JP2003512832A - 5R clabham-producing microorganism lacking LAT and CVM genes - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高レベルのクラブラン酸および強力なβ−ラクタマーゼ阻害活性を含む他の５Ｒクラバムを、低レベルまたは検出不可能な量の５Ｓクラバムとの組合せにおいて産生する生物に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to organisms that produce high levels of clavulanic acid and other 5R clabam containing potent β-lactamase inhibitory activity in combination with low or undetectable amounts of 5S clabam.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 本発明は、高レベルのクラブラン酸または強力なβ−ラクタマーゼ阻害活性を
有するものを含む他の５Ｒクラバム（clavam）を、低レベルまたは検出不可能な
レベルの５Ｓクラバムと合わせて産生する新規な生物に関する。本発明はまた、
５Ｒクラバム、特にクラブラン酸を産生するために前記微生物を使用する方法に
関する。The present invention produces other 5R clavams, including those with high levels of clavulanic acid or potent β-lactamase inhibitory activity, in combination with low or undetectable levels of 5S clavam. Concerning a new organism that does. The present invention also provides
It relates to a method of using said microorganism to produce 5R clavam, especially clavulanic acid.

【０００２】 微生物、特にストレプトミセス（Streptomyces）種は、クラブラン酸ならびに
他のクラバム、セファロスポリン、セファマイシン、ツニカマイシン、ホロマイ
シン、ポリケチドおよびペニシリンを包含する多くの抗生物質を産生する。これ
らの産生された抗生物質の絶対および相対量を操作できることに非常に興味深い
ことであり、したがってこれらの経路の代謝および遺伝メカニズムを調査する多
くの研究がなされてきた（Domain, A. L. (1990) “Biosynthesis and regulati
on of beta-lactam antibiotics" in "50 years of Penicillin applications,
history and trends"）。代謝経路のさまざまな工程を進行させる多くの酵素お
よびこれらの酵素をコードする遺伝子が知られている。Microorganisms, especially Streptomyces spp., Produce a number of antibiotics including clavulanic acid and other clavams, cephalosporins, cephamycins, tunicamycins, holomycins, polyketides and penicillins. It is of great interest to be able to manipulate the absolute and relative amounts of these produced antibiotics, and therefore many studies have been conducted to investigate the metabolic and genetic mechanisms of these pathways (Domain, AL (1990) “ Biosynthesis and regulati
on of beta-lactam antibiotics "in" 50 years of Penicillin applications,
history and trends "). Many enzymes and genes encoding these enzymes are known to drive various steps in metabolic pathways.

【０００３】 例えばストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）に
おけるセファロスポリン代謝経路において、３つの重要な抗生物質、すなわち、
ペニシリンＮ、Ｏ−カルバモイルデアセチルセファロスポリンＣおよびセファマ
イシンＣを産生することができる。これらの抗生物質はトリペプチド前駆体ｄ−
（Ｌ−ａ−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン；ＡＣＶから合成
される（J. F. Martinら (1990)、“Clusters of genes involved in Penicilli
n and cephalosporin biosynthesis" in "50 years of Penicillin application
s, history and trends"）。[0003] For example, in the cephalosporin metabolic pathway in Streptomyces clavuligerus, three important antibiotics are:
Penicillin N, O-carbamoyldeacetyl cephalosporin C and cephamycin C can be produced. These antibiotics are tripeptide precursors d-
(L-a-aminoadipyl) -L-cysteinyl-D-valine; synthesized from ACV (JF Martin et al. (1990), "Clusters of genes involved in Penicilli.
n and cephalosporin biosynthesis "in" 50 years of Penicillin application
s, history and trends ").

【０００４】 エス・クラブリゲルスにおけるペニシリンおよびセファロスポリンの両方の生
合成において知られている第一の特定の工程は、ｌａｔ遺伝子によりコードされ
る酵素リシン−ε−アミノトランスフェラーゼ（LAT）により触媒されるＬ−リ
シンのＬ−ε−アミノアジピン酸への変換である。エス・クラブリゲルスｌａｔ
遺伝子のヌクレオチド配列、その結果としてのコードされたタンパク質の誘導ア
ミノ酸配列は公知である（Tobin, M. B.ら、(1991) J. Bacteriol, 173, 6223-6
229）。ｌａｔ遺伝子を破壊または欠失させると、５Ｒクラバムクラブラン酸の
産生を増大させることができることが証明されている（WO96/41886、SmithKline
Beecham plc）。The first specific step known in the biosynthesis of both penicillins and cephalosporins in S. crabrigels is catalyzed by the enzyme lysine-ε-aminotransferase (LAT) encoded by the lat gene. Conversion of L-lysine to L-ε-aminoadipic acid. S Club Rigels lat
The nucleotide sequence of the gene and the resulting derived amino acid sequence of the encoded protein are known (Tobin, MB et al. (1991) J. Bacteriol, 173, 6223-6.
229). It has been demonstrated that disruption or deletion of the lat gene can increase production of 5R clavam clavulanate (WO96 / 41886, SmithKline.
Beecham plc).

【０００５】 クラバムはその環の立体化学により任意に２つの群に分けることができる（５
Ｓおよび５Ｒクラバム）。５Ｒおよび５Ｓクラバムの生合成に関する生化学経路
は十分には解明されていないが、これらは同じスターターユニット；３炭素化合
物（おそらくＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（Khaleeliら（1999）
J. Amer Chem. Soc. 121 (39); 9223-9224）およびアルギニン（Valentine, B.
P.ら(1993) J. Am Chem. Soc. 115, 1210-1211）に由来し、いくつかの共通の
中間体を共有する（Iwata-Reuyl, D.およびC. A. Townsend (1992) J. Am. Chem
. Soc. 114: 2762-63、ならびにJanc, J. W.ら(1993) Bioorg. Med. Chem. Lett
. 3:2313-16）と考えられる。Clavams can be arbitrarily divided into two groups depending on the stereochemistry of their rings (5
S and 5R clavum). The biochemical pathways for 5R and 5S clavam biosynthesis have not been fully elucidated, but these are the same starter unit; a three carbon compound (probably D-glyceraldehyde-3-phosphate (Khaleeli et al. (1999)).
J. Amer Chem. Soc. 121 (39); 9223-9224) and arginine (Valentine, B.
P. et al. (1993) J. Am Chem. Soc. 115, 1210-1211) and share some common intermediates (Iwata-Reuyl, D. and CA Townsend (1992) J. Am. Chem
Soc. 114: 2762-63, and Janc, JW et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett.
. 3: 2313-16).

【０００６】 ５Ｓクラバムの例としては、クラバム−２−カルボキシレート（Ｃ２Ｃ）、２
−ヒドロキシメチルクラバム（２ＨＭＣ）、２−（３−アラニル）クラバム、バ
ルクラバムおよびクラバミン酸（GB1585661、Rohl, F.ら、Arch. Microbiol. 14
7:315-320、US4202819）が挙げられる。しかしながら、５Ｒクラバムの例はほと
んどなく、最もよく知られているのは、エス・クラブリゲルスの発酵により産生
されるβ−ラクタマーゼ阻害物質クラブラン酸である。抗生物質AUGMENTIN（Smi
thKline Beechamの商標）において、クラブラン酸カリウムの形態のクラブラン
酸が、β−ラクタムアモキシシリンと組み合わされている。商業的利益のために
、クラバム生合成を理解するための研究は、５Ｒクラバム、クラブラン酸のエス
・クラブリゲルスによる生合成に集中している。クラブラン酸の生合成に関連す
る多くの酵素およびその遺伝子が同定され、公開されている。かかる刊行物の例
としては、Hodgson, J. E.ら、Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K. A.ら、Gene
147, 41-46 (1994), Paradkar, A. S.ら、J. Bact. 177 (5), 1307-14 (1995)
が挙げられる。Examples of 5S clavam include clavam-2-carboxylate (C2C), 2
-Hydroxymethyl clavam (2HMC), 2- (3-alanyl) clavam, bulk rabam and clavamic acid (GB1585661, Rohl, F. et al. Arch. Microbiol. 14
7: 315-320, US4202819). However, there are few examples of 5R clavams, and the best known one is clavulanic acid, a β-lactamase inhibitor produced by fermentation of S. clavrigels. Antibiotic AUGMENTIN (Smi
In thKline Beecham), clavulanic acid in the form of potassium clavulanate is combined with β-lactam amoxicillin. For commercial gain, research to understand clavam biosynthesis has focused on the biosynthesis of 5R clavam, clavulanic acid by S. clavrigels. Many enzymes and their genes involved in clavulanic acid biosynthesis have been identified and published. Examples of such publications include Hodgson, JE et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, KA et al., Gene
147, 41-46 (1994), Paradkar, AS et al., J. Bact. 177 (5), 1307-14 (1995).
Is mentioned.

【０００７】 クラバミン酸、すなわち、これもまたクラブラン酸前駆体である５Ｓクラバム
は、エス・クラブリゲルスにおけるクラブラン酸生合成経路においてクラバミン
酸シンターゼの作用により産生されることが知られている。遺伝子クローニング
実験により、エス・クラブリゲルスは２種のクラバミン酸シンターゼイソ酵素、
ｃａｓ１およびｃａｓ２（Marsh, E. N.らBiochemistry 31, 12648-657 (1992)
）を含み、これらは共に特定の栄養条件下でクラブラン酸産生に貢献できる（Pa
radkar, A. S.ら、J. Bact. 177 (5), 1307-14 (1995)）ことが明らかにされて
いる。クラバミン酸シンターゼ活性も他のクラブラン酸産生微生物、すなわち、
エス・ジュモンジネンシス（S.jumonjinensis）（Vidal, C. M.、ES 550549、(1
987)）およびエス・カツラハマヌス(S.katsurahamanus)（Kitano, K.ら、JP 53-
104796, (1978)）ならびに５Ｓクラバム、バルクラバムの産生菌であるエス・ア
ンチビオチコス(S.antibioticos)（Baldwin, J. E.ら、Tetrahedron Letts. 35
(17), 2783-86, (1994)）において検出されている。後者の論文では、エス・ア
ンチビオチコスが、クラブラン酸生合成に関与することが知られているもう一つ
の酵素であるプロクラバミン酸アミジノヒドロラーゼ活性を有することも報告さ
れている。Clavamic acid, 5S clavam, also a clavulanic acid precursor, is known to be produced by the action of clavamic acid synthase in the clavulanic acid biosynthetic pathway in S. crabrigels. . According to the gene cloning experiment, S. crabrigels showed two kinds of clavamate synthase isoenzymes,
cas1 and cas2 (Marsh, EN et al. Biochemistry 31, 12648-657 (1992)
), Both of which can contribute to clavulanic acid production under specific nutritional conditions (Pa
radkar, AS et al., J. Bact. 177 (5), 1307-14 (1995)). Clavamic acid synthase activity is also found in other clavulanic acid producing microorganisms, namely,
S.jumonjinensis (Vidal, CM, ES 550549, (1
987)) and S. katsurahamanus (Kitano, K. et al., JP 53-
104796, (1978)) and S-antibioticos (Baldwin, JE et al., Tetrahedron Letts.
(17), 2783-86, (1994)). The latter article also reported that S. antibiotics has proclavavamate amidinohydrolase activity, another enzyme known to be involved in clavulanic acid biosynthesis.

【０００８】 近年、エス・クラブリゲルスにおけるＣ２Ｃおよび２ＨＭＣに例示されるよう
な５Ｓクラバムの生合成について特異的な（すなわち、５Ｒクラバムの生合成に
不可欠ではない）遺伝子が同定されている。例えば、Mosher, RHら(1999) Antim
icrobial Agents and Chemotherapy 43 (5) p1215-1224は、ｃａｓ１遺伝子の上
流の３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ｃｖｍ１、２および３）
ならびにｃａｓ１の下流の３つのＯＲＦ（ｃｖｍ４、５および６）を開示してい
る。さらに、これらの５Ｓクラバム特異性遺伝子を破壊または欠失させることに
より、５Ｒクラバム、例えばクラブラン酸の産生を増大させ、５Ｓクラバム、例
えばＣ２Ｃの生合成を減少または消失させることが可能であることも証明されて
いる（WO98/33896、SmithKline Beecham plcおよびthe Governors of the Unive
rsity of Alberta）。[0008] Recently, genes specific for the biosynthesis of 5S clavam (ie, not essential for the biosynthesis of 5R clavam) have been identified, as exemplified by C2C and 2HMC in S. clavigers. For example, Mosher, RH et al. (1999) Antim.
icrobial Agents and Chemotherapy 43 (5) p1215-1224 is composed of three open reading frames (ORFs) (cvm1, 2 and 3) upstream of the cas1 gene.
And three ORFs downstream of cas1 (cvm4, 5 and 6). Furthermore, it is possible to disrupt or delete these 5S clavam specific genes to increase the production of 5R clavam, eg clavulanic acid and reduce or eliminate the biosynthesis of 5S clavam, eg C2C. Have also been certified (WO98 / 33896, SmithKline Beecham plc and the Governors of the Unive
rsity of Alberta).

【０００９】 依然として、５Ｒクラバム、例えばクラブラン酸を産生するための生物および
方法を改善することが望まれている。５Ｒクラバムの収率を定量的かつ定性的に
改善することができる生物および方法が特に必要とされている。定量的とは、本
質的にさらに高い収率を意味する。定性的とは、本質的に、望ましくない５Ｓク
ラバムのレベルが著しく少ないか、または検出できない、５Ｒクラバム生成物で
あることを意味する。[0009] There remains a need to improve organisms and methods for producing 5R clavams, such as clavulanic acid. There is a particular need for organisms and methods that can quantitatively and qualitatively improve the yield of 5R clavam. Quantitative means essentially higher yields. By qualitative is meant essentially a 5R clavam product with significantly less or undetectable levels of unwanted 5S clavam.

【００１０】 したがって、一の態様において、本発明は： ａ）ｌａｔ遺伝子が欠失、破壊またはそうでなければ不完全になっているセファ
ロスポリン生合成経路、またはその一部；および ｂ）５Ｓクラバム生合成について特異的な１またはそれ以上の遺伝子が欠失、破
壊またはそうでなければ不完全になっているクラバム生合成経路 を含む、５Ｒクラバムを産生する生物に関する。Accordingly, in one aspect, the invention provides: a) a cephalosporin biosynthetic pathway in which the lat gene is deleted, disrupted, or otherwise incomplete, or a portion thereof; and b) 5S. It relates to organisms producing a 5R clavam, which comprises a clavam biosynthetic pathway in which one or more genes specific for clavam biosynthesis are deleted, disrupted or otherwise incomplete.

【００１１】 好ましい例において、該生物は、ストレプトミセス科放線菌（Streptomycete
）、好ましくはエス・クラブリゲルスである。さらに好ましい具体例において、
破壊されているかまたはそうでなければ不完全になっている５Ｓクラバム生合成
について特異的な遺伝子は、ｃｖｍ１、ｃｖｍ２、ｃｖｍ３、ｃｖｍ４、ｃｖｍ
５およびｃｖｍ６からなる群から選択され、好ましくはｃｖｍ１、ｃｖｍ４また
はｃｖｍ５であり、最も好ましくはｃｖｍ１である。好ましくは、５Ｒクラバム
はβ−ラクタマーゼ阻害活性を有し、最も好ましくは５Ｒクラバムはクラブラン
酸である。In a preferred example, the organism is a Streptomycete family actinomycete.
), Preferably S. club ligels. In a more preferred embodiment,
Genes specific for 5S clavam biosynthesis that are disrupted or otherwise incomplete are: cvm1, cvm2, cvm3, cvm4, cvm
5 and cvm6, preferably cvm1, cvm4 or cvm5, most preferably cvm1. Preferably, the 5R clavam has β-lactamase inhibitory activity, most preferably the 5R clavam is clavulanic acid.

【００１２】 本発明において使用される「欠失した」なる用語は、遺伝子の全体または一部
の欠失を意味する。部分的欠失は、標的遺伝子から任意の量のＤＮＡが、１塩基
対（ｂｐ）から遺伝子のほぼ全ポリペプチドコーティング領域まで除去されてい
ることを含む。全体的な欠失は、遺伝子機能に必要な調節エレメント、例えば転
写プロモーターを含んでも、含まなくてもよい、フランキング配列を有するかま
たは有さない遺伝子の全コーディング領域の除去を含む。さらに、欠失の結果、
調節領域、例えばプロモーターだけが除去され、コーディング領域はそのまま残
される。結果は、ｍＲＮＡを産生することができず、したがって遺伝子は不完全
になる。The term “deleted” as used in the present invention means the deletion of all or part of a gene. Partial deletions include the removal of any amount of DNA from a target gene from 1 base pair (bp) to almost the entire polypeptide coating region of the gene. Global deletions include the removal of all coding regions of a gene with or without flanking sequences, which may or may not include regulatory elements necessary for gene function, such as transcriptional promoters. Furthermore, as a result of the deletion,
Only the regulatory region, eg the promoter, is removed, leaving the coding region intact. The result is an inability to produce mRNA and thus an imperfect gene.

【００１３】 部分的欠失に関して、遺伝子のコーディング領域から１または２塩基対だけを
除去すると、フレームシフト変異が起こり、その結果、切断された遺伝子産物が
得られる。好ましくは、切断された遺伝子産物は完全なポリペプチドが有する残
留活性を有しない。この点に関して、コーディング領域の５’末端により近い欠
失が好ましい。With respect to partial deletions, removal of only one or two base pairs from the coding region of a gene results in a frameshift mutation, resulting in a truncated gene product. Preferably, the cleaved gene product does not have the residual activity possessed by the intact polypeptide. In this regard, deletions closer to the 5'end of the coding region are preferred.

【００１４】 本発明において使用される「そうでなければ不完全になっている」なる用語は
、これに限定されないが、遺伝子または遺伝子の一部の転写を防止するためにプ
ロモーターから下流に強力な転写ターミネーターを挿入するような方法；それぞ
れｍＲＮＡと結合させるかまたはｍＲＮＡを開裂させることにより転写後レベル
で発現をブロックするためのアンチセンス（例えば、O'Connor、J Neurochem (1
991) 56:560）またはリボザイム（例えば、Usman, N. ら、Curr. Opin. Struct.
Biol (1996) 6 (4), 527-33）の使用；あるいは転写上無変化であるように遺伝
子の特定のＤＮＡ配列と結合する三重らせん形成オリゴヌクレオチドを使用する
ことにより転写を阻害すること（例えば、Dervanら、Science (1991) 251:1360
）を包含すると理解される。当業者は、当該分野において一般的な方法を用いて
、本発明のこれらの態様を実施することができる。標的遺伝子を不完全にする他
の方法は、この定義内に含まれると理解される。The term “otherwise incomplete” as used in the present invention includes, but is not limited to, a strong promoter downstream from a promoter to prevent transcription of a gene or part of a gene. A method such as inserting a transcription terminator; antisense to block expression at the post-transcriptional level by binding to or cleaving mRNA, respectively (eg O'Connor, J Neurochem (1
991) 56: 560) or ribozymes (eg Usman, N. et al., Curr. Opin. Struct.
Biol (1996) 6 (4), 527-33); or inhibiting transcription by using a triple helix-forming oligonucleotide that binds to a specific DNA sequence of the gene so that it is transcriptionally unchanged ( For example, Dervan et al., Science (1991) 251: 1360.
) Is understood to include. One of ordinary skill in the art can implement these aspects of the invention using methods conventional in the art. Other methods of making the target gene defective are understood to be included within this definition.

【００１５】 さらにもう一つの態様において、本発明は、５Ｒクラバムの生合成を促進する
発酵条件下で本発明の生物を成長させることを含む５Ｒクラバムを産生する方法
に関する。 一の好ましい態様において、本発明は本発明の方法を用いて産生される５Ｒク
ラバム、好ましくはクラブラン酸に関する。 本発明の生物を調製する方法は当該分野においてよく知られている。本発明の
生物の調製の出発点は、「親」生物である。親生物は、ストレプトミセス科放線
菌、例えばエス・クラブリゲルス（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）から入手可能−ＡＴＣＣ２７０６４
）またはこれから誘導される任意の修飾株である。かかる親株は、より高レベル
のクラブラン酸を産生するために操作されたか、または確立された株改良技術に
より選択されたものを包含する。In yet another aspect, the invention relates to a method of producing a 5R clavam comprising growing an organism of the invention under fermentation conditions that promotes biosynthesis of the 5R clavum. In one preferred embodiment, the invention relates to 5R clavam, preferably clavulanic acid, produced using the method of the invention. Methods for preparing the organisms of the invention are well known in the art. The starting point for the preparation of the organisms of the invention is the "parent" organism. The parental organism is a Streptomyces family actinomycete, such as S. crab ligels (available from American Type Culture Collection-ATCC27064
) Or any modified strain derived therefrom. Such parental strains include those engineered to produce higher levels of clavulanic acid or selected by established strain improvement techniques.

【００１６】 かかる親株は、セファロスポリン生合成経路、またはその一部を含む。生合成
経路の一部は、該生合成経路において１またはそれ以上の酵素をコードする１ま
たはそれ以上の遺伝子が、例えば欠失により存在しないか、またはそうでなけれ
ば不完全になっているものである。生合成経路遺伝子が存在しないことは、自然
現象の結果であるか、当該分野において一般的な方法を使用して操作されたかで
ある（Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T. (1989) Molecular Clo
ning A Laboratory Manual (第２版)）。Such parent strain comprises the cephalosporin biosynthetic pathway, or part thereof. Part of a biosynthetic pathway is one in which one or more genes encoding one or more enzymes in the biosynthetic pathway are absent or otherwise incomplete, for example by deletion. Is. The absence of biosynthetic pathway genes was the result of a natural phenomenon or was engineered using methods common in the art (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989 ) Molecular Clo
ning A Laboratory Manual (2nd edition)).

【００１７】 親株は５Ｒクラバム、最も好ましくはクラブラン酸の生合成の経路をも構成す
る。 親生物のｌａｔ遺伝子および５Ｓクラバム特異性遺伝子は、欠失しているか、
破壊されているか、またはそうでなければ一般的な方法（例えば、Sambrookら(1
989)前掲において開示されている方法）を用いて不完全にされていてもよい。The parent strain also constitutes the pathway for the biosynthesis of 5R clavam, most preferably clavulanic acid. The parental lat gene and the 5S clavam specificity gene are deleted,
Destroyed or otherwise common methods (eg Sambrook et al. (1
989) may be incomplete using the methods disclosed above).

【００１８】 遺伝子は、ランダム変異誘発法を用いて破壊することができる。例えば、ＵＶ
照射または変異誘発化学物質（エチジウムブロミドまたはＮＴＧ）に暴露し、続
いてｌａｔまたは５Ｓクラバム特異性遺伝子において破壊された変異体を選択す
る。別法として、エス・クラブリゲルスのｌａｔおよび５Ｓクラバム特異性遺伝
子のＤＮＡ配列は既知であるので（Tobin, M.B.ら、(1991)前掲;Mosher, RHら(1
999)前掲）、遺伝子または遺伝子の一部は、欠失しているかまたは標準的インビ
トロ変異誘発技術を用いて変異させることができる。したがって、例えばｌａｔ
または５Ｓクラバム特異性遺伝子は、ＰＣＲまたはライブラリースクリーニング
技術によりクローンし、インビトロで変異させ（例えば、単一または複数のヌク
レオチド欠失、置換または挿入による）、その後、存在する野生株遺伝子を置換
することにより親生物中に再導入することができる。遺伝子破壊法が好ましく（
例えば、アプラマイシン耐性遺伝子の挿入による不活化による）（Paradkar and
Jensen (1995) J. Bacteriol. 177 (5) 1307-1314）、遺伝子欠失法が特に好ま
しい。インビボの遺伝子置換は、例えば当該分野において一般的な方法を使用し
た二重交差（double closs-over）事象により促進することができる（例えば、A
idoo, KAら (1994) Gene 147 p41-46照）。ｃｖｍ１遺伝子は、ＷＯ９８／３３
８９６に記載されているように、アプラマイシン耐性遺伝子を使用した挿入不活
化により、あるいはより好ましくは、ｃｖｍ１遺伝子の全体または一部の欠失に
より、破壊することができる。最も好ましくは、ｃｖｍ１遺伝子の２つのＡａｔ
ＩＩ制限部位間の６５４ｂｐ部分を欠失させる。ｌａｔ遺伝子は、ＷＯ９６／４
１８８６に記載されているように挿入変異誘発により破壊することができ、ここ
に、ｌａｔ遺伝子のコーディング領域内にアプラマイシン耐性遺伝子を導入する
ために組み換えＤＮＡ技術を使用した。好ましくは、ｌａｔ遺伝子、またはその
一部が欠失している。本発明の生物は、第一段階においてｌａｔ遺伝子を欠失、
破壊またはそうでなければ不完全にし、続いて第二段階でｃｖｍ１遺伝子を欠失
、破壊またはそうでなければ不完全にすることにより構築することができる。別
法として、ｃｖｍ１遺伝子は、第一段階において欠失または破壊し、続いて第二
段階においてｌａｔ遺伝子を欠失または破壊することができる。好ましくは、ｃ
ｖｍ１遺伝子は第一段階において欠失または破壊される。Genes can be disrupted using random mutagenesis. For example, UV
Exposure to irradiation or mutagenizing chemicals (ethidium bromide or NTG), followed by selection of mutants disrupted in the lat or 5S clavam specific genes. Alternatively, the DNA sequences of the S. clavigers lat and 5S clavam specific genes are known (Tobin, MB et al. (1991) supra; Mosher, RH et al. (1
999) supra), the gene or part of the gene may be deleted or mutated using standard in vitro mutagenesis techniques. So, for example, lat
Alternatively, the 5S clavam specificity gene is cloned by PCR or library screening techniques and mutated in vitro (eg, by single or multiple nucleotide deletions, substitutions or insertions), then replacing the existing wild-type gene. It can then be reintroduced into the parent organism. Gene disruption method is preferred (
For example, due to inactivation by insertion of the apramycin resistance gene) (Paradkar and
Jensen (1995) J. Bacteriol. 177 (5) 1307-1314), the gene deletion method is particularly preferred. In vivo gene replacement can be facilitated by, for example, a double closs-over event using methods common in the art (eg, A
idoo, KA et al. (1994) Gene 147 p41-46). The cvm1 gene is WO98 / 33.
It can be disrupted by insertional inactivation using the apramycin resistance gene, or more preferably by deletion of all or part of the cvm1 gene, as described in 896. Most preferably, the two Aat of the cvm1 gene
The 654 bp portion between the II restriction sites is deleted. The lat gene is WO96 / 4
It can be disrupted by insertional mutagenesis as described in 1886, where recombinant DNA technology was used to introduce the apramycin resistance gene within the coding region of the lat gene. Preferably, the lat gene or a part thereof is deleted. The organism of the present invention has the lat gene deleted in the first step,
It can be constructed by disruption or otherwise incompleteness, followed by deletion, disruption or otherwise incompleteness of the cvm1 gene in the second step. Alternatively, the cvm1 gene can be deleted or disrupted in the first step followed by the lat gene in the second step. Preferably c
The vm1 gene is deleted or destroyed in the first step.

【００１９】 本発明の方法において、本発明の生物は、少量または検出不可能な量の５Ｓク
ラバムとともに５Ｒクラバムを産生するために用いられる。好ましい例において
、５Ｒクラバムはクラブラン酸であり、好ましくは親株と比較してより多量の５
Ｒクラバムが産生される。 本発明の方法は実験室規模でのフラスコ内で、実験工場規模での発酵槽内で、
あるいは製造規模での発酵槽内で行うことができる。In the method of the present invention, the organism of the present invention is used to produce 5R clavam with small or undetectable amounts of 5S clavam. In a preferred example, the 5R clavam is clavulanic acid, preferably a higher amount of 5R compared to the parent strain.
R clavam is produced. The method of the present invention is in a laboratory scale flask, in a laboratory scale fermenter,
Alternatively, it can be performed in a fermenter on a manufacturing scale.

【００２０】 実施例 実施例１ ｌａｔおよびｃｖｍ１遺伝子の遺伝子破壊を含むエス・クラブリゲ
ルス株の構築 ｌａｔおよびｃｖｍ１遺伝子の両方において遺伝子破壊を含むエス・クラブリ
ゲルスの株を産生するために、親エス・クラブリゲルス株をまずｃｖｍ１遺伝子
において破壊し、続いてｌａｔ遺伝子において破壊する逐次法を採用した。これ
らの遺伝子破壊に使用される基本的な方法は、プラスミドｐＣＥ０６１（WO98/3
8896、SmithKline Beecham plcおよびthe Governors of the University of Alb
ertaにおいて記載されているとおり）およびｐ４８６ｌａｔａｐ（WO96/41886、
SmithKline Beecham plcおよびthe Governors of the University of Albertaに
おいて記載されているとおり）を使用し、Paradkar and Jensen (1995)により記
載されているとおりである。Example 1 Construction of an S. crabrigels strain containing a gene disruption of the lat and cvm1 genes To produce a strain of S. crabrigels containing a gene disruption in both the lat and cvm1 genes, the parent A sequential method was employed in which the S. crabrigels strain was first disrupted in the cvm1 gene and subsequently in the lat gene. The basic method used to disrupt these genes is the plasmid pCE061 (WO98 / 3
8896, SmithKline Beecham plc and the Governors of the University of Alb
erta) and p486latap (WO96 / 41886,
SmithKline Beecham plc and the Governors of the University of Alberta), and as described by Paradkar and Jensen (1995).

【００２１】 ｃｖｍ１遺伝子の破壊 エス・クラブリゲルスの野生型株からプラスミドｐＣＥＣ０６１を調製し、Ｗ
Ｏ９４／１８２３６に記載されている方法（ただし、チオストレプトンに加えて
、形質転換体を選択するのに用いられるｏｖｅｒｐｏｕｒはアプラマイシンを含
んでいた（最終濃度２０ｕｇ／ｍｌ）ことを除く）を用いてエス・クラブリゲル
スＳＢ２０３株（エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４株の高力価変異株）
を形質転換するのに使用した。チオストレプトンおよびアプラマイシンの両方に
対して耐性であることが判明している形質転換体を次に、チオストレプトンまた
はアプラマイシンのいずれかを補足していない固体寒天培地上で胞子形成の連続
した２ラウンドをおこなって二次培養した（WO98/33896に記載しているとおり）
。各コロニーを次に抗生物質含有培地上にレプリカプレートして、アプラマイシ
ン耐性およびチオストレプトン感受性形質転換体を同定した。この方法から、８
４の推定形質転換体がさらに分析するために選択された。Disruption of the cvm1 gene Plasmid pCEC061 was prepared from a wild-type strain of S. crabrigels and
O94 / 18236, except that the overpour used to select transformants in addition to thiostrepton contained apramycin (final concentration 20 ug / ml). S.Club Ligers SB203 strain (high titer mutant of S.Clubrigels ATCC27064 strain)
Was used to transform. Transformants known to be resistant to both thiostrepton and apramycin were then transferred to a continuous sporulation on solid agar without supplementation with either thiostrepton or apramycin. 2 rounds were performed and secondary culture was performed (as described in WO98 / 33896).
. Each colony was then replica plated on antibiotic containing medium to identify apramycin resistant and thiostrepton sensitive transformants. From this method, 8
Four putative transformants were selected for further analysis.

【００２２】 これらの分離株はアプラマイシン耐性であり、チオストレプトン感受性である
ので、プラスミドは失われ、ｐＣＥＣ０６１とエス・クラブリゲルス染色体間に
二重交差が起こり、アプラマイシン耐性遺伝子が挿入された染色体においてｃｖ
ｍ１遺伝子のコピーが形成されたと推定される。ｃｖｍ１遺伝子が不活化された
ことを確認するために、該株をまた発酵させ、クラバム−２−カルボキシレート
および２ヒドロキシメチルクラバムの産生に関して分析した。これは、これらの
株を振盪フラスコ発酵において成長させ（WO94/18326に記載されているとおり）
、ＨＰＬＣ分析を使用して（WO8/33896に記載されているとおり）クラバム−２
−カルボキシレートおよび２ヒドロキシメチルクラバムの検出可能なレベルの存
在または不在を確認することにより行った。ＨＰＬＣ分析ではクラバム−２−カ
ルボキシレートまたは２ヒドロキシメチルクラバムのいずれかを検出できなかっ
た。これらの株のうちの１つ、ＧＥＭ１８０１をその後、次の段階：遺伝子破壊
によるＬＡＴ遺伝子の不活化のために選択した。Since these isolates are apramycin resistant and thiostrepton sensitive, the plasmid is lost, a double crossover occurs between pCEC061 and the S. crabrigels chromosome, and the apramycin resistance gene is inserted. In the chromosome
It is presumed that a copy of the m1 gene was formed. To confirm that the cvm1 gene was inactivated, the strain was also fermented and analyzed for production of clavam-2-carboxylate and 2-hydroxymethyl clavam. This allows these strains to grow in shake flask fermentations (as described in WO94 / 18326).
, Clavam-2 using HPLC analysis (as described in WO8 / 33896)
-By confirming the presence or absence of detectable levels of carboxylate and 2-hydroxymethyl clavam. No clavam-2-carboxylate or 2-hydroxymethyl clavam could be detected by HPLC analysis. One of these strains, GEM1801, was then selected for the next step: inactivation of the LAT gene by gene disruption.

【００２３】 ＧＥＭ１８０１におけるｌａｔの破壊 プラスミドｐ４８６ｌａｔａｐを、エス・クラブリゲルスの野生型株から調製
し、ＷＯ９４／１８３２６に記載されているようにしてエス・クラブリゲルスＧ
ＥＭ１８０１株を形質転換するために用いた。ＧＥＭ１８０１はすでにその染色
体中に挿入されたアプラマイシン遺伝子を含んでいたので、形質転換体をチオス
トレプトン耐性のみについて選択した。チオストレプトンに対して耐性であるこ
とが判明した形質転換体を、その後チオストレプトンまたはアプラマイシンのい
ずれかで補足していない固体寒天培地上での胞子形成の連続した４ラウンドによ
り二次培養した（前記実施例において記載したとおり）。各コロニーを次に抗生
物質含有培地にレプリカプレートして、アプラマイシン耐性およびチオストレプ
トン感受性である株を同定した。この方法から、９の推定変異体をさらに分析す
るために選択した。Disruption of lat in GEM1801 Plasmid p486latap was prepared from a wild-type strain of S. clavrigels and S. crab ligels G as described in WO94 / 18326.
It was used to transform EM1801 strain. Transformants were selected for thiostrepton resistance only, as GEM1801 already contained the apramycin gene inserted in its chromosome. Transformants found to be resistant to thiostrepton were then subcultured by four consecutive rounds of sporulation on solid agar without subsequent supplementation with either thiostrepton or apramycin. (As described in the previous example). Each colony was then replica plated in antibiotic containing medium to identify strains that were apramycin resistant and thiostrepton sensitive. From this method, 9 putative variants were selected for further analysis.

【００２４】 これらの分離株はアプラマイシン耐性かつチオストレプトン感受性であったの
で、プラスミドは失われたと推定された。ＧＥＭ１８０１はすでにアプラマイシ
ン耐性であったので、ｐ４８６ｌａｔａｐとエス・クラブリゲルス染色体間に二
重交差事象が起こり、これによりアプラマイシン耐性遺伝子が挿入された染色体
においてｌａｔ遺伝子のコピーが生じている分離株を同定するためには、セファ
マイシンＣ／セファロスポリン生合成経路の生成物の産生についてチオストレプ
トン感受性株を試験する必要があった。これは、分離株を、前記実施例において
記載したように振盪フラスコ発酵において発酵させ、結果として得られたブロス
をＷＯ９４／１８３２６に記載されているようにしてＨＰＬＣにより分析するこ
とにより行った。この分析から、いくつかの株（ＧＥＭ１８９４、１８９５、１
８９６、１８９７、１８９８、１８１００、および１８１０１）をさらに分析す
るために同定し、これらはセファマイシンＣ／セファロスポリン生合成経路の生
成物を産生することができなかった。このことは、ｌａｔ遺伝子が不活化されて
いたことを示す。Since these isolates were apramycin resistant and thiostrepton sensitive, it was assumed that the plasmid was lost. Since GEM1801 was already apramycin resistant, a double crossover event occurred between p486latap and the S. crabrigels chromosome, which resulted in an isolate with a copy of the lat gene in the chromosome into which the apramycin resistance gene was inserted. The thiostrepton sensitive strain had to be tested for the production of products of the cephamycin C / cephalosporin biosynthetic pathway in order to identify This was done by fermenting the isolates in shake flask fermentations as described in the previous examples and analyzing the resulting broth by HPLC as described in WO94 / 18326. From this analysis several strains (GEM 1894, 1895, 1
896, 1897, 1898, 18100, and 18101) were identified for further analysis and they failed to produce products of the cephamycin C / cephalosporin biosynthetic pathway. This indicates that the lat gene was inactivated.

【００２５】 実施例２ ｃｖｍ１／ｌａｔ二重破壊株のクラブラン酸生産性 ｌａｔおよびｃｖｍ１遺伝子の両方において不活化されている実施例１から同
定された７株（ＧＥＭ１８９４、１８９５、１８９６、１８９７、１８９８、１
８１００、および１８１０１株）をクラブラン酸生産性について振盪フラスコ発
酵において分析した。振盪フラスコ発酵およびクラブラン酸性産生に関する分析
は、ＷＯ９４／１８３２６において記載されているとおりに行った。表１に示し
た結果から、これらの変異の両方を含む株は親対照と比べてクラブラン酸生産性
が増大していることは明らかである。改善、は親株の生産性よりも６％から１６
％上回る。Example 2 Clavulanic Acid Productivity of the cvm1 / lat Double Disruption Strain 7 strains identified from Example 1 (GEM1894, 1895, 1896, 1897, 1898) that are inactivated in both the lat and cvm1 genes. 1
Strains 8100, and 18101) were analyzed for clavulanic acid productivity in shake flask fermentations. Shake flask fermentations and analyzes for clavulanic acid production were performed as described in WO94 / 18326. From the results shown in Table 1, it is clear that strains containing both of these mutations have increased clavulanic acid productivity compared to the parental control. Better, 6% to 16% higher than parental productivity
% Over.

【００２６】 表１ 培養基 クラブラン酸生産性（対照−ＳＢ２０３の％） ＧＥＭ１８９４ １０９ ＧＥＭ１８９５ １１１ ＧＥＭ１８９６ １０６ ＧＥＭ１８９７ １１５ ＧＥＭ１８９８ １１１ ＧＥＭ１８１００ １１４ ＧＥＭ１８１０１ １１６[0026] Table 1 Culture medium Clavulanic acid productivity (control-% of SB203) GEM1894 109 GEM1895 111 GEM1896 106 GEM1897 115 GEM1898 111 GEM18100 114 GEM18101 116

【００２７】 実施例３ ｃｖｍ１およびｌａｔ遺伝子の遺伝子欠失を含むエス・クラブリゲ
ルス株の構築 ｌａｔおよびｃｖｍ１遺伝子において遺伝子欠失を含むエス・クラブリゲルス
の株を産生するために、親エス・クラブリゲルス株（ＳＢ２０３）をまずｃｖｍ
１遺伝子において欠失させ、次にｌａｔ遺伝子において欠失させる逐次法を採用
した。Example 3 Construction of an S. clavuligerus Strain Containing a Gene Deletion of the cvm1 and lat Genes To produce a strain of S. crab ligels containing a gene deletion in the lat and cvm1 genes, the parent S. Crab Rigelus strain (SB203) first cvm
A sequential method was employed in which one gene was deleted and then the lat gene was deleted.

【００２８】 ｃｖｍ１遺伝子の欠失 下記のオリゴヌクレオチドプライマーおよびｐＣＥＣ０６１（WO98/33896前掲
において記載されているとおり）を鋳型として用いてエス・クラブリゲルスゲノ
ムＰＣＲ産物を形成した。当初のヌクレオチド配列を変更して、オリゴヌクレオ
チド１中にＰｓｔＩ部位を挿入し、オリゴヌクレオチド４中にＳｐｈＩ部位を挿
入した。 ＰＣＲ産物１を形成するために使用したオリゴヌクレオチド対１： プライマー１ ５’ｄＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣ３
’−配列番号：１ プライマー２ ５’ｄＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＣＧＡＴＣＣ３
’−配列番号：２ ＰＣＲ産物２を形成するために使用したオリゴヌクレオチド対２： プライマー３ ５’ｄＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＧＴＣＧＧＣＧＧＴＧＴＣＣ３
’−配列番号：３ プライマー４ ５’ｄＧＡＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＧ３
’−配列番号：４Deletion of the cvm1 gene The following oligonucleotide primer and pCEC061 (as described in WO98 / 33896, supra) were used as templates to form S. clavigerus genomic PCR products. The original nucleotide sequence was changed to insert a PstI site in oligonucleotide 1 and a SphI site in oligonucleotide 4. Oligonucleotide pair used to form PCR product 1: primer 1 5'dCTGACGCTGCAGGGAGGAAGTCCCGC3
'-SEQ ID NO: 1 primer 2 5'dCGGGGGCGAGGACGCTCGTCCCGATCC3
'-SEQ ID NO: 2 Oligonucleotide pair used to form PCR product 2: Primer 3 5'dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC3
'-SEQ ID NO: 3 primer 45'dGACGGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG3
'-SEQ ID NO: 4

【００２９】 ＧＲＩ（Felsted, Dunmow, Essex, CM63LD）から入手したＰＣＴ−２０００Ｐ
ｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーを用いて標準的ＰＣＲ反応を行った。プライマ
ー１および２を用いてＰＣＲ産物１を産生した。この産物はほぼ１Ｋｂであり、
第二のＡａｔＩＩ部位からのｃｖｍ１の３’領域および下流領域を含む。プライ
マー３および４を用いてＰＣＲ産物２を産生した。この産物はほぼ１．１Ｋｂで
あり、第一のＡａｔＩＩ部位からのｃｖｍ１の５’領域および上流領域を含む。
使用説明書（Strategene Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambrid
ge CB4 4GF）通りにＰＣＲ産物２をＳｒｆＩ消化ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ
ＳＫ（＋）とライゲートした。Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ イー・コリＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎスーパーコンピテント細胞（Strategeneから入手可能）を
アンピシリン耐性に形質転換するためにライゲート混合物を用いた（製造業者の
指示通りに）。プラスミドＤＮＡを結果として得られる形質転換体から単離し、
ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩを用いたＤＮＡ制限分析
により、７つのクローンが、ＰＣＲ産物２がライゲートされたプラスミドを含ん
でいることが明らかになった。分離株８は順方向に挿入物を含み、ｐＳＢ１と称
する。PCT-2000P obtained from GRI (Felsted, Dunmow, Essex, CM63LD)
Standard PCR reactions were performed using an eltier thermal cycler. PCR product 1 was produced using primers 1 and 2. This product is almost 1 Kb,
It contains the 3'region and the downstream region of cvm1 from the second AatII site. PCR product 2 was produced using primers 3 and 4. This product is approximately 1.1 Kb and contains the 5'region of cvm1 from the first AatII site and the upstream region.
Instructions for use (Strategene Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambrid
ge CB4 4GF) and PCR product 2 was SrfI digested pCR-Script Amp.
Ligated with SK (+). Epicurian E. coli XL1-Bl
The ligation mixture was used to transform ue MRF'Kan supercompetent cells (available from Strategene) to ampicillin resistance (as per manufacturer's instructions). Plasmid DNA was isolated from the resulting transformants,
DNA restriction analysis with SalI / HindIII and BamHI / NotI revealed that 7 clones contained the plasmid in which PCR product 2 was ligated. Isolate 8 contains the insert in the forward direction and is designated pSB1.

【００３０】 ＰＣＲ産物１をＰｓｔＩおよびＡａｔＩＩで消化し、結果として得られるＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動により分画した。１Ｋｂフラグメントを切除し、Ｓ
ｅｐｈａｇｌａｓ ｂａｎｄ ｐｒｅｐキット（Pharmacia, St. Albans, Herts
, ALI3AW）を用いてゲルから溶出させた。単離されたフラグメントをその後Ａａ
ｔＩＩおよびＰｓｔＩ消化ｐＳＢ１とライゲートした。プラスミドＤＮＡを得ら
れた形質転換体から単離し、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ、ＳｒｆＩ、ＰｓｔＩおよび
ＳａｌＩを用いた制限分析により１クローンが、ＰＣＲ産物１がライゲートされ
たプラスミドを含むことが明らかになった。ｃｖｍ１遺伝子のクローンされたコ
ピーと６５４のヌクレオチド欠失を含むこのプラスミドをｐＳＢと称する。PCR product 1 was digested with PstI and AatII and the resulting DN
A was fractionated by agarose gel electrophoresis. The 1 Kb fragment was excised and S
ephaglas band prep kit (Pharmacia, St. Albans, Herts
, ALI3AW) was used to elute from the gel. The isolated fragment is then labeled with Aa
Ligated with tII and PstI digested pSB1. Plasmid DNA was isolated from the resulting transformants and restriction analysis with NotI / EcoRI, SrfI, PstI and SalI revealed that one clone contained the plasmid ligated with PCR product 1. This plasmid, which contains a cloned copy of the cvm1 gene and a 654 nucleotide deletion, is called pSB.

【００３１】 ｐＳＢ２をエス・クラブリゲルス中に導入するために、プラスミドをさらにス
トレプトミセスにおいて機能できる複製の起源を含むように修飾した。これを行
うために、ｐＳＢ２のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、チオストレプトン耐性遺伝子（６．２Ｋｂ：Ward ら、(1986) Mol. Gen.
Genet. 203:468-478）をコードするストレプトミセスベクターｐＩＪ４８６中に
ライゲートし、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでも消化した。ライゲート混合
物を用いて、イー・コリ（ＪＭ１０９）コンピテント細胞（Strategene Ltd）を
アンピシリン耐性に形質転換した。プラスミドＤＮＡを得られた形質転換体から
単離し、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩを用いた制限分析により、６ク
ローンがｐＩＪ４８６を含有するｐｓＢ２を有することが判明した。これらのプ
ラスミドの一つをｐＳＢ３と称する。In order to introduce pSB2 into S. clavuligerus, the plasmid was further modified to contain an origin of replication capable of functioning in Streptomyces. To do this, the plasmid DNA of pSB2 was digested with EcoRI and HindIII and the thiostrepton resistance gene (6.2 Kb: Ward et al., (1986) Mol. Gen.
Genet. 203: 468-478) was ligated into the Streptomyces vector pIJ486 and also digested with EcoRI and HindIII. The ligation mixture was used to transform E. coli (JM109) competent cells (Strategene Ltd) to ampicillin resistance. Plasmid DNA was isolated from the resulting transformants and restriction analysis with EcoRI, SalI and BglII revealed that 6 clones had pIJ486 containing psB2. One of these plasmids is called pSB3.

【００３２】 アプラマイシン耐性遺伝子の挿入によりｃｖｍ１遺伝子がすでに破壊されてい
るエス・クラブリゲルスＳＢ２０３株の誘導体を形質転換するために、プラスミ
ドｐＳＢ３を用いた（WO98/33896前掲において記載されているとおり）。チオス
トレプトン耐性形質転換体を選択し、これらの形質転換体を次に非選択的培地上
での胞子形成を３ラウンド行い、アプラマイシンおよびチオストレプトン耐性の
喪失についてスクリーンした。ホモローガスな組み換えが起こり、プラスミド上
のｃｖｍ１のアプラマイシン破壊染色体コピーとｃｖｍ１の欠失コピー間に「交
換」が起こっているこれらの形質転換体を同定するためにこれを行った。これら
の分離株を次に、アプラマイシン破壊ｃｖｍ１遺伝子が予想通り欠失しているこ
とを確認するためにさらなる生化学および遺伝子試験に付した。この分析から、
クラバム遺伝子ｃｖｍ１において単純な欠失を含む数株が同定され、これらの株
のうちの１つ、ＳＢ８２を、ｌａｔ遺伝子を欠失させるための親株として選択し
た。Plasmid pSB3 was used to transform a derivative of the S. crabrigels SB203 strain in which the cvm1 gene was already disrupted by insertion of the apramycin resistance gene (as described in WO98 / 33896 supra). ). Thiostrepton resistant transformants were selected and these transformants were then subjected to three rounds of sporulation on non-selective medium and screened for loss of apramycin and thiostrepton resistance. This was done to identify those transformants in which homologous recombination had occurred, resulting in an "exchange" between the apramycin disrupted chromosomal copy of cvm1 and the deleted copy of cvm1 on the plasmid. These isolates were then subjected to further biochemical and genetic testing to confirm the expected deletion of the apramycin disrupting cvm1 gene. From this analysis
Several strains were identified that contained a simple deletion in the clavam gene cvm1 and one of these strains, SB82, was selected as the parent strain for deleting the lat gene.

【００３３】 ＳＢ８２におけるｌａｔ遺伝子の欠失 ｌａｔ遺伝子のＤＮＡ配列およびその周りのＤＮＡは公知である（Tobinら J.
Bact 173,6223-9(1991) and Perez-llarena ら J. Bact 2053-9 1997）。以下に
記載するようにｌａｔ遺伝子のほぼ１ｋｂの欠失を生じるためにＰＣＲ法を用い
た。 プライマー： ＦＺ１［５’−ｄＧＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＴ
ＴＣＣＴＴＣＡＣ−３’］−配列番号：５ および ＲＺ１［５’−ｄＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴ
ＣＧＴＧＴＴＣＡ−３’］−配列番号：６ を用いてｌａｔ遺伝子に隣接するオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ１２）
の３’領域を増幅するためにＰＣＲを用いた。Deletion of the lat gene in SB82 The DNA sequence of the lat gene and the DNA around it are known (Tobin et al. J.
Bact 173, 6223-9 (1991) and Perez-llarena et al. J. Bact 2053-9 1997). The PCR method was used to generate an approximately 1 kb deletion of the lat gene as described below. Primer: FZ1 [5'-dGTTAAAGCTTCCCGATACAGACAAGGGGT
TCCTTCAC-3 ′]-SEQ ID NO: 5 and RZ1 [5′-dATTAGGATCCCCGAGCTGTTGCTCAGCTT
CGTGTTCA-3 ′] — Open reading frame (orf12) flanking the lat gene using SEQ ID NO: 6
PCR was used to amplify the 3'region of.

【００３４】 ＰＣＲをさらに用いて以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてエス・ク
ラブリゲルス染色体ＤＮＡからｌａｔ遺伝子の３’領域を増幅した。 ＦＬ１［５’−ｄＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＧ
ＡＧＡＡＣＧ−３’］−配列番号：７ および； ＲＬ１［５’−ｄＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣＡＣＴ
ＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧ−３’］−配列番号：８PCR was further used to amplify the 3 ′ region of the lat gene from S. clavigerus chromosomal DNA using the following oligonucleotide primers: FL1 [5'-dATATGAATTCTGCAGCGCGCTCTGCCACG
AGAACG-3 ′]-SEQ ID NO: 7 and; RL1 [5′-dATATGGATCCCATCGCAACGCTCCGACACT
CCTTGGAATG-3 ']-SEQ ID NO: 8

【００３５】 ｏｒｆ１２およびｌａｔ遺伝子フラグメントの精製されたＰＣＲ産物を次に、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルを用いて、コンピテントＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ
細胞中に形質転換する前に、それぞれｐＣＲｓｃｒｉｐｔ中にクローンした。形
質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ ＩＴＰＧおよび４０
ｕｇ／ｍｌＸｇａｌを含むＬｕｒｉａ寒天を含むプレート上でスクリーンした。 プラスミドを各形質転換から調製し、ｌａｔフラグメントについてはｐＣＲ−
ｌａｔ、ｏｒｆ１２フラグメントについてはｐＣＲ−ＺをＥｃｏＲＩで消化した
。これによりプラスミドｐＣＲ−Ｚが直線化されるが、ｐＣＲ−ｌａｔの場合に
は２つのＤＮＡフラグメントが生じ、このうちの１つはｌａｔ遺伝子の３’部分
を含んでいた。Sambrook ら(1989)前掲のとおりに、消化物を低融点アガロース
中で電気泳動させ、ＤＮＡフラグメントを回収した。The purified PCR products of the orf12 and lat gene fragments were then
Competent XL1 Blue MRF using Stratagene protocol
Each was cloned into pCRscript before transformation into cells. Transformants were treated with 100 ug / ml ampicillin, 0.5 mM ITPG and 40.
Screened on plates containing Luria agar with ug / ml Xgal. Plasmids were prepared from each transformation and pCR-for the lat fragment.
For the lat, orf12 fragment, pCR-Z was digested with EcoRI. This linearizes the plasmid pCR-Z, but in the case of pCR-lat produced two DNA fragments, one of which contained the 3'portion of the lat gene. The digest was electrophoresed in low melting agarose and the DNA fragments recovered as described by Sambrook et al. (1989) supra.

【００３６】 ゲル精製ｐＣＲ−Ｚ ＥｃｏＲＩ切断ベクターを、ｌａｔ遺伝子の３’部分を
含むｐＣＲ−ｌａｔからのゲル精製ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとライゲー
トした。ライゲート混合物をその後、Sambrook ら(1989)のようにＣａＣｌ_２法
を用いてコンピテントＪＭ１０９細胞を形質転換するために使用した。形質転換
体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｕｒｉａ寒天上で選択した。結果
として得られたプラスミドｐＳＢ１３を次に、ｌａｔ遺伝子の欠失したコピーの
上流の少量の配列（１１１ヌクレオチド）を除去するためにさらに修飾した。こ
れは、ｐＳＢ１３をＤＮＡ制限酵素ＮｏｔＩで消化し、プラスミドを再ライゲー
トすることにより行った。Sambrook ら(1989)前掲のようなＣａＣｌ_２法を用い
てコンピテントＪＭ１０９細胞を形質転換するためにライゲート混合物を使用し
た。形質転換体をＬｕｒｉａ寒天＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン上で選択した
。The gel-purified pCR-Z EcoRI cut vector was ligated with the gel-purified EcoRI DNA fragment from pCR-lat containing the 3'portion of the lat gene. The ligation mixture was then used to transform competent JM109 cells using the CaCl ₂ method as in Sambrook et al. (1989). Transformants were selected on Luria agar containing 100 ug / ml ampicillin. The resulting plasmid pSB13 was then further modified to remove a small amount of sequence (111 nucleotides) upstream of the deleted copy of the lat gene. This was done by digesting pSB13 with the DNA restriction enzyme NotI and religating the plasmid. The ligation mixture was used to transform competent JM109 cells using the CaCl ₂ method as Sambrook et al. (1989) supra. Transformants were selected on Luria agar + 100 ug / ml ampicillin.

【００３７】 ストレプトミセスレプリコンおよび選択マーカーを次にベクター中に導入した
。このプラスミドをｐＳＢ４８６と称する。このプラスミドｐＳＢ４８６を次に
形質転換によりＳＢ８２中に導入した。形質転換から、８８のチオストレプトン
耐性形質転換体を選択し、セファロスポレート産生について試験した。これらの
一次形質転換体のいくつかはＳＢ８２と比べてセファロスポレート生産性が減少
していることが判明した。これらの一次形質転換体を非選択性培地上でさらに１
ラウンド胞子形成に付し、チオストレプトン耐性の喪失についてスクリーンした
。これは、プラスミドが失われている形質転換体を同定するために行われた。場
合によっては、ホモローガスな組み換えが起こり、プラスミド上のｌａｔ遺伝子
の染色体コピーとｌａｔ遺伝子の欠失コピー間で「交換」が起こった。これらの
チオストレプトン感受性株を次にセファロスポレート生産性について試験して、
「交換」が起こっているものを同定した。この方法から、一次形質転換体は９０
のチオストレプトン感受性分離株を産生し、これらはさらに試験するとセファロ
スポレートを産生できないことが判明した。これらの分離株を次にさらなる生合
成および遺伝子試験に付して、ｌａｔ遺伝子が予想通り欠失していることを確認
した。 これらの分離株はその後ｃｖｍ１およびｌａｔ遺伝子の両方が欠失しているこ
とが確認された。The Streptomyces replicon and selectable marker were then introduced into the vector. This plasmid is called pSB486. This plasmid pSB486 was then introduced into SB82 by transformation. From the transformation, 88 thiostrepton resistant transformants were selected and tested for cephalosporate production. It was found that some of these primary transformants had reduced cephalosporate productivity compared to SB82. Add these primary transformants to 1
It was subjected to round sporulation and screened for loss of thiostrepton resistance. This was done to identify transformants that have lost the plasmid. In some cases, homologous recombination occurred, resulting in an "exchange" between the chromosomal copy of the lat gene on the plasmid and the deleted copy of the lat gene. These thiostrepton sensitive strains were then tested for cephalosporate productivity,
We have identified what is happening to "exchange". From this method, 90 primary transformants were obtained.
Of thiostrepton sensitive isolates, which were found to be unable to produce cephalosporate upon further testing. These isolates were then subjected to further biosynthesis and genetic testing to confirm the expected deletion of the lat gene. These isolates were subsequently confirmed to have both the cvm1 and lat genes deleted.

【００３８】 実施例４ ｃｖｍ１／ＬＡＴ二重欠失株のクラブラン酸生産性 前記のようにｌａｔおよびｃｖｍ１遺伝子の両方において不活化されている実
施例３から同定された５株（ＧＥＭ１８５０、１８５１、１８５５、１８５６、
および１８６０）をクラブラン酸生産性について振盪フラスコ発酵において分析
した。振盪フラスコ発酵およびクラブラン酸生産性についての分析は、ＷＯ９４
／１８３２６においてと同様に行った。表１において示す結果から、これらの変
異の両方を含む株は親対照と比べてクラブラン酸生産性が増大していることは明
らかである。改善は、親株の生産性を９％から１９％上回っている。Example 4 Clavulanic Acid Productivity of the cvm1 / LAT Double Deletion Strain 5 strains identified from Example 3 (GEM 1850, 1851, which are inactivated in both the lat and cvm1 genes as described above). 1855, 1856,
And 1860) were analyzed for clavulanic acid productivity in shake flask fermentations. Shake flask fermentation and analysis for clavulanic acid productivity are described in WO94
/ 18326. From the results shown in Table 1, it is clear that strains containing both of these mutations have increased clavulanic acid productivity compared to the parental control. The improvement exceeds parent productivity by 9% to 19%.

【００３９】 表２ 培養基 クラブラン酸生産性（対照−ＳＢ２０３の％） ＧＥＭ１８５０ １１０ ＧＥＭ１８５１ １０９ ＧＥＭ１８５５ １１７ ＧＥＭ１８５６ １１９ ＧＥＭ１８６０ １０９[0039] Table 2 Culture medium Clavulanic acid productivity (control-% of SB203) GEM1850 110 GEM1851 109 GEM1855 117 GEM1856 119 GEM1860 109

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 37/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フィリップ・アンドリュー・グリーブズ イギリス、ビーエヌ14・８キューエイチ、 ウエスト・サセックス、ワーシング、クラ レンドン・ロード、グラクソスミスクライ ン (72)発明者 アリソン・ミシェル・グリフィン イギリス、ビーエヌ14・８キューエイチ、 ウエスト・サセックス、ワーシング、クラ レンドン・ロード、グラクソスミスクライ ン Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA67 CA04 DA08 EA04 GA11 4B064 AH16 CA04 CA19 CC24 DA02 4B065 AA50X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA18 CA34 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) (C12P 37/00 C12R 1: 465) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU. CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ , LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Philip Andrew Greaves England, BN 14/8 QH, West Sussex, Worthing, Clarendon Road, GlaxoSmithCline (72) Inventor Alison Michel Griffin England, 8-14 QH England, West Sussex, Worthine , Class Rendon Road, Glaxo Smith Cry emissions F-term (reference) 4B024 AA01 BA67 CA04 DA08 EA04 GA11 4B064 AH16 CA04 CA19 CC24 DA02 4B065 AA50X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA18 CA34

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ａ）ｌａｔ遺伝子が欠失しているか、破壊されているかまた
はそうでなければ不完全になっているセファロスポリン生合成経路、またはその
一部； ｂ）５Ｓクラバムの生合成について特異的な１またはそれ以上の遺伝子が欠失し
ているか、破壊されているかまたはそうでなければ不完全になっているクラバム
生合成経路を含む、５Ｒクラバムを産生する生物。1. A cephalosporin biosynthetic pathway, in which a) the lat gene is deleted, disrupted or otherwise incomplete, or part thereof; b) 5S clavam biosynthesis. An organism that produces a 5R clavam comprising a clavam biosynthetic pathway in which one or more genes specific for is deleted, disrupted or otherwise incomplete. 【請求項２】 ５Ｒクラバムがクラブラン酸である請求項１記載の生物。2. The organism according to claim 1, wherein the 5R clavam is clavulanic acid. 【請求項３】 ストレプトミセス科放線菌である請求項１または２記載の生
物。3. The organism according to claim 1, which is a Streptomyces family actinomycete. 【請求項４】 エス・クラブリゲルスである請求項３記載の生物。4. The organism according to claim 3, which is S. clavigers. 【請求項５】 ５Ｓクラバム生合成について特異的な欠失または破壊された
遺伝子が、 ａ）ｃｖｍ１； ｂ）ｃｖｍ２； ｃ）ｃｖｍ３； ｄ）ｃｖｍ４： ｅ）ｃｖｍ５；および ｆ）ｃｖｍ６からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である請求項
１ないし４のいずれか１つに記載の生物。5. The deleted or disrupted gene specific for 5S clavam biosynthesis is from the group consisting of a) cvm1; b) cvm2; c) cvm3; d) cvm4: e) cvm5; and f) cvm6. The organism according to any one of claims 1 to 4, which is one or more genes selected. 【請求項６】 ５Ｓクラバム生合成について特異的な欠失または破壊された
遺伝子がｃｖｍ１である請求項６記載の生物。6. The organism according to claim 6, wherein the deleted or disrupted gene specific for 5S clavam biosynthesis is cvm1. 【請求項７】 ５Ｒクラバムの生合成を促進する発酵条件下で、請求項１な
いし６のいずれか１つに記載の生物を成長させることを含む５Ｒクラバムの産生
方法。7. A method for producing a 5R clavum, which comprises growing the organism according to any one of claims 1 to 6 under fermentation conditions that promote the biosynthesis of the 5R clavum. 【請求項８】 ５Ｒクラバムがクラブラン酸である請求項７記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the 5R clavam is clavulanic acid. 【請求項９】 請求項７または８記載の方法を使用して産生される５Ｒクラ
バム。9. A 5R clavam produced using the method of claim 7 or 8. 【請求項１０】 クラブラン酸である請求項９記載の５Ｒクラバム。10. The 5R clavam according to claim 9, which is clavulanic acid.