JP2003513619A - 自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を治療するための遺伝子導入ベクター - Google Patents
自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を治療するための遺伝子導入ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アポトーシスを誘導する1つ以上のリガンドをコードする第1の核酸配列と、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列と、任意選択的に、1つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列と、任意選択的に、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列とを含む、遺伝子導入ベクターに関する。
Description
【0001】
本発明は、1つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第1の核酸配
列、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列、および、適切な場合には、1
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列、および、適切な場合
には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列を含む少なくとも1個の
核酸分子を含む遺伝子導入ベクターに関する。
列、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列、および、適切な場合には、1
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列、および、適切な場合
には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列を含む少なくとも1個の
核酸分子を含む遺伝子導入ベクターに関する。
【0002】
多発性硬化症(MS)または糖尿病(1型)等の、自己免疫疾患の発生は、体内
の健康な細胞を攻撃して破壊する、免疫細胞の無制御活性化に起因する。Tリン
パ球は、内因性MHC(主要組織適合複合体)分子と一緒に内因性タンパク質のフ
ラグメントを認識し、自己免疫疾患の病因に決定的に関与する。Tヘルパー細胞
(CD4+/CD8-)は、ペプチドとMHCクラスIIとの組合せを認識し、様々
なサイトカイン類を分泌することによって自己反応性抗体および免疫細胞の誘導
を刺激するため、免疫病因において重要な作用を有する。細胞起源またはウイル
ス起源のタンパク質、および細胞内で合成されるタンパク質は、プロテアソーム
で細胞内分解され、細胞表面上で、MHCクラスI分子と一緒に、Tリンパ球に
提示される。これらの細胞は、細胞溶解T細胞(CD4-/CD8+)により特異的
に認識され、除去される。
の健康な細胞を攻撃して破壊する、免疫細胞の無制御活性化に起因する。Tリン
パ球は、内因性MHC(主要組織適合複合体)分子と一緒に内因性タンパク質のフ
ラグメントを認識し、自己免疫疾患の病因に決定的に関与する。Tヘルパー細胞
(CD4+/CD8-)は、ペプチドとMHCクラスIIとの組合せを認識し、様々
なサイトカイン類を分泌することによって自己反応性抗体および免疫細胞の誘導
を刺激するため、免疫病因において重要な作用を有する。細胞起源またはウイル
ス起源のタンパク質、および細胞内で合成されるタンパク質は、プロテアソーム
で細胞内分解され、細胞表面上で、MHCクラスI分子と一緒に、Tリンパ球に
提示される。これらの細胞は、細胞溶解T細胞(CD4-/CD8+)により特異的
に認識され、除去される。
【0003】
通常、内因性タンパク質を認識するT細胞は、除去(クローン除去)されるか、
または不活性化される(アネルギー)。その結果が、身体に固有の細胞および構造
に対する寛容である。自己免疫疾患では、この寛容が、乱れているかまたは不十
分である。自己免疫疾患は、ウイルス感染または細菌感染によって誘導されるこ
ともある。病原体特異的タンパク質と細胞型特異的タンパク質とは類似している
ため、非感染細胞も、病原体特異的抗体またはT細胞によって攻撃されることが
推測される。その免疫応答が主として病原体特異的構造に向けれられるものであ
っても、慢性持続性ウイルス感染と関連して、炎症経過(その一部は、肝臓等の
極めて重要な器官に影響を及ぼす(肝炎))も起こる。損傷および症状は、病原
体ではなく、主として身体自身の免疫系によって引き起こされるため、このよう
な場合は、免疫病因を含むと言われる。移植された器官が拒絶されるとき、類似
した状況がみられる。この場合、ドナーの外来MHC分子と、その分子が複合体
を形成する対象である細胞タンパク質との組合せは、レシピエントのT細胞によ
り、外来であると認識される。
または不活性化される(アネルギー)。その結果が、身体に固有の細胞および構造
に対する寛容である。自己免疫疾患では、この寛容が、乱れているかまたは不十
分である。自己免疫疾患は、ウイルス感染または細菌感染によって誘導されるこ
ともある。病原体特異的タンパク質と細胞型特異的タンパク質とは類似している
ため、非感染細胞も、病原体特異的抗体またはT細胞によって攻撃されることが
推測される。その免疫応答が主として病原体特異的構造に向けれられるものであ
っても、慢性持続性ウイルス感染と関連して、炎症経過(その一部は、肝臓等の
極めて重要な器官に影響を及ぼす(肝炎))も起こる。損傷および症状は、病原
体ではなく、主として身体自身の免疫系によって引き起こされるため、このよう
な場合は、免疫病因を含むと言われる。移植された器官が拒絶されるとき、類似
した状況がみられる。この場合、ドナーの外来MHC分子と、その分子が複合体
を形成する対象である細胞タンパク質との組合せは、レシピエントのT細胞によ
り、外来であると認識される。
【0004】
現今の知識によれば、自己免疫疾患および免疫病因を含む他の疾患は、強力な
免疫抑制および/またはインターフェロン−β等の、制御作用を有するサイトカ
イン類を投与することによって、処置される。様々な製造会社によって提供され
る多数の異なる製剤を、免疫抑制剤を使用する伝統的な化学療法に使用すること
ができ、重要なことには、これらの製剤は、その適用領域およびその作用機序が
異なる。これらの物質の特に重大な不都合は、多くの且つ様々な、場合によって
は、生命を脅かす、副作用(特に、腎損傷、肝臓損傷、膵臓の炎症、貧血および
発熱)が発生することであり、これらの副作用は、多数の患者で認められている
。このような免疫系の非特異的阻害(たとえば、シクロスポリンまたはFK50
6を使用した場合)は、免疫防御の大幅な減弱、従って、感染症罹患性の増大に
つながるばかりでなく、腫瘍発生に有利である。たとえば、器官移植後、エプス
タインバーウイルス関連の腫瘍による影響を受けるリスクが何倍も高くなり、生
涯にわたって免疫抑制を必要とする。免疫治療薬(たとえば、インターフェロン
類)を使用すると副作用が少なくなるため、免疫治療薬の使用によって、伝統的
な化学療法が著しく改善される。しかし、これらの新規な免疫治療薬は特異的に
作用しないため、これらを使用しても、自己免疫疾患を治療することはできない
。
免疫抑制および/またはインターフェロン−β等の、制御作用を有するサイトカ
イン類を投与することによって、処置される。様々な製造会社によって提供され
る多数の異なる製剤を、免疫抑制剤を使用する伝統的な化学療法に使用すること
ができ、重要なことには、これらの製剤は、その適用領域およびその作用機序が
異なる。これらの物質の特に重大な不都合は、多くの且つ様々な、場合によって
は、生命を脅かす、副作用(特に、腎損傷、肝臓損傷、膵臓の炎症、貧血および
発熱)が発生することであり、これらの副作用は、多数の患者で認められている
。このような免疫系の非特異的阻害(たとえば、シクロスポリンまたはFK50
6を使用した場合)は、免疫防御の大幅な減弱、従って、感染症罹患性の増大に
つながるばかりでなく、腫瘍発生に有利である。たとえば、器官移植後、エプス
タインバーウイルス関連の腫瘍による影響を受けるリスクが何倍も高くなり、生
涯にわたって免疫抑制を必要とする。免疫治療薬(たとえば、インターフェロン
類)を使用すると副作用が少なくなるため、免疫治療薬の使用によって、伝統的
な化学療法が著しく改善される。しかし、これらの新規な免疫治療薬は特異的に
作用しないため、これらを使用しても、自己免疫疾患を治療することはできない
。
【0005】
抗原提示細胞(APC)は、T細胞応答の誘発においても、T細胞寛容の誘導に
おいても、重要な役割を果たす。T細胞の大幅な活性化および増加の誘導は、T
細胞が受けなければならない2つのシグナルに依存する。第1のシグナルは、A
PCの表面上のMHCと共に、抗原を認識するT細胞受容体によって、T細胞内
に伝えられる。第2のシグナル、すなわち、共刺激シグナルと呼ばれるものがな
ければ、T細胞は免疫低下状態になる。アネルギーは、T細胞が反応せず、増殖
しない状態を表す。APCは、さらに、Tヘルパー細胞の作用に影響を及ぼして
、それらの特性を、Th(Tヘルパー細胞)1表現型の方かまたはTh2表現型の
方のいずれかに向け、その結果、たとえば、自己免疫疾患の発生を促進すること
ができる。APCの抗原提示特性の種々の作用の組合せによって、Tヘルパー細
胞応答の概要が決まる。このような理由から、APCは、免疫応答が免疫原性的
に進行するかまたは免疫寛容原性的に進行するかを支配することができる。
おいても、重要な役割を果たす。T細胞の大幅な活性化および増加の誘導は、T
細胞が受けなければならない2つのシグナルに依存する。第1のシグナルは、A
PCの表面上のMHCと共に、抗原を認識するT細胞受容体によって、T細胞内
に伝えられる。第2のシグナル、すなわち、共刺激シグナルと呼ばれるものがな
ければ、T細胞は免疫低下状態になる。アネルギーは、T細胞が反応せず、増殖
しない状態を表す。APCは、さらに、Tヘルパー細胞の作用に影響を及ぼして
、それらの特性を、Th(Tヘルパー細胞)1表現型の方かまたはTh2表現型の
方のいずれかに向け、その結果、たとえば、自己免疫疾患の発生を促進すること
ができる。APCの抗原提示特性の種々の作用の組合せによって、Tヘルパー細
胞応答の概要が決まる。このような理由から、APCは、免疫応答が免疫原性的
に進行するかまたは免疫寛容原性的に進行するかを支配することができる。
【0006】
Fasは、細胞表面上に発現され、特異的リガンドFasLと相互に反応した
後、またはアゴニスト作用を有する抗Fas抗体を結合した後、アポトーシスを
仲介する。T細胞の「活性化誘導性細胞死」(AICD)と呼ばれるもの、すなわ
ち、細胞が活性化された後のそれらのプログラム細胞死は、同一の活性化T細胞
上で、FasおよびFasLの相互作用に続くオートクリンフィードバックによ
って誘導されるが、これは、T細胞寛容を維持するためのFas関連のアポトー
シスの重要性を示す事象である。
後、またはアゴニスト作用を有する抗Fas抗体を結合した後、アポトーシスを
仲介する。T細胞の「活性化誘導性細胞死」(AICD)と呼ばれるもの、すなわ
ち、細胞が活性化された後のそれらのプログラム細胞死は、同一の活性化T細胞
上で、FasおよびFasLの相互作用に続くオートクリンフィードバックによ
って誘導されるが、これは、T細胞寛容を維持するためのFas関連のアポトー
シスの重要性を示す事象である。
【0007】
APCのFas仲介アポトーシスは、免疫応答のダウンレギュレーションにお
いて、ある一定の役割を果たす。活性化T細胞は、増量したFasリガンドを発
現させ、この方式で、APCでアポトーシスを誘導する。一方、活性化マクロフ
ァージもFasリガンドを発現させるが、活性化マクロファージの場合、T細胞
でアポトーシスを誘導することができる。従って、HIV感染マクロファージ上
の大量のFasリガンドが、たとえば、HIV特異的CD4+T細胞の枯渇と関
係があると考えられる。
いて、ある一定の役割を果たす。活性化T細胞は、増量したFasリガンドを発
現させ、この方式で、APCでアポトーシスを誘導する。一方、活性化マクロフ
ァージもFasリガンドを発現させるが、活性化マクロファージの場合、T細胞
でアポトーシスを誘導することができる。従って、HIV感染マクロファージ上
の大量のFasリガンドが、たとえば、HIV特異的CD4+T細胞の枯渇と関
係があると考えられる。
【0008】
T細胞寛容を維持し、自己免疫疾患を回避するためにFas依存性アポトーシ
スが重要なことは、特に、それぞれ、FasおよびFasのリガンド、すなわち
、FasLに関する遺伝子に影響を与える突然変異が、それぞれ、lpr/lp
rおよびgld/gldマウスで自己免疫疾患を発生させることによって、証明
されている。gld/gldおよびlpr/lprは、それぞれ、FasLおよ
びFasに対する不活化突然変異について同型であるマウスを示す。lpr/l
prマウスでは、身体の末梢におけるT細胞のクローン除去も、身体独自の抗原
(自己抗原)および超抗原に対するT細胞寛容の維持も乱れている。これらの細胞
の欠点であるFas関連のアポトーシスを修正するために、T細胞内に人工的に
導入され、次いで、T細胞で発現されるFas遺伝子を使用することにより、l
pr/lprマウスにおける自己免疫疾患の発生を防止することができる。
スが重要なことは、特に、それぞれ、FasおよびFasのリガンド、すなわち
、FasLに関する遺伝子に影響を与える突然変異が、それぞれ、lpr/lp
rおよびgld/gldマウスで自己免疫疾患を発生させることによって、証明
されている。gld/gldおよびlpr/lprは、それぞれ、FasLおよ
びFasに対する不活化突然変異について同型であるマウスを示す。lpr/l
prマウスでは、身体の末梢におけるT細胞のクローン除去も、身体独自の抗原
(自己抗原)および超抗原に対するT細胞寛容の維持も乱れている。これらの細胞
の欠点であるFas関連のアポトーシスを修正するために、T細胞内に人工的に
導入され、次いで、T細胞で発現されるFas遺伝子を使用することにより、l
pr/lprマウスにおける自己免疫疾患の発生を防止することができる。
【0009】
Fas仲介アポトーシスは、体内の免疫特権部位の維持においても極めて重要
な役割を果たす。精巣および前眼房の免疫特権状態には、これらの器官の対応す
る柔組織細胞上で、Fasリガンドが強く発現されることが必要である。こうし
た場合、柔組織細胞上でFasリガンドが発現することによって、T細胞におけ
るアポトーシスが誘導されることにより、これらの組織は、T細胞により破壊さ
れることから保護されると推測される。前眼房におけるウイルス感染は、ウイル
スに対する全身性T細胞寛容を来たす。APCは、特権細胞に由来する特権抗原
と一緒にFasリガンドをその細胞表面上に提示し、身体の末梢領域にけるT細
胞のアポトーシスを誘導し、それによって、全身性T細胞寛容をもたらす。
な役割を果たす。精巣および前眼房の免疫特権状態には、これらの器官の対応す
る柔組織細胞上で、Fasリガンドが強く発現されることが必要である。こうし
た場合、柔組織細胞上でFasリガンドが発現することによって、T細胞におけ
るアポトーシスが誘導されることにより、これらの組織は、T細胞により破壊さ
れることから保護されると推測される。前眼房におけるウイルス感染は、ウイル
スに対する全身性T細胞寛容を来たす。APCは、特権細胞に由来する特権抗原
と一緒にFasリガンドをその細胞表面上に提示し、身体の末梢領域にけるT細
胞のアポトーシスを誘導し、それによって、全身性T細胞寛容をもたらす。
【0010】
1998年に、Zhangら(Zhang et al.(1998)Nat
Biotechnol 16:1045−1049)は、マウスモデルで、Fa
sリガンド(FasL)産生抗原提示細胞(APC)が、抗原特異的T細胞寛容を誘
導することをはじめて示した。アデノウイルスベクターに感染した結果として、
FasLのほかにもアデノウイルスタンパク質をコードした抗原提示細胞を使用
して、マウスでT細胞寛容を引き起こすことができた。このT細胞寛容は、アデ
ノウイルスタンパク質に特異的で、マウスサイトメガロウイルス感染に対する作
用はなかった。その後のアデノウイルス感染で、APC処置マウスは、アデノウ
イルス感染細胞に対する抑制されたT細胞応答と一致して、肝臓でのウイルスの
著しく長い持続を示した。さらに、Fas陰性マウスでは、寛容誘導することが
できなかったため、このT細胞寛容は、Fasリガンドの機能に依存していた。
1年後、同研究グループが、マウスモデルで同様に行った、同種抗原に対するT
細胞寛容の誘導に関する実験を発表した(Zhang et al.(1999)
J Immunol 162: 1423−1430)。さらに1年後、この研
究グループは、たとえば、Fas欠損マウスのマウスサイトメガロウイルス感染
後に発生する炎症性疾患を予防または慢性的に治療するために、FasL発現性
抗原提示細胞を使用ことができることを示す実験を発表した(Zhang et
al.(2000)J Clin Invest 105: 813−821)
。この実験的アプローチも同様に、治療は、抗原特異的(この場合、マウスサイ
トメガロウイルス特異的)T細胞寛容の誘導に基づいていた。上述の実験では、
Zhangらは、高感染率という利点を有し、遺伝子発現を確実にする、アデノ
ウイルスベクターを使用した。
Biotechnol 16:1045−1049)は、マウスモデルで、Fa
sリガンド(FasL)産生抗原提示細胞(APC)が、抗原特異的T細胞寛容を誘
導することをはじめて示した。アデノウイルスベクターに感染した結果として、
FasLのほかにもアデノウイルスタンパク質をコードした抗原提示細胞を使用
して、マウスでT細胞寛容を引き起こすことができた。このT細胞寛容は、アデ
ノウイルスタンパク質に特異的で、マウスサイトメガロウイルス感染に対する作
用はなかった。その後のアデノウイルス感染で、APC処置マウスは、アデノウ
イルス感染細胞に対する抑制されたT細胞応答と一致して、肝臓でのウイルスの
著しく長い持続を示した。さらに、Fas陰性マウスでは、寛容誘導することが
できなかったため、このT細胞寛容は、Fasリガンドの機能に依存していた。
1年後、同研究グループが、マウスモデルで同様に行った、同種抗原に対するT
細胞寛容の誘導に関する実験を発表した(Zhang et al.(1999)
J Immunol 162: 1423−1430)。さらに1年後、この研
究グループは、たとえば、Fas欠損マウスのマウスサイトメガロウイルス感染
後に発生する炎症性疾患を予防または慢性的に治療するために、FasL発現性
抗原提示細胞を使用ことができることを示す実験を発表した(Zhang et
al.(2000)J Clin Invest 105: 813−821)
。この実験的アプローチも同様に、治療は、抗原特異的(この場合、マウスサイ
トメガロウイルス特異的)T細胞寛容の誘導に基づいていた。上述の実験では、
Zhangらは、高感染率という利点を有し、遺伝子発現を確実にする、アデノ
ウイルスベクターを使用した。
【0011】
しかし、アデノウイルスベクターは、ヒトで正確に使用するには、非常に重大
な不都合を持っている。その第1は、抗原性ウイルスタンパク質の発現であり、
これが、アデノウイルスベクターを使用した遺伝子療法アプローチを今まで妨害
してきた。アデノウイルスベクターは、調節タンパク質および構造タンパク質を
発現させるため、形質導入細胞は免疫系により認識され、故意に発現させた抗原
と無関係に、除去される。この反応を避けるために、アデノウイルスタンパク質
を発現する適切なFasL陽性APCを使用して、実験に記載のマウスを前もっ
てアデノウイルスタンパク質に寛容にしておいた。潜在的ウイルス病原体に対し
て免疫系を寛容にするための対応するアプローチは、ヒトには適さない。
な不都合を持っている。その第1は、抗原性ウイルスタンパク質の発現であり、
これが、アデノウイルスベクターを使用した遺伝子療法アプローチを今まで妨害
してきた。アデノウイルスベクターは、調節タンパク質および構造タンパク質を
発現させるため、形質導入細胞は免疫系により認識され、故意に発現させた抗原
と無関係に、除去される。この反応を避けるために、アデノウイルスタンパク質
を発現する適切なFasL陽性APCを使用して、実験に記載のマウスを前もっ
てアデノウイルスタンパク質に寛容にしておいた。潜在的ウイルス病原体に対し
て免疫系を寛容にするための対応するアプローチは、ヒトには適さない。
【0012】
人工的に発現させたFasL分子と、APCの表面上の対応するアポトーシス
受容体との相互作用によるアポトーシスのオートクリン誘導の問題は、上述の実
験では無視された。Zhangらの実験(Zhang et al.(1998)
Nat Biotechnol 16: 1045−1049;Zhang e
t al.(1999)J Immunoll 162: 1423−1430;
Zhang et al.(2000)J Clin Invest 105:8
13−821)では、Fas欠損APCに、Fasリガンドを発現させるベクタ
ーを感染させた。能率的な治療的利用のためには、変化した抗原提示細胞を、ア
ポトーシスのオートクリン刺激から保護すること、同時に、制御できない不滅化
または腫瘍細胞に向かう細胞の形質転換を回避できることが絶対必要である。
受容体との相互作用によるアポトーシスのオートクリン誘導の問題は、上述の実
験では無視された。Zhangらの実験(Zhang et al.(1998)
Nat Biotechnol 16: 1045−1049;Zhang e
t al.(1999)J Immunoll 162: 1423−1430;
Zhang et al.(2000)J Clin Invest 105:8
13−821)では、Fas欠損APCに、Fasリガンドを発現させるベクタ
ーを感染させた。能率的な治療的利用のためには、変化した抗原提示細胞を、ア
ポトーシスのオートクリン刺激から保護すること、同時に、制御できない不滅化
または腫瘍細胞に向かう細胞の形質転換を回避できることが絶対必要である。
【0013】
さらに、先の実験は全て、アポトーシス誘導性リガンドが同時に発現しない、
T細胞寛容が誘導される対象である抗原の発現に起因する免疫系の意図しない刺
激という問題を無視している。
T細胞寛容が誘導される対象である抗原の発現に起因する免疫系の意図しない刺
激という問題を無視している。
【0014】
従って、本発明の目的は、自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患を予防また
は治療する手段を提供することである。
は治療する手段を提供することである。
【0015】
この目的は、特許請求の範囲に明示された主題事項によって実現される。
【0016】
本明細書で使用された表現「ベクター」または「遺伝子導入ベクター」は、天
然のまたは人為的に作られた、細胞における核酸の取込み、複製、発現または導
入用の生物および構築物を意味する。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘルペスウイルス等
のウイルスが、ベクターの例である。リステリア菌、赤痢菌またはサルモネラ菌
等の細菌も、ベクターの例である。リポソームまたは裸のDNA、たとえば、細
菌プラスミド、ウイルス由来のプラスミド、ファジミド、コスミド、バクテリオ
ファージまたは人為的に作製された核酸、たとえば、人工染色体は、ウイルスの
さらなる例である。
然のまたは人為的に作られた、細胞における核酸の取込み、複製、発現または導
入用の生物および構築物を意味する。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘルペスウイルス等
のウイルスが、ベクターの例である。リステリア菌、赤痢菌またはサルモネラ菌
等の細菌も、ベクターの例である。リポソームまたは裸のDNA、たとえば、細
菌プラスミド、ウイルス由来のプラスミド、ファジミド、コスミド、バクテリオ
ファージまたは人為的に作製された核酸、たとえば、人工染色体は、ウイルスの
さらなる例である。
【0017】
本明細で使用される表現「アポトーシス受容体」は、細胞の細胞質膜内にあっ
て、特異的リガンドとの相互作用および特異的リガンドによる活性化に続く細胞
でのアポトーシスを開始するポリペプチドを意味する。アポトーシス受容体の例
は、細胞質死ドメイン、たとえばCD95/Fas/Apo1、TRAIL−R
1、TRAIL−R2およびApo3を特徴とする腫瘍壊死因子受容体のサブフ
ァミリーに属するポリペプチドである。
て、特異的リガンドとの相互作用および特異的リガンドによる活性化に続く細胞
でのアポトーシスを開始するポリペプチドを意味する。アポトーシス受容体の例
は、細胞質死ドメイン、たとえばCD95/Fas/Apo1、TRAIL−R
1、TRAIL−R2およびApo3を特徴とする腫瘍壊死因子受容体のサブフ
ァミリーに属するポリペプチドである。
【0018】
本明細書で使用される表現「リガンド」または「アポトーシス誘導性リガンド
」または「アポトーシスリガンド」は、アポトーシス受容体と相互に作用するこ
とができる膜在ポリペプチドを意味する。リガンドがアポトーシス受容体に結合
することによって、受容体が活性化され、受容体を有する細胞におけるアポトー
シスを誘導する。アポトーシスリガンドの例は、CD95L/FasL/Apo
1L、TRAILおよびApo3Lである。
」または「アポトーシスリガンド」は、アポトーシス受容体と相互に作用するこ
とができる膜在ポリペプチドを意味する。リガンドがアポトーシス受容体に結合
することによって、受容体が活性化され、受容体を有する細胞におけるアポトー
シスを誘導する。アポトーシスリガンドの例は、CD95L/FasL/Apo
1L、TRAILおよびApo3Lである。
【0019】
本明細で使用される表現「抗アポトーシス分子」は、細胞におけるアポトーシ
スを阻止するポリペプチドを意味する。こうしたポリペプチドは、細胞起源のも
のであってもウイルス起源のものであってもよい。抗アポトーシス分子はさらに
、アポトーシス誘導性ポリペプチドをコードする、核酸に相補的な核酸を含む、
核酸分子を意味する。
スを阻止するポリペプチドを意味する。こうしたポリペプチドは、細胞起源のも
のであってもウイルス起源のものであってもよい。抗アポトーシス分子はさらに
、アポトーシス誘導性ポリペプチドをコードする、核酸に相補的な核酸を含む、
核酸分子を意味する。
【0020】
本明細で使用される表現「抗原」は、全タンパク質あるいは1個または数個の
T細胞エピトープを含むタンパク質の一部を含むポリペプチドを意味し、細胞に
よるタンパク質分解処理後、MHC分子によって提示され、T細胞受容体によっ
て結合される。
T細胞エピトープを含むタンパク質の一部を含むポリペプチドを意味し、細胞に
よるタンパク質分解処理後、MHC分子によって提示され、T細胞受容体によっ
て結合される。
【0021】
本明細で使用される表現「自殺酵素」は、僅かに有毒であるに過ぎないかまた
は有毒ではない物質を有毒物質に転換するか、あるいは細胞内で酵素によって使
用されるか転換されることができる方法でそれらを変える、ポリペプチドを意味
する。
は有毒ではない物質を有毒物質に転換するか、あるいは細胞内で酵素によって使
用されるか転換されることができる方法でそれらを変える、ポリペプチドを意味
する。
【0022】
本明細で使用される表現「IRES」は、5’キャップ構造等の細胞調節配列
と関係無く、機能的に活性なリボソームが結合できるようにするウイルスの核酸
配列を意味する。IRES配列は、強い二次構造を特徴とする。IRES配列は
、たとえば、ピコルナウイルスのIRES配列に記載されている。
と関係無く、機能的に活性なリボソームが結合できるようにするウイルスの核酸
配列を意味する。IRES配列は、強い二次構造を特徴とする。IRES配列は
、たとえば、ピコルナウイルスのIRES配列に記載されている。
【0023】
本発明の目的は、自己免疫疾患および免疫病因を含む疾患の症例で実現すべき
選択的抗原特異的免疫療法を可能にすることである。細胞タンパク質または病原
体特異的タンパク質に対して明示された特異性を有する個々のT細胞クローンを
除去し、それによって、抗原に対する免疫学的寛容を発生または回復させる。
選択的抗原特異的免疫療法を可能にすることである。細胞タンパク質または病原
体特異的タンパク質に対して明示された特異性を有する個々のT細胞クローンを
除去し、それによって、抗原に対する免疫学的寛容を発生または回復させる。
【0024】
本発明は、1つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第1の核酸配
列を含む少なくとも1個の核酸分子、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配
列、および、適切な場合には、1つ以上の抗アポトーシス分子コードする第3の
核酸配列、および、適切な場合には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核
酸配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。最初の3つ、または4つ全部、また
は最初の2つと第4の、核酸配列を含む核酸分子を含む遺伝子導入ベクターが好
ましい。2つの核酸分子を含み、第1および第2の核酸配列が第1の核酸分子上
に存在し、第3および第4の核酸配列が第2の核酸分子上に存在する、遺伝子導
入ベクターがさらに好ましい。第2の核酸配列の発現が、第1の核酸配列の発現
に依存するように、第1の核酸配列と第2の核酸配列が互いに機能的に連結され
ており、及び/又は第4の核酸配列の発現が第3の核酸配列の発現に依存するよ
うに、第3の核酸配列と第4の核酸配列が互いに連結されている、遺伝子導入ベ
クターが特に好ましい。
列を含む少なくとも1個の核酸分子、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配
列、および、適切な場合には、1つ以上の抗アポトーシス分子コードする第3の
核酸配列、および、適切な場合には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核
酸配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。最初の3つ、または4つ全部、また
は最初の2つと第4の、核酸配列を含む核酸分子を含む遺伝子導入ベクターが好
ましい。2つの核酸分子を含み、第1および第2の核酸配列が第1の核酸分子上
に存在し、第3および第4の核酸配列が第2の核酸分子上に存在する、遺伝子導
入ベクターがさらに好ましい。第2の核酸配列の発現が、第1の核酸配列の発現
に依存するように、第1の核酸配列と第2の核酸配列が互いに機能的に連結され
ており、及び/又は第4の核酸配列の発現が第3の核酸配列の発現に依存するよ
うに、第3の核酸配列と第4の核酸配列が互いに連結されている、遺伝子導入ベ
クターが特に好ましい。
【0025】
本発明による遺伝子導入ベクターは、自己免疫疾患および免疫病因に起因する
他の疾患の治療に使用することができる。免疫病因は、細胞性免疫機構または体
液性免疫機構、すなわち、リンパ球または抗体または補体仲介機構によって引き
起こされる、細胞、組織または器官への損傷を意味する。本発明によるベクター
を使用して、ex vivoで、身体の細胞を組換え的に変えることができる。
これらの遺伝子療法用ベクターを使用することにより、修飾すべき細胞は、細胞
を、自己免疫疾患および免疫病因に起因する他の疾患の治療に適応させる多数の
新しい特性を獲得する。本発明の意味の範囲内で、適応するは、修飾された細胞
が、病気の発生に関与する免疫細胞を誘引し、これらの細胞を特異的に認識し、
アポトーシスを誘導することによってそれらを破壊できることを意味する。
他の疾患の治療に使用することができる。免疫病因は、細胞性免疫機構または体
液性免疫機構、すなわち、リンパ球または抗体または補体仲介機構によって引き
起こされる、細胞、組織または器官への損傷を意味する。本発明によるベクター
を使用して、ex vivoで、身体の細胞を組換え的に変えることができる。
これらの遺伝子療法用ベクターを使用することにより、修飾すべき細胞は、細胞
を、自己免疫疾患および免疫病因に起因する他の疾患の治療に適応させる多数の
新しい特性を獲得する。本発明の意味の範囲内で、適応するは、修飾された細胞
が、病気の発生に関与する免疫細胞を誘引し、これらの細胞を特異的に認識し、
アポトーシスを誘導することによってそれらを破壊できることを意味する。
【0026】
本発明によるベクターは、現在利用することができ、且つ多数の異なる遺伝子
または機能領域を担持して、対応する遺伝子産物を真核細胞で発現させることが
できる多数のベクター系に基礎を置くことができる。ウイルス系に基づくベクタ
ーの場合、パッケージング細胞系または他のin vitro系を使用して、核
酸配列をこれらのベクター内にパッケージする。次いで、このベクターを能動的
に細胞内に貫入させてもよく、または、これらの細胞によって取り込まれてもよ
い。非ウイルスベクターは、物理学的機構および生物学的機構に基づく様々な導
入方法によって標的細胞内に導入される。本発明によるベクターの重要な特性は
、ベクター系によって修飾される細胞の機能を妨害しかねない、ウイルスタンパ
ク質またはベクター系と関係がある他のタンパク質が、修飾された細胞内で全く
合成されないことである。本発明の意味の範囲内で、ウイルスタンパク質または
他のタンパク質の発現は、これらのタンパク質を産生する修飾された細胞が免疫
細胞によって認識され、破壊される場合、有害であろう。本発明の意味の範囲内
で、この認識は、それによって、ウイルス性病原体または細菌性病原体の認識お
よび破壊に際して、免疫系の正常な機能を損なう場合、有害であり、通常、免疫
系によって認識される細胞または他の細胞または病原体を変性させるであろう。
この認識は、免疫病因となる免疫細胞の破壊に際して、細胞の有効性を制限する
場合、やはり有害であろう。
または機能領域を担持して、対応する遺伝子産物を真核細胞で発現させることが
できる多数のベクター系に基礎を置くことができる。ウイルス系に基づくベクタ
ーの場合、パッケージング細胞系または他のin vitro系を使用して、核
酸配列をこれらのベクター内にパッケージする。次いで、このベクターを能動的
に細胞内に貫入させてもよく、または、これらの細胞によって取り込まれてもよ
い。非ウイルスベクターは、物理学的機構および生物学的機構に基づく様々な導
入方法によって標的細胞内に導入される。本発明によるベクターの重要な特性は
、ベクター系によって修飾される細胞の機能を妨害しかねない、ウイルスタンパ
ク質またはベクター系と関係がある他のタンパク質が、修飾された細胞内で全く
合成されないことである。本発明の意味の範囲内で、ウイルスタンパク質または
他のタンパク質の発現は、これらのタンパク質を産生する修飾された細胞が免疫
細胞によって認識され、破壊される場合、有害であろう。本発明の意味の範囲内
で、この認識は、それによって、ウイルス性病原体または細菌性病原体の認識お
よび破壊に際して、免疫系の正常な機能を損なう場合、有害であり、通常、免疫
系によって認識される細胞または他の細胞または病原体を変性させるであろう。
この認識は、免疫病因となる免疫細胞の破壊に際して、細胞の有効性を制限する
場合、やはり有害であろう。
【0027】
本発明によるベクターであって、核酸配列の本発明による組合せを含むベクタ
ーによって修飾された細胞は、免疫病因となる免疫細胞によって認識される抗原
を発現する。こうした免疫病因となる細胞は、(内因性)抗原を特異的に認識し、
これらの抗原および抗原発現細胞に対する免疫反応を調整するため、明示された
疾患の病原性に特別の役割を果たす。本発明によるベクターと一緒に細胞内に導
入される抗原は、特定の疾患に特異的であってもよく、冒された器官または組織
あるいは冒された細胞型に特異的であってもよい。本発明によるベクターは、さ
らに、アポトーシス誘導性リガンドをコードする。これらのアポトーシス誘導性
リガンドは、抗原を認識する、免疫病因となる免疫細胞における自然細胞死を誘
導する。本発明によるベクターは、1つ以上の異なるアポトーシス誘導性リガン
ドをコードしてもよい。修飾された細胞は、人為的に合成された抗原性エピトー
プを認識する、従って、修飾された細胞と物理的に接触する、免疫細胞を認識し
て破壊するに過ぎない。
ーによって修飾された細胞は、免疫病因となる免疫細胞によって認識される抗原
を発現する。こうした免疫病因となる細胞は、(内因性)抗原を特異的に認識し、
これらの抗原および抗原発現細胞に対する免疫反応を調整するため、明示された
疾患の病原性に特別の役割を果たす。本発明によるベクターと一緒に細胞内に導
入される抗原は、特定の疾患に特異的であってもよく、冒された器官または組織
あるいは冒された細胞型に特異的であってもよい。本発明によるベクターは、さ
らに、アポトーシス誘導性リガンドをコードする。これらのアポトーシス誘導性
リガンドは、抗原を認識する、免疫病因となる免疫細胞における自然細胞死を誘
導する。本発明によるベクターは、1つ以上の異なるアポトーシス誘導性リガン
ドをコードしてもよい。修飾された細胞は、人為的に合成された抗原性エピトー
プを認識する、従って、修飾された細胞と物理的に接触する、免疫細胞を認識し
て破壊するに過ぎない。
【0028】
アポトーシス(アポトーシス誘導性リガンド)の誘導に関与する核酸配列および
抗原性ポリペプチド(抗原)をコードする核酸配列を、アポトーシス誘導性リガン
ドが発現されなければ抗原が発現できないように、機能的に結合させるかまたは
転写レベルで互いに連結させることができる。こうすることによって、疾患を引
き起こす免疫細胞は、変化した細胞を認識することができなくなり、また、これ
らの後者の細胞でアポトーシスが同時に誘導されることなく免疫細胞を刺激する
ことができなくなるため、本発明によるベクターの安全性が大きく向上する。
抗原性ポリペプチド(抗原)をコードする核酸配列を、アポトーシス誘導性リガン
ドが発現されなければ抗原が発現できないように、機能的に結合させるかまたは
転写レベルで互いに連結させることができる。こうすることによって、疾患を引
き起こす免疫細胞は、変化した細胞を認識することができなくなり、また、これ
らの後者の細胞でアポトーシスが同時に誘導されることなく免疫細胞を刺激する
ことができなくなるため、本発明によるベクターの安全性が大きく向上する。
【0029】
本発明によるベクターにおける核酸配列は、本発明によるベクターによって変
化した細胞が、それ自身がアポトーシスを開始し、この方法で、それ自身を破壊
するのをオートクリン機構によって妨げる遺伝子または機能領域もさらに担持し
てもよい。これによって、ベクターおよび変化した細胞の効果が増大する。この
遺伝子または機能領域は、ポトーシス誘導因子の活性のレギュレーターをコード
するか、またはそれらが発現されるのを妨げるかのいずれかである。
化した細胞が、それ自身がアポトーシスを開始し、この方法で、それ自身を破壊
するのをオートクリン機構によって妨げる遺伝子または機能領域もさらに担持し
てもよい。これによって、ベクターおよび変化した細胞の効果が増大する。この
遺伝子または機能領域は、ポトーシス誘導因子の活性のレギュレーターをコード
するか、またはそれらが発現されるのを妨げるかのいずれかである。
【0030】
適切な場合には、本発明によるベクターは、必要に応じて、体内に再注入され
た後、組換え的に修飾された細胞の除去を可能にするポリペプチドをコードする
核酸配列(自殺遺伝子)をさらに含むことができる。抗アポトーシス分子および自
殺酵素をコードする核酸配列の場合、抗原およびアポトーシス誘導性リガンドを
コードする核酸配列の機能的結合と類似した機能的結合が存在してもよい。この
結合は、抗アポトーシス分子のために、もはや身体から除去することができない
細胞を、自殺酵素の作用によって確実に除去することができる。
た後、組換え的に修飾された細胞の除去を可能にするポリペプチドをコードする
核酸配列(自殺遺伝子)をさらに含むことができる。抗アポトーシス分子および自
殺酵素をコードする核酸配列の場合、抗原およびアポトーシス誘導性リガンドを
コードする核酸配列の機能的結合と類似した機能的結合が存在してもよい。この
結合は、抗アポトーシス分子のために、もはや身体から除去することができない
細胞を、自殺酵素の作用によって確実に除去することができる。
【0031】
抗アポトーシス分子および自殺酵素に関する核酸配列は、アポトーシス誘導性
リガンドおよび抗原に関する核酸配列がある核酸分子と同一の核酸分子上にあっ
てもよく、異なる核酸分子上にあってもよい。
リガンドおよび抗原に関する核酸配列がある核酸分子と同一の核酸分子上にあっ
てもよく、異なる核酸分子上にあってもよい。
【0032】
本発明はさらに、治療薬としての遺伝子導入ベクターに関する。本発明はさら
に、自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェー
グレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、ベ
ヒテレフ(Bechterew)病等の脊椎関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎
、セリアック病、自己免疫肝炎、I型糖尿病、副腎機能不全、甲状腺炎、乾癬、
皮膚炎、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、脱毛症、多発性硬化症および重症筋無力
症を予防または治療するため、免疫病因に起因する炎症経過、たとえばウイルス
感染または細菌感染に続く慢性炎症、たとえば、B型肝炎ウイルス感染またはC
型肝炎ウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染に続く脳炎を慢
性的に予防または治療するため、および移植拒絶を予防または治療するための、
治療用組成物を製造するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
に、自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェー
グレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、ベ
ヒテレフ(Bechterew)病等の脊椎関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎
、セリアック病、自己免疫肝炎、I型糖尿病、副腎機能不全、甲状腺炎、乾癬、
皮膚炎、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、脱毛症、多発性硬化症および重症筋無力
症を予防または治療するため、免疫病因に起因する炎症経過、たとえばウイルス
感染または細菌感染に続く慢性炎症、たとえば、B型肝炎ウイルス感染またはC
型肝炎ウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染に続く脳炎を慢
性的に予防または治療するため、および移植拒絶を予防または治療するための、
治療用組成物を製造するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
【0033】
本発明はさらに、真核細胞、特に動物または哺乳類細胞、特にヒト細胞をex
vivo修飾するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
vivo修飾するための遺伝子導入ベクターの使用に関する。
【0034】
レトロウイルスベクター
遺伝子導入ベクターは、レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスに基
づくベクターであることが好ましい。これらは、核酸を細胞内に導入するのに効
果的なベクターを開発するのに適した基盤を構成する。望ましい外来遺伝子を適
当なベクター内に挿入し、レトロウイルス粒子内にパッケージすることは、既に
詳細に記述されている、到達水準である方法を使用して、実行することができる
。その後、産生される組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex v
ivoで、望ましい標的細胞と共にインキュベートする。これまで、多数の異な
るレトロウイルス系について説明してきたが、これらの系は、本発明による核酸
の組合せを導入するのに適している。従って、レトロウイルス遺伝子導入ベクタ
ー、特に、レンチウイルス遺伝子導入ベクターを、本発明による核酸配列の組合
せを真核細胞に導入するのに使用することが好ましい。
づくベクターであることが好ましい。これらは、核酸を細胞内に導入するのに効
果的なベクターを開発するのに適した基盤を構成する。望ましい外来遺伝子を適
当なベクター内に挿入し、レトロウイルス粒子内にパッケージすることは、既に
詳細に記述されている、到達水準である方法を使用して、実行することができる
。その後、産生される組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex v
ivoで、望ましい標的細胞と共にインキュベートする。これまで、多数の異な
るレトロウイルス系について説明してきたが、これらの系は、本発明による核酸
の組合せを導入するのに適している。従って、レトロウイルス遺伝子導入ベクタ
ー、特に、レンチウイルス遺伝子導入ベクターを、本発明による核酸配列の組合
せを真核細胞に導入するのに使用することが好ましい。
【0035】
本発明によるレトロウイルス遺伝子導入ベクターは、様々なレトロウイルス、
たとえば、B型、C型またはD型レトロウイルスおよびスプマウイルスおよびレ
ンチウイルス等を基礎とすることができる。
たとえば、B型、C型またはD型レトロウイルスおよびスプマウイルスおよびレ
ンチウイルス等を基礎とすることができる。
【0036】
適当なレトロウイルスファミリーの代表例は、「RNA腫瘍ウイルス」の2〜
7ページに記載されているもの、多数の非相同栄養レトロウイルス、たとえば、
NZB−X1、NZB−X2およびNZB9−1、ならびに多栄養(polyt
rophic)レトロウイルス、たとえば、MCFおよびMCF−MLVなどで
ある。これらのレトロウイルスは、ストックまたはコレクション、たとえば、A
merican Type Culture Collection ("ATC
C",Manassas,Va.)から得ることができ、あるいは、一般に行われ
ている公表された分子生物学的技法を使用して、生物材料から単離することもで
きる。
7ページに記載されているもの、多数の非相同栄養レトロウイルス、たとえば、
NZB−X1、NZB−X2およびNZB9−1、ならびに多栄養(polyt
rophic)レトロウイルス、たとえば、MCFおよびMCF−MLVなどで
ある。これらのレトロウイルスは、ストックまたはコレクション、たとえば、A
merican Type Culture Collection ("ATC
C",Manassas,Va.)から得ることができ、あるいは、一般に行われ
ている公表された分子生物学的技法を使用して、生物材料から単離することもで
きる。
【0037】
レトロウイルス遺伝子導入ベクターを作製するのに特に適したレトロウイルス
は、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク
細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス
、ネコ白血病ウイルス、細網内皮ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスの群からの
代表を含む。マウス白血病ウイルス、たとえば、代表的な4070Aおよび15
04A、アベルソン(Abelson;ATCC No.VR−999)、フレ
ンド(Friend;ATCC No.VR−245)、グラフィ(Graff
i)、グロス(Gross;ATCC No.590)、クリステン(Kirs
ten)、ハーベー(Harvey)肉腫ウイルスおよびラウシャー(Raus
cher;ATCC No.VR−998)、およびモロニーマウス白血病ウイ
ルス(ATCC No.VR−190)も、特に適する。ブラティスラバ(Bra
tislava)、ブライアン(Bryan)高力価(たとえば、ATCC N
o.VR−334、VR−657、VR−726、VR−659およびVR−7
28)、ブライアン標準、カー・ジルバ(Carr−Zilber)、エンゲル
ブレス・ホーム(Engelbreth−Holm)、ハリス(Harris)
、プラハ(Prague;たとえば、ATCC No.VR−772および45
033)およびスミット・ラピン(Schmidt−Ruppin;たとえば、
ATCC No.VR−724、VR−725およびVR−354)を含むラウ
ス肉腫ウイルスも、やはり特に適する。
は、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク
細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス
、ネコ白血病ウイルス、細網内皮ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスの群からの
代表を含む。マウス白血病ウイルス、たとえば、代表的な4070Aおよび15
04A、アベルソン(Abelson;ATCC No.VR−999)、フレ
ンド(Friend;ATCC No.VR−245)、グラフィ(Graff
i)、グロス(Gross;ATCC No.590)、クリステン(Kirs
ten)、ハーベー(Harvey)肉腫ウイルスおよびラウシャー(Raus
cher;ATCC No.VR−998)、およびモロニーマウス白血病ウイ
ルス(ATCC No.VR−190)も、特に適する。ブラティスラバ(Bra
tislava)、ブライアン(Bryan)高力価(たとえば、ATCC N
o.VR−334、VR−657、VR−726、VR−659およびVR−7
28)、ブライアン標準、カー・ジルバ(Carr−Zilber)、エンゲル
ブレス・ホーム(Engelbreth−Holm)、ハリス(Harris)
、プラハ(Prague;たとえば、ATCC No.VR−772および45
033)およびスミット・ラピン(Schmidt−Ruppin;たとえば、
ATCC No.VR−724、VR−725およびVR−354)を含むラウ
ス肉腫ウイルスも、やはり特に適する。
【0038】
本発明に記載の、ある特定の用途の場合、レトロウイルス遺伝子導入ベクター
における核酸分子の成分は、列挙されているもの以外のレトロウイルスに由来し
てもよい。たとえば、レトロウイルスベクター長末端反復(LTR)領域は、マウ
ス肉腫ウイルスから誘導でき、tRNA結合部位は、ラウス肉腫ウイルスから誘
導でき、パッケージングシグナルは、マウス白血病ウイルスから誘導でき、第2
鎖DNA合成のための起点は、トリ白血病ウイルスから誘導することができる。
における核酸分子の成分は、列挙されているもの以外のレトロウイルスに由来し
てもよい。たとえば、レトロウイルスベクター長末端反復(LTR)領域は、マウ
ス肉腫ウイルスから誘導でき、tRNA結合部位は、ラウス肉腫ウイルスから誘
導でき、パッケージングシグナルは、マウス白血病ウイルスから誘導でき、第2
鎖DNA合成のための起点は、トリ白血病ウイルスから誘導することができる。
【0039】
さらに、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、1つ以上
の非相同配列、第2鎖DNA合成の起点、および3’LTRを含む核酸分子を、
Gag/PolまたはEnvをコードする配列を含まない核酸分子と一緒に、レ
トロウイルスベクターに使用することができる。LTRは3つのエレメント、す
なわち、U5領域、R領域およびU3領域を含む。これらのエレメントは、レト
ロウイルスの生物学的活性に重要な多数のシグナル、たとえばU3領域に位置す
るプロモーターエレメントおよびエンハンサエレメントを含む。プロウイルス内
のLTRは、ゲノム末端における独特の配列重複を用いて、明白に特性決定する
ことができる本発明で使用されることが好ましい5’LTRは、5’プロモータ
ーエレメント、およびベクター核酸を逆転写して、標的細胞のゲノムに組み込む
のを可能にする最小限のLTR配列を含む。3’LTR領域は、ポリアデニル化
シグナル、およびベクター核酸を逆転写して標的細胞のゲノムに組み込むのに必
要なLTR配列を含む。
の非相同配列、第2鎖DNA合成の起点、および3’LTRを含む核酸分子を、
Gag/PolまたはEnvをコードする配列を含まない核酸分子と一緒に、レ
トロウイルスベクターに使用することができる。LTRは3つのエレメント、す
なわち、U5領域、R領域およびU3領域を含む。これらのエレメントは、レト
ロウイルスの生物学的活性に重要な多数のシグナル、たとえばU3領域に位置す
るプロモーターエレメントおよびエンハンサエレメントを含む。プロウイルス内
のLTRは、ゲノム末端における独特の配列重複を用いて、明白に特性決定する
ことができる本発明で使用されることが好ましい5’LTRは、5’プロモータ
ーエレメント、およびベクター核酸を逆転写して、標的細胞のゲノムに組み込む
のを可能にする最小限のLTR配列を含む。3’LTR領域は、ポリアデニル化
シグナル、およびベクター核酸を逆転写して標的細胞のゲノムに組み込むのに必
要なLTR配列を含む。
【0040】
tRNA結合部位および第2鎖DNA合成起点は、生物学的活性に必要であり
、これらの成分の同定は、到達水準である。たとえば、レトロウイルスtRNA
は、ワトソンクリック塩基対形成によって、tRNA結合部位に結合し、レトロ
ウイルスゲノムと一緒にウイルス粒子内にパッケージされる。次いで、このtR
NAは、逆転写酵素により、DNA合成用のプライマーとして使用される。tR
NA結合配列は、5’LTRのすぐ下流に位置し、その位置によって容易に同定
することができる。同様にし、第2鎖DNA合成起点は、レトロウイルスの第2
鎖DNA合成に非常に重要である。ポリウリジン領域と呼ばれるこの領域は、3
’LTRのすぐ上流に位置する。
、これらの成分の同定は、到達水準である。たとえば、レトロウイルスtRNA
は、ワトソンクリック塩基対形成によって、tRNA結合部位に結合し、レトロ
ウイルスゲノムと一緒にウイルス粒子内にパッケージされる。次いで、このtR
NAは、逆転写酵素により、DNA合成用のプライマーとして使用される。tR
NA結合配列は、5’LTRのすぐ下流に位置し、その位置によって容易に同定
することができる。同様にし、第2鎖DNA合成起点は、レトロウイルスの第2
鎖DNA合成に非常に重要である。ポリウリジン領域と呼ばれるこの領域は、3
’LTRのすぐ上流に位置する。
【0041】
レトロウイルス遺伝子導入におけるベクターにおける核酸配列は、5’LTR
、3’LTR、tRNA結合配列および第2鎖DNA合成の起点に加えて、パッ
ケージングシグナル、およびこれに加えて、以下に詳述する1つ以上の非相同配
列を含むことができる。
、3’LTR、tRNA結合配列および第2鎖DNA合成の起点に加えて、パッ
ケージングシグナル、およびこれに加えて、以下に詳述する1つ以上の非相同配
列を含むことができる。
【0042】
たとえば、Gag/PolまたはEnvをコードする核酸配列を持たないレト
ロウイルス遺伝子導入ベクターが使用される。たとえば、伸長パッケージングシ
グナルを有するベクター構築物を作製することによって、Gag/Polまたは
Envをコードする配列を持たないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを作製す
ることができる。用語「伸長パッケージングシグナル」は、核酸の特異的パッケ
ージングに必要な最小配列を超えるヌクレオチド配列を意味する。伸長パッケー
ジング配列を使用することにより、高力価を有するウイルスストックの作製が可
能になるが、これは、パッケージされるRNAの量が増加するためである。たと
えば、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MLV)の最小パッケージングシグ
ナルは、5’LTRの終端で開始し、且つPstI切断部位を含む配列によって
コードされる。Mo−MLVの伸長パッケージングシグナルは、Gag/Pol
遺伝子(ヌクレオチド621)の起始点を含む、ヌクレオチド567以上の配列を
含み、ヌクレオチド1560を越えて終わる。従って、ヌクレオチド567を越
えて伸長する配列を削除することによって、伸長パッケージングシグナルを持た
ないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを、Mo−MLVから作製することがで
きる。さらに、パッケージングシグナルが、レトロウイルスのGag/Pol配
列と部分的にまたは完全にオーバーラップするが、それにもかかわらず完全に削
除されるかまたはGag/Pol遺伝子の出発コドンの上流が切断されている核
酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することも可能である。さ
らに、Gag/Pol遺伝子の起始点の5’領域上流で伸長したパッケージング
シグナルを含む核酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用すること
も可能である。これらのレトロウイルスベクターを使用する場合、組換えウイル
ス粒子を作製するためには、Gag/Pol発現カセット内のGag/Pol遺
伝子の5’末端が、修飾されていて、野生型HIV−1Gag配列と異なる、G
ag遺伝子におけるコドン使用を示すように、修飾されている、パッケージング
細胞系を好んで選択すべきである。
ロウイルス遺伝子導入ベクターが使用される。たとえば、伸長パッケージングシ
グナルを有するベクター構築物を作製することによって、Gag/Polまたは
Envをコードする配列を持たないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを作製す
ることができる。用語「伸長パッケージングシグナル」は、核酸の特異的パッケ
ージングに必要な最小配列を超えるヌクレオチド配列を意味する。伸長パッケー
ジング配列を使用することにより、高力価を有するウイルスストックの作製が可
能になるが、これは、パッケージされるRNAの量が増加するためである。たと
えば、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MLV)の最小パッケージングシグ
ナルは、5’LTRの終端で開始し、且つPstI切断部位を含む配列によって
コードされる。Mo−MLVの伸長パッケージングシグナルは、Gag/Pol
遺伝子(ヌクレオチド621)の起始点を含む、ヌクレオチド567以上の配列を
含み、ヌクレオチド1560を越えて終わる。従って、ヌクレオチド567を越
えて伸長する配列を削除することによって、伸長パッケージングシグナルを持た
ないレトロウイルス遺伝子導入ベクターを、Mo−MLVから作製することがで
きる。さらに、パッケージングシグナルが、レトロウイルスのGag/Pol配
列と部分的にまたは完全にオーバーラップするが、それにもかかわらず完全に削
除されるかまたはGag/Pol遺伝子の出発コドンの上流が切断されている核
酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することも可能である。さ
らに、Gag/Pol遺伝子の起始点の5’領域上流で伸長したパッケージング
シグナルを含む核酸配列を、レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用すること
も可能である。これらのレトロウイルスベクターを使用する場合、組換えウイル
ス粒子を作製するためには、Gag/Pol発現カセット内のGag/Pol遺
伝子の5’末端が、修飾されていて、野生型HIV−1Gag配列と異なる、G
ag遺伝子におけるコドン使用を示すように、修飾されている、パッケージング
細胞系を好んで選択すべきである。
【0043】
さらに、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第2鎖D
NA合成の起点および3’LTR領域を有する核酸配列を、5’LTRの上流に
レトロウイルス核酸配列を持たない核酸配列と共に、レトロウイルス遺伝子導入
ベクターに使用することも可能である。これらのベクターは、5’LTRの上流
にEnvコード配列を持たない。さらに、5’LTR、tRNA結合配列、パッ
ケージングシグナル、第2鎖DNA合成起点および3’LTRを含むが、3’L
TRの下流にレトロウイルスパッケージングシグナル配列を含まない核酸配列を
レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することが可能である。本明細で使用
される用語「パッケージングシグナル配列」は、RNAゲノムのパッケージング
に必要な配列を意味する。
NA合成の起点および3’LTR領域を有する核酸配列を、5’LTRの上流に
レトロウイルス核酸配列を持たない核酸配列と共に、レトロウイルス遺伝子導入
ベクターに使用することも可能である。これらのベクターは、5’LTRの上流
にEnvコード配列を持たない。さらに、5’LTR、tRNA結合配列、パッ
ケージングシグナル、第2鎖DNA合成起点および3’LTRを含むが、3’L
TRの下流にレトロウイルスパッケージングシグナル配列を含まない核酸配列を
レトロウイルス遺伝子導入ベクターに使用することが可能である。本明細で使用
される用語「パッケージングシグナル配列」は、RNAゲノムのパッケージング
に必要な配列を意味する。
【0044】
上述のレトロウイルス遺伝子導入ベクターの確立に適したパッケージング細胞
系は既に入手でき、組換えベクター粒子を作製するための細胞系(ベクター細胞
系とも呼ばれる)の作製に何度も使用されている。
系は既に入手でき、組換えベクター粒子を作製するための細胞系(ベクター細胞
系とも呼ばれる)の作製に何度も使用されている。
【0045】
レトロウイルスベクターの中で、レンチウイルスベクターは、核酸配列を多数
の休止細胞および有糸***後細胞、たとえば、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞
および造血幹細胞に挿入して配列を発現させることができるため、核酸配列の本
発明による組合せを導入するのに特に適する。レンチウイルスベクター粒子は、
(i)Gag/Pol発現ベクター、(ii)パッケージングシグナル、外来核酸配
列およびフランキングLTRを含む導入構築物、および(iii)コートタンパク
質用発現ベクターによる哺乳類細胞の三重感染によって作製することができる。
この点に関して、様々な広宿主性または異種栄養性のレトロウイルスおよび他の
ウイルスからのコートタンパク質、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス(
Mo−MLV)およびMLV単離4070Aのコートタンパク質を使用すること
ができ、水疱性口内炎ウイルス(VSV)G糖タンパク質または狂犬病G糖タンパ
ク質も使用することができる。このようにして作製されたレンチウイルスベクタ
ーは、多数の異なる細胞をしっかりトランスフェクトすることができる。HIV
Pol遺伝子の中央ポリウリジン領域およびターミネーター配列を含むレンチ
ウイルスベクターは、高い形質導入効率を示し、この高い効率は、ベクターの改
良された核転座による。レンチウイルス遺伝子療法用ベクターの安全性を向上さ
せるために、アクセサリーHIV−1および/またはSIV−1遺伝子Vif、
Vpr、VpuおよびNefに欠失を含む異なる機能的パッケージング構築物を
作製することが可能である。さらに、ウイルスのトランス活性化因子タンパク質
Tatをもはや必要としない機能的レンチウイルスベクターを開発することが可
能である。さらに、複製有能組換え体の出現を最小限に抑えるために、たとえば
、TATAボックスおよび転写因子SP1およびNF−κBを結合するための部
位を含む、5’LTRおよび/または3’LTRにおけるU3領域の広域断片が
、ベクター内で欠失している自己不活化ベクター系を開発することが可能である
。これらの修飾は、ウイルス転写エレメントの大部分を除去する。さらに、U3
領域を削除することにより、LTRにあるプロモーターと内部プロモーターとの
間の起こりうる干渉を防止し、レンチウイルスベクターの組込み部位にて、隣接
する細胞遺伝子を活性化する危険性を徹底的に減少させる。合成的に作製された
、コドン改変HIVおよび/またはSIVの Gag/Pol遺伝子およびEn
v遺伝子を使して、たとえば、レンチウイルスGag/Pol遺伝子およびEn
v遺伝子のRev依存性を回避する。あるいは、HIV/SIVGag、Gag
/PolおよびEnv遺伝子転写物をRev独立方式で輸出できるようにするた
めに、たとえば、メーソン・フィッツェル(Mason−Pfitzer)サル
ウイルスCTEまたはサルレトロウイルス1型(SRV−1)CTE等の他のウイ
ルスからの構成的輸送エレメント(CTE)を使用することが可能であり、また、
B型肝炎ウイルス転写後制御エレメント(PRE)およびラウス肉腫ウイルス転写
後ダイレクトリピート(DR)エレメントを使用することも可能である。これらの
方法を使用することにより、トランス活性なRevタンパク質をレンチウイルス
ベクターから除外することができ、その結果、このベクター型の安全性を高める
一助となる。現在使用されているレンチウイルスベクター系の編集物は、たとえ
ば、Buchschacher and Wong Staalによる総説 (
Buchschacher et al.(2000)Blood 95:249
9−2504)にある。
の休止細胞および有糸***後細胞、たとえば、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞
および造血幹細胞に挿入して配列を発現させることができるため、核酸配列の本
発明による組合せを導入するのに特に適する。レンチウイルスベクター粒子は、
(i)Gag/Pol発現ベクター、(ii)パッケージングシグナル、外来核酸配
列およびフランキングLTRを含む導入構築物、および(iii)コートタンパク
質用発現ベクターによる哺乳類細胞の三重感染によって作製することができる。
この点に関して、様々な広宿主性または異種栄養性のレトロウイルスおよび他の
ウイルスからのコートタンパク質、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス(
Mo−MLV)およびMLV単離4070Aのコートタンパク質を使用すること
ができ、水疱性口内炎ウイルス(VSV)G糖タンパク質または狂犬病G糖タンパ
ク質も使用することができる。このようにして作製されたレンチウイルスベクタ
ーは、多数の異なる細胞をしっかりトランスフェクトすることができる。HIV
Pol遺伝子の中央ポリウリジン領域およびターミネーター配列を含むレンチ
ウイルスベクターは、高い形質導入効率を示し、この高い効率は、ベクターの改
良された核転座による。レンチウイルス遺伝子療法用ベクターの安全性を向上さ
せるために、アクセサリーHIV−1および/またはSIV−1遺伝子Vif、
Vpr、VpuおよびNefに欠失を含む異なる機能的パッケージング構築物を
作製することが可能である。さらに、ウイルスのトランス活性化因子タンパク質
Tatをもはや必要としない機能的レンチウイルスベクターを開発することが可
能である。さらに、複製有能組換え体の出現を最小限に抑えるために、たとえば
、TATAボックスおよび転写因子SP1およびNF−κBを結合するための部
位を含む、5’LTRおよび/または3’LTRにおけるU3領域の広域断片が
、ベクター内で欠失している自己不活化ベクター系を開発することが可能である
。これらの修飾は、ウイルス転写エレメントの大部分を除去する。さらに、U3
領域を削除することにより、LTRにあるプロモーターと内部プロモーターとの
間の起こりうる干渉を防止し、レンチウイルスベクターの組込み部位にて、隣接
する細胞遺伝子を活性化する危険性を徹底的に減少させる。合成的に作製された
、コドン改変HIVおよび/またはSIVの Gag/Pol遺伝子およびEn
v遺伝子を使して、たとえば、レンチウイルスGag/Pol遺伝子およびEn
v遺伝子のRev依存性を回避する。あるいは、HIV/SIVGag、Gag
/PolおよびEnv遺伝子転写物をRev独立方式で輸出できるようにするた
めに、たとえば、メーソン・フィッツェル(Mason−Pfitzer)サル
ウイルスCTEまたはサルレトロウイルス1型(SRV−1)CTE等の他のウイ
ルスからの構成的輸送エレメント(CTE)を使用することが可能であり、また、
B型肝炎ウイルス転写後制御エレメント(PRE)およびラウス肉腫ウイルス転写
後ダイレクトリピート(DR)エレメントを使用することも可能である。これらの
方法を使用することにより、トランス活性なRevタンパク質をレンチウイルス
ベクターから除外することができ、その結果、このベクター型の安全性を高める
一助となる。現在使用されているレンチウイルスベクター系の編集物は、たとえ
ば、Buchschacher and Wong Staalによる総説 (
Buchschacher et al.(2000)Blood 95:249
9−2504)にある。
【0046】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターに加えて、本発明によ
る核酸配列組合せの導入に同様に使用することができる多数の他のウイルス遺伝
子導入ベクターおよび非ウイルス遺伝子導入ベクターを使用することも可能であ
る。これらのベクター系は、治療的に利用可能な、組換え的に修飾された細胞系
の作製に使用されるため、安全上の理由から、もはや溶解的に複製することがで
きないように、ウイルスベクター系を修飾する。遺伝子導入ベクターは、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘ
ルペスウイルスを基礎とするベクターであることが好ましい。
る核酸配列組合せの導入に同様に使用することができる多数の他のウイルス遺伝
子導入ベクターおよび非ウイルス遺伝子導入ベクターを使用することも可能であ
る。これらのベクター系は、治療的に利用可能な、組換え的に修飾された細胞系
の作製に使用されるため、安全上の理由から、もはや溶解的に複製することがで
きないように、ウイルスベクター系を修飾する。遺伝子導入ベクターは、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘ
ルペスウイルスを基礎とするベクターであることが好ましい。
【0047】
アデノウイルスベクター
E1/E3、E1/E4およびガトレス(gutless)ベクターを含む、
組換えアデノウイルスベクター(Adベクター)の作製は、到達水準であり、公表
されたプロトコールに従って実行することができる。たとえば、(1)293細胞
のトランスフェクションおよび次の細胞内組換えに続いて組換えE1/E3欠失
Adベクターを作製するために、望ましいヌクレオチド配列をpBHG11プラ
スミドに挿入することができる。(2)望ましいヌクレオチド配列を、まず第1に
、多数のE1欠失AdベクターのE1領域内に組込み、ClaI消化H5d11
014ベクターと共に共トランスフェクトすることができ、293E4細胞のト
ランスフェクションおよび次の細胞内相同組換えに続いて、組換えE1/E4欠
失Adベクターを単離することができる。(3)次に、293細胞へのトランスフ
ェクションおよびH5.CBALPヘルパーウイルス感染に続いて、組換えガト
レスアデノウイルスベクターゲノムの効果的なパッケージングを確実にするため
に、まず第1に、望ましいヌクレオチド配列を、たとえば、バクテリオファージ
λDNAに由来する、スタッファー配列の適量と一緒にArAdプラスミドに挿
入する。塩化セシウム勾配における平衡沈降を使用して、たとえば、ヘルパーウ
イルスより低い密度を有するベクター粒子が原因で汚染しているヘルパーウイル
スから組換えガトレスアデノウイルスベクター粒子を除去することができる。
組換えアデノウイルスベクター(Adベクター)の作製は、到達水準であり、公表
されたプロトコールに従って実行することができる。たとえば、(1)293細胞
のトランスフェクションおよび次の細胞内組換えに続いて組換えE1/E3欠失
Adベクターを作製するために、望ましいヌクレオチド配列をpBHG11プラ
スミドに挿入することができる。(2)望ましいヌクレオチド配列を、まず第1に
、多数のE1欠失AdベクターのE1領域内に組込み、ClaI消化H5d11
014ベクターと共に共トランスフェクトすることができ、293E4細胞のト
ランスフェクションおよび次の細胞内相同組換えに続いて、組換えE1/E4欠
失Adベクターを単離することができる。(3)次に、293細胞へのトランスフ
ェクションおよびH5.CBALPヘルパーウイルス感染に続いて、組換えガト
レスアデノウイルスベクターゲノムの効果的なパッケージングを確実にするため
に、まず第1に、望ましいヌクレオチド配列を、たとえば、バクテリオファージ
λDNAに由来する、スタッファー配列の適量と一緒にArAdプラスミドに挿
入する。塩化セシウム勾配における平衡沈降を使用して、たとえば、ヘルパーウ
イルスより低い密度を有するベクター粒子が原因で汚染しているヘルパーウイル
スから組換えガトレスアデノウイルスベクター粒子を除去することができる。
【0048】
アデノ随伴ウイルス
さらに、既に開発されている様々なアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター系を
遺伝子導入に使用することが可能である。AAVベクターの構築に関する詳細な
説明は公表されており、到達水準である。
遺伝子導入に使用することが可能である。AAVベクターの構築に関する詳細な
説明は公表されており、到達水準である。
【0049】
組換えAAVベクターの場合、通常、全てのコード配列が、望ましい非相同核
酸配列と置き換えられる。組換えAAVは、所望の遺伝子を担持するAAVベク
ター、および必須のAAV遺伝子全てを有するヘルパーAAVプラスミドを、A
AV複製およびベクター粒子の産生に必要なヘルパー機能全てを提供するアデノ
ウイルス感染細胞内に共トランスフェクトすることによって作製される。しかし
、このベクター系を遺伝子療法で使用する際の不都合は、組換えベクターが低力
価であること、およびベクターが野生型AAVおよび伝染性ヘルパーウイルスで
汚染されている恐れがあることである。さらに、AAVベクターに組み込むべき
外来配列のサイズが5kbに限定されていることである。
酸配列と置き換えられる。組換えAAVは、所望の遺伝子を担持するAAVベク
ター、および必須のAAV遺伝子全てを有するヘルパーAAVプラスミドを、A
AV複製およびベクター粒子の産生に必要なヘルパー機能全てを提供するアデノ
ウイルス感染細胞内に共トランスフェクトすることによって作製される。しかし
、このベクター系を遺伝子療法で使用する際の不都合は、組換えベクターが低力
価であること、およびベクターが野生型AAVおよび伝染性ヘルパーウイルスで
汚染されている恐れがあることである。さらに、AAVベクターに組み込むべき
外来配列のサイズが5kbに限定されていることである。
【0050】
ポックスウイルス
所望の外来遺伝子をコードする核酸を導入するための代替アデノウイルスベク
ター系は、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む、ポックスウ
イルスファミリーを代表するものに基礎を置く。この種のベクター系は、組換え
ワクシニアウイルスの例を使用して次に説明する通りに作製される。まず第1に
、所望の遺伝子が、ワクシニアプロモーターおよびチミジンキナーゼ(TK)をコ
ードする配列等のフランキングワクシニアDNA配列の近くに位置するように、
所望の遺伝子をコードするDNAを、適当なベクターに組み込む。次いで、この
ベクターを細胞にトランスフェクトし、同時に、これらの後者をワクシニアウイ
ルスに感染させる。次いで、相同組換えを使用して、外来遺伝子を含む挿入物を
、ウイルスゲノムに組換える。このようにして得られたTK陽性組換え体は、5
−ブロモデオキシウリジンの存在下でウイルスを細胞で培養し、次にプラークを
単離することによって確立することができる。
ター系は、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む、ポックスウ
イルスファミリーを代表するものに基礎を置く。この種のベクター系は、組換え
ワクシニアウイルスの例を使用して次に説明する通りに作製される。まず第1に
、所望の遺伝子が、ワクシニアプロモーターおよびチミジンキナーゼ(TK)をコ
ードする配列等のフランキングワクシニアDNA配列の近くに位置するように、
所望の遺伝子をコードするDNAを、適当なベクターに組み込む。次いで、この
ベクターを細胞にトランスフェクトし、同時に、これらの後者をワクシニアウイ
ルスに感染させる。次いで、相同組換えを使用して、外来遺伝子を含む挿入物を
、ウイルスゲノムに組換える。このようにして得られたTK陽性組換え体は、5
−ブロモデオキシウリジンの存在下でウイルスを細胞で培養し、次にプラークを
単離することによって確立することができる。
【0051】
あるいは、他のトリポックスウイルス、たとえば、鶏痘ウイルスおよびカナリ
ア痘ウイルスを遺伝子導入に使用することが可能である。ヒトに対して病原とな
る生物に由来する免疫原を発現する組換えトリポックスウイルスは、哺乳動物へ
の投与後、防護的免疫応答を誘導することができる。トリポックス属を代表する
ものは、受容性トリ種において複製するのみで、哺乳類細胞では複製しないため
、トリポックスウイルスの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物での利用に特に有利
である。組換えトリポックスウイルスを作製する方法は到達水準であり、組換え
ワクシニアウイルスの製造に関して前述したものと類似した遺伝子組換え機構に
基づく。
ア痘ウイルスを遺伝子導入に使用することが可能である。ヒトに対して病原とな
る生物に由来する免疫原を発現する組換えトリポックスウイルスは、哺乳動物へ
の投与後、防護的免疫応答を誘導することができる。トリポックス属を代表する
ものは、受容性トリ種において複製するのみで、哺乳類細胞では複製しないため
、トリポックスウイルスの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物での利用に特に有利
である。組換えトリポックスウイルスを作製する方法は到達水準であり、組換え
ワクシニアウイルスの製造に関して前述したものと類似した遺伝子組換え機構に
基づく。
【0052】
アルファ・ウイルス
アルファ・ウイルス属を代表するもの、たとえば、シンドビスおよびセムリキ
森林熱ウイルスに由来するベクターを、選択された遺伝子のヌクレオチド配列の
導入に使用することもできる。シンドビスウイルスに基づくベクターの作製およ
び使用は到達水準であり、何度も公表されている。
森林熱ウイルスに由来するベクターを、選択された遺伝子のヌクレオチド配列の
導入に使用することもできる。シンドビスウイルスに基づくベクターの作製およ
び使用は到達水準であり、何度も公表されている。
【0053】
細菌
さらに、遺伝子導入ベクターは細菌、特にListeria monocyt
ogenes(Δmpl、ΔactA、ΔplcB)、Shigella fle
xneri(ΔaroA、ΔvirG)およびSalmonella typh
imuriumであることが好ましい。抗原特異的細胞を補充し活性化するため
の非常に有望なDNAデリバリーシステムは、たとえば、弱毒化したListe
ria monocytogenes(Δmpl、ΔactA、ΔplcB)、S
higella flexneri(ΔaroA、ΔvirG)およびSalmo
nella typhimuriumisolatesを基礎とする細菌自殺ベ
クターを使用する。このような細菌遺伝子導入システムの作製および使用は詳細
に発表されており、到達水準である。従って、L.monocytogenes
の「自殺」株は、たとえば、プロフェッショナル抗原提示細胞を選択的に感染す
ることができる。この細菌は、標的細胞の細胞質内に取込まれた後、Liste
ria 特異的ファージ溶解素によって破壊され、その結果として、細菌によっ
て輸送されたプラスミドDNAが放出され、次にこのDNAと一緒に、細胞核に
侵入する。この細菌系の重要な利点は、細菌の経口投与、および細胞の免疫応答
の導入において中心的な役割を担う、APCへのプラスミドの選択的導入である
。侵襲的細菌Shigella flexneriおよびSalmonella
typhimuriumの自殺株を、細胞壁合成に関与する代謝産物の産生に
不可欠な遺伝子を欠失させることによって弱毒化させておく。哺乳類細胞を感染
させた後、これらの細菌株は、代謝産物がないため、溶解する。
ogenes(Δmpl、ΔactA、ΔplcB)、Shigella fle
xneri(ΔaroA、ΔvirG)およびSalmonella typh
imuriumであることが好ましい。抗原特異的細胞を補充し活性化するため
の非常に有望なDNAデリバリーシステムは、たとえば、弱毒化したListe
ria monocytogenes(Δmpl、ΔactA、ΔplcB)、S
higella flexneri(ΔaroA、ΔvirG)およびSalmo
nella typhimuriumisolatesを基礎とする細菌自殺ベ
クターを使用する。このような細菌遺伝子導入システムの作製および使用は詳細
に発表されており、到達水準である。従って、L.monocytogenes
の「自殺」株は、たとえば、プロフェッショナル抗原提示細胞を選択的に感染す
ることができる。この細菌は、標的細胞の細胞質内に取込まれた後、Liste
ria 特異的ファージ溶解素によって破壊され、その結果として、細菌によっ
て輸送されたプラスミドDNAが放出され、次にこのDNAと一緒に、細胞核に
侵入する。この細菌系の重要な利点は、細菌の経口投与、および細胞の免疫応答
の導入において中心的な役割を担う、APCへのプラスミドの選択的導入である
。侵襲的細菌Shigella flexneriおよびSalmonella
typhimuriumの自殺株を、細胞壁合成に関与する代謝産物の産生に
不可欠な遺伝子を欠失させることによって弱毒化させておく。哺乳類細胞を感染
させた後、これらの細菌株は、代謝産物がないため、溶解する。
【0054】
プラスミドDNA
さらに、遺伝子導入ベクターがプラスミドであることは好ましい。裸のプラス
ミドDNAは、本発明による核酸配列組合せ用のベクターとして適当である。こ
れらの発現ベクターは、例として、以下の必須エレメントを含む。1つ以上の強
い構成プロモータおよび/または誘導プロモータ、転写ターミネーター、たとえ
ば、ウシ成長ホルモンの転写ターミネーター、抗生物質耐性または形質転換生物
を選択するための別のマーカー、本発明による第1、第2および/または第3お
よび/または第4の核酸配列、および適当な宿主生物でのプラスミドの産生を可
能にする複製起点。第2世代の線状DNAプラスミド、すなわち、MIDGEト
ランスフェクションベクターと呼ばれるものは、本発明による核酸配列の効果的
な導入に特に適する。MIDGEベクターは、不定数の所望のコード配列、およ
び外来遺伝子の発現に必要なプロモーター配列およびターミネーター配列を含む
2本のDNAポリマー鎖からなり、その鎖は、共有結合的に閉鎖した分子が形成
されるように、両端で、1本鎖デオキシリボヌクレオチドのループと連結してい
る。医療用途に望ましい外来遺伝子を除き、MIDGESは、効果的な発現に必
要な制御ユニットと一緒に、通例のDNA導入ベクターの増幅および選択に必要
なさらなるコード配列を含まない。従って、これらのベクターは、たとえば、潜
在的組込み部位を含むOri配列、または選択マーカーとして抗生物質をコード
する配列をもたず、後者の配列は、哺乳類細胞でたびたび完全に停止させること
ができないプロモーターの調節下にある。
ミドDNAは、本発明による核酸配列組合せ用のベクターとして適当である。こ
れらの発現ベクターは、例として、以下の必須エレメントを含む。1つ以上の強
い構成プロモータおよび/または誘導プロモータ、転写ターミネーター、たとえ
ば、ウシ成長ホルモンの転写ターミネーター、抗生物質耐性または形質転換生物
を選択するための別のマーカー、本発明による第1、第2および/または第3お
よび/または第4の核酸配列、および適当な宿主生物でのプラスミドの産生を可
能にする複製起点。第2世代の線状DNAプラスミド、すなわち、MIDGEト
ランスフェクションベクターと呼ばれるものは、本発明による核酸配列の効果的
な導入に特に適する。MIDGEベクターは、不定数の所望のコード配列、およ
び外来遺伝子の発現に必要なプロモーター配列およびターミネーター配列を含む
2本のDNAポリマー鎖からなり、その鎖は、共有結合的に閉鎖した分子が形成
されるように、両端で、1本鎖デオキシリボヌクレオチドのループと連結してい
る。医療用途に望ましい外来遺伝子を除き、MIDGESは、効果的な発現に必
要な制御ユニットと一緒に、通例のDNA導入ベクターの増幅および選択に必要
なさらなるコード配列を含まない。従って、これらのベクターは、たとえば、潜
在的組込み部位を含むOri配列、または選択マーカーとして抗生物質をコード
する配列をもたず、後者の配列は、哺乳類細胞でたびたび完全に停止させること
ができないプロモーターの調節下にある。
【0055】
哺乳類およびヒト細胞で、遺伝子を導入して、外来遺伝子の改良された発現を
実現するための本システムの効率は、特に、非相同クラスのペプチド、すなわち
、核局在シグナル(NLS、核局在配列)と呼ばれるものを付けることによって高
めることができる。たとえば、SV−T抗原由来のNLSを使用することによっ
て、MIDGE様構築物の核への移入を増進し、外来遺伝子の発現を高めること
ができる。さらに、MIDGESを組特異的リガンドに結合することにより、特
異的ターゲティングを実現することができる。さらに、裸のDNAと同様に、よ
り効果的に標的細胞内に確実に取込むために、MIDGESを多数の非ウイルス
遺伝子導入システムに結合してもよい。
実現するための本システムの効率は、特に、非相同クラスのペプチド、すなわち
、核局在シグナル(NLS、核局在配列)と呼ばれるものを付けることによって高
めることができる。たとえば、SV−T抗原由来のNLSを使用することによっ
て、MIDGE様構築物の核への移入を増進し、外来遺伝子の発現を高めること
ができる。さらに、MIDGESを組特異的リガンドに結合することにより、特
異的ターゲティングを実現することができる。さらに、裸のDNAと同様に、よ
り効果的に標的細胞内に確実に取込むために、MIDGESを多数の非ウイルス
遺伝子導入システムに結合してもよい。
【0056】
さらに、真核DNAトランスポゾンの成分を含む遺伝子導入ベクターを使用す
ることが可能である。トランスポゾンは、染色体のある位置から次の位置に移動
することができる天然の遺伝因子である。たとえば、Tc1/マリナー(mar
iner)ファミリーを代表するもの、たとえば、スリーピングビューティー(
sleeping beauty)トランスポゾンを、哺乳類細胞で使用するの
に適したベクターの作製に使用することができる。これらのベクターの利点は、
多数の調節配列をベクターに組込むことが可能なことである。これらのベクター
は、宿主細胞ゲノムに組込まれ、所望の外来配列を長期にわたって連続的に発現
させることができる。
ることが可能である。トランスポゾンは、染色体のある位置から次の位置に移動
することができる天然の遺伝因子である。たとえば、Tc1/マリナー(mar
iner)ファミリーを代表するもの、たとえば、スリーピングビューティー(
sleeping beauty)トランスポゾンを、哺乳類細胞で使用するの
に適したベクターの作製に使用することができる。これらのベクターの利点は、
多数の調節配列をベクターに組込むことが可能なことである。これらのベクター
は、宿主細胞ゲノムに組込まれ、所望の外来配列を長期にわたって連続的に発現
させることができる。
【0057】
核酸を真核細胞内に導入するためのシステム
さらに、非ウイルス系に基づいて、遺伝子を哺乳類細胞内に導入するための多
数の方法が記載されている。非ウイルスベクターは、粒子仲介遺伝子導入または
アデノウイルスベクター系と組合せて使用されることが多い。
数の方法が記載されている。非ウイルスベクターは、粒子仲介遺伝子導入または
アデノウイルスベクター系と組合せて使用されることが多い。
【0058】
簡単に説明すると、本発明による核酸配列組合せを、所望の外来遺伝子を効果
的に高収率で発現できるようにするのに適した調節要素を有する従来の遺伝子導
入ベクターまたは幾つかの従来の遺伝子導入ベクターの組合せに組込むことがで
きる。次いで、本発明によるベクターを、合成遺伝子導入分子、たとえばポリリ
ジン、プロタミンおよびアルブミン等のポリマーDNA結合性陽イオンに結合し
てもよく、あるいは、特異的細胞ターゲティングを仲介するリガンド、たとえば
、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフ
ェリンに結合してもよい。
的に高収率で発現できるようにするのに適した調節要素を有する従来の遺伝子導
入ベクターまたは幾つかの従来の遺伝子導入ベクターの組合せに組込むことがで
きる。次いで、本発明によるベクターを、合成遺伝子導入分子、たとえばポリリ
ジン、プロタミンおよびアルブミン等のポリマーDNA結合性陽イオンに結合し
てもよく、あるいは、特異的細胞ターゲティングを仲介するリガンド、たとえば
、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフ
ェリンに結合してもよい。
【0059】
さらに、生物分解性ラテックスビーズを使用することによって、裸のDNAの
取込み効率を高めることができる。ラテックスビーズが仲介するエンドサイトー
シスによって、DNA負荷ラテックスビーズが効率よく標的細胞内に取込まれる
。ビーズの疎水性上昇、およびこれに伴うエンドソームにおけるビーズの分解増
進によってこの方法の効率を高めることができ、結果として、DNAがより効果
的に細胞質内に放出される。
取込み効率を高めることができる。ラテックスビーズが仲介するエンドサイトー
シスによって、DNA負荷ラテックスビーズが効率よく標的細胞内に取込まれる
。ビーズの疎水性上昇、およびこれに伴うエンドソームにおけるビーズの分解増
進によってこの方法の効率を高めることができ、結果として、DNAがより効果
的に細胞質内に放出される。
【0060】
さらに、様々なリポソーム組成物および免疫刺激性の再構成インフルエンザヴ
ィロソーム(IRIV、免疫強化再構成インフルエンザヴィロソーム)も、本発明
によるベクターを哺乳類およびヒト細胞に導入するための媒体として適する(米
国特許第5,879,685号)。さらに、外来核酸配列を、ポリマーDNA結
合性陽イオン(たとえば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン)等の合成遺
伝子導入分子に結合した、適当な調節配列を含むベクターに組込み、アシアロオ
ロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフェリン等の細
胞ターゲティングリガンドに結合させることができる。別の投与システムは、異
なる組織特異的および/または構成的なプロモータの調節下にある所望の遺伝子
を含む配列の、リポソーム内へのパッケージングに基づく。さらに、光重合ヒド
ロゲル材料との組合せによって、前述の核酸の導入を増進することができる。核
酸を導入するための別の通例使用される方法は、携帯用粒子銃を使用した核酸投
与、および遺伝子導入を活性化するための電離放射線の使用である。
ィロソーム(IRIV、免疫強化再構成インフルエンザヴィロソーム)も、本発明
によるベクターを哺乳類およびヒト細胞に導入するための媒体として適する(米
国特許第5,879,685号)。さらに、外来核酸配列を、ポリマーDNA結
合性陽イオン(たとえば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン)等の合成遺
伝子導入分子に結合した、適当な調節配列を含むベクターに組込み、アシアロオ
ロソムコイド、インスリン、ガラクトース、乳糖またはトランスフェリン等の細
胞ターゲティングリガンドに結合させることができる。別の投与システムは、異
なる組織特異的および/または構成的なプロモータの調節下にある所望の遺伝子
を含む配列の、リポソーム内へのパッケージングに基づく。さらに、光重合ヒド
ロゲル材料との組合せによって、前述の核酸の導入を増進することができる。核
酸を導入するための別の通例使用される方法は、携帯用粒子銃を使用した核酸投
与、および遺伝子導入を活性化するための電離放射線の使用である。
【0061】
アデノウイルスベクター形質導入の効率を最適化するための他の方法は、感染
(M.O.I)の多様性を変えること、リン酸イオン等のイオンを除去すること、
硫酸プロタミン等のポリカチオン物質を加えること、接触時間温度およびpHを
変えること、ならびに細胞とウイルスストックまたはベクターストックとを互い
に一緒に遠心分離することとを含む。
(M.O.I)の多様性を変えること、リン酸イオン等のイオンを除去すること、
硫酸プロタミン等のポリカチオン物質を加えること、接触時間温度およびpHを
変えること、ならびに細胞とウイルスストックまたはベクターストックとを互い
に一緒に遠心分離することとを含む。
【0062】
上述の遺伝子導入システムを、単離したヒトまたは哺乳類細胞、特に抗原提示
細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞)の遺伝子操作に使用するこ
とができる。レトロウイルス遺伝子導入ベクターを使用する場合、これらの細胞
を感染させることができるように、刺激によって細胞をS期に変化させることが
できる。S期の最初の4分の1ないし半分にある細胞は、特に、レトロウイルス
によるトランスフェクションを受けやすい。
細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞)の遺伝子操作に使用するこ
とができる。レトロウイルス遺伝子導入ベクターを使用する場合、これらの細胞
を感染させることができるように、刺激によって細胞をS期に変化させることが
できる。S期の最初の4分の1ないし半分にある細胞は、特に、レトロウイルス
によるトランスフェクションを受けやすい。
【0063】
抗原性エピトープを有するポリペプチド
本発明によるベクターは、免疫細胞により認識される、タンパク質、またはタ
ンパク質もしくはポリペプチドの一部(抗原)をコードする核酸配列を含むことを
特徴とする。本発明の意味の範囲内で、免疫細胞は、制御特性または細胞溶解特
性を有するリンパ球、たとえば、CD8+/CD4-T細胞またはCD8-/DC
4+T細胞、あるいはCD8-/CD4-/CD56+キラー細胞(NK細胞)である
。本発明の意味の範囲内で、タンパク質またはポリペプチドは、ヒトまたは動物
細胞に由来するタンパク質である。これらのタンパク質またはポリペプチドは、
攻撃される細胞の表面上に位置する(たとえば、それらの作用の結果としての細
胞膜上の糖タンパク質)か、または細胞内部に位置する(たとえば、制御タンパ
ク質)かのいずれかである。これらのタンパク質またはポリペプチドは、細胞内
で処理され、クラス1またはクラス2 MHC分子の関連で、身体の免疫細胞に
提示される。本発明の意味の範囲内のタンパク質またはポリペプチドは、内因性
免疫細胞により認識され、これらの細胞の刺激、すなわち、細胞の増加につなが
り、この増加は、メッセンジャー物質(特に、IFN−γ、IL2、TNF)の放
出または免疫細胞の細胞溶解活性によって測定することができる。
ンパク質もしくはポリペプチドの一部(抗原)をコードする核酸配列を含むことを
特徴とする。本発明の意味の範囲内で、免疫細胞は、制御特性または細胞溶解特
性を有するリンパ球、たとえば、CD8+/CD4-T細胞またはCD8-/DC
4+T細胞、あるいはCD8-/CD4-/CD56+キラー細胞(NK細胞)である
。本発明の意味の範囲内で、タンパク質またはポリペプチドは、ヒトまたは動物
細胞に由来するタンパク質である。これらのタンパク質またはポリペプチドは、
攻撃される細胞の表面上に位置する(たとえば、それらの作用の結果としての細
胞膜上の糖タンパク質)か、または細胞内部に位置する(たとえば、制御タンパ
ク質)かのいずれかである。これらのタンパク質またはポリペプチドは、細胞内
で処理され、クラス1またはクラス2 MHC分子の関連で、身体の免疫細胞に
提示される。本発明の意味の範囲内のタンパク質またはポリペプチドは、内因性
免疫細胞により認識され、これらの細胞の刺激、すなわち、細胞の増加につなが
り、この増加は、メッセンジャー物質(特に、IFN−γ、IL2、TNF)の放
出または免疫細胞の細胞溶解活性によって測定することができる。
【0064】
本発明によるベクターは、1つ以上の線状エピトープまたは構造的エピトープ
を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする。これらの
エピトープは、MHC分子によって提示された後、免疫病因となるT細胞により
認識される。これらのペプチド領域およびエピトープは、他の、免疫原性ポリペ
プチドまたは非免疫原性ポリペプチドの関連で、たとえば融合タンパク質として
、あるいはタンパク質における交換可能なカセットの形態で、コードされ発現さ
れてもよく、このカセットは、タンパク質の領域またはエピトープまたはエピト
ープの組合せをコードする。本発明の意味の範囲内で、タンパク質のエピトープ
は、T細胞またはNK細胞等の免疫細胞により認識され得る、タンパク質の領域
、またはアミノ酸配列である。これらのエピトープは、健康な個体に由来する免
疫細胞によっても、自己免疫疾患にも罹患している個体に由来する免疫細胞によ
っても、認識され得る。
を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする。これらの
エピトープは、MHC分子によって提示された後、免疫病因となるT細胞により
認識される。これらのペプチド領域およびエピトープは、他の、免疫原性ポリペ
プチドまたは非免疫原性ポリペプチドの関連で、たとえば融合タンパク質として
、あるいはタンパク質における交換可能なカセットの形態で、コードされ発現さ
れてもよく、このカセットは、タンパク質の領域またはエピトープまたはエピト
ープの組合せをコードする。本発明の意味の範囲内で、タンパク質のエピトープ
は、T細胞またはNK細胞等の免疫細胞により認識され得る、タンパク質の領域
、またはアミノ酸配列である。これらのエピトープは、健康な個体に由来する免
疫細胞によっても、自己免疫疾患にも罹患している個体に由来する免疫細胞によ
っても、認識され得る。
【0065】
本発明によるベクターは、たとえば、自己免疫疾患、免疫病因による慢性的炎
症経過、および組織および器官拒絶反応の処置に使用することができる。たとえ
ば、内因性タンパク質および構造を認識する自己反応性T細胞は、多くの自己免
疫疾患に関与することが知られている。本発明によるベクターは、これらの内因
性タンパク質および構造をコードして発現させる核酸配列を含むことができる。
T細胞が病因に関与し、タンパク質および構造がT細胞によって攻撃されるする
全ての疾患が、処置に適すると認定されている。
症経過、および組織および器官拒絶反応の処置に使用することができる。たとえ
ば、内因性タンパク質および構造を認識する自己反応性T細胞は、多くの自己免
疫疾患に関与することが知られている。本発明によるベクターは、これらの内因
性タンパク質および構造をコードして発現させる核酸配列を含むことができる。
T細胞が病因に関与し、タンパク質および構造がT細胞によって攻撃されるする
全ての疾患が、処置に適すると認定されている。
【0066】
リウマチ学的疾患は、1つの自己免疫疾患群である。たとえば、関節リウマチ
の場合、関節が攻撃され、臨床上の併発症は、関節破壊、腎損傷およびアミロイ
ドーシスである。全身性エリテマトーデスは、様々な器官および組織、たとえば
、中枢神経系および腎を冒し、損傷を与える。シェーグレン症候群は、唾液腺等
の外分泌腺を冒す。多発性筋炎および皮膚筋炎は、筋系および皮膚の自己免疫疾
患であり、および筋無力症および麻痺を来たす。多発性筋痛リウマチおよび側頭
動脈炎は、血管の炎症性疾患であり、筋無力症および失明を引き起こす。ベヒテ
レフ病等の脊椎関節症は、さらに加えて関節を冒し、硬直を来たす。
の場合、関節が攻撃され、臨床上の併発症は、関節破壊、腎損傷およびアミロイ
ドーシスである。全身性エリテマトーデスは、様々な器官および組織、たとえば
、中枢神経系および腎を冒し、損傷を与える。シェーグレン症候群は、唾液腺等
の外分泌腺を冒す。多発性筋炎および皮膚筋炎は、筋系および皮膚の自己免疫疾
患であり、および筋無力症および麻痺を来たす。多発性筋痛リウマチおよび側頭
動脈炎は、血管の炎症性疾患であり、筋無力症および失明を引き起こす。ベヒテ
レフ病等の脊椎関節症は、さらに加えて関節を冒し、硬直を来たす。
【0067】
多数の胃腸疾患は、さらなる自己免疫疾患群を構成する。クローン病は、腸管
全体を冒して、出血、狭窄およびフィステルを来たし、往々にして、腫瘍疾患を
発症する結果となる。潰瘍性大腸炎は、大腸の炎症性疾患であり、穿孔および出
血を来たす。セリアック病は、小腸および大腸の両者を冒し、体重減少を招く。
自己免疫肝炎は、肝硬変および結果として肝臓移植を伴う肝臓の炎症性疾患であ
る。
全体を冒して、出血、狭窄およびフィステルを来たし、往々にして、腫瘍疾患を
発症する結果となる。潰瘍性大腸炎は、大腸の炎症性疾患であり、穿孔および出
血を来たす。セリアック病は、小腸および大腸の両者を冒し、体重減少を招く。
自己免疫肝炎は、肝硬変および結果として肝臓移植を伴う肝臓の炎症性疾患であ
る。
【0068】
内分泌学的疾患は、同様に、自己免疫反応に原因があると考えられる。I型糖
尿病は、膵臓の炎症性疾患であり、たとえば、腎、末梢神経系および眼の障害を
伴い、次には腎および膵臓の移植を必要とする可能性がある、糖尿病および血管
に対する損傷を来たす。副腎不全および甲状腺炎も、T細胞病原性を含む自己免
疫疾患である。さらに、多数の皮膚疾患が、自己免疫疾患群に属するとして分類
されている。幾つかの例として、乾癬、皮膚炎疱疹状皮膚炎および尋常性天疱瘡
等が挙げられる:これらの疾患では、感染が併発症を引き起こすことがある。脱
毛症は毛髪喪失を来たす。最後に、自己免疫反応に原因があると考えられる神経
学的疾患もある。たとえば、多発性硬化症は、中枢神経系および末梢神経系を冒
し、重症筋無力症は筋系を冒す。これらの両神経学的自己免疫疾患関連の併発症
として、麻痺が発生することもある。
尿病は、膵臓の炎症性疾患であり、たとえば、腎、末梢神経系および眼の障害を
伴い、次には腎および膵臓の移植を必要とする可能性がある、糖尿病および血管
に対する損傷を来たす。副腎不全および甲状腺炎も、T細胞病原性を含む自己免
疫疾患である。さらに、多数の皮膚疾患が、自己免疫疾患群に属するとして分類
されている。幾つかの例として、乾癬、皮膚炎疱疹状皮膚炎および尋常性天疱瘡
等が挙げられる:これらの疾患では、感染が併発症を引き起こすことがある。脱
毛症は毛髪喪失を来たす。最後に、自己免疫反応に原因があると考えられる神経
学的疾患もある。たとえば、多発性硬化症は、中枢神経系および末梢神経系を冒
し、重症筋無力症は筋系を冒す。これらの両神経学的自己免疫疾患関連の併発症
として、麻痺が発生することもある。
【0069】
本発明によるベクターは、免疫病因に起因する慢性的炎症経過、たとえばウイ
ルス感染または細菌感染後の慢性炎症(たとえば、B型肝炎ウイルス感染または
肝炎Cウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染後の脳炎)の処
置に使用することもできる。
ルス感染または細菌感染後の慢性炎症(たとえば、B型肝炎ウイルス感染または
肝炎Cウイルス感染の場合の慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染後の脳炎)の処
置に使用することもできる。
【0070】
さらに、本発明によるベクターは、組織および器官拒絶反応の処置に使用する
ことができる。一般に、移植される器官の細胞の表面上の外来構造(その構造は
、全ての細胞上に存在するMHC(主要組織適合複合体)分子によって本質的に形
成される)に対する免疫応答は、ドナーとレシピエントが互いに適合しないとき
、またはドナーの免疫応答が抑制されないとき、組織および器官の移植を許さな
い。器官移植の意味で、適合するは、ドナーおよびレシピエントにおけるクラス
I MHCおよびクラスII MHCに対する異なる対立遺伝子が、炎症性反応
が全く起きない十分な程度まで一致することを意味する。
ことができる。一般に、移植される器官の細胞の表面上の外来構造(その構造は
、全ての細胞上に存在するMHC(主要組織適合複合体)分子によって本質的に形
成される)に対する免疫応答は、ドナーとレシピエントが互いに適合しないとき
、またはドナーの免疫応答が抑制されないとき、組織および器官の移植を許さな
い。器官移植の意味で、適合するは、ドナーおよびレシピエントにおけるクラス
I MHCおよびクラスII MHCに対する異なる対立遺伝子が、炎症性反応
が全く起きない十分な程度まで一致することを意味する。
【0071】
通常、T細胞は、それらのT細胞受容体によって、内因性MHCと関係のある
非内因性タンパク質のフラグメントを認識する。内因性MHCと一緒にタンパク
質の内因性フラグメントを認識するT細胞は、様々な経路で不活化されるか、ま
たは活性化されないかのいずれかである。移植される器官に対する免疫応答の場
合、内因性MHCとの組合せで抗原が認識されななくても、レシピエントのT細
胞は、同じ抗原と外来MHCとの組合せを認識する。
非内因性タンパク質のフラグメントを認識する。内因性MHCと一緒にタンパク
質の内因性フラグメントを認識するT細胞は、様々な経路で不活化されるか、ま
たは活性化されないかのいずれかである。移植される器官に対する免疫応答の場
合、内因性MHCとの組合せで抗原が認識されななくても、レシピエントのT細
胞は、同じ抗原と外来MHCとの組合せを認識する。
【0072】
移植されるかまたは既に移植された器官に対する寛容を誘導する目的で、移植
と関連して使用される本発明によるベクターは、移植されるかまたは既に移植さ
れた器官型のタンパク質および構造をコードして発現させる。たとえば、膵臓移
植と関連して使用されるベクターは、膵臓由来の独特のタンパク質をコードする
。腎移植または肝臓移植と関連して使用されるベクターは、肝臓細胞または腎細
胞に由来する独特のタンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、内皮
細胞等の、器官特異的でないタンパク質も含むが、移植される器官に存在し、器
官拒絶の場合に、炎症性反応の標的を構成するタンパク質は含まない。
と関連して使用される本発明によるベクターは、移植されるかまたは既に移植さ
れた器官型のタンパク質および構造をコードして発現させる。たとえば、膵臓移
植と関連して使用されるベクターは、膵臓由来の独特のタンパク質をコードする
。腎移植または肝臓移植と関連して使用されるベクターは、肝臓細胞または腎細
胞に由来する独特のタンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、内皮
細胞等の、器官特異的でないタンパク質も含むが、移植される器官に存在し、器
官拒絶の場合に、炎症性反応の標的を構成するタンパク質は含まない。
【0073】
次に、本発明によるベクターによりコードされ、発現される、可能な抗原性タ
ンパク質の選択を、例として、3種の自己免疫疾患、すなわち、多発性硬化症、
重症筋無力症、関節リウマチ、およびI型糖尿病について、さらに詳細に説明す
る。
ンパク質の選択を、例として、3種の自己免疫疾患、すなわち、多発性硬化症、
重症筋無力症、関節リウマチ、およびI型糖尿病について、さらに詳細に説明す
る。
【0074】
多発性硬化症
ヒト中枢神経系の疾患である多発性硬化症(MS)は、血管周囲の炎症および脱
髄を特徴とする。白髄質体(white medullary body)の、
早期MS病変および周囲の未だ冒されていない領域における活性化T細胞の蓄積
は、多発性硬化症の発生における細胞仲介免疫(T細胞)の役割の重要性を示すも
のである。一般に認められている動物モデル、すなわち、ミエリン成分で免疫化
することにより誘導することができる実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)で行われ
た調査研究で、活性化されたミエリン特異的T細胞によって、EAEをある動物
から別の動物に導入できることが証明された。一般に、多発性硬化症に罹患して
いる患者で、ミエリンの種々の成分、星状膠細胞の成分、および中枢神経系の細
胞に由来しないタンパク質に向けられた免疫細胞を検出することができる。さら
に、種々の免疫細胞が、成分(エピトープ)の様々な領域を認識し、認識されるエ
ピトープ数の増加は疾患の悪化と相互に関係がある。
髄を特徴とする。白髄質体(white medullary body)の、
早期MS病変および周囲の未だ冒されていない領域における活性化T細胞の蓄積
は、多発性硬化症の発生における細胞仲介免疫(T細胞)の役割の重要性を示すも
のである。一般に認められている動物モデル、すなわち、ミエリン成分で免疫化
することにより誘導することができる実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)で行われ
た調査研究で、活性化されたミエリン特異的T細胞によって、EAEをある動物
から別の動物に導入できることが証明された。一般に、多発性硬化症に罹患して
いる患者で、ミエリンの種々の成分、星状膠細胞の成分、および中枢神経系の細
胞に由来しないタンパク質に向けられた免疫細胞を検出することができる。さら
に、種々の免疫細胞が、成分(エピトープ)の様々な領域を認識し、認識されるエ
ピトープ数の増加は疾患の悪化と相互に関係がある。
【0075】
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、分離して比較的容易に精製することが
できるミエリンの成分である。中枢神経系(CNS)におけるミエリンの約30%
は、MPBで構成される。MBPは、炎症誘導特性を有することが証明されたミ
エリンの第1のタンパク質構成成分であった。例として、本発明によるベクター
は、以下のエピトープを、単独でまたは組合せて、コードして発現させる:AA
1〜20、AA 7〜26、AA 16〜38、AA 38〜55、AA 5
0〜68、AA 61〜82、AA 71〜89、AA 83〜102、AA
94〜117、AA 108〜131、AA 124〜141、AA 131〜
145、AA 139〜153、AA 148〜162、AA 153〜170
、AA 80〜102、AA 81〜99、AA 82〜100、AA 83〜
99、AA 85〜99、AA 86〜99およびAA 159〜169。
できるミエリンの成分である。中枢神経系(CNS)におけるミエリンの約30%
は、MPBで構成される。MBPは、炎症誘導特性を有することが証明されたミ
エリンの第1のタンパク質構成成分であった。例として、本発明によるベクター
は、以下のエピトープを、単独でまたは組合せて、コードして発現させる:AA
1〜20、AA 7〜26、AA 16〜38、AA 38〜55、AA 5
0〜68、AA 61〜82、AA 71〜89、AA 83〜102、AA
94〜117、AA 108〜131、AA 124〜141、AA 131〜
145、AA 139〜153、AA 148〜162、AA 153〜170
、AA 80〜102、AA 81〜99、AA 82〜100、AA 83〜
99、AA 85〜99、AA 86〜99およびAA 159〜169。
【0076】
ミエリンタンパク脂質タンパク質(PLP)は、50%を越える含有率を有し、
中枢神経系におけるミエリンの最大の構成成分である。PLPは強い疎水特性を
有する膜タンパク質である。PLPは、主として、CD4+、PLP特異的T細
胞であり、増殖実験によって、多発性硬化症に罹患している患者の血液中で同定
されている。例として、本発明によるベクターは、単独でまたは組合せて、以下
のエピトープをコードして発現させる:AA 40〜60、AA 89〜106
、AA 103〜120、AA 125〜143、AA 139〜154、AA
1〜275、AA 95〜117、AA 139〜151およびAA 185
〜206。
中枢神経系におけるミエリンの最大の構成成分である。PLPは強い疎水特性を
有する膜タンパク質である。PLPは、主として、CD4+、PLP特異的T細
胞であり、増殖実験によって、多発性硬化症に罹患している患者の血液中で同定
されている。例として、本発明によるベクターは、単独でまたは組合せて、以下
のエピトープをコードして発現させる:AA 40〜60、AA 89〜106
、AA 103〜120、AA 125〜143、AA 139〜154、AA
1〜275、AA 95〜117、AA 139〜151およびAA 185
〜206。
【0077】
ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(MOG)は、ミエリンの比較的小さ
い構成成分である。(0.01〜0.05%)。MOGは、26〜28kDaの分
子量を有し、免疫グロブリン様可変ドメインおよび2つの疎水性(潜在的)貫膜ド
メインで構成される。MOGがT細胞仲介炎症性反応および脱髄抗体の両者を誘
導する動物モデルで行われた調査研究、および多発性硬化症と関連して行われた
調査研究によって、糖タンパク質は、中枢神経系の脱髄自己免疫疾患における重
要な抗原であると同定された。例として、本発明によるベクターは、個々にまた
は組合せて、MOGの以下のエピトープをコードして発現させる:AA 1〜2
2、AA 35〜55、AA 36〜45、AA 34〜56、AA 43〜5
7、AA 64〜96、AA 92〜106、AA 134〜148、AA 1
〜26、AA 14〜39、AA 27〜50、AA 38〜60、AA 50
〜74、AA 63〜87、AA 76〜100、AA 89〜113、AA
101〜125、AA 162〜178、AA 168〜182およびAA 1
4〜36。
い構成成分である。(0.01〜0.05%)。MOGは、26〜28kDaの分
子量を有し、免疫グロブリン様可変ドメインおよび2つの疎水性(潜在的)貫膜ド
メインで構成される。MOGがT細胞仲介炎症性反応および脱髄抗体の両者を誘
導する動物モデルで行われた調査研究、および多発性硬化症と関連して行われた
調査研究によって、糖タンパク質は、中枢神経系の脱髄自己免疫疾患における重
要な抗原であると同定された。例として、本発明によるベクターは、個々にまた
は組合せて、MOGの以下のエピトープをコードして発現させる:AA 1〜2
2、AA 35〜55、AA 36〜45、AA 34〜56、AA 43〜5
7、AA 64〜96、AA 92〜106、AA 134〜148、AA 1
〜26、AA 14〜39、AA 27〜50、AA 38〜60、AA 50
〜74、AA 63〜87、AA 76〜100、AA 89〜113、AA
101〜125、AA 162〜178、AA 168〜182およびAA 1
4〜36。
【0078】
オリゴデンドロサイト上のミエリン関連の塩基性タンパク質(ミエリン関連オ
リゴデンドロサイト塩基性タンパク質、MOBP)は、ミエリンの主構成成分の
1つである。段階的に進行する多発性硬化症に罹患している患者は、MOBPに
対して細胞性免疫反応を示す。例として、本発明によるベクターは、以下のエピ
トープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA 1〜19、A
A 11〜29、AA 21〜39、AA 31〜49、AA 37〜60、A
A 41〜59、AA 51〜69、AA 83〜99、AA 1〜60および
AA 27〜50。
リゴデンドロサイト塩基性タンパク質、MOBP)は、ミエリンの主構成成分の
1つである。段階的に進行する多発性硬化症に罹患している患者は、MOBPに
対して細胞性免疫反応を示す。例として、本発明によるベクターは、以下のエピ
トープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA 1〜19、A
A 11〜29、AA 21〜39、AA 31〜49、AA 37〜60、A
A 41〜59、AA 51〜69、AA 83〜99、AA 1〜60および
AA 27〜50。
【0079】
オリゴデンドロサイト特異的タンパク質(OSP)は、総ミエリンの約7%を示
す。OSPは、207アミノ酸の長さを有する貫膜タンパク質である。OSPの
第三次構造の比較によって、CNSにおける末梢ミエリンタンパク質22との相
同性が明らかにされた。段階的に進行する萎縮多発性硬化症を有する患者の髄液
で、OSPに対する抗体を検出することができた。OSP特異性を有するT細胞
は、ヒトに存在することが証明されている。例として、本発明によるベクターは
、以下のエピトープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA
52〜71、AA 72〜91、AA 82〜101、AA 102〜121、
AA 131〜151、AA 142〜161、AA 182〜201およびA
A 192〜207。
す。OSPは、207アミノ酸の長さを有する貫膜タンパク質である。OSPの
第三次構造の比較によって、CNSにおける末梢ミエリンタンパク質22との相
同性が明らかにされた。段階的に進行する萎縮多発性硬化症を有する患者の髄液
で、OSPに対する抗体を検出することができた。OSP特異性を有するT細胞
は、ヒトに存在することが証明されている。例として、本発明によるベクターは
、以下のエピトープを、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA
52〜71、AA 72〜91、AA 82〜101、AA 102〜121、
AA 131〜151、AA 142〜161、AA 182〜201およびA
A 192〜207。
【0080】
ミエリン関連糖タンパク質(MAG)は、中枢神経系および末梢神経系における
ミエリンの構成成分である。MAGは、100kDaの分子量を有する膜タンパ
ク質であり、細胞外免疫グロブリン様ドメイン5個、貫膜ドメイン1個および細
胞質ドメイン1個を含む。交互スプライシングによって形成される2つのアイソ
フォーム(L形およびS形)が記載されており、これらの形は、ミエリン形成中の
異なる時期に検出される。MAGは、ミエリン形成性シュワン細胞の軸索周膜お
よびオリゴデンドロサイトにあり、グリア−軸索相互作用と関係があると考えら
れる。例として、本発明によるベクターは、以下のエピトープを、個々にまたは
組合せてコードして発現させる:AA 20〜34、AA 124〜137、A
A 354〜377およびAA 570〜582。
ミエリンの構成成分である。MAGは、100kDaの分子量を有する膜タンパ
ク質であり、細胞外免疫グロブリン様ドメイン5個、貫膜ドメイン1個および細
胞質ドメイン1個を含む。交互スプライシングによって形成される2つのアイソ
フォーム(L形およびS形)が記載されており、これらの形は、ミエリン形成中の
異なる時期に検出される。MAGは、ミエリン形成性シュワン細胞の軸索周膜お
よびオリゴデンドロサイトにあり、グリア−軸索相互作用と関係があると考えら
れる。例として、本発明によるベクターは、以下のエピトープを、個々にまたは
組合せてコードして発現させる:AA 20〜34、AA 124〜137、A
A 354〜377およびAA 570〜582。
【0081】
次に説明するタンパク質は、病原性免疫細胞の他の標的を構成する。末梢神経
系およびシュワン細胞の構成成分としての、糖タンパク質P0。P0は、30k
Daの分子量を有し、末梢神経系におけるコンパクトミエリン(compact
myelin)の量の50%以上を構成する。末梢ミエリンタンパク質22(
PMP−22/PAS−II)は、22kDaの分子量を有する。PMP−22
は、シュワン細胞特異的ではないが、肺、胃および心臓等の他の組織でも発現さ
れる。p170k/SAG(シュワン細胞膜糖タンパク質)は、170kDaの分
子量を有する糖タンパク質である。SAGは、有髄化シュワン細胞および非有髄
化シュワン細胞によって産生される。オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク
質(OMgp)は、専ら中枢神経系で発現されるMPBと相同性を有する糖タンパ
ク質である。シュワン細胞ミエリンタンパク質(SMP)は、シュワン細胞で形成
される別の糖タンパク質であり、ニワトリで発見された。この糖タンパク質は、
MAGと44%の相同性を示す。自己免疫反応性細胞の標的として同定されてい
る他のポリペプチドは、トランスアルドラーゼ、S100β、αBクリスタリン
、2’,3’−サイクリックヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNP)
およびGFAPである。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク
質、またはそのフラグメント、特にT細胞エピトープを担持する領域、または領
域の組合せをさらにコードする。
系およびシュワン細胞の構成成分としての、糖タンパク質P0。P0は、30k
Daの分子量を有し、末梢神経系におけるコンパクトミエリン(compact
myelin)の量の50%以上を構成する。末梢ミエリンタンパク質22(
PMP−22/PAS−II)は、22kDaの分子量を有する。PMP−22
は、シュワン細胞特異的ではないが、肺、胃および心臓等の他の組織でも発現さ
れる。p170k/SAG(シュワン細胞膜糖タンパク質)は、170kDaの分
子量を有する糖タンパク質である。SAGは、有髄化シュワン細胞および非有髄
化シュワン細胞によって産生される。オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク
質(OMgp)は、専ら中枢神経系で発現されるMPBと相同性を有する糖タンパ
ク質である。シュワン細胞ミエリンタンパク質(SMP)は、シュワン細胞で形成
される別の糖タンパク質であり、ニワトリで発見された。この糖タンパク質は、
MAGと44%の相同性を示す。自己免疫反応性細胞の標的として同定されてい
る他のポリペプチドは、トランスアルドラーゼ、S100β、αBクリスタリン
、2’,3’−サイクリックヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNP)
およびGFAPである。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク
質、またはそのフラグメント、特にT細胞エピトープを担持する領域、または領
域の組合せをさらにコードする。
【0082】
重症筋無力症
進行性筋衰弱を来たす自己免疫疾患である重症筋無力症は、筋細胞上のアセチ
ルコリン受容体に向けられた自己抗体によって引き起こされる。自己抗体の産生
は、特異的Tヘルパー細胞に依存する。重症筋無力症患者の10%は、胸腺の上
皮腫瘍に罹患している。この腫瘍細胞は、アセチルコリン受容体の(サブユニッ
トおよびεサブユニットをコードするmRNAを合成し、また、ことによると、
このような方式で、胸腺におけるT細胞、または循環T細胞を、誤ってアセチル
コリン受容体のエピトープに対して感作する可能性がある。成熟中の胸腺細胞で
は、寛容誘導機構もことによると混乱している。細胞およびT細胞に対するエピ
トープを構成するアセチルコリン受容体のサブユニットにおける領域は、何度も
記載されている。例として、本発明によるベクターは、アセチルコリン受容体の
サブユニット、またはこれらのサブユニットのフラグメント、特に、以下の領域
を、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA (1〜437、AA
(3〜181、AA (37〜114、AA (37〜181、AA (62〜9
0、AA (73〜90、AA (75〜90、AA (75〜115、AA (1
30〜178、AA (138〜167、AA (144〜156、AA (14
9〜158、AA (149〜163、AA (146〜160およびAA ε2
01〜219。
ルコリン受容体に向けられた自己抗体によって引き起こされる。自己抗体の産生
は、特異的Tヘルパー細胞に依存する。重症筋無力症患者の10%は、胸腺の上
皮腫瘍に罹患している。この腫瘍細胞は、アセチルコリン受容体の(サブユニッ
トおよびεサブユニットをコードするmRNAを合成し、また、ことによると、
このような方式で、胸腺におけるT細胞、または循環T細胞を、誤ってアセチル
コリン受容体のエピトープに対して感作する可能性がある。成熟中の胸腺細胞で
は、寛容誘導機構もことによると混乱している。細胞およびT細胞に対するエピ
トープを構成するアセチルコリン受容体のサブユニットにおける領域は、何度も
記載されている。例として、本発明によるベクターは、アセチルコリン受容体の
サブユニット、またはこれらのサブユニットのフラグメント、特に、以下の領域
を、個々にまたは組合せて、コードして発現させる:AA (1〜437、AA
(3〜181、AA (37〜114、AA (37〜181、AA (62〜9
0、AA (73〜90、AA (75〜90、AA (75〜115、AA (1
30〜178、AA (138〜167、AA (144〜156、AA (14
9〜158、AA (149〜163、AA (146〜160およびAA ε2
01〜219。
【0083】
関節リウマチ
関節リウマチは、自己免疫機構に原因があると考えられる最初の全身性疾患の
1つであった。関節リウマチの本質的に2つの様相から、免疫系の基本的な乱れ
が疾患の原因であることが示唆される。その第1は、多くの場合、炎症性の肥大
性滑膜組織における、CD4+T細胞を含むリンパ球の、非常に広範囲の浸潤で
あり、その第2は、滑膜におけるB細胞およびプラズマ細胞による大量のリウマ
チ因子の産生である。リウマチ因子は、IgGの重鎖の構造付与領域に向けられ
た抗体である。関節および関節外構造における特異的組織損傷は、炎症性パンヌ
スおよびリウマチ結節と呼ばれる顆粒細胞の沈着に原因があると考えられる。関
節リウマチ発生に関与するT細胞を支持する最も重要な議論は、疾患と特定のM
HCクラスIIハプロタイプとの強い関連性と、マウスモデルで、単離されたT
細胞によって適応可能に疾患が導入されるという観察結果である。結合組織にお
ける構造物(たとえば、コラーゲン、プロテオグルカン類および軟骨細胞上の抗
原)、熱ショックタンパク質および外因性ウイルス抗原または細菌性抗原を含む
非常に多種多様の抗原が、自己反応性免疫細胞の可能な標的であると記載されて
いる。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク質またはそのフラ
グメント、特に、T細胞エピトープ(たとえばII型コラーゲン(CII))を担
持する領域または領域の組合せをコードする。
1つであった。関節リウマチの本質的に2つの様相から、免疫系の基本的な乱れ
が疾患の原因であることが示唆される。その第1は、多くの場合、炎症性の肥大
性滑膜組織における、CD4+T細胞を含むリンパ球の、非常に広範囲の浸潤で
あり、その第2は、滑膜におけるB細胞およびプラズマ細胞による大量のリウマ
チ因子の産生である。リウマチ因子は、IgGの重鎖の構造付与領域に向けられ
た抗体である。関節および関節外構造における特異的組織損傷は、炎症性パンヌ
スおよびリウマチ結節と呼ばれる顆粒細胞の沈着に原因があると考えられる。関
節リウマチ発生に関与するT細胞を支持する最も重要な議論は、疾患と特定のM
HCクラスIIハプロタイプとの強い関連性と、マウスモデルで、単離されたT
細胞によって適応可能に疾患が導入されるという観察結果である。結合組織にお
ける構造物(たとえば、コラーゲン、プロテオグルカン類および軟骨細胞上の抗
原)、熱ショックタンパク質および外因性ウイルス抗原または細菌性抗原を含む
非常に多種多様の抗原が、自己反応性免疫細胞の可能な標的であると記載されて
いる。例として、本発明によるベクターは、これらのタンパク質またはそのフラ
グメント、特に、T細胞エピトープ(たとえばII型コラーゲン(CII))を担
持する領域または領域の組合せをコードする。
【0084】
I型糖尿病
I型糖尿病は、遺伝学的疾病素質を含む多因性の自己免疫疾患である。インス
リン産生性β細胞の破壊がTリンパ球によって引き起こされる。BothCD4 + T細胞もCD8+T細胞も病因に関与し、炎症性反応の発生には、両サブタイプ
が同程度に必要である。糖尿病用の動物モデルである、NODマウスを用いた実
験で、CD8+T細胞は機能的エフェクター細胞であると同定された。前糖尿病
NODマウスから、遺伝学的疾病素質を示すが、免疫細胞を持たないSCID−
NODマウスにCD8+T細胞を導入することによって、疾患を伝達することが
できた。
リン産生性β細胞の破壊がTリンパ球によって引き起こされる。BothCD4 + T細胞もCD8+T細胞も病因に関与し、炎症性反応の発生には、両サブタイプ
が同程度に必要である。糖尿病用の動物モデルである、NODマウスを用いた実
験で、CD8+T細胞は機能的エフェクター細胞であると同定された。前糖尿病
NODマウスから、遺伝学的疾病素質を示すが、免疫細胞を持たないSCID−
NODマウスにCD8+T細胞を導入することによって、疾患を伝達することが
できた。
【0085】
既に、多数の可能な自己抗原が、糖尿病で同定されている。前糖尿病患者およ
び糖尿病が最近診断された患者で、様々な自己抗原に向けられた抗体が検出され
ている。さらに、ある程度、異なる特異性を有するCD4+およびCD8+T細胞
が検出されている。本明細書に記載の本発明の関連の中で、遺伝子療法用ベクタ
ーは、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の標的となる抗原性タンパク
質、タンパク質フラグメント、またはエピトープおよびエピトープの組合せをコ
ードして発現させる機能領域または遺伝子を担持する。本発明の意味の範囲内で
、抗原性タンパク質は、糖尿病に罹患している個体のT細胞によって、MHCク
ラスIまたはMHCクラスIIと共に、シンジェニック細胞上で認識されるタン
パク質である。
び糖尿病が最近診断された患者で、様々な自己抗原に向けられた抗体が検出され
ている。さらに、ある程度、異なる特異性を有するCD4+およびCD8+T細胞
が検出されている。本明細書に記載の本発明の関連の中で、遺伝子療法用ベクタ
ーは、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の標的となる抗原性タンパク
質、タンパク質フラグメント、またはエピトープおよびエピトープの組合せをコ
ードして発現させる機能領域または遺伝子を担持する。本発明の意味の範囲内で
、抗原性タンパク質は、糖尿病に罹患している個体のT細胞によって、MHCク
ラスIまたはMHCクラスIIと共に、シンジェニック細胞上で認識されるタン
パク質である。
【0086】
I型糖尿病における自己免疫機構の1つの標的は、チロシンホスファターゼI
A−2である。このタンパク質に対する自己抗体(この自己抗体は、ほとんど常
に、このタンパク質の細胞内ドメインに向けられている)を、糖尿病に罹患して
いる患者で検出することができる。糖尿病に対する遺伝学的疾病素質を有する個
体では、IA−2に対する自己抗体は、疾患の急速な悪化の明白なマーカーであ
る。糖尿病におけるT細胞の抗原性標的として、本ベクターは、IA−2タンパ
ク質全体、またはそのタンパク質フラグメントをコードして発現させることがで
きる。例として、本発明によるベクターは、以下の領域を、個々にまたは組合せ
て、コードして発現させる(この領域は、MHC−DR4と共に、エピトープ担
持領域として同定されている):AA 654〜674、AA 709〜732
、AA 753〜771、AA797〜817、AA 854〜872およびA
A 955〜975。
A−2である。このタンパク質に対する自己抗体(この自己抗体は、ほとんど常
に、このタンパク質の細胞内ドメインに向けられている)を、糖尿病に罹患して
いる患者で検出することができる。糖尿病に対する遺伝学的疾病素質を有する個
体では、IA−2に対する自己抗体は、疾患の急速な悪化の明白なマーカーであ
る。糖尿病におけるT細胞の抗原性標的として、本ベクターは、IA−2タンパ
ク質全体、またはそのタンパク質フラグメントをコードして発現させることがで
きる。例として、本発明によるベクターは、以下の領域を、個々にまたは組合せ
て、コードして発現させる(この領域は、MHC−DR4と共に、エピトープ担
持領域として同定されている):AA 654〜674、AA 709〜732
、AA 753〜771、AA797〜817、AA 854〜872およびA
A 955〜975。
【0087】
I型糖尿病における可能な自己抗原の中で、インスリンおよびその前駆体、す
なわち、プロインスリンは、β細胞で独占的に合成される唯一のタンパク質であ
る。前糖尿病患者および糖尿病患者で、プロインスリンに向けられた自己抗体を
検出することができる。プロインスリン特異的T細胞を導入することによって、
NODマウスで糖尿病を引き起こすことができ、この観察結果から、細胞の免疫
応答の標的としてのプロインスリンの重要性がわかる。糖尿病におけるT細胞の
抗原性標的として、本ベクターは、全α鎖、全β鎖、連結ペプチド、全プロイン
スリンタンパク質またはタンパク質フラグメントを、個々にまたは組合せて、コ
ードして発現させる。例として、本発明によるベクターは、エピトープ担持領域
と同定されている、以下の領域をコードして発現させる:α鎖とβ鎖との間の連
結ペプチドの領域からの、AA 1〜15(p1〜15)およびAA 35〜50
(p35〜50);α鎖の領域からのAA 6〜80(a6〜80);β鎖の領域か
らのAA 9〜23およびAA 10〜25(b10〜25)。
なわち、プロインスリンは、β細胞で独占的に合成される唯一のタンパク質であ
る。前糖尿病患者および糖尿病患者で、プロインスリンに向けられた自己抗体を
検出することができる。プロインスリン特異的T細胞を導入することによって、
NODマウスで糖尿病を引き起こすことができ、この観察結果から、細胞の免疫
応答の標的としてのプロインスリンの重要性がわかる。糖尿病におけるT細胞の
抗原性標的として、本ベクターは、全α鎖、全β鎖、連結ペプチド、全プロイン
スリンタンパク質またはタンパク質フラグメントを、個々にまたは組合せて、コ
ードして発現させる。例として、本発明によるベクターは、エピトープ担持領域
と同定されている、以下の領域をコードして発現させる:α鎖とβ鎖との間の連
結ペプチドの領域からの、AA 1〜15(p1〜15)およびAA 35〜50
(p35〜50);α鎖の領域からのAA 6〜80(a6〜80);β鎖の領域か
らのAA 9〜23およびAA 10〜25(b10〜25)。
【0088】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)は、I型糖尿病に罹患して
いる患者における、自己免疫反応の標的構造の1つである。患者の血中の単核細
胞は、細胞***と共にタンパク質に反応し、さらに、患者の70%以上が、GA
D65に向けられた抗体を有する。MHC型のため、糖尿病に対する遺伝学的疾
病素質を示す個体では、GAD65およびIA−2に向けられた抗体の組合せは
、I型糖尿病が発生かけているという強力な兆候である。糖尿病におけるT細胞
の抗原性標的として、本ベクターは、全GAD65タンパク質またはそのタンパ
ク質フラグメントをコードして発現させることができる。例として、本発明によ
るベクターは、以下の領域(この領域は、MHC−DQ8と共に、エピトープ担
持領域として同定されている)を、個々にまたは組合せて、コードして発現させ
る:AA 1〜60、AA 51〜120、AA 101〜115、AA 11
1〜180、AA 171〜240、AA 206〜220、AA 231〜3
00、AA 291〜360、AA 351〜420、AA 411〜480、
AA 431〜445、AA 461〜475、AA 471〜530、AA
521〜585、AA 536〜550、AA 121〜140、AA 201
〜220、AA 231〜250およびAA 471〜490。GAD65は、
CD8+T細胞の標的でもある。従って、ベクターは、領域AA 15〜23も
コードして発現させる。他の可能な領域は、AA 505〜519およびAA
521〜535である。
いる患者における、自己免疫反応の標的構造の1つである。患者の血中の単核細
胞は、細胞***と共にタンパク質に反応し、さらに、患者の70%以上が、GA
D65に向けられた抗体を有する。MHC型のため、糖尿病に対する遺伝学的疾
病素質を示す個体では、GAD65およびIA−2に向けられた抗体の組合せは
、I型糖尿病が発生かけているという強力な兆候である。糖尿病におけるT細胞
の抗原性標的として、本ベクターは、全GAD65タンパク質またはそのタンパ
ク質フラグメントをコードして発現させることができる。例として、本発明によ
るベクターは、以下の領域(この領域は、MHC−DQ8と共に、エピトープ担
持領域として同定されている)を、個々にまたは組合せて、コードして発現させ
る:AA 1〜60、AA 51〜120、AA 101〜115、AA 11
1〜180、AA 171〜240、AA 206〜220、AA 231〜3
00、AA 291〜360、AA 351〜420、AA 411〜480、
AA 431〜445、AA 461〜475、AA 471〜530、AA
521〜585、AA 536〜550、AA 121〜140、AA 201
〜220、AA 231〜250およびAA 471〜490。GAD65は、
CD8+T細胞の標的でもある。従って、ベクターは、領域AA 15〜23も
コードして発現させる。他の可能な領域は、AA 505〜519およびAA
521〜535である。
【0089】
I型糖尿病において、熱ショックタンパク質Hsp60は、活性化免疫細胞の
別の標的を構成する。このベクターは、たとえば、T細胞エピトープであるとN
ODマウスで同定されているAA437−460領域(ペプチド277)をコード
して発現させる。T細胞エピトープを含むHsp60タンパク質における多数の
エピトープまたは領域が、糖尿病罹患者および健康な対照個体で同定されている
。例として、本発明によるベクターは、全Hsp60タンパク質またはそのフラ
グメント、特に、T細胞エピトープを担持する以下の領域、または領域の組合せ
をコードする:AA 1〜20、AA 16〜35、AA 31〜50、AA
46〜65、AA 61〜80、AA 106〜125、AA 121〜140
、AA 136〜155、AA 151〜170、AA 166〜185、AA
195〜214、AA 240〜259、AA 255〜275、AA 27
1〜290、AA 286〜305、AA 301〜320、AA 346〜3
65、AA 421〜440、AA 436〜455、AA 466〜485お
よびAA 511〜530。I型糖尿病における自己免疫反応の他の標的は、β
細胞の細胞膜内の、未だ特性決定されていないタンパク質によって構成される。
島細胞タンパク質ICA69および分泌顆粒内の38kDaという分子量を有す
るタンパク質(Roep et al.(1991)Lancet 337:14
39−1441)がさらなる抗原であるとして同定されている。例として、本発
明によるベクターは、これらのタンパク質、またはそのフラグメント、特に、T
細胞エピトープを担持する領域、または領域の組合せをコードする。
別の標的を構成する。このベクターは、たとえば、T細胞エピトープであるとN
ODマウスで同定されているAA437−460領域(ペプチド277)をコード
して発現させる。T細胞エピトープを含むHsp60タンパク質における多数の
エピトープまたは領域が、糖尿病罹患者および健康な対照個体で同定されている
。例として、本発明によるベクターは、全Hsp60タンパク質またはそのフラ
グメント、特に、T細胞エピトープを担持する以下の領域、または領域の組合せ
をコードする:AA 1〜20、AA 16〜35、AA 31〜50、AA
46〜65、AA 61〜80、AA 106〜125、AA 121〜140
、AA 136〜155、AA 151〜170、AA 166〜185、AA
195〜214、AA 240〜259、AA 255〜275、AA 27
1〜290、AA 286〜305、AA 301〜320、AA 346〜3
65、AA 421〜440、AA 436〜455、AA 466〜485お
よびAA 511〜530。I型糖尿病における自己免疫反応の他の標的は、β
細胞の細胞膜内の、未だ特性決定されていないタンパク質によって構成される。
島細胞タンパク質ICA69および分泌顆粒内の38kDaという分子量を有す
るタンパク質(Roep et al.(1991)Lancet 337:14
39−1441)がさらなる抗原であるとして同定されている。例として、本発
明によるベクターは、これらのタンパク質、またはそのフラグメント、特に、T
細胞エピトープを担持する領域、または領域の組合せをコードする。
【0090】
アポトーシス誘導性リガンドの発現
本発明によるベクターは、1つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードす
る核酸配列を含むことを特徴とする。アポトーシスは、遺伝子レベルで制御され
る過程であり、ホメオスタシスの制御、組織および器官の発生、およびもはや必
要とされない免疫系の細胞の除去に関与する過程である。アポトーシスは、染色
体に対する損傷またはウイルス病原体感染によって変化を受けた細胞の除去にも
関与する。正常細胞は、「生存シグナル」と呼ばれるものによってアポトーシス
から保護される。しかし、損傷または感染によって誘発される前アポトーシスシ
グナルは、細胞死で終わる一連の事象を開始する。アポトーシスによる細胞死は
、クロマチンの肥厚、染色体DNAの断片化、膜の一種の水膨れ、細胞の収縮、
および、最後に、膜に包囲された小胞内の死細胞の分解(アポトーシス体)を特徴
とする。
る核酸配列を含むことを特徴とする。アポトーシスは、遺伝子レベルで制御され
る過程であり、ホメオスタシスの制御、組織および器官の発生、およびもはや必
要とされない免疫系の細胞の除去に関与する過程である。アポトーシスは、染色
体に対する損傷またはウイルス病原体感染によって変化を受けた細胞の除去にも
関与する。正常細胞は、「生存シグナル」と呼ばれるものによってアポトーシス
から保護される。しかし、損傷または感染によって誘発される前アポトーシスシ
グナルは、細胞死で終わる一連の事象を開始する。アポトーシスによる細胞死は
、クロマチンの肥厚、染色体DNAの断片化、膜の一種の水膨れ、細胞の収縮、
および、最後に、膜に包囲された小胞内の死細胞の分解(アポトーシス体)を特徴
とする。
【0091】
細胞には、アポトーシスの誘発を来たす、本質的に2つのシグナル経路が存在
する。この2つの経路は、異なるインデューサーに反応する。本発明に関する経
路は、CD95/Fas/Apo1、TRAILまたはApo3等の、細胞の表
面上のアポトーシス受容体の刺激、ならびにFADDおよびTRADD等のアダ
プター分子による仲介によって、制御作用を有するカスパーゼ8(FLICE、
イニシエーターカスパーゼ)の活性化、および次のカスパーゼ、たとえば、アポ
トーシスを誘導するカスパーゼ3(エフェクターカスパーゼ)の活性化を来たす。
それに対して、他のシグナル、たとえば、DNA損傷、成長因子の欠如、欠陥細
胞付着または活性化腫瘍遺伝子は、ミトコンドリアからの因子、たとえば、チト
クロームCおよびAPAF1、およびBclファミリーの因子が含まれる、シグ
ナルカスケードの誘導につながる。このカスケードは、カスパーゼ9(イニシエ
ーターカスパーゼ)の活性化、および、次に、カスパーゼ3の活性化につながる
。
する。この2つの経路は、異なるインデューサーに反応する。本発明に関する経
路は、CD95/Fas/Apo1、TRAILまたはApo3等の、細胞の表
面上のアポトーシス受容体の刺激、ならびにFADDおよびTRADD等のアダ
プター分子による仲介によって、制御作用を有するカスパーゼ8(FLICE、
イニシエーターカスパーゼ)の活性化、および次のカスパーゼ、たとえば、アポ
トーシスを誘導するカスパーゼ3(エフェクターカスパーゼ)の活性化を来たす。
それに対して、他のシグナル、たとえば、DNA損傷、成長因子の欠如、欠陥細
胞付着または活性化腫瘍遺伝子は、ミトコンドリアからの因子、たとえば、チト
クロームCおよびAPAF1、およびBclファミリーの因子が含まれる、シグ
ナルカスケードの誘導につながる。このカスケードは、カスパーゼ9(イニシエ
ーターカスパーゼ)の活性化、および、次に、カスパーゼ3の活性化につながる
。
【0092】
アポトーシス受容体は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーの一
部を形成する、「死受容体」と呼ばれるもののサブファミリーに属する。このフ
ァミリーのメンバーは、システインリッチ胞外ドメインの2〜4個のコピーを特
徴とする。アポトーシス受容体は、言い換えれば、アポトーシスシグナルのさら
なる伝達に不可欠な細胞内「死ドメイン」(DD)を有する。アダプタータンパク
質によって、アポトーシスシグナルは、多数の段階を経て、最終的にアポトーシ
スを開始するカスパーゼに伝達される。
部を形成する、「死受容体」と呼ばれるもののサブファミリーに属する。このフ
ァミリーのメンバーは、システインリッチ胞外ドメインの2〜4個のコピーを特
徴とする。アポトーシス受容体は、言い換えれば、アポトーシスシグナルのさら
なる伝達に不可欠な細胞内「死ドメイン」(DD)を有する。アダプタータンパク
質によって、アポトーシスシグナルは、多数の段階を経て、最終的にアポトーシ
スを開始するカスパーゼに伝達される。
【0093】
アポトーシス誘導性リガンドは、膜在タンパク質または可溶性タンパク質、た
とえばCD95L/FasL/Apo1L、Apo2L/TRAILまたはAp
o3Lであって、他の細胞上、または同一細胞上の、特異的受容体分子、たとえ
ば、CD95/Fas/Apo1、TRAILまたはApo3と相互に作用し、
それにによって、受容体担持細胞におけるアポトーシスを誘導する。アポトーシ
ス誘導性リガンドは、たとえば、腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーに属
する。TNFファミリーのメンバーは、構造特性および生化学的特性を特徴とす
る。メンバーは、タンパク質分解的切断によって可溶性リガンドに転換すること
もできるリンホトキシン(LT)(およびβを除き、II型貫膜タンパク質である
。リガンドは、その特異的アポトーシス受容体との相互作用によって、これらの
受容体を三量体化させる、3個の同一サブユニットを有する三量体として存在す
る。
とえばCD95L/FasL/Apo1L、Apo2L/TRAILまたはAp
o3Lであって、他の細胞上、または同一細胞上の、特異的受容体分子、たとえ
ば、CD95/Fas/Apo1、TRAILまたはApo3と相互に作用し、
それにによって、受容体担持細胞におけるアポトーシスを誘導する。アポトーシ
ス誘導性リガンドは、たとえば、腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーに属
する。TNFファミリーのメンバーは、構造特性および生化学的特性を特徴とす
る。メンバーは、タンパク質分解的切断によって可溶性リガンドに転換すること
もできるリンホトキシン(LT)(およびβを除き、II型貫膜タンパク質である
。リガンドは、その特異的アポトーシス受容体との相互作用によって、これらの
受容体を三量体化させる、3個の同一サブユニットを有する三量体として存在す
る。
【0094】
カスパーゼは、一群のシステインプロテアーゼである。14種のカスパーゼが
今までに哺乳動物(ヒトを含む)で同定されている。カスパーゼは、アミノ酸アス
パラギン酸のカルボキシル側で切れるアミノ酸4個からなるモチーフを認識する
。カスパーゼは、酵素原、すなわち、非常に低い活性を有する前駆体タンパク質
として合成され、これらの酵素原は、タンパク質分解的切断によって活性化され
る。活性化された酵素は、いずれの場合にも、切断した、同一のサブユニット2
個を含むヘテロ四量体である。多数のカスパーゼが自己タンパク分解的切断によ
って活性化されるが、さらなるカスパーゼによって活性化されるものもある。イ
ニシエーターカスパーゼと呼ばれるもの(カスパーゼ8およびカスパーゼ9)は、
エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ3)と呼ばれるものをタンパク質分解的切断
によって活性化することにより、自己増大性カスパーゼ活性の雪崩を開始する。
今までに哺乳動物(ヒトを含む)で同定されている。カスパーゼは、アミノ酸アス
パラギン酸のカルボキシル側で切れるアミノ酸4個からなるモチーフを認識する
。カスパーゼは、酵素原、すなわち、非常に低い活性を有する前駆体タンパク質
として合成され、これらの酵素原は、タンパク質分解的切断によって活性化され
る。活性化された酵素は、いずれの場合にも、切断した、同一のサブユニット2
個を含むヘテロ四量体である。多数のカスパーゼが自己タンパク分解的切断によ
って活性化されるが、さらなるカスパーゼによって活性化されるものもある。イ
ニシエーターカスパーゼと呼ばれるもの(カスパーゼ8およびカスパーゼ9)は、
エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ3)と呼ばれるものをタンパク質分解的切断
によって活性化することにより、自己増大性カスパーゼ活性の雪崩を開始する。
【0095】
アダプタータンパク質は、アポトーシスのエフェクター(カスパーゼ)とレギュ
レーター(Bcl−2ファミリー受容体)との間の連結を構成する。アダプターは
、死ドメイン(DD)、死エフェクタードメイン(DED)およびカスパーゼ補充ド
メイン(CARD)と呼ばれるものにより、同形相互作用によって、3群の因子と
物理学的に相互に作用する。
レーター(Bcl−2ファミリー受容体)との間の連結を構成する。アダプターは
、死ドメイン(DD)、死エフェクタードメイン(DED)およびカスパーゼ補充ド
メイン(CARD)と呼ばれるものにより、同形相互作用によって、3群の因子と
物理学的に相互に作用する。
【0096】
本発明によるベクターは、アポトーシス誘導性リガンドをコードする核酸配列
を含む。たとえば、本ベクターは、受容体分子CD95/Fas/Apo−1に
結合するリガンドCD95Lをコードする。CD95は、約45〜52kDaの
分子量を有する(335アミノ酸)グリコシル化膜タンパク質(I型)である。タン
パク質の幾つかの可溶性形も、メッセンジャーRNAのディファレンシャルスプ
ライシングの結果として生じる。CD95分子の発現は、インターフェロン−γ
(IFN−γ)、TNFおよびT細胞活性化によって刺激される。自然状態では、
CD95仲介アポトーシスは、天然リガンドCD95L(FasL、Apo−1
−L)と結合するCD95によって誘導される。CD95Lは、同様に、タンパ
ク質分解的切断の結果として、可溶性形で存在するTNF関連膜タンパク質(I
I型)であり、CD95に結合することができる。CD95LとCD95との相
互作用は、CD95担持細胞のCa2+−非依存的(すなわち、パーフォリン/グ
ランザイムによる誘導と異なる)アポトーシスを来たす。
を含む。たとえば、本ベクターは、受容体分子CD95/Fas/Apo−1に
結合するリガンドCD95Lをコードする。CD95は、約45〜52kDaの
分子量を有する(335アミノ酸)グリコシル化膜タンパク質(I型)である。タン
パク質の幾つかの可溶性形も、メッセンジャーRNAのディファレンシャルスプ
ライシングの結果として生じる。CD95分子の発現は、インターフェロン−γ
(IFN−γ)、TNFおよびT細胞活性化によって刺激される。自然状態では、
CD95仲介アポトーシスは、天然リガンドCD95L(FasL、Apo−1
−L)と結合するCD95によって誘導される。CD95Lは、同様に、タンパ
ク質分解的切断の結果として、可溶性形で存在するTNF関連膜タンパク質(I
I型)であり、CD95に結合することができる。CD95LとCD95との相
互作用は、CD95担持細胞のCa2+−非依存的(すなわち、パーフォリン/グ
ランザイムによる誘導と異なる)アポトーシスを来たす。
【0097】
さらに、本発明によるベクターは、特異的受容体分子TRAIL−R1(DR
4)、TRAIL−R2(KILLER、DR5、TRICK2)、TRAIL−
R3(LIT、DcR1)およびTRAIL−R4(TRUNDD、DcR2)に結
合する、タンパク質TRAIL(APO−2L)をコードする核酸配列を含むこと
ができる。TRAILは、多数の細胞、たとえば、II型インターフェロン刺激
単球、サイトメガロウイルス感染線維芽細胞、I型インターフェロン刺激T細胞
またはNK細胞および抗原刺激T細胞またはNK細胞上に、自然に存在すること
が証明されている。TRAILは、多数の形質転換腫瘍細胞系および活性化T細
胞で、アポトーシスを誘導する。TRAIL−R2受容体をコードするmRNA
を、多種多様な組織、たとえば、脾臓、胸腺および末梢血中のリンパ球で検出す
ることができた。TRAIL−R2に関するmRNAを発現させる細胞および組
織は、TRAIL仲介アポトーシスを受けやすい。
4)、TRAIL−R2(KILLER、DR5、TRICK2)、TRAIL−
R3(LIT、DcR1)およびTRAIL−R4(TRUNDD、DcR2)に結
合する、タンパク質TRAIL(APO−2L)をコードする核酸配列を含むこと
ができる。TRAILは、多数の細胞、たとえば、II型インターフェロン刺激
単球、サイトメガロウイルス感染線維芽細胞、I型インターフェロン刺激T細胞
またはNK細胞および抗原刺激T細胞またはNK細胞上に、自然に存在すること
が証明されている。TRAILは、多数の形質転換腫瘍細胞系および活性化T細
胞で、アポトーシスを誘導する。TRAIL−R2受容体をコードするmRNA
を、多種多様な組織、たとえば、脾臓、胸腺および末梢血中のリンパ球で検出す
ることができた。TRAIL−R2に関するmRNAを発現させる細胞および組
織は、TRAIL仲介アポトーシスを受けやすい。
【0098】
さらに、本発明によるベクターは、APO−3リガンド(Apo3L/TWE
AK)をコードする核酸配列を含むことができる。Apo3Lは、149アミノ
酸の長さを有するII型貫膜タンパク質である。ApoL3の細胞外領域は、T
NFと高度の相同性を示す。Apo3LmRNAは、多種多様な類リンパ組織お
よび非類リンパ組織で検出されている。ApoL3は、受容体分子Apo3(D
R3、WSL−1、TRAMP、LARD)に結合し、受容体担持細胞における
アポトーシスを誘導する。Apo3Lに対する受容体は、主としてリンパ球の細
胞表面上、たとえば、末梢血(PBL)中の非刺激休止リンパ球、フィトヘマグル
チニン(PHA)処理PBL、CD4+T細胞、CD8+T細胞およびB細胞上に発
現される。Apo3Lによるアポトーシスの誘導は、FADD/MORT1によ
り仲介される。ApoL3仲介アポトーシスは、牛痘ウイルスから得られるウイ
ルスのカスパーゼインヒビターCrmA、およびバキュロウイルスp35タンパ
ク質によって、ブロックされる。
AK)をコードする核酸配列を含むことができる。Apo3Lは、149アミノ
酸の長さを有するII型貫膜タンパク質である。ApoL3の細胞外領域は、T
NFと高度の相同性を示す。Apo3LmRNAは、多種多様な類リンパ組織お
よび非類リンパ組織で検出されている。ApoL3は、受容体分子Apo3(D
R3、WSL−1、TRAMP、LARD)に結合し、受容体担持細胞における
アポトーシスを誘導する。Apo3Lに対する受容体は、主としてリンパ球の細
胞表面上、たとえば、末梢血(PBL)中の非刺激休止リンパ球、フィトヘマグル
チニン(PHA)処理PBL、CD4+T細胞、CD8+T細胞およびB細胞上に発
現される。Apo3Lによるアポトーシスの誘導は、FADD/MORT1によ
り仲介される。ApoL3仲介アポトーシスは、牛痘ウイルスから得られるウイ
ルスのカスパーゼインヒビターCrmA、およびバキュロウイルスp35タンパ
ク質によって、ブロックされる。
【0099】
組換え的に修飾された細胞におけるアポトーシスの阻害
本発明によるベクターは、適切な場合には、1つ以上の抗アポトーシス分子を
コードする核酸配列を含むことを特徴とする。CD95、TRAIL、TRAM
P、TNFまたはリンホトキシンと、それらの特異的受容体との相互作用は、異
なる細胞間のみならず、同一の細胞上でも起こり、それによって、オートクリン
様式で、アポトーシスを誘導させる。この1例は、活性化された免疫細胞のアポ
トーシス、すなわち、活性化誘導性細胞死と呼ばれるものであり、もはや必要と
されない免疫細胞の除去につながる。T細胞受容体によって増殖するように刺激
されたT細胞は、それらの細胞表面上にCD95を発現させ、このCD95は膜
上のCD95Lと相互に作用する。
コードする核酸配列を含むことを特徴とする。CD95、TRAIL、TRAM
P、TNFまたはリンホトキシンと、それらの特異的受容体との相互作用は、異
なる細胞間のみならず、同一の細胞上でも起こり、それによって、オートクリン
様式で、アポトーシスを誘導させる。この1例は、活性化された免疫細胞のアポ
トーシス、すなわち、活性化誘導性細胞死と呼ばれるものであり、もはや必要と
されない免疫細胞の除去につながる。T細胞受容体によって増殖するように刺激
されたT細胞は、それらの細胞表面上にCD95を発現させ、このCD95は膜
上のCD95Lと相互に作用する。
【0100】
本発明によるベクターで修飾された細胞における、他の(たとえば、出発細胞
を修飾するときは細胞培養中の)細胞による、このようなオートクリン誘導、ま
たはパラクリン誘導を防止するために、ベクターは、アポトーシスの細胞内イン
ヒビター(抗アポトーシス分子)をコードする核酸配列を含むことができる。これ
らのインヒビターは、細胞膜内の異なる受容体分子、受容体とカスパーゼとの間
で死シグナルを伝達するアダプター分子、またはカスパーゼ自身のいずれかと相
互に反応する。これらのインヒビターは、細胞自身に由来して、アポトーシスの
制御に関与するか、あるいは、十分なウイルスの子孫が産生され、放出されるま
で、ウイルス感染細胞で起きるアポトーシスを防止するウイルスタンパク質であ
るかのいずれかである。
を修飾するときは細胞培養中の)細胞による、このようなオートクリン誘導、ま
たはパラクリン誘導を防止するために、ベクターは、アポトーシスの細胞内イン
ヒビター(抗アポトーシス分子)をコードする核酸配列を含むことができる。これ
らのインヒビターは、細胞膜内の異なる受容体分子、受容体とカスパーゼとの間
で死シグナルを伝達するアダプター分子、またはカスパーゼ自身のいずれかと相
互に反応する。これらのインヒビターは、細胞自身に由来して、アポトーシスの
制御に関与するか、あるいは、十分なウイルスの子孫が産生され、放出されるま
で、ウイルス感染細胞で起きるアポトーシスを防止するウイルスタンパク質であ
るかのいずれかである。
【0101】
アポトーシスの誘導は、受容体、アダプターおよびカスパーゼを含むカスケー
ドの様々な段階で、阻害することができる。特に、ウイルスは、免疫機構として
、アポトーシスに対して自分自身を守るために考案された多数の方策を有する。
本発明は、ベクターによって変更された細胞を、アポトーシスのオートクリン誘
導から保護するために、ウイルスおよび細胞の機構を使用する。
ドの様々な段階で、阻害することができる。特に、ウイルスは、免疫機構として
、アポトーシスに対して自分自身を守るために考案された多数の方策を有する。
本発明は、ベクターによって変更された細胞を、アポトーシスのオートクリン誘
導から保護するために、ウイルスおよび細胞の機構を使用する。
【0102】
本発明によるベクターは、たとえば、ウイルスのE3領域からのアデノウイル
スタンパク質をコードする核酸配列含むことができる。これらのタンパク質は、
TNFRが活性化されるとき誘導される膜結合生化学的過程を阻害する。タンパ
ク質E3−14.7Kは、TNF受容体による刺激の結果として、ホスホリパー
ゼA2(PLA2)によるアラキドン酸の放出を阻害する。アデノウイルスタンパ
ク質E3−14.5KおよびE3−10.4Kは、TNFRの刺激後、PLA2
の細胞質から細胞膜への転位置を防止する、複合体RIDを形成する。さらに、
RIDは、膜結合CD95の急速なインターナリゼーションおよびリソソーム分
解を引き起こす。
スタンパク質をコードする核酸配列含むことができる。これらのタンパク質は、
TNFRが活性化されるとき誘導される膜結合生化学的過程を阻害する。タンパ
ク質E3−14.7Kは、TNF受容体による刺激の結果として、ホスホリパー
ゼA2(PLA2)によるアラキドン酸の放出を阻害する。アデノウイルスタンパ
ク質E3−14.5KおよびE3−10.4Kは、TNFRの刺激後、PLA2
の細胞質から細胞膜への転位置を防止する、複合体RIDを形成する。さらに、
RIDは、膜結合CD95の急速なインターナリゼーションおよびリソソーム分
解を引き起こす。
【0103】
さらに、本発明によるベクターは、DEDドメインと高度の相同性を示すタン
パク質をコードする核酸配列を含むことができる。これらのタンパク質は、FL
IPと呼ばれ、ウイルスタンパク質は、υFLIPと呼ばれる。一方では、シグ
ナルは、受容体とFADDとの間をなだれ落ち、他方では、カスパーゼ8(FL
ICE)がブロックされ、その結果、DEDドメインにより、FLIPs/υF
LIPとアダプタータンパク質FADDとの間の同形相互作用によって、アポト
ーシスが防止される。
パク質をコードする核酸配列を含むことができる。これらのタンパク質は、FL
IPと呼ばれ、ウイルスタンパク質は、υFLIPと呼ばれる。一方では、シグ
ナルは、受容体とFADDとの間をなだれ落ち、他方では、カスパーゼ8(FL
ICE)がブロックされ、その結果、DEDドメインにより、FLIPs/υF
LIPとアダプタータンパク質FADDとの間の同形相互作用によって、アポト
ーシスが防止される。
【0104】
さらに、本発明によるベクターは、次に説明するタンパク質をコードする核酸
配列を含むことができる。伝染性軟属腫ウイルスからのタンパク質MC159(
Bertin et al.(1997)Proc Natl Acad Sci
U S A 94:1172−1176)およびMC160は、FADDに結
合し、それによって、カスパーゼ8およびFADDが補充されるのを妨げる。ヘ
ルペスウイルスBHV−4からのタンパク質BORFE2(E1.1)およびウマ
ヘルペスウイルスEHV−2(Bertin et al.(1997)Proc
Natl Acad Sci U S A 94:1172−1176)から
のE8は、不活性なプロカスパーゼ8に結合し、このような方式で、FADDと
の相互作用および結果として活性化を妨げる。HHV−8からのタンパク質K1
3およびヘルペスウイルスサイミリ(saimiri)からのORF71も、D
EDドメインを有し、同じ方式で作用する。さらに、アポトーシスカスケードに
おけるシグナル因子(FADD、TRADD、TRAF)を結合し、それによって
、不活化する、ウイルスタンパク質をコードすることができる。細胞タンパク質
Bcl−2と相同性を示すアデノウイルスタンパク質E1B−19Kは、FAD
Dと相互に作用し、それによって、TNFRおよびCD95からのシグナル導入
をブロックする。加えて、E1B−19Kは、さらに、Bcl−2を機能的に置
き換えて、ミトコンドリア(カスパーゼ9を介する)による活性化を妨げることが
できる。エプスタインバーウイルスLMP−1タンパク質は、様々なTRAF分
子(TNFR関連の因子)と相互に作用し、それによってTNFRからのシグナル
導入をブロックする。さらに、LMP−1は、TRADDも結合する。しかし、
たぶん、TRADD用の結合部位が修飾されているため、アポトーシスシグナル
カスケードは誘導されない。LMP−1はさらに、抗アポトーシスタンパク質A
20、Bcl−2およびMcl−1の発現を誘導する本発明によるベクターは、
たとえば、プロテインキナーゼC仲介経路を経て、Fas誘導性アポトーシスに
対する抵抗性を仲介するSV40LTタンパク質を、さらに発現させる。たとえ
ば、本発明によるベクターは、ポリオーマタンパク質STおよびMT(両者とも
、CD95仲介および/またはTNFR仲介アポトーシスに対する抵抗性を仲介
する)をコードする。STタンパク質は、タンパク質PP2Aを結合して阻害す
ることにより、これを実現する。MTタンパク質は、細胞の生存を促進するシグ
ナル経路を直接活性化する。これらの経路は、PI3キナーゼを含み、これが、
前アポトーシス作用を有するタンパク質Badを次にリン酸化し、それによって
不活化する。
配列を含むことができる。伝染性軟属腫ウイルスからのタンパク質MC159(
Bertin et al.(1997)Proc Natl Acad Sci
U S A 94:1172−1176)およびMC160は、FADDに結
合し、それによって、カスパーゼ8およびFADDが補充されるのを妨げる。ヘ
ルペスウイルスBHV−4からのタンパク質BORFE2(E1.1)およびウマ
ヘルペスウイルスEHV−2(Bertin et al.(1997)Proc
Natl Acad Sci U S A 94:1172−1176)から
のE8は、不活性なプロカスパーゼ8に結合し、このような方式で、FADDと
の相互作用および結果として活性化を妨げる。HHV−8からのタンパク質K1
3およびヘルペスウイルスサイミリ(saimiri)からのORF71も、D
EDドメインを有し、同じ方式で作用する。さらに、アポトーシスカスケードに
おけるシグナル因子(FADD、TRADD、TRAF)を結合し、それによって
、不活化する、ウイルスタンパク質をコードすることができる。細胞タンパク質
Bcl−2と相同性を示すアデノウイルスタンパク質E1B−19Kは、FAD
Dと相互に作用し、それによって、TNFRおよびCD95からのシグナル導入
をブロックする。加えて、E1B−19Kは、さらに、Bcl−2を機能的に置
き換えて、ミトコンドリア(カスパーゼ9を介する)による活性化を妨げることが
できる。エプスタインバーウイルスLMP−1タンパク質は、様々なTRAF分
子(TNFR関連の因子)と相互に作用し、それによってTNFRからのシグナル
導入をブロックする。さらに、LMP−1は、TRADDも結合する。しかし、
たぶん、TRADD用の結合部位が修飾されているため、アポトーシスシグナル
カスケードは誘導されない。LMP−1はさらに、抗アポトーシスタンパク質A
20、Bcl−2およびMcl−1の発現を誘導する本発明によるベクターは、
たとえば、プロテインキナーゼC仲介経路を経て、Fas誘導性アポトーシスに
対する抵抗性を仲介するSV40LTタンパク質を、さらに発現させる。たとえ
ば、本発明によるベクターは、ポリオーマタンパク質STおよびMT(両者とも
、CD95仲介および/またはTNFR仲介アポトーシスに対する抵抗性を仲介
する)をコードする。STタンパク質は、タンパク質PP2Aを結合して阻害す
ることにより、これを実現する。MTタンパク質は、細胞の生存を促進するシグ
ナル経路を直接活性化する。これらの経路は、PI3キナーゼを含み、これが、
前アポトーシス作用を有するタンパク質Badを次にリン酸化し、それによって
不活化する。
【0105】
同様に、本発明によるベクターは、修飾された細胞におけるアポトーシスのオ
ートクリン誘導を防止するために、カスパーゼインヒビターをコードすることが
できる。バキュロウイルスAutographica californica
核多面性ウイルス症ウイルス(AcNPV)およびBombyx mori NH
V(BmNPV)からのp35タンパク質は、ウイルス複製早期に合成され、多数
の非常に様々の刺激によるアポトーシスを防止する。p35は、TNFおよびC
D95のリガンドによるアポトーシスの誘導をブロックする。p35は、多数の
カスパーゼ(カスパーゼ1、3、6、7、8および10)によって切断される。し
かし、切断生成物は放出されないが、結合されたままであり、カスパーゼと一緒
に、安定した阻害性複合体を形成する。p35は、たとえば、本発明によるベク
ターによりコードされることができる。本発明によるベクターは、細胞セルピン
(serpin)と相同性を示すウイルスタンパク質もコードすることができる
。セルピンは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、多数の異なるカス
パーゼを阻害する。牛痘ウイルスからのCrmAは、カスパーゼ1および8をブ
ロックすることによって、CD95L誘導性およびTNFR誘導性アポトーシス
を阻害する。兎痘ウイルスからのSPI−1およびSPI−2タンパク質、およ
びワクシニアウイルスからのタンパク質B13Rは、CrmAと高度の相同性を
示し、同様に、CD95LおよびTNFによるアポトーシスを阻害する。粘液腫
ウイルスのSerp−1およびSerp−2タンパク質および兎痘ウイルスのS
PI−4タンパク質は、対応する抗アポトーシス特性を有する。さらに、vIA
P等の細胞性cIAPと相同なタンパク質、あるいはFLAME−1またはI−
FLICE等の細胞性タンパク質をコードすることができる。
ートクリン誘導を防止するために、カスパーゼインヒビターをコードすることが
できる。バキュロウイルスAutographica californica
核多面性ウイルス症ウイルス(AcNPV)およびBombyx mori NH
V(BmNPV)からのp35タンパク質は、ウイルス複製早期に合成され、多数
の非常に様々の刺激によるアポトーシスを防止する。p35は、TNFおよびC
D95のリガンドによるアポトーシスの誘導をブロックする。p35は、多数の
カスパーゼ(カスパーゼ1、3、6、7、8および10)によって切断される。し
かし、切断生成物は放出されないが、結合されたままであり、カスパーゼと一緒
に、安定した阻害性複合体を形成する。p35は、たとえば、本発明によるベク
ターによりコードされることができる。本発明によるベクターは、細胞セルピン
(serpin)と相同性を示すウイルスタンパク質もコードすることができる
。セルピンは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、多数の異なるカス
パーゼを阻害する。牛痘ウイルスからのCrmAは、カスパーゼ1および8をブ
ロックすることによって、CD95L誘導性およびTNFR誘導性アポトーシス
を阻害する。兎痘ウイルスからのSPI−1およびSPI−2タンパク質、およ
びワクシニアウイルスからのタンパク質B13Rは、CrmAと高度の相同性を
示し、同様に、CD95LおよびTNFによるアポトーシスを阻害する。粘液腫
ウイルスのSerp−1およびSerp−2タンパク質および兎痘ウイルスのS
PI−4タンパク質は、対応する抗アポトーシス特性を有する。さらに、vIA
P等の細胞性cIAPと相同なタンパク質、あるいはFLAME−1またはI−
FLICE等の細胞性タンパク質をコードすることができる。
【0106】
Cydia pompnella顆粒症ウイルス(CpGP)、Orgyiap
se audotsugata多面性ウイルス症ウイルス(OpMNPV)および
AcNPVは、上記p35のシグナルカスケードで作用するウイルスIAPs(
vIAP)をコードする。vIAPは、不活性なプロカスパーゼおよびカスパー
ゼ8を結合して阻害する(vIAPは、既に活性化されたカスパーゼを阻害する
ことはできないが、p35はできる)。cIAPは、TRAF分子と相互に作用
して、非TNFR関連の過程に起因するアポトーシスを阻害することもできる。
保存されたRING Fingerモチーフおよび少なくとも1個のいわゆるB
IRモチーフ(バキュロウイルスIAP反復)が、抗アポトーシス活性に必要であ
る。FLAME−1は、CD95/TNF受容体によるアポトーシスを阻害する
細胞タンパク質である(Srinivasula et al.(1997)J
Biol Chem 272:18542−18545)。FLAME−1は、
カスパーゼ10およびカスパーゼ8(FLICE)に対して高度の相同性を示す。
アミノ末端領域には、他のDEDタンパク質との同形相互作用を可能にするFA
DDのDEDドメインと相同性を示す2つの隣接した領域がある。第3の隣接領
域は、カスパーゼ8および10の機能的カスパーゼドメインと相同性を示す。F
LAME−1は、FADD、カスパーゼ8およびカスパーゼ9と直接相互に作用
するが、カスパーゼ活性を持たない。従って、FLAME−1は、CD95/T
NF受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなレプレッサーの役割をす
る。阻害作用は、CD95/TNR受容体/FADDからなる受容体複合体をブ
ロックする、機能的に不活性なFLAME−1タンパク質の結果として起こる。
I−FLICEは、組換え的に修飾された細胞におけるアポトーシスを防止する
ために、本発明によるベクターがコードして発現させることができる、もう1つ
の細胞性インヒビターである(Huet al.(1997)J Biol Ch
em 272:17255−17257)。I−FLICEは、FLICE/カ
スパーゼ8およびカスパーゼ10と構造的相同性を示す。アミノ末端領域には、
FADD DEDドメインと相同性を有する2つの隣接したドメインがある。カ
ルボキシ末端領域には、カスパーゼドメインと相同性を示すドメインが存在する
。しかし、I−FLICEは、カスパーゼ活性を全く示さず、CD95/TNF
受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなインヒビターの役割をする。
FLAME−1と対照的に、I−FLICEは、FLICE/カスパーゼ8およ
びカスパーゼ10に結合するだけで、FADDに結合しない。従って、CD95
L/TNFが、CD95/TNR受容体/FADDからなる受容体複合体に結合
することによって、I−FLAMEは補充されない。カスパーゼ8および10と
複合体を形成し、それによって不活化することにより、阻害作用がもたらされる
。
se audotsugata多面性ウイルス症ウイルス(OpMNPV)および
AcNPVは、上記p35のシグナルカスケードで作用するウイルスIAPs(
vIAP)をコードする。vIAPは、不活性なプロカスパーゼおよびカスパー
ゼ8を結合して阻害する(vIAPは、既に活性化されたカスパーゼを阻害する
ことはできないが、p35はできる)。cIAPは、TRAF分子と相互に作用
して、非TNFR関連の過程に起因するアポトーシスを阻害することもできる。
保存されたRING Fingerモチーフおよび少なくとも1個のいわゆるB
IRモチーフ(バキュロウイルスIAP反復)が、抗アポトーシス活性に必要であ
る。FLAME−1は、CD95/TNF受容体によるアポトーシスを阻害する
細胞タンパク質である(Srinivasula et al.(1997)J
Biol Chem 272:18542−18545)。FLAME−1は、
カスパーゼ10およびカスパーゼ8(FLICE)に対して高度の相同性を示す。
アミノ末端領域には、他のDEDタンパク質との同形相互作用を可能にするFA
DDのDEDドメインと相同性を示す2つの隣接した領域がある。第3の隣接領
域は、カスパーゼ8および10の機能的カスパーゼドメインと相同性を示す。F
LAME−1は、FADD、カスパーゼ8およびカスパーゼ9と直接相互に作用
するが、カスパーゼ活性を持たない。従って、FLAME−1は、CD95/T
NF受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなレプレッサーの役割をす
る。阻害作用は、CD95/TNR受容体/FADDからなる受容体複合体をブ
ロックする、機能的に不活性なFLAME−1タンパク質の結果として起こる。
I−FLICEは、組換え的に修飾された細胞におけるアポトーシスを防止する
ために、本発明によるベクターがコードして発現させることができる、もう1つ
の細胞性インヒビターである(Huet al.(1997)J Biol Ch
em 272:17255−17257)。I−FLICEは、FLICE/カ
スパーゼ8およびカスパーゼ10と構造的相同性を示す。アミノ末端領域には、
FADD DEDドメインと相同性を有する2つの隣接したドメインがある。カ
ルボキシ末端領域には、カスパーゼドメインと相同性を示すドメインが存在する
。しかし、I−FLICEは、カスパーゼ活性を全く示さず、CD95/TNF
受容体によるアポトーシスの支配的なネガティブなインヒビターの役割をする。
FLAME−1と対照的に、I−FLICEは、FLICE/カスパーゼ8およ
びカスパーゼ10に結合するだけで、FADDに結合しない。従って、CD95
L/TNFが、CD95/TNR受容体/FADDからなる受容体複合体に結合
することによって、I−FLAMEは補充されない。カスパーゼ8および10と
複合体を形成し、それによって不活化することにより、阻害作用がもたらされる
。
【0107】
本発明によるベクターによって修飾された細胞におけるアポトーシスの阻害は
、たとえば、アンチセンスアプローチ、誘導に関与するタンパク質(アポトーシ
ス受容体、アダプターおよびカスパーゼ)の発現を阻害することによって引き起
こすこともできる。
、たとえば、アンチセンスアプローチ、誘導に関与するタンパク質(アポトーシ
ス受容体、アダプターおよびカスパーゼ)の発現を阻害することによって引き起
こすこともできる。
【0108】
一方では、本発明によるベクターによりコードされて合成されるアンチセンス
RNAは、専らアポトーシスシグナル鎖におけるタンパク質に向けることができ
、ある特定の経路によって、たとえば、膜関連の受容体またはミトコンドリア仲
介経路によって、およびアポトーシスを阻害することができる。他方では、アン
チセンスRNAは、アポトーシスを誘導するためのシグナルカスケードにおける
異なる標的に特異的な様々な領域を含むことができる。アンチセンスRNAにお
けるこれらの異なる領域は、受容体タンパク質、アダプタータンパク質および/
またはカスパーゼに特定期である。本発明によるベクターは、たとえば、個々の
アポトーシス受容体、カスパーゼまたはアダプター分子に特異的に向けられる、
1つのアンチセンスRNAかまたは異なるアンチセンスRNAの組合せのいずれ
かを合成する。あるいは、ベクターは、それぞれ、個々のアポトーシス受容体、
カスパーゼまたはアダプター分子に特異的な幾つかの領域を含む1つのアンチセ
ンスRNAを発現させ、組合せて、アポトーシスに関与する幾つかのタンパク質
の発現を防止する。
RNAは、専らアポトーシスシグナル鎖におけるタンパク質に向けることができ
、ある特定の経路によって、たとえば、膜関連の受容体またはミトコンドリア仲
介経路によって、およびアポトーシスを阻害することができる。他方では、アン
チセンスRNAは、アポトーシスを誘導するためのシグナルカスケードにおける
異なる標的に特異的な様々な領域を含むことができる。アンチセンスRNAにお
けるこれらの異なる領域は、受容体タンパク質、アダプタータンパク質および/
またはカスパーゼに特定期である。本発明によるベクターは、たとえば、個々の
アポトーシス受容体、カスパーゼまたはアダプター分子に特異的に向けられる、
1つのアンチセンスRNAかまたは異なるアンチセンスRNAの組合せのいずれ
かを合成する。あるいは、ベクターは、それぞれ、個々のアポトーシス受容体、
カスパーゼまたはアダプター分子に特異的な幾つかの領域を含む1つのアンチセ
ンスRNAを発現させ、組合せて、アポトーシスに関与する幾つかのタンパク質
の発現を防止する。
【0109】
本発明に関して、ベクターは、たとえば、真核細胞におけるアポトーシス受容
体に関するアンチセンスRNAを合成する機能領域を担持する。前アポトーシス
作用を有するシグナルカスケードを開始する受容体分子の発現をブロックするこ
とにより、可能な最も早い段階で、遺伝子療法用ベクターで修飾された細胞にお
けるアポトーシスのオートクリン刺激がブロックされる。
体に関するアンチセンスRNAを合成する機能領域を担持する。前アポトーシス
作用を有するシグナルカスケードを開始する受容体分子の発現をブロックするこ
とにより、可能な最も早い段階で、遺伝子療法用ベクターで修飾された細胞にお
けるアポトーシスのオートクリン刺激がブロックされる。
【0110】
本発明によるベクターは、たとえば、CD95特異的アンチセンスRNAをコ
ードし、CD95/Fasの発現をブロックすることができる。CD95をブロ
ックすることにより、CD95L/FasLによるアポトーシスの誘導が防止さ
れる。たとえば、遺伝子療法用ベクターは、TNFRの発現をブロックし、細胞
をTNF仲介アポトーシスから保護するTNFR特異的アンチセンスRNAをコ
ードして発現させる。あるいは、本ベクターは、たとえば、それぞれ、TRAI
L−R1および/またはTRAIL−R2受容体の発現を防止する、TRAIL
−R1特異的および/またはTRAIL−R2特異的アンチセンスRNAをコー
ドして発現させる。こうすることによって、細胞を、TRAIL仲介アポトーシ
スに対して抵抗性にさせる。あるいは、遺伝子療法用ベクターは、変化した細胞
におけるTRAMP受容体の発現を防止するTRAMP受容体特異的アンチセン
スRNAをコードして発現させる。こうすることによって、細胞を、TRAMP
仲介アポトーシスに対して抵抗性にさせる。
ードし、CD95/Fasの発現をブロックすることができる。CD95をブロ
ックすることにより、CD95L/FasLによるアポトーシスの誘導が防止さ
れる。たとえば、遺伝子療法用ベクターは、TNFRの発現をブロックし、細胞
をTNF仲介アポトーシスから保護するTNFR特異的アンチセンスRNAをコ
ードして発現させる。あるいは、本ベクターは、たとえば、それぞれ、TRAI
L−R1および/またはTRAIL−R2受容体の発現を防止する、TRAIL
−R1特異的および/またはTRAIL−R2特異的アンチセンスRNAをコー
ドして発現させる。こうすることによって、細胞を、TRAIL仲介アポトーシ
スに対して抵抗性にさせる。あるいは、遺伝子療法用ベクターは、変化した細胞
におけるTRAMP受容体の発現を防止するTRAMP受容体特異的アンチセン
スRNAをコードして発現させる。こうすることによって、細胞を、TRAMP
仲介アポトーシスに対して抵抗性にさせる。
【0111】
本発明によるベクターは、たとえば、真核細胞におけるアダプタータンパク質
に関するアンチセンスRNAをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
これらのアダプター分子は、アポトーシス受容体より下のあるレベルで作用し、
1個のアダプター分子が幾つかのアポトーシス受容体で使用され、1つのアダプ
タータンパク質の発現をブロックすることによって、1つより多いアポトーシス
シグナル経路をブロックすることができる。1つのアダプター分子をブロックす
ることによって、異なるアポトーシス誘導性リガンドに対する抵抗性を実現する
ことができる。本発明によるベクターは、個々のアダプタータンパク質に特異的
に向けられた1つのンチセンスRNAまたは異なるアンチセンスRNAの組合せ
のいずれかを合成する。あるいは、本ベクターは、それぞれ、アダプタータンパ
ク質に特異的な個々の領域を含むアンチセンスRNAを発現させ、組合せて、幾
つかのアダプタータンパク質の発現を防止する。
に関するアンチセンスRNAをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
これらのアダプター分子は、アポトーシス受容体より下のあるレベルで作用し、
1個のアダプター分子が幾つかのアポトーシス受容体で使用され、1つのアダプ
タータンパク質の発現をブロックすることによって、1つより多いアポトーシス
シグナル経路をブロックすることができる。1つのアダプター分子をブロックす
ることによって、異なるアポトーシス誘導性リガンドに対する抵抗性を実現する
ことができる。本発明によるベクターは、個々のアダプタータンパク質に特異的
に向けられた1つのンチセンスRNAまたは異なるアンチセンスRNAの組合せ
のいずれかを合成する。あるいは、本ベクターは、それぞれ、アダプタータンパ
ク質に特異的な個々の領域を含むアンチセンスRNAを発現させ、組合せて、幾
つかのアダプタータンパク質の発現を防止する。
【0112】
本発明に関して、遺伝子療法用ベクターは、たとえば、FADDの発現を防止
するFADD特異的アンチセンスRNAをコードすることができる。FADD発
現の阻害によって、アポトーシス受容体CD95、TNFR、TRAIL−R1
、TRAIL−R2およびTRAMPによるシグナル導入がブロックされる。そ
の結果、細胞は、CD95L、TNF、TRAILおよびCD3によるアポトー
シスの誘導に対して抵抗性になる。さらに、ベクターは、たとえば、TRADD
の発現を防止するTRADD特異的アンチセンスRNAをコードすることができ
る。TRADDは、TNF/TNFRによるアポトーシスの誘導に特異的に関与
する。RADの発現を阻害することにより、TNF/TNFRによるアポトーシ
スの誘導が特異的にブロックされる。さらに、本ベクターは、APAF1特異的
アンチセンスRNAをコードすることができる。APAF1は、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスの誘導において中心的な役割を果たすアダプタータ
ンパク質であ。APAF1はチトクロームCと一緒にミトコンドリアから放出さ
れ、細胞の細胞質内で、dATPと会合して、カスパーゼ9を活性化する三量体
複合体を形成する。APAF1の合成を阻害することによって、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスがブロックされる。
するFADD特異的アンチセンスRNAをコードすることができる。FADD発
現の阻害によって、アポトーシス受容体CD95、TNFR、TRAIL−R1
、TRAIL−R2およびTRAMPによるシグナル導入がブロックされる。そ
の結果、細胞は、CD95L、TNF、TRAILおよびCD3によるアポトー
シスの誘導に対して抵抗性になる。さらに、ベクターは、たとえば、TRADD
の発現を防止するTRADD特異的アンチセンスRNAをコードすることができ
る。TRADDは、TNF/TNFRによるアポトーシスの誘導に特異的に関与
する。RADの発現を阻害することにより、TNF/TNFRによるアポトーシ
スの誘導が特異的にブロックされる。さらに、本ベクターは、APAF1特異的
アンチセンスRNAをコードすることができる。APAF1は、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスの誘導において中心的な役割を果たすアダプタータ
ンパク質であ。APAF1はチトクロームCと一緒にミトコンドリアから放出さ
れ、細胞の細胞質内で、dATPと会合して、カスパーゼ9を活性化する三量体
複合体を形成する。APAF1の合成を阻害することによって、ミトコンドリア
関連経路によるアポトーシスがブロックされる。
【0113】
本発明に関して、遺伝子療法用ベクターは、真核細胞における、カスパーゼ、
たとえば、カスパーゼ1、3、8または9に対するアンチセンスRNAをさらに
コードすることができる。本発明によるベクターは、1つのアンチセンスRNA
、または個々のカスパーゼに特異的に向けられた異なるアンチセンスRNAから
なる組合せのいずれかを合成するあるいは、本ベクターは、それぞれ、カスパー
ゼに特異的な個々の領域を含むアンチセンスRNAを発現させ、組合せて、幾つ
かのカスパーゼの発現を阻害する。
たとえば、カスパーゼ1、3、8または9に対するアンチセンスRNAをさらに
コードすることができる。本発明によるベクターは、1つのアンチセンスRNA
、または個々のカスパーゼに特異的に向けられた異なるアンチセンスRNAから
なる組合せのいずれかを合成するあるいは、本ベクターは、それぞれ、カスパー
ゼに特異的な個々の領域を含むアンチセンスRNAを発現させ、組合せて、幾つ
かのカスパーゼの発現を阻害する。
【0114】
自殺酵素
本発明によるベクターは、適切な場合には、組換え的に修飾された細胞を、い
つでも、たとえばin vivoで、除去することができる、自殺酵素をコード
する核酸配列を含むことを特徴とする。たとえば、自殺遺伝子は、体外から身体
に供給される生物学的基質(プロドラッグ)を有毒物質に転換する酵素および/ま
たは物質を、細胞の酵素によりこれらの物質が基質として使用されるような方式
で修飾する酵素を、コードして発現させる。あるいは、自殺酵素は、それ自身が
誘導な物質をコードするが、組換え的に修飾された細胞でのこれらの遺伝子の発
現は厳しく制御されている。本発明に関して、それ自身が有毒である物質をコー
ドする遺伝子は、細胞で強く抑制され、合成されない。生物学的物質または化学
物質を加えることにより、有毒なタンパク質をコードする遺伝子は活性化され、
次いで、細胞が死ぬ。本発明に関して記載されているベクターは、有毒でないか
または僅かに有毒であるにすぎないプロドラッグを、有毒な物質に転換する自殺
遺伝子をコードすることが好ましい。
つでも、たとえばin vivoで、除去することができる、自殺酵素をコード
する核酸配列を含むことを特徴とする。たとえば、自殺遺伝子は、体外から身体
に供給される生物学的基質(プロドラッグ)を有毒物質に転換する酵素および/ま
たは物質を、細胞の酵素によりこれらの物質が基質として使用されるような方式
で修飾する酵素を、コードして発現させる。あるいは、自殺酵素は、それ自身が
誘導な物質をコードするが、組換え的に修飾された細胞でのこれらの遺伝子の発
現は厳しく制御されている。本発明に関して、それ自身が有毒である物質をコー
ドする遺伝子は、細胞で強く抑制され、合成されない。生物学的物質または化学
物質を加えることにより、有毒なタンパク質をコードする遺伝子は活性化され、
次いで、細胞が死ぬ。本発明に関して記載されているベクターは、有毒でないか
または僅かに有毒であるにすぎないプロドラッグを、有毒な物質に転換する自殺
遺伝子をコードすることが好ましい。
【0115】
使用されるプロドラッグは、活性化された物質より著しく低い毒性を示さなけ
ればならず、また、酵素を活性化するためのすぐれた基質を構成しなければなら
ない。さらに、これらの物質は、生理的条件下で、十分に化学的に安定でなけれ
ばならず、また、すぐれた薬理学的および薬物動態学的特性をもたなければなら
ない。種類によって、幾つかのプロドラッグが細胞内に取込まれ、有毒物質に細
胞内転換される。他のプロドラッグは、細胞外活性化される。従って、プロドラ
ッグまたは活性化された有毒物質が細胞により容易に取込まれなければならない
。
ればならず、また、酵素を活性化するためのすぐれた基質を構成しなければなら
ない。さらに、これらの物質は、生理的条件下で、十分に化学的に安定でなけれ
ばならず、また、すぐれた薬理学的および薬物動態学的特性をもたなければなら
ない。種類によって、幾つかのプロドラッグが細胞内に取込まれ、有毒物質に細
胞内転換される。他のプロドラッグは、細胞外活性化される。従って、プロドラ
ッグまたは活性化された有毒物質が細胞により容易に取込まれなければならない
。
【0116】
たとえば、本発明によるベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジン
キナーゼ(TK)をコードして発現させる。HSV TKは、アシクロビルをリン
酸化してアシクロビルジホスフェートにし、これを、細胞性キナーゼがさらにリ
ン酸化する。基質の特異性のため、真核細胞チミジンキナーゼは、アシクロビル
をリン酸化することができず、そのため、非感染細胞またはHSV TK陰性細
胞は、グアノシン類似体に耐性がある。たとえば、本発明の治療用ベクターで修
飾されていたHSV感染および/またはチミジンキナーゼ陽性細胞は、アシクロ
ビルまたはガンシクロビルの全身投与によって選択的に除去することができる。
キナーゼ(TK)をコードして発現させる。HSV TKは、アシクロビルをリン
酸化してアシクロビルジホスフェートにし、これを、細胞性キナーゼがさらにリ
ン酸化する。基質の特異性のため、真核細胞チミジンキナーゼは、アシクロビル
をリン酸化することができず、そのため、非感染細胞またはHSV TK陰性細
胞は、グアノシン類似体に耐性がある。たとえば、本発明の治療用ベクターで修
飾されていたHSV感染および/またはチミジンキナーゼ陽性細胞は、アシクロ
ビルまたはガンシクロビルの全身投与によって選択的に除去することができる。
【0117】
さらに、本発明によるベクターは、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)チミジンキ
ナーゼをコードすることができる。VZV TKの作用は、HSV TKの作用
と類似しているが、VZV TKは6−メトキシプリンアラビノヌクレオシドを
使用するという違いがある。
ナーゼをコードすることができる。VZV TKの作用は、HSV TKの作用
と類似しているが、VZV TKは6−メトキシプリンアラビノヌクレオシドを
使用するという違いがある。
【0118】
さらに、本発明で述べるベクターは、以下のプロドラッグ/酵素系を活性化す
る酵素をコードすることができる:カルボキシルエステラーゼ(CA)は、イリノ
テカンを活性化し;シトシンデアミナーゼ(CD)は、5−フルオロシトシン(5
−FC)を活性化する;カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)は、2−クロロ
エチル−2−メシルオキシエチルアミノベンゾイル−L−グルタミン酸(CMD
A)およびCJS278Hを活性化し、また、自己活性化プロドラッグドキソルビ
シンおよびダウノルビシンも活性化する;チトクロームP450(Cyt450)
は、シクロホスファミド(CP)、イホスファミド(IF)、イポメアノール(ip
omeanol)および2−アミノアントラセン(2−AA)を活性化する;デオ
キシシチジンキナーゼ(dCK)は、シトシンアラビノース(ara−C)を活性化
する;ニトロリダクターゼ(NR)は、CB1954(5−アジリジニル−2、4
−ジニトロベンズアミド)を活性化する;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(P
NP)は、6−メチルプリン−2’−デオキシリボヌクレオシド(6−MePdR
)を活性化する;チミジンホスホリラーゼ(TP)は、5’−デオキシ−5−フル
オロウリジン(5’−DFUR)を活性化する;キサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(XGPRT)は、6−チオキサンチン(6−TX)および6
−チオグアニン(6−TG)を活性化する。さらに、本発明によるベクターは、5
−フルオロウラシルを活性化する細菌性ウラシルホスホリボシルトランスフェラ
ーゼをコードすることができるか、または、フルオロシトシン(5−FC)を活性
化する、シトシンデアミナーゼ(FCY1)およびSaccharomyces
cerevisiaeウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(FUR1)か
らなる融合タンパク質をコードすることができる。
る酵素をコードすることができる:カルボキシルエステラーゼ(CA)は、イリノ
テカンを活性化し;シトシンデアミナーゼ(CD)は、5−フルオロシトシン(5
−FC)を活性化する;カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)は、2−クロロ
エチル−2−メシルオキシエチルアミノベンゾイル−L−グルタミン酸(CMD
A)およびCJS278Hを活性化し、また、自己活性化プロドラッグドキソルビ
シンおよびダウノルビシンも活性化する;チトクロームP450(Cyt450)
は、シクロホスファミド(CP)、イホスファミド(IF)、イポメアノール(ip
omeanol)および2−アミノアントラセン(2−AA)を活性化する;デオ
キシシチジンキナーゼ(dCK)は、シトシンアラビノース(ara−C)を活性化
する;ニトロリダクターゼ(NR)は、CB1954(5−アジリジニル−2、4
−ジニトロベンズアミド)を活性化する;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(P
NP)は、6−メチルプリン−2’−デオキシリボヌクレオシド(6−MePdR
)を活性化する;チミジンホスホリラーゼ(TP)は、5’−デオキシ−5−フル
オロウリジン(5’−DFUR)を活性化する;キサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(XGPRT)は、6−チオキサンチン(6−TX)および6
−チオグアニン(6−TG)を活性化する。さらに、本発明によるベクターは、5
−フルオロウラシルを活性化する細菌性ウラシルホスホリボシルトランスフェラ
ーゼをコードすることができるか、または、フルオロシトシン(5−FC)を活性
化する、シトシンデアミナーゼ(FCY1)およびSaccharomyces
cerevisiaeウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(FUR1)か
らなる融合タンパク質をコードすることができる。
【0119】
遺伝子療法用の、本発明によるベクター
本発明は、1つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第1の核酸配
列、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列、および、適切な場合には、1
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列、および、適切な場合
には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列を含む、少なくとも1個
の核酸分子を含む、遺伝子導入ベクターに関する。
列、1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列、および、適切な場合には、1
つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列、および、適切な場合
には、1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列を含む、少なくとも1個
の核酸分子を含む、遺伝子導入ベクターに関する。
【0120】
第2の核酸配列の発現が、第1の核酸配列の発現に依存する、すなわち、抗原
の発現が、アポトーシス誘導性リガンドの発現に物理学的に連関し、且つ後者に
依存するように、第1および第2の核酸配列が互いに機能的に連結されている遺
伝子導入ベクターが特に好ましい。さらに、第3の核酸配列の発現が、第4の核
酸配列の発現に依存する、すなわち、抗アポトーシス分子の発現が、常に自殺酵
素の発現に連関し、且つ自殺酵素の発現に依存するように、第3および第4の核
酸配列が機能的に互いに連結している遺伝子導入ベクターが特に好ましい。
の発現が、アポトーシス誘導性リガンドの発現に物理学的に連関し、且つ後者に
依存するように、第1および第2の核酸配列が互いに機能的に連結されている遺
伝子導入ベクターが特に好ましい。さらに、第3の核酸配列の発現が、第4の核
酸配列の発現に依存する、すなわち、抗アポトーシス分子の発現が、常に自殺酵
素の発現に連関し、且つ自殺酵素の発現に依存するように、第3および第4の核
酸配列が機能的に互いに連結している遺伝子導入ベクターが特に好ましい。
【0121】
自己免疫疾患、または免疫病因に起因する疾患または移植された組織または器
官の拒絶に基づく疾患等の疾患を治療するために、本発明によるベクターの1つ
で、抗原提示細胞(APC)を処理することができる。APCを、たとえば、抗原
、アポトーシス誘導性リガンド、抗アポトーシス分子および自殺酵素をコードす
る核酸配列を含む遺伝子導入ベクターで処理することができる。さらに、APC
を、任意のタイプのベクターの組合せ、たとえば、本発明によるベクター(これ
らのベクターは、異なる抗原をコードする)の幾つかで処理することができる。
APCを、たとえば、抗原をコードする本発明によるベクターと、抗アポトーシ
ス分子をコードする本発明によるベクターとの組合せで処理することもできる。
たとえば、ベクターにおける個々の核酸領域が非常に大きく、たとえば、ベクタ
ーの作製または使用にネガティブな影響を及ぼすとき、またはAPCを、異なる
抗原、アポトーシスリガンド、抗アポトーシス分子または自殺酵素をコードする
ベクターで処理するとき、ベクターの組合せが有益である。
官の拒絶に基づく疾患等の疾患を治療するために、本発明によるベクターの1つ
で、抗原提示細胞(APC)を処理することができる。APCを、たとえば、抗原
、アポトーシス誘導性リガンド、抗アポトーシス分子および自殺酵素をコードす
る核酸配列を含む遺伝子導入ベクターで処理することができる。さらに、APC
を、任意のタイプのベクターの組合せ、たとえば、本発明によるベクター(これ
らのベクターは、異なる抗原をコードする)の幾つかで処理することができる。
APCを、たとえば、抗原をコードする本発明によるベクターと、抗アポトーシ
ス分子をコードする本発明によるベクターとの組合せで処理することもできる。
たとえば、ベクターにおける個々の核酸領域が非常に大きく、たとえば、ベクタ
ーの作製または使用にネガティブな影響を及ぼすとき、またはAPCを、異なる
抗原、アポトーシスリガンド、抗アポトーシス分子または自殺酵素をコードする
ベクターで処理するとき、ベクターの組合せが有益である。
【0122】
遺伝子情報を発現させるための調節要素
本発明による遺伝子導入ベクターは、第1〜第4の、上述の核酸配列以外に、
たとえば、哺乳類細胞における、たとえば、遺伝子の発現を調節および制御する
ための、さらなる配列および機能領域を含むことができる核酸を含む。これらの
配列および機能領域は、プロモーターおよび/またはプロモーターエレメントで
あってもよく、哺乳類細胞で遺伝子配列を発現させるためのウイルスプロモータ
ー配列であることが好ましい。ウイルスプロモーター配列の例としては、初期S
V40プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)LTRプロモーター、I型
ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)LTRプロモーター、アデノウイルス主要後
期プロモーター(Ad MLP)および単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモータ
ーなどがある。さらに、非ウイルス遺伝子のプロモーター、たとえばネズミ3−
ホスホグリセリンキナーゼのプロモーター、ヒトユビキチンCのプロモーターお
よびネズミメタロセイオネイン(metallotheionein)遺伝子の
プロモーターも、哺乳動物で遺伝子配列を効果的に発現させるのに適する。これ
に関して、構成的プロモータまたは制御可能な(誘導可能な)プロモーターを使用
して、発現を実行することができる。従って、例として、ホルモン刺激可能細胞
等の、ある一定の細胞型で、グルココルチコイド誘導プロモータを使用すること
ができる。
たとえば、哺乳類細胞における、たとえば、遺伝子の発現を調節および制御する
ための、さらなる配列および機能領域を含むことができる核酸を含む。これらの
配列および機能領域は、プロモーターおよび/またはプロモーターエレメントで
あってもよく、哺乳類細胞で遺伝子配列を発現させるためのウイルスプロモータ
ー配列であることが好ましい。ウイルスプロモーター配列の例としては、初期S
V40プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)LTRプロモーター、I型
ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)LTRプロモーター、アデノウイルス主要後
期プロモーター(Ad MLP)および単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモータ
ーなどがある。さらに、非ウイルス遺伝子のプロモーター、たとえばネズミ3−
ホスホグリセリンキナーゼのプロモーター、ヒトユビキチンCのプロモーターお
よびネズミメタロセイオネイン(metallotheionein)遺伝子の
プロモーターも、哺乳動物で遺伝子配列を効果的に発現させるのに適する。これ
に関して、構成的プロモータまたは制御可能な(誘導可能な)プロモーターを使用
して、発現を実行することができる。従って、例として、ホルモン刺激可能細胞
等の、ある一定の細胞型で、グルココルチコイド誘導プロモータを使用すること
ができる。
【0123】
発現率は、通常、上述のプロモーターエレメントを、エンハンサエレメントと
呼ばれるものと組合せることによって高めることができる。これに関して、ウイ
ルスのエンハンサエレメントは、通常、哺乳類細胞由来のエンハンサーより、広
い宿主スペクトルを有するため、多くの場合、特に効果的である。非常に効果的
な代表的なウイルスエンハンサーとしては、SV40初期遺伝子エンハンサおよ
びラウス肉腫ウイルスLTRおよびヒトサイトメガロウイルスからのプロモータ
ー/エンハンサ組合せなどがある。さらに、たとえば、ホルモン類または金属イ
オン等の、インデューサーの存在下で活性あるにすぎない、制御可能なエンハン
サエレメントを使用することも可能である。
呼ばれるものと組合せることによって高めることができる。これに関して、ウイ
ルスのエンハンサエレメントは、通常、哺乳類細胞由来のエンハンサーより、広
い宿主スペクトルを有するため、多くの場合、特に効果的である。非常に効果的
な代表的なウイルスエンハンサーとしては、SV40初期遺伝子エンハンサおよ
びラウス肉腫ウイルスLTRおよびヒトサイトメガロウイルスからのプロモータ
ー/エンハンサ組合せなどがある。さらに、たとえば、ホルモン類または金属イ
オン等の、インデューサーの存在下で活性あるにすぎない、制御可能なエンハン
サエレメントを使用することも可能である。
【0124】
さらに、これらの配列および機能領域は、リーダー配列および/またはプロセ
ッシング配列、たとえば、プロテアーゼ 切断部位であってもよく、哺乳類
細胞からの外来タンパク質の効果的な分泌を仲介するためには、アデノウイルス
の3部リーダー配列および哺乳類タンパク質の多数のリーダー配列、たとえば、
エリトロポイエチン遺伝子のリーダーおよびtPAリーダーであることが好まし
い。
ッシング配列、たとえば、プロテアーゼ 切断部位であってもよく、哺乳類
細胞からの外来タンパク質の効果的な分泌を仲介するためには、アデノウイルス
の3部リーダー配列および哺乳類タンパク質の多数のリーダー配列、たとえば、
エリトロポイエチン遺伝子のリーダーおよびtPAリーダーであることが好まし
い。
【0125】
さらに、これらの配列および機能領域は、転写終結配列およびポリアデニル化
配列であってもよい。哺乳類発現ベクターで使用するための、幾つかの非常に効
果的なポリAシグナルは、たとえば、ウシ成長ホルモン、マウスβ−グロビン、
初期SV40転写ユニットおよび単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に由来す
る。原核細胞転写ターミネーターについて詳細に記載されており、それらを組込
むことは、遺伝子発現に多数のポジティブな影響与える。真核細胞では、ヌクレ
オチド配列ATC AAA(A7T) TAG GAA GAを有するコンセン
サス配列が、9遺伝子の終結領域で同定されている。
配列であってもよい。哺乳類発現ベクターで使用するための、幾つかの非常に効
果的なポリAシグナルは、たとえば、ウシ成長ホルモン、マウスβ−グロビン、
初期SV40転写ユニットおよび単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に由来す
る。原核細胞転写ターミネーターについて詳細に記載されており、それらを組込
むことは、遺伝子発現に多数のポジティブな影響与える。真核細胞では、ヌクレ
オチド配列ATC AAA(A7T) TAG GAA GAを有するコンセン
サス配列が、9遺伝子の終結領域で同定されている。
【0126】
さらに、これらの配列および機能領域は、翻訳調節要素であってもよい。従っ
て、最適なKozak配列(CC(A/G)CcaugG)は、真核mRNAの翻訳
の開始を促進する。これに関して、最適な翻訳開始に特に重要なことは、−3位
のプリンAまたはGおよび出発コドンのすぐ上流のGに結合していなければなら
にことである。
て、最適なKozak配列(CC(A/G)CcaugG)は、真核mRNAの翻訳
の開始を促進する。これに関して、最適な翻訳開始に特に重要なことは、−3位
のプリンAまたはGおよび出発コドンのすぐ上流のGに結合していなければなら
にことである。
【0127】
さらに、イントロンを含まないcDNA遺伝子配列を発現させることができる
効率は、ORFの5′領域でイントロンを融合させることによって、10〜20
倍、有意に上昇する場合がある。これに関して、多数の異なるイントロンの例と
して、アデノウイルススプライスドナーを免疫グロブリン遺伝子スプライスアク
セプターに融合することによって作製された合成イントロンSIS、またはSV
40 19S後期mRNAイントロンは、様々な細胞で、ある特定の効力を有す
る。
効率は、ORFの5′領域でイントロンを融合させることによって、10〜20
倍、有意に上昇する場合がある。これに関して、多数の異なるイントロンの例と
して、アデノウイルススプライスドナーを免疫グロブリン遺伝子スプライスアク
セプターに融合することによって作製された合成イントロンSIS、またはSV
40 19S後期mRNAイントロンは、様々な細胞で、ある特定の効力を有す
る。
【0128】
さらに、正確な出発コドンにおける翻訳開始は、5′−未翻訳領域にさらなる
AUGコドンが存在することによってひどく損なわれることがある。このような
阻害は、上流AUGとインフレームである翻訳終結コドンが存在することによっ
て最小限に抑えることができる。さらに、翻訳は、5′−未翻訳領域(UTR)に
おける明確に定められた配列が二次構造を形成する傾向によって損なわれること
が多い。さらに、外来遺伝子配列内の不安定モチーフは、発現率に対してネガテ
ィブな作用を有することがある。この種の代表的な配列は、例として、多くの不
安定な哺乳類mRNAの3′UTR領域のAU−リッチ配列である。UUAUU
UAUUおよびUUAUUUA(U/A)(U(/A)は、非常に効果的な不安定配
列モチーフである。所望の外来遺伝子の発現を高めるために、これらの配列モチ
ーフは、除去するかまたは不活化すべきである。
AUGコドンが存在することによってひどく損なわれることがある。このような
阻害は、上流AUGとインフレームである翻訳終結コドンが存在することによっ
て最小限に抑えることができる。さらに、翻訳は、5′−未翻訳領域(UTR)に
おける明確に定められた配列が二次構造を形成する傾向によって損なわれること
が多い。さらに、外来遺伝子配列内の不安定モチーフは、発現率に対してネガテ
ィブな作用を有することがある。この種の代表的な配列は、例として、多くの不
安定な哺乳類mRNAの3′UTR領域のAU−リッチ配列である。UUAUU
UAUUおよびUUAUUUA(U/A)(U(/A)は、非常に効果的な不安定配
列モチーフである。所望の外来遺伝子の発現を高めるために、これらの配列モチ
ーフは、除去するかまたは不活化すべきである。
【0129】
さらに、適当な宿主特異的コドンを選択して使用すること(コドン使用)によっ
て、所望の核酸配列を発現させる効率を高めることができる。
て、所望の核酸配列を発現させる効率を高めることができる。
【0130】
発現ベクターは、通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび転写終
結配列の組合せを含む。さらに、エンハンサー、機能的スプライスドナーおよび
アクセプター部位を有するイントロン、およびリーダー配列も、必要に応じて、
モジュラー様式で、構築物内に組込むことができる。発現構築物は、レプリコン
、たとえば、哺乳類細胞等の宿主内で安定して生存することができる染色体外エ
レメント(たとえば、プラスミド)内に含まれることが多い。 哺乳類複製システ
ムは、動物ウイルス由来のものを含み、複製には、トランス活性な因子を必要と
する。たとえば、SV40またはポリオーマウイルス等のパポバウイルスの複製
システムを含むプラスミドは、付属するウイルスT抗原の存在下で、極めて多い
コピー数で複製する。哺乳類レプリコンの他の例としては、ウシ乳頭腫ウイルス
およびエプスタインバーウイルス由来のものなどがある。さらに、レプリコンは
、宿主での生存を保証する2つの複製システム、たとえば、哺乳動物における遺
伝子発現用の複製システムおよび細菌内でベクターを増幅するためのシステムを
含むことができる。プラスミドpMT2は、このような哺乳類/細菌シャトルベ
クターの1例である。
結配列の組合せを含む。さらに、エンハンサー、機能的スプライスドナーおよび
アクセプター部位を有するイントロン、およびリーダー配列も、必要に応じて、
モジュラー様式で、構築物内に組込むことができる。発現構築物は、レプリコン
、たとえば、哺乳類細胞等の宿主内で安定して生存することができる染色体外エ
レメント(たとえば、プラスミド)内に含まれることが多い。 哺乳類複製システ
ムは、動物ウイルス由来のものを含み、複製には、トランス活性な因子を必要と
する。たとえば、SV40またはポリオーマウイルス等のパポバウイルスの複製
システムを含むプラスミドは、付属するウイルスT抗原の存在下で、極めて多い
コピー数で複製する。哺乳類レプリコンの他の例としては、ウシ乳頭腫ウイルス
およびエプスタインバーウイルス由来のものなどがある。さらに、レプリコンは
、宿主での生存を保証する2つの複製システム、たとえば、哺乳動物における遺
伝子発現用の複製システムおよび細菌内でベクターを増幅するためのシステムを
含むことができる。プラスミドpMT2は、このような哺乳類/細菌シャトルベ
クターの1例である。
【0131】
アポトーシス誘導性リガンドの発現制御
リガンドの発現の、スイッチを入れたり切ったりすることができるように、ア
ポトーシス誘導性リガンドをコードする核酸配列を制御することができる。形質
導入細胞では、アポトーシス誘導性リガンド発現のスイッチを完全に切ることが
できる。これは、安定なベクター産生細胞系の作製またはおとり細胞の作製に特
に重要である。ほとんどの細胞は、ウイルス遺伝子導入ベクターの作製に使用す
ることができるパッケージング細胞系および形質導入される抗原提示細胞も含め
、その表面上にアポトーシス受容体を構成的に担持するため、アポトーシス誘導
性リガンドに関する遺伝子を有するこれらの細胞の形質導入により、アポトーシ
スのパラクリンおよびオートクリン誘導を招くであろう。培養において、パッケ
ージング系および/または形質導入細胞におけるリガンドの発現のスイッチを切
ることにより、これらの細胞間の非特異的な相互作用が防止され、培養が可能に
なる。
ポトーシス誘導性リガンドをコードする核酸配列を制御することができる。形質
導入細胞では、アポトーシス誘導性リガンド発現のスイッチを完全に切ることが
できる。これは、安定なベクター産生細胞系の作製またはおとり細胞の作製に特
に重要である。ほとんどの細胞は、ウイルス遺伝子導入ベクターの作製に使用す
ることができるパッケージング細胞系および形質導入される抗原提示細胞も含め
、その表面上にアポトーシス受容体を構成的に担持するため、アポトーシス誘導
性リガンドに関する遺伝子を有するこれらの細胞の形質導入により、アポトーシ
スのパラクリンおよびオートクリン誘導を招くであろう。培養において、パッケ
ージング系および/または形質導入細胞におけるリガンドの発現のスイッチを切
ることにより、これらの細胞間の非特異的な相互作用が防止され、培養が可能に
なる。
【0132】
次に説明する方法を使用して、リガンドの発現をスイッチ・オフすることが好
ましい。1.ClonTech,USA.により供給されるRevTetシステ
ムを使用することによる。2.発現ベクターおよび制御ベクターによる二重感染
の原理に基づくもう1つの可能性は、真核細胞の細菌の制御システム使用に基づ
く。アポトーシス誘導性リガンドに関する遺伝子は、強い原核細胞T7プロモー
ターの調節下にある。T7ポリメラーゼは、パッケージング系または次に形質導
入される細胞のいずれにも存在しないため、リガンドは発現されない。次いで、
リガンドが二重形質導入細胞で発現されるのは、T7ポリメラーゼに関する遺伝
子を共形質導入するために、第2の制御ベクターが使用されるときだけである。
3.別の適当なシステムは、バクテリオファージP1からのCre−loxPシ
ステムである。
ましい。1.ClonTech,USA.により供給されるRevTetシステ
ムを使用することによる。2.発現ベクターおよび制御ベクターによる二重感染
の原理に基づくもう1つの可能性は、真核細胞の細菌の制御システム使用に基づ
く。アポトーシス誘導性リガンドに関する遺伝子は、強い原核細胞T7プロモー
ターの調節下にある。T7ポリメラーゼは、パッケージング系または次に形質導
入される細胞のいずれにも存在しないため、リガンドは発現されない。次いで、
リガンドが二重形質導入細胞で発現されるのは、T7ポリメラーゼに関する遺伝
子を共形質導入するために、第2の制御ベクターが使用されるときだけである。
3.別の適当なシステムは、バクテリオファージP1からのCre−loxPシ
ステムである。
【0133】
抗原およびアポトーシス誘導性リガンドまたは抗アポトーシス分子および自殺酵
素の共発現 アポトーシス作用を有するリガンドと関連した免疫細胞により認識される抗原
、または抗原の構成成分のみを発現する本発明によるベクターが好ましい。この
同時発現は、合同転写物上で核酸配列を連結することにより実現される。これは
、T細胞を破壊せずに、抗原の構成成分を提示することにより、形質導入細胞が
in vivoで特異的T細胞を刺激するのを防止する。
素の共発現 アポトーシス作用を有するリガンドと関連した免疫細胞により認識される抗原
、または抗原の構成成分のみを発現する本発明によるベクターが好ましい。この
同時発現は、合同転写物上で核酸配列を連結することにより実現される。これは
、T細胞を破壊せずに、抗原の構成成分を提示することにより、形質導入細胞が
in vivoで特異的T細胞を刺激するのを防止する。
【0134】
構成的プロモーターまたは制御可能プロモーターの転写調節下で、2つ以上の
遺伝子を発現させるために、内部リボソームエントリー部位(internal ribosomal entry site:IRES)を使用することがで
きる。たとえば、ピコルナウイルス、肝炎CウイルスまたはBiP(免疫グロブ
リン重鎖結合性タンパク質)からのIRES、またはレトロウイルスのIRES
配列が使用される。
遺伝子を発現させるために、内部リボソームエントリー部位(internal ribosomal entry site:IRES)を使用することがで
きる。たとえば、ピコルナウイルス、肝炎CウイルスまたはBiP(免疫グロブ
リン重鎖結合性タンパク質)からのIRES、またはレトロウイルスのIRES
配列が使用される。
【0135】
強いプロモーターの転写調節下で2つ以上の遺伝子を発現するもう1つの可能
性は、翻訳中にリボソームリーディングフレームにおけるシフトを必要とする配
列を使用することにあり、その結果として、停止コドンが見逃される。通常、R
NAレベルでのこれらのフレームシフトシグナルは、リボソームが、特異的部位
にて、−1リーディングフレーム内に(5′配向性で)転置され、新しいリーディ
ングフレームで翻訳を続けることを必要とする。このような−1フレームシフト
シグナルは、多数の異なるウイルスファミリー、たとえば、レトロウイルス、コ
ロナウイルス、アストロウイルス、トチウイルス(totivirus)、ポド
ウイルス(podovirus)、シホウイルス(siphovirus)、ル
テオウイルス(luteovirus)およびダイアンソウイルス(diant
hovirus)で記載されている。例として、ラウス肉腫ウイルス(RSV)に
おけるフレームシフト配列は、2つの必須成分、すなわち、配列(AAAUUU
A)からなるホモポリマースリペリー(slippery)配列、および数ヌク
レオチド下流にあるRNA二次構造から成る。以下のスリペリーコンセンサス配
列は、異なるウイルスにおけるスリペリー配列を比較することによって構築され
ており、7ヌクレオチドを含み、且つ2つのホモポリマートリプレット(X−X
XY−YYZ)を含む配列から成る(Brierley(1995)J Gen
Virol 76(Pt 8):1885−1892)。
性は、翻訳中にリボソームリーディングフレームにおけるシフトを必要とする配
列を使用することにあり、その結果として、停止コドンが見逃される。通常、R
NAレベルでのこれらのフレームシフトシグナルは、リボソームが、特異的部位
にて、−1リーディングフレーム内に(5′配向性で)転置され、新しいリーディ
ングフレームで翻訳を続けることを必要とする。このような−1フレームシフト
シグナルは、多数の異なるウイルスファミリー、たとえば、レトロウイルス、コ
ロナウイルス、アストロウイルス、トチウイルス(totivirus)、ポド
ウイルス(podovirus)、シホウイルス(siphovirus)、ル
テオウイルス(luteovirus)およびダイアンソウイルス(diant
hovirus)で記載されている。例として、ラウス肉腫ウイルス(RSV)に
おけるフレームシフト配列は、2つの必須成分、すなわち、配列(AAAUUU
A)からなるホモポリマースリペリー(slippery)配列、および数ヌク
レオチド下流にあるRNA二次構造から成る。以下のスリペリーコンセンサス配
列は、異なるウイルスにおけるスリペリー配列を比較することによって構築され
ており、7ヌクレオチドを含み、且つ2つのホモポリマートリプレット(X−X
XY−YYZ)を含む配列から成る(Brierley(1995)J Gen
Virol 76(Pt 8):1885−1892)。
【0136】
たとえば、細菌または真核細胞におけるベクターの複製を可能にするベクター
特異的核酸配列、またはコード領域の発現を可能にする制御核酸配列、またはベ
クターのパッケージングまたは核酸のベクター内へのパッケージングを可能にす
る核酸配列に加えて、本発明によるベクターは、たとえば、1つ以上の自殺酵素
および1つ以上の抗アポトーシス分子をコードする核酸も含む。抗アポトーシス
分子の発現は、常に自殺酵素およびの発現と連結しており、この後者の発現に依
存している。
特異的核酸配列、またはコード領域の発現を可能にする制御核酸配列、またはベ
クターのパッケージングまたは核酸のベクター内へのパッケージングを可能にす
る核酸配列に加えて、本発明によるベクターは、たとえば、1つ以上の自殺酵素
および1つ以上の抗アポトーシス分子をコードする核酸も含む。抗アポトーシス
分子の発現は、常に自殺酵素およびの発現と連結しており、この後者の発現に依
存している。
【0137】
治療的に有効な核酸による治療の標的細胞
抗原提示細胞(APC)
自己免疫疾患または免疫病因を含む疾患を治療するために、治療すべき患者か
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応性細胞のMHCパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻
撃的に反応するか、または外来抗原を内因性MHCと一緒に認識するのはT細胞
のみであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき
、器官ドナーから抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエントを基
準にして、アロジェニック(異なるMHCパターン)である。この場合、ドナーか
らの外来MHCと一緒に細胞抗原を認識するT細胞を認識して除去することが必
要である。
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応性細胞のMHCパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻
撃的に反応するか、または外来抗原を内因性MHCと一緒に認識するのはT細胞
のみであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき
、器官ドナーから抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエントを基
準にして、アロジェニック(異なるMHCパターン)である。この場合、ドナーか
らの外来MHCと一緒に細胞抗原を認識するT細胞を認識して除去することが必
要である。
【0138】
リンパ球、アクセサリー細胞およびエフェクター細胞は、獲得免疫系の最も傑
出した代表である。リンパ球は、外来抗原を特異的に認識して、特異的体液性免
疫応答および細胞仲介免疫応答を刺激することができる。異なるリンパ球亜集団
は、それらの抗原認識機能および特異的エフェクター機能の性質が異なることが
知られている。Bリンパ球は、抗体のプロデューサーである。Bリンパ球は、細
胞外抗原およびおよび細胞の表面上に提示される抗原を認識し、抗原との接触後
、抗体分泌プラズマ細胞に分化する。細胞仲介免疫応答のメディエーターである
Tリンパ球は、幾つかのサブタイプに細分することができ、そのうちCD4+T
ヘルパー細胞およびCD8+細胞障害性T細胞が最も重要である。ヘルパーT細
胞および細胞障害性T細胞は、抗原に対して制限された特異性を示す。ヘルパー
T細胞および細胞障害性T細胞は、それぞれ、MHCクラスIIまたはMHCク
ラスIと一緒に、内因性細胞の表面上に提示されるペプチド抗原を認識するに過
ぎない。特異的MHCクラスII/ペプチド複合体を特異的に認識した後、Tヘ
ルパー細胞は、T細胞および他の免疫細胞、たとえば、B細胞およびマクロファ
ージを刺激して、増殖および分化させる、サイトカイン類を分泌する。細胞障害
性T細胞(CTL)は、非内因性タンパク質からのペプチドを、MHCクラスIタ
ンパク質と一緒にの表面上に提示している細胞を溶解する。これに対して、サプ
レッサーT細胞と呼ばれるものは、免疫機能を抑制するサイトカイン類を産生す
るTヘルパー細胞のサブタイプである。第3のクラスのリンパ球、すなわち、ナ
チュラルキラー(NK)細胞は、ウイルスおよび細胞内病原体と闘うための固有の
免疫応答成分である。
出した代表である。リンパ球は、外来抗原を特異的に認識して、特異的体液性免
疫応答および細胞仲介免疫応答を刺激することができる。異なるリンパ球亜集団
は、それらの抗原認識機能および特異的エフェクター機能の性質が異なることが
知られている。Bリンパ球は、抗体のプロデューサーである。Bリンパ球は、細
胞外抗原およびおよび細胞の表面上に提示される抗原を認識し、抗原との接触後
、抗体分泌プラズマ細胞に分化する。細胞仲介免疫応答のメディエーターである
Tリンパ球は、幾つかのサブタイプに細分することができ、そのうちCD4+T
ヘルパー細胞およびCD8+細胞障害性T細胞が最も重要である。ヘルパーT細
胞および細胞障害性T細胞は、抗原に対して制限された特異性を示す。ヘルパー
T細胞および細胞障害性T細胞は、それぞれ、MHCクラスIIまたはMHCク
ラスIと一緒に、内因性細胞の表面上に提示されるペプチド抗原を認識するに過
ぎない。特異的MHCクラスII/ペプチド複合体を特異的に認識した後、Tヘ
ルパー細胞は、T細胞および他の免疫細胞、たとえば、B細胞およびマクロファ
ージを刺激して、増殖および分化させる、サイトカイン類を分泌する。細胞障害
性T細胞(CTL)は、非内因性タンパク質からのペプチドを、MHCクラスIタ
ンパク質と一緒にの表面上に提示している細胞を溶解する。これに対して、サプ
レッサーT細胞と呼ばれるものは、免疫機能を抑制するサイトカイン類を産生す
るTヘルパー細胞のサブタイプである。第3のクラスのリンパ球、すなわち、ナ
チュラルキラー(NK)細胞は、ウイルスおよび細胞内病原体と闘うための固有の
免疫応答成分である。
【0139】
抗原提示細胞(APC)は、免疫系の制御に非常に重要である。これらの細胞は
、外来抗原を取込み、小さいペプチドに処理し、MHCタンパク質と一緒に、細
胞表面上に提示する。2つのクラスのAPCが有名である。プロフェッショナル
APCは、生成したペプチドをMHCクラスIおよびクラスIIタンパク質上に
提示し、さらに、B7.1およびB7.2等の共刺激タンパク質を発現させる。
これらのAPCの最も重要な代表は、樹状細胞およびマクロファージ、ならびに
B細胞である。これらの細胞は、それぞれ、MHCクラスIIおよびMHCクラ
スIと複合体形成するペプチドを、それらのT細胞受容体によって認識する、T
ヘルパー細胞および細胞障害性T細胞を刺激する。一方、MHC/ペプチド複合
体を提示するが共刺激タンパク質を提示しない非プロフェッショナルAPCは、
既に活性化されたT細胞によって認識されるに過ぎない。プロフェッショナルA
PCは、ex vivoで本発明によるベクターが優先的に挿入される対象であ
る主標的細胞である。
、外来抗原を取込み、小さいペプチドに処理し、MHCタンパク質と一緒に、細
胞表面上に提示する。2つのクラスのAPCが有名である。プロフェッショナル
APCは、生成したペプチドをMHCクラスIおよびクラスIIタンパク質上に
提示し、さらに、B7.1およびB7.2等の共刺激タンパク質を発現させる。
これらのAPCの最も重要な代表は、樹状細胞およびマクロファージ、ならびに
B細胞である。これらの細胞は、それぞれ、MHCクラスIIおよびMHCクラ
スIと複合体形成するペプチドを、それらのT細胞受容体によって認識する、T
ヘルパー細胞および細胞障害性T細胞を刺激する。一方、MHC/ペプチド複合
体を提示するが共刺激タンパク質を提示しない非プロフェッショナルAPCは、
既に活性化されたT細胞によって認識されるに過ぎない。プロフェッショナルA
PCは、ex vivoで本発明によるベクターが優先的に挿入される対象であ
る主標的細胞である。
【0140】
異なる血液リンパ球集団の精製は、多数の集団で記載されており、到達水準で
ある。単核細胞は、たとえば、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離
によって、末梢血から精製することができる。さらに、免疫細胞の抗体仲介認識
に基づく他の方法を、細胞集団の陽性選択および陰性選択に使用することができ
る。例として、このような方法は、免疫磁気選択、固定化モノクローナル抗体上
での「パニング」、抗体/補体仲介細胞溶解および蛍光標識細胞の細胞選別であ
る。CD3は、T細胞の選択に適した表面マーカーである。特異的Tヘルパー細
胞は、CD4マーカーを用いて選択され、細胞障害性T細胞は、CD8マーカー
を用いて選択される。他のT細胞亜集団は、マーカーCD30、CD45RA(
ナイーブT細胞)およびCD45RO(活性化T細胞およびメモリーT細胞)を用
いて、(前)選択することができる。活性化T細胞は、CD69マーカータンパ
ク質を用いて分離することができる。単球は、表面マーカーCD14およびCD
11bに向けられた特異的抗体(AB)を使用して精製することができるが、ナチ
ュラルキラー細胞は、抗CD16ABを使用して精製することができ、B細胞は
、マーカーCD19およびCD22を精製することができる。APCは、HLA
−DRに向けられた特異的抗体を使用して精製することができる。
ある。単核細胞は、たとえば、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離
によって、末梢血から精製することができる。さらに、免疫細胞の抗体仲介認識
に基づく他の方法を、細胞集団の陽性選択および陰性選択に使用することができ
る。例として、このような方法は、免疫磁気選択、固定化モノクローナル抗体上
での「パニング」、抗体/補体仲介細胞溶解および蛍光標識細胞の細胞選別であ
る。CD3は、T細胞の選択に適した表面マーカーである。特異的Tヘルパー細
胞は、CD4マーカーを用いて選択され、細胞障害性T細胞は、CD8マーカー
を用いて選択される。他のT細胞亜集団は、マーカーCD30、CD45RA(
ナイーブT細胞)およびCD45RO(活性化T細胞およびメモリーT細胞)を用
いて、(前)選択することができる。活性化T細胞は、CD69マーカータンパ
ク質を用いて分離することができる。単球は、表面マーカーCD14およびCD
11bに向けられた特異的抗体(AB)を使用して精製することができるが、ナチ
ュラルキラー細胞は、抗CD16ABを使用して精製することができ、B細胞は
、マーカーCD19およびCD22を精製することができる。APCは、HLA
−DRに向けられた特異的抗体を使用して精製することができる。
【0141】
単核細胞集団からT細胞を分離するのに適した方法は、たとえば、ヒツジ赤血
球(SRBC)を使用したロゼット形成性T細胞に基づく。さらに、この方法は、
非ロゼット形成細胞集団(Bリンパ球、単球およびマクロファージ)の単離を可能
にする。これに関して、ノイラミニダーゼまたは2−アミノエチルイソチオウロ
ニウムブロミド(AET)で処理しておいたSRBCを使用することが好ましいが
、その理由は、これらの処理済SRBCが、高いT細胞を示すためである。特異
的表面マーカーを認識するための抗体使用に基づいた前述の方法を使用して、異
なるT細胞集団を確実に同定することができる。
球(SRBC)を使用したロゼット形成性T細胞に基づく。さらに、この方法は、
非ロゼット形成細胞集団(Bリンパ球、単球およびマクロファージ)の単離を可能
にする。これに関して、ノイラミニダーゼまたは2−アミノエチルイソチオウロ
ニウムブロミド(AET)で処理しておいたSRBCを使用することが好ましいが
、その理由は、これらの処理済SRBCが、高いT細胞を示すためである。特異
的表面マーカーを認識するための抗体使用に基づいた前述の方法を使用して、異
なるT細胞集団を確実に同定することができる。
【0142】
B細胞は、例として、CD19特異的抗体を使用する既述の方法に従って、非
常に能率的に精製することができる。FACSを用いた細胞選別方法および免疫
磁気ビーズの使用方法は、特に適する。例として、単球は、L−ロイシンメチル
エステルマトリクスへの付着、たとえば、コロイド状シリカ粒子による勾配沈降
法およびフルーサイトメトリーにより単離することができる。しかし、前者の方
法は、単球を活性化する。大量の非活性化単球の精製に非常に適した別の方法は
、水簸機を用いたカウンターフロー遠心分離(カウンターフロー遠心分離水簸、
CCE)である。
常に能率的に精製することができる。FACSを用いた細胞選別方法および免疫
磁気ビーズの使用方法は、特に適する。例として、単球は、L−ロイシンメチル
エステルマトリクスへの付着、たとえば、コロイド状シリカ粒子による勾配沈降
法およびフルーサイトメトリーにより単離することができる。しかし、前者の方
法は、単球を活性化する。大量の非活性化単球の精製に非常に適した別の方法は
、水簸機を用いたカウンターフロー遠心分離(カウンターフロー遠心分離水簸、
CCE)である。
【0143】
例として、ナチュラルキラー細胞は、抗CD3抗体、抗CD5抗体、抗CD1
9抗体、抗CD14抗体および抗赤血球抗体を使用したネガティブ選択を用いて
、Ficoll−Hypaque勾配−精製リンパ球集団から単離することがで
きる。
9抗体、抗CD14抗体および抗赤血球抗体を使用したネガティブ選択を用いて
、Ficoll−Hypaque勾配−精製リンパ球集団から単離することがで
きる。
【0144】
免疫細胞は、サイトカイン刺激を用いて、他の細胞集団から生成することもで
きる。たとえば、白血球ならびに分化中の前駆細胞および幹細胞を、多数の成長
因子で刺激することができる。特に、活性化Tヘルパー細胞および活性化マクロ
ファージにより産生されるサイトカインIL−3、IL−4、IL−5、IL−
6、IL−9、CM−CSF、M−CSFおよびG−CSFは、骨髄系幹細胞を
刺激し、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸性前駆細胞、好塩
基性前駆細胞、巨核球および赤血球系前駆細胞に分化する。分化は、GM−CS
F、IL−3、IL−6、IL−11およびエリトロポイエチン(EPO)等の成
長因子によって調整される。次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄ス
トロマ細胞、前駆体T細胞、前駆体B細胞、胸腺細胞、Tヘルパー細胞、細胞障
害性T細胞およびB細胞に分化する。この分化は、IL−3、IL−4、IL−
6、IL−7、GM−CSF、M−CSF、G−CSF、IL−2およびIL−
5等の成長因子によって調整される。顆粒球単球前駆体は、単球、マクロファー
ジおよび好中球に分化する。この分化は、成長因子GM−CSF、M−CSFお
よびIL−8によって調整される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。この過
程は、GM−CSFおよびIL−5によって調整される。好塩基球前駆体の肥満
細胞および好塩基球への分化は、GM−CSF、IL−4およびIL−9により
刺激される。GM−CSF、EPOおよびIL−6による刺激後、巨核球は血小
板を産生する。EPOに刺激されて、赤血球系前駆細胞は赤血球に分化する。単
離された細胞集団の純度は、特異的抗体を使用したFACS分析でモニタリング
される。
きる。たとえば、白血球ならびに分化中の前駆細胞および幹細胞を、多数の成長
因子で刺激することができる。特に、活性化Tヘルパー細胞および活性化マクロ
ファージにより産生されるサイトカインIL−3、IL−4、IL−5、IL−
6、IL−9、CM−CSF、M−CSFおよびG−CSFは、骨髄系幹細胞を
刺激し、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸性前駆細胞、好塩
基性前駆細胞、巨核球および赤血球系前駆細胞に分化する。分化は、GM−CS
F、IL−3、IL−6、IL−11およびエリトロポイエチン(EPO)等の成
長因子によって調整される。次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄ス
トロマ細胞、前駆体T細胞、前駆体B細胞、胸腺細胞、Tヘルパー細胞、細胞障
害性T細胞およびB細胞に分化する。この分化は、IL−3、IL−4、IL−
6、IL−7、GM−CSF、M−CSF、G−CSF、IL−2およびIL−
5等の成長因子によって調整される。顆粒球単球前駆体は、単球、マクロファー
ジおよび好中球に分化する。この分化は、成長因子GM−CSF、M−CSFお
よびIL−8によって調整される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。この過
程は、GM−CSFおよびIL−5によって調整される。好塩基球前駆体の肥満
細胞および好塩基球への分化は、GM−CSF、IL−4およびIL−9により
刺激される。GM−CSF、EPOおよびIL−6による刺激後、巨核球は血小
板を産生する。EPOに刺激されて、赤血球系前駆細胞は赤血球に分化する。単
離された細胞集団の純度は、特異的抗体を使用したFACS分析でモニタリング
される。
【0145】
血液中の樹状細胞の比率は0.2%未満である。このため、この細胞集団をd
irectly直接精製する必要はない。しかし、例として、サイトカイン類を
使用して、比較的大量の樹状細胞をCD14陽性血液単球から生成することがで
きる。サイトカインTNF−α、GM−CSFおよびIL4は、単球からの分化
中の樹状細胞に適した濃度で使用される。この方法は、多くの場合に公表されて
おり、到達水準である。
irectly直接精製する必要はない。しかし、例として、サイトカイン類を
使用して、比較的大量の樹状細胞をCD14陽性血液単球から生成することがで
きる。サイトカインTNF−α、GM−CSFおよびIL4は、単球からの分化
中の樹状細胞に適した濃度で使用される。この方法は、多くの場合に公表されて
おり、到達水準である。
【0146】
単核細胞全てを細胞培地に取込んで、非特異的に刺激することが可能である。
たとえば、B細胞は、B細胞受容体に向けられた架橋抗体を使用するか、あるい
はレクチン(ヨウシュヤマゴボウマイトジェン)またはIL−4を使用して、増幅
するように刺激される。たとえば、Tリンパ球は、たとえば、モノクローナル抗
体OCT−3等のCD3結合剤と共にインキュベートすることにより、優先的に
刺激することができる。CD3結合剤は、細胞表面上のCD3分子を結合するリ
ガンドである。リガンドは、2つ以上のCD3分子を架橋することができる、O
CT−3等の抗体であってもよい。この架橋は、Tリンパ球等のCD3+細胞の
、増殖および活性化を誘導する。さらに、CD3結合剤によるTリンパ球の活性
化は、結合剤の濃度、インキュベーション時間、細胞数、インキュベーション温
度、結合剤の結合アフィニティ、親和力および細胞活性化の効率等の個々のパラ
メーターを変えることによって増強することができる。さらに、末梢血単球中の
T細胞は、ファイトヘマグルチニン(PHA)で刺激することができる。例として
、他のリンパ球スティミュレーターは、破傷風毒素、コンカナバリンA(Con
A)、イオノマイシンおよびPMAである。
たとえば、B細胞は、B細胞受容体に向けられた架橋抗体を使用するか、あるい
はレクチン(ヨウシュヤマゴボウマイトジェン)またはIL−4を使用して、増幅
するように刺激される。たとえば、Tリンパ球は、たとえば、モノクローナル抗
体OCT−3等のCD3結合剤と共にインキュベートすることにより、優先的に
刺激することができる。CD3結合剤は、細胞表面上のCD3分子を結合するリ
ガンドである。リガンドは、2つ以上のCD3分子を架橋することができる、O
CT−3等の抗体であってもよい。この架橋は、Tリンパ球等のCD3+細胞の
、増殖および活性化を誘導する。さらに、CD3結合剤によるTリンパ球の活性
化は、結合剤の濃度、インキュベーション時間、細胞数、インキュベーション温
度、結合剤の結合アフィニティ、親和力および細胞活性化の効率等の個々のパラ
メーターを変えることによって増強することができる。さらに、末梢血単球中の
T細胞は、ファイトヘマグルチニン(PHA)で刺激することができる。例として
、他のリンパ球スティミュレーターは、破傷風毒素、コンカナバリンA(Con
A)、イオノマイシンおよびPMAである。
【0147】
さらに、配列モチーフPur−Pur−CG−Pyr−Pyrと一緒に非メチ
ル化CpGモチーフ配列を含む核酸は、哺乳類B細胞、単球、マクロファージお
よび樹状細胞n活性化に特に適する。これに関して、CpG含有細菌または昆虫
のDNA、および8ヌクレオチドという最小長を有するCpG含有合成オリゴオ
キシヌクレオチド(ODNs)も、上述の細胞集団の刺激に適当な可能性がある。
増強された作用は、例として、化学的に修飾され、それによって安定化された、
オリゴヌクレオチド、たとえば、ホスホロチオエート連結ODNを使用して実現
することができる。哺乳類免疫細胞、たとえば、B細胞、単球、マクロファージ
および樹状細胞は、CpG含有核酸との接触後、直接活性化され、MHCクラス
II分子および共刺激分子の増強された表面発現および明確に定められたサイト
カインmRNAの増大した転写、ならびにTNF−(、IFN−γ、IL12お
よびIL6等の、プロ炎症性サイトカイン類の分泌という事実。特に、CpG含
有ODNの免疫学的特性の調整は、CpGモチーフと隣接する配列を特異的に選
択または変更することにより、実現することができる。
ル化CpGモチーフ配列を含む核酸は、哺乳類B細胞、単球、マクロファージお
よび樹状細胞n活性化に特に適する。これに関して、CpG含有細菌または昆虫
のDNA、および8ヌクレオチドという最小長を有するCpG含有合成オリゴオ
キシヌクレオチド(ODNs)も、上述の細胞集団の刺激に適当な可能性がある。
増強された作用は、例として、化学的に修飾され、それによって安定化された、
オリゴヌクレオチド、たとえば、ホスホロチオエート連結ODNを使用して実現
することができる。哺乳類免疫細胞、たとえば、B細胞、単球、マクロファージ
および樹状細胞は、CpG含有核酸との接触後、直接活性化され、MHCクラス
II分子および共刺激分子の増強された表面発現および明確に定められたサイト
カインmRNAの増大した転写、ならびにTNF−(、IFN−γ、IL12お
よびIL6等の、プロ炎症性サイトカイン類の分泌という事実。特に、CpG含
有ODNの免疫学的特性の調整は、CpGモチーフと隣接する配列を特異的に選
択または変更することにより、実現することができる。
【0148】
一方では、たとえば、レトロウイルスベクターが細胞ゲノム内に組込まれるた
めに、その後形質導入される細胞の増殖が必要である。他方では、レトロウイル
スベクターを用いた形質導入後に細胞が増加することにより、これらの細胞が適
切なT細胞によって認識される可能性が高まる。
めに、その後形質導入される細胞の増殖が必要である。他方では、レトロウイル
スベクターを用いた形質導入後に細胞が増加することにより、これらの細胞が適
切なT細胞によって認識される可能性が高まる。
【0149】
自己免疫疾患または免疫病因を含む疾患を治療するために、治療すべき患者か
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応細胞のMHCパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻撃
的に反応するか、または外来抗原を内因性MHCと一緒に認識するのはT細胞の
みであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき、
器官ドナーの末梢血から抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエン
トを基準にして、アロジェニック(異なるMHCパターン)である。この場合、ド
ナーからの外来MHCと一緒に細胞抗原を認識するT細胞を認識して除去するこ
とが必要である。
らのシンジェニックな抗原提示細胞が、おとり細胞の作製に使用される。抗原提
示細胞および反応細胞のMHCパターンは、必然的に全く同じであり、自己攻撃
的に反応するか、または外来抗原を内因性MHCと一緒に認識するのはT細胞の
みであり、これを、引きつけて除去する。移植拒絶を処置または予防するとき、
器官ドナーの末梢血から抗原提示細胞を精製する。これらの細胞は、レシピエン
トを基準にして、アロジェニック(異なるMHCパターン)である。この場合、ド
ナーからの外来MHCと一緒に細胞抗原を認識するT細胞を認識して除去するこ
とが必要である。
【0150】
APCの培養
哺乳類またはヒト細胞を、少なくとも1種の明確に定められた成長因子を加え
た適当な栄養培地で培養することができる。異なる細胞型の成長を促進する多数
の成長因子はが記載されている。このような成長因子の典型的な代表は、たとえ
ば、リンパ球の成長および活性化を促進するIL−2、IL−10、IL−12
およびIL−15等のサイトカインミトゲンである。その他の細胞型は、特に、
ヒト妊娠ホルモン絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)およびヒト成長ホルモンを含
む、ホルモン類等の、異なるクラスの成長因子が[脱落]している。明確に定め
られた細胞集団に適した成長因子の選択は、詳細に記載されており、到達水準で
ある。
た適当な栄養培地で培養することができる。異なる細胞型の成長を促進する多数
の成長因子はが記載されている。このような成長因子の典型的な代表は、たとえ
ば、リンパ球の成長および活性化を促進するIL−2、IL−10、IL−12
およびIL−15等のサイトカインミトゲンである。その他の細胞型は、特に、
ヒト妊娠ホルモン絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)およびヒト成長ホルモンを含
む、ホルモン類等の、異なるクラスの成長因子が[脱落]している。明確に定め
られた細胞集団に適した成長因子の選択は、詳細に記載されており、到達水準で
ある。
【0151】
以下の実施例は、本発明の説明を助けるものであって、限定するものと考えて
はならない。
はならない。
【0152】
動物実験データ
リガンド遺伝子を用いてネズミ抗原提示細胞(APC)をトランスフェクトする
ためのアデノウイルス遺伝子導入の使用 Fas(CD95)欠損C57BL(B6)マウスで腹膜洗浄を実施し、腹膜マク
ロファージを単離した。6ウェルプレートの完全DMEM培地で、ウェル当たり
5(106個のマクロファージを24時間培養し、続いて、Fasリガンド(Fa
sL、CD95L)遺伝子の発現を招くアデノアデノウイルスベクター(AdFa
sL)か、または対照ベクター(AdLacZ、β−ガラクトシダーゼの発現)を
用いて、トランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされたマクロフ
ァージを、FasLの発現および機能性について試験した。Facs分析で、A
dFasLトランスフェクトマクロファージ(AdFasL−APC)のほぼ90
%が細胞表面上にFasL遺伝子を発現していたが、AdLacZを用いてトラ
ンスフェクトしておいたマクロファージ上で、問題のFasL発現を確認するこ
とはできなかった(AdLacZ−APC)(図1A)。FasL発現が機能的でも
あるかどうかを調査するために、Fas発現性A20標的細胞を使用した細胞障
害性試験で、AdFasLトランスフェクトマクロファージを使用した。次いで
、標的細胞の濃度依存性細胞溶解が、AdFaL−APCを含む培養で確認され
たが、AdLacZ−APCおよびA20標的細胞の培養では、溶解を検出する
ことができなかったか、または自発性溶解を検出できただけであった(図1B)。
ためのアデノウイルス遺伝子導入の使用 Fas(CD95)欠損C57BL(B6)マウスで腹膜洗浄を実施し、腹膜マク
ロファージを単離した。6ウェルプレートの完全DMEM培地で、ウェル当たり
5(106個のマクロファージを24時間培養し、続いて、Fasリガンド(Fa
sL、CD95L)遺伝子の発現を招くアデノアデノウイルスベクター(AdFa
sL)か、または対照ベクター(AdLacZ、β−ガラクトシダーゼの発現)を
用いて、トランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされたマクロフ
ァージを、FasLの発現および機能性について試験した。Facs分析で、A
dFasLトランスフェクトマクロファージ(AdFasL−APC)のほぼ90
%が細胞表面上にFasL遺伝子を発現していたが、AdLacZを用いてトラ
ンスフェクトしておいたマクロファージ上で、問題のFasL発現を確認するこ
とはできなかった(AdLacZ−APC)(図1A)。FasL発現が機能的でも
あるかどうかを調査するために、Fas発現性A20標的細胞を使用した細胞障
害性試験で、AdFasLトランスフェクトマクロファージを使用した。次いで
、標的細胞の濃度依存性細胞溶解が、AdFaL−APCを含む培養で確認され
たが、AdLacZ−APCおよびA20標的細胞の培養では、溶解を検出する
ことができなかったか、または自発性溶解を検出できただけであった(図1B)。
【0153】
リガンド発現性APCによるT細胞のアロジェニック増殖の阻害
AdFasL−APC上のFasL発現が、T細胞との相互作用を調節できる
かどうか、また同種異系特異的T細胞応答を抑制するかどうかを確定するために
、AdFasL−APCおよびAdLacZ−APCをB6−lpr/lprマ
ウス(H−2Db)から作製し、混合リンパ球反応(MLR)で、Fas欠損MRL
−lpr/lprマウス(H−2Dk)またはFas発現性MRL−+/+対照マ
ウス(H−2Dk)からのT細胞と共に共培養した。アロジェニックT細胞増殖は
、[3H]−チミジンの取込みによって決定した。H−2DkT細胞のアロジェニ
ック増殖は、H−2DkT細胞のH−2DbLacZ−APCとの共培養と比較し
たとき(図2A)、H−2DbFasL−APCとの共培養で有意に減少していた
。さらに、MRL−lpr/lprマウスからのFas欠損T細胞を使用するこ
とによって、この抑制作用は、FasとFasリガンドとの相互作用に起因し、
必然的に、両分子の機能的発現を必要とすることを証明することができた(図2
B)。
かどうか、また同種異系特異的T細胞応答を抑制するかどうかを確定するために
、AdFasL−APCおよびAdLacZ−APCをB6−lpr/lprマ
ウス(H−2Db)から作製し、混合リンパ球反応(MLR)で、Fas欠損MRL
−lpr/lprマウス(H−2Dk)またはFas発現性MRL−+/+対照マ
ウス(H−2Dk)からのT細胞と共に共培養した。アロジェニックT細胞増殖は
、[3H]−チミジンの取込みによって決定した。H−2DkT細胞のアロジェニ
ック増殖は、H−2DkT細胞のH−2DbLacZ−APCとの共培養と比較し
たとき(図2A)、H−2DbFasL−APCとの共培養で有意に減少していた
。さらに、MRL−lpr/lprマウスからのFas欠損T細胞を使用するこ
とによって、この抑制作用は、FasとFasリガンドとの相互作用に起因し、
必然的に、両分子の機能的発現を必要とすることを証明することができた(図2
B)。
【0154】
ウイルス誘導性自己免疫疾患のマウスモデルにおけるFasリガンド発現性抗原
提示細胞の治療的使用 Fasリガンド欠損C57/BL6(B6)gld/gldマウスをネズミサイ
トメガロウイルス(MCMV)に感染させることにより、慢性自己免疫炎症反応を
誘導する。AdFasL−APCによるT細胞の抗原特異的抑制が、in vi
voでも達成されるかどうかを試験するために、慢性自己免疫疾患のマウスモデ
ルで、AdFasL−APCおよびAdLacZ−APCを治療的に試験した。
使用したマウスモデルで、欠損B6−lpr/lprマウスまたはFasL欠損
B6−gld/gldマウスを1(106PFUのマウスサイトメガロウイルス(
MCMV)に腹腔内感染させることにより、様々な器官における慢性炎症反応を
誘導したが、ウイルス感染細胞が消失した後、B6−+/+マウスで、関連器官
の変化を検出することができなかった。B6−lpr/lprおよびB6−gl
d/gldマウスにおける慢性炎症の原因は、ウイルス感染細胞の消失の遅延で
はなく、むしろ、器官における炎症性浸潤物の主たる原因であるT細胞の持続的
活性化であり、このため、このマウスモデルは、新規な治療コンセプトの有効性
を試験するのに非常に適していた。さらに、自己抗体の増加を検出することがで
きたため、慢性炎症は、著明な自己免疫成分を示した。図3は、MCMV感染B
6−+/+およびFasL欠損B6−gld/gldマウスにおける肺、腎臓お
よび肝臓での炎症反応の組織学的重症度を、経時的に、示す。
提示細胞の治療的使用 Fasリガンド欠損C57/BL6(B6)gld/gldマウスをネズミサイ
トメガロウイルス(MCMV)に感染させることにより、慢性自己免疫炎症反応を
誘導する。AdFasL−APCによるT細胞の抗原特異的抑制が、in vi
voでも達成されるかどうかを試験するために、慢性自己免疫疾患のマウスモデ
ルで、AdFasL−APCおよびAdLacZ−APCを治療的に試験した。
使用したマウスモデルで、欠損B6−lpr/lprマウスまたはFasL欠損
B6−gld/gldマウスを1(106PFUのマウスサイトメガロウイルス(
MCMV)に腹腔内感染させることにより、様々な器官における慢性炎症反応を
誘導したが、ウイルス感染細胞が消失した後、B6−+/+マウスで、関連器官
の変化を検出することができなかった。B6−lpr/lprおよびB6−gl
d/gldマウスにおける慢性炎症の原因は、ウイルス感染細胞の消失の遅延で
はなく、むしろ、器官における炎症性浸潤物の主たる原因であるT細胞の持続的
活性化であり、このため、このマウスモデルは、新規な治療コンセプトの有効性
を試験するのに非常に適していた。さらに、自己抗体の増加を検出することがで
きたため、慢性炎症は、著明な自己免疫成分を示した。図3は、MCMV感染B
6−+/+およびFasL欠損B6−gld/gldマウスにおける肺、腎臓お
よび肝臓での炎症反応の組織学的重症度を、経時的に、示す。
【0155】
Fasリガンド発現性APCで処理することにより達成されるMCMV誘導性慢
性炎症反応の有意な改善 MCMV感染の28日後、B6−gld/gldおよびB6−lpr/lpr
マウスにAdLacZ−APCまたはAdFasL−APC(1(106 APC
i.p.、3日ごとに12日間)を投与した。さらに、投与前に、in vit
roで、これらのAPCの一部にMCMVを間欠的に投与した。処置開始の4週
間後、器官を切除して、炎症反応の重症度を判定した(図4)。AdFasL−A
PC投与B6−gld/gldマウスの場合、炎症の有意な改善が認められ、こ
の改善は、先にMCMVが間欠的に投与されたAPCによって、なおいっそう増
大した。さらに、Fas欠損B6−lpr/lprマウスでは、治療効果を検出
することができなかったため、確認された治療効果は、Fas仲介性であること
を証明することができた。
性炎症反応の有意な改善 MCMV感染の28日後、B6−gld/gldおよびB6−lpr/lpr
マウスにAdLacZ−APCまたはAdFasL−APC(1(106 APC
i.p.、3日ごとに12日間)を投与した。さらに、投与前に、in vit
roで、これらのAPCの一部にMCMVを間欠的に投与した。処置開始の4週
間後、器官を切除して、炎症反応の重症度を判定した(図4)。AdFasL−A
PC投与B6−gld/gldマウスの場合、炎症の有意な改善が認められ、こ
の改善は、先にMCMVが間欠的に投与されたAPCによって、なおいっそう増
大した。さらに、Fas欠損B6−lpr/lprマウスでは、治療効果を検出
することができなかったため、確認された治療効果は、Fas仲介性であること
を証明することができた。
【0156】
Fasリガンド発現性APC投与後の、脾臓におけるMCMV特異的T細胞の有
意な減少 同時に、B6−gld/gldマウスから脾臓も切除し、混合リンパ球反応(
MLR)で、脾臓細胞を、48時間にわたって、B6マウスに由来するMCMV
間欠投与APCと共に共培養した。AdFasL−APC(図5)を投与しておい
た動物から得た脾臓細胞の場合、IL−2分泌の有意な減少が見られた。この結
果として、AdFasL−APCは、in vivoで、T細胞を抗原特異的様
式で抑制したことが証明された。
意な減少 同時に、B6−gld/gldマウスから脾臓も切除し、混合リンパ球反応(
MLR)で、脾臓細胞を、48時間にわたって、B6マウスに由来するMCMV
間欠投与APCと共に共培養した。AdFasL−APC(図5)を投与しておい
た動物から得た脾臓細胞の場合、IL−2分泌の有意な減少が見られた。この結
果として、AdFasL−APCは、in vivoで、T細胞を抗原特異的様
式で抑制したことが証明された。
【0157】
Fasリガンド発現性APCを投与した結果としての、MCMV感染B6−gl
d/gldマウスにおける自己抗体の産生減少 MCMV感染B6−gld/gldマウスは、高濃度の自己抗体が発生するた
め、AdFasL−APCを投与することによって、自己抗体産生に影響を与え
ることができるかどうかを調査するために、実験を実行した。このために、Ad
LacZ−APC、AdFasL−APCまたはMCMV間欠投与AdFasL
−APCのいずれかを投与しておいたマウスの血清中の、リウマチ因子IgG1
および抗二本鎖DNAIgG1自己抗体のレベルを決定した。AdFasL−A
PCを投与した動物で、自己抗体産生の有意な減少が認められ、AdFasL−
APCにMCMVを予め間欠投与しておくことによって、抑制をなおいっそう増
大することが可能であった(図6)。
d/gldマウスにおける自己抗体の産生減少 MCMV感染B6−gld/gldマウスは、高濃度の自己抗体が発生するた
め、AdFasL−APCを投与することによって、自己抗体産生に影響を与え
ることができるかどうかを調査するために、実験を実行した。このために、Ad
LacZ−APC、AdFasL−APCまたはMCMV間欠投与AdFasL
−APCのいずれかを投与しておいたマウスの血清中の、リウマチ因子IgG1
および抗二本鎖DNAIgG1自己抗体のレベルを決定した。AdFasL−A
PCを投与した動物で、自己抗体産生の有意な減少が認められ、AdFasL−
APCにMCMVを予め間欠投与しておくことによって、抑制をなおいっそう増
大することが可能であった(図6)。
【0158】
一次ヒト細胞を使用した実施例
アデノアデノウイルスベクターを用いた一次ヒトマクロファージの有効なトラン
スフェクション 白血球分離法によって単離しておいた一次単球を、in vitroで7日間
にわたって、マクロファージに分化させるか、または、IL−4およびGM−C
SFを培地に加えることによって、樹状細胞(DC)に分化させた。次に、様々な
濃度のAdLacZを用いて、マクロファージおよびDをCトランスフェクトし
た。他の細胞(たとえば、線維芽細胞またはネズミマクロファージ)と対照的に、
マクロファージもDCも、トランスフェクトすることが、著しく困難であった。
しかし、高MOI(500)を使用すると、72時間後に、x−Gal染色を用い
てβ−ガラクトシダーゼを検出することにより、マクロファージのおよそ30%
で、申し分のないトランスフェクションを示すことができた(図7)。様々なサイ
トカイン類およびリポフェクタミンを使用することによって、トランスフェクシ
ョン率を著明に上昇させることができた。
スフェクション 白血球分離法によって単離しておいた一次単球を、in vitroで7日間
にわたって、マクロファージに分化させるか、または、IL−4およびGM−C
SFを培地に加えることによって、樹状細胞(DC)に分化させた。次に、様々な
濃度のAdLacZを用いて、マクロファージおよびDをCトランスフェクトし
た。他の細胞(たとえば、線維芽細胞またはネズミマクロファージ)と対照的に、
マクロファージもDCも、トランスフェクトすることが、著しく困難であった。
しかし、高MOI(500)を使用すると、72時間後に、x−Gal染色を用い
てβ−ガラクトシダーゼを検出することにより、マクロファージのおよそ30%
で、申し分のないトランスフェクションを示すことができた(図7)。様々なサイ
トカイン類およびリポフェクタミンを使用することによって、トランスフェクシ
ョン率を著明に上昇させることができた。
【0159】
寛容原樹状細胞を用いたT細胞のアロジェニック増殖阻害
アデノウイルストランスフェクションから切り離して、寛容原DC表現型も調
査した。他の研究グループは、5日に、IL−10をDC培養に加えることによ
り、抑制DC表現型が作製されるが、同一時期にTNFを付加するとDC表現型
を強く活性化することを示し、この観察結果は、特に、共刺激性分子のディファ
レンシャル発現に原因があると考えられた。従って、これらの2つのDC集団は
、MLRで、アロジェニックT細胞刺激を誘導する能力が異なるかどうかを決定
するために、調査研究を実施した(図8)。IL−10−成熟DCは、TNF投与
DCより小さいアロジェニックT細胞増殖を誘導することが判明した。抗Fas
抗体(クローンCH−11)を加えることによってこの作用をなおいっそう増大す
ることができた。
査した。他の研究グループは、5日に、IL−10をDC培養に加えることによ
り、抑制DC表現型が作製されるが、同一時期にTNFを付加するとDC表現型
を強く活性化することを示し、この観察結果は、特に、共刺激性分子のディファ
レンシャル発現に原因があると考えられた。従って、これらの2つのDC集団は
、MLRで、アロジェニックT細胞刺激を誘導する能力が異なるかどうかを決定
するために、調査研究を実施した(図8)。IL−10−成熟DCは、TNF投与
DCより小さいアロジェニックT細胞増殖を誘導することが判明した。抗Fas
抗体(クローンCH−11)を加えることによってこの作用をなおいっそう増大す
ることができた。
【0160】
APC寛容化によってもたらされる同種異系特異的抑制の証明
確認されたT細胞増殖抑制が同種異系特異的であるかどうかを調査するために
、MLR開始の5日後にT細胞を単離し、次いで、第3のドナー(第3のパーテ
ィー)に由来するAPCに対する第2のMLRで使用した(図9)。これに関して
、最初に、IL−10−成熟DCと共に共培養しておいたT細胞の反応は、第3
のドナーから得たAPCで、損傷されない様式で進行したため、IL−10−成
熟DCは、T細胞の同種異系特異的抑制をもたらすことを証明することができた
。
、MLR開始の5日後にT細胞を単離し、次いで、第3のドナー(第3のパーテ
ィー)に由来するAPCに対する第2のMLRで使用した(図9)。これに関して
、最初に、IL−10−成熟DCと共に共培養しておいたT細胞の反応は、第3
のドナーから得たAPCで、損傷されない様式で進行したため、IL−10−成
熟DCは、T細胞の同種異系特異的抑制をもたらすことを証明することができた
。
【0161】
本発明によるベクターの構築
ベクターpcDNA3−TK−IRES−crmA(図10A)およびpcDN
A3−FasL−IRES−PLP(図10B)を、本発明によるベクターの例に
とってみる。
A3−FasL−IRES−PLP(図10B)を、本発明によるベクターの例に
とってみる。
【0162】
pcDNA3−FasL−IRES−PLP(図10A)は、たとえば、アポト
ーシス誘導性リガンドFasL、および、例として、抗原タンパク脂質タンパク
質(PLP)をコードする核酸配列を含む。アポトーシス誘導性リガンドと同一の
mRNAから抗原が翻訳されるように、2つの領域がIRES配列によって連結
されている。このクターは、クローニングベクターpcDNA3に基礎を置く。
FasLおよびPLPをコードする核酸領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)により、RNAからcDNAに転写させる。細胞からRNAを単離する方法、
および特異的RNA分子をcDNAに転写するためのPCRの使用法は、到達水
準である。PCR用のプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、5′末
端に、エンドヌクレアーゼ用の切断部位を含み、これを、次に、cDNAをベク
ターpcDNA3にクローニングするために使用した。HindIIIおよびB
amHI用の切断部位を用いて、FasLをコードする領域を、第1の領域と同
様に、ベクターpcDNA3にクローニングした。続いて、BamHIおよびE
coRI用の切断部位を用いて、PLPをコードするフラグメントを挿入した。
最後に、BamHI用認識配列を用いて、FasLとPLPとの間に、IRES
を含む核酸フラグメントをクローニングした。核酸を単離する技法、核酸を切断
する技法、核酸切断生成物を精製する技法、個々の核酸フラグメントのライゲー
ション、および細菌で人為的に作製される核酸の複製は、到達水準である。
ーシス誘導性リガンドFasL、および、例として、抗原タンパク脂質タンパク
質(PLP)をコードする核酸配列を含む。アポトーシス誘導性リガンドと同一の
mRNAから抗原が翻訳されるように、2つの領域がIRES配列によって連結
されている。このクターは、クローニングベクターpcDNA3に基礎を置く。
FasLおよびPLPをコードする核酸領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)により、RNAからcDNAに転写させる。細胞からRNAを単離する方法、
および特異的RNA分子をcDNAに転写するためのPCRの使用法は、到達水
準である。PCR用のプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、5′末
端に、エンドヌクレアーゼ用の切断部位を含み、これを、次に、cDNAをベク
ターpcDNA3にクローニングするために使用した。HindIIIおよびB
amHI用の切断部位を用いて、FasLをコードする領域を、第1の領域と同
様に、ベクターpcDNA3にクローニングした。続いて、BamHIおよびE
coRI用の切断部位を用いて、PLPをコードするフラグメントを挿入した。
最後に、BamHI用認識配列を用いて、FasLとPLPとの間に、IRES
を含む核酸フラグメントをクローニングした。核酸を単離する技法、核酸を切断
する技法、核酸切断生成物を精製する技法、個々の核酸フラグメントのライゲー
ション、および細菌で人為的に作製される核酸の複製は、到達水準である。
【0163】
pcDNA3−TK−IRES−crmA(図10B)は、チミジンキナーゼ等
の自殺酵素、およびcrmA等の抗アポトーシス分子をコードする核酸配列を含
む。crmAは、TKと一緒に発現できるに過ぎないように、crmAの発現は
、IRES配列によって、TKの発現と連結されている。このベクターは、クロ
ーンベクターpcDNA3に基礎を置き、クローニング方法、および本発明によ
るベクターの作製方法は、pcDNA3−FasL−IRES−PLPに関する
ものに類似している。HindIIIおよびBamHI用の切断部位を用いて、
チミジンキナーゼをコードする領域を、第1の領域と同様に、ベクターpcDN
A3にクローニングした。続いて、BamHIおよびXhoI用の切断部位を用
いて、crmAをコードするフラグメントを挿入した。最後に、BamHI用認
識配列を用いて、FasLとPLPとの間に、IRESを含む核酸フラグメント
をクローニングした。2つのベクターpcDNA3−FasL−IRES−cr
mAおよびpcDNA3−TK−IRES−PLPの核酸配列を、それぞれ、配
列番号1および配列番号2として記載する。 本発明を以下の図で説明する。
の自殺酵素、およびcrmA等の抗アポトーシス分子をコードする核酸配列を含
む。crmAは、TKと一緒に発現できるに過ぎないように、crmAの発現は
、IRES配列によって、TKの発現と連結されている。このベクターは、クロ
ーンベクターpcDNA3に基礎を置き、クローニング方法、および本発明によ
るベクターの作製方法は、pcDNA3−FasL−IRES−PLPに関する
ものに類似している。HindIIIおよびBamHI用の切断部位を用いて、
チミジンキナーゼをコードする領域を、第1の領域と同様に、ベクターpcDN
A3にクローニングした。続いて、BamHIおよびXhoI用の切断部位を用
いて、crmAをコードするフラグメントを挿入した。最後に、BamHI用認
識配列を用いて、FasLとPLPとの間に、IRESを含む核酸フラグメント
をクローニングした。2つのベクターpcDNA3−FasL−IRES−cr
mAおよびpcDNA3−TK−IRES−PLPの核酸配列を、それぞれ、配
列番号1および配列番号2として記載する。 本発明を以下の図で説明する。
【配列表】
【図1】
FasLを発現するアデノウイルスに、マウスマクロファージを感染させた結
果を、図表形式で示す図である。CD95欠損B6マウスからのマクロファージ
を精製し、LacZ(AdLacZ、Ad/CV;FasL対照)またはFasL
(AdFasL、Ad/FL)のいずれかを発現しているアデノウイルスに感染さ
せた。(A)AdFasL感染マクロファージおよび非感染マクロファージ上での
FasLの発現を調査するために、FACSを使用した。Theヒストグラムは
、感染細胞数およびFasL発現の強さを示す(Y軸、蛍光性細胞数;X軸、蛍
光結合抗FasL抗体を使用して決定した蛍光の強さ)。(B)感染した、Fas
L発現性細胞が、標的細胞においてアポトーシスを誘導する能力を決定するため
の51Cr放出テスト。2種の異なるアデノウイルスに感染したマクロファージ、
および/または非感染対照マクロファージを、51クロム−標識したFas+標的
細胞(A20細胞)と共にインキュベートし、培養上澄への51Cr放出によって、
標的細胞の溶解を定量した。カウント:FasL発現性細胞数;FL2−H/P
E:FasL発現の強さ;特異的溶解(%):SDSで細胞を溶解することによっ
て最大51Cr放出が達成された陽性対照を基準にした51Crの放出;E/T比:
エフェクター細胞(感染マクロファージ)の標的細胞(A20細胞)に対する比率;
Mφ−Ad/CV:AdLacZ(LacZを発現しているアデノウイルス)に感
染したマクロファージ;Mφ−Ad/FL:Ad−FasL(FasLを発現し
ているアデノウイルス)に感染したマクロファージ;Mφ−FL:FasL発現
性プラスミドを用いてトランスフェクトしたマクロファージ。
果を、図表形式で示す図である。CD95欠損B6マウスからのマクロファージ
を精製し、LacZ(AdLacZ、Ad/CV;FasL対照)またはFasL
(AdFasL、Ad/FL)のいずれかを発現しているアデノウイルスに感染さ
せた。(A)AdFasL感染マクロファージおよび非感染マクロファージ上での
FasLの発現を調査するために、FACSを使用した。Theヒストグラムは
、感染細胞数およびFasL発現の強さを示す(Y軸、蛍光性細胞数;X軸、蛍
光結合抗FasL抗体を使用して決定した蛍光の強さ)。(B)感染した、Fas
L発現性細胞が、標的細胞においてアポトーシスを誘導する能力を決定するため
の51Cr放出テスト。2種の異なるアデノウイルスに感染したマクロファージ、
および/または非感染対照マクロファージを、51クロム−標識したFas+標的
細胞(A20細胞)と共にインキュベートし、培養上澄への51Cr放出によって、
標的細胞の溶解を定量した。カウント:FasL発現性細胞数;FL2−H/P
E:FasL発現の強さ;特異的溶解(%):SDSで細胞を溶解することによっ
て最大51Cr放出が達成された陽性対照を基準にした51Crの放出;E/T比:
エフェクター細胞(感染マクロファージ)の標的細胞(A20細胞)に対する比率;
Mφ−Ad/CV:AdLacZ(LacZを発現しているアデノウイルス)に感
染したマクロファージ;Mφ−Ad/FL:Ad−FasL(FasLを発現し
ているアデノウイルス)に感染したマクロファージ;Mφ−FL:FasL発現
性プラスミドを用いてトランスフェクトしたマクロファージ。
【図2】
FasL発現性抗原提示細胞で、T細胞のアロジェニック刺激を阻害した結果
を、図表形式で示す図である。マクロファージは、B6lpr/lprマウスか
ら単離し、LacZ(AdLacZ)またはFasL(AdFasL)のいずれかを
発現しているアデノウイルスに感染させた。感染したマクロファージを、(A)F
as発現性B6+/+マウスまたは(B)Fas欠損B6lpr/lprマウスの
いずれかからのT細胞と共に共培養し、3H−チミジンの取込み(混合リンパ球反
応、MLR)によってT細胞の刺激を測定した。Mφ−CV:AdLacZ(La
cZを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファージ;Mφ−FL:
Ad−FasL(FasLを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファ
ージ。
を、図表形式で示す図である。マクロファージは、B6lpr/lprマウスか
ら単離し、LacZ(AdLacZ)またはFasL(AdFasL)のいずれかを
発現しているアデノウイルスに感染させた。感染したマクロファージを、(A)F
as発現性B6+/+マウスまたは(B)Fas欠損B6lpr/lprマウスの
いずれかからのT細胞と共に共培養し、3H−チミジンの取込み(混合リンパ球反
応、MLR)によってT細胞の刺激を測定した。Mφ−CV:AdLacZ(La
cZを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファージ;Mφ−FL:
Ad−FasL(FasLを発現しているアデノウイルス)に感染したマクロファ
ージ。
【図3】
肺、腎臓および肝臓における炎症反応を定量的に分析した結果を、図表形式で
示す図である。B6+/+およびB6gld/gldマウスを、マウスサイトメガ
ロウイルス(1(105pfu)に腹腔内感染させ、次いで、肺(上のパネル)、腎臓
(中間のパネル)および肝臓(下のパネル)における、炎症および組織損傷の程度を
、0(炎症および/または損傷なし)から4(最強の炎症および/または損傷)まで
の相対的スケールで評価した。表示の太線は、各調査時における、少なくとも5
匹のマウスの結果の平均値±標準偏差を示す。
示す図である。B6+/+およびB6gld/gldマウスを、マウスサイトメガ
ロウイルス(1(105pfu)に腹腔内感染させ、次いで、肺(上のパネル)、腎臓
(中間のパネル)および肝臓(下のパネル)における、炎症および組織損傷の程度を
、0(炎症および/または損傷なし)から4(最強の炎症および/または損傷)まで
の相対的スケールで評価した。表示の太線は、各調査時における、少なくとも5
匹のマウスの結果の平均値±標準偏差を示す。
【図4】
感染前に、AdFasL感染抗原提示細胞(APC)を投与しておいたマウスサ
イトメガロウイルス感染マウスの肺、腎臓および肝臓における炎症の減少結果を
、図表形式で示す図である。B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lp
rマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、感染後28日に、Ad−C
MVLacZ(FasL陰性対照)、マウスサイトメガロウイルス(APC+MC
MV)、AdFasL(FasL陽性対照)、またはマウスサイトメガロウイルス
およびAdFasL(MCMV+AdFasL)のいずれかに感染させておいたA
PCを投与した。このマウスに、APCを3日間隔で4回投与し、APC治療を
開始した4週間後に検査した。肺、腎臓および肝臓をヘマトキシリン・エオシン
で染色し、独立した3人が評価した。表示の太線は、様々に投与したマウスの異
なる器官における炎症反応の平均値±標準偏差を示す。肺gldおよび肺lpr
:それぞれ、B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lprマウスからの
肺;肝臓gldおよび肝臓lpr:それぞれ、B6gld/gldマウスおよび
B6lpr/lprマウスからの肝臓;腎臓gldおよび腎臓lpr:それぞれ
、B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lprマウスからの腎臓;AP
C−AdLacZ:LacZを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示
細胞;APC+MCMV:マウスサイトメガロウイルスに感染した抗原提示細胞
;APC−AdFasL:FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗
原提示細胞;APC−AdFasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスお
よびFasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞:*は、9
5%信頼区間(P<0.05)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
イトメガロウイルス感染マウスの肺、腎臓および肝臓における炎症の減少結果を
、図表形式で示す図である。B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lp
rマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、感染後28日に、Ad−C
MVLacZ(FasL陰性対照)、マウスサイトメガロウイルス(APC+MC
MV)、AdFasL(FasL陽性対照)、またはマウスサイトメガロウイルス
およびAdFasL(MCMV+AdFasL)のいずれかに感染させておいたA
PCを投与した。このマウスに、APCを3日間隔で4回投与し、APC治療を
開始した4週間後に検査した。肺、腎臓および肝臓をヘマトキシリン・エオシン
で染色し、独立した3人が評価した。表示の太線は、様々に投与したマウスの異
なる器官における炎症反応の平均値±標準偏差を示す。肺gldおよび肺lpr
:それぞれ、B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lprマウスからの
肺;肝臓gldおよび肝臓lpr:それぞれ、B6gld/gldマウスおよび
B6lpr/lprマウスからの肝臓;腎臓gldおよび腎臓lpr:それぞれ
、B6gld/gldマウスおよびB6lpr/lprマウスからの腎臓;AP
C−AdLacZ:LacZを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示
細胞;APC+MCMV:マウスサイトメガロウイルスに感染した抗原提示細胞
;APC−AdFasL:FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗
原提示細胞;APC−AdFasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスお
よびFasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞:*は、9
5%信頼区間(P<0.05)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図5】
感染前にAdFasL感染抗原提示細胞(APC)を投与しておいたサイトメガ
ロウイルス(MCMV)感染マウスからの、マウスサイトメガロウイルスに特異的
な反応性T細胞の量を確認する実験の結果を、図表形式で示す図である。B6l
pr/lprマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、図4に記載の種
々のAPCを投与した。APC治療の4週後に、脾臓細胞をMCMV感染マウス
から単離した。in vitroで、T細胞をMCMV感染APCで刺激し、4
8時間後に、IL−2含有上澄を単離した。APC−AdLacZ:LacZを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−AdFasL:
FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−Ad
FasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスおよびFasLを発現してい
るアデノウイルスに感染した抗原提示細胞s;*は、95%信頼区間(P<0.0
5)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
ロウイルス(MCMV)感染マウスからの、マウスサイトメガロウイルスに特異的
な反応性T細胞の量を確認する実験の結果を、図表形式で示す図である。B6l
pr/lprマウスをマウスサイトメガロウイルスに感染させ、図4に記載の種
々のAPCを投与した。APC治療の4週後に、脾臓細胞をMCMV感染マウス
から単離した。in vitroで、T細胞をMCMV感染APCで刺激し、4
8時間後に、IL−2含有上澄を単離した。APC−AdLacZ:LacZを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−AdFasL:
FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−Ad
FasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスおよびFasLを発現してい
るアデノウイルスに感染した抗原提示細胞s;*は、95%信頼区間(P<0.0
5)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図6】
感染前にAdFasL感染抗原提示細胞(APC)を投与しておいたサイトメガ
ロウイルス(MCMV)感染マウスにおける、減少した自己抗体産生の結果を、図
表形式で示す図である。B6gld/gldマウスをマウスサイトメガロウイル
スに感染させ、図4に記載の種々のAPCを投与した。APC治療の4週後に、
MCMV感染マウスから血清を単離した。RFIgG1:リウマチ因子;dsD
NA IgG1:二本鎖DNAに向けられた自己抗体;APC−AdLacZ:
LacZを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−Ad
FasL:FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;A
PC−AdFasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスおよびFasLを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;*は、95%信頼区間(
P<0.05)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
ロウイルス(MCMV)感染マウスにおける、減少した自己抗体産生の結果を、図
表形式で示す図である。B6gld/gldマウスをマウスサイトメガロウイル
スに感染させ、図4に記載の種々のAPCを投与した。APC治療の4週後に、
MCMV感染マウスから血清を単離した。RFIgG1:リウマチ因子;dsD
NA IgG1:二本鎖DNAに向けられた自己抗体;APC−AdLacZ:
LacZを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;APC−Ad
FasL:FasLを発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;A
PC−AdFasL+MCMV:マウスサイトメガロウイルスおよびFasLを
発現しているアデノウイルスに感染した抗原提示細胞;*は、95%信頼区間(
P<0.05)に基づいて、対照群と有意に異なる平均値を示す。
【図7】
LacZを発現しているアデノウイルスに感染させておいたヒトマクロファー
ジ。感染細胞内のβ−ガラクトシダーゼ(LacZ)を、その触媒特性によって検
出するX−Gal染色を使用して、ウイルス感染マクロファージを同定した。
ジ。感染細胞内のβ−ガラクトシダーゼ(LacZ)を、その触媒特性によって検
出するX−Gal染色を使用して、ウイルス感染マクロファージを同定した。
【図8】
抗原提示細胞としての樹状細胞(DC)の機能に対する、IL−10および腫瘍
壊死因子(TNF)の調整作用を証明するための実験結果を、図表形式で示す図で
ある。末梢血単核細胞にIL−4およびGM−CFSを投与することによって、
in vitroで、樹状細胞を末梢血単核細胞から作製した。DCに、TNF
またはIL−10のいずれかを投与し、次に、アロジェニックT細胞と共にイン
キュベートした;次いで、T細胞の刺激および増加を、3H−標識チミジンの取
込みによって測定した。APC:抗原提示細胞;DC(TNF):腫瘍壊死因子(
TNF)で刺激しておいた樹状細胞;DC(IL−10):インターロイキン−1
0で刺激しておいた(IL−10)樹状細胞;アロT細胞:アロジェニックMHC
パターン、すなわち、DCとは異なるMHCパターンを有するドナーからのT細
胞。X軸は、反応に使用されたAPCの量を示す。Y軸は、放射標識ヌクレオチ
ドの取込みの尺度またはT細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(
CPM)を示す。
壊死因子(TNF)の調整作用を証明するための実験結果を、図表形式で示す図で
ある。末梢血単核細胞にIL−4およびGM−CFSを投与することによって、
in vitroで、樹状細胞を末梢血単核細胞から作製した。DCに、TNF
またはIL−10のいずれかを投与し、次に、アロジェニックT細胞と共にイン
キュベートした;次いで、T細胞の刺激および増加を、3H−標識チミジンの取
込みによって測定した。APC:抗原提示細胞;DC(TNF):腫瘍壊死因子(
TNF)で刺激しておいた樹状細胞;DC(IL−10):インターロイキン−1
0で刺激しておいた(IL−10)樹状細胞;アロT細胞:アロジェニックMHC
パターン、すなわち、DCとは異なるMHCパターンを有するドナーからのT細
胞。X軸は、反応に使用されたAPCの量を示す。Y軸は、放射標識ヌクレオチ
ドの取込みの尺度またはT細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(
CPM)を示す。
【図9】
抗原提示細胞(APC)を寛容化することによる同種異系特異的抑制を証明する
ための実験結果を、図表形式で示す図である。末梢血単核細胞にIL−4および
GM−CFSを投与することによって、in vitroで、末梢血単核細胞か
ら樹状細胞を作製した。DCに、TNFまたはIL−10のいずれかを投与し、
続いてアロジェニックT細胞と共にインキュベートした。5日後、この反応から
のT細胞を、第3のアロジェニックドナーからの抗原提示細胞と共にインキュベ
ートし、T細胞の刺激および増加を、3H−標識チミジンの取込によって測定し
た。A、BおよびCは、異なる(アロジェニック)MHCパターンを有するドナー
を示す;MLR:混合リンパ球反応。Y軸は、放射標識ヌクレオチドの取込の尺
度またはT細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(CPM)を示す。
第1の刺激反応(第1のMLR)および第2の反応(第2のMLR)の組成を、個々
のバーの下に示す。
ための実験結果を、図表形式で示す図である。末梢血単核細胞にIL−4および
GM−CFSを投与することによって、in vitroで、末梢血単核細胞か
ら樹状細胞を作製した。DCに、TNFまたはIL−10のいずれかを投与し、
続いてアロジェニックT細胞と共にインキュベートした。5日後、この反応から
のT細胞を、第3のアロジェニックドナーからの抗原提示細胞と共にインキュベ
ートし、T細胞の刺激および増加を、3H−標識チミジンの取込によって測定し
た。A、BおよびCは、異なる(アロジェニック)MHCパターンを有するドナー
を示す;MLR:混合リンパ球反応。Y軸は、放射標識ヌクレオチドの取込の尺
度またはT細胞の刺激の尺度としての、分当たりの放射性崩壊(CPM)を示す。
第1の刺激反応(第1のMLR)および第2の反応(第2のMLR)の組成を、個々
のバーの下に示す。
【図10】
本発明によるベクターの構築物、すなわち、(A)pcDNA3−TK−IRE
S−crmAおよび(B)pcDNA3−FasL−IRES−PLPを図表形式
で示す図である。Fasリガンド(FasL)、タンパク脂質タンパク質(PLP)
、チミジンキナーゼ(TK)およびcrmAに関する核酸配列、およびネオマイシ
ンおよびアンピシリン等の抵抗性タンパク質に関する核酸配列等の、コーディン
グリーディングフレームに、薄い矢印で印をつけてある。制御活性を有する真核
細胞プロモーターエレメント、たとえば、CMVプロモーターおよびSV40プ
ロモーターを、濃い矢印で印をつけてある。SP6プロモーターおよびeT7プ
ロモーター等の原核細胞プロモーターは、細い曲がった矢印で示す。選択された
制限エンドヌクレアーゼ、たとえば、BamHI、EcoRI、XhoIおよび
HindIII用の切断部位は、ヌクレアーゼの名称で確認される。制御核酸配
列、たとえば、SV40ウイルスポリアデニル化配列(SV40polyA)およ
びIRES、すなわち、内部リボソーム結合部位には、細いバーで印をつけてあ
る。
S−crmAおよび(B)pcDNA3−FasL−IRES−PLPを図表形式
で示す図である。Fasリガンド(FasL)、タンパク脂質タンパク質(PLP)
、チミジンキナーゼ(TK)およびcrmAに関する核酸配列、およびネオマイシ
ンおよびアンピシリン等の抵抗性タンパク質に関する核酸配列等の、コーディン
グリーディングフレームに、薄い矢印で印をつけてある。制御活性を有する真核
細胞プロモーターエレメント、たとえば、CMVプロモーターおよびSV40プ
ロモーターを、濃い矢印で印をつけてある。SP6プロモーターおよびeT7プ
ロモーター等の原核細胞プロモーターは、細い曲がった矢印で示す。選択された
制限エンドヌクレアーゼ、たとえば、BamHI、EcoRI、XhoIおよび
HindIII用の切断部位は、ヌクレアーゼの名称で確認される。制御核酸配
列、たとえば、SV40ウイルスポリアデニル化配列(SV40polyA)およ
びIRES、すなわち、内部リボソーム結合部位には、細いバーで印をつけてあ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 1/12 A61P 1/16
1/16 3/10
3/10 5/14
5/14 5/38
5/38 17/00
17/00 17/06
17/06 17/14
17/14 19/02
19/02 21/00
21/00 21/04
21/04 25/00
25/00 29/00
29/00 37/00
37/00 37/02
37/02 37/06
37/06 C12N 15/00 ZNAA
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG
,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,
AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C
A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM
,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,
GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K
E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS
,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
Fターム(参考) 4B024 AA01 BA07 BA21 CA04 DA03
EA02 GA11 HA17
4C084 AA13 NA14 ZA02 ZA33 ZA66
ZA72 ZA75 ZA89 ZA92 ZA94
ZA96 ZB05 ZB08 ZB11 ZB15
ZC06 ZC08 ZC35
4C087 AA01 AA02 BC35 BC38 BC76
BC83 ZA02 ZA33 ZA66 ZA72
ZA75 ZA89 ZA92 ZA94 ZA96
ZB05 ZB08 ZB11 ZB15 ZC06
ZC08
Claims (12)
- 【請求項1】 a)1つ以上のアポトーシス誘導性リガンドをコードする第
1の核酸配列と、 b)1つ以上の抗原をコードする第2の核酸配列と、 適切な場合には、 c)1つ以上の抗アポトーシス分子をコードする第3の核酸配列と、 適切な場合には、 d)1つ以上の自殺酵素をコードする第4の核酸配列と を含む、少なくとも1個の核酸分子を含む遺伝子導入ベクター。 - 【請求項2】 第1および第2の核酸配列が1つの核酸分子上に存在し、か
つ第3および第4の核酸配列が別の核酸分子上に存在するか、あるいは最初の3
つの核酸配列、または4つ全ての核酸配列、または最初の2つと第4の核酸配列
とが、1つの核酸分子上に存在することを特徴とする請求項1に記載の遺伝子導
入ベクター。 - 【請求項3】 第2の核酸配列の発現が、第1の核酸配列の発現に依存し、
及び/又は第3の核酸配列の発現が第4の核酸配列の発現に依存するように、第
1および第2の核酸配列及び/又は第3および第4の核酸配列が互いに機能的に
連結されていることを特徴とする請求項1または2のいずれか1項に記載の遺伝
子導入ベクター。 - 【請求項4】 ベクターが、ウイルス、特にレトロウイルス、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはヘルペス
ウイルス、あるいは細菌、特にリステリア菌、赤痢菌、またはサルモネラ菌、あ
るいはリポソーム、プラスミド、ファジミド、コスミド、バクテリオファージま
たは人工染色体であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺
伝子導入ベクター。 - 【請求項5】 第1の核酸配列が、CD95L/FasL/Apo1L、T
RAILまたはApo3Lをコードすることを特徴とする請求項1〜4のいずれ
か1項に記載の遺伝子導入ベクター。 - 【請求項6】 第2の核酸配列が、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンタ
ンパク脂質タンパク質、オリゴデンドロサイト上のミエリン関連塩基性タンパク
質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、糖タ
ンパク質P0、末梢ミエリンタンパク質22、p170k/SAG、シュワン細
胞ミエリンタンパク質、トランスアルドラーゼ、S100β、αBクリスタリン
、2’,3’−サイクリックヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNP)
、GFAP、アセチルコリン受容体のαまたはεサブユニット、II型コラーゲ
ン、チロシンホスファターゼIa−2、プロインスリン、GAD65、Hsp6
0またはICA69の1つ以上のエピトープをコードすることを特徴とする請求
項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子導入ベクター。 - 【請求項7】 第3の核酸配列が、E3−14.7K、E3−14.5K、
E3−10.4K、FLIP、vFLIP、MC159、MC160、BORF
E2、ウマヘルペスウイルスEHV−2からのE8、HHV−8からのK13、
ヘルペスウイルスサイミリからのORF71、E1B−19K、LMP−1、S
V40からのLTタンパク質、ポリオーマタンパク質STおよびMT、カスパー
ゼのインヒビターまたはアンチセンスRNAをコードすることを特徴とする請求
項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子導入ベクター。 - 【請求項8】 第4の核酸配列が、チミジンキナーゼ、カルボキシルエステ
ラーゼ、シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼG2、チトクロームP
450、デオキシシチジンキナーゼ、ニトロリダクターゼ、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、キサンチン−グアニン−ホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、細菌のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、
またはシトシンデアミナーゼおよびSaccharomyces cerevi
siaeウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質を
コードすることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子導入ベ
クター。 - 【請求項9】 配列番号1または配列番号2で示される核酸配列。
- 【請求項10】 治療薬としての、請求項1〜9のいずれか1項に記載の遺
伝子導入ベクター。 - 【請求項11】 自己免疫疾患、特に関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、一過
性関節炎、脊椎関節症、ベヒテレフ病、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック
病、自己免疫肝炎、I型糖尿病、副腎機能不全、甲状腺炎、乾癬、皮膚炎、疱疹
状皮膚炎、尋常性天疱瘡、脱毛症、多発性硬化症および重症筋無力症を予防また
は治療するための治療剤、あるいは、免疫病因に起因する炎症経過、特に、ウイ
ルス感染または細菌感染に続く慢性炎症、特に、B型肝炎ウイルス感染またはC
型肝炎ウイルス感染に関連した慢性肝炎、または麻疹ウイルス感染に続く脳炎を
慢性的に予防または治療するための治療剤、あるいは移植拒絶を予防または治療
するための治療剤を製造するための請求項1〜9のいずれか1項に記載の遺伝子
導入ベクターの使用。 - 【請求項12】 動物または哺乳類細胞、特にヒト細胞をex vivoで
修飾するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子導入ベクターの
使用。
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