JP2003516726A - コリン輸送に関わるｃｔｌ膜タンパク質 - Google Patents
コリン輸送に関わるｃｔｌ膜タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ｈＣＴＬ１とｈＣＴＬ２をはじめとするＣＴＬ（Choline Transporter Like）遺伝子の新しい族の識別に関するものであって、該遺伝子は、腸管細胞、神経細胞、とくに運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏突起神経膠細胞などの細胞内でコリンの代謝および／または輸送に関わるものである。本発明は、家族性自律神経異常、およびタンジェール病の治療に新しい展望を開くものである。もっと一般的には、ＣＴＬ遺伝子の識別は、神経系の疾患、とくに神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病の治療のための新しい戦略を立てることを可能にする。
Description
【０００１】
本発明は、ｈＣＴＬ１とｈＣＴＬ２をはじめとするＣＴＬ（コリン輸送体様）
遺伝子の新しい族の識別に関するものであって、該族は、腸管細胞、神経細胞、
とくに運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏突起
神経膠細胞などの細胞内でコリンの代謝および／または輸送に関与する。本発明
は家族性自律神経異常、およびタンジェール病の治療に新しい展望を開くもので
ある。より一般的には、ＣＴＬ遺伝子の識別は神経系の疾患治療、特に神経変性
疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチン
トン病のための新しい戦略の完成を可能にするものである。
遺伝子の新しい族の識別に関するものであって、該族は、腸管細胞、神経細胞、
とくに運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏突起
神経膠細胞などの細胞内でコリンの代謝および／または輸送に関与する。本発明
は家族性自律神経異常、およびタンジェール病の治療に新しい展望を開くもので
ある。より一般的には、ＣＴＬ遺伝子の識別は神経系の疾患治療、特に神経変性
疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチン
トン病のための新しい戦略の完成を可能にするものである。
【０００２】
コリンは、ホスファチジルコリンを介して膜の生成に寄与する代謝産物である
。この代謝産物は、同時にコリン作用性ニューロン内で重要な役割をも果たし、
そこでアセチルコリン神経伝達物質の合成に関与する。特定の細胞内では、ホス
ファチジルコリンは、ホスファチジルエタノールアミンのメチル化によって生成
可能であり、また単細胞生物、動物および植物内では、遊離コリンは栄養素とし
て吸収される。ナトリウムに依存し、かつコリン作用性神経の末端内でアセチル
コリンの合成に結びつけられている、コリンの吸収は、機能部位（１−３）でと
くによく特徴付けられるが、選択的かつ不可逆的なリガンドの使用と同時であっ
ても、タンパク質（４）の精製に基づく各種の識別試験では今日まで見落とされ
てきた。
。この代謝産物は、同時にコリン作用性ニューロン内で重要な役割をも果たし、
そこでアセチルコリン神経伝達物質の合成に関与する。特定の細胞内では、ホス
ファチジルコリンは、ホスファチジルエタノールアミンのメチル化によって生成
可能であり、また単細胞生物、動物および植物内では、遊離コリンは栄養素とし
て吸収される。ナトリウムに依存し、かつコリン作用性神経の末端内でアセチル
コリンの合成に結びつけられている、コリンの吸収は、機能部位（１−３）でと
くによく特徴付けられるが、選択的かつ不可逆的なリガンドの使用と同時であっ
ても、タンパク質（４）の精製に基づく各種の識別試験では今日まで見落とされ
てきた。
【０００３】
本発明の一環として、シビレエイの電気葉に由来する相補性ｃＤＮＡから実現
された発現ライブラリに由来する酵母菌におけるコリン輸送突然変異抑圧遺伝子
をクローン化した。つぎに、相同遺伝子ｒＣＴＬ１をラットにおいて単離したが
、該遺伝子は、脊髄と脳内で３．５ｋｂの転写生成物の形で、または結腸内で５
ｋｂのｍＲＮＡの形で、強く発現される。ハイブリッド形成は、ラットの運動ニ
ューロン、感覚ニューロン、脊髄背側核のニューロン、および乏突起神経膠細胞
内でｒＣＴＬ１の強い発現を示し、また脳全体に分散した様々な神経群内にもよ
り小さな程度で示された。末梢組織では、結腸の粘膜の細胞層内で、ｒＣＴＬ１
の高いレベルを識別した。ヒトにおいて、ｈＣＴＬ１遺伝子は、９ｑ．３１．２
に局在するマーカーに結びつけられ、該マーカーは、家族性自律神経異常、およ
びタンジェール病の遺伝子座の近くにある。同様に、複数の相同遺伝子を哺乳類
（ＣＴＬ２−４）において発見した。１９ｐ１３．１でのｈＣＴＬ２、および６
ｐ２１．３でのｈＣＴＬ４の位置決定は、ＣＴＬタンパク質が、これらの遺伝子
座で複製されたために明らかな一定数の他族遺伝子に加わることを示している。
ＣＴＬ１のすべての相同遺伝子は、２つが輸送体タイプのモチーフを含む１０の
推定膜貫通領域を含有するタンパク質についてコード化する。
された発現ライブラリに由来する酵母菌におけるコリン輸送突然変異抑圧遺伝子
をクローン化した。つぎに、相同遺伝子ｒＣＴＬ１をラットにおいて単離したが
、該遺伝子は、脊髄と脳内で３．５ｋｂの転写生成物の形で、または結腸内で５
ｋｂのｍＲＮＡの形で、強く発現される。ハイブリッド形成は、ラットの運動ニ
ューロン、感覚ニューロン、脊髄背側核のニューロン、および乏突起神経膠細胞
内でｒＣＴＬ１の強い発現を示し、また脳全体に分散した様々な神経群内にもよ
り小さな程度で示された。末梢組織では、結腸の粘膜の細胞層内で、ｒＣＴＬ１
の高いレベルを識別した。ヒトにおいて、ｈＣＴＬ１遺伝子は、９ｑ．３１．２
に局在するマーカーに結びつけられ、該マーカーは、家族性自律神経異常、およ
びタンジェール病の遺伝子座の近くにある。同様に、複数の相同遺伝子を哺乳類
（ＣＴＬ２−４）において発見した。１９ｐ１３．１でのｈＣＴＬ２、および６
ｐ２１．３でのｈＣＴＬ４の位置決定は、ＣＴＬタンパク質が、これらの遺伝子
座で複製されたために明らかな一定数の他族遺伝子に加わることを示している。
ＣＴＬ１のすべての相同遺伝子は、２つが輸送体タイプのモチーフを含む１０の
推定膜貫通領域を含有するタンパク質についてコード化する。
【０００４】
このように、以下にＣＴＬと示すこのタンパク質族の識別と特徴づけは、新し
い展望を開くものであるが、それは特に、発生時に自律系ならびに運動系の発現
とともに、末梢コリン作用性成分（２７）と、成人（２８）におけるＳＮＣの段
階的髄鞘脱落（２８）を含む病気である、家族性自律神経異常、およびタンジェ
ール病（３０）と（３１）の治療に対してである。より一般的には、ＣＴＬ遺伝
子の識別は、新しい治療学を検討することを可能にするものであり、それは腸管
細胞、神経細胞のような、特に運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニ
ューロン、および乏突起神経膠細胞などのＣＴＬ遺伝子の転写産物を発現する細
胞を含有する疾患全体に対して、特に神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、アルツハイ
マー病、パーキンソン病、ハンチントン病に対するものである。
い展望を開くものであるが、それは特に、発生時に自律系ならびに運動系の発現
とともに、末梢コリン作用性成分（２７）と、成人（２８）におけるＳＮＣの段
階的髄鞘脱落（２８）を含む病気である、家族性自律神経異常、およびタンジェ
ール病（３０）と（３１）の治療に対してである。より一般的には、ＣＴＬ遺伝
子の識別は、新しい治療学を検討することを可能にするものであり、それは腸管
細胞、神経細胞のような、特に運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニ
ューロン、および乏突起神経膠細胞などのＣＴＬ遺伝子の転写産物を発現する細
胞を含有する疾患全体に対して、特に神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、アルツハイ
マー病、パーキンソン病、ハンチントン病に対するものである。
【０００５】
発明の説明
したがって本発明は、精製または単離された核酸において、下記の配列群から
選択された核の配列を含むことを特徴とする核酸に関するものである： ａ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１（ｈＣＴＬ１）； ｂ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２（ｈＣＴＬ２）； ｃ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２の、少なくとも１２の連続ヌクレオ
チド、好適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドの断片； ｄ）核の配列であって、ａ）、ｂ）またはｃ）に定義したような配列と共に最
適な整列後に、少なくとも６０％の、好適には８０％、９０％、９５％または９
９％の総同一パーセンテージを示し； ｅ）相補配列またはＲＮＡ配列であって、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に定義
したような配列に対応するもの。
選択された核の配列を含むことを特徴とする核酸に関するものである： ａ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１（ｈＣＴＬ１）； ｂ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２（ｈＣＴＬ２）； ｃ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２の、少なくとも１２の連続ヌクレオ
チド、好適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドの断片； ｄ）核の配列であって、ａ）、ｂ）またはｃ）に定義したような配列と共に最
適な整列後に、少なくとも６０％の、好適には８０％、９０％、９５％または９
９％の総同一パーセンテージを示し； ｅ）相補配列またはＲＮＡ配列であって、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に定義
したような配列に対応するもの。
【０００６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１は、以下に示すようなｈＣＴＬ１をコード化する配列
である：
である：
【０００７】
GCTGCGCGCACGCGACCGCATCCGGGCTCCTTCGGCCCCGCCATGGGCTGCTGCAGCTCCGCTTCCTCCGCC
GCGCAGAGCTCCAAACGAGAATGGAAGCCGCTGGAGGACCGTAGCTGCACAGACATACCATGGCTGCTGCTC
TTCATCCTCTTCTGCATTGGGATGGGATTTATTTGTGGCTTTTCAATAGCAACAGGTGCAGCAGCAAGACTA
GTGTCAGGATACGACAGCTATGGAAATATCCGTGGGCAGAAAAATACAAAGTTGGAAGCAATACCAAACAGT
GGCATGGACCACACCCAGCGGAAGTATGTATTCTTTTTGGATCCATGCAACCTGGACTTGATAAACCGGAAG
ATTAAGTCTGTAGCACTGTGTGTAGCAGCGTGTCCAAGGCAAGAACTGAAAACTCTGAGTGATGTTCAGAAG
TTTGCAGAGATAAATGGTTCAGCCCTATGTAGCTACAACCTAAAGCCTTCTGAATACACTACATCTCCAAAA
TCTTCTGTTCTCTGCCCCAAACTACCAGTTCCAGCGAGTGCACCTATTCCATTCTTCCATCGCTGTGCTCCT
GTGAACATTTCCTGCTATGCCAAGTTTGCAGAGGCCCTGATCACCTTTGTCAGTGACAATAGTGTCTTACAC
AGGCTGATTAGTGGAGTAATGACCAGCAAAGAAATTATATTGGGACTTTGCTTGTTATCACTAGTTCTATCC
ATGATTTTGATGGTGATAATCAGGTATATATCAAGAGTACTTGTGTGGATCTTAACGATTCTGGTCATACTC
GGTTCACTTGGAGGCACAGGTGTACTATGGTGGCTGTATGCAAAGCAAAGAAGGTCTCCCAAAGAAACTGTT
ACTCCTGAGCAGCTTCAGATAGCTGAAGACAATCTTCGGGCCCTCCTCATTTATGCCATTTCAGCTACAGTG
TTCACAGTGATCTTATTCCTGATAATGTTGGTTATGCGCAAACGTGTTGCTCTTACCATCGCCTTGTTCCAC
GTAGCTGGCAAGGTCTTCATTCACTTGCCACTGCTAGTCTTCCAACCCTTCTGGACTTTCTTTGCTCTTGTC
TTGTTTTGGGTGTACTGGATCATGACACTTCTTTTTCTTGGCACTACCGGCAGTCCTGTTCAGAATGAGCAA
GGCTTTGTGGAGTTCAAAATTTCTGGGCCTCTGCAGTACATGTGGTGGTACCATGTGGTGGGCCTGATTTGG
ATCAGTGAATTTATTCTAGCATGTCAGCAGATGACAGTGGCAGGAGCTGTGGTAACATACTATTTTACTAGG
GATAAAAGGAATTTGCCATTTACACCTATTTTGGCATCAGTAAATCGCCTTATTCGTTACCACCTAGGTACG
GTGGCAAAAGGATCTTTCATTATCACATTAGTCAAAATTCCGCGAATGATCCTTATGTATATTCACAGTCAG
CTCAAAGGAAAGGAAAATGCTTGTGCACGATGTGTGCTGAAATCTTGCATTTGTTGCCTTTGGTGTCTTGAA
AAGTGCCTAAATTATTTAAATCAGAATGCATACACAGCCACAGCTATCAACAGCACCAACTTCTGCACCTCA
GCAAAGGATGCCTTTGTCATTCTGGTGGAGAATGCTTTGCGAGTGGCTACCATCAACACAGTAGGAGATTTT
ATGTTATTCCTTGGCAAGGTGCTGATAGTCTGCAGCACAGGTTTAGCTGGGATTATGCTGCTCAACTACCAG
CAGGACTACACAGTATGGGTGCTGCCTCTGATCATCGTCTGCCTCTTTGCTTTCCTAGTCGCTCATTGCTTC
CTGTCTATTTATGAAATGGTAGTGGATGTATTATTCTTGTGTTTTGCCATTGATACAAAATACAATGATGGG
AGCCCTGGCAGAGAATTCTATATGGATAAAGTGCTGATGGAGTTTGTGGAAAACAGTAGGAAAGCAATGAAA
GAAGCTGGTAAGGGAGGCGTCGCTGATTCCAGAGAGCTAAAGCCGATGCTGAAGAAAAGGTGACTGGTCTCA
TGAGCCCTGAAGAATGAACTCAGAGGAGGTTGTTTACATGAGGTTCTCCCACTCACCAGCTGTTGAGAGTCT
GCGATTATGAAGAGCAGGATCTTATTACTTCAATGAAAGCATGTAACAAGTTTCTCAAACCACCAACAGCCA
AGTGGATTTGGTACAGTGCGGCTGTCTAATAAATAATCAAAAGCATTTGATAGAAAAAAAAAAA
GCGCAGAGCTCCAAACGAGAATGGAAGCCGCTGGAGGACCGTAGCTGCACAGACATACCATGGCTGCTGCTC
TTCATCCTCTTCTGCATTGGGATGGGATTTATTTGTGGCTTTTCAATAGCAACAGGTGCAGCAGCAAGACTA
GTGTCAGGATACGACAGCTATGGAAATATCCGTGGGCAGAAAAATACAAAGTTGGAAGCAATACCAAACAGT
GGCATGGACCACACCCAGCGGAAGTATGTATTCTTTTTGGATCCATGCAACCTGGACTTGATAAACCGGAAG
ATTAAGTCTGTAGCACTGTGTGTAGCAGCGTGTCCAAGGCAAGAACTGAAAACTCTGAGTGATGTTCAGAAG
TTTGCAGAGATAAATGGTTCAGCCCTATGTAGCTACAACCTAAAGCCTTCTGAATACACTACATCTCCAAAA
TCTTCTGTTCTCTGCCCCAAACTACCAGTTCCAGCGAGTGCACCTATTCCATTCTTCCATCGCTGTGCTCCT
GTGAACATTTCCTGCTATGCCAAGTTTGCAGAGGCCCTGATCACCTTTGTCAGTGACAATAGTGTCTTACAC
AGGCTGATTAGTGGAGTAATGACCAGCAAAGAAATTATATTGGGACTTTGCTTGTTATCACTAGTTCTATCC
ATGATTTTGATGGTGATAATCAGGTATATATCAAGAGTACTTGTGTGGATCTTAACGATTCTGGTCATACTC
GGTTCACTTGGAGGCACAGGTGTACTATGGTGGCTGTATGCAAAGCAAAGAAGGTCTCCCAAAGAAACTGTT
ACTCCTGAGCAGCTTCAGATAGCTGAAGACAATCTTCGGGCCCTCCTCATTTATGCCATTTCAGCTACAGTG
TTCACAGTGATCTTATTCCTGATAATGTTGGTTATGCGCAAACGTGTTGCTCTTACCATCGCCTTGTTCCAC
GTAGCTGGCAAGGTCTTCATTCACTTGCCACTGCTAGTCTTCCAACCCTTCTGGACTTTCTTTGCTCTTGTC
TTGTTTTGGGTGTACTGGATCATGACACTTCTTTTTCTTGGCACTACCGGCAGTCCTGTTCAGAATGAGCAA
GGCTTTGTGGAGTTCAAAATTTCTGGGCCTCTGCAGTACATGTGGTGGTACCATGTGGTGGGCCTGATTTGG
ATCAGTGAATTTATTCTAGCATGTCAGCAGATGACAGTGGCAGGAGCTGTGGTAACATACTATTTTACTAGG
GATAAAAGGAATTTGCCATTTACACCTATTTTGGCATCAGTAAATCGCCTTATTCGTTACCACCTAGGTACG
GTGGCAAAAGGATCTTTCATTATCACATTAGTCAAAATTCCGCGAATGATCCTTATGTATATTCACAGTCAG
CTCAAAGGAAAGGAAAATGCTTGTGCACGATGTGTGCTGAAATCTTGCATTTGTTGCCTTTGGTGTCTTGAA
AAGTGCCTAAATTATTTAAATCAGAATGCATACACAGCCACAGCTATCAACAGCACCAACTTCTGCACCTCA
GCAAAGGATGCCTTTGTCATTCTGGTGGAGAATGCTTTGCGAGTGGCTACCATCAACACAGTAGGAGATTTT
ATGTTATTCCTTGGCAAGGTGCTGATAGTCTGCAGCACAGGTTTAGCTGGGATTATGCTGCTCAACTACCAG
CAGGACTACACAGTATGGGTGCTGCCTCTGATCATCGTCTGCCTCTTTGCTTTCCTAGTCGCTCATTGCTTC
CTGTCTATTTATGAAATGGTAGTGGATGTATTATTCTTGTGTTTTGCCATTGATACAAAATACAATGATGGG
AGCCCTGGCAGAGAATTCTATATGGATAAAGTGCTGATGGAGTTTGTGGAAAACAGTAGGAAAGCAATGAAA
GAAGCTGGTAAGGGAGGCGTCGCTGATTCCAGAGAGCTAAAGCCGATGCTGAAGAAAAGGTGACTGGTCTCA
TGAGCCCTGAAGAATGAACTCAGAGGAGGTTGTTTACATGAGGTTCTCCCACTCACCAGCTGTTGAGAGTCT
GCGATTATGAAGAGCAGGATCTTATTACTTCAATGAAAGCATGTAACAAGTTTCTCAAACCACCAACAGCCA
AGTGGATTTGGTACAGTGCGGCTGTCTAATAAATAATCAAAAGCATTTGATAGAAAAAAAAAAA
【０００８】
「ｈＣＴＬ１」によって、ＣＴＬ１ａとＣＴＬ１ｂの交互縒り継ぎから生じた
ポリペプチドの２つの形に対するコード化遺伝子を示すものとする。
ポリペプチドの２つの形に対するコード化遺伝子を示すものとする。
【０００９】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２は、以下に示すようなｈＣＴＬ２をコード化する配列
である：
である：
【００１０】
GCGGCCGCCGGGGCTGGTCGCCTGCAGGGATGGGGGACGAGCGGCCCCACTACTACGGGAAACACGGAACGC
CACAGAAGTATGATCCCACTTTCAAAGGACCCATTTACAATAGGGGCTGCACGGATATCATATGCTGTGTGT
TCCTGCTCCTGGCCATTGTGGGCTACGTGGCTGTAGGCATCATAGCCTGGACTCATGGAGACCCTCGAAAGG
TGATCTACCCCACTGATAGCCGGGGCGAGTTCTGCGGGCAGAAGGGCACAAAAAACGAGAACAAACCCTATC
TGTTTTATTTCAACATTGTGAAATGTGCCAGCCCCCTGGTTCTGCTGGAATTCCAATGTCCCACTCCCCAGA
TCTGCGTGGAAAAATGCCCCGACCGCTACCTCACGTACCTGAATGCTCGCAGCTCCCGGGACTTTGAGTACT
ATAAGCAGTTCTGTGTTCCTGGCTTCAAGAACAATAAAGGAGTGGCTGAGGTGCTTCGAGATGGTGACTGCC
CTGCTGTCCTCATCCCCAGCAAACCCTTGGCCCGGAGATGCTTCCCCGCTATCCACGCCTACAAGGGTGTCC
TGATGGTGGGCAATGAGACGACCTATGAGGATGGGCATGGCTCCCGGAAAAACATCACAGACCTGGTGGAGG
GCGCCAAGAAAGCCAATGGAGTCCTAGAGGCGCGGCAACTCGCCATGCGCATATTTGAAGATTACACCGTCT
CTTGGTACTGGATTATCATAGGCCTGGTCATTGCCATGGCGATGAGCCTCCTGTTCATCATCCTGCTTCGCT
TCCTGGCTGGTATTATGGTCTGGGTGATGATCATCATGGTGATTCTGGTGCTGGGCTACGGAATATTTCACT
GCTACATGGAGTACTCCCGACTGCGTGGTGAGGCCGGCTCTGATGTCTCTTTGGTGGACCTCGGCTTTCAGA
CGGATTTCCGGGTGTACCTGCACTTACGGCAGACCTGGTTGGCCTTTATGATCATTCTGAGTATCCTTGAAG
TCATTATCATCTTGCTGCTCATCTTTCTCCGGAAGAGAATTCTCATCGCGATTGCACTCATCAAAGAAGCCA
GCAGGGCTGTGGGATACGTCATGTGCTCCTTGCTCTACCCACTGGTCACCTTCTTCTTGCTGTGCCTCTGCA
TCGCCTACTGGGCCAGCACTGCTGTCTTCCTGTCCACTTCCAACGAAGCGGTCTATAAGATCTTTGATGACA
GCCCCTGCCCATTTACTGCGAAAACCTGCAACCCAGAGACCTTCCCCTCCTCCAATGAGTCCCGCCAATGCC
CCAATGCCCGTTGCCAGTTCGCCTTCTACGGTGGTGAGTCGGGCTACCACCGGGCCCTGCTGGGCCTGCAGA
TCTTCAATGCCTTCATGTTCTTCTGGTTGGCCAACTTCGTGCTGGCGCTGGGCCAGGTCACGCTGGCCGGGG
CCTTTGCCTCCTATTACTGGGCCCTGCGCAAGCCGGACGACCTGCCGGCCTTCCCGCTCTTCTCTGCCTTTG
GCCGGGCGCTCAGGTACCACACAGGCTCCCTGGCCTTTGGNGCGCTCATCCTGGCCATTGTGCAGATCATCC
GTGTGATACTCGAGTACCTGGATCAGCGGCTGAAAGGTGCAGAGAACAAGTTTGCCAAGTGCCTCATGACCT
GTCTCAAATGCTGCTTCTGGTGCCTGGAGAAGTTCATCAAATTCCTTAATAGGAATGCCTACATCATGATTG
CCATCTACGGCACCAATTTCTGCACCTCGGCCAGGAATGCCTTCTTCCTGCTCATGAGAAACATCATCAGAG
TGGCTGTCCTGGATAAAGTTACTGACTTCCTCTTCCTGTTGGGCAAACTTCTGATCGTTGGTAGTGTGGGGA
TCCTGGCTTTCTTCTTCTTCACCCACCGTATCAGGATCGTGCAGGATACAGCACCACCCCTCAATTATTACT
GGGTTCCTATACTGACGGTGATCGTTGGCTCCTACTTGATTGCACACGGTTTCTTCAGCGTCTATGGCATGT
GTGTGGACACGCTGTTCCTCTGCTTCTTGGAGGACCTGGAGAGGAATGACGGCTCGGCCGAGAGGCCTTACT
TCATGTCTTCCACCCTCAAGAAACTCTTGAACAAGACCAACAAGAAGGCAGCGGAGTCCTGAAGGCCCCGTG
CTCCCCACCTCTCAAGGAGTCTCATGCCGCAGGGTGCTCAGTAGCTGGGTCTGTTCCCCCAGCCCCTTGGGT
TCACCTGAAGTCCTATCACTGCCGCTCTGCCCCTCCCCATGAGCCAGATCCCACCAGTTTCTGGACGTGGAG
AGTCTGGGGCATCTCCTTCTTATGCCAAGGGGCGCTTGGAGTTTTCATGGCTGCCCCTCCAGACTGCGAGAA
ACAAGTAAAAACCCWTTGGGGCCTCTTGATGTCTGGGATGGCACGTGGCCCGACCTCCACAAGCTCCCTCAT
GCTTCCTGTCCCCCGCTTACACGACAACGGGCCAGACCACAGGAAGGACGGTGTTTGTGTCTGAGGGAGCTG
CTGGCCACAGTGAACACCCACGTTTATTCCTGCCTGCTCCGGCCAGGACTGAACCCCTTCTCCACACCTGAA
CAGTTGGCTCAAGGGCCACCAGAAGCATTTCTTTATTATTATTATTTTTTAACCTGGACATGCATTAAAGGG
TCTATTAGCTTTCTTTYNCGTCTGTCTCAACAGCTGANATNGGGGCCGCCAAGGAGTGCCTTTCCTTTTGCT
TCCTTCNTAGGTTGGAGTTAACGGGTGGGAAGTTTTTTTTCCCANGTGGGGGTGTTTTCCTGGTTGGGAAGG
CACAGAAGTATGATCCCACTTTCAAAGGACCCATTTACAATAGGGGCTGCACGGATATCATATGCTGTGTGT
TCCTGCTCCTGGCCATTGTGGGCTACGTGGCTGTAGGCATCATAGCCTGGACTCATGGAGACCCTCGAAAGG
TGATCTACCCCACTGATAGCCGGGGCGAGTTCTGCGGGCAGAAGGGCACAAAAAACGAGAACAAACCCTATC
TGTTTTATTTCAACATTGTGAAATGTGCCAGCCCCCTGGTTCTGCTGGAATTCCAATGTCCCACTCCCCAGA
TCTGCGTGGAAAAATGCCCCGACCGCTACCTCACGTACCTGAATGCTCGCAGCTCCCGGGACTTTGAGTACT
ATAAGCAGTTCTGTGTTCCTGGCTTCAAGAACAATAAAGGAGTGGCTGAGGTGCTTCGAGATGGTGACTGCC
CTGCTGTCCTCATCCCCAGCAAACCCTTGGCCCGGAGATGCTTCCCCGCTATCCACGCCTACAAGGGTGTCC
TGATGGTGGGCAATGAGACGACCTATGAGGATGGGCATGGCTCCCGGAAAAACATCACAGACCTGGTGGAGG
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CTTGGTACTGGATTATCATAGGCCTGGTCATTGCCATGGCGATGAGCCTCCTGTTCATCATCCTGCTTCGCT
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GCTACATGGAGTACTCCCGACTGCGTGGTGAGGCCGGCTCTGATGTCTCTTTGGTGGACCTCGGCTTTCAGA
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【００１１】
核酸、核または核酸の配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌ
クレオチド配列、ヌクレオチド配列などの用語は、本明細書において区別なく使
用されるが、これらによって、ヌクレオチドの正確な連鎖を示すが、該ヌクレオ
チドは、修飾されたか否かを問わず核酸の一断片または一領域を定義することを
可能にし、また非天然ヌクレオチドを含んだり含まなかったりし、および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ，ならびに前記ＤＮＡｓの転写産物にも対応することがで
きる。核酸の天然ヌクレオチドは、塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シト
シン、チミンの中から選択されることをもって定義される。ヌクレオチドは、塩
基の部位で修飾されうる。なかでも、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン
、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，
６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、あるいはハイブリッド形成可能な
修飾されたその他全ての塩基を引用することができる。
クレオチド配列、ヌクレオチド配列などの用語は、本明細書において区別なく使
用されるが、これらによって、ヌクレオチドの正確な連鎖を示すが、該ヌクレオ
チドは、修飾されたか否かを問わず核酸の一断片または一領域を定義することを
可能にし、また非天然ヌクレオチドを含んだり含まなかったりし、および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ，ならびに前記ＤＮＡｓの転写産物にも対応することがで
きる。核酸の天然ヌクレオチドは、塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シト
シン、チミンの中から選択されることをもって定義される。ヌクレオチドは、塩
基の部位で修飾されうる。なかでも、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン
、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，
６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、あるいはハイブリッド形成可能な
修飾されたその他全ての塩基を引用することができる。
【００１２】
なお、本発明は天然染色体環境での、すなわち自然状態のヌクレオチド配列に
関するものではないと解されるべきである。対象とするのは、単離および／また
は精製された配列であり、すなわち、少なくとも部分的に修飾されたそれらの環
境を、例えば、複写によって、直接または間接に採取されたものをさす。
関するものではないと解されるべきである。対象とするのは、単離および／また
は精製された配列であり、すなわち、少なくとも部分的に修飾されたそれらの環
境を、例えば、複写によって、直接または間接に採取されたものをさす。
【００１３】
本発明の意味での、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「総同一性パーセン
テージ」によって、最良の整列の後に得られた、比較するのに完全な２つの配列
間に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味し、この百分率は純
粋に統計的で、２つの配列間の差はアトランダムにそれらの全長にわたって分散
している。核酸またはアミノ酸の２つの配列間の配列比較は、これらの完全な配
列を、最適な仕方で整列させた後に、比較することによって伝統的に実現され、
前記比較は、セグメントまたは「比較窓」によって実現されるが、それは配列の
類似性について局部領域を識別し、また比較するためである。比較のための配列
の最適な整列は、手動で行うほか、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）
［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］の局所相同アルゴリズムによって、Ｎ
ｅｄｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：
４４３］の局所相同アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１
９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４
］の類似性調査法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩの中のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）および（
製造者の手引き書に記載の標準パラメータを用いて、Ｗｉｎｄｏｓ用のＤＮＡＩ
ＳＩＳ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２，５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ、ＣＡ）を用いる情報ソフトウェアによって実現できる。
テージ」によって、最良の整列の後に得られた、比較するのに完全な２つの配列
間に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味し、この百分率は純
粋に統計的で、２つの配列間の差はアトランダムにそれらの全長にわたって分散
している。核酸またはアミノ酸の２つの配列間の配列比較は、これらの完全な配
列を、最適な仕方で整列させた後に、比較することによって伝統的に実現され、
前記比較は、セグメントまたは「比較窓」によって実現されるが、それは配列の
類似性について局部領域を識別し、また比較するためである。比較のための配列
の最適な整列は、手動で行うほか、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）
［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］の局所相同アルゴリズムによって、Ｎ
ｅｄｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：
４４３］の局所相同アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１
９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４
］の類似性調査法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩの中のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）および（
製造者の手引き書に記載の標準パラメータを用いて、Ｗｉｎｄｏｓ用のＤＮＡＩ
ＳＩＳ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２，５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ、ＣＡ）を用いる情報ソフトウェアによって実現できる。
【００１４】
この脈絡において、配列と同一性パーセンテージは、インターネット情報処理
手段を用いて得ることもできる。Ｂｌａｓｔプログラム（ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎ
ｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）および次のパラメータ”Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｐｅｎａｌ
ｔｙ １．００；Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １．００；Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ ０．３３；ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ ３０．０でのＦａｓｔＤＢ
プログラムを挙げることができる。 これらのアルゴリズムは「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｐｐ． １２７−１４９， １９
８８， ＡＬａ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）」に紹介されている。
手段を用いて得ることもできる。Ｂｌａｓｔプログラム（ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎ
ｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）および次のパラメータ”Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｐｅｎａｌ
ｔｙ １．００；Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １．００；Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ ０．３３；ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ ３０．０でのＦａｓｔＤＢ
プログラムを挙げることができる。 これらのアルゴリズムは「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｐｐ． １２７−１４９， １９
８８， ＡＬａ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）」に紹介されている。
【００１５】
核酸またはアミノ酸の２つの配列間の同一性パーセンテージは、「比較窓」に
よって最適な仕方で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定さ
れ、該窓では比較される核酸またはアミノ酸の配列の領域が、これら２つの配列
間の最適な整列の基準配列に対して、追加または欠損を含み得る。同一性パーセ
ンテージは、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列間で同一である位置
に対して同一の位置の数を定め、この同一位置の数を、比較窓内の位置の合計数
で割り、これら２つの配列間の同一性パーセンテージを得るために、得られた結
果に１００を乗じて、計算される。
よって最適な仕方で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定さ
れ、該窓では比較される核酸またはアミノ酸の配列の領域が、これら２つの配列
間の最適な整列の基準配列に対して、追加または欠損を含み得る。同一性パーセ
ンテージは、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列間で同一である位置
に対して同一の位置の数を定め、この同一位置の数を、比較窓内の位置の合計数
で割り、これら２つの配列間の同一性パーセンテージを得るために、得られた結
果に１００を乗じて、計算される。
【００１６】
少なくとも６０％、好適には８０％、９０％、９５％または９９％の同一性パ
ーセンテージを示す核の配列は、基準配列と共に最適な整列後で、基準核の配列
に対しての、一定の修飾、とくに欠損、切除、伸張、キメラ融合、および／また
は置換、とくに点置換を示し、その核の配列が、基準の核の配列と共に最適な整
列の後に、少なくとも６０％、好適には８０％、９０％、９５％または９９％の
同一性を示すことを意味するものとする。好適には、その相補配列が、本発明の
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２と特にハイブリッド形成することができる
配列である。好適には、特殊な、あるいは強ハイブリッド形成条件は、２つの配
列の一方と他方の相補配列の間に整列した後に、少なくとも６０％、好適には８
０％、９０％、９５％または９９％の同一性を保証するものとする。
ーセンテージを示す核の配列は、基準配列と共に最適な整列後で、基準核の配列
に対しての、一定の修飾、とくに欠損、切除、伸張、キメラ融合、および／また
は置換、とくに点置換を示し、その核の配列が、基準の核の配列と共に最適な整
列の後に、少なくとも６０％、好適には８０％、９０％、９５％または９９％の
同一性を示すことを意味するものとする。好適には、その相補配列が、本発明の
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２と特にハイブリッド形成することができる
配列である。好適には、特殊な、あるいは強ハイブリッド形成条件は、２つの配
列の一方と他方の相補配列の間に整列した後に、少なくとも６０％、好適には８
０％、９０％、９５％または９９％の同一性を保証するものとする。
【００１７】
強ハイブリッド形成条件でのハイブリッド形成は、温度とイオン強度条件が相
補ＤＮＡの二断片間のハイブリッド形成の維持を可能にするように選択されるこ
とを意味する。実証例として、上述のポリヌクレオチド断片を定義する目的のた
めのハイブリッド形成過程の強条件は、次のようになる。ＤＮＡ−ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成は、二段階で実現される：（１）リン酸緩衝液
（２０ ｍＭ、ｐＨ７．５）内で４２℃で３時間の前ハイブリッド形成で、該液
は、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ クエン酸
ナトリウム溶液に対応する）、５０％のホルムアルデヒド、７％のドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％の硫酸デキストラン
と１％のサケの***ＤＮＡを含有する；（２）ゾンデの大きさに依存する温度で
（すなわち、大きさのゾンデ＞１００ヌクレオチドの場合は４２℃）２０時間の
いわゆるハイブリッド形成、それに続く２×ＳＳＣ＋２％ ＳＤＳで２０℃での
２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳで２０℃での２０分の洗
浄１回。最後の洗浄は、大きさのゾンデ＞１００ヌクレオチドの場合、０．１×
ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳでの３０分間６０℃で実施される。所定のサイズのポ
リヌクレオチドについて先に述べた強ハイブリッド形成条件は、当業者によりＳ
ａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １
９８９）」の１１．１から１１．６１段落に従って、より大きな、あるいはより
小さなサイズのオリゴヌクレオチドに適合されるだろう。
補ＤＮＡの二断片間のハイブリッド形成の維持を可能にするように選択されるこ
とを意味する。実証例として、上述のポリヌクレオチド断片を定義する目的のた
めのハイブリッド形成過程の強条件は、次のようになる。ＤＮＡ−ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成は、二段階で実現される：（１）リン酸緩衝液
（２０ ｍＭ、ｐＨ７．５）内で４２℃で３時間の前ハイブリッド形成で、該液
は、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ クエン酸
ナトリウム溶液に対応する）、５０％のホルムアルデヒド、７％のドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％の硫酸デキストラン
と１％のサケの***ＤＮＡを含有する；（２）ゾンデの大きさに依存する温度で
（すなわち、大きさのゾンデ＞１００ヌクレオチドの場合は４２℃）２０時間の
いわゆるハイブリッド形成、それに続く２×ＳＳＣ＋２％ ＳＤＳで２０℃での
２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳで２０℃での２０分の洗
浄１回。最後の洗浄は、大きさのゾンデ＞１００ヌクレオチドの場合、０．１×
ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳでの３０分間６０℃で実施される。所定のサイズのポ
リヌクレオチドについて先に述べた強ハイブリッド形成条件は、当業者によりＳ
ａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １
９８９）」の１１．１から１１．６１段落に従って、より大きな、あるいはより
小さなサイズのオリゴヌクレオチドに適合されるだろう。
【００１８】
少なくとも６０％、好適には８０％、９０％、９５％または９９％の総同一性
パーセンテージを示す核の配列の中で、本発明による配列との最適な整列の後に
、核の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２と、あるいはその断片の変異核酸配
列、すなわち対立遺伝子変型に対応する核の配列全体、すなわち核の配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１または２の個別の変異が好ましい。これらの自然停止配列は、
哺乳類、とくにヒトに存在する多配置転換に、とくに病理学の発症に至ることが
ある配置転換に対応する。好適には、本発明は、変型核の配列に関するものであ
って、該配列では、突然変異が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２の正規配
列によってコード化されたポリペプチド、またはその断片のアミノ酸配列の修飾
に至る。
パーセンテージを示す核の配列の中で、本発明による配列との最適な整列の後に
、核の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２と、あるいはその断片の変異核酸配
列、すなわち対立遺伝子変型に対応する核の配列全体、すなわち核の配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１または２の個別の変異が好ましい。これらの自然停止配列は、
哺乳類、とくにヒトに存在する多配置転換に、とくに病理学の発症に至ることが
ある配置転換に対応する。好適には、本発明は、変型核の配列に関するものであ
って、該配列では、突然変異が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または２の正規配
列によってコード化されたポリペプチド、またはその断片のアミノ酸配列の修飾
に至る。
【００１９】
好適には、本発明による核酸は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、相補配列、ま
たは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の対応するＲＮＡの配列、または配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２、相補配列、または配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の対応するＲＮ
Ａの配列によって構成される。前記核酸は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のｈＣ
ＴＬ１ｂ、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９のｈＣＴＬ１ａ、および配列ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４のｈＣＴＬ２の中から選択されたポリペプチドについて一切のコー
ド化配列を含むことができる。
たは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の対応するＲＮＡの配列、または配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２、相補配列、または配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の対応するＲＮ
Ａの配列によって構成される。前記核酸は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のｈＣ
ＴＬ１ｂ、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９のｈＣＴＬ１ａ、および配列ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４のｈＣＴＬ２の中から選択されたポリペプチドについて一切のコー
ド化配列を含むことができる。
【００２０】
本発明の第２の局面は、ポリペプチドに関するものであり、該ポリペプチドは
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４および９の中から選択された一配列と共に最適整列
の後、少なくとも８０％、好適には９０％、９５％または９９％の同一性を有す
るペプチド配列を含むことを特徴としており、前記ポリペプチドは、細胞内、と
くに神経細胞内のコリンの代謝および／または輸送に関与する。好適には、前記
ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４および９の中から選択された一配
列を有する。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４および９の中から選択された一配列と共に最適整列
の後、少なくとも８０％、好適には９０％、９５％または９９％の同一性を有す
るペプチド配列を含むことを特徴としており、前記ポリペプチドは、細胞内、と
くに神経細胞内のコリンの代謝および／または輸送に関与する。好適には、前記
ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４および９の中から選択された一配
列を有する。
【００２１】
下記の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３は、ｈＣＴＬ１ｂポリペプチドを示してい
る：
る：
【００２２】
ＭＧＣＣＳＳＡＳＳＡＡＱＳＳＫＲＥＷＫＰＬＥＤＲＳＣＴＤＩＰＷＬＬＬＦＩ
ＬＦＣＩＧＭＧＦＩＣＧＦＳＩＡＴＧＡＡＡＲＬＶＳＧＹＤＳＹＧＮＩＲＧＱＫ
ＮＴＫＬＥＡＩＰＮＳＧＭＤＨＴＱＲＫＹＶＦＦＬＤＰＣＮＬＤＬＩＮＲＫＩＫ
ＳＶＡＬＣＶＡＡＣＰＲＱＥＬＫＴＬＳＤＶＱＫＦＡＥＩＮＧＳＡＬＣＳＹＮＬ
ＫＰＳＥＹＴＴＳＰＫＳＳＶＬＣＰＫＬＰＶＰＡＳＡＰＩＰＦＦＨＲＣＡＰＶＮ
ＩＳＣＹＡＫＦＡＥＡＬＩＴＦＶＳＤＮＳＶＬＨＲＬＩＳＧＶＭＴＳＫＥＩＩＬ
ＧＬＣＬＬＳＬＶＬＳＭＩＬＭＶＩＩＲＹＩＳＲＶＬＶＷＩＬＴＩＬＶＩＬＧＳ
ＬＧＧＴＧＶＬＷＷＬＹＡＫＱＲＲＳＰＫＥＴＶＴＰＥＱＬＱＩＡＥＤＮＬＲＡ
ＬＬＩＹＡＩＳＡＴＶＦＴＶＩＬＦＬＩＭＬＶＭＲＫＲＶＡＬＴＩＡＬＦＨＶＡ
ＧＫＶＦＩＨＬＰＬＬＶＦＱＰＦＷＴＦＦＡＬＶＬＦＷＶＹＷＩＭＴＬＬＦＬＧ
ＴＴＧＳＰＶＱＮＥＱＧＦＶＥＦＫＩＳＧＰＬＱＹＭＷＷＹＨＶＶＧＬＩＷＩＳ
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ＮＲＬＩＲＹＨＬＧＴＶＡＫＧＳＦＩＩＴＬＶＫＩＰＲＭＩＬＭＹＩＨＳＱＬＫ
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ＡＩＮＳＴＮＦＣＴＳＡＫＤＡＦＶＩＬＶＥＮＡＬＲＶＡＴＩＮＴＶＧＤＦＭＬ
ＦＬＧＫＶＬＩＶＣＳＴＧＬＡＧＩＭＬＬＮＹＱＱＤＹＴＶＷＶＬＰＬＩＩＶＣ
ＬＦＡＦＬＶＡＨＣＦＬＳＩＹＥＭＶＶＤＶＬＦＬＣＦＡＩＤＴＫＹＮＤＧＳＰ
ＧＲＥＦＹＭＤＫＶＬＭＥＦＶＥＮＳＲＫＡＭＫＥＡＧＫＧＧＶＡＤＳＲＥＬＫ
ＰＭＬＫＫＲ
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ＬＬＩＹＡＩＳＡＴＶＦＴＶＩＬＦＬＩＭＬＶＭＲＫＲＶＡＬＴＩＡＬＦＨＶＡ
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ＧＲＥＦＹＭＤＫＶＬＭＥＦＶＥＮＳＲＫＡＭＫＥＡＧＫＧＧＶＡＤＳＲＥＬＫ
ＰＭＬＫＫＲ
【００２３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９（ｈＣＴＬ１ａ）は、ｈＣＴＬ１遺伝子のトランスス
トライシングから生じる別の形に対応する。それは、ｈＣＴＬ１ｂとその端Ｃ−
末端だけが異なっている。停止コドンに先立つ配列は、それぞれｈＣＴＬ１ｂに
ついてはＭＬＫＫＲ、ｈＣＴＬ１ａについてはＭＡＳＧＡＳＳＡである（図１０
）。特記事項がない限り、ｈＣＴＬ１タンパク質またはポリペプチドは、ｈＣＴ
Ｌ１ａもｈＣＴＬ１ｂも指すものとする。
トライシングから生じる別の形に対応する。それは、ｈＣＴＬ１ｂとその端Ｃ−
末端だけが異なっている。停止コドンに先立つ配列は、それぞれｈＣＴＬ１ｂに
ついてはＭＬＫＫＲ、ｈＣＴＬ１ａについてはＭＡＳＧＡＳＳＡである（図１０
）。特記事項がない限り、ｈＣＴＬ１タンパク質またはポリペプチドは、ｈＣＴ
Ｌ１ａもｈＣＴＬ１ｂも指すものとする。
【００２４】
以下に示した配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４は、ｈＣＴＬ２ポリペプチドを示し
ている：
ている：
【００２５】
ＭＧＤＥＲＰＨＹＹＧＫＨＧＴＰＱＫＹＤＰＴＦＫＧＰＩＹＮＲＧＣＴＤＩＩＣ
ＣＶＦＬＬＬＡＩＶＧＹＶＡＶＧＩＩＡＷＴＨＧＤＰＲＫＶＩＹＰＴＤＳＲＧＥ
ＦＣＧＱＫＧＴＫＮＥＮＫＰＹＬＦＹＦＮＩＶＫＣＡＳＰＬＶＬＬＥＦＱＣＰＴ
ＰＱＩＣＶＥＫＣＰＤＲＹＬＴＹＬＮＡＲＳＳＲＤＦＥＹＹＫＱＦＣＶＰＧＦＫ
ＮＮＫＧＶＡＥＶＬＲＤＧＤＣＰＡＶＬＩＰＳＫＰＬＡＲＲＣＦＰＡＩＨＡＹＫ
ＧＶＬＭＶＧＮＥＴＴＹＥＤＧＨＧＳＲＫＮＩＴＤＬＶＥＧＡＫＫＡＮＧＶＬＥ
ＡＲＱＬＡＭＲＩＦＥＤＹＴＶＳＷＹＷＩＩＩＧＬＶＩＡＭＡＭＳＬＬＦＩＩＬ
ＬＲＦＬＡＧＩＭＶＷＶＭＩＩＭＶＩＬＶＬＧＹＧＩＦＨＣＹＭＥＹＳＲＬＲＧ
ＥＡＧＳＤＶＳＬＶＤＬＧＦＱＴＤＦＲＶＹＬＨＬＲＱＴＷＬＡＦＭＩＩＬＳＩ
ＬＥＶＩＩＩＬＬＬＩＦＬＲＫＲＩＬＩＡＩＡＬＩＫＥＡＳＲＡＶＧＹＶＭＣＳ
ＬＬＹＰＬＶＴＦＦＬＬＣＬＣＩＡＹＷＡＳＴＡＶＦＬＳＴＳＮＥＡＶＹＫＩＦ
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ＰＹＦＭＳＳＴＬＫＫＬＬＮＫＴＮＫＫＡＡＥＳ
【００２６】
これらのポリペプチドは、それらの基質がコリンであることを特徴とする。こ
の意味で、それらはアセチルコリンの生成に、および／または細胞の、特に腸管
細胞、神経細胞で、運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、
および乏突起神経膠細胞のような細胞の膜のリン脂質成分の生成に関与する。
の意味で、それらはアセチルコリンの生成に、および／または細胞の、特に腸管
細胞、神経細胞で、運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、
および乏突起神経膠細胞のような細胞の膜のリン脂質成分の生成に関与する。
【００２７】
本発明の別の局面は、上記で規定したような、ヌクレオチド配列を含むベクタ
ーに関するものである。このベクターにおいては、前記配列は、真核生物および
／または原核生物の細胞内の有効なプロモータと融合することができ、および／
またはさらに選択遺伝子を含むことができる。したがって、前記ベクターによっ
て変換された細胞も対象となる。変換できる細胞の中で、もちろんバクテリア細
胞（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９９３）を挙げることができるが、さらに酵
母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，１９９３）、同様に動物細胞、とくに哺乳類の細胞
の培養（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ，１９９３）、またとくにテンジ
クネズミの卵巣細胞（ＣＨＯ）、またさらに、例えばバクロウィルスを利用する
方法（Ｌｕｃｋｏｗ，１９９３）を使用することのできる昆虫細胞も挙げられる
。
ーに関するものである。このベクターにおいては、前記配列は、真核生物および
／または原核生物の細胞内の有効なプロモータと融合することができ、および／
またはさらに選択遺伝子を含むことができる。したがって、前記ベクターによっ
て変換された細胞も対象となる。変換できる細胞の中で、もちろんバクテリア細
胞（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９９３）を挙げることができるが、さらに酵
母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，１９９３）、同様に動物細胞、とくに哺乳類の細胞
の培養（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ，１９９３）、またとくにテンジ
クネズミの卵巣細胞（ＣＨＯ）、またさらに、例えばバクロウィルスを利用する
方法（Ｌｕｃｋｏｗ，１９９３）を使用することのできる昆虫細胞も挙げられる
。
【００２８】
本発明は、上述したポリペプチドと特に結合することのできる抗体にも関する
ものである。
ものである。
【００２９】
本発明の追加的な局面は、上記で規定した核酸の標本内での増幅および／また
は検出を可能にする方法に関するものであって、プライマーおよび／またはゾン
デとして、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする方
法にも関するものであって、該オリゴヌクレオチドは、上述の配列、もしくはそ
れとハイブリッド形成可能な配列の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド、
好適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドを含む。有利には
、このような配列は、ｈＣＴＬ１ａ、ｈＣＴＬ１ｂ、およびｈＣＴＬ２を特に認
識させることができる。
は検出を可能にする方法に関するものであって、プライマーおよび／またはゾン
デとして、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする方
法にも関するものであって、該オリゴヌクレオチドは、上述の配列、もしくはそ
れとハイブリッド形成可能な配列の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド、
好適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドを含む。有利には
、このような配列は、ｈＣＴＬ１ａ、ｈＣＴＬ１ｂ、およびｈＣＴＬ２を特に認
識させることができる。
【００３０】
本発明は、ＣＴＬ遺伝子族に属する他の遺伝子を識別するための方法に関して
であって、プライマーおよび／またはゾンデとして、上術の配列の、またはそれ
とハイブリッド形成可能な配列の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド、好
適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドを含む、少なくとも
一つのオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする。
であって、プライマーおよび／またはゾンデとして、上術の配列の、またはそれ
とハイブリッド形成可能な配列の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド、好
適には１５，２０，３０または５０の連続するヌクレオチドを含む、少なくとも
一つのオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする。
【００３１】
この方法は、さまざまな動物種、とりわけ哺乳類、なかでもヒトにおいて、様
々な組織内でＣＴＬ遺伝子の識別に利用することができる。
々な組織内でＣＴＬ遺伝子の識別に利用することができる。
【００３２】
さらに、上述のＣＴＬ遺伝子の、とくにｈＣＴＬ１およびｈＣＴＬ２の非コー
ド化領域を単離し、かつ特徴付けるのにも役立つ。
ド化領域を単離し、かつ特徴付けるのにも役立つ。
【００３３】
このような方法は、神経細胞の関与する遺伝子疾患、とくに家族性自律神経異
常、およびタンジェール病；さらに神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、ア
ルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病に結びつけられるＣＴＬ遺伝
子のコード化または非コード化領域内の一つまたは複数の突然変異の識別を可能
にする。
常、およびタンジェール病；さらに神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、ア
ルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病に結びつけられるＣＴＬ遺伝
子のコード化または非コード化領域内の一つまたは複数の突然変異の識別を可能
にする。
【００３４】
「突然変異」で、ＣＴＬ遺伝子のコード化または非コード化領域のどちらにも
起こりえる欠損、挿入、点突然変異（イントロン、プロモータ、エンハンサまた
はサイレンサ）を意味する。したがって、ＣＴＬタンパク質の活性、遺伝子のス
プライシング、その発現部位に影響する突然変異を識別することができる。
起こりえる欠損、挿入、点突然変異（イントロン、プロモータ、エンハンサまた
はサイレンサ）を意味する。したがって、ＣＴＬタンパク質の活性、遺伝子のス
プライシング、その発現部位に影響する突然変異を識別することができる。
【００３５】
「ゾンデ」は、本発明の意味において、標的核酸と共にハイブリッド形成体を
形成するために、所定の条件でハイブリッド形成特異性を有する、例えば、１２
から１００のヌクレオチド、とくに１５から３５のヌクレオチドを含むヌクレオ
チド断片として定義される。特異であるか否かを問わず、本発明によるゾンデは
、固体媒体上に、直接または間接に、動かなくすることができ、このとき「捕捉
ゾンデ」という。他方で、前記ゾンデは、それらの検出を可能にするマーカーを
有することがあり、このとき「検出ゾンデ」という。
形成するために、所定の条件でハイブリッド形成特異性を有する、例えば、１２
から１００のヌクレオチド、とくに１５から３５のヌクレオチドを含むヌクレオ
チド断片として定義される。特異であるか否かを問わず、本発明によるゾンデは
、固体媒体上に、直接または間接に、動かなくすることができ、このとき「捕捉
ゾンデ」という。他方で、前記ゾンデは、それらの検出を可能にするマーカーを
有することがあり、このとき「検出ゾンデ」という。
【００３６】
「捕捉ゾンデ」は、固体媒体上で、不動化されるか不動化可能であるが、それ
は適切な全ての手段、例えば、共有結合、吸着、あるいは固体媒体上での直接合
成による。これらの技術は、とくに特許出願ＷＯ９２／１００９２号に記載され
ている。もっとも一般的な方法は、様々な組織の細胞から、または媒体（ニトロ
セルロース、ナイロン、ポリスチレンなど）上で培養した細胞から、抽出した核
酸を固定し、および明確に定義された条件で、ゾンデと共に固定された標的核酸
を培養することから成る。ハイブリッド形成の後、余分なゾンデが除去され、形
成されたハイブリッド形成は適切な方法（ゾンデに結びつけられる放射能、蛍光
、または酵素活性の測定）で検出される。固体媒体としては、ＤＮＡチップ、と
くに Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ／
ＬＥＴＩ が市販しているチップも挙げられる。
は適切な全ての手段、例えば、共有結合、吸着、あるいは固体媒体上での直接合
成による。これらの技術は、とくに特許出願ＷＯ９２／１００９２号に記載され
ている。もっとも一般的な方法は、様々な組織の細胞から、または媒体（ニトロ
セルロース、ナイロン、ポリスチレンなど）上で培養した細胞から、抽出した核
酸を固定し、および明確に定義された条件で、ゾンデと共に固定された標的核酸
を培養することから成る。ハイブリッド形成の後、余分なゾンデが除去され、形
成されたハイブリッド形成は適切な方法（ゾンデに結びつけられる放射能、蛍光
、または酵素活性の測定）で検出される。固体媒体としては、ＤＮＡチップ、と
くに Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ／
ＬＥＴＩ が市販しているチップも挙げられる。
【００３７】
「検出ゾンデ」は、例えば、放射性同位元素、酵素、とくに色原体の、蛍光原
体の、または発光基質に作用することができる酵素（とりわけペルオキシダーゼ
、またはアルカリホスホターゼ）、発色団化学化合物、色原体の、蛍光原体の、
または発光する化合物、ヌクレオチド塩基の類似物、およびビオチンなどのリガ
ンドの中から選択されたマーカーによって標識をつけることができる。本発明に
よるプライマーまたはゾンデの標識付けは、放射性元素または非放射性分子によ
って実現される。使用された放射性同位元素の中で、３２Ｐ，３３Ｐ、３５Ｓ，
３Ｈまたは１２５Ｉを挙げることができる。非放射性の実体は、ビオチンなどの
リガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシジェニン、ハプテン、色素
、放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤、リン光剤などの発光剤の中
から選択される。
体の、または発光基質に作用することができる酵素（とりわけペルオキシダーゼ
、またはアルカリホスホターゼ）、発色団化学化合物、色原体の、蛍光原体の、
または発光する化合物、ヌクレオチド塩基の類似物、およびビオチンなどのリガ
ンドの中から選択されたマーカーによって標識をつけることができる。本発明に
よるプライマーまたはゾンデの標識付けは、放射性元素または非放射性分子によ
って実現される。使用された放射性同位元素の中で、３２Ｐ，３３Ｐ、３５Ｓ，
３Ｈまたは１２５Ｉを挙げることができる。非放射性の実体は、ビオチンなどの
リガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシジェニン、ハプテン、色素
、放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤、リン光剤などの発光剤の中
から選択される。
【００３８】
本発明によるポリヌクレオチドは、したがって、とくにＰＣＲ技術（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）を利用する方法において、プライマーおよび／またはゾンデとし
て使用できる（Ｅｒｌｉｃｈ，１９８９; Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，
ａｎｄ Ｒｏｌｆｓ ａｎｄ ａｌ．, １９９１）。この技術は、増幅されるべき
断片を取り囲むオリゴヌクレオチドプライマーの対の選択を必要とする。例えば
、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の技術を参照することができる。増幅
された断片は、例えばアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル上で電気泳動
の後、またはゲル上の濾過あるいはイオン交換クロマトグラフィなどのクロマト
グラフィ技術の後で識別し、それから配列されることができる。増幅の特異性は
、マトリックスとして本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、これ
らの配列を含むプラスミド、あるいはさらに派生増幅生成物を、プライマーとし
て使用することによって制御できる。増幅されたヌクレオチド断片は、ハイブリ
ッド形成反応の反応体として使用することができ、それは、前記増幅されたヌク
レオチド断片の配列に相補的な配列の標的核酸が、生物標本内に、存在すること
を証明するためである。一般的に、使用したオリゴヌクレオチドの長さによって
、ハイブリッド形成反応のための温度は、約０．８から１Ｍの濃度の食塩水内で
約２５と６５℃の間、とくに３５と６５℃の間に含まれる。特定のゾンデに関し
ては、１から２ｍＭ ＭｇＣｌ2 について、５０℃を超える温度で対にすること
ができる。オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成温度は、ＡまたはＴあたり２
℃、およびＧまたはＣについては４℃を基礎に計算され；例えば、７Ａと５Ｃの
組み合わせから成るオリゴヌクレオチドは、３４℃でハイブリッド形成する。当
業者には周知のこの規則は、本発明によるすべてのオリゴヌクレオチドについて
考えられるハイブリッド形成温度の計算を可能にする。
ーゼ連鎖反応）を利用する方法において、プライマーおよび／またはゾンデとし
て使用できる（Ｅｒｌｉｃｈ，１９８９; Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，
ａｎｄ Ｒｏｌｆｓ ａｎｄ ａｌ．, １９９１）。この技術は、増幅されるべき
断片を取り囲むオリゴヌクレオチドプライマーの対の選択を必要とする。例えば
、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の技術を参照することができる。増幅
された断片は、例えばアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル上で電気泳動
の後、またはゲル上の濾過あるいはイオン交換クロマトグラフィなどのクロマト
グラフィ技術の後で識別し、それから配列されることができる。増幅の特異性は
、マトリックスとして本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、これ
らの配列を含むプラスミド、あるいはさらに派生増幅生成物を、プライマーとし
て使用することによって制御できる。増幅されたヌクレオチド断片は、ハイブリ
ッド形成反応の反応体として使用することができ、それは、前記増幅されたヌク
レオチド断片の配列に相補的な配列の標的核酸が、生物標本内に、存在すること
を証明するためである。一般的に、使用したオリゴヌクレオチドの長さによって
、ハイブリッド形成反応のための温度は、約０．８から１Ｍの濃度の食塩水内で
約２５と６５℃の間、とくに３５と６５℃の間に含まれる。特定のゾンデに関し
ては、１から２ｍＭ ＭｇＣｌ2 について、５０℃を超える温度で対にすること
ができる。オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成温度は、ＡまたはＴあたり２
℃、およびＧまたはＣについては４℃を基礎に計算され；例えば、７Ａと５Ｃの
組み合わせから成るオリゴヌクレオチドは、３４℃でハイブリッド形成する。当
業者には周知のこの規則は、本発明によるすべてのオリゴヌクレオチドについて
考えられるハイブリッド形成温度の計算を可能にする。
【００３９】
標的核酸の他の増幅技術は、本発明によるヌクレオチド配列のプライマー対に
よって、ＰＣＲ（ＰＲＣ−ｌｉｋｅ）の代案として有利に使用することができる
。ＰＣＲ−ｌｉｋｅとは、核酸配列の直接または間接の再生を使用するすべての
方法、あるいはそこでは標識付けシステムが増幅される方法を指すものとし、こ
れらの技術は周知であり、一般的にはポリメラーゼによるＤＮＡの増幅である；
元の標本がＲＮＡであるときは、あらかじめ逆転写を実施するのがよい。現在、
この増幅を可能にするきわめて多数の方法が存在し、例えば、ＳＤＡ技術（Stra
nd Displacement Amplification）、あるいは鎖置換増幅技術（Ｗａｌｋｅｒ ａ
ｎｄ ａｌ．，１９９２）、Ｋｗｏｈらが１９８９年に示したＴＡＳ技術（Trans
cription-based Amplification System）、Ｇｕａｔｅｌｌｉらが１９９０年に
示した３ＳＲ技術（Self-Sustained Sequence Replication）、Ｋｉｅｖｉｔｉ
ｓらが１９９１年に示したＮＡＳＢＡ技術（核酸配列増幅法）、ＴＭＡ技術（Tr
anscription Mediated Amplification）、耐熱性リガーゼを使用する、Ｌａｎｄ
ｅｇｒｅｎらが１９８８年に示し、Ｂａｒａｎｙらが１９９１年に完成したＬＣ
Ｒ技術（リカーゼ連鎖反応）、Ｓｅｇｅｖが１９９２年に示したＲＣＲ技術（修
復連鎖反応）、Ｄｕｃｋらが１９９０年に示したＣＰＲ技術（Cycling Probe Re
action）、Ｍｉｅｌｅらが１９８３年に示し、ついでとくにＣｈｕらが１９８６
年に、Ｌｉｚａｒｄｉらが１９８８年に、ついでＢｕｒｇら、ならびにＳｔｏｎ
ｅらが１９９６年に完成したＱ−β−レプリカーゼ増幅技術が挙げられる。
よって、ＰＣＲ（ＰＲＣ−ｌｉｋｅ）の代案として有利に使用することができる
。ＰＣＲ−ｌｉｋｅとは、核酸配列の直接または間接の再生を使用するすべての
方法、あるいはそこでは標識付けシステムが増幅される方法を指すものとし、こ
れらの技術は周知であり、一般的にはポリメラーゼによるＤＮＡの増幅である；
元の標本がＲＮＡであるときは、あらかじめ逆転写を実施するのがよい。現在、
この増幅を可能にするきわめて多数の方法が存在し、例えば、ＳＤＡ技術（Stra
nd Displacement Amplification）、あるいは鎖置換増幅技術（Ｗａｌｋｅｒ ａ
ｎｄ ａｌ．，１９９２）、Ｋｗｏｈらが１９８９年に示したＴＡＳ技術（Trans
cription-based Amplification System）、Ｇｕａｔｅｌｌｉらが１９９０年に
示した３ＳＲ技術（Self-Sustained Sequence Replication）、Ｋｉｅｖｉｔｉ
ｓらが１９９１年に示したＮＡＳＢＡ技術（核酸配列増幅法）、ＴＭＡ技術（Tr
anscription Mediated Amplification）、耐熱性リガーゼを使用する、Ｌａｎｄ
ｅｇｒｅｎらが１９８８年に示し、Ｂａｒａｎｙらが１９９１年に完成したＬＣ
Ｒ技術（リカーゼ連鎖反応）、Ｓｅｇｅｖが１９９２年に示したＲＣＲ技術（修
復連鎖反応）、Ｄｕｃｋらが１９９０年に示したＣＰＲ技術（Cycling Probe Re
action）、Ｍｉｅｌｅらが１９８３年に示し、ついでとくにＣｈｕらが１９８６
年に、Ｌｉｚａｒｄｉらが１９８８年に、ついでＢｕｒｇら、ならびにＳｔｏｎ
ｅらが１９９６年に完成したＱ−β−レプリカーゼ増幅技術が挙げられる。
【００４０】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、有利には、本発明に
よるプライマーによる増幅反応の実施、または本発明のゾンデによる検出方法の
実施に先立って、生物標本内に含まれるｍＲＮＡからｃＤＮＡを得るために逆転
写型の酵素が使用されるだろう。このとき、得られたｃＤＮＡは、本発明による
増幅または検出方法で利用されるプライマーまたはゾンデの標的の役割を果たす
だろう。先に述べたごとく、ｈＣＴＬ１ａ、ｈＣＴＬ１ｂおよびｈＣＴＬ２間で
区別できるゾンデまたはプライマーは、とくに本発明の対象となる。
よるプライマーによる増幅反応の実施、または本発明のゾンデによる検出方法の
実施に先立って、生物標本内に含まれるｍＲＮＡからｃＤＮＡを得るために逆転
写型の酵素が使用されるだろう。このとき、得られたｃＤＮＡは、本発明による
増幅または検出方法で利用されるプライマーまたはゾンデの標的の役割を果たす
だろう。先に述べたごとく、ｈＣＴＬ１ａ、ｈＣＴＬ１ｂおよびｈＣＴＬ２間で
区別できるゾンデまたはプライマーは、とくに本発明の対象となる。
【００４１】
本発明はまた、上述の方法を実施することを可能にすることを特徴とする診断
キットにも関するものである。
キットにも関するものである。
【００４２】
本発明は、ＣＴＬ４の使用にも関するものであって、そのペプチドおよびヌク
レオチド配列は、この明細書の中で示した方法の枠内で取得番号ＡＦ１３４７７
２６と番号ＧＩ：４５２９８８６（ＮＧ２２と題する配列）でｇｅｎｂａｋ内で
入手可能なものである。
レオチド配列は、この明細書の中で示した方法の枠内で取得番号ＡＦ１３４７７
２６と番号ＧＩ：４５２９８８６（ＮＧ２２と題する配列）でｇｅｎｂａｋ内で
入手可能なものである。
【００４３】
本発明の補足的な局面は、上述のポリペプチドの活性を修飾することのできる
化合物の選別方法にある。この方法は以下の過程から成ることを特徴とする： ａ）本発明によるベクターを使用する宿主細胞内での前記ポリペプチドの発現
； ｂ）同位元素、特にＨＣ−３，ＨＣ−１５、ｄ−チュボクラリン、オクソトレ
モリン、またはカルバミル−ｂ−メチルコリンなどのコリン類似物により、およ
び前記ポリペプチドの活性を修飾することのできる少なくとも一つの化合物によ
って、標識をつけたコリンおよび／またはコリン類似物と過程ａ）で得られた宿
主細胞の培養； ｃ）コリンの混入検出および／または生成したアセチルコリンの量の分析。
化合物の選別方法にある。この方法は以下の過程から成ることを特徴とする： ａ）本発明によるベクターを使用する宿主細胞内での前記ポリペプチドの発現
； ｂ）同位元素、特にＨＣ−３，ＨＣ−１５、ｄ−チュボクラリン、オクソトレ
モリン、またはカルバミル−ｂ−メチルコリンなどのコリン類似物により、およ
び前記ポリペプチドの活性を修飾することのできる少なくとも一つの化合物によ
って、標識をつけたコリンおよび／またはコリン類似物と過程ａ）で得られた宿
主細胞の培養； ｃ）コリンの混入検出および／または生成したアセチルコリンの量の分析。
【００４４】
もちろん、ＣＴＬタンパク質の活性を修飾することのできる化合物の識別と選
別を可能にする、全変型および全ての他の技術も本発明の対象である。この意味
で、それらの活性を修飾することのできる化合物の識別と選別のための、ＣＴＬ
遺伝子とタンパク質の使用はとくに対象となる。
別を可能にする、全変型および全ての他の技術も本発明の対象である。この意味
で、それらの活性を修飾することのできる化合物の識別と選別のための、ＣＴＬ
遺伝子とタンパク質の使用はとくに対象となる。
【００４５】
この方法は、ポリペプチドの活性を修飾することのできる化合物の識別を可能
にし、該ポリペプチドは、上述の方法のおかげで識別された少なくとも一つの突
然変異を含む。さらに本発明によるポリペプチドの活性を阻害することのできる
化合物の識別も可能にする。
にし、該ポリペプチドは、上述の方法のおかげで識別された少なくとも一つの突
然変異を含む。さらに本発明によるポリペプチドの活性を阻害することのできる
化合物の識別も可能にする。
【００４６】
当業者が通常の実験の際に利用することができる下記の例によって、ＣＴＬの
活性に作用する化合物の識別を可能にするこの選別法を説明することができる（
O'Regan S. Binding of [3H]Hemicholoinium-3 to the high affinity choline
transporter in Electric Organ Synaptosomal Membranes, J.of Neurochemistr
y, 1988, Vol 51, No. 6, 1682:1687）：。
活性に作用する化合物の識別を可能にするこの選別法を説明することができる（
O'Regan S. Binding of [3H]Hemicholoinium-3 to the high affinity choline
transporter in Electric Organ Synaptosomal Membranes, J.of Neurochemistr
y, 1988, Vol 51, No. 6, 1682:1687）：。
【００４７】
［３Ｈ］ヘミコリウム（ＨＣ−３）配位子は、コリン作用性神経末端において
、アセチルコリン（ＡＣｈ）の合成に緊密に組み合わされた親和性の高いコリン
の輸送システムの活性マーカーの役割を果たすことができる（Ｋｕｈａｒ ａｎ
ｄ Ｍｕｒｒｉｎ， １９７８; Ｊｏｐｅ;１９７９）。それはラットの神経細胞
の膜内で［３Ｈ］ＨＣ−３の結合部分の特性化と位置決めを可能にし（Vickroy
and al., 1984b; Sandberg and Coyle, 1985; Chatterjee and al., 1987）、病
変後に発生する修正の追跡（Vickroy and al., 1984a）が続くが、それは化合物
、とくに医薬品による、様々な処理の後（Swann and al., 1986; Lowenstein an
d Coyle, 1986）であり、あるいは他のシナプス前コリン作用性パラメータを修
正するために、周知の脱分極条件において（Saltarelli et al., 1987）なされ
る。
、アセチルコリン（ＡＣｈ）の合成に緊密に組み合わされた親和性の高いコリン
の輸送システムの活性マーカーの役割を果たすことができる（Ｋｕｈａｒ ａｎ
ｄ Ｍｕｒｒｉｎ， １９７８; Ｊｏｐｅ;１９７９）。それはラットの神経細胞
の膜内で［３Ｈ］ＨＣ−３の結合部分の特性化と位置決めを可能にし（Vickroy
and al., 1984b; Sandberg and Coyle, 1985; Chatterjee and al., 1987）、病
変後に発生する修正の追跡（Vickroy and al., 1984a）が続くが、それは化合物
、とくに医薬品による、様々な処理の後（Swann and al., 1986; Lowenstein an
d Coyle, 1986）であり、あるいは他のシナプス前コリン作用性パラメータを修
正するために、周知の脱分極条件において（Saltarelli et al., 1987）なされ
る。
【００４８】
したがって、発明の枠内において、シナプトゾーム内のコリンの輸送における
、ＣＴＬポリペプチドの活性に対する化合物の影響の測定が可能になる。
、ＣＴＬポリペプチドの活性に対する化合物の影響の測定が可能になる。
【００４９】
このため、［３Ｈ］コリン（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ， ＣＥＡ， Ｓａｃｌａｙ，
Ｆｒａｎｃｅ）を含むシナプトゾームのアリコート分画／約数でコリンの捕捉
を測定することができる。輸送パラメータの決定のためにマーク付けされていな
いコリンを添加する。培養期間の終わりに、遠心分離にかけ、トリトンＸ−１０
０から１０％の５０μｌ内に沈滓を回収する。試験管を一度洗浄し、標本と洗浄
液をＲｅａｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎシンチレーション液（Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．，ＵＳＡ）を５ｍｌ充填した計数フラスコ内に移す。例
えばＬＳ３８０１Ｂｅｃｋｍａｎタイプの計数器を使用して放射能を決定する。
を測定することができる。輸送パラメータの決定のためにマーク付けされていな
いコリンを添加する。培養期間の終わりに、遠心分離にかけ、トリトンＸ−１０
０から１０％の５０μｌ内に沈滓を回収する。試験管を一度洗浄し、標本と洗浄
液をＲｅａｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎシンチレーション液（Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．，ＵＳＡ）を５ｍｌ充填した計数フラスコ内に移す。例
えばＬＳ３８０１Ｂｅｃｋｍａｎタイプの計数器を使用して放射能を決定する。
【００５０】
高い親和性範囲内のコリンの輸送の運動パラメータは、実験データで単純Ｍｉ
ｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ関数を調節するために、非線形最小二乗後退分析
（Ｊｏｌｉｖｅｔ，１９８２）、または線形後退プログラムでＬｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒ−Ｂｕｒｋ とＳｃａｔｃｈａｒの表現を用いて推定される。コリン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、コリン類似物、ＨＣ−３，ＨＣ
−１５（Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）、ｄ−チュボクラリ
ン（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）、オコソトレモリン（Ｓｉｇ
ｍａ）、およびカルバミル−ｂ−メチルコリン（Ｓｉｇｍａ）について、ＩＣ５
０の値を決定するために、ｌｏｇ−ｌｏｇｉｔ曲線を使用する。
ｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ関数を調節するために、非線形最小二乗後退分析
（Ｊｏｌｉｖｅｔ，１９８２）、または線形後退プログラムでＬｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒ−Ｂｕｒｋ とＳｃａｔｃｈａｒの表現を用いて推定される。コリン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、コリン類似物、ＨＣ−３，ＨＣ
−１５（Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）、ｄ−チュボクラリ
ン（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）、オコソトレモリン（Ｓｉｇ
ｍａ）、およびカルバミル−ｂ−メチルコリン（Ｓｉｇｍａ）について、ＩＣ５
０の値を決定するために、ｌｏｇ−ｌｏｇｉｔ曲線を使用する。
【００５１】
また膜へのＨＣ−３結合を測定できる。この方法で遊離リガンドから結合リガ
ンドを分離するために、高速遠心分離技術を用いるが、それは結合リガンドの損
失を最小に減らし、様々な調製物間の比較を容易にするためである。膜のアリコ
ート分画（２５μｌ）をＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）内で、合計結
合を定めるために７５μｌのＮａＣｌ ０．４Ｍ グリシルグリシン １０ｍＭ
、ｐＨ７．１で、あるいはＮａの独立結合を求めるためにＬｉＣｌ ０．４Ｍ
グリシルグリシン １０ｍＭ、ｐＨ７．１で、混合する；両者の場合、最終の塩
濃度は、ｐＨ７．４で３００ｍＭであり、Ｓａｎｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｙｌ
ｅ（１９８５）の推奨する結合媒質のそれと類似している。平衡は培養の５分後
に到達し、結合した［３Ｈ］ＨＣ−３の量は、タンパク質１０から１００μｇの
間隔で添加した膜の量に比例する。一般的に、超透明遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ）
内で、１０ｎＭの［３Ｈ］ＨＣ−３（１３２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で１５分間、環境
温度（２０−２２℃）でタンパク質約４０μｇを含む膜を培養する。つぎに、１
００ｐｓｉ（５５０００ｇｍａｘ）Ｂｅｃｋｍａｎ遠空内で５分間標本を遠心分
離にかける。上澄みを採取して、沈滓を乱さずに試験管の側面と底部をふき取る
。つぎに沈滓を５０μｌのトリトンＸ−１００ １０％内に懸濁させ、放射能を
定めるために、５０μｌの洗浄水溶液と共に、計数フラスコに移す。このように
して、全体のシナプトゾーム膜と［３Ｈ］ＨＣ−３（５−１２０ｎＭ）の濃度間
隔を用いて、結合パラメータを決定し、Ｎａの独立結合を引いた後、あるいはＳ
ｃａｔｃｈａｒｄの表現を用いて、実験データに関数Ｂ＝（Ｂｍａｘ×Ｆ）／（
ＫＤ＋Ｆ）（ここでＢは結合リガンド、Ｆは遊離リガンド）を調整するために、
非線形後退分析を実施する。いくつかの場合、非マークのコリンが１００μＭ存
在する中で白値を測定することもできる。
ンドを分離するために、高速遠心分離技術を用いるが、それは結合リガンドの損
失を最小に減らし、様々な調製物間の比較を容易にするためである。膜のアリコ
ート分画（２５μｌ）をＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）内で、合計結
合を定めるために７５μｌのＮａＣｌ ０．４Ｍ グリシルグリシン １０ｍＭ
、ｐＨ７．１で、あるいはＮａの独立結合を求めるためにＬｉＣｌ ０．４Ｍ
グリシルグリシン １０ｍＭ、ｐＨ７．１で、混合する；両者の場合、最終の塩
濃度は、ｐＨ７．４で３００ｍＭであり、Ｓａｎｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｙｌ
ｅ（１９８５）の推奨する結合媒質のそれと類似している。平衡は培養の５分後
に到達し、結合した［３Ｈ］ＨＣ−３の量は、タンパク質１０から１００μｇの
間隔で添加した膜の量に比例する。一般的に、超透明遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ）
内で、１０ｎＭの［３Ｈ］ＨＣ−３（１３２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で１５分間、環境
温度（２０−２２℃）でタンパク質約４０μｇを含む膜を培養する。つぎに、１
００ｐｓｉ（５５０００ｇｍａｘ）Ｂｅｃｋｍａｎ遠空内で５分間標本を遠心分
離にかける。上澄みを採取して、沈滓を乱さずに試験管の側面と底部をふき取る
。つぎに沈滓を５０μｌのトリトンＸ−１００ １０％内に懸濁させ、放射能を
定めるために、５０μｌの洗浄水溶液と共に、計数フラスコに移す。このように
して、全体のシナプトゾーム膜と［３Ｈ］ＨＣ−３（５−１２０ｎＭ）の濃度間
隔を用いて、結合パラメータを決定し、Ｎａの独立結合を引いた後、あるいはＳ
ｃａｔｃｈａｒｄの表現を用いて、実験データに関数Ｂ＝（Ｂｍａｘ×Ｆ）／（
ＫＤ＋Ｆ）（ここでＢは結合リガンド、Ｆは遊離リガンド）を調整するために、
非線形後退分析を実施する。いくつかの場合、非マークのコリンが１００μＭ存
在する中で白値を測定することもできる。
【００５２】
コリン輸送体の見かけ回転数は、親和性の高いコリン輸送用のＶｍａｘをＨＣ
−３結合部分用のＢｍａｘによって除して計算することができる。シナプトゾー
ムの同じ調製物に由来する材料を使用して、二つのパラメータを決定する。平行
処理した標本の最終沈滓内でＡＣｈＥの回復に対してデータを正規化するが、そ
れはシナプトゾームのタンパク質含有率と、シナプトゾーム膜の含有率とは、シ
トプラズマタンパク質がタンパク質含有率に寄与するために異なるからである。
−３結合部分用のＢｍａｘによって除して計算することができる。シナプトゾー
ムの同じ調製物に由来する材料を使用して、二つのパラメータを決定する。平行
処理した標本の最終沈滓内でＡＣｈＥの回復に対してデータを正規化するが、そ
れはシナプトゾームのタンパク質含有率と、シナプトゾーム膜の含有率とは、シ
トプラズマタンパク質がタンパク質含有率に寄与するために異なるからである。
【００５３】
本発明は、上述の方法から得ることのできる化合物と、前記化合物または上述
のベクターと、医薬品として許容できる賦形剤を含む組成物も対象とする。
のベクターと、医薬品として許容できる賦形剤を含む組成物も対象とする。
【００５４】
したがって、本発明のある局面は、医薬品、とくに腸管細胞、広義の神経細胞
、とくに運動ニューロン、感覚ニューロン、および乏突起神経膠細胞などのＣＴ
Ｌ遺伝子の転写生成物を発現する細胞が関わる遺伝子疾患、とくに家族性自律神
経異常、およびタンジェール病の治療のための医薬品、あるいはさらに神経を原
因とする疾患、とくに心配症、神経症、不安、行動障害、警戒心、記憶、睡眠、
神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、
ハンチントン病の治療を目的とする医薬品の製造のための、前記化合物またはベ
クターの使用を対象とする。くわえて、アルツハイマー病とトランスフェラーゼ
・アセチルコリンの量（Ｂａｓｋｉｎ Ｄ．Ｓ．ら、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ、
１９９９、Ｓｅｐ；５６（９）１１２１：１１２３）との間、あるいは患者の脳
内の内因性アセチルコリンの自己抑制作用（Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｃら、Ｅｘｐ Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９９ １２８（３）３８３:３８９）との間に緊密な相関が
あり、この病気へのコリンの代謝と輸送の関与が示される。
、とくに運動ニューロン、感覚ニューロン、および乏突起神経膠細胞などのＣＴ
Ｌ遺伝子の転写生成物を発現する細胞が関わる遺伝子疾患、とくに家族性自律神
経異常、およびタンジェール病の治療のための医薬品、あるいはさらに神経を原
因とする疾患、とくに心配症、神経症、不安、行動障害、警戒心、記憶、睡眠、
神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、
ハンチントン病の治療を目的とする医薬品の製造のための、前記化合物またはベ
クターの使用を対象とする。くわえて、アルツハイマー病とトランスフェラーゼ
・アセチルコリンの量（Ｂａｓｋｉｎ Ｄ．Ｓ．ら、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ、
１９９９、Ｓｅｐ；５６（９）１１２１：１１２３）との間、あるいは患者の脳
内の内因性アセチルコリンの自己抑制作用（Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｃら、Ｅｘｐ Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９９ １２８（３）３８３:３８９）との間に緊密な相関が
あり、この病気へのコリンの代謝と輸送の関与が示される。
【００５５】
したがって、クローンは、シビレエイの電気葉のＤＮＡから実現した発現ライ
ブラリから単離し、前記クローンは、酵母内のコリン輸送の突然変異をなくすこ
とができる。ラットにおいては、運動ニューロンと乏突起神経膠細胞内に、相同
物ｒＣＴＬ１の高い発現レベルが見出されるが、もっと低いレベルの発現は、脳
内に分散したニューロン群内にも現れる。したがって、ＳＮＣ内のｒＣＴＬ１の
分布は、コリン作用性タンパク質に期待されるもの分布だけに限定されない。く
わえて、５ｋｂのｍＲＮＡは、結腸粘膜の細胞層内の強い発現に結びつけられる
。コリン作用性ニューロンは、コリンの代謝における修飾にきわめて敏感である
が、それは膜ならびに神経伝達物質（２５，２６）の合成のために、コリンを必
要とするからである。したがって、ＣＴＬタンパク質は、膜の成分の合成のため
にコリンを提供し、および／またはアセチルコリンの合成に関わることができる
。卵母細胞内、および様々な培養細胞内での完全なコード化配列の形をしたｔＣ
ＴＬ１およびｒＣＴＬ１の発現は、コリン吸収における有意の修飾を示している
。
ブラリから単離し、前記クローンは、酵母内のコリン輸送の突然変異をなくすこ
とができる。ラットにおいては、運動ニューロンと乏突起神経膠細胞内に、相同
物ｒＣＴＬ１の高い発現レベルが見出されるが、もっと低いレベルの発現は、脳
内に分散したニューロン群内にも現れる。したがって、ＳＮＣ内のｒＣＴＬ１の
分布は、コリン作用性タンパク質に期待されるもの分布だけに限定されない。く
わえて、５ｋｂのｍＲＮＡは、結腸粘膜の細胞層内の強い発現に結びつけられる
。コリン作用性ニューロンは、コリンの代謝における修飾にきわめて敏感である
が、それは膜ならびに神経伝達物質（２５，２６）の合成のために、コリンを必
要とするからである。したがって、ＣＴＬタンパク質は、膜の成分の合成のため
にコリンを提供し、および／またはアセチルコリンの合成に関わることができる
。卵母細胞内、および様々な培養細胞内での完全なコード化配列の形をしたｔＣ
ＴＬ１およびｒＣＴＬ１の発現は、コリン吸収における有意の修飾を示している
。
【００５６】
ＣＴＬ族は、１０の推定膜貫通ドメインと、１１の高度に保存されたシステイン
によって特徴づけられる。これらのタンパク質は、輸送体と、またとくに膜貫通
ドメインＴＭＤ２と３で限定された構造の相同性を共有する（図２Ｂを参照）。
植物やＣ．エレガンスのような単純な動物は、この性質の遺伝子を一つしか持た
ない（図２Ｃ）。反対に、ヒトやマウスは、多くの複製遺伝子が見つかる染色体
の位置内に位置する、異なる３つ、あるいはおそらく４つの相同遺伝子を有する
ことは明らかである。９ｑ３１．２のＤ９Ｓ２９９の近傍のｈＣＴＬ１の染色体
位置決めは、家族性自律神経異常、およびタンジェール病などの遺伝子疾患の原
因となる遺伝子座のすぐ近くに、この遺伝子を位置づける。運動ニューロン、感
覚ニューロン、および乏突起神経膠細胞内のｒＣＴＬ１の強い発現、ならびにコ
リン吸収との機能的結合は、それを出生時の自律ならびに運動の現れを伴う末梢
コリン作用性成分（２７）を含む病気である家族性自律神経異常、もしくは成人
におけるＳＮＣの段階的髄鞘脱落疾患（２８）を引き起こす突然変異の場所であ
る候補プロモータにする。機能的自律神経障害（２９）に結びつけられる遺伝子
座に近接するマーカーの範囲が最近狭くなったことと組み合わせて、ｈＣＴＬ１
のゲノムの位置決めの精度を向上させるための現在の努力は、ｈＣＴＬ１のエキ
ソン領域が、突然変異の座に近いが、近位であることを示し、５’の調節ドメイ
ン内の置換の可能性を残している。
によって特徴づけられる。これらのタンパク質は、輸送体と、またとくに膜貫通
ドメインＴＭＤ２と３で限定された構造の相同性を共有する（図２Ｂを参照）。
植物やＣ．エレガンスのような単純な動物は、この性質の遺伝子を一つしか持た
ない（図２Ｃ）。反対に、ヒトやマウスは、多くの複製遺伝子が見つかる染色体
の位置内に位置する、異なる３つ、あるいはおそらく４つの相同遺伝子を有する
ことは明らかである。９ｑ３１．２のＤ９Ｓ２９９の近傍のｈＣＴＬ１の染色体
位置決めは、家族性自律神経異常、およびタンジェール病などの遺伝子疾患の原
因となる遺伝子座のすぐ近くに、この遺伝子を位置づける。運動ニューロン、感
覚ニューロン、および乏突起神経膠細胞内のｒＣＴＬ１の強い発現、ならびにコ
リン吸収との機能的結合は、それを出生時の自律ならびに運動の現れを伴う末梢
コリン作用性成分（２７）を含む病気である家族性自律神経異常、もしくは成人
におけるＳＮＣの段階的髄鞘脱落疾患（２８）を引き起こす突然変異の場所であ
る候補プロモータにする。機能的自律神経障害（２９）に結びつけられる遺伝子
座に近接するマーカーの範囲が最近狭くなったことと組み合わせて、ｈＣＴＬ１
のゲノムの位置決めの精度を向上させるための現在の努力は、ｈＣＴＬ１のエキ
ソン領域が、突然変異の座に近いが、近位であることを示し、５’の調節ドメイ
ン内の置換の可能性を残している。
【００５７】
タンジェール病の突然変異は、それほどうまく位置決定できず、ｈＣＴＬは、
この疾患に結びつけられるマーカーの間隔内にある。タンジェール病においては
、高密度リポタンパクのレベルが下がることによって、回帰する神経疾患と共に
循環するコレステロールのレベルが下がり、また腸の脂質が蓄積される（３０）
。周知のごとく、コリンは、ホスファチジルコリンを介して、高密度リポタンパ
クの生成に関与する。この意味で、コリンから合成されたリン酸脂質の一つであ
るレシチンが、高密度リポタンパク質の胆汁内分泌を増加することが証明された
（３１）。
この疾患に結びつけられるマーカーの間隔内にある。タンジェール病においては
、高密度リポタンパクのレベルが下がることによって、回帰する神経疾患と共に
循環するコレステロールのレベルが下がり、また腸の脂質が蓄積される（３０）
。周知のごとく、コリンは、ホスファチジルコリンを介して、高密度リポタンパ
クの生成に関与する。この意味で、コリンから合成されたリン酸脂質の一つであ
るレシチンが、高密度リポタンパク質の胆汁内分泌を増加することが証明された
（３１）。
【００５８】
ヒトにおけるこのタンパク質の新しい族の識別は、とくに腸管細胞、神経細胞
、とりわけ運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏
突起神経膠細胞などの細胞部位で、ＣＴＬの機能障害に結びつけられる様々な疾
患の治療に有益となり得る薬理学の道具の開発への道が開かれる。
、とりわけ運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏
突起神経膠細胞などの細胞部位で、ＣＴＬの機能障害に結びつけられる様々な疾
患の治療に有益となり得る薬理学の道具の開発への道が開かれる。
【００５９】
明細書の続きについては、以下に示す図の説明文を参照する。
【００６０】
図の説明文
図１：電気葉のｃＤＮＡの異質構造発現による酵母におけるコリン輸送の突然
変異抑制 （Ａ）選択的条件でコリンに依存する増加を示すコロニーから単離した個別の
プラスミドで突然変異酵母を転換した。転換酵母を［３Ｈ］−コリン２５ｎＭで
３０分、３０℃で保温した。１ｍＭの低温コリンがあるときとないときの吸収の
差の形で飽和可能なコリンの吸収を測定し、増加を計算に入れるために正規化す
る（ＤＯ６００）；４．１６がインサートのないプラスミドであり、それを対照
に使用した。４．１７だけがコリンの吸収を誘発することができる（平均（独立
した３−５実験の標準偏差）。 （Ｂ）４．１７によって転換された突然変異酵母によるコリンの吸収の特性化。
ＨＣ−３ １μＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭの添加、ＨＣ−３ならびにＮａＣｌの
添加によって同じ程度コリンの吸収を阻害した（平均（独立した５つの実験の標
準偏差）。
変異抑制 （Ａ）選択的条件でコリンに依存する増加を示すコロニーから単離した個別の
プラスミドで突然変異酵母を転換した。転換酵母を［３Ｈ］−コリン２５ｎＭで
３０分、３０℃で保温した。１ｍＭの低温コリンがあるときとないときの吸収の
差の形で飽和可能なコリンの吸収を測定し、増加を計算に入れるために正規化す
る（ＤＯ６００）；４．１６がインサートのないプラスミドであり、それを対照
に使用した。４．１７だけがコリンの吸収を誘発することができる（平均（独立
した３−５実験の標準偏差）。 （Ｂ）４．１７によって転換された突然変異酵母によるコリンの吸収の特性化。
ＨＣ−３ １μＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭの添加、ＨＣ−３ならびにＮａＣｌの
添加によって同じ程度コリンの吸収を阻害した（平均（独立した５つの実験の標
準偏差）。
【００６１】
図２：ＣＴＬタンパク質の配列の整列とそれらの膜位相のモデル
（Ａ）２つの同質構造タンパク質ｈＣＴＬ２とｈＣＴＬ４、および単一のＣ．
エレガンスの同質構造タンパク質Ｆ３５Ｃ８．７を備えたしびれえい由来のＣＴ
Ｌ１（ｔＣＴＬ１）、ラット（ｒＣＴＬ１），およびヒト（ｈＣＴＬ１）のアミ
ノ酸の配列の整列。黒い網掛け部は１００％の保存を、明るい灰色の網掛け部は
８０％の保存を示す（Blosum 62）。膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を形成できる疎
水性アミノ酸セグメントは、整列、番号付けの下で示されている。潜在的Ｎ−グ
リコシル化の部位はそれぞれの配列内で下線がつけられている。保存したシステ
インは整列下の星印で標識がつけられる。 （Ｂ）ＣＴＬ１の構造モデル （Ｃ）ＣＴＬタンパク質とＣｌｕｓｔａｌＷを用いて得られた類似のタンパク質
の系統樹。原核生物には同族体は見つからなかった。星印は、分析に部分的タン
パク質配列しか使用していないことを示す。
エレガンスの同質構造タンパク質Ｆ３５Ｃ８．７を備えたしびれえい由来のＣＴ
Ｌ１（ｔＣＴＬ１）、ラット（ｒＣＴＬ１），およびヒト（ｈＣＴＬ１）のアミ
ノ酸の配列の整列。黒い網掛け部は１００％の保存を、明るい灰色の網掛け部は
８０％の保存を示す（Blosum 62）。膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を形成できる疎
水性アミノ酸セグメントは、整列、番号付けの下で示されている。潜在的Ｎ−グ
リコシル化の部位はそれぞれの配列内で下線がつけられている。保存したシステ
インは整列下の星印で標識がつけられる。 （Ｂ）ＣＴＬ１の構造モデル （Ｃ）ＣＴＬタンパク質とＣｌｕｓｔａｌＷを用いて得られた類似のタンパク質
の系統樹。原核生物には同族体は見つからなかった。星印は、分析に部分的タン
パク質配列しか使用していないことを示す。
【００６２】
図３：成長したラットの組織内のｒＣＴＬ１のｍＲＮＡのノーザン分析
ｒＣＴＬ１についてゾンデで特異化した組織に由来するＲＮＡポリ（Ａ）＋（
２μｇ）をハイブリッド形成し、それを７時間曝露した。下部は（−アクチンの
ゾンデによるハイブリッド形成を示している。
２μｇ）をハイブリッド形成し、それを７時間曝露した。下部は（−アクチンの
ゾンデによるハイブリッド形成を示している。
【００６３】
図４：ＩＳＨによる成長したラットの組織内ｒＣＴＬ１の分布
（Ａ）この図は、分散した細胞内のアンチセンスｒＣＴＬ１のｃＲＮＡゾンデ
による強い標識付けを示しており、この分散した細胞は、灰白質内に局在する細
胞内、ならびにＡｍｍｏｎ角（ＣＡ１−ＣＡ３）および歯状回（ＤＧ）の海馬状
ニューロン内よりも脳梁内（ＣＣ）により高い密度で存在する。 （Ｂ）ＣＣ内でマークされた細胞の拡大図は細胞の鎖を示し、そのことからの標
識付けが示唆される（矢印の頭）。 （Ｃ）延髄の先頭断面図は白質内にも灰白質内にも存在する標識付けされた小細
胞、ならびに腹側核内に観察される、マークされた大細胞（矢印の頭、ＶＭｎＦ
、腹側正中裂）の高い密度を示している。 （Ｄ）結腸粘膜（Ｍ）を構成する細胞層は、高いレベルのｒＣＴＬ１の転写生成
物を発現している。 （Ｅ、Ｆ）ジゴキシジェニン（Ｅ）で標識付けしたｒＣＴＬ１のｃＲＮＡアンチ
センスゾンデとフルオレセイン（Ｆ）で標識付けしたアセチルトランスフェラー
ゼコリンのアンチセンスリボゾンデを用いる二重ＩＳＨは、運動ニューロンの形
でｒＣＴＬ１を発現する大きな細胞の識別に至る（矢印の頭）。ジゴキシジェニ
ンとフルオレセインでマークされたゾンデのハイブリッド形成クリオセクション
は有意の信号を示さない。
による強い標識付けを示しており、この分散した細胞は、灰白質内に局在する細
胞内、ならびにＡｍｍｏｎ角（ＣＡ１−ＣＡ３）および歯状回（ＤＧ）の海馬状
ニューロン内よりも脳梁内（ＣＣ）により高い密度で存在する。 （Ｂ）ＣＣ内でマークされた細胞の拡大図は細胞の鎖を示し、そのことからの標
識付けが示唆される（矢印の頭）。 （Ｃ）延髄の先頭断面図は白質内にも灰白質内にも存在する標識付けされた小細
胞、ならびに腹側核内に観察される、マークされた大細胞（矢印の頭、ＶＭｎＦ
、腹側正中裂）の高い密度を示している。 （Ｄ）結腸粘膜（Ｍ）を構成する細胞層は、高いレベルのｒＣＴＬ１の転写生成
物を発現している。 （Ｅ、Ｆ）ジゴキシジェニン（Ｅ）で標識付けしたｒＣＴＬ１のｃＲＮＡアンチ
センスゾンデとフルオレセイン（Ｆ）で標識付けしたアセチルトランスフェラー
ゼコリンのアンチセンスリボゾンデを用いる二重ＩＳＨは、運動ニューロンの形
でｒＣＴＬ１を発現する大きな細胞の識別に至る（矢印の頭）。ジゴキシジェニ
ンとフルオレセインでマークされたゾンデのハイブリッド形成クリオセクション
は有意の信号を示さない。
【００６４】
図５：地図を９ｑ３１．２で作成したＹＡＣでのＷＩ−１７３２０とｈＣＴＬ
−Ｆ３の共同位置決め 試験した６つのＹＡＣの中で、ＹＡＣ ７８６−ｈ−８と８０２−ａ−１だけ
がＰＣＲによってＷＩ−１７３２０マーカーについて陽性であることが分かった
；同じＹＡＣは５’ｄ’ｈＣＴＬ１でのコード化領域について、一つのマーカー
、ＣＴＬＩ−Ｆ３に対しても陽性である。またこれら２つのＹＡＣが遺伝しマー
カーＤ９Ｓ２９９を有することも分かる。正の対照として酵母のアクチンを用い
た。染色体９上のＹＡＣの位置決定（バーに向かう点線）はＧＤＢ地図の表現に
基づいている。
−Ｆ３の共同位置決め 試験した６つのＹＡＣの中で、ＹＡＣ ７８６−ｈ−８と８０２−ａ−１だけ
がＰＣＲによってＷＩ−１７３２０マーカーについて陽性であることが分かった
；同じＹＡＣは５’ｄ’ｈＣＴＬ１でのコード化領域について、一つのマーカー
、ＣＴＬＩ−Ｆ３に対しても陽性である。またこれら２つのＹＡＣが遺伝しマー
カーＤ９Ｓ２９９を有することも分かる。正の対照として酵母のアクチンを用い
た。染色体９上のＹＡＣの位置決定（バーに向かう点線）はＧＤＢ地図の表現に
基づいている。
【００６５】
図６：転換実験に用いられるプラスミド
このプラスミドは哺乳類における発現ベクターｐｃＤＮＡ３から構築された。
【００６６】
図７：ＨＣ−３に感受性のあるコリンの吸収
生理条件でのコリンの吸収を試験するために、４．１７クローン（ｔＣＴＬ１
）を転写し、ゼノプスの卵母細胞内に注入した。内生コリンの吸収率が高いので
誘導された吸収の変化の観察が困難になることに注意しなければならない。しか
しながら、ｔＣＴＬ１の発現は８８ｍＭ ＮａＣｌの存在の下、ＨＣ−３に感受
性のあるコリンの吸収を３倍に増加させる。
）を転写し、ゼノプスの卵母細胞内に注入した。内生コリンの吸収率が高いので
誘導された吸収の変化の観察が困難になることに注意しなければならない。しか
しながら、ｔＣＴＬ１の発現は８８ｍＭ ＮａＣｌの存在の下、ＨＣ−３に感受
性のあるコリンの吸収を３倍に増加させる。
【００６７】
図８：図６に記載のＣＴＬ１ｐｃＤＮＡ３ベクターによるグリオマＣ６細胞の
一時的トランスフェクション トランスフェクションの４８時間後、空のプラスミド（負の対照）でトランス
フェクションした細胞に対して、コリンの総吸収はわずかな増加しか認められな
かった。しかしながら、Ｃ６−ＣＴＬ１ｐｃＤＮＡ３細胞だけが１（ｍのヘミク
ロリニウム−３によるコリンの全体吸収の阻害を示す。よって、ＣＴＬ１はヘミ
クロリニウム−３への感受性に関与する。
一時的トランスフェクション トランスフェクションの４８時間後、空のプラスミド（負の対照）でトランス
フェクションした細胞に対して、コリンの総吸収はわずかな増加しか認められな
かった。しかしながら、Ｃ６−ＣＴＬ１ｐｃＤＮＡ３細胞だけが１（ｍのヘミク
ロリニウム−３によるコリンの全体吸収の阻害を示す。よって、ＣＴＬ１はヘミ
クロリニウム−３への感受性に関与する。
【００６８】
図９：グリオマＣ６細胞の安定トランスフェクション
抗生物質と安定化による選択の後、ＣＴＬ１（ＣｅＲ１）を発現する細胞の膜
は天然Ｃ６細胞、あるいはＣＴＬ１のアンチセンスでトランスフェクションした
細胞よりも２倍多いヘミクロリニウム−３を保持している。したがって、ＣＴＬ
１の発現はコリントランスポータータンパク質の数の増加に結びつけられている
。
は天然Ｃ６細胞、あるいはＣＴＬ１のアンチセンスでトランスフェクションした
細胞よりも２倍多いヘミクロリニウム−３を保持している。したがって、ＣＴＬ
１の発現はコリントランスポータータンパク質の数の増加に結びつけられている
。
【００６９】
図１０：ｈＣＴＬ１およびｈＣＴＬ１ｂタンパク質の配列の整列
ＣＴＬ１遺伝子転写物のトランススプライシングは、イタリック体で図に示し
たように、それらのＣ−末端の端が異なる２つのタンパク質の生成に至る。これ
らの配列はこれらのタンパク質の調節、アドレス指定、および相互作用に異なる
役割を果たすことができる。
たように、それらのＣ−末端の端が異なる２つのタンパク質の生成に至る。これ
らの配列はこれらのタンパク質の調節、アドレス指定、および相互作用に異なる
役割を果たすことができる。
【００７０】
図１１：ノーザンプリントの分析による成長したラットの組織と細胞系列内の
ｒＣＴＬ１ａおよびｒＣＴＬ１ｂのｍＲＮＡの発現相補性 それぞれのｍＲＮＡ用の特殊なゾンデにより、一方または他方がスプライシン
グした形を発現する組織と細胞を識別し、それらの大きさを特徴づけることが可
能になる。共通の配列に対応するゾンデと、同じプリントのハイブリッド形成は
、これら２つの形が成長したラットの組織内ＣＴＬ１の大半の形であることを示
している。検討した細胞系列の中で、グリオマＣ６はＣＴＬ１ｂの強い発現と、
Ｎ１８神経芽細胞腫のような他の系列にも検出される中間の大きさの転写物によ
って区別される。堆積したポリ（Ａ）+ＲＮＡの量は、脳と結腸については２μ
ｇ、回腸、系列Ｃ６とＮ１８については１０μｇであった。
ｒＣＴＬ１ａおよびｒＣＴＬ１ｂのｍＲＮＡの発現相補性 それぞれのｍＲＮＡ用の特殊なゾンデにより、一方または他方がスプライシン
グした形を発現する組織と細胞を識別し、それらの大きさを特徴づけることが可
能になる。共通の配列に対応するゾンデと、同じプリントのハイブリッド形成は
、これら２つの形が成長したラットの組織内ＣＴＬ１の大半の形であることを示
している。検討した細胞系列の中で、グリオマＣ６はＣＴＬ１ｂの強い発現と、
Ｎ１８神経芽細胞腫のような他の系列にも検出される中間の大きさの転写物によ
って区別される。堆積したポリ（Ａ）+ＲＮＡの量は、脳と結腸については２μ
ｇ、回腸、系列Ｃ６とＮ１８については１０μｇであった。
【００７１】
図１２：ｒＣＴＬ１ａ／ｐｃＤＮＡ３，ｒＣＴＬ１ｂ／ｐｃＤＮＡ３およびｐ
ｃＤＮＡ３ベクターによる遷移トランスフェクション後の、Ｎ１８細胞によるコ
リンの輸送 トランスフェクションから２４時間後、空のプラスミドによってトランスフェ
クションされた細胞よりも組み替えプラスミドによってトランスフェクションさ
れた細胞によってより多くのコリンの捕捉が観察される。３つの場合、１０μＭ
の低温コリン、または１０μＭのヘミクロリニウム−３が存在するとき、三重化
したコリンの捕捉は約５０％阻害される（結果は示されていない）。
ｃＤＮＡ３ベクターによる遷移トランスフェクション後の、Ｎ１８細胞によるコ
リンの輸送 トランスフェクションから２４時間後、空のプラスミドによってトランスフェ
クションされた細胞よりも組み替えプラスミドによってトランスフェクションさ
れた細胞によってより多くのコリンの捕捉が観察される。３つの場合、１０μＭ
の低温コリン、または１０μＭのヘミクロリニウム−３が存在するとき、三重化
したコリンの捕捉は約５０％阻害される（結果は示されていない）。
【００７２】
実施例１：酵母内のコリン輸送突然変異の補足。
【００７３】
試料と方法
Ｄ３０８−１４Ｄ（ctr ise leu his4）（6）とＵＲＡ３株（（９）を交差し
て、本発明の枠内で使用した酵母株（ctr ise URA3（）を得た。この株は、コリ
ンの外部株とコリンの吸収機構を同時に配置する場合を除き、貧ウラシル媒質内
でも、ミヨイノシトールの高い含有率でも成長しない。トルペード・マルモラー
タの冷凍した電気葉からポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製した。対応するｃＤＮＡを、
ＡｍｅｒｓｈａｍのｃＤＮＡクローン化キットを用いてｐＦＬ６１（９）プラス
ミドのＢｓｔＸＩ部位内に挿入した。ＬｉＡｃ／ＳＳ−ＤＮＡ（ＰＥＧ）（１０
）を用いて、酵母の転換を実施した。転換酵母を選択的成長条件（ウラシルなし
、コリン２０μｇ／ｍｌ、ミオイノシトール２０μｇ／ｍｌ）で固体媒質上で培
養した；コリンが存在しないときに成長できるので、逆突然変異体を除去した。
コリンに依存する成長の強い表現型を有するコロニーからプラスミドを単離し、
逆突然変異体ｃｔｒと酵母サプレッサの突然変異を除去するために、突然変異酵
母の整除可能な分画を転換するのにそれらを使用した。５つのコロニーを採用し
、コリンの吸収を試験した。
て、本発明の枠内で使用した酵母株（ctr ise URA3（）を得た。この株は、コリ
ンの外部株とコリンの吸収機構を同時に配置する場合を除き、貧ウラシル媒質内
でも、ミヨイノシトールの高い含有率でも成長しない。トルペード・マルモラー
タの冷凍した電気葉からポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製した。対応するｃＤＮＡを、
ＡｍｅｒｓｈａｍのｃＤＮＡクローン化キットを用いてｐＦＬ６１（９）プラス
ミドのＢｓｔＸＩ部位内に挿入した。ＬｉＡｃ／ＳＳ−ＤＮＡ（ＰＥＧ）（１０
）を用いて、酵母の転換を実施した。転換酵母を選択的成長条件（ウラシルなし
、コリン２０μｇ／ｍｌ、ミオイノシトール２０μｇ／ｍｌ）で固体媒質上で培
養した；コリンが存在しないときに成長できるので、逆突然変異体を除去した。
コリンに依存する成長の強い表現型を有するコロニーからプラスミドを単離し、
逆突然変異体ｃｔｒと酵母サプレッサの突然変異を除去するために、突然変異酵
母の整除可能な分画を転換するのにそれらを使用した。５つのコロニーを採用し
、コリンの吸収を試験した。
【００７４】
組み替え酵母によるコリン吸収
個別の単離したプラスミドで突然変異酵母の整除可能な分画を転換し、増幅し
た後、［３Ｈ］コリン２５ｍＭ（０．１μＣｉ，２．８ＴＢｑ／ｍｍｏｌｅ、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）で３０℃、３０分間窒素（１１）のない媒質内でコリンの吸収
を決定し、ついで濾過、洗浄した。１ｍＭの標識をつけていないコリンを添加し
てブランクを推定し、引き算した。ＤＯ６００を測定して、培養密度を正規化し
た。
た後、［３Ｈ］コリン２５ｍＭ（０．１μＣｉ，２．８ＴＢｑ／ｍｍｏｌｅ、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）で３０℃、３０分間窒素（１１）のない媒質内でコリンの吸収
を決定し、ついで濾過、洗浄した。１ｍＭの標識をつけていないコリンを添加し
てブランクを推定し、引き算した。ＤＯ６００を測定して、培養密度を正規化し
た。
【００７５】
結果
ｐＦＬ６１内のしびれえい電気葉の発現ライブラリで転換した突然変異酵母（
ｃｔｒ ｉｓｅ ＵＲＡ ３（）について、選択的条件でコリン依存成長のため
の補足は、突然変異酵母による飽和可能な［３Ｈ］コリンの吸収増加に結びつけ
られる４．１７と命名された単一のクローンの単離に到達した（図１Ａ）．周知
のごとく、コリン作用性神経末端による類縁性の高いコリンの吸収はナトリウム
に依存し、低濃度のヘミクロリニウム−３（ＨＣ３）によって阻害される（１，
１７）；４．１７で転換された酵母による飽和可能な［３Ｈ］コリンの吸収は低
濃度（１μＭ）でＨＣ−３によって阻害されるが、媒質にＮａＣｌ１００ｍＭを
添加すると信号が低下するが、これはおそらく、酵母に対する結果としての高オ
スモル濃度のためである。ＨＣ−３の阻害効果とＮａＣｌの高オスモル濃度添加
は付加的ではなく、そのことは２つの処置がコリン吸収の同じ成分を阻害するこ
とを示唆している。
ｃｔｒ ｉｓｅ ＵＲＡ ３（）について、選択的条件でコリン依存成長のため
の補足は、突然変異酵母による飽和可能な［３Ｈ］コリンの吸収増加に結びつけ
られる４．１７と命名された単一のクローンの単離に到達した（図１Ａ）．周知
のごとく、コリン作用性神経末端による類縁性の高いコリンの吸収はナトリウム
に依存し、低濃度のヘミクロリニウム−３（ＨＣ３）によって阻害される（１，
１７）；４．１７で転換された酵母による飽和可能な［３Ｈ］コリンの吸収は低
濃度（１μＭ）でＨＣ−３によって阻害されるが、媒質にＮａＣｌ１００ｍＭを
添加すると信号が低下するが、これはおそらく、酵母に対する結果としての高オ
スモル濃度のためである。ＨＣ−３の阻害効果とＮａＣｌの高オスモル濃度添加
は付加的ではなく、そのことは２つの処置がコリン吸収の同じ成分を阻害するこ
とを示唆している。
【００７６】
したがって、電気葉の４．１７クローンは酵母のコリン輸送突然変異抑制遺伝
子として働き、４．１７を発現する酵母のコリンの吸収はＨＣ−３に感受性があ
るが、ナトリウムに依存しない、したがって、神経コリントランスポーターとは
部分的にしか類似していない。したがって、４．１７クローンに対応するｃＤＮ
Ａの配列決定はそれが停止コドンの前に３ＴＭＤを含む１７５ａａの一部の欠け
た膜貫通タンパクについてコード化することを示している。欠けた脊椎の膜貫通
タンパクが酵母のプラズマ膜に向かってより容易に方向付けられることも不可能
ではない（１８）。
子として働き、４．１７を発現する酵母のコリンの吸収はＨＣ−３に感受性があ
るが、ナトリウムに依存しない、したがって、神経コリントランスポーターとは
部分的にしか類似していない。したがって、４．１７クローンに対応するｃＤＮ
Ａの配列決定はそれが停止コドンの前に３ＴＭＤを含む１７５ａａの一部の欠け
た膜貫通タンパクについてコード化することを示している。欠けた脊椎の膜貫通
タンパクが酵母のプラズマ膜に向かってより容易に方向付けられることも不可能
ではない（１８）。
【００７７】
実施例２：ＣＴＬ１の正族および同族配列のクローン化と分析。
【００７８】
試料と方法
それぞれ、Ｔ．マルモラータの電気葉とラットの脳から構築された（ＺＡＰ
ＩＩ（Stratagene）のライブラリから、ｃＤＮＡの全長、酵母のコリン輸送突然
変異抑制遺伝子であるｔＣＴＬ１と、ラットにおけるその正族、ｒＣＴＬ１を単
離した。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と外部配列決定サービス
（ESGS-Cybergene, Evry）を同時に使用して、４．４ｋｂのｔＣＴＬ１クローン
と２．９ｋｂのｒＣＴＬ１クローンの完全な配列を得た。ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅのハイドロパシ図を元にして、ＣＴＬタンパク質の上述の膜貫通タンパ
ク質ドメイン（ＴＭＤ）を割り当てた。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて同族発現
配列マーカー（ＥＳＴ）を集めた。Ｅｗｉｎｇの肉腫の細胞系統、ＩＣＢ １１
２（１２）に由来するＤＮＡを用いて得られたＰＣＲ生成物を配列決定すること
で、ヒトの正族ｈＣＴＬ１（Unigene ACC.:Hs.179902）とその同族ｈＣＴＬ２（
Unigene ACC.:Hs.167515とHs.105509）のコード化領域について配列を完成した
。ゲノム配列の概念的翻訳として、全長の他のコード化配列も利用した：ネズミ
（ｇｂＡｃｃ：ＡＡＣ８４１６６）およびヒト（ｇｂＡｃｃ：ＡＡＤ２１８１３
）のＮＧ２２は、本書では、それぞれｍＣＴＬ４およびｈＣＴＬ４と再命名した
；Ｃ．エレガンスのＦ３５Ｃ８．７；酵母のＹＯＲ １６１ｃ；シロイヌナズナ
のＦ２０Ｍ１３．２００。ｇｃｇ：ＰＩＬＥＵＰを用い、選択した配列の整列を
実施した。ＥＳＴ分析はショウジョウバエにおけるＣＴＬ１の同族（ｇｂＡｃｃ
：ＡＡ６９７３４０）、細胞性粘菌（ｇｂＡｃｃ：Ｃ２４６２２）、および発明
者らがｈＣＴＬ３と呼ぶヒトの他の同族（ｇｂＡｃｃ：Ａａ３２９４３２）とそ
のネズミの同等物、ｍＣＴＬ３（ｇｂＡｃｃ：Ｗ６４１１７）を示している。こ
れらのタンパク質の間の癒着関係はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて描かれた系統樹の
形で示された。
ＩＩ（Stratagene）のライブラリから、ｃＤＮＡの全長、酵母のコリン輸送突然
変異抑制遺伝子であるｔＣＴＬ１と、ラットにおけるその正族、ｒＣＴＬ１を単
離した。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と外部配列決定サービス
（ESGS-Cybergene, Evry）を同時に使用して、４．４ｋｂのｔＣＴＬ１クローン
と２．９ｋｂのｒＣＴＬ１クローンの完全な配列を得た。ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅのハイドロパシ図を元にして、ＣＴＬタンパク質の上述の膜貫通タンパ
ク質ドメイン（ＴＭＤ）を割り当てた。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて同族発現
配列マーカー（ＥＳＴ）を集めた。Ｅｗｉｎｇの肉腫の細胞系統、ＩＣＢ １１
２（１２）に由来するＤＮＡを用いて得られたＰＣＲ生成物を配列決定すること
で、ヒトの正族ｈＣＴＬ１（Unigene ACC.:Hs.179902）とその同族ｈＣＴＬ２（
Unigene ACC.:Hs.167515とHs.105509）のコード化領域について配列を完成した
。ゲノム配列の概念的翻訳として、全長の他のコード化配列も利用した：ネズミ
（ｇｂＡｃｃ：ＡＡＣ８４１６６）およびヒト（ｇｂＡｃｃ：ＡＡＤ２１８１３
）のＮＧ２２は、本書では、それぞれｍＣＴＬ４およびｈＣＴＬ４と再命名した
；Ｃ．エレガンスのＦ３５Ｃ８．７；酵母のＹＯＲ １６１ｃ；シロイヌナズナ
のＦ２０Ｍ１３．２００。ｇｃｇ：ＰＩＬＥＵＰを用い、選択した配列の整列を
実施した。ＥＳＴ分析はショウジョウバエにおけるＣＴＬ１の同族（ｇｂＡｃｃ
：ＡＡ６９７３４０）、細胞性粘菌（ｇｂＡｃｃ：Ｃ２４６２２）、および発明
者らがｈＣＴＬ３と呼ぶヒトの他の同族（ｇｂＡｃｃ：Ａａ３２９４３２）とそ
のネズミの同等物、ｍＣＴＬ３（ｇｂＡｃｃ：Ｗ６４１１７）を示している。こ
れらのタンパク質の間の癒着関係はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて描かれた系統樹の
形で示された。
【００７９】
結果：
クローン化遺伝子（ｔＣＴＬ１とｒＣＴＬ１）についてのタンパク質配列およ
びその人の同族（ｈＣＴＬ１、ラットと９６％の同一性）は図２Ａに示されてい
る。さらにヒトとマウスにおいて、複数の類縁性のあるタンパク質の一族の構成
員が見つかった：ヒトとマウスのゲノム配列の概念的翻訳から、ｈＣＴＬ４（ｈ
ＣＴＬ１と４３％の相同性）およびｍＣＴＬ４（上述の試料と方法参照）；およ
びｈＣＴＬ２（ｈＣＴＬ１と４３％の相同性およびｈＣＴＬ４と６７％の相同性
）、これらについては完全なコード化配列が得られた。これらすべての配列はＣ
．エレガンスのゲノム内に見出された唯一の遺伝子Ｆ３５Ｃ８．７に類似してい
る（図２Ａ）。ＢＬＯＣＫＳまたはＰＲＯＳＩＴＥデータベースでのドメイン分
析とモチーフの研究は一致しないが、トランスポーターは膜貫通ドメインＴＭＤ
２と３との整列で頻繁に引用される（図２Ｂ）。これらのタンパク質はすべて複
数の膜貫通ドメインを有し、それらが膜を１０回通過することが妥当に考えられ
る（図２Ｂ）。この族のタンパク質の他の主要特性は次の通りである：保存され
た６つのシステインを伴い、グリコシル化が可能な、ＴＭＤ１と２の間において
可変的で大きな第一の細胞外ループ；いくつかのタンパク質の中でグリコシル化
した、ＴＭＤ５と６の間で変動する第３の小さな細胞外ループ、４つの最後のＴ
ＭＤを覆い、保存された３つのシステインを含むがＣＴＬ１の正族内でしかグリ
コシル化の可能性がない、第４の細胞外ループを含む高度に保存された領域；お
よび変動可能な細胞内のＮ−およびＣ−末端の先端。興味深いことに、保存され
た領域は最初のＡＴＧがｔＣＴＬ１のＭ４７１に対応する抑制遺伝子４．１７を
含んでいる。タンパク質は明らかなペプチド・シグナルを失い、それらはプラズ
マ膜の上で標的になることが期待される。
びその人の同族（ｈＣＴＬ１、ラットと９６％の同一性）は図２Ａに示されてい
る。さらにヒトとマウスにおいて、複数の類縁性のあるタンパク質の一族の構成
員が見つかった：ヒトとマウスのゲノム配列の概念的翻訳から、ｈＣＴＬ４（ｈ
ＣＴＬ１と４３％の相同性）およびｍＣＴＬ４（上述の試料と方法参照）；およ
びｈＣＴＬ２（ｈＣＴＬ１と４３％の相同性およびｈＣＴＬ４と６７％の相同性
）、これらについては完全なコード化配列が得られた。これらすべての配列はＣ
．エレガンスのゲノム内に見出された唯一の遺伝子Ｆ３５Ｃ８．７に類似してい
る（図２Ａ）。ＢＬＯＣＫＳまたはＰＲＯＳＩＴＥデータベースでのドメイン分
析とモチーフの研究は一致しないが、トランスポーターは膜貫通ドメインＴＭＤ
２と３との整列で頻繁に引用される（図２Ｂ）。これらのタンパク質はすべて複
数の膜貫通ドメインを有し、それらが膜を１０回通過することが妥当に考えられ
る（図２Ｂ）。この族のタンパク質の他の主要特性は次の通りである：保存され
た６つのシステインを伴い、グリコシル化が可能な、ＴＭＤ１と２の間において
可変的で大きな第一の細胞外ループ；いくつかのタンパク質の中でグリコシル化
した、ＴＭＤ５と６の間で変動する第３の小さな細胞外ループ、４つの最後のＴ
ＭＤを覆い、保存された３つのシステインを含むがＣＴＬ１の正族内でしかグリ
コシル化の可能性がない、第４の細胞外ループを含む高度に保存された領域；お
よび変動可能な細胞内のＮ−およびＣ−末端の先端。興味深いことに、保存され
た領域は最初のＡＴＧがｔＣＴＬ１のＭ４７１に対応する抑制遺伝子４．１７を
含んでいる。タンパク質は明らかなペプチド・シグナルを失い、それらはプラズ
マ膜の上で標的になることが期待される。
【００８０】
これらの配列と、マウスとヒトにおける、別のタンパク質ＣＴＬ３についての
別の部分的配列、ならびに植物のゲノムからの概念的翻訳を含む、他の真核生物
内のもっと離れた同族との関係は図２Ｃに示した。ヒトにおいて、これらの族の
構成員であるｈＣＴＬ２とｈＣＴＬ４は、ｈＣＴＬ１とｈＣＴＬ３（３８％の相
同性）よりもＣ．エレガンスの単一遺伝子にもっと緊密に類似している（５１−
５２％の相同性）。２つの植物タンパク質はＣ．エレガンスの遺伝子と２５％の
相同性しか示さない。まとめて考えると、構造に関する情報とこれらの配列の関
係は、それがまさにＣＴＬタンパク質（Ｃ．エレガンスのトランスポータータイ
プのタンパク質の略語）の新しい族であることを示している。
別の部分的配列、ならびに植物のゲノムからの概念的翻訳を含む、他の真核生物
内のもっと離れた同族との関係は図２Ｃに示した。ヒトにおいて、これらの族の
構成員であるｈＣＴＬ２とｈＣＴＬ４は、ｈＣＴＬ１とｈＣＴＬ３（３８％の相
同性）よりもＣ．エレガンスの単一遺伝子にもっと緊密に類似している（５１−
５２％の相同性）。２つの植物タンパク質はＣ．エレガンスの遺伝子と２５％の
相同性しか示さない。まとめて考えると、構造に関する情報とこれらの配列の関
係は、それがまさにＣＴＬタンパク質（Ｃ．エレガンスのトランスポータータイ
プのタンパク質の略語）の新しい族であることを示している。
【００８１】
実施例４：組織内のｒＣＴＬ１の発現の分析。
【００８２】
試料と方法
ａ）ノーザンブロット法
［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識マークされ、緊縮条件で洗浄したｒＣＴＬ１の５’
でのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用い、ノーザンブロット法によって各種の組
織から抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡ（２μｇ）を分析した。７時間、ついで４０
時間（図示されていない）曝露し、対照群として（−アクチンゾンデとハイブリ
ッド形成した。 ｂ）自然位置でのハイブリッド形成 ＩＳＨ実験は（１４）、Ｓｃｈａｅｒｅｎ−ＷｉｅｍｅｒｓとＧｅｒｌｉｎ−
Ｍｏｓｅｒ（１３）のプロトコル修正に記載のように実施した。ｐＧＥＭ−４Ｚ
内のｒＣＴＬ１から派生した１．６ｋｂの制限断片ＰｓｔＩをサブクローン化し
、ジゴキシジェニンでマークされたアンチセンスおよびセンスのリボゾンデで合
成するためにそれを使用した。１−２３３２ヌクレオチドに対応する断片につい
てコード化するフルオレセインでマークされたアセチルトランスフェラーゼコリ
ンのリボゾンデを用いて（１６）、二重ＩＳＨ手順を実施した（１５）。ｒＣＴ
Ｌ１のセンス・リボゾンデは特定の信号を出さず、一方アンチセンスｃＲＮＡゾ
ンデは反応生成物に到達し、細胞核の周囲の細胞質環内に観察された。
でのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用い、ノーザンブロット法によって各種の組
織から抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡ（２μｇ）を分析した。７時間、ついで４０
時間（図示されていない）曝露し、対照群として（−アクチンゾンデとハイブリ
ッド形成した。 ｂ）自然位置でのハイブリッド形成 ＩＳＨ実験は（１４）、Ｓｃｈａｅｒｅｎ−ＷｉｅｍｅｒｓとＧｅｒｌｉｎ−
Ｍｏｓｅｒ（１３）のプロトコル修正に記載のように実施した。ｐＧＥＭ−４Ｚ
内のｒＣＴＬ１から派生した１．６ｋｂの制限断片ＰｓｔＩをサブクローン化し
、ジゴキシジェニンでマークされたアンチセンスおよびセンスのリボゾンデで合
成するためにそれを使用した。１−２３３２ヌクレオチドに対応する断片につい
てコード化するフルオレセインでマークされたアセチルトランスフェラーゼコリ
ンのリボゾンデを用いて（１６）、二重ＩＳＨ手順を実施した（１５）。ｒＣＴ
Ｌ１のセンス・リボゾンデは特定の信号を出さず、一方アンチセンスｃＲＮＡゾ
ンデは反応生成物に到達し、細胞核の周囲の細胞質環内に観察された。
【００８３】
結果：
ｒＣＴＬ１ゾンデによるラットのｍＲＮＡ分布のノーザン分析は、脊髄内と、
もっと少ない程度脳内に、３．５ｋｂのとくに衝撃的な信号を有し、５ｋｂのも
っと大きな形は結腸内、肺臓と脊髄内に存在することを示す（図３）。５ｋｂの
形状はかなり頻繁で強度が低い（４０時間の曝露、図示されていない）と思われ
る一方で、同じ条件での肝臓、脾臓、回腸については３．５ｋｂの信号は検出さ
れなかった。ＩＳＨによる強い発現を示す組織のより精密な検査は、複数のタイ
プの細胞がｒＣＴＬ１を発現することを示している（図４）。脊髄内で、腹側角
内の大きなサイズの細胞内にもっとも強い発現が認められ、それらはさらに、ア
セチルトランスフェラーゼコリンのｃＲＮＡアンチセンスリボゾンデを使用する
、二重ＩＳＨ実験によって運動ニューロンとして識別された（図４Ｅ，Ｆ）。結
果はやはり、正面核内で運動性と考えられるニューロン内に、ｒＣＴＬ１の転写
生成物の強い発現を示し、これらのコリン作用性ニューロン内での重要な役割が
示唆される。しかしながら、中隔区域または基底核内に見出されるものなどの、
アセチルトランスフェラーゼコリンのｍＲＮＡを発現する他のニューロンは、ｒ
ＣＴＬ１のｍＲＮＡの高いレベルを示さない。くわえて、ｒＣＴＬ１は、脊髄内
であっても、コリン作用性ニューロンの特異的マーカーではない、なぜなら灰白
質内にも白質内にも分散している細胞内にｒＣＴＬ１の高い密度が検出されたか
らである（図４Ｃ）。灰白質内でマークされた小さな細胞は、乏突起神経膠細胞
またはインターニューロンに対応するかもしれない。したがって脳内で、ｒＣＴ
Ｌ１のｍＲＮＡの発現は、ミエリン化繊維束内でとくに強い。結果は小脳白質、
脳幹、脳梁、海馬状フィムブリエ、側面臭覚脚内で強くマークされた細胞の高い
密度も示している。これらの区域内で、マークされた細胞は、乏突起神経膠細胞
（１９）について示されたように短い鎖（４Ｂ）の形で現れる。小脳の白質の部
位で実施された、ミエリンの基礎タンパク質の特定のリボゾンデ、乏突起神経膠
細胞マーカー（１９）とｒＣＴＬ１を用いる二重ＩＳＨ実験は、ｒＣＴＬ１が乏
突起神経膠細胞内でよく発現することを示している。ｒＣＴＬ１はまた、例えば
、Ａｍｍｏｎ角の三角錐形の細胞と歯状回の顆粒状細胞内にｒＣＴＬ１の転写生
成物が認められる海馬状形成内に、ならびに海馬状形成全体内に分散した細胞内
などの脳全体の中に分散したニューロン内に低いレベルで発現される（図Ａ４）
。したがって、ｒＣＴＬ１は中枢神経系（ＳＮＣ）同時にニューロンと乏突起神
経膠細胞によって発現されると思われる。
もっと少ない程度脳内に、３．５ｋｂのとくに衝撃的な信号を有し、５ｋｂのも
っと大きな形は結腸内、肺臓と脊髄内に存在することを示す（図３）。５ｋｂの
形状はかなり頻繁で強度が低い（４０時間の曝露、図示されていない）と思われ
る一方で、同じ条件での肝臓、脾臓、回腸については３．５ｋｂの信号は検出さ
れなかった。ＩＳＨによる強い発現を示す組織のより精密な検査は、複数のタイ
プの細胞がｒＣＴＬ１を発現することを示している（図４）。脊髄内で、腹側角
内の大きなサイズの細胞内にもっとも強い発現が認められ、それらはさらに、ア
セチルトランスフェラーゼコリンのｃＲＮＡアンチセンスリボゾンデを使用する
、二重ＩＳＨ実験によって運動ニューロンとして識別された（図４Ｅ，Ｆ）。結
果はやはり、正面核内で運動性と考えられるニューロン内に、ｒＣＴＬ１の転写
生成物の強い発現を示し、これらのコリン作用性ニューロン内での重要な役割が
示唆される。しかしながら、中隔区域または基底核内に見出されるものなどの、
アセチルトランスフェラーゼコリンのｍＲＮＡを発現する他のニューロンは、ｒ
ＣＴＬ１のｍＲＮＡの高いレベルを示さない。くわえて、ｒＣＴＬ１は、脊髄内
であっても、コリン作用性ニューロンの特異的マーカーではない、なぜなら灰白
質内にも白質内にも分散している細胞内にｒＣＴＬ１の高い密度が検出されたか
らである（図４Ｃ）。灰白質内でマークされた小さな細胞は、乏突起神経膠細胞
またはインターニューロンに対応するかもしれない。したがって脳内で、ｒＣＴ
Ｌ１のｍＲＮＡの発現は、ミエリン化繊維束内でとくに強い。結果は小脳白質、
脳幹、脳梁、海馬状フィムブリエ、側面臭覚脚内で強くマークされた細胞の高い
密度も示している。これらの区域内で、マークされた細胞は、乏突起神経膠細胞
（１９）について示されたように短い鎖（４Ｂ）の形で現れる。小脳の白質の部
位で実施された、ミエリンの基礎タンパク質の特定のリボゾンデ、乏突起神経膠
細胞マーカー（１９）とｒＣＴＬ１を用いる二重ＩＳＨ実験は、ｒＣＴＬ１が乏
突起神経膠細胞内でよく発現することを示している。ｒＣＴＬ１はまた、例えば
、Ａｍｍｏｎ角の三角錐形の細胞と歯状回の顆粒状細胞内にｒＣＴＬ１の転写生
成物が認められる海馬状形成内に、ならびに海馬状形成全体内に分散した細胞内
などの脳全体の中に分散したニューロン内に低いレベルで発現される（図Ａ４）
。したがって、ｒＣＴＬ１は中枢神経系（ＳＮＣ）同時にニューロンと乏突起神
経膠細胞によって発現されると思われる。
【００８４】
ｒＣＴＬ１の発現はＳＮＣの外、とくに、転写のもっとも大きな生成物が頻繁
にみられる結腸内でも起きる。結腸内において、陥凹部の粘膜の細胞層内でも、
管腔内でも高い発現レベルが認められた（図４Ｄ）。
にみられる結腸内でも起きる。結腸内において、陥凹部の粘膜の細胞層内でも、
管腔内でも高い発現レベルが認められた（図４Ｄ）。
【００８５】
実施例５：酵母の人工染色体（ＹＡＣ）を用いる、染色体９上のｈＣＴＬ１の
位置決め。
位置決め。
【００８６】
配列マーカー部位（ＳＴＳ：ＷＩ−１７３２０）をｈＣＴＬ１の３’のコード
化領域に対応するＥＳＴに結合した。示された領域９ｑ２２／３１内のＹＡＣは
、ヒト多形研究センター（フランス）に由来するものである。ＰＣＲ分析にＹＡ
Ｃを収容している酵母を使用した。Ｗ１−１７５２０のためのプライマーＰＣＲ
は所与のごとくであり（ｇｂＡｃｃ：Ｇ２４２２９）、酵母アクチン（ｇｂＡｃ
ｃ：Ｘ６１５０２）については直接かつ反対；ＣＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＧＡＧＡ
ＡＡＣＡＡＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）および反対：ＡＡＡＧＡ ＡＣＡ
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）である。ｈＣＴＬ
１遺伝子のコード化領域の位置決定に用いられたプライマーは直接：ＣＡＴＧＴ
ＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）と反対：
ＣＧＡＡＴＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８
）である。これらの最後のプライマー、ＣＴＬ１−Ｆ３を用いるＰＣＲ生成物は
ｃＤＮＡによって予測されるよりも長く、イントロンを含んでいるので、１６１
ではなく７６２塩基である。
化領域に対応するＥＳＴに結合した。示された領域９ｑ２２／３１内のＹＡＣは
、ヒト多形研究センター（フランス）に由来するものである。ＰＣＲ分析にＹＡ
Ｃを収容している酵母を使用した。Ｗ１−１７５２０のためのプライマーＰＣＲ
は所与のごとくであり（ｇｂＡｃｃ：Ｇ２４２２９）、酵母アクチン（ｇｂＡｃ
ｃ：Ｘ６１５０２）については直接かつ反対；ＣＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＧＡＧＡ
ＡＡＣＡＡＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）および反対：ＡＡＡＧＡ ＡＣＡ
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）である。ｈＣＴＬ
１遺伝子のコード化領域の位置決定に用いられたプライマーは直接：ＣＡＴＧＴ
ＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）と反対：
ＣＧＡＡＴＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８
）である。これらの最後のプライマー、ＣＴＬ１−Ｆ３を用いるＰＣＲ生成物は
ｃＤＮＡによって予測されるよりも長く、イントロンを含んでいるので、１６１
ではなく７６２塩基である。
【００８７】
結果：
ヒトのＥＳＴ分析の結果はまた、ｈＣＴＬ１に組み合わされた配列がＳＴＳ、
ＷＩ−１７３２０を含み、９ｑ２２／３１内に位置決定されたことを示す。この
マーカーを有するＹＡＣは未知なので、試験を実施するために、この部位で位置
を設定した６ＹＡＣを選択し、ＰＣＲ分析によってその中の２つ、７８６−Ｈと
８０２−Ａ−１がＷＩ−１７３２０に対して陽性であることを見出した。これら
２つのＹＡＣだけが、ｈＣＴＬ１の５’内のコード化領域について定義したマー
カー、ＣＴＬ２−Ｆ３に対しても陽性であった（図５）。２つのＹＡＣは遺伝子
マーカーＤ９Ｓ２９９も有し、このことは９ｑ３１．２におけるｈＣＴＬ１のよ
り正確な位置決定を示している。Ｄ９Ｓ２９９は家族性自律神経異常の突然変異
部位（ＭＩＭ ２２３９００）に対してちょうど近位にあり（２０）、タンジェ
ール病について与えられた、より広い部位（ＭＩＭ ２０５４００）（２１）の
内部にある。
ＷＩ−１７３２０を含み、９ｑ２２／３１内に位置決定されたことを示す。この
マーカーを有するＹＡＣは未知なので、試験を実施するために、この部位で位置
を設定した６ＹＡＣを選択し、ＰＣＲ分析によってその中の２つ、７８６−Ｈと
８０２−Ａ−１がＷＩ−１７３２０に対して陽性であることを見出した。これら
２つのＹＡＣだけが、ｈＣＴＬ１の５’内のコード化領域について定義したマー
カー、ＣＴＬ２−Ｆ３に対しても陽性であった（図５）。２つのＹＡＣは遺伝子
マーカーＤ９Ｓ２９９も有し、このことは９ｑ３１．２におけるｈＣＴＬ１のよ
り正確な位置決定を示している。Ｄ９Ｓ２９９は家族性自律神経異常の突然変異
部位（ＭＩＭ ２２３９００）に対してちょうど近位にあり（２０）、タンジェ
ール病について与えられた、より広い部位（ＭＩＭ ２０５４００）（２１）の
内部にある。
【００８８】
ｈＣＴＬ４とｈＣＴＬ２の染色***置決定に関する情報も利用できる：６ｐ２
１．３で組織親和性の高錯体ＩＩＩの部分としてヒトＮＧ２２（ｈＣＴＬ４）を
配列決定し、組み立てられたｈＣＴＬ２の配列は１９ｐ１３．１で独立して地図
を作製した２つのＳＴＳを含んでいる。結果として、ＣＴＬは染色体１，６，９
と１９の間の複製を備えたヒトの多数の遺伝子に似ている（２２−２４）。
１．３で組織親和性の高錯体ＩＩＩの部分としてヒトＮＧ２２（ｈＣＴＬ４）を
配列決定し、組み立てられたｈＣＴＬ２の配列は１９ｐ１３．１で独立して地図
を作製した２つのＳＴＳを含んでいる。結果として、ＣＴＬは染色体１，６，９
と１９の間の複製を備えたヒトの多数の遺伝子に似ている（２２−２４）。
【００８９】
実施例６：トランススプライシングから生まれたＣＴＬ１の２つの形。
【００９０】
ヒトとラットにおいて、ＣＴＬ１タンパク質についてコード化する遺伝子上の
トランススプライシングを明らかにした。このスプライシングは、そのＣ−末端
だけが異なっている、２つのタンパク質、ｈＣＴＬ１ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
９）とｈＣＴＬｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）に至る。停止コドンに先立つ配列
はそれぞれ、ｈＣＴＬ１ｂについてはＭＬＫＫＲ、ｈＣＴＬ１ａについてはＭＡ
ＳＧＡＳＳＡである（図１０）。これら２つの形は異なる組織分布を示す。ラッ
トにおいて、ＣＴＬ１ｂは脳内で優位に発現する一方で、ＣＴＬ１ａは大半が小
腸内に発現する（図１１）。細胞レベルで、脳の断片上でｒＣＴＬ１ａおよびｒ
ＣＴＬ１ｂゾンデをそれぞれ使用する、自然位置でのハイブリッド形成実験は、
神経膠細胞内に２つの転写産物が存在することを示しているが、ｒＣＴＬ１ａだ
けが特定の神経群内で発現される。ｒＣＴＬ１ａとｒＣＴＬ１ｂの共同位置決定
は、神経膠系統の神経膠腫でも見出される（図１１）。わずかな内生ＣＴＬ１し
か発現しないＮ１８細胞系統内でトランスフェクションした後（図１１）、ｒＣ
ＴＬ１ａまたはｒＣＴＬ１ｂについてコード化するｃＤＮＡを含むプラスミドは
、両者共の細胞による、三重化されたコリンの捕獲増加を促す（図１２）。
トランススプライシングを明らかにした。このスプライシングは、そのＣ−末端
だけが異なっている、２つのタンパク質、ｈＣＴＬ１ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
９）とｈＣＴＬｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）に至る。停止コドンに先立つ配列
はそれぞれ、ｈＣＴＬ１ｂについてはＭＬＫＫＲ、ｈＣＴＬ１ａについてはＭＡ
ＳＧＡＳＳＡである（図１０）。これら２つの形は異なる組織分布を示す。ラッ
トにおいて、ＣＴＬ１ｂは脳内で優位に発現する一方で、ＣＴＬ１ａは大半が小
腸内に発現する（図１１）。細胞レベルで、脳の断片上でｒＣＴＬ１ａおよびｒ
ＣＴＬ１ｂゾンデをそれぞれ使用する、自然位置でのハイブリッド形成実験は、
神経膠細胞内に２つの転写産物が存在することを示しているが、ｒＣＴＬ１ａだ
けが特定の神経群内で発現される。ｒＣＴＬ１ａとｒＣＴＬ１ｂの共同位置決定
は、神経膠系統の神経膠腫でも見出される（図１１）。わずかな内生ＣＴＬ１し
か発現しないＮ１８細胞系統内でトランスフェクションした後（図１１）、ｒＣ
ＴＬ１ａまたはｒＣＴＬ１ｂについてコード化するｃＤＮＡを含むプラスミドは
、両者共の細胞による、三重化されたコリンの捕獲増加を促す（図１２）。
【００９１】
これら２つのタンパク質はコリン輸送活性を備え、それらの差異を伴った発現
は、選択的活性分子の開発に道を開くことができる。
は、選択的活性分子の開発に道を開くことができる。
【００９２】
参考文献表
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【００９３】
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/14 ４Ｃ０８７
25/02 25/16 ４Ｈ０４５
25/14 25/22
25/16 25/28
25/22 Ｃ０７Ｋ 14/47
25/28 16/18
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15
16/18 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02
1/21 1/68 Ａ
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ
1/68 33/53 Ｍ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/53 5/00 Ａ
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ムーニエ，フランソワ
フランス共和国，エフ−91190 ジフ シ
ュール イヴェット，アヴェニュ デ メ
ザンジュ，２
(72)発明者 トレフォル，エリザベス
フランス共和国，エフ−75014 パリ，ア
ヴェニュ ラランド，21
(72)発明者 リュア，マーシャル
フランス共和国，エフ−92340 ブール
ラ レンヌ，リュ デュ クロ サン シ
ール，２
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 CB01 CB21
DA12 DA13 DA14 DA36 FB02
FB04
4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09
CA20 DA12 EA04 FA02 FA10
GA11 HA11 HA13 HA14 HA17
4B063 QA01 QA05 QA17 QA20 QQ21
QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ89
QQ91 QR08 QR32 QR35 QR40
QR42 QR56 QR62 QR78 QR80
QS16 QS24 QS34 QS36 QX02
QX10
4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X
AA93Y AB01 AC14 BA02
BA25 CA24 CA44 CA46
4C084 AA01 AA07 AA13 AA16 BA01
BA02 BA08 BA22 CA53 DC50
NA14 ZA022 ZA112 ZA152
ZA162 ZA202
4C087 AA01 BC83 NA14 ZA02 ZA11
ZA15 ZA16 ZA20
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
CA40 DA75 EA20 EA50 FA71
FA74
Claims (24)
- 【請求項１】精製または単離された核酸において、下記の配列群から選択さ
れた核の配列を含むことを特徴とする核酸： ａ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１； ｂ）配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２； ｃ）核の配列であって、ａ）、ｂ）に定義したような配列と共に最適に整列し
た後に、少なくとも８０％の総同一性パーセンテージを示すもの； ｅ）相補配列またはＲＮＡ配列であって、ａ）、ｂ）またはｃ）に定義したよ
うな配列に対応するもの。 - 【請求項２】配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、相補配列、または配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１の対応するＲＮＡの配列によって構成されることを特徴とする、
請求項１に記載の精製または単離された核酸。 - 【請求項３】配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、相補配列、または配列ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２の対応するＲＮＡの配列によって構成されることを特徴とする、
請求項１に記載の精製または単離された核酸。 - 【請求項４】配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のｈＣＴＬ１ｂ、配列ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．９のｈＣＴＬ１ａ、および配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４のｈＣＴＬ２の
中から選択されたポリペプチドについての、コード化核酸。 - 【請求項５】少なくとも８０％の同一性を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４お
よび９の中から選択された一配列で最適な整列の後に、有するペプチド配列を含
むことを特徴とするポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドが、細胞内、とく
に神経細胞内のコリンの代謝および／または輸送に関与するもの。 - 【請求項６】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，４および９の中から選択された一つ
の配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】基質がコリンであることを特徴とする、請求項５と６のいずれ
か一つに記載のポリペプチド。 - 【請求項８】アセチルコリンの生成、および／または細胞、とりわけ腸管細
胞、運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の側核ニューロン、および乏突起神
経膠細胞などのような神経細胞の膜のリン脂質成分の生成に関与することを特徴
とする、請求項５から７のいずれか一つに記載のポリペプチド。 - 【請求項９】請求項１から４のいずれか一つに記載の配列を含むベクター。
- 【請求項１０】前記配列が、真核生物および／または原核生物の細胞内の効
果的なプロモータと融合していることを特徴とする、請求項９に記載のベクター - 【請求項１１】さらに選択遺伝子を含むことを特徴とする、請求項９と１０
のいずれか一つに記載のベクター。 - 【請求項１２】請求項９から１１のいずれか一つに記載のベクターによって
転換された細胞。 - 【請求項１３】請求項５から８のいずれか一つに記載のポリペプチドと特に
結合することのできる抗体。 - 【請求項１４】標本内で請求項１から４のいずれか一つに記載の核酸の増幅
および／または検出を可能にする方法であって、請求項１から４のいずれか一つ
に記載の配列、もしくはそれとハイブリッド形成可能な配列の、少なくとも１２
の連続するヌクレオチドを含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを、プライ
マーおよび／またはゾンデとして使用することを特徴とする方法。 - 【請求項１５】遺伝子疾患、とくに家族性自律神経異常、およびタンジェー
ル病および神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけアルツハイマー病、パーキン
ソン病、ハンチントン病に結びつけられるＣＴＬ遺伝子のコード化または非コー
ド化領域内の一つまたは複数の突然変異の識別を可能にし、異なる種内のＣＴＬ
遺伝子族に属する他の遺伝子の単離を可能にする、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】請求項１４と１５のいずれか一つに記載の方法の実施を可能
にすることを特徴とする診断キット。 - 【請求項１７】請求項５から８のいずれか一つに記載のポリペプチドの活性
を修飾できる化合物の選別方法において、以下の過程から成ることを特徴とする
： ａ）請求項９から１１のいずれか一つに記載のベクターを使用する宿主細胞内
での前記ポリペプチドの発現； ｂ）同位元素、特にＨＣ−３，ＨＣ−１５、ｄ−チュボクラリン、オクソトレモ
リン、またはカルバミル−ｂ−メチルコリンなどのコリン類似物により、および
前記ポリペプチドの活性を修飾することのできる少なくとも一つの化合物によっ
て、標識をつけたコリンおよび／またはコリン類似物と過程ａ）で得られたホス
ト細胞の培養； ｃ）コリンの混入検出および／または生成したアセチルコリンの量の分析。 - 【請求項１８】請求項１５に記載の方法のおかげで識別された少なくとも一
つの突然変異を含む請求項５から８のいずれか一つに記載のポリペプチドの活性
を修復できる化合物の識別を可能にする請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】請求項５から８のいずれか一つに記載のポリペプチドの活性
を阻害することのできる化合物の識別を可能にする請求項１７に記載の方法。 - 【請求項２０】請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法から得るこ
とができる化合物。 - 【請求項２１】請求項２０に記載の化合物、または請求項９から１１のいず
れか一つに記載のベクターと、医薬品として許容できる賦形剤を含む組成物。 - 【請求項２２】医薬品製造のために、請求項２０に記載の化合物、または請
求項９から１１のいずれか一つに記載のベクターの使用。 - 【請求項２３】腸管細胞や、特に運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄の
背側核ニューロンおよび乏突起神経膠細胞などの神経細胞のようなＣＴＬ遺伝子
の転写生成物を発現する細胞が関わる遺伝子疾患、特に家族性自律神経異常、お
よびタンジェール病の治療を目的とする医薬品製造のための、請求項２２に記載
の使用。 - 【請求項２４】神経細胞が関わる疾患、とくに心配症、神経症、不安、行動
障害、警戒心、記憶、睡眠、および神経変性疾患、髄鞘脱落疾患、とりわけ、ア
ルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病の治療を目的とする医薬品製
造のための、請求項２２に記載の使用。
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