JP2003511352A - Dopaminergic neuron survival promoting factor and its use - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アルギニンリッチ蛋白質および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を特徴とする。本発明はまた、神経変性疾患の治療のための方法、細胞移植の実施中または後のニューロンの生存性を改善するための方法、移植用のニューロンの作製のための方法、およびアルギニンリッチ蛋白質の生物活性を調節または模倣する化合物を同定するための方法も特徴とする。   (57) [Summary] The invention features a pharmaceutical composition comprising an arginine-rich protein and a pharmaceutically acceptable excipient. The present invention also provides a method for treating a neurodegenerative disease, a method for improving the survival of neurons during or after cell transplantation, a method for making neurons for transplantation, and a method for producing arginine-rich proteins. Also featured are methods for identifying compounds that modulate or mimic biological activity.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】発明の背景 本発明は、ニューロンの生存性を高めるための組成物および方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to compositions and methods for enhancing neuronal viability.

【０００２】 末梢神経系および中枢神経系（それぞれPNSおよびCNS）におけるニューロンの
成長、生存および分化は、一部には、標的に由来するパラ分泌型および自己分泌
型の神経栄養因子に依存する。その反対に、神経栄養因子の欠乏は、パーキンソ
ン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルーゲーリッグ
病）などの神経変性疾患の発症に役割を果たすと考えられている。ニューロン培
養物における神経栄養の補給は、アストロサイトとの共培養により、またはアス
トロサイトから調製された馴化培地（CM）を供給することによって得られる。中
脳腹側由来のアストロサイトは、新線条体および大脳皮質などのCNSの他の領域
からのアストロサイトと比べて、中脳腹側ドーパミン作動性ニューロンの生存を
促進する効果がはるかに高い。インビトロ培養日数（days in vitro（DIV))が21
日間またはそれ以上である長期中脳培養物において、ドーパミン作動性ニューロ
ンの比率は、アストロサイト単層の増殖と一致して20％から60％上昇する。これ
に対して、アストロサイトの増殖が阻害される条件では、ドーパミン作動性ニュ
ーロンは5 DIVまでにほとんど消失したが、GABA作動性ニューロンはそうでなか
った。これらの結果は、近傍のドーパミン作動性ニューロンの生存および発生に
おける同型由来アストロサイトの意義を示すとともに、中脳アストロサイトが中
脳ドーパミン作動性ニューロンに対する生理的なパラ分泌型神経栄養因子の供給
源である可能性が高いことを示唆している。[0002] Neuronal growth, survival and differentiation in the peripheral and central nervous systems (PNS and CNS, respectively) depend in part on target-derived paracrine and autocrine neurotrophic factors. Conversely, deficiency of neurotrophic factors is thought to play a role in the development of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS or Rougerig's disease). Neurotrophic supplementation in neuronal cultures is obtained by co-culturing with astrocytes or by supplying conditioned medium (CM) prepared from astrocytes. Ventral midbrain-derived astrocytes are much more effective at promoting ventral midbrain dopaminergic neuron survival than astrocytes from other areas of the CNS, such as the neostriatum and cerebral cortex . 21 days in vitro culture ( d ays i n v itro (DIV))
In long-term midbrain cultures that are days or longer, the proportion of dopaminergic neurons increases by 20% to 60%, consistent with the proliferation of astrocyte monolayers. In contrast, dopaminergic neurons almost disappeared by 5 DIV in the absence of astrocyte proliferation, whereas GABAergic neurons did not. These results demonstrate the significance of homotypic astrocytes in the survival and development of nearby dopaminergic neurons, and that midbrain astrocytes provide a physiological source of paracrine neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Is likely to be.

【０００３】 アストロサイトがニューロンの生存を促進する分子を分泌することが繰り返し
示されていることから、アストロサイトは神経変性疾患を治療するための治療薬
の探索における中心となっている。多くの研究施設がアストロサイトに由来する
神経栄養因子を単離することを試みているが、大きな技術的問題によって阻まれ
ている。それは、培養下にある初代アストロサイトの最適な増殖のためには血清
が培地の必須成分であるものの、血清の存在は馴化培地中に分泌された因子を後
に精製する妨げになるというものである。[0003] Astrocytes have been central to the search for therapeutic agents to treat neurodegenerative diseases, as the repeated indications that astrocytes secrete molecules that promote neuronal survival. Many laboratories have attempted to isolate neurotrophic factors derived from astrocytes, but have been hampered by major technical problems. That is, although serum is an essential component of the medium for optimal growth of primary astrocytes in culture, the presence of serum interferes with the subsequent purification of secreted factors in conditioned medium. .

【０００４】 したがって、新規の神経栄養因子を同定および精製すること、ならびに蛋白質
単離法との適合性がある馴化培地を生産するための新規の方法を同定することに
は必要である。Therefore, there is a need to identify and purify new neurotrophic factors and to identify new methods for producing conditioned media that are compatible with protein isolation methods.

【０００５】発明の概要 本発明者らは、中脳腹側細胞系-1（VMCL-1）と命名した、自発的に不死化した
1型アストロサイト様細胞系を単離した。この細胞系は米国菌培養収養所（Ameri
can Type Culture Collection）（ATCC；Manassas、VA；ATCCアクセッション番
号：____、受託日2000年9月18日）に受託されており、中脳腹側に由来し、初代1
型アストロサイトの特徴を保っているが、無血清培地中で盛んに増殖する。これ
らの細胞から調製されるCMは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存性を少な
くとも3倍に増加させる1つまたは複数のニューロン生存因子を含んでおり、それ
らの発生も促進する。インビトロでのドーパミン作動性ニューロンに対する神経
栄養活性がこのように強く毒性の程度が少ないことがVMCL-1 CMの活性の顕著な
特徴である。さらに、本発明者らはサイズ分画法を用いて、約14〜16キロダルト
ン、18〜21キロダルトンおよび25〜35キロダルトンで溶出する活性を同定した。
VMCL-1不死化細胞系は増殖のために血清を要しないため、本発明者らがVMCL-1 C
Mニューロンの生存促進性ポリペプチドを同定することが可能となる。[0005] SUMMARY The present inventors of the invention have been named midbrain ventral cell lines -1 (VMCL-1), and spontaneously immortalized
A type 1 astrocyte-like cell line was isolated. This cell line is based on the American Cultivation Farm (Ameri
can Type Culture Collection) (ATCC; Manassas, VA; ATCC accession number: ____, contract date September 18, 2000).
It retains the characteristics of type astrocytes but grows vigorously in serum-free medium. CM prepared from these cells contains one or more neuronal survival factors that increase viability of midbrain dopaminergic neurons by at least 3-fold and also promote their development. This strong and less toxic neurotrophic activity on dopaminergic neurons in vitro is a hallmark of the activity of VMCL-1 CM. In addition, we used size fractionation methods to identify activities eluting at about 14-16 kilodaltons, 18-21 kilodaltons and 25-35 kilodaltons.
Since the VMCL-1 immortalized cell line does not require serum for growth, we have determined that VMCL-1 C
It will be possible to identify pro-survival polypeptides of M neurons.

【０００６】 本発明者らは、多段階精製プロセスを用いて、ニューロン生存促進活性と同時
精製される蛋白質としてアルギニンリッチ蛋白質（分子量約20キロダルトン）を
同定した。本蛋白質および活性は5段階の精製工程で同時精製されたことから、
本発明者らはこの蛋白質が、所望のニューロン生存促進活性を有するVMCL-1 CM
中の因子の1つであると結論づけている。The present inventors have used a multi-step purification process to identify an arginine-rich protein (molecular weight about 20 kilodaltons) as a protein that is co-purified with neuronal survival promoting activity. Since this protein and activity were co-purified in five purification steps,
We found that this protein has VMCL-1 CM with the desired neuronal survival promoting activity.
It is concluded that it is one of the factors.

【０００７】 したがって、本発明は一般に、ニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニュー
ロン）の生存性を高めるための方法、さらにはこのようなニューロン生存促進活
性を示す新規のポリペプチドを特徴とする。Accordingly, the invention generally features methods for enhancing the viability of neurons (eg, dopaminergic neurons), as well as novel polypeptides that exhibit such neuronal survival promoting activity.

【０００８】 第1の局面において、本発明は、活性ポリペプチドとしての実質的に純粋なア
ルギニンリッチ蛋白質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を特徴
とする。1つの好ましい態様において、アルギニンリッチ蛋白質はヒトアルギニ
ンリッチ蛋白質（配列番号：1）である。In a first aspect, the invention features a pharmaceutical composition that includes a substantially pure arginine-rich protein as an active polypeptide and a pharmaceutically acceptable carrier. In one preferred embodiment, the arginine rich protein is human arginine rich protein (SEQ ID NO: 1).

【０００９】 第2の局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高め
る分子量約14〜16キロダルトンの実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。In a second aspect, the invention features a substantially pure polypeptide having a molecular weight of about 14-16 kilodaltons that enhances the survival of dopaminergic neurons.

【００１０】 第3の局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高め
る分子量約18〜21キロダルトンの実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。In a third aspect, the invention features a substantially pure polypeptide with a molecular weight of about 18-21 kilodaltons that enhances the survival of dopaminergic neurons.

【００１１】 第4の局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高め
る分子量約25〜35キロダルトンの実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。In a fourth aspect, the invention features a substantially pure polypeptide having a molecular weight of about 25-35 kilodaltons that enhances the survival of dopaminergic neurons.

【００１２】 本発明のポリペプチドは、VMCL-1または別の不死化1型アストロサイト細胞系
などのグリア細胞系から入手可能である。第1、第2、第3または第4の局面の好ま
しい態様において、ドーパミン作動性ニューロンの生存性は少なくとも3倍に高
まる。より好ましくは、生存性は少なくとも4倍に高まり、最も好ましくは生存
性は少なくとも5倍に高まる。The polypeptides of the present invention are available from glial cell lines such as VMCL-1 or another immortalized type 1 astrocyte cell line. In a preferred embodiment of the first, second, third or fourth aspect the survival of dopaminergic neurons is increased at least 3-fold. More preferably, viability is increased at least 4-fold, and most preferably viability is increased at least 5-fold.

【００１３】 もう1つの局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存性を
高めるための方法を特徴とする。本方法は、ドーパミン作動性ニューロン（イン
ビトロまたはインビボで）を第1、第2、第3または第4の局面のポリペプチドと接
触させることを含む。好ましいポリペプチドはヒトアルギニンリッチ蛋白質であ
る。好ましくは、ドーパミン作動性ニューロンの生存性は少なくとも3倍、より
好ましくは少なくとも4倍に高まり、最も好ましくは少なくとも5倍に高まる。In another aspect, the invention features a method for enhancing the survival of dopaminergic neurons. The method comprises contacting a dopaminergic neuron (in vitro or in vivo) with a polypeptide of the first, second, third or fourth aspect. A preferred polypeptide is the human arginine rich protein. Preferably, the survival of dopaminergic neurons is increased at least 3-fold, more preferably at least 4-fold, and most preferably at least 5-fold.

【００１４】 もう1つの局面において、本発明は、ニューロンまたはその前駆細胞を第1、第
2、第3または第4の局面のポリペプチドの有効量とともに培養する段階を含む、
ドーパミン作動性ニューロンを移植用に増殖させるための方法を特徴とする。上
記の通り、好ましいポリペプチドはヒトアルギニンリッチ蛋白質である。好まし
い態様において、この量はドーパミン作動性ニューロンの生存性を少なくとも3
倍、少なくとも4倍、またはさらには少なくとも5倍に高めるためには十分である
。In another aspect, the invention provides a neuron or a progenitor cell thereof, which comprises
2, comprising culturing with an effective amount of the polypeptide of the third or fourth aspect,
Features a method for expanding dopaminergic neurons for transplantation. As mentioned above, the preferred polypeptide is the human arginine rich protein. In a preferred embodiment, this amount provides at least 3 viability of dopaminergic neurons.
Sufficient to increase fold, at least 4 fold, or even at least 5 fold.

【００１５】 さらにもう1つの局面において、本発明は、神経系の疾患または障害を有する
患者を治療するための方法を特徴とし、本方法は実質的に精製されたアルギニン
リッチ蛋白質の生存促進量（survival-promoting amount）を患者に投与する段
階を含む。In yet another aspect, the invention features a method for treating a patient having a disease or disorder of the nervous system, the method comprising a pro-survival amount of a substantially purified arginine-rich protein ( survival-promoting amount) to the patient.

【００１６】 さらにもう1つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるドーパミン作動
性ニューロンの細胞死を予防するためのもう1つの方法を特徴とする。本方法は
、実質的に精製されたアルギニンリッチ蛋白質のドーパミン作動性ニューロン生
存促進量を哺乳動物に投与することを含む。好ましい哺乳動物はヒトである。[0016] In yet another aspect, the invention features another method for preventing cell death of dopaminergic neurons in a mammal. The method comprises administering to the mammal a dopaminergic neuron survival-promoting amount of a substantially purified arginine-rich protein. The preferred mammal is a human.

【００１７】 本発明はまた、細胞を哺乳動物の神経系に移植する方法であって、（i）細胞
を哺乳動物の神経系に移植すること；および（ii）細胞を移植する4時間前から
細胞移植の4時間後までの時間窓（time window）の間に、アルギニンリッチ蛋白
質（例えば、ヒトアルギニンリッチ蛋白質）のドーパミン作動性ニューロン生存
促進量を哺乳動物（例えば、ヒト）に投与すること、を含む方法を特徴とする。
好ましい態様において、時間窓は細胞移植の2時間前から細胞移植2時間後までで
ある。The present invention is also a method of transplanting cells into a mammalian nervous system, comprising: (i) transplanting cells into a mammalian nervous system; and (ii) starting 4 hours prior to transplanting the cells. Administering a dopaminergic neuron survival-promoting amount of an arginine-rich protein (eg, human arginine-rich protein) to a mammal (eg, human) during a time window up to 4 hours after cell transplantation, Is characterized by a method including.
In a preferred embodiment, the time window is from 2 hours before cell transplantation to 2 hours after cell transplantation.

【００１８】 本発明は、細胞を哺乳動物の神経系に移植するもう1つの方法を特徴とする。
本方法では、細胞をアルギニンリッチ蛋白質と接触させ、続いて哺乳動物の神経
系に移植する。好ましくは、これらの2つの段階は互いに4時間以内に行う。The invention features another method of transplanting cells into the nervous system of a mammal.
In this method, cells are contacted with an arginine-rich protein and subsequently transplanted into the mammalian nervous system. Preferably, these two steps are performed within 4 hours of each other.

【００１９】 さらにもう1つの局面において、本発明は、不死化1型アストロサイト細胞系を
ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養することを含む、本発明のドーパミ
ン作動性ニューロン生存促進ポリペプチドの調製のための方法を特徴とする。In yet another aspect, the invention provides that the dopaminergic neuron survival promoting polypeptide of the invention comprises culturing an immortalized type 1 astrocyte cell line under conditions that permit expression of the polypeptide. A method for the preparation of

【００２０】 さらにもう1つの局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生
存性を高めるポリペプチドであって、分子量が約14〜16キロダルトン、約18〜21
キロダルトンまたは約25〜35キロダルトンであるポリペプチドを含む、実質的に
純粋な組成物を特徴とする。In yet another aspect, the invention is a polypeptide that enhances the survival of dopaminergic neurons, having a molecular weight of about 14-16 kilodaltons, about 18-21.
A substantially pure composition comprising a polypeptide that is kilodaltons or about 25-35 kilodaltons is featured.

【００２１】 本発明のポリペプチドまたは組成物を用いる疾患および障害の治療のための方
法も本発明の特徴である。例えば、記載のポリペプチドを用いて神経系の疾患ま
たは障害（例えば、パーキンソン病）の治療方法を遂行することができる。A method for the treatment of diseases and disorders using the polypeptides or compositions of the invention is also a feature of the invention. For example, the described polypeptides can be used to perform methods of treating diseases or disorders of the nervous system (eg, Parkinson's disease).

【００２２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの有効量を投与することによってドーパ
ミン作動性ニューロンの細胞死を防止するための方法も特徴とする。このような
薬物療法は、ポリペプチドを薬学的に許容される担体とともに投与することによ
って行われる。The invention also features methods for preventing cell death of dopaminergic neurons by administering an effective amount of a polypeptide of the invention. Such drug therapy is performed by administering the polypeptide with a pharmaceutically acceptable carrier.

【００２３】 本発明は、医薬品の製造における第1、第2、第3または第4の局面のポリペプチ
ドの使用を特徴とする。The invention features the use of the polypeptide of the first, second, third or fourth aspect in the manufacture of a medicament.

【００２４】 本発明はさらに、（1）選択的に治療または診断の目的に用いることが可能な
抗体を産生させる目的で哺乳動物を免疫化するための、（2）ポリペプチドのも
のに対応する受容体結合特性を有する分子の同定または定量化のための競合アッ
セイ法における、（3）ポリペプチドに対する結合の競合阻害を検出する目的で
、ポリペプチドと特異的に結合しうる受容体とともに試料を上記のポリペプチド
と接触させるための、および（4）対応する受容体の単離のためのアフィニティ
ー単離工程、選択的にはアフィニティークロマトグラフィーにおける、本明細書
に定義するポリペプチドの使用を特徴とする。The invention further corresponds to (2) of the polypeptide for (1) immunizing a mammal for the purpose of producing antibodies which can be selectively used for therapeutic or diagnostic purposes. (3) In a competitive assay for the identification or quantification of molecules having receptor-binding properties, (3) a sample with a receptor capable of specifically binding to a polypeptide for the purpose of detecting competitive inhibition of binding to the polypeptide. Characterized by the use of a polypeptide as defined herein in an affinity isolation step, optionally for affinity chromatography, for contacting said polypeptide and (4) isolating the corresponding receptor. And

【００２５】 上記の通り、本発明は、既知の因子とは区別しうる、哺乳動物供給源に由来す
る新規のドーパミン作動性ニューロン生存因子（例えばアルギニンリッチ蛋白質
）を提供する。これらの因子はドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する。
本発明はまた、これらの因子の調製のための工程、ならびに上記およびその他の
因子の活性を定義するための方法も提供する。因子の治療的応用は本発明のさら
に重要な1つの局面である。As noted above, the present invention provides novel dopaminergic neuronal survival factors (eg, arginine-rich protein) derived from mammalian sources that are distinguishable from known factors. These factors promote the survival of dopaminergic neurons.
The invention also provides steps for the preparation of these factors, as well as methods for defining the activity of these and other factors. The therapeutic application of the factor is one more important aspect of the invention.

【００２６】 その他の局面において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高
めるポリペプチドであって、ヘパリンセファロースCL-6Bカラム（Sigma Chemica
ls、St. Louis、MO）を用いた判定で分子量が約14〜16キロダルトンまたは25〜3
5キロダルトン（15〜102kDaの範囲の既知の分子量を有する蛋白質を同じ条件下
で用いた場合と対比して）であり、ドーパミン作動性ニューロンの生存促進活性
を有するポリペプチドを特徴とする。引用した分子量の範囲限界は厳密ではなく
、個々のポリペプチド因子の由来に応じて多少の変動があることは理解されると
考えられる。例えば、別の由来からの材料に関しては約10％の変動も不可能では
ないと考えられる。In another aspect, the invention provides a polypeptide that enhances the survival of dopaminergic neurons, comprising a heparin sepharose CL-6B column (Sigma Chemica).
ls, St. Louis, MO) with a molecular weight of approximately 14-16 kilodaltons or 25-3
5 kilodaltons (as compared to proteins with known molecular weights in the range of 15-102 kDa used under the same conditions), characterized by polypeptides with pro-survival activity for dopaminergic neurons. It will be appreciated that the range limits of the recited molecular weights are not critical and may vary somewhat depending on the origin of the individual polypeptide factors. For example, a variation of about 10% may not be possible for materials from other sources.

【００２７】 もう1つの局面において、本発明は、薬学的用途用に製剤化した本発明のポリ
ペプチドを、選択的には許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤ともに、および
／または単位投薬式剤形（unit dosage form）として含む、薬学的製剤を特徴と
する。本発明の因子を用いる際には、適した製剤または組成物を提供するために
従来の薬学的常法を用いてよい。例えば、実質的に純粋なポリペプチドとともに
存在する可能性のある任意のウイルス病原体を除去または不活性化すること、お
よび実質的に純粋なポリペプチドとともに存在する任意の毒性化合物を除去する
ために同様の予防策を講じることが好ましい。1つの態様において、薬学的製剤
は移植用の細胞（例えば、ドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆細胞）を
含む。In another aspect, the invention provides a polypeptide of the invention formulated for pharmaceutical use, optionally with an acceptable diluent, carrier or excipient, and / or in a unit dose. It is characterized by a pharmaceutical formulation, including as a unit dosage form. In using the agents of the present invention, conventional pharmaceutical methods may be used to provide suitable formulations or compositions. For example, to remove or inactivate any viral pathogens that may be present with the substantially pure polypeptide, as well as to remove any toxic compounds present with the substantially pure polypeptide. It is preferable to take precautionary measures. In one embodiment, the pharmaceutical formulation comprises cells for transplantation (eg, dopaminergic neurons or progenitor cells thereof).

【００２８】 もう1つの局面において、本発明は、移植細胞（例えばドーパミン作動性ニュ
ーロンまたはその前駆細胞）を哺乳動物の神経系に移植する方法を特徴とする。
本方法は、薬学的に許容される担体中にある本発明のポリペプチドまたは組成物
を細胞移植の前、実施中または後に哺乳動物に投与することを含む。In another aspect, the invention features a method of transplanting transplanted cells (eg, dopaminergic neurons or progenitor cells thereof) into the mammalian nervous system.
The method comprises administering to the mammal a polypeptide or composition of the invention in a pharmaceutically acceptable carrier prior to, during or after cell transplantation.

【００２９】 ポリペプチドまたは組成物は、移植の4時間前から移植4時間後までの時間窓の
間に哺乳動物に投与することが好ましい。より好ましくは、時間窓は移植2時間
前から移植2時間後までである。細胞死を予防または減少させるためにポリペプ
チドまたは組成物が時間窓の全体にわたって存在する必要はないことが理解され
ている。The polypeptide or composition is preferably administered to the mammal during a time window from 4 hours before transplantation to 4 hours after transplantation. More preferably, the time window is from 2 hours before transplantation to 2 hours after transplantation. It is understood that the polypeptide or composition need not be present throughout the time window to prevent or reduce cell death.

【００３０】 1つの関連した局面において、本発明は、細胞を哺乳動物の神経系に移植する
もう1つの方法を特徴とする。本方法は、移植しようとする細胞を、薬学的に許
容される担体中にある本発明のポリペプチドまたは組成物と細胞移植の前に接触
させることを含む。In one related aspect, the invention features another method of transplanting cells into the mammalian nervous system. The method comprises contacting the cells to be transplanted with a polypeptide or composition of the invention in a pharmaceutically acceptable carrier prior to cell transplantation.

【００３１】 移植しようとする細胞は、移植4時間以内、より好ましくは移植2時間以内にポ
リペプチドまたは組成物と接触させることが好ましい。移植後の細胞死を予防ま
たは減少させるためにポリペプチドまたは組成物がそのすべての時間にわたって
存在する必要はないことが理解されている。The cells to be transplanted are preferably contacted with the polypeptide or composition within 4 hours of transplantation, more preferably within 2 hours of transplantation. It is understood that the polypeptide or composition need not be present for all of its time to prevent or reduce cell death after transplantation.

【００３２】 非経口製剤は液体溶液または懸濁液の形態であってよく、経口投与用の製剤は
錠剤またはカプセル剤の形態であってよく、鼻腔内投与用の製剤は粉剤、点鼻薬
またはエアロゾルの形態であってよい。Parenteral formulations may be in the form of liquid solutions or suspensions, formulations for oral administration may be in the form of tablets or capsules, formulations for intranasal administration may be powders, nose drops or aerosols. It may be in the form of.

【００３３】 製剤を製造するための当技術分野で周知の方法は、例えば、「レミントン：薬 学の理論および実践（Remington: The Science and Practice of Pharmacy） 」
（第19版、ジェンナーロ（A.R. Gennaro AR.）編、1995、Mack Publishing Comp
any、Easton、PAに記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤と
して滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレング
リコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含んでよく、本因子の放出
を制御するために、生体適合性で生分解性のラクチド重合体、またはポリオキシ
エチレン-ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。因子に関する有用と
思われるその他の非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニル共重合体粒子
、浸透ポンプ、埋め込み型注入システムおよびリポソームが含まれる。吸入用の
製剤は、賦形剤として例えばラクトースなどを含んでもよく、例えばポリオキシ
エチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含む
水性溶液であってもよく、点鼻薬の形態にある投与用の油性溶液であってもよく
、または鼻腔内に適用するためのゲルであってもよい。[0033] methods well known in the art for the formulation is prepared, for example, "Remington: pharmacology of theory and practice (Remington: The Science and Practice of Pharmacy) "
(19th edition, AR Gennaro AR.), 1995, Mack Publishing Comp
It is listed in any, Easton, PA. Formulations for parenteral administration may include, for example, sterile water or saline as the excipient, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, oils of plant origin, or hydrogenated naphthalene to control the release of the factor. For this purpose, biocompatible and biodegradable lactide polymers or polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers may be used. Other parenteral delivery systems that may be useful for agents include ethylene-vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, implantable infusion systems and liposomes. Formulations for inhalation may include, for example, lactose as an excipient, may be an aqueous solution containing, for example, polyoxyethylene-9-lauryl ether, glycocholic acid and deoxycholic acid, in the form of nasal drops. It may be an oily solution for certain administrations or it may be a gel for intranasal application.

【００３４】 本因子は唯一の活性作用物質として用いることもでき、または他の有効成分、
例えば、神経疾患においてニューロンの生存を促進する可能性のある他の増殖因
子、またはペプチダーゼもしくはプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いること
もできる。The agent may also be used as the sole active agent, or other active ingredient,
It can also be used, for example, in combination with other growth factors or peptidase or protease inhibitors that may promote neuronal survival in neurological disorders.

【００３５】 本発明の製剤における本因子の濃度は、投与しようとする用量および投与経路
を含む、数多くの点に応じて変わると考えられる。The concentration of the agent in the formulations of the invention will depend on a number of factors, including the dose to be administered and the route of administration.

【００３６】 一般的にいって、非経口投与の場合、本発明の因子は、約0.1〜10％w／vのポ
リペプチドを含む水性生理的緩衝液中にある形で提供される。一般的な投与量の
範囲は約1mg／kg〜約1g／kg体重・日であり、好ましい投与量の範囲は約0.01mg／
kg〜100mg／kg体重・日である。投与される好ましい投与量は、取り扱う病態生理
学的状態の種類および進行の程度、患者の全般的健康状態、製剤の構成および投
与経路に依存する可能性が高い。Generally, for parenteral administration, the agents of the invention are provided in an aqueous physiological buffer containing about 0.1-10% w / v of the polypeptide. A typical dosage range is about 1 mg / kg to about 1 g / kg body weight per day, with a preferred dosage range of about 0.01 mg / kg.
kg to 100 mg / kg body weight / day. The preferred dose administered will likely depend on the type and extent of progression of the pathophysiological condition being treated, the general health of the patient, the composition of the formulation and the route of administration.

【００３７】 上に示した通り、本発明の因子の存在下で、ドーパミン作動性ニューロンの大
部分では死滅が防止される。パーキンソン病の患者では中脳のドーパミン作動性
ニューロンが死滅する。このため、本発明はパーキンソン病の治療法を提供する
。さらに、ドーパミン作動性ニューロンの欠乏が存在するか、または予想される
神経系の障害または疾患の治療における本因子の使用も本発明に含まれる。As indicated above, in the presence of the agents of the invention, death is prevented in the majority of dopaminergic neurons. Patients with Parkinson's disease die of midbrain dopaminergic neurons. Therefore, the present invention provides a method for treating Parkinson's disease. Further included in the invention is the use of the agent in the treatment of nervous system disorders or diseases in which there is or is a probable dopaminergic neuron deficiency.

【００３８】 本発明はまた、アルギニンリッチニューロン生存促進活性を増強または模倣す
る因子を同定するためのスクリーニング法も特徴とする。増強因子に関するこれ
らのスクリーニング法では、候補化合物がアルギニンリッチ蛋白質の発現、安定
性または生物活性を高める能力を、標準的な方法を用いて検査する。アルギニン
リッチ蛋白質と結合する候補化合物は増強剤（potentiating agent）として作用
する可能性がある。または、模倣物（例えば、アルギニンリッチ蛋白質の受容体
と結合する化合物）は、アルギニンリッチ蛋白質の非存在下で作用しうる。The invention also features screening methods for identifying factors that enhance or mimic arginine-rich neuron survival-promoting activity. In these screening methods for enhancers, the ability of candidate compounds to enhance the expression, stability or biological activity of arginine rich proteins is tested using standard methods. Candidate compounds that bind to arginine-rich proteins may act as potentiating agents. Alternatively, a mimetic (eg, a compound that binds to a receptor for an arginine rich protein) can act in the absence of the arginine rich protein.

【００３９】 「実質的に純粋な」とは、ポリペプチド（例えば、アルギニンリッチ蛋白質）
が、本来それに付随する成分から分離されていることを意味する。一般的には、
ポリペプチドは、本来それに付随する蛋白質および天然有機分子を除いた比率が
重量比で少なくとも60％である場合に、実質的に純粋であるという。好ましくは
、ポリペプチドは、純度が重量比で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも
90％、最も好ましくは少なくとも99％であるアルギニンリッチ蛋白質である。実
質的に純粋なアルギニンリッチ蛋白質は、例えば、天然の供給源（例えば神経細
胞）からの抽出により、アルギニンリッチ蛋白質をコードする組換え核酸の発現
により、または蛋白質の化学合成によって入手しうる。純度は、例えば、カラム
クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析などの任
意の適切な方法によって測定可能である。“Substantially pure” refers to a polypeptide (eg, an arginine-rich protein)
Is separated from the components that originally accompany it. In general,
A polypeptide is said to be substantially pure when the proportion of proteins and naturally occurring organic molecules with which it is associated is at least 60% by weight. Preferably, the polypeptide is at least 75% pure by weight, more preferably at least 75% by weight.
90%, most preferably at least 99% arginine rich protein. Substantially pure arginine-rich protein may be obtained, for example, by extraction from a natural source (eg nerve cells), by expression of a recombinant nucleic acid encoding the arginine-rich protein, or by chemical synthesis of the protein. Purity can be measured by any suitable method such as, for example, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis or HPLC analysis.

【００４０】 ポリペプチドは、その天然の状態で付随する混入物から分離されている場合に
、それに天然に付随する成分を実質的に含まない。このため、化学合成された、
またはその天然の源である細胞とは異なる細胞システムにおいて産生されたポリ
ペプチドは、それに天然に付随する成分を実質的に含まないと考えられる。した
がって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に天然にみられるものだけ
でなく、大腸菌（E. coli）または他の原核生物において合成されるものも含ま
れる。A polypeptide is substantially free of its naturally associated components when separated from its naturally associated contaminants. Therefore, it was chemically synthesized,
Alternatively, a polypeptide produced in a cellular system different from the cell from which it naturally originates is considered to be substantially free of components naturally associated with it. Thus, substantially pure polypeptides include those naturally occurring in eukaryotes, as well as those synthesized in E. coli or other prokaryotes.

【００４１】 「ポリペプチド」または「蛋白質」とは、グリコシル化またはリン酸化などの
翻訳後修飾の有無とは無関係に、2つを上回るアミノ酸の任意の鎖を意味する。By “polypeptide” or “protein” is meant any chain of more than two amino acids, with or without post-translational modifications such as glycosylation or phosphorylation.

【００４２】 本発明の一部であるアルギニンリッチ蛋白質には、ドーパミン作動性ニューロ
ン生存促進活性を有し、ヒトアルギニンリッチ蛋白質をコードするcDNAと高スト
リンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる蛋白質が含
まれる。好ましいアルギニンリッチ蛋白質は、配列番号：1のアミノ酸配列によ
って表されている。The arginine-rich protein, which is a part of the present invention, is a protein encoded by a nucleic acid which has a dopaminergic neuron survival promoting activity and hybridizes with a cDNA encoding a human arginine-rich protein under high stringency conditions. Is included. A preferred arginine-rich protein is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

【００４３】 本発明の一部である核酸には、ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を有
する蛋白質をコードし、ヒトアルギニンリッチ蛋白質をコードするcDNA（配列番
号：5）の鎖の一方と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸が含
まれる。好ましい核酸は、配列番号：5のヌクレオチド配列によって表されてい
る。The nucleic acid which is a part of the present invention includes a protein having a dopaminergic neuron survival promoting activity, one of the strands of the cDNA (SEQ ID NO: 5) encoding a human arginine-rich protein, and high stringency. Nucleic acids that hybridize under the conditions are included. A preferred nucleic acid is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

【００４４】 「実質的に同一な」とは、参照されるアミノ酸または核酸配列と少なくとも50
％、好ましくは85％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％同一であるポ
リペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較する配列の長
さは一般に少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ま
しくは少なくとも25アミノ酸であり、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸に
ついては、比較する配列の長さは一般に少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは
少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチドであり、
最も好ましくは110ヌクレオチドである。“Substantially identical” means at least 50 amino acid or nucleic acid sequences to which they are referenced.
%, Preferably 85%, more preferably 90%, most preferably 95% identical to a polypeptide or nucleic acid. For polypeptides, the length of comparison sequences will generally be at least 16 amino acids, preferably at least 20 amino acids, more preferably at least 25 amino acids, and most preferably 35 amino acids. For nucleic acids, the length of the compared sequences is generally at least 50 nucleotides, preferably at least 60 nucleotides, more preferably at least 75 nucleotides,
Most preferably 110 nucleotides.

【００４５】 配列の同一性は、配列解析ソフトウエア（例えば、ウィスコンシン大学バイオ
テクノロジーセンター（University of Wisconsin Biotechnology Center）遺伝
学コンピュータグループ（Genetics Computer Group）、1710 University Avenu
e、Madison、WI 53705の配列解析ソフトウエアパッケージ（Sequence Analysis
Software Package））をそれに指定されたデフォルトのパラメーターで用いて評
価することが一般的である。このソフトウエアプログラムは、種々の置換、欠失
、およびその他の改変に関する相同性の程度を割り当てることにより、類似した
配列を対応させる。保存的置換には一般に、以下の各群の内部での置換が含まれ
る：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、
グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アル
ギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。Sequence identity is determined by sequence analysis software (eg, University of Wisconsin Biotechnology Center Genetics Computer Group, 1710 University Avenu).
e, Madison, WI 53705 sequence analysis software package (Sequence Analysis
Software Package)) with the default parameters specified for it. This software program matches similar sequences by assigning degrees of homology for various substitutions, deletions, and other modifications. Conservative substitutions generally include substitutions within each of the following groups: glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine; aspartic acid,
Glutamic acid, asparagine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine; and phenylalanine, tyrosine.

【００４６】 「高ストリンジェンシー条件」とは、少なくとも40ヌクレオチド長のDNAプロ
ーブとの40℃、2×SSC中でのハイブリダイゼーションを意味する。高ストリンジ
ェンシー条件の他の定義については、参照として本明細書に組み入れられる、ア
ウスユーベル（F. Ausubel）ら、「分子生物学における最新プロトコール（Curr
ent Protocols in Molecular Biology）」、pp. 6.3.1〜6.3.6、John Wiley & S
ons、New York、NY、1994を参照されたい。By “high stringency conditions” is meant hybridization with a DNA probe of at least 40 nucleotides in length at 40 ° C. in 2 × SSC. For another definition of high stringency conditions, see F. Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology (Curr)”, which is hereby incorporated by reference.
ent Protocols in Molecular Biology) '', pp. 6.3.1-6.3.6, John Wiley & S
See ons, New York, NY, 1994.

【００４７】 「ポリペプチド」または「因子」とは、標準的な細胞生存アッセイ法において
ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する（または逆に、細胞死を防止する
）活性を有する分子を意味する。本発明の化合物の分子量は約14〜16キロダルト
ン、約18〜21キロダルトンまたは約25〜35キロダルトンである。本発明のポリペ
プチドから明確に除外されるものには、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）（
Linら、Science 260：1130〜1132、1993）、ニューツリン（neurturin）（Kotzb
auerら、Nature 384：467〜470、1996）、ペルセフィン（persephin）（Millbra
ndtら、Neuron 20：245〜253、1998）およびアルテミン（artemin）（Balohら、
ニューロン21：1291〜1302、1998）がある。By “polypeptide” or “factor” is meant a molecule that has the activity of promoting survival of dopaminergic neurons (or conversely, preventing cell death) in standard cell survival assays. The molecular weight of the compounds of the present invention is about 14-16 kilodaltons, about 18-21 kilodaltons or about 25-35 kilodaltons. Explicitly excluded from the polypeptides of the invention are glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) (
Lin et al., Science 260: 1130-1132, 1993), neurturin (Kotzb
auer et al., Nature 384: 467-470, 1996), persephin (Millbra).
ndt et al., Neuron 20: 245-253, 1998) and artemin (Baloh et al.,
Neurons 21: 1291-1302, 1998).

【００４８】 「組成物」とは、本発明のポリペプチドを含む、ポリペプチドの集合体を意味
する。By “composition” is meant an assembly of polypeptides that includes a polypeptide of the invention.

【００４９】 「薬学的に許容される担体」とは、それを投与された哺乳動物に生理学的に許
容されるとともに、同時に投与する化合物の治療的性質を保持する担体を意味す
る。薬学的に許容される担体の一例は、生理的食塩水である。その他の生理学的
に許容される担体およびその製剤は、当業者には周知であり、例えば、「レミン トン：薬学の理論および実践（Remington: The Science and Practice of Pharm acy） 」（第19版、ジェンナーロ（A.R. Gennaro AR.）編、1995、Mack Publishi
ng Company、Easton、PAに記載されている。本発明のポリペプチドまたは組成物
とともに偶発的に含まれうるウイルス病原体および毒性化合物を、当技術分野で
周知の任意の適した方法を用いて不活性化または除去しうることは理解されると
考えられる。By “pharmaceutically acceptable carrier” is meant a carrier that is physiologically acceptable to the mammal to which it is administered and that retains the therapeutic properties of the compound with which it is administered. One example of a pharmaceutically acceptable carrier is saline. Other physiologically acceptable carriers and their formulation are well known to those skilled in the art, for example, "Reming tons: Pharmaceutical Theory and Practice (Remington: The Science and Practice of Pharm acy) " (19th Edition, AR Gennaro AR., 1995, Mack Publishi
ng Company, Easton, PA. It is understood that viral pathogens and toxic compounds that may be incidentally included with the polypeptides or compositions of the invention may be inactivated or removed using any suitable method known in the art. To be

【００５０】 「ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性」を有する化合物とは、その化合
物の存在が、ニューロン生存アッセイ法（本明細書に記載するものなど）におけ
るドーパミン作動性ニューロンの生存性を、該化合物の非存在下におけるドーパ
ミン作動性ニューロンの生存性と対比して少なくとも2倍に高めるものである。
好ましくは、ドーパミン作動性ニューロンの生存性は少なくとも3倍、より好ま
しくは少なくとも4倍、最も好ましくは少なくとも5倍に高まる。アッセイ法はイ
ンビトロアッセイ法でもインビボアッセイ法でもよい。アッセイ法はインビトロ
アッセイ法であることが好ましい（以下の「細胞生存性アッセイ法」と題した項
を参照）。A compound having “dopaminergic neuron survival promoting activity” refers to the presence of the compound in the survival of dopaminergic neurons in a neuronal survival assay (such as those described herein). At least 2-fold compared to the survival of dopaminergic neurons in the absence of.
Preferably, the survival of dopaminergic neurons is increased by at least 3-fold, more preferably by at least 4-fold and most preferably by at least 5-fold. The assay method may be an in vitro assay method or an in vivo assay method. Preferably the assay is an in vitro assay (see section below entitled "Cell Viability Assay").

【００５１】 本発明は、神経細胞死の防止のための新規の方法および試薬を提供する。本発
明は、異常な神経細胞死が原因の1つである神経学的な疾患または障害の治療の
ための薬学的組成物を提供する。The present invention provides novel methods and reagents for the prevention of neuronal cell death. The present invention provides pharmaceutical compositions for the treatment of neurological diseases or disorders that are one of the causes of abnormal neuronal cell death.

【００５２】 本発明のその他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の説明および請求の
範囲から明らかであると考えられる。Other features and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments and the claims.

【００５３】発明の詳細な説明 本発明者らは、中脳由来の細胞系（「VMCL-1」と命名）がある因子を分泌し、
それが続いてドーパミン作動性ニューロンの分化および生存を促進することを発
見した。この細胞系は無血清培地中で盛んに増殖した。さらに、これらの細胞か
ら調製されるCMは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存性を少なくとも3倍
に高める1つまたは複数のニューロン生存因子を含んでおり、それらの発生も促
進する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION We secrete a factor from which a cell line derived from the midbrain (designated “VMCL-1”)
It has been discovered that it subsequently promotes the differentiation and survival of dopaminergic neurons. This cell line grew vigorously in serum-free medium. In addition, CM prepared from these cells contains one or more neuronal survival factors that enhance viability of midbrain dopaminergic neurons by at least 3-fold and also promote their development.

【００５４】 本発明者らはこのVMCL-1細胞系から、アルギニンリッチ蛋白質であることを同
定した蛋白質を精製した。本発明者らはこの蛋白質を以下の通りに精製した。容
積3LのVMCL-1馴化培地を調製し、連続的な5段階のカラムクロマトグラフィーに
かけた。各精製段階の時点で、上記に言及したバイオアッセイ法にて各カラム画
分を生物活性に関して試験した。ニューロンの生存性に対する各画分の影響を24
時間間隔で5日間にわたって評価し、1〜10の10段階尺度で評価した。5回目の精
製工程の後に、生物活性画分および付近の不活性画分をSDS-PAGEによって分析し
た。SDS-PAGE分析の結果から、活性画分からのレーンにおいて20kDaの範囲に明
瞭な蛋白質バンドが明らかになった。この「活性」バンドを切り出してトリプシ
ン消化を行い、バックグラウンドを上回る各ペプチドの分子質量および配列を質
量分析法によって決定した。以下の2つのペプチド配列が同定された： （配列番号：3）および （配列番号：4）。データベース検索により、ヒトアルギニンリッチ蛋白質（配
列番号：1）およびそのマウスオルソログ（配列番号：2）との適合度が同定され
た。マウスEST配列によってコードされる予想される蛋白質の、予想されるヒト
蛋白質と約95％同一である。ラットESTデータベースの検索により、ヒト蛋白質
およびマウス蛋白質とアミノ酸レベルで有意な相同性を有する2つの配列が判明
した（dbEST Id：4408547；EST名：EST348489）。完全長ラット配列はゲンバン
クデータベースにはなかった。From the VMCL-1 cell line, the present inventors purified a protein identified as an arginine-rich protein. The present inventors purified this protein as follows. A volume of 3 L of VMCL-1 conditioned medium was prepared and subjected to continuous 5-step column chromatography. At each purification step, each column fraction was tested for bioactivity in the bioassay method referred to above. 24 the effect of each fraction on neuronal viability
It was evaluated at time intervals over 5 days and evaluated on a 10-point scale of 1-10. After the fifth purification step, the bioactive and nearby inactive fractions were analyzed by SDS-PAGE. The results of SDS-PAGE analysis revealed a clear protein band in the range of 20 kDa in the lane from the active fraction. This "active" band was excised and trypsin digested and the molecular mass and sequence of each peptide above background determined by mass spectrometry. Two peptide sequences were identified: (SEQ ID NO: 3) and (SEQ ID NO: 4). A database search identified the fitness of the human arginine rich protein (SEQ ID NO: 1) and its mouse ortholog (SEQ ID NO: 2). The predicted protein encoded by the mouse EST sequence is about 95% identical to the predicted human protein. A search of the rat EST database revealed two sequences having significant amino acid homology with human and mouse proteins (dbEST Id: 4408547; EST name: EST348489). The full length rat sequence was not in the Genbank database.

【００５５】 このため、アルギニンリッチ蛋白質は、神経変性疾患の治療のため、およびヒ
トへの移植時または移植後のニューロンの生存性を改善するための神経栄養因子
として有用である。アルギニンリッチ蛋白質を移植用のニューロンのインビトロ
作製を改善するために用いることもできる。もう1つの用途として、アルギニン
リッチ蛋白質により、そのドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を調節また
は模倣する化合物の同定が可能となる。本蛋白質をその同種受容体を同定するた
めに用いることもできる。これらの用途のそれぞれを以下にさらに詳細に述べる
。Thus, arginine-rich proteins are useful as neurotrophic factors for the treatment of neurodegenerative diseases and for improving the survival of neurons during or after transplantation into humans. Arginine-rich proteins can also be used to improve the in vitro production of neurons for transplantation. As another use, arginine-rich proteins allow the identification of compounds that modulate or mimic their dopaminergic neuronal survival-promoting activity. The protein can also be used to identify its cognate receptor. Each of these applications is described in further detail below.

【００５６】アルギニンリッチ蛋白質の生物活性を調節する分子の同定 アルギニンリッチ蛋白質を介したニューロン生存性の調節に対する候補分子の
影響は、アルギニンリッチ蛋白質特異抗体を用いるウェスタンブロット法または
免疫沈降法などの標準的な蛋白質検出法を用いることによって翻訳レベルで測定
しうる。 Identification of Molecules that Regulate Biological Activity of Arginine-Rich Proteins The effect of candidate molecules on the regulation of neuronal viability mediated by arginine-rich proteins is determined by standard methods such as Western blotting or immunoprecipitation using arginine-rich protein-specific antibodies. Can be measured at the translational level by using conventional protein detection methods.

【００５７】 アルギニンリッチ蛋白質のレベルを調節する化合物は、精製もしくは実質的に
精製されたものでもよく、または細胞から得られる抽出物または上清などの化合
物の混合物の1つの成分であってもよい（Ausubelら、前記）。化合物の混合物の
アッセイ法では、単一の化合物または極めてわずかな数の有効化合物がアルギニ
ンリッチ蛋白質の発現について示されるまで、化合物プール（例えば、HPLCまた
はFPLCなどの標準的な精製法によって作製したもの）のサブセットのサイズを段
階的に小さくしながら投与した細胞におけるアルギニンリッチ蛋白質の発現を測
定する。The compound that regulates the level of arginine-rich protein may be purified or substantially purified, or may be one component of a mixture of compounds such as extracts or supernatants obtained from cells. (Ausubel et al., Supra). Compound mixtures are assayed by pooling compound pools (eg, those prepared by standard purification methods such as HPLC or FPLC) until a single compound or very few active compounds are shown for expression of arginine-rich proteins. The expression of an arginine-rich protein in the cells administered while gradually reducing the size of the subset of (1) is measured.

【００５８】 アルギニンリッチ蛋白質を介したニューロン生存性を調節する能力に関して、
化合物をまた直接スクリーニングしてもよい。このアプローチでは、候補化合物
の存在下におけるニューロン生存性の量をその非存在下におけるニューロン生存
性の量と同じ条件下で比較する。ここでも同じく、スクリーニングを候補化合物
のプールから開始し、そこから段階的な様式で1つまたは複数の有用な調節化合
物を単離する。生存促進活性は任意の標準的なアッセイ法によって測定しうる。Regarding the ability to regulate neuronal viability via arginine-rich proteins,
The compounds may also be screened directly. This approach compares the amount of neuronal viability in the presence of the candidate compound with the amount of neuronal viability in its absence. Again, the screening begins with a pool of candidate compounds from which one or more useful modulatory compounds are isolated in a stepwise fashion. Survival-promoting activity may be measured by any standard assay method.

【００５９】 アルギニンリッチ蛋白質の活性を調節する化合物を検出するためのもう1つの
方法は、アルギニンリッチ蛋白質と物理的に相互作用する化合物をスクリーニン
グすることである。これらの化合物は、当技術分野で知られた相互作用トラップ
発現システムを適応することによって検出することもできる。これらのシステム
は転写活性化アッセイ法を用いて蛋白質相互作用を検出するものであり、概要は
ギューリス（Gyuris）ら（Cell 75：791〜803、1993）およびフィールド（Field
）ら（Nature 340：245〜246、1989）に記載されている。または、アルギニンリ
ッチ蛋白質またはその生物活性断片を^１２５I ボルトン-ハンター（Bolton-Hunt
er）試薬（Boltonら、Biochem. J. 133：529、1973）で標識してもよい。マルチ
ウェルプレートのウェル内にあらかじめ並べた候補分子を標識アルギニンリッチ
蛋白質とともにインキュベートし、洗浄して、標識アルギニンリッチ蛋白質複合
体を有するウェルをアッセイする。種々の濃度のアルギニンリッチ蛋白質を用い
て得られたデータを用いて、候補分子の数、アルギニンリッチ蛋白質との親和性
および会合に関する値を算出する。Another method for detecting compounds that modulate the activity of arginine-rich proteins is to screen for compounds that physically interact with arginine-rich proteins. These compounds can also be detected by adapting the interaction trap expression system known in the art. These systems detect protein interactions using a transcriptional activation assay and are summarized in Gyuris et al. (Cell 75: 791-803, 1993) and Field (Field).
) Et al. (Nature 340: 245-246, 1989). Alternatively, the arginine-rich protein or its biologically active fragment can be ^bound to ¹²⁵ I Bolton-Hunt.
er) reagent (Bolton et al., Biochem. J. 133: 529, 1973). Pre-aligned candidate molecules in the wells of a multi-well plate are incubated with labeled arginine-rich protein, washed and assayed for wells with labeled arginine-rich protein complex. Data obtained using various concentrations of arginine-rich protein are used to calculate values for the number of candidate molecules, affinity and association with arginine-rich protein.

【００６０】 アルギニンリッチ蛋白質のニューロン生存促進活性の調節因子として機能する
化合物または分子には、細胞抽出物、哺乳動物血清、または哺乳動物細胞を培養
した増殖培地中に存在するものなどのペプチドおよび非ペプチド分子が含まれう
る。Compounds or molecules that function as modulators of the neuronal survival-promoting activity of arginine-rich proteins include peptides and non-peptides such as those present in cell extracts, mammalian serum, or growth medium in which mammalian cells are cultured. Peptide molecules can be included.

【００６１】 神経細胞の生存性が高まるようにアルギニンリッチ蛋白質の発現またはアルギ
ニンリッチ蛋白質を介した生物活性を調節する分子は、本発明において有用であ
ると考えられ、このような分子は例えば、以下に述べるように治療薬として用い
うる。Molecules that regulate arginine-rich protein expression or arginine-rich protein-mediated biological activity to enhance neuronal cell viability are considered useful in the invention, and such molecules include, for example: It can be used as a therapeutic agent as described in.

【００６２】治療法 ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する神経栄養因子としてのアルギニ
ンリッチ蛋白質の発見により、それをパーキンソン病などの神経変性疾患の治療
的処置のために用いることが可能となる。 Therapeutic Methods The discovery of an arginine-rich protein as a neurotrophic factor that promotes survival of dopaminergic neurons makes it possible to use it for therapeutic treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.

【００６３】 神経細胞死を予防するためにアルギニンリッチ蛋白質を細胞に加えるためには
、本蛋白質を発現しうる培養細胞系から十分な量の純粋な組換えアルギニンリッ
チ蛋白質を得ることが好ましい。好ましいアルギニンリッチ蛋白質はヒトアルギ
ニンリッチ蛋白質であるが、他の動物（例えば、ブタ、ラット、マウス、イヌ、
ヒヒ、ウシなど）に由来するアルギニンリッチ蛋白質も用いることができる。続
いて、適切なパッケージングシステムまたは投与システムを用いて罹患組織への
蛋白質の送達を達成することができる。または、アルギニンリッチ蛋白質アゴニ
ストとして作用させるために低分子類似体を用いて投与し、この方式によって所
望の生理的効果を得ることもできる。To add an arginine-rich protein to cells to prevent neuronal cell death, it is preferred to obtain a sufficient amount of pure recombinant arginine-rich protein from a cultured cell line capable of expressing the protein. The preferred arginine-rich protein is the human arginine-rich protein, but other animals (eg, pig, rat, mouse, dog,
Arginine-rich proteins from baboons, cattle, etc.) can also be used. Delivery of the protein to the diseased tissue can then be accomplished using a suitable packaging or dosing system. Alternatively, a low molecular weight analog may be used to act as an arginine-rich protein agonist, and the desired physiological effect may be obtained by this method.

【００６４】 遺伝子治療は、アルギニンリッチ蛋白質を首尾良く産生させるために、アルギ
ニンリッチ蛋白質をコードする遺伝子（またはアルギニンリッチ蛋白質のセンス
RNAをコードする核酸）の正常なコピーを細胞に導入する、もう1つの有望な治療
的アプローチである。遺伝子は、それが取り込まれ、有効なニューロン生存促進
活性をもたらすのに十分な蛋白質をコードするような形態で細胞に送達される必
要がある。Gene therapy involves the gene (or sense of arginine-rich protein) encoding the arginine-rich protein in order to successfully produce the arginine-rich protein.
Another promising therapeutic approach is to introduce a normal copy of RNA-encoding nucleic acid) into cells. The gene needs to be delivered to the cell in a form such that it is taken up and encodes a sufficient protein to provide effective neuronal survival promoting activity.

【００６５】 治療的アルギニンリッチ蛋白質遺伝子構築物のための遺伝子導入送達システム
としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス
随伴ウイルスベクター、または神経細胞に対する適切な向性を有する他のウイル
スベクターを用いうる。この目的のために有用なベクターは数多くのものが一般
に知られている（Miller、Human Gene Therapy 15〜14、1990；Friedman、Scien
ce 244：1275〜1281、1989；EglitisおよびAnderson、BioTechniques 6：608〜6
14、1988；TolstoshevおよびAnderson、Curr. Opin. Biotech. 1：55〜61、1990
；Sharp、The Lancet 337：1277〜1278、1991；Cornettaら、Nucl. Acid Res.お
よびMol. Biol. 36：311〜322、1987；Anderson、Science 226：401〜409、1984
；Moen、Blood Cells 17：407〜416、1991；Millerら、Biotech. 7：980〜990、
1989；Le Gal La Salleら、Science 259：988〜990、1993；およびJohnson、Che
st 107：77S〜83S、1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、
臨床環境で用いられている（Rosenbergら、N. Engl. J. Med. 323：370、1990；
Andersonら、米国特許第5,399,346号）。所望の細胞への治療的DNAの導入のため
に非ウイルス的アプローチをまた用いてもよい。例えば、アルギニンリッチ蛋白
質の細胞への導入は、リポフェクション（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84：7413、1987；Onoら、Neurosci. Lett. 117：259、1990；Brighamら、Am
. J. Med. Sci. 298：278、1989；Staubingerら、Meth. Enzymol. 101：512、19
83）、アシアロオロソムコイド-ポリリジン結合（Wuら、J. Biol. Chem. 263：1
4621、1988；Wuら、J. Biol. Chem. 264：16985、1989）；または、好ましさの
程度は落ちるが、外科的条件下での微量注入（Wolffら、Science 247：1465、19
90）によって行うことができる。As a gene transfer delivery system for the therapeutic arginine-rich protein gene construct, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, or another virus vector having an appropriate tropism for nerve cells is used. sell. A large number of vectors useful for this purpose are generally known (Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Scien.
ce 244: 1275-1281, 1989; Eglitis and Anderson, BioTechniques 6: 608-6.
14, 1988; Tolstoshev and Anderson, Curr. Opin. Biotech. 1: 55-61, 1990.
Sharp, The Lancet 337: 1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucl. Acid Res. And Mol. Biol. 36: 311-322, 1987; Anderson, Science 226: 401-409, 1984.
Moen, Blood Cells 17: 407-416, 1991; Miller et al. Biotech. 7: 980-990;
1989; Le Gal La Salle et al., Science 259: 988-990, 1993; and Johnson, Che.
st 107: 77S-83S, 1995). Retrovirus vectors have been particularly developed,
Used in clinical settings (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 370, 1990;
Anderson et al., US Pat. No. 5,399,346). Non-viral approaches may also be used to introduce therapeutic DNA into the desired cells. For example, introduction of an arginine-rich protein into cells is performed by lipofection (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett. 117: 259, 1990; Brigham et al., Am.
J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger et al., Meth. Enzymol. 101: 512, 19
83), asialoorosomucoid-polylysine bond (Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 1.
4621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989); or, to a lesser extent, microinjection under surgical conditions (Wolff et al., Science 247: 1465, 19).
90).

【００６６】 インビトロ感染を必要とする非ウイルス的手段を用いて遺伝子導入を行うこと
も可能と考えられる。これにはリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、電気
穿孔法およびプロトプラスト融合法が含まれると考えられる。リポソームもDNA
の細胞への送達のために有用と思われる。これらの方法を用いることはできるが
、これらの多くは効率が低い。It is also possible to perform gene transfer using non-viral means that require in vitro infection. This would include the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the electroporation method and the protoplast fusion method. Liposomes are also DNA
Would be useful for delivery to cells. Although these methods can be used, many of them are less efficient.

【００６７】 細胞または組織にベクターを導入するための多くの方法を用いることができ、
これらはインビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用に一様に適している。
エクスビボ療法に関しては、患者から採取した神経幹細胞にベクターを導入し、
クローン増殖後に同じ患者への自己移植を行うことができる。トランスフェクシ
ョンおよびリポソーム注入による送達は当技術分野で周知の方法を用いて行える
。患者の罹患細胞への正常遺伝子の移植も有用な治療法となりうる。この手順で
は、正常なアルギニンリッチ蛋白質遺伝子を、患者に対して外因的または内因的
にニューロンまたはグリアに導入する。続いて、これらの細胞を標的組織に注入
する。Many methods are available for introducing vectors into cells or tissues,
They are uniformly suitable for in vivo, in vitro and ex vivo use.
For ex vivo therapy, the vector is introduced into neural stem cells collected from the patient,
Autologous transplantation to the same patient can be performed after clonal expansion. Delivery by transfection and liposome injection can be done using methods well known in the art. Transplanting a normal gene into a patient's diseased cells may also be a useful therapy. In this procedure, the normal arginine-rich protein gene is introduced into neurons or glia exogenously or endogenously to the patient. Subsequently, these cells are injected into the target tissue.

【００６８】 上記の構築物におけるアルギニンリッチ蛋白質のcDNAの発現は、任意の適した
プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス4
0（SV40）またはメタロチオネインのプロモーター）により制御され、任意の適
した哺乳動物性調節領域によって調節することができる。例えば、必要に応じて
、神経細胞における遺伝子発現を優先的に制御することが知られたエンハンサー
を用いて、アルギニンリッチ蛋白質の発現を制御させることができる。用いられ
るエンハンサーには、発現の点で組織特異的または細胞特異的であることを特徴
とするものが非制限的に含まれると考えられる。または、アルギニンリッチ蛋白
質のゲノムクローンを治療的構築物として用いる場合には（例えば、本明細書に
記載のアルギニンリッチ蛋白質cDNAとのハイブリダイゼーションによる単離の後
に）、同種調節配列を介して、または必要に応じて、上記のプロモーターもしく
は調節領域のいずれかを含む異種由来の調節配列を介して調節を行うことができ
る。Expression of the arginine-rich protein cDNA in the constructs described above may be performed using any suitable promoter (eg, human cytomegalovirus (CMV), simian virus 4).
0 (SV40) or metallothionein promoter) and can be regulated by any suitable mammalian regulatory region. For example, if necessary, the expression of an arginine-rich protein can be controlled by using an enhancer known to preferentially control gene expression in nerve cells. The enhancers used are considered to include, without limitation, those characterized by being tissue-specific or cell-specific in terms of expression. Alternatively, when a genomic clone of the arginine-rich protein is used as a therapeutic construct (eg, following isolation by hybridization with the arginine-rich protein cDNA described herein), via a cognate regulatory sequence, or as required. Depending on, the regulation can be via a heterologous regulatory sequence that includes any of the above promoters or regulatory regions.

【００６９】 細胞内での安定性および半減期を高めるためにRNA分子を修飾してもよい。考
えられる修飾には、分子の5'および／もしくは3'末端への隣接配列の付加、また
は分子骨格内部にホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエートもしくは2'
O-メチルを用いることがが非制限的に含まれる。この概念は、イノシン、キュ
ーオシンおよびウィブトシンなどの伝統的でない塩基、さらには内因性エンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ンおよびウリジンのアセチル修飾、メチル修飾、チオ修飾および類似の修飾形態
を含めることにより、これらの分子のすべてに拡張することができる。RNA molecules may be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences to the 5'and / or 3'ends of the molecule, or phosphorothioates or 2'rather than phosphodiester bonds within the molecular backbone.
Use of O-methyl is included without limitation. This concept applies to acetyl, methyl, thio and similar modifications of non-traditional bases such as inosine, queosin and wibutosine, as well as adenine, cytidine, guanine, thymine and uridine which are not readily recognized by endogenous endonucleases. The inclusion of forms can be extended to all of these molecules.

【００７０】 本発明に含まれるもう1つの治療的アプローチは、組換えアルギニンリッチ蛋
白質を、実際の細胞欠乏部位もしくはその可能性のある部位に直接的に（例えば
、注入によって）、または全身的に（例えば、任意の従来の組換え蛋白質投与法
によって）投与することを含む。Another therapeutic approach included in the present invention is to provide recombinant arginine-rich protein directly (eg by injection) to the actual site of cellular deprivation or its potential site, or systemically. Administration (eg, by any conventional method of recombinant protein administration).

【００７１】 本発明のさらなる1つの態様は、上記に考察した治療効果のいずれかのために
、薬学的組成物を薬学的に許容される担体とともに投与することに関する。この
ような薬学的組成物は、アルギニンリッチ蛋白質、アルギニンリッチ蛋白質に対
する抗体、またはアルギニンリッチ蛋白質の模倣物もしくはアゴニストからなる
と思われる。本組成物は単独で投与してもよく、または、生理食塩水、緩衝生理
食塩水、デキストロースおよび水を非制限的に含む、任意の滅菌された生体適合
性の薬学的担体中にある形で投与しうる、安定化化合物などの少なくとも1つの
他の作用物質とともに投与してもよい。本組成物は患者に単独で投与してもよく
、または他の作用物質、薬剤もしくはホルモンと併用してもよい。One further aspect of the invention relates to administering the pharmaceutical composition with a pharmaceutically acceptable carrier for any of the therapeutic effects discussed above. Such pharmaceutical compositions would consist of arginine-rich proteins, antibodies to arginine-rich proteins, or mimetics or agonists of arginine-rich proteins. The composition may be administered alone or in the form of any sterile biocompatible pharmaceutical carrier including, but not limited to, saline, buffered saline, dextrose and water. It may be administered with at least one other agent that may be administered, such as a stabilizing compound. The composition may be administered to the patient alone or in combination with other agents, drugs or hormones.

【００７２】 1つの例では、アルギニンリッチ蛋白質を対象に対して、細胞を移植する部位
に投与する。アルギニンリッチ蛋白質の投与は細胞移植の前または後に行うこと
ができる。好ましくは、この2つの段階は互いに4時間以内に行う。必要に応じて
、アルギニンリッチ蛋白質を、細胞移植の前および／または後にさまざまな間隔
で対象に反復して投与することができる。アルギニンリッチ蛋白質のこの防御的
投与は、細胞移植から数カ月またはさらに数年にわたってもよい。In one example, an arginine-rich protein is administered to a subject at the site of cell implantation. The arginine-rich protein can be administered before or after cell transplantation. Preferably, the two steps are performed within 4 hours of each other. If desired, the arginine-rich protein can be repeatedly administered to the subject at various intervals before and / or after cell transplantation. This protective administration of arginine-rich protein may extend for months or even years after cell transplantation.

【００７３】 ヒトまたは他の哺乳動物への投与に加えて、アルギニンリッチ蛋白質を、移植
前の任意の時点におけるニューロンの生存性をニューロン形成時に改善するため
に培養物に用いることもできる。1つの例では、移植しようとする細胞を、生存
促進量のアルギニンリッチ蛋白質をも含む薬学的担体中に懸濁する。アルギニン
リッチ蛋白質を、手順の早い時点（例えば、ニューロンが最初に分化した時点）
で培養物に投与することもできる。ニューロンが初代ドーパミン作動性ニューロ
ンである必要がないことは理解されている。ニューロンを生じうる幹細胞または
任意の他の細胞からインビトロまたはインビボで分化したニューロン（例えば、
ドーパミン作動性ニューロン）は、その形成および維持に際してアルギニンリッ
チ蛋白質の存在下で培養することができる。In addition to administration to humans or other mammals, arginine-rich proteins can also be used in culture to improve neuronal viability at any time prior to transplantation during neurogenesis. In one example, the cells to be transplanted are suspended in a pharmaceutical carrier that also contains a pro-survival amount of an arginine-rich protein. Arginine-rich protein at an early point in the procedure (eg, when a neuron first differentiates)
Can also be administered to the culture at. It is understood that the neurons need not be primary dopaminergic neurons. Neurons that have differentiated in vitro or in vivo from stem cells or any other cell that can give rise to neurons (eg,
Dopaminergic neurons) can be cultured in the presence of arginine-rich proteins for their formation and maintenance.

【００７４】 本明細書に記載の方法において用いるためにはヒトアルギニンリッチ蛋白質が
好ましいが、アルギニンリッチ蛋白質は、ラット、マウスおよびウシを含む多く
の種で同定されている。当業者は、標準的な方法を用いて、他の動物からのアル
ギニンリッチ蛋白質の同定を容易に行えることを理解すると考えられる、ドーパ
ミン作動性ニューロンの生存促進活性を有し、ヒトアルギニンリッチ蛋白質をコ
ードするcDNAとハイブリダイズする核酸によってコードされる任意の蛋白質は、
本発明の一部であると考えられる。Human arginine-rich proteins are preferred for use in the methods described herein, but arginine-rich proteins have been identified in many species, including rat, mouse and bovine. Those of skill in the art will understand that arginine-rich proteins from other animals can be readily identified using standard methods, which have the pro-survival activity of dopaminergic neurons and human arginine-rich proteins. Any protein encoded by a nucleic acid that hybridizes with the encoding cDNA,
It is considered to be part of the present invention.

【００７５】診断法 アルギニンリッチ蛋白質と特異的に結合する抗体は、アルギニンリッチ蛋白質
レベルの変化を特徴とする状態もしくは疾患の診断、またはアルギニンリッチ蛋
白質による治療を受けている患者のモニターのためのアッセイ法に用いることが
できる。診断目的のために有用な抗体は、治療法に関して上に記載したものと同
じ様式で調製しうる。アルギニンリッチ蛋白質に関する診断アッセイ法には、ヒ
ト体液または細胞もしくは組織の抽出物におけるアルギニンリッチ蛋白質を検出
するための抗体および標識を用いる方法が含まれる。抗体は修飾して用いても修
飾せずに用いてもよく、それらをレポーター分子と共有的または非共有的に結合
させることによって標識してもよい。当技術分野で知られた多岐にわたるレポー
ター分子を用いることができ、そのいくつかを本明細書に述べる。 Diagnostic Methods Antibodies that specifically bind arginine-rich proteins are assays for diagnosing conditions or diseases characterized by altered levels of arginine-rich proteins, or for monitoring patients undergoing treatment with arginine-rich proteins. Can be used in law. Antibodies useful for diagnostic purposes may be prepared in the same manner as described above for therapeutics. Diagnostic assays for arginine-rich proteins include methods that use antibodies and labels to detect arginine-rich proteins in human body fluids or extracts of cells or tissues. Antibodies may be used with or without modification and may be labeled by covalently or non-covalently linking them to a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules known in the art can be used, some of which are described herein.

【００７６】 アルギニンリッチ蛋白質を測定するための手順は、ELISA、RIAおよびFACSを含
む種々のプロトコールが当技術分野で知られており、これらはアルギニンリッチ
蛋白質の発現レベルの変化または異常を診断するための基盤となる。アルギニン
リッチ蛋白質の発現に関する正常値または標準値は、正常な哺乳動物対象、好ま
しくはヒトから採取した体液または細胞抽出物を、複合体が形成するために適し
た条件下で、アルギニンリッチ蛋白質に対する抗体と組み合わせることによって
確認する。複合体の標準的な形成量はさまざまな方法によって定量化しうるが、
好ましくは測光的な手段によって行う。生検組織から得た対象試料、すなわち対
照試料および疾患試料において発現されるアルギニンリッチ蛋白質の量を標準的
な値と比較する。標準値と対象の値との偏差により、疾患を診断するためのパラ
メーターが確立される。Procedures for measuring arginine-rich proteins are known in the art, including various protocols including ELISA, RIA and FACS, which are for diagnosing alterations or abnormalities in arginine-rich protein expression levels. Will be the basis of A normal or standard value for the expression of an arginine-rich protein is an antibody against the arginine-rich protein under conditions suitable for the complex to form in a body fluid or cell extract taken from a normal mammalian subject, preferably a human. Confirm by combining with. Standard complex formation can be quantified by various methods,
It is preferably performed by photometric means. The amount of arginine-rich protein expressed in control samples, ie control and disease samples, obtained from biopsy tissues is compared to standard values. Deviation between standard and subject values establishes the parameters for diagnosing disease.

【００７７】 アルギニンリッチ蛋白質をコードする核酸配列を診断目的に用いることもでき
る。用いうる核酸配列には、アンチセンスRNAおよびDNA分子ならびにオリゴヌク
レオチド配列が含まれる。アルギニンリッチ蛋白質の発現を疾患と相関づけるこ
とができる、生検組織における遺伝子発現の検出および定量化のために核酸配列
を用いてもよい。この診断アッセイ法は、アルギニンリッチ蛋白質の有無および
過剰な発現を区別するため、ならびに治療的介入時のアルギニンリッチ蛋白質レ
ベルの調節をモニターするために用いうる。Nucleic acid sequences encoding arginine-rich proteins can also be used for diagnostic purposes. Nucleic acid sequences that can be used include antisense RNA and DNA molecules and oligonucleotide sequences. Nucleic acid sequences may be used for the detection and quantification of gene expression in biopsied tissues, which can correlate arginine-rich protein expression with disease. This diagnostic assay can be used to distinguish between the presence and overexpression of arginine-rich proteins, and to monitor the regulation of arginine-rich protein levels during therapeutic intervention.

【００７８】 アルギニンリッチ蛋白質をコードする核酸配列を、アルギニンリッチ蛋白質の
発現の変化と関連のある状態または疾患の診断のために用いることもできる。ア
ルギニンリッチ蛋白質をコードする核酸配列は、アルギニンリッチ蛋白質の発現
の変化を検出するために患者生検による体液または組織を用いる、サザン解析も
しくはノーザン解析、ドットブロット法またはメンブレンを用いる他の方法；PC
R法；またはディップスティック法、pIN、ELISAまたはチップアッセイ法に用い
うる。このような定性的または定量的な方法は当技術分野で周知である。Nucleic acid sequences encoding arginine-rich proteins can also be used for the diagnosis of conditions or diseases associated with altered expression of arginine-rich proteins. Nucleic acid sequences encoding arginine-rich proteins can be obtained by using body fluids or tissues from patient biopsies to detect altered expression of arginine-rich proteins, Southern or Northern analyses, dot blots or other methods using membranes; PC
R method; or can be used for dipstick method, pIN, ELISA or chip assay method. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.

【００７９】 アルギニンリッチ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を標準的な方法によっ
て標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で、体液または
組織試料に加えてもよい。適切なインキュベーション期間の後に試料を洗浄し、
シグナルを定量化して標準値と比較する。生検試料または抽出試料におけるシグ
ナルの量が相当する対照試料のものとは有意に変化している場合には、ヌクレオ
チド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、試料中のアル
ギニンリッチ蛋白質をコードするヌクレオチド配列のレベルに変化が存在するこ
とによって関連する疾患の存在が示される。このようなアッセイ法を、動物試験
、臨床試験または個々の患者の治療をモニターする際に特定の治療的処置方式の
有効性を評価するために用いてもよい。The nucleotide sequence encoding the arginine-rich protein may be labeled by standard methods and added to body fluids or tissue samples under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. Wash the sample after an appropriate incubation period,
The signal is quantified and compared to standard values. If the amount of signal in the biopsy or extracted sample is significantly different from that of the corresponding control sample, the nucleotide sequence is hybridized to the nucleotide sequence in the sample and the arginine-rich protein in the sample is The presence of alterations in the level of the nucleotide sequence coding for indicates the presence of the associated disease. Such assays may be used to assess the efficacy of particular therapeutic treatment regimens in animal studies, clinical trials or in monitoring treatment of individual patients.

【００８０】 アルギニンリッチ蛋白質の発現の変化と関連のある疾患の診断のための基盤と
するためには、発現に関する正常プロフィールまたは標準プロフィールを確立す
る。これは動物またはヒトのいずれかである正常対象から採取した体液または細
胞抽出物を、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために適した条件下で、アル
ギニンリッチ蛋白質をコードする配列またはその断片と組み合わせることによっ
て行いうる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常対象から得られた値を、
既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験によるものと比較
することによって定量化しうる。正常試料から得られた標準値を、疾患に関して
症候性である患者からの試料から得られた値と比較することができる。標準値と
対象の値との偏差を、疾患の存在を確認するために用いる。To establish the basis for the diagnosis of diseases associated with altered expression of arginine-rich proteins, a normal or standard profile for expression is established. This is done by combining a body fluid or cell extract from a normal subject, either an animal or a human, with a sequence encoding an arginine-rich protein or a fragment thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. sell. Standard hybridization uses values obtained from normal subjects as
It can be quantified by comparison with that from experiments using known amounts of substantially purified polynucleotide. Standard values obtained from normal samples can be compared with values obtained from samples from patients who are symptomatic for the disease. Deviation between standard and subject values is used to confirm the presence of disease.

【００８１】 ひとたび疾患を確認し、治療を開始すれば、患者における発現レベルが正常患
者に認められるものに近づき始めたか否かを評価するためにハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ法を定期的に反復してもよい。連続アッセイ法によって得られた結
果を用いて、数日間から数カ月間までの範囲の期間にわたる治療の有効性を示す
ことができる。Once the disease is identified and treatment is initiated, the hybridization assay may be repeated periodically to assess whether expression levels in the patient have begun to approach those found in normal patients. . The results obtained by the serial assays can be used to demonstrate the efficacy of treatment over a range of days to months.

【００８２】 以下の実施例は本発明を例示するためのものである。それらはいかなる意味で
も本発明を制限することを意図するものではない。The following examples serve to illustrate the invention. They are not intended to limit the invention in any way.

【００８３】実施例1：VMCL-1細胞の作製および解析 VMCL-1細胞系は以下の通りに作製した。ラットE14中脳細胞（その約2〜3％は
神経膠芽細胞である）を10％（v／v）ウシ胎仔血清を含む培地中で12時間インキ
ュベートした後に、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を***促進因子として含
む無血清培地中で増殖させた。15 DIVを過ぎた後に、増殖性のグリア様細胞の島
にいくつか観察された。単離および継代の後、この細胞（本明細書ではVMCL-1細
胞と称する）は、無血清培地または血清を含む増殖培地のいずれにおいても急速
に増殖した。その後の免疫細胞化学解析により、それらがGFAPおよびビメンチン
という2つのアストロサイトマーカーに関して陽性染色され、A2B5、O4、GalCお
よびMAP2を含む、オリゴデンドログリアまたはニューロン系列のマーカーに関し
ては陰性であることが示された。本発明者らは、VMCL-1細胞系を米国菌培養収養
所（American Type Culture Collection）（Manassas、VA；ATCCアクセッション
番号：____、受託日2000年9月18日）に受託している。 Example 1: Preparation and analysis of VMCL-1 cells The VMCL-1 cell line was prepared as follows. After incubating rat E14 midbrain cells (about 2-3% of which are glioblasts) for 12 hours in a medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum, basic fibroblast growth factor ( bFGF) was grown in serum-free medium containing mitogen. Some were observed in islets of proliferative glial-like cells after passing 15 DIV. After isolation and passage, the cells (referred to herein as VMCL-1 cells) grew rapidly in either serum-free medium or serum-containing growth medium. Subsequent immunocytochemistry analysis showed that they stained positive for two astrocyte markers, GFAP and vimentin, and were negative for oligodendroglial or neuronal lineage markers, including A2B5, O4, GalC and MAP2. Was done. The present inventors have entrusted the VMCL-1 cell line to the American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC accession number: ____, contract date September 18, 2000). .

【００８４】 VMCL-1細胞から調製した無血清CMは、培養中のE14中脳ドーパミン作動性ニュ
ーロンの生存性および分化の促進を引き起こした。これらの作用は初代中脳1型
アストロサイトに由来するCMによって生じるものと類似している。VMCL-1細胞と
E14中脳腹側由来の初代1型アストロサイトとの間で、中脳領域特異的遺伝子（例
えば、wnt-1、en-l、en-2、pax-2、pax-5およびpax-8）の発現は類似していた。
いずれもwnt-1は強く発現され、en-1はそれよりも弱く発現され、それらが中脳
由来であることから予想される発現パターンが裏づけられた。染色体解析により
、細胞の70％は異数体であり、このうち50％は四倍体であることが示された。25
回を上回る継代の後にも増殖能の明らかな低下は認められていない。この細胞系
の性質は不死化1型アストロサイトのものに一致する。Serum-free CM prepared from VMCL-1 cells caused enhanced viability and differentiation of E14 midbrain dopaminergic neurons in culture. These effects are similar to those produced by CM derived from primary midbrain type 1 astrocytes. With VMCL-1 cells
Genes specific to midbrain region (eg wnt-1, en-l, en-2, pax-2, pax-5 and pax-8) with primary type 1 astrocytes from E14 ventral midbrain Expression was similar.
In both cases, wnt-1 was strongly expressed, and en-1 was weaker, confirming the expected expression pattern from their midbrain origin. Chromosome analysis showed that 70% of the cells were aneuploid, 50% of which were tetraploid. twenty five
No clear decrease in proliferative capacity was observed after more than one passage. The nature of this cell line is consistent with that of immortalized type 1 astrocytes.

【００８５】 VMCL-1細胞はニューロンとは明確に異なるグリア様の形態を有するが、培養下
にある1型アストロサイトに典型的な大きな平坦状の形態は示さない。免疫細胞
化学解析により、それらがGFAPおよびビメンチンに関して陽性染色され、MAP2、
A2B5およびO4に関しては陰性であることが示された。このため、この細胞はオリ
ゴデンドロサイト系列のものではない。A2B5に反応は陰性であることおよびそれ
らの形態的特徴に基づけば、それらは2型アストロサイトでもない。免疫細胞化
学的証拠によって支持される分類は1型アストロサイトであるが、指摘した通り
、これらの細胞は培養下にある初代1型アストロサイトの古典的な形態的特性を
欠いている。VMCL-1 cells have a distinct glial-like morphology from neurons, but do not show the large flat morphology typical of type 1 astrocytes in culture. Immunocytochemical analysis showed that they stained positive for GFAP and vimentin, MAP2,
It was shown to be negative for A2B5 and O4. Therefore, the cells are not of oligodendrocyte lineage. Based on their negative response to A2B5 and their morphological characteristics, they are also not type 2 astrocytes. Although the class supported by immunocytochemical evidence is type 1 astrocytes, as noted, these cells lack the classical morphological properties of primary type 1 astrocytes in culture.

【００８６】実施例2：培養下のE14ドーパミン作動性ニューロンに対するVMCL-1 CMの作用 VMCL-1 CMが0％、5％、20％および50％v／vで培養下にあるE14中脳ドーパミン
作動性ニューロンの生存および発生に影響を及ぼす能力に関して検査した。培養
物を10％ウシ胎仔血清（FBS）を12時間与え、その後は無血清増殖培地中で増殖
させ、7 DIV後にそれらを染色して解析した。ドーパミン作動性ニューロンの生
存性の増加に対してはCMの用量依存的作用がみられた。CMは生存性を5倍に高め
た。これに対して、ドーパミン作動性ニューロンの生存性には有意な増加はみら
れなかった。この因子と推定されるものの生物作用プロフィールは、GDNFの供給
源であるB49神経膠腫細胞系に由来するCMのものとは大きく異なる（Linら、Scie
nce 260：1130〜1132）。 Example 2: Effect of VMCL-1 CM on E14 dopaminergic neurons in culture ECL midbrain dopamine in culture at 0%, 5%, 20% and 50% VMCL-1 CM v / v The ability to affect survival and development of agonist neurons was examined. Cultures were fed with 10% fetal bovine serum (FBS) for 12 hours, after which they were grown in serum-free growth medium and after 7 DIV they were stained and analyzed. A dose-dependent effect of CM was found to increase the survival of dopaminergic neurons. CM increased survival by a factor of 5. In contrast, the survival of dopaminergic neurons was not significantly increased. The biological action profile of this putative factor is significantly different from that of CM derived from the B49 glioma cell line, which is the source of GDNF (Lin et al., Scie.
nce 260: 1130-1132).

【００８７】実施例3：遺伝子発現解析 VMCL-1細胞系と初代培養アストロサイトとの間の類似性をさらに調べるために
、本発明者らは中脳領域に特徴的な6種のマーカー遺伝子の発現を測定した。wnt
-1、en-1、en-2、pax-2、pax-5およびpax-8の解析により、pax-2を除くすべての
遺伝子はE13およびE14中脳腹側神経組織の両方で発現されるが、pax-2はE13神経
組織では発現されるがE14神経組織では発現されないことが示された。初代アス
トロサイトおよびVMCL-1細胞はいずれもwnt-1をE13およびE14中脳腹側神経組織
のものと同程度のレベルで発現した。en-1の発現の程度は初代アストロサイトお
よびVMCL-1細胞とも同様であったが、E13およびE14中脳腹側組織における発現と
比較すると低レベルであった。これに対して、en-2、pax-5およびpax-8は初代ア
ストロサイトまたはVMCL-1のいずれにおいても発現されなかった。pax-2はE13中
脳腹側では発現されるがE14中脳腹側では発現されず、初代アストロサイトでは
発現されるがVMCL-1では発現されなかった。 Example 3 Gene Expression Analysis To further investigate the similarities between the VMCL-1 cell line and primary cultured astrocytes, we identified six marker genes characteristic of the midbrain region. Expression was measured. wnt
Analysis of -1, en-1, en-2, pax-2, pax-5 and pax-8 expresses all genes except pax-2 in both E13 and E14 ventral midbrain neural tissues However, pax-2 was shown to be expressed in E13 neural tissue but not in E14 neural tissue. Both primary astrocytes and VMCL-1 cells expressed wnt-1 at levels comparable to those in E13 and E14 ventral midbrain neural tissue. The expression level of en-1 was similar in primary astrocytes and VMCL-1 cells, but at a lower level than that in E13 and E14 midbrain tissues. In contrast, en-2, pax-5 and pax-8 were not expressed in either primary astrocytes or VMCL-1. pax-2 was expressed on the ventral side of the E13 midbrain but not on the ventral side of the E14 midbrain, and on primary astrocytes but not on VMCL-1.

【００８８】実施例4：染色体解析 34個の細胞において染色体の数を算定した。このうち9個における数は、ラッ
トに関する二倍数である42本であった。異数体であった25個の細胞のうち12／25
、すなわち48％は四倍体の範囲にあった。高二倍体（数が43〜48本）および低二
倍体（数が39〜41本）の細胞はそれぞれ集団の20％を占め、一方、細胞の12％で
は染色体の構造的な再構成がみられた。 Example 4: Chromosome analysis The number of chromosomes was calculated in 34 cells. Of these, the number in 9 was 42, which is a double number for rats. 12/25 of the 25 cells that were aneuploid
, Ie 48% were in the tetraploid range. Hyperdiploid (43-48 in number) and hypodiploid (39-41 in number) cells each make up 20% of the population, while 12% of cells have structural rearrangements of chromosomes. It was seen.

【００８９】 VMCL-1 CMに培養下にあるドーパミン作動性ニューロンの生存性を高める選択
的作用があることから、この細胞系によって産生される分子には臨床的使用の可
能性がある。VMCL-1 CMに50％v／vの濃度では毒性作用がないことは、神経栄養
因子と推定される活性物質が有毒でないことを示している。VMCL-1 CMによって
生じる作用は、中脳初代1型アストロサイトから調製したCMのものをほぼ正確に
反映している（Takeshimaら、J. Neurosci. 14：4769〜4779、1994）。VMCL-1由
来の推定因子がドーパミン作動性ニューロンに特異性が高いことは、全般的なニ
ューロンの生存性は有意に増加しないもののドーパミン作動性ニューロンの生存
性が5倍に高まったという観察所見から強く示される。本発明者らは初代1型アス
トロサイトがGDNF mRNAを発現することを示したが、ウェスタンブロット法では5
0pgの感度でCM中にGDNF蛋白質は検出されなかった。さらに本発明者らは、本実
験条件下では、至適濃度のGDNFによって媒介されるドーパミン作動性ニューロン
の生存性の増加は決して2倍を上回らないことを示している。これらの観察所見
のみからも、VMCL-1 CMの神経栄養作用の原因となる因子がGDNFではないことが
示される。The molecules produced by this cell line have potential clinical use because VMCL-1 CM has a selective effect on the survival of dopaminergic neurons in culture. The lack of toxic effects on VMCL-1 CM at a concentration of 50% v / v indicates that the putative neurotrophic factor active substance is not toxic. The effects produced by VMCL-1 CM almost exactly mirror those of CM prepared from midbrain type 1 astrocytes (Takeshima et al., J. Neurosci. 14: 4769-4779, 1994). The high specificity of VMCL-1-derived predictors for dopaminergic neurons suggests that dopaminergic neuron survival was increased five-fold, although overall neuronal survival was not significantly increased. Strongly indicated. The present inventors have shown that primary type 1 astrocytes express GDNF mRNA, but by Western blotting
No GDNF protein was detected in CM with a sensitivity of 0 pg. Furthermore, we show that under the present experimental conditions, the increase in viability of dopaminergic neurons mediated by optimal concentrations of GDNF is never more than 2-fold. These observations alone indicate that GDNF is not the causative agent of the neurotrophic effect of VMCL-1 CM.

【００９０】実施例5：1型アストロサイト馴化培地の作成 E16 1型アストロサイトCM（10L）を濾過し、0.2M NaClを含む20mM Tris-HCl（
Mallinckrodt Chemical Co. Paris、KY）、pH 7.6であらかじめ平衡化したヘパ
リンセファロースCL-6Bカラム（ベッドボリューム80mL）にアプライした。平衡
化緩衝液による洗浄の後に、結合した蛋白質を、0.2M〜2M NaCl（20mM Tris-HCl
、pH 7.6中）の直線的勾配（総容積400mL、流速100mL／hr）を用いてカラムから
溶出させた。ファルマシア（Pharmacia）LKBフラクションコレクターを用いて画
分を回収し、280nmの吸光度を測定した（Sargent-Welch PU 8600UV／VIS分光光
度計）。各画分から1mLのアリコートを採取し、4群に分けてプールして（総容積
4mL）、セントリコン-10（Centricon-10）（登録商標）膜濃縮器（Millipore、B
edford、MA）を用いて脱塩した。試料を規定培地で1：4に希釈し、ドーパミン作
動活性に関するバイオアッセイ法を行った。活性画分をプールした後（総容積80
mL）に、50mMギ酸アンモニウム、pH 7.4であらかじめ平衡化したG-75セファデッ
クス（Sephadex）（登録商標）カラム（70×2.5cm、Pharmacia Biotechnology L
td.、Cambridge、UK）にアプライした。蛋白質を同じ緩衝液（流速75mL／hr）で
分離し、280nmの吸光度を測定した。各画分から1mLのアリコートを採取し、4群
に分けてプールした上で（総容積4mL）、凍結乾燥によって濃縮し、容積1mLの蒸
留水中に再構成した。続いて試料を規定培地で1：4に希釈してドーパミン作動性
に関するバイオアッセイ法を行った。神経栄養活性を有するものを個別の画分と
してさらにバイオアッセイした。 Example 5: Preparation of type 1 astrocyte conditioned medium E16 type 1 astrocyte CM (10 L) was filtered, and 20 mM Tris-HCl (0.2 M NaCl-containing 20 mM Tris-HCl (
Mallinckrodt Chemical Co. Paris, KY), heparin sepharose CL-6B column (bed volume 80 mL) pre-equilibrated with pH 7.6. After washing with equilibration buffer, bound protein was washed with 0.2 M to 2 M NaCl (20 mM Tris-HCl).
, PH 7.6) using a linear gradient (total volume 400 mL, flow rate 100 mL / hr) to elute from the column. Fractions were collected using a Pharmacia LKB fraction collector and the absorbance at 280 nm was measured (Sargent-Welch PU 8600 UV / VIS spectrophotometer). Aliquots of 1 mL were taken from each fraction, pooled in 4 groups (total volume
4mL), Centricon-10 (registered trademark) membrane concentrator (Millipore, B
desalted, MA). Samples were diluted 1: 4 in defined medium and bioassayed for dopaminergic activity. After pooling active fractions (total volume 80
G-75 Sephadex® column (70 × 2.5 cm, Pharmacia Biotechnology L) pre-equilibrated with 50 mM ammonium formate, pH 7.4.
td., Cambridge, UK). The proteins were separated with the same buffer (flow rate 75 mL / hr), and the absorbance at 280 nm was measured. Aliquots of 1 mL were taken from each fraction, pooled in 4 groups (total volume 4 mL), concentrated by lyophilization and reconstituted in 1 mL volume of distilled water. The samples were then diluted 1: 4 in defined medium and bioassayed for dopaminergic activity. Those with neurotrophic activity were further bioassayed as individual fractions.

【００９１】 VMCL-1 CMの重要な顕著な特徴は、GABA作動性、セロトニン作動性および培養
物に存在するその他のニューロン表現型と比較して、それが主としてドーパミン
作動性ニューロンの生存を促進することである。特異性に関するこの主張はGDNF
に対してもなされている。しかし、詳細な検査の結果から、VMCL-1に由来する化
合物はGDNFではないことが示された。An important salient feature of VMCL-1 CM is that it primarily promotes survival of dopaminergic neurons as compared to GABAergic, serotonergic and other neuronal phenotypes present in culture. That is. This claim about specificity is the GDNF
Has been made against. However, detailed examination results showed that the compound derived from VMCL-1 is not GDNF.

【００９２】 本蛋白質を発現させるためには、CMVプロモーターの制御下にあるヒトアルギ
ニンリッチ蛋白質cDNAを含むpcDNA3-hARP発現構築物をCOS細胞への一時的トラン
スフェクションによって導入し、馴化培地をドーパミン作動性ニューロン生存促
進活性に関して検査する。組換え蛋白質の精製および免疫検出を容易にするため
にmycタグを挿入することが可能である。To express this protein, a pcDNA3-hARP expression construct containing the human arginine-rich protein cDNA under the control of the CMV promoter was introduced into COS cells by transient transfection and the conditioned medium was treated with dopaminergic media. Test for neuronal survival promoting activity. It is possible to insert a myc tag to facilitate purification and immunodetection of recombinant proteins.

【００９３】実施例6：ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を有する蛋白質の単離およ
び精製 精製手順は以下の通りに行った。用いた塩はすべて最も純度の高いものであり
、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）から入手した。緩衝液はすべて新た
に調製し、0.2μMフィルター（Millipore社のGP Express減圧駆動システム）を
通して濾過した。 Example 6: Isolation and isolation of a protein having a dopaminergic neuron survival promoting activity
The purification procedure was as follows. All salts used were of the highest purity and were obtained from Sigma Chemical Co. All buffers were freshly prepared and filtered through a 0.2 μM filter (Millipore GP Express vacuum drive system).

【００９４】 段階1：ヘパリン-セファロースカラムクロマトグラフィー（4℃） 3リットルのVMCL-1馴化培地を同容積の20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2
で室温にて希釈し、濾過した上で、5K PREP／SCALE-TFF 2.5ft^２カートリッジ（
Millipore）を用いて容積550mLに濃縮した。濃縮材料を、2×5mLのHiTrapヘパリ
ンカラム（Pharmacia Biotech）から構成し、少なくとも100mLの10mMリン酸ナト
リウム緩衝液、pH 7.2（緩衝液A）であらかじめ平衡化した10mLのヘパリン-セフ
ァロースカラムにローディングした。ローディングが完了した後に、カラムを10
0mLの緩衝液Aで洗浄した。合計10個の画分をそれぞれ容積約3mLの緩衝液B（緩衝
液A＋1M塩化ナトリウム）で溶出させた。300μLの試料を分析のために採取した
。Step 1: Heparin-Sepharose column chromatography (4 ° C.) 3 liters of VMCL-1 conditioned medium with the same volume of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2.
At room temperature, filter, then filter with 5K PREP / SCALE-TFF 2.5ft ² cartridge (
Millipore) was used to concentrate to a volume of 550 mL. The concentrated material consisted of a 2 x 5 mL HiTrap heparin column (Pharmacia Biotech) and was loaded onto a 10 mL heparin-Sepharose column pre-equilibrated with at least 100 mL of 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 (buffer A). . After loading is complete,
It was washed with 0 mL of buffer A. A total of 10 fractions were eluted with buffer B (buffer A + 1M sodium chloride) in a volume of about 3 mL each. A 300 μL sample was taken for analysis.

【００９５】 段階2：スーパーロース（Superose）12カラムクロマトグラフィー（4℃） 段階1からの画分のすべてをプールした後に、セントリコンプラス-20（Centri
con Plus-20）濃縮器（5,000 MWCO、Millipore）を用いて4.5mLに濃縮し、スー
パーロース（Superose）12媒質（Prep Grade、Sigma Chemical Co.）を充填し、
0.6M塩化ナトリウムを含む少なくとも300mLの20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
7.2（GF緩衝液）であらかじめ平衡化した16×600mmのゲル濾過カラムにローディ
ングした。蛋白質の溶出はGF緩衝液にて行った。各2ミリリットルの画分を回収
して活性に関して分析した。活性蛋白質は84mlのGF緩衝液がカラムを通過した後
の容積15mL中に溶出され、蛋白質標準物質（Bio-Rad）を用いて得られたカラム
較正データに基づくとこれは約20〜30kDaの溶出領域に対応していた。Step 2: Superose 12 column chromatography (4 ° C.) After pooling all the fractions from Step 1, Centricon Plus-20 (Centri).
con Plus-20) concentrated to 4.5 mL using a concentrator (5,000 MWCO, Millipore), filled with Superose 12 medium (Prep Grade, Sigma Chemical Co.),
At least 300 mL of 20 mM sodium phosphate buffer containing 0.6 M sodium chloride, pH
Loaded onto a 16 x 600 mm gel filtration column pre-equilibrated with 7.2 (GF buffer). The protein was eluted with a GF buffer. Fractions of 2 ml each were collected and analyzed for activity. Active protein was eluted in a volume of 15 mL after 84 ml of GF buffer had passed through the column, which was based on column calibration data obtained using a protein standard (Bio-Rad), which resulted in an elution of approximately 20-30 kDa. It corresponded to the area.

【００９６】 段階3：セラミックハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（室温；F
PLCシステム） 20〜30kDa溶出領域に対応する段階2からの活性画分をプールし、セントリコン
プラス-20（Centricon Plus-20）濃縮器（5,000 MWCO）を用いて7.5mLに濃縮し
た上で、2Lの10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2（緩衝液A）に対して4℃で一
晩透析し、緩衝液Aで平衡化した1mLのプレパック式セラミックハイドロキシアパ
タイト（I型、Bio-Rad）カラムに（Superloopを介して）ローディングした。過
剰量の非結合蛋白質（素通り画分）を緩衝液Aでカラムから洗い流した後に、1.0
M NaClを含む緩衝液Aによる0〜100％の直線的勾配に適用された。各1ミリリット
ルの画分を回収して活性に関して分析した。活性蛋白質は0.4〜0.8MのNaCl濃度
に対応する勾配領域内に幅広いピークとして溶出した。Step 3: Ceramic hydroxyapatite column chromatography (room temperature; F
PLC system) The active fractions from step 2 corresponding to the 20-30 kDa elution region were pooled, concentrated to 7.5 mL using a Centricon Plus-20 concentrator (5,000 MWCO) and then 2 L Dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 (buffer A) at 4 ° C overnight and equilibrated with buffer A onto a 1 mL pre-packed ceramic hydroxyapatite (type I, Bio-Rad) column. Loaded (via Superloop). After washing excess column of unbound protein (pass-through fraction) with buffer A,
A 0-100% linear gradient with buffer A containing M NaCl was applied. Fractions of 1 ml each were collected and analyzed for activity. The active protein eluted as a broad peak in the gradient region corresponding to a NaCl concentration of 0.4-0.8M.

【００９７】 段階4：陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（室温；FPLCシステム） 幅広いピークに対応する画分をプールし（総容積＝15mL）、セントリコンプラ
ス-20濃縮器（5,000 MWCO）を用いて6mLに濃縮した上で、2Lの20mMトリス-塩酸
緩衝液、pH 7.5（緩衝液A）に対して4℃で一晩透析し、1mLの陰イオン交換FPLC
カラム（Uno、Bio-Rad）に（Superloopを介して）ローディングし、緩衝液Aで平
衡化した。過剰量の非結合蛋白質を緩衝液Aでカラムから洗い流した後に、0〜10
0％の1.0M NaCl（緩衝液A中）による直線的勾配に適用された。各1ミリリットル
の画分を回収して活性に関して分析した。活性蛋白質は素通り画分中（すなわち
、非結合蛋白質分画中）に認められた。Step 4: Anion exchange column chromatography (room temperature; FPLC system) Fractions corresponding to broad peaks were pooled (total volume = 15 mL) and made up to 6 mL using a Centricon Plus-20 concentrator (5,000 MWCO). After being concentrated, it was dialyzed against 2 L of 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 (buffer A) at 4 ° C. overnight, and 1 mL of anion exchange FPLC.
The column (Uno, Bio-Rad) was loaded (via Superloop) and equilibrated with buffer A. Wash off excess unbound protein from the column with buffer A and then
A linear gradient with 0% 1.0 M NaCl in buffer A was applied. Fractions of 1 ml each were collected and analyzed for activity. Active protein was found in the flow-through fraction (ie in the unbound protein fraction).

【００９８】 段階5：バイオシル（BioSil）125カラムクロマトグラフィー（室温；HPLCシステ
ム） 段階4（総容積7mL）からの活性蛋白質画分をセントリコンプラス-20濃縮器（5
,000 MWCO）を用いてほぼ容積ゼロ（約1μL）まで濃縮し、0.6mLの10mMリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH 7.2中に再構成した。再構成した材料（70μL、分析用試験
）を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2（GF緩衝液）で平衡化したバイオシ
ル（BioSil）125 HPLCゲル濾過カラム（Bio-Rad）にローディングした。クロマ
トグラフィーはHP 1100シリーズのHPLCシステム（Hewlett-Packard）を用いて行
った。溶出液を120μLずつの画分として回収して活性および蛋白質含有量（SDS-
PAGE）に関して分析した。活性はカラムから溶出した280nm吸光度の主ピークに
付随する画分中に認められ、これはSDS-PAGE分析によれば45kDa蛋白質によって
代表された。しかし、45kDa蛋白質ピークの側方の画分には活性が認められず、
このことから活性が、12％SDS-PAGE銀染色ゲル上で検出可能な濃度よりもはるか
に低い濃度で45kDa蛋白質とともに共溶出した別の蛋白質の存在に起因するとい
う可能性が示された。このため、段階5による残りの濃縮材料をセントリコン-3
（Centricon-3）濃縮器（Millipore）を用いて80μLまでさらに濃縮し、上記の
分析用試験に関するものと同じ条件で60μLをカラムにローディングして分離し
た。溶出液の各120μLの画分から8μLのアリコートを採取し、SDS-PAGE（12％ゲ
ル）を銀染色と組み合わせることによって分析した。この分析により、さらに別
の2つの蛋白質（分子量は約18kDaおよび20kDa）が活性画分に付随し、主要な45k
Da蛋白質とともに共溶出されることが示された。活性画分を1Lのアンモニウム緩
衝液、pH 8.0（4℃）に対して透析し、これを合わせて、P-1が20kDa蛋白質およ
び45kDa蛋白質を含み、P-2が18kDa蛋白質および45kDa蛋白質を含むような2つの
活性プールP-1およびP-2を作成した。各プールをSpeedVac真空濃縮器（Savant）
で乾燥濃縮し、15μLの0.1M酢酸アンモニウム緩衝液、pH 6.9中に再構成した。
各試料からアリコートを採取して活性に関して分析した。さらに、1μLのアリコ
ートを12％SDS-PAGE分析にかけた後に銀染色を行った。Step 5: BioSil 125 column chromatography (room temperature; HPLC system) The active protein fraction from Step 4 (total volume 7 mL) was added to Centricon Plus-20 concentrator (5
1,000 MWCO) and concentrated to near zero volume (about 1 μL) and reconstituted in 0.6 mL of 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2. The reconstituted material (70 μL, analytical test) was loaded onto a BioSil 125 HPLC gel filtration column (Bio-Rad) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 (GF buffer). Chromatography was performed using a HP 1100 series HPLC system (Hewlett-Packard). The eluate was collected in 120 μL fractions to collect activity and protein content (SDS-
PAGE). The activity was found in the fraction associated with the main peak at 280 nm absorbance eluting from the column, which was represented by the 45 kDa protein by SDS-PAGE analysis. However, no activity was observed in the fractions flanking the 45 kDa protein peak,
This suggests that the activity may be due to the presence of another protein co-eluted with the 45 kDa protein at a concentration much lower than that detectable on a 12% SDS-PAGE silver stained gel. For this reason, the remaining concentrated material from Step 5 is sentricon-3.
It was further concentrated to 80 μL using a (Centricon-3) concentrator (Millipore) and 60 μL loaded and separated on the column under the same conditions as for the analytical test above. An 8 μL aliquot was taken from each 120 μL fraction of the eluate and analyzed by SDS-PAGE (12% gel) combined with silver staining. This analysis revealed that two additional proteins (molecular weight approximately 18 and 20 kDa) were associated with the active fraction, with the major 45 kDa.
It was shown to co-elute with Da protein. The active fraction was dialyzed against 1 L of ammonium buffer, pH 8.0 (4 ° C), and combined, P-1 contained 20kDa protein and 45kDa protein, and P-2 contained 18kDa protein and 45kDa protein. Two such active pools P-1 and P-2 were created. SpeedVac vacuum concentrator (Savant) for each pool
Concentrated to dryness at. And reconstituted in 15 μL 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.9.
An aliquot was taken from each sample and analyzed for activity. In addition, 1 μL aliquots were subjected to 12% SDS-PAGE analysis followed by silver staining.

【００９９】 以上の分析の結果により、P-1は所望の生存促進活性を含むが、P-2は含まない
ことがはっきりと示された。次の段階では、P-1およびP-2の両方をSpeedVacで乾
燥濃縮して、新たに調製した10μLのSDS-PAGE試料還元緩衝液（Bio-Rad）中に（
それぞれを）再構成し、沸騰水浴中で1分間インキュベートした上で12％SDS-PAG
Eゲルにローディングした。電気泳動が完了した後に、ゲルを室温のメタノール
／酢酸／水の溶液（50：10：40）中で40分間固定し、ナノピュア水（nanopure w
ater）で3回洗浄した上で、ゲルコード青色染色（GelCode Blue Stain）試薬（P
ierce）を用いて室温で一晩染色した。染色が完了し、ナノピュア水でゲルコー
ド溶液をゲルから洗い流した後に、45kDa蛋白質（P-1およびP-2の両方）および2
0kDa蛋白質（P-1のみ）に対応する可視的な蛋白質バンドを、カミソリの刃を用
いてゲルから切り出した。対応するバンドを含む各ゲル切片を1.5mL微量遠心管
に入れて、インゲル消化（in-gel digestion）時まで保存した。The results of the above analysis clearly showed that P-1 contained the desired survival-promoting activity, but P-2 did not. In the next step, both P-1 and P-2 were dried and concentrated in a SpeedVac and placed in a freshly prepared 10 μL SDS-PAGE sample reduction buffer (Bio-Rad) (
Reconstitute each) and incubate in boiling water bath for 1 min, then 12% SDS-PAG
Loaded on E gel. After the electrophoresis was completed, the gel was fixed in a methanol / acetic acid / water solution (50:10:40) at room temperature for 40 minutes, and the nanopure water (nanopure w
After washing 3 times with ater), GelCode Blue Stain reagent (P
ierce) and stained overnight at room temperature. After the staining was completed and the gel code solution was washed from the gel with nanopure water, 45 kDa protein (both P-1 and P-2) and 2
The visible protein band corresponding to the 0 kDa protein (P-1 only) was excised from the gel using a razor blade. Each gel section containing the corresponding band was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube and stored until in-gel digestion.

【０１００】実施例7：インゲル消化断片のnESI-MS／MSによる分析 コロイド性のクーマシーブルー染色を除去するために、蛋白質ゲルバンドを10
0mM炭酸水素アンモニウムとともに30％アセトニトリル（水溶液）中にて室温で1
時間インキュベートした。色素が完全に除去されるまで脱染溶液を何回も交換し
た。続いてゲル片を脱イオン水（ほぼ200μL）で覆って10分間振盪した。ゲル片
をアセトニトリル中で脱水し、過剰量の液体を除去した後に遠心蒸発器で完全に
乾燥させた。200ngの改変トリプシン（Promega、Madison、WI）を含む20μLの50
mM炭酸水素アンモニウム、pH 8.3でゲルバンドを再水和した。ゲル片を50mM炭酸
水素アンモニウム、pH 8.3（約50μL）で覆い、37℃で一晩インキュベートした
。続いて消化溶液を清浄なエッペンドルフチューブに移し、50〜100μLの5％酢
酸（水溶液）中でゲル片の超音波処理を30分間行った。抽出溶液を消化溶液と合
わせ、遠心蒸発器で蒸発乾燥させた。 Example 7: Analysis of Ingel Digested Fragments by nESI-MS / MS To remove colloidal Coomassie blue staining, 10 protein gel bands were removed.
1 at room temperature in 30% acetonitrile (aq) with 0 mM ammonium bicarbonate
Incubated for hours. The destaining solution was changed many times until the dye was completely removed. The gel pieces were then covered with deionized water (approximately 200 μL) and shaken for 10 minutes. Gel pieces were dehydrated in acetonitrile to remove excess liquid and then thoroughly dried in a centrifugal evaporator. 20 μL of 50 containing 200 ng modified trypsin (Promega, Madison, WI)
The gel band was rehydrated with mM ammonium bicarbonate, pH 8.3. The gel pieces were covered with 50 mM ammonium bicarbonate, pH 8.3 (about 50 μL) and incubated overnight at 37 ° C. The digestion solution was then transferred to a clean Eppendorf tube and the gel pieces were sonicated in 50-100 μL of 5% acetic acid (aq) for 30 minutes. The extraction solution was combined with the digestion solution and evaporated to dryness in a centrifugal evaporator.

【０１０１】 このインゲル消化抽出物をまず、ボイジャーエリート（Voyager Elite）STR M
ALDI-TOFMS装置（Applied Biosystems Inc.、Framinghaxn、MA）を用いるマトリ
ックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析法（MALDI-TOFMS）によっ
て分析した。抽出物を5μLの50％アセトニトリル、1％酢酸中に溶解した。ジヒ
ドロキシ安息香酸をマトリックスとして用い、陽イオンリフレクトロンモードで
スペクトルを収集した。各試料の約5分の1をこの分析に用いた。これらのスペク
トルは消化抽出物中のペプチドの質量を提示しており、続いてこれを、ペプチド
マスフィンガープリンティングと呼ばれるプロセスである、企業内の重複を除い
た蛋白質配列データベースの検索に用いた。残りの試料はナノエレクトロスプレ
ーイオン化-タンデム質量分析法（nESI-MS／MS）によるペプチド配列解析のため
に用いた。この場合にはC18 ZipTips（Millipore）を用いて抽出物をまず脱塩し
て、75％メタノール（水溶液）、0.1％酢酸（5μL）中に再溶解した。試料の約2
分の1をナノエレクトロスプレー用ガラス毛細管（Micromass）にローディングし
た。nESI-MS／MS分析はQ-Star四重極飛行時間型ハイブリッド型質量分析計（PE
SCIEX、Concord、ON）を用いて行った。MS／MS分析はすべて陽イオンモードで行
った。衝突ガスは窒素とし、衝突エネルギーは40〜60eVとした。MS／MSスペクト
ルは一般に2分間にわたって1秒毎に収集した。このMS／MSスペクトルを、部分配
列タグを用いる企業内の重複を除いた蛋白質配列の検索に用いた（すなわち、デ
ータベースの検索にはペプチド質量および小数の断片イオンのみを用いた）。蛋
白質がこの手順によって同定されなかった場合には、2つまたはそれ以上のペプ
チドのアミノ酸配列をMS／MSスペクトルからできる限り完全に決定した。これら
の配列を、NCBIの蛋白質データベース、ヌクレオチドデータベースおよびEST配
列データベースに対してBLAST検索を行うために用いた。The ingel digest extract was first treated with Voyager Elite STR M
Analyzed by matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOFMS) using an ALDI-TOFMS instrument (Applied Biosystems Inc., Framinghaxn, MA). The extract was dissolved in 5 μL of 50% acetonitrile, 1% acetic acid. Spectra were collected in the cation reflectron mode using dihydroxybenzoic acid as the matrix. About one-fifth of each sample was used for this analysis. These spectra represent the mass of peptides in the digested extract, which was subsequently used to search in-house deduplicated protein sequence databases, a process called peptide mass fingerprinting. The remaining samples were used for peptide sequence analysis by nanoelectrospray ionization-tandem mass spectrometry (nESI-MS / MS). In this case the extract was first desalted using C18 ZipTips (Millipore) and redissolved in 75% methanol (aq), 0.1% acetic acid (5 μL). About 2 of samples
One part was loaded into a nanoelectrospray glass capillary (Micromass). nESI-MS / MS analysis is based on the Q-Star quadrupole time-of-flight hybrid mass spectrometer (PE
SCIEX, Concord, ON). All MS / MS analyzes were performed in positive ion mode. The collision gas was nitrogen, and the collision energy was 40-60 eV. MS / MS spectra were typically collected every second for 2 minutes. This MS / MS spectrum was used to search for deduplicated protein sequences within the company using partial sequence tags (ie, only the peptide mass and a small number of fragment ions were used to search the database). If the protein was not identified by this procedure, the amino acid sequences of two or more peptides were determined as completely as possible from MS / MS spectra. These sequences were used to perform a BLAST search against the NCBI protein database, nucleotide database and EST sequence database.

【０１０２】 この解析の結果から、P-1（活性）およびP-2（不活性）の双方にある45kDa蛋
白質はグリア由来ネキシンとして同定され、P-1中の20kDa蛋白質はアルギニンリ
ッチ蛋白質として同定された。このため、アルギニンリッチ蛋白質はP-1に認め
られた活性の原因となった主要な蛋白質である可能性が高いが、ネキシンの存在
が活性のために必要である可能性も否定できない。From the results of this analysis, a 45 kDa protein in both P-1 (active) and P-2 (inactive) was identified as a glial-derived nexin, and a 20 kDa protein in P-1 was identified as an arginine-rich protein. Was done. Therefore, the arginine-rich protein is likely to be the major protein responsible for the activity found in P-1, but it cannot be denied that the presence of nexin is necessary for the activity.

【０１０３】実施例8：ヒト中脳組織からの不死化細胞系の作製 本明細書に記載の方法を用いて、流産したヒト組織から、同一または同様のニ
ューロン生存促進活性を有する1型アストロサイト由来細胞系を作製することが
できる。ヒトの場合、E14に対応する在胎期間は約9〜10週齡であるが、他の在胎
期間のものでも成功する可能性が高いと思われる。ヒト化合物は、本明細書に記
載した通りの標準的な蛋白質精製法を用いて同定される。 Example 8: Generation of Immortalized Cell Lines from Human Midbrain Tissue Using the methods described herein, type 1 astrocytes with the same or similar neuronal survival promoting activity from aborted human tissues. Origin cell lines can be generated. In humans, the gestational age corresponding to E14 is about 9-10 weeks old, but other gestational ages are likely to succeed. Human compounds are identified using standard protein purification methods as described herein.

【０１０４】 ヒト胎児アストロサイトの自発的な不死化を誘導するためには、ヒト胎児脳か
ら中脳腹側組織を摘出する。摘出はpH 7.4の塩溶液（例えば、ハンクス平衡塩類
溶液（HBSS））中にて滅菌条件下で行うことが好ましい。底板が無傷の中脳腹側
（VM）の位置を特定して、新鮮な塩溶液を入れた培養皿中で顕微解剖を行い、非
神経組織を完全に除去した上で塩溶液中で保存する。組織を収集した後に塩溶液
を除去し、増殖培地（例えば、N2）を2回交換しながら組織をすすぎ洗いし、続
いて2.0mLの増殖培地中に分散させ、これを以後のすべての手順に用いる。次に
組織を破砕する。細胞を完全に分散させるためには約10〜15回のストロークが必
要である。細胞を遠心し（1,000rpm、2分間）、培地を吸引してペレットを増殖
培地中に分散させる。血球計算器を用いて細胞の数を算定し、密度を約2.5×10
^５個／mLに調整する。続いて細胞を、あらかじめポリオルニチン（15mg／mL）お
よびフィブロネクチン（1.0mg／mL）をコーティングした培養皿の中に5.0×10^４ 個／cm²の密度で分散させる。培養皿をインキュベーターに移す（37℃、5％CO_２ 、湿度100％）。bFGF（10ng／mL）を毎日添加し、培地を1日毎に交換する。培養
物の集密度が約50％となる8〜12 DIVの時点で、細胞に5日間擾乱を加える。これ
らの条件により、増殖中のアストロサイトのわずかな割合に自発的な不死化が引
き起こされることがすでに示されている。[0104]   In order to induce spontaneous immortalization of human fetal astrocytes,
The ventral midbrain tissue is removed. Extraction is performed with a salt solution having a pH of 7.4 (for example, Hanks balanced salt solution).
It is preferably carried out under sterile conditions in solution (HBSS). Ventral midbrain with intact bottom plate
(VM) is specified, and microdissection is performed in a culture dish containing fresh salt solution.
The nerve tissue is completely removed and then stored in a salt solution. Salt solution after collecting tissue
The tissue and rinsing the tissue with two changes of growth medium (eg N2),
And then disperse in 2.0 mL of growth medium and use this for all subsequent procedures. next
Disrupt the tissue. About 10 to 15 strokes are required to completely disperse the cells.
It is important. Centrifuge cells (1,000 rpm, 2 minutes), aspirate medium and grow pellet
Disperse in medium. Count the number of cells using a hemocytometer and adjust the density to approximately 2.5 x 10
⁵Adjust to individual / mL. Next, the cells were preliminarily treated with polyornithine (15 mg / mL) and
And 5.0 × 10 in a culture dish coated with fibronectin (1.0 mg / mL)^Four Pieces / cm²Disperse at a density of. Transfer the culture dish to an incubator (37 ℃, 5% CO_Two , Humidity 100%). bFGF (10 ng / mL) is added daily and the medium is changed every day. culture
The cells are disturbed for 5 days at 8-12 DIV when the confluency is about 50%. this
These conditions caused a small percentage of proliferating astrocytes to undergo spontaneous immortalization.
It has already been shown to be awakened.

【０１０５】 または、ヒトGFAPプロモーターの転写制御下にあるSV40の発癌性早期領域、お
よびおよび選択マーカー（例えば、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
プロモーターを含むpPGK-neo）を含むDNA構築物による細胞の形質転換を行うこ
とにより、初代培養物からヒト中脳1型アストロサイト細胞系を樹立することも
できる。形質転換体をG418で選択して、クローニングする。他の形質転換したア
ストロサイトが、GFAP免疫反応性、およびβアラニンによる阻害が可能なGABAに
関する高親和性取り込み機構を含む、1型アストロサイトの表現型に一致する特
徴を保持することは以前に示されている（Radanyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
S A 89：6467〜6471、1992）。Alternatively, traits of cells with a DNA construct containing the oncogenic early region of SV40 under the transcriptional control of the human GFAP promoter and a selectable marker (eg, pPGK-neo containing the mouse phosphoglycerate kinase gene promoter). The human midbrain type 1 astrocyte cell line can also be established from the primary culture by performing the conversion. Transformants are selected with G418 and cloned. Previously, other transformed astrocytes retained phenotypically consistent features of type 1 astrocytes, including GFAP immunoreactivity and a high affinity uptake mechanism for GABA that could be inhibited by β-alanine. Shown (Radany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA 89: 6467-6471, 1992).

【０１０６】 上記の結果は以下の方法を用いて得られた。[0106]   The above results were obtained using the following method.

【０１０７】 中脳培養物 初代中脳細胞培養物は、時間を規定して妊娠させたスプレーグ・ドーリーラッ
ト（Taconic Fanns；Germantown、NY）から、以前に記載された通りに調製した
（Shimodaら、Brain Res. 586：319〜323、1992；Takeshiimaら、J. Neurosci.
14：4769〜4779、1994；Takeshimaら、Neuroscience. 60：809〜823、1994；Tak
eshimaら、J. Neurosci. Meth. 67：27〜41、1996）。摘出した組織を集め、実
験の目的に応じて、酸素供給下にある冷（4℃）HBSSまたは10％ウシ胎仔血清（B
iofluids Laboratories、Rockville、MD）を含む培地中にプールした。妊娠ラッ
トを妊娠14日（すなわち、E14）にCO_２曝露によって屠殺し、腹部領域を70％EtO
Hで清拭して腹腔切開術を行い、胎仔を採取して、Ca^２＋およびMg^２＋を含まな
い冷却したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、pH 7.4中にプールした。
続いて無傷の脳を摘出し、間脳と中脳との間に切開を加えて、視蓋の内側に切れ
目を入れて側方に展開した。中脳ドーパミン作動性領域を含む腹側内側の1.0mm³ の組織ブロックを単離した。摘出した組織ブロックは冷却した（4℃）酸素添加
培地中にプールした。事前に消化を行わずに組織を破砕した。または、細胞を10
U／mLのパパイン（Sigma Chemical Co.）を含むL-15増殖培地中にて37℃で15分
間インキュベートし、培地で洗浄した上で（2mL×3回）、針およびシリンジのみ
を用いて組織を破砕した。分散した細胞を1.5mLのエッペンドルフチューブ（1.0
mL／チューブ）に移し、約600gで2分間遠心した。より高速の遠心をより長期間
用いると、培養物に細胞残渣が混入し、その結果として細胞の増殖は最適な状態
に及ばなくなる。培地を慎重に吸引し、細胞を新鮮な培地中に再懸濁して、血球
計算器を用いて数を算定する。腹腔切開からプレーティングまでのすべての手順
は2時間以内に完了させた。典型的な実験では、一連の同腹仔である10〜15匹の
胎仔から、1.0×10^５個／胎仔または1.0×10^６〜1.5×10^６個／同腹仔の細胞が
得られた。Midbrain Cultures Primary midbrain cell cultures were prepared as previously described from time-pregnant Sprague Dawley rats (Taconic Fanns; Germantown, NY) (Shimoda et al. Brain Res. 586: 319-323, 1992; Takeshiima et al., J. Neurosci.
14: 4769-4779, 1994; Takeshima et al., Neuroscience. 60: 809-823, 1994; Tak.
eshima et al., J. Neurosci. Meth. 67: 27-41, 1996). Collected tissues were collected and, depending on the purpose of the experiment, cold (4 ° C) HBSS or 10% fetal bovine serum (B
iofluids Laboratories, Rockville, MD). Pregnant rats were sacrificed on day 14 of gestation (ie, E14) by CO ₂ exposure and the abdominal area 70% EtO.
Laparostomy was performed with a H wipe and fetuses were harvested and pooled in chilled Ca ²⁺ and Mg ²⁺ free Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.4.
Subsequently, the intact brain was removed, an incision was made between the diencephalon and the midbrain, and a cut was made inside the tectum to develop laterally. A ventral medial 1.0 mm ³ tissue block containing the midbrain dopaminergic region was isolated. The excised tissue blocks were pooled in chilled (4 ° C) oxygenated medium. Tissues were disrupted without prior digestion. Or 10 cells
Incubate for 15 minutes at 37 ° C in L-15 growth medium containing U / mL papain (Sigma Chemical Co.), wash with medium (2 mL x 3 times), and use tissue only with needle and syringe. Was crushed. Place the dispersed cells in a 1.5 mL Eppendorf tube (1.0
(mL / tube) and centrifuged at about 600 g for 2 minutes. The use of higher speed centrifugation for longer periods of time contaminates the culture with cell debris, resulting in sub-optimal cell growth. Carefully aspirate the medium, resuspend cells in fresh medium and count using a hemocytometer. All procedures from laparotomy to plating were completed within 2 hours. In a typical experiment, a series of litters, 10-15 fetuses, yielded 1.0 × 10 ⁵ cells / fetus or 1.0 × 10 ⁶ -1.5 × 10 ⁶ cells / litter.

【０１０８】 中脳ミクロアイランド（microisland）培養物 中脳ミクロアイランド培養物を作製するためには、細胞を上記の通りに調製し
、最終密度が5.0×10^５個／mLとなるように再懸濁した。細胞懸濁液の25μLの小
滴（細胞1.25×10^４個）を、ポリ-D-リジン（50μg／mL）をコーティングした8
穴チャンバースライドに100μLピペットを用いて載せた。液滴の面積は約12.5mm ² であり、最終平均細胞密度は1.0×10^５個／cm^２であった。液滴を均一に分散さ
せ、塗沫化を避けるためにピペット先端を垂直方向に引き抜いた。ミクロアイラ
ンド培養物によって占有される面積は培養期間を通じて一定に保たれた。培養物
を湿度100％の5％CO_２中にて37℃で30分間インキュベートして細胞を付着させた
後、375μLの増殖培地を各ウェルに添加した。最初は12時間後に培地を交換し、
以後は2日毎に培地のほぼ半分を交換した。[0108] Midbrain microisland culture   To make midbrain microisland cultures, cells were prepared as described above.
, The final density is 5.0 × 10⁵The cells were resuspended so that the number of cells / mL was set. 25 μl small of cell suspension
Drop (cell 1.25 × 10^Four8) coated with poly-D-lysine (50 μg / mL)
The well chamber slide was mounted using a 100 μL pipette. Droplet area is about 12.5 mm ² And the final average cell density is 1.0 x 10⁵Pieces / cm^TwoMet. Disperses the droplets evenly
And the pipette tip was pulled out vertically to avoid smearing. Micro Aira
The area occupied by the sand culture remained constant throughout the culture period. Culture
Humidity 100% 5% CO_TwoAllow the cells to attach by incubating for 30 minutes at 37 ° C in
Afterwards, 375 μL of growth medium was added to each well. First, change the medium after 12 hours,
After that, almost half of the medium was replaced every 2 days.

【０１０９】 細胞生存性アッセイ法 プレーティング前および培養物における生細胞および死細胞の同定には、二色
蛍光細胞生存性アッセイキット（Live／Dead Viability／Cytotoxicity Assay K
it、#L-3224、Molecular Probes, Inc.、Eugene、OR）を用いた。生細胞および
死細胞はそれぞれ緑色および赤色の蛍光を生じ、生存性に関する2種類の陽性指
示薬となる。エチジウムホモ二量体およびカルセイン-AMをDPBSで希釈し、最終
濃度をそれぞれ3.8μMおよび2.0μMとした。細胞生存性の評価はプレーティング
前に行った。細胞懸濁液を同容積の色素（典型的には20μL）とともに、室温、
暗所下においた加湿チャンバー内でカバーグラスを被せた状態で15分間インキュ
ベートし、FITC光学素子を用いて蛍光顕微鏡により検査した。プレーティング直
前の細胞生存率は約95％であった。Cell Viability Assay For the identification of live and dead cells before plating and in culture, the two-color fluorescent cell viability assay kit (Live / Dead Viability / Cytotoxicity Assay K
It, # L-3224, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Live and dead cells produce green and red fluorescence, respectively, and are two positive indicators of viability. Ethidium homodimer and calcein-AM were diluted with DPBS to final concentrations of 3.8 μM and 2.0 μM, respectively. Evaluation of cell viability was performed before plating. Cell suspension with an equal volume of dye (typically 20 μL) at room temperature,
Incubation was performed for 15 minutes in a humidified chamber in the dark with the cover glass covered, and the cells were examined by a fluorescence microscope using a FITC optical element. The cell viability immediately before plating was about 95%.

【０１１０】 培地 用いた無血清培地は、同容積のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）およびハ
ムF-12培地（Gibco、Grand Island、N.Y.；320〜1320AJ）、1.0mg／mLのウシア
ルブミン第V画分（Sigma Chemical Co.；A-4161）、0.1μg／mLのアポトランス
フェリン（Sigma；T-7786）、5μg／mLのインスリン（Sigma；I-1882）、30nM L
-チロキシン（Sigma；T-0397）、20nMプロゲステロン（Sigma；P-6149）、30nM
セレン化ナトリウム（Sigma；S-5261）、4.5mMグルタミン（Gibco、320-5039AF
）、100U／mLのペニシリンおよび100μg／mLのストレプトマイシン（Gibco；P10
0-1-91）からなるものとした。Medium The serum-free medium used was the same volume of Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) and Ham's F-12 medium (Gibco, Grand Island, NY; 320-1320AJ), 1.0 mg / mL bovine albumin V fraction. Min (Sigma Chemical Co .; A-4161), 0.1 μg / mL apotransferrin (Sigma; T-7786), 5 μg / mL insulin (Sigma; I-1882), 30 nM L
-Thyroxine (Sigma; T-0397), 20nM progesterone (Sigma; P-6149), 30nM
Sodium selenide (Sigma; S-5261), 4.5 mM glutamine (Gibco, 320-5039AF)
), 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin (Gibco; P10
0-1-91).

【０１１１】 VMCL-1細胞系からの馴化培地の調製 VMCL-1細胞系から馴化培地を調製する際には、2.0×10^６個の細胞を、1.0％の
FBSを含む20mLの増殖培地中にある状態で、15cmのコーティングしていない培養
皿にプレーティングした。集密度が80％となった時点で培地を吸引し、細胞を無
血清培地で1回洗った。アルブミンを含まない20mLの無血清N2培地を添加し、馴
化を48時間続けて行わせた。この期間中に、細胞は通常100％の集密度になるま
で増殖した。培地を吸引して50mLチューブにプールし、遠心分離（15,000rpm、2
0分間）を行った後に1.0Lプラスチック容器にプールした。通常はCMの各バッチ
の5mLを0.22μmのフィルターを用いて濾過滅菌し、5mLのアリコートとして-70℃
で保存した上で、より大量の貯蔵物としてCMをプールする前に、神経栄養作用強
度の決定に用いた。必要に応じて、当技術分野で知られた標準的な産業的細胞培
養法を用いて、VMCL-1 CMを大量に作製することができる。Preparation of conditioned medium from the VMCL-1 cell line When preparing conditioned medium from the VMCL-1 cell line, 2.0 x 10 ⁶ cells were added at 1.0%
Plated in 15 cm uncoated culture dishes while in 20 mL of growth medium containing FBS. When the confluency reached 80%, the medium was aspirated and the cells were washed once with the serum-free medium. 20 mL of serum-free N2 medium containing no albumin was added and acclimation was continued for 48 hours. During this period, cells usually grew to 100% confluence. Aspirate the medium and pool in a 50 mL tube and centrifuge (15,000 rpm, 2
(0 min) and then pooled in a 1.0 L plastic container. Normally, 5 mL of each batch of CM is filter sterilized using a 0.22 μm filter and aliquoted to 5 mL at -70 ° C.
The CM was stored in and used for determination of neurotrophic potency before pooling CM as a larger stock. If desired, VMCL-1 CM can be made in bulk using standard industrial cell culture methods known in the art.

【０１１２】 1型アストロサイトに関する馴化培地の作製 1型アストロサイトを以下の通りに調製した。E16ラット胎仔の脳幹を冷DPBS中
で摘出し、中脳領域をアストロサイト培地（DMEM／ハムF-12培地が1：1、15％FB
S、4.0mMグルタミン、30nMセレン化ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマ
イシン）に移した。シリンジに装着した18ゲージ針を用いる2mLの新鮮な培地中
での破砕によって細胞を分散させた。細胞を遠心管に入れて2,000rpmで5分間遠
心し、培地中に再懸濁して再び破砕した。最終的な細胞ペレットを分散させ、15
mLの培地中に1×10^６個／75cm^２フラスコの密度でプレーティングした。細胞を5
％CO_２および95％大気の雰囲気下にて37℃で24時間インキュベートし、付着しな
かった細胞を吸引によって除去した。細胞をさらに9日間培養し、その後に混入
している任意の細胞種を除去するためにフラスコを16時間激しく振盪した。アス
トロサイト単層をDPBSで3回洗い、トリプシン処理を行って再プレーティングを
行った（細胞密度は1×10^６個／フラスコ）。この時点で、細胞のわずかな割合
を8穴チャンバースライド（Nunc Inc.、Naperville、IL）にプレーティングし、
これらの姉妹培養物にフラスコ培養に関する記載と同じ処理を行った。集密に達
した時点で、培地を7.5％FBSを含む培地に交換し、細胞を48時間インキュベート
した。次の交換時には、規定無血清培地（DMEM／ハムF-12培地が1：1、4.0mMグ
ルタミン、30nMセレン化ナトリウム、ペニシリン100U／mLおよびストレプトマイ
シン100mg／mL）を添加し、細胞をさらに48時間インキュベートした。培地を交
換し、5日後に馴化培地を回収して、蛋白質分解を阻害するためにロイペプチン
（10mM：Bachem、Torrance、CA）および4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニ
ルフルオリド塩酸塩（1.0mM：ICN Biochemicals、Aurora、OH）と混合した。回
収した時点で、培養物の表現型を評価するために、チャンバースライド上に培養
したアストロサイト単層を免疫染色した。Preparation of conditioned medium for type 1 astrocytes Type 1 astrocytes were prepared as follows. The brain stem of E16 rat fetuses was removed in cold DPBS, and the midbrain region was treated with astrocyte medium (DMEM / Ham's F-12 medium was 1: 1, 15% FB).
S, 4.0 mM glutamine, 30 nM sodium selenide, penicillin and streptomycin). Cells were dispersed by disruption in 2 mL of fresh medium using an 18 gauge needle attached to a syringe. The cells were placed in a centrifuge tube, centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes, resuspended in the medium, and disrupted again. Disperse the final cell pellet, 15
The plating was performed at a density of 1 × 10 ⁶ cells / 75 cm ² flask in mL of medium. 5 cells
Incubated for 24 hours at 37 ° C. in an atmosphere of% CO ₂ and 95% air, non-adherent cells were removed by aspiration. The cells were cultured for an additional 9 days, after which the flask was shaken vigorously for 16 hours to remove any contaminating cell types. The astrocyte monolayer was washed 3 times with DPBS, treated with trypsin, and replated (cell density was 1 × 10 ⁶ cells / flask). At this point, a small percentage of the cells were plated onto 8-well chamber slides (Nunc Inc., Naperville, IL),
These sister cultures were treated as described for flask culture. When confluence was reached, the medium was replaced with medium containing 7.5% FBS and cells were incubated for 48 hours. At the next exchange, a defined serum-free medium (1: 1 DMEM / Ham's F-12 medium, 4.0 mM glutamine, 30 nM sodium selenide, 100 U / mL penicillin and 100 mg / mL streptomycin) was added, and the cells were further added for 48 hours. Incubated. The medium was changed, and the conditioned medium was collected after 5 days, and leupeptin (10 mM: Bachem, Torrance, CA) and 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (1.0 mM) were added to inhibit proteolysis. mM: ICN Biochemicals, Aurora, OH). At the time of harvest, cultured astrocyte monolayers were immunostained on chamber slides to assess the phenotype of the cultures.

【０１１３】 VMCL-1細胞の培養 VMCL-1の培養およびVMCL-1 CMの調製に際しては、2.0×10^６個の細胞を、当初
は10％のFBSを含む20mLの増殖培地中にある状態で、15cmのコーティングしてい
ない培養皿にプレーティングした。集密度が80％に達した時点で培地を吸引し、
細胞を無血清培地で1回洗った。通常はアルブミンを含まない20mLの無血清N2培
地を添加し、馴化を48時間続けて行わせた。N2培地は馴化培地の収集を目的とし
た使用に特に適することが明らかとなった。この48時間の間に、細胞は通常100
％の集密度になるまで増殖した。培地を吸引して50mLチューブにプールし、遠心
分離（15,000rpm、20分間）を行った後に1.0Lプラスチック容器にプールした。
通常はCMの各バッチの約5mLを0.22μmのフィルターを用いて濾過滅菌し、0.5mL
のアリコートとして-70℃で保存した上で、より大量の貯蔵物としてCMをプール
する前に、神経栄養作用強度の決定に用いた。VMCL-1細胞系は現在、50回を上回
る継代を経ている。Culturing of VMCL-1 cells For the cultivation of VMCL-1 and the preparation of VMCL-1 CM, 2.0 × 10 ⁶ cells were initially placed in 20 mL of growth medium containing 10% FBS. , 15 cm uncoated culture dishes were plated. Aspirate the medium when the confluency reaches 80%,
The cells were washed once with serum-free medium. Normally, 20 mL of serum-free N2 medium containing no albumin was added and acclimation was continued for 48 hours. It has turned out that N2 medium is particularly suitable for use for the purpose of collecting conditioned medium. During the last 48 hours, cells typically
Proliferated to% confluency. The medium was aspirated and pooled in a 50 mL tube, centrifuged (15,000 rpm, 20 minutes), and then pooled in a 1.0 L plastic container.
Normally, about 5 mL of each batch of CM is sterilized by filtration using a 0.22 μm filter to give 0.5 mL.
Were stored at -70 ° C. as aliquots of CM and used to determine neurotrophic potency before pooling CM as a larger stock. The VMCL-1 cell line is currently undergoing more than 50 passages.

【０１１４】 免疫細胞化学 MAP2およびTHの免疫細胞化学試験に関しては、培養物を冷DPBSで洗浄し（250
μL×2回）、4％ホルムアルデヒド（PBS中）で10分間固定して、-20℃の1％CH₃C
OOH／95％EtOHを用いて透過化処理を5分間行った後にPBSで洗浄した（250μL×3
回）。非特異的な結合は1％ウシ血清アルブミン（PBS中）（BSA-PBS）で15分間
ブロッキングした。抗TH抗体（50μL）（Boehringer-Mannhenm、Indianapolis、
IN）または抗MAP2抗体（Boehringer-Mannheim）を各ウェルに加え、スライドグ
ラスを室温、暗所下の加湿容器内で2時間インキュベートした。対照染色はマウ
ス血清を抗TH抗体と同じ希釈度で用いて行った。PBSで洗浄した後に（250μL×2
回）、抗マウスIgG-FITC（50μL）を加え、およびスライドグラスをさらに1時間
インキュベートしたPBSで洗浄した後（250μL×2回）に過剰量の液体を吸引し、
チャンバー壁を取り除いて、ベクトラシールド（VectaShield）マウント用培地
（Vector Laboratories、Burlingame、CA）を加えた後にカバーグラスを被せて
、マニキュア液でシールした。いくつかの実験では、ビオチン化二次抗体を用い
てTHが同定され、ビオチン化ペルオキシダーゼ-アビジン複合体を用いて、ニッ
ケルにより増強されるジアミノベンジジン（DAB）反応産物が生じた（ABCキット
；Vector Laboratories）。Immunocytochemistry For immunocytochemistry studies of MAP2 and TH, cultures were washed with cold DPBS (250
[mu] L × 2 times), and fixed for 10 min in 4% formaldehyde (in PBS), 1% CH ₃ C of -20 ° C.
After permeabilization with OOH / 95% EtOH for 5 minutes, it was washed with PBS (250 μL x 3
Times). Non-specific binding was blocked with 1% bovine serum albumin (in PBS) (BSA-PBS) for 15 minutes. Anti-TH antibody (50 μL) (Boehringer-Mannhenm, Indianapolis,
IN) or anti-MAP2 antibody (Boehringer-Mannheim) was added to each well, and the slide glass was incubated at room temperature in a humidified container in the dark for 2 hours. Control staining was performed using mouse serum at the same dilution as anti-TH antibody. After washing with PBS (250 μL x 2
Anti-mouse IgG-FITC (50 μL) was added, and the slide glass was further washed with PBS incubated for 1 hour (250 μL × 2 times), and then an excess amount of liquid was aspirated,
The chamber wall was removed, and a VectaShield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) was added, followed by covering with a cover glass and sealing with nail polish. In some experiments, TH was identified using a biotinylated secondary antibody and a biotinylated peroxidase-avidin complex was used to generate a nickel-enhanced diaminobenzidine (DAB) reaction product (ABC kit; Vector). Laboratories).

【０１１５】 グリア線維酸性蛋白質（GFAP、Boehringer-Mannheini、#814369）に関する固
定および透過化処理は、5％CH₃COOH／95％C₂H₅OHを-20℃で用いる1回の段階で行
った。以降の手順はTHの可視化に用いたものと同じとした。A2B5およびO4につい
ては、培養物を冷DPBSで洗浄して（250μL×2回）、1％BSA-PBSで10分間ブロッ
キングした。A2B5抗体（50μL）を各ウェルに加えて1時間インキュベートした。
DPBSで洗浄した後に（250μL×2回）、二次抗体である抗IgM-FITCを30分間与え
た。続いて細胞をDPBSで洗浄した（250μL×2回）。細胞核の対比染色のために
、細胞を0.5μg／mLの核酸色素H33258（Hoechst、Kansas City、MO）とともに10
mM炭酸水素ナトリウム中にて室温で15分間インキュベートし、続いてPBS中で10
分間×2回すすぎ洗いをした。冷DPBSによる最終洗浄（250μL×2回）の後に、そ
れらを上記の通りにマウントした。Fixation and permeabilization of glial fibrillary acidic protein (GFAP, Boehringer-Mannheini, # 814369) was performed in a single step using 5% CH ₃ COOH / 95% C ₂ H ₅ OH at -20 ° C. It was The subsequent procedure was the same as that used for TH visualization. For A2B5 and O4, cultures were washed with cold DPBS (250 μL x 2) and blocked with 1% BSA-PBS for 10 minutes. A2B5 antibody (50 μL) was added to each well and incubated for 1 hour.
After washing with DPBS (250 μL × 2 times), the secondary antibody, anti-IgM-FITC, was given for 30 minutes. Subsequently, the cells were washed with DPBS (250 μL × 2 times). For counterstaining of cell nuclei, cells were incubated with 0.5 μg / mL nucleic acid dye H33258 (Hoechst, Kansas City, MO) for 10
Incubate for 15 minutes at room temperature in mM sodium bicarbonate followed by 10 in PBS.
Rinse twice for 2 minutes. After a final wash with cold DPBS (250 μL x 2), they were mounted as above.

【０１１６】 RT-PCR解析 ラットのE13もしくはE14中脳腹側組織から、または1×10^９個のアストロサイ
トから、または1×10^９個のVMCL-1細胞から、RNA-STAT試薬（TelTest、Universi
ty of Malyland、Baltimore、MD）を用いて全RNAを抽出した。第1鎖のcDNAはRNA
から作製し、製造者の手順を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。RT-PCR analysis From rat E13 or E14 ventral midbrain tissue, or from 1 × 10 ⁹ astrocytes, or from 1 × 10 ⁹ VMCL-1 cells, RNA-STAT reagent (TelTest, Universi
ty of Malyland, Baltimore, MD) was used to extract total RNA. First strand cDNA is RNA
And amplified by polymerase chain reaction using the manufacturer's procedure.

【０１１７】 断片のサイズおよび相対的存在量を決定するために、反応産物を2％アガロー
スゲル電気泳動によって分離した。cDNAのローディング量が等しいことを確認す
るために、β-アクチンおよびGAPDHに関するPCRの結果を対照として含めた。To determine the size and relative abundance of the fragments, reaction products were separated by 2% agarose gel electrophoresis. PCR results for β-actin and GAPDH were included as controls to ensure equal loading of cDNA.

【０１１８】 染色体解析 2.5％FBS、D-グルコース（2.5g／L）および1：100に希釈したITS補充栄養素を
加えたDMEM／F-12の1：1培地中で細胞を増殖させた。24時間後に、中期にある継
代培養物の***周期をコルヒチン（10μg／mL）で停止させた。細胞をトリプシ
ン処理し、低張性ショック（75mM KCl）を与えた。続いて細胞をMeOH／CH_３COOH
、3：1を3回交換し、固定し、風乾させた。続いて細胞を4％ギムザ（Geisma）液
を用いて染色し、顕微鏡で検査した。Chromosome analysis Cells were grown in 1: 1 medium of DMEM / F-12 supplemented with 2.5% FBS, D-glucose (2.5 g / L) and ITS supplemented nutrients diluted 1: 100. Twenty-four hours later, the mitotic cycle of metaphases in metaphase was stopped with colchicine (10 μg / mL). Cells were trypsinized and given hypotonic shock (75 mM KCl). Then, the cells were MeOH / CH ₃ COOH
, 3: 1 three times, fixed and air dried. The cells were then stained with 4% Geisma solution and examined microscopically.

【０１１９】受託物 本出願者らは、VMCL-1細胞系を含む少なくとも25本のバイアルを、米国菌培養
収養所（American Type Culture Collection）、Manassas VA、20110U.S.A.、AT
CCアクセッション番号____に受託している。細胞は2000年9月18日にATCCに受託
された。このVMCL-1の受託物は、公的受託機関であるATCC受託機関に30年間、ま
たは最も新たな請求から5年間、または特許の有効期間のうち最も長い期間にわ
たって保管されると考えられ、その期間内にそれが生存不能となった場合には交
換されると考えられる。さらに、本出願者らは、試料の生存性の表示を提供する
ことを含め、連邦規則集第37編（37 C.F.R.）§§1.801〜1.809のすべての条項
を満たしている。本出願者らは、受託された材料のATCCからの入手可能性に関し
て何ら制限を課していない。しかし、本出願者らは、生体材料の譲渡またはその
商業的な輸送に対する法律によって課せられる制限を撤廃する権限を何ら有して
はいない。本出願者らは、本特許の下に与えられるその権利のいかなる侵害を放
棄するものではない。 Consignment Applicants have provided at least 25 vials containing the VMCL-1 cell line to the American Type Culture Collection, Manassas VA, 20110U.SA, AT.
We accept CC accession number ____. The cells were entrusted to the ATCC on September 18, 2000. This VMCL-1 consignment is believed to be stored at the ATCC Trustee, which is a public trustee, for 30 years, or five years from the most recent claim, or for the longest period of validity of the patent. If it becomes non-viable within the period, it is considered to be replaced. In addition, Applicants meet all the provisions of 37 CFR 37 CFR §§1.801-1.809, including providing an indication of sample viability. Applicants have not placed any restrictions on the availability of the commissioned material from the ATCC. However, Applicants have no authority to remove the restrictions imposed by law on the transfer of biomaterials or their commercial transportation. Applicants do not waive any infringement of their rights under this patent.

【０１２０】その他の態様 以上の明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、参照として本明細
書に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、
本発明に記載の方法およびシステムに対するさまざまな改変および変更が明らか
であると考えられる。本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、請求す
る本発明がこのような特定の態様に過度に制限されるべきではないことが理解さ
れる必要がある。実際には、本発明の実施に関して説明した態様のさまざまな改
変が分子生物学または関連分野の当業者には明らかであり、それらも本発明の範
囲に含まれるものとする。 Other Embodiments All publications and patent applications mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Those skilled in the art will appreciate that without departing from the scope and spirit of the invention,
Various modifications and variations to the methods and systems described in the present invention will be apparent. Although the present invention has been described in conjunction with specific embodiments thereof, it should be understood that the claimed invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention will be apparent to those skilled in molecular biology or related fields and are intended to be within the scope of the invention.

【配列表】[Sequence list]

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１４年９月１３日（２００２．９．１３）[Submission date] September 13, 2002 (2002.9.13)

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０００５[Name of item to be corrected] 0005

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０００５】発明の概要 本発明者らは、中脳腹側細胞系-1（VMCL-1）と命名した、自発的に不死化した
1型アストロサイト様細胞系を単離した。この細胞系は米国菌培養収養所（Ameri
can Type Culture Collection）（ATCC；Manassas、VA；ATCCアクセッション番
号：PTA-2479、受託日2000年9月18日）に受託されており、中脳腹側に由来し、
初代1型アストロサイトの特徴を保っているが、無血清培地中で盛んに増殖する
。これらの細胞から調製されるCMは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存性
を少なくとも3倍に増加させる1つまたは複数のニューロン生存因子を含んでおり
、それらの発生も促進する。インビトロでのドーパミン作動性ニューロンに対す
る神経栄養活性がこのように強く毒性の程度が少ないことがVMCL-1 CMの活性の
顕著な特徴である。さらに、本発明者らはサイズ分画法を用いて、約14〜16キロ
ダルトン、18〜21キロダルトンおよび25〜35キロダルトンで溶出する活性を同定
した。VMCL-1不死化細胞系は増殖のために血清を要しないため、本発明者らがVM
CL-1 CMニューロンの生存促進性ポリペプチドを同定することが可能となる。[0005] SUMMARY The present inventors of the invention have been named midbrain ventral cell lines -1 (VMCL-1), and spontaneously immortalized
A type 1 astrocyte-like cell line was isolated. This cell line is based on the American Cultivation Farm (Ameri
can Type Culture Collection) (ATCC; Manassas, VA; ATCC accession number: PTA-2479 , contract date September 18, 2000), and is derived from the ventral midbrain.
It retains the characteristics of primary type 1 astrocytes, but proliferates actively in serum-free medium. CM prepared from these cells contains one or more neuronal survival factors that increase viability of midbrain dopaminergic neurons by at least 3-fold and also promote their development. This strong and less toxic neurotrophic activity on dopaminergic neurons in vitro is a hallmark of the activity of VMCL-1 CM. In addition, we used size fractionation methods to identify activities eluting at about 14-16 kilodaltons, 18-21 kilodaltons and 25-35 kilodaltons. Since the VMCL-1 immortalized cell line does not require serum for growth, we
It will be possible to identify pro-survival polypeptides of CL-1 CM neurons.

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００８３[Name of item to be corrected] 0083

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【００８３】実施例1：VMCL-1細胞の作製および解析 VMCL-1細胞系は以下の通りに作製した。ラットE14中脳細胞（その約2〜3％は
神経膠芽細胞である）を10％（v／v）ウシ胎仔血清を含む培地中で12時間インキ
ュベートした後に、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を***促進因子として含
む無血清培地中で増殖させた。15 DIVを過ぎた後に、増殖性のグリア様細胞の島
にいくつか観察された。単離および継代の後、この細胞（本明細書ではVMCL-1細
胞と称する）は、無血清培地または血清を含む増殖培地のいずれにおいても急速
に増殖した。その後の免疫細胞化学解析により、それらがGFAPおよびビメンチン
という2つのアストロサイトマーカーに関して陽性染色され、A2B5、O4、GalCお
よびMAP2を含む、オリゴデンドログリアまたはニューロン系列のマーカーに関し
ては陰性であることが示された。本発明者らは、VMCL-1細胞系を米国菌培養収養
所（American Type Culture Collection）（Manassas、VA；ATCCアクセッション
番号：PTA-2479、受託日2000年9月18日）に受託している。 Example 1: Preparation and analysis of VMCL-1 cells The VMCL-1 cell line was prepared as follows. After incubating rat E14 midbrain cells (about 2-3% of which are glioblasts) for 12 hours in a medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum, basic fibroblast growth factor ( bFGF) was grown in serum-free medium containing mitogen. Some were observed in islets of proliferative glial-like cells after passing 15 DIV. After isolation and passage, the cells (referred to herein as VMCL-1 cells) grew rapidly in either serum-free medium or serum-containing growth medium. Subsequent immunocytochemistry analysis showed that they stained positive for two astrocyte markers, GFAP and vimentin, and were negative for oligodendroglial or neuronal lineage markers, including A2B5, O4, GalC and MAP2. Was done. The present inventors entrusted the VMCL-1 cell line to the American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC accession number: PTA-2479 , contract date September 18, 2000). ing.

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１１９[Name of item to be corrected] 0119

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０１１９】受託物 本出願者らは、VMCL-1細胞系を含む少なくとも25本のバイアルを、米国菌培養
収養所（American Type Culture Collection）、Manassas VA、20110U.S.A.、AT
CCアクセッション番号PTA-2479に受託している。細胞は2000年9月18日にATCCに
受託された。このVMCL-1の受託物は、公的受託機関であるATCC受託機関に30年間
、または最も新たな請求から5年間、または特許の有効期間のうち最も長い期間
にわたって保管されると考えられ、その期間内にそれが生存不能となった場合に
は交換されると考えられる。さらに、本出願者らは、試料の生存性の表示を提供
することを含め、連邦規則集第37編（37 C.F.R.）§§1.801〜1.809のすべての
条項を満たしている。本出願者らは、受託された材料のATCCからの入手可能性に
関して何ら制限を課していない。しかし、本出願者らは、生体材料の譲渡または
その商業的な輸送に対する法律によって課せられる制限を撤廃する権限を何ら有
してはいない。本出願者らは、本特許の下に与えられるその権利のいかなる侵害
を放棄するものではない。 Consignment Applicants have provided at least 25 vials containing the VMCL-1 cell line to the American Type Culture Collection, Manassas VA, 20110U.SA, AT.
It is entrusted to CC accession number PTA-2479 . The cells were entrusted to the ATCC on September 18, 2000. This VMCL-1 consignment is believed to be stored at the ATCC Trustee, which is a public trustee, for 30 years, or five years from the most recent claim, or for the longest period of validity of the patent. If it becomes non-viable within the period, it is considered to be replaced. In addition, Applicants meet all the provisions of 37 CFR 37 CFR §§1.801-1.809, including providing an indication of sample viability. Applicants have not placed any restrictions on the availability of the commissioned material from the ATCC. However, Applicants have no authority to remove the restrictions imposed by law on the transfer of biomaterials or their commercial transportation. Applicants do not waive any infringement of their rights under this patent.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ // Ｃ１２Ｎ 15/09 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 HA20 4B065 AA90X BB19 BB34 CA44 CA46 4C076 AA19 BB01 BB25 CC01 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA23 CA28 DB59 MA24 NA14 ZA012 ZA152 4C087 BB45 MA24 NA14 ZA01 ZA15─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C12N 5/06 C12N 5/00 E // C12N 15/09 15/00 A (81) Designated country EP (AT , BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM) , GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA ( AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, C , CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU , SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF F terms (reference) 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 HA20 4B065 AA90X BB19 BB34 CA44 CA46 4C076 AA19 BB01 BB25 CC01 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA23 CA28 DB59 MA24 NA14 ZA012 ZA152 4C087 BB45 MA24 NA14 ZA01 ZA15

Claims (33)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 （i）実質的に純粋なアルギニンリッチ蛋白質、および（ii
）中枢神経系への投与に関して薬学的に許容される担体、を含む薬学的組成物。1. (i) a substantially pure arginine-rich protein, and (ii)
) A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier for administration to the central nervous system. 【請求項２】 アルギニンリッチ蛋白質がヒトアルギニンリッチ蛋白質であ
る、請求項1記載の薬学的組成物。2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the arginine-rich protein is a human arginine-rich protein. 【請求項３】 薬学的に許容される担体がリポソームである、請求項1記載
の薬学的組成物。3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the pharmaceutically acceptable carrier is a liposome. 【請求項４】 （i）実質的に純粋なアルギニンリッチ蛋白質、（ii）薬学
的に許容される担体、および（iii）神経細胞、を含む薬学的組成物。4. A pharmaceutical composition comprising (i) a substantially pure arginine-rich protein, (ii) a pharmaceutically acceptable carrier, and (iii) nerve cells. 【請求項５】 神経細胞がニューロン、神経幹細胞またはニューロン前駆細
胞である、請求項4記載の薬学的組成物。5. The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the nerve cell is a neuron, a neural stem cell or a neuron progenitor cell. 【請求項６】 ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高めるための方法で
あって、ドーパミン作動性ニューロンを、実質的に精製されたアルギニンリッチ
蛋白質の生存促進量（survival-promoting amount）と接触させる段階を含む方
法。6. A method for enhancing the survival of dopaminergic neurons, the method comprising contacting the dopaminergic neurons with a survival-promoting amount of a substantially purified arginine-rich protein. Including the method. 【請求項７】 アルギニンリッチ蛋白質がヒトアルギニンリッチ蛋白質であ
る、請求項6記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the arginine-rich protein is a human arginine-rich protein. 【請求項８】 ドーパミン作動性ニューロンを移植用に増殖させるための方
法であって、ニューロンまたはその前駆細胞を、実質的に精製されたアルギニン
リッチ蛋白質の生存促進量と共に培養する段階を含む方法。8. A method for expanding dopaminergic neurons for transplantation, comprising culturing neurons or their progenitor cells with a survival-promoting amount of a substantially purified arginine-rich protein. 【請求項９】 アルギニンリッチ蛋白質がヒトアルギニンリッチ蛋白質であ
る、請求項8記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the arginine-rich protein is a human arginine-rich protein. 【請求項１０】 アルギニンリッチ蛋白質を薬学的に許容される賦形剤とと
もに投与する、請求項8記載の方法。10. The method of claim 8, wherein the arginine rich protein is administered with a pharmaceutically acceptable excipient. 【請求項１１】 神経系の疾患または障害を有する患者を治療する方法であ
って、患者に実質的に精製されたアルギニンリッチ蛋白質の生存促進量を投与す
る段階を含む方法。11. A method of treating a patient having a disease or disorder of the nervous system, the method comprising administering to the patient a survival-promoting amount of a substantially purified arginine-rich protein. 【請求項１２】 哺乳動物におけるドーパミン作動性ニューロンの細胞死を
予防するための方法であって、哺乳動物に実質的に精製されたアルギニンリッチ
蛋白質の生存促進量を投与することを含む方法。12. A method for preventing cell death of dopaminergic neurons in a mammal, comprising administering to the mammal a survival-promoting amount of a substantially purified arginine-rich protein. 【請求項１３】 細胞を哺乳動物の神経系に移植する方法であって、（i）
細胞を哺乳動物の神経系に移植すること、および（ii）細胞の移植の4時間前か
ら該細胞の該移植の4時間後までの時間窓（time window）の間にアルギニンリッ
チ蛋白質の生存促進量を該哺乳動物に投与することを含む方法。13. A method for transplanting cells into the nervous system of a mammal, which comprises (i)
Transplanting cells into the nervous system of a mammal, and (ii) promoting survival of arginine-rich protein during a time window from 4 hours before the transplantation of cells to 4 hours after the transplantation of the cells. A method comprising administering an amount to the mammal. 【請求項１４】 哺乳動物がヒトである、請求項13記載の方法。14. The method of claim 13, wherein the mammal is a human. 【請求項１５】 アルギニンリッチ蛋白質がヒトアルギニンリッチ蛋白質で
ある、請求項13記載の方法。15. The method according to claim 13, wherein the arginine-rich protein is a human arginine-rich protein. 【請求項１６】 時間窓が細胞の移植の2時間前から該細胞の該移植の2時間
後までである、請求項13記載の方法。16. The method according to claim 13, wherein the time window is from 2 hours before the transplantation of the cells to 2 hours after the transplantation of the cells. 【請求項１７】 細胞を哺乳動物の神経系に移植する方法であって、 （a）細胞をアルギニンリッチ蛋白質と接触させる段階、および （b）該細胞を哺乳動物の神経系に移植する段階 を含む方法。17. A method of transplanting cells into the nervous system of a mammal, comprising: (A) contacting the cell with an arginine-rich protein, and (B) transplanting the cells into the nervous system of a mammal Including the method. 【請求項１８】 段階（a）および段階（b）を互いに4時間以内に行う、請
求項17記載の方法。18. The method of claim 17, wherein steps (a) and (b) are performed within 4 hours of each other. 【請求項１９】 哺乳動物がヒトである、請求項17記載の方法。19. The method of claim 17, wherein the mammal is a human. 【請求項２０】 アルギニンリッチ蛋白質がヒトアルギニンリッチ蛋白質で
ある、請求項11記載の方法。20. The method according to claim 11, wherein the arginine-rich protein is a human arginine-rich protein. 【請求項２１】 ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高める化合物であ
る、分子量が約14〜16キロダルトンの実質的に純粋な化合物。21. A substantially pure compound having a molecular weight of about 14-16 kilodaltons, which is a compound that enhances the survival of dopaminergic neurons. 【請求項２２】 ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高める、分子量が
約25〜35キロダルトンの実質的に純粋な化合物。22. A substantially pure compound having a molecular weight of about 25-35 kilodaltons that enhances the survival of dopaminergic neurons. 【請求項２３】 グリア細胞系から得られる、請求項21または22記載の化合
物。23. A compound according to claim 21 or 22 obtained from a glial cell line. 【請求項２４】 グリア細胞系がVMCL-1である、請求項23記載の化合物。24. The compound of claim 23, wherein the glial cell line is VMCL-1. 【請求項２５】 ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高めるための方法
であって、ドーパミン作動性ニューロンを請求項21または22記載の化合物と接触
させることを含む方法。25. A method for enhancing the survival of dopaminergic neurons, comprising contacting dopaminergic neurons with a compound according to claim 21 or 22. 【請求項２６】 ドーパミン作動性ニューロンを移植用に増殖させるための
方法であって、ニューロンまたはその前駆細胞を請求項21または22記載の化合物
とともに培養することを含む方法。26. A method for expanding dopaminergic neurons for transplantation, comprising culturing neurons or their progenitor cells with a compound according to claim 21 or 22. 【請求項２７】 請求項21または22記載の化合物の調製のための方法であっ
て、不死化1型アストロサイト細胞系を化合物の発現を許容する条件下で培養す
ることを含む方法。27. A method for the preparation of a compound according to claim 21 or 22 which comprises culturing an immortalized type 1 astrocyte cell line under conditions permitting expression of the compound. 【請求項２８】 ドーパミン作動性ニューロンの生存性を高める化合物であ
って、分子量が約14〜16キロダルトンまたは分子量が約25〜35キロダルトンであ
る化合物を含む、実質的に純粋な組成物。28. A substantially pure composition comprising a compound that enhances the survival of dopaminergic neurons, the compound having a molecular weight of about 14-16 kilodaltons or a molecular weight of about 25-35 kilodaltons. 【請求項２９】 ヒトにおけるドーパミン作動性ニューロンの細胞死を予防
するための方法であって、請求項21または22記載の化合物の有効量をヒトに投与
することを含む方法。29. A method for preventing cell death of dopaminergic neurons in a human, comprising administering to the human an effective amount of a compound according to claim 21 or 22. 【請求項３０】 請求項21または22記載の化合物の、医薬品の製造のための
使用。30. Use of a compound according to claim 21 or 22 for the manufacture of a medicament. 【請求項３１】 薬学的用途用に製剤化した請求項21または22記載の化合物
を、選択的には許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤ともに、および／または
単位投薬式剤形（unit dosage form）として含む、薬学的製剤。31. A compound of claim 21 or 22 formulated for pharmaceutical use, optionally together with an acceptable diluent, carrier or excipient, and / or in a unit dosage form. pharmaceutical formulation, including as a dosage form). 【請求項３２】 細胞を哺乳動物の神経系に移植する方法であって、薬学的
に許容される担体中にある請求項21または22記載の化合物を細胞移植の前、実施
中または後に哺乳動物に投与することを含み、化合物を移植の4時間前から移植
の4時間後までの時間窓の間に該哺乳動物に投与する方法。32. A method of transplanting cells into the nervous system of a mammal, wherein the compound of claim 21 or 22 is in a pharmaceutically acceptable carrier before, during or after cell transplantation. And administering the compound to the mammal during a time window from 4 hours before transplantation to 4 hours after transplantation. 【請求項３３】 細胞を哺乳動物の神経系に移植する方法であって、細胞を
移植4時間以内に請求項21または22記載の化合物と接触させることを含む方法。33. A method of transplanting cells into the nervous system of a mammal, comprising contacting the cells with the compound of claim 21 or 22 within 4 hours of transplantation.