JP2003515568A - 吸入療法における二酸化炭素増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、エアゾール化された医薬品を最大約10％の二酸化炭素ガスを含む空気混合物に入れて投与するステップを含むヒトあるいは動物の呼吸器系でのエアゾール化された医薬品の沈着を増強する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は一般的には薬学及び医薬提供に関するものである。より具体的には、
本発明は吸入療法中のエアゾール化された医薬品の呼吸器系沈着を増強するため
の二酸化炭素ガス使用法に関するものである。

【関連技術の説明】

【０００２】 小粒子リポソーム・エアゾール療法はリポソーム内に組み込まれた脂溶性ある
いは水溶性抗がん剤を用い、これはジェット霧化器内の水性分散剤から投与され
る（米国特許第5,049,388 参照）。霧化によって発生される1−3μm質量メジア
ン空気力学的直径のエアゾールを用いることで呼吸器系表面への標的を定めた伝
達が可能になる。沈着されたリポソームはその後、肺内部で局所的に、あるいは
血液循環内に医薬品を放出し、呼吸器系外組織に提供される。

【０００３】 上記医薬品が脂溶性の場合、それは用いられる脂質及び用いられる抗がん剤に
特有な形態で脂質分子と結合して、懸濁水性媒体内に含まれている可能性のある
種々の可溶性成分によってさらに修正される可能性がある。こうした可溶性成分
は緩衝塩類及び恐らくは肺組織内での界面活性リン脂質の合成及び分泌を強化し
、さらにすでに存在している、あるいはエアゾール治療によって生じる可能性の
ある呼吸器系不全を抑制するためのイノシトルを含んでいる（7）。

【０００４】 その薬品が水溶性の場合、それは多薄層性リポソームの脂質二層（ラメラ）間
の同心円性空間内に存在している水性気泡内に適切な手順で組み込むことができ
る。単薄層性リポソームも調製することができるが、脂溶性あるいは水溶性薬剤
を細くするその能力は、その捕捉が１つの気泡に限定されるので減少する。エア
ゾール水滴は１つ以上の薬剤−リポソームを含んでいてもよい。さらに、異なっ
た薬品含有リポソームを混合したり、あるいはその内分で薬品が結合してそのリ
ポソーム内に共に組み込まれているリポソームを用いることによって複数の薬品
をエアゾール・リポソーム療法で用いることも可能である。

【０００５】 霧化によってリポソームは霧化器から容易に放出されるサイズに分断される。
直径が最大数ミクロンまでのリポソームは通常500nm以下の直径に分断され、霧
化器の作動特性その他の要因によってはそれよりさらにずっと小さいサイズに分
断される場合もある。リポソーム内に含まれる水溶性薬品が分断されると、かな
りの量、おそらく50％程度の水溶性化合物が放出される。これはその使用にとっ
て禁忌ではないが、２つの形状の薬品製剤が投与されることを意味し、その効果
には、いずれか１つの形状だけが投与された場合に両方の形状でつくりだされる
治療効果が含まれる。リポソーム・エアゾール療法についての他の多くの詳細は
米国特許第5,049,388に述べられている。

【０００６】 一般的に、吸入療法の基本的な目的は医薬品のエアゾール化された粒子を主要
気道及び呼吸器系の周辺領域に局所的に伝達することである。しかしながら、1
−2μmの最適サイズ範囲の場合でさえ、吸入された粒子の沈着部分はわずか20％
程度である。吸入されたエアゾールの呼吸器系沈着は粒子サイズ、吸湿性、そし
て気道の形状にかなり影響を受ける（1，2）。呼吸パターンも吸入された粒子の
沈着パターンを決める重要な変数である（1，2）。

【０００７】 具体的に、呼吸を抑えると、肺内部での粒子の滞留時間が増大することから肺
内沈着が著しく増大する。これによって、特に小さな周辺気道内での重力沈降の
時間が長くなり、水性粒子が100％近い湿度で十分に均衡して、最大サイズにか
り、それがさらに沈着を増強する（1，2）。コンピュータ・シミュレーションは
ヒトにおいて32秒間呼吸を止めることによって沈着率が3.2倍に増大されること
を示している。この効果の生理学的原理は深い呼吸によって粒子摂取量が増大し
、吸入体積が通常の１回の呼吸によって吸入される量の８倍程度の増大すること
による。1回の呼吸での吸入体積が増えると、気道の直径が最も小さい肺の最深
部まで粒子が浸透し、従って、重力及び最大粒子サイズによる沈着が最大の効率
で行われる。

【０００８】 こうした生理学的特性の拡大することで、（エアゾール粒子を含む）吸入され
る空気の体積を増強させ得る因子を直接利用して、主な気道での沈着量の著しい
増大と肺周辺部でのより大きな沈着量をもたらすことができる。二酸化炭素（CO ₂ ）は呼吸の最も重要な調節因子である。二酸化炭素は存在している圧力勾配に
従って組織から血液に自由に拡散する。血液中で二酸化炭素のレベルが上昇する
と二酸化炭素は脳脊髄液内に容易に拡散して、そこでHCO₃ ⁻とH⁺に転化される。
延髄の腹側表面上の中央化学受容体がCSF内の増大したH⁺に反応して、換気量（
速度及び１回の呼吸量）を補償的に増大させる。

【０００９】 研究者たちは実験動物及びヒトにおける換気を操作するために二酸化炭素吸入
を用いてきている。５％二酸化炭素を吸入すると１回の呼吸量が192％も増大す
る（3）。この増加は急激で、露出期間中その状態が維持される（4）。二酸化炭
素への露出が中止されると、換気の変化が数分間以内に通常のレベルに逆転する
（4）。同様に、ヒトが5％を吸入すると、1分間の呼吸量が3倍に増大する（5）
。5％または7.5％の二酸化炭素を通常のヒトが２分間吸入すると呼吸の頻度がそ
れぞれ6.7％及び19％の割合で増大すると同時に、１回の呼吸量がそれぞれ31％
及び52％増大したので、単位時間あたりの吸入量はそれぞれ34％及び75％増大し
た（6）。これらの濃度により長時間露出させると、さらに大きな反応は示され
た（5）。

【００１０】 カンプトセシン類似物及びタクセンは化学療法剤として現在開発中の化学剤で
ある（21、26）。抗がん剤、パクリタキセル（PTX）そして種々のカンプトテキ
ン（CPT）誘導体は肺がんを含む種々のヒト腫瘍の治療において臨床的活性を示
す。これらの薬剤は単一の薬剤、あるいは他の薬品との組み合わせで用いられた
場合（21）に有効な結果をもたらす。これらの薬品は経口あるいは静脈内注射な
どの投与方法で全身的に与えられ、パクリタキセルの場合の最も効果的なルート
は継続的な静脈注入であり（22、24）、経口的に投与されるカンプトセシンの親
油性コンジナーが最も高い有効性を示す。

【００１１】 そうした治療方式において、毒性副作用が発現することが重要な障害である。
ヌード・マウス（23）及び実験用マウス呼吸器系転移（6）内でのいくつかの皮
下ヒトがん移植片をカンプトセシン及び9−ニトロカンプトテキン（９NC）のリ
ポソーム性製剤を用いてうまく治療することができた。カンプトセシンを用いて
マウスで薬力学的調査を行ったところ、リポソーム性カンプトセシンの吸入によ
って肺と他の器官でかなりの薬品レベルがつくりだされ、エアゾール提供を中止
すると急速にそれが消えた（17）。これらのレベルにもかかわらず、エアゾール
伝達レベルが一般的には薬品沈着においてわずか15−20％の効率しか示さず（29
、30）、従って、呼吸器系での沈着を増大させることは有利であろう。

【００１２】 これら薬品伝達の全身性経路を用いると、一定量の薬品が血流から出て行き、
呼吸器系組織内に局所化されるが、肺は薬品沈着の主要な器官ではない。従来の
リポソームをこれらの薬品の基材として用いても通常用いられる全身性経路によ
って投与される薬品の肺内沈着は改善されない（11、27）。霧化は例えばカンプ
トセシンあんど、呼吸器系に対する標的薬品伝達のため非常に有効な経路である
（17）。自然発生的一次及び転移性肺腫瘍を有するイヌはデキソルビシン及びPT
Xの新しい製剤をエアゾール化して提供するとうまく治療することができた（16
）。しかしながら、これらの例では、エアゾールは一般的に通常の空気を用いて
発生された。

【００１３】 種々の組織に対する遺伝子伝達はウイルス性及び非ウイルス性ベクターの療法
を用いて達成されている。非ウイルス性ベクターの利用はウイルス性ベクターに
関連した免疫原性反応を回避することはできるものの、陽イオン性脂質及び多価
陽イオン性ポリマーなど非ウイルス性ベクターは通常はウイルス性ベクターの高
レベルの遺伝子発現特性との関連性は認められない。しかしながら、陽イオン性
ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）は組織培養とin vivoの療法で有効性
を示す（36）。すべての第3窒素上のプロトン化窒素はポリエチレンイミンに巨
大な緩衝性能力を提供する。ポリエチレンイミンは核に対してDNAを効率的に送
り込み（37）、そしてDNAse劣化からDNA を保護することができる（36）。直鎖
及び側鎖両方の形状のポリエチレンイミンは、肺、脳、及び腎臓など種々の組織
において高レベルの導入遺伝子発現をもたらすことが示されている（39−41）。
ポリエチレンイミンもin vivoで腫瘍に効率的にDNAを伝達するために用いられて
いる（42）。

【００１４】 エアゾール伝達は肺に対して遺伝子を提供する非侵入性経路であり、肺がん及
び肺嚢胞性線維症などの疾病を治療するために利用できる可能性を秘めている。
しかしながら、導入遺伝子発現のレベルは、一部には霧化中のDNA成長可能性の
喪失によって、非常に高くはない（43）。PEIは霧化中にDNAを保護することがで
き（44）、そして、テストされた他のほとんどの陽イオン性脂質よりも高いレベ
ルで肺にトランスフェクションをもたらした（44、45）。PEI−媒介トランスフ
ェクションも肺界面活性剤による抑制に対して抵抗性を示す（46）。

【００１５】 吸入経路による呼吸器系への薬品沈着の効率の増大はいくつかの方法：１）エ
アゾール化のために用いられる製剤中の薬品の濃度の変更（31）、２）より効率
的なタイプの霧化器の使用（32）、３）治療期間の延長、あるいは４）呼吸パタ
ーンの変更（４）によって達成される。上にも述べたように、二酸化炭素は呼吸
の天然の調節因子である。低濃度（約3−7％）のCO₂を含む空気を吸入すると、
呼吸パターンに同様の変化が起き、十分に耐えることができた（13，6）。空気
に5％CO₂含んだものを吸入しても、ヒトにおける通常の生理学的運動と呼吸パタ
ーンに変化は認められなかった（32）。５％CO₂含んだ空気の同様の効果はエア
ゾール治療を用いて、ヒトで得ることができる。従って、吸入療法のためにCO₂
の濃度を高めた空気を利用すると、化学療法剤のより効率的な呼吸器伝達をもた
らすことができる。吸入療法空にエアゾール化された医薬品の呼吸器系沈着を増
強するための手段がない点で先行技術は不十分である。本発明はこの領域での長
年のニーズと要望に応えるものである。

【００１６】

【発明の要約】 本発明は最大で約10％の二酸化炭素ガスを含む空気混合物に入れたエアゾール
化された薬品を投与するステップを含む個人や動物の肺内でのエアゾール化され
た薬品の沈着を増大させるための方法を提供する。2.5％、5％、そして7.5％の
二酸化炭素濃度が用いられている。エアゾールは１−30分間あるいはそれ以上の
時間で投与することができる。投与された薬品は可溶性薬品、不溶性薬品、ある
いはオリゴヌクレオチド、遺伝子、ペプチド、あるいは蛋白質など溶液に溶解す
ることができ、ジェット霧化器で直接霧化したり、リポソームなどの基質に組み
込むことができるもの、遅放出性ポリマー、あるいはエアゾール化前の多価陽イ
オン性ポリマーなどである。 本発明の他の、そしてさらなる態様、特徴、及び利点は開示の目的で提供され
る本発明の現段階での好ましい実施の形態についての以下の説明から明らかにな
るであろう。

【００１７】 ［発明の詳細な説明］ ヒトあるいは動物の呼吸器系でのエアゾール化された医薬品の沈着を増強する
方法において、前記エアゾール化された医薬品を最大約10％の二酸化炭素ガスを
含む空気混合物に入れて投与するステップを含む方法を提供する。好ましい濃度
は2.5％、5％、そして7.5％炭酸ガスである。このエアゾールは1−30分間あるい
はそれ以上の時間投与することができる。

【００１８】 本発明は水溶性薬品のエアゾール伝達に関するものである。こうした医薬品は
水溶液あるいは緩衝液として調製され、直接エアゾール化される。代表的な水溶
性医薬品はトブラマイシン及びペンタミジンなどの抗生物質、アセチル・システ
インなどの粘膜溶解剤、アルブテロルなどの気管支拡張剤、臭化イプラトロピウ
ムなどの副交感神経剤、DNAzeなどの酵素、そしてリバビリンなどの高ウイルス
剤である。

【００１９】 また、本発明はエアゾールによる伝達まえに基質と組み合わせられる不溶性薬
品を伝達するために用いることもできる。使用可能な基質としては、リポソーム
、遅放出性ポリマー、そして多価陽イオン性ポリマーである。リポソームはアン
ホテリシンB：ニスタチン、グルココルチコイド、CsA、FK506、ラパミシン、あ
るいはマイコフェノレートなどの免疫抑制剤、そしてカンプトセシン、カンプト
セシン誘導体、そしてパクリタキセルなどの抗がん剤などである。これらのリポ
ソームはリン脂質ジラウロリルホスファコルチコイド（DLPC）などの脂質から形
成することができ、あるいはジミリスチルホスホエタノールアミン・ポリ（エチ
レン・グリコール）2000などの修正リン脂質を用いて調製された立体構造的に安
定したリポソームである。ポリ（ラク酸共グリコ酸）（PLGA）、あるいはポリエ
チレンイミン（PEI ）などの多価陽イオン性ポリマーを用いることもできる。

【００２０】 本発明は治療用蛋白質、治療用ペプチド、DNA遺伝子、センス・オリゴヌクレ
オチド、抗センス・オリゴヌクレオチド、そしてウイルス性ベクターなどの伝達
にも適用することができる。DNA遺伝子の代表的な例はクロラムフェニコール・
アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子（CAT）あるいはp53遺伝子である。好まし
くはこれらの遺伝子はポリエチレンイミンなどの多価陽イオン性ポリマー基質を
介して伝達される。陽イオン性リポソームも基質として用いることができる。ポ
リエチレンイミンは約１０：１から約２０：１の範囲の窒素：リン酸比率を有し
ている。好ましい実施の形態では、PEIの窒素：リン酸塩脂質は約１０：１であ
る。

【００２１】 用語の定義は以下の通りである。特に具体的な指定がない用語はこの分野での
通例に即して解釈されるものとする。 ここで用いられている『エアゾール』という用語は空気中での相対的安定性を
有するのに十分な細かなサイズとその結果としての例定着速度を有する個体又は
液体粒子の空気中の分散剤を意味する（８）。 ここで述べられている『リポソーム・エアゾール』とは、その内部でリポソー
ムあるいはヒト又は動物の呼吸器系に伝達することが意図された１つ以上の薬物
含んだリポソームをリポソームが分散されている水溶性液滴を有している（9）
。

【００２２】 ここで用いられる場合、本出願のために定義されているエアゾール液滴のサイ
ズは米国特許第5,049、338に定義されているもの、つまり、幾何学的標準偏差が
1.8−2.2の範囲の質量メジアン空気力学直径（MMAD）である。しかしながら、低
濃度の９−NC及び恐らくは他のカンプトセシン誘導体の場合、質量メジアン空気
力学直径は0.8μｍなど、１μ以下の場合もある。本発明によって開示される研
究の結果では、リポソームは、それが周辺相対湿度に均衡した場合には液滴体積
のほとんど全部を構成している。

【００２３】 ここで用いられている場合、『ウェイベル肺モデル』とは、ヒトの気道の23の
連続した分岐を示すヒトの肺の構造の分類を意味する。気管をラベル０とし、気
管支と細気管支は気管16まで広がっている。気道のこれらの部分は絨毛表皮及び
粘膜腺を含んでいる。それらは両方で粘膜絨毛ブランケットを構成している。分
岐17−23は肺胞部分を構成しており、絨毛ブランケットは有していない。従って
、ここに沈着される粒子は気管に運ばれて飲み込まれることはない。

【００２４】 ここでは、制御された高炭酸実験条件下で、吸入された薬品粒子の沈着が基本
的な呼吸状態中に観察されるレベルより大幅に増大することが想定されている。
ジェット霧化器の持続的流動を維持するために二酸化炭素ガス/空気混合物の使
用すると、肺周辺部に伝達される医薬品量の効率が大幅に増大する（Weibel発生
17−23）。同様に、この方式は吸入された薬品の生物学的活性を増大させるため
にも有効に使用することができるであろう。こうした考え方は、理論的にはどん
な薬品、遺伝子、オリゴヌクレオチド、あるいは蛋白質/ペプチド製剤（可溶性
、リポソーム性、結晶性、あるいはポリエチレンイミンなどのポリマーに基づく
基質）及びジェット霧化器から駆動されるいずれのガスに対しても理論的には適
用することができるであろう。

【００２５】 本発明は主として単位時間あたりの吸入体積の増大をもたらすエアゾール化さ
れた薬品を用いての吸入療法中の呼吸の深さと頻度を増大させるための炭酸ガス
の使用に関するものである。１回の呼吸で肺体積が増大すると吸入された薬品粒
子の肺内沈着量、特に呼吸量が低い場合は十分に換気されない肺周辺部でのそれ
が増大する。呼吸の頻度及び深さの療法の増大によってもたらされる１分あたり
の吸入体積が増大すると、単位時間あたりの吸入量体積の増大につながる。

【００２６】 最大10％の炭酸ガスを含んだ空気混合物に入れた薬品を投与すると、呼吸器系
でのその薬品の沈着量が増大して、エアゾール薬品伝達の効率と治療効果が測定
可能な程度に改善される。好ましい実施の形態では炭酸ガス濃度は2.5％、5％、
及び7.5％である。エアゾールは1−30分間、あるいはそれ以上の時間投与するこ
とができる。二酸化炭素による増強効果は30秒以内に明白となる。二酸化炭素の
呼吸効果は一時的なもので、繰り返し用いることができる。

【００２７】 以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明するために提供されるもので
、いかなる意味でも本発明の範囲の限定は意図していない。

【００２８】実施例１ 材料 Xecham社（New Brunswick, NJ）からPTX を入手した。CPTはSigma社（St.Loui
s, MO）から、そして9NCはChemWerth社（Woobridge、CN）から入手した。ジラウ
ロリルホスファチジルコリン（DLPC）はAvanti Polar Lipids 社（Albaster, AL
）から入手した。DMSOはSigma社（St.Louis, MO）から購入し、HPLCグレード、
その他の有機性溶媒はFisher Scientific社から得た。イリゲーション用の無菌
水はBaxter Healthcare Corporation (Deerfield, IL)からのものである。 ICR (生後7−８週)をHarlan-Sprague Dawley (Indianapolis, IN)から入手し
て、標準的な檻の中で、えさと水を適宜与えて飼育した。雌のC57BL/6マウス（
生後８−９週）と雌のBalb/Cマウス（生後5−7週）をHarlan Spraque Dawley (H
ouston, TX)から入手した。すべての動物の世話はBaylor Collegeの医学機関動
物飼育及び使用委員会の指示に従って行われた。

【００２９】 導入遺伝子発現を測定するためのレポータ遺伝子としてバクテリア性クロラム
フェニコル・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子（CAT, p4119, 参考文献15）
を主に用いた。このCAT遺伝子はヒト・サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモ
ート/エンハンサ要素の制御下にあった。CMVプロモート/エンハンサ要素及びヒ
ト成長ホルモン・ポリアデニル化配列の挿入によって修正されたルシフェラーゼ
・プラスミド（pGL3、）Promega、Mdison, WI)はMichael Barry博士（Center fo
r Cell and Gene Therapy, Baylor）から寄贈されたものであった。すべてのプ
ラスミドはQiagenカラム（Qiagen Valencia, CA）上で精製され、内毒素は含ん
でいなかった。プラスミドは260nmで紫外線吸収によって定量された。アガロー
ス・ゲル分析を行ったところ、そのプラスミドは超らせんプラスミドと少量の裸
のプラスミドとの混合物であることが分かった。

【００３０】 p53遺伝子を含んだプラスミドはY.K. Fung博士（Children's Hospital,Los An
geles, Ca）から入手した。このp53遺伝子はヒト・サイトメガロウイルス（CMV
）プロモータ/エンハンサ要素のよって制御される。比較対象として用いられた
プラスミドはファイアフライ・ルシフェラーゼ（Lue）遺伝子を含んでおり、Mic
hael Barry博士（Baylor医学大学）から入手したものである。このプラスミドは
Balor Biolabs (Haraban, LA)によって生成され、内毒素を含んでおらず、紫外
線吸収を用いて定量された。アガロース・ゲル分析を行ったところ、このプラス
ミドは主に超らせん構造状態で、少量の裸プラスミドを含んでいることが分かっ
た。

【００３１】 B16−F10 メラノーマ細胞株をDivision of Cancer treatment and Diagnosis
Center (DCTDC, NCE, Frederick, MD)から入手し、10％ウシ胎児血清で補強され
たDMEM内で培養した。この細胞株は肺で腫瘍を形成することが示されている（15
）。200μｌの培養液に25,000B16-F10細胞を入れたものをC57BL/6マウスの尾の
血管を通じてそれぞれのマウスに注入した。肺転移は細胞注入から2週間後に目
でも確認された。それらの細胞をパッセージ3−12で用いた。

【００３２】実施例２ 統計 平均値を比較するために、偏差の一方向分析（ANOVA）を行った後、蝋側学生t
テストを実施した。その偏差はp＜0.05の場合に有意とみなされた。

【００３３】実施例３ リポソームの調製 DLPC、PTX及びカンプトセシンの原液をこれまでに述べられている方法（17）
を用いて、それぞれ100、10及び１mg/mlのｔ−ブタノール内で調製した。パクリ
タキセル及びDLPCの画分を１：１０の重量比で混合した。カンプトセシン：DLPC
の比率は1:50であった。その後、薬品―リン脂質混合物を液体窒素内で凍結して
、一昼夜凍結乾燥させて、乾いた粉末を得た。その製剤を−20℃で密封保存した
。使用前に、その混合物を水分補給のために無菌水で再構成して、均一の多重ラ
メラ・リポソーム性懸濁液が得られるまで攪拌した。霧化前の懸濁液内のカンプ
トセシン及びパクリタキセルの当初濃度はそれぞれ0.5mg/ｍｌと10mg/ｍｌであ
った。霧化の前と後のリポソームのサイズはNicomp Submicron Particle Sizer
Model 370 9NICOMP（Santa Barbara, CA）を用いて判定した。

【００３４】実施例４ エアゾール粒子サイズ特性 リポソーム性カプセル化医薬品を含んだエアゾール粒子の特性を参考文献（３
１）に述べられているようなAndeersen/AFCM非成長性大気粒子サイズ判定サンプ
ラ（Andersen Instruments, Atalanta, GA）を用いて判定した。AERO-MIST霧化
器を通じて10L/分の流速で流動している空気又はガス混合物によってつくられた
エアゾール内の薬品の濃度についてもエアゾール化を開始してから1分後から1分
間サンプルを回収することで測定した。質量メジアン空気力学直径（MMAD）及び
幾何学的標準偏差（GSD）はKaleidaGraph 2.0 ソフトウエア（synagy Software,
Reading, PA）を用いて30,31で述べたように計算した。

【００３５】実施例５ パクリタキセル及びカンプトセシンのエアゾール伝達 これまでに述べられている方法（16−18）に従ってエアゾールによるマウスの
治療を行った。簡単に言うと、AERO−MISTジェット霧化器（CIS-USA Bedford, M
A）を用いて10L/分の流量でエアゾール粒子を発生させた。マウスを密封したプ
ラスチック製檻（23 x 18 x 13 cm）内に入れて、エアゾールに30分間露出させ
た。このエアゾールは通常の空気、あるいは通常の空気と二酸化炭素をブレンダ
ー（Bird 3m, Palrm Springs, CA）で混合させて得られた５％CO₂を含んだ空気
を用いて発生されたもので、二酸化炭素濃度はFluid Fytite (Bacharach Inc.,
Pitsburg, PA)によって較正された。各時点で、檻から３匹のマウスを取り出し
てイソフラレイン、USP(Abbott Laboratries, Chicago, IL)に露出させ、さらに
放血させて致死させた。器官を切除し、計量し、抽出を行う前に−70℃で凍結保
存した。

【００３６】実施例６ 組織からの薬品の抽出 抽出を行う前に、サンプルを解凍して、すぐに鋏で小さな断片に切断した。組
織からパクリタキセルを抽出するために、各サンプルに３mlのエチルアセテート
を加えてミニ・ビードビー（Wig-L-Bug. Model 311B. Crescent Dental MFR, CO
., Lyons, IL）内で２分間均一化させた。均一化されたものを10ｍｌのガラス製
遠心分離管に移して、1,000ｘｇで10分間遠心分離した。上澄み液画分を分離し
て、有機溶媒を空気で蒸発させた。残留物を0.2ｍｌのメタノール：アセトニト
リル（２：１、体積比）内で再構成し、水槽超音波装置内で超音波処理し、1,00
0xgで10分間遠心分離にかけた。上澄み液画分を37℃で３０分間加温して、HPLC
で分離した。

【００３７】 カンプトセシン及び9NCの抽出手順はこれまでに述べられている手順（17）に
従った。簡単に言うと、組織を解凍した後、抽出精度を判定するための内部標準
として、20μgの９NCを20μｌに溶かしたものを加えた。そのサンプルを小さな
断片に切断して、1mlの0.1％水性酢酸溶液、pＨ3.2を各サンプルに加えた。 ミニ・ビードビータ内で均一化させた後、均一化されたものを1,000xgで5分間
遠心分離した。上澄み液画分を８mlの塩化メチレンで再抽出させた。有機性画分
を分離して、空気中で室温下で乾燥させた。乾燥されたサンプルを0.2ｍｌのア
セトニトリル内で再構成させた。

【００３８】実施例７ HPLC分析 Waters486紫外線吸収検出装置（Waters, Milford, MA）で227nmで逆相HPLCモ
ニタリングを行ってパクリタキセルの定量を行った。すべての測定はWaters Nov
a-Pack C１８カラム（3.9 ｘ 150cm）上で室温で行われた。可動相は49％アセ
トニトリルと51％水分で構成されていた。流量は1.5ｍｌ/分であった。各サンプ
ルの25μｌ画分をWatersミレニアム・ソフトウエアで分析した。PTX抽出効率を
判定するために、同じ手順を用い、分かっている量のパクリタキセルを各組織に
加えて、パクリタキセルの抽出量と比較した。抽出効率（％）は抽出後のパクリ
タキセルの量/付加したパクリタキセルの量x100で計算した。テストされたすべ
ての組織に対して、平均抽出効率は89＋４％（データは示さず）で、この指数を
用いて組織内の薬品の最終濃度を測定した。

【００３９】 Waters NovaPak C１８カラム（3.9 ｘ 150ｃｍ）（17）を用いてカンプトセ
シンのHPLC分析を行った。カンプトセシンに関するクロマトグラフをWaters 47
0走査蛍光検出装置（λex=360nm、λem=455nm）でモニターし、pNCはWaters 440
紫外線吸収検出装置を用いて254nmでモニタリングを行って探知した。可動相は
アセトニトリル30％と0.1％酢酸水溶液、ｐＨ3.5、70%で構成され、流量は1.2ｍ
ｌ/分（１６、17）に設定された。

【００４０】実施例８ リポソーム製剤のエアゾール特性 CPT-DLPC及びPTX-DPLCリポソームの性質、及びそれらのエアゾール特性を表Ｉ
に示す。５％CO₂を含んだ空気を用いても、エアゾール内のいずれの薬品の濃度
もそのＭＭＡＤ及びGSDも変わらなかった（Ｐ＞0.1、学生tテスト、両側検出）
。霧化手順によって溶液内粒子のサイズは両方の薬品の場合共、ミクロンからナ
ノ粒子レベルに減少された。CPT-DPLCのリポソームのサイズは霧化前の2.54+0.9
1から５％CO₂を含んだ空気を用いて霧化した後の0.49＋0.07μｍに減少した。PT
X-DLPC製剤の場合、これらの値はそれぞれ、13.14+12.15μｍと0.23＋0.17μｍ
であった。霧化の前と後のエアゾール粒子サイズは通常の空気及び５％CO₂を含
んだ空気を用いたエアゾールによって投与されたPTX-PLDCとCPT-DLPCのいずれに
対しても違いはなかった（P>0.5; 学生tテスト、両側検出）。

【００４１】

【表１】

【００４２】実施例９ 通常の空気及び５％CO₂を含んだ空気で発生させたエアゾールによって投与され
た後のCPT-DPLCの組織内分布及び薬力学 ICRマウスを２つのグループに分け、第1のグループ（n=4）には通常の空気で
発生させたエアゾールを用いて発生させたCPT-DLPCを投与したところ、治療中に
呼吸パターンの変化は認められなかった。第2のグループ(n=6)には５％CO₂を含
んだ空気内で同じ製剤を投与した。

【００４３】 ５％CO₂を含んだ空気を用いて発生させたエアゾールを吸入させたところ、カ
ンプトセシンの肺内での沈着量がかなり増大した（2.1から3.5倍）（図１参照）
。第1及び第2のマウスの肺組織１ｇからはCPTがそれぞれ134＋123と476＋216ng
の割合で検出された。５％CO₂を含んだ空気を用いても呼吸パターンに変化は認
められなかった。５％CO₂を含んだ空気を用いて発生させたCPT-DLPCエアゾール
の吸入後、肝臓、脾臓、腎臓、血液及び脳内の薬品濃度も増大した。

【００４４】 通常の空気あるいは５％CO₂を含んだ空気を用いてCPT-DLPCに30分間露出中、
及び露出後の肺内部のカンプトセシンの薬力学的沈着についての判定を行った（
図２）。治療中肺内でのカンプトセシンの濃度は増大し、エアゾール治療（30分
間）の終了時に最大の濃度（Cmax）になり、その後、肺内部での濃度は低下し始
めた。通常の空気及び５％CO₂を含んだ空気で発生させたエアゾールに対して肺
内でのピーク・レベルは組織１あたり、それぞれ232＋158及び486＋78ngであっ
た。エアゾールの供給が中止されてから15分間は、薬品濃度は急激に低下した。
両方の措置によるクリアランス半減期（T1/2）は12−15分間であった。薬力学的
曲線の特徴は両方のタイプの治療で非常に類似している。両方のタイプの空気を
用いたエアゾール化が終了してから90分後（120分の時点）でも微量の薬品が検
出された。

【００４５】実施例１０ 通常の空気及び５％CO ₂ を含んだ空気を用いて発生させたエアゾールで処理した
後のPTX薬の組織内分布及び薬力学 検出方法上の制約から、パクリタキセルを懸濁液１ｍぁたり10ｍｇ溶かしたリ
ポソーム製剤を用いた。露出期間の途中、及び終了時（30分間）、及び処理終了
後のいろいろな時点でマウスを致死させた。マウスは通常の空気及び５％CO₂を
含んだ空気で発生させたDLPCエアゾールに露出させた。 どちらのタイプの空気でも治療終了時（30分間）で肺内でのパクリタキセルCm
ax値が得られた（図３）。５％CO₂を含んだ空気で処理したグループでは、通常
の空気を用いたグループのそれと比較して、Cmax値が4.5倍高かった（それぞれ
、23.1＋4.3及び5.5＋0.2μg/g）。この二酸化炭素によって誘発された増強はリ
ポソーム製剤とは関係していなかった（図４）。ジミリスチルホスホエタノール
アミン・ポリ（エチレン・グリコール）2000を用いてつくられた立体構造的に安
定化されたパクリタキセル・リポソームは、５％CO₂を含んだ空気を用いた場合
とほぼ同様のレベルで肺内で沈着した。

【００４６】 ５％CO₂を含んだ空気による措置は通常の空気の場合と比較して、肺濃度時間
曲線の下方に5.7倍も広い面積をつくりだした（それぞれ33.7及び5.9μｇ−ｈｒ
/g）。両方のケースで、PTX濃度は処理終了後、肺内組織から低下し始めた。肺
内部のパクリタキセルに関するT1/2α及びT1/2β値は、通常の空気を用いた場合
、それぞれ0.3と1.6時間であった。５％CO₂を含んだ空気でつくったリポソーム
・エアゾールによって投与したパクリタキセルに関しては、T1/2α値は9.7時間
、そしてT1/2β値は5.1時間であった。肝臓、脾臓、腎臓及び血液など他の器官
に関する比較調査も行われたが、エアゾール化のために通常の空気を用いたこれ
らの組織内のパクリタキセルのレベルは検出可能なレベル以下であった。５％CO ₂ を含んだ空気を用いたリポソーム・エアゾール伝達後のパクリタキセルの組織
内分布を表２に示す。肺内で最も高い薬品濃度が検出された。他の器官での濃度
はやや低かった。台形規則を用いた種々の器官に対する3時間の処理で得た濃度-
時間曲線下方の面積の調査から、肺、肝臓、腎臓、血液、及び脳に関して組織１
グラムあたり、それぞれ34＋２、9.8＋1.9、2.4＋1.4、2.8＋1.5、0.13＋0.10、
0.23＋0.2μgPTS−時間の値が得られた。

【００４７】

【表２】

【００４８】実施例１１ 薬品沈着における二酸化炭素誘発呼吸器系パターンの効果 ５％のCO_２を含んだ空気の吸入後に見られる肺内部の薬品濃度の増加は、呼吸
パターンの変化ということで説明が可能である。５％のCO_２を含んだ空気内での
マウスの呼吸パターンがだんだんとゆっくりと深くなり、治療終了のほぼ直後に
通常の状態に戻ることが目視で確認できる。組織学的分析によっては肺組織内に
おいてはいかなる変化も確認されなかった。他の研究者たちによって行われたプ
レスチモグラフ研究は、５％のCO_２を含んだ空気を吸入すると、主に一回の呼吸
量が増加（およそ１７０−１８０％）することで、哺乳動物の呼吸量が増加する
のだということを明らかにした（１８，１９）。カンプトセシン及びパクリタキ
セルの肺内での平均沈着量は、およそ２−４倍に増加した。この一回の呼吸量の
増加の不均衡は、呼吸パラメータ、例えば呼吸回数、呼気サイクルの吸息持続時
間および換気量などの要素における生理学的変化のために起こるものであろう（
１３）。深く完全に呼吸することによってエアゾールの持続時間は通常の呼吸に
比べて約２倍になった（１５）。

【００４９】実施例１２ PEI-DNA複合体の作成 PEI（２５ ｋＤａ，分岐）がAldrich Chemical（Milwaukee, WI）から購入
された。PEIの原液がPBS１ｍｌ（窒素０．１M）あたり４．３ｍｇの濃度、ｐＨ
７−７．５で作成された。PEIおよびDNAが、所要の濃度で５ｍｌの水内に別々に
混入された。上記PEI溶液をゆっくりとかき回し、DNA溶液を加えて最終的に１０
ｍｌの溶液を作った。この混合物は、霧状化する前の約１５−２０分の間室温に
おいても保持することができる。得られたこれらの量は、PEI窒素：DNAリン酸塩
（N:P）として示され、これはDNAがマイクログラムにつき３ｎｍｏｌのリン酸塩
を有しており、またPEI溶液０．１Mあたり１μｌがアミン窒素１００ｎｍｏｌを
有していることを考慮にいれて、計算することができる。N:Pの比率１０：１はP
EI：DNA重量比率１：２９に相当する。

【００５０】実施例13 PEI−DNA複合体のエアゾール伝達 マウスをエアゾール伝達を行う前にテープで密封したプラスチック製檻に入れ
た（48）。これは非拘束、全身エアゾール露出システムである。PEI-DNA複合体
を通常の空気あるいは５％CO₂を含んだ空気を用いて10リットル/分の流量でAero
-Mist霧化器（CIS-US, Inc/, Bedford, MA）でエアゾール化した。Aero-Mistは
高出力で効率的な霧化器で、これまでに述べられている方法（50）でAndersen
カスケード・インパクタ（Andersen Instruments, Atlanta, GA）を用いてエアゾ
ールを1−2μｍの最適範囲でつくりだすことが実証されている。乾燥した空気の
供給源(Aridyne 3500, Timerer, Lancaster, PA)を空気圧縮装置及び炭酸ガスタ
ンクに取り付けたBird 3Mガス・ブレンダ（Parlm Spring, CA）に送った。得ら
れた空気と炭酸ガスの混合物を霧化器に送った。５％CO₂を含んだ空気の採集濃
度はFyrite溶液（Bacharach, Pittsburge, PA）を用いて判定した。10ｍｌ溶液
の霧化に約30分間かかった。

【００５１】実施例１４ CARアッセイ 各時点でマウスに麻酔をかけて致死させ、肺、その他の器官を取り出して、重
さを量り、すぐに凍結した。CAT ELISAキット（Boehringer Mannheim Gmbt, Ma
nnheim, Germany）を用いてｉｎ ｖｉｖｏでの発現をモニターした。組織を、W
ig-L-Bug均一化装置（Crescent Dental Mfg., Lyons, I）を用いて700μlCATア
ッセイ細胞溶解緩衝液内でこれらの組織を均一化させた。均一化させたものを遠
心分離にかけた後、200μｌの抽出物を用いて96ウェル・プレート・フォーマッ
トでCAT ELISAを行った。マイクロタイタ・プレート・リーダー（Molecular Dev
ices, Sunnyvale, CA)を用いて吸収を読み取った。比較対象として自然のままの
マウスを用いた。CAT活性は精製CAT酵素を用いてつくられた標準曲線を用いて組
織1gあたりのCATのngで示してある。1ウェルあたり0.1−0.3pg程度の低いCAT蛋
白質でも検出できるように、メーカーからの指示に従って、このアッセイの感度
をさらに強化した。

【００５２】実施例１５ ルシフェラーゼ・アッセイ マウスを麻酔にかけて致死させ、肺を取り出した。ルシフェラーゼ・アッセイ
・キット（Promega）を用いてルシフェラーゼ発現の測定を行った。肺を1ｍｌの
ルシフェラーゼ・アッセイ細胞溶解緩衝液内でWig-L-Bugホモジェナイザを用い
て均一化させた。均一化されたものを遠心分離した後、10μｌの抽出物を50μｌ
のルシフェラーゼ基質に加えて、96ウェル・プレート内でルミノネータ（Microl
umat LB 96 P, EG & G Berthold, Germany）内で10分間かけて読み取った。自然
のままのマウスを比較対象として用いた。ルシフェラーゼ活性は組織１がたり10
秒間でのPLUとして示してある。このシステムでは、１０^７RLUがPromega社から
の精製ルシフェラーゼを用いて１ngのルシフェラーゼに対応する。

【００５３】実施例１６ 組織断面の組織学的分析 マウスをイソフレインで麻酔にかけて、腹部大動脈を介して血を放出させて致
死させた。肺を分離、カニューレ挿入した後、10％中性緩衝液ホルマリンを用い
てインフレーションによって固定し、組織学的分析のために処理した。薄片を４
μmで切断して、ヘマトサイクリン及びエオシン染色を用いて、顕微鏡で炎症及
び毒性の兆候について調べた。

【００５４】実施例１７ ミエロペロキシダーゼ（MPO）アッセイ エアゾール露出から２４時間後、マウスをイソフレインで麻酔をかけ、腹部大
動脈から血を放出させて致死させた。心臓を通じて食塩水で灌流させた後、肺を
取り出した。組織を臭化ヘキサデシルメチルアンモニウム（0.5％HTABを50mＭの
リン酸緩衝剤、pH6.0に溶かしたもの、組織1gあたりHTAB５ml）内で、これまで
に述べられている手順（51）に従って均一化した。遠心分離後、上澄み液内での
MPO活性を0-ジアシニジン−ジヒドロクロライド（0.167mg/ml）+ 0.0005%過酸化
水素を用いて判定した。吸収はマイクロタイタ・プレート・リーダー（Molecula
r Device）を用いて460nmで測定した。15分後の絶対値を』記録した。自然のま
まのマウスを比較対象として用いた。

【００５５】実施例１８ ５％CO₂を含んだ空気を用いてPEI-DNA複合体を霧化すると、普通の空気を用いた 場合より肺での導入遺伝子の発現が増大する ５％CO₂を含んだ空気を吸入すると、マウス及びヒトにおいて、１回の呼吸量
が増大し、呼吸頻度も増大する（52−54）。PEI-DNAエアゾールを伝達するため
に５％CO₂を含んだ空気を用いると、そのマウスはより深く、そしてより高い頻
度で呼吸していることを目で観察することができる。５％CO₂を含んだ空気で発
生させたエアゾールの吸入はエアゾール粒子をより多く吸入させると同時に、そ
の結果として、１回の呼吸量と呼吸頻度の増大により、通常の空気でもたらされ
るエアゾールと比較してより高いレベルでの導入遺伝子発現をもたらすことが可
能になる。

【００５６】 PEI-DNA複合体を通常の空気及び５％CO₂を含んだ空気のいずれかを用いたエア
ゾールによってBalb/Cマウスに提供した。N:P比率を１０：１として固定量のCAT
プラスミド（溶液10ml中に１mg）を上に述べた手順で30分間かけて霧化した。24
時間後に肺を取り出して、トランスフェクションの程度を調べるためにCATアッ
セイを行った。５％CO₂を含んだ空気を用いた場合、空気だけで霧化したエアゾ
ールと比較して検出されたCATのレベルが3倍増大した（P=0.001）(図５)。５％C
O₂を含んだ空気も得られた薬品−リポソーム・エアゾール粒子の粒子サイズには
変化をもたらさなかった。

【００５７】 CATプラスミドの量を固定して、５％CO₂を含んだ空気の量を変えた場合のPEI-
DNAの肺への伝達の増大についても調べた。この複合体は空気中の二酸化炭素の
割合を０％、2.5％、5％、10％、そして比較量を用いてエアゾール化させた。ア
ッセイを行ったCAT活性は2.5％あるいは10％の割合を用いた場合に、５％CO₂を
含んだ空気を用いた場合と同様のトランスフェクション・レベルが達成されるこ
とを示している（図６）。

【００５８】 増大された二酸化炭素は他のいくつかの生理学的パラメータを変化させること
でPEI-DNA複合体のトランスフェクション効率に影響を及ぼす。しかしながら、
二酸化炭素はPEI-DNA溶液のｐＨは基本的には変化させないし、得られたエアゾ
ール液滴の粒子サイズも通常の空気の場合と比較して大きく変化させるものでは
ない。肺における導入遺伝子発現の増大はエアゾール粒子の沈着量が原因である
可能性が最も高い。５％CO₂を含んだ空気は他のポリマーDNAあるいは陽イオン脂
質―DNA 複合体のエアゾール伝達も最適化する可能性がある（45）。この程度の
割合の二酸化炭素はヒトは十分に耐えられるものであり、単位時間あたりの吸入
体積を増大させることが示されている（54、55）ので、こうした方式はヒトの肺
システムのサイズ、形状、及び生理を考慮に入れた場合ヒトにおける肺疾患治療
に有効である可能性が高い。

【００５９】実施例１９ PEIによるDNA伝達は用量に依存している 導入遺伝子の発現をさらに最適化するために、N:P比率を１０：１に固定して
、DNAの量をエアゾール化された溶液10ｍぁたり250μｇから4mgの範囲で変化さ
せた。これによって、受け入れ容器内の濃度とエアゾール出力内での霧化された
総DNA総量の両方が増大した。Aerotech II霧化器からの霧化された出力は約80％
と計算された。総ガラス製印ピンジャー（AGI）で測定して、受け入れ容器内のD
NAの72％程度が吸入チェンバーに移された（50）。

【００６０】 残りはTコネクタ及び管内で捕捉されてしまった。単位時間あたりの義務的な
鼻呼吸、肺の生理（単位時間あたり体積及び沈着分）（50）、及びエアゾールの
出力濃度（4.8μg/リットル）、マウスの肺に沈着したDNAの量を、（最初の猟奇
濃度を2mgDNA/10m溶液を仮定して）エアゾール露出中の30分間あたり約4−5μg
と推定された。これらの計算は通常の呼吸に基づいて行われたが、５％CO₂を含
んだ空気が存在していれば１回の呼吸量と呼吸頻度が増大することからさらに高
くなるであろう（53）。

【００６１】 これらの複合体を2mgＤＮＡを含む５％CO₂を含んだ空気でエアゾール化させた
ところ、肺でのCAT発現が最高のレベルとなった（図７）。250μgＤＮＡを用い
て測定されたCATのレベルは比較対象の肺と有意差を示さなかった（P=0.34）。
また、４ｍｇのＤＮＡをＮ：Ｐ比を１０：１として１０ｍｌに溶かすと、一定量
のＤＮＡが沈積され、２ｍｇの場合と知覚して検出されるＣＡＴの量にさらなる
変化は認められなかった（Ｐ＝０．５１）。

【００６２】 なお、濃度と伝達されるＤＮＡの量の両方での増大が認められる。しかしなが
ら、最適濃度でエアゾールの露出時間をさらに延長すると、肺での発現量がさら
に増大する可能性がある。肺におけるこれらの発現レベルは他の伝達システムと
用いた場合とほぼ同様である（34）。

【００６３】実施例２０ PEI-DNA比の最適化 ＰＥＩは霧化中にＤＮＡを保護し、エアゾール伝達を行った後は他のほとんど
の陽イオン性脂質と比較して肺での導入遺伝子の発現レベルを高くするが、遺伝
子伝達のための最適パラメータを決めることは有利であろう。いずれかの陽イオ
ン性粒子とマイナスに荷電されたDNAとの間の電荷反応もその複合体のトランス
フェクションの効率を決める重要なパラメータである。これまでの研究で肺での
トランスフェクションのための最適PEI:DNA(N:P)比率が調べられている（３８、
５６）。しかしながら、これらの調査では静脈注射によるPEI-DNA伝達の方式が
用いられている。エアゾールによる遺伝子伝達には別の条件が必要になる。

【００６４】 ｉｎ ｖｉｖｏでのエアゾール伝達のために理想的な電荷比率を決めるために
、異なったＰＥＩ：ＤＮＡ（Ｎ：Ｐ）比率の肺をトランスフェクトする能力との
関係で調べた。ＤＮＡの量は2mgで一定にし、PEI濃度を５：１、１０：１、１２
．５：１、１５：１、１７．５：１及び２０：１に変化させた。これらの比率は
従来のin vitroおよびin vivo研究（４３）を参考にして選ばれたものである。
これらの複合体を５％CO₂を含んだ空気を用いてエアゾール化させた。１５：１
のＮ：Ｐ比率が肺で最も高いCAT発現レベルを示すのに対して、５：１の比率で
はCAT発現のレベルは非常に低かった（図８）。１０：１、１２．５：１、１５
：１、１７．５：１及び２０：１の比率では有意差が認められなかった（P>0.1
）が、１５：１と２０：１及び１０：１と１５：１の間ではかなりの違いが見ら
れた。（Ｐ＝０．０５）（Ｐ＝０．０１４）

【００６５】 CAT以外のプラスミドのための最適比率を判定するために、肺でのルシフェラ
ーゼ遺伝子の発現に関する種々のＮ：Ｐ比率をテストした。評価された比率は５
：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１及び４０：１であった。ＣＡＴ
と比較して肺に移行したルシフェラーゼに関する最適曲線は２０：１の比率の場
合が最高であった（Ｐ＜０．０５他の比率との比較で）（図８）。このことは、
種々のプラスミドが異なったＮ：Ｐ比率を必要としていることを示唆しており、
ルシフェラーゼ・プラスミドの異なったサイズがＣＡＴプラスミドと比較して立
体構造的に異なったＰＥＩとの複合体をもたらすことを示唆している。また、プ
ラスミドの純度及び超らせん形構造の割合も原因となっている可能性がある。そ
れでも、これら２つのプラスミドの最適Ｎ：Ｐ比率にはかなりの重複範囲が存在
している。異なったプラスミドのための最適比率は異なっている可能性がある。
実験的な変更可能性を考えれば、１０：１から２０：１の間の比率が適切であろ
う。１０：１以下の比率では肺での非常に高いレベルのトランスフェクションは
示されない。これらの結果は側鎖25K PEIを用いた実験結果と一致しているが、
後者の場合は伝達方式は静脈注射であった（５６）。

【００６６】実施例２１ １回のエアゾール伝達後の肺内でのＣＡＴ発現の経時変化 ＣＡＴ発現を用いて遺伝子発現の経時変化もモニターした。１回のエアゾール
伝達後のＣＡＴ発現の持続性を分析することで治療的研究のための治療方針を計
画する上で重要な情報が提供される。２ミリグラムのＣＡＴプラスミドを５％CO ₂ を含んだ空気を用いてエアゾール化して、１５：１と１０：１の２つの比率で
マウスに与えた。１０：１グループに関してはエアゾール露出から１，２、３、
及び６日目の異なった時点で調査が行われた。異なった時点で肺及びその他の組
織を取り出して、すぐに凍結した。すべての組織を最後の時点では同時に調べた
（６日目）。１５：１グループに対しては、エアゾール処理から１、３、７及び
１０日目にマウスを致死させた。各時点で肺を取り出して、重量を測定し、凍結
させ、最後の時点（１０日目）でＣＡＴ蛋白質についてのアッセイを行った。

【００６７】 調べられた両方のＮ：Ｐ比率で、ＣＡＴ発現は２４時間後が最高で、それ以後
３日間は一定であった（１日目と３日目には統計的有意差はなく、Pは１５：１
の場合に０．４、１０：１の場合に０．１２）。CATレベルは１週間後にピーク
・レベルの５０％まで低下し、１０日目以降にもかなりのレベルが観察された（
比較対象との対比でp=0.001）。このことは、伝達が種々の臨床目的に十分なレ
ベルであることを示唆している。最大１０日目までの遺伝子発現の持続は遺伝子
のエアゾール伝達を行うために用いられる他の比較対象陽イオン性脂質と同等か
、あるいはそれを上回っている（３４，５８）。

【００６８】実施例２２ 導入遺伝子の組織内分布 ＤＮＡベクターを静脈注射や腹膜内注射で伝達すると、通常、種々の組織内で
の発現がもたらされる。ＰＥＩ−ＤＮＡのエアゾール伝達が全身的な遺伝子伝達
をもたらすかどうかを調べるために、上の実験で同じグループ（１０：１グルー
プ）のマウスから種々の組織を取り出して、最後の時点でＣＡＴアッセイを行っ
た。調べられた組織は、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺、脳及び血液である。肺以
外の組織で検出されたCATのレベルは非常に低く、比較対象の組織と有意差は認
められない（すべての組織に対してP>0.1）（図１１）。

【００６９】 このシステムでエアゾール伝達を行った後の遺伝子発現は肺だけに限定されて
おり、このことは全身性伝達が最低のレベルであることを示唆している。肺とは
対照的に、肝臓、脾臓、及び腎臓などの静脈注射や腹膜内注射で遺伝子が与えら
れた場合は通常は検出可能なレベルの発現を示す組織が、PEi-DNAエアゾールに
よって伝達された場合は、ほとんど、あるいはまったくCAT発現を示さない。問
題の遺伝子の発現を肺だけに限定する必要がある場合には、このことは重要であ
る。他の研究で、気管内での遺伝子伝達はその遺伝子を肺だけに限定するために
用いられている（５８）。しかしながら、エアゾールを用いた場合と比較してや
や侵入的な技術であり、通常は肺の周辺領域に均一に沈着をもたらすレベルが低
い。エアゾール伝達は粒子を非侵入的かつ均一に肺全体に分散させるのに役立つ
（49）。

【００７０】実施例２３ 組織学的調査では炎症の兆候は示されない PEI-DNAのエアゾール伝達がいずれかのタイプの毒性や急性炎症を引き起こす
かどうかを調べるために、２ミリグラムのCATプラスミドをN:P比率を１５：１と
してPEIと複合化して、マウスを５％CO₂を含んだ空気を用いて発生させたエアゾ
ールに露出させた。２４時間後にマウスを致死させて、肺をホルマリン内で固定
して、ヘマトサイクリン及びエオシンで染色した。薄片を調べてみると、肺は炎
症性細胞浸潤や肺に対する損傷など、組織的異常は認められなかった（図１２）
。

【００７１】 PEＩ-DNAエアゾールによる肺への遺伝子伝達を最適化するために５％CO₂を含
んだ空気を使用しても安全で、肺に対して高度の固有性が示されるようである。 １回のエアゾール露出から１週間経過しても、この方式では高いレベルの発現
が検出されるが、いくつかの療法では遺伝子を反復的に、そしてより高い頻度で
提供する必要がある。より長い時間PEI-DNAエアゾールを肺やその他の器官に露
出させた場合の影響について調べる必要がある。

【００７２】実施例２４ ミエロペロキシダーゼ・アッセイではいずれの炎症も示されなかった 急性肺炎は一部には周辺組織への多形核白血球（PMN）のシーケンストレーシ
ョンによって引き起こされる。多形核白血球に対する生化学的マーカーはミエロ
ペロキシダーゼ（MPO）で、これはアズール顆粒内で見られる酵素であり、肺で
の炎症マーカーとして用いられることがある（１８）。肺へのニューロフィル炎
症を評価するために、２ｍｇのCATプラスミドをN::P比率を１５：１としてPEIと
複合化させて、マウスを５％CO₂を含んだ空気を用いて３０分間そのエアゾール
に露出させた。２４時間後にマウスを致死させて、肺を取り出し、ミエロペロキ
シダーゼ・アッセイを行った（表３）。

【００７３】 比較対象及びエアゾールに露出させた肺内のミエロペロキシダーゼ含有量はそ
れほど違ってはいなかった（Ｐ＝０．９２）。ミエロペロキシダーゼ・アッセイ
は比較対象とエアゾールに露出させた肺とのあいだに何の違いも示さなかった。
つまり比較対象とエアゾールに露出させた肺の間には、反応１５分後にも絶対吸
収値（OD）に違いを示さなかった。（OD：比較対象の場合0.078＋0.009、エアゾ
ール露出肺の場合0.084＋0.004で、Ｐ＞０．５）。

【００７４】

【表３】

【００７５】実施例２５ ｐ53アッセイ ELISAキット（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を用いてｐ53発現につ
いて調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現を行わせるために、組織培養プレート（
48ウェル・プレートで20,000細胞/ウェル）内で成長させたB16−F10細胞をPEI-D
NA複合体で24時間トランスフェクションさせた。その後、培地を洗浄して細胞溶
解緩衝剤を用いて細胞溶解を行った。遠心分離後、100μｌの細胞溶解物質を用
いてｐ53 ELISAを行った。そのｐ53レベルをBCA蛋白質アッセイで測定した綜蛋
白質含有量に正規化した（Piece Rockford, IL）。in vivoでの発現を行わせる
ために、マウスをPEI: ｐ53エアゾールに露出させ、24時間後に致死させて、肺
を取り出し、重量を測定した。肺を1ｍｌの氷冷細胞溶解緩衝液（20mM Tris 0.
5mM EDTA、１％Nonidet P40、0.05％ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＥ、1μｇ/mlペプ
シン、2μg/ml レウペプシン）でＷｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇビード・ホモジェナイザ（
Crescent, Lyons, II）を用いて均一化させた。4℃で遠心分離を行った後、上澄
み液100μｌを用いてｐ53 ELISAを96ウェル・プレートで行った。吸光度（450n
m）をMolecular Devices (Sunnyvale, CA)マイクロタイタ・プレート・リーダー
を用いて3回実験方式で読み取った。ｐ53の量は精製ｐ53を用いて作成された標
準曲線を用いて判定した。このアッセイは10ｐｇ/ml程度の低いレベルまでｐ53
レベルを検出することができ、このアッセイの線形測定範囲は50−1000ｐｇ／ｍ
ｌである。肺内の総蛋白質量をBCA蛋白質アッセイを用いて調べた。

【００７６】実施例２６ PEI-DNA複合体のエアゾール伝達後のマウスの肺でのｐ53発現 上に述べたPEI-DNA複合体に対して行ったのと同様にPEI-ｐ53複合体を作成し
た。2ミリグラムのｐ53プラスミドをＰＥＩ：ＤＮＡ（Ｐ：Ｎ）比率を１０：１
としてポリエチレンイミンと複合化し、５％CO₂を含んだ空気を用いてエアゾー
ル化し、C57BL/6マウスに露出させた。マウスはエアゾール伝達前にテープで密
封された檻内部に入れられた。これは非拘束的、非全身性エアゾール露出システ
ムである。PEI-ｐ53を上に述べたｐリエチレンイミン：ＣＡＴ複合体の存在下で
Aero-Mist霧化器を用いてエアゾール化させた。

【００７７】 肺内部でのｐ53発現をPEI-ｐ53複合体をマウスに投与してから24時間後にELIS
Aで分析した。複合体のエアゾール伝達は自然のままのマウスの肺と比較して、
肺組織で検出されるｐ53のレベルが４倍に増大した。比較対象マウスでのｐ53の
レベルは蛋白質１ｍあたり0.0398＋0.01ｐｇで、エアゾール露出されたマウスで
のレベルは蛋白質１ｍがたり0.040＋0.008ｐｇであった（数値は平均＋ＳＤ）（
59）。PEI-ｐ53への露出はｐ53レベルの増大をもたらさなかった（データ示さず
）。

【００７８】実施例２７ PEI-ｐ53のエアゾール伝達によるB16-F10肺転移の抑制 0日目にC57BL/6マウスに静脈注射で25,000のB16-F10細胞を投与した。そのマ
ウスを５％CO₂を含んだ空気で発生させたポリエチレンイミン−ｐ53エアゾール
複合体でそのマウスにがん細胞を注入してから１週間に２度の割合で処理して（
１、４、８、１１、１５、１８及び２２日目）、22日目に処理を終了した（全部
で７回のエアゾール露出を行った）。比較対象グループには未処理のマウス、 ポリエチレンイミンで処理したマウス、そして、ポリエチレンイミンーLucエア
ゾール複合体で処理したマウスが含まれていた。比較対象のマウスは腫瘍細胞注
入後24時間、つまり治療が中止されて、実験が打ち切られた時点から死に始めた
。処理に用いた用量はポリエチレンイミン：ＤＮＡ（Ｎ：Ｐ）比率を１０：１と
してエアゾール化された溶液10ｍぁたり２ｍｇであった。これはマウスに対して
エアゾール伝達されたDNAの総量である。1匹のマウスに与えられたＤＮＡの量は
空気の存在下で約4−5μｇと推定され、５％CO₂を含んだ空気が存在してる場合
には１回の呼吸量及び呼吸頻度が増えることから増大した。

【００７９】 腫瘍摂取から24日目にマウスを致死させて、肺を固定し、腫瘍指数を計算した
。PEI−p53で処理されたマウスは腫瘍指数が非常に低かった（他のグループとの
比較でP<0.001）のに対して、比較対象グループのすべては腫瘍ノジュールがよ
り大きかった（図１３（Ａ），（Ｂ））。未処理のマウス及びポリエチレンイミ
ンだけかポリエチレンイミン−Lucで処理されたマウスのほとんどは数えられな
い程の腫瘍のジュールが発生しており、胸壁にも侵入が見られ、首や腹部リンパ
・ノードなどの肺以外の箇所への転移も見られた。しかしながら、ポリエチレン
イミン−Luc複合体で処理されたマウスのすべては非常に小さな、明確な腫瘍核
を有しており、胸壁や肺以外の箇所への転移は認められなかった。未処理のマウ
スと比較して、５％CO₂を含んだ空気だけで処理した場合には腫瘍の成長に対す
る影響は認められなかった（データ示さず）。肺重量もPEI-p53で処理したグル
ープとすべての比較対象グループとの間ではかなりの違いが見られた（図13（Ｃ
））。

【００８０】 本明細書では以下の資料が引用されている。 1. Persons et al., Airway deposition of hygroscopic heterodispersed
aerosols: results of a computer model. J. Appl. Physiol. 63:1195-120
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【００８１】 本明細書において言及されている特許あるいは刊行物は、いずれも本発明の関
連する分野の当業者のレベルを示している。これらの特許および刊行物は個々の
刊行物は個別的、具体的に組み込まれるのと同様にその全体が本明細書に組み込
まれる。

【００８２】 本発明が、上記の目的、及びそれらと本質的に付随した目的を実行し、その目
的と利点を得るのに適していることは当業者には十分に理解されるであろう。本
明細書に示されている方法、手段、処置、分子および具体的化合物の例は、好適
な実施例を示すもので、例示的なものであり、本発明の範囲の制限をその意図と
していない。本請求項に定義されている本発明の趣旨に含まれる技術の当業者に
よって、これらの発明の変型および他の利用法も可能であろう。

【図面の簡単な説明】

上に述べた、そして以下に明らかにされる本発明の特徴、利点、及び目的が達
成され、より詳細に理解されるように、上に簡単に要約した本発明のより具体的
な説明を添付図面に示されているそのいくつかの実施の形態を参照して以下に行
う。これらの図面は本明細書の一部を形成するものである。しかしながら、添付
図面は本発明の好ましい実施の形態を示すもので、従って本発明の限定を意図す
るものではない。

【図１】 図１は通常の空気（ベタ）あるいは５％CO₂を含んだ空気（斜線）を用いて発
生されたリポソーム・エアゾールに30分間露出させた後のカンプトセシンの組織
内分布を示している。治療（30分間）の終了後、1グループあたり３匹のマウス
から器官を切除して、HPLCによって薬品濃度を調べた。５％CO₂を含んだ空気と
通常の空気を比較したP値は肺、肝臓、脾臓、腎臓、血液及び脳に対してそれぞ
れ0.02、0.13、0.04，0.04、0.03そして0/01であった（学生tテスト、両側検定
）。

【図２】 図２は通常の空気（O）及び５％CO₂を含んだ空気（＊）を用いて発生されたエ
アロゾルにより30分間投与されたCPT −リポソームに関する呼吸系内濃度−時間
曲線を示している。各時点で、３匹のマウスからの肺を切除して、薬品濃度をHP
LCで判定した。平均値にSDを加味したものを計算した。

【図３】 図３は通常の空気（ベタ）あるいは５％CO₂を含んだ空気（斜線）を用いて発
生されたリポソーム・エアゾールに30分間露出させた後のPTXリポソームに関す
る呼吸器系ない濃度時間曲線を示している。各時点で３匹のマウスからの肺を組
み合わせて、薬品濃度をHPLCで判定した。各実験は３回繰り返し、平均値にSDを
加味したものを計算した。

【図４】 図４は種々のリポソーム性製剤を含むエアゾールに露出させたマウスの肺の組
織パクリタキセル・レベルの比較を示している。パクリタキセルに対する等しい
レベルの露出がDPLCを用いた場合と同様ディミリスチルホスホエタノールアミン
・ポリ（エチレン・グリコール）2000から調製した立体構造的に安定させたパク
リタキセル・リポソーム内で行われた。

【図５】 図５は空気あるいは５％CO₂を含んだ空気を用いて発生されたPEI−DNA エアゾ
ールによる肺肺でのCAT発現の比較を示している。CATプラスミド１ミリグラムを
N：P比率を10:1としてPEIと複合化させ、得られた複合体をマウスに対して30分
間エアゾール投与した。24時間後に肺を取り出して、CATアッセイを上に述べた
ように行った。数値は平均値＋SD（１グループあたり6匹のマウス。P＝0.001）
。

【図６】 図６はエアゾールによる肺へのPEI−DNA伝達の効率に対するCO₂の割合の効果
を示している。CATプラスミドの量を固定し、異なった濃度のCO₂を含む空気を用
いた。これらの複合体は0％、2.5％、5％、10％二酸化炭素及び比較対象を用い
てエアゾール化した。マウスを致死させて、肺を取り出し、CATアッセイを行っ
た。数値は平均値＋SD。

【図７】 図７はPEI−DNAによる肺内での遺伝子発現が用量依存であることを示している
。CATプラスミドの用量を徐々に多くしてCATプラスミドをN：P比を10：１に設定
して５％CO₂を含んだ空気を用いてエアゾール化した。伝達されたDNAの総量と伝
達されたPEI−DNAの濃度の両方で増大が認められた。24時間後にマウスを致死さ
せて、肺を取り出し、CAT蛋白質のアッセイを行った。数値は平均値＋SD。（ｎ
＝1グループあたりマウス５匹）。

【図８】 図８はエアゾールによる肺へのPEI−DNA伝送の効率に対するN：P比の影響を示
している。CATプラスミドの量を固定して（2mg）、種々のPEI−DNA(N：P)比率を
用いた。この複合体を５％CO₂を含んだ空気を用いてエアゾール化した。24時間
後にマウスを致死させて、肺を取り出し、CATアッセイを行った。数値は平均値
＋SD。（ｎ＝1グループあたりマウス５匹）。

【図９】 図９は肺内でのルシフェラーゼ遺伝子発現に対するN：P比の影響を示している
。固定量のルシフェラーゼ・プラスミド（２mg ）をN：P比を変えて伝達した。
これらの複合体は５％CO₂を含んだ空気を用いてエアゾール化した。24時間後に
マウスを致死させて、肺を取り出し、ルシフェラーゼ・アッセイを行った。数値
は平均値＋SD。（ｎ＝1グループあたりマウス５匹）。

【図１０】 図１０は１回のPEI−DNAエアゾール露出後の導入遺伝子発現の時間経過を示し
ている。図１０（A）で、マウスには５％CO₂を含んだ空気を用いてN：P比を１５
：１にして２ｍｇのCATプラスミドを含むエアゾールが伝達された。24時間後に
マウスを致死させて、肺を取り出し、すぐに凍結した。CATアッセイを最後の時
点で行った。数値は平均値＋SD。（ｎ＝1グループあたりマウス５匹）。図１０
（B）は２つの異なったN：P比を用いた場合のCAT発現の持続を示している。両方
のグループのマウス（n=１グループにつき１つの時点で5匹のマウス）に対して
５％CO₂を含んだ空気を用いてN：P比を１５：１にして２ｍｇのCATプラスミドを
含むエアゾールが伝達された。10：１の比率の時点はエアゾールに露出させてか
ら１、２、３及び６日目で、15：１の比率の時点はエアゾールに露出させてから
１、３、７及び10日目であった。

【図１１】 図１１は１回のPEI −DNAエアゾール露出後の導入遺伝子の組織内分布を示し
ている。図９の場合と同じ（10:1グループからの）マウスを用いた。種々の組織
を取り出して、直ぐに凍結させた。CAT蛋白質アッセイを最後の時点に行った。
数値は平均値＋SD。（ｎ＝1時点あたりマウス５匹）。エアゾール露出グループ
の肺以外の組織でのCATのレベルは比較対象組織と変わらなかった（P>0.1）。

【図１２】 図１２はPEI−DNAエアゾール処理グループの組織分析を示している。2ミリグ
ラムのCATプラスミドをN：P比を15：1にしてPEIと複合化して、その複合体を５
匹のマウスに対して５％CO₂を含んだ空気を用いて30分間エアゾール投与した。
マウスを２４時間後に致死させて、肺を取り出し、ホルマリン内で固定した。薄
片をヘムトサイクリン及びエオシン（E&E）で染色した。図１２（A）：細気管支
（比較対照）；図１２（B）：細気管支（処理）。拡大率100倍。

【図１３】 図１３はPEI−p53伝達によるB16 −F10 肺転移の吸入を示している。図１３（
A）：腫瘍指数を以下の式：腫瘍指数＝肺重量xそのグループの平均等級で計算し
た。数値は平均値＋SD。（ｎ＝1グループあたりマウス10匹）。図１３（B）：比
較対象からの代表的肺。PEI−ルガンドPEI−p53で処理したマウスを示してある
。（ｎ＝１グループあたりマウス10匹。）PEIで処理したグループからの肺（図
示せず）は形、サイズ、及び腫瘍核が比較対象及びPIE−Luc処理グループの場合
に示したものと動揺であった。データは２回の個別実験を示している。図１３（
C）：種々のグループからの肺重量。数値は平均値＋SD。（ｎ＝1グループあたり
マウス10匹）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/24 Ａ６１Ｋ 47/24 47/32 47/32 47/34 47/34 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナイト，ジェイ．，バーノン アメリカ合衆国 77027 テキサス ヒュ ーストン，ラナ レーン 29 (72)発明者 コシュキナ，ナジェズダ アメリカ合衆国 77054 テキサス ヒュ ーストン，ナンバー 1721， ケンブリッ ジ 7900 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA93 BB21 BB27 CC15 CC27 CC32 CC35 DD17 DD29 DD63 FF34 4C086 AA01 AA02 BA02 EA15 MA02 MA03 MA05 MA13 MA56 NA05 NA11 ZA59 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトあるいは動物の呼吸器系でのエアゾール化された医薬品
   の沈着を増強する方法において、前記エアゾール化された医薬品を最大約１０％
   の二酸化炭素ガスを含む空気混合物に入れて投与するステップを含む方法。
2. 【請求項２】 前記空気混合物が２．５％の二酸化炭素ガスを含んでいるこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記空気混合物が５％の二酸化炭素ガスを含んでいることを
   特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記空気混合物が７．５％の二酸化炭素ガスを含んでいるこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記エアゾール約１分から３０分間投与されることを特徴と
   する請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 前記医薬品がジェット霧化器によってエアゾール化されるこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 前記医薬品が水溶性あるいは脂溶性の医薬品であることを特
   徴とする請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 前記水溶性あるいは脂溶性医薬品が抗生物質、粘膜溶解剤、
   気管支拡張剤、副交感神経剤、酵素及び抗ウイルス剤で構成される群から選択さ
   れることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記医薬品が基質を通じて伝達される不溶性医薬品であるこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記基質がリポソーム、遅放出性ポリマーおよび多価陽イ
    オン性・ポリマーで構成される群より選択されることを特徴とする請求項９記載
    の方法。
11. 【請求項１１】 前記リポソームが従来型リポソームあるいは立体的安定構
    造リポソームであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記従来型リポソームがホスファチジルコリンあるいはポ
    リ（エチレングリコール）修正リン脂質で構成される脂質から形成されているこ
    とを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ホスファチジルコリンがジラウロイルホスファチジル
    コリンであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記立体的安定構造リポソームが修正リン脂質より形成さ
    れていることを特徴とする請求項１１記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記修正リン脂質がジミリスチルフォスフォエタノールア
    ミン・ポリ（エチレングリコール）２０００であることを特徴とする請求項１４
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記リポソームがリポソーム・カプセル内の親油性医薬品
    を送り込むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記親油性医薬品がアンフォテリシンB、ナイスタチン、
    グルココルチコイド、免疫抑制性および抗癌性の製剤で構成される群より選択さ
    れることを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記抗癌剤が、カンプトセシン、カンプトセシン誘導体お
    よびパクリタキセルで構成される群より選択されることを特徴とする請求項１７
    記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記薬品が、治療蛋白質、治療ペプチド、DNA遺伝子、セ
    ンス・オリゴヌクレオチド、抗センス・オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリ
    ゴヌクレオチドおよびウィルス・ベクターで構成される群より選択されることを
    特徴とする請求項１記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記DNA遺伝子がクロラムフェニコール・アセチル転移酵素
    あるいはP５３のものであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記DNA遺伝子が多価陽イオン性ポリマー基質あるいは陽
    イオン性リポソームを通じて伝達されることを特徴とする請求項１９記載の方法
    。
22. 【請求項２２】 前記多価陽イオン性ポリマーがポリエチレンイミンである
    ことを特徴とする請求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記ポリエチレンイミンが、約１０：１から２０：１の範
    囲の比率で窒素：リン酸塩を有していることを特徴とする請求項２２記載の方法
    。
24. 【請求項２４】 前記ポリエチレンイミンが１０：１の比率で窒素：リン酸
    塩を有していることを特徴とする請求項２３記載の方法。