JP2003519623A - Ｄｎａ小溝結合剤としてのジアミジン化合物 - Google Patents

Ｄｎａ小溝結合剤としてのジアミジン化合物

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JP2003519623A JP2001547085A JP2001547085A JP2003519623A JP 2003519623 A JP2003519623 A JP 2003519623A JP 2001547085 A JP2001547085 A JP 2001547085A JP 2001547085 A JP2001547085 A JP 2001547085A JP 2003519623 A JP2003519623 A JP 2003519623A
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デイビッド・ボイキン
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Abstract

(57)【要約】 フラミジンのフェニル環の一つがベンゾイミダゾールにより置換されたフラミジン類の非対称性誘導体は、純粋なＡＴ配列に対するよりも強くＤＮＡのＧＣ含有部位と結合することが定量的フットプリント分析により見出された。これらの化合物は、多層状二量体として高度協同的様式でＤＮＡの特異的ＧＣ含有配列にある小溝で結合することが示された。本発明化合物は、混合配列ＤＮＡとの選択的結合に有用であり、また遺伝子発現の調節方法、日和見感染症および癌の処置方法、並びにある種のＤＮＡ配列の検出方法で使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） この出願は、１９９９年１２月２０日付、合衆国仮出願番号６０／１７２８６
３の利益を主張するもので、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】 （政府支援の記載） この発明は、国立衛生研究所からの交付番号ＡＩ−３３３６３のもと合衆国政
府支援により行なわれた。合衆国政府はこの発明に対し、ある種の権利を有する
ものとする。
【０００３】 （発明の属する分野） この発明は、混合配列（すなわち、ＧＣおよびＡＴ塩基対）を認識し、二量体
形成を通してＤＮＡ小溝に特異的に結合する新規化合物に関するものである。
【０００４】 （発明の背景） 望ましく予測可能な方法で細胞における遺伝子発現を調節し得る分子の設計お
よび発見は、化学および生物学の共通問題における中心的な研究目標である。例
えば、Schreiber,S.L.、Bioorg.Med.Chem.６、１１２７−１１５２（１９９８）
、C.Denisonおよび T.Kodadek、Chem.Biol.５、Ｒ１２９−Ｒ１４５（１９９８
）、A.G.Papavassiliou、Molecular Medicine Today ３５８−３６６（１９９８
）、R.E.Bremerら、Chem.Biol.５、１１９−１３３（１９９８）、J.Gottesfeld
ら、Nature ３８７、２０２−２０５（１９９７）、H.Iida、Current Opinion B
iotechnology １０、２９−３３（１９９９）参照。「化学遺伝学」の発展的分
野は、標的遺伝子を認識するのに必要な選択性を有する分子を要求する。例えば
、S.Schreiber、前出、および Schreiber,S.、FASEB.J.１１、Ｍ１頁（１９９７
）。
【０００５】 若干の芳香族ジアミジン類については、ＤＮＡの小溝に結合し、有用な抗菌活
性を呈することが示されている。アリールアミジン類の抗菌作用方法の様々な仮
説が提起された。しかしながら、これらの化合物が、ＤＮＡとの複合体形成およ
びそれに続くＤＮＡ依存的微生物酵素の選択的阻害により機能するという証拠は
増大している。転写制御における介入は立証されており、構造的に多様な小溝結
合剤に関する尤もらしい作用方式であると思われる。B.P.Dasら、J.Med.Chem.２
０、５３１−５３６（１９７７）、D.W.Boykinら、J.Med.Chem.、３６、９１２
−９１６（１９９５）、A.Kumarら、Eur.J.Med.Chem.３１、７６７−７７３（１
９９６）、R.J.Lombardyら、J.Med.Chem.３１、９１２−９１６（１９９６）、R
.R.Tidwellら、Antimicrob.Agents Chemother.３７、１７１３−１７１６（１９
９３）、R.R.Tidwell、R.R.および C.A.Bell、“Pentamidine and Related Comp
ounds in Treatment of Pneumocystis carinii Infection”、Pneumocystis car
inii中、（Marcel Decker、ニューヨーク、５６１−５８３（１９９３））、D.H
endersonおよび L.H.Hurley、Nature Med.１、５２５−５２７（１９９５）、J.
Mote,Jr.ら、J.Mol.Biol.２２６、７２５−７３７（１９９４）、および D.W.Bo
ykinら、J.Med.Chem.４１、１２４−１２９（１９９８）。
【０００６】 ＤＮＡ小溝で結合する有機カチオンはまた、抗日和見感染症から抗癌特性の範
囲に及ぶ生物活性を有する。例えば、C.Bailly、Advances in DNA Sequence-Spe
cific Agents、第３巻、９７−１５６頁（L.H.Hurley編、JAIプレス・インコー
ポレイテッド、ロンドン、イギリス国、１９９８）、J.A.Mountzourisおよび L.
H.Hurley、Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids、２８８−３２３頁（S.M.Hec
ht編、オクスフォード・ユニヴァーシティー・プレス、ニューヨーク、１９９６
）、E.Hildebrantら、J.Euk.Microbiol.４５、１１２（１９９８）、および K.H
opkinsら、J.Med.Chem.４１、３８７２（１９９８）参照。上記化合物は、核酸
認識特性に関する豊富な基本的情報を提供しており、それらは核酸複合体の研究
における重要なモデルであり続けている。
【０００７】 この一連の分子のＤＮＡ小溝およびＡＴ配列認識特性は、３０年を越える間に
わたって充分に調べられてきた。例えば、C.Zimmerおよび U.Wahnert、Prog.Bio
phys.Mol.Biol.４７、３１（１９８６）、B.H.Geierstangerおよび D.E.Wemmer
、Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.２４、４６３（１９９５）、W.D.Wilson、N
ucleic Acids in Chemistry and Biology、８章（G.M.Blackburnおよび M.J.Gai
t編、IRLプレス、オクスフォード、イギリス国、１９９６）参照。化合物ネトロ
プシン（図１参照）は、Ｂ形ＤＮＡにより結晶化された最初の小溝結合性化合物
であり、複合体の構造は、ＡＴ塩基対配列特異的認識に関する分子ベースについ
て明白な示唆を与えるものであった。M.L.Kopkaら、Proc.Natl.Acad.Sci.８２、
１３７６（１９８５）。またネトロプシンの構造により、小溝結合性ネトロプシ
ン類似体、レキシトロプシンの開発が誘導され、それらはＧＣ塩基対を特異的に
認識し得るため、広範な配列認識能力を有し得るものであった。J.W.Lownら、Bi
ochemistry２５、７４０８（１９８６）、M.L.Kopkaおよび T.A.Larsen、Nuclei
c Acid Targeted Drug Design、３０３−３７４Ｃ頁（L.ProbstおよびT.J.Perun
編、マーセル・デッカー・インコーポレイテッド、ニューヨーク、１９９２）、
および M.L.Kopkaら、Structure ５、１０３３（１９９７）。上記類似体の設計
における最初の努力により、実際にＧＣ塩基対の認識性が高い化合物が提供され
たが、不運なことに得られた特異性はたいしたことがなかった。この領域におけ
る飛躍的な前進は、モノカチオン性化合物ジスタマイシン（図１）が多層状逆平
行二量体としてＤＮＡの幾つかのＡＴ配列の小溝へ結合し得るという発見により
もたらされた。J.G.Peltonおよび D.E.Wemmer、Proc.Natl.Acad.Sci.８６、５７
２３（１９８９）、および J.G.Peltonおよび D.E.Wemmer、J.Am.Chem.Soc.１１
２、１３９３（１９９０）参照。
【０００８】 ＡＴ配列に関する早期認識原理の一つは、小溝がＧＣ領域におけるよりもＡＴ
領域における方が狭いという事実であり、それは恐らくＢ形ＤＮＡにおける小溝
が二量体結合に要求される幅まで容易に広がり得るという二量体複合体の最も驚
くべき特徴であると思われる。溝の広がりは、二量体を結合させ得るだけでなく
、二量体の２分子による相補鎖認識を通じてデュプレックスにおける両鎖を認識
させる。イミダゾールによるジスタマイシンにおけるピロール基の置換により、
二量体複合体を伴うＧＣ認識特異性が改善され、このシステムにおける最近の設
計努力は、高レベルの成果を達成した。例えば、C.L.Kielkopfら、Nature Struc
t.Biol.５、１０４（１９９８）、S.Whiteら、Nature３９１、４６８（１９９８
）、C.L.Kielkopfら、Science ２８２、１１１（１９９８）、S.E.Swalleyら、J
.Am.Chem.Soc.１２１、１１１３（１９９９）、および D.M.Hermanら、J.Am.Che
m.Soc.１２１、１１２１（１９９９）参照。最近認識単位としてヒドロキシピロ
ール基を組込むことにより、ＡＴおよびＴＡ並びにＧＣおよびＣＧ塩基対は、ジ
スタマイシンに関連したピロール‐イミダゾールポリアミドによりＤＮＡ配列に
おいて有効に区別され得る。
【０００９】 ピロール−イミダゾールポリアミド系は、多層状二量体認識単位を形成するこ
とが見出された唯一の公知小溝結合性モチーフである。ネトロプシンでさえ、詳
細に構造的に特性確認された最初の小溝結合剤およびモノカチオン性ジスタマイ
シンに関係のあるジカチオン性のもの（図１）は、二量体認識単位を形成しない
。２：１ネトロプシン−ＤＮＡ複合体の最近の結晶構造によると、複合体におけ
る２個のネトロプシン分子がジスタマイシンにより観察された並んでいる二量体
の代わりに縦列単量体単位として小溝に結合していることが見出された。例えば
、X.Chenら、J.Mol.Biol.２６７、１１５７（１９９７）、X.Chenら、Nucleic A
cids Res.２６、５４６４（１９９８）、および X.Chenら、Nature Struct.Biol
.１、１６９（１９９４）参照。ネトロプシンおよび他の小溝剤、例えば図１に
示されたフラン誘導体の２つの電荷は、多層状二量体形成を阻止するものと仮定
されている。
【００１０】 最近の証拠は、モノカチオン性シアニン染料の中には、ＤＮＡ小溝において多
層状二量体の配列を形成し得るものもあることを示唆している。J.L.Seifertら
、J.Am.Chem.Soc.（投稿中、１９９９）参照。しかしながら、見たところは二量
体ＤＮＡ認識モチーフを形成しない他のモノカチオン性小溝剤、例えばヘキスト
３３２５８（図１参照）および類似体がある。これらの結果は、二量体によるＤ
ＮＡの小溝認識に関する静電的および立体化学的必要条件が非常に限定的である
ことを示しており、さらにジカチオンによる多層状二量体形成が起こりそうも無
いことを示唆してる。
【００１１】 （発明の要約） 本発明は、化合物構造に対し非常に感受性の高い方法で混合ＤＮＡ配列（すな
わちＡＴおよびＧＣ塩基対）を選択的に認識する非縮合芳香族系に基いた、発明
者らによる新種の有機ジカチオンの驚くべき発見に基いている。これらは混合配
列認識能力を有する最初の非ペプチド化合物であって、類似化合物が容易に細胞
に入り、一般的に毒性が低いため、この結果は特に有望である。K.Hopkinsら、J
.Med.Chem.４１、３８７２−３８７８（１９９８）参照。この発見の驚くべき特
徴は、認識が、ＤＮＡ結合部位における高度協同的二量体形成、すなわちジカチ
オンの場合には起こらないと予測されたプロセスを通して行われることである。
一連の化合物は、ＤＮＡの特異的認識および遺伝子発現の制御を目的とした合成
的に入手できる新規モチーフを提供する。従って、上記化合物は、日和見感染症
、癌および他の細胞増殖疾患、および遺伝子原因の疾患（すなわち、ＤＮＡの突
然変異により誘発される疾患など）の処置および予防を含む非常に多くの治療お
よび処置において有用である。さらに、ある種の本発明化合物は蛍光性であるた
め、本発明化合物により認識されるある種の特異配列の検出に有用である。
【００１２】 従って、本発明の第一態様は、式Ｉ：
【化２１】 ［式中、 Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、 Ｙは、ＣＨまたはＮであり、 Ａは、ＣＨまたはＮであり、 Ｂは、ＮＨ、ＯまたはＳから成る群から選択され、 Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、お
よびオキシアリールアルキルから成る群から選択され、 Ｒ2およびＲ9は、各々独立して、Ｈ、Ｈ2、ヒドロキシ、低級アルキル、シク
ロアルキル、アリール、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシシ
クロアルキル、アルコキシシクロアルコキシ、ヒドロキシアルキル、アミノアル
キルおよびアルキルアミノアルキルから成る群から選択され、そして Ｒ3、Ｒ4、Ｒ13およびＲ14は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、アルコキシ
アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル
、アミノアルキル、およびアルキルアミノアルキルから成る群から選択されるか
、またはＲ3およびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になってＣ2
−Ｃ10アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルキレンを表すか、またはＲ3お
よびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になって、
【化２２】 （式中、ｎは１〜３の数であり、そしてＲ10はＨまたは−ＣＯＮＨＲ11ＮＲ15Ｒ 16 （式中、Ｒ11は低級アルキルであり、Ｒ15およびＲ16は各々独立してＨおよび
低級アルキルから成る群から選択される）である）であり、 Ｌは、
【化２３】 （式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、各々個々に、Ｈ、アルキル、ハロ、アリー
ル、アリールアルキル、アミノアルキル、アミノアリール、オキソアルキル、オ
キソアリール、およびオキソアリールアルキルから成る群から選択される） から成る群から選択されるものであり、上記式Ｉの化合物は二量体形成において
小溝で混合配列ＤＮＡに結合する］ で示される化合物である。本発明の好ましい態様において、式Ｉの化合物はジカ
チオンであり、Ｌは
【化２４】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である。
【００１３】 本発明の第二態様は、ＤＮＡの試料を式Ｉの化合物と接触させることを含む混
合配列ＤＮＡの選択的結合方法である。
【００１４】 本発明の第三態様は、ＤＮＡの試料を式Ｉの蛍光性化合物と接触させ、次いで
試料における蛍光を観察することを含み、蛍光観察により混合ＤＮＡ配列が結合
されたことが示される、混合ＤＮＡ配列の検出方法である。
【００１５】 本発明の第四の態様は、医薬的に許容し得る担体中に式Ｉの化合物を含む医薬
製剤である。
【００１６】 本発明のさらに別の態様は、遺伝子発現の制御方法、微生物感染の処置方法、
癌および他の細胞増殖疾患の処置方法、および遺伝子原因疾患（すなわち、病状
が遺伝子突然変異（複数も可）により誘発される場合）の処置方法を包含する。
【００１７】 本発明の他の態様は、遺伝子発現制御用医薬または微生物感染処置用医薬の製
造を目的とした上記活性化合物の使用、または処置を必要とする対象における遺
伝子原因疾患の処置方法を含む。
【００１８】 本発明の前記および他の態様は、以下、明細書において詳細に説明されている
。
【００１９】 （図面の簡単な説明） 図１は、小溝結合性化合物ネトロプシン、ジスタマイシン、ヘキスト３３２５８
、フラミジン（ＤＢ７５）、ＤＢ２７０およびＤＢ２９３に関する化学構造を示
す。図１はまた、ここに記載されている通り、オリゴ１、オリゴ２、オリゴ２−
１およびオリゴ２−２に関するＤＮＡ配列を示す。
【００２０】 図２は、ここに記載されている２６５ｂｐ ＤＮＡフラグメントに関する化合
物ＤＢ２９３による定量的デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント滴定実験
の結果を説明している。プラスミドｐＢＳからのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限フ
ラグメントを、ＡＭＶ逆転写酵素の存在下［α−32Ｐ］ｄＡＴＰによりＥｃｏＲ
Ｉ部位で３’末端標識した。図２Ａに示されている通り、デオキシリボヌクレア
ーゼＩ消化産物を、８モル尿素含有８％ポリアクリルアミドゲルで分割した。薬
剤濃度は、ＤＢ２９３について（レーン１−１１）０、０.３、０.６、０.９、
１.２、１.５、１.８、２.１、２.４、２.７、３.０マイクロモルおよびＤＢ２
７０について（レーン１２−１５）０、１、２および５マイクロモルである。「
Ｇ」標識トラックは、グアニンに特異的なジメチルスルフェート−ピペリジンマ
ーカーを表す。ＤＮＡ標識トラックは、薬剤も酵素も全く含まなかった。ゲルの
右側の数は、フラグメントの番号付けの概略を示す。左側にある長方形は、ＤＢ
２９３に関する（白い四角）ＡＴ濃厚および（黒塗り四角）ＧＣ濃厚結合部位の
位置を示す。図２Ｂは、（白い円）ＡＴ部位５'−ＡＡＴＴＡＡおよび（黒塗り
四角）ＧＣ濃厚部位５'−ＡＣＣＡＴＧへのＤＢ２９３の結合に関するフットプ
リントプロットを示した図である。相対バンド強度ＲはＩＣ／ＩＯ比に対応し、
この場合ＩＣはリガンド濃度ｃでのバンド強度であり、ＩＯはＤＢ２９３の不存
在下における同バンドの強度である。図２Ｃに示された示差的開裂プロットは、
（黒塗りの円）５マイクロモルＤＢ２７０または（白い四角）１.５マイクロモ
ルＤＢ２９３の存在下でのデオキシリボヌクレアーゼＩによる切断に対するＤＮ
Ａの感受性を比較している。文字配列に向かう点の偏差（負の値）は、リガンド
保護部位に対応し、離れていく方の偏差（正の値）は高い開裂を表す。縦の目盛
はｌｎ（ｆa）−ｌｎ（ｆc）の単位であり、ここでｆaは薬剤存在下における結
合での開裂分率（fractional cleavage）であり、ｆcは対照における同結合の開
裂分率である。結果は、便宜上対数目盛で示されている。配列下の長方形は、（
白い四角）ＡＴ結合部位および（黒塗りの四角）ＧＣ濃厚部位の位置を示す。
【００２１】 図３は、オリゴ１およびオリゴ２−１へのＤＢ２９３およびＤＢ２７０の結合
に関する結果のスキャッチャードプロットを示し、加えて最適結合曲線が示され
ている。黒塗り三角および白い三角は、それぞれオリゴ１へのＤＢ２９３および
ＤＢ２７０結合性に関するものである。黒塗り円および白い円は、それぞれオリ
ゴ２−１へのＤＢ２９３およびＤＢ２７０結合性に関するものである。オリゴ２
−１へのＤＢ２７０の結合は弱いため、結果はデュプレックスへの単一ＤＢ２７
０結合の仮定と適合していた。このプロットに関するデータによるセンサーグラ
ムは図６に示されている。
【００２２】 図４は、（上部、Ａ）遊離ＤＮＡ、（中間部、Ｂ）ＤＢ２９３対オリゴ２−１
の１：１比試料、および（下部、Ｃ）２：１比について示されたＴＨ６−ＴＣＨ
３スペクトル領域の二次元ＣＯＳＹスペクトルである。１：１比試料中における
遊離ＤＮＡおよび２：１複合体に関するシグナルは、上部および下部スペクトル
へ線を結ぶことにより示されている。
【００２３】 図５は、オリゴ２−１とＤＢ２７０およびＤＢ２９３の複合体に関する割合の
関数としてＴｍ曲線を示す。黒塗り円は遊離ＤＮＡを示し、黒塗り三角および白
い三角はそれぞれ１：１および２：１比でのＤＢ２９３を示し、黒塗り四角およ
び白い四角はそれぞれ１：１および２：１比でのＤＢ２７０を示す。
【００２４】 図６は、（上部、Ａ）オリゴ２−１および（下部、Ｂ）オリゴ１へのＤＢ２７
０およびＤＢ２９３の結合に関するセンサーグラムを示す。薬剤濃度の範囲は１
ナノモルから１マイクロモルである。
【００２５】 （好ましい態様の詳細な記載） 以下、添付図面を参照しながら本発明についてさらに詳しく記載し、本発明の
好ましい態様を示す。しかしながら、この発明は異なる形態で具体化され得るも
ので、ここに示された態様に限定されるものとみなすべきではない。むしろ、こ
れらの態様は、この開示が徹底的かつ完全なものとなり、当技術分野における熟
練した専門家に本発明の範囲を完全に伝えるために提供されている。
【００２６】 特記しない場合、ここに使用されている技術および科学用語は全て、この発明
が属する技術分野における通常熟練者により一般に理解されているものと同じ意
味を有する。ここに挙げられている出版物、特許出願、特許および他の参考文献
は全て、出典明示により本明細書の一部とする。
【００２７】 ヌクレオチド配列は、左から右へ５'から３'方向で一本鎖のみによりここでは
提示されている。ヌクレオチドは、３７ＣＦＲ§１.８２２および確立された慣
用法に従いＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨された方式でここで
は示されている。例えば、PatentIn User Manual、９９−１０２（１９９０年１
１月）（米国特許局）参照。
【００２８】 本発明のある種の目的、利益および新規特徴は、後続の記載事項に示されてお
り、下記事項を調べると当技術分野における熟練者には明白なものとなるはずで
あるか、または本発明の実践により知識が体得され得る。
【００２９】 ここで使用されている「アルキル」の語は、Ｃ1−10の両端を含め、線状、分
枝状または環状、飽和または不飽和（すなわち、アルケニルおよびアルキニル）
炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブ
テニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブ
チニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアレニル基を包含する。
ここで使用されている「アシル」の語は、カルボキシル基の−ＯＨが別の置換基
により置換された（すなわち、ＲＣＯ−により表されたところによると、Ｒはア
ルキルまたはアリール基である）有機酸基を包含する。普通の意味で「アシル」
の語は、具体的にはアリールアシル基を包含する。アシル基の具体例は、アセチ
ルおよびベンゾイルを包含する。ここで使用されている「アリール」の語は、５
および６員炭化水素および複素環芳香族環を指す。アリール基の具体例には、シ
クロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリ
ジン、イミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジ
ン、ピリミジンなどがあるが、これらに限定されるわけではない。ここで使用さ
れている「アルコキシル」の語は、Ｃ1−10の両端を含め、線状、分枝状または
環状飽和または不飽和オキソ炭化水素鎖、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキ
シ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシおよびペントキシを包含する。こ
こで使用されている「アリールオキシル」の語は、フェニルオキシルまたはヘキ
シルオキシル、およびアルキル、ハロ、またはアルコキシル置換フェニルオキシ
ルまたはヘキシルオキシルを包含する。ここで使用されている「置換アルキル」
および「置換アリール」の語は、ここで定義されたアルキルおよびアリール基を
包含し、その場合アリールまたはアルキル基の１個またはそれ以上の原子または
官能基は、別の原子または官能基、例えばハロゲン、アリール、アルキル、アル
コキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ス
ルフェートおよびメルカプトにより置換されている。ここで使用されている「ハ
ロ」、「ハライド」、または「ハロゲン」の語は、フルオロ、クロロ、ブロモお
よびヨード基を包含する。
【００３０】 ここで使用されている「混合配列ＤＮＡ」の語は、ＧＣ塩基対およびＡＴ塩基
対を含むＤＮＡの配列を指す。
【００３１】 本発明の式Ｉで示される化合物（以後、「活性化合物」と称す）は、ＤＮＡの
混合配列、すなわちＧＣおよびＡＴ塩基対の結合に有用である。意外なことに、
活性化合物は、多層状二量体として高度協同的方法で特異的ＧＣ含有配列におけ
るＤＮＡの小溝で結合する。本発明化合物はＤＮＡの特異的混合配列に結合し得
るため、それらは例えば遺伝子転写での介入による遺伝子発現の制御に有用であ
る。従って、活性化合物は、例えばニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis
carinii）などの日和見感染症の処置、癌および他の増殖性疾患の処置、および
例えば特定遺伝子における突然変異により誘発される遺伝子疾患（例、嚢胞性線
維症、成人多嚢胞病、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症
など）の処置における医薬用途を有し得る。さらに、ある種の本発明化合物は蛍
光性であるため（すなわち、図１に示されたＤＢ２９３）、それらは当業界公知
の蛍光検出方法を通して化合物により結合された特定ＤＮＡ配列を検出するのに
有用である。
【００３２】 本発明の活性化合物は、K.Hopkinsら、J.Med.Chem.４１、３８７２−３８７８
（１９９８）で示された方法により製造され得る。本発明の活性化合物はまた、
下記要領で修正が加えられた、R.Kadaら、Collect.Czech.Chem.Comm.３８、１７
００−１７０４（１９７３）で示された方法により製造され得、この開示につい
ても出典明示により本明細書の一部とする。さらに、活性化合物は医薬的に許容
し得る塩類として投与され得る。上記塩類には、グルコン酸、乳酸、酢酸、酒石
酸、クエン酸、燐酸、ホウ酸、硝酸、硫酸および塩酸塩類がある。本発明の塩類
は、一般に、溶解状態で２当量の塩基化合物を所望の酸と反応させることにより
製造され得る。反応完了後、塩が不溶性である適量の溶媒を加えることにより溶
液から塩類が結晶化される。
【００３３】 上記で示したところによると、本発明方法は、日和見微生物感染症、例えばニ
ューモシスティス・カリニ（P.carinii）およびジアルジア・ランブリア（Giard
ia lamblia）の処置に有用である。これらの化合物はまた、真菌感染症、例えば
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォル
マンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergill
us fumigatus）、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）およびそれらの組み
合わせの処置に有用であり得る。本発明方法は、病状の徴候、増大または展開を
阻害し、病状の退縮を誘発し、病状を回復させ、または他の点で罹患しているか
または病気に罹る危険に瀕した対象の全般的な満足すべき状態を改善するという
点でこれらの病状の処置に有用である。
【００３４】 本発明化合物は、感染症および他の疾患の処置を目的とする方法だけでなく、
酵素、例えばトポイソメラーゼの阻害方法でも有用である。
【００３５】 本発明方法により処置される対象は一般的にはヒト対象であるが、本発明方法
は当業界に精通した者には周知の適当な対象の場合でも有用であり得る。
【００３６】 上記で示したところによると、本発明は、下記でさらに詳細に検討されている
通り経口、静脈内またはエーロゾル投与用の医薬的に許容し得る担体中に前述の
活性化合物、またはその医薬的に許容し得る塩類を含む医薬製剤を提供する。ま
た、本発明は、凍結乾燥されたもので、再構成されて静脈内または筋肉内注射に
よる投与用の医薬的に許容し得る製剤を形成し得る上記化合物またはその塩類を
提供する。
【００３７】 特定化合物の治療有効量、本発明の範囲に含まれる用途は、化合物および患者
によって幾分変化し、患者の状態および送達経路により異なる。一般的な案とし
て、約０.１〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量が治療効果を有し、塩が使用される場合
を含め、重量は全て活性化合物の重量に基いて計算される。高レベルでの毒性に
関する懸念により、静脈内用量は低レベル、例えば約１０ｍｇ／ｋｇ以下に制限
され得、塩が用いられる場合を含め、重量は全て活性基剤の重量に基いて計算さ
れる。約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量が経口投与に使用され得る。
典型的には、約０.５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量が筋肉内注射に使用され
得る。好ましい用量は、静脈内または経口投与の場合１マイクロモル／ｋｇ〜５
０マイクロモル／ｋｇ、さらに好ましくは２２マイクロモル／ｋｇおよび３３マ
イクロモル／ｋｇの化合物である。処置の持続時間は通常２〜３週間の期間また
は病状が本質的に制御されるまで１日１回である。低頻度で低用量の投与は、感
染の再発生を阻止または低減化すべく予防的に使用され得る。
【００３８】 本発明方法によると、ここに記載されている医薬的活性化合物またはその医薬
的に許容し得る塩類は、固体または液体として経口投与され得るか、または溶液
、懸濁液または乳剤として筋肉内投与または静脈内投与され得る。別法として、
化合物または塩類はまた、リポソーム懸濁液として吸入、静脈内または筋肉内的
に投与され得る。吸入による投与時、活性化合物または塩は、約０.５〜約５ミ
クロン、好ましくは約１〜約２ミクロンの粒子サイズを有する複数の固体粒子ま
たは小滴形態をとるべきである。
【００３９】 本発明はまた、静脈内または筋肉内注射に適した医薬組成物を提供する。医薬
組成物は、ここに記載された式(I)の化合物、またはその医薬的に許容し得る塩
を医薬的に許容し得る担体中に含む。溶液が望ましい場合、水は水溶性化合物ま
たは塩類に関して特に好適な担体である。水不溶性化合物または塩類については
、有機賦形剤、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ールまたはそれらの混合物が好適であり得る。後者の場合、有機賦形剤はかなり
の量の水を含み得る。いずれの場合にしても溶液は、次に当業界公知の適当な方
法で、典型的には０.２２ミクロンフィルターに通す濾過により滅菌され得る。
滅菌に続いて、溶液は、適当な容器、例えば脱発熱物質（depyrogenated）ガラ
スビン中に分配され得る。勿論、分配は、好ましくは無菌方法により行われる。
次いで、滅菌閉鎖物がビンに配置され得、所望ならばビン内容物は凍結乾燥され
得る。
【００４０】 式(Ｉ)の化合物またはそれらの塩類に加えて、医薬組成物は、他の添加物、例
えばｐＨ調節性添加剤を含み得る。特に、有用なｐＨ調節剤には、酸、例えば塩
酸、塩基または緩衝液、例えば乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、燐酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはグルコン酸ナトリウムがある
。さらに、組成物は、微生物予防剤を含み得る。有用な微生物予防剤には、メチ
ルパラベン、プロピルパラベンおよびベンジルアルコールがある。微生物予防剤
は、典型的には製剤が多重投与用に設計されたビンに入れられるときに使用され
る。勿論、示された通り、本発明医薬組成物は、当業界でよく知られた技術を用
いて凍結乾燥され得る。
【００４１】 本発明のさらに別の態様では、密閉容器中単位用量形態で、式(Ｉ)の化合物ま
たはその塩を含む注射可能な安定した滅菌組成物が提供される。化合物または塩
は、適当な医薬的に許容し得る担体により再構成され、対象へのその注射に適し
た液体組成物を形成し得る凍結乾燥物形態で提供される。単位用量形態は、典型
的には約１０ｍｇ〜約１０グラムの化合物または塩を含む。化合物または塩が実
質的に水不溶性である場合、生理学的に許容し得る乳化剤の充分量が、水性担体
中で化合物または塩を乳化するのに充分な量で使用され得る。上記の有用な一乳
化剤はホスファチジルコリンである。
【００４２】 他の医薬組成物もここに開示された水不溶性化合物またはその塩類から例えば
水性基剤エマルジョンとして製造され得る。かかる場合に、組成物は、充分量の
医薬的に許容し得る乳化剤を含むことにより、目的量の化合物またはその塩を乳
化させる。特に有用な乳化剤にはホスファチジルコリンおよびレシチンがある。
【００４３】 さらに、本発明は、ここに開示された化合物およびその塩類のリポソーム製剤
を提供する。リポソーム懸濁液を形成させる技術は当業界では公知である。化合
物またはその塩が水溶性塩であるとき、慣用的リポソーム技術を用いることによ
り、同物質は脂質小胞に組込まれ得る。かかる場合では、化合物または塩が水溶
性であるため、化合物または塩は、リポソームの親水性中心部またはコア内に実
質的に吸収される。使用される脂質層は、慣用的な組成物から成り得、コレステ
ロールを含み得るかまたはコレステロール不含有であり得る。興味の対象である
化合物または塩が水不溶性であるとき、同じく慣用的リポソーム形成技術を用い
ることにより、塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質２層内へ実質的に
吸収され得る。いずれの場合にしても、生成されるリポソームは、標準音波処理
およびホモジネート化技術の使用を通すためサイズが縮小され得る。
【００４４】 勿論、ここに開示された化合物またはその塩類を含むリポソーム製剤を凍結乾
燥することにより、凍結乾燥物が生成され得、医薬的に許容し得る担体、例えば
水により再構成させることにより、リポソーム懸濁液が再生され得る。
【００４５】 また、エーロゾルとして、吸入による投与に適した医薬製剤も提供される。こ
れらの製剤は、ここに記載された目的化合物またはその塩の溶液または懸濁液、
または化合物または塩の複数の固体粒子を含む。所望の製剤は、小チャンバーに
入れられ、噴霧され得る。噴霧化は圧縮空気または超音波エネルギーにより達成
され、化合物または塩類を含む複数の液体小滴または固体粒子が形成され得る。
液体小滴または固体粒子は、約０.５〜約１０ミクロン、さらに好ましくは約０.
５〜約５ミクロンの範囲の粒子サイズを有するべきである。固体粒子は、当業界
公知の何らかの適当な方法、例えば微粉化で、固体化合物またはその塩を加工処
理することにより入手され得る。最も好ましくは、固体粒子または小滴のサイズ
は約１〜約２ミクロンとなる。この点で、市販の噴霧器はこの目的の達成に利用
され得る。化合物は、米国特許第５６２８９８４号（出典明示により本明細書の
一部とする）に示された方法で呼吸に適する粒子のエーロゾル懸濁液により投与
され得る。
【００４６】 好ましくは、エーロゾルとしての投与に適した医薬製剤が液体形態であるとき
、製剤は、水を含む担体中に水溶性化合物またはその塩を含む。噴霧化されると
き所望のサイズ範囲内の小滴を形成させるのに充分な程度まで製剤の表面張力を
低下させる界面活性剤も存在し得る。
【００４７】 上記の通り、本発明は、水溶性および水不溶性化合物およびその塩類の両方を
提供する。本明細書で使用されている「水溶性」の語は、約５０ｍｇ／ｍＬまた
はそれを越える量で水に可溶性である組成物を定義するものとする。また、本明
細書で使用されている「水不溶性」の語は、水に対する溶解度が約２０ｍｇ／ｍ
Ｌより低い組成物を定義するものとする。ある種の適用例では水溶性化合物また
は塩類が望ましいものであり得、同様に他の適用例では水不溶性化合物または塩
類が望ましいものであり得る。
【００４８】 以下、実施例により、本発明の説明を行うが、発明を制限するものとみなすべ
きではない。
【００４９】 （実施例） 実施例１ 式Ｉの化合物の合成 修正された文献方法（R.Kadaら、Collect.Czech.Chem.Comm.３８、１７００−
１７０４（１９７３））に従い、１５０℃で２２時間（窒素下）ＤＭＦ（２５ｍ
ｌ）およびニトロベンゼン（５ｍｌ）から成る混合物中５−（４−ニトロフェニ
ル）フルフラル（１０ミリモル）を４−ニトロ−１,２−フェニレンジアミン（
１０ミリモル）と反応させることにより、２−［５（６）−ニトロ−２−ベンゾ
イミダゾイル］−５−（４−ニトロフェニル）フランを製造した。室温に冷却す
ると、懸濁した固体が得られ、これをＭｅＯＨ（３０ｍｌ）で希釈し、集め、最
後にエーテルで充分にすすいだ。収率：２.５６ｇ、７３％；ｍｐ３５０−３５
１℃分解；文献値ｍｐ３４８−３５０℃）。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：７.
５１（ｄ,Ｊ＝３.７Ｈｚ、１Ｈ）、７.５７（ｄ,Ｊ＝３.７Ｈｚ、１Ｈ）、７.７
８（ｄ,Ｊ＝８.９Ｈｚ、１Ｈ）、７.９４（ｓ,１Ｈ）、８.１４（ｄｄ,Ｊ＝８.
９、２.２Ｈｚ、１Ｈ）、８.１７（ｄ,Ｊ＝８.８Ｈｚ、２Ｈ）、８.３６（ｄ,Ｊ
＝９.１Ｈｚ、２Ｈ）、８.４７（ｄ,Ｊ＝１.７Ｈｚ、１Ｈ）（ベンゾイミダゾー
ルＮＨは観察されなかった）。
【００５０】 ２−［５（６）−アミノ−２−ベンゾイミダゾイル］−５−（４−アミノフェ
ニル）フラン。ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）中２−［５（６）−ニトロ−２−ベンゾ
イミダゾイル］−５−（４−ニトロフェニル）フラン（２.６３ｇ、７.５ミリモ
ル）の懸濁液に、塩化錫２水和物（１６.０ｇ、７１ミリモル）を加え、混合物
を窒素下激しく攪拌しながら３時間還流することにより、溶液が得られた。室温
で一夜攪拌後、ＮａＯＨ水溶液を加えることにより溶液を塩基性にし、固体をＥ
ｔＯＡｃにより抽出した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）および濾過後、溶媒を減圧除去し
、残留物をＥｔＯＨに溶かした。次いで、この溶液を水で希釈することにより、
帯緑黄色の固体が得られ、これを集め、デシケーター（Ｐ2Ｏ5）で乾燥した。収
率：０.９５ｇ、４４％；ｍｐ１６１−１６５℃分解。ビス‐ニトロ誘導体とは
対照的に、このビス‐アミンの1Ｈ ＮＭＲがかなり複雑であったということは、
それが２種の可能な互変異性体の混合物として存在することを示している。ＨＣ
ｌ／ＥｔＯＨに遊離塩基の試料を溶かした後濃縮することにより製造された、塩
酸塩の1Ｈ ＮＭＲはそれほど複雑ではなかった（ＤＭＳＯ−ｄ6、Ｄ2Ｏ）：７.
１７（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）、７.２１（ｄ,Ｊ＝３.７Ｈｚ、１Ｈ）、７.３
０（ｄｄ,Ｊ＝８.７、１.９Ｈｚ、１Ｈ）、７.６３（ｄ,Ｊ＝１.９Ｈｚ、１Ｈ）
、７.７４（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、１Ｈ）、７.７８（ｄ,Ｊ＝３.８Ｈｚ、１Ｈ）、
７.９４（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）。
【００５１】 ２−［５（６）−グアニジノ−２−ベンゾイミダゾイル］−５−（４−グアニ
ジノフェニル）フラン。乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）に２−［５（６）−アミノ−２
−ベンゾイミダゾイル］−５−（４−アミノフェニル）フラン（０.３６３ｇ、
１.２５ミリモル）および１,３−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル
−２−チオプソイド尿素（０.７５５ｇ、２.６０ミリモル）を溶かした冷却溶液
に、トリエチルアミン（０.７８ｇ、７.７１ミリモル）、次いで塩化水銀（II）
（０.７８ｇ、２.８７ミリモル）を加え、生成した懸濁液を周囲温度で３日間攪
拌した。ＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、セライトで濾過後、黒ずんだ溶液を飽和Ｎａ2Ｃ
Ｏ3溶液、水（３回）、および最後に食塩水で充分に洗浄した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ 4 ）後、溶媒を減圧除去し、残存油状物をＭｅＯＨで希釈すると、ＢＯＣ−保護
ビス‐グアニジンが２クロップ（０.５８ｇ）で淡緑色固体として得られた。生
成物をＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨから再沈澱により精製すると、部分濃縮後、けばだ
った淡緑色固体（０.４２ｇ、４３％）が得られた、ｍｐ＞４００℃分解、暗色
化＞３００℃。
【００５２】 脱保護するため、ＣＨＣｌ3（１２ｍｌ）およびＥｔＯＨ（１０ｍｌ）に保護
ビス‐グアニジンを溶かした溶液を、０−５℃で乾燥ＨＣｌにより飽和させ、２
日間室温で攪拌させると、オレンジ色に着色した懸濁液が得られた。溶媒を減圧
除去後、固体を熱ＥｔＯＨ（６０ｍｌ）中にとり、小量の不溶性物質を濾過し、
溶媒を再除去した。エーテルで磨砕後、黄色固体を集め、５０−６０℃で３日間
真空乾燥した。収率：０.２４ｇ、９２％（ビス‐アミンから全部で４０％）。1 Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：７.２４（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、１Ｈ）、７.３３（
ｄ,Ｊ＝３.６Ｈｚ、１Ｈ）、７.３８（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）、７.５１（ｂ
ｒ ｓ、３Ｈ）、７.５７（ｓ、１Ｈ）、７.６４（ｂｒ ｓ、３Ｈ）、７.６８（
見かけ上ｓ、１Ｈ）、７.７４（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ、１Ｈ）、８.０５（ｄ、Ｊ＝
８.５Ｈｚ、２Ｈ）、１０.０５（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、１０.１９（ｂｒ ｓ、１Ｈ
）。ＦＡＢＭＳ（チオグリセリン）：ｍ／ｚ３７５（１００）。ＦＡＢＨＲＭＳ
：Ｃ19Ｈ18Ｎ8Ｏ（ＭＨ＋）に関する計算値：３７５.１６８２。実測値：３７５
.１６７０。元素分析．Ｃ19Ｈ18Ｎ8Ｏ・３ＨＣｌ・２Ｈ2Ｏに関する計算値：Ｃ
、４３.９０、Ｈ、４.８５、Ｎ、２１.５６、Ｃｌ、２０.４６。実測値：Ｃ、４
３.６８、Ｈ、４.４７、Ｎ、２０.６８、Ｃｌ、２０.４６。
【００５３】 １−［（５−ブロモベンゾ［ｂ］フラン−２−イル］−３−ジメチルアミノプ
ロパン塩酸塩。１５０ｍｌのエタノール中２−アセチル−５−ブロモベンゾ［ｂ
］フラン（２３.９ｇ、０.１モル）、ジメチルアミン塩酸塩（８.１５ｇ、０.１
モル）、パラホルムアルデヒド（３.６ｇ）および２ｍｌの３５％塩酸から成る
混合物を、２０時間還流加熱した（後にＴＬＣを行った）。溶媒量を減圧下５０
ｍｌに減らし、アセトン：エーテル（１：２）の混合物を加え、生成した固体を
濾過し、エーテルで洗浄し、２４時間真空オーブン中４５℃で乾燥すると、２３
.０ｇ（６９％）が得られた、ｍｐ１８５−１８７℃分解。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ6）：８.０７（ｄ、Ｊ＝２.０Ｈｚ、１Ｈ）、７.９１（ｓ、１Ｈ）、７.
７０（ｄ、Ｊ＝８.８Ｈｚ、１Ｈ）、７.６６（ｄｄ、Ｊ＝２.０Ｈｚ、Ｊ＝８.８
Ｈｚ、１Ｈ）、３.５８（ｔ、Ｊ＝７.２、２Ｈ）、３.４１（ｔ、Ｊ＝７.２、２
Ｈ）、２.７８（ｓ、６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１８６.７、１５
３.７、１５２.２、１３１.２、１２８.８、１２６.０、１１６.２、１１４.３
、１１３.５、５１.０、４２.２、３３.３。小量（約５％）の対応する除去生成
物（ビニルケトン）の存在が、1Ｈ ＮＭＲから明白であった。生成物を次の段階
で直接使用し、それ以上精製はしなかった。
【００５４】 １−［（５−ブロモベンゾ［ｂ］フラン−２−イル］−４−（４−ブロモフェ
ニル）ブタン−１,４−ジオン。１８０ｍｌジオキサン中上記マンニッヒ塩基（
１６.６ｇ、０.０５モル）、３−ベンジル−５（２−ヒドロキシエチル）−４−
メチルチアゾリウムクロリド触媒（０.６８、０.００２５モル）、トリエチルア
ミン（１５.１５ｇ、０.１５モル）および４−ブロモベンズアルデヒド（９.２
５ｇ、０.０５モル）から成る混合物を１２時間（窒素下）還流加熱した。溶媒
を減圧下除去し、残留物を水で処理した。生成したゴム質物質を１５０ｍｌのク
ロロホルムで抽出した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧下除去した。
残留物をＥｔＯＨ：エーテル（１：１）で処理し、残存固体を濾過し、エーテル
で洗浄し、乾燥すると、７.４ｇ（３４％）が得られた、ｍｐ１７６−１７７℃
。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：８.０３（ｄｄ、Ｊ＝０.４および１.５Ｈｚ、
１Ｈ）、７.９１（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、２Ｈ）、７.８２（ｄ、Ｊ＝０.４、１Ｈ
）、７.７２（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、２Ｈ）、７.６８（ｄ、Ｊ＝８.８、１Ｈ）、
７.６４（ｄｄ、Ｊ＝１.５および８.８Ｈｚ、１Ｈ）、３.４０−３.４５（ｍ、
２Ｈ）、３.３７−３.３３（ｍ、２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１９
７.３、１８８.９、１５３.５、１５２.７、１３５.２、１３１.５、１３０.７
、１２９.６、１２８.８、１２７.０、１２５.７、１１５.９、１１４.１、１１
２.４、３２.３、３２.０。ＭＳ ｍ／ｅ４３６（Ｍ＋）。元素分析、Ｃ18Ｈ12Ｂ
ｒ2Ｏ3に関する計算値、Ｃ、４９.５７、Ｈ、２.７７。実測値：Ｃ、４９.４９
、Ｈ、２.７４。
【００５５】 ２−［（５−ブロモベンゾ［ｂ］フラン−２−イル］−５−（４−ブロモフェ
ニル）フラン。１５０ｍｌのＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１：１）に上記ジケトン（
８.７２ｇ、０.０２モル）を溶かした溶液をＨＣｌガスで飽和させ、室温で４時
間攪拌した（後続してＴＬＣを行った）。溶媒を減圧下除去し、残留物を２００
ｍｌの１０％ＮａＨＣＯ3水溶液と攪拌し、濾過し、水で洗浄し、乾燥し、エー
テル：ＣＨ2Ｃｌ2（４：１）から再結晶化すると、白色固体７.１ｇ（８５％）
が得られた、ｍｐ２０４−２０６℃。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：７.８６（
ｄ、Ｊ＝２.０、１Ｈ）、７.７６（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、２Ｈ）、７.６５（ｄ、
Ｊ＝８.４、２Ｈ）、７.５８（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１Ｈ）、７.４５（ｄｄ、Ｊ
＝２.０および８.４Ｈｚ、１Ｈ）、７.２３（ｓ、１Ｈ）、７.１７（ｄ、Ｊ＝４
.０Ｈｚ、１Ｈ）、７.１１（ｄ、Ｊ＝４.０Ｈｚ、１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ6）：１５２.９、１５２.７、１４８.０、１４４.１、１３１.６、１３０
.４、１２８.４、１２７.０、１２５.５、１２３.３、１２０.９、１１５.５、
１１２.７、１１１.２、１０８.６、１０１.１。ＭＳ ｍ／ｅ４３６（Ｍ＋）。
元素分析、Ｃ18Ｈ12Ｂｒ2Ｏ3に関する計算値、Ｃ、４９.５７、Ｈ、２.７７。実
測値：Ｃ、４９.４９、Ｈ、２.７４。
【００５６】 ２−［（５−シアノベンゾ［ｂ］フラン−２−イル］−５−（４−シアノフェ
ニル）フラン。６０ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリジノンに上記ジブロモ化合物
（８.３６ｇ、０.０２モル）およびＣｕＣＮ（５.３４ｇ、０.０６モル）から成
る混合物を４時間還流加熱（窒素下）し、冷却し、水で希釈し、２００ｍｌの１
０％ＮａＣＮ水溶液と３時間攪拌した。固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。
粗生成物をＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１：１）に溶かし、中性アルミナによるクロ
マトグラフィーにかけると、淡黄色固体４.３５ｇ（７０％）が得られた、ｍｐ
２４７−２４８℃。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：８.１８（ｄ、Ｊ＝１.６Ｈ
ｚ、１Ｈ）、７.９８（ｄ、Ｊ＝８.０Ｈｚ、２Ｈ）、７.８８（ｄ、Ｊ＝８.０、
２Ｈ）、７.８１（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１Ｈ）、７.７３（ｄｄ、Ｊ＝１.６およ
び８.４Ｈｚ、１Ｈ）、７.４１（ｓ、１Ｈ）、７.３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３.６Ｈ
ｚ）、７.２１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３.６Ｈｚ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：
１５５.６、１５２.４、１４８.４、１４４.７、１３２.９、１３２.６、１２８
.８、１２８.３、１２６.１、１２４.１、１１８.６、１１８.３、１１２.３、
１１１.９、１１１.２、１０６.４、１０１.９。ＭＳ ｍ／ｅ３１０（Ｍ＋）。
元素分析、Ｃ20Ｈ10Ｎ2Ｏ2に関する計算値、Ｃ、７７.４１、Ｈ、３.２５、Ｎ、
９.０２。実測値：Ｃ、７７.４１、Ｈ、３.２６、Ｎ、８.９５。
【００５７】 ２−［（５−アミジノベンゾ［ｂ］フラン−２−イル］−５−（４−アミジノ
フェニル）フラン２塩酸塩。７０ｍｌのエタノール中上記ジシアノ化合物（３.
１ｇ、０.０１モル）を、０−５℃で乾燥ＨＣｌガスにより飽和させ、次いで室
温で８日間攪拌した（ＩＲおよびＴＬＣによりモニターした）。エーテルを混合
物に加え、黄色イミデートエステル２塩酸塩を濾過し、エーテルで洗浄した。固
体を５０℃で２４時間真空中で乾燥すると、４.３ｇ（９３％）が得られた。固
体をそれ以上精製せずに次の段階で直接使用した。
【００５８】 ２０ｍｌのエタノール中イミデートエステル２塩酸塩（１.４３ｇ、０.００３
モル）の懸濁液を、アンモニアガスで飽和させ、２４時間攪拌し、溶媒を減圧下
除去した。固体を水に懸濁し、ｐＨを９に調節し、オフホワイト固体を濾過した
。固体をＨＣｌ飽和エタノール中で攪拌し、黄色塩を濾過し、７５℃で２４時間
真空オーブン中で乾燥すると、０.７ｇ（６８％）が得られた、ｍｐ３２０分解
。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6／Ｄ2Ｏ）：８.２０（ｄ、Ｊ＝１.２、１Ｈ）、８
.０１（ｄ、Ｊ＝８.０Ｈｚ、２Ｈ）、７.７４（ｄ、Ｊ＝８.０、２Ｈ）、７.８
２（ｄ、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１Ｈ）、７.７８（ｄｄ、Ｊ＝１.２および８.４Ｈｚ、
１Ｈ）、７.４７（ｓ、１Ｈ）、７.３７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３.６Ｈｚ）、７.２０
（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３.６Ｈｚ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１６５.７、１
６４.８、１５６.７、１５２.８、１４８.６、１４５.０、１３４.０、１２８.
９、１２８.７、１２６.４、１２４.９、１２３.９、１２３.３、１２２.０、１
１２.１、１１１.８、１１１.２、１０２.５。ＦＡＢＭＳ ｍ／ｅ３４５（Ｍ＋
＋１）。元素分析、Ｃ20Ｈ16Ｎ4Ｏ2・２ＨＣｌ・０.５Ｈ2Ｏに関する計算値、Ｃ
、５６.３６、Ｈ、４.４９、Ｎ、１３.１４。実測値：Ｃ、５６.７３、Ｈ、４.
７１、Ｎ、１２.７１。
【００５９】 実施例２ ＤＮＡフィンガープリント試験 フラミジンの一連の類似体（図１に示されている）のＤＮＡ認識特性について
特性確認するため、幾つかの異なるＤＮＡ配列をもつ若干の誘導体を用いて、定
量的デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント試験を行った。C.Baillyら、Bi
ochemistry３５、１１５０（１９９６）および C.Baillyら、Anti Cancer Drug
Design（投稿中、１９９９）における記載に従い、プラスミドＤＮＡ制限フラグ
メントを製造し、デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント実験を実施した。
【００６０】 図２は、ここに記載された２６５ｂｐ ＤＮＡフラグメントにおける化合物Ｄ
Ｂ２９３による定量的デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント滴定実験の結
果を示す。プラスミドｐＢＳからのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII制限フラグメントは、
ＡＭＶ逆転写酵素の存在下［α−32Ｐ］ｄＡＴＰによりＥｃｏＲＩ部位が３'末
端標識されていた。図２Ａで概説されている通り、デオキシリボヌクレアーゼＩ
消化産物を、８モル尿素含有８％ポリアクリルアミドゲルで分割した。薬剤濃度
は、（レーン１−１１）ＤＢ２９３に関して０、０.３、０.６、０.９、１.２、
１.５、１.８、２.１、２.４、２.７、３.０マイクロモルおよび（レーン１２−
１５）ＤＢ２７０に関して０、１、２および５マイクロモルである。「Ｇ」標識
トラックは、グアニンに特異的なジメチルスルフェート‐ピペリジンマーカーを
表す。ＤＮＡ標識トラックは、薬剤も酵素も全く含まなかった。ゲルの右側の番
号は、フラグメントの番号付けの概略を示す。左側の長方形は、ＤＢ２９３に関
する（白い四角）ＡＴ濃厚および（黒塗り四角）ＧＣ濃厚結合部位の位置を示す
。図２Ｂは、（白い円）ＡＴ部位５'−ＡＡＴＴＡＡおよび（黒塗りの四角）Ｇ
Ｃ濃厚部位５'−ＡＣＣＡＴＧへのＤＢ２９３の結合性に関するフットプリント
プロットの概略図である。相対バンド強度ＲはＩＣ／ＩＯ比に対応しており、こ
の場合ＩＣはリガンド濃度ｃにおけるバンドの強度であり、ＩＯはＤＢ２９３の
不存在下における同バンドの強度である。図２Ｃに示された種々の開裂プロット
は、（黒塗り円）５マイクロモルＤＢ２７０または（白い四角）１.５マイクロ
モルＤＢ２９３の存在下でのデオキシリボヌクレアーゼＩによる切断に対するＤ
ＮＡの感受性を比較している。文字配列に向かう点の偏差（負の値）はリガンド
保護部位に対応し、離れていく偏差（正の値）は高い開裂を表す。垂直目盛はｌ
ｎ（ｆａ）−ｌｎ（ｆｃ）の単位であり、この場合ｆａは薬剤存在下における結
合での開裂分率であり、ｆｃは対照における同結合の開裂分率である。結果は、
目盛で示されている。配列下部の長方形は、（白い四角）ＡＴ結合部位および（
黒塗り四角）ＧＣ濃厚部位の位置を示す。
【００６１】 対称性化合物フラミジンおよびビスベンゾイミダゾールＤＢ２７０による結果
は、ＡＴ特異的小溝結合剤について予測された通りであり、他のフラン誘導体お
よび関連化合物に関する観察結果と一致している。しかしながら、非対称性化合
物ＤＢ２９３（図１）の場合、フットプリント法の結果は、図２に示されている
通り、予想外のＧＣ濃厚領域における強いフットプリントの形態で若干の驚くべ
き点を提示している。例えば、図２における２６５量体ｐＢＳフラグメントの９
０−１００塩基領域では、ＤＢ２９３は非常に強いフットプリントを与え、ＤＢ
２７０およびフラミジンが与えるフットプリント無視できる程度である。この配
列領域におけるフットプリントの最も驚くべき特徴は、ＡＴ濃厚配列に対するそ
のＧＣ含有率であり、この場合フットプリントは通常小溝剤により観察される。
【００６２】 フットプリントデータの定量分析は、ＡＴＧＡ部位でのＣ50値、すなわち半最
大フットプリント値に必要とされる薬剤濃度が、近隣ＡＴＴＡ部位での場合より
顕著に低いことを表していることから、ＤＢ２９３はＡＴ塩基対のみを含む部位
よりもＧＣ塩基対を含む部位の方を好むことが示されている。示差的開裂プロッ
トは、ＤＢ２７０およびＤＢ２９３の両方が、ＡＴ塩基対のみにより構成される
部位に同様に結合することを示している（図２）。幾つかの制限フラグメントに
よるフットプリント試験は、ＤＢ２７０ではなく、ＤＢ２９３がＧＣ塩基対含有
部位、例えばＡＴＧＡ、ＡＣＧＡおよびＡＴＧＴに強く結合することを示してい
た。
【００６３】 実施例３ 熱融解実験 ＧＣ濃厚配列を伴うこれらの化合物の複合体をより詳細に調べるため、２６５
量体ｐＢＳ制限フラグメントからの９３−１０４塩基配列領域を含むヘアピンデ
ュプレックスモデルを合成し、図１におけるオリゴ２と同じ要領で示す。多数の
小溝剤の分析で使用されたＡＡＴＴ配列をもつオリゴ１（同じく図１に示されて
いる）は、レファレンスを提供している。
【００６４】 マイクロコンピューターにインターフェースで連結させたキャリー４分光光度
計により熱融解実験を行った。レファレンスキュベット中に固定させたサーミス
ターを用いて温度をモニターした。１ｃｍ道長換算容量（reduced volume）石英
セル中１ｍＬの緩衝液（０.０１モルＭＥＳおよび０.００１モルＥＤＴＡ）にオ
リゴマーを加え、２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、濃度を測定した
。全般的に、ヘアピンオリゴ２については２×１０−6モル、およびヘアピンオ
リゴ２−１については３×１０−6モルの濃度で実験を行った。複合体に関する
Ｔｍ実験を比率の関数として行った。
【００６５】 ＤＢ２９３による滴定におけるオリゴ２のＴｍ測定により、Ｔｍの３０℃増加
がもたらされ、４：１ ＤＢ２９３：ヘアピンデュプレックスの比率に到達する
まで安定には達しなかった。ＤＢ２９３対オリゴマーデュプレックスの高比率は
、１３塩基対のみのデュプレックスにとって驚くべきことであった。複合体の性
質に関する理解をさらに深めるため、分割されたオリゴ２を２種の類似ヘアピン
デュプレックス、オリゴ２−１およびオリゴ２−２に分割した（図１）。得られ
た結果を説明するものとして、オリゴ２−１とＤＢ２７０およびＤＢ２９３複合
体の微分Ｔｍ曲線は、図５に示されている。ＤＢ２９３複合体は、１：１比で２
相性融解曲線を有し、遊離ヘアピンデュプレックスのＴｍ付近に高温相および低
温相を伴う。２：１比では、低温相が消失し、高温トランジションのみが存在す
る。オリゴ２−１とのＤＢ２７０およびフラミジン複合体の融解曲線は、１：１
および２：１比で単一トランジションを有し、融解温度はＤＢ２９３値より下で
ある。フットプリント実験の場合と同様、これらの結果は、非対称性ＤＢ２９３
に対して対称性化合物間にＤＮＡ相互作用における劇的な差異があることを説明
している。さらに、Ｔｍ比の結果は、ＤＢ２９３の普通ではないＤＮＡ認識特性
が、オリゴ２−１および２−２との２：１複合体およびオリゴ２との４：１複合
体の形成に因ることを示唆している。上記二量体複合体はまた、ＤＢ２９３の予
想外のフットプリント行動を説明し得るが、ＤＢ２９３の＋２電荷に基くと、二
量体複合体は予測されない。
【００６６】 実施例４ 表面プラスモン共鳴実験 表面プラスモン共鳴を用いることによりさらに詳細にＤＮＡとこれらの化合物
の比較定量分析を遂行するため、オリゴ２−１および２−２の５'−ビオチン標
識類似体を次の要領でＢＩＡコア４チャンネルストレプトアビジン被覆センサー
チップに固定化した。ＤＮＡの固定化および表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）結合
性試験：５'−ビオチン標識ヘアピンをＨＰＬＣ精製により購入した（ミドラン
ド・カンパニー）。５０ナノモル濃度でのＭＥＳ１０緩衝液（０.０１モルＭＥ
Ｓおよび０.００１モルＥＤＴＡ、０.１モルＮａＣｌ含有）にＤＮＡを含む試料
を、ＢＩＡコア２０００ＳＰＲ器具において５μｌ／分での直接流通によりＢＩ
ＡコアＳＡ（ストレプトアビジン）チップに適用した。ほぼ同量のオリゴ１、オ
リゴ２−１およびオリゴ２−２をＳＡチップの表面に固定化した。流速２０μｌ
／分、２５℃でＳＡ表面における異なる濃度の各化合物の多重注射により定常状
態分析を遂行した。
【００６７】 オリゴ１を対照配列として固定化し、一フローセルを非修飾レファレンスとし
て残した。ＳＰＲ実験からの結合結果は、単一部位モデル（Ｋ2＝０）または２
部位モデルと適合していた：ｒ＝（Ｋ1 ＊Ｃfree＋２＊Ｋ1 ＊Ｋ2 ＊Ｃfree 2）／（
１＋Ｋ1 ＊Ｃfree＋２＊Ｋ1 ＊Ｋ2 ＊Ｃfree 2）（式中、ｒはＤＮＡヘアピンデュプ
レックス１モル当たりの結合化合物のモルを表し、Ｋ1およびＫ2はマクロ結合定
数であり、Ｃfreeは複合体と平衡状態にある遊離化合物濃度である）。流動溶液
における濃度により遊離化合物を固定する。オリゴ１へのフラン誘導体全ての結
合は単一部位モデルにより最適であり、オリゴ２−１および２−２へのＤＢ２９
３の結合は２部位モデルを必要とし、非常に大きな正の協同作用との相互作用に
ついて予測された通りＫ2はＫ1よりかなり大きいことが見出された。オリゴ１お
よび２−１は図３に示されており、差異が図示されている。
【００６８】 オリゴ１へのフラン化合物全部の結合は類似しており、ＡＡＴＴ配列を含むＤ
ＮＡデュプレックスを伴う若干の小溝結合性カチオンによる結果から予測された
通り、１：１比で飽和に達する。しかしながら、オリゴ２−１および２−２への
ＤＢ２９３結合に関する結果は、対称性化合物による結果とは劇的に異なり、そ
してオリゴ１およびＤＢ２９３により得られた結果とも劇的に異なる。ＤＢ２９
３およびＤＢ２７０の結合性に関するスキャッチャードプロットを図３に示す。
【００６９】 ＡＴ部位を伴うフットプリント実験の場合と同様（図２）、ＤＢ２７０および
ＤＢ２９３は、２.３−２.６×１０7の結合定数でＤＢ２７０またはＤＢ２９３
の単一分子を結合する強結合性部位の一タイプを示す線状スキャッチャードプロ
ットと非常に類似した形でオリゴ１に結合する。オリゴ２−１へのＤＢ２７０の
結合は、オリゴ１へのその結合より少なくとも１０倍弱く、恐らくは短すぎて非
常に強い小溝複合体を形成し得ないオリゴマーにおけるＴＡＴ配列でのその相互
作用を表すと思われる。しかしながら、図３で示された通り、ＤＢ２９３とオリ
ゴ２−１の結合は高度に協同的であり、オリゴ２−１ヘアピンデュプレックス一
本につきＤＢ２９３の２分子で飽和する。２部位モデルに結合結果を適合させて
、マクロ結合定数を測定すると、初回結合について２.８×１０6の結合定数（Ｋ 1 ）および第１部位が満たされた後の第２部位への結合について７.３×１０7の
Ｋ2が得られた。オリゴ２−２へのＤＢ２９３の結合についても非常に類似した
結果が得られる。オリゴ２−１および２−２へのＤＢ２７０およびＤＢ２９３の
第一分子結合に関する結合定数の類似性は、これらが類似プロセスであることを
示唆している。ＤＢ２９３の第２分子が、オリゴマーへのＤＢ２７０およびＤＢ
２９３の第一分子の結合の場合（Ｋ1）より２５倍大きいＫ2により協同的に結合
するとき劇的な差異が生じる。これらの結果は、ＤＢ２９３により観察される普
通ではないフットプリントパターンが、特異的ＤＮＡ配列における高度協同的２
：１複合体の形成に起因することを強く示唆している。近接類似体、フラミジン
およびＤＢ２７０は、これらのＤＮＡ配列において強くは結合またはフットプリ
ントしない。３種のフラン化合物は全てジカチオンであるため、対称性誘導体が
二量体複合体を形成するのを阻止するのは、明らかに構造であって、電荷ではな
い。
【００７０】 実施例５ フラン誘導体の構造試験 フラミジンおよびアルキル誘導体のＸ線構造を含め、オリゴ１のＡＡＴＴ配列
を含むオリゴマーをもつ若干のフラン誘導体の構造試験により、アミジン基がＡ
ＡＴＴ部位における溝の床でＡおよびＴ塩基の端と相互作用する１：１の古典的
な小溝結合性複合体が明らかに示された。C.A.Laughton、Biochemistry３５、５
６５５（１９９６）および S.Neidle、Biopolymers４４、１０５（１９９７）参
照。これは、オリゴ１と図１のフラン類の実験結果から予測された複合体のタイ
プである。ＤＢ２９３の２：１複合体を特性検定するため、ＤＢ２９３−オリゴ
２−１複合体のＮＭＲ試験を開始した。ＮＭＲスペクトルは全て、ヴァリアン・
ユニティー・プラス６００ＭＨｚ分光計により得られた。Ｄ2Ｏでのスペクトル
収集に関する典型的な条件：２秒緩和遅延、５ｍｍＮＭＲ管中０.６ｍＬの試料
、およびフーリエ変換前に１.０Ｈｚ線広域化。二次元実験は、ｔ２次元での２
０４８複合データ点およびｔ１次元での５１２点での両次元における６０００Ｈ
ｚのスペクトル幅により達成され、１Ｄスペクトルは６０００Ｈｚのスペクトル
幅および３２Ｋデータ点で集められた。
【００７１】 ＤＢ２９３によるオリゴマーデュプレックスのプロトンＮＭＲ滴定では、２種
のＤＮＡのみが１：１モル比で検出されている。これら２種は、芳香族〜チミン
メチルＮＭＲスペクトル領域について図４で２Ｄ ＣＯＳＹスペクトルにより明
確に説明されている。遊離ＤＮＡは、オリゴマーにおける６個のＴ残基について
予測された通り６個の完全分割されたＴＨ６−ＴＣＨ3交差ピークを有する。１
：１比複合体では、緩慢な交換における２種について予測された通り１２個の交
差ピークがあり、そして１種は遊離ＤＮＡと同じ化学シフトを有する。２：１比
では、遊離ＤＮＡシグナルは消失し、２：１複合体に関するシグナルは強度が倍
増する。２：１複合体および遊離ＤＮＡだけが、１：１比ＣＯＳＹスペクトル（
図４）において観察される種類であり、結合性実験で観察される高い協同性と一
致している。１：１複合体に関する中間シグナルは、ＤＢ２９３とのオリゴ２−
１の滴定中終始いかなる実験からも全く検出され得ず、１：１比で観察される２
種は遊離オリゴマーおよび２：１複合体である。２Ｄ ＮＯＥＳＹ分析では、強
いシグナルがＣ Ｈ５−Ｈ６相互作用に関して得られ、遊離ＤＮＡおよび２：１
複合体に関するシグナルのみが再び検出される（示されていない）。反対に、２
セットの交差ピークが、緩慢な交換で２個の異なる結合分子について予測された
通りオリゴ２−１複合体でのＤＢ２９３に関して検出される。２個のＤＢ２９３
分子およびＤＢ２９３からＤＮＡ小溝プロトンまでの間の交差ピークは、化合物
が逆平行二量体として小溝で結合し、両ＤＮＡ鎖との接触に至ることを明白に示
している。２個の結合ＤＢ２９３分子からＴ４・Ａ１５〜Ｃ７・Ｇ１２のＤＮＡ
塩基対までに強い交差ピークが観察され、これらの相互作用により、オリゴ２−
１および２−２の両方に共通したＡＴＧＡ配列に二量体が置かれる。
【００７２】 これらの結果から、図１の３種のフラン誘導体は全て、古典的小溝単量体複合
体としてオリゴ１におけるＡＡＴＴ配列に結合することが明らかである。対称性
化合物、例えばＤＢ２７０およびフラミジンは、ＤＮＡ複合体において二量体種
を形成しないため、古典的ＡＴ小溝結合部位を有しないＤＮＡ配列には結合しな
い。ＤＢ２９３は、ＡＴＧＡおよび恐らくは他の配列をも含むＤＮＡ部位と複合
して逆平行多層状二量体を形成する。二量体複合体は、ＡＴおよびＧＣ塩基対の
両方を含むＤＮＡ配列を認識し得る化合物の理解および設計を目的とした新しい
モチーフを提供する。ここに示された結果は、混合ＤＮＡ配列への芳香族ジカチ
オンの結合が、化合物構造およびＤＮＡ配列に対して鋭敏な感受性を有すること
を示している。出願人らは本発明の理論に縛られることを望まないが、ＤＢ２９
３二量体複合体の協同的形成に関する根拠は、二量体における特異的ＤＮＡ配列
および化学基の配向間の相互作用においてコード化されていると思われる。ＤＢ
２９３の好ましいスタッキングによりアニオン性ＤＮＡ小溝に関係した二量体が
得られるということもまた、２：１複合体形成に寄与し得ることである。
【００７３】 上記で述べたことは本発明を説明するもので、それを限定するものとしてみな
すべきではない。本発明は前記請求の範囲により定められ、請求の範囲の均等内
容事項もそこに包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 小溝結合性化合物ネトロプシン、ジスタマイシン、ヘキスト３３
２５８、フラミジン（ＤＢ７５）、ＤＢ２７０およびＤＢ２９３に関する化学構
造を示す。図１はまた、ここに記載されている通り、オリゴ１、オリゴ２、オリ
ゴ２−１およびオリゴ２−２に関するＤＮＡ配列を示す。
【図２Ａ】 ここに記載されている２６５ｂｐ ＤＮＡフラグメントに関す
る化合物ＤＢ２９３による定量的デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント滴
定実験の結果を説明している。プラスミドｐＢＳからのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ
制限フラグメントを、ＡＭＶ逆転写酵素の存在下［α−32Ｐ］ｄＡＴＰによりＥ
ｃｏＲＩ部位で３’末端標識した。図２Ａに示されている通り、デオキシリボヌ
クレアーゼＩ消化産物を、８モル尿素含有８％ポリアクリルアミドゲルで分割し
た。薬剤濃度は、ＤＢ２９３について（レーン１−１１）０、０.３、０.６、０
.９、１.２、１.５、１.８、２.１、２.４、２.７、３.０マイクロモルおよびＤ
Ｂ２７０について（レーン１２−１５）０、１、２および５マイクロモルである
。「Ｇ」標識トラックは、グアニンに特異的なジメチルスルフェート−ピペリジ
ンマーカーを表す。ＤＮＡ標識トラックは、薬剤も酵素も全く含まなかった。ゲ
ルの右側の数は、フラグメントの番号付けの概略を示す。左側にある長方形は、
ＤＢ２９３に関する（白い四角）ＡＴ濃厚および（黒塗り四角）ＧＣ濃厚結合部
位の位置を示す。
【図２Ｂ】 （白い円）ＡＴ部位５'−ＡＡＴＴＡＡおよび（黒塗り四角）
ＧＣ濃厚部位５'−ＡＣＣＡＴＧへのＤＢ２９３の結合に関するフットプリント
プロットを示した図である。相対バンド強度ＲはＩＣ／ＩＯ比に対応し、この場
合ＩＣはリガンド濃度ｃでのバンド強度であり、ＩＯはＤＢ２９３の不存在下に
おける同バンドの強度である。
【図２Ｃ】 示された示差的開裂プロットは、（黒塗りの円）５マイクロモ
ルＤＢ２７０または（白い四角）１.５マイクロモルＤＢ２９３の存在下でのデ
オキシリボヌクレアーゼＩによる切断に対するＤＮＡの感受性を比較している。
文字配列に向かう点の偏差（負の値）は、リガンド保護部位に対応し、離れてい
く方の偏差（正の値）は高い開裂を表す。縦の目盛はｌｎ（ｆa）−ｌｎ（ｆc）
の単位であり、ここでｆaは薬剤存在下における結合での開裂分率（fractional
cleavage）であり、ｆcは対照における同結合の開裂分率である。結果は、便宜
上対数目盛で示されている。配列下の長方形は、（白い四角）ＡＴ結合部位およ
び（黒塗りの四角）ＧＣ濃厚部位の位置を示す。
【図３】 オリゴ１およびオリゴ２−１へのＤＢ２９３およびＤＢ２７０の
結合に関する結果のスキャッチャードプロットを示し、加えて最適結合曲線が示
されている。黒塗り三角および白い三角は、それぞれオリゴ１へのＤＢ２９３お
よびＤＢ２７０結合性に関するものである。黒塗り円および白い円は、それぞれ
オリゴ２−１へのＤＢ２９３およびＤＢ２７０結合性に関するものである。オリ
ゴ２−１へのＤＢ２７０の結合は弱いため、結果はデュプレックスへの単一ＤＢ
２７０結合の仮定と適合していた。このプロットに関するデータによるセンサー
グラムは図６に示されている。
【図４】 （上部、Ａ）遊離ＤＮＡ、（中間部、Ｂ）ＤＢ２９３対オリゴ２
−１の１：１比試料、および（下部、Ｃ）２：１比について示されたＴＨ６−Ｔ
ＣＨ３スペクトル領域の二次元ＣＯＳＹスペクトルである。１：１比試料中にお
ける遊離ＤＮＡおよび２：１複合体に関するシグナルは、上部および下部スペク
トルへ線を結ぶことにより示されている。
【図５】 オリゴ２−１とＤＢ２７０およびＤＢ２９３の複合体に関する割
合の関数としてＴｍ曲線を示す。黒塗り円は遊離ＤＮＡを示し、黒塗り三角およ
び白い三角はそれぞれ１：１および２：１比でのＤＢ２９３を示し、黒塗り四角
および白い四角はそれぞれ１：１および２：１比でのＤＢ２７０を示す。
【図６】 （上部、Ａ）オリゴ２−１および（下部、Ｂ）オリゴ１へのＤＢ
２７０およびＤＢ２９３の結合に関するセンサーグラムを示す。薬剤濃度の範囲
は１ナノモルから１マイクロモルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ザ・ジョージア・ステイト・ユニヴァーシ ティ・リサーチ・ファウンデイション，イ ンコーポレイテッド アメリカ合衆国ジョージア州30303，アト ランタ，ユニヴァーシティ・プラザ (72)発明者 ダブリュー・デイビッド・ウィルソン アメリカ合衆国30307ジョージア州アトラ ンタ、ダイソン・ドライブ1669番 (72)発明者 デイビッド・ボイキン アメリカ合衆国30315ジョージア州アトラ ンタ、ノース・イースト、スプリングデイ ル・ロード1369番 (72)発明者 リチャード・アール・ティドウェル アメリカ合衆国27312ノースカロライナ州 ピッツボロ、ダブリューアール・クラー ク・ロード390番、ルート３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 HA11 HA17 4B063 QA13 QA18 QQ42 QQ61 QR32 QR41 QX02 4C063 AA01 BB01 CC75 DD26 EE01 4C084 AA13 CA59 MA13 MA52 MA66 NA14 ZB261 ZB351 4C086 AA01 AA02 AA03 BC39 GA02 MA04 MA13 MA52 MA66 NA14 ZB26 ZB35 ZC78

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 ［式中、 Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、 Ｙは、ＣＨまたはＮであり、 Ａは、ＣＨまたはＮであり、 Ｂは、ＮＨ、ＯまたはＳから成る群から選択され、 Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、お
    よびオキシアリールアルキルから成る群から選択され、 Ｒ2およびＲ9は、各々独立して、Ｈ、Ｈ2、ヒドロキシ、低級アルキル、シク
    ロアルキル、アリール、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシシ
    クロアルキル、アルコキシシクロアルコキシ、ヒドロキシアルキル、アミノアル
    キルおよびアルキルアミノアルキルから成る群から選択され、そして Ｒ3、Ｒ4、Ｒ13およびＲ14は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、アルコキシ
    アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル
    、アミノアルキル、およびアルキルアミノアルキルから成る群から選択されるか
    、またはＲ3およびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になってＣ2
    −Ｃ10アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルキレンを表すか、またはＲ3お
    よびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になって、 【化２】 （式中、ｎは１〜３の数であり、そしてＲ10はＨまたは−ＣＯＮＨＲ11ＮＲ15Ｒ 16 （式中、Ｒ11は低級アルキルであり、Ｒ15およびＲ16は各々独立してＨおよび
    低級アルキルから成る群から選択される）である）であり、 Ｌは、 【化３】 （式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、各々個々に、Ｈ、アルキル、ハロ、アリー
    ル、アリールアルキル、アミノアルキル、アミノアリール、オキソアルキル、オ
    キソアリール、およびオキソアリールアルキルから成る群から選択される） から成る群から選択されるものであり、上記式Ｉの化合物は二量体としてＤＮＡ
    の小溝に結合する］ で示される化合物。
  2. 【請求項２】 式中、Ｌは 【化４】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、式Ｉで示される化合物。
  3. 【請求項３】 式中、Ｌは 【化５】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、式Ｉで示される化合物。
  4. 【請求項４】 混合配列ＤＮＡを結合する方法であって、試料ＤＮＡを式（
    I）： 【化６】 ［式中、 Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、 Ｙは、ＣＨまたはＮであり、 Ａは、ＣＨまたはＮであり、 Ｂは、ＮＨ、ＯまたはＳから成る群から選択され、 Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、お
    よびオキシアリールアルキルから成る群から選択され、 Ｒ2およびＲ9は、各々独立して、Ｈ、Ｈ2、ヒドロキシ、低級アルキル、シク
    ロアルキル、アリール、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシシ
    クロアルキル、アルコキシシクロアルコキシ、ヒドロキシアルキル、アミノアル
    キルおよびアルキルアミノアルキルから成る群から選択され、そして Ｒ3、Ｒ4、Ｒ13およびＲ14は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、アルコキシ
    アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル
    、アミノアルキル、およびアルキルアミノアルキルから成る群から選択されるか
    、またはＲ3およびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になってＣ2
    −Ｃ10アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルキレンを表すか、またはＲ3お
    よびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になって、 【化７】 （式中、ｎは１〜３の数であり、そしてＲ10はＨまたは−ＣＯＮＨＲ11ＮＲ15Ｒ 16 （式中、Ｒ11は低級アルキルであり、Ｒ15およびＲ16は各々独立してＨおよび
    低級アルキルから成る群から選択される）である）であり、 Ｌは、 【化８】 （式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、各々個々に、Ｈ、アルキル、ハロ、アリー
    ル、アリールアルキル、アミノアルキル、アミノアリール、オキソアルキル、オ
    キソアリール、およびオキソアリールアルキルから成る群から選択される） から成る群から選択されるものであり、上記式Ｉの化合物は二量体としてＤＮＡ
    の小溝に結合する］ で示される化合物と接触させることを含む方法。
  5. 【請求項５】 式中、Ｌは 【化９】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 式中、Ｌは 【化１０】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 混合配列ＤＮＡの検出方法であって、ＤＮＡの試料を式（Ｉ
    ）： 【化１１】 ［式中、 Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、 Ｙは、ＣＨまたはＮであり、 Ａは、ＣＨまたはＮであり、 Ｂは、ＮＨ、ＯまたはＳから成る群から選択され、 Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、お
    よびオキシアリールアルキルから成る群から選択され、 Ｒ2およびＲ9は、各々独立して、Ｈ、Ｈ2、ヒドロキシ、低級アルキル、シク
    ロアルキル、アリール、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシシ
    クロアルキル、アルコキシシクロアルコキシ、ヒドロキシアルキル、アミノアル
    キルおよびアルキルアミノアルキルから成る群から選択され、そして Ｒ3、Ｒ4、Ｒ13およびＲ14は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、アルコキシ
    アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル
    、アミノアルキル、およびアルキルアミノアルキルから成る群から選択されるか
    、またはＲ3およびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になってＣ2
    −Ｃ10アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルキレンを表すか、またはＲ3お
    よびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になって、 【化１２】 （式中、ｎは１〜３の数であり、そしてＲ10はＨまたは−ＣＯＮＨＲ11ＮＲ15Ｒ 16 （式中、Ｒ11は低級アルキルであり、Ｒ15およびＲ16は各々独立してＨおよび
    低級アルキルから成る群から選択される）である）であり、 Ｌは、 【化１３】 （式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、各々個々に、Ｈ、アルキル、ハロ、アリー
    ル、アリールアルキル、アミノアルキル、アミノアリール、オキソアルキル、オ
    キソアリール、およびオキソアリールアルキルから成る群から選択される） から成る群から選択されるものであり、上記式Ｉの化合物は二量体としてＤＮＡ
    の小溝に結合する］ で示される蛍光化合物と接触させ、次いで試料における蛍光を観察することを含
    み、蛍光の観察により式（Ｉ）の化合物があるＤＮＡ配列に結合していることが
    示される、混合配列ＤＮＡの検出方法。
  8. 【請求項８】 式中、Ｌは 【化１４】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 式中、Ｌは 【化１５】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 式Ｉ： 【化１６】 ［式中、 Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、 Ｙは、ＣＨまたはＮであり、 Ａは、ＣＨまたはＮであり、 Ｂは、ＮＨ、ＯまたはＳから成る群から選択され、 Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、オキシアルキル、オキシアリール、お
    よびオキシアリールアルキルから成る群から選択され、 Ｒ2およびＲ9は、各々独立して、Ｈ、Ｈ2、ヒドロキシ、低級アルキル、シク
    ロアルキル、アリール、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシシ
    クロアルキル、アルコキシシクロアルコキシ、ヒドロキシアルキル、アミノアル
    キルおよびアルキルアミノアルキルから成る群から選択され、そして Ｒ3、Ｒ4、Ｒ13およびＲ14は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、アルコキシ
    アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル
    、アミノアルキル、およびアルキルアミノアルキルから成る群から選択されるか
    、またはＲ3およびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になってＣ2
    −Ｃ10アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルキレンを表すか、またはＲ3お
    よびＲ4は一緒になってまたはＲ13およびＲ14は一緒になって、 【化１７】 （式中、ｎは１〜３の数であり、そしてＲ10はＨまたは−ＣＯＮＨＲ11ＮＲ15Ｒ 16 （式中、Ｒ11は低級アルキルであり、Ｒ15およびＲ16は各々独立してＨおよび
    低級アルキルから成る群から選択される）である）であり、 Ｌは、 【化１８】 （式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、各々個々に、Ｈ、アルキル、ハロ、アリー
    ル、アリールアルキル、アミノアルキル、アミノアリール、オキソアルキル、オ
    キソアリール、およびオキソアリールアルキルから成る群から選択される） から成る群から選択されるものである］ で示される化合物を医薬的に許容し得る担体中に含む医薬製剤。
  11. 【請求項１１】 式中、Ｌは 【化１９】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項１０記載の医薬製剤。
  12. 【請求項１２】 式中、Ｌは 【化２０】 であり、ＡはＮであり、ＢはＮＨであり、ＸはＯであり、ＹはＣＨであり、Ｒ1
    、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ14は各々Ｈであり、Ｒ3およびＲ 13 は各々Ｈ2である、請求項１０記載の医薬製剤。
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