JP2003514017A - 膵臓癌の治療のためのｎｓａｉｄの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、特にスリンダクまたはその類似体の使用を含む膵臓癌を治療するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 膵臓癌は、最も一般的な癌による死因として肺癌、結腸癌および乳癌に次ぐ順
位を占めている(1)。膵臓癌は男性により一般的であり、６０歳から７０歳の間
の男性が最も危険性が高い。膵臓癌の原因は不明である。

【０００２】 最も一般的な症状は体重の減少、腹痛および黄疸である。通常、体重の減少は
深刻であり、その原因は完全には解明されていない。平均的な減少量は約２５ポ
ンドである。癌が総胆管をふさぐと黄疸が起こる。膵臓癌の生存率は低い。膵臓
癌は、悪性腫瘍が確認されるまでに身体の他の部分に広がって（転移して）いる
ことが多い。平均余命は診断の時点から６ヶ月あまりである。

【０００３】 腫瘍は、取り除くことができない生命にかかわる組織を冒しているか、遠く離
れた部位にまで広がっているために、手術によって取り除くことができないこと
が多い。化学療法および放射線療法を腫瘍に対して用いることができるが、これ
らの治療法が役立たないことが多い。

【０００４】 非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）の数は、別個の分類を形成するほどまで増
加している。アスピリンに加えて米国で入手可能なNSAIDは、関節炎の治療用の
メクロフェナム酸ナトリウム、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、イン
ドメタシン、ピロキシカム、スリンダクおよびトルメチン、痛覚消失用のメフェ
ナム酸およびゾメピラックならびに関節炎と痛覚消失両用のイブプロフェン、フ
ェノプロフェンおよびナプロキセンを含む。イブプロフェン、メフェナム酸およ
びナプロキセンは月経困難症の管理にも用いられる。

【０００５】 NSAIDの臨床上の有用性は、多くの副作用のために制限されている。フェニル
ブタゾンは肝壊死および肉芽腫性肝炎に、スリンダク、インドメタシン、イブプ
ロフェンおよびナプロキセンは肝炎および胆汁うっ滞性肝炎に関連付けられてい
る。血清アミノトランスフェラーゼ、特にアラニンアミノトランスフェラーゼの
一時的な上昇が報告されている。アスピリンを含むこれらの薬物の全てはシクロ
オキシゲナーゼを阻害し、それによって次には、糸球体濾過率ならびに腎臓のナ
トリウムおよび水分***の調節を助けるプロスタグランジン類の合成が阻害され
る。このため、NSAIDは、水分貯留をもたらし、ナトリウムの***を減少させ、
高カリウム血症、乏尿症および無尿症を引き起こす可能性がある。また、これら
の薬物の全てが消化性潰瘍を引き起こす可能性がある。Remington's Pharmaceut ical Sciences , Mack Pub. Co., Easton, PA (18th ed., 1990) 1115-1122頁を
参照。

【０００６】 癌、特に結腸癌に対するNSAIDの効果については多くの文献がある。たとえば
、H. A. ワイス（Weiss）ら, Scand J. Gastroent., 31, 137 (1996) (suppl. 2
20)およびシフ（Shiff）ら, Exp. Cell Res., 222, 179 (1996)を参照。さらに
最近では、B. ベッロシッロ（Bellosillo）ら, Blood, 92, 1406 (1998)が、ア
スピリンおよびサリチル酸塩はインビトロでB細胞CLL細胞の生存度を低下させる
が、インドメタシン、ケトロラク(ketoralac)およびNS-398は低下させないと報
告している。スリンダクは、結腸癌の治療のための複合治療において研究されて
いる。H. M. ヴェルヘール（Verheul）ら, Brit. J. Cancer, 79, 114 (1999);
F. A. シニクロープ（Sinicrope）ら, Clin. Cancer Res., 2, 37 (1996); およ
び M. ムーゲン（Mooghen）ら, J. Pathol., 156, 394 (1988)を参照。

【０００７】 C. P. ダッフィー（Duffy）ら, Eur. J. Cancer, 34, 1250 (1998)は、ある化
学療法薬の細胞傷害作用が、ある非ステロイド系抗炎症剤と組み合わせると高ま
ることを報告した。ヒト肺癌細胞およびヒト白血病細胞に対して観察されたこの
効果は非常に特異的で予測不可能であった。すなわち、NSAIDと薬剤の組合せに
は効果的なものあれば、効果がないものもあった。引き出された唯一の結論は、
その効果はNSAIDのシクロオキシゲナーゼ阻害活性によるものではないというこ
とであった。

【０００８】 ダッフィー（Duffy）のグループは、抗がん薬となり得る“MRPの基質”と抗が
ん薬の効力を強めるNSAIDとの組合せを対象とするＰＣＴ出願を１９９７年１０
月２４日に行った。請求項に列挙されたNSAIDは、アセメタシン、インドメタシ
ン、スリンダク、スリンダクスルフィド、スリンダクスルホン、トルメチンおよ
びゾメピラックである。ナプロキセンおよびピロキシカムは不活性であると報告
された。

【０００９】 したがって、癌を抑制し、比較的非毒性の薬剤を用いて抗がん薬の効力を強め
るための方法が継続して必要とされている。 発明の要旨 １つの局面では、本発明は、膵臓癌に冒された哺乳類に前記哺乳類の膵臓癌細
胞の生存度を阻害するのに有効な量のNSAID、好ましくはスリンダク((Z)-5-フル
オロ-2-メチル-1-[[4-(メチルスルフィニル)フェニル]メチレン]-1H-インデン-3
-酢酸)またはその類似体であって、好ましくはCOX-2阻害剤であるものを投与す
ることを含む膵臓癌を治療するための治療方法を提供する。本発明はまた、細胞
を有効感作量のNSAID、好ましくはスリンダク、または前記その類似体に接触さ
せることを含むヒト膵臓癌細胞の化学療法剤への感受性を高める方法を提供する
。これにより、本発明は、有効量のNSAID、好ましくはスリンダクまたは前記そ
の類似体を膵臓癌に冒され化学療法（「抗腫瘍性」）剤による治療中である患者
に投与する、膵臓癌に冒されたヒトまたは他の哺乳類の治療のための治療方法を
提供する。

【００１０】 スリンダクは、ゲムシタビンまたは5-FUのような膵臓癌に対して有効な１つ以
上の化学療法剤と共に投与されるのが好ましい。

【００１１】 膵臓癌細胞を化学療法剤に感作させるスリンダクの能力を評価する方法もまた
提供される。このアッセイ方法は、（ａ）膵臓癌細胞の第１の部分をヒト癌患者
から単離するステップと；（ｂ）それらの生存度を測定するステップと；（ｃ）
スリンダクまたは前記その類似体を前記患者に投与するステップと；（ｄ）膵臓
癌細胞の第２の部分を前記患者から単離するステップと；（ｅ）膵臓癌細胞の第
２部分の生存度を測定するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）で測定した生存度
とステップ（ｂ）で測定した生存度とを比較するステップとを含み、ステップ（
ｅ）での生存度の低下によって細胞が前記化学療法剤に感作されたことが示され
る。

【００１２】 膵臓癌細胞が、膵臓癌に冒された哺乳類の血液から由来する場合と同様に、ス
テップ（ｂ）および（ｅ）は化学療法剤の存在下で行うのが好ましい。

【００１３】 これにより、膵臓癌の治療を受ける予定または治療中の癌患者を迅速に評価し
、患者が化学療法とスリンダクまたはその類似体の投与との併用によって利益を
得るかどうかを調べることができる。

【００１４】 本明細書中に用いる用語“スリンダク”およびスリンダクの類似体は、スリン
ダクスルホン、スリンダクスルフィドのような代謝物および製薬上許容可能なそ
の塩を含む。 図面の簡単な説明 図１。膵臓腺癌および対応する正常組織の代表的な免疫ブロットの複写写真。
正常（N）組織を有する３人を含む６人の患者から得た腫瘍（T）検体から溶解物
を調製した（試料番号は表１に記載のものに対応する）。図示するように特異的
なCOX-2、COX-1、p21^rasおよびアクチン抗体での免疫ブロット法によって溶解物
を分析した。COX-2免疫ブロットの陽性対照（＋）はリポ多糖（LPS）で処理した
マウスのマクロファージ細胞系であるRaw 264.7から調製された細胞溶解物であ
る。陰性対照（−）は、COX-1もCOX-2もどちらも発現させない結腸癌細胞系HCT1
16である。

【００１５】 図２。患者試料におけるCOX-2発現率。表１の黒丸で示す全ての腫瘍試料およ
び白丸で示す正常組織についてのCOX-2発現率の値がプロットされている。平均
値、中央値および範囲が示されている。膵臓の腫瘍／正常組織のセットのCOX-2
発現率を図内挿入図に示す（n=11）。対応する黒丸で示す腫瘍値と白丸で示す正
常値とが線よって結ばれている。腫瘍検体と正常検体とのCOX-2発現の差異は、
統計的に有意であると判断された（P=0.004）。

【００１６】 図３。膵臓腫瘍細胞系におけるCOX-2の発現。Ａ）免疫ブロット分析によって
検出されたヒト膵臓細胞系におけるCOX-2発現。各細胞系のK-ras変異状況も示す
。Ｂ）細胞系BxPC-3をMEK阻害剤PD98059またはDMSOで10時間処理した後の活性化
MAPキナーゼおよびCOX-2の発現レベル。燐酸化活性Erk 1/2 Mapキナーゼをリン
酸特異的Mapキナーゼ抗体で検出した。Ｃ）３つのハムスター膵臓細胞系でのCOX
-2発現の比較。D27は非悪性の親細胞系であり、これからD27/K-rasおよびB12/13
という形質転換系を得た。COX-2をプローブした後、ブロットを剥離してアクチ
ンを再プローブし、タンパク質負荷が同等であることを示した。Ｄ）COX-2発現
の誘導性。血清飢餓細胞を図示された時間10％FCSで刺激し、続いて細胞溶解を
行なった。COX-2の発現を増殖細胞（Gr）、血清飢餓細胞（0h）およびFCS刺激細
胞から調製した溶解物中で免疫ブロット分析によって測定した。

【００１７】 図４。膵臓腫瘍細胞系の増殖に対するCOX阻害剤の効果。黒い棒で示す細胞系B
xPC-3および斜線の棒で示すPaCa-2を、DMSO（対照）あるいは図示された濃度の
スリンダク（Ａ）、インドメタシン（Ｂ）またはNS-398（Ｃ）の存在下で平板培
養した。３日目に、２つのウエル内の細胞を計数し、DMSOの存在下で増殖する細
胞の数の百分率で表した。少なくとも２回の独立した実験からの平均値+/-標準
偏差を示す。

【００１８】 図５。プロスタグランジンE₂の産生。Ａ）膵臓腫瘍細胞系におけるPGE₂レベル
。指数関数的に増殖する細胞を無血清培地で15μMアラキドン酸で１時間インキ
ュベートした後、培養上清におけるPGE₂のレベルを酵素免疫測定法によって測定
した。PGE₂の産生をタンパク質濃度に正規化した。表示された結果は、２回の独
立した実験からの平均値+/-標準偏差である。Ｂ）PGE₂の産生に対するCOX阻害剤
の効果。BxPC-3細胞系をDMSOまたは２種類の濃度のCOX阻害剤（100μMのスリン
ダク、10μMのインドメタシンおよび10μMのNS-398を黒い棒で示し、250μMのス
リンダク、100μMのインドメタシンおよび50μMのNS-398を点描の棒で示す）で
２４時間インキュベートした後、細胞溶解を行い、酵素免疫測定法によって細胞
内のPGE₂を測定した。COX阻害剤によるPGE₂阻害率を示す。データは、少なくと
も２回の独立した実験からのものである。

【００１９】 図６は、膵臓腫瘍細胞系BxPCの増殖に対するスリンダクとゲムシタビンとの組
合せの効果を表すグラフである。

【００２０】 図７は、膵臓腫瘍細胞系PaCa-2の増殖に対するスリンダクとゲムシタビンとの
組合せの効果を表すグラフである。 発明の詳細な説明 早期診断の実現が困難なことと膵臓癌の攻撃的な性質により、膵臓癌患者の生
存率は低い。膵臓癌の治療にはほとんど選択肢がないので、薬物療法のための可
能性のある目的物を特定することが重要である。膵臓の腫瘍形成についてより多
くの識見を得るために、膵臓腫瘍は、遺伝子的な損傷を検出するために分子レベ
ルで分析されてきた。K-ras遺伝子内で活性化する変異が、膵臓癌腫の90％まで
において検出されており、Ras経路の活性化が膵臓癌の発達において重要である
ことを示唆している(2)。現在、膵臓癌患者についての実験的な化学療法の戦略
は、Rasシグナル形質導入経路を目的物とする薬物を含んでいる。

【００２１】 多数の証拠が、酵素シクロオキシゲナーゼ（COX）、具体的にはCOX-2が有望な
化学療法の目的物であり得ることを示唆している。たとえば、疫学的研究によっ
て、アスピリンまたは他の非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）の長期的使用によ
って結腸癌の危険性が40〜50％減少し得ることが示されている(3)。NSAIDはまた
、動物モデルシステムにおいて化学的に誘導された結腸癌腫を阻害し得る(4)。N
SAIDはアラキドニン酸のプロスタグランジンおよび他のエイコサノイド類への変
換における鍵酵素であるシクロオキシゲナーゼ（COX）を阻害することが知られ
ているので、これらの研究は、COXが炎症における既知の役割に加えて発癌現象
において役割を果たしている可能性があることを示している。COX-1およびCOX-2
と呼ばれるCOXの２つの異性体が確認されている。COX-1は構成的に発現し、COX-
2は血清、ホルボールエステルおよび増殖因子のような***促進性の刺激によっ
て誘導される(5、6)。近年、COX-2の発現は数種類のヒト癌において高くなるこ
とが示されており、COX-2の存在が癌の発達と相関していることを示唆している(
7〜11)。COX-2を発癌現象と直接的に結びつけるさらなる研究には、COX-2を発現
するヒト結腸癌細胞は侵入性を高めるという観察(12)や大腸上皮細胞において発
現したCOX-2はアポプトーシスを阻害するという観察(13)が含まれる。結腸癌細
胞におけるCOX-2の発現は血管新生因子の生成を刺激することによって共培養さ
れた内皮細胞の血管新生を促進することもわかっている(14)。さらに、結直腸癌
に至る遺伝性の病気であるヒト家族性腺腫性ポリポージス（FAP）についてのマ
ウスモデルによって、COX-2を結腸直腸の腫瘍形成と結びつける直接的な遺伝学
的証拠が提供された。すなわち、このシステムではCOX-2遺伝子ノックアウトお
よび特異的COX-2阻害剤が形成される腸ポリープの数を減少させることがわかっ
た(15)。

【００２２】 腫瘍形成性Rasの存在は、H-ras形質転換ラットの腸および***上皮細胞ならび
に非小細胞性肺癌細胞系におけるCOX-2発現の誘導と関連付けられてきた(16〜18
)。本発明者らの知る限りでは、腫瘍形成性RasとCOX-2発現との関連は生体内で
は検討されていない。膵臓腫瘍でK-ras遺伝子内で活性化する変異の頻度が高い
ので、本発明者らは生体内で腫瘍形成性RasとCOX-2発現との関係を調べることが
できるはずである。本研究では、原発性ヒト膵臓腺癌におけるCOX-2タンパク質
のレベルを評価した。本発明者らは、COX-2発現が膵臓腫瘍および膵臓癌細胞系
のK-ras変異状況と相関するかどうかをさらに調べた。原発性膵臓腫瘍および細
胞系における高レベルのCOX-2タンパク質を示すデータを考慮して、本発明者ら
はCOX阻害剤であるスリンダク、インドメタシンおよびNS-398のヒト膵臓腫瘍細
胞系での細胞増殖およびプロスタグランジンE₂産生に対する効果について試験し
た。

【００２３】 シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）発現は、数種類のヒト癌でアップレギュレ
ートされ、発癌現象とも直接的に結びつけられた。膵臓癌におけるCOX-2の役割
を調査するため、本発明者らは、原発性ヒト膵臓腺癌（n=23）および対の正常隣
接組織（n=11）におけるCOX-2タンパク質発現を免疫ブロット分析によって評価
した。COX-2発現は正常な膵臓組織に比べて膵臓腫瘍検体で非常に高いことがわ
かった。膵臓腫瘍で観察される高レベルのCOX-2タンパク質が腫瘍形成性K-rasの
存在と相関するかどうかを調べるため、本発明者らは、腫瘍および対応する正常
組織のサブセットでのK-ras変異状況を測定した。腫瘍形成性K-rasの存在は、分
析した膵臓腺癌で発現したCOX-2タンパク質のレベルとは相関していなかった。
これらの観察は、ヒト膵臓腫瘍細胞系のパネルにおいても確認された。さらに、
最も高いレベルのCOX-2を発現する膵臓腫瘍細胞系（BxPC-3）では、COX-2発現は
Erk 1/2 Mapキナーゼ活性化とは無関係であることが示された。COX-2と腫瘍形成
性K-ras発現との間の相関関係の欠如は、Ras活性化が膵臓腫瘍細胞におけるCOX-
2発現の誘導には十分であり得ず、Ras以外のシグナル経路の異常な活性化がCOX-
2発現をアップレギュレートするのに必要となり得ることを示唆している。本発
明者らはまた、COX阻害剤であるスリンダク、インドメタシンおよびNS-398がCOX
-2陽性（BxPC-3）およびCOX-2陰性（PaCa-2）の両方の膵臓腫瘍細胞系における
細胞増殖を阻害したことを報告する。しかしながら、インドメタシンおよびNS-3
98による細胞増殖の抑制は、PaCa-2細胞系よりもBxPC-3細胞系における方が非常
に大きかった（それぞれP=0.004およびP＜0.001）。さらに、この３種のCOX阻害
剤は、BxPC-3細胞系におけるプロスタグランジンE₂（PGE₂）のレベルを低下させ
た。総合すると、本発明者らのデータは、COX-2が膵臓腫瘍形成で重要な役割を
果たし、したがって膵臓癌治療のために有望な化学療法の目的物となり得ること
を示唆している。

【００２４】 スリンダク((Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-[[4-(メチルスルフィニル)フェニル]
メチレン]-1H-インデン-3-酢酸)は以下の化学式を有し、メルク（Merk）社から
クリノリル（Clinoril（登録商標））として入手可能である。

【００２５】

【化１】

【００２６】 スリンダクは、骨関節炎、慢性間接リウマチ、強直性脊椎炎、急性肩痛および
急性痛風性関節炎の徴候および症状の急性および長期的軽減に示されるインデン
系抗炎症剤である。スリンダクはまた鎮痛および解熱特性を有する。その作用の
正確な機構は不明であるが、スルフィド代謝物がプロスタグランジン合成を阻害
し得ると考えられる。スリンダクは経口投与すると約90％吸収される。絶食中の
患者で約２時間、食べ物と共に投与した場合は３時間から４時間でピーク血漿レ
ベルに達する。スリンダクの平均半減期は７.８時間であり、スルフィド代謝物
の平均半減期は１６.４時間である。スリンダクは機能性分類ＩＶの関節炎（無
能力、ほとんどまたは完全に寝たきり、あるいは車椅子状態；ほとんどまたは全
くセルフケアできない）、アスピリンまたは他の非ステロイド系抗炎症剤によっ
て急に引き起こされる急性喘息発作、じんま疹または鼻炎の患者および薬物に敏
感な患者には禁忌されている。

【００２７】 スリンダクの合成ならびにその類似体（代謝物および塩を含む）は、たとえば
、米国特許第3,654,349号および第3,647,858号ならびにFed. Proc., 31, 377 (1
972); Drug. Metab. Disps., 1, 721 (1972)に開示されている。

【００２８】 たとえば、スリンダクの類似体は化学式(I)の置換されたインデニル酢酸を含
む。

【００２９】

【化２】

【００３０】 式中、

【化３】は、アリールまたはヘテロアリール、たとえば1-3, N、Oおよ

【００３１】 び／またはS原子を含む5、6または7員ヘテロアリール環であってもよく； R₁は水素、低級(C₁-C₄)アルキルまたはハロゲン化低級アルキルであってもよ
く； R₂は、水素または(C₁-C₆)アルキルであってもよく； R₃、R₄、R₅およびR₆は、それぞれ水素、アルキル、(C₂-C₅)アシルオキシ、ア
ルコキシ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ
、ジアルキルアミノアルキル、スフアミル（sufamyl）、アルキチオ（alkythio
）、メルカプト、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルスルホニル、ハロ
ゲン、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルバミド、ハロゲノア
ルキル、シクロアルキルまたはシクロアルコキシであってもよく； R₇は、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルであってもよく； R₈は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはハロアルキルであって
もよく； Mは、ヒドロキシ、低級アルコキシ、置換された低級アルコキシ、アミノ、ア
ルキルアミノ、ジアルキルアミノ、N-モルホリノ、ヒドロキシアルキルアミノ、
ポリヒドロキシアルキルアミノ、ジアルキルアミノアルキルアミノ、アミノアル
キルアミノおよびMeがカチオンであるOMe基；ならびに製薬上許容可能なその塩
であってもよい。

【００３２】 アルキルは、低級アルキル、すなわち(C₁-C₄)アルキルであるのが好ましい。
アシルは、(C₂-C₄)アシルであるのが好ましい。

【００３３】 インドメタシンおよびNS-398を含む他のNSAIDもまた、以下に述べるように膵
臓腫瘍細胞系の増殖を阻害し、単独でまたは好ましくはスリンダクと組み合わせ
て本発明の方法に用いることができる。

【００３４】 ゲムシタビン（ゲムシタビンHClまたはジェムザール(Gemzar（登録商標）)は
、2'-デオキシ-2', 2'-ジフルオロシチジン-HCl(B-異性体)であり抗腫瘍ヌクレ
オシド類似体である。これは、限局性または転移性膵臓癌（膵臓の腺癌）の治療
のために、約500〜4000mg/m²/週の用量で最高７週/サイクル間、注射または注入
により投与することができる。これはまた、5-FUのような他の抗がん剤と共に投
与することもできる。PDR (53rd ed., 1999)、1578-1582頁を参照。

【００３５】 スリンダクまたはNS-398単独およびゲムシタビンとの組合せの膵臓腫瘍細胞Bx
PC-3およびPaCa-2の増殖に対する効果を調べた。この薬物の組合せでの処理によ
って、いずれか一方の化合物単独よりも大きく両細胞系の増殖が阻害された。抗
炎症特性を有するナツシロギク（feverfew）の活性成分であるパセノライドもま
たPaCa-2細胞の増殖を阻害し、ゲムシタビンと組み合わせるといずれか一方の化
合物単独でよりも大きな阻害効果を示すことがわかった。パセノライド処理によ
ってNF-(BのDNA結合活性が阻害された。これらの結果は、抗炎症薬が膵臓腫瘍に
対するゲムシタビンの有効性を高め得ることを示唆している。

【００３６】 癌すなわち膵臓癌の急性または慢性的治療管理におけるスリンダク、その類似
体またはその組合わせの予防または治療用量は、治療する固形腫瘍、用いられる
化学療法剤または他の抗がん療法および投与経路のような癌の段階によって異な
る。用量およびおそらくは投与の頻度もまた、個々の患者の年齢、体重および反
応によって異なる。一般に、本明細書中に記載の条件に対するスリンダクおよび
その類似体の１日の全用量の範囲は、１回または分割の用量で約50ｍｇから約25
00ｍｇである。好ましくは、１日の用量は１回または分割の用量で約100ｍｇか
ら約1500ｍｇ、最も好ましくは、１日当たり約150〜500ｍｇであるのがよい。患
者を治療管理する際、治療は低用量から開始し、患者の全体的な反応に合わせて
増加させるのがよい。幼児、小児、６５歳を超える患者および腎機能または肝機
能に障害のある患者は、最初は低用量を投与され、全体的な反応および血中濃度
に基づいて滴定されることがさらに推奨される。これらの範囲外の投与量を用い
ることが必要となり得る場合もある。さらに、臨床医または治療する医師は、個
々の患者の反応によって、どのように、いつ、治療を中断、調整または終了すれ
ばよいかが分かる。用語"有効量"または"有効感作量"は、上記の投与量および投
与頻度のスケジュールに含まれている。

【００３７】 患者に有効な投与量のスリンダクを提供するのにいかなる適切な投与経路を使
用してもよい。たとえば、経口、経直腸、非経口（皮下、静脈内、筋肉内）、髄
腔内、経皮などの投与形態を使用してよい。投与の形態は、タブレット、トロー
チ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、貼付剤などを含む。スリンダクは、化学
療法の適用の前、同時または後、あるいは化学療法の全期間または一時期に継続
的に、すなわち毎日投与してもよい。スリンダクは、抗がん化学療法剤を輸送す
るために用いられるのと同じ担体またはビークルと組み合わせてもよい場合があ
る。

【００３８】 このため、本発明の化合物は、不活性希釈剤または同化可能な可食性の担体の
ような製薬上許容可能なビークルと組み合わせて、たとえば経口で全身に投与し
てもよい。これらは、硬質または軟質の外被のゼラチンカプセルに封入してもよ
いし、圧縮してタブレットにしてもよく、または患者の食事の食べ物に直接組み
込んでもよい。経口治療的投与には、活性化合物を１つ以上の賦形剤と組み合わ
せて摂取可能なタブレット、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸
濁液、シロップ、オブラートなどの形態で用いてもよい。このような組成物およ
び調剤は、少なくとも0.1％の活性化合物を含んでいるのがよい。この組成物お
よび調剤の割合はもちろん変えてもよく、所定の単位投与形態の重量の約2％か
ら約60％の間であるのが好都合であるかもしれない。このような治療的に有用な
組成物における活性化合物の量は、有効投与量のレベルが得られるようなもので
ある。

【００３９】 タブレット、トローチ、丸剤、カプセルなどは以下のものを含んでもよい。ト
ラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結着
剤；リン酸ジカルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、バレイショデ
ンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような湿
潤剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームのよ
うな甘味剤あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリー香料の
ような着香剤を添加してもよい。単位投与形態がカプセルの場合は、上記の種類
の物質に加えて植物油またはポリエチレングリコールのような液体担体を含んで
もよい。剤皮として、あるいは固形の単位投与形態の物理的形態を変更するため
に、種々の他の物質が存在し得る。たとえば、タブレット、丸剤、またはカプセ
ルをゼラチン、ロウ、シェラックまたは砂糖などで被膜してよい。シロップまた
はエリキシルは、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、防腐剤として
のメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジ香味のような色素お
よび香料といった活性化合物を含んでもよい。もちろん、いかなる単位投与形態
の調製に用いられるいかなる物質であっても、製薬上許容可能であり、使用され
る量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は徐放性製剤ま
たはデバイスに組み込まれていてもよい。

【００４０】 活性化合物はまた、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与しても
よい。活性化合物の溶液またはその塩は、水中で調製したり、任意には非毒性表
面活性剤と混合することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチ
レングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物ならびに油で調製すること
ができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調剤は微生物の増殖を防
止するために防腐剤を含む。

【００４１】 注射または注入用に適切な製薬投与形態として、無菌水溶液または分散液、あ
るいは無菌注射可能または注入可能溶液または分散液の即時調製に適合し、任意
にリポソームにカプセル化された活性成分を含む無菌粉末であってもよい。いず
れの場合も、最終的な投与形態は、製造および保存の条件下で無菌、流体および
安定していなければならない。液体担体またはビークルは、たとえば、水、エタ
ノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポ
リエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれら
の適切な混合物を含む溶剤または液体分散溶媒であり得る。たとえば、リポソー
ムの形成、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持、または表面活性剤の使
用によって適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、種々
の抗菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、
ソルビン酸、チメロサールなどによって行なうことができる。多くの場合、等張
剤、たとえば、砂糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収
を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組
成物に用いることにより、注射可能な組成物の吸収を長期間にわたり行なうこと
ができる。

【００４２】 無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を上に挙げた種々の他の成分を有す
る適切な溶剤に組み入れることによって調製され、必要に応じて、フィルター殺
菌を行なう。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方
法は、真空乾燥および凍結乾燥法であり、これらの方法により、予め殺菌濾過さ
れた溶液に存在する活性成分と付加的な望ましい成分との粉末を製造する。

【００４３】 スリンダクおよびその類似体の化合物の有用な投与量は、それらのインビトロ
活性と動物モデルでのインビボ活性とを比較することによって決定することがで
きる。マウスおよび他の動物での有効投与量をヒトに外挿する方法は当該分野で
公知である；たとえば米国特許第4,938,949号を参照。

【００４４】 以下の物質および方法を使用した下記の詳細な実施例を参照して本発明を説明
する。

【００４５】 １．患者試料 インディアナ大学組織調達研究所（Indiana University Tissu
e Procurement Laboratory）と、国立がん研究所（National Cancer Institute
）の資金援助を受けるコーパレイティブ・ヒューマン・ティシュー・ネットワー
ク（Cooperative Human Tissue Network (CHTN)）から保存された組織を入手し
た。合計２３の原発性ヒト膵臓癌検体を本研究で分析した。対応する対の正常隣
接組織を患者の１１人から得た。患者は化学療法の前歴がないことを基準にして
選択した。組織を外科的に切除して１時間以内に液体窒素中で凍結し、その後−
８０℃で保存した。検体のサブセットからパラフィン切片を調製した。本研究で
用いた全ての腫瘍検体は病理医による検査を受け、原発性膵臓腺癌に分類された
。本研究については施設内治験審査委員会（Institutional Review Board (IRB)
）の承認を得た。

【００４６】 ２．免疫ブロット 凍結した組織をRIPA溶解緩衝液（PBS、1％NP40、0.5％デ
オキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、1mM PMSF、1mM Na₃VO₄、20mM ベータ-グ
リセロリン酸、1mMフッ化ナトリウム、ペプスタチン（1 μg/ml）、アプロチニ
ン（20 μg/ml）、およびロイペプチン（1 μg/ml）で素早く均質化した。13,00
0×gで１０分間の遠心分離によって溶解物を清澄化し、次いで試料緩衝液中で煮
沸した。BCAタンパク質定量キット（ピアス社(Pierce)）を用いてタンパク質濃
度を測定した。等量の総タンパク質を10%のゲル（ノベックス社(Novex)）でSDS-
PAGEによって分解し、イモビロンＰ膜（MSI社）に移した。一次抗体COX-1（C-20
、サンタクルスバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology））、COX-2
（C20、サンタクルスバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology））、p
21^ras（pan-ras Ab-3、オンコジーンサイエンス社（Oncogene Science））、ア
クチン（広範囲のアクチンイソ型を認識するC-11、サンタクルスバイオテクノロ
ジー社（Santa Cruz Biotechnology））またはリン酸特異的Mapキナーゼ抗体（
ニューイングランドバイオラボ社（New England Biolabs））を製造業者の推奨
する通りに用いてブロットをプローブした。ECL（アマシャム社（Amersham））
によってバンドを視覚化し、濃度測定によって定量化した。COX-2の量を陽性対
照（リポ多糖（LPS）で刺激したマウスのマクロファージ細胞系Raw 264.7から調
製した3μgの細胞溶解物）の割合として表した。それぞれCOX-1およびCOX-2抗体
によるCOX-1およびCOX-2の特異的認識を、ペプチド阻害実験によって確認した（
データは示されていない）。

【００４７】 ３．免疫組織化学 アビジン−ビオチン複合体法(19)を用いてホルマリン固定
のパラフィン包埋切片５μｍに免疫化学組織染色を行なった。COX-2発現の評価
に一次ポリクローナル抗体を用いた（オックスフォードバイオメディカルリサー
チ社（Oxford Biomedical Research, Inc.）、Oxford、MI；希釈度 1:100）。3,
3'-ジアミノベンジジン（DAB）を色原体として用い、0.2%メチルグリーンを 対
比染色として用いた。陽性および陰性対照を並行して実施し、適切な結果が出た
。

【００４８】 ４．K-ras変異分析 組織を溶解緩衝液（50 mM トリス pH 8.0、100 mM EDTA
、100 mM NaCl、1% SDS、0.5 mg/ml プロテイナーゼK）で55℃で一晩インキュベ
ートすることによってゲノムDNAを調製した。RNAse（0.1 mg/ml）を添加し、37
℃で２時間インキュベーションを続けた。次いで、試料をフェノール、フェノー
ル：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。再懸濁したゲノムDNA（0.5
μg）のK-rasエクソン1をPCRによって増幅した（5'プライマー＝5'-ATGACTGAAT
ATAAACTTGT-3'（配列識別番号：1）；3'プライマー＝5'-CTCTATTGTTGGATCATATT-
3'）（配列識別番号：2）（20）。K-ras変異特異的オリゴヌクレオチド（オンコ
ジーンリサーチプロダクツ社（Oncogene Research Products））を利用してドッ
トブロットハイブリダイゼーションによりPCR増幅産物のK-rasコドン12での変異
を検出した（21）。精製したPCR増幅産物を配列決定することによりK-rasコドン
13での変異を検出した。

【００４９】 ５．統計的分析 ノンパラメトリックの符号付き順位検定により、癌検体と対
応する正常な隣接組織との間で統計的に有意なCOX-2タンパク質の増加の存在を
測定した。二元配置の分散分析（ANOVA）を用いて、COX阻害剤の存在下でのBxPC
-3細胞系とPaCa-2細胞系との細胞増殖率の平均値の差異を調べた。

【００５０】 ６．細胞系 ヒト膵臓腫瘍細胞系（AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、HPAF
-II、Hs766T、PaCa-2およびPANC-1）をアメリカンタイプ培養コレクション（Ame
rican Type Culture Collection（ATCC、Rockville、MD））から入手し、推奨さ
れる通りに培養した。ハムスターの膵臓細胞系（D27、D27/K-ras、B12/13）を上
記のように培養した（22、23）。阻害剤研究のために、BxPC-3細胞をMapキナー
ゼキナーゼ（MEK）阻害剤PD98059（40 μM）またはDMSOで１０時間処理した。溶
解物を調製し、上記のように解析した。

【００５１】 ７．細胞増殖 細胞を、DMSO、スリンダク（シグマ社（Sigma））、インドメ
タシン（シグマ社（Sigma））、またはNS-398（バイオモル社（Biomol））の存
在下で６ウエルプレートで二重に平板培養した。３日目に細胞をトリプシン処理
してトリパンブルーで染色し、血球計数器を用いて計数した。細胞数を平均する
ことによって細胞増殖を測定し、DMSO対照試料の細胞数の割合として表した。

【００５２】 ８．プロスタグランジンE₂アッセイ 細胞を１２ウエルプレートで平板培養し
た。３日目に培地を吸引し、無血清培地の15μMアラキドン酸と交換し、１時間
後酵素免疫測定法（バイオトラク（Biotrak）、アマシャム社（Amersham））に
よって製造業者の推奨する通りにPGE₂について培養上清のアッセイを行なった。
産生されたPGE₂の量をタンパク質濃度に正規化した。細胞を１２ウエルプレート
でCOX阻害剤の存在下で２４時間平板培養した後、細胞溶解して酵素免疫測定法
（Biotrak）によって製造業者の推奨する通りに定量を行なうことにより、細胞
内のPGE₂レベルを測定した。細胞内のPGE₂レベルを測定するため、アッセイの前
に細胞をアラキドン酸でプレインキュベートしなかった。

【００５３】 ９．略語 COX、シクロオキシゲナーゼ；Erk 1/2 MAP キナーゼ（Erk、MAPK）
、細胞外シグナル制御キナーゼ1および2マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ
；MEK、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ；NSAIDS、非ステロイ
ド系抗炎症薬；PGE₂ 、プロスタグランジンE₂；PMA、ホルボール 12-ミリステー
ト 13-アセテート。 実施例１ ヒト膵臓腺癌におけるCOX-2発現 原発性ヒト膵臓腺癌（n=23）および対の正常隣接組織（n=11）で免疫ブロット
分析によってCOX-2タンパク質の発現を調べた。対の正常隣接組織を有する３人
を含む６人の患者から調製した溶解物の代表的な免疫ブロットを図１に示す。各
正常検体では検出不能なレベルのCOX-2タンパク質が観察された。対照的に、膵
臓腫瘍組織のCOX-2タンパク質発現は検出不能（試料#21）から僅か／中程度（試
料#12、14、20）、高レベル（試料#9、22）までの範囲にわたった。COX-1タンパ
ク質は膵臓腫瘍および正常組織の両方で観察されたが、発現のレベルは一定せず
、腫瘍検体で一貫して高いわけではなかった（図１）。腫瘍および対応する正常
組織の両方において、同様のレベルのp21^rasおよびアクチンの発現が見られた（
図１）。

【００５４】 COX-2発現率を、濃度測定分析を行なうことにより全ての組織検体について測
定し、100％に設定した陽性対照を基準として計算した（表１および図２のグラ
フ）。本研究用の陽性対照は、リポ多糖（LPS）で刺激したマウスのマクロファ
ージ細胞系Raw 264.7であり、COX-2発現を誘導することが以前に明らかになって
いた（22）。膵臓腺癌で広範囲（0〜93％）のCOX-2発現が見られたのに対し、正
常組織ではCOX-2発現の範囲は非常に狭かった（0〜4.3％）。COX-2発現の平均値
および中央値は共に腫瘍試料の方が高く、COX-2発現は正常組織に比べて膵臓腺
癌で高くなることを示唆している。膵臓腫瘍と対応する正常組織との間のCOX-2
発現の差異は、統計的に有意であると判断された（P=0.004）（図２、図内挿入
図）。COX-2陽性および陰性試料は、それぞれCOX-2発現の割合が5％より高いま
たは低い試料と定義した。これは免疫ブロットでの視覚的検出と密接に対応して
いる。これらの基準によると、組織セットの１１の腫瘍試料のうち６試料（55％
）がCOX-2陽性であった。同様に、分析した全腫瘍検体２３のうち１３の検体（5
6％）がCOX-2陽性であり、対照的に正常組織試料（n=11）は全てCOX-2陰性であ
った。

【００５５】 膵臓腫瘍検体の免疫組織化学染色によって、COX-2発現は癌腫細胞に局限され
、腫瘍の間質画分（stromal compartment）では検出できないことが示された。 実施例２ 膵臓腫瘍および細胞系におけるCOX-2発現およびK-ras変異 COX-2発現レベルが腫瘍のK-ras変異状況と相関しているかどうかを測定するた
め、ゲノムDNAを組織検体のサブセットから単離し、PCRで増幅したK-rasエクソ
ン1産物の対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによって、コドン12でのK-r
as 変異の存在をスクリーニングした。続いて、コドン12での変異がなかった検
体について配列決定してコドン13でのK-ras変異の存在を調べた（表１）。分析
した全ての正常組織は、コドン12（GGT = Gly）およびコドン13（GGC = Gly）で
野生型であった。分析した１３の膵臓癌検体のうち、１つの検体はコドン13で変
異を有し、１０の試料はコドン12で変異しており、85％のK-ras変異頻度に相当
した。K-ras変異とCOX-2タンパク質発現の程度との間に直接的な相関関係がある
ようには思われなかった。たとえば、高レベルのCOX-2タンパク質を発現し、K-r
asに変異を持つ試料（すなわち、腫瘍試料#9、16および22）もあったが、変異し
たK-rasを有する他の試料は、ほとんどまたは全くCOX-2タンパク質を発現しなか
った（すなわち、腫瘍試料#3、17、18、19および21）。

【００５６】 同様に、公知のK-ras変異状況を有するヒト膵臓腺癌細胞系のパネルにおいて
活性化K-rasの発現とCOX-2との間には直接的な相関関係は観察されなかった（25
、26）。膵臓腫瘍細胞系で発現したCOX-2の頻度とその量の変動性との両方が原
発性膵臓腺癌における本発明者らの研究結果を反映していた。分析した８つのヒ
ト膵臓腫瘍細胞系のうちで、腫瘍形成性K-rasを発現する７つの細胞系のうちの
３つだけが検出可能なレベルのCOX-2タンパク質（Capan-1、Capan-2およびHPAF-
II）を示した（図４Ａ）。高レベルのCOX-2タンパク質は、高レベルのRas非依存
性Raf活性を示す野生型K-ras-発現細胞系BxPC-3においても観察された(26)。Map
キナーゼキナーゼ（MEK）阻害剤PD98059でBxPC-3細胞系を処理すると、活性リン
酸化Erk1/2 Mapキナーゼのレベルは著しく低下したが、合成されるCOX-2の量に
は影響せず、COX-2発現がErk1/2活性化とは無関係であることを示唆している（
図４Ｂ）。総合すると、本発明者らの結果は、Ras経路の活性化は、膵臓腫瘍細
胞におけるCOX-2のアップレギュレーションを媒介するには十分でないことを示
唆している。本発明者らはまた、３つのハムスターの膵臓細胞系でのCOX-2発現
のレベルを比較した。D27/K-rasおよびB12/13形質転換細胞系は、非悪性ハムス
ター膵臓じん埃細胞系であるD27に由来し、それぞれ腫瘍形成性K-rasでのトラン
スフェクションまたは化学発癌剤でのインビトロ処理による（22、23）。D27/K-
rasおよびB12/13細胞系はいずれも腫瘍形成性K-rasを潜伏させたが、B12/13細胞
だけがD27親系と比べて高いレベルのCOX-2タンパク質を示した（図４Ｃ）。これ
らの結果は、Ras活性化だけでは膵臓癌細胞におけるCOX-2発現をアップレギュレ
ートするのに十分ではないという本明者らの結論を確証し、化学発癌剤への暴露
後に起こるさらなる事象が必要な場合があることを示唆している。

【００５７】 ヒト膵臓癌細胞系においてCOX-2発現を誘導することができるかどうかを調べ
るため、４つの細胞系を血清飢餓化し、続いて10% FCSで種々の時間で処理した
（図４Ｄ）。COX-2-陽性のBXPC-3およびCapan-1細胞系では、COX-2は、指数関数
的に増殖する細胞の場合よりも低いレベルではあったが、血清飢餓後も依然とし
て検出可能であった。FCS刺激の後、これらの細胞系でCOX-2発現を誘導すること
ができた。対照的に、COX-2陰性細胞系のAsPC-1とPaCa-2のいずれにおいても、
血清処理によってCOX-2発現を誘導することはできなかった。これらの処理条件
下では、Erk1/2が活性化しており（未公表の観察）、Erk 1/2活性化はCOX-2陰性
膵臓腫瘍細胞でCOX-2発現を誘導するには十分でないことがここでも示されてい
る。細胞系を腫瘍促進剤であるPMAで処理した際にも同様の結果が観察された（
未公表の観察）。 実施例３ シクロオキシゲナーゼ阻害剤での膵臓腫瘍細胞系の治療 COX-2-陽性ヒト膵臓腫瘍細胞系のBxPC-3およびCOX-2-陰性細胞系のPaCa-2をCO
X阻害剤であるスリンダク、インドメタシン、またはNS-398で処理した。スリン
ダクおよびインドメタシンはCOX-1もCOX-2も共に阻害する非選択的COX阻害剤で
あり(27)、NS-398はより特異的なCOX-2の阻害剤である(28)。３日間の処理の後
、細胞増殖に対するCOX阻害剤の効果を測定した（図５）。３つの阻害剤の全て
が両方の膵臓腫瘍細胞系において用量に応じて細胞増殖を抑制することがわかっ
た。しかしながら、インドメタシンおよびNS-398は、PaCa-2細胞系よりもCOX-2
発現細胞系BxPC-3においてより高い程度まで細胞増殖を阻害することがわかった
（それぞれP=0.004およびP<0.001）。スリンダクで処理した２つの細胞系では細
胞増殖の阻害に大きな差異は観察されなかった（P=0.333）。

【００５８】 ヒト膵臓腫瘍細胞系におけるCOX-2の機能活性を評価するため、プロスタグラ
ンジンE₂（PGE₂）産生を酵素免疫測定法により測定した（図６Ａ）。PGE₂産生は
BxPC-3、Capan-1、Capan-2およびHPAF-II細胞系で増加し、これらの細胞系で発
現するCOX-2のレベルの上昇と相関していた。対照的に、COX-2陰性膵臓細胞系で
はほとんど検出できないレベルのPGE₂が検出された。PGE₂産生に対するCOX阻害
剤の効果を測定するため、COX-2陽性細胞系のBxPC-3を２種類の異なる濃度のス
リンダク（100、250 μM）、インドメタシン（10、100 μM）、またはNS-398（1
0、50 μM）で２４時間インキュベートした後、細胞内のPGE₂レベルを測定した
（図６Ｂ）。細胞内レベルは阻害剤処理に応答する変化により敏感であるはずな
ので、増殖培地に分泌されたPGE₂ではなく細胞内のPGE₂を測定した。種々のCOX
阻害剤の２種類の濃度は上記の細胞増殖アッセイ（図５）で評価され、高い方の
濃度はCOX阻害剤のIC₅₀値に相当する。低い方の濃度ではNS-398とインドメタシ
ンとが共にPGE₂産生をそれぞれ75％および95％阻害したが、対照的に、低い方の
濃度のスリンダクはPgE₂レベルに影響を与えなかった。それでもなお、高い方の
IC₅₀濃度の３つの阻害剤全てが、BxPC-3細胞系において細胞内PGE₂レベルを実質
的に、つまり86％から98％抑制した。これらのデータは、COX阻害剤は、PGE₂産
生を減少させることによってCOX-2陽性BxPC-3細胞系で少なくとも部分的にその
効果を発揮し得ることを示唆している。しかし、COX-2陰性細胞系では、COX阻害
剤の効果はCOXおよびPGE₂に依存しない機構によって媒介される場合がある。 実施例４ スリンダクとゲムシタビンとの組合せの相乗効果 ０日目にBxPC-3またはPaCa-2細胞を平板培養した。スリンダク（sul、マイク
ロM）、ゲムシタビン（Gem、nM）、または図６〜図７に示すような組合せである
化合物を翌日（１日目）に添加した。３日目に細胞をトリプシン化して手動で計
数した。それぞれの実験について２つずつ各点をつけた。100％とした培地＋溶
媒対照試料に存在する細胞の数を基準として細胞数を生存率で表した。スリンダ
ク単独の試料の生存率も示す（Gem、0 nM）。

【００５９】 これらのデータは、膵臓腫瘍細胞においてスリンダクとゲムシタビンとの組合
せの方がいずれか一方の化合物単独よりも効果的であることを示している。

【００６０】 休止細胞では、COX-2の発現は通常検出不能であるが、***促進性刺激物およ
び抗炎症剤によって急速に誘導することができる(5、6、29)。近年の研究によっ
て、COX-2発現が結腸、肺、胃、膵臓および食道を含む種々のヒト癌においてア
ップレギュレートされることが示されている(7〜11)。本研究では、対の正常膵
臓組織ではほとんど検出できないレベルであるのに対して、ヒト膵臓腫瘍では高
レベルのCOX-2タンパク質が発現し、COX-2タンパク質の発現の増加が膵臓の腫瘍
形成に相関することを示唆していることを報告する。本発明者らの結果は、膵臓
腫瘍でのCOX-2 RNAおよびタンパク質のアップレギュレーションならびに悪性上
皮細胞でのCOX-2の局在を示す最近の報告を確証している(11)。より以前の研究
では、膜リン脂質からのアラキドン酸の放出を触媒するII型ホスホリパーゼA2の
発現が正常膵臓組織に比べて膵臓管腺癌でより高くなることが示されている(30)
。さらに、ハムスターのN-ニトロソビス(2-オキソプロピル)アミン(BOP)によっ
て開始される膵臓腫瘍の発達は、２種類のプロスタグランジン合成阻害剤、フェ
ニルブタゾンおよびインドメタシンの投与によって阻害された(31)。インビボお
よびインビトロでの本発明者らの観察と合わせると、これらの研究は、COX-2の
発現の増加によるプロスタグランジン産生の増加が膵臓腫瘍形成に向けての多段
階の進行における重要な事象となる場合があることを示唆している 最近の研究によって、Ras活性化が数種のシステムにおいてCOX-2発現を誘導す
る場合があることが示唆されている。活性化された腫瘍形成性H-rasは、Rat-1繊
維芽細胞で誘導的に発現され、COX-2発現およびPGE₂産生が付随的に増加した(32
)。この特定の細胞系では、特異的マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナ
ーゼ（MEK）阻害剤であるPD98059が腫瘍形成性RasによるCOX-2誘導を抑制するこ
とがわかり、Rasに依存したCOX-2の誘導にErk1/2活性化が必要なことを示唆して
いる。同様に、高レベルのCOX-2およびプロスタグランジンE₂がRas形質転換***
上皮細胞（C57/MG）細胞で検出された(17)。腫瘍形成性K-Rasを発現するヒトの
非小細胞性肺癌（NSCLC）細胞系では、Ras変異のないNSCLC系に比べて構成的に
高発現のサイトゾルのホスホリパーゼA₂およびCOX-2により、PGE₂産生の増加が
媒介された(18)。本研究では、腫瘍形成性K-Rasの発現が、原発性ヒト膵臓腺癌
におけるCOX-2発現の増加と相関しているかという問題に取り組んだ。本発明者
らは、K-ras遺伝子のコドン12または13での変異の存在は、検出可能なレベルのC
OX-2タンパク質の発現とは相関していないことを見出した。腫瘍形成性Rasを有
する腫瘍のサブセットでCOX-2発現がないのは、膵臓癌腫でErk1/2活性がダウン
レギュレートされるからかもしれない(26)。また、高レベルの活性化Erk1/2を示
した２つの膵臓腫瘍試料（試料#4および21、データは示されていない）において
も本研究では低レベルのCOX-2しか検出されておらず、Erk1/2活性化だけではCOX
-2発現を誘導するには十分でないことを示唆している。これらの研究結果は、腫
瘍環境において、腫瘍形成性K-rasの存在が、膵臓癌でのCOX-2発現の増加に直接
的につながるわけではないことを示唆している。

【００６１】 不均質な原発性腫瘍組織に対して均質な細胞の集団の代表であるという理由で
調べた膵臓癌細胞系の分析でも、同様の結論に達した。８つの細胞系のうち７つ
においてK-ras変異が活性化したにもかかわらず、検出可能な量のCOX-2タンパク
質を発現したのは変異K-rasを有する細胞系のうちの３つだけであった。COX-2発
現はまた、高レベルの活性Rafを持つ野生型K-ras BxPC-3細胞系で高かった(26)
。COX-2は４つのCOX-2陽性細胞系で構成的に発現したが、対照的に、COX-2陰性
細胞系では血清またはPMAによりCOX-2発現を誘導することはできず、これらの細
胞ではCOX-2発現が妨害されることが示唆された。MEK阻害剤PD98059での処理後
、BxPC-3細胞系でのCOX-2発現は減少せず、この細胞系においてCOX-2誘導はRas
経路の活性化とは無関係であることが示唆された。腫瘍形成性Rasでのトランス
フェクションか化学発癌剤での処理かのいずれかによって生じた形質転換された
ハムスターの膵臓細胞系でのCOX-2タンパク質の発現差異によって、Ras活性化が
COX-2発現の誘導を媒介するには十分でないことがさらに示された。Rasに加えて
、他のシグナル経路の活性化が協働して癌細胞におけるCOX-2発現の程度を決定
する場合がある。このような経路は、リポ多糖処理されたヒト単球でCOX-2の誘
導を調節すると報告されたp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを含み得
る(33)。さらに、ヒト脈管内皮細胞では、NF-(B p65転写因子が低酸素症に応答
してCOX-2の誘導を媒介することがわかった(34)。従って、COX-2発現の誘導は多
数のシグナル経路によって媒介されるものと思われる。活性化される特異的経路
は、細胞の種類および刺激によって決まる場合がある。どのシグナル経路が膵臓
腫瘍細胞で機能するのかを特定するためにはさらなる実験が必要である。

【００６２】 COX-2陽性（BxPC-3）および陰性（PaCa-2）細胞系の両方で、COX阻害剤のスリ
ンダク、インドメタシンまたはNS-398での処理によって細胞増殖が阻害された。
しかしながら、細胞系BxPC-3は、PaCa-2細胞系に比べてインドメタシンおよびNS
-398による増殖阻害への感受性が非常に高く、これら２つの化合物は、スリンダ
クよりもCOX-２発現細胞に対して選択性が高いことを示唆している。さらに、Bx
PC-3細胞系では、IC₅₀濃度のCOX阻害剤が細胞内のPGE₂レベルを実質的に低下さ
せた。非COX-2発現細胞系では検出可能なPGE₂は存在しなかった。これらのデー
タは、COX阻害剤が、膵臓腫瘍細胞系でCOX/PGE₂依存型および非依存型経路のい
ずれによってもその阻害効果を発揮することを示唆している。NS-398は、COX-2
とは無関係にアポプトーシスを誘導することにより細胞増殖を阻害することが以
前より示されている(35)。同様に、COX活性を阻害しないスリンダクの代謝物で
あるスリンダクスルホンは、ラットモデルにおいてプロスタグランジンのレベル
を低下させることなく結腸の発癌現象を阻害することがわかった(36)。さらに、
シクロオキシゲナーゼヌル胚線維芽細胞(cyclooxygenase null embryo fibrobla
sts)では、NSAIDの形質転換ならびに抗細胞増殖および抗腫瘍作用がCOX発現とは
無関係であることが最近示された(37)。

【００６３】 種々のヒト癌での高レベルのCOX-2の検出および結腸癌でのNSAIDの化学予防的
効果によって、COX-2が発癌現象に重要な関わりを持つことが示されている。ア
ポプトーシスの阻害(13)、転移可能性の増加(12)および血管新生の促進(14)を含
む、COX-2アップレギュレーションの生物学的結果が報告されている。これらの
事象は細胞の形質転換および腫瘍の進行に寄与する場合がある。COX-2発現は、
分析した患者の膵臓腫瘍試料の55％で著しく高かったので、COX-2を化学療法の
新しい目的物として特定した。インビトロで膵臓腫瘍細胞増殖およびPGE₂産生を
阻害するCOX阻害剤の能力を示すこれらの結果は、現在は治療の選択肢がほとん
どない膵臓癌患者の治療においてNSAIDが有効な場合があることを示している。C
OX-2発現は、予後または診断の手段としても有用である。 参考文献： 1. ランディス（Landis）ら, CA Cancer J. Clin., 48, 6-29 (1998). 2. アルモグエラ（Almoguera）ら, Cell, 53, 549-54 (1988). 3. トゥーン（Thun）, M.J., Cancer Metastasis Rev., 13, 269-77 (1994).
4. ジャルディエッロ（Giardiello）ら, Eur. J. Cancer, 31A, 1071-6 (1995). 5. ドゥヴィット（DeWitt）ら, Arch. Biochem. Biophys., 306, 94-102 (1993)
. 6. ハマサキら, Arch. Biochem. Biophys., 304, 226-34 (1993). 7. エバーハート（Eberhart）ら, Gastroenterology, 107, 1183-8 (1994). 8. リスティマキ（Ristimaki）ら, Cancer Res., 57, 1276-80 (1997). 9. ツィンマーマン（Zimmermann）ら, Cancer Res., 59, 198-204 (1999). 10. ウォルフ（Wolff）ら, Cancer Res., 58, 4997-5001 (1998). 11. タッカー（Tucker）ら, Cancer Res., 59, 987-90 (1999). 12. ツジら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3336-40 (1997). 13. ツジら, Cell, 83, 493-501 (1995). 14. ツジら, Cell, 93, 705-16 (1998). 15. オシマ（Oshima）ら, Cell, 87, 803-9 (1996). 16. シェン（Sheng）ら, Gastroenterology, 113, 1883-91 (1997). 17. スッバラマイア（Subbaramaiah）ら, Cancer Res., 56, 4424-9 (1996). 18. ヒーズリー（Heasley）ら, J. Biol. Chem., 272, 14501-4 (1997). 19. スウ（Hsu）ら, J. Histochem. Cytochem., 29, 577-80 (1981). 20. スミら, Pancreas, 9, 657-61 (1994). 21. コニシら, Cancer, 69, 2293-99 (1992). 22. マンゴールド（Mangold）ら, Carcinogenesis, 15, 1979-84 (1994). 23. ステイルーク（Stayrook）ら, Anticancer Res., 18, 823-8 (1998). 24. リーゼ（Riese）ら, J. Leukoc. Biol., 55, 476-82 (1994). 25. バーロップ（Berrozpe）ら, Int. J. Cancer, 58, 185-91 (1994). 26. イップ−シュナイダ−（Yip-Schneider）ら, Int. J. Oncol., 15, 271-9 (
1999). 27. ミード（Meade）ら, J. Biol. Chem., 268, 6610-4 (1993). 28. フタキら, Prostaglandins, 47, 55-9 (1994). 29. リー（Lee）ら, J. Biol. Chem., 267, 25934-8 (1992). 30. キヨハラら, Int. J. Pancreatol., 13, 49-57 (1993). 31. タカハシら, Carcinogenesis, 11, 393-5 (1990). 32. シェン（Sheng）ら, J. Biol. Chem., 273, 22120-7 (1998). 33. ディーン（Dean）ら, J. Biol. Chem., 274, 264-9 (1999). 34. シュメッテェ（Schmedtje）ら, J. Biol. Chem., 272, 601-8 (1997). 35. エルダー（Elder）ら, Clin. Cancer Res., 3, 1679-83 (1997). 36. ピアッツァ（Piazza）ら, Cancer Res., 57, 2909-15 (1997). 37. チャン（Zhang）ら, J. Exp. Med., 190, 451-59 (1999).

【００６４】

【表１】

【００６５】 a 合計２３の膵臓腺癌を入手して表示のように番号を付けた。対の正常隣接組
織(N)もまた１１人の患者から得た。 b COX-2免疫ブロットの濃度測定分析を行なってCOX-2発現率を測定し、100％に
設定した陽性対照を基準として表した。 c パラフィン切片から調製したスライドをヘマトキシリン／エオジン染色して
視覚化し、癌の割合を測定した。 d 患者試料から単離したゲノムDNAから生成したK-rasエクソン1PCR増幅産物の
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによってコドン12でのK-ras変異状態
を測定した。K-rasエクソン1PCR増幅産物を配列決定することによってコドン13
変異を測定した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 膵臓腺癌および対の正常組織の代表的な免疫ブロットの複写写真。

【図２】 患者試料におけるCOX-2発現率を示す図。

【図３】 膵臓腫瘍細胞系におけるCOX-2の発現を示す図。３Ａは免疫ブロッ
ト分析によって検出されたヒト膵臓細胞系におけるCOX-2発現、３Ｂは細胞系BxP
C-3をMEK阻害剤PD98059またはDMSOで10時間処理した後の活性化MAPキナーゼおよ
びCOX-2の発現レベル、３Ｃは３つのハムスター膵臓細胞系でのCOX-2発現の比較
、３ＤはCOX-2発現の誘導性を示す図。

【図４】 膵臓腫瘍細胞系の増殖に対するCOX阻害剤の効果を示す図。

【図５】 プロスタグランジンE₂の産生を示す図。５Ａは膵臓腫瘍細胞系にお
けるPGE₂レベル、５ＢはPGE₂の産生に対するCOX阻害剤の効果を示す図。

【図６】 膵臓腫瘍細胞系BxPCの増殖に対するスリンダクとゲムシタビンとの
組合せの効果を表すグラフ。

【図７】 膵臓腫瘍細胞系PaCa-2の増殖に対するスリンダクとゲムシタビンと
の組合せの効果を表すグラフ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月９日（２００１．１０．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 スウィーニィー、クリストファー、ジェ イ． アメリカ合衆国、46202 インディアナ州、 インディアナポリス、ウエスト ウォルナ ット ストリート、アパートメント ビ ー． 725 (71)出願人 イプ−シュナイダー、ミッシェル、ティ ー． アメリカ合衆国、46033 インディアナ州、 カーメル、レッド オーク レーン 75 (71)出願人 クロウェル、パメラ、エル． アメリカ合衆国、46033 インディアナ州、 カーメル、チャリング クロス ロード 12715 (72)発明者 マーシャル、マーク、スティーブン アメリカ合衆国、46033 インディアナ州、 カーメル、スプルース コート 1519 (72)発明者 スウィーニィー、クリストファー、ジェ イ． アメリカ合衆国、46202 インディアナ州、 インディアナポリス、ウエスト ウォルナ ット ストリート、アパートメント ビ ー． 725 (72)発明者 イプ−シュナイダー、ミッシェル、ティ ー． アメリカ合衆国、46033 インディアナ州、 カーメル、レッド オーク レーン 75 (72)発明者 クロウェル、パメラ、エル． アメリカ合衆国、46033 インディアナ州、 カーメル、チャリング クロス ロード 12715 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 MA52 NA14 ZB261 4C086 AA01 AA02 EA17 MA01 MA04 MA52 ZB26 4C206 AA01 AA02 DA23 MA01 MA04 MA72 NA14 ZB26

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌細胞を有効量のNSAIDに接触させることを含む膵臓癌細
   胞の生存度を低下させる方法。
2. 【請求項２】 前記細胞を有効感作量のNSAIDに接触させることを含む哺
   乳類の膵臓癌細胞の化学療法剤への感受性を高める方法。
3. 【請求項３】 前記NSAIDが、COX-2阻害剤であるスリンダクまたはその類
   似体である請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記哺乳類の癌細胞がヒト癌細胞である請求項１または２
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記スリンダクまたはその類似体がヒト癌患者に投与され
   る請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記癌患者が、化学療法剤での治療中である請求項５に記
   載の方法。
7. 【請求項７】 前記化学療法剤が、ゲムシタビンである請求項６に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 前記スリンダクまたはその類似体が経口投与される請求項
   ３に記載の方法。
9. 【請求項９】 （ａ）膵臓癌細胞の第１の部分をヒト膵臓癌患者から単離
   するステップと； （ｂ）それらの生存度を測定するステップと； （ｃ）スリンダクまたはその類似体を前記患者に投与するステップと； （ｄ）膵臓癌細胞の第２の部分を前記患者から単離するステップと； （ｅ）膵臓癌細胞の前記第２の部分の生存度を測定するステップと； （ｆ）ステップ（ｅ）で測定した生存度をステップ（ｂ）で測定した生存度と
   比較するステップとを含み、ステップ（ｅ）での生存度の低下によって前記細胞
   が前記化学療法剤に感作されたことが示される、膵臓癌細胞を化学療法剤に感作
   させるCOX-2阻害剤であるスリンダクまたはその類似体の能力を評価する方法。
10. 【請求項１０】 ステップ（ｂ）および（ｅ）が前記化学療法剤の存在下で
    行なわれる請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記化学療法剤が、ゲムシタビンおよび／または5-FUであ
    る請求項１０に記載の方法。