JP2003512016A - コリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コリン・オキシダーゼ活性を有する単離ポリペプチド及び上記ポリペプチドをコードする単離核酸配列に関する。本発明は、上記核酸配列を含む核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに上記ポリペプチドの製造方法及び使用方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明の背景 本発明の分野 本発明は、コリン・オキシダーゼ活性を有する単離ポリペプチド及び当該ポリ
ペプチドをコードする単離核酸配列に関する。本発明は、上記核酸配列を含む、
核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに上記ポリペプチドの製造及び使用
方法にも関する。

【０００２】 関連分野の説明 コリン・オキシダーゼ（Ｃｈｏｌｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＥＣ １．１．３
．１７））は、ベタイン・アルデヒド（ｂｅｔａｉｎｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ）を
介するコリンからグリシン・ベタインの生合成を触媒することができる２官能価
酵素である。この酵素は、共有結合したＦＡＤを含む可溶性酵素である。コリン
は、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）の天然の加水分解産物である。グリシン・ベ
タインは、多数の微生物及び植物内で浸透圧保護の役割を演じていると提案され
ている。浸透圧保護剤としての生理学的役割に加えて、グリシン・ベタインは、
それから誘導されるメチル基が、植物におけるアルカロイド中に、哺乳動物及び
微生物におけるメチオニン中に、そして微生物におけるコバラミン（ビタミンＢ ₁₂ ）中に取り込まれるところの一般代謝において作用する。さらに、ベタインは
、いくつかの微生物により、炭素及び窒素源として使用されることができる。

【０００３】 コリン・オキシダーゼは、臨床生化学における用途をもち、ここでは、コリン
・オキシダーゼは、血清及び羊水中のコリン含有リン脂質の推定のために使用さ
れる。さらに、コリン・オキシダーゼをコードする遺伝子は、着目の生体系、例
えば植物内での浸透圧耐性を強化するために好適なものであることができる。 ＪＰ ５４０３５２８４は、シリンドロカーポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐ
ｏｎ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、又はジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌ
ａ）属に属する微生物からのコリン・オキシダーゼの製造について開示している
。

【０００４】 Deschnium et al. (1995, Plant Molecular Biology 29: 897-907 ）は、アル
スロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏ
ｒｍｉｓ）からのコリン・オキシダーゼ遺伝子のクローニングについて開示して
いる。Rozwadowski et al. (1991, Journal of Bacteriology 173: 472-478）は
、アルスロベクター・パセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｃｅｎｓ）
からのコリン・オキシダーゼのクローニングについて開示している。ＪＰ ５３
１７０５６は、サーモアクチノマイセス・モノスポラス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ ｍｏｎｏｓｐｏｒｕｓ）からのコリン・オキシダーゼのクロー
ニングについて開示している。

【０００５】 本発明の目的は、コリン・オキシダーゼ活性を有する改良されたポリペプチド
及び当該ポリペプチドをコードする核酸を提供することである。 本発明の要約 本発明は、以下の： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも６５％の同一性を有する
アミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｂ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１の
ヌクレオチド４９〜１６７７を含むゲノムＤＮＡ、（iii ）少なくとも１００ヌ
クレオチドから成る（ｉ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、
又は（iii ）の相補鎖、と、低ストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズする
核酸配列によりコードされるポリペプチド； （ｃ）１以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号２の
アミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体； （ｄ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び （ｅ）コリン・オキシダーゼ活性を有する、（ａ），（ｂ）、又は（ｄ）の断
片、 から成る群から選ばれる、コリン・オキシダーゼ活性を有する単離ポリペプチド
に関する。

【０００６】 本発明は、上記ポリペプチドをコードする単離核酸配列、及び当該核酸配列を
含む、核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに上記ポリペプチドの製造及
び使用方法にも関する。 本発明の詳細な説明 コリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチド 本明細書中、用語“コリン・オキシダーゼ活性”は、酸素の存在下、コリンの
酸化を触媒してグリシン・ベタイン・アルデヒドと過酸化水素を生成する、コリ
ン：酸素１−酸化還元酵素として定義される。本発明の目的のためには、コリン
・オキシダーゼ活性は、Ikuta et al., 1977, J.Biochem. 82: 157-163により記
載された手順に従って測定される。ここでは、コリンの酸化からの過酸化水素の
生成が計測される。コリン・オキシダーゼ活性の１単位は、標準条件下１分間当
りに生成する１．０μモルの過酸化水素として定義される。

【０００７】 第１の態様においては、本発明は、少なくとも約６５％の、好ましくは、少な
くとも約７０％の、より好ましくは少なくとも約８０％の、さらにより好ましく
は少なくとも約９０％の、最も好ましくは少なくとも約９５％の、そしてさらに
最も好ましくは少なくとも約９７％の、配列番号２のアミノ酸１〜５４３に対す
る同一性度を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、コリン・
オキシダーゼ活性を有するもの（以下、“相同ポリペプチド”という。）に関す
る。好ましい態様においては、上記相同ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸
１〜５４３から、５アミノ酸、好ましくは４アミノ酸、より好ましくは３アミノ
酸、さらにより好ましくは２アミノ酸、そして最も好ましくは１アミノ酸、相違
するアミノ酸配列を有する。本発明の目的のためには、２つのアミノ酸配列の間
の同一性度は、同一性表及び以下の多数アラインメント・パラメーター：１０の
ギャップ・ペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティー、を用いて、ＬＡＳ
ＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェア（DNASTAR, Inc.,
Madison, WI）を用いてＣｌｕｓｔａｌ法（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153
）により測定される。対毎のアラインメント・パラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝
１、ギャップ・ペナルティー＝３、ウインドウズ＝５、及び正方行列（ｄｉａｇ
ｏｎａｌｓ）＝５であった。

【０００８】 好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５４３又は
その対立遺伝子変異体；あるいはコリン・オキシダーゼ活性を有するその断片を
含む。より好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２のア
ミノ酸１〜５４３を含む。他の好ましい態様においては、本発明のポリペプチド
は配列番号２のアミノ酸１〜５４３又はその対立遺伝子変異体；あるいはコリン
・オキシダーゼ活性を有するその断片から成る。他の好ましい態様においては、
本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５４３から成る。

【０００９】 配列番号２の断片は、上記アミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル
末端から１以上のアミノ酸が欠失されているポリペプチドである。好ましくは、
断片は、少なくとも４５３のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも４８３の
アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも５１３のアミノ酸残基を含む。 対立遺伝子変異体は、同一染色体遺伝子座をコピーする遺伝子の２以上の代替
形態の中のいずれかを意味する。対立遺伝子変異体は、突然変異を通じて天然に
生じ、そして集団内の多型をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレン
ト（コードされたポリペプチドにおける変化がない）であることができ、又は変
更されたアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。ポリペプ
チドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされたポリ
ペプチドである。

【００１０】 第２の態様においては、本発明は、同一条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレオ
チド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含むゲ
ノムＤＮＡ配列、（iii ）（ｉ）又は（ii）のサブ配列、あるいは（ｉ），（ii
）、又は（iii ）の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブと、極低ストリン
ジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中スト
リンジェンシー条件、より好ましくは中〜高ストリンジェンシー条件、さらによ
り好ましくは高ストリンジェンシー条件、そして最も好ましくは極高ストリンジ
ェンシー条件下、ハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、コリン・オ
キシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する（J.Sambrook, E.F.Fritsch,
and T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d editio
n, Cold Spring Harbor, New York ）。配列番号１のサブ配列は、少なくとも１
００ヌクレオチド又は好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドであることがで
きる。その上、上記サブ配列は、コリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチ
ド断片をコードすることができる。上記ポリペプチドは、コリン・オキシダーゼ
活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体又は断片であることもできる。

【００１１】 配列番号１の核酸配列又はそのサブ配列、並びに配列番号２のアミノ酸配列又
はその断片を、本分野において周知の方法に従って異なる属又は種の株からのコ
リン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、か
つ、クローニングするための核酸プローブをデザインするために使用することが
できる。特に、このようなプローブは、その中の対応の遺伝子を同定及び単離す
るために、標準的なサザン・ブロッティング手順に従って、着目の属又は種のゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用されることが
できる。このようなプローブは、全体配列よりもかなり短いものであることがで
きるが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、そしてより好ましくは少
なくとも３５ヌクレオチド長でなければならない。より長いプローブを使用する
こともできる。ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブの両者を使用することができる
。上記プローブは典型的には、（例えば、³²Ｐ， ³Ｈ，³⁵Ｓ、ビオチン、又はア
ビジンを用いて）対応の遺伝子を検出するために標識される。このようなプロー
ブは本発明により包含される。

【００１２】 従って、上記の他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリ
ーは、上記プローブとハイブリダイズし、かつ、コリン・オキシダーゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされることができ
る。上記の他の生物からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動又は他の分離技術により分離されることができる
。上記ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又
は他の好適な担体材料上に移され、そして固定される。配列番号１又はそのサブ
配列に相同であるクローン又はＤＮＡを同定するために、上記担体材料がサザン
・ブロットにおいて使用される。本発明の目的のために、ハイブリダイゼーショ
ンは、上記核酸配列が、極低〜極高ストリンジェンシー条件下、配列番号１に示
す核酸配列、その相補鎖、又はそのサブ配列に対応する標識された核酸プローブ
にハイブリダイズするということを示す。上記条件下でそれに上記核酸プローブ
がハイブリダイズするところの分子はＸ線フィルムを用いて検出される。

【００１３】 好ましい態様においては、上記核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドを
コードする核酸配列又はそのサブ配列である。他の好ましい態様においては、上
記核酸プローブは配列番号１である。他の好ましい態様においては、上記核酸プ
ローブは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３００６６内に
含まれるプラスミドｐＦＤ０８０８内に含まれる核酸配列であり、ここで、この
核酸配列はコリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。他の
好ましい態様においては、上記核酸プローブは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３００６６内に含まれるプラスミドｐＦＤ０８０８内に含
まれる配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列（すなわち、配列番号１
のヌクレオチド４９〜１６７７）である。

【００１４】 長さ少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブのためには、極低〜極高ス
トリンジェンシー条件は、標準的なサザン・ブロッティング手順の後、５×ＳＳ
ＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００μｇ／ml剪断及び変性サケ***ＤＮＡ、及び極
低及び低ストリンジェンシーについて２５％ホルムアミド、中及び中〜高ストリ
ンジェンシーについて３５％ホルムアミド、又は高及び極高ストリンジェンシー
について５０％ホルムアミド中、４２℃におけるプレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーションとして定義される。

【００１５】 長さ少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブのためには、上記担体材料
は、好ましくは少なくとも４５℃（極低ストリンジェンシー）、より好ましくは
少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃
（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリン
ジェンシー）、さらにより好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、そして
最も好ましくは少なくとも７０℃（極高ストリンジェンシー）において、２×Ｓ
ＳＣ、０．２％ ＳＤＳを用いて各々１５分間３回、最終的に洗浄される。

【００１６】 長さ約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブのためには
、ストリンジェンシー条件は、標準的なサザン・ブロッティング手順の後、１ml
当り、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH7.6、6mM ＥＤ
ＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１mMピロリン酸
ナトリウム、１mMリン酸２塩基性ナトリウム、０．１mM ＡＴＰ、及び０．２mg
酵母ＲＮＡ中、Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Aca
demy of Sciences USA 48: 1390 ）に従う計算を用いて、計算されたＴｍから約
５℃〜約１０℃下廻る温度における、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダ
イゼーション、及びハイブリダイゼーション後洗浄として定義される。

【００１７】 長さ約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブのためには
、上記担体材料を、１５分間６×ＳＣＣプラス０．１％ ＳＤＳ中１回、そして
計算されたＴｍから５℃〜１０℃下廻る温度において６×ＳＳＣを用いて各１５
分間２回洗浄する。 第３の態様においては、本発明は、１以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又
は挿入を含む配列番号２のアミノ酸配列をもつポリペプチドの変異体に関する。

【００１８】 上記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸残基の挿入又は
欠失により、そして／又は異なるアミノ酸残基による１以上のアミノ酸残基の置
換により、配列番号２又はその成熟ポリペプチドのアミノ酸配列と相違する。好
ましくは、アミノ酸の変更は、僅かなものであり、すなわち、上記タンパク質の
折り畳み及び／又は活性に実質的に影響しない保存的アミノ酸置換である；典型
的には１〜約３０アミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末
端の伸長、例えば、アミノ−末端メチオニン残基；約２０〜２５残基までの小さ
なリンカー・ペプチド；又は正味電荷又は他の機能を変えることにより精製を容
易にする小さな伸長、例えば、ポリ−ヒスチジン域、抗原性エピトープ又は結合
性ドメイン。

【００１９】 保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）
、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミ
ン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン
）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、並
びに小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、及びメチオニ
ン）の群内にある。一般に比活性を変えないアミノ酸置換は、本分野において知
られており、そして例えば、H.Neurath and R.L.Hill, 1979, In, The Proteins
Academic Press, New York により記載されている。最も普通に生じる交換は、
Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／
Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，
Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／
Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌ
ｙ、並びにその逆の交換である。

【００２０】 第４の態様においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をもつポリペプ
チド又はその成熟ポリペプチドとの免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同
一性をもつ単離ポリペプチドに関する。この免疫化学的特性は、周知のオクテル
ロニー２重拡散手順により免疫学的交差反応同一性テストにより測定される。特
に、配列番号２のアミノ酸配列をもつポリペプチド又はその成熟ポリペプチドの
エピトープと免疫学的に反応性であり、又はそれに結合するポリクローナル抗体
を含む抗血清が、Harboe and Ingild, In N.H.Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks,
editors, A Manual of Quantitative Immunoele Ctrophoresis, Blackwell Sci
entific Publications, 1973, Chapter 23、又はJohnstone and Thorpe, Immuno
chemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982（より特に
２７〜３１頁）により記載された手順に従って、ウサギ（又は他のゲッ歯類）を
免疫感作させることにより調製される。免疫化学的同一性を有するポリペプチド
は、特定の免疫化学的技術を用いた、沈降物の全融合、同一沈降形態、及び／又
は同一電気泳動易動性の如き同一のやり方で上記抗血清と反応するポリペプチド
である。免疫化学的同一性のさらなる説明は、Axelsen, Bock, and Kroll, In N
.H.Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immu
noelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 10に
より記載されている。部分的免疫化学的同一性をもつポリペプチドは、特定の免
疫化学的技術を用いた沈降物の部分的融合、部分的に同一な沈降形態、及び／又
は部分的な同一な電気泳動易動性の如き部分的に同一のやり方で上記抗血清と反
応するポリペプチドである。部分的免疫化学的同一性のさらなる説明は、Bock a
nd Axelsen, In N.H.Axelsen, J.Kroll, and B.Weeks, editors, A Manual of Q
uantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 19
73, Chapter 11により記載されている。

【００２１】 上記抗体は、モノクローナル抗体であることもできる。モノクローナル抗体は
、例えば、E.Harlow and D.Lane, editors, 1988, Antibodies, A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York の方法に従
って、調製され、そして使用されることができる。 本発明のポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドのコリン・オキシダ
ーゼ活性の、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは
少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好まし
くは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％をもつ。

【００２２】 本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られうる。本発明の目
的のためには、本明細書中に使用するとき用語“から得られる”とは、所定の源
に関して、上記核酸配列によりコードされたポリペプチドが、その源により又は
その源からの核酸配列がその中に挿入されているところの細胞により、作られる
ことを意味するであろう。好ましい態様においては、上記ポリペプチドは細胞外
に分泌される。

【００２３】 本発明のポリペプチドはバクテリアのポリペプチドであることができる。例え
ば、上記ポリペプチドは、グラム陽性バクテリアのポリペプチド、例えば、バチ
ルスのポリペプチド、例えば、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）
、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチル
ス・チーリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のポ
リペプチド；又はストレプトミセスのポリペプチド、例えば、ストレプトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプト
ミセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）のポリペプチ
ド；又はグラム陰性バクテリアのポリペプチド、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）又はシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）のポリペプチドで
あることができる。

【００２４】 本発明のポリペプチドは、真菌の（ｆｕｎｇａｌ）ポリペプチド、そしてより
好ましくは酵母のポリペプチド、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ク
ルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サ
ッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の
ポリペプチド；又はより好ましくは、糸状菌ポリペプチド、例えば、アクレモニ
ウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、
アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フ
ザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポル
セ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコー（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍ
ｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａ
ｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａ
ｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセ
ス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タ
ラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃ
ｕｓ）、シェラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏ
ｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のポリペプチ
ドであることができる。

【００２５】 好ましい態様においては、上記ポリペプチドは、サッカロミセス・カールスバ
ーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）、サッカロミセス・ジアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄ
ｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビフォ
ルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）のポリペプチドで
ある。

【００２６】 他の好ましい態様においては、上記ポリペプチドは、アスペルギルス・アキュ
レアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・
アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォ
エチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジ
ャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス
・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギル
ス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザ
エ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈ
ｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃ
ｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコー・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅ
ｉ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
ｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕ
ｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコダーマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコダーマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコダーマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコダーマ・レエセイ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のポリペプチドである。

【００２７】 他の好ましい態様においては、上記ポリペプチドは、フザリウム・バクトリジ
オイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セ
レアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェ
レンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クル
モラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネガンジ（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅ
ｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕ
ｍ）、フザリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）
、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）
、フザリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃ
ｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈ
ｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕ
ｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈ
ｅｃｉｏｉｄｅｓ）、又はフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎ
ｅｎａｔｕｍ）のポリペプチドである。

【００２８】 より好ましい態様においては、上記フザリウム・ベネナタムの細胞は、フザリ
ウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＡＴＣＣ
２０３３４として当初寄託され、そして最近、Yoder and Christianson, 1998
, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 及びO'Donnell et al., 1998, Fung
al Genetics and Biology 23: 57-67 によりフザリウム・ベネナタムとして再分
類された、フザリウム・ベネナタムＡ３／５；並びにその種名により、それらか
目下知られているところの種名に拘らず、フザリウム・ベネナタムの分類学的等
価物である。他の好ましい態様においては、上記フザリウム・ベネナタム細胞は
、ＷＯ ９７／２６３３０中に開示されているような、フザリウム・ベネナタム
Ａ３／５又はフザリウム・ベネナタムＡＴＣＣ ２０３３４の形態学的突然変異
体である。

【００２９】 上述の種に関しては、本発明は、完全状態及び不完全状態の両者、並びに他の
分類学的等価物、例えば、奇形変態（ａｎａｍｏｒｐｈｓ）を、その種名により
それらか知られているところの種名に拘らず、包含すると理解される。当業者は
、適当な等価物の同一性を容易に認識するであろう。例えば、フザリウムの分類
学的等価物は、D.L.Hawksworth, p.M.Kirk, B.C.Sutton, and D.N.Pegler (edit
ors), 1995, In re Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi, Eighth Ed
ition, CAB International, University Press, Cambridge, England, pp.173-1
74により定義されている。

【００３０】 上記種の株は、多数の培養物コレクション、例えば、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Shimmelcultures (CBS)
、及びAqricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern
Regional Research Center (NRRL) において公衆に容易に入手されうる。

【００３１】 さらに、上記ポリペプチドは、上述のプローブを用いて天然（例えば、土壌、
堆肥、水等）から単離された微生物を含む他の源から同定され、そして得られう
る。天然生息環境から微生物を単離するための技術は、本分野において周知であ
る。次に、核酸配列は、他の微生物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを
同様にスクリーニングすることにより得られうる。一旦、ポリペプチドをコード
する核酸配列が上記プローブ（単数又は複数）を用いて検出されれば、上記配列
は、当業者に知られた技術を用いて単離され又はクローン化されることができる
（例えば、Sambrook et al., 1989 、前掲参照）。

【００３２】 本明細書中に定義するとき、“単離された”ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより測定されるとき、他の非コリン・オキシダーゼ・ポリペプチドを本質的
に含まない、すなわち、少なくとも約２０％の純度の、好ましくは少なくとも約
４０％の純度の、より好ましくは約６０％の純度の、さらにより好ましくは約８
０％の純度の、最も好ましくは約９０％の純度の、そしてさらに最も好ましくは
約９５％の純度のポリペプチドである。

【００３３】 本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、その内部で他のポリペ
プチドがそのポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端において融合されているとこ
ろの融合ポリペプチド又は解裂性の融合ポリペプチド又はその断片をも含む。融
合ポリペプチドは、本発明の核酸配列（又はその部分）に他のポリペプチドをコ
ードする核酸配列（又はその部分）を融合することにより作られる。融合ポリペ
プチドを作るための技術は本分野において知られており、そしてそれらがフレー
ム内にあり、そして融合ポリペプチドの発現が同一プロモーター（単複）及びタ
ーミネターの制御下にあるように、上記ポリペプチドをコードするコーディング
配列を連結させることを含む。

【００３４】 核酸配列 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列にも関する。好ま
しい態様においては、核酸配列は配列番号１に記載されるものである。他のより
好ましい態様においては、上記核酸配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＮＲＲＬ Ｂ−３００６６内に含まれるプラスミドｐＦＤ０８０８内に含まれ
る配列である。他の好ましい態様においては、上記核酸配列は、配列番号１の成
熟ポリペプチド・コーディング領域である。他のより好ましい態様においては、
上記核酸配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３００６
６内に含まれるプラスミドｐＦＤ０８０８内に含まれる成熟ポリペプチド・コー
ディング領域である。本発明は、遺伝子コードの縮重により配列番号１とは相違
する、配列番号２のアミノ酸配列をもつポリペプチド又はその成熟ポリペプチド
をコードする核酸配列をも包含する。本発明は、コリン・オキシダーゼ活性を有
する配列番号２の断片をコードする配列番号１のサブ配列にも関する。

【００３５】 配列番号１のサブ配列は、その５′及び／又は３′末端からの１以上のヌクレ
オチドが欠失されていることを除き、配列番号１により包含された核酸配列であ
る。好ましくは、サブ配列は少なくとも１３５９のヌクレオチド、より好ましく
は少なくとも１４４９のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも１５５
９ヌクレオチドを含む。

【００３６】 本発明は、配列番号１の成熟ポリペプチド・コーディング配列内に少なくとも
１の突然変異を含む突然変異体核酸配列であって、配列番号２のアミノ酸１〜５
４３から成るポリペプチドをコードするものにも関する。 ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するための技術は本
分野において知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの製
造、又はその組合せを含む。上記ゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクロー
ニングは、例えば、周知のポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）又
は共有構造特徴をもつクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリー
の抗体スクリーニングを用いることにより、行われることができる。例えば、In
nis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Pres
s, New York を参照のこと。他の核酸増幅手順、例えば、リガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、ライゲートされた活性化転写（ＬＡＴ）、及び核酸配列ベースの増幅（
ＮＡＳＢＡ）を使用することができる。上記核酸配列は、フザリウムの株、ある
いは他の又は関連の生物からクローン化されることができ、そしてそれ故、例え
ば、上記核酸配列のポリペプチド・コーディング領域の対立遺伝子又は種変異体
であることができる。

【００３７】 用語“単離された核酸配列”とは、本明細書中に使用するとき、他の核酸配列
を本質的に含まない、例えば、アガロース電気泳動により測定されるとき、少な
くとも約２０％の純度、好ましくは少なくとも約４０％の純度、より好ましくは
少なくとも約６０％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約８０％の純度、
そして最も好ましくは少なくとも約９０％の純度をもつ核酸配列をいう。例えば
、単離核酸配列は、その天然の位置からそれが再生産されるであろうところの異
なる部位まで上記核酸配列を移動させるための遺伝子操作において使用される標
準的なクローニング手順により得られることができる。上記クローニング手順は
、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸断片の切除及び単離
、ベクター分子内への上記断片の挿入、並びに上記核酸配列の多数コピー又はク
ローンが複製されるであろうところの宿主細胞内への組換えベクターの取り込み
を含むことができる。上記核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合
成起源、又はそのいずれかの組合せであることができる。

【００３８】 本発明は、少なくとも約６５％の、好ましくは約７０％の、好ましくは約８０
％の、より好ましくは約９０％の、さらにより好ましくは約９５％の、そして最
も好ましくは約９７％のホモロジーの、配列番号１の成熟ポリペプチド・コーデ
ィング配列（すなわち、ヌクレオチド４９〜１６７７）に対するホモロジー度を
もち、かつ、活性ポリペプチドをコードする核酸配列にも関する。本発明の目的
のためには、２つの核酸配列の間のホモロジー度（ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ
ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、同一性表及び以下の多数アラインメント・パラメータ
ー：１０のギャップ・ペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティーをもって
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェア（DNASTAR,
Inc., Madison, WI）を用いてＷｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎ法（Wilbur and Lip
man, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-73
0 ）により測定される。対合のアラインメント・パラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ
＝３、ギャップ・ペナルティー＝３、そしてウィンドウズ＝２０であった。

【００３９】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、上記ポリペプチドに実
質的に類似するポリペプチドの合成のために必要であることができる。用語、上
記ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、上記ポリペプチドの非天然形態を
いう。これらのポリペプチドは、いくらかの操作された方法において、その天然
源から単離されたポリペプチドとは異なることができ、例えば、比活性、耐熱性
、至適pH等において相違する変異体であることができる。上記変異体配列は、配
列番号１のポリペプチドコーディング部分として提供された核酸配列、例えばそ
のサブ配列に基づき、そして／又は上記核酸配列によりコードされたポリペプチ
ドの他のアミノ酸配列を生じないが、上記酵素の生産のために意図された宿主生
物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸
配列を生じさせることができるヌクレオチド置換の導入により、構築されること
ができる。ヌクレオチド置換の一般的説明に関しては、例えば、Ford et al., 1
991, Protein Expression and Purification 2: 95-107を参照のこと。

【００４０】 上記置換が上記分子の働きに決定的な領域の外で行われ、そして未だ活性なポ
リペプチドをもたらすことができるということは当業者にとって明らかであろう
。本発明の単離核酸配列によりコードされたポリペプチドの活性に不可欠であり
、そしてそれ故好ましくは置換を受けるべきではないアミノ酸残基は、本分野に
おいて知られた手順、例えば、部位指定突然変異誘発又はアラニン−スキャニン
グ突然変異誘発（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-10
85を参照のこと）に従って同定されうる。後者の技術においては、突然変異がそ
の分子内の正電荷をもつ各残基において導入され、そして得られた突然変異体分
子が、上記分子の活性に決定的であるアミノ酸残基を同定するために、コリン・
オキシダーゼ活性についてテストされる。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気
共鳴分析、結晶学又は光アフィニティー・ラベリングのような技術により測定さ
れるときの３次元構造の分析により決定されることもできる（例えば、de Vos e
t al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecu
lar Biology 224; 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64
を参照のこと）。

【００４１】 本発明は、本明細書中に定義するような、配列番号１の核酸配列又はその相補
鎖；又はその対立遺伝子変異体及びサブ配列と同一条件下ハイブリダイズする核
酸プローブと、極低ストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー
条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、より好ましくは中〜高ストリ
ンジェンシー条件、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件、そして最
も好ましくは極高ストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズする、本発明のポ
リペプチドをコードする単離核酸配列にも関する（Sambrook et al., 1989 、前
掲）。

【００４２】 本発明は、（ａ）極低、低、中、中〜高、高、又は極高ストリンジェンシー条
件下、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌ
クレオチド４９〜１６７７を含むゲノムＤＮＡ配列、（iii ）（ｉ）又は（ii）
のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖とハイブリダイ
ズさせ；そして（ｂ）その核酸配列を単離することにより製造される単離核酸配
列にも関する。上記サブ配列は、好ましくは、コリン・オキシダーゼ活性を有す
るポリペプチド断片をコードする配列の如き少なくとも１００ヌクレオチドから
成る配列である。

【００４３】 突然変異体核酸配列の製造方法 本発明は、さらに、突然変異体核酸配列の製造方法であって、配列番号１の成
熟ポリペプチド・コーディング配列又はそのサブ配列内に少なくとも１の突然変
異を導入することを含み、ここで上記突然変異体核酸配列が、配列番号２のアミ
ノ酸１〜５４３から成るポリペプチド又はコリン・オキシダーゼ活性を有する、
その断片をコードする、前記方法に関する。

【００４４】 １のヌクレオチドを他のヌクレオチドと変換するために上記核酸配列内に１の
突然変異を導入することは、本分野において知られた方法のいずれかを用いて部
位指定突然変異誘発により達成されることができる。特に有用であるのは、着目
の挿入物を含むスーパーコイルの２本鎖ＤＮＡベクター、及び所望の突然変異を
含む２つの合成プライマーを使用する手順である。上記ベクターの反対鎖に各々
相補的である、オリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラー
ゼによる温度サイクリングの間に伸長する。上記プライマーの取り込みの間に、
ずらされたニックを含む突然変異されたプラスミド生成する。温度サイクリング
の後、上記生成物を、メチル化ＤＮＡ及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎ
Ｉで処理して、その親ＤＮＡテンプレートを消化し、そして突然変異含有合成Ｄ
ＮＡについて選択する。本分野において知られた他の手順を使用することもでき
る。

【００４５】 核酸構築物 本発明は、その制御配列と適合性のある条件下好適な宿主細胞内での上記コー
ディング配列の発現を指令する１以上の制御配列に作用可能な状態で連結された
本発明の核酸配列を含む核酸構築物にも関する。発明とは、非限定的に、転写、
転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、上記ポリペプチドの生産に係
るいずれかのステップを含むと理解される。

【００４６】 “核酸構築物”は、本明細書中、天然遺伝子から単離された、又は天然には存
在しないであろうやり方で併合され、そして近接された核酸のセグメントを含む
ように修飾されている、１本鎖又は２本鎖の、核酸分子として定義される。用語
核酸構築物は、その核酸構築物が本発明のコーディング配列の発現のために要求
される制御配列の全てを含むとき、用語発現カセットと同義である。用語“コー
ディング配列”は、本明細書中、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に
特定する核酸配列として定義される。ゲノム・コーディング配列の境界は、一般
に、リボソーム結合部位（原核生物）又はｍＲＮＡの５′末端にあるオープン・
リーディング・フレームの直上流に位置するＡＴＧ開始コドン（真核生物）並び
にｍＲＮＡの３′末端にあるオープン・リーディング・フレームの直下流に位置
する転写終結配列により決定される。コーディング配列は、非限定的に、ＤＮＡ
，ｃＤＮＡ、及び組換え核酸配列を含むことができる。

【００４７】 本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列は、上記ポリペプチドの発現
に備えるさまざまな方法において操作されることができる。ベクター内へのその
挿入前の上記核酸配列の操作は、上記発現ベクターに依存して望ましいものであ
ることも必要なものであることができる。組換えＤＮＡ法を用いる核酸配列を修
飾するための技術は、本分野において周知である。

【００４８】 用語“制御配列”は、本明細書中、本発明のポリペプチドの発現のために必要
な又は有利である成分の全てを含むと定義される。各制御配列は、上記ポリペプ
チドをコードする核酸配列に対し天然又は外来のものであることができる。この
ような制御配列は、非限定的に、リーダー、ポリアデニレーション配列、プロペ
プチド配列、プロモーター、シグナル・ペプチド配列、及び転写ターミネーター
を含む。少なくとも、上記制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止
シグナルを含む。上記制御配列は、その制御配列とポリペプチドをコードする核
酸配列のコーディング領域とのライゲーションを容易にする特別な制限部位を導
入する目的のためのリンカーを提供されることができる。用語“使用可能な状態
で連結された”は、本明細書中、その制御配列がポリペプチドの発現を指令する
ようにＤＮＡ配列のコーディング配列に対して一定の位置にコーディング配列が
適切に置かれているような配置として定義される。

【００４９】 上記制御配列は、適当なプロモーター配列、すなわち、上記核酸配列の発現の
ために宿主細胞により認識される核酸配列でありうる。このプロモーター配列は
、上記ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選
ばれた宿主細胞内で転写活性を示すいずれかの核酸配列であることができ、突然
変異体、切頭化、及びハイブリッド・プロモーターを含み、そしてその宿主細胞
に対し同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得
られうる。

【００５０】 特にバクテリア宿主細胞内で本発明の核酸構築物の転写を指令するために好適
なプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コ
エリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺
伝子（ｄａｇ Ａ）、バチルス・スブチリスのレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓ
ｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｅ Ｂ）、バチルス・リケニフォルミスのアルファ
−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ Ｌ）、バチルス・ステアロサーモフィラスのマル
トース形成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ Ｍ）、バチルス・アミロリクエファシ
エンスのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ Ｑ）、バチルス・リケニフォル
ミスのペニシリナーゼ遺伝子（Ｐｅｎ Ｐ）、バチルス・サブチリスのｘｙｌ
Ａ遺伝子及びｘｙｌ Ｂ遺伝子、並びに原核生物のベーターラクタマーゼ遺伝子
から得られたプロモーター（Villa-Kameroff et al., 1978, Proceedings of th
e National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731）、並びにｔａｃプロモー
ター（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA 80: 21-25）である。さらなるプロモーターは、“Useful prsteins from
recombinant bacteria”in Scientific American, 1980, 242: 74-94中；及びS
ambrook et al., 1989、前掲中に記載されている。

【００５１】 糸状菌宿主細胞内で本発明の核酸構築物の転写を指令するために好適なプロモ
ーターの例は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコー・
ミエヘイのアスパラギン酸プロティティナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性
アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性アルファーアミラー
ゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ
（ｇｌａ Ａ）、リゾムコー・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエ
のアルカリ・プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオース・ホスフェ
ート・イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアセトアミダーゼ、及び
フザリウム。オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼのための遺伝子から得
られたプロモーター（ＷＯ ９６／００７８７）、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモ
ーター（アスペルギルス・ニガーの中性アルファーアミラーゼのための遺伝子と
アスペルギルス・オリザエのトリオース・ホスフェート・イソメラーゼのための
遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びその突然変異体、切頭化、及
びハイブリッドプロモーターである。

【００５２】 酵母宿主においては、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエの
エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの
ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコール・デ
ヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（
ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレー
ト・キナーゼのための遺伝子から得られる。酵母宿主のための他の有用なプロモ
ーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488により記載されている。

【００５３】 上記制御配列は、好適な転写終結配列、すなわち、転写を終結させるために宿
主細胞により認識される配列であることもできる。この終結（ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｏｒ）配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用可能な
状態で連結される。選ばれた宿主細胞内で働くいずれのターミネーターも、本発
明において使用されうる。

【００５４】 糸状菌宿主細胞のために好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザ
エのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペ
ルギルス・ニジュランスのアントラニレート（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ）シン
ターゼ、アスペルギルス・ニガーのアルファーグルコシダーゼ、及びフザリウム
・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼのための遺伝子から得られる。

【００５５】 酵母細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエの
エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのシトクロームＣ（ＣＹＣ１）、及び
サッカロミセス・セレビシエのグリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒド
ロゲナーゼのための遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なター
ミネーターは、Romanos et al., 1992 、前掲により記載されている。

【００５６】 制御配列は、好適なリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重
要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であることもできる。このリーダー配列は、上記
ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用可能な状態で連結される。
選ばれた宿主細胞内で働くいずれのリーダー配列も本発明において使用されるこ
とができる。

【００５７】 糸状菌宿主細胞のために好適なリーダーは、アスペルギルス・オリザエのＴＡ
ＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニジュランスのトリオース・ホスフェート
・イソメラーゼのための遺伝子から得られる。 酵母宿主細胞のために好適なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエノ
ラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレート
・キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのアルファー因子、及びサッカロミセ
ス・セレビシエのアルコール・デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−オ
スフェート・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）のための遺伝子から得られ
る。

【００５８】 制御配列は、ポリアデニレーション配列、すなわち、上記核酸配列の３′末端
に作用可能な状態で連結され、そして転写されるとき、転写されたｍＲＮＡにポ
リアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列、で
あることもできる。選ばれた宿主細胞内で働くいずれのポリアデニレーション配
列も本発明において使用されうる。

【００５９】 糸状菌宿主細胞のために好ましいポリアデニレーション配列は、アスペルギル
ス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラー
ゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレート・シンターゼ、フザリウ
ム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー
のアルファーグルコシダーゼのための遺伝子から得られる。

【００６０】 酵母宿主細胞のために有用なポリアデニレーション配列は、Guo and Sherman,
1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990 により記載されている。 制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし
、そしてそのコードされたポリペプチドをその細胞の分泌経路に指向けるシグナ
ル・ペプチド・コーディング領域であることもできる。上記核酸配列のコーディ
ング配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング領域
のセグメントと翻訳リーディング・フレーム内で天然に連結されているシグナル
・ペプチド・コーディング領域を、本来的に含むことができる。あるいは、上記
コーディング配列の５′末端は、そのコーディング配列にとって外来のシグナル
・ペプチド・コーディング領域を含みうる。この外来シグナル・ペプチド・コー
ディング領域は、そのコーディング配列がシグナル・ペプチド・コーディング領
域を天然には含まない場合に、必要とされるかもしれない。あるいは、外来シグ
ナル・ペプチド・コーディング領域は、上記ポリペプチドの分泌を強化するため
にその天然のシグナル・ペプチド・コーディング領域を単に置き替えることがで
きる。しかしながら、選ばれた宿主細胞の分泌経路に発現されたポリペプチドを
指向けるいずれのシグナル・ペプチド・コーディング領域も本発明において使用
されうる。

【００６１】 バクテリア宿主細胞のために有効なシグナル・ペプチド・コーディング領域は
、バチルスＮＣＩＢ １１８３７マルトース形成性アミラーゼ、バチルス・ステ
アロサーモフィラスのアルファーアミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスのズ
ブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルス・リケニフォルミスのベーター
ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒ
Ｔ，ｎｐｒ Ｓ，ｎｐｒ Ｍ）、及びバチルス・サブチリスのｐｒｓ Ａのた
めの遺伝子から得られたシグナル・ペプチド・コーディング領域である。さらな
るシグナル・ペプチドが、Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews
57: 109-137により記載されている。

【００６２】 糸状菌宿主細胞のために有効なシグナル・ペプチド・コーディング領域は、ア
スペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性
アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコー・ミエヘ
イのアスパラギン酸プロティナーゼ、フミコーラ・インソレニスのセルラーゼ、
及びフミコーラ・ラヌギノーサのリパーゼのための遺伝子から得られるシグナル
・ペプチド・コーディング領域である。

【００６３】 酵母宿主細胞のために有用なシグナル・ペプチドは、サッカロミセス・セレビ
シエのアルファー因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼ（ｉｎ
ｖｅｒｔａｓｅ）のための遺伝子から得られる。他の有用なシグナル・ペプチド
・コーディング領域は、Romanos et al., 1992、前掲により記載されている。 制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に置かれた、アミノ酸配列をコードす
るプロペプチド・コーディング領域であることもできる。得られたポリペプチド
は、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はある場合には、チモーヂン（Ｚｙｍｏ
ｇｅｎ）として知られる。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、そしてそ
のプロポリペプチドからのそのプロペプチドの酵素による又は自己触媒による開
裂により、成熟活性ポリペプチドに変換されることができる。プロペプチド・コ
ーディング領域は、バチルス・サブチリスのアルカリ・プロテアーゼ（ａｐｒ
Ｅ）、バチルス・サブチリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒ Ｔ）、サッカロミセ
ス・セレビシエのアルファー因子、リゾムコー・ミエヘイのアスパラギン酸プロ
ティナーゼ、及びミセリオフトーラ・サーモフィラのラッカーゼのための遺伝子
から得られうる（ＷＯ ９５／３３８３６）。

【００６４】 シグナル・ペプチド領域とプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末
端に存在する場合、そのプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣りに
置かれ、そしてそのシグナル・ペプチド領域はそのプロペプチド領域のアミノ末
端の隣りに置かれる。 宿主細胞の増殖に対して上記ポリペプチドの発現の調節を許容する調節配列を
付加することも望ましいものであることができる。調節系の例は、遺伝子の発現
が、調節性化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応答してオン・オフさ
れることを引き起こすものである。原核系における調節系は、ｌａｃ，ｔａｃ、
及びｔｒｐオペレーター系を含む。酵母においては、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系
が使用されうる。糸状菌においては、ＴＡＫＡアルファーアミラーゼ・プロモー
ター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ・プロモーター、及びアスペ
ルギルス・オリザエのグルコアミラーゼ・プロモーターが、調節配列として使用
されうる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を許容するものである。真核系にお
いては、これらは、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダク
ターゼ遺伝子、及び重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。こ
れらの場合には、上記ポリペプチドをコードする核酸配列は、上記調節配列と作
用可能な状態で連結されるであろう。

【００６５】 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を変更する
ための核酸構築物にも関する。上記構築物は、上記内因性遺伝子の発現を変更す
るために必要な最小数の成分を含むことができる。１の態様においては、上記核
酸構築物は、好ましくは、（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ
）エクソン、及び（ｄ）スプライス−ドナー部位、を含む。細胞内への上記核酸
構築物の取り込みの間、上記構築物は、内因性遺伝子部位における細胞ゲノム内
への相同的組換えにより挿入される。上記ターゲッティング配列は、上記要素（
ｂ）〜（ｄ）が上記内因性遺伝子に作用可能な状態で連結されるような、上記内
因性遺伝子内への要素（ａ）〜（ｄ）の組み込みを指令する。他の態様において
は、核酸構築物は、（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エク
ソン、（ｄ）スプライス−ドナー部位、（ｅ）イントロン、及び（ｆ）スプライ
ス−アクセプター部位を含み、ここで、上記ターゲッティング配列は、要素（ｂ
）〜（ｆ）が上記内因性遺伝子に作用可能な状態で連結するような、要素（ａ）
〜（ｆ）の組み込みを指令する。しかしながら、上記構築物は、選択マーカーの
ような追加の成分を含んでもよい。

【００６６】 両態様において、上記成分の導入は、内因性遺伝子の発現が変更されていると
ころの新たな転写ユニットの生産をもたらす。本質的には、この新たな転写ユニ
ットは、上記ターゲッティング構築物と上記内因性遺伝子により導入された上記
配列の融合生成物である。内因性遺伝子が変更されている１の態様においては、
その遺伝子は活性化されたものである。この態様においては、相同的組換えは、
その対応の親細胞内で明らかであるよりも高いレベルでその遺伝子が発現される
ことを引き起こす調節配列の挿入を通して、親細胞の内因性遺伝子と通常会合す
る調節領域を、置換し、破壊し、又は不能にするために使用される。この活性化
された遺伝子は、本分野において周知の方法を用いて上記構築物内に増幅可能な
選択マーカー遺伝子を含ませることにより、さらに増幅されることができる（例
えば、米国特許第５，６４１，６７０号参照）。内因性遺伝子が変更される他の
態様においては、上記遺伝子の発現は低減される。

【００６７】 上記ターゲッティング配列は、内因性遺伝子内に、上記遺伝子のすぐ隣りに、
上流遺伝子内に、又は上記内因性遺伝子の上流に又はそれから遠く離れて、存在
することができる。例えば、環状プラスミド又はＤＮＡ断片は、好ましくは、単
一のターゲッティング配列を使用する。一方、線状プラスミド又はＤＮＡ断片は
、好ましくは、２つのターゲッティング配列を使用する。

【００６８】 上記構築物の調節配列は、１以上のプロモーター、エンハンサー、足場付着領
域又はマトリックス付着部位、負の調節要素、転写結合性部位、又はこれらの配
列の組合せから作られることができる。 上記構築物は、上記内因性遺伝子の１以上のエクソンをさらに含む。エクソン
は、ＲＮＡにコピーされ、そしてそのエクソン配列が上記内因性遺伝子のコーデ
ィング領域とフレーム内で存在するように、成熟ｍＲＮＡ分子内に存在するＤＮ
Ａ配列として定義される。エクソンは、場合により、１以上のアミノ酸をコード
し、そして／又はアミノ酸を部分的にコードするＤＮＡを含むことができる。あ
るいは、上記エクソンは、５′非コーディング領域に対応するＤＮＡを含む。内
因性エクソン（単数及び複数）が１以上のアミノ酸及び／又はアミノ酸の一部を
コードする場合、その核酸構築物は、転写及びスプライシングの間に、そのリー
ディング・フレームが、第２エクソン由来のｍＲＮＡの部分の適当なリーディン
グ・フレームが変更されないように、上記内因性遺伝子のコーディング領域とフ
レーム内で存在するように、デザインされる。

【００６９】 上記構築物のスプライス−ドナー部位は、１のエクソンから他のエクソンへの
スプライシングを指令する。典型的には、第１エクソンは、第２エクソンの５′
側にあり、そしてその３′側で第１エクソンに重なり、そして隣接するスプライ
ス−ドナー部位は、第２エクソンの５′側で第２エクソンに隣接するスプライス
−アクセプター部位を認識する。スプライス−アクセプター部位は、スプライス
−ドナー−部位と同様に、１のエクソンから他のエクソンへのスプライシングを
指令する配列である。スプライス−ドナー部位と一緒に働いて、スプライシング
装置は、スプライス−アクセプター部位を使用して、イントロンの除去を行う。

【００７０】 発現ベクター 本発明は、本発明の核酸配列、プロモーター、並びに転写及び翻訳終結シグナ
ルを含む組換え発現ベクターにも関する。上記さまざまな核酸及び制御配列は、
一緒になって、そのような部位において上記ポリペプチドをコードする核酸配列
の挿入又は置換を許容するための１以上の便利な制限部位を含むことができる組
換え発現ベクターを作ることができる。あるいは、本発明の核酸配列は、発現の
ために適当なベクター内に上記配列を含む核酸配列又は核酸構築物を挿入するこ
とにより、発現されることができる。発現ベクターの作製においては、上記コー
ディング配列は、そのコーディング配列が発現のために適当な制御配列も作用可
能な状態で連結されるように、上記ベクター内に置かれる。

【００７１】 組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順を受けることができ、そし
て上記核酸配列の発現を引き起こすことができるいずれかのベクター（例えば、
プラスミド又はウイルス）であることができる。このベクターの選択は、典型的
には、その中にそのベクターが導入されるべきところの宿主細胞とそのベクター
との適合性に依存するであろう。上記ベクターは、線状又は閉環状プラスミドで
あることができる。

【００７２】 上記ベクターは、自律複製性ベクター、すなわち、染色体外存在物として存在
し、その複製が染色体の複製から独立しているようなベクター、例えば、プラス
ミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、又は人工染色体であることができる。
上記ベクターは、自律複製を保証するためのいずれかの手段を含むことができる
。あるいは、上記ベクターは、宿主細胞内に導入されるとき、ゲノム内に組み込
まれ、そしてその中にそれが組み込まれているところの染色体とともに複製され
るようなものであることができる。さらに、単一のベクター又はプラスミドある
いは２以上のベクター又はプラスミドであって一緒になって宿主細胞のゲノム内
に導入されるべき全ＤＮＡを含むもの、又はトランスポゾンを使用することがで
きる。

【００７３】 本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を許容す
る１以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物又はウイ
ルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性などを提供する遺伝子で
ある。バクテリアの選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス又はバチルス・
リケニフォルミスからのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えば、アンピシリ
ン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する
マーカーである。酵母宿主細胞のために好適なマーカーは、ＡＤＥ２，ＨＩＳ３
，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主
細胞における使用のための選択マーカーは、非限定的に、ａｍｄ Ｓ（アセトア
ミダーゼ）、ａｒｇ Ｂ（オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂ
ａｒ（ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロ
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａ Ｄ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒ
Ｇ（オロチジン−５′−ホスフェート・デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（スルフ
ェート・アジニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐ Ｃ（アントラニレート・
シンターゼ）、並びにそれらの等価物を含む。アスペルギルス細胞における使用
のために好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オ
リザエのａｍｄ Ｓ遺伝子及びｐｙｒ Ｇ遺伝子、並びにストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスのｂａｒ遺伝子である。

【００７４】 本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノム内へのベクターの組み込み
又はゲノムから独立した細胞内での自律複製を許容する要素（単数又は複数）を
含む。 宿主細胞ゲノム内への組み込みのために、ベクターは、相同的又は非相同的組
換えによるゲノム内へのベクターの組み込みのために、上記ポリペプチドをコー
ドする核酸配列又は上記ベクターの他の要素に頼ることができる。あるいは、ベ
クターは、宿主細胞のゲノム内への相同的組換えによる組込みを指令するための
追加の核酸配列を含むことができる。この追加の核酸配列は、ベクターが、染色
体（単複）内の正しい位置（単複）において宿主細胞ゲノム内に組み込まれるこ
とを可能にする。正しい位置における組込みの確率を高めるために、上記組込み
要素は、好ましくは、相同的組換えの確率を高めるためにその対応の標的配列と
高く相同である、十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、好まし
くは４００〜１０，０００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１０，０００
塩基対を、含むべきである。組込み要素は、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相
同であるいずれかの配列であることができる。さらに、組込み要素は、非コーデ
ィング又はコーディング核酸配列であることができる。他方において、ベクター
は、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができる。

【００７５】 自律的複製のためには、ベクターは、そのベクターが着目の宿主細胞内で自律
的に複製することを可能にする複製起点をさらに含むことができる。バクテリア
の複製起点の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２
，ｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、並びにバ
チルス内での複製を許容するＰＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＴＡ１０６０、及び
ｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞における使用のための複製起点の例は、２ミク
ロン複製起点、ＡＲＳ１，ＡＲＳ４，ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、並びにＡＲ
Ｓ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞内でその働きを温度感受
性にする突然変異をもつものであることができる（例えば、Ehrlich, 1978, Pro
ceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433 を参照のこと）
。

【００７６】 本発明の核酸配列の２以上のコピーが、その遺伝子産物の生産を高めるために
宿主細胞内に挿入されることができる。核酸配列のコピー数の増加は、上記配列
の少なくとも１の追加のコピーを宿主ゲノム内に組みこむことにより又は上記核
酸配列とともに増幅可能な選択マーカーを含ませることにより得られることがで
き、ここでは、選択マーカーの増幅されたコピー、そしてそれにより核酸配列の
追加のコピーを含む細胞が、適当な選択剤の存在下でその細胞を培養することに
より、選択されることができる。

【００７７】 本発明の組換え発現ベクターを構築するために先に記載した要素をライゲート
するために使用される手順は、本分野において周知である（例えば、Sambrook e
t al., 1989 、前掲を参照のこと）。 宿主細胞 本発明は、上記ポリペプチドの組換え製造において有利に使用される、本発明
の核酸配列を含む組換え宿主細胞にも関する。本発明の核酸配列を含むベクター
は、そのベクターが先に記載されたような染色体構成部分（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ
）として又は自律複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞内に
導入される。用語“宿主細胞”は、複製の間に生じる突然変異に因りその親細胞
と同一ではない、親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選定は、上記
ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源にかなりの程度依存するであろう。

【００７８】 宿主細胞は、単細胞微生物、例えば、原核生物、又は非単細胞微生物、例えば
、真核生物であることができる。 有用な単細胞性の細胞は、バクテリア細胞、例えば、グラム陽性バクテリアで
あって、非限定的に、バチルス細胞、例えば、バチルス・アルカロフィラス、バ
チルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュ
ランス、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアギュランス、バチルス・ラウタ
ス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウ
ム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・サブチリス、及びバチルス
・チューリンギエンシスを含むもの；又はストレプトミセス細胞、例えば、スト
レプトミセス・リビダンス及びストレプトミセス・ムリナスを含むもの、又はグ
ラム陰性バクテリア、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びシュードモナス種である。好ま
しい態様においては、バクテリア宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・
リケニフォルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス、又はバチルス・サブチ
リス細胞である。他の好ましい態様においては、バチルス細胞は、好アルカリ性
バチルスである。

【００７９】 バクテリア宿主細胞内へのベクターの導入は、例えば、コンピテント細胞（例
えば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 、又
はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 20
9-221 参照）を用いた、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1
979, Molecular General Genetics 168: 111-115参照）、エレクトロポレーショ
ン（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 参照）、
又はコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bac
teriology 169: 5771-5278参照）により行われることができる。

【００８０】 宿主細胞は、真核生物、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌（ｆｕｎｇ
ａｌ）の細胞であることができる。 好ましい態様においては、宿主細胞は真菌細胞である。“真菌”は本明細書中
に使用するとき、（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionar
y of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press,
Cambridge, UK により定義されるような）子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門（ｃ
ｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及び接合菌門、並びに（Hawksworth et al.,
1995 、前掲、１７１頁に引用されるような）卵菌門並びに全ての栄養胞子（ｍ
ｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）菌（Hawksworth et al., 1995 、前掲）を含む。

【００８１】 より好ましい態様においては、真菌宿主細胞は酵母細胞である。“酵母”は、
本明細書中に使用するとき、子嚢胞子形成酵母（エンドミセタレス（Ｅｎｄｏｍ
ｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子形成酵母、及び不完全菌に属する酵母（ブラス
トミセテス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来変更さ
れうるので、本発明の目的のためには、酵母は、Biology and Activities of Ye
ast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc.App.Ba
cteriol. Symposium Series No.9, 1980）中に記載されるように定義されるであ
ろう。

【００８２】 さらにより好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、キャンディダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス、又はヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉ
ａ）細胞である。

【００８３】 最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベ
ルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）、サッカロミセス・ジアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄ
ｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビフォル
ミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）の細胞である。他の
最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）の細胞である。他の最も好まし
い態様においては、酵母宿主細胞は、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏ
ｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞である。

【００８４】 他のより好ましい態様においては、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。“糸
状菌（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）”は、（Hawksworth et al., 199
5 、前掲により定義されるような）亜門、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌
門の全ての繊維状形態を含む。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン
、キトサン、マンナン、その他の複合多糖から成る菌糸体を特徴とする。無性成
長は菌糸の伸長であり、そして炭素同化は絶対好気性である。これに反し、酵母
、例えば、サッカロミセス・セレビシエによる無性成長は、単細胞性の葉状体（
ｔｈａｌｌｕｓ）の発芽により、そして炭素同化は発酵的であることができる。

【００８５】 さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、非限定的に、アクレ
モニウム、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、ムコー、ミセリオフトー
ラ、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム、又はトリ
コダーマの種の細胞である。 最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ
、アスペルギルス・フォエチダス、アスペルギルス・ジャポニカス、アスペルギ
ルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザエの
細胞である。他の最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フザリウム
・バクトリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クルックウェレ
ンス、フザリウム・クルモラム、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・グ
ラミナム、フザリウム・ヘテロスポラム、フザリウム・ネガンジ、フザリウム・
オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム、フザリウム・ロゼウム、フザリ
ウム・サムブシナム、フザリウム・サルコクロウム、フザリウム・スポロトリチ
オイデス、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロサム、フザリウム・
トリコテシオイデス、又はフザリウム・ベネナタムの細胞である。さらに最も好
ましい態様においては、糸状菌親細胞は、フザリウム・ベネナタム（Ｎｉｒｅｎ
ｂｅｒｇ ｓｐ．ｎｏｖ．）細胞である。他の最も好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞は、フミコーラ・インソレンス、フミコーラ・ラヌギノーサ、ムコ
ー・ミエヘイ、ミセリオフトーラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、
ペニシリウム・パープロゲナム、チエラビア・テレストレス、トリコダーマ・ハ
ルジアナム、トリコダーマ・コニンジイ、トリコダーマ・ロンジブラチアタム、
トリコダーマ・レーセイ、又はトリコダーマ・ビリデの細胞である。

【００８６】 真菌細胞は、それ自体知られたやり方で、プロトプラスト形成、プロトプラス
トの形質転換、及び細胞壁の再生を含む方法により形質転換されることができる
。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のために好適な手順は、ＥＰ ２３８ ０
２３及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Scie
nces USA 81: 1470-1474中に記載されている。フザリウム種を形質転換させるた
めに好適な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156、及びＷＯ ９
６／００７８７により記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abel
son, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecula
r Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press
, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及
びHinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences U
SA 75: 1920 により記載されている手順を用いて形質転換されることができる。

【００８７】 製造方法 本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって：（ａ）その野生型にお
いて上記ポリペプチドを産生することができる株を培養して、上記ポリペプチド
を含む上清を作り；そして（ｂ）上記ポリペプチドを回収する、前記方法にも関
する。好ましくは、この株は、フザリウム属に属し、そしてより好ましくはフザ
リウム・ベネナタムである。

【００８８】 本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって：（ａ）上記ポリペプチ
ドの生産を誘導する条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）上記ポリペプチド
を回収する、を含む前記方法にも関する。 本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって：（ａ）上記ポリペプチ
ドの生産を誘導する条件下で宿主細胞を培養し、ここでこの宿主細胞は、配列番
号１の成熟ポリペプチド・コーディング領域内に少なくとも１の突然変異をもつ
突然変異体核酸配列を含み、ここでこの突然変異体核酸配列は、配列番号２のア
ミノ酸１〜５４３から成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）上記ポリペプ
チドを回収する、を含む前記方法にも関する。

【００８９】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの製造方法であって：（ａ）上記ポ
リペプチドをコードする内因性核酸配列の第２エクソンに作用可能な状態で連結
された調節配列、エクソン、及び／又はスプライス−ドナー部位を含む新たな転
写ユニットをその内に取り込んでもつ相同組換え体細胞を、上記ポリペプチドの
生産を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）上記ポリペプチドを回収する、を
含む前記方法に関する。本法は、米国特許第５，６４１，６７０号中に記載され
た遺伝子活性化技術の使用に基づく。

【００９０】 本発明の製造方法においては、細胞は、本分野において知られた方法を用いて
、上記ポリペプチドの生産のために好適な栄養培地中で培養される。例えば、細
胞は、上記ポリペプチドが発現され、そして／又は単離されることを許容する条
件下、及び好適な培地中で行われる実験室又は工業的発酵槽内での、振とうフラ
スコ培養、及び小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェッド−バッチ、又は
固相発酵を含むもの）により培養されることができる。培養は、本分野において
知られた手順を用いて炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行
われる。好適な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は（例えば、the Am
erican Type Culture Collectionのカタログ中に）公表された組成に従って調製
されることができる。上記ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、上記ポ
リペプチドは上記培地から直接回収されることができる。上記ポリペプチドが分
泌されない場合、それは細胞溶解産物から回収されることができる。

【００９１】 上記ポリペプチドは、上記ポリペプチドに特異的である本分野において知られ
た方法を用いて検出されることができる。上記検出方法は、特異的抗体の使用、
酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失を含むことができる。例えば、酵素アッ
セイは、本明細書中に記載するように、ポリペプチドの活性を測定するために使
用されることができる。

【００９２】 得られたポリペプチドは、本分野において知られた方法により回収されること
ができる。例えば、上記ポリペプチドは、非限定的に、遠心分離、濾過、抽出、
スプレードライング、蒸発、又は沈降を含む慣用の手順により上記栄養培地から
回収されることができる。 本発明のポリペプチドは、非限定的に、クロマトグラフィー（例えば、イオン
交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電
気泳動手順（例えば、調製用等電点電気泳動）、溶解度分離（例えば、硫酸アン
モニウム沈澱）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出を含む本分野において知られたさ
まざまな手順により精製されることができる（例えば、Protein Purification,
J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989）。

【００９３】 植物 本発明は、回収可能な量において上記ポリペプチドを発現させ、そして製造す
るために、本発明のコリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る核酸配列で形質転換されているトランスジェニック植物、植物部分、又は植物
細胞にも関する。上記ポリペプチドは上記植物又は植物部分から回収されること
ができる。あるいは、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食品又は
飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価、嗜好性、及びレオロジー特性を
改良し又は抗栄養因子を破壊するために、そのまま使用されることもできる。

【００９４】 トランスジェニック植物は双子葉植物又は単子葉植物であることができる。単
子葉植物の例は、草、例えば、イチゴツナギ（ｍｅａｄｏｗ ｇｒａｓｓ）（ブ
ルー・グラス（ｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ）、Ｐｏａ）、飼い葉（ｆｏｒａｇｅ ｇ
ｒａｓｓ）、例えば、ウシノケグサ（ｆｅｓｔｕｃａ）、ロリウム（ｌｏｌｉｕ
ｍ）、温帯草（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｇｒａｓｓ）、例えば、アグロスティス（
Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、及び穀類、例えば、小麦、オートムギ、ライ麦、大麦、稲
、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、及びトウモロコシ（ｍａｉｚｅ（ｃｏｒｎ））
である。

【００９５】 双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物（ｌｅｇｕｍｅ）、例えば、ルピナス
（ｌｕｐｉｎｓ）、ポテト、サトウダイコン（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ）、エンド
ウ豆（ｐｅａ）、インゲン豆（ｂｅａｕ）、及びダイズ、並びにアブラナ科（ｃ
ｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ）植物（アブラナ科（ｆａｍｉｌｙ Ｂｒａｓｓｉｃａｃ
ｅａｅ））、例えば、カリフラワー、ナタネ、及び近い関係にあるモデル生物ア
ラビドプシス・ケリアナである。

【００９６】 植物部分の例は茎、カルス、葉、根、果実、種子、及び塊茎である。また、特
定の植物組織、例えば、クロロプラスト、アポプラスト、ミトコンドリア、小胞
（ｖａｃｕｏｌｅ）、ペルオキシソーム、及び細胞質も植物部分であると考えら
れる。さらに、その組織の起源に拘らず、いずれの植物細胞も植物部分と考えら
れる。

【００９７】 本発明の範囲内には、上記植物、植物部分、及び植物細胞の子孫も含まれる。 本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、本
分野において知られた方法に従って構築されることができる。簡単に言えば、植
物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする１以上の発現構築物を植
物の宿主ゲノム内に取り込み、そして得られた修飾植物又は植物細胞をトランス
ジェニック植物又は植物細胞に増殖させることにより構築される。

【００９８】 便利には、上記発現構築物は、選ばれた植物又は植物部分内での上記核酸配列
の発現のために要求される適当な調節配列と作用可能な状態で連結された本発明
のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物である。さらに、発現構
築物は、発現構築物がその中に組み込まれているところの宿主細胞を同定するた
めに有用な選択マーカー及び着目の植物内への構築物の導入のために必要なＤＮ
Ａ配列を含むことができる（後者は、使用されるべきＤＮＡ導入方法に依存する
）。

【００９９】 調節配列、例えば、プロモーター配列とターミネーター配列、そして場合によ
り、シグナル配列とトランジット配列の選定は、例えば、いつ、どこで、そして
どのように、そのポリペプチドが発現されることが望まれるかに基づいて、決定
される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成的又
は誘導性であることができ、又は発生的、段階又は組織特異的であることができ
、そして遺伝子産物は、特定組織又は植物部分、例えば、種子又は葉に標的化さ
れることができる。調節配列は、例えば、Tague et al., 1988, Plant Physiolo
gy 86: 506により記載されている。

【０１００】 構成的発現のためには、３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターが使用されうる（Fran
ck et al., 1980, cell 21: 285-294 ）。器官特異的プロモーターは、例えば、
貯蔵庫（ｓｔｒａｇｅ ｓｉｎｋ）組織、例えば、種子、ポテト塊茎、及び果実
からのプロモーター（Edwards & Coruzzi, 1990, Anm.Rev.Genet. 24: 275-303
）、又は代謝庫（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｉｎｋ）組織（例えば、成長点（ｍｅ
ｒｉｓｔｅｍｓ））からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えば、稲
からのグルテリン、プロラミン、グロブリン、又はアルブミン・プロモーター（
Wu et al., 1988, Plant and Cell Physiology 39: 885-889）、ソラマメからの
レグミンＢ４及び未知の種子タンパク質遺伝子からのソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆ
ａｂａ）プロモーター（Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 1
52: 708-711 ）、種子油体タンパク質からのプロモーター（Chen et al., 1998,
Plant and Cell Physiology 39: 935-941）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉ
ｃａ ｎａｐｕｓ）からの保存タンパク質ｎａｐ Ａプロモーター、又は例えば
、ＷＯ ９１／１４７７２中に記載されているような、本分野において知られた
他の種子特異的プロモーターのいずれかであることができる。さらに、プロモー
ターは、葉特異的プロモーター、例えば、稲又はトマトからのｒｂｃｓプロモー
ター（Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000）、クロレラ・
ウイルス・アデニン・メチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra an
d Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93）、又は稲からのａｌｄ
Ｐ遺伝子プロモーター（Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genet
ics 248: 668-674）、又は外傷誘導性プロモーター、例えば、ポテトｐｉｎ２プ
ロモーター（Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588）である
ことができる。

【０１０１】 プロモーター・エンハンサー要素も、植物における酵素のより高い発現を達成
するために使用されることができる。例えば、プロモーター・エンハンサー要素
は、プロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との
間に置かれるイントロンであることができる。例えば、Xu et al., 1993 、前掲
は、発現を高めるための稲アクチン１遺伝子の第１イントロンの使用について開
示している。

【０１０２】 上記発現構築物の選択マーカー遺伝子及びいずれかの他の部分は、本分野にお
いて入手可能なものから選ばれることができる。 核酸構築物は、アグロバクテリウム仲介形質転換、ウイルス仲介形質転換、マ
イクロインジェクション、微粒子銃、微粒子銃形質転換、及びエレクトロポレー
ションを含む本分野において知られた慣用技術に従って植物ゲノム内に取り込ま
れる（Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Techno
logy 8: 535: Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274）。

【０１０３】 現在、アグロバクテリウム・チュムファシエンス仲介遺伝子伝達がトランスジ
ェニック双子葉植物を作製するために選ばれる方法である（レビューのためには
、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38 を参
照のこと）。しかしながら、それは、単子葉植物を形質転換させるためにも使用
されることができる。但し、他の形質転換方法も、一般に、これらの植物のため
に好まれる。目下、トランスジェニック単子葉植物を作製するために選ばれる方
法は、胚性カルス又は発生胚の微粒子銃（形質転換性ＤＮＡで被覆された微小金
又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281;
Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al.,
1992, Bio/Technology 10: 667-674 ）。単子葉植物の形質転換のための他の方
法は、Dmirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428により
記載されたようなプロトプラスト形質転換に基づくものである。

【０１０４】 形質転換後、その中に発現構築物が取り込まれているところの形質転換体が選
択され、そして本分野において周知の方法に従って全体植物に再生される。 本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって：（ａ）上記ポリペプチ
ドの生産を誘導する条件下、本発明のコリン・オキシダーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物又は植物部分を栽培
し；そして（ｂ）上記ポリペプチドを回収する、を含む前記方法にも関する。

【０１０５】 コリン・オキシダーゼ活性の除去又は低下 本発明は、親細胞の突然変異体細胞の製造方法であって、上記ポリペプチドを
コードする核酸配列又はその制御配列を破壊又は欠失させることを含み、そして
これが同一条件下で培養されるとき上記親細胞よりも低下した上記ポリペプチド
を生産する上記突然変異体細胞をもたらす。前記方法にも関する。

【０１０６】 コリン・オキシダーゼ活性が低下している株の構築は、便利には、細胞内の、
コリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチドの発現のために必要な核酸配列
を修飾又は不活性化することにより達成されることができる。修飾は不活性化さ
れるべき核酸配列は、例えば、コリン・オキシダーゼ活性を示すために不可欠な
、上記ポリペプチド又はその部分をコードする核酸配列であることができ、又は
その核酸配列は、その核酸配列のコーディング配列からの上記ポリペプチドの発
現のために要求される調節機能をもつものであることができる。このような調節
又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわち、上記ポ
リペプチドの発現に影響を及ぼすために十分な部分であることができる。可能な
修飾のための他の制御配列は先に記載したものである。

【０１０７】 上記核酸配列の修飾又は不活性化は、上記細胞を突然変異誘発に供し、そして
コリン・オキシダーゼ産生能が低下している細胞について選択又はスクリーニン
グすることにより行われることができる。特異的又は無作為であることができる
突然変異誘発は、例えば、好適な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により
、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成突然変
異誘発に供することにより、行われることができる。さらに、上記突然変異誘発
は、上記突然変異誘発剤のいずれかの組合せを用いて行われることができる。

【０１０８】 本発明の目的のために好適な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線
（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチル・ヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチル・
メタン・スルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオ
チド・アナログを含む。

【０１０９】 上記のような剤が使用されるとき、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件
下選ばれた突然変異誘発剤の存在下で突然変異されるべき細胞をインキュベート
し、そして低下したコリン・オキシダーゼ活性又は生産を示す細胞について選択
することにより、行われる。 本発明のポリペプチドの生産の修飾又は不活性化は、本ポリペプチドをコード
する核酸配列又はその転写又は翻訳のために要求される調節要素における１以上
のヌクレオチドの導入、置換、又は除去により達成されることができる。例えば
、ヌクレオチドは、終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープン・リー
ディング・フレームの変更をもたらすように、挿入又は除去されることができる
。このような修飾又は不活性化は、本分野において知られた方法に従って、部位
指定突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発により達成されることができる。

【０１１０】 原則として、上記修飾は、インビボにおいて、すなわち、修飾されるべき核酸
配列を発現する細胞に対して直接行われることができるけれども、上記修飾は以
下に例示するようにインビトロにおいて行われることが好ましい。 選ばれた宿主細胞による生産除去し又は低下させるための便利な方法の例は、
遺伝子置換又は遺伝子破壊によるものである。遺伝子破壊方法（ｔｈｅ ｇｅｎ
ｅ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）においては、着目の内因性遺伝
子又は遺伝子断片に対応する核酸配列がインビトロにおいて突然変異誘発されて
、欠陥核酸配列が作られ、これが次に宿主細胞内に形質転換されて、欠陥遺伝子
を作り出す。相同的組換えにより、上記欠陥核酸配列は内因性遺伝子又は遺伝子
断片を置換する。上記欠陥遺伝子又は遺伝子断片も、その中で上記ポリペプチド
をコードする遺伝子が修飾又は破壊されているところの形質転換体の選択のため
に使用されることができるマーカーをコードすることが望ましい。

【０１１１】 あるいは、上記核酸配列の修飾又は不活性化は、上記ポリペプチド・コーディ
ング配列に相補的な核酸配列を用いて確立されたアンチセンス技術により行われ
ることができる。より特に、細胞による上記ポリペプチドの生産は、上記細胞内
で転写され、そして、上記細胞内で生産される上記ポリペプチドのｍＲＮＡにハ
イブリダイズすることができる。上記ポリペプチドをコードする核酸配列に相補
的なヌクレオチド配列に導入することにより、低減され又は排除されることがで
きる。上記相補的アンチセンス・ヌクレオチド配列が上記ポリペプチドｍＲＮＡ
にハイブリダイズすることを許容する条件下、翻訳されたポリペプチドの量は、
こうして低減され又は取り除かれる。

【０１１２】 本発明の方法に従って修飾されるべき細胞は、微生物起源、例えば、上記細胞
に対し相同であるか異種であるかを問わず、所望のタンパク質産物の生産のため
に好適な真菌株に起源をもつことが好ましい。本発明は、さらに、上記ポリペプ
チドをコードする核酸配列又はその制御配列の破壊又は欠失を含む親細胞の突然
変異体細胞であって、その親細胞よりも低い上記ポリペプチドを生産する突然変
異体細胞をもたらすものに関する。

【０１１３】 そのように作出された上記ポリペプチド欠陥突然変異体細胞は、同種及び／又
は異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞として特に有用である。それ故、本
発明は、さらに、同種又は異種ポリペプチドの製造方法であって：（ａ）上記ポ
リペプチドの製造を誘導する条件下で上記突然変異体細胞を培養し；そして（ｂ
）上記ポリペプチドを回収する、を含む方法に関する。用語“異種ポリペプチド
”は、本明細書中、宿主細胞に対して天然（生来）でないポリペプチド、天然配
列を変更するように修飾が行われている非天然タンパク質、又は組換えＤＮＡ技
術による宿主細胞の操作の結果として発現が定量的に変更されている非天然タン
パク質として定義される。

【０１１４】 さらなる、局面においては、本発明は、発酵が完結する前、間、又は後に、発
酵ブロスに、コリン・オキシダーゼ活性を阻害することができる剤の有効量を添
加し、その発酵ブロスから着目の産物を回収し、そして場合により、その回収さ
れた産物をさらなる精製に供することによる、本発明のポリペプチドと着目のタ
ンパク質産物の両者を生産する細胞の発酵により、コリン・オキシダーゼ活性を
本質的に有さないタンパク質産物の製造方法に関する。

【０１１５】 さらなる局面においては、本発明は、上記産物の発現を許容する条件下で上記
細胞を培養し、コリン・オキシダーゼ活性を実質的に低下させるように、得られ
た培養ブロスを併合pH及び温度処理に供し、そして上記培養ブロスから上記産物
を回収することによる、コリン・オキシダーゼ活性を本質的に有さない、タンパ
ク質産物の製造方法に関する。あるいは、上記併合pH及び温度処理は、上記培養
ブロスから回収された酵素調製物に対して行われることができる。上記併合pH及
び温度処理は、場合により、コリン・オキシダーゼ阻害剤との処理による組合せ
において使用されることができる。

【０１１６】 本発明の上記局面に従えば、コリン・オキシダーゼ活性の少なくとも６０％、
好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好
ましくは少なくとも９５％そして最も好ましくは少なくとも９５％が除去される
ことができる。コリン・オキシダーゼ活性の完全な除去も、上記方法の使用によ
り得られることができる。

【０１１７】 上記併合pH及び温度処理は、好ましくは、所望の効果を達成するために十分な
時間期間にわたり、ここで典型的には、３０〜６０分間が十分であるが、６．５
〜７の範囲内のpH及び３５〜７０℃の範囲内の温度において、行われる。 着目の産物の培養及び精製のために使用される方法は、本分野において知られ
た方法により行われることができる。

【０１１８】 本質的にコリン・オキシダーゼを含まない産物を製造するための本発明の方法
は、真核ポリペプチド、特に真菌タンパク質、例えば酵素の製造において特に重
要である。上記酵素は、例えば、デンプン加水分解酵素、脂肪分解酵素タンパク
質分解酵素、セルロース分解酵素、酸化還元分解酵素、又は植物細胞壁分解酵素
から選ばれることができる。このような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミ
ラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、
カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、サイクロデキストリン・グ
リコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラ
クトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース・オ
キシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インベ
ルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノ
シダーゼ、オキシダーゼ、ペクチノリティック酵素、ペルオキシダーゼ、フィタ
ーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解
酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又は
キシラナーゼを含む。コリン・オキシダーゼ欠陥細胞は、医薬として重要な異種
タンパク質、例えば、ホルモン、成長因子、レセプター、などを発現させるため
に使用されることもできる。

【０１１９】 用語“真核ポリペプチド”は、天然ポリペプチドだけでなく、例えば、アミノ
酸置換、欠失又は付加、又は活性、耐熱性、耐pH性を高めるためのこのような他
の修飾により修飾されている酵素の如きポリペプチドをも含むと理解される。 さらなる局面においては、本発明は、本発明の方法により作られる、コリン・
オキシダーゼ活性を本質的に有さないタンパク質産物に関する。

【０１２０】 用途 本発明は、コリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチドの使用方法にも関
する。 本発明のポリペプチドは、コリン、レシチン、コリン・エステラーゼ活性、及
びホスホリパーゼＣ及びＤの活性を計測するための化学発光検出アッセイにおい
て使用されることができる。例えば、Anaokar et al., 1979, Clinical Chemist
ry 25: 103-107; Artiss et al., 1979, Microchemistry Journal 24: 239-258;
Immamura and Horiuti, 1978, Journal of Biochemistry 83: 677-680; 及びOk
abe et al., 1977, Clin.Chim.Acta 80: 87-94を参照のこと。

【０１２１】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、生物、特に植物、例えば、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの寒冷耐性及び塩耐性を高めるために使用されることがで
きる。例えば、Rozwadowski et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 472
-478; Hayashi et al., 1998, Plant, Cell, and Environment 21: 232-239; WO
96/1003; WO 96/29857; 及びWO 97/24026 を参照のこと。

【０１２２】 本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、これは本発明の範囲を限定
するものと解釈されてはならない。 実施例 バッファー及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬グレードの商
業的製品であった。

【０１２３】 実施例１：発酵及び菌糸体組織 フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）ＣＣ１−
３、フザリウム株ＡＴＣＣ ２０３３４の形態学的突然変異体（Wiebe et al.,
1991, Mycol. Research 95: 1284-1288 ）を、炭素源及び酵母エキスとしてＮＵ
ＴＲＩＯＳＥ（商標）（Roquette Freres, S.A., Beinheim, France ）を用いた
供給バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵を使用して２リッターの実験室規模の発
酵槽内で培養した。リン酸アンモニウムを上記フィード中に提供した。pHを６〜
６．５に維持し、そして温度を、溶存酸素をプラスに伴って３０℃に保った。

【０１２４】 菌糸体サンプルを、接種から２，４，６、及び８日後に収獲し、そして液体窒
素中で急速冷凍した。サンプルがＲＮＡ抽出のために破壊されるまで、それらサ
ンプルを−８０℃において保存した。 実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの構築 全細胞ＲＮＡを、Timberlake and Barnard (1981, Cell 26: 29-37) の方法に
従って、実施例１に記載の菌糸体サンプルから抽出し、そしてそのＲＮＡサンプ
ルを、１％ホルムアルデヒド−アガロース・ゲルからのブロッティング後のノー
ザン・ハイブリダイゼーションにより分析した（Davis et al., 1986, Basic Me
thods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New Y
ork ）。ポリアデニル化ｍＲＮＡ画分は、製造者の指示に従ってmRNA Separator
Kit（商標）（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）を用いて全ＲＮ
Ａから単離した。２本鎖ｃＤＮＡを、Gubler and Hoffman (1983, Gene 25: 263
-269 ）に従って約５μｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを用いて合成した。但し、Ｎ
ｏｔＩ−（ｄＴ）１８プライマー（Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway, NJ
）を第１ストランド合成を開始させるために使用した。このｃＤＮＡをヤエナリ
（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（Boehringer Mannheim Corporation, Ind
ianapolis, IN ）で処理し、そして両端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New En
gland Biolabs, Beverly, MA）を用いてブラント化した。

【０１２５】 上記ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化し、アガロース・ゲル電気泳動（約０．７〜
４．５kb）によりサイズ選択し、そしてｐＺＥｒＯ−２．１（Invitrogen Corpo
ration, Carlsbad, CA）であって、ＮｏｔＩプラスＥｃｏＲＶで解裂され、かつ
、ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（Boehringer Mannheim Corporation, India
napolis, IN ）で脱リン酸化されているものとライゲートした。上記ライゲーシ
ョン混合物をコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen Corpora
tion, Carlsbad, CA）を形質転換させるために使用した。形質転換体を、５０μ
ｇ／mlの最終濃度においてカナマイシンを含む２ＹＴ寒天プレート（Miller, 19
92, A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbr
ook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York）上で選択された。

【０１２６】 ２つの独立した方向性ｃＤＮＡライブラリーを、プラスミド・クローニング・
ベクターｐＺＥｒＯ−２．１を用いて構築した。ライブラリーＡを、４日目に収
獲した菌糸体からのｍＲＮＡを用いて行い、そしてライブラリーＢを６日目の時
点からのｍＲＮＡを用いて構築した。ｃＤＮＡライブラリーのいずれも、細胞内
の遺伝子発現プロフィールの対応の“スナップショット”を調べるために、増幅
されなかった。代わりに、上記ライブラリーがプレートされ、力価計測され、そ
して互いに独立したクローンをＤＮＡシークエンシングにより分析した。

【０１２７】 ライブラリーＡ（４日目の細胞）は、約７．５×１０⁴ の独立クローンから成
り、そしてライブラリーＢ（６日目の細胞）は、凡そ１．２×１０⁵ クローンか
ら成っていた。Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡを、各ライブラリー内の４０のコロニ
ーから単離し、そしてｃＤＮＡ挿入物の存在とサイズについてチェックした。こ
の分析においては、ライブラリーＡからの４０コロニー中３９（９７．５％）が
、６００bp〜２２００bpの範囲のサイズ（平均＝１０５０bp）をもつ挿入物を含
んでいた。同様に、ライブラリーＢから拾い上げられた４０コロニー中３９（９
７．５％）が、８００〜３６００bpの範囲のサイズ（平均＝１３８０bp）をもつ
挿入物をもっていた。

【０１２８】 実施例３：テンプレート調製及びヌクレオチド配列決定 実施例２に記載した各ｃＤＮＡライブラリーから、１１９２形質転換体コロニ
ーを、上記形質転換プレートから９６ウェル・マイクロタイター・ディシュであ
って５０μｇ／mlカナマイシンを含む２ＹＴブロス（Miller, 1992、前掲）２０
０μｌを含むものの中に直接拾い上げた。上記プレートを、振とうせずに３７℃
で一夜インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの滅菌５０％グ
リセロールを各ウェルに添加した。上記形質転換体を、各ウェル内に１ml当り５
０μｇのカナマイシンを補ったMagnificent Broth（商標）（Mac Connell Resea
rch, San Diego, CA）１mlを含む、２次深皿９６ウェル・マイクロカルチャー・
プレート（Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersberg, MD ）
内で複製した。１次マイクロタイター・プレートを、−８０℃で冷凍保存した。
２次深皿プレートを、ロータリー・シェーカー上で激しく撹乱しながら（３００
rpm ）一夜３７℃でインキュベートした。こぼれと相互汚染を防止し、そして十
分な通気を許容するために、各２次培養プレートを、ポリプロピレン・パッド（
Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD ）とプラスチ
ックのマイクロタイター・ディッシュのカバーで覆った。

【０１２９】 ＤＮＡを、Utterback et al. (1995, Genome Sci.Technol. 1: 1-8）により修
飾されたようなAdranced Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, M
D ）の９６ウェルのＭｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔプロトコールを用いて各ウェルか
ら単離した。シングル−パスＤＮＡシークエンシングを、染料−ターミネーター
化学（Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60）及び
リバースｌａｃシークエンシング・プライマーを用いてPerkin-Elmer Applied B
iosystems Model 377 XL Automatic DNA Sequencer (Perkin-Elmer Applied Bio
systems, Inc., Foster City, CA）を用いて行った。

【０１３０】 実施例４：ＤＮＡ配列データの分析 ヌクレオチド配列データを、品質に関して精査し、そして２％を超える不適当
なスペーシング又はあいまいさのレベルを与えるサンプルを捨て又は再分析した
。ベクター配列を、ＦＡＣＴＵＲＡ（商標）ソフトウェア（Perkin-Elmer Appli
ed Biosystems, Inc., Foster City, CA）の助けを借りて手作業でトリミングし
た。さらに、配列を、あいまいな塩基のコールの数が増大したとき、各サンプル
の末端において切断した。全ての配列を、互いに比較して、Ａｕｔｏ Ａｓｓｅ
ｍｂｌｅｒ（商標）ソフトウェア（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., F
oster City, CA）を用いた重複度を決定した。最後に、全ての配列を３つのフレ
ーム内で翻訳し、そして７０の域値等級をもつＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス
を用いた修飾Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いたＧｅｎｅ Ａ
ｓｓｉｓｔ（商標）ソフトウェア（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., F
oster City, CA）を用いて非冗長データ・ベース（ＮＲＤＢ）に対してサーチし
た。ＮＲＤＢを、Ｇｅｎｐｅｐｔ，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＰＩＲデータベ
ースからアセンブルした。

【０１３１】 実施例５：コリン・オキシダーゼｃＤＮＡクローンの同定 １の推定コリン・オキシダーゼ・クローンを、製造者の指示に従ってApplied
Biosystems Model 377 XL 自動化ＤＮＡシーケンサーを用いてランダムｃＤＮＡ
クローンを部分的に配列決定し、そしてアルスロバクター・グロビフォルミス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）のコリン・オキシダーゼ
（ＴＲＥＭＢＬ ５９１１７）のアミノ酸配列に対して上記演繹アミノ酸を比較
することにより、同定した。このクローンは、アルスロバクター・グロビフォル
ミスのコリン・オキシダーゼ・アミノ酸配列に対するそのアラインメントに基づ
き完全長であると推定された。ｐＦＤ０８０８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＦＤ０８０
８と命名された上記クローンが、ヌクレオチド配列分析のために選択された。

【０１３２】 実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＤ０８０８からのフザリウム・ベネナタムのコリ
ン・オキシダーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列決定及び特徴付け ＤＮＡ配列決定を、染料−ターミネーター化学（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてApplied Biosystems Model 377 XL Automate
d DNA Sequencer を用いて行った。連続配列を、トランスポゾン挿入戦略を用い
て作製した（Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosys
tems, Inc., Foster City, CA ）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＤ０８０８からのコリン・
オキシダーゼ・クローンを、６．７の平均冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）まで
配列決定した。

【０１３３】 上記コリン・オキシダーゼ・クローンは、６０，０５７の分子量をもつ５４３
アミノ酸から成るポリペプチドをコードする１６２９bpのオープン・リーディン
グ・フレームをコードしていた。このヌクレオチド配列（配列番号１）と演繹ア
ミノ酸配列（配列番号２）を図１に示す。Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラム（Nielse
n et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6 ）を用いることによっては、シ
グナル・ペプチドは推定されなかった。

【０１３４】 コリン・オキシダーゼ配列の比較アラインメントを、同一性表と以下の多数ア
ラインメント・パラメーター：１０のギャップ・ペナルティー及び１０のギャッ
プ長ペナルティーを用いたＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標
）ソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いてＣｌｕｓｔａｌ法（Hi
ggins, 1989, CABIOS 5: 151-153）を用いて企てた。対毎のアラインメント・パ
ラメーターはＫｔｕｐｌｅ＝１、ギャップ・ペナルティー＝３、ウィンドウズ＝
５、及びダイアゴナルズ＝５であった。

【０１３５】 上記比較アラインメントは、フザリウム・ベネナタムのコリン・オキシダーゼ
がアルスロバクター・グロビフォルミス（ＴＲＥＭＢＬ ５９１１７）からのコ
リン・オキシダーゼと２８．２％の同一性を共有し、そしてリゾビウム・メリロ
チ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＥＭＢＬ Ｕ３９９４０）から
のコリン・デヒドロゲナーゼと２３．９％の同一性を共有することを示した。上
記フザリウム・ベネナタムのコリン・オキシダーゼ内には３つの潜在的なＮ−結
合グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が存在し、そしてその中の
１は、上記推定されたタンパク質のアラインメントに基づきアルスロバクター・
グロビフォルミスのコリン・オキシダーゼ内で保存されている。

【０１３６】 生物学的材料の寄託 以下の生物学的材料を、ブダペスト条約の条件下、the Agricultural Researc
h Service Patent Culture Collection, Northarn Regionol Research Center,
1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604に寄託され、そして以下の
受託番号を与えられている： 寄託物 受託番号 寄託日 E. coli TOP10 (pFD0808) NRRL B-30066 1998年10月27日 上記株は、上記培養物へのアクセスが、３７ＣＦＲセクション１．１４及び３
５ＵＳＣセクション１２２の下に米国特許商標長長官により資格を付与すべきと
決定された特許出願の係属中、可能であるということを保証する条件下で、寄託
されている。上記寄託物は、上記寄託株の実質的に純粋な培養物を表す。上記寄
託物は、上記出願の対応出願又はその分割継続出願が出願されている国の外国特
許法により要求されるとき、入手されることができる。しかしながら、寄託物の
入手可能性は、行政作用により付与される特許権の効力を制限することにおける
、本発明を実施するライセンスを構成するものではない。

【０１３７】 本明細書中に記載し、かつ、請求する発明は、本明細書中に開示された特定の
態様により範囲が限定されるべきではない。なぜならそれらの態様は本発明のい
くつかの局面の説明であると意図されるからである。いずれかの均等な態様が本
発明の範囲内にあると意図される。実際、本明細書中に示され、そして記載され
たものに加えて、本発明のさまざまな修飾が、以上の記載から当業者にとって明
らかになるであろう。このような修飾も、添付の請求の範囲内にあると意図され
る。矛盾する場合、定義を含む本発明の開示が参酌されるであろう。

【０１３８】 さまざまな参考文献を本明細書中に引用するが、その開示をそれらの全体とし
て援用する。

【０１３９】

【表１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａはフザリウム・ベネナタムのコリン・オキシダーゼのｃＤＮＡ配列（配
列番号１）を示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、フザリウム・ベネナタムのコリン・オキシダーゼの演繹アミノ酸配
列（配列番号２）を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月２０日（２００１．６．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，Ｈ Ｒ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 レイ，マイケル ダブリュ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616， デイビス，ロビン プレイス 605 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 CA03 CA06 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 CC04 DD03 LL01 4B065 AA16X AA57X AA65Y AA72X AA87X AB01 BA02 CA28 CA44

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも６５％の同一性を有する
   アミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｂ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１の
   ヌクレオチド４９〜１６７７を含むゲノムＤＮＡ、（iii ）少なくとも１００ヌ
   クレオチドから成る（ｉ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、
   又は（iii ）の相補鎖、と、低ストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズする
   核酸配列によりコードされるポリペプチド； （ｃ）１以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号２の
   アミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体； （ｄ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び （ｅ）コリン・オキシダーゼ活性を有する、（ａ），（ｂ）、又は（ｄ）の断
   片、 から成る群から選ばれる、コリン・オキシダーゼ活性を有する単離ポリペプチド
   。
2. 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも６５％の同一
   性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも７０％の同一
   性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも８０％の同一
   性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも９０％の同一
   性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３と少なくとも９５％の同一
   性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか
   １項に記載のポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号２のアミノ酸配列又はその断片から成る、請求項１
   〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号２のアミノ酸配列から成る、請求項８に記載のポリ
   ペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸１〜５４３から成る、請求項９に記
    載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 低ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ）又は
    （ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と、ハイ
    ブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 低ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、又は（iii ）（ｉ）、又は（ii）の相補鎖と、ハイブリダイ
    ズする核酸配列によりコードされる、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 中ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ）又は
    （ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と、ハイ
    ブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
14. 【請求項１４】 中ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、又は（iii ）（ｉ）、又は（ii）の相補鎖と、ハイブリダイ
    ズする核酸配列によりコードされる、請求項１３に記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 高ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ）又は
    （ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と、ハイ
    ブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 高ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１のヌクレ
    オチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７を含む
    ゲノムＤＮＡ配列、又は（iii ）（ｉ）、又は（ii）の相補鎖と、ハイブリダイ
    ズする核酸配列によりコードされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、１以上のアミノ酸の置換、欠失、及
    び／又は挿入を含む、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体
    である、請求項１に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３００６６内に含まれるプ
    ラスミドｐＦＤ０８０８内に含まれる核酸配列によりコードされる、請求項１に
    記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 配列番号２のコリン・オキシダーゼ活性の少なくとも２０
    ％を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドと同
    じコリン・オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
21. 【請求項２１】 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコ
    ードする核酸配列を含む単離核酸配列。
22. 【請求項２２】 配列番号１の成熟ポリペプチド・コーディング配列内に少
    なくとも１の突然変異をもつ核酸配列を含む単離核酸配列であって、この突然変
    異体核酸配列が配列番号２のアミノ酸１〜５４３から成るポリペプチドをコード
    する、前記単離核酸配列。
23. 【請求項２３】 （ａ）低ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１の
    ヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７
    を含むゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ
    ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と
    ハイブリダイズさせ、そして（ｂ）その核酸配列を単離することにより、製造さ
    れる単離核酸配列。
24. 【請求項２４】 （ａ）中ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１の
    ヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７
    を含むゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ
    ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と
    、ハイブリダイズさせ、そして（ｂ）その核酸配列を単離することにより、製造
    される、請求項２３に記載の単離核酸配列。
25. 【請求項２５】 （ａ）高ストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１の
    ヌクレオチド４９〜１６７７、（ii）配列番号１のヌクレオチド４９〜１６７７
    を含むゲノムＤＮＡ配列、（iii ）少なくとも１００ヌクレオチドから成る（ｉ
    ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii ）の相補鎖と
    、ハイブリダイズさせ、そして（ｂ）その核酸配列を単離することにより、製造
    される、請求項２４に記載の単離核酸配列。
26. 【請求項２６】 好適な発現宿主内で前記ポリペプチドの産生を指令する１
    以上の制御配列に作用可能な状態で連結された請求項２１の核酸配列を含む核酸
    構築物。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の核酸構築物を含む組換え発現ベクター
    。
28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の核酸構築物を含む組換え宿主細胞。
29. 【請求項２９】 （ａ）配列番号１の成熟ポリペプチド・コーディング配列
    内に少なくとも１の突然変異を導入し、ここでその突然変異体核酸配列は配列番
    号２のアミノ酸１〜５４３から成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）上記
    突然変異体核酸配列を回収する、を含む、突然変異体核酸配列の製造方法。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法により製造された突然変異体核酸
    配列。
31. 【請求項３１】 （ａ）前記ポリペプチドをコードする請求項３０に記載の
    突然変異体核酸配列を含む株を培養して、前記ポリペプチドを含む上清を製造し
    ；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含む、ポリペプチドの製造方法
    。
32. 【請求項３２】 （ａ）１の株を培養して前記ポリペプチドを含む上清を製
    造し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含む、請求項１〜２０のい
    ずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
33. 【請求項３３】 （ａ）前記ポリペプチドの製造のために好適な条件下、前
    記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む宿主細胞を培養し
    ；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含む、請求項１〜２０のいずれ
    か１項に記載のポリペプチドの製造方法。
34. 【請求項３４】 （ａ）前記ポリペプチドの製造を誘導する条件下、宿主細
    胞を培養し、ここでこの宿主細胞は、配列番号１の前記成熟ポリペプチド・コー
    ディング配列内に少なくとも１の突然変異をもつ突然変異体核酸配列を含み、こ
    こでこの突然変異体核酸配列は、配列番号２のアミノ酸１〜５４３から成るポリ
    ペプチドをコードし；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含む、ポリ
    ペプチドの製造方法。
35. 【請求項３５】 （ａ）前記ポリペプチドの製造を誘導する条件下、前記ポ
    リペプチドをコードする内因性核酸配列の第２エクソンに作用可能な状態で連結
    された、調節配列、エクソン、及び／又はスプライス・ドナー部位を含む新たな
    転写ユニットをその内部に取り込んで有する相同的組換え細胞を培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に
    記載のポリペプチドの製造方法。
36. 【請求項３６】 細胞の突然変異体の製造方法であって、請求項１〜２０の
    いずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列又はその制御配列を破
    壊又は欠失することを含み、上記細胞よりも少ない前記ポリペプチドを産生する
    突然変異体をもたらす、前記製造方法。
37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の方法により製造された突然変異体。
38. 【請求項３８】 異種タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求
    項３７に記載の突然変異体。
39. 【請求項３９】 （ａ）前記ポリペプチドの製造を誘導する条件下、請求項
    ３８に記載の突然変異体を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、
    を含む、異種タンパク質の製造方法。