JP2003511679A - Lipid bilayer array and methods of making and using same - Google Patents

Lipid bilayer array and methods of making and using same

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Abstract

(57)【要約】 基体上で別個の分離した脂質二重層領域のアレイを形成する方法が開示されている。これらの方法は、基体上での自己制御式拡散を利用する。また、これらの方法により形成されたアレイおよびこれらのアレイの使用も、開示されている。本発明は、１局面では、基体上に分離脂質領域のパターンを形成する方法を包含する。この方法は、基体の平面部分を覆って、脂質二重層拡張部を形成する工程を包含し、この拡張部は、下部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれている。 Abstract: A method for forming an array of discrete, discrete lipid bilayer regions on a substrate is disclosed. These methods utilize self-controlled diffusion over the substrate. Also disclosed are arrays formed by these methods and the use of these arrays. The present invention, in one aspect, includes a method of forming a pattern of separated lipid regions on a substrate. The method includes forming a lipid bilayer extension over a planar portion of the substrate, the extension being sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 本願は、一部は、ＮＳＦ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍからの助成
金で援助され、また、授与されたＤＭＲ−９８０８６７７の下で、ＮＳＦのＭＲ
ＳＥＣ Ｐｒｏｇｒａｍで援助されている。従って、米国政府は、本発明につい
て、一定の権利を有する。本発明は、国立科学財団により授与された契約ＤＭＲ
−９８０８６７７、ＤＣＢ−９８０７５５９の下で、政府の援助によりなされた
。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。This application is partly supported by a grant from the NSF Biophysics Program and also under the award of DMR-9808677 to the NSF MR.
Assisted by the SEC Program. Accordingly, the U.S. Government has certain rights in this invention. This invention is a contract DMR awarded by the National Science Foundation.
-9808677, DCB-9807559, with government support. The government has certain rights in the invention.

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、基体上の分離したまたは別個の脂質二重層領域のアレイに関し、そ
してこのようなアレイを製造し使用する方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to arrays of discrete or discrete lipid bilayer regions on a substrate and to methods of making and using such arrays.

【０００３】 （参考文献）[0003]   (References)

【０００４】[0004]

【表１】 （発明の背景） 表面を機能的にしかつパターン化する性能は、広く関心がもたれている。固体
支持体上の脂質二重層は、二次元流動性であるので、特に難題である。二重層は
、ガラス支持体上で組み立てるとき、水の薄層（５〜２０Å）で緩衝され、その
結果、両方の小葉部分は、生体膜の必須機能である流動性を保持する。その結果
、これらの成分は、絶えず混ざり、その全面に自由に拡散する。このような支持
膜は、天然細胞膜の物理的特性の多くを保持し、必須成分が存在している場合、
生細胞と相互作用できる。それゆえ、流体支持した脂質二重層の機能化およびパ
ターン化は、膜生物物理学の基本研究用の分離を達成するために、そして硬い表
面と生細胞との間で界面を作成するために、バイオセンサを製作する際に適用さ
れる。[Table 1] BACKGROUND OF THE INVENTION The ability to functionalize and pattern surfaces is of wide interest. Lipid bilayers on solid supports are a particular challenge as they are two-dimensional fluid. When assembled on a glass support, the bilayer is buffered with a thin layer of water (5-20 Å) so that both leaflet sections retain the fluidity which is an essential function of the biological membrane. As a result, these components are constantly mixed and freely spread throughout the surface. Such supporting membranes retain many of the physical properties of natural cell membranes, and when essential components are present,
Can interact with living cells. Therefore, the functionalization and patterning of fluid-supported lipid bilayers was performed to achieve separation for basic studies of membrane biophysics and to create an interface between a hard surface and living cells. It is applied when manufacturing biosensors.

【０００５】 本発明者の１人は、以前に、平坦基体表面で支持した二重層の別個の領域を分
割する方法を報告した。以前に報告した１方法では、支持した二重層拡張部は、
先に組み立てた連続二重層の表面を引っ掻くことにより、分割される。これらの
引っ掻き部は、組織分布的な相互作用と摩擦学的な相互作用とを組み合わせるこ
とにより、側方拡散に対する障壁として機能する。第二の方法は、この膜を組み
立てる前に、光線または電子線の食刻を使用して、この固体支持体の特性をパタ
ーン化する工程を包含する。パターン化した材料の化学組成に依存して、脂質は
、パターン化領域で集まらないか、または集まるが不動となるかのいずれかとな
る。One of the inventors has previously reported a method of splitting discrete regions of a bilayer supported on a flat substrate surface. In one previously reported method, the supported bilayer extension was
It is split by scratching the surface of the previously assembled continuous bilayer. These scratches function as barriers to lateral diffusion by combining topographical and tribological interactions. The second method involves using light or electron beam etching to pattern the properties of the solid support prior to assembling the membrane. Depending on the chemical composition of the patterned material, the lipid will either not collect at the patterned regions or collect but become immobile.

【０００６】 いずれかの場合、そのパターン化効果は、囲いに入れた（ｃｏｒｒａｌｌｅｄ
）領域に対する拡散混合を制限することにある。引っ掻くことは、簡単な適用方
法であるが、うまく制御できないか、または完全には理解できない。表面パター
ン化には、その表面に第二材料を塗布する必要があり、使用する材料と脂質との
相互作用は、十分には理解されていない。両方の場合、このガラス支持体は、化
学的および／または物理的に変性させなければならない。In either case, the patterning effect is corralled.
) To limit the diffusive mixing for a region. Scratching is a simple application method, but it is not well controlled or incompletely understood. Surface patterning requires the application of a second material to the surface and the interaction of the material used with the lipid is not well understood. In both cases, the glass support must be chemically and / or physically modified.

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、１局面では、基体上に分離脂質領域のパターンを形成する方法を包
含する。この方法は、基体の平面部分を覆って、脂質二重層拡張部を形成する工
程を包含し、この拡張部は、下部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれ
ている。この二重層拡張部には、表面突出部のエンボスパターンを有するブロッ
タが、塗布され、基体上の脂質二重層拡張部の領域を、このブロッタ接触表面へ
移動させる役割を果たす。この突出部は、（ｉ）その上での脂質二重層の形成を
支持できる接触面を有し、そして（ｉｉ）このような接触面で結合された分離領
域を形成する。このブロッタを除去したとき、このブロッタ突出部により形成さ
れたこの分離領域に対応している分離脂質領域のパターンが残る。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention, in one aspect, includes a method of forming a pattern of discrete lipid regions on a substrate. The method involves covering a planar portion of a substrate to form a lipid bilayer extension, which extension is sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase. A blotter having an embossed pattern of surface protrusions is applied to this bilayer extension and serves to move the area of the lipid bilayer extension on the substrate to this blotter contact surface. The protrusion has (i) a contact surface capable of supporting the formation of a lipid bilayer thereon, and (ii) forming a separation region bound by such contact surface. When the blotter is removed, the pattern of separated lipid regions corresponding to the separated regions formed by the blotter protrusions remains.

【０００８】 他の局面では、この脂質二重層の一部が移動されるブロッタは、水性媒体で覆
われた平面基体を打ち抜くのに使用され、それにより、この基体表面に、このブ
ロッタにある表面突出部のパターンに対応している脂質二重層領域のパターンを
置く。[0008] In another aspect, a blotter to which a portion of the lipid bilayer is transferred is used to punch a planar substrate covered with an aqueous medium, thereby allowing the substrate surface to surface to the surface of the blotter. Place a pattern of lipid bilayer regions that corresponds to the pattern of protrusions.

【０００９】 両方の方法では、第一基体は、水性フィルムを覆う脂質二重層の形成に適当な
材料（例えば、ＳｉＯ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2およびマイカ）から形成される。こ
のブロッタは、脂質二重層を持ち上げることができる材料（例えば、ポリジメチ
ルシロキサン（ＰＤＭＳ）または表面酸化ＰＤＭＳ）から形成される。In both methods, the first substrate is formed from materials suitable for forming a lipid bilayer overlying an aqueous film (eg, SiO 2 , MgF 2 , CaF 2 and mica). The blotter is formed from a material that can lift lipid bilayers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or surface-oxidized PDMS.

【００１０】 関連した局面では、この脂質二重層の一部が移動されるブロッタは、印刷媒体
を打ち抜くのに使用され、それにより、この脂質二重層パターンは、この印刷媒
体に移動される。この媒体は、さらに、現像されて、着色パターンを生じ得、こ
の場所にこの脂質が沈着された。In a related aspect, a blotter to which a portion of the lipid bilayer is transferred is used to punch a print medium, whereby the lipid bilayer pattern is transferred to the print medium. The medium can be further developed to produce a colored pattern, where the lipid was deposited.

【００１１】 表面パターン化装置も開示されており、これは、平面を有する基体から構成さ
れ、この表面で形成され、脂質二重層領域のパターンは、下部水性フィルムと上
バルク水相との間に挟まれている。この脂質領域は、この基体表面上のこの領域
間に物理的障壁なしで、自己制御式の側方拡散により、互いから安定に分離され
る。A surface patterning device is also disclosed, which is composed of a substrate having a flat surface and formed on this surface, wherein the pattern of lipid bilayer regions is between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase. It is sandwiched. The lipid regions are stably separated from each other by self-regulating lateral diffusion without physical barriers between the regions on the substrate surface.

【００１２】 この基体は、水性フィルムを覆って脂質二重層領域を支持する適当な材料（例
えば、ＳｉＯ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2およびマイカ）から形成される。The substrate is formed of a suitable material (eg, SiO 2 , MgF 2 , CaF 2 and mica) that covers the aqueous film and supports the lipid bilayer region.

【００１３】 この脂質二重層は、一重層または二重層形成脂質（例えば、ホスファチジルコ
リン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびスフィ
ンゴミエリン）、および必要に応じて、二重層適合性脂質（例えば、ステロール
および脂肪酸）から形成される。この装置は、１０3個またはそれ以上の別個の
二重層適合性表面領域を含む得、この領域は、１μｍと約１０μｍの間の距離だ
け、互いから分離され得る。The lipid bilayer is a monolayer or bilayer forming lipid (eg, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and sphingomyelin), and optionally a bilayer compatible. Formed from natural lipids such as sterols and fatty acids. The device may include 10 3 or more distinct bilayer compatible surface regions, which regions may be separated from each other by a distance of between 1 μm and about 10 μm.

【００１４】 この装置は、１以上の分析物と１以上の選択脂質二重層固着生体分子との間の
結合事象を検出する際に使用するように設計され得る。代表的な生体分子には、
膜貫通レセプタまたはイオンチャンネルがある。この生体分子がポリヌクレオチ
ドを含む場合、この領域は、別個の領域のアレイの形状であり、各々が、異なる
領域で、異なるポリヌクレオチドを運ぶ。The device can be designed for use in detecting binding events between one or more analytes and one or more selected lipid bilayer anchored biomolecules. Typical biomolecules include
There are transmembrane receptors or ion channels. If the biomolecule comprises a polynucleotide, this region is in the form of an array of discrete regions, each carrying a different polynucleotide in a different region.

【００１５】 また、本発明の形成部分は、１以上の分析物と１以上の選択脂質二重層固着生
体分子との間の結合事象を検出する際に使用する方法である。この方法は、この
ような分析物を含有する混合物と上記タイプの表面検出器アレイ装置とを接触す
る工程、およびこの選択配位子とそれを特異的に結合するレセプタとの結合を検
出する工程を包含する。The forming moiety of the invention is also a method used in detecting a binding event between one or more analytes and one or more selected lipid bilayer anchored biomolecules. This method comprises the steps of contacting a mixture containing such an analyte with a surface detector array device of the type described above, and detecting the binding of this selective ligand with a receptor that specifically binds it. Includes.

【００１６】 さらに別の局面では、本発明は、基体の表面上で選択パターンを生じる微細加
工方法を包含する。この方法は、このような基体の平面部分を覆って、脂質二重
層領域のパターンを形成する工程を包含し、この脂質二重層領域は、下部水性フ
ィルムと上部バルク水相との間に挟まれる。この脂質二重層領域のパターンは、
この選択パターンに対応しており、そしてこの脂質二重層領域は、この基体表面
上のこの領域間に物理的障壁なしで、自己制御式の側方拡散により、互いから安
定に分離される。一旦、この基体上で、この脂質二重層領域のパターンが形成さ
れると、この基体は、さらに処理されて、所望選択パターンを達成する。In yet another aspect, the invention includes a microfabrication method that produces a selected pattern on the surface of a substrate. The method involves covering a planar portion of such a substrate to form a pattern of lipid bilayer regions, the lipid bilayer regions being sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase. . The pattern of this lipid bilayer region is
Corresponding to this selection pattern, the lipid bilayer regions are stably separated from each other by self-regulating lateral diffusion without physical barriers between the regions on the substrate surface. Once the pattern of lipid bilayer regions is formed on the substrate, the substrate is further processed to achieve the desired selected pattern.

【００１７】 別の局面では、本発明は、上記タイプのブロッタの同一平面上で脂質二重層表
面領域を形成する工程、およびこの脂質領域を障壁で分離された二重層適合性基
体領域を有する基体に移動することにより、基体上で分離脂質領域のアレイを形
成する方法を包含する。この移動は、この分離領域を脂質二重層で基質領域を部
分的に満たすのに有効である。次いで、この基体領域に、追加二重層形成脂質が
添加されて、各基体表面領域を脂質二重層で満たす。In another aspect, the invention provides a step of forming a coplanar lipid bilayer surface region of a blotter of the type described above, and a substrate having a bilayer compatible substrate region separated by a barrier between the lipid regions. To form an array of discrete lipid regions on the substrate by moving to. This migration is effective in partially filling the separation region with the lipid bilayer in the substrate region. Additional bilayer-forming lipids are then added to this substrate region to fill each substrate surface region with a lipid bilayer.

【００１８】 本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、添付の図面と関連して以下の
詳細な説明を読むと、さらに十分に明らかとなる。These and other objects and features of the present invention will become more fully apparent when the following detailed description is read in conjunction with the accompanying drawings.

【００１９】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 以下の用語は、他に指示がなければ、下記の意味を有する。[0019]   (Detailed Description of the Invention)   (I. Definition)   The following terms have the following meanings unless otherwise indicated.

【００２０】 「水性」との用語は、脂質に有害ではない水ベースの液体媒体を意味する。[0020]   The term "aqueous" means a water-based liquid medium that is not harmful to lipids.

【００２１】 「水性薄膜」との用語は、基体表面と脂質二重層領域との間にある水性媒体の
フィルムであって、典型的には、５〜２０オングストローム、好ましくは、約１
０オングストロームである。The term “aqueous thin film” is a film of an aqueous medium between the substrate surface and the lipid bilayer region, typically 5-20 angstroms, preferably about 1 Å.
It is 0 angstrom.

【００２２】 「バルク水相」との用語は、水性媒体の層であって、基体上の脂質二重層領域
を覆っており、分離脂質二重層領域間の側方空間へと伸長している層を意味する
。The term “bulk aqueous phase” is a layer of an aqueous medium that covers the lipid bilayer regions on a substrate and extends into the lateral space between the separated lipid bilayer regions. Means

【００２３】 脂質二重層の表面「拡張部」とは、基体の表面の脂質二重層フィルムの実質的
に遮断されていない平面拡張部を意味する。「拡張部」は、本発明に従って、複
数の分離脂質二重層「領域」に分割される。By surface “extension” of the lipid bilayer is meant a substantially unobstructed planar extension of the lipid bilayer film on the surface of the substrate. The "extension" is divided according to the invention into a plurality of discrete lipid bilayer "regions".

【００２４】 「レセプタ」とは、配位子または分析物分子と特異的に相互作用できる高分子
である。細胞では、レセプタは、典型的には、脂質二重層膜（例えば、細胞外ゴ
ルジまたは核膜）と会合している。インビトロで脂質の拡張部に取り込むための
レセプタ（例えば、支持二重層）は、組換え発現した細胞から精製されるか、ま
たは小レセプタの場合、化学的に合成されるか、いずれかであり得る。A “receptor” is a macromolecule capable of specifically interacting with a ligand or analyte molecule. In cells, receptors are typically associated with lipid bilayer membranes, such as extracellular Golgi or nuclear membranes. Receptors (eg, supporting bilayers) for incorporation into lipid extensions in vitro can either be purified from recombinantly expressed cells or, in the case of small receptors, chemically synthesized. .

【００２５】 「配位子」または「分析物」は、レセプタに特異的に結合できる分子である。
この配位子のレセプタへの結合は、典型的には、高い結合親和性（すなわち、Ｋ
ｍ＞１０5）により特徴付けられ、そしてレセプタ機能の変化（例えば、このレ
セプタまたはその一部と会合したイオンチャンネルの開放）として、またはレセ
プタの直接的な環境変化（例えば、表面プラスモン共鳴による結合の検出）とし
て、いずれかで検出できる。インビボで脂質の拡張部に取り込むための配位子（
例えば、支持二重層）は、組換え発現した細胞から精製されるか、または小レセ
プタの場合、化学的に合成されるか、いずれかであり得る。A “ligand” or “analyte” is a molecule capable of specifically binding to a receptor.
Binding of this ligand to the receptor typically results in a high binding affinity (ie, K
m> 10 5 ) and as a change in receptor function (eg, opening of ion channels associated with this receptor or a part thereof) or by a direct environmental change of the receptor (eg, by surface plasmon resonance). Detection of binding). Ligands for incorporation into lipid extensions in vivo (
For example, the supporting bilayer) can either be purified from recombinantly expressed cells or, in the case of small receptors, chemically synthesized.

【００２６】 結合は、あるタンパク質が別のタンパク質に「非特異的に」固着することから
生じるよりもむしろレセプタ上の結合部位と配位子との間の分子相互作用から生
じるなら、「特異的」である。この配位子が可逆様式でレセプタに結合する場合
、結合の特異性は、既知方法に従って、標識した配位子と過剰の未標識配位子と
を競争させることにより、確認できる。非特異的な相互作用は、この配位子また
はレセプタのいずれかに対して結合部位を有しない過剰なタンパク質（例えば、
ＢＳＡ）を含ませることにより、最小にできる。Binding is “specific if it results from the molecular interaction between the binding site on the receptor and the ligand, rather than from one protein sticking to another protein“ nonspecifically ”. It is. If this ligand binds to the receptor in a reversible manner, the specificity of the binding can be confirmed by competing the labeled and excess unlabeled ligand according to known methods. Non-specific interactions result in excess protein (eg, with no binding site for this ligand or receptor).
It can be minimized by including BSA).

【００２７】 （ＩＩ．表面パターン化装置） 本発明は、脂質二重層が基体表面で安定な自己制御式単一層を形成でき、事実
上、その側方拡散によって、分離脂質二重層領域のサイズを制限するという本明
細書中の発見を利用する。膜形成脂質は、基体表面に塗布するとき、疎水性相互
作用、界面張力および分子間反発相互作用の均衡の結果として、二重層に組み立
てることができる；平面二重層と酸化物支持体との間の相互作用には、ファンデ
ルワールス力、静電気力、水和力および立体力（ｓｔｅｒｉｃ ｆｏｒｃｅ）の
均衡が関与している。これらの力の均衡の結果として、支持脂質二重層は、その
表面の限られた範囲にわたってのみ拡張できるにすぎない。側方拡張は、ｐＨに
依存している；高いｐＨは、拡張を阻止するのに対して、低いｐＨでは、拡張は
、初期には、極めて迅速であるが、次いで、数分のうちに、緩慢となる。このｐ
Ｈ効果は、この基体（例えば、ガラス面および界面で生じた水構造体）のプロト
ン化状態に関連がありそうである。II. Surface Patterning Device The present invention allows the lipid bilayer to form a stable, self-regulating monolayer on the surface of the substrate, effectively by lateral diffusion thereof to determine the size of the discrete lipid bilayer region. Take advantage of the finding herein of limiting. Membrane-forming lipids, when applied to a substrate surface, can assemble into bilayers as a result of the balance of hydrophobic interactions, interfacial tensions and intermolecular repulsive interactions; between planar bilayers and oxide supports. Is involved in the van der Waals force, electrostatic force, hydration force, and steric force balance. As a result of these force balances, the supporting lipid bilayer can only extend over a limited area of its surface. Lateral expansion is pH-dependent; high pH blocks expansion, whereas at low pH expansion is initially very rapid, but then within minutes. Be slow. This p
The H effect is likely to be related to the protonated state of this substrate (eg, water structures created at glass surfaces and interfaces).

【００２８】 拡張部は、最終的には、これらの脂質が互いとの相互作用を失うので、自己制
御式である。１局面では、本発明は、パターン化高分子打ち抜き加工（ｐｏｌｙ
ｍｅｒ ｓｔａｍｐ）を使用して二重層材料を徐々に取り除くことにより、この
自己制御式側方拡張部を利用する。一旦、材料が除去されると、残っている支持
膜は、側方に拡張するが、この拡張部は、停止して、事実上、支柱なしで立つよ
うになるが、これは、二重層材料の安定な流体領域に結合される。珍しいことに
、除去した材料を新たな表面に移動して、それにより、流体二重層を任意の所望
パターンで打ち抜くことも可能であることもまた判明している。The extension is ultimately self-regulating as these lipids lose their interaction with each other. In one aspect, the invention features a patterned polymer stamping (poly).
This self-regulating lateral extension is utilized by gradually removing the bilayer material using a mer stamp). Once the material is removed, the remaining support membrane expands laterally, but this expansion stops and stands virtually without struts, which is a double layer material. Bound to the stable fluid region of. It has also been found that, unusually, it is also possible to transfer the removed material to a new surface, thereby punching the fluid bilayer in any desired pattern.

【００２９】 図１は、本発明に従って構成した表面パターン化装置２０の一部の透視図であ
る。この装置は、基体２２から製作され、その表面２４は、酸化ケイ素または溶
融シリカウエハのような材料から形成される。この基体の代表的な寸法は、典型
的には、１側面あたり約０．５ｃｍ〜約５ｃｍの間であり、約０．１ｍｍ〜約１
ｃｍの厚さである。FIG. 1 is a perspective view of a portion of a surface patterning device 20 constructed in accordance with the present invention. The device is made from a substrate 22, the surface 24 of which is formed from a material such as silicon oxide or a fused silica wafer. Typical dimensions of this substrate are typically between about 0.5 cm and about 5 cm per side, about 0.1 mm to about 1 cm.
The thickness is cm.

【００３０】 この基体表面には、複数の分離脂質二重層領域（例えば、領域２６、２８）が
備えられ、これらは、チャンネル（例えば、チャンネル３０）で分離されている
。これらの分離領域は、互いから完全に分離され得る（例えば、チャンネルを分
離することにより、完全に取り囲まれ得る）か、隣接領域は、脂質二重層「ブリ
ッジ」で接合され得、これらは、接合領域間で脂質を拡散させ得るが、このブリ
ッジを構成する脂質の自己制御式拡散によって、安定に形成される。The substrate surface is provided with a plurality of separated lipid bilayer regions (eg, regions 26, 28), which are separated by channels (eg, channels 30). These separation regions can be completely separated from each other (eg, can be completely surrounded by separating channels) or adjacent regions can be joined in a lipid bilayer "bridge". Lipids can diffuse between regions but are stably formed by the self-regulating diffusion of the lipids that make up this bridge.

【００３１】 各脂質二重層領域と基体表面の基底領域との間には、水性フィルム３２が差し
挟まれ、これは、約５Åと２０Åの間（典型的には、約１０Å）の厚さである。
選択表面の「二重層適合性」の程度は、その形状よりもむしろその固有の材料特
性の関数である。脂質二重層と基体との間の相互作用には、静電気力および水和
力、ならびに長距離ファンデルワールス力に由来の引力寄与が関与している。こ
れらの力は、単一の脂質二重層を安定化するように、この二重層領域を表面に安
定に固着するように、これらの領域が基体表面で側方に移動するのを防止するよ
うに、作用する。適当な二重層適合性表面では、エネルギー最小値は、約５Åと
２０Åの間（典型的には、約１０Å）で、その支持表面から、この二重層膜を捕
捉するが、これは、対応する厚さの水性フィルムにより、この支持表面から分離
される。バルク水相３４が、この脂質二重層およびこれらの領域を分離するチャ
ンネルを覆っている。An aqueous film 32 is sandwiched between each lipid bilayer region and the base region of the substrate surface, which has a thickness of between about 5Å and 20Å (typically about 10Å). is there.
The degree of "double layer compatibility" of the selected surface is a function of its inherent material properties rather than its shape. The interactions between lipid bilayers and substrates involve electrostatic and hydration forces, as well as attractive contributions from long-range Van der Waals forces. These forces stabilize the single lipid bilayer, stabilize this bilayer region to the surface, and prevent these regions from migrating laterally at the substrate surface. , Works. For a suitable bilayer compatible surface, the energy minimum is between about 5Å and 20Å (typically about 10Å), which captures this bilayer membrane from its supporting surface, which corresponds to A thick aqueous film separates this support surface. A bulk aqueous phase 34 covers the lipid bilayer and the channels that separate these regions.

【００３２】 二重層適合性表面は、典型的には、親水性である。本発明の装置の微細加工で
使用するのに適当な多くの材料は、洗浄すると、二重層適合性表面領域を呈する
ことが理解できる。それらを二重層適合性表面に適するようにする特性を有する
代表的な材料には、種々のガラス、酸化ケイ素（酸化したケイ素（ＳｉＯ2）を
含めて）、ＭｇＦ2、ＣａＦ2、マイカ、および種々の高分子フィルム（例えば、
ポリアクリルアミドまたはデキストラン薄膜（例えば、文献２３、２４を参照；
両方の内容は、本明細書中で参考として援用されている）が挙げられる。両方の
種類の高分子フィルムは、適当な二重層適合性表面を形成し、これは、水和され
て、この高分子フィルムと支持二重層膜との間で、水性フィルムを提供する。適
当な二重層適合性表面および二重層障壁領域のそれ以上の詳細は、共有にかかる
米国特許出願ＳＮ０８，９７８，７５６（これは、１９９７年１１月２６日に出
願され、その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で詳述されてい
る。The bilayer compatible surface is typically hydrophilic. It will be appreciated that many materials suitable for use in microfabrication of the device of the present invention will exhibit a bilayer compatible surface area upon cleaning. Representative materials having properties that make them suitable for bilayer compatible surfaces include various glasses, silicon oxides (including oxidized silicon (SiO 2 )), MgF 2 , CaF 2 , mica, and Various polymeric films (eg,
Polyacrylamide or dextran thin films (see, eg, references 23 and 24;
Both contents are incorporated herein by reference). Both types of polymeric films form suitable bilayer compatible surfaces which are hydrated to provide an aqueous film between the polymeric film and the supporting bilayer membrane. Further details of suitable bilayer compatible surfaces and bilayer barrier regions can be found in commonly owned US patent application SN 08,978,756, which was filed on November 26, 1997, the contents of which are hereby incorporated by reference. Incorporated by reference in the book).

【００３３】 この支持二重層それ自体は、自己組立式の二次元流体系であり、これは、典型
的には、小胞形成脂質分子の２枚の対向小葉からなる。しかしながら、それは、
任意の適当な膜形成性の両親媒性物質から、下記のようにして作製できる。殆ど
の小胞形成脂質は、長鎖カルボン酸（例えば、グリセリド）であり、そのグリセ
ロールの水酸基は、（ｉ）脂肪酸鎖および（ｉｉ）荷電部分または極性部分（例
えば、リン酸エステル基）でエステル化されている。この小胞形成脂質は、好ま
しくは、２本の炭化水素鎖（典型的には、アシル鎖）および極性ヘッド基を有す
るものである。リン酸エステル基を有する長鎖カルボン酸、すなわちリン脂質は
、本発明で使用するのに特に適している。The supporting bilayer itself is a self-assembling two-dimensional fluid system, which typically consists of two opposing leaflets of vesicle-forming lipid molecules. However, it
It can be prepared from any suitable film-forming amphiphile as follows. Most vesicle-forming lipids are long chain carboxylic acids (eg, glycerides) whose glycerol hydroxyl groups are esterified with (i) fatty acid chains and (ii) charged or polar moieties (eg, phosphate ester groups). Has been converted. The vesicle-forming lipid is preferably one that has two hydrocarbon chains (typically an acyl chain) and a polar head group. Long chain carboxylic acids with phosphate ester groups, ie phospholipids, are particularly suitable for use in the present invention.

【００３４】 種々の合成小胞形成脂質および天然に生じる小胞形成脂質があり、これらには
、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノー
ルアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびス
フィンゴミエリンが挙げられ、ここで、その２本の炭化水素鎖は、典型的には、
約１４〜２２個の炭素原子長であり、不飽和度が変わる。上記脂質およびリン脂
質（そのアシル鎖は、飽和度が変わる）は、商業的に得ることができるか、また
は公開された方法に従って調製できる。他の適当な脂質には、糖脂質およびステ
ロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。There are various synthetic and naturally occurring vesicle-forming lipids, which include phospholipids such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidic acid. , Phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycerol (PG) and sphingomyelin, wherein the two hydrocarbon chains are typically
It is about 14 to 22 carbon atoms long, varying degrees of unsaturation. The lipids and phospholipids (the acyl chains of which have varying degrees of saturation) can be obtained commercially or prepared according to published methods. Other suitable lipids include glycolipids and sterols (eg cholesterol).

【００３５】 本発明で使用するのが好ましいジアシル鎖脂質には、ジアシルグリセロール、
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（
ＰＧ）が挙げられる。これらの脂質は、小胞形成脂質として、主要リポソーム成
分として使用され、また、下記の誘導体化脂質で使用されるために好ましい。Preferred diacyl chain lipids for use in the present invention include diacyl glycerol,
Phosphatidyl ethanolamine (PE) and phosphatidyl glycerol (
PG). These lipids are preferred for use as vesicle-forming lipids, as the major liposome component, and in the derivatized lipids described below.

【００３６】 これらのリン脂質および他のものの全ては、リン脂質の専門業者（例えば、Ａ
ｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌ
ａｂａｍａ）および一般化学薬品業者（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手できる。All of these phospholipids and others are commercially available from phospholipid specialists (eg A
vani Polar Lipids, Inc. , Alabaster, Al
abama) and general chemical vendors (eg Sigma Chemical)
Co. (St. Louis, MO)).

【００３７】 この水性フィルムおよびバルク水相は、任意の適当な水溶液（例えば、緩衝化
生理食塩水液（例えば、ＰＢＳ））であり得る。このバルク溶液は、例えば、異
なる組成の溶液で貫流リンスすることにより、容易に変えることができる（もち
ろん、この支持二重層を常に水面下に保つように、注意する）。The aqueous film and bulk aqueous phase can be any suitable aqueous solution, such as a buffered saline solution (eg, PBS). The bulk solution can be easily changed, for example by rinsing through with solutions of different composition (care is taken, of course, to keep the supporting bilayer always below water).

【００３８】 本発明に従って、多数の異なる寸法の脂質領域アレイが製造され得る。これら
は、例として、（ｉ）２５００個の同じ２００μｍ平方のコラル（ｃｏｒｒａｌ
）または領域の１ｃｍ2アレイを含む装置、（ｉｉ）１０，０００個の同じ１０
０μｍ平方の領域の１ｃｍ2アレイを含む装置、（ｉｉｉ）２μｍのチャンネル
で分離した約３７，０００個の同じ５０μｍ平方の領域の１ｃｍ2アレイを含む
装置、および（ｉｖ）１μｍ幅のチャンネルで分離した約２．８百万個の５μｍ
平方のコラルまたは領域の１ｃｍ2アレイを含む装置が挙げられる。A number of differently sized lipid domain arrays can be manufactured in accordance with the present invention. These are, by way of example, (i) 2500 identical 200 μm square corrals.
) Or a device comprising a 1 cm 2 array of regions, (ii) 10,000 identical 10
Device containing 1 cm 2 array of 0 μm square area, (iii) Device containing about 37,000 identical 1 μm 2 array of 50 μm square area separated by 2 μm channel, and (iv) separated by 1 μm wide channel About 2.8 million 5 μm
Examples include devices that include a 1 cm 2 array of square corals or areas.

【００３９】 本発明の代表的な実施形態には、その二重層脂質拡張部が異なる生体分子（例
えば、レセプタタンパク質分子、配位子タンパク質分子または他のタンパク質分
子）を含む装置が挙げられる。このような装置は、バイオセンサーに特に有用で
あり、これは、本明細書の応用部分でさらに詳細に記述されており、この二重層
適合性表面に蛋白リポソームを融合することにより、下記のようにして、作製さ
れる。Representative embodiments of the invention include devices in which the bilayer lipid extensions include different biomolecules (eg, receptor protein molecules, ligand protein molecules or other protein molecules). Such devices are particularly useful in biosensors, which are described in more detail in the application section of this specification, by fusing protein liposomes to this bilayer-compatible surface as described below. Then, it is produced.

【００４０】 蛋白リポソーム小胞は、ガラス表面に融合でき、平面支持膜（５）を作製でき
ることが認められている。この技術は、非常に多くの状況でうまく適合されてい
る。一例では、Ｈ２Ｋｋタンパク質は、洗浄剤透析により、卵ホスファチジルコ
リン−コレステロール小胞に再構成し、これらの小胞は、ガラス（５）の平面膜
を作製するのに使用した。Ｈ２Ｋｋ含有膜は、細胞と接触したとき、特定の細胞
傷害性応答を誘発できた。It is recognized that protein liposome vesicles can be fused to a glass surface to create a planar support membrane (5). This technique has been well adapted in numerous situations. In one example, the H2Kk protein was reconstituted into egg phosphatidylcholine-cholesterol vesicles by detergent dialysis and these vesicles were used to make planar membranes of glass (5). H2Kk-containing membranes were able to elicit specific cytotoxic responses when contacted with cells.

【００４１】 Ｃｈａｎら（２２）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固
着膜レセプタが蛋白リポソーム融合から形成された平面膜で側方に可動性である
こと、およびこの可動性がこの膜への細胞付着を高めることを立証した。他の用
途は、支持膜を作製するのに、小胞融合、ラングミュアー−ブロジェット方法論
および誘導体化表面の組み合わせを使用する。Chan et al. (22) showed that the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring membrane receptor is laterally mobile with a planar membrane formed from protein-liposome fusion, and that this mobility allows cell attachment to the membrane. Proved to increase. Other applications use a combination of vesicle fusion, Langmuir-Blodgett methodology and derivatized surfaces to create support membranes.

【００４２】 この二重層膜にレセプタまたはイオンチャンネルを取り込むことに加えて、こ
の二重層は、任意数の基または化合物のいずれかで誘導体化されて、所望の特性
を有する表面が作製され得る。例えば、これらのリポソームは、表面脂質成分に
付着することにより、この脂質の表面に結合した配位子を含有し得る。一般に、
このような配位子は、小胞形成脂質の極性ヘッド基にカップリングされる。この
ようなカップリングを達成する代表的な方法は、以下で記述する。In addition to incorporating receptors or ion channels into the bilayer membrane, the bilayer can be derivatized with any of a number of groups or compounds to create a surface with desired properties. For example, these liposomes may contain a ligand bound to the surface of the lipid by attaching it to a surface lipid component. In general,
Such ligands are coupled to the polar head group of vesicle-forming lipids. An exemplary method of achieving such coupling is described below.

【００４３】 この装置は、例えば、微細加工により設計され、装置が目指す機能を実行する
のに必要な他の要素を含めるのが適当である。例えば、バイオセンサーとして使
用するように設計された装置では、分離脂質二重層領域を支持する基体領域は、
電極であり得、これは、例えば、この膜領域を横切るイオン流れを測定するため
に、塩橋によって、この基体表面に連結され、例えば、この場合、この膜領域は
、イオンチャンネルを含むように、構成される。あるいは、膜間電流を測定する
装置は、この膜を横切るイオン流れをモニターするのに使用できるｐＨ感受性染
料などを含み得る。さらに他の実施形態では、この装置は、この分離二重層領域
に取り込まれた１個以上の異なる生体分子に結合する分析物を測定するように、
設計される。ここで、この装置は、装置内の１個以上の領域への光学的に活性な
分析物の結合を測定する光学走査装置と組み合わせて、使用され得る。The device is suitably designed, for example, by micromachining, and suitably contains the other elements necessary to carry out the intended function of the device. For example, in a device designed for use as a biosensor, the substrate region supporting the discrete lipid bilayer region is
It may be an electrode, which is connected to the substrate surface, for example by a salt bridge, to measure the ion flow across the membrane region, eg where the membrane region comprises ion channels. , Composed. Alternatively, the device for measuring the transmembrane current may include a pH sensitive dye or the like that can be used to monitor the flow of ions across the membrane. In yet another embodiment, the device measures the analyte bound to one or more different biomolecules incorporated into the separated bilayer region,
Designed. Here, the device can be used in combination with an optical scanning device that measures the binding of the optically active analyte to one or more regions within the device.

【００４４】 （ＩＩＩ．表面パターン化装置の作製） 本発明は、基体上で脂質二重層領域の表面パターン化アレイを形成する３つの
異なる方法を考慮している。III. Fabrication of Surface Patterning Devices The present invention contemplates three different methods of forming surface patterned arrays of lipid bilayer regions on a substrate.

【００４５】 （Ａ．ブロッティング） これらの方法の第一のものは、「ブロッティング」と呼ばれ、図２Ａで図示し
ている。この方法は、まず、好ましくは平面の基体４２の上に、連続脂質二重層
拡張部を形成する工程を包含する。この脂質拡張部を形成する方法は、参考文献
１０および１４を含めて、他の箇所で詳述されており、また、共有にかかる米国
特許出願０８／９７８，７５６で詳述されている。A. Blotting The first of these methods is called “blotting” and is illustrated in FIG. 2A. The method first comprises forming a continuous lipid bilayer extension on a preferably planar substrate 42. Methods of forming this lipid extension are described elsewhere, including references 10 and 14, and in co-owned US patent application 08 / 978,756.

【００４６】 図２Ｂで示すように、次いで、この拡張部には、表面突出部（例えば、突出部
４６）のエンボスパターンを有するブロッタ４４が適用され、この突出部は、（
ｉ）その上での脂質二重層の形成を支持できる接触面（例えば、表面４８）を有
し、そして（ｉｉ）このような接触面と境界を接する分離領域（例えば、領域５
０）を形成する。このブロッタは、好ましくは、高分子材料から形成され、好ま
しい材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であり、これは、例えば、プ
ラズマ処理により、表面酸化され得る。このブロッタはまた、ブロッタを基体に
接して水面下の状態で保持するための重し５２を含む。As shown in FIG. 2B, a blotter 44 having an embossed pattern of surface protrusions (eg, protrusions 46) is then applied to the extension, which protrusion (
a) a separation region (e.g. region 5) having i) a contact surface (e.g., surface 48) capable of supporting formation of a lipid bilayer thereon, and (ii) bounding such contact surface.
0) is formed. The blotter is preferably formed from a polymeric material, a preferred material being polydimethylsiloxane (PDMS), which can be surface oxidized, for example by plasma treatment. The blotter also includes a weight 52 for holding the blotter against the substrate and underwater.

【００４７】 本発明の重要な局面によれば、このブロッティングは、接触面４８と接触させ
て脂質二重層領域をこのような表面に移動するのに効果的であり、このブロッタ
を除去したとき、分離したばかりの脂質二重層領域（例えば、領域５６）間に、
チャンネル（例えば、チャンネル５４）が残る。除去した脂質二重層６０は、次
いで、第二ガラス表面４３（図２Ｃ）に移動され、そして図２Ｄで示すように、
置かれ得る。According to an important aspect of the invention, this blotting is effective in contacting the contact surface 48 to transfer the lipid bilayer region to such a surface, and when the blotter is removed, Between the freshly separated lipid bilayer regions (eg, region 56),
The channel (eg, channel 54) remains. The removed lipid bilayer 60 is then transferred to the second glass surface 43 (Figure 2C) and, as shown in Figure 2D,
Can be placed.

【００４８】 図２Ｅ〜２Ｇで示した他の好ましい実施形態では、二重層材料は、小胞６１か
ら予め組み立てられて酸化ＰＤＭＳ表面４８に「インクを塗り」、この材料は、
次いで、打ち抜き加工により、ガラス４２に移動されて、膜パッチ６０をガラス
４２へと確実に移動する。In another preferred embodiment illustrated in FIGS. 2E-2G, the bilayer material is pre-assembled from the vesicles 61 to “ink” the oxidized PDMS surface 48, which material comprises:
Then, by punching, the film patch 60 is moved to the glass 42 to reliably move the film patch 60 to the glass 42.

【００４９】 代表的な１方法として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製の１モル％のＮ
−（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスルホニル）−１，２−ジヘキサンデコノイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥ）と共
に、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ製の卵ホスファチジルコリン（卵
ＰＣ）から、小胞を調製した。小胞からの支持脂質二重層の調製は、他の文献等
で詳細に述べられている。この脂質懸濁液のｐＨは、拡散が起こると予想される
ような値であった。結果として、拡張後に二重層のない領域が残るように、残留
材料の量に対する除去材料の量を選択する必要がある。Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ
ｓ Ｓｅｎｓｙｓ ＣＣＤカメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅ８００蛍光顕微鏡を使
用して、これらの二重層を画像化した。無視できる量の抵抗加熱を生じる＜２μ
Ａの電流を使って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中で、先に明確に述べた方法を使用し
て、この膜内での電気泳動を実行した。As a typical method, 1 mol% N produced by Molecular Probes is used.
-(Texas Red sulfonyl) -1,2-dihexanedeconoyl-sn-
Vesicles were prepared from egg phosphatidylcholine (egg PC) from Avanti Polar Lipids with glycero-3-phosphoethanolamine (Texas Red DHPE). The preparation of supporting lipid bilayers from vesicles is described in detail in other literatures. The pH of this lipid suspension was such that diffusion was expected to occur. As a result, it is necessary to select the amount of removal material relative to the amount of residual material such that the region without the bilayer remains after expansion. Photometric
These bilayers were imaged using a Nikon E800 fluorescence microscope equipped with a s Sensys CCD camera. <2μ causing negligible resistance heating
Electrophoresis in this membrane was carried out in Millipore water using an electric current of A, using the method explicitly mentioned above.

【００５０】 パターン化フォトレジストを使って、シリコンマスター（ｍａｓｔｅｒ）上に
Ｓｙｌｇａｒｄ １８４（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を硬化することにより、ポ
リジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）打ち抜き（ｓｔａｍｐ）を形成した。さらに
好ましくは、Ｓｙｌｇａｒｄ １８２は、６５℃より低い温度では硬化しないの
で、使用され得、このことは、ＰＤＭＳの柔軟性が重要であることを示唆してい
る。ヘキサメチルジシラザンで蒸気感作したシリコンウエハ上で、Ｓｈｉｐｌｅ
ｙ ３６１２ポジティブフォトレジスト（１μｍ厚）を使用して、これらのマス
ターを作製した。このパターン化は、標準的な光食刻技術を使用して、達成した
。ＰＤＭＳは、１μｍ高さの正方形グリッドである；これらのグリッド線の幅は
、１５μｍであり、これらの線は、２１５μｍ離れている。この打ち抜きを使用
して脂質二重層をエンボス加工すると、約３μｍ幅で２２７μｍ離れたグリッド
線が得られる。Polydimethylsiloxane (PDMS) stamps were formed by curing Sylgard 184 (Dow Corning) on a silicon master using a patterned photoresist. More preferably, Sylgard 182 may be used as it does not cure below 65 ° C., suggesting that the flexibility of PDMS is important. On a silicon wafer vapor-sensitized with hexamethyldisilazane, Shiple
These masters were made using y3612 positive photoresist (1 μm thick). This patterning was accomplished using standard photo-etching techniques. PDMS is a 1 μm high square grid; the width of these grid lines is 15 μm and the lines are 215 μm apart. Embossing of the lipid bilayer using this stamping results in grid lines approximately 3 μm wide and 227 μm apart.

【００５１】 図３Ａは、支持脂質二重層を超純水中で１０分間エンボス加工した後のエピ蛍
光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像を描写している。この画像は、エン
ボス加工の約３０分後に撮影したが、この時点で、この二重層は、事実上、仕上
がっており、この膜が除去された領域へと拡張している。これらの脂質が除去さ
れた画像では、明らかに、黒色のグリッドパターンが見え、このパターンは、水
中で、少なくとも１週間にわたって、安定であることが明らかとなった。この二
重層の拡張前線がガラス表面上にフィンガー様突出部で進行しているので、この
二重層の拡張は、このパターンのギザギザ縁部の原因となっている。このグリッ
ド（黒色）領域での蛍光強度は、背景レベルに非常に近く、このことは、このグ
リッド領域から脂質材料がほぼ完全に除去されたこと、すなわち、この二重層の
両方の小葉が除去されたようであることを示している。これらのグリッド線は、
予想した３μｍよりもむしろ約１９μｍ幅である。しかしながら、ＰＤＭＳの特
性の１つは、変形可能であることなので、もし、エンボス加工中に二重層と接触
しているＰＤＭＳ領域が予想より大きいとしても、驚くことではない。FIG. 3A depicts an epifluorescence image after embossing the supported lipid bilayer for 10 minutes in ultrapure water. The image was taken about 30 minutes after embossing, at which point the bilayer is effectively finished and extends into the area where the membrane was removed. An image with these lipids removed clearly showed a black grid pattern, which was found to be stable in water for at least 1 week. The expansion of the bilayer is responsible for the jagged edges of the pattern, as the expansion front of the bilayer is progressing with finger-like protrusions on the glass surface. The fluorescence intensity in this grid (black) area is very close to the background level, which means that the lipid material is almost completely removed from this grid area, ie both leaflets of this bilayer are removed. It seems to have been. These grid lines are
It is about 19 μm wide rather than the expected 3 μm. However, one of the properties of PDMS is that it is deformable, so it is not surprising if the PDMS region in contact with the bilayer during embossing is larger than expected.

【００５２】 このパターンが側方拡散に対する障壁として機能するかどうかを決定するため
に、本発明者らは、この二重層の平面に平行な電場を加えた。電気泳動は、負に
荷電したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識脂質を正電極の方へと引き付けて、それらがパ
ターン化領域の境界に接して蓄積するにつれて、定常状態で勾配を形成する。図
３Ｂは、１１Ｖ／ｃｍおよび１Ａの電場を６５分間加えた後の図３Ａと同じ領域
の画像を描写している。明るい蛍光の濃度勾配は、各分割領域の右側で見られ、
このことは、これらの脂質が正方形のコラル内で可動性であるがこのコラル内に
制限されていることを立証している。この電場を取り除くと、これらの脂質は、
緩和して、均一に戻る；その電場方向は、逆にでき、この勾配は、その反対側に
沿って形成される。それゆえ、ＰＤＭＳ打ち抜き加工で脂質を除去することによ
り形成された二重層のない領域は、側方拡散に対して安定な障壁として役立つこ
とが分かる。光脱色（ＦＲＡＰ）実験後の蛍光回復もまた、実行し（データは、
示されていない）、これらは、パターン化領域内（しかし、境界を横切らない）
での回復を立証した。To determine whether this pattern acts as a barrier to lateral diffusion, we applied an electric field parallel to the plane of this bilayer. Electrophoresis attracts negatively charged Texas Red labeled lipids towards the positive electrode, forming a steady-state gradient as they accumulate near the border of the patterned region. FIG. 3B depicts an image of the same area as FIG. 3A after applying an electric field of 11 V / cm and 1 A for 65 minutes. A bright fluorescence concentration gradient can be seen to the right of each segment,
This demonstrates that these lipids are mobile but restricted within the square coral. When this electric field is removed, these lipids
It relaxes back to uniform; its electric field direction can be reversed and this gradient is formed along its opposite side. Therefore, it can be seen that the bilayer-free region formed by removing lipids by PDMS stamping serves as a stable barrier to lateral diffusion. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments was also performed (data
(Not shown), these are within the patterned area (but not across the boundary)
Proved the recovery in.

【００５３】 図３Ｅは、小さい二重層領域を表面（これは、比較的に大きい障壁領域で分離
された）上に置くことにより作製されたパターンを描写している。図３Ｆは、同
様なサイズにした障壁領域で取り囲まれた二重層領域を描写している。図３Ｇ〜
３Ｉは、加えた電場の影響下にて、フライパン取っ手形の二重層領域を横切って
移動している蛍光材料の写真を描写している。これは、二重層領域の形状が、外
力と共に、材料を濃縮、希釈、混合または移動するのに使用され得ることを示し
ている。FIG. 3E depicts a pattern made by placing small bilayer regions on the surface, which are separated by relatively large barrier regions. FIG. 3F depicts a bilayer region surrounded by similarly sized barrier regions. 3G-
3I depicts a photograph of fluorescent material moving across a frying pan handle shaped bilayer region under the influence of an applied electric field. This indicates that the shape of the bilayer region can be used with external forces to concentrate, dilute, mix or transfer material.

【００５４】 このエンボス加工領域の外部境界では、興味深い状況が生じる。この二重層被
覆領域の半分の大きさの打ち抜きが使用され、その結果、この二重層領域の半分
だけがパターン化された。これらの境界でパターン化した領域は、材料のより大
きなレザバ（次いで、その内部にあるもの）と隣接していたので、この二重層が
拡張するにつれて、これらの障壁は、その縁部で消えるはずであり、実際に消え
る。この結果は、拡散に対する障壁を形成するには、引き続いた拡張後に、これ
らの二重層領域が未連結のまま残るように十分な材料を除去する必要があるにす
ぎないことを意味する。それに加えて、小胞とインキュベートすることにより、
（すなわち、材料を入れ直すことにより）、拡散に対する全ての障壁を消すこと
は可能である。インキュベーション後、これらの脂質は、今一度、全表面にわた
って、自由に拡散する。An interesting situation arises at the outer boundary of this embossed area. A punch half the size of this bilayer covered area was used so that only half of this bilayer area was patterned. The regions patterned at these boundaries were adjacent to the larger reservoir of material (then what was inside it), so as this bilayer expands, these barriers should disappear at their edges. And actually disappears. This result means that to form a barrier to diffusion, only sufficient material needs to be removed so that these bilayer regions remain unconnected after subsequent expansion. In addition, by incubating with vesicles,
It is possible to eliminate all barriers to diffusion (ie by re-dosing the material). After incubation, these lipids are once again free to diffuse across the entire surface.

【００５５】 （Ｂ．打ち抜き加工） この方法（これは、図２Ａ〜２Ｄで図示している）では、脂質二重層領域は、
上記のように、平面脂質拡張部で覆った第一基体からブロッタ４４の接触面へと
移動されて、図示しているように、このブロッタの共平面ブロッティング表面上
で、二重層領域（例えば、領域６０）のパターンを生じる。これらのブロッタ表
面で二重層を形成する工程は、上記ブロッティング方法と類似し得る（この場合
、このブロッタは、基体上の平面脂質拡張部に適用される）か、またはブロッテ
ィング表面に脂質二重層領域を直接形成することにより得る。この第二方法では
、小胞は、水中で、例えば、少なくとも１時間にわたって、脂質二重層が露出面
で形成されるまで、これらのブロッティング表面と接触して置かれる。次いで、
例えば、このブロッタから過剰の小胞を振り落とすことにより、それらは除去さ
れる。B. Punching In this method, which is illustrated in FIGS. 2A-2D, the lipid bilayer region is
As described above, it was moved from the first substrate covered with the planar lipid extension to the contact surface of the blotter 44 and, as shown, on the coplanar blotting surface of this blotter, a bilayer region (eg, The pattern in area 60) is produced. The process of forming bilayers on these blotter surfaces can be similar to the blotting method described above, in which the blotter is applied to a planar lipid extension on the substrate, or the lipid bilayer region on the blotting surface. Is obtained by directly forming In this second method, vesicles are placed in contact with their blotting surface in water, for example for at least 1 hour, until a lipid bilayer is formed on the exposed surface. Then
They are removed, for example, by shaking off excess vesicles from this blotter.

【００５６】 この方法の最終工程（これは、図２Ｄで示す）では、このブロッタは、第二基
体４３で打ち抜かれて、これらのブロッタ表面の脂質二重層領域を基体へと移動
する。In the final step of the method, which is shown in FIG. 2D, the blotter is stamped with the second substrate 43 to transfer the lipid bilayer region of these blotter surfaces to the substrate.

【００５７】 図４Ａは、第一インク塗り手順を使用して打ち抜かれた材料のエピ蛍光画像を
示し、これは、図３Ａで示したものと同じグリッドパターンを示している。その
明るい蛍光パターンは、図３Ａで除去した領域と対応しており、このことは、こ
のエンボス加工方法が、実際に、二重層材料を除去することのさらなる証拠を与
える。移動した脂質が、それ自体、流体二重層に組み立てられるかどうかを試験
するために、その中心のすぐ下の蛍光領域（図４Ａ）を光脱色した。図４Ｂは、
４６分後の同じ領域であり、脱色した領域にある蛍光の殆どが回復したことが明
らかである。よく検査してみると、回復は完全ではないことが分かる；本発明者
らは、現在行われている除去および設置工程によれば、完全には覆われていない
領域（長距離の拡散を許容するのに十分には連結されているが）が一部残ると推
測している。移動した脂質の蛍光レベルは、これらの脂質を除去した表面の蛍光
レベルの約６０％である；その４０％の損失のうち、約１０％は、この除去の際
に失われ、そして３０％は、その打ち抜きの際に失われた。本発明者らは、この
システムおよびこれらの方法の変動を最適化するためには、殆どなにもしなかっ
たが、その打ち抜き材料または打ち抜き微細構成は、有益であると判明し得る。
第二方法を使用して、類似の結果が得られた。本発明者らは、ついでに、これら
の２方法で、受容面と接触している膜小葉の反転が存在していることを述べてお
く。第一方法では、この支持膜のうち、このガラスと最初に接触している面は、
移動および印刷後も、接触したままである。第二方法（この場合、このアセンブ
リは、最初は、ＰＤＭＳ表面上にある）では、この移動は、ＰＤＭＳ上にあると
きにバルク溶液と接触している面を、受容ガラス面と最も近くまで接触して置く
ようにするはずである。このことは、自己組織化システムの配向を反転するのに
有用であると判明し得る。FIG. 4A shows an epifluorescence image of the material stamped using the first inking procedure, which shows the same grid pattern as shown in FIG. 3A. The bright fluorescence pattern corresponds to the areas removed in FIG. 3A, which gives further evidence that this embossing method actually removes the bilayer material. To test whether the migrated lipids assemble themselves into a fluid bilayer, the fluorescent region just below its center (FIG. 4A) was photobleached. FIG. 4B shows
It is clear that most of the fluorescence in the bleached area, which is the same area after 46 minutes, has been recovered. A closer inspection reveals that the recovery is not complete; we have found that the removal and installation processes that are currently in place do not allow areas that are not completely covered (allowing long distance diffusion). I suspect that some will remain) although they are connected enough to do so. The fluorescence level of transferred lipids is about 60% of the fluorescence level of these lipid-removed surfaces; of that 40% loss, about 10% is lost during this removal and 30% is , Lost during the punching. We have done very little to optimize the variability of this system and these methods, but the stamped material or stamped topography may prove beneficial.
Similar results were obtained using the second method. We then note that in these two methods, there is an inversion of the membrane leaflet in contact with the receiving surface. In the first method, the surface of the supporting film that first contacts the glass is
It remains in contact after being moved and printed. In the second method (where the assembly is initially on the PDMS surface), this movement involves contacting the surface that is in contact with the bulk solution when on PDMS with the receiving glass surface closest. I should put it in. This may prove useful in reversing the orientation of self-assembled systems.

【００５８】 打ち抜きにより形成したパターンはまた、エンボス加工で形成されたパターン
の場合と同様に、小胞と共にインキュベートすることにより、消すことができる
。パターン領域以外は清浄な表面にさらに材料を追加することは、これらのパタ
ーンが支持脂質二重層の自己制御式側方拡張部により維持されることの他の証明
になる。The pattern formed by stamping can also be erased by incubation with vesicles, as in the case of the pattern formed by embossing. Adding more material to the clean surface except in the pattern areas is another proof that these patterns are maintained by the self-regulating lateral extensions of the supporting lipid bilayer.

【００５９】 （Ｃ．脂質領域の増強） 脂質領域を形成する第三の方法は、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃで図示している。
この方法では、上記のように、ブロッタの接触面で、別個の脂質領域が形成され
る。これらの脂質領域は、次いで、基体（例えば、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃでは
、基体７０）の対応領域に打ち抜くことにより、移動される。好ましくは、この
基体は、共有にかかる米国特許出願ＳＮ０８，９７８，７５６で記述されたよう
なもの（これは、脂質二重層適合性表面領域を有する）、または脂質二重層障壁
（例えば、障壁７６）で分離された領域７２、７４のような脂質領域である。ブ
ロッタ４６上の接触面４６ａおよび４６ｂは、好ましくは、この基体上の脂質領
域７２および７４と１対１の対応を有し、それと正しく合わせて設置でき、その
結果、各ブロッタ接触面は、その脂質二重層をこの基体の対応脂質領域上に置く
ようにされる。C. Enhancement of Lipid Domain A third method of forming lipid domains is illustrated in FIGS. 5A, 5B and 5C.
In this method, as described above, distinct lipid regions are formed at the contact surface of the blotter. These lipid regions are then transferred by punching into the corresponding regions of the substrate (eg substrate 70 in FIGS. 5A, 5B and 5C). Preferably, the substrate is as described in commonly owned US patent application SN08,978,756, which has a lipid bilayer compatible surface region, or a lipid bilayer barrier (eg, barrier 76). ) Are lipid regions such as regions 72, 74 separated by. The contact surfaces 46a and 46b on the blotter 46 preferably have a one-to-one correspondence with the lipid regions 72 and 74 on this substrate and can be placed in proper alignment therewith so that each blotter contact surface is The lipid bilayer is placed on the corresponding lipid region of this substrate.

【００６０】 図５Ａで図示しているように、この脂質移動打ち抜きは、各基体の脂質を部分
的に充填するのに効果的であり、各領域内では、脂質二重層の島が生じる。この
方法の１局面に従って、このブロッタ移動工程における基体領域の各々に移動さ
れる脂質の量は、ブロッタの接触面の各々の表面積を選択的に変えることにより
、選択的に変わる。それゆえ、図５Ａでは、図示した４つの領域の脂質量が、右
から左の方向および後ろから前の方向での伝播の際に増えていると想定され得る
。図７Ａは、異なる量の第一脂質材料の異なる間隔を空けた位置へのこのような
分布を上から見た図を示す。図６Ａは、上記の「インクを塗った」打ち抜き方法
を描写しており、その結果、図６Ｂでは、障壁領域で分離した表面４２上で空間
的に分布しているパッチ６０が得られる。空隙充填（ｉｎ−ｆｉｌｌ）は、脂質
小胞６１（これらは、パッチ６０および／または表面４２と接触しており、この
二重層領域を二重層障壁の地点まで満たす）を追加することにより、図６Ｃで描
写されている。図７Ａ〜７Ｃに戻って参照すると、図７Ａは、図６Ｂで描写した
工程を上から見た図である。図７Ｂは、図６Ｃを上から見た図を描写しており、
パッチ６０に起因した脂質成分のみを照らしている。図７Ｃは、この空隙充填脂
質小胞材料の照明を描写している。それゆえ、まとめると、図７Ａ〜７Ｃは、い
かにして、本発明が独立して支持された脂質二重層領域（これは、障壁領域で支
持される）のアレイを形成する方法および装置を提供するかを明示しており、こ
こで、各二重層領域は、異なる脂質組成または比または脂質を含む。As illustrated in FIG. 5A, this lipid migration punching is effective in partially filling the lipids of each substrate, resulting in lipid bilayer islands within each region. According to one aspect of this method, the amount of lipid transferred to each of the substrate regions in this blotter transfer step is selectively varied by selectively changing the surface area of each of the contact surfaces of the blotter. Therefore, in FIG. 5A, it can be assumed that the lipid content of the four regions shown is increasing during propagation in the right-to-left direction and the back-to-front direction. FIG. 7A shows a top view of such distribution of different amounts of the first lipid material to different spaced positions. FIG. 6A depicts the “inked” stamping method described above, resulting in spatially distributed patches 60 on surface 42 separated by barrier regions in FIG. 6B. The void-filling (in-fill) is achieved by adding lipid vesicles 61, which are in contact with patch 60 and / or surface 42, filling this bilayer region to the point of the bilayer barrier. Pictured at 6C. Referring back to FIGS. 7A-7C, FIG. 7A is a top view of the process depicted in FIG. 6B. FIG. 7B depicts a top view of FIG. 6C,
Only the lipid component originating from patch 60 is illuminated. FIG. 7C depicts the illumination of this void-filled lipid vesicle material. Therefore, in summary, Figures 7A-7C provide a method and apparatus in which the present invention forms an array of independently supported lipid bilayer regions, which are supported by barrier regions. It is specified that each bilayer region comprises a different lipid composition or ratio or lipid.

【００６１】 この移動工程に続いて、この基体は、図５Ｂで示すように、基体の脂質領域の
各々での脂質適用範囲を「満たす」または完成する脂質二重層領域を形成するの
に効果的な脂質小胞に晒される。図５ｅおよび５ｆは、異なる照明条件下にて、
各位置での第一および第二二重層形成材料の量を示す。これは、例えば、部分的
に充填した基体を脂質小胞に晒すことにより行うことができ、上述のように、基
体上で平面拡張部を作製することと類似している。この充填と共に、この基体上
の各脂質領域（例えば、領域７２、７４）は、引き続いて追加した脂質材料へと
ブロッタを移動することにより規定割合の脂質材料を置いた脂質二重層領域で、
覆われる。Following this transfer step, the substrate is effective in forming lipid bilayer regions that “fill” or complete lipid coverage at each of the lipid regions of the substrate, as shown in FIG. 5B. Exposed to various lipid vesicles. 5e and 5f show that under different lighting conditions,
The amount of first and second bilayer forming material at each position is shown. This can be done, for example, by exposing the partially filled substrate to lipid vesicles, which is similar to making a planar extension on the substrate, as described above. With this loading, each lipid region on the substrate (eg, regions 72, 74) is a lipid bilayer region that has a defined proportion of lipid material deposited thereon by subsequently moving the blotter to the added lipid material,
To be covered.

【００６２】 この方法は、例えば、異なる選択量の２種またはそれ以上の脂質および／また
は異なる割合の脂質／非脂質生体分子（例えば、脂質／レセプタタンパク質）で
アレイを作製する際に、有用である。後者の場合、例えば、異なるサイズの接触
表面積を有するブロッタは、一定割合の脂質／タンパク質を含有する脂質二重層
を使って、調製され得る。この材料が基体に移動されるとき、この異なるサイズ
のブロッタ表面領域には、異なる選択量の脂質およびタンパク質が移動され、そ
れゆえ、異なる選択量のタンパク質は、個々の基体の脂質領域に移動される。こ
の基体に脂質を追加することに続いて、各領域は、選択した異なる脂質／タンパ
ク質割合を有する。This method is useful, for example, in making arrays with different selected amounts of two or more lipids and / or different proportions of lipid / non-lipid biomolecules (eg lipid / receptor proteins). is there. In the latter case, for example, blotters with different sized contact surface areas can be prepared using lipid bilayers containing a fixed proportion of lipid / protein. When this material is transferred to the substrate, differently sized blotter surface areas are loaded with different selective amounts of lipids and proteins, and thus different selective amounts of proteins to the lipid regions of the individual substrates. It Following the addition of lipid to the substrate, each region has a different lipid / protein ratio of choice.

【００６３】 本発明に従って選択割合の成分を使って脂質二重層領域を形成する他の方法も
また、考慮される。例えば、サイズが小さい脂質領域のグリッドは、選択したサ
イズの異なる内部領域を除去するために、染みを付けることができる。これらの
内部領域を脂質小胞で満たすことにより、またはブロッタから打ち抜くことによ
り、各アレイ領域に、所望割合の成分を置くことができる。Other methods of forming lipid bilayer regions using selected proportions of components according to the present invention are also contemplated. For example, a grid of small sized lipid regions can be spotted to remove selected inner regions of different sizes. By filling these interior regions with lipid vesicles or punching out from the blotter, each array region can be populated with the desired proportion of components.

【００６４】 本発明は、当業者が認識できるように、微細加工および印刷、ならびに診断お
よび薬物スクリーニングの適用分野で、種々の用途を有する。The present invention has a variety of uses in microfabrication and printing, and diagnostic and drug screening applications, as will be appreciated by those skilled in the art.

【００６５】 例えば、微細加工では、本発明に従って形成された脂質領域のパターンは、非
脂質分子、例えば、タンパク質（例えば、これは、脂質適合性部分を有する）を
固着するのに使用できる。この生体分子を、例えば、固定剤で、この表面に固定
した後、最初の脂質パターンは、除去できる。同様に、印刷時では、打ち抜き上
で形成された脂質二重層領域のパターンは、選択した印刷媒体（例えば、紙）に
移動でき、次いで、引き続いて、脂質適合性染料を捕捉するのに使用される。こ
の染料が捕捉され、この媒体に固着された後、これらの脂質は、例えば、洗浄工
程により、除去され得る。For example, in microfabrication, the pattern of lipid regions formed according to the present invention can be used to anchor non-lipid molecules, such as proteins (eg, which have lipid compatible moieties). After immobilizing the biomolecule on the surface, for example with a fixative, the initial lipid pattern can be removed. Similarly, during printing, the pattern of lipid bilayer regions formed on the die-cut can be transferred to the print medium of choice (e.g., paper) and then subsequently used to capture the lipid compatible dye. It After the dye has been captured and fixed to the medium, these lipids can be removed, for example by a washing step.

【００６６】 （実験） １モル％のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩（Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（登録商標）ＤＨＰＥ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）また
は３モル％のＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登
録商標）ＤＭＰＥ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使って、卵ホスファ
チジルコリン（卵ＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）から、小さ
い単層小胞を調製した。適当な量の各種脂質を、クロロホルム中で共に混合し、
Ｎ2下で乾燥し、そして真空下で少なくとも４０分間置いた。次いで、これらの
脂質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（１８ＭΩ）水で再構成し、そして５０ｎｍの細孔を
有する膜を含むＡｖａｎｔｉ押出機に、１９回通した。押し出した小胞を４℃で
保存し、そして３日以内に使用した。使用の３日未満前に調製した５０ｎＭ押出
小胞を使用するのが好ましく、そしてより好ましくは、これらは、使用直前に調
製される。Experiment: 1 mol% of Texas Red® 1,2-dihexadecanoyl-s
n-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (Tex
as Red (R) DHPE, Molecular Probes) or 3 mol% of Marina Blue (R) 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Marina Blue (R) DMPE, Molecular). Probes) were used to prepare small unilamellar vesicles from egg phosphatidylcholine (egg PC, Avanti Polar Lipids). Mix appropriate amounts of various lipids together in chloroform,
Dry under N 2 and place under vacuum for at least 40 minutes. These lipids were then reconstituted with Millipore (18 MΩ) water and passed 19 times through an Avanti extruder containing a membrane with 50 nm pores. Extruded vesicles were stored at 4 ° C and used within 3 days. It is preferred to use 50 nM extruded vesicles prepared less than 3 days before use, and more preferably they are prepared immediately before use.

【００６７】 Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｓｅｎｓｙｓ ＣＣＤカメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅ８００蛍光顕微鏡を使用して、これらの二重層を画像化した。このＴｅｘａ
ｓ Ｒｅｄ蛍光団を画像化するには、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフィルター（Ｃｈｒｏ
ｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）セットを使用した；Ｃａｓｃａｄｅ
Ｂｌｕｅフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ
．）を使用して、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ蛍光団を画像化した。Ｃａｓｃａｄｅ
Ｂｌｕｅフィルターセットは、十分に合理的に、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅのス
ペクトルと一致する。先に説明した方法を使用して、２μＡ未満の電流（これは
、無視できる量の抵抗加熱を生じる）を使って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中で、こ
の膜内において、電気泳動を実行した。これらの蛍光プローブの拡散係数は、カ
スタム適合プログラム（ｃｕｓｔｏｍ ｆｉｔｔｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ）を使
用した蛍光プロフィールの時間展開のフーリエ分析により、決定した。These bilayers were imaged using a Nikon E800 fluorescence microscope equipped with a Photometrics Sensys CCD camera. This Texa
To image the s Red fluorophore, a Texas Red filter (Chro
ma Technology Corp. ) Set used; Cascade
Blue Filter Set (Chroma Technology Corp.
． ) Was used to image the Marina Blue fluorophore. Cascade
The Blue filter set matches reasonably well with the Marina Blue spectrum. Electrophoresis was performed in this membrane in Millipore water with a current of less than 2 μA, which produced a negligible amount of resistive heating, using the method described above. The diffusion coefficient of these fluorescent probes was determined by Fourier analysis of the time evolution of the fluorescence profile using a custom fitting program.

【００６８】 パターン化フォトレジストを使って、７０℃で、８０分間にわたって、シリコ
ンマスター上でＳｙｌｇａｒｄ １８２（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を硬化する
ことにより、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）打ち抜きを形成した。これら
のマスターは、シリコンウエハ（これらは、ヘキサメチルジシラザンで蒸気感作
した）上で、Ｓｈｉｐｌｅｙ ３６１２ネガティブフォトレジスト（１μｍまた
は１．６５μｍ厚）を使用して、作製した。このパターン化は、標準的な光食刻
技術を使用して、達成した。展開後、これらのウエハを、再度、ヘキサメチルジ
シラザンで蒸気感作して、ＰＤＭＳの引き続いた除去を助けた。ヘキサメチルジ
シラザンで蒸気感作したシリコンウエハ上で硬化することにより、平らなＰＤＭ
Ｓ打ち抜きを形成した。そのチャンバ内に少量の空気を漏らしつつ、１５〜６０
秒間にわたって、高出力下にて、プラズマクリーナー（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＤＭＳの表面酸化を実行した。ＩＣＮｘ７洗浄
剤（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）中で洗浄することに続いて、蒸留水
中で徹底的にリンスし、次いで、窯で、４００℃で、少なくとも４時間にわたっ
て焼き付けることにより、ガラススライドを調製した。このように調製したガラ
スを、洗浄から３日以内に使用するのが好ましい。Polydimethylsiloxane (PDMS) stampings were formed by curing Sylgard 182 (Dow Corning) on a silicon master at 70 ° C. for 80 minutes using a patterned photoresist. These masters were made on Silicon wafers, which were steam sensitized with hexamethyldisilazane, using Shipley 3612 negative photoresist (1 μm or 1.65 μm thick). This patterning was accomplished using standard photo-etching techniques. After deployment, these wafers were again steam sensitized with hexamethyldisilazane to aid in the subsequent removal of PDMS. Flat PDM by curing on a silicon wafer vapor sensitized with hexamethyldisilazane
An S punch was formed. 15-60 while leaking a small amount of air into the chamber
Plasma cleaner (Harrick Sci)
The surface oxidation of PDMS was carried out using Glass slides are prepared by washing in ICNx7 detergent (ICN, Costa Mesa, CA), followed by a thorough rinse in distilled water, then baking in a kiln at 400 ° C for at least 4 hours. did. The glass thus prepared is preferably used within 3 days of washing.

【００６９】 以下のようにして、これらの脂質二重層のマイクロコンタクト（ｍｉｃｒｏｃ
ｏｎｔａｃｔ）印刷を実行した。酸化から３０分以内に、ＰＤＭＳを、１分間に
わたって、（水中で、または５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８の
緩衝液と混合して、いずれかで）、脂質小胞の溶液と接触させ、次いで、過剰の
小胞を大量の水で洗浄した。さらに好ましくは、１８ｍｅｇ−ｏｈｍの超純水の
代わりに、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）が使用で
きる。ＰＤＭＳを水中で常に保持して、「インクを塗った」ＰＤＭＳを、次いで
、軽量（５．２ｇ）を使用して、５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ
８．０）の溶液中で、好ましくは、１０〜１５秒間にわたって、ガラス表面と接
触させた。The microcontacts of these lipid bilayers were performed as follows.
printing was performed. Within 30 minutes of oxidation, PDMS is contacted with a solution of lipid vesicles (either in water or mixed with 5 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8 buffer) for 1 minute, The excess vesicles were then washed with copious amounts of water. More preferably, 10 mM Tris, 100 mM NaCl (pH 8.0) can be used instead of 18 meg-ohm ultrapure water. The PDMS was kept in water at all times and the "inked" PDMS was then used (5.2 g) using 5 mM Tris, 50 mM NaCl (pH).
The solution was contacted with the glass surface in the solution of 8.0), preferably for 10 to 15 seconds.

【００７０】 他の文献等9で詳細に記述されているように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
をマイクロコンタクト印刷することにより、ガラス上で、永久グリッドパターン
（これらは、膜分割用の障壁として働く）を作製した。要約すると、８０μｇ／
ｍｌのＡｌｅｘａ４８８標識ＢＳＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１
７ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸緩衝液の溶液２０μｌを、酸化ＰＤＭＳ打ち抜きに
置き、１０分間そのままにして、その過剰分を振り落とし、次いで、この打ち抜
きをＮ2下にて乾燥した。この打ち抜きを、軽量（１４ｇ）を使用して、３０分
間にわたって、ガラススライドと接触させた。このスライドを、脱イオン水中で
、激しくリンスして、過剰のＢＳＡを除去し、そしてＮ2下にて乾燥した。[0070] As detailed in other literatures 9 description, bovine serum albumin (BSA)
By microcontact printing to create permanent grid patterns on the glass, which act as barriers for membrane division. In summary, 80 μg /
1 ml of Alexa488 labeled BSA (Molecular Probes)
20 μl of a solution of 7 mM (pH 8.0) phosphate buffer was placed in the oxidized PDMS punch, left for 10 minutes, the excess was shaken off, then the punch was dried under N 2 . The punch was contacted with a glass slide using light weight (14 g) for 30 minutes. The slides were rinsed vigorously in deionized water to remove excess BSA and dried under N 2 .

【００７１】 本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記述されているものの、本発
明から逸脱することなく、種々の改良を行い得ることが分かる。Although the present invention has been described with reference to particular methods and embodiments, it will be appreciated that various modifications can be made without departing from the invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１は、本発明の１局面に従って形成したパターン化基体装置の一部を示す。[Figure 1]   FIG. 1 illustrates a portion of a patterned substrate device formed according to one aspect of the present invention.

【図２】 図２Ａ〜２Ｈは、本発明に従って基体上のパターン化二重層領域および二重層
なし領域を作成するのに使用した２つの方法の概略図であり、ここで、図２Ａは
、ブロットによるパターン化を図示しており、そして図２Ｂは、打ち抜きによる
パターン化を図示している。2A-2H are schematic diagrams of two methods used to create patterned bilayer regions and bilayer-free regions on a substrate in accordance with the present invention, where FIG. 2A is a blot. FIG. 2B illustrates patterning by stamping and FIG. 2B illustrates patterning by stamping.

【図３】 図３Ａ〜３Ｄは、エンボス加工により形成した支持脂質二重層のエピ蛍光画像
であり、これらは、脂質を除去した領域に自己制御式の側方拡張を起こすために
、３０分間待った後（図３Ａ）、６５分間にわたって、この二重層平面に平行に
、電場（１１Ｖ／ｃｍおよび１μＡ）を加えた後、負に荷電したＴｅｘａｓレッ
ド標識脂質成分の濃度の定常状態勾配が生じた後（図３Ｂ）を示している。3A-3D are epifluorescence images of supported lipid bilayers formed by embossing, which waited for 30 minutes to cause self-regulated lateral expansion in the lipid-free areas. After (FIG. 3A), after applying an electric field (11 V / cm and 1 μA) parallel to this bilayer plane for 65 minutes, after a steady state gradient of the concentration of negatively charged Texas red labeled lipid components occurred. (FIG. 3B).

【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、打ち抜きにより形成した支持脂質二重層のエピ蛍光画像
であり、ここで、この画像は、光脱色直後（図４Ａ）および光脱色の４６分後（
図４Ｂ）に撮影したが、これらは、印刷ライン内での側方拡散の結果としての脱
色の部分的な回復を示している。4A and 4B are epifluorescence images of supported lipid bilayers formed by stamping, where the images were obtained immediately after photobleaching (FIG. 4A) and 46 minutes after photobleaching (
Taken in FIG. 4B), these show a partial recovery of bleaching as a result of lateral diffusion within the print line.

【図５】 図５Ａおよび５Ｂは、部分充填および空隙充填透視図を描写している。[Figure 5]   5A and 5B depict partial and void-filling perspective views.

【図６】 図６Ａ〜６Ｃは、本発明の別の実施態様に従って構成したパターン化基体装置
の作製における工程を描写している。6A-6C depict steps in the fabrication of a patterned substrate device constructed in accordance with another embodiment of the present invention.

【図７】 図７Ａ〜７Ｃは、例えば、図６Ａ〜６Ｃで描写しているように、本発明を実施
することで得られた二重層アレイを上から見た図を描写している。7A-7C depict top-down views of a bilayer array obtained by practicing the present invention, eg, as depicted in FIGS. 6A-6C.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホウヴィス， ジェニファー エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306， パロ アルト， コロラド アベニュー 880 (72)発明者 ボクサー， スティーブン ジー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94304， スタンフォード， メイフィールド ア ベニュー 811 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA21 BB15 BB20 CC03 CC07 FA15 4G075 AA13 AA24 BA05 BD16 CA47 CA53 【要約の続き】 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (72) Inventor Hovis, Jennifer S. United States California 94306, Palo Alto, Colorado Ave 880 (72) Inventor Boxer, Stephen Gee. United States California 94304, Stanford, Mayfield Avenue 811 F Term (reference) 4B029 AA07 AA21 BB15 BB20 CC03 CC07 FA15 4G075 AA13 AA24 BA05 BD16 CA47 CA53 [Continued Summary]

Claims (23)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 基体上に分離脂質領域のパターンを形成する方法であって、
該方法は、以下の工程を包含する： 基体の平面部分を覆って、脂質二重層拡張部を形成する工程であって、該拡張
部は、下部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれている、工程； 該拡張部に、表面突出部のエンボスパターンを有するブロッタを塗布する工程
であって、該突出部は、（ｉ）その上での脂質二重層の形成を支持できる接触面
を有し、そして（ｉｉ）該接触面で結合された分離領域を形成する、工程； 該塗布によって、該接触面と接触する該基体上の該脂質二重層拡張部の領域を
、該接触面に移動させて、該ブロッタを除去したとき、該基体上に、該接触面に
より形成された該分離領域に対応している分離脂質領域のパターンを残す工程。1. A method of forming a pattern of discrete lipid regions on a substrate comprising:
The method includes the steps of: forming a lipid bilayer extension over the planar portion of the substrate, the extension being sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase. A step of applying a blotter having an embossed pattern of surface protrusions to the extension, the protrusions comprising (i) a contact surface capable of supporting formation of a lipid bilayer thereon. And (ii) forming a separate region bound at the contact surface; a region of the lipid bilayer extension on the substrate contacting the contact surface by the coating, the contact surface And removing the blotter, leaving a pattern of separated lipid regions on the substrate corresponding to the separated regions formed by the contact surface. 【請求項２】 前記基体の表面が、ＳｉＯ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2およびマイ
カからなる群から選択される材料から形成される、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the surface of the substrate is formed from a material selected from the group consisting of SiO 2 , MgF 2 , CaF 2 and mica. 【請求項３】 前記接触面が、ＰＤＭＳまたは表面処理ＰＤＭＳから形成さ
れる、請求項１に記載の方法。3. The method of claim 1, wherein the contact surface is formed from PDMS or surface treated PDMS. 【請求項４】 基体上に分離脂質領域のパターンを形成する方法であって、
該方法は、以下の工程を包含する： 接触面上での脂質二重層の形成を支持できる接触面を規定する表面突出部のエ
ンボスパターンを有するブロッタ上で、該接触面に脂質二重層領域を形成する工
程；および 水性媒体で覆われた平面基体を、該ブロッタで打ち抜いて、それにより、該接
触面上の脂質二重層領域を該基体に移動させて、該基体上で、該ブロッタにある
該表面突出部のパターンに対応している脂質二重層領域のパターンを形成する工
程。4. A method of forming a pattern of discrete lipid regions on a substrate, comprising:
The method comprises the following steps: on a blotter having an embossed pattern of surface protrusions that define a contact surface that can support the formation of a lipid bilayer on the contact surface, the contact surface with a lipid bilayer region. Forming; and a planar substrate covered with an aqueous medium is punched with the blotter, thereby transferring the lipid bilayer region on the contact surface to the substrate, on the substrate, at the blotter. Forming a pattern of lipid bilayer regions corresponding to the pattern of the surface protrusions. 【請求項５】 前記第一および第二の表面が、ＳｉＯ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2
およびマイカからなる群から選択される材料から形成される、請求項４に記載の
方法。5. The first and second surfaces are SiO 2 , MgF 2 , CaF 2
5. The method of claim 4, formed from a material selected from the group consisting of and mica. 【請求項６】 前記ブロッタ接触面が、ＰＤＭＳまたは表面酸化ＰＤＭＳか
ら形成される、請求項４に記載の方法。6. The method of claim 4, wherein the blotter contact surface is formed from PDMS or surface oxidized PDMS. 【請求項７】 前記脂質二重層領域を形成する工程が、別の基体上に含まれ
る脂質二重層の平面拡張部に前記ブロッタを塗布して、該二重層領域を該基体か
ら該ブロッタの接触面へと移動する工程を包含する、請求項４に記載の方法。7. The step of forming the lipid bilayer region comprises applying the blotter to a planar extension of a lipid bilayer contained on another substrate to contact the bilayer region from the substrate to the blotter. The method of claim 4 including the step of moving to a surface. 【請求項８】 前記脂質二重層領域を形成する工程が、前記ブロッタの接触
面を水中に沈めた状態で、該接触面を脂質小胞の懸濁液に曝露させる工程を包含
する、請求項４に記載の方法。8. The step of forming the lipid bilayer region comprises exposing the contact surface of the blotter to a suspension of lipid vesicles while the contact surface is submerged in water. The method according to 4. 【請求項９】 表面パターン化装置であって、該装置は、基体および脂質二
重層領域のパターンを含み、該基体は、平面を有し、そして該脂質二重層領域は
、該表面上に形成され、下部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれ、該
脂質領域は、該基体表面上の該領域間に物理的障壁なしで、自己制御式の側方拡
散により、互いから安定に分離される、 装置。9. A surface patterning device, the device comprising a pattern of a substrate and a lipid bilayer region, the substrate having a flat surface, and the lipid bilayer region being formed on the surface. Sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase, the lipid regions are stable from one another by self-regulating lateral diffusion without physical barriers between the regions on the substrate surface. A device that is separated. 【請求項１０】 前記表面が、ＳｉＯ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2およびマイカか
らなる群から選択される材料から形成される、請求項９に記載の装置。10. The device of claim 9, wherein the surface is formed from a material selected from the group consisting of SiO 2 , MgF 2 , CaF 2 and mica. 【請求項１１】 前記脂質二重層拡張部が、ホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン
からなる群から選択される少なくとも１種の脂質を含む、請求項９に記載の装置
。11. The lipid bilayer extension comprises at least one lipid selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and sphingomyelin. 9. The device according to item 9. 【請求項１２】 前記脂質二重層拡張部が、主に、ホスファチジルコリンか
ら構成される、請求項１１に記載の装置。12. The device of claim 11, wherein the lipid bilayer extension is predominantly composed of phosphatidylcholine. 【請求項１３】 少なくとも５×１０3個の別個の二重層適合性表面領域を
含む、請求項９に記載の装置。13. The device of claim 9, comprising at least 5 × 10 3 distinct bilayer compatible surface areas. 【請求項１４】 前記脂質二重層領域が、１μｍと約１０μｍの間の距離だ
け、互いから分離されている、請求項９に記載の装置。14. The device of claim 9, wherein the lipid bilayer regions are separated from each other by a distance of between 1 μm and about 10 μm. 【請求項１５】 １以上の分析物と１以上の選択脂質二重層固着生体分子と
の間の結合事象を検出する際に使用され、さらに、前記脂質二重層領域で固着さ
れた該１以上の生体分子を含む、請求項９に記載の装置。15. Use in detecting a binding event between one or more analytes and one or more selected lipid bilayer anchored biomolecules, further comprising the one or more anchored in the lipid bilayer region. 10. The device of claim 9, which comprises biomolecules. 【請求項１６】 前記１以上の生体分子が、１以上の膜間レセプタまたはイ
オンチャンネルを含む、請求項１５に記載の装置。16. The device of claim 15, wherein the one or more biomolecules comprises one or more transmembrane receptors or ion channels. 【請求項１７】 前記生体分子が、ポリヌクレオチドを含み、そして前記領
域が、別個の領域のアレイの形状であり、各々が、異なる領域で、異なるポリヌ
クレオチドを運ぶ、請求項１５に記載の装置。17. The device of claim 15, wherein the biomolecule comprises a polynucleotide and the regions are in the form of an array of discrete regions, each carrying a different polynucleotide in a different region. . 【請求項１８】 １以上の分析物と１以上の選択脂質二重層固着生体分子と
の間の結合事象を検出する際に使用する方法であって、該方法は、以下の工程を
包含する： （ａ）該分析物を含有する混合物と表面検出器アレイ装置とを接触する工程で
あって、該装置は、（ｉ）基体および（ｉｉ）脂質二重層領域のパターンを含み
、該基体は、平面を有し、そして該脂質二重層領域は、該平面上で形成され、下
部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれ、該領域は、（ｉ）該基体表面
上の該領域間に物理的障壁なしで、自己制御式の側方拡散により、互いから安定
に分離され、そして（ｉｉ）該生体分子の１以上を含む；そして （ｂ）選択配位子と該配位子を特異的に結合するレセプタとの結合を検出する
工程。18. A method for use in detecting a binding event between one or more analytes and one or more selected lipid bilayer anchored biomolecules, the method comprising the steps of: (A) contacting a mixture containing the analyte with a surface detector array device, the device comprising (i) a substrate and (ii) a pattern of lipid bilayer regions, the substrate comprising: A plane and the lipid bilayer region is formed on the plane and sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase, the region being (i) between the regions on the substrate surface. Stable separation from each other by a self-controlled lateral diffusion without a physical barrier, and (ii) containing one or more of said biomolecules; and (b) a selective ligand and said ligand. The step of detecting binding with a receptor that specifically binds. 【請求項１９】 選択ポリヌクレオチド分析物についての配列情報を決定す
るのに使用され、前記生体分子が、ポリヌクレオチドである、請求項１８に記載
の方法。19. The method of claim 18, wherein the biomolecule used to determine sequence information for a selected polynucleotide analyte is a polynucleotide. 【請求項２０】 基体の表面上で選択パターンを生じる微細加工方法であっ
て、該方法は、以下の工程を包含する： 該基体の平面部分を覆って、脂質二重層領域のパターンを形成する工程であっ
て、該脂質二重層領域は、下部水性フィルムと上部バルク水相との間に挟まれ、
該パターンは、該選択パターンに対応しており、そして該脂質二重層領域は、該
基体表面上の該領域間に物理的障壁なしで、自己制御式の側方拡散により、互い
から安定に分離される；および さらに、該基体を処理して、所望選択パターンを達成する工程。20. A microfabrication method for producing a selected pattern on the surface of a substrate, which method comprises the steps of: forming a pattern of lipid bilayer regions over a planar portion of the substrate. Wherein the lipid bilayer region is sandwiched between a lower aqueous film and an upper bulk aqueous phase,
The pattern corresponds to the selection pattern, and the lipid bilayer regions are stably separated from each other by self-regulating lateral diffusion without physical barriers between the regions on the substrate surface. And further treating the substrate to achieve the desired selected pattern. 【請求項２１】 印刷媒体の表面で選択パターンを生じる印刷方法であって
、該方法は、以下の工程を包含する： 接触面上での脂質二重層の形成を支持できる接触面を規定する表面突出部のエ
ンボスパターンを有するブロッタ上で、該接触面に脂質二重層領域を形成する工
程； 該ブロッタを該印刷媒体上に打ち抜いて、それにより、該ブロッタ上の該脂質
二重層領域を該印刷媒体に移動する工程；および さらに、該印刷媒体を処理して、該媒体上の該脂質二重層領域のパターンに関
連した可視パターンを形成する工程。21. A printing method for producing a selected pattern on the surface of a print medium, the method comprising the steps of: a surface defining a contact surface capable of supporting formation of a lipid bilayer on the contact surface. Forming a lipid bilayer region on the contact surface on a blotter having an embossed pattern of protrusions; punching the blotter onto the print medium, thereby printing the lipid bilayer region on the blotter. Transferring to the medium; and further processing the print medium to form a visible pattern associated with the pattern of the lipid bilayer regions on the medium. 【請求項２２】 分離脂質領域のアレイを形成する方法であって、該方法は
、以下の工程を包含する： 接触面上での脂質二重層の形成を支持できる接触面を規定する表面突出部のエ
ンボスパターンを有するブロッタ上で、該接触面に脂質二重層領域を形成する工
程； 表面領域上の脂質二重層を支持できる表面領域を有する基体に、該脂質二重層
領域を移動する工程であって、該領域は、このような領域における脂質二重層の
側方拡張を制限する障壁により分離されており、ここで、該移動は、該基体領域
を該ブロット上の脂質二重層で部分的に満たすのに有効である、工程；および 該基体領域に追加の二重層形成脂質を添加して、それにより、各基体表面領域
を脂質二重層で満たす工程。22. A method of forming an array of discrete lipid regions, the method comprising the steps of: surface overhanging defining a contact surface capable of supporting formation of a lipid bilayer on the contact surface. A step of forming a lipid bilayer region on the contact surface on a blotter having an embossed pattern; a step of moving the lipid bilayer region to a substrate having a surface region capable of supporting the lipid bilayer on the surface region. Thus, the regions are separated by a barrier that limits the lateral expansion of the lipid bilayer in such regions, where the migration partially causes the substrate region to be in the lipid bilayer on the blot. Effective for filling; and adding an additional bilayer-forming lipid to the substrate region, thereby filling each substrate surface region with a lipid bilayer. 【請求項２３】 前記ブロット上の前記脂質二重層領域が、選択した既知量
の１以上の脂質会合生体分子を含み、前記添加が、前記基体上に、既知割合の脂
質および脂質会合生体分子で、分離脂質二重層領域を形成するのに有効である、
請求項２２に記載の方法。23. The lipid bilayer region on the blot comprises a selected known amount of one or more lipid-associated biomolecules, and the loading comprises a known proportion of lipid and lipid-associated biomolecules on the substrate. , Effective in forming a separated lipid bilayer region,
23. The method of claim 22.
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