JP2003523313A - Methods for inhibiting chaperone proteins - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、シャペロン蛋白質と、そのクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドとの結合を阻害する方法を提供する。本法は、クマリンまたはクマリン誘導体をシャペロン蛋白質と接触させることを含み、これによって該クマリンまたは該クマリン誘導体が該シャペロン蛋白質に結合し、これが該シャペロン蛋白質が該クライアント蛋白質または該クライアントポリペプチドと結合することを阻害する方法である。   (57) [Summary] SOLUTION: The present invention provides a method for inhibiting the binding of a chaperone protein to its client protein or client polypeptide. The method includes contacting the coumarin or coumarin derivative with a chaperone protein, whereby the coumarin or coumarin derivative binds to the chaperone protein, which binds the chaperone protein to the client protein or the client polypeptide. It is a method to inhibit that.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、シャペロン蛋白質と、そのクライアント（client）蛋白質またはク
ライアントポリペプチドとの結合を阻害する方法に関する。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for inhibiting the binding between a chaperone protein and its client protein or client polypeptide.

【０００２】 （発明の背景） シャペロン蛋白質は、他の蛋白質またはポリペプチド（クライアント蛋白質ま
たはクライアントポリペプチドと呼ばれる）の適切なアセンブリ（assembly）を
仲介する蛋白質であるが、それら自身組み立て構造の一部ではない。これらの蛋
白質は、オリゴマー複合体を形成するためのポリペプチドの互いのおよび他の高
分子との会合（association）だけでなく、例えば合成や輸送の間の蛋白質のフ
ォールディングおよび再フォールディングなど、多くの高分子アセンブリプロセ
スに関わる。それらは、新たに合成されたポリペプチド鎖のフォールディング、
蛋白質がその機能を実行するときに起こるであろう部分的なアンフォールディン
グまたは脱会合、膜を横切る蛋白質の輸送や、高温など環境的ストレスへの暴露
による部分的に変性された蛋白質の修復に関係している。BACKGROUND OF THE INVENTION Chaperone proteins are proteins that mediate the proper assembly of other proteins or polypeptides (called client proteins or client polypeptides), but are themselves part of the assembly structure. is not. These proteins are associated with many associations of polypeptides with each other and with other macromolecules to form oligomeric complexes, as well as many other factors, such as protein folding and refolding during synthesis and transport. Involved in polymer assembly process. They are the folding of newly synthesized polypeptide chains,
Involved in the partial unfolding or disassociation, transport of proteins across the membrane, and repair of partially denatured proteins that are exposed to environmental stresses such as high temperature, which may occur when the protein performs its function is doing.

【０００３】 シャペロン蛋白質は、アセンブリの間のみ接近可能なそれらのターゲット中の
特異的な構造特徴に非共有結合することによって作用し、そうでなければ不適切
な非機能的な構造を生じる動的行き詰まり（kinetic dead end）として作用する
であろう非生産的なアセンブリ経路を阻害する。それらの機能は、蛋白質アセン
ブリに関係する多くの細胞のプロセスが、それらの機能的コンフォメーション状
態で蛋白質を保持する非共有結合的な相互作用の数多さ、多様性、および柔軟性
の結果として、機能不全の固有のリスクを負うために要求される。多くの本質的
な細胞のプロセスは、不適切な相互作用に起因するエラーの結果として起こるリ
スクを伴う、相互作用する蛋白質表面の細胞内環境への一時的な暴露に関係する
。このようなプロセスとしては、蛋白質合成、蛋白質輸送または転置、蛋白質機
能、オルガネラ生物発生、およびストレス応答が挙げられる。シャペロン蛋白質
は、蛋白質のアセンブリが起こる細胞の全ての部分に局在する。シャペロン蛋白
質の異なるクラスのメンバーは、例えばミトコンドリア内へのポリペプチドの輸
送およびそれらの最終的な機能的コンフォメーションへのアセンブリのようなプ
ロセスの仲介に協力する。Chaperone proteins act by noncovalently binding to specific structural features in their targets that are accessible only during assembly, and otherwise give rise to unsuitable nonfunctional structures. Inhibits unproductive assembly pathways that would act as kinetic dead ends. Their function is as a result of the large number, diversity, and flexibility of noncovalent interactions that many cellular processes involved in protein assembly retain in their functional conformational state. Required to bear the inherent risk of dysfunction. Many essential cellular processes involve transient exposure of interacting protein surfaces to the intracellular environment, with the risk of errors resulting from inappropriate interactions. Such processes include protein synthesis, protein transport or translocation, protein function, organelle biogenesis, and stress response. Chaperone proteins are localized in all parts of the cell where protein assembly occurs. Members of different classes of chaperone proteins cooperate in mediating processes such as transport of polypeptides into mitochondria and assembly into their final functional conformation.

【０００４】 近年、シャペロン蛋白質が細胞増殖に関係する種々の蛋白質と相互作用するこ
とが明らかにされてきている。このようなシャペロン蛋白質の１つである熱ショ
ック蛋白質（Ｈｓｐ）９０は、それらの正常な同等物と比較して、２〜１０倍高
いレベルで腫瘍細胞中に構成的に発現する(Ferrariniら、Int. J. Cancer 51:61
3-619(1992)参照)。種々の化合物がＨｓｐ９０のシャペロン蛋白質機能を妨げる
ことが知られている。例えば、ベンゾキノンアンサマイシン、ゲルダナマイシン
およびヘルビマイシンＡが、関連性のない大環状抗生物質〔ラジシコル（radici
col）〕と一緒にＨｓｐ９０に結合し、その機能（腫瘍細胞増殖における機能を
含む）を阻害することが示されている（Whitesellら、Proc. Nat'l Acad. Sci.
USA 91:8324-8328(1994); Schulteら、Cell Stress and Chaperone Proteins 3:
100-108(1998);Johnsonら、Mol. Endocrinol. 9:670-678(1995);Sullivanら、J.
Biol. Chem. 272:8007-8012(1997)参照）。これらの化合物の使用は、それらの
Ｈｓｐ９０拮抗作用に関係しないインビボでの毒性を示すように、必ずしも臨床
用途によく適してはいない。In recent years, it has been revealed that chaperone proteins interact with various proteins involved in cell proliferation. One such chaperone protein, heat shock protein (Hsp) 90, is constitutively expressed in tumor cells at 2-10 fold higher levels compared to their normal equivalents (Ferrarini et al., Int. J. Cancer 51:61
3-619 (1992)). Various compounds are known to interfere with the Hsp90 chaperone protein function. For example, the benzoquinones ansamycins, geldanamycins and herbimycins A are irrelevant macrocyclic antibiotics [radicicols.
col)] and inhibit its function, including its function in tumor cell proliferation (Whitesell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.
USA 91: 8324-8328 (1994); Schulte et al., Cell Stress and Chaperone Proteins 3:
100-108 (1998); Johnson et al., Mol. Endocrinol. 9: 670-678 (1995); Sullivan et al., J.
Biol. Chem. 272: 8007-8012 (1997)). The use of these compounds is not always well suited for clinical use, as they show in vivo toxicity not related to their Hsp90 antagonism.

【０００５】 上記の点から、シャペロン蛋白質の拮抗物質を利用する更なる方法が要求され
ている。特に、シャペロン蛋白質の機能を阻害する臨床的に適した化合物を利用
する方法が要求されている。本発明はこのような方法を提供する。本発明のこれ
らのおよび他の利点並びにさらなる発明の特徴は、ここに提供した本発明の記載
から明らかになるだろう。In view of the above points, there is a need for a further method using an antagonist of chaperone protein. In particular, there is a demand for a method of utilizing a clinically suitable compound that inhibits the function of chaperone protein. The present invention provides such a method. These and other advantages of the invention, as well as additional inventive features, will be apparent from the description of the invention provided herein.

【０００６】 （発明の簡単な要旨） 本発明は、シャペロン蛋白質と、そのクライアント蛋白質またはクライアント
ポリペプチドとの結合を阻害する方法を提供する。本法は、シャペロン蛋白質を
クマリンまたはクマリン誘導体と接触させることを含み、これによって該クマリ
ンまたは該クマリン誘導体が該シャペロン蛋白質に結合し、これが該シャペロン
蛋白質が該クライアント蛋白質または該クライアントポリペプチドと結合するこ
とを阻害する方法である。該クライアント蛋白質または該クライアントポリペプ
チドは、該シャペロン蛋白質が該クマリンまたは該クマリン誘導体に結合した後
、不活性または低活性である。BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method of inhibiting the binding of a chaperone protein to its client protein or client polypeptide. The method comprises contacting the chaperone protein with coumarin or a coumarin derivative, whereby the coumarin or coumarin derivative binds to the chaperone protein, which binds the chaperone protein to the client protein or the client polypeptide. It is a method of inhibiting that. The client protein or client polypeptide is inactive or less active after the chaperone protein binds to the coumarin or the coumarin derivative.

【０００７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、シャペロン蛋白質と、そのクライアント蛋白質またはクライアント
ポリペプチドとの結合を阻害する方法を提供する。本法は、シャペロン蛋白質を
クマリンまたはクマリン誘導体と接触させることを含み、これによって該クマリ
ンまたは該クマリン誘導体が該シャペロン蛋白質に結合し、これが該シャペロン
蛋白質が該クライアント蛋白質または該クライアントポリペプチドと結合するこ
とを阻害する方法である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method of inhibiting the binding of a chaperone protein to its client protein or client polypeptide. The method comprises contacting the chaperone protein with coumarin or a coumarin derivative, whereby the coumarin or coumarin derivative binds to the chaperone protein, which binds the chaperone protein to the client protein or the client polypeptide. It is a method of inhibiting that.

【０００８】 本発明におけるシャペロン蛋白質は、任意の適当なシャペロン蛋白質またはシ
ャペロン蛋白質複合体であってよい。シャペロンおよびシャペロン蛋白質複合体
のファミリーの例としては、制限されないが、ヌクレオプラスミン、シャペロニ
ン、熱ショック蛋白質類（Ｈｓｐ類）、ＤｎａＪ蛋白質、ＧｒｐＥ蛋白質、Ｓｅ
ｃＢ蛋白質、シグナル認識粒子、プロシークエンス（prosequence）、ユビキチ
ン化蛋白質、ＰａｐＤ蛋白質、ＰｒｔＭおよびＰｒｓＡ、Ｌｉｍ蛋白質、Ｒｂ蛋
白質、小熱ショック蛋白質、ＥｘｂＢ蛋白質およびプリオンが挙げられる。熱シ
ョック蛋白質複合体の例としては、制限されないが、以下のものが挙げられる：
（１）ステロイドレセプター会合Ｈｓｐ９０含有中間体フォールディング複合体
（steroid receptor-associated Hsp90-containing intermediate folding comp
lex）、これは中間複合体（Ｈｓｐ７０／Ｈｓｐ９０／ｐ６０^Hop−ＰＲ）を介す
るプロゲステロンレセプター（ＰＲ）の成熟において機能するものであって、こ
れによって該レセプターはホルモンに結合する能力はまだないが、該中間複合体
は結果として起こる成熟のために要求されるものである； （２）シャペロン蛋白質のＨｓｐ７０ファミリー、これには細胞質ゾルシャペロ
ン蛋白質Ｈｓｃ７０、熱ストレス誘導Ｈｓｐ７０、および小胞体シャペロン蛋白
質Ｇｒｐ７８が含まれる； （３）共シャペロン蛋白質ｐ４８^Hip、これはＨｓｐ７０のアデノシントリホス
ファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）ドメインに結合し、そのアデノシンジホスフェート
（ＡＤＰ）結合の状態を安定化させるものである； （４）ｐ６０^Hop、これはＮ−末端テトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）モチー
フ（これは、しばしば直列で(in tandem)発生し、蛋白質−蛋白質相互作用を仲
介するらしい３４アミノ酸の変性配列である）を介してＨｓｐ７０に結合し、そ
してＣ末端に近接する第２のＴＰＲモチーフを介してＨｓｐ９０に結合するもの
であって、そして精製Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０と共にインキュベートする場
合、該他の２つの蛋白質と共に三者複合体（tripartite complex）を形成するも
のである； （５）ｐ２３、これは成熟したＰＲ複合体の構成要素である非常に酸性のリン蛋
白質であり、ＰＲの不存在下でさえもしばしばＨｓｐ９０およびイムノフィリン
に会合して見出されるものであり、そして、ステロイドレセプター会合Ｈｓｐ９
０複合体に関与することに加えて、Ｂ型肝炎ウイルス逆転写酵素、突然変異ｐ５
３、アリールハイドロカーボンレセプター、および熱ショック転写因子Ｈｓｆ−
１とのＨｓｐ９０複合体として見出され得るものである； （６）イムノフィリン類、これらはそれらのＴＰＲモチーフを介してＨｓｐ９０
に結合し、マルチシャペロン蛋白質複合体においてｐ６０^Hopを置換するもので
あって、そしてそれらが微小管と核構造の両方に会合して見出されているので、
輸送機能をまた有し得るものである； （７）Ｈｓｐ９０（すなわちＰＰ５：これはそのＮ−末端ドメイン中に４ＴＰＲ
モチーフを含有するセリン／スレオニンホスファターゼである）およびＭａｓ７
０ｐ（これは７ ＴＰＲモチーフを含有する外側のミトコンドリア膜における蛋
白質の輸入機構の構成要素である）に結合することが示されている２つの他の蛋
白質含有ＴＰＲモチーフ（Ｍａｓ７０ｐ−Ｈｓｐ９０複合体の存在は、Ｈｓｐ９
０がミトコンドリア中への蛋白質移動に関与し得ることを示唆する）；および、
（８）ｐ５０^Cdc37、これはＨｓｐ９０複合体中のイムノフィリンをキナーゼ類
（例えばＣｄｋ４，ｖ−ＳｒｃおよびＲａｆ−１）と置換し、そしてＴＰＲモチ
ーフを有しないが、Ｈｓｐ９０のＴＰＲ結合ドメインに近い部位に結合するもの
である。The chaperone protein in the present invention may be any suitable chaperone protein or chaperone protein complex. Examples of families of chaperones and chaperone protein complexes include, but are not limited to, nucleoplasmin, chaperonins, heat shock proteins (Hsps), DnaJ protein, GrpE protein, Se.
Examples include cB protein, signal recognition particle, prosequence, ubiquitinated protein, PapD protein, PrtM and PrsA, Lim protein, Rb protein, small heat shock protein, ExbB protein and prion. Examples of heat shock protein complexes include, but are not limited to:
(1) Steroid receptor-associated Hsp90-containing intermediate folding comp
lex), which functions in maturation of the progesterone receptor (PR) via an intermediate complex (Hsp70 / Hsp90 / p60 ^Hop- PR), whereby the receptor is not yet capable of binding hormones, The intermediate complex is required for the resulting maturation; (2) the Hsp70 family of chaperone proteins, which includes the cytosolic chaperone protein Hsc70, heat stress-induced Hsp70, and the endoplasmic reticulum chaperone protein Grp78. (3) the co-chaperone protein p48 ^Hip , which binds to the adenosine triphosphatase (ATPase) domain of Hsp70 and stabilizes its adenosine diphosphate (ADP) binding state; (4) p60 ^Hop , This is the N-terminal tetrato It binds to Hsp70 via a copeptide repeat (TPR) motif, which is a degenerate sequence of 34 amino acids that often occurs in tandem and appears to mediate protein-protein interactions, and is adjacent to the C-terminus. Binding to Hsp90 via a second TPR motif that forms a tripartite complex with the other two proteins when incubated with purified Hsp70 and Hsp90; (5) p23, a highly acidic phosphoprotein that is a constituent of the mature PR complex, is often found associated with Hsp90 and immunophilins even in the absence of PR, and , Steroid receptor associated Hsp9
Hepatitis B virus reverse transcriptase, mutation p5, in addition to being involved in the 0 complex
3, aryl hydrocarbon receptor, and heat shock transcription factor Hsf-
Can be found as a Hsp90 complex with 1; (6) Immunophilins, which are Hsp90 via their TPR motifs.
Binding to and replacing p60 ^Hop in the multi-chaperone protein complex, and since they are found associated with both microtubules and nuclear structures,
(7) Hsp90 (ie PP5: which has 4TPR in its N-terminal domain)
Is a serine / threonine phosphatase containing motif) and Mas7
The presence of two other protein-containing TPR motifs (Mas70p-Hsp90 complex), which have been shown to bind to 0p, which is a component of the protein import machinery in the outer mitochondrial membrane containing the 7 TPR motif. Is Hsp9
0 may be involved in protein translocation into mitochondria); and,
(8) p50 ^Cdc37 , which ^replaces the immunophilins in the Hsp90 complex with kinases (eg Cdk4, v-Src and Raf-1) and has no TPR motif but is close to the TPR binding domain of Hsp90. Is bound to.

【０００９】 好ましくは、シャペロン蛋白質はＨｓｐ９０であり、これはストレスのない状
態でさえも細胞性蛋白質全部の１〜２％を占める真核細胞中最も豊富な蛋白質の
一つである。哺乳類の細胞において、細胞質ゾル中には２つのＨｓｐ９０異性体
、ヒトにおいてはＨｓｐ９０αおよびＨｓｐ９０β、マウスにおいてはＨｓｐ８
６およびＨｓｐ８４が存在する（主に小胞体中に局在しているサード ホモログ
であるグルコース調節蛋白質９４（Ｇｒｐ９４）を有する）。さらに切り詰めら
れた(truncate)、細胞質ゾルのファミリーのメンバー（Ｈｓｐ７５と呼ばれる）
が近年同定されている。機能的分析は、Ｈｓｐ９０が３つの主要なドメイン（荷
電したドメインによって分けられた、よく保存されたアミノおよびカルボキシル
末端領域）から構成されることを明らかにしている（Scheibelら、J. Biol. Che
m., 272:18608-18613(1997)；Scheibelら、Proc Natl Acad Sci USA 95:1495-14
99(1998)参照）。Preferably, the chaperone protein is Hsp90, which is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells accounting for 1-2% of all cellular proteins even in the absence of stress. In mammalian cells, the two Hsp90 isomers in the cytosol, Hsp90α and Hsp90β in human, and Hsp8 in mouse.
6 and Hsp84 are present (with glucose-regulated protein 94 (Grp94), a third homolog predominantly localized in the endoplasmic reticulum). A more truncated member of the cytosolic family (called Hsp75)
Has been recently identified. Functional analysis reveals that Hsp90 is composed of three major domains, a well-conserved amino and carboxyl terminal region separated by a charged domain (Scheibel et al., J. Biol. Che.
m., 272: 18608-18613 (1997); Scheibel et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 1495-14.
99 (1998)).

【００１０】 Ｈｓｐ９０は、ステロイドレセプターファミリーのメンバー、アリールハイド
ロカーボンレセプターおよびレチノイドレセプターを含む、幾つかの「リガンド
依存性」転写因子の完全な活性のために要求される。Ｈｓｐ９０に結合する「リ
ガンド非依存性」転写因子としては、ＭｙｏＤ、Ｈｓｆ−１、突然変異ｐ５３お
よび低酸素誘導因子１−αが挙げられる。また、Ｈｓｐ９０またはＧｒｐ９４は
Ｓｒｃファミリーのメンバー、腫瘍遺伝子の上皮成長因子（ＥＧＦ）、レセプタ
ーに関係したチロシンキナーゼｐ１８５^erbB2、サイクリン依存性キナーゼ４（
Ｃｄｋ４）、細胞周期会合キナーゼＷｅｅ１、およびセリン−スレオニンキナー
ゼＲａｆ−１（これは、マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼ経路のメ
ンバーである）を含む、広く多様なチロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼ
の適切な機能および適切な細胞局在のために必要であることが示されている。Hsp90 is required for the full activity of several “ligand-dependent” transcription factors, including members of the steroid receptor family, aryl hydrocarbon receptors and retinoid receptors. "Ligand-independent" transcription factors that bind to Hsp90 include MyoD, Hsf-1, mutant p53 and hypoxia inducible factor 1-α. Hsp90 or Grp94 is a member of the Src family, an oncogene epidermal growth factor (EGF), a receptor-related tyrosine kinase p185 ^erbB2 , a cyclin-dependent kinase 4 (
Cdk4), the cell cycle-associated kinase Wee1, and the serine-threonine kinase Raf-1 (which is a member of the mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway), including a wide variety of tyrosine and serine / threonine kinases. It has been shown to be necessary for function and proper cellular localization.

【００１１】 「クマリンまたはクマリン誘導体」は、クマリンファミリーの任意の適当なメ
ンバーである。この化合物のファミリーは、２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
核（分子式Ｃ₉Ｈ₆Ｏ₂）を有し、以下に示される(DeGarmo, Coumarin, in ETC 1s
t ed., vol.4, 588-593；2nd ed., vol.6, 425-433, (Monsanto Chemical Co.)
；Sethnaら、Chem. Rev. 36:27(1945)参照)。誘導体としては、例えばアルキル
、ヒドロキシおよびメトキシ誘導体、並びに例えば３，４−ジヒドロクマリン、
６−メチルクマリン、ウンベリフェロン（７−ヒドロキシクマリン）、４−ヒド
ロキシクマリン（下記参照）、ジクマロール（下記参照）、ワルファリン（３位
置換−４−ヒドロキシクマリン、この例は下記参照）、フェンプロクモン（下記
参照）、クマロン（ベンゾフラン）、およびクマロン−インデン樹脂類などのよ
り複雑な誘導体が挙げられる。A “coumarin or coumarin derivative” is any suitable member of the coumarin family. This family of compounds has a 2H-1-benzopyran-2-one nucleus (molecular formula C ₉ H ₆ O ₂ ) and is shown below (DeGarmo, Coumarin, in ETC 1s.
t ed., vol.4, 588-593; 2nd ed., vol.6, 425-433, (Monsanto Chemical Co.)
See Sethna et al., Chem. Rev. 36:27 (1945)). Derivatives include, for example, alkyl, hydroxy and methoxy derivatives, and for example 3,4-dihydrocoumarin,
6-methylcoumarin, umbelliferone (7-hydroxycoumarin), 4-hydroxycoumarin (see below), dicoumarol (see below), warfarin (3-substituted-4-hydroxycoumarin, see below for this example), fenpro Included are more complex derivatives such as cummon (see below), coumarone (benzofuran), and coumarone-indene resins.

【００１２】[0012]

【化１】 [Chemical 1]

【００１３】 好ましくは、クマリンまたはクマリン誘導体は、クマリン抗生物質である。ク
マリン抗生物質は、下記のような４−ヒドロキシ−８−メチルクマリン核（Ａ）
およびノビオース糖部分（Ｂ）を有する（Finland & Nichols, Anti-Biot. Chem
other. 4:1954-68(1957)；Godfrey & Price, Structure-Activity Relationship
s in Coumermycins, in Structure-Activity Among the Semisynthetic Antibio
tics 653-718(D. Perlman, ed.(1977)参照)。[0013] Preferably the coumarin or coumarin derivative is a coumarin antibiotic. Coumarin antibiotics are 4-hydroxy-8-methylcoumarin nuclei (A) such as
And a noviose sugar moiety (B) (Finland & Nichols, Anti-Biot. Chem
other. 4: 1954-68 (1957); Godfrey & Price, Structure-Activity Relationship
s in Coumermycins, in Structure-Activity Among the Semisynthetic Antibio
tics 653-718 (see D. Perlman, ed. (1977)).

【００１４】[0014]

【化２】 [Chemical 2]

【００１５】 Ｒ¹およびＲ²は、任意の適当な置換基であり得る。Ｒ¹として適当な置換基の
例としては、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニル、アルキ
ニル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シク
ロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、
またはＯ＝Ｃ−Ｒ³が挙げられる。Ｒ³は、例えばＨ、アルキル、ハロアルキル、
アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキ
ルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロ
シクロアルキル、ヘテロアリール、またはＮＲ⁴などの任意の適当な置換基であ
り得る。Ｒ⁴は、例えばＨ、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニ
ル、アルキニル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルア
ミノ、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル、または
ヘテロアリールなどの任意の適当な置換基であり得る。好ましくは、Ｒ³は置換
ヘテロアリールである。Ｒ²として適当な置換基の例としては、Ｈ、アルキル、
ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロアル
コキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキル、アリール、アラ
ルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、またはＯ＝Ｃ−Ｒ⁵が挙げら
れる。Ｒ⁵は、例えばＨ、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニル
、アルキニル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミ
ノ、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル、またはヘ
テロアリールなどの任意の適当な置換基であり得る。好ましくは、Ｒ⁵はアリー
ルであり、より好ましくは単環式、そして最も好ましくは六員環であり、そして
例えばハロゲン（例えばフッ素、塩素、または臭素）、アルキル、ハロアルキル
、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、ヒ
ドロキシ、アミノ、チオ、アルキルチオ、またはアシルなどで置換されている。
これらの置換基は、それら自身置換されていても置換されていなくてもよい。R ¹ and R ² can be any suitable substituents. Examples of suitable substituents for R ¹ include H, alkyl, haloalkyl, alkylthio, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, alkylamino, dialkylamino, cycloalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, heteroaryl,
Or O = C-R ³ can be exemplified. R ³ is, for example, H, alkyl, haloalkyl,
It may be any suitable substituent such as alkylthio, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, alkylamino, dialkylamino, cycloalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, heteroaryl, or NR ⁴ . R ⁴ is any suitable substituent such as H, alkyl, haloalkyl, alkylthio, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, alkylamino, dialkylamino, cycloalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, or heteroaryl. Can be. Preferably R ³ is substituted heteroaryl. Examples of suitable substituents for R ² are H, alkyl,
Haloalkyl, alkylthio, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, alkylamino, dialkylamino, cycloalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, heteroaryl, or O = C-R ⁵ and the like. R ⁵ is any suitable substituent such as H, alkyl, haloalkyl, alkylthio, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, alkylamino, dialkylamino, cycloalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, or heteroaryl. Can be. Preferably R ⁵ is aryl, more preferably monocyclic, and most preferably a 6-membered ring, and for example halogen (eg fluorine, chlorine or bromine), alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, Substituted with haloalkoxy, nitro, cyano, hydroxy, amino, thio, alkylthio, or acyl and the like.
These substituents may themselves be substituted or unsubstituted.

【００１６】 ここで用いられる用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味
し、これは他に特定される場合を除き、約１〜約２０個の炭素原子鎖、好ましく
は約１〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約１〜約８個の炭素原子、最も好
ましくは約１〜約６個の炭素原子を含有する。このようなアルキル基の例として
は、メチル、エチル、プロピル（すなわち、ｎ−またはイソプロピル）、ブチル
（すなわち、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ、またはｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル、イ
ソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニルなどが挙げられる。As used herein, the term “alkyl” refers to a straight or branched chain alkyl group, which unless otherwise specified, has a chain of about 1 to about 20 carbon atoms, preferably It contains from about 1 to about 10 carbon atoms, more preferably from about 1 to about 8 carbon atoms, and most preferably from about 1 to about 6 carbon atoms. Examples of such alkyl groups include methyl, ethyl, propyl (ie n- or isopropyl), butyl (ie n-, sec-, iso or tert-butyl), pentyl, isoamyl, hexyl, octyl, Examples include dodecanyl.

【００１７】 用語「ハロアルキル」は、ここで定義されるアルキルにおいて、水素原子がハ
ロゲン（例えば、塩素、フッ素、または臭素）で置換されているものを意味する
。The term “haloalkyl” means an alkyl, as defined herein, wherein a hydrogen atom is replaced with a halogen (eg chlorine, fluorine, or bromine).

【００１８】 用語「アルキルチオ」は、ここで定義されるアルキルであって、硫黄置換基を
有するものを意味する。アルキルチオの例としては、メタンチオール、エタンチ
オールなどが挙げられる。The term “alkylthio” means an alkyl, as defined herein, having a sulfur substituent. Examples of alkylthio include methanethiol, ethanethiol and the like.

【００１９】 用語「アルケニル」は、直鎖または分枝鎖のアルケニル基を意味し、これは他
に特定される場合を除き、二重結合を１以上有し、そして約２〜約２０個の炭素
原子、好ましくは約２〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭
素原子、最も好ましくは約２〜約６個の炭素原子を含有する。アルケニル基の例
としては、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニルなどが挙げ
られる。The term “alkenyl” means a straight or branched chain alkenyl group, which unless otherwise specified, has one or more double bonds and contains from about 2 to about 20 carbon atoms. It contains carbon atoms, preferably about 2 to about 10 carbon atoms, more preferably about 2 to about 8 carbon atoms, and most preferably about 2 to about 6 carbon atoms. Examples of alkenyl groups include vinyl, allyl, 1,4-butadienyl, isopropenyl and the like.

【００２０】 用語「アルキニル」は、直鎖または分枝鎖のアルキニル基を意味し、これは三
重結合を１以上有し、約２〜約２０個の炭素原子、好ましくは約２〜約１０個の
炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭素原子、最も好ましくは約２〜約６
個の炭素原子を含有する。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル（
プロパルギル）、ブチニルなどが挙げられる。The term “alkynyl” means a straight or branched alkynyl group, which has one or more triple bonds and has about 2 to about 20 carbon atoms, preferably about 2 to about 10 carbon atoms. Carbon atoms, more preferably about 2 to about 8 carbon atoms, and most preferably about 2 to about 6 carbon atoms.
Contains 4 carbon atoms. Examples of alkynyl groups include ethynyl, propynyl (
Propargyl), butynyl and the like.

【００２１】 用語「アルコキシ」は、直鎖または分枝鎖のアルコキシ基を意味し、これは一
般式Ｏ−Ｒのエーテル基を１以上有し、そして約２〜約２０個の炭素原子、好ま
しくは約２〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭素原子、最
も好ましくは約２〜約６個の炭素原子を含有する。アルコキシ基の例としては、
メトキシ、エトキシなどが挙げられる。The term “alkoxy” means a straight or branched chain alkoxy group having one or more ether groups of the general formula OR and having from about 2 to about 20 carbon atoms, preferably Contains about 2 to about 10 carbon atoms, more preferably about 2 to about 8 carbon atoms, and most preferably about 2 to about 6 carbon atoms. Examples of alkoxy groups include:
Examples include methoxy and ethoxy.

【００２２】 用語「ハロアルコキシ」は、ここで定義されるアルコキシであって、水素原子
がハロゲン（例えば、塩素、フッ素、または臭素）で置換されているものを意味
する。The term “haloalkoxy” means an alkoxy, as defined herein, in which a hydrogen atom has been replaced with a halogen (eg chlorine, fluorine, or bromine).

【００２３】 用語「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」は、アルキルアミン基ま
たはジアルキルアミン基を意味する（ここで用語「アルキル」は上述のように定
義される）。アルキルアミノ基の例としては、メチルアミノ（ＮＨＣＨ₃）、エ
チルアミノ（ＮＨＣＨ₂ＣＨ₃）、プロピルアミノ（すなわち、ｎ−またはイソプ
ロピルアミノ）、ブチルアミノ（すなわち、ｎ−、イソ、ｓｅｃ−、またはｔｅ
ｒｔ−ブチルアミノ）、ｎ−ヘキシルアミノなどが挙げられる。ジアルキルアミ
ノ基の例としては、ジメチルアミノ（Ｎ（ＣＨ₃）₂）、ジエチルアミノ（Ｎ（Ｃ
Ｈ₂ＣＨ₃）₂）、ジプロピルアミノ（すなわち、ジ−ｎ−またはジ−イソプロピ
ルアミノ）、ジブチルアミノ（すなわち、ジ−ｎ−、ジ−イソ、ジ−ｓｅｃ−、
またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）、ジ−ｎ−ヘキシルアミノなどが挙げられ
る。The terms “alkylamino” and “dialkylamino” mean an alkylamine or dialkylamine group, where the term “alkyl” is defined as above. Examples of alkylamino groups include methylamino (NHCH ₃ ), ethylamino (NHCH ₂ CH ₃ ), propylamino (ie n- or isopropylamino), butylamino (ie n-, iso, sec-, or te
(rt-butylamino), n-hexylamino and the like. Examples of the dialkylamino group include dimethylamino (N (CH ₃ ) ₂ ) and diethylamino (N (C
H ₂ CH _{3) 2),} dipropylamino (i.e., di-n-or di - isopropylamino), dibutylamino (i.e., di-n-, di - iso, di-sec-,
Or di-tert-butylamino), di-n-hexylamino and the like.

【００２４】 用語「シクロアルキル」は、単環式アルキル基、または１以上のアルキル炭素
環式環を含有する多環式アルキル基（これは、多環式基が各環の炭素環式環骨格
において３〜約１０個の炭素原子を有する場合、同一または異なり得る）を意味
する。好ましくは、シクロアルキルは約４〜約７個の炭素原子、より好ましくは
約５〜約６個の炭素原子を有する。単環式シクロアルキル基の例としては、シク
ロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル
、シクロデシルなどが挙げられる。多環式シクロアルキル基の例としては、デカ
ヒドロナフチル、ビシクロ［５．４．０］ウンデシル、アダマンチルなどが挙げ
られる。The term “cycloalkyl” refers to a monocyclic alkyl group, or a polycyclic alkyl group containing one or more alkyl carbocyclic rings (wherein the polycyclic group is the carbocyclic ring skeleton of each ring). Have from 3 to about 10 carbon atoms, which may be the same or different). Preferably, the cycloalkyl has about 4 to about 7 carbon atoms, more preferably about 5 to about 6 carbon atoms. Examples of monocyclic cycloalkyl groups include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclodecyl and the like. Examples of polycyclic cycloalkyl groups include decahydronaphthyl, bicyclo [5.4.0] undecyl, adamantyl and the like.

【００２５】 用語「アリール」は、当該分野において一般的に理解されるような芳香族炭素
環式環基を指し、例えばフェニル基およびナフチル基などの単環式および多環式
の芳香族が挙げられ、この基は他に示さない限り、ハロゲン、アルキル、アルコ
キシ、アミノ、シアノ、ニトロなどからなる群から選ばれる１以上の置換基で置
換されていてもよい。好ましくは、アリールは、例えばフェニル、ナフチル、お
よびビフェニルを含む１以上の六員炭素環式環を有するものであり、ここで述べ
たように置換されていてもよい。The term “aryl” refers to aromatic carbocyclic ring groups as commonly understood in the art, including monocyclic and polycyclic aromatic groups such as phenyl and naphthyl groups. However, unless otherwise indicated, this group may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halogen, alkyl, alkoxy, amino, cyano, nitro and the like. Preferably aryl has one or more 6-membered carbocyclic rings including, for example, phenyl, naphthyl, and biphenyl, and may be substituted as described herein.

【００２６】 用語「アラルキル」は、ここで定義されるアルキルであって、アルキル水素原
子がここで定義されるアリールによって置換されているものを意味する。アラル
キル基の例としては、ベンジル、フェネチル、１−フェニルプロピル、２−フェ
ニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプ
ロピル、３−ナフチルプロピル、３−ナフチルブチルなどが挙げられる。The term “aralkyl” means alkyl as defined herein, wherein an alkyl hydrogen atom is replaced by an aryl as defined herein. Examples of the aralkyl group include benzyl, phenethyl, 1-phenylpropyl, 2-phenylpropyl, 3-phenylpropyl, 1-naphthylpropyl, 2-naphthylpropyl, 3-naphthylpropyl, 3-naphthylbutyl and the like.

【００２７】 用語ヘテロ環およびヘテロ環式は、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリー
ルの両方を指す。用語「ヘテロシクロアルキル」は、ここで定義したシクロアル
キル基（多環式を含む）であって、炭素環式環の少なくとも１つの炭素が、例え
ばＯ、Ｎ、またはＳなどのヘテロ原子で置換されているものを意味する。ヘテロ
シクロアルキルは、環内に１以上の二重結合を有していてもよいが、必ずしも芳
香族ではない。ヘテロシクロアルキルは、好ましくは各環の炭素環式骨格中に３
〜約１０個の原子（メンバー）、好ましくは約４〜約７個の原子、より好ましく
は約５〜約６個の原子を有する。ヘテロシクロアルキル基の例としては、エポキ
シ、アジリジル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、リボース、ジヒドロフ
ラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラニル、モルホリニルなどが挙げられ
る。The terms heterocycle and heterocyclic refer to both heterocycloalkyl and heteroaryl. The term “heterocycloalkyl” is a cycloalkyl group as defined herein, including polycyclic, in which at least one carbon of the carbocyclic ring is substituted with a heteroatom such as O, N, or S. Means what has been done. Heterocycloalkyl may have one or more double bonds in the ring but is not necessarily aromatic. Heterocycloalkyl is preferably 3 in the carbocyclic skeleton of each ring.
To about 10 atoms (members), preferably about 4 to about 7 atoms, more preferably about 5 to about 6 atoms. Examples of heterocycloalkyl groups include epoxy, aziridyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, ribose, dihydrofuranyl, piperidinyl, piperazinyl, pyranyl, morpholinyl and the like.

【００２８】 用語「ヘテロアリール」は、当該分野において一般的に理解されるような芳香
族ヘテロ環式環によって定義された基を意味し、例えばイミダゾール、チアゾー
ル、ピラゾール、ピロール、フラン、ピラゾリン、チオフェン、オキサゾール、
イソキサゾール、ピリジン、ピリドン、ピリミジン、シトシン、５−メチルシト
シン、チミン、ピラジン、およびトリアジン基などの単環式基、並びに例えばキ
ノリン、イソキノリン、インドール、プリン、アデニン、グアニン、Ｎ⁶−メチ
ルアデニン、およびベンゾチアゾール基などの多環式基が挙げられ、このヘテロ
アリール基は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、シアノ、ニトロなど
からなる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。ここで定義し
たヘテロアリールは、たとえヘテロアリールが芳香族性と関連した物理的および
化学的特性を示さないにしても、当該分野において理解される用語のように、フ
ェニルが芳香族であるのと同じ意味において必ずしも「芳香族」ではないことも
また理解されよう。The term “heteroaryl” means a group defined by an aromatic heterocyclic ring as commonly understood in the art, eg, imidazole, thiazole, pyrazole, pyrrole, furan, pyrazoline, thiophene. , Oxazole,
Monocyclic groups such as isoxazole, pyridine, pyridone, pyrimidine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, pyrazine, and triazine groups, and, for example, quinoline, isoquinoline, indole, purine, adenine, guanine, N ⁶ -methyladenine, and Examples thereof include a polycyclic group such as a benzothiazole group, and the heteroaryl group may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halogen, alkyl, alkoxy, amino, cyano, nitro and the like. Heteroaryl, as defined herein, refers to phenyl as aromatic, as is understood in the art, even though heteroaryl does not exhibit the physical and chemical properties associated with aromaticity. It will also be understood that it is not necessarily "aromatic" in the same sense.

【００２９】 上述したいずれのものも、任意の適当な置換基で置換されていても置換されて
いなくてもよい。適当な置換基の例としては、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素
、または臭素）、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキ
シ、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、チオ、アルキルチ
オ、またはアシルが挙げられる。これらの置換基は、それら自身、置換されてい
ても置換されていなくてもよい。Any of the above may or may not be substituted with any suitable substituents. Examples of suitable substituents include halogen (eg, fluorine, chlorine, or bromine), alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, haloalkoxy, nitro, cyano, hydroxy, amino, thio, alkylthio, or acyl. To be These substituents may themselves be substituted or unsubstituted.

【００３０】 より好ましくは、クマリン抗生物質は、ノボビオシン、クロロビオシンまたは
クメルマイシンＡ１であり、これらを以下に示す。More preferably, the coumarin antibiotic is novobiocin, chlorobiocin or coumermycin A1, which are shown below.

【００３１】[0031]

【化３】 [Chemical 3]

【００３２】[0032]

【化４】 [Chemical 4]

【００３３】 最も好ましくは、クマリン抗生物質は、ノボビオシンであり、その薬物動態(p
harmokinetics)および毒性プロフィールが明確に理解されている、よく研究され
た抗生物質である。４ｇ／日の用量（最大耐量よりもかなり下）は、投与後２時
間で２００〜３００μｇ／ｍｌ以上の血漿レベル（これは３００〜５００μＭの
薬物濃度に相当する）を生じる（Drusanoら、Antimicrob. Agents Chemother. 3
0:42-45 (1986)；Ederら、J. Clin. Invest. 79:1524-1528 (1987)参照）。Most preferably, the coumarin antibiotic is novobiocin and its pharmacokinetics (p
harmokinetics) and toxicity profiles are well-studied antibiotics. A dose of 4 g / day (well below the maximal tolerated dose) results in plasma levels of 200-300 μg / ml or higher 2 hours after administration, which corresponds to a drug concentration of 300-500 μM (Drusano et al., Antimicrob. Agents Chemother. 3
0: 42-45 (1986); Eder et al., J. Clin. Invest. 79: 1524-1528 (1987)).

【００３４】 クマリンまたはクマリン誘導体とシャペロン蛋白質との接触は、任意の適当な
手法で実施され得る。例えば、クマリンまたはクマリン誘導体は、インビボまた
はエクスビボの投与によってシャペロン蛋白質と接触され得る。好ましくは、ク
マリンまたはクマリン誘導体はインビボで哺乳動物に投与され、より好ましくは
、クマリンまたはクマリン誘導体はインビボでヒトに投与される。Contacting the coumarin or coumarin derivative with the chaperone protein can be carried out by any suitable technique. For example, the coumarin or coumarin derivative can be contacted with the chaperone protein by in vivo or ex vivo administration. Preferably, the coumarin or coumarin derivative is administered to a mammal in vivo, more preferably the coumarin or coumarin derivative is administered to a human in vivo.

【００３５】 インビボおよびエクスビボの両方において、クマリンまたはクマリン誘導体の
投与を容易にするため、それは適当な組成物に処方され得る。一般的に、このよ
うな組成物（例えば、医薬組成物）は、有効成分（すなわち、クマリンまたはク
マリン誘導体）および許容され得る担体（例えば、薬理学的に許容され得る担体
）を含有する。このような組成物は、医療を求める患者に有効成分を送達するの
に適当であり得、そして自体公知の手法で（例えば、従来の、混合、溶解、造粒
、糖衣作製、水ひ（levigating）、乳化、カプセル化、捕捉（entrapping）また
は凍結乾燥のプロセスによって）製造され得る。To facilitate administration of coumarin or a coumarin derivative, both in vivo and ex vivo, it may be formulated in suitable compositions. In general, such compositions (eg, pharmaceutical compositions) contain the active ingredient (ie, coumarin or coumarin derivatives) and an acceptable carrier (eg, pharmaceutically acceptable carrier). Such compositions may be suitable for delivering the active ingredient to a patient in need of medical care and are known in the art (eg, conventional, mixing, dissolving, granulating, dragee-making, levigating). ), Emulsification, encapsulation, entrapping or lyophilization processes).

【００３６】 本発明に従って使用するための医薬組成物は、賦形剤並びに医薬的に使用でき
る製剤内への有効化合物の加工処理を促進する任意の助剤を含む１以上の薬理学
的に（例えば、生理学的に）許容され得る担体を使用して、常法で処方され得る
。適切な処方物は、選ばれる投与経路に依存する。例えば、注射用には、有効成
分は水溶液中に、好ましくは生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。経粘
膜投与用には、浸透される障壁に適した浸透剤が処方物中に使用される。このよ
うな浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。経口投与用には、有効成分は、
錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸
濁剤などの中に含有させるために適した担体と組み合わせることができる。吸入
による投与用には、有効成分は、適当なプロペラントを使用するとともに、加圧
容器またはネブライザーから放出されるエアゾールスプレーの形態で簡便に送達
される。有効成分は、注射（例えば、ボーラス注射または連続注射）による非経
口投与用に処方することができる。このような組成物は、油性または水性ビヒク
ル中の懸濁液、溶液、または乳液のような形態をとることができ、そして処方用
薬剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤）を含むことができ
る。他の薬理学的賦形剤は当該分野で公知である。A pharmaceutical composition for use according to the invention comprises one or more pharmacologically (excipients) which comprises one or more auxiliaries which facilitate the processing of the active compounds into pharmaceutically usable formulations. For example, it can be formulated in a conventional manner using a (physiologically) acceptable carrier. Proper formulation is dependent upon the route of administration chosen. For example, for injection, the active ingredient may be formulated in an aqueous solution, preferably in a physiologically compatible buffer. For transmucosal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art. For oral administration, the active ingredient is
It can be combined with a carrier suitable for inclusion in tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions and the like. For administration by inhalation, the active ingredient is conveniently delivered in the form of an aerosol spray which is expelled from a pressurized container or nebulizer with the use of a suitable propellant. The active ingredient can be formulated for parenteral administration by injection (eg, bolus injection or continuous injection). Such compositions can take such forms as suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous vehicles, and with the prescription agents (eg, suspending agents, stabilizing agents and / or dispersions). Agent). Other pharmacological excipients are known in the art.

【００３７】 クマリンまたはクマリン誘導体は、単位投与形態（例えば、錠剤またはカプセ
ル剤）で投与することができる。ここで使用される用語「単位投与形態」は、ヒ
トおよび動物被検体にとって単位投薬量として適当な物理的に分離した単位であ
って、各単位は、単独または他の活性薬剤と組み合わせて、医薬的に許容され得
る希釈剤、担体、またはビヒクルと共同して所望の効果を生じさせるのに十分な
量に見積もられた所定量を含有する。本発明の単位投与形態についての詳細は、
用いられる特定のクマリンまたはクマリン誘導体および達成される効果、並びに
ホスト中での各々に関連する薬力学に依存する。投与される用量は、個々の患者
における「有効量」または「有効レベル」を達成するために必要な量とすべきで
ある。有効レベルは服用の好ましい終点として使用されるので、実際の用量およ
びスケジュールは、薬物動態、薬物分布および代謝における個体間の差によって
変えることができる。The coumarin or coumarin derivative can be administered in a unit dosage form such as a tablet or capsule. The term "unit dosage form" as used herein is a physically discrete unit suitable as a unit dosage for human and animal subjects, each unit being taken alone or in combination with other active agents to produce a pharmaceutical drug. Contains a predetermined amount, which is estimated to be sufficient to produce the desired effect in association with a physiologically acceptable diluent, carrier, or vehicle. For more information on the unit dosage forms of the present invention,
It depends on the particular coumarin or coumarin derivative used and the effect to be achieved, and the pharmacodynamics associated with each in the host. The dose administered should be that amount necessary to achieve an "effective amount" or "effective level" in the individual patient. Since the effective level is used as the preferred endpoint for dosing, the actual dose and schedule can be varied due to individual differences in pharmacokinetics, drug distribution and metabolism.

【００３８】 当業者は、個々の患者における所望の有効レベルを達成するために、使用され
る組成物の正確な処方のための適切な用量、スケジュール、および投与方法を容
易に決定することができる。クマリンまたはクマリン誘導体の多くは有効レベル
を達成するために必要とされる有効量が明確に確立された周知化合物である。し
かしながら、当業者は、投与される任意の所定のクマリンまたはクマリン誘導体
に要求される適切な用量を決定するために、適切な患者サンプル（例えば血液お
よび／または組織）の直接的（例えば、分析化学的分析）または間接的分析によ
って、本発明の化合物の有効レベルの適切な指標をたやすく決定し、使用するこ
ともできる。Those of ordinary skill in the art can easily determine the appropriate dosage, schedule and method of administration for the precise formulation of the composition used to achieve the desired effective level in the individual patient. . Many of the coumarins or coumarin derivatives are well-known compounds with well established effective amounts required to achieve effective levels. However, one of ordinary skill in the art will be able to determine the appropriate dose required for any given coumarin or coumarin derivative to be administered directly (eg, analytical chemistry) of an appropriate patient sample (eg, blood and / or tissue). Or indirect analysis, a suitable indicator of the effective level of the compound of the present invention can be readily determined and used.

【００３９】 シャペロン蛋白質とクマリンまたはクマリン誘導体の間の相互作用の結果、シ
ャペロン蛋白質はそのクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドに結
合しないかまたは低親和性で結合するようになる。このような結合の妨害は任意
の適当な方法によって成し遂げられ得る。例えば、シャペロン蛋白質とクマリン
またはクマリン誘導体は、共有または非共有的に結合することによって相互作用
し得る。非共有である場合、結合は水素結合、イオン結合、疎水性またはファン
デルワールス相互作用、または任意の他の適切な結合型を通じてなされ得る。好
ましくは、結合は非共有結合、より好ましくは水素または疎水性結合を通じてな
される。シャペロン蛋白質がＨｓｐ９０で、クマリンまたはクマリン誘導体がノ
ボビオシンである好ましい実施態様においては、相互作用の結果、ノボビオシン
がＨｓｐ９０のカルボキシル末端領域（これはアデノシントリホスフェート（Ａ
ＴＰ）結合ドメインを含有する）と結合するようになる。The interaction between the chaperone protein and the coumarin or coumarin derivative results in the chaperone protein not binding to its client protein or client polypeptide or binding with low affinity. Such disruption of binding can be accomplished by any suitable method. For example, chaperone proteins and coumarins or coumarin derivatives may interact by covalently or non-covalently binding. If non-covalent, the bond may be through hydrogen bonds, ionic bonds, hydrophobic or van der Waals interactions, or any other suitable type of bond. Preferably, the attachment is through a non-covalent bond, more preferably hydrogen or a hydrophobic bond. In a preferred embodiment in which the chaperone protein is Hsp90 and the coumarin or coumarin derivative is novobiocin, the interaction results in novobiocin having a carboxyl-terminal region of Hsp90 (which is adenosine triphosphate (A
TP) containing the binding domain).

【００４０】 本発明におけるクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドは、任意
の適当なクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドであり得る。クラ
イアント蛋白質またはクライアントポリペプチドとしては、限定されないが、種
々の転写因子（ステロイドホルモンレセプター、アリールハイドロカーボンレセ
プター、ｖ−ＥｒｂＡ、レチノイドレセプター、Ｓｉｍ、ＭｙｏＤ１、Ｈｓｆ−
１、突然変異ｐ５３を含む）、各種プロテインキナーゼおよび種々の他の蛋白質
（例えば、細胞骨格蛋白質、カルモジュリン、Ｇ蛋白質βγ−サブユニット、プ
ロテアソーム、Ｂ型肝炎ウィルス逆転写酵素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタ
ーおよび網膜芽種蛋白質）が挙げられる。Thormeyer & Baniahmad, Int. J. Mol
. Med. 4(4):351-58(1999)（ｖＥｒｂＡ）；Moffett & Pelletier, FEBS Lett.
466(1):80-6(2000)（Ｓｉｍ）；Jonesら、B. Biol. Sci. 326(1235):277-84(199
0)（ＭｙｏＤ１）；Greenら、Mol. Cell Biol. 15:3354-62(1995)（Ｈｓｆ−１
）が一般的に参照される。ステロイドホルモンレセプターの例としては、グルコ
コルチコイドレセプター、プロゲステロンレセプター、エストロゲンレセプター
、アンドロゲンレセプター、およびミネラルコルチコイドレセプターが挙げられ
る。細胞骨格蛋白質としてはアクチン、チューブリン、および中間フィラメント
が挙げられる。The client protein or client polypeptide in the present invention can be any suitable client protein or client polypeptide. Examples of the client protein or client polypeptide include, but are not limited to, various transcription factors (steroid hormone receptor, aryl hydrocarbon receptor, v-ErbA, retinoid receptor, Sim, MyoD1, Hsf-).
1, including mutant p53), various protein kinases and various other proteins (eg, cytoskeletal protein, calmodulin, G protein βγ-subunit, proteasome, hepatitis B virus reverse transcriptase, tumor necrosis factor (TNF)) Receptors and retinoblastoma proteins). Thormeyer & Baniahmad, Int. J. Mol
Med. 4 (4): 351-58 (1999) (vErbA); Moffett & Pelletier, FEBS Lett.
466 (1): 80-6 (2000) (Sim); Jones et al., B. Biol. Sci. 326 (1235): 277-84 (199).
0) (MyoD1); Green et al., Mol. Cell Biol. 15: 3354-62 (1995) (Hsf-1.
) Is commonly referred to. Examples of steroid hormone receptors include glucocorticoid receptor, progesterone receptor, estrogen receptor, androgen receptor, and mineralocorticoid receptor. Cytoskeletal proteins include actin, tubulin, and intermediate filaments.

【００４１】 好ましくは、クライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドはプロテイ
ンキナーゼである。より好ましくは、プロテインキナーゼはチロシンキナーゼま
たはセリン／スレオニンキナーゼである。セリン／スレオニンキナーゼとしては
、キナーゼのＲａｆファミリー、ＭＥＫ（ＭＡＰ／ＥＲＫ（細胞外シグナル調節
キナーゼ））、ヘム調節ＥｌＦ−２ａキナーゼ、カルモジュリン依存性真核生物
延長因子（ｅＥＦ）−２キナーゼ、およびカゼインキナーゼが挙げられる。Webe
rら、Oncogene 19(2):169-76(2000)（Ｒａｆファミリー）；Bommhardtら、J Imm
unol. 164(5):2326-37(2000)（ＭＥＫ）が一般的に参照される。チロシンキナー
ゼとしては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２としても知られている）にコ
ードされるｐ１８５（ｐ１８５^erbB2）、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ｐ６０^{v-s rc} またはｐ６０^c-src）、Ｗｅｅ１、セブンレスおよびＦｐｓ／Ｆｅｓが挙げら
れる。Hung & Lau, Semin. Oncol. 26(4 Suppl 12):51-9(1999)（ＨＥＲ−２／
ｎｅｕにコードされるｐ１８５）；Schwartzberg, Oncogene 17:1463-8(1998)（
Ｓｒｃファミリーキナーゼ）；Pendergast, Curr. Opn. Cell Biol. 8(2):174-8
1(1996)（Ｗｅｅ１）；Smithgallら、Crit. Rev. Oncogene 9(1):43-62(1998)（
Ｆｐｓ／Ｆｅｓ）が一般的に参照される。最も好ましくは、クライアント蛋白質
またはクライアントポリペプチドはｐ１８５^erbB2、ｐ６０^v-srcまたはＲａｆ−
１である。あるいは、クライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドは好
ましくは突然変異ｐ５３蛋白質である。Preferably the client protein or client polypeptide is a protein kinase. More preferably, the protein kinase is a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase. Serine / threonine kinases include the Raf family of kinases, MEK (MAP / ERK (extracellular signal-regulated kinase)), heme-regulated ElF-2a kinase, calmodulin-dependent eukaryotic elongation factor (eEF) -2 kinase, and casein. Examples include kinases. Webe
r et al., Oncogene 19 (2): 169-76 (2000) (Raf family); Bommhardt et al., J Imm.
General reference is made to unol. 164 (5): 2326-37 (2000) (MEK). Tyrosine kinases include p185 (p185 ^erbB2 ) encoded by HER-2 / neu (also known as c- ^erbB2 ), Src family kinases (p60 ^{vs rc} or p60 ^c-src ), Wee1, sevenless and Fps / Fes can be mentioned. Hung & Lau, Semin. Oncol. 26 (4 Suppl 12): 51-9 (1999) (HER-2 /
neu-encoded p185); Schwartzberg, Oncogene 17: 1463-8 (1998) (
Src family kinase); Pendergast, Curr. Opn. Cell Biol. 8 (2): 174-8
1 (1996) (Wee1); Smithgall et al., Crit. Rev. Oncogene 9 (1): 43-62 (1998) (
Fps / Fes) is commonly referred to. Most preferably, the client protein or client polypeptide is p185 ^erbB2 , p60 ^v-src or Raf-.
It is 1. Alternatively, the client protein or client polypeptide is preferably a mutant p53 protein.

【００４２】 シャペロン蛋白質がクマリンまたはクマリン誘導体に結合した後、クライアン
ト蛋白質またはクライアントポリペプチドは一般的に不活性または低活性である
。クライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドは任意の適当な方法によ
って不活性または低活性になり得る。例えば、クライアント蛋白質またはクライ
アントポリペプチドは、そのシャペロン蛋白質に結合していないので細胞機構に
よって分解され得るか、またはその活性または認識部位をゆがめ、該ポリペプチ
ドがその指定された機能を行うことを妨げる不適切なコンフォメーションをとり
得る。また、クライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドは、例えば、
その指定された機能を行うことを妨げる不適当な細胞領域に局在し得る。好まし
くは、クライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドは分解される。After the chaperone protein has bound to the coumarin or coumarin derivative, the client protein or client polypeptide is generally inactive or less active. The client protein or client polypeptide can be rendered inactive or underactive by any suitable method. For example, a client protein or client polypeptide may be degraded by cellular machinery because it is not bound to its chaperone protein, or distorts its activity or recognition site, preventing the polypeptide from performing its designated function. It can have an inappropriate conformation. In addition, the client protein or client polypeptide is, for example,
It may be localized to inappropriate cellular regions that prevent it from performing its designated function. Preferably, the client protein or client polypeptide is degraded.

【００４３】 本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は本発明の例
示のためにのみ供され、いかようにも本発明の範囲を限定することを意図するも
のではない。The invention is further described in the following examples. These examples are provided only for illustrating the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

【００４４】[0044]

【実施例】【Example】

実施例１ 本実施例は、シャペロン蛋白質がクマリンまたはクマリン誘導体に結合するこ
とを示す。さらに、本実施例は、シャペロン蛋白質と種々のクマリン誘導体との
インキュベーションが、続いてのシャペロン蛋白質のそのクライアント蛋白質ま
たはクライアントポリペプチドへの結合を阻害することを示す。Example 1 This example demonstrates that chaperone proteins bind to coumarin or coumarin derivatives. Furthermore, this example demonstrates that incubation of chaperone proteins with various coumarin derivatives inhibits subsequent binding of chaperone proteins to their client proteins or polypeptides.

【００４５】 シャペロン蛋白質がノボビオシン（クマリン抗生物質）に結合することを示す
ため、まずノボビオシンをセファロースに固定化した（Staudenbauer & Orr, Nu
cleic Acids Res. 9:3589-3603(1981)参照）。続いて、シャペロン蛋白質（純粋
なＨｓｐ９０か、細胞溶菌液中にＨｓｐ９０を含む溶液のいずれか）を、固定化
ノボビオシンとインキュベートした。該細胞溶菌液を、クマリン抗生物質ファミ
リーの種々のメンバー（すなわちノボビオシン、クロロビオシン、またはクメル
マイシンＡ１）と、さらにＡＴＰと共にプレインキュベートし、Ｈｓｐ９０の結
合を阻害するそれらの能力を確認した。固定化ノボビオシンに結合したＨｓｐ９
０の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、例えばBioRad社の市販のキットを使用し
た銀染色、または適当な抗体、例えばＳＰＡ８３０（StressGen Biotechnology,
Vancouver, Canada）を用いるウェスタンブロッティングを行うことにより分析
した。In order to show that the chaperone protein binds to novobiocin (coumarin antibiotics), novobiocin was first immobilized on Sepharose (Staudenbauer & Orr, Nu.
cleic Acids Res. 9: 3589-3603 (1981)). The chaperone protein (either pure Hsp90 or a solution containing Hsp90 in the cell lysate) was then incubated with immobilized novobiocin. The cell lysates were pre-incubated with various members of the coumarin antibiotic family (ie novobiocin, chlorobiocin, or coumermycin A1) and further with ATP to confirm their ability to inhibit Hsp90 binding. Hsp9 bound to immobilized novobiocin
An amount of 0 is followed by SDS-PAGE followed by silver staining, eg using a commercially available kit from BioRad, or an appropriate antibody, eg SPA830 (StressGen Biotechnology,
Analysis was performed by performing Western blotting using Vancouver, Canada).

【００４６】 固定化ノボビオシンは、疎水的な様式で純粋なＨｓｐ９０および細胞溶菌液中
に存在するＨｓｐ９０の両方に結合した。細胞溶菌液と過剰の可溶性ノボビオシ
ン、クロロビオシン、クメルマイシンＡ１またはＡＴＰとのプレインキュベーシ
ョンは、用量に依存する様式で、続いてのＨｓｐ９０の固定化ノボビオシンへの
結合を阻害した（これはウェスタンブロッティングにより決定された）。可溶性
ノボビオシンはＨｓｐ９０の固定化ノボビオシンへの結合を約８ｍＭで阻害した
。クロロビオシンおよびクメルマイシンＡ１は、Ｈｓｐ９０の固定化ノボビオシ
ンへの結合を０．５ｍＭで阻害し、その一方、ＡＴＰは約１０ｍＭと１５ｍＭと
の間でＨｓｐ９０の結合を阻害した（このことは銀染色により示された）。Immobilized novobiocin bound in a hydrophobic manner to both pure Hsp90 and Hsp90 present in cell lysates. Preincubation of cell lysates with excess soluble novobiocin, chlorobiocin, coumermycin A1 or ATP inhibited subsequent binding of Hsp90 to immobilized novobiocin in a dose-dependent manner (as determined by Western blotting). ). Soluble novobiocin inhibited the binding of Hsp90 to immobilized novobiocin at about 8 mM. Chlorobiocin and coumermycin A1 inhibited the binding of Hsp90 to immobilized novobiocin at 0.5 mM, while ATP inhibited Hsp90 binding between about 10 mM and 15 mM (this was shown by silver staining). ).

【００４７】 これらのデータは、ノボビオシン、クマリン誘導体がＨｓｐ９０のようなシャ
ペロン蛋白質に結合すること、および続いてのＨｓｐ９０結合が、クマリン誘導
体（ノボビオシン、クロロビオシン、またはクメルマイシンＡ１）およびＡＴＰ
との接触によって阻害され得ることを示す。These data show that novobiocin, a coumarin derivative, binds to chaperone proteins such as Hsp90, and that subsequent Hsp90 binding results in coumarin derivatives (novobiocin, chlorobiocin, or coumermycin A1) and ATP.
It shows that it can be inhibited by contact with.

【００４８】 実施例２ 本実施例は、クマリンまたはクマリン誘導体のシャペロン蛋白質との接触によ
るクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドのインビボでの枯渇（de
pletion）を示す。Example 2 This example demonstrates the in vivo depletion of a client protein or client polypeptide by contacting a coumarin or coumarin derivative with a chaperone protein.
pletion).

【００４９】 Ｈｓｐ９０のクライアント蛋白質の枯渇を確認するため、市販のＳＫＢＲ３細
胞（American Type Culture Collection, Rockville, MD）とｖ−ｓｒｃ−３Ｔ
３繊維芽細胞（National Cancer Institute, Rockville, MD）を、ノボビオシン
（クマリン抗生物質）の濃度を増加させて処理した。種々のＨｓｐ９０のクライ
アントポリペプチドのレベルはウェスタンブロッティングによりアッセイした：
まずメンブレンを適当な一次抗体〔すなわち、ｐ１８５^erbB2、ｐｐ６０^v-src、
およびｐ５３抗体（Oncogene Research Products/Calbiochem, Cambridge, MA）
；ゲルソリン抗体（Sigma）；Ｇｒｐ７８およびＲａｆ−１抗体（Santa Cruz Bi
otechnology, Santa Cruz, CA）；およびシンデリン（scinderin）抗体（Dr. J.
M. Trifaro, University of Ottawa, Canadaから寄贈）〕でプローブし、続いて
西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体で処理し、そして化学発光試薬
によりそのシグナルを検出した。To confirm the depletion of Hsp90 client protein, commercially available SKBR3 cells (American Type Culture Collection, Rockville, MD) and v-src-3T were used.
3 fibroblasts (National Cancer Institute, Rockville, MD) were treated with increasing concentrations of novobiocin (coumarin antibiotic). Levels of various Hsp90 client polypeptides were assayed by Western blotting:
First, the membrane is treated with an appropriate primary antibody [ie p185 ^erbB2 , pp60 ^v-src
And p53 antibody (Oncogene Research Products / Calbiochem, Cambridge, MA)
Gelsolin antibody (Sigma); Grp78 and Raf-1 antibody (Santa Cruz Bi
otechnology, Santa Cruz, CA); and the scinderin antibody (Dr. J.
M. Trifaro, University of Ottawa, Canada)], followed by treatment with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and detection of the signal by chemiluminescent reagents.

【００５０】 コントロールとして、定常状態レベルのシンデリン〔アクチン会合蛋白質（ac
tin-associated protein）〕およびＢｉＰ（Ｇｒｐ７８：小胞体に局在するＨｓ
ｐ７０ファミリーシャペロン蛋白質）を、上述と同様の方法を使用してアッセイ
した。また、蛋白質合成への全般的な妨害を終夜のＳＫＢＲ３細胞のシクロヘキ
サミド処理後に決定した。As a control, steady-state levels of cinderin [actin-associated protein (ac
tin-associated protein)] and BiP (Grp78: Hs localized in the endoplasmic reticulum)
The p70 family chaperone protein) was assayed using a method similar to that described above. Also, general interference with protein synthesis was determined after overnight cyclohexamide treatment of SKBR3 cells.

【００５１】 ｐ１８５^erbB2蛋白質（Ｈｓｐ９０のクライアントポリペプチド）のレベルは
、８００μＭのノボビオシンで終夜処理した後では未処理のコントロールに比較
して８０％減少し、３００μＭのノボビオシンで終夜処理した後ではコントロー
ルと比較して４０％減少した。また、Ｈｓｐ９０のクライアントポリペプチドＲ
ａｆ−１、ｐ６０^v-src、および突然変異ｐ５３蛋白質のレベルもノボビオチン
で終夜処理した後では著しく減少した。ｖ−ｓｒｃ−形質転換３Ｔ３繊維芽細胞
において、ｐ６０^v-src蛋白質のレベルは５００μＭのノボビオシンに曝した後
では５０％減少した。また、ノボビオシンは、ＳＫＢＲ３細胞中で突然変異ｐ５
３蛋白質を顕著に枯渇させ、その一方、同細胞中でＲａｆ−１蛋白質を検知でき
ないレベルまで枯渇させた。コントロールとして、定常状態レベルのシンデリン
（アクチン会合蛋白質）およびＢｉＰ（Ｇｒｐ７８：小胞体に局在するＨｓｐ７
０ファミリーシャペロン蛋白質）は、使用したノボビオシンの用量および接触時
間によって変化しなかった。また、蛋白質合成への全般的な妨害は、終夜のＳＫ
ＢＲ３細胞のシクロヘキサミド処理が定常状態レベルの該蛋白質に顕著に影響を
及ぼさなかったことから、ノボビオチンにより影響が及ぼされることはありそう
にない。Levels of the p185 ^erbB2 protein (a client polypeptide of Hsp90) were reduced by 80% after overnight treatment with 800 μM novobiocin compared to untreated controls and after overnight treatment with 300 μM novobiocin. A 40% decrease in comparison. Also, the Hsp90 client polypeptide R
The levels of af-1, p60 ^v-src , and mutant p53 protein were also significantly reduced after overnight treatment with novobiotin. In v-src-transformed 3T3 fibroblasts the level of p60 ^v-src protein was reduced by 50% after exposure to 500 μM novobiocin. In addition, novobiocin has a mutated p5 in SKBR3 cells.
The 3 proteins were significantly depleted, while Raf-1 protein was depleted to undetectable levels in the same cells. As controls, steady-state levels of Cinderin (actin associated protein) and BiP (Grp78: Hsp7 localized in the endoplasmic reticulum)
0 family chaperone protein) was unchanged by the dose of novobiocin used and the contact time. Also, the general impediment to protein synthesis is the overnight SK
Cyclohexamide treatment of BR3 cells did not significantly affect steady-state levels of the protein, and is unlikely to be affected by novobiotin.

【００５２】 従って、これらのデータは、ノボビオシン（クマリン誘導体）のシャペロン蛋
白質Ｈｓｐ９０との接触がＨｓｐ９０のｐ１８５^erbB2（Ｈｓｐ９０のクライア
ント蛋白質）への結合を妨害し、これにより続いてのクライアント蛋白質ｐ１８
５^erbB2の不活性化、特に枯渇がもたらされることを示す。Thus, these data show that contact of the novobiocin (coumarin derivative) with the chaperone protein Hsp90 interferes with the binding of Hsp90 to p185 ^erbB2 (the client protein of Hsp90), which results in the subsequent client protein p18.
5 shows that inactivation of ^erbB2 , especially depletion, results.

【００５３】 実施例３ 本実施例は、クマリンまたはクマリン誘導体とシャペロン蛋白質との接触が、
正常ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）中のクライアント蛋白質またはクライア
ントポリペプチドレベルを減少させることを示す。Example 3 In this example, contact between coumarin or a coumarin derivative and a chaperone protein was
It is shown to reduce client protein or client polypeptide levels in normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

【００５４】 ノボビオシン（クマリン誘導体）で処理した後のＲａｆ−１(Ｈｓｐ９０のク
ライアント蛋白質)の減少を確認するため、標準的なプロトコールに従って、Ｐ
ＢＭＣをヒト血液から単離し、１４時間ノボビオシンの濃度を変化させて培養し
た。Ｒａｆ−１蛋白質のレベルは、実施例２で述べたように、ウェスタンブロッ
ティングを使用して決定した。また、コントロール蛋白質（ゲルソリン）を同様
の方法を使用してアッセイした。細胞生存度は、生育細胞によって通常排除され
る生体染色剤（例えば、トリパンブルー）を取り込む細胞の能力によって評価し
た。To confirm the reduction of Raf-1 (the client protein of Hsp90) after treatment with novobiocin (coumarin derivative), Pf was assayed according to standard protocols.
BMCs were isolated from human blood and cultured for 14 hours with varying concentrations of novobiocin. Raf-1 protein levels were determined using Western blotting as described in Example 2. A control protein (gelsolin) was also assayed using a similar method. Cell viability was assessed by the ability of cells to take up a vital stain (eg trypan blue) that is normally eliminated by viable cells.

【００５５】 Ｈｓｐ９０のクライアントＲａｆ−１蛋白質は、ノボビオシン（クマリン誘導
体）とのインキュベーションによって、例えば約０.８ｍＭノボビオシンの濃度
でほとんど完全に枯渇されたように、用量に依存する態様で枯渇されることがわ
かった。他の蛋白質レベルは、試験された最も高い薬物濃度においてさえ、変化
せずにそのままだった。ＰＢＭＣは生きたままであった（トリパンブルーにより
調べた）。The client Raf-1 protein of Hsp90 is depleted in a dose-dependent manner by incubation with novobiocin (a coumarin derivative), for example almost completely depleted at a concentration of about 0.8 mM novobiocin. I understood. Other protein levels remained unchanged, even at the highest drug concentrations tested. PBMC remained alive (checked with trypan blue).

【００５６】 実施例４ 本実施例は、クマリンまたはクマリン誘導体のインビボでの投与が、ネズミ脾
細胞中のクライアント蛋白質またはクライアントポリペプチドレベルに影響を及
ぼすことを示す。Example 4 This example demonstrates that in vivo administration of coumarin or a coumarin derivative affects client protein or client polypeptide levels in murine splenocytes.

【００５７】 Ｒａｆ−１蛋白質（Ｈｓｐ−９０のクライアントポリペプチド）のレベルを決
定するため、正常Ｃ５７Ｂ１６マウスに５日間１２時間間隔でノボビオシン（ク
マリン誘導体）の腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）をした。動物を最終注射後３
時間で屠殺した。脾臓を取り出し、細胞を溶解し、全蛋白質を例えばBioRad社の
市販のキットを使用してBradford法によってアッセイした。この用量では、マウ
スにおいて、ノボビオシンの血清レベルは最初の１時間の間１００μg／ｍｌと
４５０μg／ｍｌとの間で変化し、該薬物の血漿クリアランスの半減期は約８０
分であることが報告されている（Ederら、Cancer Res. 51:510-513(1991)参照）
。Ｒａｆ−１レベルは、実施例２で述べたように、ウェスタンブロッティングに
よって決定した。また、コントロール蛋白質（ゲルソリン）も同じ方法を使用し
てアッセイした。Ｒａｆ−１特異的バンドの光学密度をＮＩＨイメージソフトウ
ェアを使用して決定した。To determine the level of Raf-1 protein (a client polypeptide of Hsp-90), normal C57B16 mice were given an intraperitoneal injection (100 mg / kg) of novobiocin (coumarin derivative) at 12 hour intervals for 5 days. 3 after the final injection of the animal
Slaughtered in time. The spleen was removed, the cells were lysed and total protein was assayed by the Bradford method, eg using a commercially available kit from BioRad. At this dose, in mice, serum levels of novobiocin varied between 100 and 450 μg / ml during the first hour, and the plasma clearance half-life of the drug was approximately 80.
Minutes (see Eder et al., Cancer Res. 51: 510-513 (1991)).
. Raf-1 levels were determined by Western blotting as described in Example 2. A control protein (gelsolin) was also assayed using the same method. The optical density of Raf-1 specific bands was determined using NIH image software.

【００５８】 この投薬計画の５日後、ノボビオシンを与えたマウスは、コントロール比べて
脾細胞Ｒａｆ−１蛋白質のレベルが顕著に低くなった。平均で、ノボビオシンで
処理したグループのＲａｆ−１蛋白質は、コントロールに対して４４％減少した
。１０匹の処理マウスのうち７匹では、平均脾細胞Ｒａｆ−１蛋白質レベルはそ
れ以上でさえあった（コントロールの２９％まで減少した）。脾細胞ゲルソリン
は、全ての処理マウスで変化しないままであった。Five days after this dosing regimen, mice receiving novobiocin had significantly lower levels of splenocyte Raf-1 protein compared to controls. On average, Raf-1 protein in the novobiocin-treated group was reduced by 44% relative to control. In 7 out of 10 treated mice, mean splenocyte Raf-1 protein levels were even higher (decreased to 29% of control). Splenocyte gelsolin remained unchanged in all treated mice.

【００５９】 これらのデータは、ノボビオシンを用いるインビボでの処理がターゲットとす
る組織中のクライアント蛋白質Ｒａｆ−１のレベルを顕著に減少させることを示
す。おそらく、レベルの減少は、ノボビオシン（クマリン誘導体）とシャペロン
蛋白質Ｈｓｐ９０との間の接触に起因するものであった。These data show that in vivo treatment with novobiocin significantly reduces the level of the client protein Raf-1 in targeted tissues. Presumably, the reduced levels were due to contact between the novobiocin (coumarin derivative) and the chaperone protein Hsp90.

【００６０】 ここに挙げた全ての参考文献（特許、特許出願および刊行物を含む）は、言及
することでその全体がここに組み込まれるものである。All references cited herein, including patents, patent applications and publications, are hereby incorporated by reference in their entireties.

【００６１】 好適な実施態様を強調して本発明を説明してきたが、当業者には、好ましい実
施態様のバリエーションが使用される可能性があること、ならびに本発明はここ
で特に説明した以外の方法でも実施できることを意図していることが自明であろ
う。従って、上記の請求の範囲で定義される発明の精神および範囲内に包含され
る全ての変形を本発明は含む。
Although the present invention has been described with emphasis on the preferred embodiments, those skilled in the art will appreciate that variations of the preferred embodiments may be used, and that the invention is not specifically described herein. It will be obvious that the intention is that it can also be carried out in a method. Accordingly, this invention includes all modifications that come within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedure for Amendment] Submission for translation of Article 34 Amendment of Patent Cooperation Treaty

【提出日】平成１３年５月７日（２００１．５．７）[Submission date] May 7, 2001 (2001.5.7)

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】特許請求の範囲[Name of item to be amended] Claims

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【特許請求の範囲】[Claims]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 311/10 Ｃ０７Ｄ 311/10 311/46 311/46 311/56 311/56 Ｃ０７Ｈ 17/075 Ｃ０７Ｈ 17/075 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ネッカーズ、レオナルド エム． アメリカ合衆国、メリーランド州 20850、 ベセスダ、ウィシオミング ロード 5121 (72)発明者 シュルト、テオドール ダヴリュ． アメリカ合衆国、メリーランド州 20814、 ベセスダ、アパートメント 21、バッテリ ー レーン 4867 Ｆターム(参考） 4C057 BB02 DD01 KK09 4C062 EE74 EE85 4C086 AA01 AA02 BA08 EA11 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZB33 ZC02─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61P 43/00 111 A61P 43/00 111 C07D 311/10 C07D 311/10 311/46 311/46 311/56 311/56 C07H 17/075 C07H 17/075 C12N 9/99 C12N 9/99 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH , GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, A L, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD , GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US , UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Neckers, Leonard M. 5121 (72) Inventor Schilt, Theodore Dwry. Bethesda, MD 20850, Maryland, United States. Battery Lane 4867 F-Term, Apartment 21, Bethesda, 20814, Maryland, USA (Reference) 4C057 BB02 DD01 KK09 4C062 EE74 EE85 4C086 AA01 AA02 BA08 EA11 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZB33 ZC02

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 シャペロン蛋白質と、そのクライアント蛋白質またはクライ
アントポリペプチドとの結合を阻害する方法であって、 シャペロン蛋白質をクマリンまたはクマリン誘導体と接触させることを含み、
これによって該クマリンまたは該クマリン誘導体が該シャペロン蛋白質に結合し
、この結合が該シャペロン蛋白質がそのクライアント蛋白質またはクライアント
ポリペプチドと結合することを阻害する、方法。1. A method of inhibiting the binding between a chaperone protein and its client protein or client polypeptide, which method comprises contacting the chaperone protein with coumarin or a coumarin derivative,
A method whereby the coumarin or the coumarin derivative binds to the chaperone protein and this binding inhibits the chaperone protein from binding to its client protein or client polypeptide. 【請求項２】 上記シャペロン蛋白質が熱ショック蛋白質（Ｈｓｐ）９０で
ある、請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the chaperone protein is heat shock protein (Hsp) 90. 【請求項３】 上記クマリンまたはクマリン誘導体がクマリン抗生物質であ
る、請求項１に記載の方法。3. The method of claim 1, wherein the coumarin or coumarin derivative is a coumarin antibiotic. 【請求項４】 上記クマリン抗生物質がクロロビオシンまたはクメルマイシ
ンＡ１である、請求項３に記載の方法。4. The method of claim 3, wherein the coumarin antibiotic is chlorobiocin or coumermycin A1. 【請求項５】 上記クマリン抗生物質がノボビオシンである、請求項３に記
載の方法。5. The method of claim 3, wherein the coumarin antibiotic is novobiocin. 【請求項６】 上記クマリンまたはクマリン誘導体がノボビオシンである、
請求項２に記載の方法。6. The coumarin or coumarin derivative is novobiocin.
The method of claim 2. 【請求項７】 ノボビオシンがＨｓｐ９０のカルボキシル末端領域に結合す
る、請求項６に記載の方法。7. The method of claim 6, wherein novobiocin binds to the carboxyl-terminal region of Hsp90. 【請求項８】 上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプチ
ドがチロシンまたはセリン／スレオニンキナーゼである、請求項１に記載の方法
。8. The method of claim 1, wherein the client protein or client polypeptide is tyrosine or serine / threonine kinase. 【請求項９】 上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプチ
ドがチロシンキナーゼｐ１８５^erbB2またはｐ６０^v-srcである、請求項８に記載
の方法。9. The method of claim 8, wherein the client protein or the client polypeptide is the tyrosine kinase p185 ^erbB2 or p60 ^v-src . 【請求項１０】 上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプ
チドがセリン／スレオニンキナーゼＲａｆ−１である、請求項８に記載の方法。10. The method of claim 8, wherein the client protein or client polypeptide is serine / threonine kinase Raf-1. 【請求項１１】 上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプ
チドが突然変異ｐ５３蛋白質である、請求項１に記載の方法。11. The method of claim 1, wherein the client protein or client polypeptide is a mutant p53 protein. 【請求項１２】 上記シャペロン蛋白質が上記クマリンまたは上記クマリン
誘導体に結合した後に上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプ
チドが不活性となる、請求項１に記載の方法。12. The method according to claim 1, wherein the client protein or the client polypeptide becomes inactive after the chaperone protein binds to the coumarin or the coumarin derivative. 【請求項１３】 上記クライアント蛋白質または上記クライアントポリペプ
チドが分解される、請求項１２に記載の方法。13. The method of claim 12, wherein the client protein or client polypeptide is degraded.