JP2003510610A - 酸化リン脂質を使用する血栓症発現危険性検定 - Google Patents
酸化リン脂質を使用する血栓症発現危険性検定Info
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Abstract
(57)【要約】
血栓症の危険性を評価するための、リン脂質を含む酸化脂質を凝固検定で膜ソースとして使用し、結果を、活性化タンパク質Ｃ（「ＡＰＣ」）の存在及び非存在で非酸化リン脂質を膜ソースとして使用する検定と比較する。検定は、ＡＰＣの抗凝固機能を酸化依存的又は非依存的な方法で特異的に妨げる抗体の患者における存在を監視することができる。これは、静脈血栓症又は動脈血栓症の症状を発現する患者の傾向を指示することができる。
Description
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、血栓症発現の危険性を示す凝血診断検定の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
生理的な凝血は、負の電荷を帯びたリン脂質からなる膜の存在を要することが
充分に認識されている。（Mann, K. G., Jenny R. J., and Krishnaswam
y, S. 1988. "Cofactor proteins in the assembly and expression
of blood clotting enzyme complexes," Ann. Rev. Biochem. 57:915-9
56及びFurie, B. and Furie, B. C. 1988. "The molecular basis of
blood coagulation," Cell. 53:505-518）で考察されているように、酵素
、普通はビタミンＫ依存性タンパク質が補因子、普通は非ビタミンＫ依存性タン
パク質と結合して基質、普通はビタミンＫ依存性タンパク質を活性化すると、酵
素原活性化が急速に起こる。これらの反応は、凝固促進性である反応及び抗凝固
性である反応の両方を含む。
充分に認識されている。（Mann, K. G., Jenny R. J., and Krishnaswam
y, S. 1988. "Cofactor proteins in the assembly and expression
of blood clotting enzyme complexes," Ann. Rev. Biochem. 57:915-9
56及びFurie, B. and Furie, B. C. 1988. "The molecular basis of
blood coagulation," Cell. 53:505-518）で考察されているように、酵素
、普通はビタミンＫ依存性タンパク質が補因子、普通は非ビタミンＫ依存性タン
パク質と結合して基質、普通はビタミンＫ依存性タンパク質を活性化すると、酵
素原活性化が急速に起こる。これらの反応は、凝固促進性である反応及び抗凝固
性である反応の両方を含む。
【０００３】
正味負電荷に加えて、リン脂質先頭基の性質が触媒及び結合効率に貢献すると
思われる。一般には、ホスファチジルセリン（ＰＳ）がもっとも重要なリン脂質
であると見なされている（Pei, G., Powers, D. D., and Lentz, B. R.
1993. "Specific contribution of different phospholipid surfaces
to the activation of prothrombin by the fully assembled proth
rombinase," J. Biol. Chem. 268:3226-3233及びMann, K. G., Jenny R
. J., and Krishnaswamy, S. 1988. Ann. Rev. Biochem. 57:915-956
）。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はカルジオリピンの存在が、活
性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）複合体による因子Ｖａの不活性化の速度を潜在的に
増すことがわかった（Smirnov, M. D. and Esmon, C. T. 1994. "Phosp
hatidylethanolamine incorporation into vesicles selectively enhance
s factor Va inactivation by activated protein," C. J. Biol. Ch
em. 269:816-819）。ＡＰＣは、致命的な血栓症を防ぐために要する決定的な天
然抗凝固因子である。ＡＰＣ複合体による因子Ｖａ及びＶＩＩＩａの不活性化は
凝固の規制においてきわめて重要であり、この反応が障害をきたす場合に認めら
れる重篤な臨床的問題によって証明されるとおりである（Esmon, C. T. and
Schwarz, H. P. 1995. "An update on clinical and basic aspect
s of the protein C anticoagulant pathway," Trends Cardiovasc. M
ed. 5:141-148）。また、リン脂質小胞中の不飽和脂肪酸の存在が因子Ｖａの不
活性化を増強することがわかった（Smirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon
, C. T., and Esmon, N. L. 1999. "The effect of membrane comp
osition on the hemostatic balance," Biochemistry 38:3591-3598）。
また、因子ＶＩＩＩ結合（Gilbert, G. E. and Arena, A. A. 1995. "P
hosphatidylethanolamine induces high affinity binding sites for f
actor VIII on membranes containing phosphatidyl-L-serine," J. Bio
l. Chem. 270:18500-18505）、因子Ｘの組織因子−因子ＶＩＩａ活性化（Neue
nschwander, P. F., Bianco-Fisher, E., Rezaie, A. R., and Morris
sey, J. H. 1995. "Phosphatidylethanolamine augments factor VIIa-t
issue factor activity: enhancement of sensitivity to phosphatidyl
serine," Biochemistry 34:13988-13993）及びプロトロンビン活性化（Smeets
, E. F., Comfurius, P., Bevers, E.M., and Zwaal, R. F. A. 19
96. "Contribution of different Phospholipid classes to the proth
rombin converting capacity of sonicated lipid vesicles," Thromb.
Res. 81:419-426及びBilly, D., Willems, G. M., Hemker, H. C.,
and Lindhout, T. 1995. "Prothrombin contributes to the assembly
of the factor Va-factor Xa complex at phosphatidylserine-contai
ning phospholipid membranes," J. Biol. Chem. 270:26883-26889）にお
けるＰＥの役割が報告されている。これら後者の研究では、ＰＥの影響は、ＡＰ
Ｃ複合体に対する影響とは定性的及び定量的に異なるものであった（検討のため
に（Smirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon, C. T., and Esmon, N.
L. 1999. Biochemistry 38:3591-3598）を参照）。
思われる。一般には、ホスファチジルセリン（ＰＳ）がもっとも重要なリン脂質
であると見なされている（Pei, G., Powers, D. D., and Lentz, B. R.
1993. "Specific contribution of different phospholipid surfaces
to the activation of prothrombin by the fully assembled proth
rombinase," J. Biol. Chem. 268:3226-3233及びMann, K. G., Jenny R
. J., and Krishnaswamy, S. 1988. Ann. Rev. Biochem. 57:915-956
）。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はカルジオリピンの存在が、活
性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）複合体による因子Ｖａの不活性化の速度を潜在的に
増すことがわかった（Smirnov, M. D. and Esmon, C. T. 1994. "Phosp
hatidylethanolamine incorporation into vesicles selectively enhance
s factor Va inactivation by activated protein," C. J. Biol. Ch
em. 269:816-819）。ＡＰＣは、致命的な血栓症を防ぐために要する決定的な天
然抗凝固因子である。ＡＰＣ複合体による因子Ｖａ及びＶＩＩＩａの不活性化は
凝固の規制においてきわめて重要であり、この反応が障害をきたす場合に認めら
れる重篤な臨床的問題によって証明されるとおりである（Esmon, C. T. and
Schwarz, H. P. 1995. "An update on clinical and basic aspect
s of the protein C anticoagulant pathway," Trends Cardiovasc. M
ed. 5:141-148）。また、リン脂質小胞中の不飽和脂肪酸の存在が因子Ｖａの不
活性化を増強することがわかった（Smirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon
, C. T., and Esmon, N. L. 1999. "The effect of membrane comp
osition on the hemostatic balance," Biochemistry 38:3591-3598）。
また、因子ＶＩＩＩ結合（Gilbert, G. E. and Arena, A. A. 1995. "P
hosphatidylethanolamine induces high affinity binding sites for f
actor VIII on membranes containing phosphatidyl-L-serine," J. Bio
l. Chem. 270:18500-18505）、因子Ｘの組織因子−因子ＶＩＩａ活性化（Neue
nschwander, P. F., Bianco-Fisher, E., Rezaie, A. R., and Morris
sey, J. H. 1995. "Phosphatidylethanolamine augments factor VIIa-t
issue factor activity: enhancement of sensitivity to phosphatidyl
serine," Biochemistry 34:13988-13993）及びプロトロンビン活性化（Smeets
, E. F., Comfurius, P., Bevers, E.M., and Zwaal, R. F. A. 19
96. "Contribution of different Phospholipid classes to the proth
rombin converting capacity of sonicated lipid vesicles," Thromb.
Res. 81:419-426及びBilly, D., Willems, G. M., Hemker, H. C.,
and Lindhout, T. 1995. "Prothrombin contributes to the assembly
of the factor Va-factor Xa complex at phosphatidylserine-contai
ning phospholipid membranes," J. Biol. Chem. 270:26883-26889）にお
けるＰＥの役割が報告されている。これら後者の研究では、ＰＥの影響は、ＡＰ
Ｃ複合体に対する影響とは定性的及び定量的に異なるものであった（検討のため
に（Smirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon, C. T., and Esmon, N.
L. 1999. Biochemistry 38:3591-3598）を参照）。
【０００４】
血栓症の危険性が高い患者の一つのグループは、ＰＴＴ（部分トロンボプラス
チン時間）又はＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）技術に基づく凝
固検定で使用されるアニオンリン脂質に結合する抗体であるループス抗凝固因子
を有する患者である。The Merck Manual (16th Ed. 1992)の１２２５、J.
E. Ansell, Handbook of Hemostasis and Thrombosis （Little, Bro
wn & Co., Boston）の１９（1986）を参照。ループス抗凝固因子を有する患
者に典型的なＰＴＴ試験結果は、ＰＴＴ技術（因子ＸＩＩ、ＸＩ、Ｘ及びＶＩＩ
Ｉ）によって計測される、患者血漿と正常血漿との１：１混合物で矯正すること
ができない凝固時間の延長、正常又はわずかに延びたＰＴ（プロトロンビン時間
）及びこれらの凝固因子の非特異的機能低下である。ループス抗凝固抗体はまた
、カルジオリピンと反応することができるため、カルジオリピンを試薬として使
用する検定を妨げることができる。たとえば前出のThe Merck Manualを参照。
抗カルジオリピン又は抗ホスファチジルエタノールアミン抗体は互いに交差反応
することができるが、凝固促進性リン脂質が抗凝固因子になるのに充分な親和力
で相互作用することはできない。リン脂質に対するＡＰＣ複合体の特異性のため
、そのような抗体は、「ループス抗凝固因子」の存在を診断するために使用され
るＡＰＣの非存在で実施される凝固試験に影響することなく、ＡＰＣ抗凝固活性
を選択的に抑制するであろう。
チン時間）又はＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）技術に基づく凝
固検定で使用されるアニオンリン脂質に結合する抗体であるループス抗凝固因子
を有する患者である。The Merck Manual (16th Ed. 1992)の１２２５、J.
E. Ansell, Handbook of Hemostasis and Thrombosis （Little, Bro
wn & Co., Boston）の１９（1986）を参照。ループス抗凝固因子を有する患
者に典型的なＰＴＴ試験結果は、ＰＴＴ技術（因子ＸＩＩ、ＸＩ、Ｘ及びＶＩＩ
Ｉ）によって計測される、患者血漿と正常血漿との１：１混合物で矯正すること
ができない凝固時間の延長、正常又はわずかに延びたＰＴ（プロトロンビン時間
）及びこれらの凝固因子の非特異的機能低下である。ループス抗凝固抗体はまた
、カルジオリピンと反応することができるため、カルジオリピンを試薬として使
用する検定を妨げることができる。たとえば前出のThe Merck Manualを参照。
抗カルジオリピン又は抗ホスファチジルエタノールアミン抗体は互いに交差反応
することができるが、凝固促進性リン脂質が抗凝固因子になるのに充分な親和力
で相互作用することはできない。リン脂質に対するＡＰＣ複合体の特異性のため
、そのような抗体は、「ループス抗凝固因子」の存在を診断するために使用され
るＡＰＣの非存在で実施される凝固試験に影響することなく、ＡＰＣ抗凝固活性
を選択的に抑制するであろう。
【０００５】
インビトロでの凝固試験における凝固促進性リン脂質に対するループス抗凝固
抗体の妨害にもかかわらず、抗体を有する人は、静脈又は動脈の血栓症の危険性
が増大していると報告されている。さらには、妊娠期間の初期１／３期間におけ
る自然流産の繰り返しが報告されている。同上。患者は、血栓症の可能性を減ら
すために長期的な抗凝固治療を受けているが、そのような治療の有効性を監視す
るのに適切な技術が開発されていない。また、ループス抗凝固因子の試験で必ず
しも陽性にならない他の患者が、現在の凝固試験によっては検出されない抗体の
存在によって血栓症の危険にあるかもしれないことにも注目すべきである。さら
には、ループス抗凝固因子又は他の危険因子を有するすべての人が同一の血栓症
傾向を有するわけではない。
抗体の妨害にもかかわらず、抗体を有する人は、静脈又は動脈の血栓症の危険性
が増大していると報告されている。さらには、妊娠期間の初期１／３期間におけ
る自然流産の繰り返しが報告されている。同上。患者は、血栓症の可能性を減ら
すために長期的な抗凝固治療を受けているが、そのような治療の有効性を監視す
るのに適切な技術が開発されていない。また、ループス抗凝固因子の試験で必ず
しも陽性にならない他の患者が、現在の凝固試験によっては検出されない抗体の
存在によって血栓症の危険にあるかもしれないことにも注目すべきである。さら
には、ループス抗凝固因子又は他の危険因子を有するすべての人が同一の血栓症
傾向を有するわけではない。
【０００６】
血栓症の危険にある患者を特定しようとするため、標準的凝固試験を患者血漿
に対して実施した。抗凝固治療は一部の患者で有意な危険を伴うため、患者がそ
のような治療の恩恵を受ける可能性があるかどうかを決定することが非常に望ま
しい。ＰＴＴ及び／又はＰＴ試験結果が正常に見えない、上記のようなさらなる
試験、たとえば正常血漿を添加するか、過剰なリン脂質をさらに添加して試験を
繰り返すことが提案されている。以前、狼瘡患者及び血栓症を発症する傾向がも
っとも高い他の患者の間で区別するための技術が開発された。この方法は、以下
で論じる米国特許第５，４７２，８５２号で開示され、特許請求されたものであ
る。
に対して実施した。抗凝固治療は一部の患者で有意な危険を伴うため、患者がそ
のような治療の恩恵を受ける可能性があるかどうかを決定することが非常に望ま
しい。ＰＴＴ及び／又はＰＴ試験結果が正常に見えない、上記のようなさらなる
試験、たとえば正常血漿を添加するか、過剰なリン脂質をさらに添加して試験を
繰り返すことが提案されている。以前、狼瘡患者及び血栓症を発症する傾向がも
っとも高い他の患者の間で区別するための技術が開発された。この方法は、以下
で論じる米国特許第５，４７２，８５２号で開示され、特許請求されたものであ
る。
【０００７】
以前、ループス抗凝固因子の少なくとも部分母集団が、プロトロンビン活性化
よりも効果的にＡＰＣ抗凝固活性を抑制することができることを確認した（Smir
nov, M. D., Triplett, D. T., Comp, P. C., Esmon, N. L., and
Esmon, C. T. 1995. "On the role of phosphatidylethanolamine i
n the inhibition of activated protein C activity by antiphospho
lipid antibodies," J. Clin. Invest. 94:309-316）。この差は、膜二分
子層中のＰＥの存在によって劇的に増強される（Smirnov, M. D., Triplett,
D. T., Comp, P. C., Esmon, N. L., and Esmon, C. T. 1995.
J. Clin. Invest. 95:309-316及びRauch, J., Tannenbaum, M., Tannenb
aum, H., Ramelson, H., Cullis, P. R., Tilcock, C. P. S., Hope
, M. J., and Janoff, A. S. 1986. "Human hybridoma lupus antic
oagulants distinguish between lamellar and hexagonal phase lipid
systems," J. Biol. Chem. 261:9672-9677）。
よりも効果的にＡＰＣ抗凝固活性を抑制することができることを確認した（Smir
nov, M. D., Triplett, D. T., Comp, P. C., Esmon, N. L., and
Esmon, C. T. 1995. "On the role of phosphatidylethanolamine i
n the inhibition of activated protein C activity by antiphospho
lipid antibodies," J. Clin. Invest. 94:309-316）。この差は、膜二分
子層中のＰＥの存在によって劇的に増強される（Smirnov, M. D., Triplett,
D. T., Comp, P. C., Esmon, N. L., and Esmon, C. T. 1995.
J. Clin. Invest. 95:309-316及びRauch, J., Tannenbaum, M., Tannenb
aum, H., Ramelson, H., Cullis, P. R., Tilcock, C. P. S., Hope
, M. J., and Janoff, A. S. 1986. "Human hybridoma lupus antic
oagulants distinguish between lamellar and hexagonal phase lipid
systems," J. Biol. Chem. 261:9672-9677）。
【０００８】
「Assay For Detection of Selective Protein C Inhibition by Pa
tients」と題する米国特許第５，４７２，８５２号には、血栓症を発症する患者
の傾向を測定する方法が開示されている。有効量のホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＥ）及び有効量のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む膜ソースを検定
に使用した。好ましくは、ＰＥ１０〜５０％及びＰＳ５〜５０％を検定に使用し
た。残り分の％を充足するためにホスファチジルコリン（ＰＳ）を検定で使用し
た。８５２特許で開示され、特許請求された検定では、外因性活性化タンパク質
Ｃ（ＡＰＣ）の存在及び非存在で患者血漿及び対照血漿を検定した。外因性ＡＰ
Ｃ及び最適なリン脂質を含むサンプルの凝固時間と、それらを含まないサンプル
の凝固時間とを比較することにより、血栓症の危険性を評価することができる。
tients」と題する米国特許第５，４７２，８５２号には、血栓症を発症する患者
の傾向を測定する方法が開示されている。有効量のホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＥ）及び有効量のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む膜ソースを検定
に使用した。好ましくは、ＰＥ１０〜５０％及びＰＳ５〜５０％を検定に使用し
た。残り分の％を充足するためにホスファチジルコリン（ＰＳ）を検定で使用し
た。８５２特許で開示され、特許請求された検定では、外因性活性化タンパク質
Ｃ（ＡＰＣ）の存在及び非存在で患者血漿及び対照血漿を検定した。外因性ＡＰ
Ｃ及び最適なリン脂質を含むサンプルの凝固時間と、それらを含まないサンプル
の凝固時間とを比較することにより、血栓症の危険性を評価することができる。
【０００９】
凝塊形成の過程で、白血球が成長中の血栓に補充され、活性化される。これら
の活性化された白血球が、リン脂質を酸化させるとして知られる物質である、過
酸化水素及び超酸化水素などの潜在的な酸化剤を放出すると報告されている。Ma
lech, H. L. and Gallin, J. I. 1987. "Neutrophils in human dis
eases," N. Engl. J. Med. 317:687-694、McCord, J. M. 1985. "Oxyg
en-derived free radicals in postischemic tissue injury," N. Engl
. J. Med. 312:159-163。
の活性化された白血球が、リン脂質を酸化させるとして知られる物質である、過
酸化水素及び超酸化水素などの潜在的な酸化剤を放出すると報告されている。Ma
lech, H. L. and Gallin, J. I. 1987. "Neutrophils in human dis
eases," N. Engl. J. Med. 317:687-694、McCord, J. M. 1985. "Oxyg
en-derived free radicals in postischemic tissue injury," N. Engl
. J. Med. 312:159-163。
【００１０】
リン脂質は凝固及び上記で論じたような凝固検定で重要な役割を有することが
立証され、リン脂質の特定のパラメータに関するいくつかの報告が上記で論じた
ように報告されているが、そのような検定で使用される試薬を改良することによ
って血栓症の危険性を測定するための検定を改良する必要性が絶えずある。加え
て、白血球からの酸化剤の放出に関する報告が、膜酸化が血栓症に関与するかも
しれないと推測しているが、ＡＰＣ活性に対する脂質酸化の示差効果が報告又は
予測されたことはない。
立証され、リン脂質の特定のパラメータに関するいくつかの報告が上記で論じた
ように報告されているが、そのような検定で使用される試薬を改良することによ
って血栓症の危険性を測定するための検定を改良する必要性が絶えずある。加え
て、白血球からの酸化剤の放出に関する報告が、膜酸化が血栓症に関与するかも
しれないと推測しているが、ＡＰＣ活性に対する脂質酸化の示差効果が報告又は
予測されたことはない。
【００１１】
今、酸化されたリン脂質が、凝塊促進反応にほとんど影響せずに、ＡＰＣの抗
凝固特性を選択的に増強することがわかった。また、抗リン脂質抗体の部分集合
が酸化リン脂質増強を選択的に解消することがわかった。本明細書には、酸化リ
ン脂質及び非酸化リン脂質を別個の試薬として使用することによって血栓症発現
の危険性を評価するのに有用な検定を開示する。各試薬を並行検定で使用するこ
とにより、サンプルを凝固に関して試験する。結果を、正常血漿を使用して得ら
れた結果と比較して、サンプル血漿が血栓症の指示物質を含有するかどうかを評
価する。
凝固特性を選択的に増強することがわかった。また、抗リン脂質抗体の部分集合
が酸化リン脂質増強を選択的に解消することがわかった。本明細書には、酸化リ
ン脂質及び非酸化リン脂質を別個の試薬として使用することによって血栓症発現
の危険性を評価するのに有用な検定を開示する。各試薬を並行検定で使用するこ
とにより、サンプルを凝固に関して試験する。結果を、正常血漿を使用して得ら
れた結果と比較して、サンプル血漿が血栓症の指示物質を含有するかどうかを評
価する。
【００１２】
発明の詳細な説明
今、脂質酸化が、活性化タンパク質Ｃ（「ＡＰＣ」）複合体の抗凝固活性を増
強することによって血栓をより非トロンボゲン形成性にするための機構であるこ
とを見いだした。その結果、酸化リン脂質に対する抗体を有する患者は、血栓拡
張を充分に防ぐことができない可能性が高く、付随して、深静脈血栓症及び動脈
血栓症をより起こしやすい。これらの抗体の特異性が、血栓が凝塊促進性になる
のを防いで凝塊抑制性にする。
強することによって血栓をより非トロンボゲン形成性にするための機構であるこ
とを見いだした。その結果、酸化リン脂質に対する抗体を有する患者は、血栓拡
張を充分に防ぐことができない可能性が高く、付随して、深静脈血栓症及び動脈
血栓症をより起こしやすい。これらの抗体の特異性が、血栓が凝塊促進性になる
のを防いで凝塊抑制性にする。
【００１３】
最近のデータが、現在の検定によって特定される抗体の多くが部分的又は完全
に脂質又はタンパク質抗原いずれかの酸化形態を標的にしていることを示した（
たとえば（Horkko, S, Miller, E., Dudi, E., Reaven, P., Curtiss,
L. K., Zvaifler, N. J., Terkeltaub, R., Pierangeli, S. S., B
ranch, D. W., Palinski, W. et al. 1996. "Antiphospholipid antib
odies are directed against epitopes of oxidized phospholipids. R
ecognition of cardiolipin by monoclonal antibodies to epitopes
of oxidized low density lipoprotein," J. Clin. Invest. 98:815-
825を参照）。驚くことに今、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む
酸化リン脂質が因子Ｖａ不活性化複合体におけるＡＰＣの活性をさらに高めるこ
とがわかった。加えて、ループス抗凝固抗体又は抗リン脂質抗体の少なくとも一
クラスの、ＡＰＣ活性を抑制する能力が酸化リン脂質の存在によって増強される
。患者血漿は、引用例として本明細書に含める米国特許第５，４７２，８５２号
に記載の方法にしたがって、活性化タンパク質Ｃの存在又は非存在における一段
階検定で検定することにより、スクリーニングすることができる。この８５２号
特許の方法は、ＰＥを含む有効量の酸化リン脂質を含む膜ソースを使用すること
によって変形することができる。
に脂質又はタンパク質抗原いずれかの酸化形態を標的にしていることを示した（
たとえば（Horkko, S, Miller, E., Dudi, E., Reaven, P., Curtiss,
L. K., Zvaifler, N. J., Terkeltaub, R., Pierangeli, S. S., B
ranch, D. W., Palinski, W. et al. 1996. "Antiphospholipid antib
odies are directed against epitopes of oxidized phospholipids. R
ecognition of cardiolipin by monoclonal antibodies to epitopes
of oxidized low density lipoprotein," J. Clin. Invest. 98:815-
825を参照）。驚くことに今、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む
酸化リン脂質が因子Ｖａ不活性化複合体におけるＡＰＣの活性をさらに高めるこ
とがわかった。加えて、ループス抗凝固抗体又は抗リン脂質抗体の少なくとも一
クラスの、ＡＰＣ活性を抑制する能力が酸化リン脂質の存在によって増強される
。患者血漿は、引用例として本明細書に含める米国特許第５，４７２，８５２号
に記載の方法にしたがって、活性化タンパク質Ｃの存在又は非存在における一段
階検定で検定することにより、スクリーニングすることができる。この８５２号
特許の方法は、ＰＥを含む有効量の酸化リン脂質を含む膜ソースを使用すること
によって変形することができる。
【００１４】
さらなる手法が本発明の検定又はそれから導出されるデータの解釈に役立つか
もしれない。ＡＰＣの存在における検定で試験される特定のサンプルの特性をよ
り良好に評価するため、例２に記載するように、酸化リン脂質試薬を非酸化リン
脂質試薬と比べて使用して、ＡＰＣの非存在で患者サンプルのベースライン凝固
値を決定することが望ましいかもしれない。望ましいかもしれないもう一つの手
法は、免疫グロブリンである患者血漿の精製したサブポーション又は画分の凝固
時間を検定する手法である。患者血漿又は血清からの免疫グロブリンを精製する
手法が例３に記載されており、同様に用いることができる、当該技術で公知の精
製法が他にもある。患者血漿又は患者精製免疫グロブリンを試験サンプルとして
使用するとき使用することができるもう一つのさらなる手法は、既知の正常血漿
中で試験サンプルを希釈する手法である。本発明の検定で使用するのに適切な希
釈は、標準的技術、たとえば、試験サンプルの連続希釈物を調製し、種々の希釈
度で本明細書に記載する凝固検定を実施し、どの希釈度が、望ましい検定条件、
たとえば凝固時間を提供し、生じるかもしれない差違を作業員が測定することを
許すかを決定して、そのような差違がサンプル中の種々の因子の可能な高い濃度
又は異例に低い濃度（疾病又は投薬の過程で起こりうる）によって隠蔽されない
ようにすることによって決定することができる。加えて、希薄すぎるサンプルは
、検定において検出可能な差違を示さないかもしれない。正常血漿中の患者血漿
の好ましい希釈は、およそ正常血漿３部に対して患者血漿１部、およそ１：４の
希釈であることがわかった。免疫グロブリン患者サンプルの場合、約０．６mg/m
lの濃度がもっとも好ましいことがわかった。
もしれない。ＡＰＣの存在における検定で試験される特定のサンプルの特性をよ
り良好に評価するため、例２に記載するように、酸化リン脂質試薬を非酸化リン
脂質試薬と比べて使用して、ＡＰＣの非存在で患者サンプルのベースライン凝固
値を決定することが望ましいかもしれない。望ましいかもしれないもう一つの手
法は、免疫グロブリンである患者血漿の精製したサブポーション又は画分の凝固
時間を検定する手法である。患者血漿又は血清からの免疫グロブリンを精製する
手法が例３に記載されており、同様に用いることができる、当該技術で公知の精
製法が他にもある。患者血漿又は患者精製免疫グロブリンを試験サンプルとして
使用するとき使用することができるもう一つのさらなる手法は、既知の正常血漿
中で試験サンプルを希釈する手法である。本発明の検定で使用するのに適切な希
釈は、標準的技術、たとえば、試験サンプルの連続希釈物を調製し、種々の希釈
度で本明細書に記載する凝固検定を実施し、どの希釈度が、望ましい検定条件、
たとえば凝固時間を提供し、生じるかもしれない差違を作業員が測定することを
許すかを決定して、そのような差違がサンプル中の種々の因子の可能な高い濃度
又は異例に低い濃度（疾病又は投薬の過程で起こりうる）によって隠蔽されない
ようにすることによって決定することができる。加えて、希薄すぎるサンプルは
、検定において検出可能な差違を示さないかもしれない。正常血漿中の患者血漿
の好ましい希釈は、およそ正常血漿３部に対して患者血漿１部、およそ１：４の
希釈であることがわかった。免疫グロブリン患者サンプルの場合、約０．６mg/m
lの濃度がもっとも好ましいことがわかった。
【００１５】
本発明の検定では、適切な酸化脂質を含む試薬を使用する。適切な酸化脂質は
、好ましくは他のリン脂質、もっとも好ましくはホスファチジルセリン（ＰＳ）
と組み合わされたＰＥを含む。もう一つの実施態様では、本発明の検定に使用さ
れる試薬は、ＰＥ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を含む。もっとも好ましく
は、本発明で有用な試薬は、ＰＥ、ＰＳ及びＰＣを含む。好ましくは、試薬を製
造するためには天然の脂質ソースを使用するが、合成脂質から製造される小胞が
、正常血漿の凝固時間を計測する検定で、天然ソース脂質から製造された小胞と
充分に類似した挙動を示すならば、合成脂質を使用してもよいことが考えられる
。
、好ましくは他のリン脂質、もっとも好ましくはホスファチジルセリン（ＰＳ）
と組み合わされたＰＥを含む。もう一つの実施態様では、本発明の検定に使用さ
れる試薬は、ＰＥ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を含む。もっとも好ましく
は、本発明で有用な試薬は、ＰＥ、ＰＳ及びＰＣを含む。好ましくは、試薬を製
造するためには天然の脂質ソースを使用するが、合成脂質から製造される小胞が
、正常血漿の凝固時間を計測する検定で、天然ソース脂質から製造された小胞と
充分に類似した挙動を示すならば、合成脂質を使用してもよいことが考えられる
。
【００１６】
異なる組成のリン脂質を含む他の脂質試薬は、使用するリン脂質の割合を変更
することによって同様な方法で製造することができる。好ましくは、米国特許第
５，４７２，８５２号に記載の組成の脂質試薬を使用する。具体的には、正常（
対照）血漿と血栓症を発現する傾向のある患者からの血漿との間の検出可能な示
差効果ならびに凝固検定で前記ＰＥを補うのに有効な量のＰＳを提供するのに有
効な量のＰＥを含むリン脂質成分を使用する。好ましくは、リン脂質成分は、Ｐ
Ｅ約１０％〜約５０％、ＰＳ約５％〜約５０％を含み、残余がＰＣ又は両性であ
り、中性ｐＨで正味電荷を有しないリン脂質である。好ましくは、ＰＳ成分は、
リン脂質成分の約５％〜約２５％である。非常に好ましい実施態様では、膜ソー
スのリン脂質成分は、リン脂質成分の重量に基づき、ＰＥ約４０％、ＰＳ約２０
％及びＰＣ約４０％を含む。
することによって同様な方法で製造することができる。好ましくは、米国特許第
５，４７２，８５２号に記載の組成の脂質試薬を使用する。具体的には、正常（
対照）血漿と血栓症を発現する傾向のある患者からの血漿との間の検出可能な示
差効果ならびに凝固検定で前記ＰＥを補うのに有効な量のＰＳを提供するのに有
効な量のＰＥを含むリン脂質成分を使用する。好ましくは、リン脂質成分は、Ｐ
Ｅ約１０％〜約５０％、ＰＳ約５％〜約５０％を含み、残余がＰＣ又は両性であ
り、中性ｐＨで正味電荷を有しないリン脂質である。好ましくは、ＰＳ成分は、
リン脂質成分の約５％〜約２５％である。非常に好ましい実施態様では、膜ソー
スのリン脂質成分は、リン脂質成分の重量に基づき、ＰＥ約４０％、ＰＳ約２０
％及びＰＣ約４０％を含む。
【００１７】
脂質試薬を製造するために使用されるリン脂質は、使用前には実質的に非酸化
状態であるべきであり、調製中は、酸化試薬を製造することが望まれるまでリン
脂質を非酸化状態に維持するよう注意を払うべきである。リン脂質の供給業者の
選択は、非酸化対照中に存在する酸化の程度における一つの変数であることがわ
かった。たとえば、Avanti Polar Lipids社から購入されるものが、業者の供
述及び銅触媒酸化の後で認められたＡＰＣ活性の増強の両方に基づくと、他の供
給元から購入されるものよりも酸化の程度がずっと低いことがわかった。酸化に
関してリン脂質を試験するために利用可能な方法がいくつかある。一つの方法は
、肉眼でリン脂質を観察してリン脂質が変色しているように見えるかどうかを決
定する方法である。酸化リン脂質は、非酸化リン脂質と比べるとさえない色又は
黄色に見える。これは、ＰＥ及びＰＳに特に当てはまる。加えて、簡単な分光光
度試験が利用可能である。ＵＶスペクトルにおける２３３ナノメートルと２１５
ナノメートルとの吸収バンドの比は、Klein, R. A., Biochim Biophys Act
a, 210:486 (1970)の手順にしたがって計測することができる。Klein法による
と、０．０２の比が約０．１％酸化生成物に相当する。本発明で有用な脂質試薬
の場合、試薬中で使用され、酸化脂質を試薬として使用する場合に得られる結果
に照らして試験されると、ＡＰＣの存在で、表Ｉに見られるような正常血漿の凝
固時間において有意な差を示す、実質的に非酸化状態の脂質を使用することが望
ましい。
状態であるべきであり、調製中は、酸化試薬を製造することが望まれるまでリン
脂質を非酸化状態に維持するよう注意を払うべきである。リン脂質の供給業者の
選択は、非酸化対照中に存在する酸化の程度における一つの変数であることがわ
かった。たとえば、Avanti Polar Lipids社から購入されるものが、業者の供
述及び銅触媒酸化の後で認められたＡＰＣ活性の増強の両方に基づくと、他の供
給元から購入されるものよりも酸化の程度がずっと低いことがわかった。酸化に
関してリン脂質を試験するために利用可能な方法がいくつかある。一つの方法は
、肉眼でリン脂質を観察してリン脂質が変色しているように見えるかどうかを決
定する方法である。酸化リン脂質は、非酸化リン脂質と比べるとさえない色又は
黄色に見える。これは、ＰＥ及びＰＳに特に当てはまる。加えて、簡単な分光光
度試験が利用可能である。ＵＶスペクトルにおける２３３ナノメートルと２１５
ナノメートルとの吸収バンドの比は、Klein, R. A., Biochim Biophys Act
a, 210:486 (1970)の手順にしたがって計測することができる。Klein法による
と、０．０２の比が約０．１％酸化生成物に相当する。本発明で有用な脂質試薬
の場合、試薬中で使用され、酸化脂質を試薬として使用する場合に得られる結果
に照らして試験されると、ＡＰＣの存在で、表Ｉに見られるような正常血漿の凝
固時間において有意な差を示す、実質的に非酸化状態の脂質を使用することが望
ましい。
【００１８】
酸化の防止は、リン脂質をアルゴン又は窒素ガス下に維持することによって達
成することができる。したがって、リン脂質を、広くガス抜きした緩衝剤、好ま
しくはChelex 100樹脂（Biorad）で前処理した緩衝剤に入れて窒素又はアルゴ
ン下でうず回転させて希釈することが、脂質を非酸化状態に保持する方法である
。
成することができる。したがって、リン脂質を、広くガス抜きした緩衝剤、好ま
しくはChelex 100樹脂（Biorad）で前処理した緩衝剤に入れて窒素又はアルゴ
ン下でうず回転させて希釈することが、脂質を非酸化状態に保持する方法である
。
【００１９】
例１
非酸化リン脂質試薬及び酸化リン脂質試薬を調製する方法
ＰＥ４０％、ＰＳ２０％及びＰＣ４０％を含む、本発明の検定で有用な試薬を
調製した。ウシ脳から導出した（したがって、天然の脂肪酸で構成される）個々
のリン脂質をAvanti Polar Lipids社から取得した。Klein分光光度検定を使用
してそれらを試験すると、１％未満しか酸化されていないことがわかった。脂質
を前記の重量比で混合し、アルゴン下に乾燥させ、３時間凍結乾燥させて有機溶
媒を除去した。次に、アルゴン下で再構成し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５又は０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０mM トリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４中にうず回転によって５mg/ml全脂質まで懸濁させた。使用前に、緩衝
剤をChelex 100樹脂（BioRad）で処理し、アルゴンで飽和させた。使用するリ
ン脂質の割合を変えることにより、異なる組成のリン脂質を含む他の試薬を同様
な方法で製造してもよい。
調製した。ウシ脳から導出した（したがって、天然の脂肪酸で構成される）個々
のリン脂質をAvanti Polar Lipids社から取得した。Klein分光光度検定を使用
してそれらを試験すると、１％未満しか酸化されていないことがわかった。脂質
を前記の重量比で混合し、アルゴン下に乾燥させ、３時間凍結乾燥させて有機溶
媒を除去した。次に、アルゴン下で再構成し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５又は０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０mM トリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４中にうず回転によって５mg/ml全脂質まで懸濁させた。使用前に、緩衝
剤をChelex 100樹脂（BioRad）で処理し、アルゴンで飽和させた。使用するリ
ン脂質の割合を変えることにより、異なる組成のリン脂質を含む他の試薬を同様
な方法で製造してもよい。
【００２０】
リポソームを、１００nmポリカーボネートフィルタ（Nucleopore）に通して押
し出すことによって調製した。このようにして調製した非酸化リポソームは、す
ぐに使用することもできるし、貯蔵することもできる。非酸化リポソームは、検
定に必要になるまで又は酸化が望まれるまで、室温で約３日までの間、アルゴン
下に貯蔵することができる。本発明の検定では比較目的のために非酸化リポソー
ムが必要であるため、酸化を防ぐのに有効な安定剤を、非酸化形態で検定に使用
される非酸化リポソームの量まで加えることが望ましいかもしれない。そのよう
な安定剤は、ＥＤＴＡ及び酸化防止剤、たとえばＢＨＴ又はその等価物を含む。
具体例では、１mM ＥＤＴＡを、リポソームを非酸化状態で保存するための上記
方法にしたがって製造した調製物に加えた。以下に記す方法を使用して酸化リポ
ソームにまでさらに処理される非酸化リポソームの場合、安定剤を加えることは
望ましくない。
し出すことによって調製した。このようにして調製した非酸化リポソームは、す
ぐに使用することもできるし、貯蔵することもできる。非酸化リポソームは、検
定に必要になるまで又は酸化が望まれるまで、室温で約３日までの間、アルゴン
下に貯蔵することができる。本発明の検定では比較目的のために非酸化リポソー
ムが必要であるため、酸化を防ぐのに有効な安定剤を、非酸化形態で検定に使用
される非酸化リポソームの量まで加えることが望ましいかもしれない。そのよう
な安定剤は、ＥＤＴＡ及び酸化防止剤、たとえばＢＨＴ又はその等価物を含む。
具体例では、１mM ＥＤＴＡを、リポソームを非酸化状態で保存するための上記
方法にしたがって製造した調製物に加えた。以下に記す方法を使用して酸化リポ
ソームにまでさらに処理される非酸化リポソームの場合、安定剤を加えることは
望ましくない。
【００２１】
本発明の検定で使用するための酸化リポソームは、非酸化リポソームの空気へ
の暴露を許すことによって製造することもできるし、酸化反応を使用することに
よって製造することもできる。ある程度の制御を処理に加えることができるよう
、酸化反応を使用することが好ましい。酸化のためには、ガラス管中で１０mM
ＣｕＳＯ4１μlをリポソーム１ml（２００mg/ml）に加えてＣｕＳＯ4１０
μMを得た。銅イオンがリン脂質の空気酸化のための触媒として作用する。次に
、懸濁液を３７℃でうず回転させて空気を溶液に導入した。経験的観測による決
定で小胞が崩壊しないように制御される限り、他の酸化方法、たとえば引用例（
Chatterjee, S. N. and Agarwal, S. 1988. "Liposomes as membrane
model for study of lipid peroxidation," Free Radical Biology
and Medicine 4:51-72及びGoni, F. M. and Alonso, A. 1989. "Studi
es of phospholipid peroxidation in liposomes," In CRC Handbook
of Free Radicals and Antioxidants in Biomedicine, J. Miquel, Qu
intanilha, A. T., and Weber, H., editors. CRC Press, Inc., Boc
a Raton, FL. 103-122）で論じられている方法を使用してもよい。空気によ
る酸化のみを使用することもできるが、上記に挙げた酸化反応を使用して酸化脂
質を生成することが好ましい。いずれの方法においても、反応は、触媒を封鎖す
るのに効果的なキレート化剤又は酸化防止剤、たとえばＢＨＴを加えることによ
り、望みどおりに阻止することができる。酸化脂質の適性は、凝固検定を含む予
備的滴定試験によって評価することができる。この環境で、凝固検定の当業者に
公知の条件を使用して、ＡＰＣの存在における予備的滴定試験で、非酸化脂質を
使用する凝固検定と比べて凝固の延長が起こるかどうかを決定することができる
。
の暴露を許すことによって製造することもできるし、酸化反応を使用することに
よって製造することもできる。ある程度の制御を処理に加えることができるよう
、酸化反応を使用することが好ましい。酸化のためには、ガラス管中で１０mM
ＣｕＳＯ4１μlをリポソーム１ml（２００mg/ml）に加えてＣｕＳＯ4１０
μMを得た。銅イオンがリン脂質の空気酸化のための触媒として作用する。次に
、懸濁液を３７℃でうず回転させて空気を溶液に導入した。経験的観測による決
定で小胞が崩壊しないように制御される限り、他の酸化方法、たとえば引用例（
Chatterjee, S. N. and Agarwal, S. 1988. "Liposomes as membrane
model for study of lipid peroxidation," Free Radical Biology
and Medicine 4:51-72及びGoni, F. M. and Alonso, A. 1989. "Studi
es of phospholipid peroxidation in liposomes," In CRC Handbook
of Free Radicals and Antioxidants in Biomedicine, J. Miquel, Qu
intanilha, A. T., and Weber, H., editors. CRC Press, Inc., Boc
a Raton, FL. 103-122）で論じられている方法を使用してもよい。空気によ
る酸化のみを使用することもできるが、上記に挙げた酸化反応を使用して酸化脂
質を生成することが好ましい。いずれの方法においても、反応は、触媒を封鎖す
るのに効果的なキレート化剤又は酸化防止剤、たとえばＢＨＴを加えることによ
り、望みどおりに阻止することができる。酸化脂質の適性は、凝固検定を含む予
備的滴定試験によって評価することができる。この環境で、凝固検定の当業者に
公知の条件を使用して、ＡＰＣの存在における予備的滴定試験で、非酸化脂質を
使用する凝固検定と比べて凝固の延長が起こるかどうかを決定することができる
。
【００２２】
例２
ＡＰＣの非存在におけるベースライン凝固値の測定及びＡＰＣの存在における値
との比較 ＳＴ４凝固計（Diagnostica Stago, Parsippany, NJ）を使用して、一段階
凝固検定として凝固検定を実施した。ＡＰＣ及び／又は免疫グロブリン（正常又
は患者サンプル）を省いた検定の場合、緩衝剤（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２
Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mg/mlゼラチン）で量を充足した。
との比較 ＳＴ４凝固計（Diagnostica Stago, Parsippany, NJ）を使用して、一段階
凝固検定として凝固検定を実施した。ＡＰＣ及び／又は免疫グロブリン（正常又
は患者サンプル）を省いた検定の場合、緩衝剤（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２
Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mg/mlゼラチン）で量を充足した。
【００２３】
ＡＰＣの存在又は非存在における凝固検定に対する脂質酸化の影響をリン脂質
酸化時間の関数として測定した（図１）。溜めておいた正常血漿（５０μl）を
反応容器に配置し、以下の試薬を括弧内に示す最終濃度で加えた。ラッセルクサ
リヘビ蛇毒（C. T. Esmon, Dissertation, Washington University, St.
Louis, 1973）又はAmerican Diagnostica, Greenwich, CN）から得られた
因子Ｘ活性化酵素（０．１〜０．１５nM、ＡＰＣの非存在で３０秒の凝固時間を
出すのに十分）、リン脂質（１０μg/ml）、ＡＰＣ（０．２μg/ml）、最終量を
２００μlにするための緩衝剤。３７℃で１分間のインキュベーションののち、
ＣａＣｌ2（６．２５mM）で凝固を誘発した。
酸化時間の関数として測定した（図１）。溜めておいた正常血漿（５０μl）を
反応容器に配置し、以下の試薬を括弧内に示す最終濃度で加えた。ラッセルクサ
リヘビ蛇毒（C. T. Esmon, Dissertation, Washington University, St.
Louis, 1973）又はAmerican Diagnostica, Greenwich, CN）から得られた
因子Ｘ活性化酵素（０．１〜０．１５nM、ＡＰＣの非存在で３０秒の凝固時間を
出すのに十分）、リン脂質（１０μg/ml）、ＡＰＣ（０．２μg/ml）、最終量を
２００μlにするための緩衝剤。３７℃で１分間のインキュベーションののち、
ＣａＣｌ2（６．２５mM）で凝固を誘発した。
【００２４】
ＰＥの存在又は２０時間の銅触媒脂質酸化のいずれも、ＡＰＣの非存在におけ
る凝固検定に対して有意な影響を及ぼさなかった。ＰＳ及びＰＣのみを含有する
小胞の酸化は、小胞がＡＰＣ抗凝固活性を支持する能力を増強しなかった。小胞
を含有するＰＥの酸化は、ＡＰＣの抗凝固活性を劇的に増強した。
る凝固検定に対して有意な影響を及ぼさなかった。ＰＳ及びＰＣのみを含有する
小胞の酸化は、小胞がＡＰＣ抗凝固活性を支持する能力を増強しなかった。小胞
を含有するＰＥの酸化は、ＡＰＣの抗凝固活性を劇的に増強した。
【００２５】
酸化又は非酸化脂質を使用してＡＰＣの非存在における凝固時間を計測するこ
とにより、既知の正常血漿と比較した血漿試験サンプルのベースライン凝固値を
得ることができる。この測定は、強力なループス抗凝固活性又は患者サンプル中
の他の未知成分の、凝固時間の延長に対する可能な貢献を説明づける。ＡＰＣの
非存在における患者サンプルの凝固時間がＡＰＣの非存在における正常血漿の凝
固時間よりも数秒（たとえば５秒超）長いと測定するならば、ＡＰＣの存在にお
ける患者サンプルの凝固時間は、脂質ソースが酸化されているかいないかにかか
わらず、正常血漿の凝固時間よりもずっと長いと予想される。
とにより、既知の正常血漿と比較した血漿試験サンプルのベースライン凝固値を
得ることができる。この測定は、強力なループス抗凝固活性又は患者サンプル中
の他の未知成分の、凝固時間の延長に対する可能な貢献を説明づける。ＡＰＣの
非存在における患者サンプルの凝固時間がＡＰＣの非存在における正常血漿の凝
固時間よりも数秒（たとえば５秒超）長いと測定するならば、ＡＰＣの存在にお
ける患者サンプルの凝固時間は、脂質ソースが酸化されているかいないかにかか
わらず、正常血漿の凝固時間よりもずっと長いと予想される。
【００２６】
加えて、例２の方法は、上記で論じたさらなる手段の一つ、たとえば例３で論
じるように、患者サンプルからの免疫グロブリンの検定又は精製の前に、正常血
漿中での患者サンプルの希釈を利用することによって変更することができる。
じるように、患者サンプルからの免疫グロブリンの検定又は精製の前に、正常血
漿中での患者サンプルの希釈を利用することによって変更することができる。
【００２７】
例３
凝固障害と診断された患者の血漿からのＩｇＧと比較した正常血漿導出ＩｇＧの
評価 この研究で使用した患者を表Ｉに記載する。以下のようにして患者１〜７を評
価した。二重遠心分離したクエン酸塩添加血漿をすべての凝固検定に使用し、Sl
etnes, K. E., Gravem, K., and Wisloff, F. 1992. "Preparation o
f plasma for the detection of lupus anticoagulants and antiphos
pholipid antibodies." Thromb. Res. 66:43-53の方法にしたがって調製し
た。試験血漿と正常血漿との５０：５０混合物中、市販のＰＴＴ試薬（Staclot
（登録商標）LA, Diagnostica Stago）を使用した場合の凝固時間の延長によ
り、ループス抗凝固因子の存在又は明らかな非存在を決定した。事前に立証して
おいた対照母集団の９５％を超える凝固時間を示す血漿にさらなる試験を実施し
た。六方（ＩＩ）相リン脂質の存在における凝固時間（≧８秒）の正規化及び有
意修正によって診断を確認した。血清サンプル（Quanta Lite aCL IgG、IgM
、Inova Diagnostics, San Diego, CA）に対する市販のＥＬＩＳＡ法によっ
て抗カルジオリピンＩｇＧ及びＩｇＭを試験した。プロトロンビン、タンパク質
Ｓ及びβ２糖タンパク質Ｉに対する抗体を前記のようにＥＬＩＳＡによって分析
した（Safa, O., Crippa, L., Della, V.P., Sabbadini, M. G., Viga
no, D. S., and D'Angelo, A. 1999. "IgG reactivity to phospholi
pid-bound beta(2)-glycoprotein I is the main determinant of the
fraction of lupus anticoagulant activity quenched by addition
of hexagonal (II) phase phospholipid in patients with the clini
cal suspicion of antiphospholipid-antibody syndrome." Haematologica
84:829-838）。
評価 この研究で使用した患者を表Ｉに記載する。以下のようにして患者１〜７を評
価した。二重遠心分離したクエン酸塩添加血漿をすべての凝固検定に使用し、Sl
etnes, K. E., Gravem, K., and Wisloff, F. 1992. "Preparation o
f plasma for the detection of lupus anticoagulants and antiphos
pholipid antibodies." Thromb. Res. 66:43-53の方法にしたがって調製し
た。試験血漿と正常血漿との５０：５０混合物中、市販のＰＴＴ試薬（Staclot
（登録商標）LA, Diagnostica Stago）を使用した場合の凝固時間の延長によ
り、ループス抗凝固因子の存在又は明らかな非存在を決定した。事前に立証して
おいた対照母集団の９５％を超える凝固時間を示す血漿にさらなる試験を実施し
た。六方（ＩＩ）相リン脂質の存在における凝固時間（≧８秒）の正規化及び有
意修正によって診断を確認した。血清サンプル（Quanta Lite aCL IgG、IgM
、Inova Diagnostics, San Diego, CA）に対する市販のＥＬＩＳＡ法によっ
て抗カルジオリピンＩｇＧ及びＩｇＭを試験した。プロトロンビン、タンパク質
Ｓ及びβ２糖タンパク質Ｉに対する抗体を前記のようにＥＬＩＳＡによって分析
した（Safa, O., Crippa, L., Della, V.P., Sabbadini, M. G., Viga
no, D. S., and D'Angelo, A. 1999. "IgG reactivity to phospholi
pid-bound beta(2)-glycoprotein I is the main determinant of the
fraction of lupus anticoagulant activity quenched by addition
of hexagonal (II) phase phospholipid in patients with the clini
cal suspicion of antiphospholipid-antibody syndrome." Haematologica
84:829-838）。
【００２８】
患者８〜１３は、医療記録からの事前報告（登録以来、抗凝固治療を受けた患
者の場合）又は希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒検定のための市販キット（American
Diagnostica, DVVT #810及びDVV Confirm #815）のいずれかを使用して、
ループス抗凝固活性に関して評価した。抗カルジオリピンＩｇＧ及びプロトロン
ビン、タンパク質Ｓ、β２糖タンパク質Ｉ及びAnnexin Vに対する抗体を、β２
糖タンパク質Ｉに関して前記した標準ＥＬＩＳＡ技術によって測定した（Merril
l, J. T., Shen, C., Lahita, R. G., and Mongee, A. B. 1997.
"High prevalence of antiphospholipid antibodies in patients takin
g procainamide." J. Rheum. 24:1083-1088）。
者の場合）又は希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒検定のための市販キット（American
Diagnostica, DVVT #810及びDVV Confirm #815）のいずれかを使用して、
ループス抗凝固活性に関して評価した。抗カルジオリピンＩｇＧ及びプロトロン
ビン、タンパク質Ｓ、β２糖タンパク質Ｉ及びAnnexin Vに対する抗体を、β２
糖タンパク質Ｉに関して前記した標準ＥＬＩＳＡ技術によって測定した（Merril
l, J. T., Shen, C., Lahita, R. G., and Mongee, A. B. 1997.
"High prevalence of antiphospholipid antibodies in patients takin
g procainamide." J. Rheum. 24:1083-1088）。
【００２９】
先に、狼瘡患者の少なくとも部分集合から導出された血漿又は免疫グロブリン
が、ホスファチジルエタノールアミン依存的な方法で、ＡＰＣ機能を選択的に抑
制することができることを示した。Smirnov, M. D., Triplett, D. T., C
omp, P. C., Esmon, N. L., and Esmon, C. T. 1995. "On the ro
le of phosphatidylethanolamine in the inhibition of activated pr
otein C activity by antiphospholipid antibodies." J. Clin. Inves
t. 95:309-316及びSmirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon, C. T., an
d Esmon, N. L. 1999. "The effect of membrane composition on t
he hemostatic balance," Biochemistry 38:3591-3598）。アルゴン下での
貯蔵及びリポソーム調製から１週間以内の使用をはじめとして、酸化に対しては
通常の注意を払ったが、これらの研究で使用したリン脂質の酸化状態は詳細には
わからなかった。
が、ホスファチジルエタノールアミン依存的な方法で、ＡＰＣ機能を選択的に抑
制することができることを示した。Smirnov, M. D., Triplett, D. T., C
omp, P. C., Esmon, N. L., and Esmon, C. T. 1995. "On the ro
le of phosphatidylethanolamine in the inhibition of activated pr
otein C activity by antiphospholipid antibodies." J. Clin. Inves
t. 95:309-316及びSmirnov, M. D., Ford, D. A., Esmon, C. T., an
d Esmon, N. L. 1999. "The effect of membrane composition on t
he hemostatic balance," Biochemistry 38:3591-3598）。アルゴン下での
貯蔵及びリポソーム調製から１週間以内の使用をはじめとして、酸化に対しては
通常の注意を払ったが、これらの研究で使用したリン脂質の酸化状態は詳細には
わからなかった。
【００３０】
酸化脂質の使用が凝固時間に影響するかどうかを試験するため、狼瘡及び血栓
症患者の選択群からのＩｇＧを、酸化リポソームと非酸化リポソームとの間で、
ＡＰＣに対する活性に関して試験した。
症患者の選択群からのＩｇＧを、酸化リポソームと非酸化リポソームとの間で、
ＡＰＣに対する活性に関して試験した。
【００３１】
血栓症患者から標準的な手法によって免疫グロブリン（ＩｇＧ）を精製した。
血漿又は血清を５０％ＮＨ4ＳＯ4で沈殿させた。沈殿物を再懸濁させ、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０２トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。次に、この
物質をタンパク質Ｇカラム（Amersham-Pharmacia）に塗布し、緩衝剤で洗浄し、
０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶離させた。溶離物を１Ｍ トリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ９ですぐに中和し、緩衝剤に対して透析した。免疫グロブリンを０．６mg/ml
の最終濃度まで凝固検定に加えた。
血漿又は血清を５０％ＮＨ4ＳＯ4で沈殿させた。沈殿物を再懸濁させ、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０２トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。次に、この
物質をタンパク質Ｇカラム（Amersham-Pharmacia）に塗布し、緩衝剤で洗浄し、
０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶離させた。溶離物を１Ｍ トリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ９ですぐに中和し、緩衝剤に対して透析した。免疫グロブリンを０．６mg/ml
の最終濃度まで凝固検定に加えた。
【００３２】
これらの検定の結果を表Ｉに示す。実施したとおり、この検定は、ループス抗
凝固活性に対して比較的に感度が低く（≦５秒の延長）、提示されるデータの簡
素化を可能にし、ＡＰＣの存在における凝固時間の延長のみが示される。患者１
〜７は凝固サービスから来た患者であったが、ループス抗凝固陽性としても選択
した。全身性エリテマトーデスの患者８〜１３は、リウマチ科クリニックから来
た患者であった。血栓症が発生している両グループで、ＡＰＣ活性の酸化特異的
抑制を示す免疫グロブリンが見られる（患者１、２、４及び１０）。これらの免
疫グロブリンは、非酸化リン脂質に対するＡＰＣ抗凝固活性に対してほとんど影
響を及ぼさなかった。各グループの患者（患者６、７及び１２）は、両方の脂質
調製物に対する活性の低下を示した。患者７及び特に患者１２の場合、酸化脂質
と非酸化脂質とで活性の差が本質的に維持された。
凝固活性に対して比較的に感度が低く（≦５秒の延長）、提示されるデータの簡
素化を可能にし、ＡＰＣの存在における凝固時間の延長のみが示される。患者１
〜７は凝固サービスから来た患者であったが、ループス抗凝固陽性としても選択
した。全身性エリテマトーデスの患者８〜１３は、リウマチ科クリニックから来
た患者であった。血栓症が発生している両グループで、ＡＰＣ活性の酸化特異的
抑制を示す免疫グロブリンが見られる（患者１、２、４及び１０）。これらの免
疫グロブリンは、非酸化リン脂質に対するＡＰＣ抗凝固活性に対してほとんど影
響を及ぼさなかった。各グループの患者（患者６、７及び１２）は、両方の脂質
調製物に対する活性の低下を示した。患者７及び特に患者１２の場合、酸化脂質
と非酸化脂質とで活性の差が本質的に維持された。
【００３３】
したがって、ＡＰＣの存在における検定で患者血漿サンプルを試験し、酸化脂
質試薬を使用することによって第一の凝固時間を得、非酸化脂質試薬を使用する
ことによって第二の凝固時間を得ることが、患者血漿中の抗体機能的活性を細分
類する方法を提供する。第一の凝固時間が第二の凝固時間と本質的に同じである
ならば、患者サンプルが、酸化脂質の機能を非酸化脂質よりも大きな程度に封鎖
する抗体を含有すると予想することができる。このデータは、血栓症又は血栓症
状再発の傾向を予測するのに有用であるかもしれない。
質試薬を使用することによって第一の凝固時間を得、非酸化脂質試薬を使用する
ことによって第二の凝固時間を得ることが、患者血漿中の抗体機能的活性を細分
類する方法を提供する。第一の凝固時間が第二の凝固時間と本質的に同じである
ならば、患者サンプルが、酸化脂質の機能を非酸化脂質よりも大きな程度に封鎖
する抗体を含有すると予想することができる。このデータは、血栓症又は血栓症
状再発の傾向を予測するのに有用であるかもしれない。
【００３４】
血漿が正常である、すなわちそのような抗体を含有しないならば、酸化リン脂
質試薬を使用した場合、非酸化リン脂質試薬の場合と比べて長い凝固時間を予想
するであろう。（表Ｉ、規準１及び規準２を参照）。
質試薬を使用した場合、非酸化リン脂質試薬の場合と比べて長い凝固時間を予想
するであろう。（表Ｉ、規準１及び規準２を参照）。
【００３５】
【表１】
１規準１＝患者１〜７に対する健常な対照、規準２＝患者８〜１３に対する健常
な対照２ ＤＶＴ＝深静脈血栓症、ＥＭ＝肺動脈塞栓症、ＭＩ＝心筋梗塞、ＳＬＥ＝全身
性エリテマトーゼス、ＣＶＡ＝脳血管障害３ ＬＡ＝ループス抗凝固因子。患者１〜７はStaclot（登録商標）ＬＡ検定（Dia
gnostica Stago社から市販）基準、患者８〜１３はAmerican Diagnosticaの希
釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）検定基準。４ ＡＣＡ＝抗カルジオリピン抗体。患者８〜１３ではＩｇＭは計測せず。５ すべてのサンプルをプロトロンビン（Ｐｔ）、タンパク質Ｓ（ＰｒＳ）及びβ
２糖タンパク質Ｉ（β２）に対する反応性に関してＥＬＩＳＡで試験。アネキシ
ンＶ（ＡｎＶ）に対しては患者８〜１３のみを試験。６ 検定結果は、ＡＰＣの存在で酸化リポソームを用いて計測した凝固時間からＡ
ＰＣの非存在で酸化リポソームを用いた凝固時間を差し引いたものとして報告。７ 検定結果は、ＡＰＣの存在で非酸化リポソームを用いて計測した凝固時間から
ＡＰＣの非存在で非酸化リポソームを用いた凝固時間を差し引いたものとして報
告。
な対照２ ＤＶＴ＝深静脈血栓症、ＥＭ＝肺動脈塞栓症、ＭＩ＝心筋梗塞、ＳＬＥ＝全身
性エリテマトーゼス、ＣＶＡ＝脳血管障害３ ＬＡ＝ループス抗凝固因子。患者１〜７はStaclot（登録商標）ＬＡ検定（Dia
gnostica Stago社から市販）基準、患者８〜１３はAmerican Diagnosticaの希
釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）検定基準。４ ＡＣＡ＝抗カルジオリピン抗体。患者８〜１３ではＩｇＭは計測せず。５ すべてのサンプルをプロトロンビン（Ｐｔ）、タンパク質Ｓ（ＰｒＳ）及びβ
２糖タンパク質Ｉ（β２）に対する反応性に関してＥＬＩＳＡで試験。アネキシ
ンＶ（ＡｎＶ）に対しては患者８〜１３のみを試験。６ 検定結果は、ＡＰＣの存在で酸化リポソームを用いて計測した凝固時間からＡ
ＰＣの非存在で酸化リポソームを用いた凝固時間を差し引いたものとして報告。７ 検定結果は、ＡＰＣの存在で非酸化リポソームを用いて計測した凝固時間から
ＡＰＣの非存在で非酸化リポソームを用いた凝固時間を差し引いたものとして報
告。
【図１】
リン脂質の酸化時間の関数として測定されるＡＰＣの存在又は非存在における
凝固検定に対するリン脂質酸化の影響を示すグラフである。検定は、ＡＰＣを含
むＰＥ：ＰＳ：ＰＣ（塗りつぶした四角）及びＡＰＣを含まないＰＥ：ＰＳ：Ｐ
Ｃ（塗りつぶしていない四角）ならびにＡＰＣを含むＰＳ：ＰＣ（塗りつぶした
円）及びＡＰＣを含まないＰＳ：ＰＣ（塗りつぶしていない円）で実施した。小
胞を含有するＰＥの酸化は、ＡＰＣの抗凝固活性を劇的に増大させた。
凝固検定に対するリン脂質酸化の影響を示すグラフである。検定は、ＡＰＣを含
むＰＥ：ＰＳ：ＰＣ（塗りつぶした四角）及びＡＰＣを含まないＰＥ：ＰＳ：Ｐ
Ｃ（塗りつぶしていない四角）ならびにＡＰＣを含むＰＳ：ＰＣ（塗りつぶした
円）及びＡＰＣを含まないＰＳ：ＰＣ（塗りつぶしていない円）で実施した。小
胞を含有するＰＥの酸化は、ＡＰＣの抗凝固活性を劇的に増大させた。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月２９日（２００１．１０．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 セイファ、ジャミラバディ，オゥミド
アメリカ合衆国オゥクラホゥマ州73120、
オゥクラホゥマ・シティ、プラーズァ・テ
ラス 13321番 ＃285
Claims (29)
- 【請求項１】 リン脂質を試薬として使用する、患者の血栓症危険性の傾向
を決定するための凝固検定において、酸化リン脂質試薬を使用して前記検定を実
施して第一の結果を得、非酸化リン脂質試薬を使用して前記検定を実施して第二
の結果を得、前記第一及び第二の結果を比較する凝固検定。 - 【請求項２】 酸化リン脂質を含む凝固検定で使用するための試薬。
- 【請求項３】 前記酸化リン脂質がホスファチジルエタノールアミンを含む
、請求項２記載の試薬。 - 【請求項４】 ホスファチジルセリンをさらに含む、請求項３記載の試薬。
- 【請求項５】 ホスファチジルコリンをさらに含む、請求項４記載の試薬。
- 【請求項６】 前記試薬が、ホスファチジルエタノールアミン４０％、ホス
ファチジルセリン２０％及びホスファチジルコリン４０％を含む、請求項５記載
の試薬。 - 【請求項７】 患者血漿サンプル中の、酸化脂質の作用を選択的に封鎖する
抗体の存在を決定するための検定であって、 （ａ）前記サンプルの第一のアリコートを得、活性化タンパク質Ｃを提供し、
酸化リン脂質試薬を提供し、凝固を誘発し、凝固時間を計測して第一の凝固時間
を得ることによって凝固検定を実施することと、 （ｂ）同時又は後で、前記サンプルの第二のアリコートを得、活性化タンパク
質Ｃを提供し、非酸化リン脂質試薬を提供し、凝固を誘発し、凝固時間を計測し
て第二の凝固時間を得ることによって凝固検定を実施することと、 （ｃ）前記第一の凝固時間を前記第二の凝固時間と比較し、前記第一の凝固時
間が前記第二の凝固時間と本質的に同じであるならば、患者サンプルが、酸化脂
質の機能を非酸化脂質よりも大きな程度に封鎖する抗体を含有する可能性がある
と決定することと を含む検定。 - 【請求項８】 ベースライン凝固値を得ることをさらに含み、前記ベースラ
イン凝固値を、酸化リン脂質の存在で、ただし活性化タンパク質Ｃの添加なしで
前記サンプルの第三のアリコートの凝固時間を計測し、第三の凝固時間ベースラ
イン値を得、非酸化リン脂質の存在で、ただし活性化タンパク質Ｃの添加なしで
前記サンプルの第四のアリコートの凝固時間を計測し、第四の凝固時間ベースラ
イン値を得ることによって得て、それにより、所与の患者サンプルが、活性化タ
ンパク質Ｃの非存在で、正常血漿サンプルと比べて延長した凝固時間を示すかど
うかを決定し、工程（ａ）及び（ｂ）にしたがって凝固時間を活性化タンパク質
Ｃの存在で試験したとき、前記患者サンプルが、凝固時間の延長を説明づけるこ
とができる他の成分を有するかもしれないと結論づける、請求項７記載の検定。 - 【請求項９】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルエタノールアミ
ンを含む、請求項７又は８記載の検定。 - 【請求項１０】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルセリンをさら
に含む、請求項９記載の検定。 - 【請求項１１】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルコリンをさら
に含む、請求項１０記載の検定。 - 【請求項１２】 前記リン脂質試薬それぞれが、ホスファチジルエタノール
アミン４０％、ホスファチジルセリン２０％及びホスファチジルコリン４０％を
含む、請求項１１記載の検定。 - 【請求項１３】 患者が血栓症を発現する傾向を決定するための検定であっ
て、前記患者から採取した血漿サンプルの第一の凝固時間を活性化タンパク質Ｃ
及び酸化リン脂質試薬の存在で計測し、前記患者から採取した血漿サンプルの第
二の凝固時間を活性化タンパク質Ｃ及び非酸化リン脂質試薬の存在で計測し、結
果を分析し、前記第一の凝固時間が前記第二の凝固時間と比べて延長していない
ならば、前記患者が血栓症を発現する傾向を有すると決定することによる検定。 - 【請求項１４】 前記血漿サンプルから患者免疫グロブリン画分を得、前記
免疫グロブリン分を前記凝固時間計測に使用する、請求項１３記載の検定。 - 【請求項１５】 前記第一及び第二の凝固時間を計測する前に、前記血漿サ
ンプル又はその免疫グロブリン画分を適量の正常血漿で希釈することをさらに含
む、請求項１３又は１４記載の検定。 - 【請求項１６】 前記正常血漿の適量が、患者血漿サンプル１部に対して３
部である、請求項１５記載の検定。 - 【請求項１７】 前記正常血漿の適量が、前記免疫グロブリン濃度を約０．
６mg/mlにするのに充分である、請求項１５記載の検定。 - 【請求項１８】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルエタノールア
ミンを含む、請求項１３又は１４記載の検定。 - 【請求項１９】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルセリンをさら
に含む、請求項１８記載の検定。 - 【請求項２０】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルコリンをさら
に含む、請求項１９記載の検定。 - 【請求項２１】 前記リン脂質試薬それぞれが、ホスファチジルエタノール
アミン４０％、ホスファチジルセリン２０％及びホスファチジルコリン４０％を
含む、請求項２０記載の検定。 - 【請求項２２】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルエタノールア
ミンを含む、請求項１５記載の検定。 - 【請求項２３】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルセリンをさら
に含む、請求項２２記載の検定。 - 【請求項２４】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルコリンをさら
に含む、請求項２３記載の検定。 - 【請求項２５】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルコリンをさら
に含む、請求項２４記載の検定。 - 【請求項２６】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルエタノールア
ミンを含む、請求項１６又は１７記載の検定。 - 【請求項２７】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルセリンをさら
に含む、請求項２６記載の検定。 - 【請求項２８】 前記リン脂質試薬それぞれがホスファチジルコリンをさら
に含む、請求項２７記載の検定。 - 【請求項２９】 前記リン脂質試薬それぞれが、ホスファチジルエタノール
アミン４０％、ホスファチジルセリン２０％及びホスファチジルコリン４０％を
含む、請求項２８記載の検定。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15656499P | 1999-09-28 | 1999-09-28 | |
| US60/156,564 | 1999-09-28 | ||
| PCT/US2000/026438 WO2001023895A2 (en) | 1999-09-28 | 2000-09-26 | Thrombotic episode risk assays using oxidized phospholipids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003510610A true JP2003510610A (ja) | 2003-03-18 |
Family
ID=22560094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001527230A Pending JP2003510610A (ja) | 1999-09-28 | 2000-09-26 | 酸化リン脂質を使用する血栓症発現危険性検定 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1218753A2 (ja) |
| JP (1) | JP2003510610A (ja) |
| AU (1) | AU772269B2 (ja) |
| CA (1) | CA2385012A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001023895A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020009221A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2020-01-09 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | リポソームを含有する液状血液凝固能測定試薬 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5472852A (en) * | 1993-09-15 | 1995-12-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assay for detection of selective Protein C inhibition by patients |
-
2000
- 2000-09-26 AU AU76173/00A patent/AU772269B2/en not_active Ceased
- 2000-09-26 JP JP2001527230A patent/JP2003510610A/ja active Pending
- 2000-09-26 WO PCT/US2000/026438 patent/WO2001023895A2/en active IP Right Grant
- 2000-09-26 EP EP00965455A patent/EP1218753A2/en not_active Withdrawn
- 2000-09-26 CA CA002385012A patent/CA2385012A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020009221A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2020-01-09 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | リポソームを含有する液状血液凝固能測定試薬 |
| JPWO2020009221A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2021-08-02 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | リポソームを含有する液状血液凝固能測定試薬 |
| JP7376478B2 (ja) | 2018-07-06 | 2023-11-08 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | リポソームを含有する液状血液凝固能測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2385012A1 (en) | 2001-04-05 |
| WO2001023895A3 (en) | 2001-06-07 |
| AU7617300A (en) | 2001-04-30 |
| AU772269B2 (en) | 2004-04-22 |
| WO2001023895A2 (en) | 2001-04-05 |
| EP1218753A2 (en) | 2002-07-03 |
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