JP2003513280A - Ｘａ因子阻害剤の活性をモニターするためラッセルクサリヘビ蛇毒誘導血漿Ｘａ因子活性の使用 - Google Patents
Ｘａ因子阻害剤の活性をモニターするためラッセルクサリヘビ蛇毒誘導血漿Ｘａ因子活性の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は直接又は間接のＸａ因子阻害剤の効果をモニターする方法に関し、この方法は患者から血漿試料を集め、ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を添加しそして凝血時間又は残存ＦＸａ活性を色素生産により測定することからなる。
Description
【０００１】
本発明はＸａ因子活性の測定に関する。そのような活性は血液凝固時間又は色
素産生性基質を使用して測定することができる。本発明はＦＸａ阻害剤の活性を
測定するための定量方法に関する。より詳しくは、本発明は個体の内在ＦＸａ活
性を誘発しそしてＦＸａ阻害剤の効果を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用に関する。血漿中のＦＸａ活性を測定する方
法は凝血時間及び色素産生方法による。
素産生性基質を使用して測定することができる。本発明はＦＸａ阻害剤の活性を
測定するための定量方法に関する。より詳しくは、本発明は個体の内在ＦＸａ活
性を誘発しそしてＦＸａ阻害剤の効果を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用に関する。血漿中のＦＸａ活性を測定する方
法は凝血時間及び色素産生方法による。
【０００２】
ＡＰＴＴ及びＰＴのような定量法が血液凝固時間を測定するため以前から使用
されてきた。しかしながら、そのような定量法は直接Ｘａ因子（以後“ＦＸａ”
で表す）阻害剤の投与における投薬量の差異を検出するに十分な感度を持たない
。
されてきた。しかしながら、そのような定量法は直接Ｘａ因子（以後“ＦＸａ”
で表す）阻害剤の投与における投薬量の差異を検出するに十分な感度を持たない
。
【０００３】
本発明は直接ＦＸａ阻害剤の安全性及び効力をモニターする問題に関する。本
発明の方法はすべての種において静脈内又は経口投与により活性のＦＸａ阻害剤
の安全性及び効力をモニターするために使用することができる。本発明の方法は
トロンビン阻害剤及び間接ＦＸａ阻害剤例えば凝血カスケードの上流の因子に対
する抗凝血剤及びヘパリン、より特定すると低分子ヘパリンの安全性及び効力を
測定するために使用することもできると考えられている。本方法は患者の前血栓
症状態を予測するために使用することができる。ＦＸａ阻害剤の活性を測定する
ための改良された定量方法を開発するための研究の中で、今回これがＦＸａ阻害
剤の活性により生ずる凝血時間の延長を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用により達成できることを発見した。
発明の方法はすべての種において静脈内又は経口投与により活性のＦＸａ阻害剤
の安全性及び効力をモニターするために使用することができる。本発明の方法は
トロンビン阻害剤及び間接ＦＸａ阻害剤例えば凝血カスケードの上流の因子に対
する抗凝血剤及びヘパリン、より特定すると低分子ヘパリンの安全性及び効力を
測定するために使用することもできると考えられている。本方法は患者の前血栓
症状態を予測するために使用することができる。ＦＸａ阻害剤の活性を測定する
ための改良された定量方法を開発するための研究の中で、今回これがＦＸａ阻害
剤の活性により生ずる凝血時間の延長を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用により達成できることを発見した。
【０００４】
特許請求の範囲に説明されているように、本発明はＸａ因子阻害剤の効果をモ
ニターする方法により目的を達成し、前記方法は ａ）ＦＸａ阻害剤、抗凝血薬、抗血栓症薬、又はそれらのいずれかの組合せの
投与を受けた患者から血漿試料を集め、 ｂ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を血漿試料に添加し、そして ｃ）凝血時間又は色素産生変化を測定する 各段階からなる。
ニターする方法により目的を達成し、前記方法は ａ）ＦＸａ阻害剤、抗凝血薬、抗血栓症薬、又はそれらのいずれかの組合せの
投与を受けた患者から血漿試料を集め、 ｂ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を血漿試料に添加し、そして ｃ）凝血時間又は色素産生変化を測定する 各段階からなる。
【０００５】
本発明の別の目的はＸａ因子阻害剤の効果をモニターする方法であり、前記方
法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）正常血漿試料を連続希釈するために使用するため同じ種のＸ因子欠如血漿
試料を準備し、 ｃ）ａ）及びｂ）で定義した血漿試料にラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を添加
し、 ｄ）哺乳動物からの血漿試料について測定した凝血時間をＸ因子欠如血漿で希
釈した血漿試料について測定した凝血時間と比較し、 ｅ）ＦＸａ活性％（正常な血漿含量に比例する）の標準曲線を作りそして凝血
時間延長を測定し、 ｆ）ＦＸａ阻害剤処置を受けた個体の凝血時間を知り、そして残存ＦＸａ活性
％又はＦＸａ阻害％を標準曲線から求める 各段階からなる。
法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）正常血漿試料を連続希釈するために使用するため同じ種のＸ因子欠如血漿
試料を準備し、 ｃ）ａ）及びｂ）で定義した血漿試料にラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を添加
し、 ｄ）哺乳動物からの血漿試料について測定した凝血時間をＸ因子欠如血漿で希
釈した血漿試料について測定した凝血時間と比較し、 ｅ）ＦＸａ活性％（正常な血漿含量に比例する）の標準曲線を作りそして凝血
時間延長を測定し、 ｆ）ＦＸａ阻害剤処置を受けた個体の凝血時間を知り、そして残存ＦＸａ活性
％又はＦＸａ阻害％を標準曲線から求める 各段階からなる。
【０００６】
本発明の別の目的はＸａ因子阻害剤の効果をモニターする方法であり、前記方
法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液をｂ）で定義した血漿試料に添加し、 ｄ）Ｘａ因子阻害剤のない血漿試料について測定した凝血時間をＸａ因子阻害
剤を添加した血漿試料について測定した凝血時間と比較し、 ｅ）用量依存凝血時間延長曲線を作りそして対照血漿凝血時間より２倍長い凝
血時間に延長するために必要なＦＸａ阻害剤の濃度を求める 各段階からなる。
法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液をｂ）で定義した血漿試料に添加し、 ｄ）Ｘａ因子阻害剤のない血漿試料について測定した凝血時間をＸａ因子阻害
剤を添加した血漿試料について測定した凝血時間と比較し、 ｅ）用量依存凝血時間延長曲線を作りそして対照血漿凝血時間より２倍長い凝
血時間に延長するために必要なＦＸａ阻害剤の濃度を求める 各段階からなる。
【０００７】
哺乳動物はヒト又はウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス又はラットのような動物で
ある。Ｘａ因子阻害剤は血液凝固酵素、特にＸａ因子の阻害剤である化合物であ
る。用語「患者」はヒト又は哺乳動物である。
ある。Ｘａ因子阻害剤は血液凝固酵素、特にＸａ因子の阻害剤である化合物であ
る。用語「患者」はヒト又は哺乳動物である。
【０００８】
本発明の別の目的は残存ＦＸａ活性を色素生産により測定することによるＸａ
因子阻害剤の効果をモニターする方法であり、前記方法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−Ｘ）の溶液をｂ）で定義した血漿試料
に添加し、 ｄ）Ｘａ因子阻害剤のない血漿試料について測定したＦＸａ活性をＸａ因子阻
害剤を添加した血漿試料について測定した残存ＦＸａ活性と比較し、 ｅ）ＦＸａ阻害剤により誘導されるＲＶＶ−Ｘの用量依存阻害の標準曲線を作
り、 ｆ）標準曲線を使用することによりＦＸａ阻害剤治療の間の種々の時点の患者
におけるＦＸａ阻害剤の濃度を評価することができる 各段階からなる。
因子阻害剤の効果をモニターする方法であり、前記方法は ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−Ｘ）の溶液をｂ）で定義した血漿試料
に添加し、 ｄ）Ｘａ因子阻害剤のない血漿試料について測定したＦＸａ活性をＸａ因子阻
害剤を添加した血漿試料について測定した残存ＦＸａ活性と比較し、 ｅ）ＦＸａ阻害剤により誘導されるＲＶＶ−Ｘの用量依存阻害の標準曲線を作
り、 ｆ）標準曲線を使用することによりＦＸａ阻害剤治療の間の種々の時点の患者
におけるＦＸａ阻害剤の濃度を評価することができる 各段階からなる。
【０００９】
本発明の別の目的は血漿試料の取り扱いによる凝血時間の測定における変動を
減らすか又は最小にすることである。これは血漿試料にセファリンを添加するこ
とにより達成される。好ましいセファリン源はウサギ脳に由来する。ＦＸａ活性
の定量に好ましい色素産生性化合物はSpectrozyme FXa(R) である。他のＦＸａ
色素産生性基質も使用することができる。本発明の方法は好ましくは７ないし８
のｐＨの緩衝剤中で実行する。好ましい緩衝剤は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及
びポリエチレン グリコール−８０００（ＰＥＧ−８０００）を含むトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（Ｔｒｉｓ）である。好ましい濃度はＴｒ
ｉｓ、ＮａＣｌ及びＰＥＧ−８０００につきそれぞれ１０mMないし２００mM、２
０mMないし６００mMそして０.０２％ないし１％である。
減らすか又は最小にすることである。これは血漿試料にセファリンを添加するこ
とにより達成される。好ましいセファリン源はウサギ脳に由来する。ＦＸａ活性
の定量に好ましい色素産生性化合物はSpectrozyme FXa(R) である。他のＦＸａ
色素産生性基質も使用することができる。本発明の方法は好ましくは７ないし８
のｐＨの緩衝剤中で実行する。好ましい緩衝剤は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及
びポリエチレン グリコール−８０００（ＰＥＧ−８０００）を含むトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（Ｔｒｉｓ）である。好ましい濃度はＴｒ
ｉｓ、ＮａＣｌ及びＰＥＧ−８０００につきそれぞれ１０mMないし２００mM、２
０mMないし６００mMそして０.０２％ないし１％である。
【００１０】
本発明の別の目的はＦＸａ阻害剤測定のための診断検査のため本発明の方法を
使用するためのキットを提供することである。 本発明の別の目的はＸａ因子阻害剤の活性を測定するため本発明の方法の使用
である。特に好ましいＦＸａ阻害剤は３−（４′−Ｎ−オキソピリジルフェノイ
ル）−３−メチル−２−（ｍ−アミジノベンジル）−プロピオン酸メチルである
。
使用するためのキットを提供することである。 本発明の別の目的はＸａ因子阻害剤の活性を測定するため本発明の方法の使用
である。特に好ましいＦＸａ阻害剤は３−（４′−Ｎ−オキソピリジルフェノイ
ル）−３−メチル−２−（ｍ−アミジノベンジル）−プロピオン酸メチルである
。
【００１１】
実施例においてはＲＶＶＴプロトコルが凝血時間により血漿中のＲＶＶ−Ｘ誘
導ＦＸａ活性を測定するために有用であることを示している。第二のプロトコル
、ＲＶＶＣプロトコルは色素生産関連方法により血漿中のＲＶＶ−Ｘ誘導ＦＸａ
活性を測定するために有用である。ＲＶＶＴはＦＸａ阻害剤による凝血時間の用
量依存延長を示す。ＲＶＶＣはＦＸａ阻害剤による用量依存ＦＸａ阻害を示す。
二つの方法はヒト患者から採取したエックス ビボ血漿試料におけるＦＸａ阻害
剤の濃度の変動を識別するために成功裏に使用される。
導ＦＸａ活性を測定するために有用であることを示している。第二のプロトコル
、ＲＶＶＣプロトコルは色素生産関連方法により血漿中のＲＶＶ−Ｘ誘導ＦＸａ
活性を測定するために有用である。ＲＶＶＴはＦＸａ阻害剤による凝血時間の用
量依存延長を示す。ＲＶＶＣはＦＸａ阻害剤による用量依存ＦＸａ阻害を示す。
二つの方法はヒト患者から採取したエックス ビボ血漿試料におけるＦＸａ阻害
剤の濃度の変動を識別するために成功裏に使用される。
【００１２】
本発明の方法を以下の実施例において詳しく説明する。
実施例１
ラッセルクサリヘビ蛇毒誘発凝血時間（ＲＶＶＴ）プロトコル
試薬：
ＦＸａ緩衝液：
０.０５Ｍ Tris、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ ＰＥＧ−8000、ｐＨ７.５
Tris ６.０６ｇ、ＮａＣｌ ８.７７ｇ、ＰＥＧ−8000 １.０ｇを８００mlの水
に添加し、ｐＨを濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節する。水で１Ｌにする。 ＲＶＶ−Ｘ： Enzyme Research Lab. ＦＸａ緩衝液で１mg／mlとし、次いで同じ緩衝液で１／400に希釈する。 ＲＶＶ−Ｘ使用溶液（ＲＶＶ−Ｃａ）： ２mlの１／400 ＲＶＶ−Ｘ＋１８mlの０.００３５Ｍ ＣａＣｌ2 ＲＶＶ−Ｘの濃度はこの段階で０.２５μg／mlである。 ＦＸ欠如血漿： American Diagnostica Inc．
に添加し、ｐＨを濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節する。水で１Ｌにする。 ＲＶＶ−Ｘ： Enzyme Research Lab. ＦＸａ緩衝液で１mg／mlとし、次いで同じ緩衝液で１／400に希釈する。 ＲＶＶ−Ｘ使用溶液（ＲＶＶ−Ｃａ）： ２mlの１／400 ＲＶＶ−Ｘ＋１８mlの０.００３５Ｍ ＣａＣｌ2 ＲＶＶ−Ｘの濃度はこの段階で０.２５μg／mlである。 ＦＸ欠如血漿： American Diagnostica Inc．
【００１３】
手順：
すべての試薬は使用するまで４℃（氷−水混合物使用）に保たれなければなら
ない。 標準 １．正常なプールした血漿又は患者血漿をＦＸ欠如血漿で１〜１／256の２倍
連続希釈を行う。 ２．ＦＸａ緩衝液 ０.２ml、血漿希釈物０.１mlをキュベットに、次いで０.１
mlのＲＶＶ−Ｃａ（ＭＬＡ−800クロッターをこの試薬に自動的に添加する）を
添加する。 ３．凝血時間を測定する。 ４．標準曲線を作成する。
ない。 標準 １．正常なプールした血漿又は患者血漿をＦＸ欠如血漿で１〜１／256の２倍
連続希釈を行う。 ２．ＦＸａ緩衝液 ０.２ml、血漿希釈物０.１mlをキュベットに、次いで０.１
mlのＲＶＶ−Ｃａ（ＭＬＡ−800クロッターをこの試薬に自動的に添加する）を
添加する。 ３．凝血時間を測定する。 ４．標準曲線を作成する。
【００１４】
化合物３−（４′−Ｎ−オキソピリジルフェノイル）−３−メチル−２−（ｍ−
アミジノベンジル）−プロピオン酸メチル（以後“ＲＰＲ”で表す）又はＲＰＲ
のトリフルオロ酢酸塩による用量依存凝血時間延長曲線： １．ＦＸａ緩衝液０.１ml、ＲＰＲの連続希釈液０.１ml正常合プールした漿又
は患者血漿０.１mlをキュベットに、次いで０.１mlのＲＶＶ−Ｃａ（ＭＬＡ−80
0クロッターをこの試薬に自動的に添加する）を添加する。 ２．凝血時間を測定する。 ３．用量依存凝血時間延長曲線を作成する。 ４．２×ＲＶＶＴにつき濃度を計算する。
アミジノベンジル）−プロピオン酸メチル（以後“ＲＰＲ”で表す）又はＲＰＲ
のトリフルオロ酢酸塩による用量依存凝血時間延長曲線： １．ＦＸａ緩衝液０.１ml、ＲＰＲの連続希釈液０.１ml正常合プールした漿又
は患者血漿０.１mlをキュベットに、次いで０.１mlのＲＶＶ−Ｃａ（ＭＬＡ−80
0クロッターをこの試薬に自動的に添加する）を添加する。 ２．凝血時間を測定する。 ３．用量依存凝血時間延長曲線を作成する。 ４．２×ＲＶＶＴにつき濃度を計算する。
【００１５】
実施例２
色素産生により測定する血漿中のラッセルクサリヘビ蛇毒誘導ＦＸａ（ＲＶＶＣ
）プロトコル ＲＶＶＣ定量方法 色素産生により測定する血漿中のＲＶＶ誘導ＦＸａ活性 Ａ）試薬 ＰＥＧ−Ｃａ++緩衝液： ０.０５Ｍ Tris、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍ ＣａＣｌ2、０.１％ ＰＥ
Ｇ−8000、ｐＨ７.５０ Tris ６.０６ｇ、ＮａＣｌ ８.７７ｇ、ＰＥＧ−8000 １ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ 2 Ｏ １.４７ｇを８００mlの水に添加し、濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節し、
水で１Ｌにする。 ＲＶＶ−Ｘ（ラッセルクサリヘビ蛇毒）： ４４μlのＰＥＧ−Ｃａ++緩衝液を５０μlのＲＶＶ−Ｘストック（Enzyme Res
earch Labs、１.８８mg／ml）に添加して１mg／mlの溶液を作り、常に氷上に保
存する。 １mg／mlのストックを１／１０→１／１０→１／４（＝１／400）に希釈する
。希釈はＰＥＧ−ＣＡＥ緩衝液で行う。
）プロトコル ＲＶＶＣ定量方法 色素産生により測定する血漿中のＲＶＶ誘導ＦＸａ活性 Ａ）試薬 ＰＥＧ−Ｃａ++緩衝液： ０.０５Ｍ Tris、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍ ＣａＣｌ2、０.１％ ＰＥ
Ｇ−8000、ｐＨ７.５０ Tris ６.０６ｇ、ＮａＣｌ ８.７７ｇ、ＰＥＧ−8000 １ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ 2 Ｏ １.４７ｇを８００mlの水に添加し、濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節し、
水で１Ｌにする。 ＲＶＶ−Ｘ（ラッセルクサリヘビ蛇毒）： ４４μlのＰＥＧ−Ｃａ++緩衝液を５０μlのＲＶＶ−Ｘストック（Enzyme Res
earch Labs、１.８８mg／ml）に添加して１mg／mlの溶液を作り、常に氷上に保
存する。 １mg／mlのストックを１／１０→１／１０→１／４（＝１／400）に希釈する
。希釈はＰＥＧ−ＣＡＥ緩衝液で行う。
【００１６】
基質 Spectrozyme FXa(R)：
５０μ moleのSpectrozyme FXa、 American Diagno sticを５mlの無菌水に溶
解して１０mMのストック溶液を作る。 Spectrozyme FXa(R)１.６mM使用溶液： ０.８mlの１０mM ストック溶液を４.２mlのＰＥＧ−Ｃａ緩衝液に添加する。
解して１０mMのストック溶液を作る。 Spectrozyme FXa(R)１.６mM使用溶液： ０.８mlの１０mM ストック溶液を４.２mlのＰＥＧ−Ｃａ緩衝液に添加する。
【００１７】
Ｂ）手順：
１．試薬を次の順序でマイクロタイタープレート又は試験管に添加する：
【表１】
２．次いで５分間動力学的に反応させる。
【００１８】
Ｃ）計算：
初速度を測定し、しかしながら、遅れ期間を無視する。一般に時間経過の直線
部分の初速度を測定する。 異なる時点における臨床試料の初速度を使用しそして次に投与前対照と比較し
て阻害％を計算する。 血漿中に加えられた種々濃度の化合物ＲＰＲをＰＴ、ＡＰＴＴ及びＰＶＶＴ延
長につき分析した。表１の結果はＦＸａ阻害剤としての化合物ＲＰＲの効果に関
してＲＶＶＴが３つの凝血時間定量法の中で最も感度の高い指標であることを示
唆している。 ＲＶＶ−Ｘ誘導凝血時間（ＲＶＶＴ）定量法は患者の内在血漿ＦＸａに対する
ＲＰＲの効果をモニターするのに都合よく使用することができる。
部分の初速度を測定する。 異なる時点における臨床試料の初速度を使用しそして次に投与前対照と比較し
て阻害％を計算する。 血漿中に加えられた種々濃度の化合物ＲＰＲをＰＴ、ＡＰＴＴ及びＰＶＶＴ延
長につき分析した。表１の結果はＦＸａ阻害剤としての化合物ＲＰＲの効果に関
してＲＶＶＴが３つの凝血時間定量法の中で最も感度の高い指標であることを示
唆している。 ＲＶＶ−Ｘ誘導凝血時間（ＲＶＶＴ）定量法は患者の内在血漿ＦＸａに対する
ＲＰＲの効果をモニターするのに都合よく使用することができる。
【００１９】
【表２】
【００２０】
実施例３
ラッセルクサリヘビ蛇毒誘導凝血時間（ＲＶＶＴ）プロトコル（II）
試薬：
ＦＸａ緩衝液：
０.０５Ｍ Tris、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ ＰＥＧ−8000、ｐＨ７.５
Tris ６.０６ｇ、ＮａＣｌ ８.７７ｇ、ＰＥＧ−8000 １.０ｇを８００mlの水
に添加し、〜２mlの濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節する。水で１Ｌにする。
ＲＶＶ−Ｘ： Enzyme Research Lab. ＦＸａ緩衝液で１mg／mlとし、次いで同じ緩衝液で１
２００に希釈する。 ２mlの１／２００ ＲＶＶ−Ｘ＋１８mlの０.００３５Ｍ ＣａＣｌ2、ＲＶＶ−
Ｘの最終濃度はこの段階で０.５μg／mlである。
に添加し、〜２mlの濃塩酸を使用してｐＨ７.５に調節する。水で１Ｌにする。
ＲＶＶ−Ｘ： Enzyme Research Lab. ＦＸａ緩衝液で１mg／mlとし、次いで同じ緩衝液で１
２００に希釈する。 ２mlの１／２００ ＲＶＶ−Ｘ＋１８mlの０.００３５Ｍ ＣａＣｌ2、ＲＶＶ−
Ｘの最終濃度はこの段階で０.５μg／mlである。
【００２１】
ウサギ脳
Centerchem
セファリン
ＦＸａ緩衝液中０.０３５Ｍ ＣａＣｌ2の３.１２５mlを加えて元に戻し、１.
６mg／mlの最終濃度にする。 ＲＶＶ−Ｘ ＲＢ セファリン使用溶液（ＲＶＶ−Ｃａ−セファリン）： 等量の０.５μg／ml ＲＶＶ−Ｘを等量の１.６mg／mlのウサギ脳セファリンと
混合する。 この段階で試薬貯蔵液中のＲＶＶ−Ｘ及びセファリンの最終濃度はそれぞれ、
０.２５μg／ml及び０.８mg／mlである。
６mg／mlの最終濃度にする。 ＲＶＶ−Ｘ ＲＢ セファリン使用溶液（ＲＶＶ−Ｃａ−セファリン）： 等量の０.５μg／ml ＲＶＶ−Ｘを等量の１.６mg／mlのウサギ脳セファリンと
混合する。 この段階で試薬貯蔵液中のＲＶＶ−Ｘ及びセファリンの最終濃度はそれぞれ、
０.２５μg／ml及び０.８mg／mlである。
【００２２】
手順：
すべての試薬は使用するまで４℃（氷−水混合物使用）に保たれなければなら
ない。 投与前血漿 正常ＲＶＶＴ １．ＦＸａ緩衝液 ０.２ml、投与前血漿０.１mlをキュベットに、次いで０.１
mlのＲＶＶ−Ｃａ−セファリンを添加する（ＲＶＶ−Ｘ及びセファリンの最終濃
度はそれぞれ、０.０６２５μg／ml及び０.２mg／mlである）。 ２．凝血時間を測定する。 結果：ＲＶＶＴのフォールド変化を計算する。
ない。 投与前血漿 正常ＲＶＶＴ １．ＦＸａ緩衝液 ０.２ml、投与前血漿０.１mlをキュベットに、次いで０.１
mlのＲＶＶ−Ｃａ−セファリンを添加する（ＲＶＶ−Ｘ及びセファリンの最終濃
度はそれぞれ、０.０６２５μg／ml及び０.２mg／mlである）。 ２．凝血時間を測定する。 結果：ＲＶＶＴのフォールド変化を計算する。
【００２３】
ＲＶＶＴに与えるウサギ脳セファリンの効果
セファリンの希釈液を添加したＲＶＶ誘導血漿（プールしたＧＫ血漿及びドナ
ーＤＮ、ＲＢ、ＴＤ）凝血時間（ｎ＝２）
ーＤＮ、ＲＢ、ＴＤ）凝血時間（ｎ＝２）
【表３】
【００２４】
結論：
試料取り扱いによるＲＶＶＴの変動は反応混合物に〜０.２mg／mlのウサギ脳セ
ファリンの添加により少なくすることができる。
ファリンの添加により少なくすることができる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年９月２７日（２００１．９．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
刊行物（Clinical Chemistry, 26巻／7号、885-890ページ、1980年）はＸ因子
がラッセルクサリヘビ蛇毒により直接活性化されるＸ因子の定量法を開示してお
り、アルコール中で（13巻、6号、539-545ページ、1996年）Ｘ因子及びＸａ因子
に与えるアセトアルデヒドの影響を記述している。症例報告においてＩｇＧが無
傷のＸ因子の軽鎖に結合しそしてこれによりＸ因子の活性化を阻害すると報告し
ている（Thrombosis & Haemostasis 72巻（3号）、363-371ページ、1994年）。
がラッセルクサリヘビ蛇毒により直接活性化されるＸ因子の定量法を開示してお
り、アルコール中で（13巻、6号、539-545ページ、1996年）Ｘ因子及びＸａ因子
に与えるアセトアルデヒドの影響を記述している。症例報告においてＩｇＧが無
傷のＸ因子の軽鎖に結合しそしてこれによりＸ因子の活性化を阻害すると報告し
ている（Thrombosis & Haemostasis 72巻（3号）、363-371ページ、1994年）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ＡＰＴＴ及びＰＴのような定量法が血液凝固時間を測定するため以前から使用
されてきた。しかしながら、そのような定量法は直接Ｘａ因子（以後“ＦＸａ”
で表す）阻害剤の投与における投薬量の差異を検出するに十分な感度を持たない
。本発明は直接ＦＸａ阻害剤の安全性及び効力をモニターする問題に関する。本
発明の方法はすべての種において静脈内又は経口投与により活性のＦＸａ阻害剤
の安全性及び効力をモニターするために使用することができる。本発明の方法は
トロンビン阻害剤及び間接ＦＸａ阻害剤例えば凝血カスケードの上流の因子に対
する抗凝血剤及びヘパリン、より特定すると低分子ヘパリンの安全性及び効力を
測定するために使用することもできると考えられている。本方法は患者の前血栓
症状態を予測するために使用することができる。ＦＸａ阻害剤の活性を測定する
ための改良された定量方法を開発するための研究の中で、今回これがＦＸａ阻害
剤の活性により生ずる凝血時間の延長を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用により達成できることを発見した。
されてきた。しかしながら、そのような定量法は直接Ｘａ因子（以後“ＦＸａ”
で表す）阻害剤の投与における投薬量の差異を検出するに十分な感度を持たない
。本発明は直接ＦＸａ阻害剤の安全性及び効力をモニターする問題に関する。本
発明の方法はすべての種において静脈内又は経口投与により活性のＦＸａ阻害剤
の安全性及び効力をモニターするために使用することができる。本発明の方法は
トロンビン阻害剤及び間接ＦＸａ阻害剤例えば凝血カスケードの上流の因子に対
する抗凝血剤及びヘパリン、より特定すると低分子ヘパリンの安全性及び効力を
測定するために使用することもできると考えられている。本方法は患者の前血栓
症状態を予測するために使用することができる。ＦＸａ阻害剤の活性を測定する
ための改良された定量方法を開発するための研究の中で、今回これがＦＸａ阻害
剤の活性により生ずる凝血時間の延長を測定するためラッセルクサリヘビ蛇毒（
以後“ＲＶＶ−Ｘ”で表す）の使用により達成できることを発見した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Claims (10)
- 【請求項１】 ａ）ＦＸａ阻害剤、抗凝血薬、抗血栓症薬、又はそれらのい
ずれかの組合せの投与を受けた患者から血漿試料を集め、 ｂ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を血漿試料に添加し、そして ｃ）凝血時間又は色素産生変化を測定する、 各段階からなる、Ｘａ因子（ＦＸａ）阻害剤の効果をモニターする方法。 - 【請求項２】 ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）正常血漿試料を連続希釈するために使用するため同じ種のＸ因子欠如血漿
試料を準備し、 ｃ）ａ)及びｂ)で定義した血漿試料にラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液を添加し
、 ｄ）血漿試料について測定した凝血時間をＸ因子欠如血漿で希釈した血漿試料
について測定した凝血時間と比較し、 ｅ）ＦＸａ活性％（正常血漿含量に比例する）及び凝血時間延長の標準曲線を
作り、 ｆ）ＦＸａ阻害剤処理を受けた哺乳動物の凝血時間を知り、残存ＦＸａ活性％
又はＦＸａ阻害％を標準曲線から求める、 各段階からなる、Ｘａ因子阻害剤の効果をモニターする方法。 - 【請求項３】 ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒の溶液をｂ）で定義した血漿試料に添加し、 ｄ）Ｘａ因子阻害剤のない血漿試料について測定した凝血時間をＸａ因子阻害
剤を添加した血漿試料についてのそれと比較し、 ｅ）用量依存凝血時間延長曲線を作りそして対照血漿凝血時間より２倍長い凝
血時間に延長するために必要なＦＸａ阻害剤の濃度を求める、 各段階からなる、Ｘａ因子阻害剤の効果をモニターする方法。 - 【請求項４】 ａ）哺乳動物から血漿試料を集め、 ｂ）前記血漿試料を小部分に分け、一つの部分を対照正常血漿として保持しそ
して他の部分にＸａ因子阻害剤の連続希釈液を添加し、 ｃ）ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−Ｘ）の溶液をｂ）で定義した血漿試料
に添加し、 ｄ）対照血漿について測定したＦＸａ活性をＸａ因子阻害剤を添加した他の血
漿試料について測定した残存ＦＸａ活性と比較し、 ｅ）ＦＸａ阻害剤により誘導されるＲＶＶ−Ｘの用量依存阻害の標準曲線を作
り、 ｆ）ＦＸａ阻害剤の濃度を標準曲線を使用することにより評価する、 各段階からなる、Ｘａ因子阻害剤の効果をモニターする方法。 - 【請求項５】 残存ＦＸａ活性を色素産生により測定する請求項１〜４のい
ずれかの項に記載の方法。 - 【請求項６】 セファリンを血漿試料に添加する請求項１〜５のいずれかの
項に記載の方法。 - 【請求項７】 血漿試料を７〜８のｐＨを有する緩衝剤にインキュベートす
る請求項１〜６のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項８】 ＦＸａ阻害剤測定のための診断検査の準備のための請求項１
〜７のいずれかの項に記載の方法の使用。 - 【請求項９】 直接又は間接のＸａ因子阻害剤の活性の測定のための請求項
１〜７のいずれかの項に記載の方法の使用。 - 【請求項１０】 ＦＸａ阻害剤が３−（４′−Ｎ−オキソピリジルフェノイ
ル）−３−メチル−２−（ｍ−アミジノベンジル）−プロピオン酸メチルである
請求項９に記載の使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16316199P | 1999-11-02 | 1999-11-02 | |
| US60/163,161 | 1999-11-02 | ||
| GBGB9930535.1A GB9930535D0 (en) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | Method |
| GB9930535.1 | 1999-12-23 | ||
| PCT/EP2000/010646 WO2001033217A2 (en) | 1999-11-02 | 2000-10-28 | Monitoring the activity of factor xa inhibitors |
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|---|---|
| JP2003513280A true JP2003513280A (ja) | 2003-04-08 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| AU (1) | AU1515701A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011508583A (ja) * | 2007-12-28 | 2011-03-10 | ワールプール，ソシエダッド アノニマ | シリンダとリニアモータ駆動ピストンの間の衝撃を検出する方法、シリンダとリニアモータ駆動ピストンの間の衝撃の検出器、ガスコンプレッサ、リニアモータ駆動のシリンダ・ピストンセットのための制御システム |
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|---|---|---|---|---|
| ES2620421T3 (es) * | 2009-10-30 | 2017-06-28 | Senova Gesellschaft für Biowissenschaft und Technik mbH | Peptidasas acopladas a polímero |
| US20110136779A1 (en) * | 2009-11-23 | 2011-06-09 | Milner Peter G | Methods for stroke reduction in atrial fibrillation patients |
| US20110144199A1 (en) * | 2009-11-23 | 2011-06-16 | Milner Peter G | Methods for treating atrial fibrillation |
| US9549912B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-01-24 | Armetheon, Inc. | Methods for treating atrial fibrillation |
| CN108982865B (zh) * | 2018-08-16 | 2021-05-11 | 上海原科实业发展有限公司 | 一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN114681597A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-07-01 | 兆科药业（合肥）有限公司 | 蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子Xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4946775A (en) * | 1985-09-05 | 1990-08-07 | Yin E Thye | Composition, kit and method for assaying heparin and a method for making the composition |
| US5120537A (en) * | 1989-06-14 | 1992-06-09 | Oklahoma Medical Research Foundation | Factor xa based anticoagulant compositions |
| US5187155A (en) * | 1989-06-23 | 1993-02-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anticoagulant peptides |
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| BR9612423B1 (pt) | 1996-01-02 | 2010-11-30 | composto de n-[(amino-imino-metil ou amino-metil) fenil] propil amidas substituìdas, e, composição farmacêutica. | |
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