JP2003521227A - Membrane transport protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、膜輸送タンパク質（MTRP）と、MTRPを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、MTRPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。 (57) Abstract The present invention provides membrane transport proteins (MTRPs) and polynucleotides that identify and encode MTRPs. The invention also provides expression vectors and host cells, antibodies, agonists, antagonists. Furthermore, the present invention provides a method for diagnosing or treating or preventing a disease associated with the expression of MTRP.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （技術分野） 本発明は、膜輸送タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列、並びにこれらの
配列を用いた膜輸送障害、免疫異常症／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常
症の診断、治療並びに予防に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to nucleic acid sequences and amino acid sequences of membrane transport proteins, and diagnosis of cell proliferation disorders including membrane transport disorders, immunological disorders / inflammatory diseases, and cancers using these sequences. , Treatment and prevention.

【０００２】 （発明の背景） 真核細胞は、脂質二重層膜に包まれ、機能的に明確な膜結合区画に細区分され
る。膜は、細胞外環境であるサイトゾルと、ゴルジや小胞体のような細胞内オル
ガネラとを隔てている。脂質膜は殆どの極性分子に対して高い不浸透性を有する
ので、必須栄養素、K⁺、NH₄ ⁺、P₁、SO₄ ^2- 等の金属イオン、糖、ビタミン、代謝
性廃棄物、細胞シグナル分子、薬剤、ペプチド、タンパク質及び他の高分子を、
脂質膜内外またはオルガネラ間で輸送する際には、様々な輸送分子を媒介としな
ければならない。多数の輸送媒体は基質に固有のものであり、各輸送体タンパク
質は、分子クラスの特定のメンバー、例えばイオン、糖、アミノ酸等を膜通過輸
送する。例えばアミノ酸は、特定のアミノ酸透過酸素を介して細胞内に輸送され
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Eukaryotic cells are enveloped by lipid bilayer membranes and subdivided into functionally defined membrane-bound compartments. The membrane separates the cytosol, which is the extracellular environment, from intracellular organelles such as the Golgi and the endoplasmic reticulum. Since lipid membranes have high impermeability to most polar molecules, essential nutrients, metal ions such as K ⁺ , NH ₄ ⁺ , P ₁ and SO ₄ ^2- , sugars, vitamins, metabolic wastes, cells Signal molecules, drugs, peptides, proteins and other macromolecules,
Various transport molecules must be mediated during transport across lipid membranes or between organelles. Many transport media are substrate specific, and each transporter protein transports specific members of a molecular class, such as ions, sugars, amino acids, etc., across a membrane. For example, amino acids are transported intracellularly via specific amino acid permeation oxygen.

【０００３】 輸送体タンパク質はマルチパスの膜貫通タンパク質であり、能動的に膜を通過
させて分子を輸送するか、受動的に分子が通過するのを許容するかのいずれかで
ある。能動輸送には、通常電気化学勾配に逆らうような方向性を持たせたような
、溶質の膜通過ポンプ輸送を必要とする。能動輸送は、ATPの加水分解や電気化
学的に有利なイオン勾配等の代謝性エネルギー源に緊密に結びついている。受動
輸送には、電気化学勾配を下げるような溶質の運動に関与している。輸送体タン
パク質は、担体タンパク質またはチャネルタンパク質のいずれかに更に区分され
る。能動輸送または受動輸送において機能するような担体タンパク質は、輸送さ
れる特定の溶質に結合し、結合した溶質を膜通過輸送するような構造変化を受け
る。受動輸送においてのみ機能するようなチャネルタンパク質は、膜に親水性の
孔を開ける。孔が開くと、無機イオン等の特定の溶質は膜を通過し、溶質の電気
化学勾配を下げる。Transporter proteins are multi-pass transmembrane proteins that either actively cross the membrane to transport the molecule or passively allow the molecule to pass through. Active transport requires transmembrane pumping of solutes, usually oriented to counter the electrochemical gradient. Active transport is tightly coupled to metabolic energy sources such as ATP hydrolysis and electrochemically favorable ionic gradients. Passive transport involves the movement of solutes that lower the electrochemical gradient. Transporter proteins are subdivided into either carrier proteins or channel proteins. Carrier proteins that function in active or passive transport undergo structural changes that bind to the particular solute being transported and transport the bound solute across the membrane. Channel proteins that function only in passive transport will perforate the membrane with hydrophilic pores. When the pores open, certain solutes, such as inorganic ions, pass through the membrane, lowering the solute's electrochemical gradient.

【０００４】 輸送体タンパク質は、抗生物質抵抗性、毒素分泌、イオンバランス、シナプス
神経伝達、腎機能、腸吸収、腫瘍成長、及びその他の種々の細胞機能において役
割を演じる（Griffith, J. 及び C. Sansom (1998) The Transporter Facts Boo k , Academic Press. San Diego CA, pp. 3-29）。ヒトの種々の先天性疾患は、
輸送体タンパク質の突然変異によって引き起こされる。例えばシスチン尿症は、
シスチンのジスルフィド結合二量体であるようなシスチンを尿から血液へ輸送で
きないことに起因する先天性疾患である。シスチンが尿に蓄積することが原因と
なって腎臓にシスチン石が形成される。また、多数の輸送体タンパク質は、輸送
メカニズムが機能するような組織に特異性を与えるようなサブユニットから構成
され、従って、組織に特異的な障害に関連する。輸送体タンパク質の例として、
促進輸送体、２次活性共搬（secondary active symporter）、イオン勾配により
駆動される交互輸送機構が含まれ、また、多数の薬物抵抗に関与し、抗原ペプチ
ドを主要組織抗原複合体クラスＩ分子へ標的にすることに関与しているような活
性ATP結合カセット輸送体、E1-E2カチオン輸送ATPアーゼが含まれる。Transporter proteins play a role in antibiotic resistance, toxin secretion, ion balance, synaptic neurotransmission, renal function, intestinal absorption, tumor growth, and various other cellular functions (Griffith, J. and C. Sansom (1998) The Transporter Facts Boo k , Academic Press. San Diego CA, pp. 3-29). Various congenital diseases in humans
Caused by mutations in transporter proteins. For example, cystinuria is
It is a congenital disease caused by the inability to transport cystine, which is a disulfide-bonded dimer of cystine, from urine to blood. Cystine stones are formed in the kidney due to the accumulation of cystine in the urine. Also, many transporter proteins are composed of subunits that confer tissue specificity such that the transport mechanism functions, and thus are associated with tissue-specific disorders. Examples of transporter proteins include
Includes facilitative transporter, secondary active symporter, alternate transport mechanism driven by ionic gradient, and is involved in many drug resistances, making antigenic peptides into major tissue-antigen complex class I molecules Included are the E1-E2 cation transport ATPases, the active ATP binding cassette transporters involved in targeting.

【０００５】 １つの溶質を膜の片側から反対側へ輸送するような担体タンパク質は、ユニポ
ータと称される。対照的に、共役輸送体は、１つの溶質の輸送と第２の溶質の輸
送とを同時または連続的に同一方向（シンポート）または逆方向（アンチポート
）に結びつける。例えば、腸上皮及び腎上皮は、ナトリウムの細胞への運動が電
気化学勾配を下げるような第２の溶質を細胞内に共輸送するような種々のシンポ
ータシステムを有する。溶質の摂取に推進力を与えるようなナトリウム勾配は、
遍在するNa^-/K⁺ ATPアーゼによって維持される。ナトリウム結合輸送体には、哺
乳類のグルコース輸送体（SGLTI）、ヨウ素輸送体（NIS）、及びマルチビタミン
輸送体（SMVT）が含まれる。これら３つの輸送体は、１２個の推定されている膜
貫通セグメント、細胞外グリコシル化部位、及び細胞質的に方向づけられたＮ末
端及びＣ末端を有する。放射性ヨウ素の甲状腺イメージング技術のため及びラジ
オアイソトープを甲状腺へ特に標的にするためにNISは分子ベースであるので、N
ISは、種々の甲状腺病理学の評価、診断、治療において非常に重要な役割を果た
す（Levy, O. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5568-5573）。SMVTは
、腸粘膜、腎臓、及び胎盤において発現し、ビオチンやパントテナート等の水溶
性ビタミンの輸送に関係している（Prasad, P.D. ら (1998) J. Biol. Chem. 27
3:7501-7506）。Carrier proteins that transport one solute from one side of the membrane to the other are called uniporters. In contrast, a conjugate transporter couples the transport of one solute and the transport of a second solute simultaneously or sequentially in the same direction (symport) or in the opposite direction (antiport). For example, intestinal epithelium and renal epithelium have various symporter systems such that the movement of sodium into the cell co-transports a second solute into the cell, which reduces the electrochemical gradient. Sodium gradients, which provide a driving force for solute uptake,
Maintained by / K ⁺ ATP-ase ^- Na ubiquitous. Sodium binding transporters include the mammalian glucose transporter (SGLTI), iodine transporter (NIS), and multivitamin transporter (SMVT). These three transporters have 12 putative transmembrane segments, extracellular glycosylation sites, and cytoplasmically oriented N- and C-termini. Because NIS is molecular-based for thyroid imaging techniques of radioiodine and for specifically targeting radioisotopes to the thyroid, N
IS plays a very important role in the evaluation, diagnosis, and treatment of various thyroid pathologies (Levy, O. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5568-5573). SMVT is expressed in the intestinal mucosa, kidney, and placenta and is involved in the transport of water-soluble vitamins such as biotin and pantothenate (Prasad, PD et al. (1998) J. Biol. Chem. 27.
3: 7501-7506).

【０００６】 輸送体タンパク質の最大且つ最も多様であるファミリーは、ATP結合カセット
（ABC）輸送体である。ファミリーとしてのABC輸送体は、イオン、糖、アミノ酸
、ペプチド、リン脂質等の小さな分子から、リポペプチド、大型のタンパク質、
複合疎水性薬剤まで、化学構造及びサイズが著しく異なるような基質を輸送する
ことができる。各ABC輸送体は、輸送に必要なエネルギーを供給するためにATPを
加水分解するような２個のヌクレオチド結合ドメイン（NBD）と、膜チャネルを
形成するような２個の膜スパンドメイン（MSD）の、合わせて４個のモジュール
からなる。NBDは、約２００アミノ酸残基からなり、MSDは各々６個の推定されて
いる膜貫通セグメントを有する（Saurin, W. ら (1994) Mol. Microbiol. 12:99
3-1004、Shani,N. ら (1996) J. Biol. Chem. 271:8725-8730、Koster, W. 及び
B. Bohm (1992) Mol. Gen. Genet. 232:399-407を参照）。４個のABC輸送体モ
ジュールは、膵嚢胞性繊線維膜貫通コンダクタンス調節器（CFTR）のケースとし
て単一の遺伝子によってコードされるか或いは分離遺伝子によってコードされる
であろう。分離遺伝子によってコードされる場合、各遺伝子産物には１個のNBD
及びMSDが含まれる。これらの「半分子」は、抗原処理に関連するような小胞体
ベースの主要組織抗原複合体（MHC）ペプチド輸送システムであるところのTap1
及びTap2のようなホモダイマー及びヘテロダイマーを形成する（Androlewicz, M
.J. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12716-12720）。The largest and most diverse family of transporter proteins are the ATP-binding cassette (ABC) transporters. ABC transporters as a family include small molecules such as ions, sugars, amino acids, peptides and phospholipids, lipopeptides, large proteins,
Substrates with markedly different chemical structures and sizes can be transported to complex hydrophobic drugs. Each ABC transporter has two nucleotide binding domains (NBD) that hydrolyze ATP to supply the energy required for transport, and two membrane spanning domains (MSD) that form membrane channels. It consists of 4 modules in total. NBD consists of approximately 200 amino acid residues and MSDs each have 6 putative transmembrane segments (Saurin, W. et al. (1994) Mol. Microbiol. 12:99.
3-1004, Shani, N. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 8725-8730, Koster, W. and
B. Bohm (1992) Mol. Gen. Genet. 232: 399-407). The four ABC transporter modules may be encoded by a single gene as a case of pancreatic cystic fibrous transmembrane conductance regulator (CFTR) or by a segregating gene. One NBD for each gene product when encoded by a separate gene
And MSD are included. These “half-molecules” are Tap1s, an endoplasmic reticulum-based major tissue antigen complex (MHC) peptide transport system that is involved in antigen processing.
And homodimers such as Tap2 and heterodimers (Androlewicz, M
J. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12716-12720).

【０００７】 遺伝病の中にはABC輸送体の欠如に起因するものがあり、次に掲げる疾病及び
それに対応するタンパク質、すなわち嚢胞性線維症（CFTR、イオンチャネル、We
lsh, M.J. 及び A.E. Smith (1993) Cell 73:1251-1254）、X-linked副腎白質ジ
ストロトフィー、先天性超長鎖脂肪酸ペルオキシソームβ酸化異常（副腎白質ジ
ストロトフィープロテイン、ALDP）、ツェルヴェーガー症候群、先天性ペルオキ
シソーム生物発生異常（ペルオキシソーム膜プロテイン70、PMP70）、高インス
リン低血糖症（スルフォニル尿素受容体、SUR）等がABC輸送体の欠如に起因する
遺伝病として挙げられる。Pグリコプロテインとして知られるABC輸送体であると
ころの多剤耐性（MDR）プロテインは、広範囲の疎水性薬剤への耐性（MDR1；Got
tesman, M.M. 及び I. Pastan (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:385-427）また
はホスファチジルコリン輸送（MDR2；Ruetz, S. 及び P. Gros (1994) Cell 77:
1071-1081）に関連している。MDRは、癌細胞に共通し、化学療法の有効性を下げ
たり失敗させたりする（Taglight, D. 及び S. Michaelis (1998) Methods Enzy
mol. 292:131-163）。MDRは、通常、肺、腸、腎臓等において毒性物質をサイト
ソルから胆汁、腸管腔、または尿へ運搬するために機能するような、MRP中のPグ
リコプロテインや多剤耐性タンパク質等の輸送体によって仲介される。癌細胞に
おいて、これらの輸送体は化学療法剤を細胞外空間へ押し出し、それによって薬
剤抵抗を与える。最近、ABC輸送体型タンパク質がヒトの白血病細胞株から単離
された。アントラサイクリン（anthracycline）耐性関連タンパク質（GI 127945
7, SEQ ID NO:42）と命名されたこの輸送体は、多剤耐性白血病細胞サブライン
において過剰発現し、MRPを含む他の多剤耐性関連タンパク質と配列相同性を有
する（Longhurst, T.J. ら (1996) Br. I. Cancer 74:1331-1335）。Some genetic diseases are due to a lack of ABC transporters, and the following diseases and their corresponding proteins, cystic fibrosis (CFTR, ion channel, Wet).
Lsh, MJ and AE Smith (1993) Cell 73: 1251-1254), X-linked adrenoleukodystrophy, congenital very long chain fatty acid peroxisome β-oxidation abnormality (adrenoleukodystrophy protein, ALDP), Zellweger syndrome, Congenital abnormalities in peroxisome biogenesis (peroxisome membrane protein 70, PMP70), hyperinsulin hypoglycemia (sulfonylurea receptor, SUR), etc. are mentioned as genetic diseases caused by lack of ABC transporter. Multidrug resistance (MDR) protein, an ABC transporter known as P-glycoprotein, is resistant to a wide range of hydrophobic drugs (MDR1; Got
tesman, MM and I. Pastan (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 385-427) or phosphatidylcholine transport (MDR2; Ruetz, S. and P. Gros (1994) Cell 77:
1071-1081). MDR is common in cancer cells and reduces or fails the effectiveness of chemotherapy (Taglight, D. and S. Michaelis (1998) Methods Enzy
mol. 292: 131-163). MDR is a transporter such as P-glycoprotein and multidrug resistance protein in MRP that normally functions to transport toxic substances from cytosol to bile, intestinal lumen, or urine in lung, intestine, kidney, etc. Mediated by In cancer cells, these transporters push chemotherapeutic agents into the extracellular space, thereby conferring drug resistance. Recently, an ABC transporter-type protein has been isolated from a human leukemia cell line. Anthracycline resistance-related protein (GI 127945
7, SEQ ID NO: 42), is overexpressed in the multidrug-resistant leukemia cell subline and has sequence homology with other multidrug resistance-related proteins, including MRP (Longhurst, TJ et al. 1996) Br. I. Cancer 74: 1331-1335).

【０００８】 細胞膜を通過するような脂肪酸の輸送は、拡散、高適応力、低親和性プロセス
によって行われる。しかしながら、通常の生理学条件下において脂肪酸輸送の有
意割合は、高親和性、低適応力タンパク仲介輸送プロセスを経由して発生するよ
うである。４つの膜貫通セグメントを伴う内在性タンパク質であるところの脂肪
酸輸送体タンパク質（FATP）は、筋肉、心臓、脂肪等の高レベルの細胞膜脂肪酸
フラックスを示すような組織においてする。FATPの発現は、脂肪転換中に3T3-L1
細胞において上方制御され、COS7線維芽細胞における発現は、長鎖脂肪酸の細胞
の摂取量を向上させる。発現の研究は、脂質代謝、肥満症、II型糖尿病における
FATPの役割を示唆している（Hui, T.Y. ら (1998) J. Biol. Chem. 273:27420-2
7429）。The transport of fatty acids across the cell membrane is carried out by diffusion, high adaptability, low affinity processes. However, under normal physiological conditions, a significant proportion of fatty acid transport appears to occur via a high-affinity, low-adaptive protein-mediated transport process. The fatty acid transporter protein (FATP), which is an integral protein with four transmembrane segments, is found in tissues such as muscle, heart, and fat that exhibit high levels of cell membrane fatty acid flux. FATP expression is 3T3-L1 during fat conversion
Upregulated in cells, expression in COS7 fibroblasts improves cellular uptake of long chain fatty acids. Expression studies in lipid metabolism, obesity, type II diabetes
Suggests a role for FATP (Hui, TY et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 27420-2
7429).

【０００９】 El-E2（またはP型）ATPアーゼは、全ての生物学的関連のあるカチオンの膜フ
ラックスを仲介するような原核生物及び真核生物の両方に存在するような、カチ
オン輸送体のスーパーファミリーを構成する。これらのATPアーゼは、ATP加水分
解反応の過程においてEl及びE2と称する２つの異なる配座状態に存在すると仮定
されている。また、アシルリン酸、主としてアスパルチルリン酸の形状でATP加
水分解からエネルギーを変換するとも仮定されている。このファミリーのメンバ
ーは４大グループ、すなわち、Ca^2- 輸送ATPアーゼ、Na⁺/K⁺ 輸送ATPアーゼ及び
胃のH⁺/K⁺ 輸送ATPアーゼ、細胞膜H⁺ 輸送ATPアーゼ（プロトンポンプ）、及び
細菌性P型ATPアーゼに区分される（BLOCKS: BL00154, P-type cation-transport
ing ATPase superfamily signature）。The El-E2 (or P-type) ATPase is a cation transporter, such as is present in both prokaryotes and eukaryotes, that mediates the membrane flux of all biologically relevant cations. Make up a super family. These ATPases have been postulated to exist in two different conformational states, designated El and E2, during the ATP hydrolysis reaction. It has also been postulated to convert energy from ATP hydrolysis in the form of acyl phosphates, primarily aspartyl phosphates. Members of this family are four major groups: Ca ² -transport ATPase, Na ⁺ / K ⁺ transport ATPase and gastric H ⁺ / K ⁺ transport ATPase, plasma membrane H ⁺ transport ATPase (proton pump), and Classified into bacterial P-type ATPase (BLOCKS: BL00154, P-type cation-transport
ing ATPase superfamily signature).

【００１０】 アミノ酸の代謝は、複雑であり且つ高度に調整される。細胞は新規アミノ酸生
成が可能である一方、特定のアミノ酸浸透タンパク質を介してアミノ酸を細胞内
に輸送することは、全ての必須アミノ酸の好適且つ完全な有効性を維持するため
に絶対に必要である。細胞増殖及び分化の最中にこれは特に重要である。タンパ
ク質の構成単位としての役割に加えて、アミノ酸は種々の重要な高分子のために
前駆体として働く。例えば、ホルモンチロキシン、メラニン色素、及び神経伝達
物質ヒスタミン、エピネフリン、セロトニンは、ヒスチジン、チロシン、トリプ
トファンを含む種々のアミノ酸前駆体から生産される。スフィンゴリピド構造の
構成要素であるスフィンゴシンは、セリンに由来する。ヘム分子の構成要素であ
るポルフィリン環は、窒素ドナーとしてグリシンを用いる。核酸の成分であるプ
リン環及びピリミジン環の構造の大部分は、無数のアミノ酸の要素から形成され
る。アミノ酸もまたエネルギー代謝において重要である。アミノ酸は、脂肪酸や
グルコースと異なり細胞内に蓄積されないので、過剰アミノ酸はクエン酸サイク
ルに送られ、脂肪酸、ケトン体、グルコースを含むエネルギー分子を生産する。
従って、増殖細胞にも非増殖細胞にもアミノ酸代謝の正確な制御が極めて重要で
ある。Amino acid metabolism is complex and highly regulated. While cells are capable of producing new amino acids, the transport of amino acids into cells via specific amino acid permeation proteins is absolutely necessary to maintain the favorable and complete effectiveness of all essential amino acids. . This is especially important during cell proliferation and differentiation. In addition to serving as building blocks for proteins, amino acids act as precursors for a variety of important macromolecules. For example, the hormones thyroxine, melanin pigment, and the neurotransmitters histamine, epinephrine, and serotonin are produced from various amino acid precursors including histidine, tyrosine, tryptophan. Sphingosine, a component of the sphingolipid structure, is derived from serine. The porphyrin ring, which is a constituent of the heme molecule, uses glycine as the nitrogen donor. The majority of the structures of the purine and pyrimidine rings, which are components of nucleic acids, are formed from a myriad of amino acid elements. Amino acids are also important in energy metabolism. Amino acids, unlike fatty acids and glucose, are not accumulated intracellularly, so excess amino acids are sent to the citric acid cycle to produce energy molecules including fatty acids, ketone bodies, and glucose.
Therefore, accurate control of amino acid metabolism in both proliferating and non-proliferating cells is extremely important.

【００１１】 ヒトの末梢血リンパ球から複製したE16遺伝子は、複数予測されるような膜貫
通ドメインを伴うような241アミノ酸内在性膜タンパク質をコードする（Gaugits
ch, H.W. ら (1992) J. Biol. Chem. 267:11267-11273）。E16遺伝子の発現は、
細胞活性化及び***に結びついている。骨髄性細胞及びリンパ球様細胞において
、E16転写は刺激作用後に急速に減少し、急速に低下する。この発現のパターン
は、Ｔ細胞システムにおけるピンタ腫瘍遺伝子及びリンホカインに見られる動力
学に類似である。結腸、胃、乳の腺癌及びリンパ腫において高レベルのE16の発
現が検出される一方で、成人の脳、肺、肝臓、結腸、食道、胃腸、腎臓や、４か
月の胎児の脳、肺、肝臓、腎臓等の正常な（非癌性の）ヒトの組織においては、
E16の発現は殆ど或いは全く検出されない（Wolf, D.A. ら (1996) Cancer Res.
56:5012-5022；Gaugitsch ら、上述）。E16は、テストした各細胞株において検
出された。E16が急速に***する細胞株に存在し、増殖ポテンシャルが低いヒト
の組織に存在しないことは、エネルギー代謝、生化学合成経路、及びタンパク質
合成のための重要な構成単位を供給することを補助するような細胞***プロセス
にE16が直接関与していることを示唆している。The E16 gene, replicated from human peripheral blood lymphocytes, encodes a 241 amino acid integral membrane protein with a predicted transmembrane domain (Gaugits
ch, HW et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 11267-11273). Expression of the E16 gene
It is associated with cell activation and division. In myeloid and lymphoid cells, E16 transcription is rapidly reduced after stimulation and rapidly reduced. This pattern of expression is similar to the kinetics found in the Pinta oncogene and lymphokines in the T cell system. High levels of E16 expression are detected in colon, stomach, breast adenocarcinoma and lymphoma, while adult brain, lung, liver, colon, esophagus, gastrointestinal, kidney and 4-month fetal brain, lung , In normal (non-cancerous) human tissues such as liver, kidney,
Little or no expression of E16 is detected (Wolf, DA et al. (1996) Cancer Res.
56: 5012-5022; Gaugitsch et al., Supra). E16 was detected in each cell line tested. E16's Presence in Rapidly Dividing Cell Lines and Absence of Low Proliferative Potential Human Tissues Assist in Supplying Key Building Blocks for Energy Metabolism, Biochemical Synthesis Pathways, and Protein Synthesis Suggests that E16 is directly involved in the cell division process.

【００１２】 ポリペプチドの転写後修飾は、ゴルジ装置のルーメンにおいて発生する。その
ような修飾には、例えば、Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（N-a
cetylglucosaminyltransferase）等の酵素によって糖分子を追加し、グリコプロ
テインを生産することが含まれる。この反応における糖供与分子は、一般には、
ウリジン２リン酸ガラクトース（UDP-Gal）等のヌクレオチド糖である。ウリジ
ン２リン酸ガラクトース及びその他のヌクレオチド糖は、特定の輸送体分子によ
ってサイトソルからゴルジ装置へ輸送される。グリコプロテインが合成され、そ
れによって細胞機能に重大な影響を与えるような、これらのヌクレオチド糖の有
効性を制御することは可能である（Toma, L. ら (1996) J. Biol. Chem. 271:38
97-3901、Guillen, E. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7888-7892）
。Post-transcriptional modification of polypeptides occurs in the lumen of the Golgi apparatus. Such modifications include, for example, N-acetylglucosaminyl transferase (Na
It involves adding glycomolecules by enzymes such as cetylglucosaminyltransferase) to produce glycoproteins. The sugar-donor molecule in this reaction is generally
It is a nucleotide sugar such as uridine diphosphate galactose (UDP-Gal). Uridine diphosphate galactose and other nucleotide sugars are transported from the cytosol to the Golgi apparatus by specific transporter molecules. It is possible to control the effectiveness of these nucleotide sugars such that glycoproteins are synthesized and thereby significantly affect cell function (Toma, L. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271. : 38
97-3901, Guillen, E. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7888-7892)
.

【００１３】 新しい膜輸送体タンパク質及びそれをコードするようなポリヌクレオチドの発
見は、膜輸送障害、免疫異常症、炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常の診断
、予防及び治療に役立つような新たな成分を与えることにより、当業者の需要を
満足させる。The discovery of new membrane transporter proteins and polynucleotides encoding them may be useful in the diagnosis, prevention and treatment of cell proliferative disorders including membrane transport disorders, immune disorders, inflammatory diseases, and cancer. The demands of those skilled in the art are satisfied by providing new ingredients.

【００１４】 （発明の要約） 本発明は、総称して「MTRP」、個別には「MTRP-1」、「MTRP-1」、「MTRP-2」
、「MTRP-3」、「MTRP-4」、「MTRP-5」、「MTRP-6」、「MTRP-7」、「MTRP-8」
、「MTRP-9」、「MTRP-10」、「MTRP-11」、「MTRP-12」、「MTRP-13」、「MTRP
-14」、「MTRP-15」、「MTRP-16」及び「MTRP-17」と呼ばれる実質的に精製され
たポリペプチドである膜輸送タンパク質を提供する。本発明の一実施態様では、
SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を
含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1
−17からなる一群から選択されたアミノ酸配列の保存されたアミノ酸が１つ以上
置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。(Summary of the Invention) The present invention is generically referred to as "MTRP", and individually "MTRP-1", "MTRP-1", and "MTRP-2"
, "MTRP-3", "MTRP-4", "MTRP-5", "MTRP-6", "MTRP-7", "MTRP-8"
, "MTRP-9", "MTRP-10", "MTRP-11", "MTRP-12", "MTRP-13", "MTRP"
-14 "," MTRP-15 "," MTRP-16 "and" MTRP-17 ", which are membrane-transport proteins that are substantially purified polypeptides. In one embodiment of the invention,
Provided is a substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. The present invention also provides SEQ ID NO: 1
There is provided a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more conserved amino acids of an amino acid sequence selected from the group consisting of -17 are substituted.

【００１５】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−17及びそれらの
断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単
離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオチド配列
同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。The invention further provides a substantially purified variant having 90% or more amino acid identity with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. provide. The present invention also provides an isolated and substantially purified polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. The present invention also provides SEQ ID
An isolated and purified polynucleotide variant sequence having 90% or more polynucleotide sequence identity with a polynucleotide encoding a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 1-17 and fragments thereof. provide.

【００１６】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条
件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。Furthermore, the present invention provides an isolated hybridisation under stringent conditions to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. To provide a purified polynucleotide.
The invention also provides an isolated and purified polynucleotide comprising a sequence complementary to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. provide.

【００１７】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列の相補体を、少なくとも１つのサンプ
ルのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を
形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを
含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレ
オチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様で
は、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。The present invention is also a method of detecting a polynucleotide in a sample containing nucleic acids, the method comprising: (a) hybridizing a complement of a polynucleotide sequence with a polynucleotide of at least one sample, and performing hybridization. A detection method comprising the step of forming a complex and (b) the step of detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex and the presence of the polynucleotide in the sample are correlated. . In one embodiment of the invention, the step of amplifying the polynucleotide prior to hybridization is included.

【００１８】 本発明はまた、SEQ ID NO:18−34及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。また、本発明は、SEQ ID NO:18−34及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列と９０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する
単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、SEQ
ID NO:18−34及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌク
レオチドを提供する。The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34 and fragments thereof. The invention also provides an isolated and purified polynucleotide variant sequence having 90% or more polynucleotide sequence identity with a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34 and fragments thereof. provide. Further, the present invention provides SEQ
There is provided an isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of ID NO: 18-34 and fragments thereof.

【００１９】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−17からなる一群から選択されたアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む
発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に
含まれる。The present invention further provides an expression vector comprising at least one fragment of a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17. In another embodiment, the expression vector is contained within a host cell.

【００２０】 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む
宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを
回収する過程とを含む製造方法を提供する。The present invention also provides a method for producing a polypeptide, which comprises (a) culturing a host cell containing an expression vector having the polynucleotide of the present invention under conditions suitable for expression of the polypeptide. , (B) recovering the polypeptide from the medium of the host cell.

【００２１】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に提供する。The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof, together with a suitable pharmaceutical carrier. provide.

【００２２】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポ
リペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。The present invention further provides a purified antibody that binds a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. The invention also provides purified agonists and antagonists of the polypeptide.

【００２３】 本発明はまた、MTRPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防
方法であって、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好
適な医薬用担体と共に患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防方
法を提供する。The present invention also provides a method of treating or preventing a disease associated with decreased MTRP expression or activity, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. There is provided a method of treatment or prophylaxis comprising administering to a patient an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide together with a suitable pharmaceutical carrier.

【００２４】 本発明はまた、MTRPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防
方法であって、SEQ ID NO:1−17及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを患者に効果的な量投与す
ることを含む、治療または予防方法を提供する。The present invention also relates to a method of treating or preventing a disease associated with increased expression or activity of MTRP, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 and fragments thereof. Methods of treatment or prophylaxis are provided that include administering to the patient an effective amount of a polypeptide antagonist.

【００２５】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。Regarding the Description of the Present Invention Before explaining the protein and nucleic acid sequences and methods of the present invention, the present invention is not limited to the specific devices and materials and methods disclosed herein, and its embodiments are modified. Please understand what you can do. Also, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is limited only by the scope of the following claims,
It should also be understood that it is not intended to limit the scope of the invention.

【００２６】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。“A”, “the (these, etc.)” represent the singular in this specification and the claims.
Note that includes plural forms unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, “a host cell” includes a plurality of host cells, “antibody” includes a plurality of antibodies, and equivalents well known to those skilled in the art.

【００２７】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。All technical and scientific terms used herein, unless defined otherwise,
It has the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
Although any apparatus and materials and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice and testing of the present invention, suitable apparatus and materials and methods are described herein.
All references cited herein are cited to describe and disclose the cell lines, protocols, reagents, vectors described in the references that may be used in connection with the present invention. The mere fact that the conventional invention is cited does not mean that the novelty of the present invention is impaired.

【００２８】 （定義） 用語「MTRP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたMTRPのアミノ酸配列を指す。Definitions The term “MTRP” is obtained substantially from all species including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant (especially mammals including bovine, ovine, porcine, murine, equine and human). It refers to the amino acid sequence of purified MTRP.

【００２９】 用語「アゴニスト」は、MTRPの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指
す。このアゴニストは、MTRPに直接相互作用するか、或いはMTRPが関与する生物
学的経路の成分と作用して、MTRPの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小
分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of MTRP. This agonist either interacts directly with MTRP or interacts with components of the biological pathway involving MTRP to regulate the activity of MTRP such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, or any other compound or The composition may be included.

【００３０】 用語「アレル変異配列」は、MTRPをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮ
Ａ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば
変わらない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在しな
いもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変
異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は
、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じ
る。The term “allelic variant” refers to another form of the gene encoding MTRP. An allelic variant sequence results from at least one mutation in a nucleic acid sequence, the variant mRN
A or a mutant polypeptide, and their structures and functions may or may not change. Some genes include those in which no naturally-occurring allelic variant is present, or one gene or many genes are present. Generally, mutations that give rise to allelic variant sequences are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these mutations, either alone or concurrently with other mutations, occurs one or more times within a given sequence.

【００３１】 MTRPをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、MTRPと同じポリペプチド或いはMTRPの機能特性の少なく
とも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、MTRPをコードするポリヌ
クレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との
不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにMTRPをコードするポリ
ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或
いは検出困難な多型を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレン
ト変化を生じMTRPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換
を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にMTRPの活性が
保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または
両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ
酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリ
シン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有
するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得
る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含ま
れ得る。A “mutant” nucleic acid sequence that encodes MTRP refers to a polypeptide that has the same polypeptide as MTRP or at least one of the functional properties of MTRP, even though various nucleotide deletions, insertions, or substitutions have occurred. . This definition includes improper or unexpected hybridization of an MTRP-encoding polynucleotide sequence with an allelic variant at a position other than the normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotide probes of the MTRP-encoding polynucleotide. Includes polymorphisms that are easily or difficult to detect using. The encoded protein may also be mutated and may contain deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues which result in silent changes and are functionally equivalent to MTRP. Intentional amino acid substitutions are similar in terms of residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as the activity of MTRP is retained biologically or immunologically. Can be based on. For example, negatively charged amino acids can include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids can include lysine and arginine. Amino acids with similar hydrophilicity values and having polar uncharged side chains can include asparagine, glutamine, serine, threonine. Amino acids with similar hydrophilicity values and having uncharged side chains can include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, phenylalanine and tyrosine.

【００３２】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。The terms “amino acid” and “amino acid sequence” refer to oligopeptide, peptide, polypeptide, protein sequences, or any fragment thereof, including naturally occurring and synthetic molecules. When the "amino acid sequence" is a naturally occurring protein molecule, "
Amino acid sequence "and like terms are not intended to limit the amino acid sequence to the complete, unaltered amino acid sequence associated with the protein molecules described.

【００３３】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。The term “amplification” refers to making copies of nucleic acid sequences. Amplification is generally performed by the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art.

【００３４】 用語「アンタゴニスト」は、MTRPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、MTRPに直接相互作用するか、或いはMTRPが関与する生
物学的経路の成分と作用して、MTRPの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子
、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。The term “antagonist” is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of MTRP. An antagonist is an antibody, nucleic acid, carbohydrate, small molecule, or any other compound or composition that directly interacts with MTRP or interacts with components of a biological pathway involving MTRP to regulate the activity of MTRP. May include proteins such as things.

【００３５】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')₂、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。MTRPポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。
動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用される
ポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可
能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチ
ドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロ
ブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、この結
合したペプチドを用いて動物を免疫化する。The term “antibody” refers to intact molecules such as Fab and F (ab ′) ₂ , and fragments thereof, Fv fragments, which are capable of binding antigenic determinants. Antibodies that bind MTRP polypeptides can be produced using intact molecules or fragments thereof containing small peptides that immunize the antibody.
The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, mouse, rat, or rabbit) can be synthesized from the translation of RNA or chemically and is optionally conjugated with a carrier protein. It is also possible. Commonly used carriers that are chemically linked to peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemonean (KLH). The conjugated peptide is then used to immunize the animal.

【００３６】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。The term “antigenic determinant” refers to the region (ie, epitope) of a molecule that makes contact with a particular antibody.
Refers to. When a protein or a fragment of a protein is used to immunize a host animal, various regions of this protein are antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region on the protein or a three-dimensional structure). Can induce the production of The antigenic determinant may compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit an immune response) to bind the antibody.

【００３７】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖に相補的な核酸配列を含
む任意の組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。
「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現
はセンス鎖を指す。The term “antisense” refers to any composition containing a nucleic acid sequence that is complementary to the sense strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense molecules can be produced by any method including synthesis or transcription. Once introduced into a cell, complementary nucleotides combine with the natural sequences made by the cell to form a duplex, which inhibits transcription or translation.
The expression "minus (-)" refers to the antisense strand, and the expression "plus (+)" refers to the sense strand.

【００３８】 用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的な
機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或い
は組換え体のMTRP、合成のMTRPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な
動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。The term “biological activity” refers to a protein having the structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly, the term "immunologically active" means that natural or recombinant MTRP, synthetic MTRP or any oligopeptide thereof induces a specific immune response in a suitable animal or cell to induce a specific antibody. Refers to the ability to combine with.

【００３９】 用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成して
自然に結合することを指す。例えば、配列「５'Ａ−Ｇ−Ｔ３'」が相補的な配列
「３'Ｔ−Ｃ−Ａ５'」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核
酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全
な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブ
リダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間
の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（PNA）分子の設計若しくは
使用において特に重要である。The terms “complementary” and “complementarity” refer to the natural binding of polynucleotides to form base pairs. For example, the sequence "5'AG-T3 '" binds to the complementary sequence "3'TC-A5'". The complementarity between two single-stranded molecules may be partial, where only some of the nucleic acids bind, or there may be complete complementarity between the single strands resulting in perfect complementarity. The degree of complementarity between nucleic acid strands greatly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that depend on binding between nucleic acid strands, as well as in the design or use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.

【００４０】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
MTRP若しくはMTRPの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥
状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハ
イブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性
剤（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハ
ート液、乾燥ミルク、サケ***DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。“Composition comprising a given polynucleotide sequence” or “composition comprising a given amino acid sequence” refers broadly to any composition comprising a given nucleotide or amino acid sequence. The composition may include a dry formulation or an aqueous solution.
A composition comprising a polynucleotide sequence encoding MTRP or a fragment of MTRP can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a freeze-dried state and can be bound to a stabilizer such as sugar. In hybridization, the probe is developed in an aqueous solution containing salts (eg, NaCl) and detergents (eg, SDS: sodium dodecyl sulfate) and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). obtain.

【００４１】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされ
た核酸配列であって、XL-PCR^TM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'及び
／または３'の方向に延長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のための
コンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、
及び場合によっては、１つ以上のパブリックのドメインESTの重複によって構築
された核酸配列を指す。延長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配
列もある。A “consensus sequence” is a nucleic acid sequence that has been sequenced to separate unwanted bases and is 5'and / or 3'using XL-PCR ^™ (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Sequenced nucleic acid sequence or GELVI
EW fragment construction system (GCG, Madison, WI), etc. One or more Insight clones using computer programs for fragment construction,
And, in some cases, refers to nucleic acid sequences constructed by duplication of one or more public domain ESTs. Some consensus sequences are constructed by both extension and overlap.

【００４２】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。The term “conservative amino acid substitution” refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the substitution does not significantly change the structure or function of the protein,
The structure of the protein, in particular its function, is preserved. The following shows conservative amino acid substitutions in which the original amino acid of one protein is replaced with another amino acid. Original residue Conservative substitution Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln , Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile . Leu, Thr In general, in the case of conservative amino acid substitutions, a) the backbone structure of the polypeptide in the substituted region, eg β sheet or α helix conformation, b) the charge of the molecule at the substituted site or Hydrophobic and / or c) most of the side chains are retained.

【００４３】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。The term “deletion” refers to a change in an amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in a nucleic acid sequence that lacks one or more nucleotides.

【００４４】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. Chemical modifications of polynucleotide sequences include, for example, replacement of hydrogen with an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group. A derivative polynucleotide has at least one biological or immunological function of a natural molecule (unmodified molecule).
Encodes a polypeptide that maintains one. A derivative polypeptide is a polypeptide modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that maintains at least one of the biological or immunological functions of the original polypeptide. That is.

【００４５】 用語「断片」は、MTRPまたはMTRPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分
であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが
短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／ア
ミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連
続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、
治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、
１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若
しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片
は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチ
ド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或い
は、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ
酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を
含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。The term “fragment” refers to a unique portion of MTRP or a polynucleotide encoding MTRP that is identical to its parent sequence but shorter than that sequence. The maximum length of a "fragment" is the parent sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment contains 5 to 1000 consecutive nucleotides or amino acid residues. Probe, primer, antigen,
The therapeutic molecule, or fragment used for other purposes, comprises at least 5, 10, 15,
It is the length of 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 or 500 consecutive nucleotides or amino acid residues. Fragments may also be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment may comprise a predetermined length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids shown in the given sequence (or the first 25% or 50% of the polypeptide). . These lengths are examples, and any length described in the specification including the sequence listing and the tables and drawings can be included in the embodiments of the present invention.

【００４６】 SEQ ID NO:18−34のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる
、SEQ ID NO:18−34を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含
む。SEQ ID NO:18−34のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技
術、またはSEQ ID NO:18−34を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方
法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:18−34の正確な断片の長さや領
域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定で
きる。Certain fragments of SEQ ID NO: 18-34 include, for example, a region of unique polynucleotide sequence that uniquely identifies SEQ ID NO: 18-34, which differs from other sequences in the same genome. . Certain fragments of SEQ ID NO: 18-34 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods of distinguishing SEQ ID NO: 18-34 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 18-34 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.

【００４７】 SEQ ID NO:1−17のある断片は、SEQ ID NO:18−34のある断片によってコード
される。SEQ ID NO:1−17のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−17を同定する固
有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−17のある断片は、特異
的にSEQ ID NO:1−17を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用で
ある。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−17の正確な断片の長さや領域は、その
断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。Certain fragments of SEQ ID NO: 1-17 are encoded by certain fragments of SEQ ID NO: 18-34. Certain fragments of SEQ ID NO: 1-17 contain regions of unique amino acid sequence that uniquely identify SEQ ID NO: 1-17. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-17 are useful as immunogenic peptides for the production of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-17. The exact fragment length and region of SEQ ID NO: 1-17 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.

【００４８】 用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるというこ
とではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特
異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえな
い（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特
異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合
は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。The term “similarity” refers to a degree of complementarity. This includes partial similarity and complete similarity. The term “identity” can also be called “similarity”. Partially complementary sequences in which hybridization of the same sequence to the target nucleic acid is at least partially blocked are said to be "substantially similar." Inhibition of hybridization between the perfectly complementary sequence and the target sequence is tested using a hybridization assay (Southern or Northern blotting, solution hybridization, etc.) under mildly stringent conditions. Substantially similar sequences or hybridization probes competitively suppress binding of the perfectly similar (identical) sequence to the target sequence under mildly stringent conditions. This does not mean that non-specific binding is allowed under mildly stringent conditions, but under mildly stringent conditions, the binding of two sequences to each other is specific (ie, selective). You have to interact. A second target sequence, which may not be said to be partially complementary (eg, less than 30% similarity or identity), can be used to test for the absence of non-specific binding. In the absence of non-specific binding, the substantially similar sequence or probe will not hybridize to the second non-complementary target sequence.

【００４９】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。The term “percent identity” or “% identity” with respect to polynucleotide sequences refers to matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is a percentage. Such algorithms can insert gaps in the sequences to make a more meaningful comparison between the two sequences in a standardized and reproducible manner to optimize the alignment between the two sequences.

【００５０】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and includes a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison W
I). This CLUSTAL V is for Higgins, DG and PM Sharp (1989) CABIOS
5: 151-153, Higgins, DG et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For pairwise alignments of polynucleotide sequences, the default parameter is Kt.
Set uple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. Percentage identity is reported by CLUSTAL V as the "percentage similarity" of aligned polynucleotide sequence pairs.

【００５１】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以
下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。Alternatively, a set of commonly used and freely available sequence comparison algorithms is
NCBI, Bethesda, MD, and Internet (http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
National Center for Biotechnology Information (NCB)
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF et al. (1990) J
Mol. Biol. 215: 403-410). The suite of BLAST software includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available,
Used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. "BLAST 2 Sequen
"ces" can be used interactively by accessing http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). The BLAST program is commonly used with gaps and other parameters that set defaults. For example,
When comparing two nucleotide sequences, one may blast with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set to default parameters.
will use n. Such default parameters are, for example: Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on May be measured for the entire length of a given sequence, as determined by the sequence number of, or for shorter lengths, for example, fragments obtained from a given given sequence, for example at least contiguous , 20 or 30
, 40, 50, 70, 100, 200 nucleotide fragments. Such lengths are merely exemplary, and fragments of any length of the sequences set forth in the specification including sequence listing and tables and figures may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.

【００５２】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードが縮重するため、類似のア
ミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的
に同じタンパク質をコードする多数の核酸配列を作ることができる。Nucleic acid sequences that do not show high identity may encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. Degeneracy can be used to alter nucleic acid sequences to create multiple nucleic acid sequences each encoding substantially the same protein.

【００５３】 ポリペプチド配列に用いられる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。The term “percentage of identity” or “% identity” as used for polypeptide sequences
"Is the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm." Methods of polypeptide sequence alignment are well known. Some alignment methods consider conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, described in detail above, generally conserve charge and hydrophobicity at the site of substitution, and result in polypeptide structure (and thus function) as well.
Is saved.

【００５４】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (supra). For pairwise alignments of polypeptide sequences using CLUSTAL V, the default parameters are Ktuple = 1, gap
Set penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, the percent identity of paired aligned polypeptide sequences is reported by CLUSTAL V as the "percentage of similarity."

【００５５】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。Alternatively, the NCBI BLAST software suite is used. For example, when making a pairwise comparison of two polypeptide sequences, one would use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set with default parameters. . Such default parameters are, for example: Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on It may be measured over the entire length of the peptide sequence, or for shorter lengths, eg fragments derived from one large given polypeptide sequence, eg at least 15, 20, or 30, 40 contiguous. , 50, 70, 150 residues may be measured against the length of the fragment. Such lengths are merely exemplary, and fragments of any length of the sequences set forth in the specification including sequence listing and tables and figures may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.

【００５６】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得り
、安定した有糸***染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小
染色体である。“Human Artificial Chromosome (HAC)” can contain a DNA sequence of about 6 kb to 10 Mb in size, and is a small linear chain containing all the elements necessary for stable segregation and maintenance of mitotic chromosomes. It is a chromosome.

【００５７】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。The term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been altered in order to resemble a more human antibody while retaining its original binding ability.

【００５８】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニー
リングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配
列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で
、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリ
ダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性
即ちストリンジェント（stringency）の決定において特に重要であり、よりスト
リンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の
対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者に
よって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過
程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００
μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ***DNAが含まれる。“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms base pairs with a complementary single strand under defined hybridization conditions. Specific hybridization means that two nucleic acid sequences have high identity. Under conditions that allow annealing, specific hybridization complexes are formed and remain hybridized after the washing process. The washing process is particularly important in determining the stringency or stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, non-specific binding, ie binding of pairs of nucleic acid strands that are not perfectly matched. Is reduced. The conditions under which annealing between nucleic acid sequences is permissible are routinely determined by those of skill in the art and are constant during hybridization, but the washing process involves changing the conditions during which to achieve the desired stringency. Is possible and hybridization specificity is obtained. Annealing conditions are, for example, at a temperature of 68 ° C., about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS, and about 100.
Includes μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.

【００５９】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う温度
で部分的に表すことができる。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨに
おける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、
（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブ
とハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼー
ションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainvi
ew NY; 特に2巻の9章に記載されている。In general, hybridization stringency can be expressed in part at the temperature at which the wash process occurs. The wash temperature is usually selected to be about 5-20 ° C below the thermal melting point (Tm) of the particular sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is
It is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. The formula for calculating the Tm and the conditions for nucleic acid hybridization are well known, Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Volume 2 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainvi.
ew NY; Especially described in Chapter 2 of Volume 2.

【００６０】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２×SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの濃
度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２×SSCの範囲である。通常は、
遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断
剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性したサケ***DNAが含まれ
る。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAと
DNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これら
の洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェント
な条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を
示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリ
ペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a wash step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Alternatively, it is carried out at temperatures of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. The concentration of SSC is in the range of about 0.1-2xSSC in the presence of about 0.1% SDS. Normally,
Blocking agents are used to prevent non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, about 100-200 μg / ml denatured salmon sperm DNA. Organic solvents such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v, for example RNA and
It can be used in specific cases such as hybridization of DNA. Useful modifications of these wash conditions are well known to those of skill in the art. Hybridization, particularly under highly stringent conditions, may suggest evolutionary similarities between the nucleotides. Such similarities strongly suggest that the nucleotides and encoded polypeptides play a similar role.

【００６１】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。The term “hybridization complex” refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonds between complementary bases. Hybridization complexes may be formed in solution (eg, C ₀ t or R ₀ t analysis), or one nucleic acid sequence in solution and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin). ,
Or a slide glass, or any suitable substrate for immobilizing cells and their nucleic acids)
Can be formed with another nucleic acid sequence fixed to.

【００６２】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。The term “insertion” or “addition” refers to a change in an amino acid sequence or nucleic acid sequence in which one or more amino acid residues or nucleotides have been added, respectively.

【００６３】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。“Immune response” refers to conditions associated with inflammatory diseases and trauma, immune disorders, infectious diseases, genetic diseases and the like. These conditions are characterized by the expression of various factors such as cytokines and chemokines, other signaling molecules that affect the cell and systemic defense systems.

【００６４】 用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレ
オチドの配列を指す。The term “microarray” refers to an array of different polynucleotides arranged on a substrate.

【００６５】 マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基
板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。The term “element” or “array element” as used in the context of microarray refers to a hybridizable polynucleotide arrayed on the surface of a substrate.

【００６６】 用語「変調」は、MTRPの活性の変化を指す。例えば、変調によって、MTRPのタ
ンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或い
は免疫学的特性の変化が起こる。The term “modulation” refers to a change in the activity of MTRP. For example, modulation results in a change in MTRP protein activity or binding properties, or other biological, functional or immunological properties.

【００６７】 用語「核酸」或いは「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であ
って、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮ
Ａ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（PNA）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物
質を指す。The term “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” refers to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, or fragments thereof. In addition, DN of genomic or synthetic origin, which is a single-strand or double-strand and is a sense or antisense strand
A or RNA, peptide nucleic acid (PNA), any DNA-like substance, and RNA-like substance.

【００６８】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。“Operably linked” refers to the condition in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription or expression of the coding sequence. Generally, operably linked DNA sequences are very contiguous or contiguous if the regions encoding the two proteins must be joined in the same reading frame.

【００６９】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or anti-gene agent that comprises an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length linked to a peptide backbone of amino acid residues ending in lysine. This terminal lysine renders the composition soluble. PNAs can bind preferentially to complementary single-stranded DNA or RNA to stop elongation of transcripts and polyethylene glycol to prolong life in cells.

【００７０】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、MTRPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一
本鎖に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列
の増幅（及び同定）に用いることができる。The “probe” is a nucleic acid sequence encoding the same sequence or allele nucleic acid sequence, MTRP, a complementary sequence thereof, or a fragment thereof used for detecting a related nucleic acid sequence. A probe is an oligonucleotide or polynucleotide that has been isolated with a detectable label or reporter molecule attached. Typical labels include radioisotopes and ligands, chemiluminescent reagents, enzymes. A "primer" is capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide,
A short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide. After the primer anneals to the polynucleotide, it is extended by a DNA polymerase enzyme along the target DNA single strand. The primer set can be used, for example, for amplification (and identification) of a nucleic acid sequence in a PCR method.

【００７１】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。The probes and primers used in the present invention include at least 15 of known sequences.
Of contiguous nucleotides. Longer probes and primers can be used to increase specificity. For example, at least 20 or 25, 30, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 contiguous of the disclosed nucleic acid sequences.
, 150 nucleotides. It should be understood that probes and primers that are considerably longer than the above examples can be used, and nucleotides of any length shown in the tables and drawings of the present specification and the sequence listing can also be used.

【００７２】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。For the preparation and use of the probe and the primer, see, for example, Sambrook,
J. et al., 1989, Name "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd
Editions 1-3 (Cold Spring Harbor Press, Plainview NY), or Ausubel, FM
In 1987, the name "Current Protocols in Molecular Biology" (Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY), and Innis et al.,
In 1990, the name `` PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications '' (Acade
mic Press, San Diego CA.). The set of primers for PCR is, for example, Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA), and the like, and can be derived from one known sequence using a computer program for such purpose.

【００７３】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素
、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定
する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴ
ヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。Oligonucleotides used as primers are selected by computer programs well known in the art for primer selection. For example, OLIGO 4.06 software selects primer pairs for PCR, each up to 100 nucleotides,
And is useful for the analysis of large polynucleotides and oligonucleotides of up to 5,000 nucleotides from an input polynucleotide sequence of up to 32,000 bases. Similar primer selection programs include additional features that expand capacity. For example, the PrimOU primer selection program (Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, available from Dallas TX)
Since a specific primer can be selected from the megabase sequence, it is useful for designing a primer in a genome-wide scope. Primer3 primer selection program (Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research,
(Available from Cambridge MA1) allows users to specify sequences that they would like to avoid as primer binding sites.
) ”Can be entered. In addition, Primer3 is especially useful for the selection of oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs can be obtained from each source and modified to meet the needs of users). Can also). PrimerGen Program (UK Human Genome Mapping Pro
(available from the ject Resource Center, Cambridge UK), which designs primers based on multiple sequence alignments, so that they will hybridize to either the most conserved or the least conserved regions of the aligned nucleic acid sequences. Can be selected. Therefore, this program is useful for identifying unique and conserved oligonucleotide or polynucleotide fragments. The fragment of the oligonucleotide or polynucleotide identified by any of the selection methods described above is, for example, a PCR method or a sequencing primer, a microarray element, or a specific identifying a polynucleotide that is completely or partially complementary to a nucleic acid of a sample. It is useful for the hybridization technique such as the probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.

【００７４】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。As used herein, a “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence but a sequence that is an artificial combination of two or more distant segments of a sequence. Often, this artificial combination is made by chemical synthesis, but it is more common to artificially manipulate distant segments of nucleic acid using genetic engineering techniques such as those described in Sambrook, supra. is there. The "recombinant nucleic acid" also includes a nucleic acid modified by simply adding or substituting a part of the nucleic acid. The recombinant nucleic acid may also include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such recombinant nucleic acid can be, for example, part of a vector used to transform a cell.

【００７５】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。Alternatively, such recombinant nucleic acid is a vaccinia virus-based virus that, when used to vaccinate a mammal expressing the recombinant nucleic acid, elicits a protective immune response in the mammal. It can be part of the vector.

【００７６】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。MTRPをコードする
核酸若しくはその断片、MTRP自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細
胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶
液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組織プ
リント等も含まれ得る。The term “sample” is used in its broadest sense. Samples suspected of containing MTRP-encoding nucleic acids or fragments thereof, MTRP itself include body fluids, extracts from cells, chromosomes or subcellular organelles isolated from cells, membranes, cells, and solutions. Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, tissues or tissue prints and the like may also be included.

【００７７】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。The terms “specific binding” and “specifically bind” refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. Point to. This interaction depends on the presence of a particular structure of the protein recognized by the binding molecule, eg, an antigenic determinant or epitope. For example, when the antibody is specific to the epitope "A", the reaction solution containing the unbound labeled "A" and the antibody is bound to the polypeptide containing the epitope A or the unbound unlabeled "A". Is present, the amount of labeled A bound to the antibody is reduced.

【００７８】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除
去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものを指す。The term “substantially purified” refers to a nucleic acid sequence or amino acid sequence that has been removed from the natural environment and then isolated or separated so that the composition to which it is naturally associated is at least about 60. % Or more, preferably about 75% or more, and most preferably about 90% or more.

【００７９】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。“Substitution” is the replacement of one or more amino acids or nucleotides by different amino acids or nucleotides.

【００８０】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。The term “substrate” refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microspheres. Includes particles and capillaries. The substrate has various surface morphologies such as walls or trenches, pins, channels, pores, to which polynucleotides and polypeptides bind.

【００８１】 「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞
には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の
一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限
られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。“Transformation” is the process by which exogenous DNA enters and changes the recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions by a variety of methods well known in the art and is performed by any well known method of inserting an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. be able to. This transformation method is
The choice depends on the type of host cell to be transformed. This method includes, but is not limited to, viral infection, electroporation, lipofection, and particulate irradiation. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously, either as a plasmid or as part of a host chromosome. Further, a cell that transiently expresses the introduced DNA or the introduced RNA within a limited time is also included.

【００８２】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１
つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団（population）、病態、病態の特徴を表し得る。A “variant sequence” of a particular nucleic acid sequence refers to the default parameter setting “BLAST
2 Sequences "tool Version 2.0.9 (May-07-1999) shows that the specific nucleic acid sequence identity for a given length of a given nucleic acid sequence is at least 40%.
The nucleic acid sequence determined to be. Such nucleic acid pairs may, for example, be at least 50% or 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, over a length.
It may exhibit 95%, 98%, or more identity. A variant sequence can be represented, for example, as an "allelic" variant sequence (described above) or a "splice" variant sequence, a "species" variant sequence, a "polymorphism" variant sequence. Splice variant sequences may have very high identities to the reference molecule, but alternative splicing of exons during mRNA processing may result in more or less polynucleotides. The corresponding polypeptide may have additional functional domains present in the reference molecule or may lack domains present in the reference molecule. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides have a high degree of amino acid identity with each other. Polymorphic variant sequences differ in the polynucleotide sequence of a given gene from a given species and the species. The polymorphic variant sequence also includes one of the polynucleotide sequences
A "single nucleotide polymorphism" (SNP) that differs by two nucleotides may also be included. The presence of SNPs may be indicative of, for example, a population, a pathological condition, a characteristic of the pathological condition.

【００８３】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの
対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。A “variant” of a particular polypeptide sequence refers to the default parameter setting “
Blast 2 Sequences "Tool Version 2.0.9 (May-07-1999) by blastp, the identity of the particular polypeptide sequence to a certain length of a certain nucleic acid sequence is determined to be at least 40% of the nucleic acid sequence That is. Such polypeptide pairs may, for example, be at least 50% or 60%, 70%, 8 in a length.
It may exhibit 0%, 85%, 90%, 95%, 98%, or more identity.

【００８４】 （発明） 本発明は、新規の膜輸送タンパク質（MTRP）及びMTRPをコードするポリヌクレ
オチドの発見に基づき、膜輸送障害、免疫異常症／炎症性疾患、及び癌を含む細
胞増殖異常症の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。(Invention) The present invention is based on the discovery of a novel membrane transport protein (MTRP) and a polynucleotide encoding MTRP, and cell proliferative disorders including membrane transport disorders, immune disorders / inflammatory diseases, and cancers. The use of these compositions in the diagnosis, treatment, and prevention of.

【００８５】 表１は、MTRPをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサイ
ト社クローンを示す。列１及び列２はそれぞれ、ポリペプチド及びポリヌクレオ
チドのSEQ ID NOを示す。列３は、各MTRPをコードする核酸が同定されたIncyte
クローンのクローンIDを示し、列４は、それらのクローンが単離されたcDNAライ
ブラリを示す。列５は、Incyteクローン及びそれらに対応するcDNAライブラリを
示す。cDNAライブラリが示されていないインサイト社クローンは、プールされた
cDNAライブラリに由来する。列５のクローンは、各MTRPのコンセンサスヌクレオ
チド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片として有
用である。Table 1 shows the Incyte clones used to construct the full length nucleotide sequence encoding MTRP. Columns 1 and 2 show the SEQ ID NOs for the polypeptide and polynucleotide, respectively. Column 3 shows Incyte in which the nucleic acid encoding each MTRP was identified.
The clone IDs of the clones are shown and column 4 shows the cDNA library in which those clones were isolated. Column 5 shows Incyte clones and their corresponding cDNA libraries. Insight clones for which the cDNA library is not shown were pooled
Derived from a cDNA library. The clone in row 5 was used to construct the consensus nucleotide sequence for each MTRP and is useful as a fragment in hybridization techniques.

【００８６】 表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示し、列１はSEQ ID N
O、列２は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列３は潜在リン酸化部位
、列４は潜在グリコシル化部位、列５はシグネチャ（signature）配列及びモチ
ーフを有するアミノ酸残基、列６はBLAST解析によって同定された相同配列、列
７は分析方法及び場合によってはその分析方法が利用できる検索可能なデータベ
ースを示す。列７の分析方法は、配列相同性及びタンパク質モチーフから各ポリ
ペプチドを特徴付けるために用いることが可能である。Each column of Table 2 shows various properties of each polypeptide of the invention, column 1 SEQ ID N
O, column 2 is the number of amino acid residues in each polypeptide, column 3 is a potential phosphorylation site, column 4 is a potential glycosylation site, column 5 is an amino acid residue having a signature sequence and motif, column 6 is Homologous sequences identified by BLAST analysis, column 7 indicates the method of analysis and optionally the searchable database in which the method of analysis is available. The analysis method in column 7 can be used to characterize each polypeptide from sequence homology and protein motifs.

【００８７】 図１Ａ−図１Ｄに示されているように、MTRP-3は、マウス脂肪酸輸送タンパク
質 (FATP；GI 2612939; SEQ ID NO:35)と化学的及び構造的類似性を有する。詳
細には、MTRP-3とFATPとの同一性は６５％である。図２Ａ−図２Ｄに示されてい
るように、MTRP-4は、Schistosoma mansoni ATP結合カセットファミリータンパ
ク質である SMDR-1 (GI 425474; SEQ ID NO:36)と化学的及び構造的類似性を有
する。詳細には、MTRP-4とSMDR-1との同一性は３８％である。図３Ａ−図３Ｄに
示されているように、MTRP-5は、ラットナトリウム依存性綜合ビタミン輸送体（
SMVT; GI 3015617; SEQ ID NO:37）と化学的及び構造的相同性を有する。詳細に
は、MTRP-5とSMVTとの同一性は８２％である。As shown in FIGS. 1A-1D, MTRP-3 has chemical and structural similarities to the mouse fatty acid transport protein (FATP; GI 2612939; SEQ ID NO: 35). Specifically, the identity between MTRP-3 and FATP is 65%. As shown in Figures 2A-2D, MTRP-4 has chemical and structural similarities to SMDR-1 (GI 425474; SEQ ID NO: 36), a Schistosoma mansoni ATP-binding cassette family protein. . Specifically, the identity between MTRP-4 and SMDR-1 is 38%. As shown in FIGS. 3A-3D, MTRP-5 is a rat sodium-dependent integrated vitamin transporter (
SMVT; GI 3015617; SEQ ID NO: 37) with chemical and structural homology. Specifically, the identity between MTRP-5 and SMVT is 82%.

【００８８】 表３の列は、組織特異性と、MTRPをコードするヌクレオチド配列に関連した疾
患または異常症、症状とを示している。表３の列１は、ヌクレオチドの配列番号
（SEQ ID NO）を示している。列２は、MTRPを発現する組織カテゴリー、及びMTR
Pを発現する全組織におけるその割合を示す。列３は、MTRPを発現する組織に関
連する疾患若しくは異常症、症状、並びにMTRPを発現する全組織におけるそれら
の割合を示す。列４は、各cDNAライブラリをサブクローニングするために用いた
ベクターを示す。The columns of Table 3 show the tissue specificity and diseases or disorders associated with the nucleotide sequence encoding MTRP, symptoms. Column 1 of Table 3 shows the nucleotide sequence number (SEQ ID NO). Column 2 is a tissue category expressing MTRP, and MTR
The ratio in all tissues expressing P is shown. Column 3 shows diseases or disorders associated with MTRP-expressing tissues, symptoms, and their proportion in total MTRP-expressing tissues. Column 4 shows the vector used to subclone each cDNA library.

【００８９】 SEQ ID NO:30及びSEQ ID NO:31の発現パターンに注目されたい。SEQ ID NO:30
は、５つのライブラリのみで発現し、そのうちの少なくとも４つ（８０％）が細
胞増殖に関連し、少なくとも１つ（２０％）が免疫応答に関連する。５つのライ
ブラリの内の２つ（４０％）が心血管組織に関連し、少なくとも１つ（２０％）
が胃腸、神経、及び生殖組織に関連する。SEQ ID NO:31は、４つのライブラリの
みで発現し、そのうちの少なくとも３つ（７５％）が細胞増殖に関連し、少なく
とも２つ（５０％）が炎症または免疫応答に関連する。４つのライブラリの内の
２つ（５０％）が造血／免疫組織に関連し、少なくとも１つ（２５％）が心血管
及び生殖組織に関連する。Note the expression patterns of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31. SEQ ID NO: 30
Is expressed in only 5 libraries, of which at least 4 (80%) are associated with cell proliferation and at least 1 (20%) with immune responses. 2 out of 5 libraries (40%) are associated with cardiovascular tissue and at least 1 (20%)
Is associated with gastrointestinal, nerve, and reproductive tissues. SEQ ID NO: 31 is expressed in only 4 libraries, of which at least 3 (75%) are associated with cell proliferation and at least 2 (50%) are associated with inflammation or immune response. Two of the four libraries (50%) are associated with hematopoietic / immune tissues and at least one (25%) is associated with cardiovascular and reproductive tissues.

【００９０】 MTRPをコードする核酸配列の以下に示す断片は、SEQ ID NO:18−34の同定、及
びSEQ ID NO:18−34と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するハイブリダイ
ゼーション若しくは増幅の技術において、これらの断片は有用である。これら有
用な断片には、SEQ ID NO:18のヌクレオチドの約110から154までの断片と、SEQ
ID NO:19のヌクレオチドの約759から839までの断片と、SEQ ID NO:20のヌクレオ
チドの約1531から1578までの断片と、SEQ ID NO:21のヌクレオチドの約538から5
97までの断片と、SEQ ID NO:22のヌクレオチドの約2241から2294までの断片と、
SEQ ID NO:23のヌクレオチドの約116から145までの断片と、SEQ ID NO:24のヌク
レオチドの約60から89までの断片と、SEQ ID NO:25のヌクレオチドの約160から1
89までの断片と、SEQ ID NO:26のヌクレオチドの約763から792までの断片と、SE
Q ID NO:27のヌクレオチドの約43から72までの断片と、SEQ ID NO:28のヌクレオ
チドの約361から405までの断片と、SEQ ID NO:29のヌクレオチドの約35から79ま
での断片と、SEQ ID NO:30のヌクレオチドの約206から250までの断片と、SEQ ID
NO:31のヌクレオチドの約71から115までの断片と、SEQ ID NO:32のヌクレオチ
ドの約161から205までの断片と、SEQ ID NO:33のヌクレオチドの約364から408ま
での断片と、SEQ ID NO:34のヌクレオチドの約18から62までの断片とが含まれる
。SEQ ID NO:20−30及びSEQ ID NO:32−34の特定の断片によってコードされるポ
リペプチドは、例えば、抗体の作製に有用である。The following fragments of the nucleic acid sequence encoding MTRP are identified by SEQ ID NO: 18-34 and techniques for hybridization or amplification that distinguish SEQ ID NO: 18-34 from related polynucleotide sequences. In, these fragments are useful. These useful fragments include fragments of about 110 to 154 nucleotides of SEQ ID NO: 18,
A fragment of about 759 to 839 nucleotides of ID NO: 19, a fragment of about 1531 to 1578 nucleotides of SEQ ID NO: 20, and about 538 to 5 nucleotides of SEQ ID NO: 21.
A fragment up to 97, and a fragment from about 2241 to 2294 of the nucleotides of SEQ ID NO: 22,
Approximately 116 to 145 of the nucleotide of SEQ ID NO: 23, approximately 60 to 89 of the nucleotide of SEQ ID NO: 24, and approximately 160 to 1 of the nucleotide of SEQ ID NO: 25.
89 and a fragment from about nucleotides 763 to 792 of nucleotides of SEQ ID NO: 26, SE
A fragment of about 43 to 72 nucleotides of Q ID NO: 27, a fragment of about 361 to 405 nucleotides of SEQ ID NO: 28, and a fragment of about 35 to 79 nucleotides of SEQ ID NO: 29. , A fragment of about 206 to 250 of the nucleotides of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:
A fragment of about 71 to 115 nucleotides of NO: 31, a fragment of about 161-1205 of nucleotides of SEQ ID NO: 32, a fragment of about 364-408 of nucleotides of SEQ ID NO: 33, SEQ Approximately 18 to 62 of the nucleotides of ID NO: 34 are included. Polypeptides encoded by specific fragments of SEQ ID NO: 20-30 and SEQ ID NO: 32-34 are useful, for example, in raising antibodies.

【００９１】 表４の列は、MTRPをコードするcDNAのクローンが単離されたcDNAライブラリの
作製に用いられた組織の説明を示す。列１は、ヌクレオチドのSEQ ID NOを示し
、列２はそれらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示し、列３は列２のcD
NAライブラリに対応する組織の由来及び詳細を示す。The columns of Table 4 provide a description of the tissues used to generate the cDNA library in which a clone of the MTRP-encoding cDNA was isolated. Column 1 shows the SEQ ID NO of the nucleotides, column 2 shows the cDNA library from which those clones were isolated, column 3 shows the cDNA of column 2
The origin and details of the tissue corresponding to the NA library are shown.

【００９２】 本発明はまた、MTRPの変異体を含む。好適なMTRPの変異体は、MTRPアミノ酸配
列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５
％ものアミノ酸配列同一性を有し、MTRPの機能的若しくは構造的特徴の少なくと
も１つを有する。The present invention also includes variants of MTRP. Preferred MTRP variants have at least about 80%, or at least about 90%, or at least about 95% MTRP amino acid sequence.
It has as much as% amino acid sequence identity and has at least one functional or structural characteristic of MTRP.

【００９３】 本発明はまた、MTRPをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例では
、本発明は、MTRPをコードするSEQ ID NO:18−34からなる一群から選択された配
列を有するポリヌクレオチド配列を含む。The present invention also includes polynucleotides encoding MTRPs. In a particular embodiment, the invention comprises a polynucleotide sequence having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34 encoding MTRP.

【００９４】 本発明はまた、MTRPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、MTRPをコードするポリヌクレ
オチド配列と少なくとも約７５％、または少なくとも約８５％、または少なくと
も約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様
は、SEQ ID NO:18−34からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７５
％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％ものポリヌクレオチ
ド配列同一性を有する、SEQ ID NO:18−34からなる一群から選択された配列を含
むポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変
異配列は、MTRPの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸
配列をコードし得る。The present invention also includes variant sequences of the polynucleotide sequence encoding MTRP. In particular, such polynucleotide variants have at least about 75%, or at least about 85%, or even at least about 95% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide sequence encoding MTRP. A particular embodiment of the present invention comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34 and at least about 75
%, Or at least about 85%, or even at least about 95% polynucleotide sequence identity, including variant sequences of the polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34. Variant sequences of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of MTRP.

【００９５】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るMTRPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のMTRPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。It is noted that various polynucleotide sequences that encode MTRPs that may be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to polynucleotide sequences of any known naturally-occurring gene. Those of ordinary skill in the art will understand. Thus, the present invention may include all of the possible polynucleotide sequence variations that may be created by the selection of combinations based on possible codon choices. These combinations are based on the standard triplet genetic code applied to the naturally occurring MTRP polynucleotide sequences, and are considered to be the clear disclosure of all mutations.

【００９６】 MTRPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択されたス
トリンジェントな条件の下で、自然発生のMTRPのヌクレオチドとハイブリダイズ
可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なった
コドンの使用を有するMTRP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作
り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基
づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生
する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、
MTRP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由
は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性
を備えるRNA転写物を作ることにある。It is desirable that the nucleotide sequence encoding MTRP and its mutated sequences be able to hybridize with the nucleotides of naturally occurring MTRP under suitable selected stringent conditions, but with non-naturally occurring codons. It may be beneficial to create a nucleotide sequence that encodes MTRP or a derivative thereof with substantially different codon usage, such as inclusion. Codons can be selected based on the frequency with which a particular codon is utilized by the host to increase the rate at which peptide expression occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Without changing the encoded amino acid sequence,
Another reason to substantially alter the nucleotide sequences encoding MTRP and its derivatives is to produce RNA transcripts with favorable properties, such as longer half-life, than transcripts made from naturally occurring sequences.

【００９７】 本発明はまた、MTRP及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を
完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野
で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れ
の中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、MTRPまたはその任意の断片
をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。The invention also includes the production of DNA sequences encoding MTRP and its derivatives, or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of the various available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry may be used to introduce mutations into the sequence encoding MTRP or any fragment thereof.

【００９８】 更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:18−34及びそれらの断片とハイブリダイ
ズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼ
ーションの条件は、「定義」に記載されている。The present invention further provides a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the claimed polynucleotide sequences, in particular SEQ ID NO: 18-34 and fragments thereof, under various stringent conditions. (E.g. Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; and Kimmel. AR (1987) Methods En.
zymol. 152: 507-511.). Hybridization conditions, including annealing and wash conditions, are described in the "Definitions".

【００９９】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）
、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ）、
或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられる
ような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用い
られる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、
PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 80
0 (Perkin-Elmer) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373
或いは377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシ
ークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周
知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。Any of the embodiments of the present invention can be practiced using DNA sequencing methods well known in the art. This method includes, for example, the Klenow fragment of DNA polymerase I, SE
QUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq Polymerase (Perkin Elmer)
, Thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ),
Alternatively, enzymes such as a combination of proofreading exonuclease and polymerase as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD) are used. Preferably, MICROLAB 2200 Liquid Transfer System (Hamilton, Reno, NV),
PTC200 Thermal Cycler200 (MJ Research, Watertown MA) and ABI CATALYST 80
Automate sequence preparation using a device such as 0 (Perkin-Elmer). Then ABI 373
Alternatively, sequencing is performed using the 377 DNA Sequencing System (Perkin-Elmer), MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics. Sunnyvale CA) or other methods known in the art. The resulting sequences are analyzed using various algorithms well known in the art (e.g., Ausubel, FM (1997) Short Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, RA (1995) Molecular Biology and Biotechnology , Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.).

【０１００】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、MTRPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素な
どの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの方法で
は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター
内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Met
hods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に伸長
して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は
、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば
、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を参照）。キャプチャPCR
法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接す
るDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Ap
plic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ
−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を
挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列
を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res
. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERライ
ブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能であ
る。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エ
キソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、プ
ライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Bioscien
ces, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３
０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対
してアニーリングするよう設計される。A variety of PCR-based methods well known in the art can be used to extend the nucleic acid sequence encoding MTRP using a partial nucleotide sequence to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. To detect. For example, one method utilizing restriction site PCR is to amplify an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using common and nested primers (eg, Sarkar, G. (1993) PCR Met.
See hods Applic 2: 318-322). An alternative method using the inverse PCR method uses primers that extend in a wide range of directions and amplify unknown sequences from a circularized template. This template is derived from a restriction fragment containing known genomic loci and sequences surrounding it (see, eg, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). Capture PCR
A third method using the method involves PCR amplification of DNA fragments flanking known sequences of human and yeast artificial chromosome DNA (eg, Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Ap.
See plic 1: 111-119). This method allows digestion and ligation with multiple restriction enzymes to insert the recombinant double-stranded sequence into a region of unknown sequence prior to PCR. It is also possible to obtain the unknown sequence using other methods well known in the art. (For example, Parker, JD et al. (1991) Nucleic Acids Res
. 19: 3055-3060). Furthermore, by using PCR, nested primers, and PROMOTER FINDER library (Clontech, Palo Alto CA), walking within genomic DNA is possible. This method does not require screening the library and is useful for looking for intron / exon junctions. In all PCR-based methods, the primers are commercially available OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Bioscien
ces, Plymouth MN) or another suitable program etc.
It is designed to anneal to the template at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C with 0 nucleotides, a GC content of 50% or more.

【０１０１】 完全な長さのcDNAのスクリーニングの際は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that are size-selected to contain large cDNAs. Furthermore, if the oligo d (T) library cannot produce a full-length cDNA, a randomly primed library, which often contains a sequence having the 5'region of the gene, is useful. Genomic libraries will be useful for extension of sequences into the 5'non-transcribed regulatory regions.

【０１０２】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、Perkin-Elmer）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。Sequencing or PCR using a commercially available capillary electrophoresis system
It is possible to analyze or confirm the size of the nucleotide sequence of the product. For more information,
Capillary sequencing uses a flowable polymer for electrophoretic separation, and a laser-activated fluorochrome specific for four different nucleotides and a CCD camera used to detect emitted wavelengths. It is possible.
The output / light intensity is determined by the appropriate software (eg GENOTYPER and SEQUENCE NAVIGA
TOR, Perkin-Elmer) is used to convert to an electric signal, and the process from sample loading to computer analysis and electronic data display can be controlled by computer. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA, which may be present in small amounts in a particular sample.

【０１０３】 本発明の別の実施例では、MTRPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、適切な宿主細胞内にMTRP、その断片または機能
的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的に
同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り
、これらの配列をMTRPのクローン化及び発現に利用可能である。In another embodiment of the invention, the polynucleotide sequence encoding MTRP or a fragment thereof is used in a recombinant DNA molecule to express MTRP, a fragment thereof or a functional equivalent in a suitable host cell. Is possible. Due to the unique duplication of the genetic code, alternative DNA sequences may be produced which encode substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences, which sequences are available for MTRP cloning and expression.

【０１０４】 種々の目的でMTRPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオ
チド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方
向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコ
シル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可
能である。The nucleotide sequences of the invention can be recombined using methods generally known in the art to alter the MTRP coding sequence for a variety of purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using DNA mixing with random fragments or PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, oligonucleotide-mediated directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.

【０１０５】 別の実施例によれば、MTRPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてMTRP自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ
（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にMTRPのアミノ酸配列または任意のそ
の一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタン
パク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプ
チドを作ることが可能である。According to another embodiment, the MTRP-encoding sequence may be wholly or partially synthesized using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH et al. (1980)).
) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser. 225-232). Alternatively, chemical methods can be used to synthesize MTRP itself or fragments thereof. For example, peptide synthesis can be performed using a variety of solid phase techniques (eg, Roberge, JY et al. (1995) Science 269:
See 202-204). Alternatively, automation of synthesis may be achieved using, for example, the ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Further, the amino acid sequence of MTRP, or any portion thereof, may be modified by direct synthetic alterations and / or combinations with sequences from other proteins or any portion thereof using chemical methods. It is possible to make a polypeptide.

【０１０６】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei ns, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NYを参照)
。This peptide is used for preparative high performance liquid chromatography (eg, Chiez, RM).
And FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421)). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see, for example, Creighton. T. (1983) Proteins , Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NY).
.

【０１０７】 生物学的に活性なMTRPを発現させるために、MTRPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含
む。これらの要素には、ベクター及びMTRPをコードするポリヌクレオチド配列に
おけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻
訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様
々である。特定の開始シグナルによって、MTRPをコードする配列のより効果的な
翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン
及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。MTRPをコードする配列及びその
開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる
転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、
コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければ
ならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから
得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含
めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (19
94) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。To express biologically active MTRP, the nucleotide sequence encoding MTRP or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the elements necessary for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted into a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and expression-inducible promoters, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions in the vector and the polynucleotide sequence encoding MTRP. Such elements vary in length and specificity. A particular initiation signal makes it possible to achieve more efficient translation of the MTRP coding sequence. Such signals include the ATG initiation codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding MTRP and its initiation codon, upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be required. However,
In-frame AT if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted
Exogenous translational control signals, including the G start codon, must be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be obtained from a variety of natural and synthetic sources. The efficiency of expression can be increased by the inclusion of enhancers suitable for the particular host cell system used. (For example, Scharf, D. et al. (19
94) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162.).

【０１０８】 当業者に周知の方法を用いて、MTRPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。(
例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及び
Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wi
ley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。Methods which are well known to those skilled in the art can be used to produce expression vectors containing sequences encoding MTRP and suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods include in vitro recombinant DNA technology, synthetic technology, and in vivo gene recombination technology. (
For example, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; and
Ausubel, FM et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wi
ley & Sons, New York NY, ch. 9 and 13-1-4).

【０１０９】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、MTRPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミド）
で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用され
る宿主細胞によって限定されるものではない。A variety of expression vector / host systems may be utilized to retain and express sequences encoding MTRP. These include, but are not limited to, microorganisms such as recombinant bacteriophage, plasmids, or bacteria transformed with cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors. (Eg baculovirus) infected insect cell lines, viral expression vectors (eg cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or bacterial expression vectors (eg Ti or pBR322 plasmids).
Plant cell lines transformed with, and animal cell lines. The present invention is not limited by the host cell used.

【０１１０】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、MTRPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、MTRPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にMTRPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺
伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば
、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を
参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のMTRPが必要な場合は、MTRPの発
現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発す
るT5またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for the polynucleotide sequence encoding MTRP. For example, routine cloning, subcloning of a polynucleotide sequence encoding MTRP,
PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (G
A multifunctional E. coli vector such as IBCO BRL) can be used. Ligation of the MTRP-encoding sequence at multiple cloning sites in the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method for identification of transformed bacteria containing recombinant molecules. In addition, these vectors can be used to generate in vitro transcription of cloned sequences, dideoxin screening, single chain rescue by helper phage, and nested deletions. (See, for example, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.). For example, when a large amount of MTRP is required for antibody production, a vector which induces MTRP expression at a high level can be used. For example, a vector containing a strongly inducible T5 or T7 bacteriophage promoter can be used.

【０１１１】 MTRPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods
Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.
を参照) 植物系もMTRPの発現に使用可能である。MTRPをコードする配列の転写は、例え
ば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、
或いはTMV（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー
配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは
病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である
。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）Mc
Graw Hill NY, pp.191-196を参照）。It is possible to use yeast expression systems for the expression of MTRP. Various vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase and PGH promoter can be used for yeast Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris . Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention within the cell, integrating foreign sequences into the host genome for stable growth. (For example, Ausubel .; and Bitter, GA et al. (1987) Methods above.
Enzymol. 153: 51-794: Scorer. CA et al. (1994) Bio / Technology 121-181-184.
Plant systems can also be used to express MTRP. Transcription of the sequence encoding MTRP is, for example, a viral promoter such as CaMV-derived 35S and 19S promoters alone,
Alternatively, it is promoted in combination with an omega leader sequence derived from TMV (Takamatsu, N. et al. (1987) EMBO J 6: 307-311). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. (For example, The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) Mc
See Graw Hill NY, pp.191-196).

【０１１２】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にMTRPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にMTRPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いること
が可能である。In mammalian cells, a variety of virus-based expression systems may be utilized. When adenovirus is used as an expression vector, the MTRP coding sequence may be linked to an adenovirus transcript / translation complex consisting of a late promoter and a triple leader sequence. Insertion into the nonessential E1 or E3 region of the viral genome makes it possible to obtain a live virus expressing MTRP in infected host cells (Logan, J.
And Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers, such as the Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer, can be used to increase expression in mammalian host cells. For high level expression of proteins, SV40 or EBV based vectors can be used.

【０１１３】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。Human artificial chromosomes (HACs) can be used to supply fragments of DNA that are larger than those expressed on a plasmid and contained therein. HACs of about 6kb-10Mb for treatment
Are prepared and delivered by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (For example, Harrington.JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 3.
45-355.).

【０１１４】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるMTRPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、MTRPをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。For long-term production of recombinant proteins in mammalian systems, stable expression of MTRP in cell lines is desirable. For example, the expression vector can be used to transform a cell line with a sequence encoding MTRP. Such expression vectors contain replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells are grown in enriched medium for about 1-2 days before being transferred to selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to selective mediators, and its presence allows growth and recovery of cells which successfully express the introduced sequences. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques suitable for that cell type.

【０１１５】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk⁻又はapr⁻細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cMTRPsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clon
tech）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質ル
シフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Clon
tech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォ
ーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定
したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（19
95）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照）。[0115] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. The selection systems include, but are not limited to, include herpes simplex virus thymidine kinase gene and adenine phosphoribosyltransferase genes, respectively tk ^- or apr ^- used in the cell. (For example, Wigler, M. et al. (1
977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, and als or pat confers resistance to chlorsulfuron (cMTRPsulfuron) and phosphinotricin acetyltransferase (eg, phosphinotricin acetyltransferase). , Wigl
er, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; Colbere-Garapin,
F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Further genes available for selection have been described in the literature, eg trpB and hisD which alter what the cell needs for metabolism (eg Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.
. Sci. 85: 8047-51). Anitocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clon
tech), β-glucuronidase and its substrate GUS, luciferase and its substrate luciferin and other visible markers are used. Green fluorescent protein (GFP) (Clon
tech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers can be used not only to identify transformants, but also to quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (eg, Rhodes, CA et al. (19
95) Methods Mol. Biol. 55: 121-791).

【０１１６】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、MTRPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、MTRPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がMTRPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。Even if the presence / absence of expression of a marker gene indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if the MTRP coding sequence is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing the MTRP coding sequence can be identified by a lack of marker gene function.
Alternatively, the marker gene can be placed in tandem with the MTRP-encoding sequence under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.

【０１１７】 一般に、MTRPをコードする核酸配列を含み、MTRPを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。In general, a host cell containing a nucleic acid sequence encoding MTRP and expressing MTRP can be identified using a variety of methods well known to those of skill in the art. These methods include
Protein biological tests or immunological methods including DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR methods, membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for detection and / or quantification of nucleic acids or proteins. Assay included,
It is not limited to these.

【０１１８】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるMT
RPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。MTRP上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (
1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。MT with either specific polyclonal or monoclonal antibodies
Immunological methods for detecting and measuring the expression of RP are well known in the art. Such techniques include enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), fluorescence activated cell sorters (FACS) and the like. Two-site, monoclonal-based immunoassay using a monoclonal antibody that reacts with two non-interfering epitopes on MTRP
Is preferred, but competitive binding assays can also be used. These and other assays are well known in the art. (For example, Hampton. R
Et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
MN, Sect. IV; Coligan, JE et al Current Protocols in Immunology , Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; and Pound, JD (
1990) Immunochemical Protocols , Humans Press, Totowa NJ).

【０１１９】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。MTRPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、MTRPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。Various labeling and conjugation methods are well known to those of skill in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for producing labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences associated with a polynucleotide encoding MTRP include oligo-labeling, nick-translation, end-labeling, or labeled nucleotides. Includes the PCR amplification used. Alternatively, the MTRP coding sequence, or any fragment thereof, can be cloned into a vector to generate an mRNA probe. Such vectors, which are well known in the art and are commercially available, can be used for the synthesis of RNA probes in vitro by the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3, or SP6 and labeled nucleotides. . These methods are described, for example, in Amersham Pharmac
ia Biotech and Promega (Madison WI), US Biochemical Corp (Cleveland OH
) Can be used with various kits commercially available. Suitable reporter molecules or labels that can be used for easy detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents and the like.

【０１２０】 MTRPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用され
るその配列及び／またはそのベクターによる。MTRPをコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するMTRPの分泌を誘
導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding MTRP are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of this protein in cell culture. Whether the protein produced by a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence and / or the vector used. It will be understood by those skilled in the art that the expression vector containing the polynucleotide encoding MTRP can be designed to contain a signal sequence that induces the secretion of MTRP that penetrates the prokaryotic cell membrane and the eukaryotic cell membrane.

【０１２１】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」または「pro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利
用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能で
ある。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿
主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture C
ollection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正
しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。In addition, a host cell strain may be chosen for its ability to regulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Modifications of such polypeptides include acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation (
lipidation), and acylation, but is not limited thereto.
Post-translational processing which cleaves a "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify target proteins, folds and / or activities. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38) with specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity are available in the American Type Culture C
Ollection (ATCC; Bethesda, MD) and is selected to ensure correct modification and processing of foreign proteins.

【０１２２】 本発明の別の実施例では、MTRPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラMT
RPタンパク質が、MTRPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質
（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−Hi
s、FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マ
ルトース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、
金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG
、c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的
に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タン
パク質の免疫親和性の精製ができる。また、MTRPをコードする配列と異種タンパ
ク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺
伝子操作すると、MTRPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質
の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販
されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる
。In another embodiment of the invention, the natural or modified or recombinant nucleic acid sequence encoding MTRP is linked to a heterologous sequence which results in translation of the fusion protein of any of the host systems described above. For example, a chimeric MT containing a heterologous moiety that can be recognized by a commercially available antibody.
The RP protein may facilitate the screening of peptide libraries for inhibitors of MTRP activity. In addition, the heterologous protein portion and the heterologous peptide portion are
Commercially available affinity substrates can be used to facilitate purification of the fusion protein. Such parts include glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-Hi.
s, FLAG, c-mc, hemagglutinin (HA), but are not limited thereto. GST and MBP, Trx, CBP, 6-His immobilized glutathione, maltose, phenylarsine oxide, calmodulin,
Each of the metal chelate resins allows purification of the cognate fusion protein. FLAG
, C-mc, and hemagglutinin (HA) allow purification of the immunoaffinity of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, MTRP can be cleaved from the heterologous moiety after purification by genetically engineering such that the fusion protein contains a proteolytic cleavage site between the MTRP coding sequence and the heterologous protein sequence. Methods for expressing and purifying fusion proteins are described in Ausubel. (1995, supra ch 10). A variety of commercially available kits can be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.

【０１２３】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したMTRPの合成が可能である。こ
れらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコ
ードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、^３５Ｓメチオニンであ
る放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。In another embodiment of the invention, it is possible to synthesize radiolabeled MTRP in vitro using the TNT rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extraction system (Promega). These systems connect transcription and translation of sequences encoding proteins that are operably linked to the T7 or T3, SP6 promoters. Translation occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor, which is, for example, ³⁵ S methionine.

【０１２４】 MTRPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペプチ
ドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。MTRPの種々の
断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。Fragments of MTRP can be produced by direct peptide synthesis using solid phase techniques as well as recombinant products (see, eg, Creighton, pp. 55-60. Supra). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automated synthesis can be performed using, for example, a 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Various fragments of MTRP are synthesized separately and then combined to produce the full length molecule.

【０１２５】 （治療） MTRPのある領域と膜輸送タンパク質のある領域との間に、例えば配列及びモチ
ーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。この輸送タンパク質に
は、アミノ酸輸送体、ABC輸送体、ヌクレオチド-糖輸送体、膜貫通担体タンパク
質、及びATP依存性輸送体タンパク質が含まれる。更に、MTRPの発現は、神経組
織、生殖組織及び胃腸組織、癌及びその他の細胞増殖の症状、炎症反応及び免疫
応答と密接な関係がある。従って、MTRPは、膜輸送障害、免疫異常症／炎症性疾
患、及び癌を含む細胞増殖異常症においてある役割を果たすと考えられる。MTRP
の発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、MTRPの発現または活
性を低下させることが望ましい。また、MTRPの発現または活性の低下に関連する
疾患の治療においては、MTRPの発現または活性を増大させることが望ましい。Treatment There are chemical and structural similarities between certain regions of MTRPs and certain regions of membrane transport proteins, eg in the context of sequences and motifs. The transport proteins include amino acid transporters, ABC transporters, nucleotide-sugar transporters, transmembrane carrier proteins, and ATP-dependent transporter proteins. Furthermore, the expression of MTRP is closely associated with neural tissue, reproductive and gastrointestinal tissue, cancer and other cell proliferative conditions, inflammatory and immune responses. Thus, MTRPs are thought to play a role in membrane trafficking disorders, immune disorders / inflammatory diseases, and cell proliferative disorders including cancer. MTRP
In treating diseases associated with increased expression or activity of MTRP, it is desirable to reduce the expression or activity of MTRP. Further, in treating a disease associated with a decrease in the expression or activity of MTRP, it is desirable to increase the expression or activity of MTRP.

【０１２６】 従って、一実施例において、MTRPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にMTRPまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、膜輸送障害が含
まれ、その中にはシスチン尿症、２塩基性アミノ酸尿症、高シスチン尿症（hype
rcystinuria）、リシン尿症、ハートナップ病、トリプトファン吸収不全症、メ
チオニン吸収不全症、ヒスチジン尿症、イミノグリシン尿症、ジカルボン酸アミ
ノ酸尿症（dicarboxylicaminoaciduria）、シスチン症、腎性糖尿病、グルコー
ス‐ガラクトース吸収不全症、家族性高コレステロール血症、低尿酸血症、家族
性低リン酸血症性くる病、congenital chloridorrhea、嚢胞性線維症、家族性甲
状腺腫、遠位尿細管性アシドーシス、メンケス病、致死性下痢症、腎原発性尿崩
症、若年性悪性貧血、葉酸吸収不全症、副腎白質ジストロトフィー、遺伝性ミオ
グロビン尿症、ツェルヴェーガー症候群、インスリン過剰血性低血糖症、運動不
能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、ベッカー筋ジストロフィ
ー、顔面麻痺、シャルコー‐マリー‐ツース病、糖尿病、尿崩症、糖尿病性ニュ
ーロパシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、高カリウム血性周期性四肢麻痺
、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性高熱、多剤耐性、重
症筋無力症、筋緊張性異栄養症、緊張病、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニ
ー、末梢神経疾患、脳性腫瘍、前立腺癌と、口峡炎、徐脈型不整脈、頻拍性型不
整脈、高血圧症、遺伝性QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシーラ
ネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシ
ー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、
感染性節炎、及び多発性筋炎などの輸送に関連した心臓病と、アルツハイマー病
、健忘症、双極性障害、痴呆、うつ病、てんかん、トゥーレット病、妄想性精神
病、及び***病などの輸送に関連した神経障害と、神経線維腫症、帯状疱疹後神
経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイドーシス、鎌状赤血球性貧血、ウィル
ソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、常染色体性感音性難聴、高血糖症、低
血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、副腎機能不全、グルコース‐
ガラクトース吸収不良症候群、及び高コレステロール血症などの輸送に関連した
ほかの疾患が含まれ、また、免疫異常症／炎症性疾患も含まれ、その中には後天
性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー
、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免
疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚
葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アト
ピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少
症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群
、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多
発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎
、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレ
ン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、
血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循
環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症
、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常症も含まれ、その中には日
光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織
病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原
発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及
び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、頚部、胆嚢、神経節
、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺
、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。Accordingly, in one embodiment, MTRP or a fragment or derivative thereof can be administered to a patient for the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of MTRP. Non-limiting examples of such diseases include impaired membrane trafficking, including cystinuria, dibasic amino aciduria, hypercystinuria.
rcystinuria), ricinuria, heart nap disease, tryptophan malabsorption, methionine malabsorption, histidineuria, iminoglycineuria, dicarboxylicaminoaciduria, cystinosis, renal diabetes, glucose-galactose absorption Deficiency, familial hypercholesterolemia, hypouricemia, familial hypophosphatemic rickets, congenital chloridorrhea, cystic fibrosis, familial goiter, distal tubular acidosis, Menkes disease, lethal Diarrhea, primary renal insipidus, juvenile pernicious anemia, folate malabsorption, adrenoleukodystrophy, hereditary myoglobinuria, Zellweger syndrome, hyperinsulinemia of hypoglycemia, akinesia, muscle atrophy Lateral sclerosis, ataxia-telangiectasia, Becker muscular dystrophy, facial paralysis, Charcot-Marie-Tooth , Diabetes, diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy, hyperkalemic periodic quadriplegia, normokalemic periodic quadriplegia, Parkinson's disease, malignant hyperthermia, multidrug resistance, myasthenia gravis, myotonic dystrophy Nutrition, catatonic disease, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, peripheral nerve disease, cerebral tumor, prostate cancer and goutitis, bradyarrhythmia, tachyarrhythmia, hypertension, prolonged QT syndrome , Myocarditis, cardiomyopathy, nemalin myopathy lanemarin myopathy, central myopathy, lipid myopathy, mitochondrial myopathy, thyrotoxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis,
Transport-related heart disease such as infectious adenitis and polymyositis, and transport of Alzheimer's disease, amnesia, bipolar disorder, dementia, depression, epilepsy, Tourette's disease, delusional psychosis, and schizophrenia -Related neuropathy, neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, Wilson disease, cataract, infertility, pulmonary stenosis, autosomal sensorineural hearing loss, high Glycemia, hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease, adrenal insufficiency, glucose-
It also includes galactose malabsorption syndromes and other transport-related diseases such as hypercholesterolemia, and also immunodeficiency / inflammatory disorders, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal glands. Dysfunction, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidiasis Ectoderm dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphotoxin-induced transient lymphopenia, erythroblastosis, nodular Erythema, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis , Myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjögren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis Illness,
Thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, and viral and bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma , And also cell proliferation disorders, including actinic keratoses and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), bone marrow fibres. , Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically the adrenal gland, bladder , Bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, Includes cancer of the uterus.

【０１２７】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むMTRPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MTRPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。In another embodiment, MTRP or a fragment or derivative thereof is expressed for the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of MTRP, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the resulting vector to a patient.

【０１２８】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むMTRPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたMTRPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。In yet another embodiment, substantially purified MTRP is used for the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of MTRP, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the pharmaceutical composition containing it to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.

【０１２９】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むMTRPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MTRPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。In yet another embodiment, an agonist that modulates MTRP activity is provided for the treatment or prevention of diseases associated with decreased MTRP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer to a patient.

【０１３０】 更なる実施例では、MTRPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にMTRPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定
するものではないが、このような疾患の例には、上述した膜輸送障害、免疫異常
症／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常症が含まれる。一実施態様では、MT
RPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはMTRPを発現する
細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用
いられ得る。In a further example, an MTRP antagonist can be administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with increased MTRP expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, membrane trafficking disorders, immune disorders / inflammatory disorders, and cell proliferative disorders, including cancer, as described above. In one embodiment, MT
Antibodies that specifically bind RP can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver the drug to cells or tissues that express MTRP.

【０１３１】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むMTRPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、MTRPをコードする
ポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能であ
る。In another embodiment, the complement of a polynucleotide encoding MTRP for the treatment or prevention of diseases associated with increased expression or activity of MTRP, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer a vector that expresses

【０１３２】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。In another example, any protein, antagonist, antibody, agonist, complementary sequence, vector of the invention can be administered in combination with another suitable therapeutic agent. One of ordinary skill in the art can select suitable therapeutic agents for use in the combination therapy according to conventional pharmaceutical principles. The combination with therapeutic agents may bring about a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases listed above. Using this method, it is possible to obtain a medicinal effect with a small amount of each drug, and it is possible to reduce the possibility of a wide range of side effects.

【０１３３】 MTRPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたMTRPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてMTRPと特異的に結合するものを同定が可能である。MTRP
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含ま
れる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、
二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。MTRP antagonists can be prepared using methods conventional in the art. Specifically, purified MTRP can be used to produce antibodies, or a library of therapeutic agents can be screened to identify those that specifically bind to MTRP. MTRP
Antibodies can also be produced using a method generally used in this field. Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chains,
Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries are included. However, it is not limited to these. For treatment, neutralizing antibodies (ie,
Those which inhibit the formation of dimers) are particularly preferred.

【０１３４】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、MTRPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are injected with MTRP or any fragment, or oligopeptide thereof with immunogenic properties. Can be immunized with. Depending on the host species, various adjuvants may be used to enhance the immune response. Such adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and surfactants such as dinitrophenol. However, it is not limited thereto. Among the adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferable.

【０１３５】 MTRPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には約１０以上のアミ
ノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、または
それらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望
ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。MTRPアミノ酸の短い伸
展部は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が
産生され得る。Oligopeptides, peptides or fragments used to elicit antibodies against MTRP are preferably composed of at least about 5 amino acids, generally about 10 or more amino acids. These oligopeptides or peptides, or fragments thereof, are preferably identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and also include the entire amino acid sequence of small naturally occurring molecules. Short stretches of MTRP amino acids can be fused with sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies to the chimeric molecule.

【０１３６】 MTRPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。Monoclonal antibodies against MTRP can be produced by any cell line in culture, using any technique which produces antibody molecules. These techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler,
G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. (1985) .J. Immunol. Met.
hods 81-8-42; Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030.
Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).

【０１３７】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:6
04-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分
野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して
、MTRP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタ
イプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖
混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。In addition, techniques such as splicing the mouse antibody gene to the human antibody gene developed for the production of “chimeric antibodies” can be used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity. (For example, Morrison, SL et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81-4851-4855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 6.
04-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452,454). Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies are applied using methods well known in the art to produce MTRP-specific single chain antibodies. Antibodies with related specificities but of different idiotype composition can also be generated by chain mixing from random combinatorial immunoglobulin libraries (e.g., Burton DR (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. 88: 11120-3).

【０１３８】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。Antibodies can be induced by in vivo production in a population of lymphocytes, or by screening immunoglobulin libraries or a panel of highly specific binding reagents, as shown in the literature. (See, for example, Orlando, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833.
-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).

【０１３９】 MTRPに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断
片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab
断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照）。Antibodies containing specific binding sites for MTRP can also be produced. For example,
Such fragments include F (ab ') fragments produced by pepsin digestion of antibody molecules and Fabs produced by reducing the disulfide bridges of the fragments to F (ab').
Fragments are included, but are not limited to. Alternatively, generating a Fab expression library allows for rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (eg, Huse, WD et al. (1989) Science 254: 12.
See 75-1281).

【０１４０】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、MTRP
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性MTRPエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出)。Various immunoassays are used to screen to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, or immunoradioactivity, using either polyclonal or monoclonal antibodies with isolated specificity are well known in the art. MTRP is usually used for such immunoassays.
Included is the measurement of complex regulation between the antibody and its specific antibody. Two-site monoclonal-based immunoassays are generally used with monoclonal antibodies reactive to two non-interfering MTRP epitopes, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).

【０１４１】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、M
TRP抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状
態の下でMTRP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったも
のである。多数のMTRPエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体
試薬の測定値Ｋａは、MTRP抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のMTRP
エピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定
値を表す。Ka値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、MTRP抗体
複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好まし
い。Ka値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、MTRPが抗体から最
終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類
似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer,
A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons
, New York NY)。Using various methods such as Scatchard analysis in conjunction with radioimmunoassay techniques, M
Assess the affinity of the TRP antibody. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the molar concentration of MTRP antibody complex divided by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The measured value Ka of the polyclonal antibody reagent having a heterogeneous affinity for many MTRP epitopes represents the average affinity or binding activity of the MTRP antibody. Specific MTRP
The Ka of the monoclonal antibody reagent monospecific for the epitope represents a true measure of affinity. High affinity antibody reagents with Ka values of 10 ⁹ to 10 ¹² L / mol are preferably used in immunoassays in which the MTRP antibody complex must withstand vigorous manipulation. The low affinity antibody reagent having a Ka value of 10 ⁶ to 10 ⁷ L / mol is preferably used for immunopurification and similar treatments in which MTRP must be finally dissociated from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach .IRL Press, Washington, DC; Liddell, JE and Cryer,
A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies , John Wiley & Sons
, New York NY).

【０１４２】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、ある下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも１〜
２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を
含むポリクロナール抗体試薬は一般に、MTRP抗体複合体を沈殿させなければなら
ない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活
性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Catty, 前出
, 及びColigan 他、前出を参照)。The antibody titer and avidity of the polyclonal antibody reagents are further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain downstream applications. For example, at least 1
Polyclonal antibody reagents containing 2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used for treatments in which the MTRP antibody complex must be precipitated. Specificity of antibodies and antibody titer, binding activity, quality of antibodies and guidelines for usage in various applications are publicly available. (Eg Catty, supra
, And Coligan et al., Supra).

【０１４３】 本発明の別の実施例では、MTRPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、MTRPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに
好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、MTRPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相
補的分子または断片は、MTRPの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使
用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、MTRPをコードする配列の制
御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding MTRP, or any fragment or complementary sequence thereof, can be used for therapeutic purposes. In certain embodiments, if the complementary sequence of a polynucleotide encoding MTRP is suitable for blocking transcription of mRNA, it can be used. In particular, cells can also be transformed with sequences complementary to the polynucleotide encoding MTRP. Thus, the complementary molecule or fragment can be used to regulate the activity of MTRP or the regulation of gene function. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the sequence encoding MTRP or at various positions along the coding region.

【０１４４】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてMTRPをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia, or various bacterial plasmids can also be used to deliver the nucleotide sequence to the target organ, tissue or cell population. Methods which are well known to those skilled in the art can be used to produce vectors expressing nucleic acid sequences complementary to MTRP-encoding polynucleotides (see, eg, Sambrook et al., Supra, and Ausubel et al., Supra). .

【０１４５】 MTRPをコードする遺伝子は、MTRPをコードするポリヌクレオチド又はその断片
を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによ
って止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はア
ンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入れられな
い場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわ
れるまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以
上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持
続し得る。The gene encoding MTRP can be stopped by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses high levels of a polynucleotide encoding MTRP or a fragment thereof. Such constructs can be used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Even when not integrated into DNA, such vectors continue to transcribe mRNA molecules until impaired by endogenous nucleases. Non-replicating vectors also have transient expression that lasts for a month or more, and may last even longer if suitable replication elements are part of the vector system.

【０１４６】 上記した通り、遺伝子の発現は、MTRPをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA或いはRNA、PNA）を
設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−１０から
約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが可能
である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最近
の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Hub
er, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Pu
blishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子
もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を
阻止するように設計できる。As described above, gene expression can be regulated by designing a sequence complementary to the regulatory 5 ′ or regulatory region of the gene encoding MTRP or an antisense molecule (DNA or RNA, PNA). . For example, it is possible to use an oligonucleotide derived from the transcription start site from about -10 to about +10 from the start site. Similarly, it can be blocked using "triple helix" and base pairing methods.
The triple helix structure is useful because it prevents the double helix from expanding sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules. Recent therapeutic advances with triplex DNA have been described in the literature (eg Gee, JE et al. (1994) In: Hub.
er, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futura Pu
See blishing Co., Mt. Kisco, NY). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of mRNA by blocking the binding of transcripts to ribosomes.

【０１４７】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、MTRPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。Ribozymes, enzymatic RNA molecules, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand scission.
For example, recombinant hammerhead ribozyme molecules that specifically and effectively catalyze nucleotide strand scissions in sequences encoding MTRP are included.

【０１４８】 任意の潜在的RNA標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵ
Ａ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャ
ニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む
標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配
列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価
することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテ
ストすることによって評価することが可能である。A specific ribozyme cleavage site in any potential RNA target is followed by the sequence GU
Initially identified by scanning the target molecule against ribozyme cleavage sites including A, GUU, and GUC. Once identified, a short RNA sequence of 15 to 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site is evaluated for secondary structural features that impair the function of the oligonucleotide. Is possible. The suitability of candidate targets can also be assessed by testing their ease of hybridization with complementary oligonucleotides using a ribonuclease protection assay.

【０１４９】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでMTRPをコードするDNA配列の
転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポ
リメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能で
ある。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作
製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made for the synthesis of nucleic acid molecules using methods well known in the art. These methods include methods of chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, RNA molecules can be generated in vitro and in vivo by transcription of a DNA sequence encoding MTRP, such DNA sequences using various RNA polymerase promoters, such as T7 or SP6, for the expression of various vectors. Can be incorporated into. Alternatively, these cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells, or tissues.

【０１５０】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。Modification of RNA molecules can increase intracellular stability and prolong half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5'and / or 3'ends of the molecule, or the use of phosphorothionate or 2'O methyl rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. , Are not limited to these. Unique to PNA production, this concept is that adenine, cytidine, guanine, thymine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases,
And the acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of uridine, as well as the inclusion of non-conventional bases such as inosine, queosine, and wybutosine, in whole of these molecules. Can be expanded to.

【０１５１】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。[0151] vectors available are a number of ways of introducing into a cell or tissue, in vivo, are equally suitable for use in in vitr o, and ex vivo. For ex vivo treatment, the vector is introduced into hepatocytes taken from a patient and cloned and propagated for autologous transplant back into the same patient. Transfection, ribosome injection or delivery by polycationic aminopolymers can be performed using methods well known in the art (eg Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462.
-66 :).

【０１５２】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。Any of the above methods of treatment can be applied to any subject in need of treatment including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits and monkeys.

【０１５３】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、MTRP、MTRPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はMTRPの
インヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類
以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。
このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが
含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又
はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。Another embodiment of the present invention relates to the administration of a pharmaceutical or sterile composition together with a pharmaceutically acceptable carrier for all of the above mentioned therapeutic effects. Such a pharmaceutical composition comprises MTRP, an antibody against MTRP, a mimetic, an agonist, an antagonist, an inhibitor of MTRP, or the like. The composition can be administered alone or with one or more additional agents such as stabilizers to a sterile biocompatible pharmaceutical carrier.
Such pharmaceutical carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water and the like. This composition can be administered alone or with another agent such as a drug or hormone.

【０１５４】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。The pharmaceutical compositions used in the present invention can also be administered using any number of routes. This route includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, ectopic, sublingual, It also includes, but is not limited to, the rectum.

【０１５５】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。In addition to active ingredients, these pharmaceutical compositions may contain suitable pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants that facilitate the formulation of the active compounds into pharmaceutically usable agents. The carrier may be included. Detailed techniques for formulation and administration are described in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA).

【０１５６】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。Pharmaceutical compositions for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosages suitable for oral administration. Such carriers allow tablets, pills, dragees, capsules, and pharmaceutical compositions to be ingested by patients.
It is formulated as a liquid, gel, syrup, mud, or suspension.

【０１５７】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。Medicaments for oral use include tablets or dragee cores (after grinding if desired) by mixing the active compound with solid drug additives and treating the resulting granule mixture. cores). Suitable excipients include lactose, sucrose, mannitol, or sugars including sorbitol, starch from corn, wheat, rice, potato, or other plants, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, or cellulose such as sodium carboxymethylcellulose, Gum, including gum arabic and gum tragacanth, carbohydrates or protein excipients such as proteins such as gelatin and collagen.
If desired, a disintegrant or solubilizer such as cross-linked polyvinylpyrrolidone, kanten, alginic acid, or its salt sodium alginate is added.

【０１５８】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。Dragee cores are used with suitable coatings, such as concentrated sugar solutions. Such concentrated sugar solvents may include gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel, polyethylene glycol, and / or titanium dioxide, lacquer solvents, and suitable organic or mixed solvents. Dyestuffs or pigments are added to the tablets or dragee coatings for identification of the product or to indicate the quantity of active compound, ie the dose.

【０１５９】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。Pharmaceutical formulations for oral use include push-fit capsules made of gelatin, encapsulated capsules made of gelatin with a coating such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules contain the active ingredient in admixture with excipients or binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and, if desired, stabilizers. In soft capsules, the active compound, with or without stabilizer,
It may be dissolved or suspended in a suitable solution such as a fatty oil, solution, or polyethylene glycol solution.

【０１６０】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。Pharmaceutical agents suitable for parenteral administration are formulated in aqueous solution, but physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution and physiological buffered saline are preferred. Aqueous suspension injections may contain substances which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active compounds may be formulated as suitable oily injection suspensions. Suitable hydrophilic solutions or vehicles include fatty oils such as sesame oil, ethyl oleate, triglycerides or synthetic fatty acids such as ribosomes. Non-lipid polycationic amino polymers are used for delivery purposes. Optionally, the suspension may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds to allow for concentrated solutions.

【０１６１】 局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。For local or nasal administration, suitable penetrants that penetrate certain barriers are used in the formulation. Such penetrants are well known to those of ordinary skill in the art.

【０１６２】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared using methods well known in the art, such as conventional mixing, dissolving, granulating, sugar coating, elevating, emulsifying, encapsulating, encapsulating, or lyophilizing processes. Can be manufactured.

【０１６３】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬
剤の形態には、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び
２％〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．
５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。Pharmaceutical compositions are formulated as salts and can be formed with many acids including but not limited to hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid. Salts are more soluble in water or other protic solvents than are the corresponding free base systems. Another drug form comprises some or all of 1 mM to 50 mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, and 2% to 7% mannitol, with a pH range of 4.5-5.
5, a lyophilized powder that is buffered prior to use can be used.

【０１６４】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。MTRPの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。After the pharmaceutical compositions have been prepared, they are packaged in suitable boxes and labeled as medication for the indicated symptoms. For administration of MTRP, such labels will include amount, frequency and mode of administration.

【０１６５】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。Suitable pharmaceutical compositions for use in the present invention include compositions which contain an effective amount of active ingredients to achieve the objectives. Those of ordinary skill in the art can determine a dose that is sufficiently effective based on their ability.

【０１６６】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。For any composition, the therapeutically effective dose can be estimated initially either in tumor cell assays, eg, of tumor cells, or in animal models. Usually, a mouse, a rabbit, a dog, a pig, or the like is used as the animal model. Animal models can also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Based on such treatment, a beneficial dose and administration route for human can be determined.

【０１６７】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばMTRP又はその
断片、MTRPの抗体、MTRPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED_５０（服
用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはLD_５０（服用に対して集団
の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験におけ
る標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬
用量比は治療指数であり、LD_５０／ED_５０と示すことができる。高い治療指数を
示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデー
タが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このよ
うな組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED_５０を含む血
中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の
感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。A pharmaceutically effective dose is related to the amount of active ingredients, such as MTRP or fragments thereof, MTRP antibodies, MTRP agonists or antagonists, inhibitors, etc. that ameliorates the symptoms or condition. Medicinal efficacy and toxicity can be calculated, for example, by calculating the ED ₅₀ (50% of the population has a medicinal effect on dose) or LD ₅₀ (50% of the population is fatal on dose) statistics. , Can be determined by standard drug techniques in cell culture or animal studies. Dosage ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as LD _{50 /} ED _50. Pharmaceutical compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from cell culture assays and animal studies are used in formulating a range of dosage for human application. The dosage contained in such compositions is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED ₅₀ with little or no toxicity. The dosage will vary within this range depending upon the dosage form employed, the patient sensitivity, and the route of administration.

【０１６８】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the patient that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Dosage factors considered include disease severity, general health of the patient, age, weight and sex of the patient, time and frequency of administration, concomitant medications, response susceptibility, and treatment. Contains the response. Long-acting pharmaceutical compositions may be administered every three or four days, once a week, once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.

【０１６９】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。The usual dose varies depending on the route of administration, but is about 0.1-100,000 μg.
Up to about 1 gram. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to practitioners in the art. Those skilled in the art will utilize formulations of nucleotides that are different than the protein or inhibitor. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide is
It will be specific to a particular cell, condition, location, etc.

【０１７０】 （診断） 別の実施例では、MTRPに特異的に結合する抗体が、MTRPの発現によって特徴付
けられる疾患の診断、またはMTRPやMTRPのアゴニストまたはアンタゴニスト、イ
ンヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる
。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。
MTRPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織か
ら採取されたものからMTRPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾を
して或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性
の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いら
れるが、その内の幾つかは上記した。Diagnosis In another embodiment, a patient who is diagnosed with a disease in which an antibody that specifically binds MTRP is characterized by the expression of MTRP, or is treated with MTRP or an agonist or antagonist of MTRP, an inhibitor. Used in an assay to monitor Antibodies useful for diagnosis are formulated in the same manner as described in treatment.
MTRP diagnostic assays include methods of detecting MTRP from human body fluids or from cells or tissues using antibodies and labels. These antibodies, used with or without modification, can be labeled by covalent or non-covalent attachment of reporter molecules. Various reporter molecules known in the art are used, some of which have been mentioned above.

【０１７１】 MTRPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのMTRPの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なMTRPの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または
細胞とMTRPに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体
形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量され得る。被験者
のMTRPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較され
る。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。Various protocols for measuring MTRP, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide the basis for diagnosing altered or aberrant levels of MTRP expression. The value of expression of normal or standard MTRP is determined by binding a body fluid or cell collected from a subject such as a normal mammal, for example, a human, with an antibody against MTRP under conditions suitable for complex formation. To do. The amount of canonical complex formation can be quantified by various methods such as photometric. The amount of MTRP expression, control and disease in the subject, samples from biopsy tissue are compared to standard values. The deviation between the standard value and the subject is the parameter for diagnosing the disease.

【０１７２】 別の実施例によれば、MTRPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて
、疾患と相関し得るMTRPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量
する。この診断アッセイを用いて、MTRPの不在、存在、及び過度の発現を調べ、
治療中のMTRPレベルの制御を監視する。According to another embodiment, a polynucleotide encoding MTRP can be used for diagnosis. The polynucleotide used includes an oligonucleotide sequence,
Included are complementary RNA and DNA molecules, and PNAs. This polynucleotide is used to detect and quantify the expression of genes in biopsy tissues that express MTRPs that can be correlated with disease. Use this diagnostic assay to check for the absence, presence, and overexpression of MTRPs,
Monitor control of MTRP levels during treatment.

【０１７３】 ある実施形態では、MTRPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よって、MTRPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調
節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異
性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅のストリンジェントは、プローブがMTRPをコードする自然界の配列
のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみ
を同定するかどうかによって決まるであろう。In certain embodiments, it is possible to identify a nucleic acid sequence encoding MTRP by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising a gene sequence encoding MTRP or a closely related molecule. is there. The specificity of the probe, whether it is made from a highly specific region such as a 5'regulatory region or a region with a slightly low specificity of a conserved motif, and the stringency of hybridization or amplification are Will identify only the naturally occurring sequences that encode MTRPs, or will only identify the naturally occurring sequences that encode alleles or related sequences.

【０１７４】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、MTRPをコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:18−34の配列
、或いはMTRP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配
列に由来し得る。Probes may also be utilized in the detection of related sequences and may have at least 50% sequence identity with any sequence encoding MTRP. The desired hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 18-34, or the genomic sequence of the MTRP gene promoter, enhancer, intron.

【０１７５】 MTRPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、MTRP及びMTRP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプロ
ーブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクタ
ーは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適
な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合
成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば^３２Ｐ或
いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によ
ってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレ
ポーターの集団によって標識され得る。As a method for producing a hybridization probe specific to DNA encoding MTRP, there is a method in which a polynucleotide sequence encoding MTRP and an MTRP derivative is cloned into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are commercially available, well known to those skilled in the art, and are used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide. Hybridization probes can be labeled with a population of different reporters such as radionuclides such as ³² P or ³⁵ S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase linked to the probe by an avidin / biotin binding system.

【０１７６】 MTRPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、MTRPの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例に
は、膜輸送障害が含まれ、その中にはシスチン尿症、２塩基性アミノ酸尿症、高
シスチン尿症（hypercystinuria）、リシン尿症、ハートナップ病、トリプトフ
ァン吸収不全症、メチオニン吸収不全症、ヒスチジン尿症、イミノグリシン尿症
、ジカルボン酸アミノ酸尿症（dicarboxylicaminoaciduria）、シスチン症、腎
性糖尿病、グルコース‐ガラクトース吸収不全症、家族性高コレステロール血症
、低尿酸血症、家族性低リン酸血症性くる病、congenital chloridorrhea、嚢胞
性線維症、家族性甲状腺腫、遠位尿細管性アシドーシス、メンケス病、致死性下
痢症、腎原発性尿崩症、若年性悪性貧血、葉酸吸収不全症、副腎白質ジストロト
フィー、遺伝性ミオグロビン尿症、ツェルヴェーガー症候群、インスリン過剰血
性低血糖症、運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、ベッ
カー筋ジストロフィー、顔面麻痺、シャルコー‐マリー‐ツース病、糖尿病、尿
崩症、糖尿病性ニューロパシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、高カリウム
血性周期性四肢麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性
高熱、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性異栄養症、緊張病、錐体外路性終末欠
陥症候群、ジストニー、末梢神経疾患、脳性腫瘍、前立腺癌と、口峡炎、徐脈型
不整脈、頻拍性型不整脈、高血圧症、遺伝性QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネ
マリンミオパシーラネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミト
コンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚
筋炎、封入体筋炎、感染性節炎、及び多発性筋炎などの輸送に関連した心臓病と
、アルツハイマー病、健忘症、双極性障害、痴呆、うつ病、てんかん、トゥーレ
ット病、妄想性精神病、及び***病などの輸送に関連した神経障害と、神経線維
腫症、帯状疱疹後神経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイドーシス、鎌状赤
血球性貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、常染色体性感音性
難聴、高血糖症、低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、副腎機能
不全、グルコース‐ガラクトース吸収不良症候群、及び高コレステロール血症な
どの輸送に関連したほかの疾患が含まれ、また、免疫異常症／炎症性疾患も含ま
れ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫
症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性
動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内
分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎
、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性
一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッ
ドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過
敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、
骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、
強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデ
ス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症
、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫
感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常症も含
まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝
炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真
性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、
頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ
る。MTRPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドッ
トブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipst
ick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異MTRPの発現を検出するために
患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可
能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。Polynucleotide sequences encoding MTRP can be used to diagnose disorders associated with MTRP expression. Non-limiting examples of such diseases include impaired membrane transport, including cystinuria, dibasic amino aciduria, hypercystinuria, ricinuria, Heart Nap disease, tryptophan malabsorption, methionine malabsorption, histidineuria, iminoglycinuria, dicarboxylicaminoaciduria, cystinosis, renal diabetes, glucose-galactose malabsorption, familial hypercholesterolemia , Hypouricemia, familial hypophosphatemic rickets, congenital chloridorrhea, cystic fibrosis, familial goiter, distal tubular acidosis, Menkes disease, lethal diarrhea, renal primary Diabetes insipidus, juvenile pernicious anemia, folate malabsorption, adrenoleukodystrophy, hereditary myoglobinuria, Zellweger syndrome, excess insulin Bloody hypoglycemia, akinesia, amyotrophic lateral sclerosis, ataxia-telangiectasia, Becker muscular dystrophy, facial paralysis, Charcot-Marie-Tooth disease, diabetes, diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy , Hyperkalemic periodic quadriplegia, normokalemic periodic quadriplegia, Parkinson's disease, malignant hyperthermia, multiple drug resistance, myasthenia gravis, myotonic dystrophy, catatonia, extrapyramidal terminal defect syndrome, Dystonia, peripheral nerve disease, cerebral tumor, prostate cancer and stomatitis, bradyarrhythmia, tachyarrhythmia, hypertension, hereditary QT prolongation syndrome, myocarditis, cardiomyopathy, nemarin myopathy with nemarine myopathy , Central nucleus myopathy, lipid myopathy, mitochondrial myopathy, thyrotoxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis Transport-related heart disease such as infectious adenitis and polymyositis, and transport of Alzheimer's disease, amnesia, bipolar disorder, dementia, depression, epilepsy, Tourette's disease, delusional psychosis, and schizophrenia -Related neuropathy, neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, Wilson disease, cataract, infertility, pulmonary stenosis, autosomal sensorineural hearing loss, high Includes other transport-related disorders such as glycemia, hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease, adrenal insufficiency, glucose-galactose malabsorption syndrome, and hypercholesterolemia, as well as immune disorders / Inflammatory diseases are also included, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergies, ankylosing spondylitis, Loidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candid ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact skin Inflammation, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphotoxin-induced temporary lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout , Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis,
Osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis,
Scleroderma, Schergren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections and bacteria Infectious diseases, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma, and also cell proliferation disorders, including actinic keratosis and atherosclerosis. , Bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, Lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast,
It includes cancers of the cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterus and the like. The polynucleotide sequence encoding MTRP can be obtained by the Southern method, Northern method, dot blot method, or other membrane-based technology, PCR method, dipstick (dipst) method.
ick), pin, ELISA-based assays, and microarrays that utilize body fluids or tissues collected from patients to detect the expression of mutant MTRPs. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.

【０１７７】 特定の形態において、MTRPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。MTRPをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のMTRPをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。In a particular form, the nucleotide sequence encoding MTRP is associated with a disease,
It will be particularly useful in assays to detect the above mentioned diseases. The nucleotide sequence encoding MTRP may be labeled by standard methods and added to a body fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the samples are washed and the signal is quantified and compared to standard values. If the amount of signal in the patient sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation of the nucleotide sequence encoding MTRP in the sample reveals the presence of the associated disease. Using such assays, in animal studies, clinical trials, or in monitoring individual patient care,
It is possible to estimate a particular therapeutic effect.

【０１７８】 MTRPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、MTRPをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の
値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。A normal or canonical expression profile is established to provide a basis for diagnosis of diseases associated with expression of MTRP. This can be achieved by ligating a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, with a sequence or a fragment thereof encoding MTRP under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridizations can be quantitated by comparing the values obtained from normal subjects to those from experiments in which known amounts of substantially purified polynucleotides are used. Standard values obtained from normal samples can be compared with those obtained from subjects who exhibit symptoms of the disease. Deviation between standard and subject values is used to establish the presence of disease.

【０１７９】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。Once the presence of the disease is established and the treatment protocol is initiated, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to estimate whether the level of expression in a subject has begun to approach the values shown in normal patients. It is possible. The results of repeated assays can be used to see the effect of treatment over a period of days to months.

【０１８０】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。In cancer, aberrant amounts of transcripts in living tissue from an individual predispose to the development of the disease and can provide a method of detecting the disease prior to the actual onset of clinical symptoms. is there. This type of clearer diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive therapies early to prevent the development or progression of cancer.

【０１８１】 MTRPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
MTRPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはMTRPをコードするポリヌクレ
オチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝
子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリン
ジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用
いることが可能である。Further diagnostic uses for oligonucleotides designed from MTRP coding sequences can include the use of PCR. Such oligomers are chemically synthesized,
It can be produced enzymatically or in vitro . The oligomer is preferably
It contains a fragment of a polynucleotide encoding MTRP or a fragment of a polynucleotide complementary to the polynucleotide encoding MTRP, and is used for identifying a specific gene or condition under optimal conditions. Further, the oligomer can be used for detecting and / or quantifying a closely related DNA or RNA sequence under slightly mild stringent conditions.

【０１８２】 MTRPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ
、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速な高スループット型のアッセイ
を用いることで加速された。Methods that can be used to quantify MTRP expression include radiolabelling of nucleotides or biotin labeling, coamplification of regulatory nucleic acids, and standard curves plus results. (For example, Melby, PC et al. (1993) J. Imm
unol. Methods, 159: 235-44; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The quantitation rate of a large number of samples was accelerated by using a high throughput assay in which the oligomer of interest was included in different dilutions and quantified by spectrophotometry or non-color response.

【０１８３】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多型を識別する。この情報は、遺伝子機能の
決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び開
発に有用である。In another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein are used as targets in microarrays. Microarrays are used to monitor the expression levels of a large number of genes at the same time and identify gene mutations, mutations and polymorphisms. This information is useful in determining gene function, interpreting the genetic basis of disease, diagnosing disease, and monitoring and developing the activity of therapeutic agents.

【０１８４】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、MTRPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌Ｐ１生成
物或いは単一染色体cDNAライブラリである。（例えば、Harrington, 1.3. 他 (1
997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 5−87-134, 及
びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワー
ルドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上の
MTRPをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対
する素因が、このような疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。本発
明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子
配列における違いを検出することもある。Microarrays are prepared, used, and analyzed by methods well known in the art. (For example, Brennan, TM et al. (1995) US Pat. No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Pro.
c. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995) PCT application number W
O95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT application number WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155; and Heller, MJ et al. (1997) U.S. Pat.No. 5,605,662) Another embodiment of the invention also employs a nucleic acid sequence encoding MTRP. Thus, it is possible to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. This array maps to:
Specific chromosomes, specific regions of chromosomes or artificially generated chromosomes, for example, human artificial chromosomes (HACs), yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), bacterial P1 products or single chromosome cDNA libraries. (For example, Harrington, 1.3. Other (1
997) Nat Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 5-87-134, and Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154) in sit fluorescence hybridization ( FISH) will correlate with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data (see, eg, Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, pp. 965-968.). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or the World Wide Web site of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). On a physical chromosome map
The correlation of the position of the gene encoding MTRP with a particular disease, or the predisposition to a particular disease, helps determine the region of DNA associated with such a disease. The nucleotide sequences of the present invention may also be used to detect differences in gene sequences between normal, carrier and infected individuals.

【０１８５】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色***置の違いを検出することも
ある。The genetic map can also be expanded using physical mapping techniques such as in sit hybridization of chromosomal preparations and binding analysis using established chromosomal markers. By placing the gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse,
Relevant markers are often revealed, even if the number or arm of a particular human chromosome is not known. The new array by physical mapping
It can also be assigned to a chromosome arm. This is valuable information for researchers studying genetic disorders using positional cloning or other gene discovery techniques. The location of the disease or syndrome is, for example, 11q22-
Once roughly determined by gene binding to a particular gene region such as 23, any sequence mapping for that region represents a relevant gene or regulatory gene for further investigation (eg, Gatti, RA et al. (1988). Nature 336: 577-580
See). Further, by using the nucleotide sequence of the present invention of interest, a normal person, a holder,
That is, a difference in chromosomal position due to translocation, inversion, etc. between infected persons may be detected.

【０１８６】 本発明の別の実施例では、MTRP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。MTRPとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成
は計測されることもある。In another embodiment of the invention, MTRP, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof can be used to screen a library of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for such screening may be free in solution, immobilized on a solid support, retained on the surface of cells, or present intracellularly. Formation by binding the complex between MTRP and the agent being tested may be measured.

【０１８７】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、MTRP、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたMTRPが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたMTRPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。Another method used for drug screening is used to increase the screening throughput of compounds with suitable binding affinity for the protein of interest (eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. See WO84 / 03564). In this method, a significant number of different small test compounds are synthesized on plastic pins or other substrates. The test compound is washed after reacting with MTRP, or a fragment thereof. The bound MTRP is then detected by methods well known in the art. Purified MTRP can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.

【０１８８】 別の実施例では、MTRPと結合可能な中和抗体がMTRPと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、MTRPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。In another example, competitive drug screening assays can be used in which neutralizing antibodies capable of binding MTRP specifically compete with the test compound for binding MTRP.
In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with MTRP.

【０１８９】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にMTRPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。In another example, nucleotide sequences encoding MTRPs are used in evolving molecular biology techniques, including, but not limited to, currently known nucleotides such as the triplet code and specific base pair interactions. New technologies can be provided that depend on the characteristics of the sequence.

【０１９０】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。Those skilled in the art will be able to make full use of the present invention without further explanation given the preceding description. Therefore, the specific preferred embodiments described below are for purposes of illustration and not limitation of the present invention.

【０１９１】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願[1998
年11月4日に提出した代理人整理番号PF-0633P]、米国出願[1998年11月24日に提
出した代理人整理番号PF-0645P]、米国出願[1998年12月22日に提出した代理人整
理番号PF-0657P]、及び米国出願通し番号60/121,1896に言及することをもって本
明細書の一部とする。All patent applications, patents, publications mentioned above and below, especially US applications [1998]
No. PF-0633P filed on November 4, 1998, US application [Agent number PF-0645P filed on November 24, 1998], US application filed on December 22, 1998 Attorney Docket Number PF-0657P], and US Serial No. 60 / 121,1896 are incorporated herein by reference.

【０１９２】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入、或いは表４に列記した組織から単離した。ある
組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した。一
方では、別の組織をホモジナイズし、フェノール、或いはグアニジニウムイソチ
オシアネート及びフェノールの単相溶液を含むTRIZOL (Life Technologies)など
の好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶液を塩化セシウム遠心するか、クロ
ロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタ
ノール、或いは別の方法でこの溶液からRNAを沈殿させた。Example 1 Preparation of cDNA Library RNA was purchased from Clontech or isolated from the tissues listed in Table 4. A tissue was homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution. On the one hand, another tissue was homogenized and dissolved in a mixture of phenol or a suitable denaturant such as TRIZOL (Life Technologies) containing a single phase solution of guanidinium isothiocyanate and phenol. The solution was centrifuged with cesium chloride or extracted with chloroform. RNA was precipitated from this solution with either isopropanol or sodium acetate and ethanol, or otherwise.

【０１９３】 RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリで
は、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN
. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ（A＋）RNAを
単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの
別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。RNA extraction with phenol and precipitation were repeated as many times as necessary to increase the purity of the RNA. In some cases, RNA is treated with a DNA degrading enzyme. Most libraries have oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega) or OLIGOTEX latex particles (QIAGEN).
Valencia CA), OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN) was used to isolate poly (A +) RNA. Alternatively, another RNA isolation kit such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX) was used to isolate directly from tissue lysates.

【０１９４】 ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAラ
イブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)
またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で
公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。
(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)
またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素
でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech
)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ（300〜1000bp）を選択した
。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technolo
gies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)などの好適なプラスミ
ドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラス
ミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF、SOLR、またはLife Technologi
es社のDH5αまたはDH 10B、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に
形質転換した。In some cases, RNA was provided to Stratagene and a cDNA library corresponding to Stratagene was created. Otherwise, UNIZAP vector system (Stratagene)
Alternatively, a cDNA library was prepared by using the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) to synthesize cDNA by a recommended method known in the art or a similar method.
(See, eg, Ausubel, 1997, supra, Units 5.1-6.6). Reverse transcription is oligo d (T)
Or started with random primers. A synthetic oligonucleotide adapter was attached to the double-stranded cDNA and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or restriction enzymes. For most libraries, SEPHACRYL S 1000 or SEPHAROSE CL2B, SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech
), And the size of the cDNA (300-1000 bp) was selected by agarose gel electrophoresis. PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene) or pSPORT1 plasmid (Life Technolo
gies), plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA), etc., and the cDNA was ligated to the compatible restriction enzyme site of the polylinker of a suitable plasmid. Use this recombinant plasmid with Stratagene XL1-Blue, XL1-BIueMRF, SOLR, or Life Technologi.
The cells were transformed into competent E. coli cells containing es DH5α or DH10B and ELECTROMAX DH10B.

【０１９５】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。 2 Isolation of cDNA clones Plasmids were recovered from host cells by in vivo excision utilizing the UNIZAP vector system (Stratagene) or cell lysis. Magic or WIZARD Minipreps
DNA purification system (Promega) and AGTC Miniprep purification kit (Edge Biosystems, G
aithersburg MD), QIAGEN's QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid, QI
Plasmids were purified using at least one of the AWELL 8 Ultra Plasmid Purification System, REAL Prep 96 Plasmid Kit. After precipitation, it was resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without freeze-drying.

【０１９６】 別法では、高スループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプラ
スミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細
胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理し
てから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャ
ナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates by a high throughput direct ligation PCR method. (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). Host cell lysis and thermal cycling processes were performed in a single reaction mixture. Samples are processed and transferred to 384-well plates for storage and the concentration of amplified plasmid DNA is quantified using PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and Fluoroskan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Measured.

【０１９７】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)と
HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Ham
ilton) 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行った。c
DNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試薬
、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキッ
ト(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。c
DNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics
)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373
または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知のその他の
配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で配列を延長した。 3 Sequencing and analysis cDNA sequencing reactions can be performed using standard methods or ABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cycler or PTC-200 thermal cycler (MJ Research)
HYDRA Microdispenser (Robbins Scientific) or MICROLAB 2200 (Ham
ilton) High throughput equipment such as combination with liquid transfer system. c
For the preparation of a DNA sequencing reaction, a reagent from Amersham Pharmacia Biotech or a reagent contained in an ABI sequencing kit such as ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Perkin-Elmer) was used. c
For electrophoretic separation of DNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics
), ABI PRISM 373 using standard ABI protocol and base pair calling software
Alternatively, the 377 Sequencing System (Perkin-Elmer), other sequence analysis systems well known in the art, was used. The open reading frame of the cDNA sequence is standard (Ausubel, 1997
, Unit 7.7), supra. Some of the cDNA sequences were selected and extended by the method described in 5 of this example.

【０１９８】 cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。The construction and analysis of the polynucleotide sequences obtained from the sequencing of the cDNA was carried out in combination with software utilizing algorithms well known to those skilled in the art.
Table 5 outlines the tools, software, algorithms utilized, their description, references, and threshold parameters used. Column 1 of Table 5 is the tools and programs used, algorithms, column 2 is a brief description thereof, column 3 is a reference cited as part of this specification by reference, column 4 is a sequence of two sequences. The score, probability value, and other parameters used in the evaluation of the degree of coincidence are shown (the higher the probability value, the higher the homology between sequences). MACDNASIS PRO software (Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA) and LASER GENE software (DNASTAR)
Was used.

【０１９９】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して
対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwi
ssProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、また
はPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデー
タベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確率
を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Eddy
, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。Confirmation of polynucleotide sequences is accomplished by using BLAST and dynamic programming, programs and algorithms based on dinucleotide nearest neighbor analysis to remove vectors and linkers, poly A sequences and mask ambiguous base pairs. I went there. next,
Using databases based on BLAST, FASTA and BLIMPS, public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotic databases and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and PFAM databases. Annotations were obtained by querying these sequences against sequences selected from. These sequences were constructed into full-length polynucleotide sequences using programs based on Phred and Phrap, Consed and screened for open reading frames with programs based on BLAST and FASTA, BLIMPS. The full-length polynucleotide sequence is translated to derive the corresponding full-length amino acid sequence, and the GenBank database (above) and Swi
These full-length sequences were analyzed by querying databases such as ssProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, or Hidden Markov Model (HMM) based protein family databases such as PFAM. HMMs use probabilities to analyze the consensus primary structure of gene families (eg, Eddy
, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365).

【０２００】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:18−34からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。The programs described above for the construction and analysis of full length polynucleotide and amino acid sequences can also be used to identify fragments of the polynucleotide sequence from SEQ ID NO: 18-34. Fragments of about 20 to 4000 nucleotides are useful for hybridization and amplification and have been described in the invention above.

【０２０１】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識され
たヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出,
7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。 4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of gene transcripts, which is a labeled nucleotide on the membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is attached. With sequence hybridization (see, for example, Sambrook, supra,
Chapter 7; and Ausubel. FM et al., Supra, Chapters 4 and 16).

【０２０２】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連
する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に
速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、
厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができ
る。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大BLASTスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。Using similar computer technology for BLAST, GenBank or LIFESEQ (Inc
Search for identical or related molecules in nucleotide databases such as yte Pharmaceuticals). This assay is much faster than many membrane-based hybridizations. You can also change the sensitivity of the computer search so that any particular match
It can be established whether it is classified as an exact match or a homologous match. The search criterion is the product score defined as (% sequence identity x% maximum BLAST score) / 100. The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length of the sequence match. For example, if the product score is 40, the match is 1 to 2
Exact within% error, at 70 the match would be exact. Similar molecules are usually identified by selecting those molecules that show a product score in the range of 15-40, although lower scores may identify related molecules.

【０２０３】 ノーザン分析の結果は、MTRPをコードする転写物が発生したライブラリの分布
割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラリの
分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、
胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリー
には、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経、貯留(pooled)が含まれる。カテゴリー
別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライ
ブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で
発現する割合を表３に示した。Results of Northern analysis are reported as the percent distribution of the library in which transcripts encoding MTRP occurred. The analysis also includes classification of the cDNA library by organ / tissue and disease. Organ / tissue categories include cardiovascular, skin, development, endocrine,
Includes gastrointestinal, hematopoietic / immune, musculoskeletal, neural, reproductive, urological. Disease categories include cancer, inflammation / trauma, cell proliferation, nerves, pooled. By category, the number of libraries expressing the sequence of interest was counted and divided by the number of libraries in the entire range. Table 3 shows the ratio (percentage) of specific expression in each tissue and the ratio of expression in each disease.

【０２０４】 ５ MTRPをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:18−34の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長し
て作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合成
し、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。開
始プライマーは、OLIGO 4．06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他
の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約
５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニール
するように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じな
いようにヌクレオチドを延長した。 5 Extension of Polynucleotide Encoding MTRP The full-length nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18-34 was prepared using oligonucleotide primers designed from suitable fragments of the full-length molecule. The fragment was extended and produced. One primer was synthesized to initiate the 5'extension of the known fragment and the other primer was synthesized to initiate the 3'extension of the known fragment. The starting primer has a GC content of about 50% or more and a length of about 22 to about 30 nucleotides and a pH of about 68 using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or other suitable program. It was designed to anneal to the target sequence at a temperature of ~ 72 ° C. The nucleotides were extended so that hairpin structures and primer-primer dimers did not occur.

【０２０５】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。This sequence was extended with selected human cDNA libraries. If more than one extension is required or desired, additional or nested primer sets are designed.

【０２０６】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg^２+と(NH₄)₂SO₄とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。Amplification was performed with high fidelity by the PCR method using a method known in the art. PCR is PTC-200
It was performed in a 96-well block plate using a thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture consisted of template DNA, 200 nmol of each primer, Mg ²⁺ and (NH ₄ ) ₂ SO ₄ and β.
− Buffer containing mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pha
rmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), Pfu DNA polymerase (St
ratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 60 ° C. for 1 minute Step 4 68 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6 68 ° C. for 5 minutes Step 7 Storage at 4 ° C Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 57 ° C. for 1 minute Step 4 68 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6 68 ° C. for 5 minutes Step 7 Store at 4 ° C.

【０２０７】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長す
ることに成功したかを決定する。The DNA concentration in each well was dissolved in 1X TE and 0.5 μl of undiluted PCR product.
100 μl PICOGREEN quantification reagent (0.25% (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR) is distributed to each well of an opaque fluorometer plate (Coming Costar, Acton MA) to allow the DNA to bind to the reagent and be measured. Fluoroskan this plate
Scan with II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) and measure the fluorescence of the sample to quantify the concentration of DNA. A 5-10 μl aliquot of the reaction mixture is analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction succeeded in extending the sequence.

【０２０８】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。The extended nucleotides are desalted and concentrated before being transferred to a 384 well plate and Cvi
JI Cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison W
Digested with I) and sonicated or sheared before religation to pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel to cut the fragments and the agar was digested with Agar ACE (Promega). T4 Ligase (New England B
clones extended with iolabs, Beverly MA) were cloned into pUC 18 vector (Amersham Pha
rmacia Biotech) and treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) extension of restriction sites to transfect competent E. coli cells. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing antibiotics, each colony was cut off, and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture solution at 37 ° C. overnight.

【０２０９】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）( 1−15, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECT
キット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
e sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシング
した。The cells were lysed and the DNA was PCR amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure. Step 1 3 minutes at 94 ° C Step 2 15 seconds at 94 ° C Step 3 1 minute at 60 ° C Step 4 2 minutes at 72 ° C Step 5 Repeat steps 2, 3 and 4 29 times Step 6 5 minutes at 72 ° C Step 7 Store at 4 ° C. DNA was quantified with PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with poor DNA recovery were amplified again under the above conditions. Dilute the sample with 20% dimethysulphoxide (1-15, v / v) and use DYENAMIC DIRECT
Kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
Sequencing was performed using the e sequencing ready reaction kit (Perkin-Elmer).

【０２１０】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:18−34のヌクレオチド配列を利用し、この延
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′
調節配列を得た。Similarly, following the procedure described above, utilizing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18-34, using the oligonucleotide designed for this extension and a suitable gene library, 5 '
The regulatory sequence was obtained.

【０２１１】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:18−34から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなる
オリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの
場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフト
ウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイ
ンし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐^３２Ｐ]アデノシン三リン酸（A
mersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Bost
on MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレ
オチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Phar
macia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０^７カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco R
I、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノム
DNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。 6 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes Hybridization probes derived from SEQ ID NO: 18-34 are used to screen cDNA, mRNA, or genomic DNA. Special mention is made of labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs, but essentially the same procedure is used for larger cDNA fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software, such as OLIGO 4.06 software (National Bioscience), with 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- ³² P] adenosine triphosphate (A
mersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Bost)
on MA) and used in combination for labeling. The labeled oligonucleotide was loaded onto a SEPHADEX G-25 ultrafine exclusion dextran bead column (Amersham Phar
Substantially purified using macia Biotech). An aliquot containing the labeled probe at 10 ⁷ counts per minute was added to the following endonucleases: Ase I, Bgl II, Eco R.
Human genome cleaved with one of I, Pst I, Xba1 or Pvu II (DuPont NEN)
Used in typical membrane-based hybridization analysis of DNA.

【０２１２】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。The DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blots are sequentially washed at room temperature, eg, under conditions of max 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. The hybridization patterns are visualized and compared by autoradiography or another imaging means.

【０２１３】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。 7 It is possible to synthesize array elements on the surface of a substrate using a microarray chemical bonding method and an inkjet device (see eg Baldeschweiler above). Using an array similar to dot blotting or slot blotting, heat, UV,
It is placed and bonded to the surface of the substrate using mechanical or chemical bonding methods. A typical array can be made manually or using available methods and machines and can include any suitable number of elements. After hybridization, unhybridized probe is removed and a scanner is used to determine the level and pattern of fluorescence. Scanned images can be analyzed to determine the degree of complementarity and the relative amount / expression level of each probe that hybridizes to the element on the microarray.

【０２１４】 完全長のcDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERG
ENEソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択す
ることが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、
或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択さ
れたcDNAを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。cDNAは、例えばＵＶ
交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び
化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他. (1995) Science
270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照)。蛍
光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーションするために用い
る。上記した方法でこの基質を分析する。Full-length cDNAs, expressed gene sequence fragments (ESTs), or fragments thereof, may form part of the microarray. A fragment suitable for hybridization is LASERG
Selection can be made using software known in the art such as ENE software (DNASTAR). A full-length cDNA corresponding to one of the nucleic acid sequences of the invention, EST,
Alternatively, those fragments, or cDNA arbitrarily selected from the cDNA library related to the present invention, are aligned on a suitable substrate such as a glass slide. cDNA is, for example, UV
It is immobilized on slides using UV cross-linking, then heat and chemical treated and finally dried (eg Schena, M. et al. (1995) Science.
270: 467-470; and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645). A fluorescent probe is prepared and used to hybridize to the element on the substrate. This substrate is analyzed as described above.

【０２１５】 ８ 相補的ポリヌクレオチド MTRPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のMTRPの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）及びMTRPのコーディング配列を用いて、適
切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがMTRPをコードする転写物に結合する
のを阻害する。 8 Complementary Polynucleotides A sequence complementary to the MTRP coding sequence or any portion thereof is used to reduce or inhibit the expression of naturally occurring MTRP. Although the use of oligonucleotides containing from about 15 to about 30 base pairs is described, essentially the same method can be used with smaller or larger sequence fragments. Appropriate oligonucleotides are designed using Oligo 4.06 software (National Biosciences) and MTRP coding sequences. The most unique 5'to inhibit transcription
A complementary oligonucleotide is designed from the sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent the ribosome from binding to the MTRP-encoding transcript.

【０２１６】 ９ MTRPの発現 MTRPの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うこ
とができる。細菌でMTRPが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベル
を高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニング
する。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に関連するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモー
ターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、BL21
(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソ
プロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとMTRPを発現する。
真核細胞でのMTRPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロ
ウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイルス(AcM
NPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同
組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちら
かによって、MTRPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、
強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換
えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に
感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染
の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engel
hard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。 9 MTRP Expression MTRP expression and purification can be performed using a bacterial or virus-based expression system. For MTRP expression in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an antibiotic resistance and an inducible promoter that enhances the transcription level of the cDNA. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. BL21 recombinant vector
Transform into a suitable bacterial host such as (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express MTRP when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG).
Expression of MTRPs in eukaryotic cells is expressed in insect or mammalian cell lines by the Autographica californica nuclear pleiotropic virus (AcM), commonly known as baculovirus.
NPV). The nonessential polyhedrin gene of baculovirus is replaced with the MTRP-encoding cDNA by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid-mediated transfer. The infectivity of the virus is maintained,
The strong polyhedrin promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculovirus is often used to infect Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells, but can also be used to infect human hepatocytes. In the case of the latter infection, further genetic modification of the baculovirus is required. (For example, Engel
hard. EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).

【０２１７】 殆どの発現系では、MTRPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で
固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharma
cia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でMTRPからタンパク分解的
に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクロナール及
びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能
となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、金属キレー
ト樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausu
bel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したMTRPを
直接用いて以下のアッセイを行うことができる。In most expression systems, MTRP is used, for example glutathione S transferase (GST).
, Or a fusion protein synthesized with a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, the affinity-based purification of the recombinant fusion protein from crude cell lysate can be performed rapidly in one step. The 26-kilodalton enzyme GST from Schistosoma japonicum allows purification of fusion proteins with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharma
cia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from MTRP at specific manipulation sites. FLAG, a peptide of 8 amino acids, allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which 6 histidine residues are continuously extended enables purification with a metal chelate resin (QIAGEN). The method of protein expression and purification is described by Ausu
bel (1995, supra, ch 10, 16). The following assay can be performed using MTRP purified by these methods directly.

【０２１８】 １０ MTRP活性の実証 MTRPに関連するATPアーゼ活性は、放射性同位元素を使って識別されるATP-[γ
-³²P]の加水分解、クロマトグラフ法による加水分解生成物の分離、及び回収し
た ³²Pのシンチレーションカウンタでの定量によって測定することができる。反
応混合物には、ATP-[γ-³²P]及び、３７℃で好適な時間インキュベートされるよ
うな好適な緩衝溶液内において量が変化するようなMTRPが含まれる。反応はトリ
クロロ酢酸を用いて酸を析出することによって終了し、その後塩基を用いて中和
し、反応混合物のアリコートを膜またはフィルターペーパーを用いたクロマトグ
ラフィーにかけて反応生成物を分離する。遊離された ³²Pの量は、シンチレーシ
ョンカウンタで計数される。回収した放射活性の量は、このアッセイにおけるMT
RPのATPアーゼ活性に比例する。 10 Demonstration of MTRP Activity MTRP-related ATPase activity was identified using radioisotopes ATP- [γ
^-32 P] hydrolysis, separation of hydrolysis products by chromatographic methods, and quantification of recovered ³² P by a scintillation counter. The reaction mixture contains ATP- [γ- ³² P] and MTRP in varying amounts in a suitable buffer solution that is incubated at 37 ° C. for a suitable time. The reaction is terminated by precipitating the acid with trichloroacetic acid, then neutralized with base, and an aliquot of the reaction mixture is chromatographed on membrane or filter paper to separate the reaction products. The amount of ³² P released is counted by a scintillation counter. The amount of radioactivity recovered is the MT
It is proportional to the ATPase activity of RP.

【０２１９】 MTRP輸送体活性は、標識した基質がツメガエル卵母細胞内に摂取される量を測
定することによってアッセイされる。段階V及びVIの卵母細胞は、MTRP mRNAに卵
母細胞当たり10 ng注入され、MTRPタンパク質を発現させるために、OR2培養基（
82.5 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、1mM Na₂HPO₄、5 mM Ｈep
es、3.8 mM NaOH、50μg/mlゲンタマイシン、pH 7.8）内において１８℃で３日
間インキュベートされる。卵母細胞はその後、標準摂取培養基（100 mM NaCl、2
mM KCl、1 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM Hepes/Tris、pH 7.5）に移される。³ H標識した基質を卵母細胞に加えることにより、様々な基質（例えば、アミノ酸
、糖、薬剤、神経伝達物質等）の摂取が開始される。３０分間のインキュベーシ
ョンの後、Na⁺ 遊離培養基内で卵母細胞を３回洗浄することにより摂取は終了す
る。³Hの摂取量を測定したら、対照標準と比較する。MTRP輸送活性は、内在化し
た³H標識基質の標識に比例する。MTRP transporter activity is assayed by measuring the amount of labeled substrate taken up into Xenopus oocytes. Oocytes at stages V and VI were injected with MTRP mRNA at 10 ng per oocyte, and OR2 medium (in order to express MTRP protein).
82.5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM CaCl ₂ , 1 mM MgCl ₂ , 1 mM Na ₂ HPO ₄ , 5 mM Hep
es, 3.8 mM NaOH, 50 μg / ml gentamicin, pH 7.8) at 18 ° C. for 3 days. The oocytes were then treated with standard uptake medium (100 mM NaCl, 2 mM).
mM KCl, 1 mM CaCl ₂ , 1 mM MgCl ₂ , 10 mM Hepes / Tris, pH 7.5). Addition of ³ H-labeled substrates to oocytes initiates uptake of various substrates (eg, amino acids, sugars, drugs, neurotransmitters, etc.). After a 30 minute incubation, uptake is terminated by washing the oocytes 3 times in Na ⁺ free culture medium. ^{Once the 3} H intake has been measured, it is compared to a control standard. MTRP transport activity is proportional to the label of the internalized ³ H-labeled substrate.

【０２２０】 １１ 機能的アッセイ MTRPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
MTRPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発
現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。
このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (In
vitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモータ
ーを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来
のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する
。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時
に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入
されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNA
の組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質に
は、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパ
ク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(F
CM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その
細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或
いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。こ
れらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA
内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測され
るDNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面
及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の
細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細
胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York,
NY.に記載されている。 11 Functional Assay MTRP function is at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems.
Evaluation is by expression of the MTRP coding sequence. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels.
Such vectors include pCMV SPORT ^™ (Life Technologies.) And pCR 3.1 (In
Vitrogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. For example, 5 to 10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line derived from endothelium or hematopoiesis by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows to distinguish between transfected and non-transfected cells. In addition, by expressing the labeled protein, the cDNA
The expression from the recombinant vector can be accurately predicted. Such labeled proteins include green fluorescent protein (GFP; Clontech), and CD64 or CD64-GFP fusion protein. Automatic flow cytometry using a technology based on laser optics (F
CM) is used to identify transfected cells expressing GFP or CD64-GFP and to assess their apoptotic status and other cellular characteristics. In addition, FCM detects and weighs uptake of fluorescent molecules that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena include nuclear DNA measured by staining DNA with propidium iodide.
Changes in contents, down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, and changes in protein expression on cell surface and intracellular as measured by reactivity with specific antibodies. , Changes in plasma membrane composition measured by binding of fluorescent-complexed annexin V protein to the cell surface. Flow cytometry is by Ormerod, MG (1994) Flow Cytometry Oxford, New York,
It is listed in NY.

【０２２１】 遺伝子発現におけるMTRPの影響は、MTRPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野
で公知の方法で細胞から精製することができる。MTRP及び目的の他の遺伝子をコ
ードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することがで
きる。The effect of MTRPs on gene expression is dependent on the sequence encoding MTRPs and CD64 or CD64-G.
Highly purified cell populations transfected with either FP can be evaluated. CD64 or CD64-GFP is expressed on the surface of transformed cells and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or antibodies against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods known in the art. Expression of mRNAs encoding MTRP and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.

【０２２２】 １２ MTRPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたMTRPを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す
。 Production of 12 MTRP-Specific Antibodies Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; eg, Harrington, MG (1990)
Methods Enzymol. 1816-3088-495) or MTRP substantially purified by other purification techniques are used to immunize rabbits using standard protocols to generate antibodies.

【０２２３】 別法では、MTRPアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する
親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で
周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。Alternatively, the MTRP amino acid sequence may be analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine highly immunogenic regions and the corresponding oligopeptides synthesized and used to determine well known methods to those of skill in the art. To produce antibodies. Selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or within adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).

【０２２４】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin-Elmer）を用いてfmoc法
のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（MBS）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis M
O）に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フ
ロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウ
サギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗MTRP活性を検査する
には、ペプチドまたはMTRPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサ
ギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgG
と反応させる。Usually, an oligopeptide having a length of about 15 residues was synthesized by fmoc method chemistry using an Applied Biosystems peptide synthesizer ABI 431A peptide synthesizer (Perkin-Elmer), and N-maleimidobenzoyl-N-hydroxy was synthesized. KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis M by reaction with succinimide ester (MBS)
O) to enhance immunogenicity (see, eg, Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in Freund's complete adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-MTRP activity of the obtained antiserum, the peptide or MTRP was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum and washed, and then radioactive iodine was added. Labeled goat anti-rabbit IgG
React with.

【０２２５】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生MTRPの精製 自然発生MTRP或いは組換えMTRPを、MTRPに特異的な抗体を用いるイムノアフィ
ニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化ク
ロマトグラフィー用レジンと抗MTRP抗体とを共有結合させることにより構築する
。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。 13 Purification of Spontaneous MTRPs Using Specific Antibodies Spontaneous MTRPs or recombinant MTRPs are substantially purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for MTRPs. The immunoaffinity column is constructed by covalently binding an anti-MTRP antibody with a resin for activation chromatography such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.

【０２２６】 MTRPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、MTRPを優先的に吸着
できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファー
で）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とMTRPとの結合を切るような条
件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、MTRPを回収する。A culture solution containing MTRP is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions capable of preferentially adsorbing MTRP (for example, with a buffer having a high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that break the binding between the antibody and MTRP (for example, a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ion such as urea or thiocyanate ion), and MTRP is recovered.

【０２２７】 １４ MTRPと相互作用する分子の同定 MTRP又は生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例え
ば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識
する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したMTRP
と共にインキュベートし、洗浄して、標識したMTRP複合体を有する全てのウェル
をアッセイする。様々なMTRP濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とMTRP
との関連、親和性、数について数値を計算する。 Identification of 14 MTRP-Interacting Molecules MTRP or a biologically active fragment thereof was labeled with ¹²⁵ I Bolton-Hunter reagent (see, eg, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529). Label with. Candidate molecules pre-arranged in multiwell plates are labeled with MTRP
Incubate with, wash, and assay all wells with labeled MTRP complex. Using the data obtained at various MTRP concentrations, the candidate molecule and MTRP
Calculate numerical values for relationships, affinities, and numbers.

【０２２８】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。Those skilled in the art will be able to make various modifications of the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with reference to particular preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such particular embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are within the scope of the following claims.

【０２２９】 （表の簡単な説明） 表１は、MTRPをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチ
ド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番号、cDNA
ライブラリ、及びcDNA断片を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE TABLES Table 1 lists the polypeptide and nucleotide sequences used to generate the full-length sequences encoding MTRPs (SEQ ID NO), clone identification number, cDNA.
A library and a cDNA fragment are shown.

【０２３０】 表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びに
MTRPの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す。Table 2 lists the characteristics of each polypeptide sequence, including latent motifs and homologous sequences, and
The method, algorithm, and searchable database used for MTRP analysis are shown.

【０２３１】 表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パター
ンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及び症状と、各DNAがクローニング
されたベクターとを示す。Table 3 shows the tissue-specific expression patterns of each nucleic acid sequence determined by Northern analysis, the diseases, disorders and conditions associated with these tissues, and the vectors in which each DNA was cloned.

【０２３２】 表４は、MTRPをコードするcDNAクローンを単離したcDNAライブラリの作製に用
いた組織を示す。[0232] Table 4 shows the tissues used for the construction of the cDNA library in which the cDNA clone encoding MTRP was isolated.

【０２３３】 表５は、MTRPの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びに
その説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。Table 5 shows the tools, programs, and algorithms used in the MTRP analysis, along with a description, references, and threshold parameters.

【表１】 [Table 1]

【表２】 [Table 2]

【表３】 [Table 3]

【表４】 [Table 4]

【表５】 [Table 5]

【表６】 [Table 6]

【表７】 [Table 7]

【表８】 [Table 8]

【表９】 [Table 9]

【表１０】 [Table 10]

【表１１】 [Table 11]

【表１２】 [Table 12]

【表１３】 [Table 13]

【表１４】 [Table 14]

【表１５】 [Table 15]

【表１６】 [Table 16]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１Ａ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R, Madison WI)を用いて作成した、MTRP-3 (インサイト社クローン番号1720440; SEQ ID NO:3)とマウス脂肪酸輸送タンパク質 (GI 2612939; SEQ ID NO:35)との
間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[Fig. 1A] LASERGENE software's multi-sequence alignment program (DNASTE
R, Madison WI), amino acid sequence alignment between MTRP-3 (Incyte clone number 1720440; SEQ ID NO: 3) and mouse fatty acid transport protein (GI 2612939; SEQ ID NO: 35). Indicates.

【図１Ｂ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R, Madison WI)を用いて作成した、MTRP-3 (インサイト社クローン番号1720440; SEQ ID NO:3)とマウス脂肪酸輸送タンパク質 (GI 2612939; SEQ ID NO:35)との
間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[FIG. 1B] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R, Madison WI), amino acid sequence alignment between MTRP-3 (Incyte clone number 1720440; SEQ ID NO: 3) and mouse fatty acid transport protein (GI 2612939; SEQ ID NO: 35). Indicates.

【図１Ｃ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R, Madison WI)を用いて作成した、MTRP-3 (インサイト社クローン番号1720440; SEQ ID NO:3)とマウス脂肪酸輸送タンパク質 (GI 2612939; SEQ ID NO:35)との
間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[FIG. 1C] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R, Madison WI), amino acid sequence alignment between MTRP-3 (Incyte clone number 1720440; SEQ ID NO: 3) and mouse fatty acid transport protein (GI 2612939; SEQ ID NO: 35). Indicates.

【図１Ｄ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R, Madison WI)を用いて作成した、MTRP-3 (インサイト社クローン番号1720440; SEQ ID NO:3)とマウス脂肪酸輸送タンパク質 (GI 2612939; SEQ ID NO:35)との
間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[Fig. 1D] LASERGENE software's multi-sequence alignment program (DNASTE
R, Madison WI), and amino acid sequence alignment between MTRP-3 (Incyte clone number 1720440; SEQ ID NO: 3) and mouse fatty acid transport protein (GI 2612939; SEQ ID NO: 35). Indicates.

【図２Ａ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-4 (インサイト社クローン番号2274290; SEQ ID NO:4
) とSchistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO:36)との間のアミノ酸
配列アラインメントを示す。[FIG. 2A] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-4 (Incyte clone number 2274290; SEQ ID NO: 4
) And Schistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO: 36).

【図２Ｂ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-4 (インサイト社クローン番号2274290; SEQ ID NO:4
) とSchistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO:36)との間のアミノ酸
配列アラインメントを示す。[FIG. 2B] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-4 (Incyte clone number 2274290; SEQ ID NO: 4
) And Schistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO: 36).

【図２Ｃ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-4 (インサイト社クローン番号2274290; SEQ ID NO:4
) とSchistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO:36)との間のアミノ酸
配列アラインメントを示す。[FIG. 2C] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-4 (Incyte clone number 2274290; SEQ ID NO: 4
) And Schistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO: 36).

【図２Ｄ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-4 (インサイト社クローン番号2274290; SEQ ID NO:4
) とSchistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO:36)との間のアミノ酸
配列アラインメントを示す。[Fig. 2D] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-4 (Incyte clone number 2274290; SEQ ID NO: 4
) And Schistosoma mansoni SMDR1 (GI 425474; SEQ ID NO: 36).

【図３Ａ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-5 (インサイト社クローン番号2740029; SEQ ID NO:5
)とラットナトリウム依存性綜合ビタミン輸送体（GI 3015617; SEQ ID NO:37）
との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[FIG. 3A] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-5 (Incyte clone number 2740029; SEQ ID NO: 5
) And rat sodium-dependent integrated vitamin transporter (GI 3015617; SEQ ID NO: 37)
Amino acid sequence alignment between

【図３Ｂ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-5 (インサイト社クローン番号2740029; SEQ ID NO:5
)とラットナトリウム依存性綜合ビタミン輸送体（GI 3015617; SEQ ID NO:37）
との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[FIG. 3B] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-5 (Incyte clone number 2740029; SEQ ID NO: 5
) And rat sodium-dependent integrated vitamin transporter (GI 3015617; SEQ ID NO: 37)
Amino acid sequence alignment between

【図３Ｃ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-5 (インサイト社クローン番号2740029; SEQ ID NO:5
)とラットナトリウム依存性綜合ビタミン輸送体（GI 3015617; SEQ ID NO:37）
との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[Fig. 3C] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-5 (Incyte clone number 2740029; SEQ ID NO: 5
) And rat sodium-dependent integrated vitamin transporter (GI 3015617; SEQ ID NO: 37)
Amino acid sequence alignment between

【図３Ｄ】 LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R)を用いて作成した、MTRP-5 (インサイト社クローン番号2740029; SEQ ID NO:5
)とラットナトリウム依存性綜合ビタミン輸送体（GI 3015617; SEQ ID NO:37）
との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。[Fig. 3D] LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R), MTRP-5 (Incyte clone number 2740029; SEQ ID NO: 5
) And rat sodium-dependent integrated vitamin transporter (GI 3015617; SEQ ID NO: 37)
Amino acid sequence alignment between

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/18 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｈ０４５ 3/00 3/08 3/06 3/10 3/08 7/00 3/10 7/06 7/00 9/06 7/06 9/10 9/06 １０１ 9/10 9/12 １０１ 11/00 9/12 11/08 11/00 13/12 11/08 15/08 13/12 17/00 15/08 17/06 17/00 17/12 17/06 19/02 17/12 19/06 19/02 19/10 19/06 21/00 19/10 21/04 21/00 25/02 21/04 25/08 25/02 25/16 25/08 25/18 25/16 25/24 25/18 25/28 25/24 27/12 25/28 27/16 27/12 29/00 １０１ 27/16 31/00 29/00 １０１ 31/04 31/00 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 35/00 31/18 35/02 35/00 37/00 35/02 37/02 37/00 37/08 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１７２，２１４ (32)優先日 平成10年12月22日(1998．12．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１２１，８９６ (32)優先日 平成11年２月26日(1999．2．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ05 QQ42 QQ52 QR08 QR31 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 BA03 CA25 DC50 NA14 ZA022 ZA062 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA202 ZA332 ZA362 ZA422 ZA452 ZA532 ZA552 ZA592 ZA662 ZA672 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB052 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB332 ZB352 ZB372 ZB382 ZC062 ZC212 ZC332 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA00 EA20 EA50 FA72 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61P 1/18 A61P 3/06 4H045 3/00 3/08 3/06 3/10 3/08 7/00 3/10 7/06 7/00 9/06 7/06 9/10 9/06 101 9/10 9/12 101 11/00 9/12 11/08 11/00 13/12 11/08 15/08 13/12 17/00 15/08 17/06 17/00 17/12 17/06 19/02 17/12 19/06 19/02 19/10 19/06 21/00 19/10 21/04 21 / 00 25/02 21/04 25/08 25/02 25/16 25/08 25/18 25/16 25/24 25/18 25/28 25/24 27/12 25/28 27/16 27/12 29 / 00 101 27/16 31/00 29/00 101 31/04 31/00 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 35/00 31/18 35/02 35/00 37 / 00 35/02 37/02 37/00 37/08 37/02 C07K 14/47 37/08 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1 / 19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/53 M C12P 21/02 33 / 566 C12Q 1/68 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/53 5/00 A 33/566 A61K 37/02 (31) Priority claim number 60/172, 214 (32) Priority date December 22, 1998 (December 22, 1998) (33) Priority claiming country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 121,896 (32) Priority date February 26, 1999 (February 26, 1999) ( 33) Priority claiming countries United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW) , SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, B , BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, C Z, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU , SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Yue, Henry 94087, USA USA Sunnyvale Louis Ave 826 (72) Inventor Tung, Wye Tom, USA 95118, San Jose Runwick Court 4230 (72) Inventor Lal, Pretty, California 95054, Santa Clara, USA Russ Drive 2382 (72) Inventor Coley, Neil Sea, USA 94040 Mountainview # 30 Dale Avenue 1240 (72) Inventor Gegler, Carl Jay USA 94025 California Menlo Park Oakland Avenue 1048 (72) Inventor Bogun, Mariah Earl United States California 94577 San Leandro Santiago Road 14244 (72) Inventor Azimzai, Yalda United States California 94545 Hayward Rock Springs Drive 2045 (72) Inventor Ryu, Dunge Aina Em United States California 95136 San Jose Park Belmont Place 55 F Term (Reference) 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ05 QQ42 QQ52 QR08 QR31 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 ZA ZA ZA ZA ZA ZA ZA ZA 422 ZA 522 ZA 422 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB052 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB332 ZB352 ZB372 ZB382 ZC062 ZC212 ZC332 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA00 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:17（SEQ ID NO:1−17）、並び
にそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製さ
れたポリペプチド。1. A substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 17 (SEQ ID NO: 1-17), and fragments thereof. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配
列同一性を有する実質的に精製された変異体。2. A substantially purified variant having at least 90% amino acid sequence identity with the amino acid sequence of claim 1. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
ポリヌクレオチド。3. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌ
クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。4. An isolated and purified polynucleotide variant sequence having at least 90% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide of claim 3. 【請求項５】 ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチ
ドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。5. An isolated and purified polynucleotide which hybridizes with the polynucleotide of claim 3 under stringent conditions. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
され精製されたポリヌクレオチド。6. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 3. 【請求項７】 ポリヌクレオチドの検出法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプル内の少なくとも一つの核酸とハ
イブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの
存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。7. A method of detecting a polynucleotide comprising: (a) hybridizing the polynucleotide of claim 6 with at least one nucleic acid in a sample, thereby forming a hybridization complex; b) a step of detecting the hybridization complex, the step of detecting the presence of the hybridization complex correlating with the presence of the polynucleotide in the sample. Law. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチド
の増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の検出法。8. The detection method according to claim 7, further comprising a step of amplifying the polynucleotide before the hybridization. 【請求項９】 SEQ ID NO:18−34及びそれらの断片からなる一群より選択
されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。9. An isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34 and fragments thereof. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと少なくと９０％のポリヌ
クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。10. An isolated and purified polynucleotide variant sequence having at least 90% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide of claim 9. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
離され精製されたポリヌクレオチド。11. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 9. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも一つの断片を
含む発現ベクター。12. An expression vector comprising at least one fragment of the polynucleotide of claim 3. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。13. A host cell containing the expression vector of claim 12. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とする製造方法。14. A method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the host cell according to claim 13 under conditions suitable for expression of the polypeptide; and (b) a medium for the host cell. And a step of recovering the polypeptide from the same. 【請求項１５】 好適な医療用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
医薬品組成物。15. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 together with a suitable medical carrier. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
抗体。16. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。17. A purified agonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。18. A purified antagonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項１９】 MTRPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療また
は予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を
含む、MTRPの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。19. A method of administering MTRP expression or activity, which comprises the step of administering an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 15 to a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with decreased MTRP expression or activity. A method of treating or preventing a disorder associated with depression. 【請求項２０】 MTRPの発現または活性の増大に関連する疾患の治療また
は予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程
を含む、MTRPの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法
。20. An increase in MTRP expression or activity, comprising the step of administering an effective amount of the antagonist of claim 18 to a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with increased MTRP expression or activity. A method of treating or preventing a related disorder.