1991) J. Immunol vol. 147pp. 1163-1170; Naka
nishi, K. et al. (1995) Int. Immunol vol. 7pp. 259-268). Therefore, the help of IL-4 derived from IL-4-producing cells such as T cells (NK1 + CD4 + T cells), eosinophils and mast / basophil cells may be required. There is
(Coffman, RL. Et al. (1997) J. Exp. Med. Vol. 185pp. 373-375; Sabin, EA.
et al. (1996) J. Exp. Med. vol. 184pp. 1871-1878). Thus, at least two factors in the parasite antigen may be required to induce polyclonal IgE production: B cell mitogenic activity and IL-4 production. Lee et al. Showed that roundworm fluid can increase total IgE levels in mice with a single subcutaneous injection (McGibbon, AM. Et al. (1990) Mol Biochem. Parasito.
l. vol. 39pp. 163-172; Lee, TDG. et al. (1995) J Allergy Clin. Immunol v
ol. vol. 95pp. 124-1254; Lee, TDG. et al. (1993) Int. Atch Allergy Immun
ol. vol. 102pp. 185-190). However, they did not isolate a molecule that induces IgE production, but showed that the purified roundworm major allergen ABA-1 does not induce an increase in total IgE. Thus, they suggested a model of polyclonal IgE induction by C. elegans, where the C. elegans products contain B cell mitogens that polyclonally activate B cells and are activated by other factors. Was I
When these stimulated B cells are placed under the influence of L-4 or IL-4-like molecules, the B cell response turns into a polyclonal IgE response.

【００４８】 ＬＮｎＴでＩＰ免疫されたマウス由来の脾臓細胞はインビトロにおいて再刺激
なしにＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生したが、それらは検出可能な
量のＩＬ−２およびＩＦＮ−γも産生した。さらに、この炭化水素でのＩＰ免疫
後にＩＬ−４欠損マウスはポリクローナルＩｇＥ産生を誘導しなかったが、それ
らのマウスは有意な量のＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを産生した。S.
mansoni感染後のＩＬ-５およびＩＬ-１０の産生の生起も、ＩＬ-４欠損マウス
で認められた（Pearce, EJ. et al. (1996) Int. Immunol. vol. 8pp. 435-444;
King., CL. et al. (1996) Exp Parasitol. vol. 84pp. 245-252)。これらの結
果は、多価ＬＮｎＴによりインビボでポリクローナルＩｇＥ産生を誘導するのに
ＩＬ-４が必要であることを示す。さらに、多価ＬＮｎＴを用いてＩＰ免疫した
マウス由来の脾臓細胞は、Ｔ細胞***促進物質ＣｏｎＡに反応して明らかに多い
ＩＬ-４を産生することが見出された。この結果は、住血吸虫に感染した宿主が
、***促進物質により誘導されるＩＬ-４産性を示し、その産生が血清全ＩｇＥ
と相関するという報告(King, CL. et al., (1993), J Immunol. vol. 150pp 187
3-1888; Ogilvie BM Nature 1964 204. 91-92; Zwingenberger, K. et al. (199
1) Scand J Immunol. vol. 34pp. 243-251)と一致する。それゆえ、多価ＬＮｎ
Ｔは、宿主をＩＬ-４を産生に対して感受性にする可能性がある。細胞内染色に
よりＩＬ-４の供給源をインビトロ培養物中で分析し、ＣＤ４+Ｔ細胞がＩＬ-４
の産生の原因であることが示された。 これらの知見をまとめると、多価ＬＮｎＴは少なくとも２つの機能、すなわち
Ｂ細胞***促進活性およびＩＬ-４産生誘導を有し、ポリクローナルＩｇＥの産
生を誘導する可能性がある。実際、セイラインでＩＰ免疫した対照マウス由来の
脾臓細胞は、ＬＮｎＴに対しても有意な増殖応答を示し、この炭水化物が有糸分
裂促進活性を有することが示唆された。Spleen cells from mice IP-immunized with LNnT produced IL-4, IL-5 and IL-10 in vitro without restimulation, although they had detectable amounts of IL-2 and IFN-. It also produced γ. Moreover, IL-4 deficient mice did not induce polyclonal IgE production after IP immunization with this hydrocarbon, but they produced significant amounts of IL-5, IL-10 and IFN-γ. S.
Occurrence of IL-5 and IL-10 production after mansoni infection was also observed in IL-4-deficient mice (Pearce, EJ. et al. (1996) Int. Immunol. vol. 8pp. 435-444;
King., CL. Et al. (1996) Exp Parasitol. Vol. 84pp. 245-252). These results indicate that IL-4 is required by polyvalent LNnT to induce polyclonal IgE production in vivo. Furthermore, it was found that spleen cells from mice immunized IP with polyvalent LNnT produced a significantly higher amount of IL-4 in response to the T cell mitogen ConA. This result indicates that schistosome-infected hosts show mitogen-induced IL-4 productivity, whose production is serum total IgE.
(King, CL. Et al., (1993), J Immunol. Vol. 150pp 187.
3-1888; Ogilvie BM Nature 1964 204. 91-92; Zwingenberger, K. et al. (199
1) Consistent with Scand J Immunol. Vol. 34pp. 243-251). Therefore, multivalent LNn
T may sensitize the host to IL-4 production. The source of IL-4 was analyzed in in vitro cultures by intracellular staining, and CD4 + T cells showed IL-4.
Has been shown to be responsible for the production of. Taken together, these findings suggest that multivalent LNnT has at least two functions, B cell mitogenic activity and induction of IL-4 production, and may induce the production of polyclonal IgE. Indeed, spleen cells from control mice IP-immunized with saline also showed a significant proliferative response to LNnT, suggesting that this carbohydrate has mitogenic activity.

【００４９】 ＣＢＡ／ＪおよびＢＡＬＢ／Ｃマウスは、２回目の免疫後にポリクローナルＩ
ｇＥを産生し、他方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはそれを３回目の免疫後に産生する
。S.Mansoni感染に対する宿主応答は系統に依存することがわかっている。ＣＢ
Ａ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、およびＢＡＬＢ/Ｃマウスは、より大きな肝臓肉芽腫
および高い肝門脈高血圧を進行させ、一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、比較的小
さい肉芽腫および低い肝門脈高血圧を進行させた(Fanning, MM. et al. (1981)
J. Inf. Dis vol. 144 148-153; Hernandez, NJ. et al. (1997) Eur. J. Immun
ol. vol. 27pp. 666-670)。ＬＮｎＴを用いた免疫は、マウスの感受性系統に関
してS.mansoni感染と同じ特性を有すると考えられ、この炭水化物はS.mansoniの
最も有力な推定抗原である可能性があることが示唆される。Amiriらは、全Ｉｇ
Ｅ応答の完全な抑制は、苦痛の負担およびS.mansoni感染正常マウスおよびＩＦ
Ｎ-γノックアウトマウスにおける寄生体量および卵の産生を減じることを示し
た(Amiri, P. et al. (1993) J. Exp. Med. vol. 180pp. 43-51)。今回の結果は
、S.mansoniの一次感染において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがS. mansoniの炭水化
物抗原に反応して比較的低量のポリクローナルＩｇＥ産生を生じ、結果的に卵の
産生および寄生体量を減じるというこれらの報告と関連している可能性がある(A
miri, P. et al. (1992) Nature vol.356pp.604)。CBA / J and BALB / C mice had polyclonal I after the second immunization.
It produces gE, whereas C57BL / 6 mice produce it after the third immunization. The host response to S. Mansoni infection has been shown to be strain-dependent. CB
A / J, C3H / HeJ, and BALB / C mice develop larger hepatic granulomas and high hepatic portal hypertension, while C57BL / 6 mice develop relatively small granulomas and low hepatic portal hypertension. (Fanning, MM. Et al. (1981)
J. Inf. Dis vol. 144 148-153; Hernandez, NJ. Et al. (1997) Eur. J. Immun
ol. vol. 27pp. 666-670). Immunization with LNnT appears to have the same characteristics as S. mansoni infection with respect to susceptible strains of mice, suggesting that this carbohydrate may be the most likely putative antigen of S. mansoni. Amiri et al.
Complete suppression of the E response is associated with pain burden and S. mansoni infected normal mice and IF.
It was shown to reduce the amount of parasites and egg production in N-γ knockout mice (Amiri, P. et al. (1993) J. Exp. Med. Vol. 180 pp. 43-51). The present results show that, in the primary infection of S. mansoni, C57BL / 6 mice produced relatively low amounts of polyclonal IgE in response to the carbohydrate antigen of S. mansoni, resulting in the production of eggs and the amount of parasites. May be associated with these reports of reduction (A
miri, P. et al. (1992) Nature vol.356 pp.604).

【００５０】 加えて、S.mansoniの感染による腹腔Ｂ-１細胞の派生は系統依存的であり、Ｃ
５７ＢＬ／６マウスでなくＣＢＡ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪおよびＢＡＬＢ／Ｃマウ
スにおいても起こる(Palanivel, V. et al. (1996) Exp. Parasitol vol. 84pp.
168-177)。Ｂ-１細胞のサブセットは、Ｔｈ１応答をダウンレギュレーションす
るＢ細胞ＩＬ-１０の主要な供給源である(Amiri, P. et al (1992) Nature vol.
356, pp. 604)。腹腔Ｂ-１細胞が部分的に多価ＬＮｎＴによるポリクローナル
ＩｇＥの産生に関与していると考えられるという今回の結果（図２ｄ）は報告と
一致している。 多価ＬＮｎＴに応答するポリクローナルＩｇＥ産生はＬＰＳ汚染によるもので
はない。なぜならＬＮｎＴ-ＨＳＡを用いてＩＰ免疫したマウスは対照と同じ量
の血清ＩｇＧ３を産生するからである。ＬＰＳがインビボおよびインビトロの両
方においてＩｇＧ３の産生を誘導することが知られている(Coffman, RL. et al.
(1986) J Immunol vol. 136pp. 949-954; Finkelman, FD et al. (1990) Annu.
Rev. Immunol. vol. 8pp. 303-333)。さらに、ＬＰＳ自体はインビボでＩＬ-４
の産生を誘導しなかったが、ＬＮｎＴ-ＨＳＡでＩＰ免疫したマウス由来の脾臓
細胞はＩＬ-４を誘導した。In addition, the derivation of peritoneal B-1 cells by S. mansoni infection is lineage-dependent and C
It also occurs in CBA / J, C3H / HeJ and BALB / C mice but not in 57BL / 6 mice (Palanivel, V. et al. (1996) Exp. Parasitol vol. 84 pp.
168-177). A subset of B-1 cells is a major source of B cell IL-10 that downregulates Th1 responses (Amiri, P. et al (1992) Nature vol.
356, pp. 604). The present results (FIG. 2d) that peritoneal B-1 cells are considered to be partially involved in the production of polyclonal IgE by polyvalent LNnT are consistent with the report. Polyclonal IgE production in response to multivalent LNnT is not due to LPS contamination. This is because mice immunized IP with LNnT-HSA produce the same amount of serum IgG3 as controls. LPS is known to induce IgG3 production both in vivo and in vitro (Coffman, RL. Et al.
(1986) J Immunol vol. 136pp. 949-954; Finkelman, FD et al. (1990) Annu.
Rev. Immunol. Vol. 8pp. 303-333). Furthermore, LPS itself is IL-4 in vivo.
However, spleen cells from mice IP-immunized with LNnT-HSA induced IL-4.

【００５１】 再刺激を行わないインビトロでの培養物のインキュベーションの後、Ｂ７-２
ポジティブ細胞はＬＮｎＴ-ＨＳＡでＩＰ免疫したマウスにおいて、セイライン
またはＨＳＡで免疫した対照マウスと比較して、Ｂ２２０＋細胞数が増加した。
Ｂ７-１およびＢ７-２同時刺激分子はＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４のリガンドであり
、Ｔ細胞の活性化、サイトカインの産生および耐性の調節に関与している(McKni
ght, AJ. et al. (1994) J Immunol. vol. 152pp. 5220-5225; Perez, VL. et a
l. (1997) Immunity vol. 6pp. 411-417)。Ｂ７-１およびＢ７-２による同時刺
激は、これらの分子の効果は免疫反応の状態、抗原接種の投与量および経路、Ａ
ＰＣのタイプおよび疾患の試験的モデルに依存しているが、Ｔｈ１細胞の分化を
特異的に調節する(Thompson, CB. (1995). Cell vol. 81pp. 979-982)。例えば
、マウスにおける試験的アレルギー脳脊髄炎（ＥＡＥ）の試験において、抗Ｂ７
-１を用いた投与はＴｈ１細胞が介在する神経学的疾患の重篤度を低下させ、一
方、抗Ｂ７-２投与は重得度を高める(Kuchroo, VK. et al. (1995) Cell vol. 8
0pp. 707-718)。近年の研究は、Ｂ７-２がＴｈ２応答を開始させる能力において
重要な役割を果たしている可能性があることを示唆する(Thompson, CB. (1995).
Cell vol. 81 pp. 979-982: McArthur, JG. et al. (1993) J. Exp. Med. vol.
178pp. 1645-1653)。今回の結果はこれらの報告と一致し、Ｂ７-２の発現が多
価ＬＮｎＴによるポリクローナルＩｇＥの産生と密接に関連していることを示唆
する。しかしながら、多価ＬＮｎＴを用いてＩＰ免疫されたマウスから新たに単
離された２２０＋細胞は、対照マウス由来のものと比較して有意なレベルのＢ７
-２を発現しなかった。この結果は、ＬＮｎＴが間接的にＢ２２０細胞において
Ｂ７-２の発現を誘導することを意味する。このことは、ＴＬ２細胞により分泌
されるＩＬ-４によるものである可能性がある。なぜならＩＬ-４欠損マウスはＢ
７-２の発現を誘導しなかったからである。Stackらは、小さい脾臓Ｂ細胞のＩＬ
-４による処理はＢ７-２およびＢ７-２分子の両方を誘導することを示した(Stac
k, RM. et al. (1994) J.Immunol.vol. 152 pp. 5723-5733)。彼らはまた、Ｂ７
-２の発現は６時間で検出され、２４時間で最大となるように思われ、Ｂ７-１は
４８時間までは認められず、７２時間で最大であったことも報告した。Ｂ７-１
発現は１２０時間まで検出されなかった。この違いはＢ細胞の状態による可能性
がある。この結果は、多価ＬＮｎＴによりプライムされたＢ２２０＋細胞の発現
を示すが、対照的に、その著者らは、休止Ｂ細胞について調べた。 現段階の知見は、細胞表面上の抗原特異的ＩｇＥの架橋により損傷性の化学メ
ディエイタがエフェクター細胞から放出されるアレルギーおよびアナフィラキシ
ー反応の免疫療法および予防に、多価ＬＮｎＴによるインビボでのＩｇＥ産生誘
導が有用でありうることを示唆する。さらに、これらの結果は、寄生体感染のみ
ならず環境アレルギーにおけるアナフィラキシー反応の減少への適用を促すもの
である（Hagel, I. et al. (1993) Parasite Immunol. vol. 15, pp. 311-315）
。After incubation of the culture in vitro without restimulation, B7-2
Positive cells had an increased B220 + cell number in mice immunized IP with LNnT-HSA as compared to control mice immunized with saline or HSA.
B7-1 and B7-2 costimulatory molecules are ligands for CD28 / CTLA-4 and are involved in T cell activation, cytokine production and regulation of resistance (McKni
ght, AJ. et al. (1994) J Immunol. vol. 152pp. 5220-5225; Perez, VL. et a
l. (1997) Immunity vol. 6pp. 411-417). Co-stimulation with B7-1 and B7-2 shows that the effects of these molecules are the state of the immune response, the dose and route of vaccination, A
It specifically regulates Th1 cell differentiation, depending on the type of PC and experimental model of disease (Thompson, CB. (1995). Cell vol. 81 pp. 979-982). For example, in a test for experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice, anti-B7
-1 administration reduces the severity of Th1 cell-mediated neurological disorders, while anti-B7-2 administration increases the severity (Kuchroo, VK. Et al. (1995) Cell vol. 8
0pp. 707-718). Recent studies suggest that B7-2 may play an important role in the ability to mount a Th2 response (Thompson, CB. (1995).
Cell vol. 81 pp. 979-982: McArthur, JG. Et al. (1993) J. Exp. Med. Vol.
178pp. 1645-1653). Our results are consistent with these reports and suggest that B7-2 expression is closely associated with the production of polyclonal IgE by polyvalent LNnT. However, 220+ cells freshly isolated from mice IP-immunized with multivalent LNnT had significant levels of B7 compared to those from control mice.
-2 was not expressed. This result means that LNnT indirectly induces the expression of B7-2 in B220 cells. This may be due to IL-4 secreted by TL2 cells. Because the IL-4 deficient mouse is B
This is because it did not induce expression of 7-2. Stack et al., IL of small spleen B cells
-4 treatment was shown to induce both B7-2 and B7-2 molecules (Stac
k, RM. et al. (1994) J. Immunol. vol. 152 pp. 5723-5733). They are also B7
The expression of -2 was detected at 6 hours and appeared to be maximal at 24 hours, B7-1 was also absent by 48 hours and was also maximal at 72 hours. B7-1
No expression was detected up to 120 hours. This difference may be due to B cell status. The results show expression of B220 + cells primed by multivalent LNnT, in contrast, the authors examined resting B cells. The current findings are that polyvalent LNnT induces IgE production in vivo for immunotherapy and prevention of allergic and anaphylactic reactions in which damaging chemical mediators are released from effector cells by cross-linking antigen-specific IgE on the cell surface. Suggest that may be useful. Furthermore, these results promote application not only to parasite infection but also to reduction of anaphylactic reaction in environmental allergy (Hagel, I. et al. (1993) Parasite Immunol. Vol. 15, pp. 311- 315)
.

【００５２】均等物 当業者は、常套的な実験以上のものを使用せずに、本明細書記載の本発明の特
別な具体例に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであ
ろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されるものである。 Equivalents One of ordinary skill in the art would be able to recognize or ascertain many equivalents to the particular embodiments of the invention described herein without undue experimentation. Ah Such equivalents are intended to be within the scope of the following claims.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１ａ〜１ｃは腹腔内免疫後のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける血清
Ｉｇ産生を示す。図１（ａ）：セイライン、ＨＳＡ、Ｌｅｙ−ＨＳＡ、ＬＮｎＴ
−ＨＳＡまたはＨＳＡ−アラムでメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを腹腔内免疫した。
すべての抗原はＨＳＡとして１０μｇの蛋白重量で接種した。最初（点々の棒）
の免疫および２回目（黒棒）の追加免疫からそれぞれ６日後および５日後に血液
試料を取り、血清全ＩｇＥを測定した。結果を、４個体の血清の平均値±１ＳＥ
として示す。図１（ｂ）：ＩＰ免疫後の血清全ＩｇＥの経時変化。０日目に、セ
イライン（白四角）、ＨＳＡ（１０μｇ；白三角）またはＬＮｎＴ−ＨＳＡ（１
０μｇのＨＳＡ；黒丸）でＢＡＬＢ／Ｃマウスを腹腔内免疫した。２週間後、追
加免疫を同じ方法で行った。１０、２０、２７、４１および６９日目に採血し、
血清全ＩｇＥを調べた。結果を、４個体の血清の平均値±１ＳＥとして示す。図
１（ｃ）：セイライン（点々の棒）、ＨＳＡ（白棒）またはＬＮｎＴ−ＨＳＡ（
黒棒）での３回目の腹腔内免疫から５日後の血清ＩｇＧイソタイプ。結果を、４
個体の血清の平均値±１ＳＥとして示す。すべての結果は３つの実験の典型例を
示す。1a-1c show serum Ig production in BALB / C mice after intraperitoneal immunization. Figure 1 (a): saline, HSA, Le y -HSA, LNnT
Female BALB / C mice were immunized ip with -HSA or HSA-alum.
All antigens were inoculated as HSA at a protein weight of 10 μg. First (dotted bars)
Blood samples were taken 6 days and 5 days after the second immunization and the second (black bar) booster, respectively, and serum total IgE was measured. The results are the mean value of the sera of 4 individuals ± 1 SE
Show as. FIG. 1 (b): Time course of serum total IgE after IP immunization. On day 0, saline (open square), HSA (10 μg; open triangle) or LNnT-HSA (1
BALB / C mice were intraperitoneally immunized with 0 μg of HSA; black circles). Two weeks later, a booster was given in the same way. Blood was collected on days 10, 20, 27, 41 and 69,
Serum total IgE was examined. The results are shown as the mean value of sera of 4 individuals ± 1 SE. Figure 1 (c): Saline (dotted bar), HSA (white bar) or LNnT-HSA (
Serum IgG isotype 5 days after the third intraperitoneal immunization with (black bar). The result is 4
The mean value of individual serum is shown as ± 1 SE. All results are representative of 3 experiments.

【図２】 図２ｄ−２ｄは、多価糖での腹腔内免疫後の抗原特異的抗体産生
を示す。メスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、図１にて説明したように採血した
。最初（点々の棒）の免疫および２回目（黒棒）の免疫の後、ＨＳＡ特異的Ｉｇ
Ｅ（図２ａ）、ＨＳＡ特異的ＩｇＧ（図２ｂ），ＬＮｎＴ−ＨＳＡ特異的ＩｇＥ
（図２ｃ）、およびＬＮｎＴ−ＨＳＡ特異的ＩｇＧ（図２ｄ）を、材料および方
法にて説明したようにＥＬＩＳＡにより測定した。４倍希釈血清の４５０ｎｍに
おける吸光度により特異的ＩｇＥを測定した。特異的ＩｇＧを終点力価として測
定した。結果を、４個体の血清の平均値±１ＳＥとして示す。すべての結果は３
つの実験の典型例を示す。2d-2d show antigen-specific antibody production after intraperitoneal immunization with polyvalent sugars. Female BALB / C mice were immunized and bled as described in FIG. After the first (dotted bar) immunization and the second (black bar) immunization, HSA-specific Ig
E (Fig. 2a), HSA-specific IgG (Fig. 2b), LNnT-HSA-specific IgE.
(FIG. 2c), and LNnT-HSA-specific IgG (FIG. 2d) were measured by ELISA as described in Materials and Methods. Specific IgE was measured by the absorbance of 4-fold diluted serum at 450 nm. Specific IgG was measured as the endpoint titer. The results are shown as the mean value of sera of 4 individuals ± 1 SE. All results are 3
A typical example of two experiments is shown.

【図３】 セイライン、ＨＳＡまたはＬＮｎＴ−ＨＳＡでの腹腔内免疫後の
ＣＢＡ／Ｊ（図３ａ）およびＣ５７ＢＬ／６（図３ｂ）マウスにおける血清全Ｉ
ｇＥを示す。最初（点々の棒）の免疫および２回目（黒棒）の追加免疫それぞれ
から５日および６日後に血液試料を取り、血清全ＩｇＥを調べた。結果を、４個
体の血清の平均値±１ＳＥとして示す。図３ｃ：皮下（ＳＣ）免疫後の血清全Ｉ
ｇＥの経時変化。０日目に、セイライン（白四角）、ＨＳＡ（１０μｇ；白三角
）またはＬＮｎＴ−ＨＳＡ（１０μｇのＨＳＡ）でＢＡＬＢ／Ｃマウスを皮下免
疫した。２週間後、追加免疫を同じ方法で行った。１０、２０、２７、４１およ
び６９日目に採血し、血清全ＩｇＥを調べた。結果を、４個体の血清の平均値±
１ＳＥとして示す。図３Ｄ：セイライン、ＨＳＡまたはＬＮｎＴ−ＨＳＡでの２
回目の腹腔内追加免疫後のＣＢＡ／ＣａＪ（白棒）およびＣＢＡ／ＣａＪ ｘｉ
ｄ（斜線棒）における全血清ＩｇＥ。結果を、４個体の血清の平均値±１ＳＥと
して示す。すべての結果は２つの実験の典型例を示す。FIG. 3 Serum total I in CBA / J (FIG. 3a) and C57BL / 6 (FIG. 3b) mice after intraperitoneal immunization with saline, HSA or LNnT-HSA.
It shows gE. Blood samples were taken 5 and 6 days after the first (dotted bar) and the second (black bar) booster immunizations respectively, and examined for serum total IgE. The results are shown as the mean value of sera of 4 individuals ± 1 SE. Figure 3c: Serum total I after subcutaneous (SC) immunization.
Time course of gE. On day 0, BALB / C mice were subcutaneously immunized with saline (open squares), HSA (10 μg; open triangles) or LNnT-HSA (10 μg HSA). Two weeks later, a booster was given in the same way. Blood was collected on days 10, 20, 27, 41 and 69 for serum total IgE. The results are the mean values of the sera of 4 individuals
Shown as 1SE. Figure 3D: 2 with saline, HSA or LNnT-HSA
CBA / CaJ (white bar) and CBA / CaJ xi after the second intraperitoneal booster
Total serum IgE in d (hatched bar). The results are shown as the mean value of sera of 4 individuals ± 1 SE. All results are representative of two experiments.

【図４】 脾臓細胞の増殖応答を示す。セイライン、ＨＳＡ（１０μｇ）ま
たはＬＮｎＴ−ＨＳＤＡ（１０μｇのＨＳＡ）にてＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内
免疫した。２および３週間後に追加免疫を同じ方法で行った。最終免疫から５日
後に脾臓を取った。２．５ｘ１０６個の脾臓細胞をＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ；点
々の棒）、ＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ；斜線の棒）、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ（１０μｇ
／ｍｌのＨＳＡ；黒棒）で刺激し、あるいは刺激しなかった（白棒）。結果を、
１群あたりの４匹のマウスそれぞれの平均ｃｐｍ（実験値−培地対照値）±１Ｓ
Ｅとして示す。結果は３つの実験の典型例である。FIG. 4 shows the proliferative response of splenocytes. BALB / C mice were immunized intraperitoneally with saline, HSA (10 μg) or LNnT-HSDA (10 μg HSA). Boosts were given the same way after 2 and 3 weeks. Spleens were taken 5 days after the final immunization. 2.5 × 10 6 spleen cells were subjected to ConA (2 μg / ml; dotted bar), HSA (10 μg / ml; shaded bar), LNnT-HSA (10 μg).
/ Ml HSA; black bar) or not (white bar). The result
Mean cpm (experimental value-medium control value) ± 1S for each of 4 mice per group
Shown as E. Results are typical of 3 experiments.

【図５】 Ｂ２２０＋細胞におけるＢ７−１およびＢ７−２発現を示す。セ
イライン（図５ａ、５ｄ）、ＨＳＡ（図５ｂ、５ｅ）、またはＬＮｎＴ−ＨＳＡ
（図５ｃ、５ｆ）で腹腔内免疫したマウスからの脾臓細胞を刺激物質を添加せず
に２４時間インキュベーションした。Ｂ７−１（図５ａ、５ｂ、５ｃ）またはＢ
７−２（図５ｄ、５ｅ、５ｆ）のいずれかに対するＰＥ−結合ｍＡｂで細胞ペレ
ットを染色した。右上の区画内の数は、６個体の試料から得たＢ２２０およびＢ
７分子の両方を発現する細胞のパーセンテージの平均値±１ＳＥを示す。図５ｇ
、５ｈ：セイラン（白四角）、ＨＳＡ（白三角）またはＬＮｎＴ−ＨＳＡ（黒丸
）で腹腔内免疫されたマウスにおけるＢ７発現に対する培養インキュベーション
時間の影響。Ｂ７−１（図５ｇ）またはＢ７−２（図５ｈ）を発現するＢ２２０
＋細胞のパーセンテージを、再刺激せずにインキュベーションしてから２４、７
２および１２０時間目にモニターした。結果は２つの実験の典型を示す。FIG. 5 shows B7-1 and B7-2 expression in B220 + cells. Saline (Fig. 5a, 5d), HSA (Fig. 5b, 5e), or LNnT-HSA
Spleen cells from mice immunized intraperitoneally with (FIGS. 5c, 5f) were incubated for 24 hours without the addition of stimulants. B7-1 (Figs. 5a, 5b, 5c) or B
Cell pellets were stained with PE-conjugated mAb against any of 7-2 (FIGS. 5d, 5e, 5f). The numbers in the upper right section are B220 and B obtained from 6 samples.
Mean ± 1 SE of the percentage of cells expressing both 7 molecules is shown. Figure 5g
5h: Effect of culture incubation time on B7 expression in mice immunized ip with Ceylan (open squares), HSA (open triangles) or LNnT-HSA (filled circles). B220 expressing B7-1 (Figure 5g) or B7-2 (Figure 5h)
+ 7% of cells after incubation without restimulation 24,7
Monitored at 2 and 120 hours. The results are representative of two experiments.

【図６】 ＬＮｎＴ−デキストラン結合体ＬＮｎＴ３５にて２回（白棒）ま
たは３回（黒棒）腹腔内処理されたマウスにおける全ＩｇＥレベル（ｎｇ／ｍｌ
）を示す。FIG. 6: Total IgE levels (ng / ml) in mice treated twice (white bar) or three times (black bar) ip with LNnT-dextran conjugate LNnT35.
) Is shown.

【図７】 最初に、ＲＰＭＩ（セイライン）、オボアルブミン、ＬＮｎＴ−
デキストラン結合体ＬＮｎＴ４５またはデキストランで処理し、次いで、オボア
ルブミンで追加処理されたマウスにおける全ＩｇＥのレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示
す。FIG. 7: First, RPMI (Saline), ovalbumin, LNnT-
Levels of total IgE (ng / ml) in mice treated with dextran conjugate LNnT45 or dextran and then boosted with ovalbumin are shown.

【図８】 最初に、ＲＰＭＩ（セイライン）、オボアルブミン、ＬＮｎＴ−
デキストラン結合体ＬＮｎＴ４５またはデキストランで処理し、次いで、オボア
ルブミンで追加処理されたマウスにおけるオボアルブミン特異的ＩｇＥのレベル
を示す。FIG. 8: First, RPMI (Saline), ovalbumin, LNnT-
Figure 3 shows levels of ovalbumin-specific IgE in mice treated with dextran conjugate LNnT45 or dextran, then boosted with ovalbumin.

【図９】 セイライン、ＨＳＡまたはＬＮｎＴ−ＨＳＡのいずれかで処理さ
れたマウスにおける全ＩｇＥレベル（ｎｇ／ｍｌ）の経時変化（免疫後７０日目
まで）を示す。FIG. 9 shows the time course of total IgE levels (ng / ml) in mice treated with either saline, HSA or LNnT-HSA (up to 70 days after immunization).

【図１０】 図１０ａ−１０ｃは、担体（デキストラン）またはＬＮｎＴ−
デキストラン結合体で免疫されたマウスの全脾臓細胞によるＴｈ２型サイトカイ
ン産生レベルを示す。図１０ａはＩＬ−１３レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図１
０ｂはＩＬ−４レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図１０ｃＩＬ−１０レベル（ｐｇ
／ｍｌ）を示す。10a-10c show carrier (dextran) or LNnT-.
Figure 3 shows Th2-type cytokine production levels by total spleen cells of mice immunized with dextran conjugates. Figure 10a shows IL-13 levels (pg / ml). Figure 1
0b indicates IL-4 level (pg / ml). Figure 10 cIL-10 levels (pg
/ Ml).

【図１１】 図１０ａ−１０ｃは、担体（デキストラン）またはＬＮｎＴ−
デキストラン結合体で免疫されたマウスの全脾臓細胞によるＴｈ１型サイトカイ
ンインターフェロン−ガンマの産生レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。FIGS. 10a-10c show carrier (dextran) or LNnT-.
FIG. 3 shows the production level (pg / ml) of Th1 type cytokine interferon-gamma by whole spleen cells of mice immunized with dextran conjugate.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C085 AA02 BB24 GG02 GG06 4C086 AA01 AA02 EA02 MA01 MA04 MA56 MA66 NA14 ZB07 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, C R, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI , GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, K Z, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA , MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, S K, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG , US, UZ, VN, YU, ZA, ZW F-term (reference) 4C085 AA02 BB24 GG02 GG06                 4C086 AA01 AA02 EA02 MA01 MA04                       MA56 MA66 NA14 ZB07

Claims (27)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 多価ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む作用
剤を対象に投与して、対象における免疫応答をモジュレートすることを特徴とす
る、対象における免疫応答をモジュレートする方法。1. An immune response in a subject, which is characterized in that an agent comprising polyvalent lacto-N-neotetraose (LNnT) is administered to the subject to modulate the immune response in the subject. Method. 【請求項２】 作用剤が、蛋白担体に結合したＬＮｎＴを含むものである請
求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the agent comprises LNnT bound to a protein carrier. 【請求項３】 作用剤が、ヒト血清アルブミンに結合したＬＮｎＴを含むも
のである請求項２記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein the agent comprises LNnT bound to human serum albumin. 【請求項４】 作用剤が、炭水化物ポリマーに結合したＬＮｎＴを含むもの
である請求項１記載の方法。4. The method of claim 1, wherein the agent comprises LNnT bound to a carbohydrate polymer. 【請求項５】 作用剤が、デキストランに結合したＬＮｎＴを含むものであ
る請求項４記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein the agent comprises LNnT bound to dextran. 【請求項６】 作用剤が腹腔内投与される請求項１記載の方法。6. The method of claim 1, wherein the agent is administered intraperitoneally. 【請求項７】 作用剤が静脈内投与される請求項１記載の方法。7. The method of claim 1, wherein the agent is administered intravenously. 【請求項８】 モジュレートされる免疫応答がＩｇＥ応答である請求項１記
載の方法。8. The method of claim 1, wherein the modulated immune response is an IgE response. 【請求項９】 ポリクローナルＩｇＥ応答が刺激される請求項８記載の方法
。9. The method of claim 8, wherein a polyclonal IgE response is stimulated. 【請求項１０】 対象をアレルゲンに曝露する前に対象に作用剤を投与する
ことを特徴とし、対象におけるアレルゲン特異的ＩｇＥ応答の発生が阻害される
ものである、請求項８記載の方法。10. The method of claim 8, wherein the agent is administered to the subject prior to exposing the subject to the allergen, wherein the development of the allergen-specific IgE response in the subject is inhibited. 【請求項１１】 Ｔｈ２型サイトカイン産生能のある細胞を多価ラクト−Ｎ
−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む作用剤と接触させて、細胞によりＴｈ２
型サイトカインが産生されるようにすることを特徴とする、Ｔｈ２型サイトカイ
ン産生を刺激する方法。11. A cell capable of producing a Th2-type cytokine is polyvalent lacto-N.
Contacting with an agent containing neotetraose (LNnT) and allowing cells to produce Th2
A method for stimulating Th2-type cytokine production, which comprises allowing the production of type-2 cytokines. 【請求項１２】 サイトカインがＩＬ−４である請求項１１記載の方法。12. The method of claim 11, wherein the cytokine is IL-4. 【請求項１３】 サイトカインがＩＬ−１０またはＩＬ−１３である請求項
１１記載の方法。13. The method according to claim 11, wherein the cytokine is IL-10 or IL-13. 【請求項１４】 作用剤が、蛋白担体に結合したＬＮｎＴを含むものである
請求項１１記載の方法。14. The method according to claim 11, wherein the agent comprises LNnT bound to a protein carrier. 【請求項１５】 作用剤が、ヒト血清アルブミンに結合したＬＮｎＴを含む
ものである請求項１４記載の方法。15. The method according to claim 14, wherein the agent comprises LNnT bound to human serum albumin. 【請求項１６】 作用剤が、炭水化物ポリマーに結合したＬＮｎＴを含むも
のである請求項１１記載の方法。16. The method of claim 11, wherein the agent comprises LNnT linked to a carbohydrate polymer. 【請求項１７】 作用剤が、デキストランに結合したＬＮｎＴを含むもので
ある請求項１６記載の方法。17. The method according to claim 16, wherein the agent comprises LNnT bound to dextran. 【請求項１８】 多価ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む作
用剤に脾臓細胞を接触させて、脾臓細胞の増殖を刺激することを特徴とする、脾
臓細胞の増殖を刺激する方法。18. A method for stimulating spleen cell proliferation, which comprises stimulating spleen cell proliferation by contacting spleen cells with an agent containing polyvalent lacto-N-neotetraose (LNnT). . 【請求項１９】 作用剤が、蛋白担体に結合したＬＮｎＴを含むものである
請求項１８記載の方法。19. The method according to claim 18, wherein the agent comprises LNnT bound to a protein carrier. 【請求項２０】 作用剤が、ヒト血清アルブミンに結合したＬＮｎＴを含む
ものである請求項１９記載の方法。20. The method according to claim 19, wherein the agent comprises LNnT bound to human serum albumin. 【請求項２１】 作用剤が、炭水化物ポリマーに結合したＬＮｎＴを含むも
のである請求項１８記載の方法。21. The method of claim 18, wherein the agent comprises LNnT linked to a carbohydrate polymer. 【請求項２２】 作用剤が、デキストランに結合したＬＮｎＴを含むもので
ある請求項２１記載の方法。22. The method of claim 21, wherein the agent comprises LNnT bound to dextran. 【請求項２３】 多価ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む作
用剤および医薬担体を含み、対象におけるＩｇＥ応答のモジュレーターとして使
用するための説明書とともに包装された医薬組成物。23. A pharmaceutical composition comprising an agent comprising polyvalent lacto-N-neotetraose (LNnT) and a pharmaceutical carrier packaged with instructions for use as a modulator of an IgE response in a subject. 【請求項２４】 作用剤が、蛋白担体に結合したＬＮｎＴを含むものである
請求項２３記載の医薬組成物。24. The pharmaceutical composition according to claim 23, wherein the agent contains LNnT bound to a protein carrier. 【請求項２５】 作用剤が、ヒト血清アルブミンに結合したＬＮｎＴを含む
ものである請求項２４記載の医薬組成物。25. The pharmaceutical composition according to claim 24, wherein the agent comprises LNnT bound to human serum albumin. 【請求項２６】 作用剤が、炭水化物ポリマーに結合したＬＮｎＴを含むも
のである請求項２３記載の医薬組成物。26. The pharmaceutical composition according to claim 23, wherein the agent comprises LNnT linked to a carbohydrate polymer. 【請求項２７】 作用剤が、デキストランに結合したＬＮｎＴを含むもので
ある請求項２６記載の医薬組成物。27. The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the agent comprises LNnT bound to dextran.
JP2000584900A 1998-12-01 1999-12-01 Immunomodulation methods using carbohydrate antigens Pending JP2003524612A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11049698P 1998-12-01 1998-12-01
US60/110,496 1998-12-01
US45174599A 1999-11-30 1999-11-30
US09/451,745 1999-11-30
PCT/US1999/028308 WO2000032205A1 (en) 1998-12-01 1999-12-01 Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003524612A true JP2003524612A (en) 2003-08-19

Family

ID=26808075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000584900A Pending JP2003524612A (en) 1998-12-01 1999-12-01 Immunomodulation methods using carbohydrate antigens

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20020142945A1 (en)
EP (1) EP1135143A1 (en)
JP (1) JP2003524612A (en)
CA (1) CA2353502A1 (en)
MX (1) MXPA01005441A (en)
WO (1) WO2000032205A1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001078748A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
DE60301677T2 (en) 2002-02-04 2006-07-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pharmaceutical and food compositions containing a di- or oligosaccharide that enhances insulin release
CA2833369C (en) 2011-04-18 2020-09-08 Donald A. Harn Vaccine delivery method

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6841543B1 (en) * 1996-01-31 2005-01-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of inhibiting production of T helper type 2 cytokines in human immune cells

Also Published As

Publication number Publication date
CA2353502A1 (en) 2000-06-08
WO2000032205A8 (en) 2000-08-24
EP1135143A1 (en) 2001-09-26
MXPA01005441A (en) 2002-03-14
WO2000032205A9 (en) 2001-07-12
US20020142945A1 (en) 2002-10-03
WO2000032205A1 (en) 2000-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pearce et al. Downregulation of Th1 cytokine production accompanies induction of Th2 responses by a parasitic helminth, Schistosoma mansoni.
AU2005316265B2 (en) Use of flagellin in the immunotherapy of Yersinia pestis
US7799755B2 (en) Immunomodulatory methods using oligosaccharides
EP1113818A1 (en) METHODS OF TREATING IgE-ASSOCIATED DISORDERS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREIN
Bauer et al. Modulation of the allergic immune response in BALB/c mice by subcutaneous injection of high doses of the dominant T cell epitope from the major birch pollen allergen Bet v 1
WO2005037190A2 (en) Multiplex vaccines
US9987372B2 (en) Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
JP2000510844A (en) Method of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
US20140322274A1 (en) Therapeutic Agents
Stertman et al. Starch microparticles as an adjuvant in immunisation: effect of route of administration on the immune response in mice
US20040047866A1 (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
JP2002526420A (en) Substantially non-toxic, biologically active mucosal adjuvants in vertebrates
WO2001078748A2 (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
US8765721B2 (en) Composition comprising phosphatidyl serine and an antigen or allergen and the use thereof
KR101849831B1 (en) Vaccine composition comprising M cell homing peptide-antigen conjugate and mucoadhesive vehicle
JP2003524612A (en) Immunomodulation methods using carbohydrate antigens
JP2004508290A (en) Use of granular vectors in immunomodulation
AU3106300A (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
Pankhurst et al. MAIT cells activate dendritic cells to promote T follicular helper cell differentiation and humoral immunity
JP2003516936A (en) Adjuvanted gene vaccine
Creticos Peptide downregulation of the immune response
Wang Therapeutic vaccines based on Mycobacterium vaccae for treatment of an established IgE response to ovalbumin in BALB/c mice
MacAry and David M. Kemeny, BSC, PHD, MRCPATH