JP2003509011A - Angiogenic proteins and their use - Google Patents

Angiogenic proteins and their use

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JP2003509011A
JP2003509011A JP2001502444A JP2001502444A JP2003509011A JP 2003509011 A JP2003509011 A JP 2003509011A JP 2001502444 A JP2001502444 A JP 2001502444A JP 2001502444 A JP2001502444 A JP 2001502444A JP 2003509011 A JP2003509011 A JP 2003509011A
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seq
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polypeptides
antibody
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スティーブン エム． ルーベン，
ジン−シャン フ，
リャン カオ，
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 ヒト脈管形成ポリペプチド、それらの生物学的に活性、診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、あるいは誘導体、ならびにこのような脈管形成ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が開示される。組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順ならびにこのようなポリペプチドに対する抗体、アゴニストおよびアンタゴニストもまた提供される。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、創傷治癒を刺激するためにおよび脈管組織修復のために治療的に使用され得る。この抗体およびアンタゴニストを使用して、腫瘍新脈管形成、従って、腫瘍増殖、炎症、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を阻害する方法もまた提供する。新脈管形成およびリンパ管形成を促進するための抗体およびアゴニストを使用する方法がさらに提供される。   (57) [Summary] Disclosed are human angiogenic polypeptides, their biologically active, diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs, or derivatives, and DNA (RNA) encoding such angiogenic polypeptides. . Also provided are procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques, as well as antibodies, agonists and antagonists to such polypeptides. Such polypeptides and polynucleotides can be used therapeutically to stimulate wound healing and for vascular tissue repair. Also provided are methods of using the antibodies and antagonists to inhibit tumor angiogenesis, and thus tumor growth, inflammation, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, and psoriasis. Further provided are methods of using the antibodies and agonists to promote angiogenesis and lymphangiogenesis.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、脈管形成タンパク質、および脈管形成タンパク質のアゴニストまた
はアンタゴニストに関する。本発明はさらに、脈管形成タンパク質活性のアゴニ
ストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to angiogenic proteins and agonists or antagonists of angiogenic proteins. The invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of angiogenic protein activity.

【０００２】 （関連分野） 新規な血管の形成、すなわち新脈管形成は、胚発生、続く成長および組織修復
に必須である。新脈管形成はまた、特定の病理学的状態、例えば、新生物（すな
わち、腫瘍および神経膠腫）に必須な部分である。異常な新脈管形成は、炎症、
慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症のような他の疾患と関連する（Ｆ
ｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
：４４２−４４７（１９８７））。RELATED ART The formation of new blood vessels, or angiogenesis, is essential for embryonic development, subsequent growth and tissue repair. Angiogenesis is also an integral part of certain pathological conditions such as neoplasms (ie tumors and gliomas). Abnormal angiogenesis is inflammation,
Associated with other diseases such as rheumatoid arthritis, psoriasis and diabetic retinopathy (F
olkman, J .; And Klagsbrun, M .; , Science 235
: 442-447 (1987)).

【０００３】 酸性線維芽細胞増殖因子分子および塩基性線維芽細胞増殖因子分子の両方は、
内皮細胞および他の細胞型のマイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉ
ｏｔｒｏｐｉｎ）およびアンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）は、新脈管形
成を誘導し得るが、これらの機構は解明されていない（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、
Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｐｒｅｓ
ｓ、１５３−１７０頁（１９９３））。血管内皮細胞に対する高度に選択的なマ
イトジェンは、血管内皮増殖因子またはＶＥＧＦ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅ
ｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２（１９９２））（これはまた、血管浸潤
因子（ＶＰＦ）としても公知である）である。Both acidic and basic fibroblast growth factor molecules are
It is a mitogen for endothelial cells and other cell types. Angiotropin
otropin) and angiogenin can induce angiogenesis, but their mechanism has not been elucidated (Folkman, J.,.
Cancer Medicine, Lea and Febiger Pres
s, 153-170 (1993)). Highly selective mitogens for vascular endothelial cells include vascular endothelial growth factor or VEGF (Ferrara, N. et al., E.
ndocr. Rev. 13: 19-32 (1992)) (also known as vascular infiltration factor (VPF)).

【０００４】 血管内皮増殖因子は、分泌脈管形成マイトジェン（この標的細胞は、特異的に
、血管内皮細胞に制限されるようである）である。マウスＶＥＧＦ遺伝子が特徴
付けられ、そして、胚形成におけるその発現パターンが分析された。ＶＥＧＦの
持続性の発現が、有窓内皮に隣接した上皮細胞（例えば、脈絡叢および腎臓糸球
体）で観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化の多機能性レギュ
レーターとしてのＶＥＧＦの役割と一致した（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ １１４：５２１−５３２ （１９９２））。Vascular endothelial growth factor is a secretory angiogenic mitogen whose target cells appear to be specifically restricted to vascular endothelial cells. The mouse VEGF gene was characterized and its expression pattern in embryogenesis was analyzed. Persistent expression of VEGF was observed in epithelial cells adjacent to the fenestrated endothelium (eg choroid plexus and renal glomerulus). This data is consistent with the role of VEGF as a multifunctional regulator of endothelial cell proliferation and differentiation (Breier, G. et al., Deve).
Lopment 114: 521-532 (1992)).

【０００５】 ＶＥＧＦは、ヒト血小板由来増殖因子のＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂと配列相
同性を共有する（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０６
−１３０９（１９８９））。相同性の程度は、それぞれ約２１％および２３％で
ある。ジスルフィド結合形成に寄与する８つのシステイン残基は、これらのタン
パク質で厳密に保存されている。これらは類似するが、ＶＥＧＦとＰＤＧＦとの
間には特異的な差異が存在する。ＰＤＧＦは、結合組織の主要な増殖因子である
が、ＶＥＧＦは、内皮細胞に非常に特異的である。あるいは、スプライスｍＲＮ
Ａが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦおよびＰＤＧＦの両方に関して同定され、そしてこれ
らの異なるスプラインシング産物は、生物学的活性およびレセプター結合特異性
が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦは、ホモ二量体またはヘテロ二量体として機
能し、そしてレセプターの二量体化の後に内因性チロシンキナーゼ活性を誘発す
るレセプターに結合する。VEGF shares sequence homology with the human platelet-derived growth factors PDGFa and PDGFb (Leung, DW, et al., Science 246: 1306).
-1309 (1989)). The degree of homology is about 21% and 23%, respectively. The eight cysteine residues that contribute to disulfide bond formation are tightly conserved in these proteins. Although they are similar, there are specific differences between VEGF and PDGF. PDGF is the major connective tissue growth factor, whereas VEGF is highly specific to endothelial cells. Alternatively, splice mRN
A has been identified for both VEGF, PLGF and PDGF, and these different splicing products differ in biological activity and receptor binding specificity. VEGF and PDGF bind to receptors that function as homodimers or heterodimers and induce endogenous tyrosine kinase activity after receptor dimerization.

【０００６】 ＶＥＧＦは、選択的スプライシングに起因して、１２１、１６５、１８９およ
び２０６アミノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ
１６５は可溶性であり、そして新脈管形成を促進し得、一方、ＶＥＧＦ１８９お
よびＶＥＧＦ２０６は細胞表面上のヘパリン含有プロテオグリカンに結合する。
ＶＥＧＦの時間的および空間的発現は、血管の生理学的増殖と関連する（Ｇａｊ
ｄｕｓｅｋ，Ｃ．Ｍ．およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．、Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．１３９：５７０−５７９（１９８９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：８１１−８２２（１９８９））。その高度な親和性
結合部位は、組織切片中の内皮細胞においてのみ局在する（Ｊａｋｅｍａｎ，Ｌ
．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２４４−２５３（１９８９））。こ
の因子は、下垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そしていく
つかのヒト神経膠腫と関連する（Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５９
：８４５−８４８（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１またはＶＥ
ＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞にヌードマウス中で腫瘍
を形成させる能力を与える（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９１：１６０−１７０（１９９３））。ＶＥＧＦモノクローナル抗体によ
るＶＥＧＦ機能の阻害は、免疫欠失マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示
された（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４（１９９３
））。さらに、ＶＥＧＦレセプターのドミナントネガティブ変異が、マウスにお
いて神経膠芽腫の増殖を阻害することが示された。VEGF has four different forms of 121, 165, 189 and 206 amino acids due to alternative splicing. VEGF121 and VEGF
165 is soluble and can promote angiogenesis, while VEGF189 and VEGF206 bind heparin-containing proteoglycans on the cell surface.
Temporal and spatial expression of VEGF is associated with physiological growth of blood vessels (Gaj
duty, C.I. M. And Carbon, S .; J. , Cell Physio
l. 139: 570-579 (1989); McNeil, P .; L. Et al., J. C
ell. Biol. 109: 811-822 (1989)). Its high affinity binding site is localized only on endothelial cells in tissue sections (Jakeman, L.
． B. Et al., Clin. Invest. 89: 244-253 (1989)). This factor can be isolated from pituitary cells and several tumor cell lines and is associated with several human gliomas (Plate, KH, Nature 359).
: 845-848 (1992)). Interestingly, VEGF121 or VE
Expression of GF165 confers the ability of Chinese hamster ovary cells to form tumors in nude mice (Ferrara, N. et al., J. Clin. Inve.
st. 91: 160-170 (1993)). Inhibition of VEGF function by VEGF monoclonal antibody has been shown to inhibit tumor growth in immunodeficient mice (Kim, KJ, Nature 362: 841-844 (1993).
)). Furthermore, dominant negative mutations in the VEGF receptor have been shown to inhibit glioblastoma growth in mice.

【０００７】 血管浸潤因子（ＶＰＦ）はまた、たとえ障害の休止後であっても、血漿タンパ
ク質に対する持続性微小血管透過性亢進の原因である（これは、正常な創傷治癒
の特徴的な特性である）ことが見出された。これは、ＶＰＦが創傷治癒における
重要な因子であることを示唆する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７６：１３７５−１３７９（１９９２）。Vascular invasion factor (VPF) is also responsible for persistent microvascular permeability to plasma proteins, even after cessation of injury, which is a characteristic feature of normal wound healing. It was found. This suggests that VPF is an important factor in wound healing. Brown, L .; F. Et al., J. Exp. Me
d. 176: 1375-1379 (1992).

【０００８】 ＶＥＧＦの発現は、血管化組織（例えば、肺、心臓、胎盤および固体腫瘍）に
おいて高く、そして時間的および空間的の両方で新脈管形成と関連する。ＶＥＧ
Ｆはまた、インビボにて新脈管形成を誘導することが示された。新脈管形成は、
正常組織（特に血管組織）の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは、血管組織修復
の促進（例えば、アテローム性動脈硬化症）の際の使用が提案されている。VEGF expression is high in vascularized tissues (eg lung, heart, placenta and solid tumors) and is associated with angiogenesis both temporally and spatially. VEG
F has also been shown to induce angiogenesis in vivo. Angiogenesis is
Since it is essential for repair of normal tissue (particularly vascular tissue), VEGF has been proposed for use in promoting vascular tissue repair (eg, atherosclerosis).

【０００９】 米国特許第５，０７３，４９２号（Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発
行）は、適切な環境中で内皮細胞増殖を相乗的に増強するための方法を開示し、
この方法は、その環境にＶＥＧＦ、エフェクターおよび血清由来因子を添加する
工程を包含する。さらに、血管内皮細胞増殖因子ＣのサブユニットのＤＮＡが、
ポリメラーゼ連鎖反応技術によって調製された。このＤＮＡは、ヘテロ二量体ま
たはホモ二量体のいずれかとして存在し得るタンパク質をコードする。このタン
パク質は、哺乳動物血管内皮細胞のマイトジェンであり、そしてそのような場合
、欧州特許出願第９２３０２７５０．２号（１９９２年９月３０日公開）に開示
されるように、血管の発達および修復の促進に有用である。US Pat. No. 5,073,492 (issued to Chen et al., Dec. 17, 1991) discloses a method for synergistically enhancing endothelial cell proliferation in a suitable environment,
The method involves adding VEGF, effector and serum derived factors to the environment. In addition, the DNA of the subunit of vascular endothelial growth factor C
Prepared by the polymerase chain reaction technique. This DNA encodes a protein that can exist as either a heterodimer or a homodimer. This protein is a mitogen of mammalian vascular endothelial cells, and in such cases, it is involved in vascular development and repair as disclosed in European Patent Application No. 92302750.2 (published September 30, 1992). Useful for promotion.

【００１０】 血管内皮増殖因子ファミリーへの近年の加えられたものとしては、ＶＥＧＦ−
３、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＶＥＧＦ−Ｅが挙げられる。ＶＥＧＦ−３増殖因子は
、国際公開第ＷＯ ９６／３９４２１号（Ｈｕらに対して１９９６年１２月１２
日に公開）に開示されるように、血管内皮細胞および／または中胚葉細胞の増殖
を促進する強いマイトジェンである。ＶＥＧＦ−Ｄは、血管内皮増殖因子ファミ
リーの別のメンバーであり、そして国際公開第ＷＯ ９８／０７８３２号（１９
９８年２月２６日公開）に開示されるように内皮細胞の増殖または分化を刺激お
よび／または増強する能力を有する。より最近、Ｍｅｙｅｒらは、血管内皮増殖
因子ファミリーの新規メンバー（これはＶＥＧＦ−Ｅと命名される）を公開した
。ＶＥＧＦ−Ｅは、ＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）に選択的に結合する強力な
脈管形成因子である（Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、１８：３６３−３７４（１
９９９））。A recent addition to the vascular endothelial growth factor family is VEGF-.
3, VEGF-D, and VEGF-E. VEGF-3 growth factor is described in WO 96/39421 (Hu et al., Dec. 12, 1996).
As disclosed in (Publication Date), it is a strong mitogen that promotes proliferation of vascular endothelial cells and / or mesodermal cells. VEGF-D is another member of the vascular endothelial growth factor family, and WO 98/07832 (19).
(Published February 26, 1998) and have the ability to stimulate and / or enhance endothelial cell proliferation or differentiation. More recently, Meyer et al. Published a new member of the vascular endothelial growth factor family, designated VEGF-E. VEGF-E is a potent angiogenic factor that selectively binds to VEGF receptor 2 (KDR) (Meyer et al., EMBO J, 18: 363-374 (1).
999)).

【００１１】 従って、脈管形成タンパク質を促進または阻害する処置に対する必要性が存在
する。Accordingly, there is a need for treatments that promote or inhibit angiogenic proteins.

【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーのタンパク質のメンバーおよび関連
するタンパク質（本明細書中にでは総称して、「脈管形成タンパク質」または「
脈管形成ポリペプチド」という）、ならびに脈管形成タンパク質のアゴニストお
よび／またはアンタゴニストに関する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides members of the VEGF / PDGF family of proteins and related proteins (collectively referred to herein as “angiogenic proteins” or “angiogenic proteins”).
Angiogenic polypeptides "), as well as agonists and / or antagonists of angiogenic proteins.

【００１３】 本発明のさらなる局面に従って、治療目的のために（例えば、新脈管形成、創
傷治癒、損傷した骨および組織の増殖を刺激するため、ならびに血管組織修復を
促進するため）、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。特に、末梢動
脈疾患（例えば、重篤な四肢の虚血および冠状疾患）の処置のために、そのよう
なポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
利用するプロセスが提供される。本発明のさらなる別の局面に従って、そのよう
なポリペプチドに対するアゴニストが提供され、このアゴニストは、そのような
ポリペプチドの作用を促進するため（例えば、新脈管形成、リンパ管形成（ｌｙ
ｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進するため、または血管組織修復を促進
するため）に使用され得る。本発明はさらに、上記のポリペプチドの改変体（こ
れは、このポリペプチドの脈管形成エピトープまたは免疫原性エピトープをコー
ドする）に関する。According to a further aspect of the invention, for therapeutic purposes (eg for stimulating angiogenesis, wound healing, proliferation of damaged bone and tissue, and promoting vascular tissue repair), and so on. Processes for utilizing different polypeptides or polynucleotides encoding such polypeptides are provided. In particular, processes are provided that utilize such polypeptides, or polynucleotides encoding such polypeptides, for the treatment of peripheral arterial disease, such as severe limb ischemia and coronary disease. According to yet another aspect of the invention there is provided an agonist for such a polypeptide, which agonist promotes the action of such a polypeptide (eg, angiogenesis, lymphangiogenesis (ly).
mphangiogenesis) or to promote vascular tissue repair). The invention further relates to variants of the above-mentioned polypeptide, which encode an angiogenic or immunogenic epitope of this polypeptide.

【００１４】 本発明のさらに別の局面に従って、そのようなポリペプチドに対するアゴニス
トが提供され、このアゴニストは、そのようなポリペプチドの作用を増強または
促進するため（例えば、腫瘍新脈管形成を阻害して腫瘍の増殖を阻害するため、
または糖尿病性網膜症、炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬を処置するため）に
使用され得る。本発明のさらに別の局面に従って、そのようなポリペプチドのア
ゴニストが提供され、このアゴニストは、そのようなポリペプチドの作用を増強
するため（例えば、新脈管形成、リンパ脈管形成を促進するため、または血管組
織修復を促進するため）に使用され得る。According to yet another aspect of the invention there is provided an agonist for such a polypeptide, wherein the agonist enhances or enhances the action of such a polypeptide (eg inhibiting tumor angiogenesis). To inhibit tumor growth,
Or to treat diabetic retinopathy, inflammation, rheumatoid arthritis and psoriasis). According to yet another aspect of the invention there is provided an agonist of such a polypeptide, which agonist enhances the action of such polypeptide (eg, promotes angiogenesis, lymphangiogenesis). Or to promote vascular tissue repair).

【００１５】 本発明のさらなる別の局面に従って、そのようなポリペプチドに対する抗体お
よびそのような抗体を生成するためのプロセスが提供される。本発明のなおさら
なる局面に従って、治療目的のために（例えば、新脈管形成、創傷治癒、損傷し
た骨および組織の増殖を刺激するため、血管組織修復を促進するため、ならびに
リンパ管形成を刺激するため）、そのような抗体を利用するためのプロセスが提
供される。特に、末梢動脈疾患（例えば、重篤な四肢の虚血および冠状疾患）の
処置のために、そのような抗体を利用するプロセスが提供される。According to yet another aspect of the invention, there are provided antibodies against such polypeptides and processes for producing such antibodies. In accordance with still further aspects of the invention, for therapeutic purposes (eg, to stimulate angiogenesis, wound healing, proliferation of damaged bone and tissue, to promote vascular tissue repair, and to stimulate lymphangiogenesis. In order to do so, a process for utilizing such an antibody is provided. In particular, processes are provided that utilize such antibodies for the treatment of peripheral arterial disease, such as severe limb ischemia and coronary disease.

【００１６】 本発明のさらなる別の局面に従って、そのようなポリペプチドの作用を阻害す
るため（例えば、腫瘍新脈管形成を阻害して腫瘍の増殖を阻害するため、または
糖尿病性網膜症、炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬を処置するため）に使用さ
れ得る、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。According to yet another aspect of the invention, to inhibit the action of such polypeptides (eg to inhibit tumor angiogenesis to inhibit tumor growth, or to diabetic retinopathy, inflammation). , For treating rheumatoid arthritis and psoriasis) are provided.

【００１７】 本発明の１つの局面に従って、新規な成熟ポリペプチド、ならびにこれらの生
物学的に活性でありかつ診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、
および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。According to one aspect of the invention, novel mature polypeptides, as well as biologically active and diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs thereof,
And derivatives are provided. The polypeptides of the present invention are of human origin.

【００１８】 本発明の別の局面に従って、表１に示されるアミノ酸配列を有する全長またま
短縮型の脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された
核酸分子が提供される。本発明はまた、脈管形成タンパク質の生物学的に活性で
ありかつ診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、および誘導体に
関する。According to another aspect of the invention, there is provided an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a full length or truncated angiogenic polypeptide having the amino acid sequence shown in Table 1. The invention also relates to biologically active and diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs and derivatives of angiogenic proteins.

【００１９】 本発明のさらに別の局面に従って、組換え技術によってそのようなポリペプチ
ドを産生するためのプロセスが提供され、このプロセスは、このタンパク質の発
現を促進しかつこのタンパク質の引続く回収を促進する条件下で、本発明のポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含む組換えの原核生物宿主細胞および／または
真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する。According to yet another aspect of the invention there is provided a process for producing such a polypeptide by recombinant technology, which process promotes expression of the protein and subsequent recovery of the protein. Culturing a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the invention under facilitating conditions.

【００２０】 本発明の別の局面に従って、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズする
に十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明の別の局面に
従って、本発明の核酸配列およびそのような核酸配列によってコードされるタン
パク質における変異と関連した、疾患またはそのような疾患に対する感受性を診
断する方法が提供される。According to another aspect of the invention there is provided a nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to specifically hybridize to the nucleic acid sequence of the invention. According to another aspect of the invention there is provided a method of diagnosing a disease or susceptibility to such a disease associated with mutations in the nucleic acid sequences of the invention and the proteins encoded by such nucleic acid sequences.

【００２１】 本発明のなおさらなる局面に従って、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡ
ベクターの製造に関連したインビトロ目的のために、そのようなポリペプチドま
たはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプ
ロセスが提供される。According to still further aspects of the invention, scientific research, DNA synthesis and DNA
Processes are provided for utilizing such polypeptides or polynucleotides encoding such polypeptides for in vitro purposes associated with the production of vectors.

【００２２】 本発明のさらに別の局面に従って、所望の活性を増強または阻害し得る脈管形
成タンパク質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングする
方法が提供される。According to yet another aspect of the invention, there is provided a method of screening for angiogenic protein agonists and / or antagonists that may enhance or inhibit a desired activity.

【００２３】 本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明ら
かであるはずである。These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.

【００２４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 本発明の１つの局面に従って、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー
を含むポリペプチド分子が提供される。より詳細には、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ
ファミリーのメンバーとしては、以下が挙げられる：欧州特許第ＥＰ−６８２１
１０号に開示されるような血小板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）（配列番号１
〜２）；欧州特許第ＥＰ−２８２３１７号に開示されるような血小板由来増殖因
子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（配列番号３〜４）；国際公開第ＷＯ９２／０６１９４号
に開示されるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）（配列番号５〜６）；Ｈａｕｓｅ
ｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ４：２５９−２６８（１９９３）に開示
されるような胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）（配列番号７〜８）；欧州特許第
ＥＰ−３９９８１６号に開示されるような神経膠腫由来増殖因子（ＧＤＧＦ）（
配列番号９〜１０）；国際公開第ＷＯ９０／１３６４９に開示されるような血管
内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（配列番号１１〜１２）；欧州特許第ＥＰ−５０６４
７７号に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（配列番号１３
〜１４）；国際公開第ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖
因子２（ＶＥＧＦ−２）（配列番号１５〜１６）；国際公開第ＷＯ９６／３９４
２１号に開示されるような血管内皮増殖因子３（ＶＥＧＦ−３）（配列番号 １
７〜１８）；国際公開第ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増
殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）（配列番号１９〜２０）；国際公開第ＷＯ９８／０２
５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ１（ＶＥＧＦ−Ｄ１）（配列
番号２１〜２２）；および、ドイツ特許第ＤＥ１９６３９６０１号に開示される
ような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）（配列番号２３〜２４）（これらは
、本明細書中において、総称して「脈管形成タンパク質」または「脈管形成ポリ
ペプチド」といわれる）。上記の参考文献は、本明細書中にその全体が参考とし
て援用される。Detailed Description of the Preferred Embodiments Definitions According to one aspect of the invention there is provided a polypeptide molecule comprising members of the PDGF and VEGF families. More specifically, PDGF and VEGF
Members of the family include: European Patent EP-6821.
Platelet-derived growth factor A (PDGF-A) as disclosed in No. 10 (SEQ ID NO: 1)
~ 2); Platelet-derived growth factor B (PDGF-B) (SEQ ID NOs: 3-4) as disclosed in European Patent EP-283217; Placental proliferation as disclosed in WO92 / 06194. Factor (PlGF) (SEQ ID NOs: 5-6); Hause
r et al., Placental Growth Factor 2 (PIGF-2) (SEQ ID NOs: 7-8) as disclosed in Gorwt Factors 4: 259-268 (1993); nerves as disclosed in EP-399816. Glioma-derived growth factor (GDGF) (
SEQ ID NOs: 9-10); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) as disclosed in WO 90/13649 (SEQ ID NOs: 11-12); European Patent EP-5064.
Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) as disclosed in No. 77 (SEQ ID NO: 13)
~ 14); Vascular Endothelial Growth Factor 2 (VEGF-2) as disclosed in WO 96/39515 (SEQ ID NOs: 15-16); WO 96/394.
21. Vascular Endothelial Growth Factor 3 (VEGF-3) (SEQ ID NO: 1).
7-18); vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) (SEQ ID NOs: 19-20) as disclosed in WO98 / 07832; WO98 / 02.
Vascular endothelial growth factor-D1 (VEGF-D1) (SEQ ID NOS: 21-22) as disclosed in DE 543; and vascular endothelial growth factor E (VEGF-E) as disclosed in German Patent DE19639601. (SEQ ID NOS: 23-24) (these are collectively referred to herein as "angiogenic proteins" or "angiogenic polypeptides"). The above references are incorporated herein by reference in their entireties.

【００２５】 本明細書中に使用される場合「アゴニスト」は、脈管形成タンパク質の所望の
活性を促進または増強する、任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体また
は分子（低分子を含む）をいう。“Agonist” as used herein refers to any polynucleotide, polypeptide, antibody or molecule (including small molecules) that promotes or enhances the desired activity of an angiogenic protein. ..

【００２６】 本明細書中に使用される場合「アンタゴニスト」は、脈管形成タンパク質の所
望の活性を減少させるかまたは阻害する、任意のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体または分子（低分子を含む）をいう。As used herein, an “antagonist” is any polynucleotide, polypeptide, antibody or molecule that reduces or inhibits the desired activity of an angiogenic protein, including small molecules. Say.

【００２７】 本明細書中に使用される場合「所望の活性」は、アゴニストおよび／またはア
ンタゴニストが、脈管形成タンパク質の天然の活性に対して、内皮細胞増殖（新
脈管形成またはリンパ管形成）を促進するか、または内皮細胞増殖（新脈管形成
またはリンパ管形成）を阻害する能力をいう。As used herein, “desired activity” means that an agonist and / or an antagonist refers to endothelial cell proliferation (angiogenesis or lymphangiogenesis) relative to the natural activity of angiogenic proteins. ) Or inhibit endothelial cell proliferation (angiogenesis or lymphangiogenesis).

【００２８】 （脈管形成タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明は、脈管形成タンパク質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに
関する。Angiogenic Protein Agonists and Antagonists The present invention relates to angiogenic protein agonists and / or antagonists.

【００２９】 脈管形成タンパク質アゴニストの１つの実施形態としては、ポリペプチドに結
合し、そしてその所望の活性を促進または増強する抗体が挙げられる。これらの
アゴニストの例としては、脈管形成ポリペプチドに結合し、そしてそれらのポリ
ペプチドの脈管形成活性を促進する（例えば、脈管形成タンパク質の二量体化形
態を安定化することによってか、またはこの抗体に結合するポリペプチドを凝縮
させ、そして脈管形成ポリペプチドの活性を集中または局在化させることによっ
て）特定の脈管形成ポリペプチドに対する、モノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体が挙げられる。One embodiment of an angiogenic protein agonist includes an antibody that binds to a polypeptide and promotes or enhances its desired activity. Examples of these agonists include those that bind to angiogenic polypeptides and promote the angiogenic activity of those polypeptides (eg, by stabilizing dimeric forms of angiogenic proteins. , Or by condensing the polypeptide that binds to the antibody and concentrating or localizing the activity of the angiogenic polypeptide) to a specific angiogenic polypeptide, a monoclonal or polyclonal antibody.

【００３０】 別の潜在的な脈管形成タンパク質アゴニストとしては、脈管形成タンパク質の
活性を促進または増強する低分子が挙げられる。例えば、そのような低分子アゴ
ニストは、脈管形成タンパク質レセプターまたは関連するレセプターに結合し、
それによって脈管形成タンパク質の活性を増強することに関与し得る。Another potential angiogenic protein agonist includes small molecules that promote or enhance the activity of angiogenic proteins. For example, such small molecule agonists bind to angiogenic protein receptors or related receptors,
It may thus be involved in enhancing the activity of angiogenic proteins.

【００３１】 さらなる実施形態において、脈管形成タンパク質アゴニストとしては、脈管形
成タンパク質の活性を促進するポリペプチドが挙げられる。例えば、そのような
ポリペプチドアゴニストは、脈管形成タンパク質または関連するレセプターに結
合し、それによって脈管形成タンパク質の活性を増強することに関与し得る。In a further embodiment, angiogenic protein agonists include polypeptides that promote the activity of angiogenic proteins. For example, such polypeptide agonists may be involved in binding angiogenic proteins or related receptors, thereby enhancing the activity of angiogenic proteins.

【００３２】 別の例としては、脈管形成タンパク質の所望の活性を促進または増強するアン
チセンス構築物が挙げられる。Another example includes antisense constructs that enhance or enhance the desired activity of angiogenic proteins.

【００３３】 潜在的な脈管形成タンパク質アンタゴニストとしては、ポリペプチドに結合し
、そして効果的に脈管形成タンパク質活性を除去する、抗体または（いくつかの
場合）オリゴヌクレオチドが挙げられる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは
、脈管形成タンパク質レセプターに結合するタンパク質と親密に関連し得るが、
これらは、ポリペプチドの不活性形態であり、それによって脈管形成タンパク質
の作用を妨げる。これらのアンタゴニストの例としては、脈管形成タンパク質ポ
リペプチドのネガティブドミナント変異体が挙げられ、例えば、ヘテロ二量体形
態の脈管形成タンパク質の１つの鎖は、優性でありかつ生物学的活性が保持され
ないように変異され得る。ネガティブドミナント変異体の例としては、二量体脈
管形成タンパク質の短縮型バージョンが挙げられ、これは、野生型の脈管形成タ
ンパク質を形成するために別の二量体と相互作用し得るが、生じるホモ二量体は
、不活性でありかつ特徴的な所望の活性を示すことができない。Potential angiogenic protein antagonists include antibodies or (in some cases) oligonucleotides that bind to the polypeptide and effectively eliminate angiogenic protein activity. Alternatively, the potential antagonist may be intimately associated with a protein that binds to the angiogenic protein receptor,
These are inactive forms of the polypeptide and thereby interfere with the action of angiogenic proteins. Examples of these antagonists include negative dominant variants of angiogenic protein polypeptides, eg, one chain of angiogenic protein in heterodimeric form is predominant and biologically active. It can be mutated so that it is not retained. Examples of negative dominant mutants include truncated versions of dimeric angiogenic proteins, which may interact with another dimer to form wild-type angiogenic proteins. The resulting homodimer is inactive and is unable to exhibit the characteristic desired activity.

【００３４】 別の潜在的な脈管形成タンパク質アンタゴニストは、アンチセンス技術を用い
て調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を使用して、三重ら
せん形成またはアンチセンスのＤＮＡもしくはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御
し得、これらの方法の各々は、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの
結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列の５’コード領域を使用して、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関
与する遺伝子領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによって脈管形成タ
ンパク質の転写および生成を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
は、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の脈管形成タ
ンパク質ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡがインビボで発現されて脈管形成タンパク質の生成を阻害し得る
ように細胞に、送達され得る。Another potential angiogenic protein antagonist is an antisense construct prepared using antisense technology. Antisense technology can be used to control gene expression via triple helix formation or antisense DNA or RNA, each of which methods is based on the binding of a polynucleotide to DNA or RNA. For example, the 5'coding region of the polynucleotide sequence encoding the mature polypeptide of the invention is used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10-40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the gene regions involved in transcription (triple helix-Lee et al., Nu.
cl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Sc.
ience 241: 456 (1988); and Dervan et al., Science.
251: 1360 (1991)), thereby interfering with the transcription and production of angiogenic proteins. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block the translation of mRNA molecules into angiogenic protein polypeptides (Antisense-Okano, J.
． Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynu.
cleotides as Antisense Inhibitors of
Gene Expression, CRC Press, Boca Rato
n, FL (1988)). The above oligonucleotides are also antisense RN
A or DNA can be delivered to cells such that it can be expressed in vivo to inhibit the production of angiogenic proteins.

【００３５】 さらなる実施形態において、脈管形成タンパク質アンタゴニストとしてはまた
、低分子が挙げられ、この低分子は、ポリペプチドの活性部位に結合してこの部
位を占有し、それによってその触媒部位を基質にアクセス不可能にし、その結果
正常な生物学的活性が妨げられる。低分子の例としては、小さいペプチド分子ま
たは小さいペプチド様分子が挙げられるがこれら限定されない。In a further embodiment, angiogenic protein antagonists also include small molecules, which bind to and occupy the active site of the polypeptide, thereby rendering its catalytic site a substrate. Inaccessible, thus impeding normal biological activity. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptide molecules or small peptide-like molecules.

【００３６】 アンタゴニストは、固体腫瘍転移に必要である新脈管形成を制限するために利
用され得る。新脈管形成および新生血管形成は、固体腫瘍増殖に必須な工程であ
るので、脈管形成（ａｎｇｉｏｏｇｅｎｉｃ）タンパク質の脈管形成活性の阻害
は、さらなる増殖を妨害するため、固体腫瘍を遅延させるため、または固体腫瘍
を消失させるためにさえも非常に有用である。Antagonists can be utilized to limit the angiogenesis required for solid tumor metastasis. Since angiogenesis and neovascularization are essential steps in solid tumor growth, inhibition of the angiogenic activity of angiogenic proteins interferes with further growth and thus delays solid tumors. , Or even very useful for eliminating solid tumors.

【００３７】 本発明はまた、脈管形成タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストである
ものを同定するための化合物をスクリーニングする方法に関する。このような方
法の例は、コマイトジェン（ｃｏｍｉｔｏｇｅｎ）Ｃｏｎ Ａの存在下でヒト内
皮細胞の増殖を有意に刺激する脈管形成タンパク質の能力を利用する。内皮細胞
が得られ、そして９６ウェルの平らな底面の培養プレート中（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において、Ｃｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が補充された反応混合物中で培養される。Ｃｏｎ−Ａ、本
発明のポリペプチドおよびスクリーニングされる化合物が添加される。３７℃で
のインキュベーション後、培養物は、１ＦＣｉの3［Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＢＧｑ；ＮＥＮ）を用いて3［Ｈ］が取り込まれるのに十
分な時間パルスされ、そしてガラスファイバーのフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上に収集される。三連
の培養物の平均3［Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ）は、液体シンチレーション
カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）
を用いて測定した。コントロールアッセイ（化合物が排除された場合）と比較し
た有意な3［Ｈ］チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。The present invention also relates to methods of screening compounds to identify those that are agonists or antagonists of angiogenic proteins. An example of such a method utilizes the ability of angiogenic proteins to significantly stimulate the proliferation of human endothelial cells in the presence of comitogen Con A. Endothelial cells were obtained and in 96-well flat bottom culture plates (Costar, C
Ambridge, MA), Con-A (Calbiochem, La.
(Jolla, CA) is incubated in the reaction mixture supplemented. Con-A, the polypeptide of the invention and the compound to be screened are added. After incubation at 37 ° C., the cultures contained 1 FCi of 3 [H] thymidine (5 Ci / m 2
mol; 1Ci = 37BGq; NEN) and pulsed for a period of time sufficient to incorporate 3 [H], and a glass fiber filter (Cambridge).
e Technology, Watertown, MA). Mean 3 [H] thymidine incorporation (cpm) of triplicate cultures was measured by liquid scintillation counter (Beckman Instruments, Irvine, CA).
Was measured using. Significant 3 [H] thymidine incorporation compared to control assay (when compound was excluded) is indicative of stimulation of endothelial cell proliferation.

【００３８】 アゴニストについてアッセイするため、上記のアッセイを実施し、そして化合
物が、脈管形成性タンパク質の存在下において。3［Ｈ］チミジン取りこみを促
進する能力は、この化合物が脈管形成性タンパク質に対してアゴニストであるこ
とを示す。逆に、アンタゴニストについてアッセイするため、上記のアッセイを
実施し、そして化合物が、脈管形成性タンパク質の存在下において。3［Ｈ］チ
ミジン取りこみを阻害する能力は、この化合物が脈管形成性タンパク質に対して
アンタゴニストであることを示す。あるいは、脈管形成性タンパク質に対するア
ンタゴニストは、競合阻害アッセイに適切な条件下で、脈管形成性タンパク質お
よび潜在的なアンタゴニストを、膜に結合した、脈管形成タンパク質レセプター
または組換えレセプターと組合せることにより、検出され得る。脈管形成性タン
パク質は、放射性活性などにより標識され得、その結果、このレセプターに結合
した脈管形成性タンパク質分子の数は、潜在的なアンタゴニストの有効性を決定
し得る。To assay for agonists, the above assay was performed and the compound was in the presence of angiogenic proteins. The ability to promote 3 [H] thymidine uptake indicates that this compound is an agonist for angiogenic proteins. Conversely, the above assay is performed to assay for antagonists, and the compound is in the presence of angiogenic proteins. The ability to inhibit 3 [H] thymidine uptake indicates that this compound is an antagonist for angiogenic proteins. Alternatively, the antagonist to the angiogenic protein combines the angiogenic protein and potential antagonist with a membrane-bound, angiogenic protein receptor or recombinant receptor under conditions suitable for competitive inhibition assays. Can be detected. Angiogenic proteins can be labeled, such as by radioactivity, so that the number of angiogenic protein molecules bound to this receptor can determine the efficacy of potential antagonists.

【００３９】 あるいは、脈管形成性タンパク質およびレセプターの相互作用後の既知のセカ
ンドメッセンジャー系の反応は、化合物の存在または非存在下において、測定さ
れ、そして比較される。このようなセカンドメッセンジャー系としては、ｃＡＭ
Ｐグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙
げられるがこれらに限定されない。別の方法において、脈管形成性タンパク質レ
セプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、この化合物の存在下で、標
識した脈管形成性タンパク質とともにインキュベートする。次いで、この相互作
用を増強またはブロックする化合物の能力を測定し得る。Alternatively, the response of a known second messenger system after interaction of angiogenic proteins and receptors is measured and compared in the presence or absence of the compound. As such a second messenger system, cAM
P-guanylate cyclase, ion channels or phosphoinositide hydrolysis, but is not limited thereto. In another method, a mammalian cell or membrane preparation expressing an angiogenic protein receptor is incubated with a labeled angiogenic protein in the presence of the compound. The ability of the compound to enhance or block this interaction can then be measured.

【００４０】 （エピトープおよび抗体） 本発明は、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピト
ープ、あるいはＡＴＣＣ寄託番号９７１４９もしくは７５６９８に含まれるポリ
ヌクレオチド配列によってコードされるか、または配列番号１もしくは３または
ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９もしくは７５６９８の配列の相補鎖に、上記で規定
されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低
いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、
あるいはそれらからなるポリペプチドを含む。配列番号２または４の配列を含む
代表的なクローンは、１９９４年３月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番
号７５６９８を与えられ、そして１９９５年５月１２日に寄託されてＡＴＣＣ寄
託番号９７１４９を与えられた。ＡＴＣＣは、アメリカ合衆国バージニア州２０
１１０−２２０９、マナサス、１０８０１ブールバード大学に位置する。ＡＴＣ
Ｃ寄託は、国際的承認に関するブダペスト条約の規約に従ってなされた。本発明
はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチ
ド配列（例えば、配列番号１または３に開示された配列など）、本発明のエピト
ープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、およ
び上記で規定されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはより
低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダ
イズするポリヌクレオチド配列を含む。Epitopes and Antibodies The present invention is encoded by the epitope of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or the polynucleotide sequence contained in ATCC Deposit No. 97149 or 75698, or SEQ ID NO: 1. Or 3 or a polynucleotide complementary to the complementary strand of the sequence of ATCC Deposit No. 97149 or 75698 under stringent or lower stringency hybridization conditions as defined above. Contains an epitope of the polypeptide sequence, or
Alternatively, it includes a polypeptide consisting of them. A representative clone containing the sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 was the American TypeCul on March 4, 1994.
Deposited to the Pure Collection ("ATCC"), was given ATCC deposit no. 75698, and was deposited on May 12, 1995, was given ATCC deposit no. 97149. ATCC is Virginia 20, USA
Located at 11001 Boulevard University, 110-2209, Manassas. ATC
The C deposit was made in accordance with the Budapest Treaty Convention on International Recognition. The present invention further provides a polynucleotide sequence encoding an epitope of the polypeptide sequence of the present invention (eg, the sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 or 3), a polynucleotide of a complementary strand of the polynucleotide sequence encoding the epitope of the present invention. Nucleotide sequences, and polynucleotide sequences that hybridize to complementary strands under stringent or lower stringency hybridization conditions as defined above.

【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺
乳動物、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有
するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピト
ープを含むポリペプチドならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを包含する。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物に
おいて抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知
の任意の方法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって測定された
。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例え
ば、本明細書中に記載されたイムノアッセイ）によって測定されるように、抗体
がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫
特異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応
性を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要とはし
ない。As used herein, the term "epitope" refers to that portion of a polypeptide that has antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. In a preferred embodiment, the present invention includes a polypeptide comprising an epitope as well as a polynucleotide encoding this polypeptide. As used herein, an "immunogenic epitope" is defined as the portion of a protein that elicits an antibody response in an animal and can be any method known in the art (eg, antibody production as described below). Method). (For example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
81: 3998-4002 (1983)). As used herein, the term "antigenic epitope" refers to an antibody as defined by any method known in the art, such as the immunoassays described herein. It is defined as the part of the protein that is capable of immunospecifically binding to an antigen. Immunospecific binding excludes non-specific binding but does not necessarily exclude cross-reactivity with other antigens. Antigenic epitopes do not necessarily require immunogenicity.

【００４２】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１，２１
１号にさらに記載される）を参照のこと）。Fragments that function as epitopes can be generated by any conventional means. (For example, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 5131-5135 (1985) (U.S. Pat. No. 4,631,21).
1)).

【００４３】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なく
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。好ましいポ
リペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、
５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００
アミノ酸残基長の免疫原性エピトープあるいは抗原性エピトープを含む。さらな
る非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書で開示された抗原性エピト
ープ、ならびにそれらの一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、このエピト
ープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有
用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書に開示された抗原性エピトー
プ、ならびにこれらの抗原性エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の
組み合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイの標的分子として使用
され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９
８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１
９８３）を参照のこと）。In the present invention, the antigenic epitope is preferably at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, more preferably at least 8,
At least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 40, at least 50, and most It preferably comprises a sequence of between about 15 and about 30 amino acids. Preferred polypeptides are at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or 100
It includes immunogenic or antigenic epitopes of amino acid residue length. Additional non-exclusive preferred antigenic epitopes include the antigenic epitopes disclosed herein, as well as portions thereof. Antigenic epitopes are useful, for example, to raise antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to this epitope. Preferred antigenic epitopes include the antigenic epitopes disclosed herein, as well as any combination of two, three, four, five or more of these antigenic epitopes. Antigenic epitopes can be used as target molecules in immunoassays. (For example, Wilson et al., Cell 37: 767-778 (19
84); Sutcliffe et al., Science 219: 660-666 (1).
983)).

【００４４】 同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピト
ープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性
エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上
の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、ア
ルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を
惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合で
は（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され
得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、
変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹
起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにお
いて）。Similarly, immunogenic epitopes can be used to induce antibodies, eg, according to methods well known in the art. (For example, Sutcliffe et al. (Supra); Wils
on et al. (supra); Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 910-914; and Bittle et al., J. Am. Gen. Virol. 6
6: 2347-2354 (1985)). Preferred immunogenic epitopes include the immunogenic epitopes disclosed herein, as well as any combination of two, three, four, five or more of these immunogenic epitopes. A polypeptide comprising one or more immunogenic epitopes may be presented to elicit an antibody response against an animal system (eg rabbit or mouse) with a carrier protein (eg albumin), or the polypeptide may be If sufficiently long (at least about 25 amino acids), the polypeptide can be presented without a carrier. However, immunogenic epitopes containing as few as 8-10 amino acids
It has been shown to be sufficient (e.g. in Western blotting) to raise antibodies capable of (at least) binding to the linear epitope of the denatured polypeptide.

【００４５】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブー
スター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週
間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離の
ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の
血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で
周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。The epitope-bearing polypeptides of the present invention can be used to induce antibodies according to methods well known in the art. This method includes, but is not limited to, in vivo immunization, in vitro immunization, and phage display methods.
For example, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; and Bitt.
le et al. Gen. Virol. , 66: 2347-2354 (1985). When in vivo immunization is used, animals can be immunized with free peptides; however, anti-peptide antibody titers are dependent on the macromolecule carrier (eg, keyhole limpet hemacyanin (KLH) or tetanus toxoid) peptide. Can be boosted by combining. For example, peptides containing cysteine residues can be linked to carriers using linkers such as maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). On the other hand, other peptides can be bound to the carrier using more common binding agents such as glutaraldehyde. Animals such as rabbits, rats, and mice use, for example, emulsions (about 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant or any known to stimulate an immune response) with either free peptide or carrier-bound peptide. Immunization by intraperitoneal injection (including other adjuvants) and / or intradermal injection. Several booster injections may be needed to provide a useful titer of anti-peptide antibody, for example, at intervals of about 2 weeks. This titer can be detected, for example, by an ELISA assay using free peptide adsorbed on the solid surface. Titer of anti-peptide antibody in serum from immunized animals is increased by selection of anti-peptide antibody (eg, by adsorption of peptide on solid support and elution of selected antibody according to methods well known in the art). You can

【００４６】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合さ
れ得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易
にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリ
ペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されてい
る。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，
３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。免疫系に対して上皮障害を横切
る抗原の増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結
合パートナーへ結合された抗原（例えば、インシュリン）について実証された（
例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照
のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィド結合二量体構
造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフ
ラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であるこ
とが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープを
コードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タ
グまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換えられ、発現さ
れたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ
らによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の
容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において
、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化され、その結果
、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からな
るアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タンパク質について
の基質結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて
感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へ
ロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を
用いて選択的に溶出され得る。As will be appreciated by those in the art, and as discussed above, the polypeptides of the present invention that include immunogenic or antigenic epitopes can be fused to other polypeptide sequences. For example, the polypeptides of the present invention are immunoglobulin (Ig
A, IgE, IgG, IgM) constant domains or parts thereof (CH1, C)
H2, CH3, or any combination thereof and portions thereof), resulting in a chimeric polypeptide. Such fusion proteins may facilitate purification and increase half-life in vivo. This has been shown for a chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4-polypeptide and various domains of the constant region of the heavy or light chain of mammalian immunoglobulins. For example, EP 394,827; Traunecker et al., Nature,
331: 84-86 (1988). Enhanced delivery of antigens across epithelial disorders to the immune system has been demonstrated for antigens bound to FcRn binding partners such as IgG or Fc fragments (eg insulin) (
See, for example, PCT publications WO 96/2024 and WO 99/04813). IgG fusion proteins having a disulfide-bonded dimer structure due to disulfide bonds of the IgG moiety are also more effective in binding and neutralizing other molecules than monomeric polypeptides or fragments thereof alone Was found. For example, Fountoulakis et al. Biochem.
, 270: 3958-3964 (1995). Nucleic acids encoding the above epitopes can also be recombined with a gene of interest as an epitope tag (eg, a hemagglutinin (“HA”) tag or a flag tag) for detection and purification of the expressed polypeptide. Can assist. For example, Janknecht
The system described by et al. Allows easy purification of native fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht et al., 1991, Proc. Na.
tl. Acad. Sci. USA 88: 8972-897). In this system, the gene of interest is subcloned into a vaccinia recombination plasmid so that the open reading frame of this gene is translationally fused to an amino-terminal tag consisting of 6 histidine residues. This tag serves as the substrate binding domain for the fusion protein. Extracts from cells infected with recombinant vaccinia virus are loaded onto Ni2 + nitriloacetic acid-agarose columns, and histidine-tagged proteins can be selectively eluted with imidazole-containing buffer.

【００４７】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用することにより、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこ
れらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には
、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３
０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、
ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ
およびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３
（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によってその全体に
おいて参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番
号１または３に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによ
ってコードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され
得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポ
リヌクレオチド配列において変化を生じるように２つ以上のＤＮＡセグメントを
アセンブルすることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド
またはそのコードされるポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ
−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ラン
ダム変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ
、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の、
１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと
組み換えられ得る。Further fusion proteins of the invention may be produced through the techniques of gene shuffling, motif shuffling, exon shuffling, and / or codon shuffling (collectively referred to as "DNA shuffling"). D
NA shuffling can be utilized to modulate the activity of the polypeptides of the invention and this method can be used to produce polypeptides with modified activity, as well as agonists and antagonists of these polypeptides. Generally, US Pat. Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,83.
No. 0,721; No. 5,834,252; and No. 5,837,458,
And Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol.
8: 724-33 (1997); Harayama, Trends Biote.
chnol. 16 (2): 76-82 (1998); Hansson et al., J. Am. M
ol. Biol. 287: 265-76 (1999); and Lorenzo
And Blasco, Biotechniques 24 (2): 308-13.
(1998), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In one embodiment, modification of the polynucleotides corresponding to SEQ ID NO: 1 or 3 and the polypeptides encoded by these polynucleotides can be accomplished by DNA shuffling. DNA shuffling involves assembling two or more DNA segments to produce changes in polynucleotide sequence by homologous or site-specific recombination. In another embodiment, the polynucleotide of the invention or its encoded polypeptide is error prone prior to recombination.
-Prone) by subjecting it to random mutagenesis by PCR, random nucleotide insertion or other methods. In another embodiment, one or more components, motifs, sections, portions, domains, fragments, etc. of the polynucleotides encoding the polypeptides of the invention are of one or more heterologous molecules,
It can be recombined with one or more components, motifs, sections, parts, domains, fragments and the like.

【００４８】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２もしくは４の改変体
、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセ
プター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体
、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーに
よって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本
発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結
合フラグメントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「
抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部
分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本
発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ
、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任
意のサブクラスであり得る。Antibodies In addition, the polypeptides of the invention may be polypeptides, polypeptide fragments of the invention (as determined by immunoassays well known in the art for assaying specific antibody-antigen binding). , Or variants of SEQ ID NO: 2 or 4, and / or antibodies and T cell antigen receptors (TCRs) that immunospecifically bind to an epitope. The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies or chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, fragments produced by Fab expression libraries. , But not limited to, anti-idiotype (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-Id antibodies against the antibodies of the invention), and epitope binding fragments of any of the above. As used herein, the term "
"Antibody" refers to an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule and an immunoglobulin molecule, ie, a molecule containing an antigen binding site that immunospecifically binds an antigen. The immunoglobulin molecule of the present invention may be any type of immunoglobulin molecule (eg IgG
, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), any class (eg,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or any subclass.

【００４９】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのア
ミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは
１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因
性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、およ
び例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号
において記載のような）を含む。Most preferably, the antibody is a human antigen-binding antibody fragment of the invention, which comprises Fab, Fab 'and F (ab') 2, Fd, single chain Fvs (sc).
Fv), single chain antibodies, disulfide-bonded Fvs (sdFv) and VL or V
Examples include, but are not limited to, fragments that include any of the H domains. Antigen-binding antibody fragments, including single chain antibodies, may include variable regions alone or in combination with all or part of the following: hinge region, CH1 domain, C
H2 domain and CH3 domain. Also included in the invention are antigen binding fragments that also include any combination of variable and hinge regions, CH1 domains, CH2 domains and CH3 domains. Antibodies of the invention may be derived from any animal origin including birds and mammals. Preferably, the antibody is human, murine (eg, mouse and rabbit), donkey, ship rabbit (
ship rabbit), goat, guinea pig, camel, horse, or chicken. As used herein, "human" antibody includes antibodies having the amino acid sequence of human immunoglobulin and is transgenic for a human immunoglobulin library or one or more human immunoglobulins and is endogenous. Antibodies isolated from animals that do not express sex immunoglobulin (as described below and, for example, in US Pat. No. 5,939,598 to Kucherlapati et al.).

【００５０】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。The antibodies of the present invention may be monospecific, bispecific, trispecific or of greater multispecificity. A multispecific antibody may be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or both a polypeptide of the invention and a heterologous epitope (eg, a heterologous polypeptide or a solid support material). Can be specific to. For example, PCT Publication WO 93/17715; WO 9
2/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tu
tt et al. Immunol. 147: 60-69 (1991); U.S. Pat. No. 4
, 474,893, 4,714,681, 4,925,648,
No. 5,573,920, No. 5,601,819; Kostelny et al.
J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

【００５１】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。The antibodies of the invention may be described or specified with respect to the epitopes or parts of the polypeptides of the invention to which they recognize or specifically bind. Portions of this epitope or polypeptide may be identified, for example, by N-terminal and C-terminal positions, by size in contiguous amino acid residues, as described herein, or as listed in the tables and figures. Can be transformed.

【００５２】 １つの実施形態において、ＰＤＧＦ−Ａ−特異的抗体を生成するために用いら
れ得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドとしては、以下が挙げられる：配列番
号２のおよそＬｙｓ−７２〜およそＬｅｕ−８０のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド、配列番号２のおよそＩｌｅ−８２〜およそＩｌｅ−８８のアミノ酸残基を
含むポリペプチド、配列番号２のおよそＰｒｏ−１０６〜およそＳｅｒ−１１４
のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号２のおよそＬｙｓ−１３９〜およ
そＶａｌ−１４５のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号２のおよそＡｒ
ｇ−１５９〜およそＬｙｓ−１６５のアミノ酸残基を含むポリペプチド、および
配列番号２のおよそＳｅｒ−１８３〜およそＴｈｒ−２１１のアミノ酸残基を含
むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメータ
ーを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析により、ＰＤＧＦ−Ａタ
ンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。In one embodiment, antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate PDGF-A-specific antibodies include: about Lys-72 to about Leu- of SEQ ID NO: 2. A polypeptide comprising 80 amino acid residues, a polypeptide comprising amino acid residues from approximately Ile-82 to approximately Ile-88 of SEQ ID NO: 2, approximately Pro-106 to approximately Ser-114 in SEQ ID NO: 2.
A polypeptide comprising amino acid residues of SEQ ID NO: 2, a polypeptide comprising amino acid residues of approximately Lys-139 to Val-145 of SEQ ID NO: 2, approximately Ar of SEQ ID NO: 2.
A polypeptide comprising amino acid residues from g-159 to about Lys-165, and a polypeptide containing amino acid residues from about Ser-183 to about Thr-211 of SEQ ID NO: 2. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the PDGF-A protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００５３】 好ましい実施形態において、この抗原性エピトープは、配列番号２のおよそＩ
ｌｅ−８２〜およそＩｌｅ−８８のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope is approximately I of SEQ ID NO: 2.
It contains amino acid residues from le-82 to approximately Ile-88.

【００５４】 ＰＤＧＦ−Ｂ特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号４のおよそ
Ａｒｇ−３９〜およそＧｌｎ−４５のアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４
のおよそＡｓｐ−５１〜およそＡｓｐ−５６のアミノ酸を含むポリペプチド、配
列番号４のおよそＴｈｒ−６５〜およそＧｌｙ−７１のアミノ酸を含むポリペプ
チド、配列番号４のおよそＬｅｕ−１１０〜およそＡｌａ−１１６のアミノ酸を
含むポリペプチド、配列番号４のおよそＳｅｒ−１３１〜およそＴｈｒ−１４４
のアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４のおよそＰｒｏ−１８８〜およそＴ
ｈｒ−２０６のアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４のおよそＡｒｇ−２１
６〜およそＬｙｓ−２２７のアミノ酸を含むポリペプチド、および配列番号４の
およそＴｈｒ−２２９〜およそＬｅｕ−２３５のアミノ酸を含むポリペプチド。
これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメーターを用いるＪａｍ
ｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析により、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の抗原性
エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate PDGF-B specific antibodies include: about Arg-39 to about Gln- of SEQ ID NO: 4. A polypeptide containing 45 amino acids, SEQ ID NO: 4
Of about Asp-51 to about Asp-56 of amino acids, SEQ ID NO: 4 of about Thr-65 to about Gly-71 amino acids of polypeptide, SEQ ID NO: 4 of about Leu-110 to about Ala-116. Of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, approximately Ser-131 to approximately Thr-144
A polypeptide containing amino acids of SEQ ID NO: 4, from about Pro-188 to about T
A polypeptide comprising the amino acid of hr-206, approximately Arg-21 of SEQ ID NO: 4.
A polypeptide comprising 6 to about Lys-227 amino acids, and a polypeptide comprising about Thr-229 to about Leu-235 amino acids of SEQ ID NO: 4.
These polypeptide fragments are Jam using the default parameters.
Analysis of the eson-Wolf antigenic index determined that it carried an antigenic epitope of the PDGF-B protein.

【００５５】 好ましい実施形態において、この抗原性エピトープは、配列番号４のおよそＡ
ｒｇ−３９〜およそＧｌｎ−４５のアミノ酸残基、配列番号４のおよそＡｓｐ−
５１〜およそＡｓｐ−５６のアミノ酸残基、および配列番号４のおよそＴｈｒ−
６５〜およそＧｌｙ−７１のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope is approximately A of SEQ ID NO: 4.
rg-39 to about Gln-45 amino acid residues, about Asp-of SEQ ID NO: 4
51 to approximately Asp-56 amino acid residues, and SEQ ID NO: 4 approximately Thr-
65 to approximately containing Gly-71 amino acid residues.

【００５６】 ＰＩＧＦ特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドまたは
ペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号６のおよそＶａ
ｌ−４６〜およそＣｙｓ−５２のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号６
のおよそＡｒｇ−１１０〜およそＳｅｒ−１１６のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド、および配列番号６のおよそＶａｌ−１２６〜およそＡｓｐ−１４４のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォル
トパラメーターを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によりＰＩ
ＧＦタンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate PIGF-specific antibodies include: approximately Va of SEQ ID NO: 6.
a polypeptide comprising amino acid residues 1-46 to approximately Cys-52, SEQ ID NO: 6
Of about Arg-110 to about Ser-116, and a polypeptide containing about Val-126 to about Asp-144 of SEQ ID NO: 6. These polypeptide fragments were labeled PI by analysis of the Jameson-Wolf antigenicity index using default parameters.
It was determined to carry an antigenic epitope of the GF protein.

【００５７】 好ましい実施形態において、この抗原性エピトープは、配列番号６のおよそＶ
ａｌ−４６〜およそＣｙｓ−５２のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope is approximately V of SEQ ID NO: 6.
It contains amino acid residues from al-46 to approximately Cys-52.

【００５８】 ＰＩＧＦ−２特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号８のおよそ
Ｖａｌ−４６〜およそＣｙｓ−５２のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番
号８のおよそＡｒｇ−１１０〜およそＳｅｒ−１１６のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド、および配列番号８のおよそＶａｌ−１２６〜およそＡｓｐ−１５９の
アミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、デフ
ォルトパラメーターを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析により
ＰＩＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate PIGF-2 specific antibodies include: approximately Val-46 to approximately Cys- of SEQ ID NO: 8. A polypeptide comprising the amino acid residue of 52, a polypeptide comprising the amino acid residue of about Arg-110 to about Ser-116 of SEQ ID NO: 8, and the amino acid residue of about Val-126 to about Asp-159 of SEQ ID NO: 8. A polypeptide comprising. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the PIGF-2 protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００５９】 好ましい実施形態において、この抗原性エピトープは、配列番号８のおよそＶ
ａｌ−４６〜およそＣｙｓ−５２のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope is approximately V of SEQ ID NO: 8.
It contains amino acid residues from al-46 to approximately Cys-52.

【００６０】 ＧＤＧＦ特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドまたは
ペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号１０のおよそＴ
ｈｒ−３０〜およそＡｌａ−３６のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号
１０のおよそＴｙｒ−４６〜およそＣｙｓ−５１のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド、配列番号１０のおよそＧｌｕ−６３〜およそＩｌｅ−６８のアミノ酸残基
を含むポリペプチド、配列番号１０のおよそＳｅｒ−１２５〜およそＣｙｓ−１
４２のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号１０のおよそＰｒｏ−１４４
〜およそＨｉｓ−１５１のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号１０のお
よそＧｌｎ−１５５〜およそＬｙｓ−１７２のアミノ酸残基を含むポリペプチド
、および配列番号１０のおよそＡｓｎ−１７９〜およそＡｒｇ−１９０のアミノ
酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルト
パラメーターを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によりＧＤＧ
Ｆタンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate GDGF-specific antibodies include: approximately T of SEQ ID NO: 10.
a polypeptide containing amino acid residues from hr-30 to about Ala-36, a polypeptide containing amino acid residues from about Tyr-46 to about Cys-51 of SEQ ID NO: 10, about Glu-63 to about Ile of SEQ ID NO: 10. A polypeptide comprising -68 amino acid residues, approximately Ser-125 to approximately Cys-1 of SEQ ID NO: 10
A polypeptide comprising 42 amino acid residues, approximately Pro-144 of SEQ ID NO: 10
~ A polypeptide comprising amino acid residues of about His-151, a polypeptide comprising amino acid residues of about Gln-155 to about Lys-172 of SEQ ID NO: 10, and about Asn-179 to about Arg-190 of SEQ ID NO: 10. A polypeptide comprising the amino acid residue of. These polypeptide fragments were analyzed for GDG by the Jameson-Wolf antigenic index analysis using default parameters.
It was determined to carry an antigenic epitope of the F protein.

【００６１】 好ましい実施形態において、この抗原性エピトープは、配列番号１０のおよそ
Ｔｈｒ−３０〜およそＡｌａ−３６のアミノ酸残基、および配列番号１０のおよ
そＴｙｒ−４６〜およそＣｙｓ−５１のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope is about Thr-30 to about Ala-36 amino acid residues of SEQ ID NO: 10 and about Tyr-46 to Cys-51 amino acid residues of SEQ ID NO: 10. including.

【００６２】 ＶＥＧＦ特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドまたは
ペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号１２のおよそＧ
ｌｕ−６４〜およそＩｌｅ−６９のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号
１２のおよそＧｌｙ−８５〜およそＧｌｙ−９１のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド、配列番号１２のおよそＨｉｓ−１２５〜およそＣｙｓ−１４３のアミノ酸
残基を含むポリペプチド、配列番号１２のおよそＰｒｏ−１４５〜およそＨｉｓ
−１５２のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号１２のおよそＧｌｎ−１
５６〜およそＬｙｓ−１７３のアミノ酸残基を含むポリペプチド、および配列番
号１２のおよそＡｓｎ−１８０〜およそＡｒｇ−１９１のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメーターを
用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によりＶＥＧＦタンパク質の
抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-specific antibodies include: approximately G of SEQ ID NO: 12.
A polypeptide containing amino acid residues from lu-64 to about Ile-69, a polypeptide containing amino acid residues from about Gly-85 to about Gly-91 of SEQ ID NO: 12, about His-125 to about Cys with SEQ ID NO: 12. -143, a polypeptide comprising amino acid residues, approximately Pro-145 to approximately His of SEQ ID NO: 12.
A polypeptide comprising the amino acid residue of -152, approximately Gln-1 of SEQ ID NO: 12
A polypeptide comprising amino acid residues from 56 to about Lys-173, and a polypeptide comprising amino acid residues from about Asn-180 to about Arg-191 of SEQ ID NO: 12. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the VEGF protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００６３】 ＶＥＧＦ−Ａ特異的抗体を生成するのに用いられ得る抗原性のポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列番号１４のおよ
そＴｈｒ−３０〜およそＡｌａ−３６のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列
番号１４のおよそＴｙｒ−４６〜およそＣｙｓ−５１のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド、配列番号１４のおよそＧｌｕ−６３〜およそＩｌｅ−６８のアミノ酸
残基を含むポリペプチド、配列番号１４のおよそＳｅｒ−１２５〜およそＶａｌ
−１４３のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号１４のおよそＧｌｙ−１
４５〜およそＣｙｓ−１６６のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号１４
のおよそＰｒｏ−１６８〜およそＨｉｓ−１７５のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド、配列番号１４のおよそＧｌｎ−１７９〜およそＬｙｓ−１９６のアミノ酸
残基を含むポリペプチド、および配列番号１４のおよそＡｓｎ−２０３〜およそ
Ａｒｇ−２１４のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラ
グメントは、デフォルトパラメーターを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性
指数の分析によりＶＥＧＦ−Ａタンパク質の抗原性エピトープを保有することが
決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-A specific antibodies include: about Thr-30 to about Ala- of SEQ ID NO: 14. A polypeptide containing 36 amino acid residues, a polypeptide containing amino acid residues of about Tyr-46 to about Cys-51 of SEQ ID NO: 14, an amino acid residue of about Glu-63 to about Ile-68 of SEQ ID NO: 14. A polypeptide comprising, about Ser-125 to about Val of SEQ ID NO: 14
A polypeptide comprising an amino acid residue of -143, approximately Gly-1 of SEQ ID NO: 14
A polypeptide comprising amino acid residues from 45 to approximately Cys-166, SEQ ID NO: 14
Of about Pro-168 to about His-175, a polypeptide containing about Gln-179 to about Lys-196 of SEQ ID NO: 14, and about Asn-203 of SEQ ID NO: 14. A polypeptide comprising about Arg-214 amino acid residues. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the VEGF-A protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００６４】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、以下のアミノ酸残基
を含む：配列番号１４のおよそＴｈｒ−３０〜およそＡｌａ−３６、および配列
番号１４のおよそＴｙｒ−４６〜およそＣｙｓ−５１。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises the following amino acid residues: approximately Thr-30 to approximately Ala-36 of SEQ ID NO: 14, and approximately Tyr-46 to approximately Cys- of SEQ ID NO: 14. 51.

【００６５】 ＶＥＧＦ−２特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチド
が挙げられる：配列番号１６のおよそＡｓｐ−４０〜およそＡｌａ−４５、配列
番号１６のおよそＬｙｓ−５４〜およそＬｅｕ−６０、配列番号１６のおよそＧ
ｌｎ−８４〜およそＧｌｙ−８９、配列番号１６のおよそＡｒｇ−９４〜およそ
Ｔｈｒ−１０６、配列番号１６のおよそＩｌｅ−１２２〜およそＣｙｓ−１３１
、配列番号１６のおよそＡｓｎ−１７５〜およそＬｅｕ−１８１、配列番号１６
のおよそＧｌｎ−２３７〜およそＰｒｏ−２４４、配列番号１６のおよそＡｓｐ
−２６７〜およそＰｈｅ−２７６、配列番号１６のおよそＰｒｏ−２８２〜およ
そＡｓｐ−２８７、配列番号１６のおよそＳｅｒ−３０３〜およそＳｅｒ−３１
４、配列番号１６のおよそＡｌａ−３３０〜およそＴｈｒ−３３８、配列番号１
６のおよそＡｒｇ−３４５〜およそＣｙｓ−３５８、配列番号１６のおよそＧｌ
ｙ−３７３〜およそＣｙｓ−３９５、および配列番号１６のおよそＰｒｏ−４１
０〜およそＳｅｒ−４１９。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルト
パラメータを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によって、ＶＥ
ＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-2 specific antibodies include polypeptides that include the following amino acid residues: approximately to SEQ ID NO: 16. Asp-40 to about Ala-45, about Lys-54 to about Leu-60 of SEQ ID NO: 16, about G of SEQ ID NO: 16
In-84 to about Gly-89, about Arg-94 to about Thr-106 of SEQ ID NO: 16, about Ile-122 to about Cys-131 of SEQ ID NO: 16.
SEQ ID NO: 16, about Asn-175 to about Leu-181, SEQ ID NO: 16
About Gln-237 to about Pro-244, about Asp of SEQ ID NO: 16
-267 to about Phe-276, about Pro-282 to about Asp-287 of SEQ ID NO: 16, about Ser-303 to about Ser-31 of SEQ ID NO: 16.
4, about Ala-330 to about Thr-338 of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 1
6 about Arg-345 to about Cys-358, SEQ ID NO: 16 about Gl
y-373 to approximately Cys-395, and approximately Pro-41 of SEQ ID NO: 16.
0 to approximately Ser-419. These polypeptide fragments were identified as VE by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.
It was determined to carry an antigenic epitope of the GF-2 protein.

【００６６】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、以下のアミノ酸残基
を含む：配列番号１６のおよそＡｓｐ−４０〜およそＡｌａ−４５、配列番号１
６のおよそＬｙｓ−５４〜およそＬｅｕ−６０、配列番号１６のおよそＧｌｎ−
８４〜およそＧｌｙ−８９、配列番号１６のおよそＡｒｇ−９４〜およそＴｈｒ
−１０６、および配列番号１６のおよそＩｌｅ−１２２〜およそＣｙｓ−１３１
。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises the following amino acid residues: approximately Asp-40 to approximately Ala-45 of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 1.
6 about Lys-54 to about Leu-60, SEQ ID NO: 16 about Gln-.
84 to about Gly-89, about Arg-94 to about Thr of SEQ ID NO: 16
-106, and about Ile-122 to about Cys-131 of SEQ ID NO: 16.
.

【００６７】 ＶＥＧＦ−３特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチド
が挙げられる：配列番号１８のおよそＳｅｒ−２４〜およそＬｙｓ−３４、配列
番号１８のおよそＡｌａ−４５〜およそＡｒｇ−５０、配列番号１８のおよそＡ
ｒｇ−１２５〜およそＡｌａ−１３８、配列番号１８のおよそＰｒｏ−１４１〜
およそＳｅｒ−１４９、および配列番号１８のおよそＨｉｓ１６７〜およそＰｒ
ｏ−１７２。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメータを用
いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によって、ＶＥＧＦ−３タンパ
ク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-3-specific antibodies include polypeptides that include the following amino acid residues: SEQ ID NO: 18 approximately. Ser-24 to approximately Lys-34, SEQ ID NO: 18 approximately Ala-45 to approximately Arg-50, SEQ ID NO: 18 approximately A
rg-125 to approximately Ala-138, SEQ ID NO: 18 to approximately Pro-141 to
Approximately Ser-149, and approximately His167 to approximately Pr of SEQ ID NO: 18.
o-172. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the VEGF-3 protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００６８】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、以下のアミノ酸残基
を含む：配列番号１８のおよそＳｅｒ−２４〜およそＬｙｓ−３４、および配列
番号１８のおよそＡｌａ−４５〜およそＡｒｇ−５０。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises the following amino acid residues: approximately Ser-24 to approximately Lys-34 of SEQ ID NO: 18, and approximately Ala-45 to approximately Arg- of SEQ ID NO: 18. Fifty.

【００６９】 ＶＥＧＦ−Ｄ特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチド
が挙げられる：配列番号２０のおよそＭｅｔ−１〜およそＧｌｎ−１４、配列番
号２０のおよそＨｉｓ−２９〜およそＡｒｇ−４１、配列番号２０のおよそＭｅ
ｔ−４８〜およそＴｈｒ−５８、配列番号２０のおよそＧｌｕ−７５〜およそＴ
ｈｒ−８７、配列番号２０のおよそＬｅｕ−９５〜およそＰｈｅ−１０３、配列
番号２０のおよそＰｒｏ−１８１〜およそＬｙｓ−１９１、配列番号２０のおよ
そＴｒｐ−１９９〜およそＣｙｓ−２０４、配列番号２０のおよそＡｓｐ−２８
１〜およそＴｈｒ−２９３、配列番号２０のおよそＰｒｏ−３１０〜およそＡｌ
ａ−３１６、および配列番号２０のおよそＧｌｙ−３１８〜およそＰｒｏ−３２
５。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメータを用いるＪａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によって、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの
抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-D specific antibodies include polypeptides that include the following amino acid residues: SEQ ID NO: 20 approximately. Met-1 to approximately Gln-14, SEQ ID NO: 20 approximately His-29 to approximately Arg-41, SEQ ID NO: 20 approximately Me
t-48 to about Thr-58, about Glu-75 to about T of SEQ ID NO: 20
hr-87, about Leu-95 to about Phe-103 of SEQ ID NO: 20, about Pro-181 to about Lys-191 of SEQ ID NO: 20, about Trp-199 to about Cys-204 of SEQ ID NO: 20, About Asp-28
1 to about Thr-293, about Pro-310 to about Al of SEQ ID NO: 20
a-316, and about Gly-318 to about Pro-32 of SEQ ID NO: 20.
5. These polypeptide fragments are labeled with Ja using the default parameters.
Analysis of the meson-Wolf antigenic index determined that it carries an antigenic epitope of the VEGF-D polypeptide.

【００７０】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、以下のアミノ酸残基
を含む：配列番号２０のおよそＭｅｔ−１〜およそＧｌｎ−１４、配列番号２０
のおよそＨｉｓ−２９〜およそＡｒｇ−４１、配列番号２０のおよそＭｅｔ−４
８〜およそＴｈｒ−５８、および配列番号２０のおよそＧｌｕ−７５〜およそＴ
ｈｒ−８７。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises the following amino acid residues: approximately Met-1 to approximately Gln-14 of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 20.
About His-29 to about Arg-41 of SEQ ID NO: 20.
8 to about Thr-58, and about Glu-75 to about T of SEQ ID NO: 20.
hr-87.

【００７１】 ＶＥＧＦ−Ｄ１特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチド
またはペプチドの非限定的な例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ドが挙げられる：配列番号２２のおよそＳｅｒ−２２〜およそＧｌｎ−４３、配
列番号２２のおよそＨｉｓ−５８〜およそＡｒｇ−７０、配列番号２２のおよそ
Ｍｅｔ−７７〜およそＴｈｒ−８７、配列番号２２のおよそＧｌｕ−１０４〜お
よそＴｈｒ−１１６、配列番号２２のおよそＬｅｕ−１２４〜およそＰｈｅ−１
３２、配列番号２２のおよそＰｒｏ−２１０〜およそＬｙｓ−２２０、配列番号
２２のおよそＴｒｐ−２２８〜およそＣｙｓ−２３３、配列番号２２のおよそＡ
ｓｐ−３１０〜およそＴｈｒ−３２２、配列番号２２のおよそＰｒｏ−３３９〜
およそＡｌａ−３４５、および配列番号２２のおよそＧｌｙ−３４７〜およそＰ
ｒｏ−３５４。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパラメータを
用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によって、ＶＥＧＦ−Ｄタン
パク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-D1-specific antibodies include polypeptides that include the following amino acid residues: SEQ ID NO: 22 approximately. Ser-22 to about Gln-43, about His-58 to about Arg-70 of SEQ ID NO: 22, about Met-77 to about Thr-87 of SEQ ID NO: 22, about Glu-104 to about Thr-116 of SEQ ID NO: 22. , About Leu-124 to about Phe-1 of SEQ ID NO: 22
32, about Pro-210 to about Lys-220 of SEQ ID NO: 22, about Trp-228 to about Cys-233 of SEQ ID NO: 22, about A of SEQ ID NO: 22
sp-310 to about Thr-322, about Pro-339 of SEQ ID NO: 22 to
Approximately Ala-345, and approximately Gly-347 to approximately P of SEQ ID NO: 22.
ro-354. These polypeptide fragments were determined to carry an antigenic epitope of the VEGF-D protein by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.

【００７２】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、以下のアミノ酸残基
を含む：配列番号２２のおよそＳｅｒ−２２〜およそＧｌｎ−４３、配列番号２
２のおよそＨｉｓ−５８〜およそＡｒｇ−７０、および配列番号２２のおよそＭ
ｅｔ−７７〜およそＴｈｒ−８７。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises the following amino acid residues: about Ser-22 to about Gln-43 of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 2.
2 from about His-58 to about Arg-70, and about M of SEQ ID NO: 22.
et-77 to approximately Thr-87.

【００７３】 ＶＥＧＦ−Ｅ特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチド
が挙げられる：配列番号２４のおよそＡｓｐ−２１〜およそＴｒｐ−２６、配列
番号２４のおよそＡｓｐ−４６〜およそＰｈｅ−５６、配列番号２４のおよそＧ
ｌｙ−６８〜およそＳｅｒ−７４、および配列番号２４のおよそＰｒｏ−１２１
〜およそＡｒｇ−１３２。これらのポリペプチドフラグメントは、デフォルトパ
ラメータを用いるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によって、ＶＥＧ
Ｆ−Ｅタンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定された。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate VEGF-E specific antibodies include polypeptides comprising the following amino acid residues: SEQ ID NO: 24 approximately Asp-21 to approximately Trp-26, SEQ ID NO: 24 approximately Asp-46 to approximately Phe-56, SEQ ID NO: 24 approximately G
ly-68 to approximately Ser-74, and approximately Pro-121 of SEQ ID NO: 24.
~ Approximately Arg-132. These polypeptide fragments were labeled with VEG by analysis of the Jameson-Wolf antigenic index using default parameters.
It was determined to carry an antigenic epitope of the FE protein.

【００７４】 好ましい実施形態においては、この抗原性エピトープは、配列番号２４のおよ
そＡｓｐ−２１〜およそＴｒｐ−２６のアミノ酸残基を含む。In a preferred embodiment, the antigenic epitope comprises amino acid residues from about Asp-21 to about Trp-26 of SEQ ID NO: 24.

【００７５】 本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた
、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、
そして本発明のポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。Antibodies that specifically bind any epitope or polypeptide of the invention may also be excluded. Therefore, the present invention specifically binds the polypeptide of the present invention,
It also includes antibodies that allow the elimination of the polypeptides of the invention.

【００７６】 本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載されるか、または特定化さ
れ得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチド
に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも
８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも
６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有する
ポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態におい
て、本発明の抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよ
び／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する
。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％
未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５
０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方
法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本
発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に
開示された、任意の単一特異的な抗原性または免疫原性ポリペプチド、あるいは
２、３、４、５以上の特異的抗原性および／または免疫原生ポリペプチドの組み
合わせに関する。さらに本発明には、（本明細書中に記載されるような）ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗
体が含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するその結合親
和性によって記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０ -2 Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０ -5 Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０ -8 Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１
０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、
５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、または１０-15Ｍ未満の解離定数す
なわちＫdを有する結合親和性が挙げられる。[0076]   The antibodies of the invention are also described or specified by their cross-reactivity.
Can be Any other analog of the polypeptides of the invention, ortholog
Antibodies that do not bind log) or homologs are included. Polypeptide of the invention
At least 95%, at least 90%, at least 85%, at least
80%, at least 75%, at least 70%, at least 65%, at least
60%, at least 55% and at least 50% identity (known in the art
Method and when calculated using the methods described herein)
Antibodies that bind the polypeptide are also included in the invention. In particular embodiments
Thus, the antibody of the present invention is a human homologue of a human protein, a rat homologue, and a rat homologue.
And / or rabbit homologues and corresponding epitopes thereof
. Less than 95%, less than 90%, less than 85%, 80% to the polypeptide of the present invention
Less than, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55% and 5
Less than 0% identity (methods known in the art and those described herein)
Antibodies that do not bind to a polypeptide having (as calculated using the method) are also
Included in the invention. In certain embodiments, the above cross-reactivity is referred to herein
Any of the disclosed monospecific antigenic or immunogenic polypeptides, or
A set of 2, 3, 4, 5 or more specific antigenic and / or immunogenic polypeptides
Regarding the alignment. Further, the present invention includes striations (as described herein).
Polynucleotides of the invention are hybridized under
Antibodies that bind the polypeptide encoded by the bridging polynucleotide
The body is included. The antibody of the present invention also has its binding parent to the polypeptide of the present invention.
It may be described or specified by its compatibility. The preferred binding affinity is 5 x 10 -2 M, 10-2M, 5 x 10-3M, 10-3M, 5 x 10-FourM, 10-FourM, 5 x 10 -Five M, 10-FiveM, 5 x 10-6M, 10-6M, 5 x 10-7M, 10-7M, 5 x 10 -8 M, 10-8M, 5 x 10-9M, 10-9M, 5 x 10-TenM, 10-TenM, 5 x 1
0-11M, 10-11M, 5 x 10-12M, 10-12M, 5 x 10-13M, 10-13M,
5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15M or 10-15Dissociation constant less than M
Nawachi KdAnd binding affinity with.

【００７７】 本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定される際の、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なく
とも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なく
とも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対する結合を競合的に阻害
する。The present invention also includes any method known in the art for determining competitive binding (
Antibodies that competitively inhibit the binding of antibodies to the epitopes of the invention as determined by, for example, the immunoassays described herein) are provided. In preferred embodiments, the antibody competitively inhibits binding to the epitope by at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%. .

【００７８】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプ
チド部分または全体のいずれかとの相互作用を途絶させる抗体を含む。好ましく
は、本発明の抗体は、本明細書中で開示される抗原性エピトープまたはその一部
に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方
を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活性化を
妨げるレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプターの活性化（すなわち、
シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分野で
公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、レセプター
のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいは（例えば、
上記に記載されたような）免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によるその
基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非
存在下での活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少
なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、ま
たは少なくとも５０％、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体が提
供される。 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター
特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好ましく
は、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識し
ない抗体の特徴とする。同様に、本発明には、リガンドに結合し、そしてリガン
ドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それに
よってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは妨
げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、レセプターを活性化する
抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストのように作用し得、すなわ
ち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性の全体またはサブセット（
ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを、例えば、レセプターの二量化を誘導することによ
って増強または活性化する。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプ
チドの特異的な生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴ
ニストまたはインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニストとして特定化され得る。
上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎ
ｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈ
ａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９
９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４
（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３
１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：
２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７
）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５
）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１
９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１
９９６）（上記の文献はすべて、本明細書中でその全体が参考として援用される
）を参照のこと。The antibody of the present invention may act as an agonist or antagonist of the polypeptide of the present invention. For example, the invention includes antibodies that disrupt the interaction of the receptor / ligand with either or all of the polypeptide moieties of the invention. Preferably, the antibodies of the present invention bind to the antigenic epitopes disclosed herein or a portion thereof. The invention features both receptor-specific and ligand-specific antibodies. The present invention also features receptor-specific antibodies that do not interfere with ligand binding but prevent receptor activation. Activation of the receptor (ie,
Signal transduction) can be determined by the techniques described herein or otherwise known in the art. For example, activation of the receptor may be due to receptor phosphorylation (eg tyrosine or serine / threonine) or (eg
It can be determined by immunoprecipitation (as described above), followed by detection of its substrate by Western blot analysis. In certain embodiments, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%, ligand activity of activity in the absence of antibody. Alternatively, an antibody that inhibits receptor activity is provided. The present invention also recognizes receptor-specific antibodies that interfere with both ligand binding and receptor activation, as well as receptor-ligand complexes, and, preferably, specifically binds unbound receptor or unbound ligand. Characterize antibodies that do not recognize. Similarly, the invention includes neutralizing antibodies that bind to the ligand and prevent it from binding to the receptor, as well as binding to the ligand, thereby preventing receptor activation, but preventing the ligand from binding to the receptor. No antibodies included. Further included in the invention are antibodies that activate the receptor. These antibodies may act like receptor agonists, ie, all or a subset of the biological activity of ligand-mediated receptor activation (
any of the subsets) is enhanced or activated, for example by inducing receptor dimerization. The antibody may be specified as an agonist, antagonist or inverse agonist for a biological activity, including the specific biological activity of the peptides of the invention disclosed herein.
The antibody agonists described above can be made using methods known in the art. For example, PCT Publication WO 96/40281; US Pat. No. 5,811,097; Den.
g et al., Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998); H.
arrop et al. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (19
98); Zhu et al., Cancer Res: 58 (15): 3209-3214.
(1998); Yoon et al. Immunol. 160 (7): 3170-3
179 (1998); Prat et al. Cell. Sci. 111 (Pt2):
237-247 (1998); Pitard et al. Immunol. Meth
ods 205 (2): 177-190 (1997); Liautard et al., C.
ytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson et al.,
J. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301 (1997)
); Taryman et al., Neuron 14 (4): 755-762 (1995).
); Muller et al., Structure 6 (9): 1153-1167 (1).
998); Bartunek et al., Cytokine 8 (1): 14-20 (1.
996) (all of the above references are incorporated herein by reference in their entirety).

【００７９】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
ならびに治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化する
のために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的
サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定す
るためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９
８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。The antibodies of the invention can be used to purify, detect and target the polypeptides of the invention, including, but not limited to, diagnostic and therapeutic methods both in vitro and in vivo. . For example, the antibody has use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring the levels of polypeptides of the invention in biological samples. For example, Harlow et al., An
tibodies: A Laboratory Manual, (Cold S
pring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 19
88), which is incorporated herein by reference in its entirety.

【００８０】 以下により詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組
成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端も
しくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または
毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０
８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１
４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。As discussed in more detail below, the antibodies of the invention can be used either alone or in combination with other compositions. The antibody may further be recombinantly fused at its N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or may be chemically linked (including covalent and non-covalent) to the polypeptide or other composition. . For example, the antibodies of the invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules and effector molecules useful as labels in detection assays, such as heterologous polypeptides, drugs, radionuclides or toxins. For example, PCT publication WO92 / 0
8495; WO91 / 14438; WO89 / 12624; US Pat. No. 5,31.
4,995; and EP 396,387.

【００８１】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨が
ないような抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含む
。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル
化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ
）、アミド化、公知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）に
よる誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質へ
の連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、
特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを
含むが、これらに限定されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導
体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。The antibodies of the invention may be modified (ie, covalent attachment of any type of molecule to the antibody such that the antibody does not prevent the antibody from producing an anti-idiotypic response). Derivatives (by covalent attachment). For example, without limitation, antibody derivatives include, for example, glycosylations, acetylations, pegylations, phosphorylations.
), Amidation, derivatization with known blocking / blocking groups, proteolytic cleavage, ligation to cellular ligands or other proteins, and the like. Numerous optional chemical modifications
It can be carried out by known techniques including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. In addition, the derivative may contain one or more non-classical amino acids.

【００８２】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロ
イント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉ
ｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜
在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなア
ジュバントはまた、当該分野で周知である。The antibodies of the invention can be produced by any suitable method known in the art.
Polyclonal antibodies to the antigen of interest can be produced by various procedures well known in the art. For example, the polypeptides of the invention can be administered to a variety of host animals, including but not limited to rabbits, mice, rats, etc., to induce the production of serum containing polyclonal antibodies specific for the antigen. Various adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species, and Freund's (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide (mi
general gel), surface-active substances such as lysolecithin, pluronic (p
luuronic) polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (calumet-
Bacillus gellan) and potentially useful human adjuvants such as corynebacterium parvum. Such adjuvants are also well known in the art.

【００８３】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクロ
ーナル抗体が生成される方法ではない。Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art including the use of hybridoma, recombinant, and phage display techniques, or a combination thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using the hybridoma technology known in the art, including: Har
Low et al., Antibodies: A Laboratory Manual,
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
, 2nd edition, 1988); Hammerling et al., Monoclonal An.
tibodies and T-Cell Hybridomas 563-6
81 (Elsevier, NY 1981), which is incorporated by reference in its entirety. The term "monoclonal antibody" as used herein is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. The term "monoclonal antibody" refers to an antibody that is derived from a single clone, including any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone, and not the method by which the monoclonal antibody is produced.

【００８４】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、慣用的であり、そして当該分野に周知であり、そして実施例に詳細に議論さ
れる。非限定的な例においては、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのよ
うなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される
（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾
臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によって任意の
適切なメラノーマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の
細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限定希釈によって選択およびクローン化
する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗
体を分泌する細胞について当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的
に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブ
リドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。Methods for producing and screening for particular antibodies using hybridoma technology are routine and well known in the art and are discussed in detail in the Examples. In a non-limiting example, mice can be immunized with a polypeptide of the invention or cells expressing such a peptide. Once an immune response is detected (eg, antibodies specific for the antigen are detected in mouse serum), the mouse spleen is harvested and splenocytes isolated. The splenocytes are then fused by well known techniques to any suitable melanoma cells (eg cells from cell line SP20 available from the ATCC). Hybridomas are selected and cloned by limiting dilution. The hybridoma clones are then assayed for cells secreting antibodies capable of binding the polypeptides of the invention by methods known in the art. Ascites fluid, which generally contains high levels of antibodies, can be produced by immunizing mice with positive hybridoma clones.

【００８５】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、産生す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞を用
いた本発明の抗原と免疫させたマウスから単離された脾細胞とを融合させること
によって、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリド
ーマクローンについての融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングする
ことによって産生される。Accordingly, the invention provides a method of producing an antibody produced by a method comprising culturing a monoclonal antibody and a hybridoma cell secreting the antibody of the invention, wherein, preferably, this antibody The hybridoma is a hybridoma clone which secretes an antibody capable of binding to the polypeptide of the present invention by fusing splenocytes isolated from the immunized mouse with the antigen of the present invention using myeloma cells. Produced by screening the hybridomas resulting from the fusion.

【００８６】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。Antibody fragments that recognize particular epitopes can be produced by known techniques. For example, Fab and F (ab ′) 2 fragments of the invention are (Fa
It can be produced by proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules using enzymes such as papain (to produce the b fragment) or pepsin (to produce the F (ab ') 2 fragment). F (ab ′) 2 fragments contain the variable region, the light chain constant region and the CH1 domain of the heavy chain.

【００８７】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナト
リアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合
ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメイ
ンを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識
した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または補足された抗原を使用する
）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子
ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え
的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメイ
ンを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状フ
ァージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製す
るために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示され
る方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇ
ｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅ
ｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４
）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０
２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１
８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２
０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９
号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，
９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５
７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第
５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号
および同第５，９６９，１０８号（上記の参考文献は、本明細書中でその全体が
参考として援用される）。For example, the antibodies of the present invention can also be produced using various phage display methods known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles which carry the polynucleotide sequences encoding them. In particular, such phage can be utilized to display antigen binding domains expressed from a repertoire or combinatorial antibody library (eg human or mouse). Phage expressing an antigen binding domain that binds the antigen of interest can be selected or identified with the antigen (eg, using labeled antigen or antigen bound or supplemented to a solid surface or bead). Phage used in these methods are typically phage having the antibody domain of Fab, Fv or disulfide-stabilized Fv recombinantly fused to either the phage gene III protein or the phage gene VIII protein. Is a filamentous phage containing the fd and M13 binding domains expressed from E. coli. Examples of phage display methods that can be used to generate the antibodies of the invention include those disclosed below: Brinkman et al. Immunol. Method
s 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Am. Immunol. Me
thods 184: 177-186 (1995); Kettleboroug.
h et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Pe.
rsic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Ad.
vances in Immunology 57: 191-280 (1994)
); PCT application number PCT / GB91 / 01134; PCT publication WO 90/0
2809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/1.
8619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/2.
0401; and U.S. Patent Nos. 5,698,426; 5,223,409.
No. 5,403,484; No. 5,580,717; No. 5,427.
No. 908; No. 5,750,753; No. 5,821,047; No. 5,5.
No. 71,698; No. 5,427,908; No. 5,516,637; No. 5,780,225; No. 5,658,727; No. 5,733,743 and No. 5,969,108 (the above references are incorporated herein by reference in their entirety).

【００８８】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを作製するために単離されそして用いられ得、そして（例えば、以下
に詳細が記載されるように）哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。このような方法は、例えば、以下に開
示される：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗ
ａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は
、その全体が参考として援用される）。As described in the above references, after phage selection, the region encoding the antibody derived from the phage can be used to generate whole antibodies, including human antibodies, or any other desired antigen binding fragment. It can be separated and used and expressed in any desired host, including mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria (eg, as described in detail below). For example, techniques for recombinantly producing Fab, Fab 'and F (ab') 2 fragments can also be used using methods known in the art. Such methods are disclosed, for example, in: PCT Publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioT.
techniques 12 (6): 864-869 (1992); and Saw.
ai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); and Better et al., S.
science 240: 1041-1043 (1998) (these references are incorporated by reference in their entirety).

【００８９】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を作製するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗体に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。これらはそれらの全
体が参考として本明細書中に援用される）。抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。Examples of techniques that can be used to produce single chain Fvs and antibodies include US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston.
Et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (19.
91); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, the use of chimeric, humanized or human antibodies may be preferred. A chimeric antibody is a molecule in which different parts of the antibody are derived from different animal species (for example, an antibody having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a human immunoglobulin constant region). Methods for making chimeric antibodies are known in the art. For example, Morris
on, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTec.
hnies 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J.
． Immunol. Methods 125: 191-202; US Pat. No. 5,
807,715; 4,816,567; and 4,816,397.
No., which are hereby incorporated by reference in their entireties. A humanized antibody is an antibody molecule from a non-human species antibody that binds to a desired antibody having one or more complementarity determining regions (CDRs) from the non-human species and a framework region from a human immunoglobulin molecule. . Often, framework residues in the human framework regions will be replaced with the corresponding residue from the CDR donor antibody to alter (preferably improve) antigen binding. Substitutions of these frameworks are identified by methods well known in the art, for example modeling CDR and framework residue interactions to identify framework residues important for antigen binding, and at specific positions. By sequence comparison to identify unusual framework residues. (For example, Queen et al., US Pat. No. 5,585,089; Riechmann. Et al.
See Nature 332: 323 (1988). These are incorporated herein by reference in their entirety). Antibodies can be humanized using various techniques known in the art including the following: eg, CDR-grafting (European Patent No. 23).
No. 9,400; PCT Publication WO 91/09967; US Pat. No. 5,225,5.
39; 5,530,101 and 5,585,089), veneering or resurfacing.
ng) (European Patent Nos. 592,106; 519,596; Padlan,
Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498
(1991); Studnicka et al., Protein Engineeri.
ng 7 (6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS.
91: 969-973 (1994)), and chain shuffling (cha).
in shuffling (US Pat. No. 5,565,332).

【００９０】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、および同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。Fully human antibodies are particularly desirable for therapeutic treatment of human patients. Human antibodies can be made by a variety of methods known in the art including phage display methods described above using antibody libraries derived from human immunoglobulin sequences. U.S. Pat. Nos. 4,444,887 and 4,716,111; and PCT
Published WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/2489
3, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/3373
5, and WO 91/10741 ;, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【００９１】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウ
スを産生するために未分化胚芽細胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、
ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジ
ェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体また
は部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に指向するモノクローナル抗体は
、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得
られる。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、トランスジェニックマウスの再編成
によってＢ細胞分化の間かくまわれ、そしてクラススイッチングおよび体細胞変
異が引き続いて起こる。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用
なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。
ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨ
ｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）
を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技
術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論につい
ては、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ
９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米
国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，
４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５
４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第
５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これら
はその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，
Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択した抗原を
指向するヒト抗体を提供することに従事し得る。Human antibodies can also be produced using transgenic mice that are incapable of expressing functional endogenous immunoglobulins but are capable of expressing human immunoglobulin genes. For example, a complex of human heavy and light chain immunoglobulin genes can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, human variable regions, constant regions and diversity regions (diversity)
region) can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to the human heavy chain gene and human light chain gene. The mouse heavy and light chain immunoglobulin genes can be rendered non-functional separately or simultaneously with the introduction of human immunoglobulin loci by homologous recombination. In particular, homozygous deletions in the JH region interfere with endogenous antibody production. The modified embryonic stem cells are developed and microinjected into undifferentiated embryo cells to produce chimeric mice. Next, the chimeric mouse
Breed to produce homozygous offspring that express human antibodies. Transgenic mice are immunized in the normal fashion with a selected antigen (eg, all or part of a polypeptide of the invention). Monoclonal antibodies directed against the antigen are obtained from immunized transgenic mice using conventional hybridoma technology. Human immunoglobulin transgenes are masked during B cell differentiation by rearrangement of transgenic mice and are followed by class switching and somatic mutations. Thus, the use of such techniques allows for the production of therapeutically useful IgG, IgA, IgM and IgE antibodies.
For an overview of this technology for producing human antibodies, see Lonberg and H.
uszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)
checking ... For a detailed discussion of this technology for producing human antibodies and human monoclonal antibodies, as well as protocols for producing such antibodies, see, eg, PCT Publication WO98 / 24893; WO92 / 01047; WO
96/34096; WO96 / 33735; European Patent 0 598 877; U.S. Patents 5,413,923; 5,625,126; 5,633.
No. 425; No. 5,569,825; No. 5,661,016; No. 5,5.
45,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; and 5,939,598 (these are incorporated by reference in their entirety). Are incorporated herein by reference). In addition, Abgenix,
Inc. (Freemont, CA) and Genpharm (San Jos.
e., CA) may engage in providing human antibodies directed against the selected antigen using techniques similar to those described above.

【００９２】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８）） さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合
を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化および／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
そのような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。Human antibodies that fully recognize the selected epitope were "guided (gui).
ed) selection ”. In this approach,
The selected non-human monoclonal antibody (eg, mouse antibody) is used to guide the selection of human antibodies that fully recognize the same epitope. (Jespers
Et al., Bio / technology 12: 899-903 (1988)) Furthermore, antibodies to the polypeptides of the invention produce anti-idiotypic antibodies that "mimic" the polypeptides of the invention using techniques well known to those of skill in the art. Can be used in sequence to do. (Eg Greenspan and Bona, FASEB
J. 7 (5): 437-444; (1989) and Nissinoff, J.
． Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991). ) For example, binding and multimerization of polypeptides
ization) and / or antibodies that competitively inhibit the binding of the polypeptides of the invention to ligands can be used to produce anti-idiotypes that “mimic” the multimerization and / or binding domains of the polypeptides, And consequently binds and neutralizes the polypeptide and / or its ligand.
Neutralization of such anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic regimens to neutralize polypeptide ligands. For example, such anti-idiotypic antibodies can be used to bind to a polypeptide of the invention and / or to bind its ligand / receptor, thereby blocking its biological activity.

【００９３】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、または低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、
上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に
結合する、好ましくは、配列番号：２または４のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを含む。Polynucleotides Encoding Antibodies The present invention further provides polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding the antibodies of the present invention and fragments thereof. The invention also provides for stringent or low stringency hybridization conditions (eg,
A polypeptide encoding an antibody (as defined above), preferably an antibody which specifically binds to a polypeptide of the invention, preferably which binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. It includes a polynucleotide that hybridizes to the nucleotide.

【００９４】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレオチ
ド配列が知られている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドから集められ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、
これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：抗体をコードする配列の部分を
含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、アニーリングおよびこれら
のオリゴヌクレオチドの連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチ
ドの増幅。The polynucleotide may be obtained by any method known in the art, and the nucleotide sequence of the polynucleotide determined. For example, if the nucleotide sequence of the antibody is known, the polynucleotide encoding the antibody can be assembled from chemically synthesized oligonucleotides (eg, Kutmeier et al., B.
ioTechniques 17: 242 (1994)),
Briefly, this involves the following steps: synthesis of overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence encoding the antibody, annealing and ligation of these oligonucleotides, followed by PCR of the ligated oligonucleotides. amplification.

【００９５】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブ
ラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体
の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から作製されたｃＤＮＡライブ
ラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））を、例
えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定す
るために、配列の３’末端もしくは５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライ
マーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによ
って作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用い
て、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。Alternatively, the antibody-encoding polynucleotide can be made from nucleic acids from suitable sources. No clone containing a nucleic acid encoding a particular antibody is available, but if the sequence of the antibody molecule is known, the nucleic acid encoding the immunoglobulin is
It can be chemically synthesized or from a suitable source (eg, an antibody cDNA library, or any tissue or cell expressing the antibody (eg, a hybridoma cell selected for expression of an antibody of the invention)). The generated cDNA library, or a nucleic acid isolated from it (preferably polyA + RNA), is used, for example, to identify a cDNA clone from a cDNA library encoding an antibody at the 3'end or 5'end of the sequence. It can be obtained by PCR amplification using synthetic primers hybridizable to the ends or by cloning using oligonucleotide probes specific for particular gene sequences. The amplified nucleic acid produced by PCR can then be cloned into a replicable cloning vector using any method known in the art.

【００９６】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。Once the nucleotide sequence of the antibody and the corresponding amino acid sequence have been determined,
Nucleotide sequences of antibodies can be prepared by methods well known in the art for manipulation of nucleotide sequences (eg, recombinant DNA technology, site-directed mutagenesis, PCR, etc. (eg,
Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, AL.
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
And Ausubel et al., 1998, Current Protocols.
in Molecular Biology, John Wiley & Sons
, NY. Both are incorporated herein by reference in their entirety. )) Can be engineered with to produce antibodies with different amino acid sequences to generate, for example, amino acid substitutions, deletions, and / or insertions.

【００９７】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は自然発生し得るか
、またはコンセンサスフレームワーク領域、および好ましくはヒトフレームワー
ク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈ
ｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を
参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによ
って作製されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する
抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸
置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸
置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ
以上の鎖内のジスルフィド結合が欠如した抗体分子を作製するように、鎖内ジス
ルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換ま
たは欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本
発明によって、および当該分野の技術において包含される。In certain embodiments, the amino acid sequences of the variable domains of the heavy and / or light chains are identified by methods well known in the art for identification of sequences of complementarity determining regions (CDRs) (eg, sequence Other heavy chains to determine hypervariable regions,
And by comparing the variable region of the light chain with a known amino acid sequence). Using conventional recombinant DNA techniques, one or more CDRs may be inserted within the framework regions as described above (eg, into the human framework regions for humanizing non-human antibodies). . This framework region can be naturally occurring or can be a consensus framework region, and preferably a human framework region (eg, for the listed human framework regions, Ch
othia et al. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)). Preferably, the polynucleotide produced by the combination of the framework regions and CDRs encodes an antibody that specifically binds to a polypeptide of the invention. Preferably, as discussed above, one or more amino acid substitutions may be made within the framework regions, and preferably the amino acid substitutions improve the binding of the antibody to its antigen. Further, such methods provide for amino acid substitutions or deletions of cysteine residues in one or more variable regions involved in intrachain disulfide bonds, so as to produce antibody molecules lacking one or more intrachain disulfide bonds. It can be used to create losses. Other changes to the polynucleotide are encompassed by the present invention and in the art.

【００９８】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによる、「キ
メラ抗体」を生産するために発達した技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上
記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域から
誘導された可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。In addition, techniques developed to produce "chimeric antibodies" by splicing genes from mouse antibody molecules of suitable antigen specificity with genes from human antibody molecules of suitable biological activity. (Morrison et al., Proc. N.
atl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuber.
ger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda.
Et al., Nature 314: 452-454 (1985)). As mentioned above, a chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species, such molecules having variable regions derived from the constant regions of mouse mAb and human immunoglobulin (eg, human Antibody).

【００９９】 あるいは、単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。Alternatively, techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,46)
778; Bird, Science 242: 423-42 (1988); H.
uston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 587.
9-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334: 544.
-54 (1989)) can be adapted to the production of single chain antibodies. Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region through amino acid bridges, yielding single chain polypeptides. E. Techniques for the assembly of functional Fv fragments in E. coli can also be used (Sk
erra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).

【０１００】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え体発現技術によって産
生され得る。Methods of Producing Antibodies The antibodies of the invention are produced by any method known in the art for synthesizing antibodies, particularly by chemical synthesis or, preferably, by recombinant expression techniques. Can be done.

【０１０１】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え体発現は、
抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする
。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部
分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリ
ヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周
知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、ヌクレオチ
ド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質
を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体
をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含
有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、
インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙
げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗
体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このよ
うなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０
７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号
を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列ならびに重鎖または軽鎖の全体の
発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る抗体の可変ドメインを
含み得る。An antibody of the invention, or a fragment, derivative or analog thereof (eg,
Recombinant expression of the heavy or light chain of the antibody of the invention or the single chain antibody of the invention)
Construction of an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody is required. Once the polynucleotide encoding the antibody molecule of the invention or the heavy or light chain of the antibody, or a portion thereof (preferably containing the variable domain of the heavy or light chain) is obtained, production of the antibody molecule Vectors for can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Accordingly, methods for preparing a protein by expression of a polynucleotide containing an antibody encoding a nucleotide sequence are described herein. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing antibody coding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example:
In vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination are included. Accordingly, the invention provides a replicable vector comprising a nucleotide sequence encoding an antibody molecule of the invention, or a heavy or light chain thereof, or a heavy or light chain variable domain, operably linked to a promoter. To do. Such vectors include constant regions of antibody molecules (eg, PCT Publication WO 86/0580).
7; PCT Publication WO 89/01036; and US Pat. No. 5,122,464) and antibodies that can be cloned into such vectors for full expression of heavy or light chains. Variable domains of

【０１０２】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
した、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体
をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につい
ての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは
、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子の全体の発現のために宿主細胞
において同時発現され得る。The expression vector is transferred into a host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce the antibody of the invention. Accordingly, the invention includes a host cell containing a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or a heavy or light chain thereof, or a single chain antibody of the invention, operably linked to a heterologous promoter. In a preferred embodiment for expression of double-chain antibodies, the vectors encoding both heavy and light chains are co-expressed in a host cell for total expression of immunoglobulin molecules, as detailed below. Can be done.

【０１０３】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
を用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転
換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体を
コードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス
）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植
物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞の
ゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）
または哺乳動物のウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイル
ス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え
発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９
３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、
組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のた
めに使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期遺伝
子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハ
ムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な
発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃ
ｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。A variety of host expression vector systems may be utilized to express the antibody molecule of the present invention. Such host expression systems represent vehicles in which the coding sequence of interest may be produced and subsequently purified, but also in situ when transformed or transfected with sequences encoding the appropriate nucleotides. 2 represents a cell capable of expressing an antibody molecule of the invention. These include bacteria transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors containing antibody-encoding sequences (eg E. coli, B. subtilis).
To a yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, Saccharomyces, Pichia); a recombinant viral expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, baculovirus) Insect insect cell line; plant cell line infected with a recombinant viral expression vector (eg cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a recombinant plasmid expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg Ti plasmid ) Plant cell line transformed with); or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, metallothionein promoter)
Alternatively, a mammalian cell line (eg, COS, CHO, BHK, 29) carrying a recombinant expression construct containing a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter).
3, 3T3 cells), but are not limited thereto. Preferably Esc
bacterial cells such as herichia coli, and more preferably, especially
Eukaryotic cells for the expression of whole recombinant antibody molecules are used for the expression of recombinant antibody molecules. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) in combination with vectors such as the major immediate early gene promoter element from human cytomegalovirus have been shown to be effective expression systems for antibodies. Yes (Föcking et al., Gene 45: 101 (1986); C
Ockett et al., Bio / Technology 8: 2 (1990)).

【０１０４】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学組成物の作製のために、容易に精製される融合タンパ
ク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベク
ターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターに
インフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．
ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７
９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ
Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−
５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸ
ベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タン
パク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、
このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリッ
クスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グル
タチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは
、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その
結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る
。In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending on the use intended for the expression of the antibody molecule. For example, if large quantities of such proteins are to be produced, vectors may be desired that direct high levels of expression of the fusion protein product, which are easily purified for the production of pharmaceutical compositions of antibody molecules. In such a vector, the antibody-encoding sequence may be separately ligated in frame to the vector along with the lacZ-encoding region, such that a fusion protein is produced.
coli expression vector pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:17).
91 (1983)); pIN vector (Inouye & Inouye, Nucl.
eic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Van.
Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-
5509 (1989)) and the like, but are not limited thereto. pGEX
Vectors can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). In general,
Such fusion proteins are soluble and can be easily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vector is designed to contain a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.

【０１０５】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）に個々にクロー
ニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモー
ター）の制御下に配置され得る。In an insect system, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (Aut
ographa California nuclear polyhedr
osis virus) (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes. The virus is Spodoptera frugi
Proliferates in perda cells. The antibody coding sequence may be individually cloned into a nonessential region of the virus (eg, the polyhedrin gene) and placed under control of an AcNPV promoter (eg, the polyhedrin promoter).

【０１０６】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得
る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目
的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿
入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイ
ルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特
定の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のた
めに必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配
列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所
望のコード配列のリーディングフレームと同調でなければならない。これらの外
因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源
のであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミ
ネーターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこ
と）。Many viral-based expression systems can be utilized in mammalian host cells. When an adenovirus is used as an expression vector, the sequence of interest encoding the antibody can be linked to an adenovirus transcription / translation control complex (eg, a late promoter and a tripartite leader sequence). This chimeric gene can then be inserted in the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a nonessential region of the viral genome (eg region E1 or E3) results in a recombinant virus that survives in the infected host and is capable of expressing antibody molecules. (For example, Logan & Shenk, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)). Specific initiation signals may also be required for efficient translation of inserted antibody coding sequences. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences. Furthermore, this start codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be increased by including appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (Bittner et al., Meth).
ods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)).

【０１０７】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products can be important for protein function. Different host cells have characteristic and unique mechanisms for post-translational processing and modification of protein and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells may be used that have the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation of the gene product, and phosphorylation. Such mammalian host cells include CHO, VERY, BHK, Hela, COS, M
DCK, 293, 3T3, WI38 and, in particular, breast cancer cell lines (eg BT
483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D) as well as normal mammary gland cell lines such as CRL7030 and Hs578Bst.

【０１０８】 組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで
形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮され
た培地中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプ
ラスミド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドを
それらの染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株
にクローニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法は、抗体分子を発
現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞
株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングお
よび評価において特に有用であり得る。For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred.
For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than the use of expression vectors containing viral origins of replication, the host cell is controlled by appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and selectable markers. It can be transformed with DNA. Following the introduction of exogenous DNA, engineered cells can be grown for 1-2 days in concentrated medium and then switched to selective medium. A selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes and proliferate, forming a lesion that can then be cloned and propagated into the cell line. . This method can be advantageously used to engineer cell lines expressing antibody molecules. Such engineered cell lines may be particularly useful in screening and evaluation of compounds that interact directly or indirectly with the antibody molecule.

【０１０９】 多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、ま
たはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏ
ｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これら
に限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として
使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０））；Ｏ’Ｈａ
ｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１
９８１）；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび
Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（
１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９
９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９
３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，ＴＩＢ ＴＥ
ＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐性を与
えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））
。当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、所望の組換えクロー
ンの選択に慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａ
ｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、こ
れらはその全体が本明細書において参考として援用される。Many selection systems may be used, including herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), which may be used in tk-, hgprt-, or aprt- cells, respectively. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Szybalska and S
zybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2
02 (1992)), and adenine phosphoribosyl transferase (Lo
wy et al., Cell 22: 817 (1980)) gene, but is not limited thereto. Antimetabolite resistance can also be used as the basis for selection of the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler et al.,
Natl. Acad. Sci. USA 77: 357 (1980)); O'Ha.
Re et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1
981); gpt which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (
1981)); conferring resistance to aminoglycoside G-418 neo (Clin
ic Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, Bio.
therapy 3: 87-95 (1991); Tolstosev, Ann.
． Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (19
93); Mulligan, Science 260: 926-932 (199).
3); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Bio
chem. 62: 191-217 (1993); May 1993, TIB TE.
CH 11 (5): 155-215); as well as hygro conferring resistance to hygromycin (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)).
. Recombinant DNA technology methods generally known in the art can be routinely applied to the selection of desired recombinant clones, and such methods are described, for example, in Ausub.
el et al. (ed.), Current Protocols in Molecular
r Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); K.
riegler, Gene Transfer and Expression
, A Laboratory Manual, Stockton Press,
NY (1990); and Dracopoli et al. (Eds.), Current P.
rotocols in Human Genetics, John Wile
y & Sons, NY (1994) chapters 12 and 13; Colberre-Ga.
rapin et al. Mol. Biol. 150: 1 (1981), which are incorporated herein by reference in their entirety.

【０１１０】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。抗体を発
現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の培養液におい
て存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加
する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体の産生
もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。Expression levels of antibody molecules can be increased by vector amplification (for a review, Bebbington and Hentschel, The use of).
vectors based on gene amplification
for the expression of cloned genes i
n mammalian cells in DNA cloning, Volume 3 (Academic Press, New York, 1987)). If the marker can be amplified in the vector system expressing the antibody, increasing the level of inhibitor present in the culture medium of the host cell will increase the number of copies of the marker gene. The production of this antibody is also increased due to the binding of this amplified region to the antibody gene (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257.
(1983)).

【０１１１】 その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖から誘導されるポリペプ
チドをコードする第１のベクターおよび軽鎖から誘導されるポリペプチドをコー
ドする第２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクター
は、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカ
ーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードし、か
つその発現を可能とする単一のベクターが使用され得る。このような状況におい
て、この軽鎖は、過剰の有毒な遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置される
べきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；
Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９
７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮ
Ａを含み得る。The host cell is co-expressed with two expression vectors of the invention, a first vector encoding a polypeptide derived from the heavy chain and a second vector encoding a polypeptide derived from the light chain. Can be transfected. The two vectors may contain identical selectable markers which enable equal expression of heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector may be used which encodes both heavy and light chain polypeptides and allows for expression thereof. In such a situation, this light chain should be placed before the heavy chain to avoid excess toxic free heavy chain (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986);
Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 219.
7 (1980)). The coding sequences for the heavy and light chains may be cDNA or genomic DN.
A may be included.

【０１１２】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。Once the antibody molecule of the present invention is produced by an animal, chemically synthesized, or recombinantly expressed, any of the art-known methods for the purification of immunoglobulin molecules. Methods such as chromatography (eg, ion exchange,
It can be purified by affinity (particularly by affinity for protein A followed by specific antigen), and size column chromatography), centrifugation, differential solubility, or any other standard technique for protein purification.
Furthermore, the antibodies of the present invention or fragments thereof can be fused to heterologous polypeptide sequences described herein or otherwise known in the art to facilitate purification.

【０１１３】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、
抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた
、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法にお
いて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３
／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇ
ｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこ
と。これらは、その全体が参考として援用される。The present invention relates to a polypeptide of the invention (or a portion thereof, preferably at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 of this polypeptide,
Or 100 amino acids), recombinantly fused or chemically linked (including both covalent and non-covalent bonds) to produce a fusion protein. The fusion need not be direct, but can occur via a linker sequence. The antibody is a polypeptide of the invention (or a portion thereof, preferably at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
(80, 90, or 100 amino acids). For example, by fusing or conjugating a polypeptide of the invention to an antibody specific for a particular cell surface receptor, either in vitro or in vivo, the polypeptide of the invention is directed against a particular cell type. To target
Antibodies can be used. Antibodies fused or conjugated to the polypeptides of the invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. See, eg, Harbor et al., Supra, and PCT Publication WO93.
/ 21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. L
ett. 39: 91-99 (1994); US Patent No. 5,474,981; G.
illies et al., PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell.
Et al., J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991). These are incorporated by reference in their entirety.

【０１１４】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。The invention further includes compositions comprising a polypeptide of the invention fused or linked to a domain other than the variable region of an antibody. For example, the polypeptides of the invention can be fused or conjugated to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The part of this antibody fused to the polypeptide of the invention comprises the constant region, hinge region, CH1 domain, C
It may include the H2 domain, and the CH3 domain, or any combination of whole domains or portions thereof. These polypeptides can also be fused or conjugated to portions of the above antibodies to form multimers. For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention can form a dimer through a disulfide bond between the Fc portions. Higher multimeric forms can be made by fusing the polypeptide to portions of IgA and IgM. Methods for fusing or conjugating the polypeptides of the invention to antibody moieties are known in the art. For example, US Pat. Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,04.
No. 6, No. 5,349,053; No. 5,447,851; No. 5,112.
, 946; EP 307,434; EP 367,166; PCT publication WO9.
6/04388; WO91 / 06570; Ashkenazi et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991).
); Zheng et al. Immunol. 154: 5590-5600 (199
5); and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 11337-11341 (1992) (the above references are incorporated by reference in their entireties).

【０１１５】 上記で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または
配列番号２または４の変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドの
インビボ半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫
学的アッセイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合体化さ
れ得る。さらに、配列番号２または４に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部
分に融合または結合体化させて、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、
ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を
記載している（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに
起因する）を有する抗体に融合または結合体化される本発明のポリぺプチドもま
た、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子
に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉ
ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多く
の場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従
って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，
２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された
後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化
のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る
。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ
−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイ
の目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎ
ｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）
を参照のこと）。As discussed above, the polypeptide corresponding to the polypeptide, polypeptide fragment, or variant of SEQ ID NO: 2 or 4, is intended to increase the in vivo half-life of this polypeptide. Alternatively, it can be fused or conjugated to the antibody moieties described above for use in immunological assays using methods known in the art. In addition, the polypeptide corresponding to SEQ ID NO: 2 or 4 may be fused or conjugated to the antibody portion described above to facilitate purification. One reported example is
A chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4 polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of mammalian immunoglobulins has been described (EP 394,827; Traunecker et al., Nature).
331: 84-86 (1988)). Polypeptides of the invention fused or conjugated to an antibody having a disulfide-linked dimer structure (due to IgG) also bind to other molecules than monomeric secreted proteins or protein fragments alone. And can be more efficient in neutralizing (Funtoulaki
S., et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)). In many cases, the Fc portion of the fusion protein will be beneficial in therapy and diagnosis, and thus may result, for example, in improved pharmacokinetic properties (EP A 232,
262). Alternatively, it may be desirable to delete the Fc portion after the fusion protein has been expressed, detected and purified. For example, if the fusion protein is used as an antigen for immunization, the Fc portion may interfere with therapy and diagnosis. For example, in drug discovery, human proteins such as hIL-5 are
Has been fused to the Fc portion for the purpose of high throughput screening assays to identify antagonists of -5 (Bennett et al., J. Molec.
urular Recognition 8: 52-58 (1995); Johann.
Son et al. Biol. Chem. 270: 9459-9471 (1995).
checking).

【０１１６】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。In addition, the antibodies of the invention or fragments thereof may be fused to a marker sequence, such as a peptide that facilitates purification. In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is inter alia a hexa-histidine peptide (eg pQE vector (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chats.
The tag, provided by W. Worth, CA, 91311), and many of these marker amino acid sequences are commercially available. For example, Gentz et al., Proc
． Natl. Acad. Sci. Hexa-histidine provides convenient purification of fusion proteins, as described in USA 86: 821-824 (1989). Another peptide tag useful for purification is the "HA" tag (Wilson et al., Ce, which corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein.
ll37: 767 (1984)), and "flag" tags.

【０１１７】 本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメン
トをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジ
メン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生また
は進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能
な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては
、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、
種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金
属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメン
ト）に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用
する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結
合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合
体化され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照の
こと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げら
れ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよ
びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェ
ロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジク
ロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリト
リンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質
の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；な
らびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまた
は９９Ｔｃが挙げられる。The invention further includes an antibody or fragment thereof conjugated to a diagnostic or therapeutic agent. Antibodies can be used diagnostically, for example, to monitor tumor development or progression as part of a clinical testing procedure (eg, to determine the efficacy of a given treatment regimen). Detection can be facilitated by coupling the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent substances, luminescent substances, bioluminescent substances, radioactive substances,
Positron emitting metals using various positron emission tomography, and non-radioactive paramagnetic metal ions. The detectable substance is either directly or indirectly directed to the antibody (or fragment thereof) by a mediator using techniques known in the art, such as linkers known in the art. Can be linked or conjugated via. See, eg, US Pat. No. 4,741,900 for metal ions that can be conjugated to antibodies for use as diagnostics according to the present invention. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent substances include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; examples of luminescent substances include luminol; bioluminescent substances Examples of luciferase include luciferase, luciferin and aequorin; and examples of suitable radioactive substances include 125I, 131I, 111In or 99Tc.

【０１１８】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合体化され得る。細
胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては
、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジン
Ｄ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔ
ｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌ
ｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサン
トロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、
グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロー
ル、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げら
れる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプ
リン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５
−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例え
ば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラ
ン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファ
ミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジア
ミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダ
ウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例
えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラ
マイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、
ならびに抗有糸***剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含む
が、それらに限定されない。Furthermore, the antibody or fragment thereof may be used in therapeutic moieties (eg cytotoxins (eg cytostatic or cytotoxic agents)), therapeutic agents or radioactive metal ions (eg α-emitters (eg 213Bi)). Etc.). Cytotoxic or cytotoxic agents include any agent that is harmful to cells. Examples include paclitaxel, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, teniposide (t
Enoposide), vincristine, vinblastine, colchicine (col)
chicin), doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracin dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone,
Glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and puromycin, and analogs or homologues thereof. The therapeutic agent may be an antimetabolite (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracildecarbazine (5
-fluorouracil decarbazine), alkylating agents (e.g., mechlorethamine, thioepa (thioepa) chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclophosphamide (cyclothosphamide), busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, And cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin), anthracyclines (eg daunorubicin (formerly daunomycin) and doxorubicin), antibiotics (eg dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin, mithramycin, And anthramycin (AMC),
And anti-mitotic agents such as vincristine and vinblastine, but are not limited thereto.

【０１１９】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス性薬剤
（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８
９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参
照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２
３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジ
オスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリン
ホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「
ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳ
Ｆ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。The conjugates of the invention can be used to modify a given biological response and the therapeutic agent or drug moiety is not construed as limited to classical chemotherapeutic agents. For example, the drug moiety can be a protein or polypeptide that has the desired biological activity. Such proteins include, for example, toxins (eg, abrin, ricin A, pseudomonas exotoxin, or diphtheria toxin); proteins (eg,
Tumor necrosis factor, a-interferon, β-interferon, nerve growth factor,
Platelet-derived growth factor, tissue plasminogen activator, apoptotic drug (eg TNF-α, TNF-β, AIM I (International Publication No. WO97 / 338).
99), AIM II (see WO 97/34911), Fas ligand (Takahashi et al., Int. Immunol).
． 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (International Publication No. WO99 / 2).
3105)), thrombotic or anti-angiogenic agents (eg, angiostatin or endostatin); or biological response modifiers (eg, lymphokines, interleukin-1 (“IL-1”)). , Interleukin-2 ("
IL-2 "), interleukin-6 (" IL-6 "), granulocyte macrophage colony stimulating factor (" GM-CSF "), granulocyte colony stimulating factor (" G-CS ").
F "), or other growth factors).

【０１２０】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。The antibody can also be attached to a solid support, which is particularly useful for immunoassay or purification of the target antigen. Such solid supports include, but are not limited to, glass, cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene.

【０１２１】 このような治療部分を抗体に結合体化する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎ
ｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３
０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐ
ｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと
。Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known, eg Arn.
on et al., “Monoclonal Antibodies For Immun.
targeting Of Drugs In Cancer Therap
y ”Monoclonal Antibodies And Cancer T
cure, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan RL
iss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies.
For Drug Delivery "Controlled Drug D
release (2nd edition), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Ma.
rcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibo
dy Carriers Of Cytotoxic Agents In C
cancer Therapy: A Review "Monoclonal An
tibodies'84: Biological And Clinical
Applications, Pinchera et al. (Eds.), Pp. 475-506 (1
985); "Analysis, Results, And Future Pr.
Descendant Of The Therapeutic Use Of
Radiolabeled Antibody In Cancer Ther
apy ”Monoclonal Antibodies For Cancer
Detection And Therapy, Baldwin et al. (Ed.), 3
03-16 (Academic Press 1985), and Thorp
e, et al., "The Preparation And Cytotoxic Pr.
operations of Antibody-Toxin Conjugate
s ", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).

【０１２２】 あるいは、抗体は第二の抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（
これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによ
る記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。Alternatively, the antibody is conjugated to a second antibody, and is described in US Pat. No. 4,676,980 (
This may form an antibody heteroconjugate as described by Segal in (incorporated herein in its entirety).

【０１２３】 単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投
与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。Antibodies, with or without a therapeutic moiety that binds to the antibody, administered alone or in combination with cytotoxic factors and / or cytokines, can be used as therapeutic agents.

【０１２４】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対するモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細
胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞
集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そ
してその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固
体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング」、な
らびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およ
びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこ
と）が挙げられる。Immunophenotyping The antibodies of the invention can be utilized for immunophenotyping cell lines and biological samples. The translation products of the genes of the present invention are useful as cell-specific markers, or more particularly as cell markers that are differentially expressed at various stages of differentiation and / or maturation of particular cell types. obtain. Monoclonal antibodies against specific epitopes, or combinations of epitopes, allow screening of cell populations that express the marker. Various techniques can be utilized with monoclonal antibodies to screen for cell populations that express markers, and include magnetic separation using antibody-coated magnetic beads, solid matrices (ie, "Panning" with antibodies attached to plates), as well as flow cytometry (see, eg, US Pat. No. 5,985,660; and Morrison et al., Cell, 96: 737-49 (1999)). To be

【０１２５】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可
能にする。These techniques apply to hematological malignancies (ie, minimal residual disease (MRD) in patients with acute leukemia).
And allows screening of specific populations of cells as may be found with "non-self" cells in transplantation to prevent graft versus host disease (GVHD). Alternatively, these techniques allow for the screening of hematopoietic stem and progenitor cells that may undergo proliferation and / or differentiation as may be found in human cord blood.

【０１２６】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。Assays for Antibody Binding The antibodies of the invention can be assayed for immunospecific binding by any method known in the art. Immunoassays that can be used include Western blots, radioimmunoassays, to name just a few.
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoprecipitation assay, precipitation reaction, gel diffusion precipitation reaction, immunodiffusion assay, agglutination assay, complement fixation assay, immunoradiometric assay, fluorescent immunoassay, protein A Included, but not limited to, competitive and non-competitive assay systems that use techniques such as immunoassays. Such assays are routine and well known in the art (eg, Ausubel et al. Eds., 1994, Current Protocol), which is incorporated by reference herein in its entirety.
ls in Molecular Biology, Volume 1, John Wil
ey & Sons, Inc. , New York). Exemplary immunoassays are briefly described below (although these are not intended to be limiting).

【０１２７】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、
アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そしてバ
ックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロ
ースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認識し得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。Immunoprecipitation protocols generally involve RIPA buffer (1% NP-40 or Triton X-100, 1, 1% NP-40 or Triton X-100, supplemented with protein phosphatase inhibitors and / or protease inhibitors (eg, EDTA, PMSF, aprotinin, sodium vanadate). % Sodium deoxycholate, 0.1%
SDS, 0.15M NaCl, 0.01M sodium phosphate (pH 7.2)
) Lysing a population of cells in a lysis buffer such as 1% Transylol), adding the antibody of interest to the cell lysate, and incubating at 4 ° C. for a period of time (eg 1-4 hours) Adding protein A sepharose beads and / or protein G sepharose beads to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for about 1 hour or more, washing the beads in lysis buffer, and SDS / sample buffer Resuspending the beads in. The ability of the antibody of interest to immunoprecipitate a particular antigen can be determined, for example, by Western blot analysis.
Can be assayed. One of skill in the art will be aware of parameters that can be modified to increase binding of antibody to antigen and to reduce background (eg, preclearing cell lysates with Sepharose beads). obtain. For further discussion on immunoprecipitation protocols, see, eg, Ausub.
el et al., 1994, Current Protocols in Molec.
ural Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc.
． , New York, 10.16.1.

【０１２８】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱
脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄
緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合体化された二次抗体（一
次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程
、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工
程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバッ
クグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認識
し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。Western blot analysis generally involves the steps of preparing a protein sample, polyacrylamide gel (eg 8% -20% SDS-depending on the molecular weight of the antigen).
Electrophoresis of the protein sample in PAGE, transferring the protein sample from the polyacrylamide gel to a membrane such as nitrocellulose, PVDF or nylon, blocking solution (eg 3% BSA or PBS with skim milk powder) ), Blocking the membrane in a wash buffer (eg,
Washing the membrane in PBS-Tween 20), blocking the membrane with a primary antibody (antibody of interest) diluted in blocking buffer, washing the membrane in washing buffer , A secondary antibody conjugated to an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) or a radioactive molecule (eg, 32P or 125I) diluted in blocking buffer (which recognizes the primary antibody, eg, anti-body). Human antibody) to block the membrane, wash the membrane in wash buffer, and detect the presence of the antigen. One of skill in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected and to reduce background noise. For further discussion on Western blot protocols, see, eg, Ausubel et al., Eds., 1994, Current Protocols i.
n Molecular Biology, Volume 1, John Wiley & S
ons, Inc. , New York, 10.8.1.

【０１２９】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
体化された目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートす
る工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて
、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検
出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェ
ルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体が
ウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化された
第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加
され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラ
メータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関し
て、認識し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。ELISA involves preparing an antigen, coating the wells of a 96-well microtiter plate with the antigen, conjugating to a detectable compound such as an enzyme substrate (eg horseradish peroxidase or alkaline phosphatase). The antibody of interest is added to the wells and incubated for a period of time, and the presence of the antigen is detected. In the ELISA, the antibody of interest need not be bound to a detectable compound; instead, a second antibody conjugated to the detectable compound (which recognizes the antibody of interest) will bind to the wells. Can be added. Further, instead of coating the well with the antigen, the antibody can be coated to the well. In this case, a second antibody conjugated to a detectable compound can be added following the addition of the antigen of interest to the coated wells. One of ordinary skill in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected and other variations of the ELISA known in the art. For more discussion on ELISA, see, for example, Aus.
ubel et al., 1994, Current Protocols in Mol.
electrical Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, I
nc. , New York, 11.2.1.

【０１３０】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸増量の
非標識抗原の存在下での、目的の抗体との標識された抗原（例えば、３Ｈまたは
１２５Ｉ）のインキュベーション、および標識抗原に結合体化された抗体の検出
を含む。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、ス
キャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競
合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸
増量の非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５
Ｉ）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。[0130] The binding affinity of the antibody for the antigen and the off-rate of the antibody-antigen interaction (of
f-rate) can be determined by competitive binding assay. One example of a competitive binding assay is a radioimmunoassay, which comprises incubating a labeled antigen (eg, 3H or 125I) with an antibody of interest in the presence of increasing amounts of unlabeled antigen, and Includes detection of antibody conjugated to labeled antigen. The affinity of the antibody of interest for a particular antigen, and the binding off-rate can be determined from the data by Scatchard plot analysis. Competition with the second antibody can also be determined using a radioimmunoassay. In this case, the antigen is labeled compound (eg, 3H or 125) in the presence of increasing amounts of unlabeled second antibody.
Incubated with the antibody of interest bound to I).

【０１３１】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。Therapeutic Uses The present invention further relates to antibody-based therapies for treating an animal, preferably a mammal, and most preferably for treating one or more of the disclosed diseases, disorders, or conditions. Preferably, the step of administering the antibody of the present invention to a human patient is included. Therapeutic compounds of the invention include antibodies of the invention (including fragments, analogs and derivatives thereof, as described herein) and nucleic acids encoding the antibodies of the invention (described herein). (Including, but not limited to, fragments, analogs and derivatives thereof and anti-idiotypic antibodies). Antibodies of the invention include diseases, disorders or conditions associated with aberrant expression and / or activity of the polypeptides of the invention (including any one or more of the diseases, disorders, or conditions described herein). Can be used to treat, inhibit or prevent). Aberrant expression of the polypeptide of the invention and /
Alternatively, treating and / or preventing a disease, disorder or condition associated with activity includes, but is not limited to, ameliorating the symptoms associated with the disease, disorder or condition. The antibodies of the present invention are known in the art or can be provided in a pharmaceutically acceptable composition as described herein.

【０１３２】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。A summary of how the antibodies of the invention may be used therapeutically is mediated locally or systemically in the body (eg, mediated by complement (CDC), or by effector cells (ADCC)). By direct binding of the polynucleotide or polypeptide of the invention by the direct cytotoxicity of the antibody. Some of these approaches are described in more detail below. Given the teachings provided herein, one of ordinary skill in the art would be able to determine, without undue experimentation, how to use the antibodies of the invention for diagnostic, monitoring or therapeutic purposes. Recognize.

【０１３３】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。The antibodies of the invention may be other monoclonal or chimeric antibodies, or lymphokines or hematopoietic growth factors (eg IL-2, IL-2, IL-2, IL-2, IL-2, IL-2, IL-2, IL-2, IL-2 IL-3 and IL
(Such as −7).

【０１３４】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。The antibodies of the invention can be administered alone or in combination with other types of treatments such as radiation therapy, chemotherapy, hormone therapy, immunotherapy and anti-tumor agents.
Generally, it is preferred to administer a species-sourced or species-reactive product that is the same species as the patient's species (in the case of antibodies). Thus, in a preferred embodiment, human antibodies,
The fragment derivative, analog, or nucleic acid is administered to a human patient for treatment or prevention.

【０１３５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に対するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、
１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、
１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ
、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１
０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０- 15 Ｍよりも小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。A high affinity and / or Alternatively, it is preferred to use potent in vivo inhibitory and / or neutralizing antibodies, fragments thereof, or regions thereof. Such antibodies, fragments or regions preferably have an affinity for the polynucleotides or polypeptides of the present invention, including fragments thereof. The preferred binding affinity is 5 × 10 −2 M, 10 −2 M, 5 × 10 −3 M, 10 −3 M, 5 × 10 −4 M,
10 −4 M, 5 × 10 −5 M, 10 −5 M, 5 × 10 −6 M, 10 −6 M, 5 × 10 −7 M,
10 -7 M, 5 x 10 -8 M, 10 -8 M, 5 x 10 -9 M, 10 -9 M, 5 x 10 -10 M
10 -10 M, 5x10 -11 M, 10 -11 M, 5x10 -12 M, 10 -12 M, 5x1
0 -13 M, 10 -13 M, 5 × 10 -14 M, 10 -14 M, 5 × 10 -15 M, and 10 - 15 binding affinity are exemplified with small dissociation constant or Kd than M.

【０１３６】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。Gene Therapy In certain embodiments, a nucleic acid comprising a sequence encoding an antibody or functional derivative thereof treats a disease or disorder associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide of the invention, Administered for the purpose of gene therapy to inhibit or prevent. Gene therapy refers to a therapy that is performed by administering an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.

【０１３７】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。Any method available in the art for gene therapy can be used in accordance with the present invention. An exemplary method is described below.

【０１３８】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。For a general review of methods of gene therapy, see Goldspiel et al., Cli.
Nal Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstos.
hev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573
-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-.
932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann.
Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIB.
See TECH 11 (5): 155-215 (1993). Methods generally known in the recombinant DNA art that can be used are described in Ausubel.
Et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Express.
Ion, A Laboratory Manual, Stockton Pre
ss, NY (1990).

【０１３９】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、あるいはそのフラグメントもしくはキメ
ラタンパク質、またはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。In a preferred aspect, the compound comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody, said nucleic acid sequence being an expression vector expressing the antibody, or a fragment or chimeric protein thereof, or a heavy or light chain thereof in a suitable host. Is part of. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the antibody coding region, said promoter being inducible or constitutive, and optionally tissue-specific. In another particular embodiment, nucleic acid molecules are used that flank the region encoding the antibody and any other desired sequence that facilitates homologous recombination at the desired site in the genome, whereby the antibody is Provides intrachromosomal expression of a nucleic acid encoding (Koller and Smithies, Proc
． Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989).
); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989).
). In a particular embodiment, the expressed antibody molecule is a single chain antibody; or the nucleic acid sequence comprises sequences encoding both the heavy and light chains of the antibody or fragments thereof.

【０１４０】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。Delivery of the nucleic acid to the patient can be direct (where the patient is directly exposed to the nucleic acid or nucleic acid-bearing vector) or indirect (where the cells are first transfected with the nucleic acid in vitro). Converted and then transplanted to the patient). These two approaches are known as in vivo gene therapy or as ex vivo gene therapy, respectively.

【０１４１】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、
そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または弱
毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，
２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接注
射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉ
ｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面レセプタ
ーでコーティングするか、あるいは薬剤をトランスフェクトすること、リポソー
ム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それ
らを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセ
プター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与することに
より（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−
４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞の型
を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより達成され得る。別の実
施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガンドはエン
ドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチド
を含み、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする。さらに別の実施形
態において、核酸は、特異的なレセプターを標的化することにより、細胞特異的
な取り込みおよび発現についてインビボで標的化され得る（例えば、ＰＣＴ公開
第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２０
３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照の
こと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、
発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔ
ｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−
４３８（１９８９））。In certain embodiments, the nucleic acid sequences are directly administered in vivo, where they are expressed to produce the encoded product. This can be accomplished by a number of methods known in the art, such as constructing them as part of a suitable nucleic acid expression vector,
And by administering it intracellularly (eg, defective or attenuated retroviruses or other viral vectors (US Pat. No. 4,980,
286)), or by direct injection of naked DNA, or microparticle bombardment (eg gene gun; Bioli).
Stic, Dupont), or by coating with lipids or cell surface receptors, or by transfecting drugs, encapsulation in liposomes, microparticles, or microcapsules, or by entering them into the nucleus. By administering in combination with a known peptide, by administering in combination with a ligand that undergoes receptor-mediated endocytosis (eg Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-
4432 (1987)) (which can be used to target cell types that specifically express the receptor) and the like. In another embodiment, a nucleic acid-ligand complex can be formed where the ligand comprises a fusogenic viral peptide that disrupts endosomes, allowing the nucleic acid to avoid lysosomal degradation. In yet another embodiment, the nucleic acids can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression by targeting specific receptors (eg, PCT Publication No. WO92 / 06180; WO92 /). No. 22635; No. WO 92/20
316; WO93 / 14188, WO93 / 20221). Alternatively, the nucleic acid can be introduced inside the cell and by homologous recombination,
Can be incorporated into host cell DNA for expression (Koller and Smit
hies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-
8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-.
438 (1989)).

【０１４２】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な構成要素を含
む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベ
クター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レ
トロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅ
ｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対し
てより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レ
トロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療における
レトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である：Ｃｌｏ
ｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；
Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏ
ｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１
２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０
−１１４（１９９３）。In a specific embodiment, viral vectors that contain nucleic acid sequences that encode the antibodies of the invention are used. For example, a retroviral vector can be used (Mi
ller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993).
checking). These retroviral vectors contain the necessary components for the correct packaging of the viral genome and integration into host cell DNA. The nucleic acid sequence encoding the antibody used in gene therapy is cloned into one or more vectors, which facilitates delivery of the gene into patients. For more details on retroviral vectors, see Boesen et al., Biothe.
rapid 6: 291-302 (1994), which describes the use of retroviral vectors to deliver the mdr1 gene to hematopoietic stem cells to make the stem cells more resistant to chemotherapy. Can be issued. Other references describing the use of retroviral vectors in gene therapy are: Clo
wes et al. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994);
Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmo.
ns and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 1.
29-141 (1993); and Grossman and Wilson, C.
urr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110
-114 (1993).

【０１４３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞に感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノ
ウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用
の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４
（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９
９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２
５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎ
ｇら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され
得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。Adenovirus is another viral vector that can be used in gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive vehicles for delivering genes to respiratory epithelia. Adenovirus naturally infects respiratory epithelia where it causes mild disease. Other targets of adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenovirus has the advantage that it can infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson, Curr
ent Opinion in Genetics and Developopm
ent 3: 499-503 (1993) provides an overview of adenovirus-based gene therapy. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3.
-10 (1994) demonstrated the use of adenovirus vectors to transfer genes into the respiratory epithelia of rhesus monkeys. Other examples of the use of adenoviruses in gene therapy are described by Rosenfeld et al., Science 252: 431-434.
(1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (19.
92); Mastrangeli et al., J. Am. Clin. Invest. 91:22
5-234 (1993); PCT Publication No. WO94 / 12649; and Wan.
G et al., Gene Therapy 2: 775-783 (1995). In a preferred embodiment, adenovirus vectors are used.

【０１４４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 2).
04: 289-300 (1993); U.S. Pat. No. 5,436,146).

【０１４５】 遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェク
ション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のよ
うな方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入
の方法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺
伝子を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。そ
れらの細胞は次いで、患者に送達される。Another approach to gene therapy involves transferring a gene to cells in tissue culture by such methods as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, or viral infection. Generally, the method of transfer will involve transfer of the selectable marker to the cells. The cells are then subjected to selection to isolate cells that have taken up and are expressing the transferred gene. The cells are then delivered to the patient.

【０１４６】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能であ
る。In this embodiment, the nucleic acid is introduced into the cell prior to in vivo administration of the resulting recombinant cell. Such introduction can be performed by any method known in the art including, but not limited to, transfection, electroporation, microinjection, viral vectors containing nucleic acid sequences. Alternatively, infection with a bacteriophage vector, cell fusion, chromosome-mediated gene transfer, microcell-mediated gene transfer, spheroplast fusion and the like. Many techniques are known in the art for introducing foreign genes into cells (eg, Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993).
); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (19
93); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (198
5)), and can be used according to the invention if the necessary developmental and physiological functions of the recipient cells are not disrupted. This technique should provide for stable transfer of the nucleic acid to the cell so that the nucleic acid is expressible by the cell and preferably heritable and expressible by the progeny of the cell.

【０１４７】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。The resulting recombinant cells can be delivered to a patient by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells contemplated for use depends on the desired effect, patient condition, etc. and can be determined by one of ordinary skill in the art.

【０１４８】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。Cells into which nucleic acids can be introduced for purposes of gene therapy include any desired available cell type and include, but are not limited to: epithelial cells, endothelial cells, keratinocytes, fibers. Blood cells such as blast cells, muscle cells, hepatocytes; T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, granulocytes; various stem or progenitor cells, especially hematopoietic Stem cells or hematopoietic progenitor cells (eg, cells such as those obtained from bone marrow, cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc.).

【０１４９】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。In a preferred embodiment, the cells used for gene therapy are autologous to the patient.

【０１５０】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され、かつインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／または前駆
細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ
公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅ
ｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗお
よびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６
）を参照のこと）。In embodiments in which recombinant cells are used in gene therapy, the nucleic acid sequence encoding the antibody is introduced into the cells such that the nucleic acid sequences are expressible by the cells or their progeny, and then the recombinant cells are , Administered in vivo for therapeutic effects. In certain embodiments, stem cells or progenitor cells are used. Any stem and / or progenitor cells that can be isolated in vitro and maintained in vitro can potentially be used according to this embodiment of the invention (eg, PCT).
Publication No. WO94 / 08598: Temple and Anderson, Ce
ll 71: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. C
ell Bio. 21A: 229 (1980); and Pitelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986
)checking).

【０１５１】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能で
ある。In a particular embodiment, the nucleic acid to be introduced for the purpose of gene therapy contains an inducible promoter operably linked to the coding region so that expression of the nucleic acid is controlled by the appropriate transcription inducer. Can be controlled by controlling the presence or absence of.

【０１５２】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明
するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対す
る化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合
物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよ
び細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され
得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するため
に用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙
げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして
化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプル
に対するそのような化合物の効果が観察される。Demonstration of Therapeutic or Prophylactic Activity The compounds or pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro, and then in vivo, for the desired therapeutic or prophylactic activity prior to use in humans. It For example, in vitro assays to demonstrate therapeutic or prophylactic utility of a compound or pharmaceutical composition include the effect of the compound on cell lines or patient tissue samples. The effect of a compound or composition on cell lines and / or tissue samples can be determined utilizing techniques known to those of skill in the art, including but not limited to rosette formation assays and cytolytic assays. In vitro assays that can be used in accordance with the present invention to determine if administration of a particular compound is indicated include in vitro cell culture assays, in which a patient tissue sample is grown in culture and the compound Or otherwise administered the compound, and the effect of such compound on the tissue sample is observed.

【０１５３】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は好ましく
は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような動物が挙げられるが
それらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最
も好ましくはヒトである。Therapeutic / Prophylactic Administration and Compositions The present invention provides for treatment, inhibition and prophylaxis by administration to a subject of an effective amount of a compound or pharmaceutical composition of the invention, preferably an antibody of the invention. To provide a method. In a preferred aspect, the compound is substantially purified (eg, substantially free of substances that limit its effect or produce undesired side effects). The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, etc., and is preferably a mammal, and most preferably a human.

【０１５４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。Formulations and methods of administration that can be used when the compound comprises nucleic acids or immunoglobulins are described above; additional suitable formulations and routes of administration are selected from among those described herein below. Can be done.

【０１５５】 種々の送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム中でのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル
、この化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるがそれらに限定されない。化
合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス
注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜な
ど）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一
緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の
薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射
を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取
り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入
することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール
化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。Various delivery systems are known and can be used to administer a compound of the invention (eg, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the compound). , Receptor-mediated endocytosis (
For example, Wu and Wu, J .; Biol. Chem. 262: 4429-443
2 (1987)), the construction of nucleic acids as part of retroviruses or other vectors). Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The compound or composition may be administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, by absorption through the epithelial or mucosal lining, such as the oral, rectal and intestinal mucosa, and other It can be administered with a biologically active agent. Administration can be systemic or local. Further, the pharmaceutical compounds or compositions of the invention may be administered by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections; intraventricular injection may be for example, intraventricular injection attached to a reservoir, such as the Ommaya reservoir. Introduction to the central nervous system by means of a catheter). Pulmonary administration may also be employed, eg, by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

【０１５６】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。In certain embodiments, it may be desirable to administer the pharmaceutical compounds or compositions of the invention locally to the area in need of treatment; this is for example, but not limited to, surgery. By local injection, topical application (eg in combination with post-surgical wound dressing), injection, by catheter, by suppository, or by an implant (the implant being a membrane such as a sialastic membrane or Porous, non-porous, or glue-like materials, including fibers). Preferably, when administering proteins of the invention, including antibodies, care must be taken to use materials that do not absorb proteins.

【０１５７】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。In another embodiment, the compound or composition may be delivered into vesicles, particularly liposomes (Langer, Science 249: 1527-1533 (
1990); Treat et al., Liposomes in the Therap.
y of Infectious Disease and Cancer, L
opez-Berestein and Fidler (ed.), Liss, New
York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein,
Ibid, pages 317-327; see ibid.).

【０１５８】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：
３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５
（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放
出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。In yet another embodiment, the compound or composition can be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump may be used (Lang.
er (supra); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. En
g. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:
507 (1980); Saudek et al., N. et al. Engl. J. Med. 321: 5
74 (1989)). In another embodiment, polymeric materials may be used (Medical Applications of Control).
led Release, Langer and Wise (ed.), CRC Pre
s. , Boca Raton, Florida (1974); Control
ed Drug Bioavailability, Drug Product
Design and Performance, Smolen and Bal
1 (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and P.
eppas, J .; , Macromol. Sci. Rev. Macromol. C
hem. 23:61 (1983); Levy et al., Science.
228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:
351 (1989); Howard et al., J. Am. Neurosurg. 71: 105
(1989) also). In yet another embodiment, the controlled release system can be placed near the therapeutic target, ie, the brain, thus requiring only a portion of the systemic dose (eg, Goodson, Medical Applica).
Tions of Controlled Release (supra), Volume 2,
115-138 (1984)).

【０１５９】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。Other controlled release systems are discussed in the review by Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

【０１６０】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に進入する
ことが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば
、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１
８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタ
ンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、
細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内
に組み込まれ得る。In certain embodiments, where the compound of the invention is a protein-encoding nucleic acid, the nucleic acid constitutes it as part of a suitable nucleic acid expression vector and is administered so that it is intracellular. (Eg, by using a retroviral vector (see US Pat. No. 4,980,286), or by direct injection, or microparticle bombardment (eg, gene gun; Biolist).
ic, Dupont), or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or in combination with homeobox-like peptides known to enter the nucleus (eg, Joliot et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1.
864-1868 (1991)) and the like, so as to promote the expression of the encoded protein in vivo. Alternatively, the nucleic acid is
It can be introduced intracellularly and integrated into the host cell DNA for homologous recombination for expression.

【０１６１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用について、連邦規制当局もしくは州政府により許可されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起
源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油
、鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的
組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液
、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な
溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては
、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小
麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリ
セロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリ
コール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、
少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は
、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの
形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキ
ャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニ
トール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ
ウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適
切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。この
ような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な
量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処
方物は、投与形態に適するべきである。The present invention also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments,
The term "pharmaceutically acceptable" is licensed by the federal regulatory agency or state government for use in animals, and more particularly in humans, or is listed in the United States Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopoeia. Means that The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers include sterile liquids such as water and oils, including oils of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin (eg, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.). Can be. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions, and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene. , Glycol, water, ethanol and the like. The composition can also, if desired,
Small amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents may be included. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers are E.I. W. "Remington" by Martin
's Pharmaceutical Sciences ". Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.

【０１６２】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために適合された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、単位投薬形態において別々にかまたは一
緒に混合してのいずれかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小
袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉体または水を含ま
ない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組
成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され
得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るよう
に、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。In a preferred embodiment, the composition is formulated according to conventional procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to human beings. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. If desired, the composition can also include a solubilizer and a local anesthesia such as lignocaine to relieve pain at the site of injection. In general, the ingredients are either dried separately in a unit dosage form or mixed together, for example in a dry container in an airtight container, such as an ampoule or sachet, which shows a quantity of the active agent. Supplied as frozen powder or water-free concentrate. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.

【０１６３】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。The compounds of the present invention may be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include salts formed with anions, such as salts derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, and sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide. , Isopropylamine, triethylamine, 2
-Salts formed with cations such as salts derived from ethylaminoethanol, histidine, procaine and the like.

【０１６４】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、阻害および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、最適な投薬量の範囲の同定を補助するために使用され得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線か
ら推定され得る。The amount of a compound of the invention that is effective in treating, inhibiting and preventing a disease or disorder associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide of the invention can be determined by standard clinical techniques. . In addition, in vitro assays can optionally be used to help identify optimal dosage ranges. Precise dosages to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the severity of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

【０１６５】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。For antibodies, the dosage administered to a patient is typically 0.1 mg to 100 mg per kg patient body weight. Preferably, the dosage administered to a patient is between 0.1 mg and 20 mg / kg of the patient's body weight, more preferably 1 mg to 10 mg / kg of the patient's body weight. In general, human antibodies have a longer half-life within the human body than antibodies from other species due to the immune response to the foreign polypeptides. Thus, low dosages and infrequent administrations of human antibodies are often possible. Further, the dosage and frequency of administration of the antibodies of the invention may be altered (eg,
It can be reduced by enhancing antibody uptake by lipidation and the like and tissue penetration (eg into the brain).

【０１６６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the invention. Notifications in the form prescribed by governmental agencies regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products may optionally be accompanied by such containers. This notice
It reflects the agency's approval of manufacture, use or sale for human administration.

【０１６７】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。Diagnostic and Imaging Labeled antibodies that specifically bind to a polypeptide of interest, as well as its derivatives and analogs thereof, have been used for diagnostic purposes to detect abnormal expression and expression of a polypeptide of the invention. Diseases and / or disorders associated with activity can be detected, diagnosed or monitored. The present invention provides for the detection of aberrant expression of a polypeptide of interest, which comprises (a) using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest to target in a cell or body fluid of an individual. Assaying the expression of the polypeptide of
And (b) comparing the level of gene expression to the level of standard gene expression, whereby increasing or decreasing the level of assayed polypeptide gene expression compared to the standard level of expression. Shows abnormal expression.

【０１６８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。The present invention provides a diagnostic assay for diagnosing a disorder, which assay comprises (
a) assaying the expression of the polypeptide of interest in cells or fluids of an individual using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest, and (b) this gene expression level and standard Comparing the level of gene expression, whereby an increase or decrease in the assayed polypeptide gene expression level compared to its standard expression level is indicative of a particular disorder. With respect to cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsied tissue from an individual may indicate a predisposition for the development of the disease or may provide a means for detecting the disease prior to the onset of actual clinical symptoms. Can be provided. A more definitive diagnosis of this type may allow health professionals to use preventative measures or early aggressive treatment, thereby preventing the development or further progression of cancer.

【０１６９】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。Antibodies of the invention can be used to assay protein levels in biological samples using classical immunohistological methods known to those of skill in the art (eg, Jalk).
anen et al. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985);
Jalkanen et al. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (
1987)). Other antibody-based methods useful for detecting protein gene expression include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). Suitable antibody assay labels are known in the art and are enzymatic labels (eg glucose oxidase); radioisotopes (eg iodine (125I, 1, 1
21I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium (3H), indium (112In), and technetium (99Tc)); luminescent labels (eg luminol); and fluorescent labels (eg fluorescein and rhodamine), and Examples include biotin.

【０１７０】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）、投
与後に、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；お
よびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、この
バックグラウンドレベルを超える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリ
ペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バ
ックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検
出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得
る。One aspect of the present invention is the detection and diagnosis of diseases or disorders associated with aberrant expression of the polypeptide of interest in animals, preferably mammals, and most preferably humans. In one embodiment, diagnosis is a) administering to a subject an effective amount of a labeled molecule that specifically binds to a polypeptide of interest (eg, parenterally, subcutaneously, or intraperitoneally). B) to allow the labeled molecule to preferentially concentrate at the site in the subject where the polypeptide is expressed (and to remove unbound labeled molecule to background levels) A) waiting for a time interval after administration; c) determining a background level; and d) detecting a labeled molecule in the subject, so that the background level is exceeded. Detection of the labeled molecule indicates that the subject has a particular disease or disorder associated with aberrant expression of the polypeptide of interest. Background level can be determined by a variety of methods, including comparing the amount of labeled molecule detected to standard values previously determined for a particular system.

【０１７１】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。It will be appreciated in the art that the size of the subject and the imaging system used will determine the amount of imaging moiety needed to produce a diagnostic image. In the case of a radioisotope moiety, the amount of radioactivity injected for a human subject will usually be about 5
It is in the range of 20 millicuries of 99mTc. The labeled antibody or antibody fragment will then preferentially accumulate at the location of cells which contain the particular protein.
In vivo tumor imaging is described by S. W. Burchiel et al., "Immunophar
macokinetics of Radiolabeled Antibod
ies and Their Fragments "(Tumor Image
ng: The Radiochemical Detection of Ca
ncer, Chapter 13, S. W. Burchiel and B.I. A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982).

【０１７２】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標
識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与
後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。
別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日
間である。Depending on a number of variables, including the type of label used and the mode of administration, the labeled molecule will preferentially concentrate at the site of the subject and will not be bound. The time interval after administration is 6-48 hours or 6-24 hours or 6-12 hours, which allows the C. to be cleared to background levels.
In another embodiment, the post-administration time interval is 5-20 days or 5-10 days.

【０１７３】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。In one embodiment, monitoring a disease or disorder comprises repeating the method for diagnosing the disease or disorder (eg, 1 month after the first diagnosis, 6 months after the first diagnosis, the first diagnosis). 1 year later).

【０１７４】 標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされない
が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影
法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が
挙げられる。The presence of labeled molecule can be detected from the patient using methods known in the art for in vivo scanning. These methods depend on the type of label used. One of ordinary skill in the art can determine the appropriate method for detecting a particular label. Methods and devices that can be used in the diagnostic methods of the invention include, but are not limited to, computer tomography (CT), whole body scanning such as position emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI). , And ultrasonic diagnostic methods.

【０１７５】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を
用いて患者から検出される。In a specific embodiment, the molecule is labeled with a radioisotope and is detected in a patient using a radiation responsive surgical instrument (Thurston et al., US Pat. No. 5,441,050). . In another embodiment, the molecule is labeled with a fluorescent compound and is detected in the patient using a fluorescence responsive scanning instrument. In another embodiment, the molecule is labeled with a positron emitting metal and is detected in the patient using proton emission tomography. In yet another embodiment, the molecule is labeled with a paramagnetic label and is detected in the patient using magnetic resonance imaging (MRI).

【０１７６】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製さ
れた抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離
されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態にお
いては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この
抗体は、検出可能な基質（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合
物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第
二の抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備え
る。(Kit) The present invention provides a kit that can be used in the above method. In one embodiment, the kit comprises an antibody of the invention (preferably a purified antibody) in one or more containers. In certain embodiments, the kits of the invention comprise a substantially isolated polypeptide comprising an epitope that is specifically immunoreactive with the antibodies included in the kit. Preferably, the kit of the present invention further comprises a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. In another specific embodiment, a kit of the invention provides for the binding of an antibody to a polypeptide of interest (e.g., the antibody has a detectable substrate (e.g., the antibody is a fluorescent compound, an enzyme substrate, a radioactive compound or A luminescent compound) or a second antibody which recognizes the first antibody can be conjugated with a detectable substrate).

【０１７７】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピ
トープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、この
ようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイト
メトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化
合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態にお
いては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に
合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた
、固体支持体に付着され得る。In another specific embodiment of the invention, the kit is for diagnostic use in screening serum containing antibodies specific for proliferative and / or cancerous polynucleotides and polypeptides. It's a kit. Such a kit may include a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. Such a kit may comprise a substantially isolated polypeptide antigen that comprises an epitope that is specifically immunoreactive with at least one anti-polypeptide antigen antibody. Further, such kits are for detecting the binding of the antibody to an antigen (eg, the antibody can be conjugated with a fluorescent compound such as fluorescein or rhodamine, which can be detected by flow cytometry). Means are provided. In certain embodiments, the kit may comprise a recombinantly produced polypeptide antigen or a chemically synthesized polypeptide antigen. The polypeptide antigens of this kit can also be attached to a solid support.

【０１７８】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗
原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。In a more particular embodiment, the detection means of the above kit comprises a solid support to which the polypeptide antigen is attached. Such a kit also comprises a non-attached reporter-labeled anti-human antibody. In this embodiment, binding of the antibody to the polypeptide antigen can be detected by binding of the reporter-labeled antibody.

【０１７９】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質
的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗
体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナ
ール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競
合抗原を含み得る。In a further embodiment, the invention comprises a diagnostic kit for use in screening serum containing an antigen of a polypeptide of the invention. The diagnostic kit comprises a substantially isolated antibody that is specifically immunoreactive with a polypeptide or polynucleotide antigen, and means for detecting binding of the polynucleotide or polypeptide antigen to the antibody. . In one embodiment, the antibody is
Attached to a solid support. In a particular embodiment, the antibody may be a monoclonal antibody. The detection means of this kit may include a second labeled monoclonal antibody. Alternatively, or additionally, the detection means may include a labeled, competing antigen.

【０１８０】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または
比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイン
キュベートすることにより検出される酵素である。In one diagnostic configuration, the test serum is reacted with a solid phase reagent having surface bound antigens obtained by the method of the invention. After binding the specific antigen antibody with this reagent and removing the unbound serum components by washing, in order to bind the reporter with this reagent, depending on the amount of anti-antigen antibody bound on the solid support, This reagent is reacted with a reporter-labeled anti-human antibody. The reagent is washed again to remove unbound labeled antibody and the amount of reporter associated with the reagent is determined. Typically, the reporter is an enzyme detected by incubating this solid phase in the presence of a suitable fluorometric, luminescent or colorimetric substrate (Sigma, St. Louis, MO).

【０１８１】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。The solid surface reagents in the above assay are used to convert protein material to solid support material (
For example, prepared by known techniques for attachment to polymeric beads, dipsticks, 96-well plates or filtration material). These methods of attachment generally include non-specific adsorption of proteins to the support or chemically active groups (eg, activated carboxyl groups, hydroxyl groups, or aldehyde groups) on the solid support. Covalent attachment of proteins (typically via free amine groups). Alternatively, streptavidin-coated plates can be used with biotinylated antigen.

【０１８２】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。Accordingly, the present invention provides an assay system or kit for performing this diagnostic method. The kit generally comprises a support having surface-bound recombinant antigens, and a reporter-labeled anti-human antibody for detecting surface-bound anti-antigen antibody.

【０１８３】 （ポリヌクレオチド） 本発明のポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子としては、以下が挙げら
れる：欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板由来増殖因子
Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）（配列番号１）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（配列番号３）；国際公開番
号ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）（配列
番号５）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６
８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）（配列番号
７）；欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるような神経膠腫由来増殖因
子（ＧＤＧＦ）（配列番号９）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示さ
れるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（配列番号１１）；欧州特許番号ＥＰ
−５０６４７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（配列
番号１３）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮
増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）（配列番号１５）；国際公開番号ＷＯ９６／３９４
２１号に開示されるような血管内皮増殖因子−３（ＶＥＧＦ−３）（配列番号１
７）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因
子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）（配列番号１９）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ１（ＶＥＧＦ−Ｄ１）（配列番号２１）
およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖
因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）（配列番号２３）。上記の参考文献は、その全体が本明
細書で参考として援用される。Polynucleotides Isolated nucleic acid molecules comprising a polynucleotide of the invention include: Platelet-derived growth factor A (PDGF-A) as disclosed in European Patent No. EP-682110. (SEQ ID NO: 1); Platelet-derived growth factor B (PDGF-B) as disclosed in European Patent No. EP-283217 (SEQ ID NO: 3); Placental growth factor as disclosed in International Publication No. WO 92/06194. (PIGF) (SEQ ID NO: 5); Hauser et al., Gorth Factors, 4: 259-26.
8 (1993) placental growth factor 2 (PIGF-2) (SEQ ID NO: 7); glioma-derived growth factor (GDGF) (SEQ ID NO: 9) as disclosed in European Patent No. EP-399816. ); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (SEQ ID NO: 11) as disclosed in WO 90/13649; European Patent No. EP.
Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) (SEQ ID NO: 13) as disclosed in WO-506477; Vascular Endothelial Growth Factor 2 (VEGF-2) (SEQ ID NO: SEQ ID NO: as disclosed in WO 96/39515). 15); International Publication Number WO96 / 394
Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGF-3) as disclosed in No. 21 (SEQ ID NO: 1)
7); Vascular Endothelial Growth Factor D (VEGF-D) as disclosed in International Publication No. WO98 / 07832 (SEQ ID NO: 19); Vascular Endothelial Growth Factor D1 as disclosed in International Publication No. WO98 / 02543. (VEGF-D1) (SEQ ID NO: 21)
And vascular endothelial growth factor E (VEGF-E) (SEQ ID NO: 23) as disclosed in German Patent No. DE19639601. The above references are incorporated herein by reference in their entireties.

【０１８４】 本発明の脈管形成タンパク質は、全て構造的に関連する。全８つのシステイン
が、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの全てのメンバー内で保存されていることは
特に重要である（図３Ａ〜３Ｃの囲まれた領域を参照のこと）。さらに、ＰＤＧ
Ｆ／ＶＥＧＦファミリーのサイン、ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣ（配列番号２９
）は、本明細書中に開示される全ての脈管形成タンパク質で保存される。The angiogenic proteins of the present invention are all structurally related. It is especially important that all eight cysteines are conserved within all members of the VEGF / PDGF family (see boxed regions in Figures 3A-3C). Furthermore, PDG
F / VEGF family signature, PXCVXXXRCXGCC (SEQ ID NO: 29
) Is conserved in all angiogenic proteins disclosed herein.

【０１８５】 本発明の脈管形成ポリペプチドは、全長ポリペプチドならびに全長ポリペプチ
ドの任意のリーダー配列および活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド
配列を含む。The angiogenic polypeptides of the present invention include full length polypeptides as well as polynucleotide sequences encoding any leader sequences and active fragments of the full length polypeptides.

【０１８６】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えば、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖
または一本鎖であり得、一本鎖は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、表１のヌクレオチド
配列のコード配列に同一であり得るか、または遺伝コードの重複または縮重の結
果として、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１
または２３のＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコード配列で
あり得る。The polynucleotides of the invention may be in the form of RNA or in the form of DNA (eg c
(Including DNA, genomic DNA and synthetic DNA). The DNA can be double-stranded or single-stranded, and the single-stranded can be the coding strand or non-coding (antisense) strand. The coding sequence encoding the mature polypeptide may be identical to the coding sequence of the nucleotide sequence of Table 1 or, as a result of duplication or degeneracy of the genetic code, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21
Alternatively, it may be a different coding sequence that codes for the same mature polypeptide as the 23 DNA.

【０１８７】 図３Ａ〜３Ｃのそれぞれの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
、以下を含み得る：それぞれの成熟ポリペプチドのコード配列のみ；それぞれの
成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダーま
たは分泌配列、あるいはプロタンパク質配列）；それぞれの成熟ポリペプチドの
コード配列（および、必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配列（
例えば、イントロン、または成熟ポリペプチドのコード配列の５’側および／ま
たは３’側の非コード配列）。The polynucleotide encoding each mature polypeptide of FIGS. 3A-3C may include: coding sequence of each mature polypeptide only; coding sequence of each mature polypeptide and additional coding sequences (eg, A leader or secretory sequence, or a proprotein sequence); the coding sequence (and optionally further coding sequence) and non-coding sequence of each mature polypeptide (
(For example, introns, or non-coding sequences 5'and / or 3'of the mature polypeptide coding sequence).

【０１８８】 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、そのポリペ
プチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。Thus, the term “polynucleotide encoding a polypeptide” includes polynucleotides that contain only the coding sequence for that polypeptide, as well as polynucleotides that contain additional coding and / or non-coding sequences.

【０１８９】 本発明はさらに、図３Ａ〜３Ｃの推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオ
チドの改変体に関する。このポリヌクレオチドの改変体は、このポリヌクレオチ
ドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはこのポリヌクレオチドの天然に存在
しない改変体であり得る。The present invention further relates to variants of the polynucleotides described herein above which encode fragments, analogs and derivatives of the polypeptides having the deduced amino acid sequences of Figures 3A-3C. The variant of the polynucleotide can be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.

【０１９０】 従って、本発明は、図３Ａ〜３Ｃに示されるのと同じそれぞれの成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびに図３Ａ〜３Ｃのポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログをコードする、このようなポリヌクレオチド
の改変体を含む。このようなヌクレオチド改変体としては、欠失改変体、置換改
変体、および付加または挿入改変体が挙げられる。Accordingly, the present invention thus encodes the same polynucleotides encoding each of the mature polypeptides shown in FIGS. 3A-3C, as well as fragments, derivatives or analogs of the polypeptides of FIGS. Various polynucleotide variants. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and addition or insertion variants.

【０１９１】 本明細書中上記で示されるように、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５
、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のコード配列の天然
に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知のよ
うに、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有
するポリヌクレオチド配列の代替形態であり、この置換、欠失または付加は、コ
ードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しない。As indicated herein above, the polynucleotides are SEQ ID NOs: 1, 3, 5
, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 coding sequences that are naturally occurring allelic variants of the coding sequences. As is known in the art, allelic variants are alternative forms of polynucleotide sequences that have one or more nucleotide substitutions, deletions or additions, which substitutions, deletions or additions, are encoded polypeptides. Does not substantially change the function of.

【０１９２】 本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチ
ドの発現または分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプ
チドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じ読み
枠で融合され得る、ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列を有するポリペプチ
ドは、プレタンパク質であり、そして宿主細胞によってそのリーダー配列が切断
されて、そのポリペプチドの成熟形態を形成し得る。ポリヌクレオチドはまた、
成熟タンパク質＋さらなる５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得
る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてそのタ
ンパク質の不活性な形態である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タン
パク質が残る。The invention also provides that the coding sequence for the mature polypeptide functions as a polynucleotide (eg, a secretory sequence to control the transport of the polypeptide from the cell) that aids expression or secretion of the polypeptide from the host cell. A leader sequence), which can be fused in the same reading frame. A polypeptide having a leader sequence is a preprotein, and its leader sequence may be cleaved by the host cell to form the mature form of the polypeptide. The polynucleotide also
It may encode a mature protein plus a proprotein which is an additional 5'amino acid residue. A mature protein with a prosequence is a proprotein and is an inactive form of that protein. Once the prosequence is cleaved, the active mature protein remains.

【０１９３】 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ
配列を有するタンパク質、あるいはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の
両方を有するタンパク質をコードし得る。Thus, for example, a polynucleotide of the invention may encode a mature protein, or a protein having a prosequence, or a protein having both a prosequence and a presequence (leader sequence).

【０１９４】 本発明のポリヌクレオチドはまた、マーカー配列にインフレームで融合されて
いるコード配列を有し得、このマーカー配列は、本発明のポリペプチドの精製を
可能にする。このマーカーアミノ酸配列は、細菌宿主の場合においてマーカーに
融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するためのｐＱＥベクターによって供
給されるヘキサ−ヒスチジンタグであり得るか、または、例えば、マーカー配列
は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を使用する場合、赤血球凝集素「
ＨＡ」タグであり得る。このＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク
質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６
７（１９８４））。The polynucleotides of the invention may also have a coding sequence fused in frame to a marker sequence, which marker sequence allows for purification of the polypeptide of the invention. The marker amino acid sequence can be a hexa-histidine tag provided by the pQE vector to provide for purification of the mature polypeptide fused to the marker in the case of a bacterial host, or, for example, the marker sequence can be a mammalian sequence. When using an animal host (eg, COS-7 cells), hemagglutinin "
HA "tag. This HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson, I., et al., Cell 37:76.
7 (1984)).

【０１９５】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同
一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を包含する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチ
オニンを欠失するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号
２のおよそ１位〜およそ２１１位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオ
チド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a single embodiment comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence which is at least 95% identical to the following nucleotide sequences, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identical. Including isolated nucleic acid molecules: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 but lacking the N-terminal methionine. (C) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence from about position 1 to about position 211 of SEQ ID NO: 2; or (d) (a), (b) or (c) the nucleotide sequence A nucleotide sequence that is complementary to any of the sequences.

【０１９６】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同
一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を包含する：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチ
オニンを欠失するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号
４のおよそ１位〜およそ２４１位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオ
チド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a single polynucleotide comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identical to the following nucleotide sequences: Including isolated nucleic acid molecules: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 but lacking the N-terminal methionine. (C) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of about 1 to about 241 of SEQ ID NO: 4; or (d) (a), (b) or (c) the nucleotide sequence A nucleotide sequence that is complementary to any of the sequences.

【０１９７】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同
一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を包含する：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチ
オニンを欠失するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号
６のおよそ１位〜およそ１４９位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオ
チド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a single embodiment comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence which is at least 95% identical to the following nucleotide sequences, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identical. Including isolated nucleic acid molecules: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; (b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 but lacking the N-terminal methionine. (C) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence from about position 1 to about 149 of SEQ ID NO: 6; or (d) (a), (b) or (c) the nucleotide sequence A nucleotide sequence that is complementary to any of the sequences.

【０１９８】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同
一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を包含する：（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチ
オニンを欠失するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号
８のおよそ１位〜およそ１７０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオ
チド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the invention is a single polynucleotide comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence which is at least 95% identical to the following nucleotide sequences, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identical. Including isolated nucleic acid molecules: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; (b) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 but lacking the N-terminal methionine. (C) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence from about position 1 to about position 170 of SEQ ID NO: 8; or (d) (a), (b) or (c) the nucleotide sequence A nucleotide sequence that is complementary to any of the sequences.

【０１９９】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号１０におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１０におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号１０におけるアミノ酸約１〜約１９０の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 190 in SEQ ID NO: 10; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２００】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号１２におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１２におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号１２におけるアミノ酸約１〜約１９１の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。Further embodiments of the invention are polys that have a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) a polynucleic acid having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 191 in SEQ ID NO: 12; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０１】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号１４におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１４におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号１４におけるアミノ酸約１〜約２１４の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a poly nucleotide sequence having at least 95% identity, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identity to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; (b) a polynucleotide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 214 in SEQ ID NO: 14; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０２】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号１６におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１６におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号１６におけるアミノ酸約１〜約４１９の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１
４９号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１
４９号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する
成熟ＶＥＧＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受
託番号第９７１４９号中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるが、Ｎ
末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｇ
）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）中のヌクレオチド配
列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (b) a polynucleotide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 419 in SEQ ID NO: 16; or (d) ATCC Deposit No. 971.
A nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in No. 49; (e) ATCC Deposit No. 971.
A nucleotide sequence encoding a mature VEGF2 polypeptide having an amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in No. 49; (f) encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97149;
A nucleotide sequence encoding a polypeptide lacking a terminal methionine; or (g
) A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in (a), (b), (c), (d), (e), or (f).

【０２０３】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号１８におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１８におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号１８におけるアミノ酸約１〜約２０７の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 207 in SEQ ID NO: 18; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０４】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号２０におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２０におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号２０におけるアミノ酸約１〜約３２５の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。Further embodiments of the invention are polys that have a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) a polynucleotide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 325 in SEQ ID NO: 20; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０５】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号２２におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２２におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号２２におけるアミノ酸約１〜約３５４の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。Further embodiments of the invention are polys that have a nucleotide sequence that is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (b) a polynucleotide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 354 in SEQ ID NO: 22; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０６】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９５％同一、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号２４におけるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２４におけるアミノ酸配列
を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号２４におけるアミノ酸約１〜約１３２の配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（
ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。A further embodiment of the present invention is a polynucleotide having a nucleotide sequence which is at least 95% identical, and more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identical to the following nucleotide sequences: An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides is included: (a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; (b) a polynucleotide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 but lacking the N-terminal methionine. A nucleotide sequence encoding a peptide; (c) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the sequence of amino acids from about 1 to about 132 in SEQ ID NO: 24; or (d) (a), (b), or (
A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences in c).

【０２０７】 脈管形成ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なく
とも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そ
のポリヌクレオチド配列が脈管形成ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド
配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを
意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列のヌク
レオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得
るか、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチ
ドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオ
チド配列の５’末端部位もしくは３’末端部位で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどの場所においても生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々に
、または参照配列内の１つ以上の隣接群としてのいずれかで散在される。A polynucleotide having a nucleotide sequence that is, for example, at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence that encodes an angiogenic polypeptide is a reference nucleotide whose polynucleotide sequence encodes an angiogenic polypeptide. Except that it may contain up to 5 point mutations for each 100 nucleotides of the sequence,
The nucleotide sequence of the polynucleotide is intended to be identical to the reference sequence. In other words, up to 5% of the nucleotides of the reference sequence can be deleted or replaced by another nucleotide in order to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the reference nucleotide sequence. Alternatively, up to 5% of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These variations in the reference sequence may occur at the 5'or 3'ends of the reference nucleotide sequence, or at any position between their terminal positions, individually between the nucleotides in the reference sequence. , Or as one or more contiguous groups in the reference sequence.

【０２０８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１、３、５、７
、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド
配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一
であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ
ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ５３７１１）を使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍ
ｉｔｈおよびＷａｒｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの
配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））。Ｂ
ｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本
発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合
は、当然のことながら、同一性のパーセントが参照ヌクレオチド配列の全長にわ
たり計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性
におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule may be labeled, for example, in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7,
, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 are known to be at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the nucleotide sequence shown. Computer programs (eg, Bestfit)
program (Wisconsin Sequence Analysis)
Package, Version 8 for Unix (registered trademark), Gen
etics Computer Group, University Rese
arch Park, 575 Science Drive, Madison,
WI53711) and can be conventionally determined. Bestfit is Sm
Find the best segment of homology between two sequences using the local homology algorithm of ith and Warterman (Advances in Ap).
plied Mathematics 2: 482-489 (1981)). B
It will be appreciated that if estfit or any other sequence alignment program is used to determine whether a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the invention, the identity will be the same. Is calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence and the parameters are set such that gaps in homology of up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence are allowed.

【０２０９】 脈管形成「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９
、２１または２３に含まれる配列、または例えば、ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
または７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローン、あるいはそれらの補体にハイブ
リダイズし得るポリヌクレオチドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ
、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）
、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪
断サケ***ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩インキュベーション、次いで
０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄することをいう。The angiogenic “polynucleotide” also has the sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19 under stringent hybridization conditions.
, 21 or 23, or, for example, ATCC Deposit No. 97149.
Or a cDNA clone contained in 75698, or a polynucleotide capable of hybridizing to the complement thereof. “Stringent hybridization conditions” means 50% formamide, 5 × SSC (750 mM NaCl
, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6)
5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 µg / ml denatured sheared salmon sperm DNA at 42 ° C overnight incubation, then wash filters in 0.1xSSC at about 65 ° C. It means to do.

【０２１０】 より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で脈管形成ポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる）；塩条件、または温度の操作を通じて達成される。例えば、より低いスト
リンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．
２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ
、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ***ブロッキングＤＮＡを含む溶
液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ Ｓ
ＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシ
ーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる
洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。Nucleic acid molecules that hybridize to the angiogenic polynucleotides at lower stringency hybridization conditions are also contemplated. Changes in hybridization stringency and signal detection are primarily achieved through manipulation of formamide concentrations (lower percentages of formamide produce reduced stringency); salt conditions, or temperature. For example, lower stringency conditions are 6 × SSPE (20 × SSPE = 3M NaCl;
2M NaH 2 PO 4 ; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS
, 30% formamide, 100 μg / ml salmon sperm blocking DNA, incubated overnight at 37 ° C .; then 1 × SSPE, 0.1% S
Includes washing with DS at 50 ° C. Furthermore, in order to achieve even lower stringency, the washes performed after stringent hybridization can be performed at higher salt concentrations (eg 5 × SSC).

【０２１１】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ***ＤＮＡ、お
よび市販の製品処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。Note that changes in the above conditions may be achieved by the inclusion and / or substitution of alternative blocking reagents used to suppress background in hybridization experiments. Representative blocking reagents include Denhardt's reagent, BLOTTO, heparin, denatured salmon sperm DNA, and commercial product formulations. The inclusion of specific blocking reagents may require modification of the above hybridization conditions due to compatibility issues.

【０２１２】 当然ながら、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’
末端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ス
トレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレ
オチドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例え
ば、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて生成した事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡ
クローン）にハイブリダイズするので、「ポリヌクレオチド」の定義に包含され
ない。Of course, the poly A + sequence (eg, any 3'of the cDNA shown in the sequence listing)
A polynucleotide that hybridizes only to the terminal poly A + region) or to a complementary stretch of T (or U) residues is any such polynucleotide comprising a poly (A) stretch or its complement. Nucleic acid molecule (eg, virtually any double-stranded cDNA generated using oligo dT as a primer)
Clone) and is not included in the definition of "polynucleotide".

【０２１３】 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参
照ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてよ
り好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ
、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０（例えば、５０）ｎｔにハイブリダ
イズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これ
らは、上記で議論されるように、そして以下でより詳細に議論されるように、診
断のプローブおよび診断のプライマーとして有用である。A polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a polynucleotide is at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt.
, And even more preferably, a polynucleotide (either DNA or RNA) that hybridizes to about 30-70 (eg, 50) nt. These are useful as diagnostic probes and diagnostic primers, as discussed above and in more detail below.

【０２１４】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部とは、参照ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、表１のヌクレオチド配列）由来の２
０個以上連続したヌクレオチドを意図する。もちろん、ポリＡ配列（例えば、配
列番号Ｘのの３’末端ポリ（Ａ）トラクト）、あるいはＴ（またはＵ）残基の相
補的ストレッチ）のみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのようなポ
リヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ、またはその相補体（例えば、事実上
任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするの
で、本発明の核酸の一部へのハイブリダイズに使用される本発明のポリヌクレオ
チドに含まれない。[0214] For example, a portion of a "at least 20 nt long" polynucleotide refers to a 2'derived from the nucleotide sequence of a reference polynucleotide (eg, the nucleotide sequence of Table 1).
0 or more consecutive nucleotides are intended. Of course, a polynucleotide that hybridizes only to a poly A sequence (eg, the 3'terminal poly (A) tract of SEQ ID NO: X, or a complementary stretch of T (or U) residues) is such a polynucleotide. Hybridizes to any nucleic acid molecule comprising a poly (A) stretch, or its complement (eg, virtually any double-stranded cDNA clone), and thus is used for hybridizing to a portion of a nucleic acid of the invention. The present invention is not included in the polynucleotide of the present invention.

【０２１５】 しかし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１
、または２３に示される核酸配列、または実際に、脈管形成タンパク質活性を有
するポリペプチドをコードする寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に、少なくとも９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性な配列を有する核酸分子が
好ましい。「脈管形成活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的ア
ッセイにおいて脈管形成活性を示すポリペプチドを意図する。例えば、脈管形成
タンパク質活性は、例えば、マイトジェンアッセイおよび内皮細胞泳動アッセイ
を使用して測定され得る。例えば、Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２５７６−２５８１（１９９６）およびＪｏ
ｕｋｏｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２９０−２９８（１９９６）を参照のこと。「
リンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）活性を有するポリペプチド」
はによって、特定の生物学的アッセイにおいてリンパ管形成活性を示すポリペプ
チドを意図する。例えば、脈管形成タンパク質活性は、例えば、マイトジェンア
ッセイおよび内皮泳動アッセイを使用して測定され得る。例えば、Ｏｌｏｆｓｓ
ｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２５７６−２
５８１（１９９６）およびＪｏｕｋｏｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２９０−２９８
（１９９６）を参照のこと。However, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21
, Or 23, or indeed at least 9 in the nucleic acid sequence of the deposited cDNA encoding a polypeptide having angiogenic protein activity.
Nucleic acid molecules having 5%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity are preferred. By "polypeptide having angiogenic activity" is intended a polypeptide that exhibits angiogenic activity in a particular biological assay. For example, angiogenic protein activity can be measured using, for example, mitogenic and endothelial cytophoretic assays. For example, Olofsson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 2576-2581 (1996) and Jo.
ukov et al., EMBO J .; 5: 290-298 (1996). "
A polypeptide having lymphangiogenic activity "
By is intended a polypeptide that exhibits lymphangiogenic activity in a particular biological assay. For example, angiogenic protein activity can be measured using, for example, mitogen and endothelium assay. For example, Olofss
on et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576-2.
581 (1996) and Joukov et al., EMBO J. 5: 290-298
See (1996).

【０２１６】 当然のことながら、遺伝子コードの縮重に起因して、例えば、寄託されたｃＤ
ＮＡの核酸配列、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９
、２１、または２３示される核酸配列またはそのフラグメントに対して少なくと
も９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配
列を有する多数の核酸分子が、「脈管形成機能活性を有する」ポリペプチドをコ
ードするということを、当業者は、直ちに理解する。実際に、これらのヌクレオ
チド配列のいずれかの縮重改変体すべてが、同じポリぺプチドをコードするので
、多くの場合、このことは、上記の比較アッセイを実行しなくても、当業者に明
らかである。縮重改変体でないような核酸分子について、合理的な数がまた、機
能活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに理解される
。なぜならば、当業者が、さらに以下に記載されるように、タンパク質を有意に
機能させるかまたは機能しそうにないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミ
ノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を完全に知っているからである。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, for example, the deposited cD
NA nucleic acid sequence, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19
, 21, or 23, or a fragment thereof, has a sequence of at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to a number of nucleic acid molecules. One of skill in the art will immediately understand that it encodes a “polypeptide having tube forming functional activity”. In fact, since all degenerate variants of any of these nucleotide sequences encode the same polypeptide, this will often be apparent to one of skill in the art without performing the comparative assay described above. Is. It is further understood in the art that, for nucleic acid molecules that are not degenerate variants, a reasonable number also encodes a polypeptide having functional activity. Amino acid substitutions that cause the protein to function significantly or are unlikely to function (eg, replacing one aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid), as described further below. Because I know completely.

【０２１７】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、
Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａ
ｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７
：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここにおいてこの著者らは、タ
ンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容性であることを示す。For example, guidance on how to make phenotypically silent amino acid substitutions includes:
Bowie, J .; U. Et al., "Deciphering the Message"
in Protein Sequences: Tolerance to A
"Mino Acid Substitutions", Science 247
1306-1310 (1990), where the authors show that the protein is surprisingly tolerant of amino acid substitutions.

【０２１８】 従って、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０、２２または２４のポリペプチドならびにそれらのフラグメント（これら
のフラグメントは、このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドに対して、少なくとも３０塩基、および好ましくは少なくとも５０塩基を有
する）をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の同一性、好
ましくは少なくとも９０％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％、
９６％、９７％または９８％の同一性を有するポリペプチドに関する。Therefore, the present invention provides SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18.
, 20, 22 or 24 polypeptides and fragments thereof (these fragments have at least 30 bases, and preferably at least 50 bases relative to the polypeptide encoded by such a polynucleotide). At least 70% identity, preferably at least 90% identity, and more preferably at least 95% identity to the polynucleotide,
It relates to polypeptides having 96%, 97% or 98% identity.

【０２１９】 「同一性」はそれ自体で、当該分野で認識される意味を有し、そして公開され
た技術を使用して算出され得る。（例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）；ＢＩＯＣＯ
ＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥ
ＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，（１９９３）；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵ
ＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉ
ｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，（
１９９４）；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８７）；ならびにＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥ
Ｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋ
ｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照のこと）。２つの
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が
存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である。（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．
，およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８
：１０７３（１９８８）。）２つの配列の間の同一性または類似性を決定するた
めに一般に使用される方法としては、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒｓ，」Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９９４），およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，お
よびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１
０７３（１９８８）に開示される方法があげられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列する方法は、コンピュータープログ
ラム（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）），Ｂ
ＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍ
ｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０），Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇ
ｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋ
ａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５
３７１１（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを使用
する，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２
：４８２−４８９（１９８１））を含む）で分類される。本発明の参照ヌクレオ
チド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドによって、以下のことが意図される。ポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列は、以下のことを除いて参照配列に同一である。ポリヌクレオチ
ド配列は、脈管形成ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００
ヌクレオチドあたり、５つの点変異までを含み得る。すなわち、参照ヌクレオチ
ド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを得るために、参照配列内の５％のヌクレオチドまでが、別のヌクレオチド
で欠失または置換され得るか、あるいは参照ヌクレオチド内の総ヌクレオチドの
５％までの数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。問い合わせはは、配
列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，または２３
，ＯＲＦ （オープンリーディングフレーム）、または本明細書中に記載される
任意の特異的なフラグメントであり得る。“Identity”, by itself, has its art-recognized meaning and can be calculated using published techniques. (For example, COMPUTATIONAL MO
LECULAR BIOLOGY, Lesk, A .; M. Hen, Oxford Un
diversity Press, New York, (1988); BIOCO
MPUTING: INFORMATION AND GENOME PROJE
CTS, Smith, D.M. W. Hen, Academic Press, New Y
ork, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF OF SEQU
ENCE DATA, PART I, Griffin, A .; M. , And Gri
ffin, H.F. G. Hen, Humana Press, New Jersey, (
1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR
BIOLOGY, von Heinje, G .; , Academic Pres
s, (1987); and SEQUENCE ANALYSIS PRIME
R, Gribskov, M .; And Devereux, J .; Hen, M Stock
Ton Press, New York, (1991)). Although there are numerous ways to determine the identity between two polynucleotide or polypeptide sequences, the term "identity" is well known to those of skill in the art. (Carillo, H .;
, And Lipton, D .; , SIAM J .; Applied Math. 48
: 1073 (1988). ) A commonly used method for determining identity or similarity between two sequences is the “Guide to Huge Comp”.
Uters, "Martin J. Bishop, ed., Academic Pr
ess, San Diego, (1994), and Carillo, H .; , And Lipton, D .; , SIAM J .; Applied Math. 48: 1
No. 073 (1988), but not limited thereto.
Methods for aligning polynucleotides or polypeptides are described by computer programs (GCG program package (Devereux, J., et al., Nucle.
ic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), B
LASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, SF, et al., JM.
olec. Biol. 215: 403 (1990), Bestfit prog.
ram (Wisconsin Sequence Analysis Pack)
age, Version 8 for Unix (registered trademark), Genetic
s Computer Group, University Research
Park, 575 Science Drive, Madison, WI 5
3711 (Advances in Applied Mathematics 2 using the local homology algorithm of Smith and Waterman.
: 482-489 (1981))). By a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence of the invention, the following is intended. The nucleotide sequence of the polynucleotide is identical to the reference sequence except for the following. The polynucleotide sequence comprises 100 each of the reference nucleotide sequences encoding the angiogenic polypeptide.
Up to 5 point mutations can be included per nucleotide. That is, up to 5% of the nucleotides in the reference sequence may be deleted or replaced by another nucleotide or a reference nucleotide may be obtained in order to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence which is at least 95% identical to the reference nucleotide sequence. Up to 5% of the total nucleotides within can be inserted into the reference sequence. Inquiries are SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23
, ORF (open reading frame), or any of the specific fragments described herein.

【０２２０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も
良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照される）を決定する
ための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ
．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコン
ピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ
配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴ
に変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性
パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列の
ＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝
Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒ
ｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）であ
る。As a practical matter, will any particular nucleic acid molecule or polypeptide be at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to a nucleotide sequence of the invention? Whether or not it can be determined conventionally using known computer programs. A preferred method for determining the best overall compatibility (also referred to as global sequence alignment) between a query sequence (sequence of the invention) and a subject sequence is described by Brutlag et al. (Comp. App. Biosci
． 6: 237-245 (1990)) based on the FASTDB computer program. In a sequence alignment, both the query and subject sequences are DNA sequences. RNA sequences are U to T
Can be compared by converting to. The results of this global sequence alignment are expressed as percent identity (%). The preferred parameters used in the FASTDB alignment of DNA sequences to calculate percent identity are: Matrix =
Unity, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1
, Joining Penalty = 30, Randomization Gr
up Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Pena
lty = 5, Gap Size Penalty 0.05, Windows S
size = 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter).

【０２２１】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to the 5'or 3'deletions (as opposed to due to internal deletions), manual correction must be made to the results. This is because the FASTDB program does not consider 5'and 3'truncations of the subject sequence when calculating percent identity. For a subject sequence that is cleaved at the 5'or 3'end, the percent identity to the query sequence is the 5'and 3'of the subject sequence that is not matched / aligned as a percentage of the total bases of the query sequence. Corrected by calculating the number of bases in. Whether the nucleotides are matched / aligned is determined by the results of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity and calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to arrive at the final percent identity score. This corrected score is what is used for the purposes of the present invention. Only the bases outside the 5'and 3'bases of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence, as indicated by the FASTDB alignment, are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score.

【０２２２】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment shows no match / alignment at the first 10 bases at the 5'end. 1
0 unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at the non-matching 5'and 3'ends / total number of bases in the query sequence), so 10% is FASTD
Subtracted from the percent identity score calculated by the B program.
If the remaining 90 bases were an exact match, the final percent identity would be 90%. In another example, a 90 base subject sequence is compared to a 100 base query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so that there are no bases at the 5'or 3'of the subject sequence that are not matched / aligned with the query. In this case, FASTD
The percent identity calculated by B is not manually corrected. Again, only the 5'or 3'bases of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected. No other manual correction is made for the purposes of the present invention.

【０２２３】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。An amino acid sequence of a subject polypeptide may be one in which the subject polypeptide sequence has It is intended to be identical to the query sequence, except that changes of up to 5 amino acids per 100 amino acids may be included. In other words, up to 5% of the amino acid residues in the sequence of interest are inserted, deleted, (indels) in order to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to the query amino acid sequence.
Or it may be replaced by another amino acid. These modifications of the reference sequence can occur at the amino-terminal or carboxy-terminal positions of the reference amino acid sequence, or anywhere between those terminal positions, either individually between the residues in the reference sequence or the reference sequence. Interspersed in any of one or more consecutive groups within.

【０２２４】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば表１に示されるアミノ
酸配列または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列に対
して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で
あるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来的に決定され得
る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適
合性（全体的な配列整列とも呼ばれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒ
ｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２
４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用し
て決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方と
もにヌクレオチド配列か両方ともアミノ酸配列かのいずれかである。この全体的
な配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列
において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔ
ｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅ
ｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝
０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎ
ｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方
）である。As a practical matter, any particular polypeptide will be at least 90%, 95%, 96%, 97% relative to, for example, the amino acid sequence shown in Table 1 or the amino acid sequence encoded by the deposited DNA clone. Whether it is%, 98%, or 99% identical can be conventionally determined using known computer programs. A preferred method for determining the best overall compatibility (also called global sequence alignment) between a query sequence (the sequence of the invention) and a subject sequence is Br.
utlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-2.
45) can be determined using the FASTDB computer program based on the algorithm. In a sequence alignment, the query and subject sequences are either both nucleotide sequences or both amino acid sequences. The results of this global sequence alignment are expressed as percent identity. The preferred parameters used in the FASTDB amino acid alignment are: Matrix = PAM0, kt
apple = 2, Mismatch Penalty = 1, Joining Pe
nalty = 20, Randomization Group Length =
0, Cutoff Score = 1, Window Size = sequence length, Gap
Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Win
dow Size = 500 or the length of the target amino acid sequence (whichever is shorter).

【０２２５】 対象配列が、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失のために（内部欠失のためではなく
）問い合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばなら
ない。これは、全体的同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログ
ラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端の短縮を考慮しないからである。Ｎ末端お
よびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一
性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残
基と一致／整列されない対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の
残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されるか否かは
、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは
、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され
た同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達
する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本発明の目的に使用されるも
のである。問い合わせ配列と一致／整列されない対象配列のＮ末端およびＣ末端
の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。
それは、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側の位置の問い合わ
せ残基のみである。If the subject sequence is shorter than the query sequence (rather than due to internal deletions) due to N-terminal or C-terminal deletions, a manual correction must be made to the results. This is because the FASTDB program does not consider N- and C-terminal truncations of the subject sequence when calculating the overall percent identity. For subject sequences that are truncated at the N-terminus and the C-terminus, the percent identity to the query sequence is the N-terminus of the subject sequence that is not matched / aligned with the corresponding subject residue as a percent of the total bases of the query sequence and Corrected by calculating the number of residues in the query sequence that are C-terminal. Whether the residues are matched / aligned is determined by the results of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to arrive at the final percent identity score. This final percent identity score is what is used for the purposes of the present invention. Only residues at the N- and C-termini of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence are considered for the purpose of manually adjusting the percent identity score.
It is only the query residues at positions outside the furthest N- and C-terminal residues of the subject sequence.

【０２２６】 例えば、９０アミノ酸の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１０
０残基の問い合わせ配列に整列される。欠失が、対象配列のＮ末端で生じ、従っ
て、ＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端の残基
の数／問い合わせ配列の残基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢ
プログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残
りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％であ
る。別の例では、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較さ
れる。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、対象配列のＮ末端または
Ｃ末端に問い合わせと一致／整列しない残基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴ
ＤＢによって算定された同一性パーセントは、手動では修正されない。また、Ｆ
ＡＳＴＤＢ整列に示されるように、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列
のＮ末端およびＣ末端の外側の位置の残基のみが手動で補正される。他の手動の
補正は、本発明の目的のためにはなされない。For example, a 90 amino acid subject sequence is used to determine percent identity to determine 10
Aligned to a 0 residue query sequence. Deletions occur at the N-terminus of the subject sequence, so the FASTDB alignment shows no match / alignment at the first 10 residues at the N-terminus. 1
0 unpaired residues represent 10% of the sequence (number of non-matching N- and C-terminal residues / total number of residues in the query sequence), so 10% are FASTDB
Subtracted from the percent identity score calculated by the program. If the remaining 90 bases were an exact match, the final percent identity would be 90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 residue query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion so that there are no residues at the N-terminus or C-terminus of the subject sequence that are not matched / aligned with the query. In this case, FAST
The percent identity calculated by DB is not corrected manually. Also, F
Only residues outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected, as shown in the ASTDB alignment. No other manual correction is made for the purposes of the present invention.

【０２２７】 （脈管形成ポリペプチド） 本発明はさらに、図３Ａ〜３Ｃの推測されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に
関する。Angiogenic Polypeptides The present invention further relates to polypeptides having the deduced amino acid sequences of Figures 3A-3C, as well as fragments, analogs and derivatives of such polypeptides.

【０２２８】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」は、配列番号２、４、６、８
、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４に含まれるかまたは
寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる短いアミノ酸配列
をいう。タンパク質フラグメントは、「自立（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であり得るか、またはこのフラグメントが一部もしくは領域、最も好ましくは単
一の連続する領域として形成するより大きなポリペプチド内に含まれ得る。本発
明のポリペプチドフラグメントの代表例は、例えば、およそのアミノ酸番号１〜
２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、
１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜
２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０または２８１からコ
ード領域の末端由来のフラグメントを含む。さらに、ペプチドフラグメントは、
およそ２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１
２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸長であり得る。これに関係して「お
よそ（約）」は、いずれかの末端または両方の末端で、いくつか（５、４、３、
２または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい、特に列挙された範囲を含む
（表１を参照のこと）。In the present invention, “polypeptide fragment” refers to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8
It refers to the short amino acid sequence encoded by the cDNA contained in 10, 12, 14, 16, 18, 18, 22, 22 or 24 or contained in the deposited clone. Protein fragments are "free-standing."
Or it may be contained within a larger polypeptide forming part or region of this fragment, most preferably as a single contiguous region. Representative examples of polypeptide fragments of the invention are, for example, approximately amino acid number 1 to
20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120,
121-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-
220, 221-240, 241-260, 261-280 or 281 from the end of the coding region. Furthermore, the peptide fragment is
Approximately 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 1
It can be 20, 130, 140 or 150 amino acids long. In this context, "approximately" means some (5, 4, 3,
2 or 1) amino acids larger or smaller, including the specifically listed ranges (see Table 1).

【０２２９】[0229]

【表１】 好ましいポリペプチドフラグメントは、分泌された脈管形成タンパク質ならび
にその成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末
端またはカルボキシ末端、あるいは両方からの一連の欠失した残基を有する、分
泌された脈管形成タンパク質またはその成熟形態を含む。例えば、１〜６０の範
囲の任意の数のアミノ酸は、分泌された脈管形成ポリペプチドまたは成熟形態の
いずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０の範囲の任意の数の
アミノ酸は、分泌された脈管形成タンパク質または成熟形態のカルボキシ末端か
ら欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任
意の組合せもまた、好ましい。同様に、これらの脈管形成ポリペプチドフラグメ
ントをコードするポリペプチドヌクレオチドフラグメントもまた、好ましい。[Table 1] Preferred polypeptide fragments include secreted angiogenic proteins as well as their mature forms. Further preferred polypeptide fragments include secreted angiogenic proteins or mature forms thereof with a series of deleted residues from the amino or carboxy terminus, or both. For example, any number of amino acids in the range of 1-60 can be deleted from the amino terminus of either the secreted angiogenic polypeptide or the mature form. Similarly, any number of amino acids in the range 1-30 may be deleted from the carboxy terminus of the secreted angiogenic protein or mature form. Moreover, any combination of the above amino-terminal deletions and carboxy-terminal deletions is also preferred. Similarly, polypeptide nucleotide fragments encoding these angiogenic polypeptide fragments are also preferred.

【０２３０】 構造的ドメインまたは機能的ドメインによって特徴付けられた脈管形成ポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドのフラグメントはまた、好ましい。このようなフ
ラグメントは、αへリックスおよびαへリックス形成領域、βシートおよびβシ
ート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親
水性領域、疎水性領域、α−両親媒性領域、β−両親媒性領域、可撓性領域、表
面形成領域、基質結合領域および高抗原性指標領域を含む。保存ドメインに含ま
れる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もし
くは２４のポリペプチドフラグメントは、特に本発明によって意図される（図３
Ａ〜３Ｃを参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオ
チドフラグメントもまた、意図される。Fragments of angiogenic polypeptides and polynucleotides characterized by structural or functional domains are also preferred. Such fragments include α-helix and α-helix forming regions, β-sheet and β-sheet forming regions, turns and turn-forming regions, coils and coil-forming regions, hydrophilic regions, hydrophobic regions, α-amphipathic regions. , Β-amphipathic region, flexible region, surface forming region, substrate binding region and high antigenicity indicator region. Polypeptide fragments of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24 contained in the conserved domain are specifically contemplated by the present invention (FIG. 3).
See A-3C). Moreover, polynucleotide fragments encoding these domains are also contemplated.

【０２３１】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性な脈管形成タンパク質フラグメ
ントである。生物学的に活性なフラグメントは、開示された脈管形成ポリペプチ
ドの１つの活性に同様であるが、同一である必要はない活性を発揮するフラグメ
ントである。このフラグメントの生物学的な活性は、改善された所望の活性、ま
たは減少した所望されない活性を含み得る。Other preferred fragments are biologically active angiogenic protein fragments. Biologically active fragments are fragments that exert an activity that is similar to one of the disclosed angiogenic polypeptides, but need not be the same. The biological activity of this fragment may include an improved desired activity, or a decreased undesired activity.

【０２３２】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または
合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.

【０２３３】 脈管形成ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機
能の顕著な効果を有さずに変化し得ることは、当該分野において認識される。配
列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質上の重
要な領域が存在することを覚えておくべきである。It is recognized in the art that some amino acid sequences of angiogenic polypeptides may be altered without having a significant effect on protein structure or function. If such differences in sequence are intended, it should be remembered that there are important regions on the protein that determine activity.

【０２３４】 従って、本発明はさらに、実質的な脈管形成ポリペプチド活性を示すかまたは
以下に記載されるタンパク質部分のような脈管形成タンパク質の領域を含む脈管
形成ポリペプチドの改変を含む。このような変異体は、欠失、挿入、転位（ｉｎ
ｖｅｒｓｉｏｎ）、反復および型置換を含む。上記のように、アミノ酸変化が表
現型的にサイレントであることに関する指針が、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅ
ｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）
に見出され得る。Accordingly, the invention further includes modifications of angiogenic polypeptides that exhibit substantial angiogenic polypeptide activity or include regions of angiogenic proteins such as the protein moieties described below. . Such variants include deletions, insertions, and rearrangements (in
version), iteration and type substitution. As noted above, guidelines for amino acid changes being phenotypically silent are provided by Bowie, J. et al. U. "De
ciphering the Message in Protein Seq
uences: Tolerance to Amino Acid Subst
"Motions" Science 247: 1306-1310 (1990)
Can be found in.

【０２３５】 従って、表１のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下
であり得る：（Ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸
残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）と置換されるもの（このような置換さ
れるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であっても
よく、もしくはそうでなくてもよい）、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基
が置換基を有するもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリぺプチドが別の化合物と融合
されるもの（例えば、ポリぺプチドの半減期を増加するための化合物（例えば、
ポリエチレングリコール））、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプ
チドに融合されるもの（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポ
リペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列）、または（ｖ
）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしく
は２４に示される少数のアミノ酸残基を含み、そして保存モチーフを残存しかつ
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーのポリペプチドの活性特性をなおさらに残存する
もの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示か
ら、当業者の範囲内であると考えられる。Accordingly, fragments, derivatives or analogs of the polypeptides of Table 1 can be: (I) one or more amino acid residues being conservative or non-conservative (preferably conservative). Amino acid residue) (such a substituted amino acid residue may or may not be an amino acid residue encoded by the genetic code), or (ii) 1 Having one or more amino acid residues having a substituent, or (iii) fusing the mature polypeptide with another compound (eg, a compound for increasing the half-life of the polypeptide (eg,
Polyethylene glycol)), or (iv) those in which additional amino acids are fused to the mature polypeptide (eg, leader or secretory sequences, or sequences used to purify the mature polypeptide or proprotein sequences), or (v
) Containing a small number of amino acid residues shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24, and retaining a conserved motif and poly in the VEGF / PDGF family. Those that still retain the active properties of the peptide. Such fragments, derivatives and analogs are considered to be within the skill of those in the art given the teachings herein.

【０２３６】 特に所望されることは、荷電されたアミノ酸の、別の荷電されたアミノ酸およ
び中性または負に荷電されたアミノ酸との置換である。後者は、減少された正電
荷を有するタンパク質を生じ、脈管形成タンパク質の特性を改善する。凝集の防
止が非常に所望される。薬学的処方物が調製される場合、タンパク質凝集は、活
性の減少を生じるだけでなく、問題を含む。なぜなら、凝集物は免疫原性である
からである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３
３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３
８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７
７（１９９３））。Of particular desirability is the replacement of a charged amino acid with another charged amino acid and a neutral or negatively charged amino acid. The latter results in proteins with a reduced positive charge, improving the properties of angiogenic proteins. Prevention of agglomeration is highly desirable. When a pharmaceutical formulation is prepared, protein aggregation not only results in diminished activity, but is also problematic. This is because aggregates are immunogenic (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 3.
31-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:83.
8-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therap
eutic Drug Carrier Systems 10: 307-37
7 (1993)).

【０２３７】 アミノ酸置換もまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。Ｏ
ｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、特定の
変異がＴＮＦレセプターの２つの公知の型のうちの１つのみへのＴＮＦ−αの選
択的結合を生じることを記載する。従って、本発明の脈管形成タンパク質は、天
然の変異または人為的操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失また
は付加を含み得る。Amino acid substitutions may also alter the selectivity of binding to cell surface receptors. O
Stade et al., Nature 361: 266-268 (1993) describe that certain mutations result in the selective binding of TNF-α to only one of the two known forms of the TNF receptor. Thus, the angiogenic proteins of the present invention may contain one or more amino acid substitutions, deletions or additions, either by natural mutations or artificial manipulations.

【０２３８】 示されるように、荷電は、タンパク質のフォールディングまたは活性に顕著な
効果を与えない、保存的アミノ酸置換のようなわずかな特性であることが好まし
い（表２を参照のこと）。As shown, charge is preferably a minor property, such as a conservative amino acid substitution, that does not have a significant effect on protein folding or activity (see Table 2).

【０２３９】[0239]

【表２】 もちろん、当業者が多くの因子に依存して作成するアミノ酸置換の数は、上記
のものを含む。一般には、任意の所定の脈管形成ポリペプチドについての置換の
数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３以下である。[Table 2] Of course, the number of amino acid substitutions that one of ordinary skill in the art will make will depend on many factors, including those described above. Generally, the number of substitutions for any given angiogenic polypeptide is 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 or 3 or less.

【０２４０】 機能に不可欠な本発明の脈管形成タンパク質におけるアミノ酸は、当該分野に
おいて公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング
変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：
１０８１−１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、単一
のアラニン変異を分子内のいずれもの残基に誘導する。次いで、生じた変異分子
は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロもしくはインビボ
での増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合に不可欠な部位
はまた、構造的分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識）によ
って決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９
０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３
１２（１９９２））。Amino acids in the angiogenic proteins of the invention that are essential for function can be generated by methods known in the art (eg, site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science 244:
1081-1085 (1989)). The latter procedure induces a single alanine mutation at any residue in the molecule. The resulting mutant molecule is then tested for biological activity (eg, receptor binding or proliferative activity in vitro or in vivo). Sites essential for ligand-receptor binding can also be determined by structural analysis (eg, crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling) (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-9).
04 (1992) and de Vos et al., Science 255: 306-3.
12 (1992)).

【０２４１】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは、均一にまで精製される。The polypeptides and polynucleotides of the invention are preferably provided in isolated form and are preferably purified to homogeneity.

【０２４２】 用語「単離される（された）」は、その物質が最初の環境（例えば、天然に生
じる場合はその天然の環境）から除かれることを意味する。例えば、生きている
動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離され
るではないが、天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離さ
れた同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離される。こ
のようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、そして／またはこのよ
うなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得る。そし
てこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない場合は、さ
らに単離される。The term “isolated” means that the material is removed from its original environment (eg, its natural environment if naturally occurring). For example, a naturally-occurring polynucleotide or polypeptide present in a living animal is not isolated, but is the same polynucleotide or DNA or polypeptide that is separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. The peptide is isolated. Such polynucleotides may be part of the vector, and / or such polynucleotides or polypeptides may be part of the composition. And when such a vector or composition is not part of its natural environment, it is further isolated.

【０２４３】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００
ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ以下の長
さである。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、開示され
た脈管形成タンパク質のコード配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを
含むが、特定の脈管形成タンパク質の任意のイントロンの全てまたは一部を含ま
ない。別の実施形態において、特定の脈管形成タンパク質をコードする配列を含
む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノム中の特定の脈管形成タンパク質
遺伝子の５’または３’）のコード配列を含まない。In a particular embodiment, the polynucleotide of the invention is 300 kb, 200
The length is kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb, or 7.5 kb or less. In a further embodiment, the polynucleotide of the invention comprises at least 15 contiguous nucleotides of the disclosed angiogenic protein coding sequence, but includes all or part of any intron of the particular angiogenic protein. Absent. In another embodiment, the nucleic acid comprising a sequence encoding a particular angiogenic protein does not include the coding sequence of a genomic flanking gene (ie, 5 ′ or 3 ′ of the particular angiogenic protein gene in the genome). .

【０２４４】 本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６
、１８、２０、２２もしくは２４のポリペプチド（および特にその成熟形態のポ
リペプチド）、および配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０、２２もしくは２４のポリペプチドに少なくとも７０％類似性（好ましく
は少なくとも７０％の同一性）を有するポリペプチド、および配列番号２、４、
６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４のポリペプチ
ドに少なくとも９０％類似性（好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する
ポリペプチド、およびさらにより好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１
２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４のポリペプチドに少なくとも９
５％類似性（なおさらに好ましくは少なくとも９０％同一性）を有するポリペプ
チドを含み、そして少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５
０アミノ酸を一般に含むポリペプチドのこのような部分を有するこのようなポリ
ペプチドの部分もまた含む。The polypeptides of the present invention have the sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16.
, 18, 20, 22 or 24 polypeptides (and particularly the mature form of the polypeptides), and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18
, 20, 22 or 24 polypeptides having at least 70% similarity (preferably at least 70% identity), and SEQ ID NOs: 2, 4,
Polypeptides having at least 90% similarity (preferably at least 95% identity) to 6,8,10,12,14,16,18,20,22 or 24 polypeptides, and even more preferably SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 1
At least 9 in 2, 14, 16, 18, 20, 22, or 24 polypeptides
Polypeptides having 5% similarity (even more preferably at least 90% identity), and at least 30 amino acids and more preferably at least 5 amino acids.
Also included are portions of such polypeptides that have such portions of the polypeptide that generally contain 0 amino acids.

【０２４５】 当該分野で公知のように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換と第二のポリペプチド
の配列との比較によって決定される。As is known in the art, “similarity” between two polypeptides is determined by comparing the amino acid sequence of one polypeptide and its conservative amino acid substitutions with the sequence of a second polypeptide. To be done.

【０２４６】 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対
応する全長ポリペプチドを作製するために使用され得る；従って、フラグメント
は、全長ポリペプチドを作製するための中間体として使用され得る。本発明のポ
リヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために使用され得る。A fragment or portion of a polypeptide of the invention can be used to produce the corresponding full-length polypeptide by peptide synthesis; thus, the fragment can be used as an intermediate to produce the full-length polypeptide. . Fragments or portions of the polynucleotides of the invention can be used to synthesize the full length polynucleotides of the invention.

【０２４７】 （アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失） さらに、タンパク質操作は、ネイティブな脈管形成タンパク質の１つ以上の特
性を改善または改変するために使用され得る。カルボキシ末端アミノ酸の欠失は
、タンパク質の活性を増強し得る。１例はインターフェロンγであり、このタン
パク質のカルボキシ末端から１０個のアミノ酸残基を欠失させることによって、
１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。従って、本発明の１つの
局面は、（例えば、代表的なｐＨ、温度条件または他の貯蔵条件に曝露する場合
に）ネイティブな脈管形成タンパク質に比べて増強された安定性を示すような脈
管形成タンパク質のポリペプチドアナログおよびこのようなアナログをコードす
るヌクレオチド配列を提供することである。Amino-Terminal Deletions and Carboxy-Terminal Deletions In addition, protein engineering can be used to improve or modify one or more properties of native angiogenic proteins. Deletion of the carboxy terminal amino acid may enhance the activity of the protein. One example is interferon gamma, by deleting 10 amino acid residues from the carboxy terminus of this protein,
It showed up to 10-fold higher activity (Dobeli et al., J. of Biotec.
Hnology 7: 199-216 (1988)). Accordingly, one aspect of the invention is that such a pulse exhibits enhanced stability (eg, when exposed to typical pH, temperature conditions, or other storage conditions) relative to the native angiogenic protein. To provide polypeptide analogs of tube forming proteins and nucleotide sequences encoding such analogs.

【０２４８】 Ｎ末端およびＣ末端の両方から欠失されたアミノ酸を有する欠失変異体はまた
、本発明によって含まれる。このような変異体は、以下の規定によって記載され
たＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組合せを含む。これらの組
合せは、当業者に公知の組換え技術を使用して作製され得る。Deletion variants with amino acids deleted from both the N- and C-termini are also included by the invention. Such variants include all combinations of N-terminal deletion variants and C-terminal deletion variants described by the definitions below. These combinations can be made using recombinant techniques known to those of skill in the art.

【０２４９】 特に、脈管形成ポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の一般式によって記載され
得る： １．）ｍ2〜２１１、ここで、ｍ2は、１〜２１０の整数であり、ここで、ｍ2
は、配列番号２において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに、Ｃ
末端欠失もまた、一般式１〜ｎ2によって記載され得、ここで、ｎ2は、２〜２１
１の整数であり、ここで、ｎ2は、配列番号２において同定されるアミノ酸残基
の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ末端およ
びカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これは一般的
に、配列番号２の残基ｍ2〜ｎ2を有すると記載され得、ここで、ｎ2およびｍ2は
、上記の通りの整数である。In particular, the N-terminal deletion of angiogenic polypeptides can be described by the following general formula: ) M 2 ~211, wherein, m 2 is an integer of from 1 to 210, wherein, m 2
Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 2. Furthermore, C
Terminal deletion also can be described by the general formula 1 to n 2, where, n 2 is 2 to 21
Is an integer of 1, where n 2 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 2. Furthermore, the invention also provides a polypeptide in which one or more amino acids have been deleted from both the amino and carboxyl termini, which generally comprises residues m 2 to n 2 of SEQ ID NO: 2. Can be described, where n 2 and m 2 are integers as described above.

【０２５０】 ２．）ｍ4〜２４１、ここで、ｍ4は、１〜２４０の整数であり、ここで、ｍ4
は、配列番号４において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに、Ｃ
末端欠失もまた、一般式１〜ｎ4によって記載され得、ここで、ｎ4は、２〜２４
１の整数であり、ここで、ｎ4は、配列番号４において同定されるアミノ酸残基
の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ末端およ
びカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これは一般的
に、配列番号４の残基ｍ4〜ｎ4を有すると記載され得、ここで、ｎ4およびｍ4は
、上記の通りの整数である。2. ) M 4 ~241, wherein, m 4 is an integer of 1 to 240, wherein, m 4
Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 4. Furthermore, C
Terminal deletions can also be described by the general formulas 1 to n 4 , where n 4 is 2 to 24
Is an integer of 1, where n 4 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 4. Furthermore, the invention also provides a polypeptide in which one or more amino acids have been deleted from both the amino and carboxyl termini, which generally has residues m 4 to n 4 of SEQ ID NO: 4. Can be described, where n 4 and m 4 are integers as described above.

【０２５１】 ３．）ｍ4〜１４９、ここで、ｍ6は、１〜１４８の整数であり、ここで、ｍ6
は、配列番号６において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに、Ｃ
末端欠失もまた、一般式１〜ｎ6によって記載され得、ここで、ｎ6は、２〜１４
９の整数であり、ここで、ｎ6は、配列番号６において同定されるアミノ酸残基
の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ末端およ
びカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これは一般的
に、配列番号６の残基ｍ6〜ｎ6を有すると記載され得、ここで、ｎ6およびｍ6は
、上記の通りの整数である。3. ) M 4 to 149, where m 6 is an integer from 1 to 148, where m 6
Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 6. Furthermore, C
Terminal deletion also can be described by the general formula 1 to n 6, wherein, n 6 is 2 to 14
Is an integer of 9, where n 6 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 6. Furthermore, the present invention may also include one or more amino acids providing the deleted polypeptide from both the amino and carboxyl termini, which generally as having residues m 6 ~n 6 of SEQ ID NO: 6 Can be described, where n 6 and m 6 are integers as described above.

【０２５２】 ４．）ｍ8〜１７０、ここで、ｍ8は、１〜１６９の整数であり、ここで、ｍ8
は、配列番号８において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに、Ｃ
末端欠失もまた、一般式１〜ｎ8によって記載され得、ここで、ｎ8は、２〜１７
０の整数であり、ここで、ｎ8は、配列番号８において同定されるアミノ酸残基
の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ末端およ
びカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これは一般的
に、配列番号８の残基ｍ8〜ｎ8を有すると記載され得、ここで、ｎ8およびｍ8は
、上記の通りの整数である。4. ) M 8 to 170, where, m 8 is an integer of from 1 to 169, where, m 8
Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 8. Furthermore, C
Terminal deletion also can be described by the general formula 1 to n 8, wherein, n 8 is 2 to 17
Is an integer of 0, where n 8 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 8. Furthermore, the present invention may also include one or more amino acids providing the deleted polypeptide from both the amino and carboxyl termini, which generally as having residues m 8 ~n 8 of SEQ ID NO: 8 Can be described, where n 8 and m 8 are integers as described above.

【０２５３】 ５．）ｍ10〜１９０、ここで、ｍ10は、１〜１８９の整数であり、ここで、ｍ 10 は、配列番号１０において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに
、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ10によって記載され得、ここで、ｎ10は、２
〜１９０の整数であり、ここで、ｎ10は、配列番号１０において同定されるアミ
ノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ
末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これ
は一般的に、配列番号１０の残基ｍ10〜ｎ10を有すると記載され得、ここで、ｎ 10 およびｍ10は、上記の通りの整数である。[0253]   5. ) MTen~ 190, where mTenIs an integer from 1 to 189, where m Ten Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 10. further
, C-terminal deletion also has the general formula 1-nTenCan be described by where nTenIs 2
Is an integer from ~ 190, where nTenIs the amino acid identified in SEQ ID NO: 10.
Corresponds to the position of the no acid residue. Furthermore, the present invention also provides that one or more amino acids are amino
Providing a polypeptide deleted from both the terminal and carboxyl termini, which
Is generally residue m of SEQ ID NO: 10Ten~ NTenCan be described as having n Ten And mTenIs an integer as described above.

【０２５４】 ６．）ｍ12〜１９１、ここで、ｍ12は、１〜１９０の整数であり、ここで、ｍ 12 は、配列番号１２において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに
、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ12によって記載され得、ここで、ｎ12は、２
〜１９１の整数であり、ここで、ｎ12は、配列番号１２において同定されるアミ
ノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ
末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これ
は一般的に、配列番号１２の残基ｍ12〜ｎ12を有すると記載され得、ここで、ｎ 12 およびｍ12は、上記の通りの整数である。[0254]   6. ) M12~ 191, where m12Is an integer from 1 to 190, where m 12 Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 12. further
, C-terminal deletion also has the general formula 1-n12Can be described by where n12Is 2
˜191, where n12Is the amino acid identified in SEQ ID NO: 12.
Corresponds to the position of the no acid residue. Furthermore, the present invention also provides that one or more amino acids are amino
Providing a polypeptide deleted from both the terminal and carboxyl termini, which
Is generally residue m of SEQ ID NO: 1212~ N12Can be described as having n 12 And m12Is an integer as described above.

【０２５５】 ７．）ｍ14〜２１４、ここで、ｍ14は、１〜２１３の整数であり、ここで、ｍ 14 は、配列番号１４において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに
、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ14によって記載され得、ここで、ｎ14は、２
〜２１４の整数であり、ここで、ｎ14は、配列番号１４において同定されるアミ
ノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ
末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これ
は一般的に、配列番号１４の残基ｍ14〜ｎ14を有すると記載され得、ここで、ｎ 14 およびｍ14は、上記の通りの整数である。[0255]   7. ) M14~ 214, where m14Is an integer from 1 to 213, where m 14 Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 14. further
, C-terminal deletion also has the general formula 1-n14Can be described by where n14Is 2
Is an integer from ˜214, where n14Is the amino acid identified in SEQ ID NO: 14.
Corresponds to the position of the no acid residue. Furthermore, the present invention also provides that one or more amino acids are amino
Providing a polypeptide deleted from both the terminal and carboxyl termini, which
Is generally residue m of SEQ ID NO: 1414~ N14Can be described as having n 14 And m14Is an integer as described above.

【０２５６】 ８．）ｍ16〜４１９、ここで、ｍ16は、１〜４１８の整数であり、ここで、ｍ 16 は、配列番号１６において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに
、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ16によって記載され得、ここで、ｎ16は、２
〜４１９の整数であり、ここで、ｎ16は、配列番号１６において同定されるアミ
ノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ
末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これ
は一般的に、配列番号１６の残基ｍ16〜ｎ16を有すると記載され得、ここで、ｎ 16 およびｍ16は、上記の通りの整数である。[0256]   8. ) M16~ 419, where m16Is an integer from 1 to 418, where m 16 Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 16. further
, C-terminal deletion also has the general formula 1-n16Can be described by where n16Is 2
Is an integer from ˜419, where n16Is the amino acid identified in SEQ ID NO: 16.
Corresponds to the position of the no acid residue. Furthermore, the present invention also provides that one or more amino acids are amino
Providing a polypeptide deleted from both the terminal and carboxyl termini, which
Is generally residue m of SEQ ID NO: 1616~ N16Can be described as having n 16 And m16Is an integer as described above.

【０２５７】 特に好ましいのは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｆ−３２〜Ｒ−２２６を含む
ポリペプチドフラグメント、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。また、別の好ましい実施形態は、配列番号１６のアミノ酸Ｓ−２
２８〜Ｓ−４１９を含む。また好ましいのは、これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドである。さらに、配列番号１６のポリペプチドのこのＦ−３
２〜Ｒ−２２６は好ましくは、配列番号１６のポリペプチドのＳ−２２８〜Ｓ−
４１９と会合する。会合は、リンカー（例えば、セリン、グリシン、プロリンの
連結）を介した連結による、または抗体による、ジスルフィド、共有結合または
非共有結合相互作用を通してであり得る。Particularly preferred is a polypeptide fragment comprising amino acid residues F-32 to R-226 of SEQ ID NO: 16, as well as a polynucleotide encoding this polypeptide. Yet another preferred embodiment is amino acid S-2 of SEQ ID NO: 16.
28 to S-419 are included. Also preferred are polynucleotides encoding these polypeptides. Furthermore, this F-3 of the polypeptide of SEQ ID NO: 16
2 to R-226 are preferably S-228 to S- of the polypeptide of SEQ ID NO: 16.
Meet with 419. Association may be through disulfide, covalent or non-covalent interactions, by linkage through a linker (eg, serine, glycine, proline linkage) or by an antibody.

【０２５８】 ９．）ｍ18〜２０７、ここで、ｍ18は、１〜２０６の整数であり、ここで、ｍ 18 は、配列番号１８において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに
、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ18によって記載され得、、ここで、ｎ18は、
２〜２０７の整数であり、ここでｎ18は、配列番号１８において同定されるアミ
ノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミノ
末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、これ
は一般的に、配列番号１８の残基ｍ18〜ｎ18を有すると記載され得、ここで、ｎ 18 およびｍ18は、上記の通りの整数である。[0258]   9. ) M18~ 207, where m18Is an integer from 1 to 206, where m 18 Corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 18. further
, C-terminal deletion also has the general formula 1-n18Can be described by, where n18Is
Is an integer from 2 to 207, where n18Is the amino acid identified in SEQ ID NO: 18.
Corresponds to the position of the no acid residue. Furthermore, the present invention also provides that one or more amino acids are amino
Providing a polypeptide deleted from both the terminal and carboxyl termini, which
Is generally residue m of SEQ ID NO: 1818~ N18Can be described as having n 18 And m18Is an integer as described above.

【０２５９】 １０．）ｍ20〜３２５、ここで、ｍ20は、１〜３２４の整数であり、ここで、
ｍ20は、配列番号２０において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さら
に、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ20によって記載され得、ここで、ｎ20は、
２〜３２５の整数であり、ここで、ｎ20は、配列番号２０において同定されるア
ミノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミ
ノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、こ
れは一般的に、配列番号２０の残基ｍ20〜ｎ20を有すると記載され得、ここで、
ｎ20およびｍ20は、上記の通りの整数である。10. ) M 20 to 325, where m 20 is an integer from 1 to 324, and
m 20 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 20. Furthermore, C-terminal deletions can also be described by the general formulas 1 to n 20 , where n 20 is
Is an integer from 2 to 325, where n 20 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 20. Furthermore, the invention also provides a polypeptide in which one or more amino acids have been deleted from both the amino and carboxyl termini, which generally comprises residues m 20 to n 20 of SEQ ID NO: 20. Can be described, where
n 20 and m 20 are integers as described above.

【０２６０】 １１．）ｍ22〜３５４、ここで、ｍ22は、１〜３５３の整数であり、ここで、
ｍ22は、配列番号２２において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さら
に、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ22によって記載され得、ここで、ｎ22は、
２〜３５４の整数であり、ここで、ｎ22は、配列番号２２において同定されるア
ミノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミ
ノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、こ
れは一般的に、配列番号２２の残基ｍ22〜ｎ22を有すると記載され得、ここで、
ｎ22およびｍ22は、上記の通りの整数である。11. ) M 22 ~354, wherein m 22 is an integer of from 1 to 353, where
m 22 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 22. Further, C-terminal, deletions also can be described by the general formula 1 to n 22, wherein, n 22 is
Is an integer from 2 to 354, where n 22 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 22. Furthermore, the present invention may also include one or more amino acids providing the deleted polypeptide from both the amino and carboxyl termini, which generally as having residues m 22 ~n 22 of SEQ ID NO: 22 Can be described, where
n 22 and m 22 are integers as described above.

【０２６１】 １２．）ｍ24〜１３２、ここで、ｍ24は、１〜１３１の整数であり、ここで、
ｍ24は、配列番号２４において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さら
に、Ｃ末端欠失もまた、一般式１〜ｎ24によって記載され得、ここで、ｎ24は、
２〜１３２の整数であり、ここで、ｎ24は、配列番号２４において同定されるア
ミノ酸残基の位置に対応する。さらに、本発明はまた、１以上のアミノ酸がアミ
ノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失されたポリペプチドを提供し、こ
れは一般的に、配列番号２４の残基ｍ24〜ｎ24を有すると記載され得、ここで、
ｎ24およびｍ24は、上記の通りの整数である。12. ) M 24 to 132, wherein m 24 is an integer of from 1 to 131, where
m 24 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 24. In addition, C-terminal deletions may also be described by the general formulas 1 to n 24 , where n 24 is
Is an integer from 2 to 132, where n 24 corresponds to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 24. Furthermore, the invention also provides a polypeptide in which one or more amino acids have been deleted from both the amino and carboxyl termini, which generally comprises residues m 24 to n 24 of SEQ ID NO: 24. Can be described, where
n 24 and m 24 are integers as described above.

【０２６２】 なお別の局面では、本発明によってまた、Ｎ末端残基およびＣ末端残基の両方
からアミノ酸が欠失された欠失変異体が含まれる。このような変異体は、上記の
Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせを含む。In yet another aspect, the invention also includes deletion mutants in which amino acids have been deleted from both the N-terminal residue and the C-terminal residue. Such variants include all combinations of N-terminal deletion variants and C-terminal deletion variants described above.

【０２６３】 本発明の別の局面では、開示された脈管形成ポリペプチド配列の変異体は、脈
管形成活性のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを検出するためのスクリ
ーニング剤として有用であるか、あるいはこれらは、開示された脈管形成ポリペ
プチドの脈管形成活性についてのアゴニスト剤および／またはアンタゴニスト剤
として用いられるように改変され得るか、あるいは別の薬剤（例えば、開示され
た脈管形成ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体（例えば、その結
果は、開示された脈管形成ポリペプチドの脈管形成活性についてのアゴニストお
よび／またはアンタゴニストのいずれかであり得る））と共に同時処置適用にお
いて用いられ得る。In another aspect of the invention, the disclosed variants of the angiogenic polypeptide sequences are useful as screening agents for detecting agonists and / or antagonists of angiogenic activity, or Can be modified to be used as an agonist and / or antagonist agent for the angiogenic activity of the disclosed angiogenic polypeptide, or can be modified by another agent (eg, to the disclosed angiogenic polypeptide). Can be used in a co-treatment application with a monoclonal antibody (eg, the result of which can be either an agonist and / or an antagonist of the angiogenic activity of the disclosed angiogenic polypeptides) specific for the same. .

【０２６４】 本発明の別の局面では、本発明の他の参照および開示された脈管形成ポリペプ
チドのフラグメント（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０、２２、または２４）は生成されて、開示された脈管形成ポリペプチドの
活性を調節する、アゴニスト薬剤および／またはアンタゴニスト薬剤として有用
であり得る変異体を生じ得る。さらに、これらのポリペプチド変異体を、同時処
置適用において別の薬剤（例えば、開示された脈管形成ポリペプチドについて特
異的なモノクローナル抗体）とともに用いて、例えば、特定の所望の活性を増強
または低減し得る。In another aspect of the invention, fragments of other reference and disclosed angiogenic polypeptides of the invention (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18).
, 20, 22 or 24) can be generated to give variants that may be useful as agonist and / or antagonist agents that modulate the activity of the disclosed angiogenic polypeptides. In addition, these polypeptide variants may be used in co-treatment applications with another agent (eg, a monoclonal antibody specific for the disclosed angiogenic polypeptides) to, for example, enhance or reduce certain desired activities. You can

【０２６５】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意
味する；これは、コード領域の前の領域およびコード領域の後の領域（リーダー
およびトレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ））、ならびに個々のコードセグメント（エ
キソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。[0265] The term "gene" means the segment of DNA involved in the production of polypeptide chains; that is, the region before the coding region and the region after the coding region (leader and trailer), and It contains intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons).

【０２６６】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１
または２３に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメ
ントによって、本明細書中に考察される診断プローブおよびプライマーとして有
用である、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ
、なおさらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少
なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。もちろん、５０、７５
、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００
、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５
、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０
、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５
、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、
１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１
３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５
２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５または１６５０ｎｔの長さのよ
り大きなフラグメントもまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５
、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド配列の、全てでない場合
、大部分に対応するフラグメントと同様に、本発明によって有用である。例えば
、少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、配列番号１、３、５、７
、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド
配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。この文脈
では、「約」は、いずれかの末端または両方の末端で、いくつか（５、４、３、
２または１）のヌクレオチドがより大きいかまたはより小さい、特に引用される
範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードする。The present invention further relates to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21
Or at least about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, useful as a diagnostic probe and primer as discussed herein, with a fragment of the isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence set forth in 23.
, Even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt long fragments are contemplated. Of course 50, 75
, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300
325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525
550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750
, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975
, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150,
1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1
350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 15
Larger fragments of 25, 1550, 1575, 1600, 1625 or 1650 nt in length are also SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
, 17, 19, 21 or 23 are useful according to the invention, as are the fragments corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequences shown. For example, with fragments of at least 20 nt in length, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7
, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 are intended to be fragments containing 20 or more contiguous bases from the nucleotide sequence shown. In this context, "about" means some (5, 4, 3,
2 or 1) inclusive of the specifically quoted ranges, larger or smaller nucleotides. Preferably, these fragments encode a polypeptide having biological activity.

【０２６７】 本発明の全長遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイ
ブリダイゼーションプローブとして用いられて、全長のｃＤＮＡを単離し得、そ
してこの遺伝子に対して高い配列類似性を有するかまたは類似の生物学的活性を
有する他のｃＤＮＡを単離し得る。この型のプローブは好ましくは、少なくとも
３０塩基を有し、そして例えば、５０以上の塩基を含み得る。このプローブをま
た用いて、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域もしくは
プロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノム
クローンを同定し得る。スクリーニングの例は、公知のＤＮＡ配列を用いてオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成することによって遺伝子のコード領域を単離する
ことを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌ
クレオチドを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリ
ーがスクリーニングされて、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリ
ダイズするかが決定される。Fragments of the full-length gene of the present invention can be used as hybridization probes for cDNA libraries to isolate full-length cDNAs and have high sequence similarity to this gene or similar organisms. Other cDNAs with biological activity can be isolated. This type of probe preferably has at least 30 bases and can include, for example, 50 or more bases. This probe can also be used to identify cDNA clones corresponding to full length transcripts as well as genomic clones containing the complete gene including regulatory or promoter regions, exons and introns. An example of a screen involves isolating the coding region of a gene by synthesizing an oligonucleotide probe with a known DNA sequence. Using a labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention, a library of human cDNA, genomic DNA or mRNA is screened to determine which member of the library the probe hybridizes to. It is determined.

【０２６８】 （融合タンパク質） 任意の開示される脈管形成ポリペプチドを用いて、融合タンパク質を作製し得
る。例えば、脈管形成ポリペプチドは、第２のタンパク質に融合された場合、抗
原性タグとして用いられ得る。脈管形成ポリペプチドに対して惹起された抗体を
用いて、脈管形成ポリペプチドに結合することによって、第２のタンパク質を間
接的に検出し得る。さらに、分泌タンパク質は、輸送シグナルに基づいて細胞位
置を標的化するので、脈管形成ポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合され
ると、標的化分子として用いられ得る。Fusion Proteins Any of the disclosed angiogenic polypeptides can be used to make fusion proteins. For example, the angiogenic polypeptide can be used as an antigenic tag when fused to a second protein. Antibodies raised against the angiogenic polypeptide can be used to indirectly detect the second protein by binding to the angiogenic polypeptide. Moreover, since secreted proteins target cell locations based on transport signals, angiogenic polypeptides, once fused to other proteins, can be used as targeting molecules.

【０２６９】 開示された脈管形成ポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナ
ル配列だけでなく、他の異種の機能的領域もまた含む。融合体は、直接的である
ことをかならずしも必要としないが、リンカー配列を通して生じ得る。Examples of domains that can be fused to the disclosed angiogenic polypeptides include not only heterologous signal sequences, but also other heterologous functional regions. The fusion does not necessarily need to be direct, but can occur through linker sequences.

【０２７０】 さらに、融合タンパク質はまた、１以上の開示された脈管形成ポリペプチドの
特徴を改善するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電した
アミノ酸）の領域は、脈管形成ポリペプチドのＮ末端に対して添加されて、宿主
細胞からの精製の間またはその後の取り扱いおよび保存の間の安定性および持続
性を改善し得る。また、ペプチド部分は、開示された脈管形成ポリペプチドのい
ずれかに添加されて、精製を容易にし得る。このような領域は、特定の脈管形成
ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容
易にするペプチド部分の添加は、当該分野で周知でありそして慣用的な技術であ
る。In addition, fusion proteins can also be engineered to improve the characteristics of one or more of the disclosed angiogenic polypeptides. For example, a region of additional amino acids (especially charged amino acids) may be added to the N-terminus of an angiogenic polypeptide to provide stability and persistence during purification from host cells or subsequent handling and storage. Can be improved. Also, peptide moieties can be added to any of the disclosed angiogenic polypeptides to facilitate purification. Such regions may be removed prior to final preparation of the particular angiogenic polypeptide. Addition of peptide moieties to facilitate handling of polypeptides is well known and routine in the art.

【０２７１】 さらに、開示された脈管形成ポリペプチド（フラグメントおよび特にエピトー
プを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と合わされて、
キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そ
してインビボで増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリ
ペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する（ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８））。ジスルフィド結合された二量体構造（ＩｇＧに起因する）
を有する融合タンパク質はまた、他の分子に結合しそしてこの分子を中和する際
に、モノマー分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも効率的で
あり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５
８−３９６４（１９９５））。Further, the disclosed angiogenic polypeptides, including fragments and particularly epitopes, are combined with portions of the constant domain of immunoglobulins (IgG),
Chimeric polypeptides can be produced. These fusion proteins facilitate purification and exhibit increased half-life in vivo. One reported example describes a chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4 polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of mammalian immunoglobulins (EP
A 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-.
86 (1988)). Disulfide-bonded dimer structure (due to IgG)
A fusion protein with a protein may also be more efficient at binding to and neutralizing other molecules than monomeric secretory proteins or protein fragments alone (Funtoulakis et al., J. Biochem. 270: 395.
8-3964 (1995)).

【０２７２】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応２０４５８６９）は、
別のヒトタンパク質またはその一部とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の
種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質にお
けるＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改善さ
れた薬物動態学的特性をもたらし得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるい
は、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後にＦｃ部分を欠
失することが所望される。例えば、Ｆｃ部分は、融合タンパク質が免疫のための
抗原として用いられる場合、治療および診断を妨害し得る。薬物の探索では、例
えば、ヒトタンパク質（例えば、ｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニスト
を同定する、高スループットスクリーニングアッセイを目的として、Ｆｃ部分と
融合された（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉ
ｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。Similarly, EP-A-O 464 533 (Canadian counterpart 2045869)
Disclosed are fusion proteins that include various portions of the constant regions of immunoglobulin molecules, along with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc part in the fusion protein may be beneficial in therapy and diagnosis, thus leading to, for example, improved pharmacokinetic properties (EP-A 0232 262). Alternatively, it may be desirable to delete the Fc portion after the fusion protein has been expressed, detected and purified. For example, the Fc portion can interfere with therapy and diagnosis when the fusion protein is used as an antigen for immunization. In drug searches, for example, human proteins (eg, hIL-5) were fused to the Fc portion for the purpose of high throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5 (D. Bennett et al., J. Molecular). Recogni
8: 52-58 (1995); Johnson et al. Bio
l. Chem. 270: 9459-9471 (1995)).

【０２７３】 さらに、開示された脈管形成ポリペプチドは、マーカー配列（例えば、特定の
脈管形成ポリペプチドの精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい
実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペ
プチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏ
ｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供さ
れるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例
えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合
タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグ
である「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトー
プに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。Further, the disclosed angiogenic polypeptides can be fused to a marker sequence (eg, a peptide that facilitates purification of a particular angiogenic polypeptide). In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is, inter alia, a hexa-histidine peptide (eg pQE vector (QIAGEN, Inc., 9259 Eto.
n Avenue, Chatsworth, CA, 91311), and many of these marker amino acid sequences are commercially available. For example, Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
Hexa-histidine provides convenient purification of the fusion protein, as described in 821-824 (1989). Another peptide tag useful for purification, the "HA" tag, corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)).

【０２７４】 従って、これら上記の融合物のうちのいずれかは、開示された脈管形成ポリヌ
クレオチドまたは脈管形成ポリペプチドを使用して操作され得る。Accordingly, any of these above fusions may be engineered using the disclosed angiogenic polynucleotides or angiogenic polypeptides.

【０２７５】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、開示された脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの産生に関す
る。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベ
クター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは
、複製能があってもよいし、または複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイ
ルス増殖は、一般に、補完的な宿主細胞においてのみ起こる。Vectors and Host Cells The present invention also relates to vectors containing the disclosed angiogenic protein-encoding polynucleotides, host cells, and recombinantly produced polypeptides. The vector can be, for example, a phage vector, a plasmid vector, a viral vector, or a retroviral vector. The retroviral vector may be replication competent or replication defective. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing host cells.

【０２７６】 開示された脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主中での
増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミド
ベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電した脂質との
複合体において導入される。このベクターがウイルスである場合、これは、適切
なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得、次いで
宿主細胞に形質導入され得る。Polynucleotides encoding the disclosed angiogenic proteins can be ligated into a vector containing a selectable marker for growth in a host. Generally, the plasmid vector is introduced in a precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or in complex with a charged lipid. If the vector is a virus, it can be packaged in vitro using a suitable packaging cell line and then transduced into host cells.

【０２７７】 開示された目的の脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド挿入物は
、いくつかの名前を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌ
ａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏ
Ａプロモーター、およびＥ．ｃｏｌｉ ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロ
モーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプ
ロモーターのような、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。
他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のた
めの部位、転写終結のための部位、および転写された領域において、翻訳のため
のリボソーム結合部位をさらに含む。この構築物によって発現される転写物のコ
ード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めの翻訳開始コドンおよ
び翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧ
ＡまたはＵＡＧ）を含む。The disclosed polynucleotide inserts encoding angiogenic proteins of interest are phage λPL promoter, E. coli, to name a few. coli l
ac promoter, E. E. coli trp promoter, E. coli. coli pho
A promoter, and E. It should be operably linked to a suitable promoter, such as the E. coli tac promoter, the SV40 early promoter and the SV40 late promoter, and the promoter of the retroviral LTR.
Other suitable promoters are known to those of skill in the art. The expression construct further comprises a site for transcription initiation, a site for transcription termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the transcript expressed by this construct is preferably the translation initiation codon at the beginning of the translated polypeptide and a stop codon appropriately located at the end of the translated polypeptide (UAA, UG).
A or UAG).

【０２７８】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細
胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞
およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、
ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細
胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養
培地および条件は当該分野で公知である。As indicated, the expression vector preferably contains at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase, G418, or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and E. coli. coli
For culturing in and other bacteria, a tetracycline resistance gene, a kanamycin resistance gene, or an ampicillin resistance gene can be mentioned. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli cells, Streptomyces.
s cells, and Salmonella typhimurium cells); fungal cells (eg yeast cells); insect cells (eg Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9 cells); animal cells (eg CHO cells,
COS cells, 293 cells, and Bowes melanoma cells); as well as plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the above-described host cells are known in the art.

【０２７９】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、お
よびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−
３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの
中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳ
Ｇ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベ
クターは、当業者に容易に明らかである。Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE60, and pQE-9 (available from QIAGEN, Inc.); pBluescri.
pt vector, Phasescript vector, pNH8A, pNH16a,
pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems)
tems, Inc. ); And ptrc99a, pKK223-.
3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Bi
otech, Inc. Available from). Among the preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (
(Available from Stratagene); and pSVK3, pBPV, pMS
G, and pSVL (available from Pharmacia). Other suitable vectors will be readily apparent to those of skill in the art.

【０２８０】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
る（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。開示された脈管形成ポリペプチドが、
組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際に発現され得ることが特に意図され
る。Introduction of the construct into the host cell is carried out by calcium phosphate transfection, DE
It can be provided by AE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davis et al., Basic Methods In Molecu.
lar Biology (1986)). The disclosed angiogenic polypeptides include
It is specifically contemplated that it may actually be expressed by a host cell that lacks the recombinant vector.

【０２８１】 開示された脈管形成ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール
沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換
え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、精製のために、高
速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。The disclosed angiogenic polypeptides can be ammonium sulfate or ethanol precipitated, acid extracted, anion exchange or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite. It can be recovered and purified from recombinant cell culture by well known methods including chromatography, and lectin chromatography. Most preferably high performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification.

【０２８２】 開示された脈管形成ポリペプチド（好ましくは分泌形態）はまた、以下から回
収され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織お
よび細胞を含む天然の供給源から精製された産物；化学的合成手順の産物；なら
びに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物
細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生され
た産物。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、開示された脈管形成ポリ
ペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。
さらに、開示された脈管形成ポリペプチドはまた、いくつかの場合において、宿
主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従
って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべ
ての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去される
ことは当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質におけるＮ末端メチ
オニンもまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかの
タンパク質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結
合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。The disclosed angiogenic polypeptides, preferably in secreted form, can also be recovered from: Natural sources, including body fluids, tissues and cells, whether directly isolated or cultured. Products purified from sources; products of chemical synthetic procedures; and recombinant techniques from prokaryotic or eukaryotic hosts, including, for example, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells. The product produced by. Depending on the host used in a recombinant production procedure, the disclosed angiogenic polypeptides may be glycosylated or non-glycosylated.
In addition, the disclosed angiogenic polypeptides may also, in some cases, include an initial modified methionine residue as a result of host-mediated processes. Therefore, it is well known in the art that, in general, the N-terminal methionine encoded by the translation initiation codon is highly efficiently removed from any post-translational protein in all eukaryotic cells. The N-terminal methionine in most proteins is also efficiently removed in most prokaryotes, but for some proteins this prokaryotic removal process depends on the nature of the amino acids to which the N-terminal methionine is covalently attached. And is inefficient.

【０２８３】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、脈管形成タンパク質コ
ード配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明
の開示された脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連
結され、そして開示された脈管形成タンパク質をコードする内因性のポリヌクレ
オチドを活性化、変更、および／または増幅する、遺伝物質（例えば、異種ポリ
ヌクレオチド配列）を含むように操作されている。例えば、当該分野で公知の技
術は、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／また
はエンハンサー）ならびに開示された脈管形成タンパク質配列をコードする内因
性ポリヌクレオチドを作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９
７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月
２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日
に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９
８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それらの全体が参考として援用さ
れる）。In addition to including host cells that include the vector constructs discussed herein, the present invention also includes primar (primarily mammalian) vertebrate sources.
y) Includes host cells, secondary host cells, and immortalized host cells. These host cells have been engineered to delete or replace endogenous genetic material (eg, angiogenic protein coding sequences) and / or encode the disclosed angiogenic proteins of the invention. To include genetic material (eg, a heterologous polynucleotide sequence) that is operably linked to the polynucleotide and that activates, alters, and / or amplifies the endogenous polynucleotide encoding the disclosed angiogenic proteins. Is being operated by. For example, techniques known in the art operatively link heterologous regulatory regions (eg, promoters and / or enhancers) and endogenous polynucleotides encoding the disclosed angiogenic protein sequences via homologous recombination. Can be used to (eg, 199
US Patent No. 5,641,670 issued June 24, 1995; International Publication No. WO 96/29411 published September 26, 1996; International published August 4, 1994 Publication WO 94/12650; Koller et al., Proc.
． Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989).
); And Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (19).
89). Each of these disclosures is incorporated by reference in its entirety).

【０２８４】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、
本発明の脈管形成ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド
合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸また
は化学的アミノ酸アナログが、置換または付加として、脈管形成タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以
下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−
ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸
、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪
酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロ
キシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−
ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メ
チルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般の
アミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり
得る。Further, the polypeptides of the present invention can be chemically synthesized using techniques known in the art (eg, Creighton, 1983, Proteins: Stru).
cultures and Molecular Principles, W.C. H.
Freeman & Co. , N .; Y. And Hunkapiller, M .; Et al., 1984, Nature 310: 105-111). For example,
Peptides corresponding to fragments of the angiogenic polypeptides of the present invention can be synthesized by using a peptide synthesizer. Furthermore, if desired, nonclassical amino acids or chemical amino acid analogs can be introduced as a substitution or addition into the polynucleotide sequence encoding the angiogenic protein. Non-classical amino acids include, but are not limited to, the normal amino acid D isomer, 2,4-
Diaminobutyric acid, a-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, g-Abu, e-Ahx, 6-aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropionic acid, ornithine, norleucine , Norvaline, hydroxyproline, sarcosine, citrulline, homocitrulline, cysteic acid, t-
Butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, b-alanine, fluoroamino acids, designer amino acids (eg, b-methyl amino acids), Ca-methyl amino acids, Na-methyl amino acids, and common amino acid analogs. In addition, the amino acids can be D (dextrorotatory) or L (levorotatory).

【０２８５】 本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の
保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子また
は他の細胞リガンドとの結合などによって、翻訳の間または翻訳後に示差的に修
飾される脈管形成ポリペプチドを含む。任意の多数の化学修飾が公知の技術（臭
化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢ
Ｈ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマ
イシンの存在下での代謝的合成などが含まれるがこれらに限定されない）によっ
て実行され得る。The invention can be used, for example, by glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, conjugation to antibody molecules or other cellular ligands, and the like. It includes angiogenic polypeptides that are differentially modified during or after translation. Any number of chemical modifications are known in the art (cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaB
Specific chemical cleavage by H 4 ; acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin, and the like).

【０２８６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型また
はＯ結合型の炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原
核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が、
例えば挙げられる。このポリペプチドはまた、酵素標識、蛍光標識、放射性同位
元素標識、またはアフィニティー標識のような検出可能な標識で修飾され、タン
パク質の検出および単離を可能にし得る。Further post-translational modifications encompassed by the present invention include, for example, N-linked or O-linked carbohydrate chains, N- or C-terminal processing, attachment of chemical moieties to amino acid backbones, N-linked or O-linked. Chemical modification of linked carbohydrate chains, and addition or deletion of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression,
For example: The polypeptide may also be modified with a detectable label such as an enzymatic label, a fluorescent label, a radioisotope label, or an affinity label to allow detection and isolation of the protein.

【０２８７】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、脈管形成ポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこ
の分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分
を含み得る。The present invention also provides chemically modified derivatives of angiogenic polypeptides that may provide additional benefits, such as increased solubility, stability and circulation time of the polypeptide, or decreased immunogenicity. (See US Pat. No. 4,179,337). The chemical moieties for derivatization can be selected from water soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like. The polypeptide may be modified at random positions within the molecule or at predetermined positions within the molecule and may contain one, two, three or more attached chemical moieties.

【０２８８】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつ
かの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを
示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時
間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または抗原性の欠失、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエ
チレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。The polymer can be a polymer of any molecular weight and can be branched or unbranched. With respect to polyethylene glycol, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa (the term “about”) for polyethylene glycol preparations, due to ease of handling and manufacturing. Are shown to be heavier than the indicated molecular weight and some are less than the indicated molecular weight). The desired therapeutic profile (eg, desired sustained release duration, effect on biological activity, if any, ease of handling, degree of antigenicity or lack of antigenicity, and therapeutic protein or analog). Other sizes may be used, depending on other known effects of polyethylene glycol).

【０２８９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to the protein in view of its effect on the functional or antigenic domains of the protein. There are numerous coupling methods available to those of skill in the art (eg, EP 0 401 384 (G-CSF, incorporated herein by reference).
To PEG), Malik et al., Exp. Hematol. 20: 102
8-1035 (1992) (tresyl chloride)
Report also the PEGylation of GM-CSF with). For example, polyethylene glycol can be covalently attached to an amino acid residue via a reactive group, such as a free amino or carboxyl group. Reactive groups are groups to which activated polyethylene glycol molecules can be attached. The amino acid residue having a free amino group may include a lysine residue and an N-terminal amino acid residue; the amino acid residue having a free carboxyl group may include an aspartic acid residue, a glutamic acid residue and a C-terminal amino acid residue. Residues may be mentioned. Sulfhydryl residues are also
It can be used as a reactive group for attaching polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is a bond at the amino group, eg at the N-terminus or at the lysine group.

【０２９０】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。Proteins that are chemically modified at the N-terminus may be particularly desirable. Using polyethylene glycol as an example of the composition of the present invention, the ratio of polyethylene glycol molecules to protein (polypeptide) molecules in the reaction mixture should be performed from various polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.). The type of PEGylation reaction and method of obtaining the selected N-terminal PEGylated protein can be selected. The method of obtaining the N-terminal PEGylated preparation (ie, separating this moiety from other mono-PEGylated moieties, if necessary) is performed by purification of the N-terminal PEGylated material from a population of PEGylated protein molecules. obtain. The selective protein chemically modified by N-terminal modification is
It can be achieved by reductive alkylation, which takes advantage of the differential reactivity of different types of primary amino groups (lysine vs. N-terminus) available for derivatization in a particular protein. Under appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of proteins at the N-terminus with a carbonyl group-containing polymer is achieved.

【０２９１】 本発明の脈管形成ポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量体、
三量体、四量体およびより高度の多量体）であり得る。従って、本発明は、単量
体および多量体の本発明の開示された脈管形成ポリペプチド、それらの調製物お
よびそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実施形態
では、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。
さらなる実施形態では、本発明の多量体は、少なくとも二量体、少なくとも三量
体、または少なくとも四量体である。Angiogenic polypeptides of the present invention may be monomeric or multimeric (ie, dimers,
Trimers, tetramers and higher multimers). Accordingly, the invention relates to monomeric and multimeric disclosed angiogenic polypeptides of the invention, their preparations and compositions (preferably pharmaceutical compositions) containing them. In particular embodiments, the polypeptides of the invention are monomers, dimers, trimers or tetramers.
In a further embodiment, the multimers of the invention are at least dimers, at least trimers, or at least tetramers.

【０２９２】 本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本
明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明の脈管形成ポリペプチドの
みを含む多量体（本明細書中に記載される脈管形成タンパク質フラグメント、改
変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む）をいう。これらの
ホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有する脈管形成ポリペプチドを含
み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、開示された脈管形成タンパ
ク質のうち１つの同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含む多量体で
ある。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有
する脈管形成ポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形態では、本発明の
多量体は、ホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有する脈管形
成ポリペプチドを含む）またはホモ三量体（例えば、同一および／または異なる
アミノ酸配列を有する脈管形成ポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態
では、本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三
量体または少なくともホモ四量体である。Multimers encompassed by the present invention can be homomers or heteromers. As used herein, the term homomer refers to a multimer comprising only angiogenic polypeptides of the invention (angiogenic protein fragments, variants, splicing variants, and fusions described herein). (Including protein). These homomers can include angiogenic polypeptides having the same or different amino acid sequences. In certain embodiments, homomers of the invention are multimers that include only polypeptides having the same amino acid sequence of one of the disclosed angiogenic proteins. In another particular embodiment, the homomers of the invention are multimers that include angiogenic polypeptides having different amino acid sequences. In certain embodiments, the multimers of the invention are homodimers (eg, including angiogenic polypeptides having the same or different amino acid sequences) or homotrimers (eg, the same and / or different amino acid sequences). Including angiogenic polypeptides). In a further embodiment, the homomeric multimers of the invention are at least homodimers, at least homotrimers or at least homotetramers.

【０２９３】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明の脈管形成ポリペ
プチドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質の
ポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施形態では、本発明の多量体は、
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体
または少なくともホモ四量体である。The term heteromer, as used herein, refers to a multimer comprising one or more heterologous polypeptides (ie, polypeptides of different proteins) in addition to the angiogenic polypeptide of the invention. Say. In a particular embodiment, the multimers of the invention are
It is a heterodimer, a heterotrimer or a heterotetramer. In a further embodiment, the homomeric multimers of the invention are at least homodimers, at least homotrimers or at least homotetramers.

【０２９４】 本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合性の
結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間接的
に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明の多量体（例えば、ホモ
二量体またはホモ三量体など）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触
する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロ多量体（例えば、ヘ
テロ三量体またはヘテロ四量体など）は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本
発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペ
プチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形成される。他の実施形態
では、本発明の多量体は、本発明の脈管形成ポリペプチドとの、および／または
本発明の脈管形成ポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような
共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０、２２、または２４に列挙されるポリペプチド配列）
中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネ
イティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリ
ペプチド配列内に位置するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この
共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような
共有結合は、脈管形成融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれ
る、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タ
ンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載される
ような）本発明の脈管形成ポリヌクレオチド−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異
種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共
有結合した多量体を形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメン
バー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例
えば、国際公開第ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと）など）由来の異種ポリペプチド配列間
にある。The multimers of the invention can be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic and / or covalent linkages, and / or can be indirectly linked, for example by liposome formation. Thus, in one embodiment, multimers of the invention (eg, homodimers or homotrimers, etc.) are formed when the polypeptides of the invention contact each other in solution. In another embodiment, a heteromultimer of the invention (eg, a heterotrimer or heterotetramer, etc.) is a polypeptide of the invention in solution in which the antibody to the polypeptide of the invention (of the invention Formed when contacted with antibodies (including antibodies against heterologous polypeptide sequences in a fusion protein). In other embodiments, the multimers of the invention are formed by covalent attachment to and / or between angiogenic polypeptides of the invention. Such covalent linkages may be obtained by polypeptide sequence (eg, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12).
, 14, 16, 18, 20, 22, or 24).
It may include one or more amino acid residues contained therein. In one example, the covalent bond is a bridge between cysteine residues located within the interacting polypeptide sequence in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In another example, this covalent bond is the result of chemical or recombinant manipulation. Alternatively, such a covalent bond may comprise one or more amino acid residues contained in the heterologous polypeptide sequence in the angiogenic fusion protein. In one example, the covalent bond is between the heterologous sequences contained in the fusion protein of the invention (eg, US Pat. No. 5,478,925).
See No.). In a particular example, the covalent bond is between a heterologous sequence contained in an angiogenic polynucleotide-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another particular example, the covalent attachment of a fusion protein of the invention may be accomplished by the formation of another TNF family ligand / receptor member (eg, osteoprotegerin) (eg, International Publication No. WO. 98/49305, the contents of which are incorporated herein by reference in its entirety).

【０２９５】 本発明の多量体は、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば
、本発明の多量体中に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公
知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得
る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書
中でその全体が参考として援用される）。さらに、本発明の多量体は、多量体中
に含まれることが所望されるポリペプチドの配列中に位置するシステイン残基間
に１つ以上の分子間架橋を形成するために、当該分野で公知の技術を用いて生成
され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本
明細書中でその全体が参考として援用される）。さらに、本発明のポリペプチド
は、そのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付
加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１つ以上のこ
れらの改変したポリペプチドを含む多量体を生成するために適用され得る（例え
ば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその
全体が参考として援用される）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明の多
量体に含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成する
ように適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、
これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。The multimers of the invention can be produced using chemical techniques known in the art. For example, the polypeptides desired to be included in the multimers of the present invention can be chemically crosslinked using linker molecules and linker molecule length optimization techniques known in the art (eg, US Pat. , 478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety). Furthermore, the multimers of the invention are known in the art to form one or more intermolecular bridges between cysteine residues located in the sequence of the polypeptide desired to be included in the multimer. (See, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety). Furthermore, the polypeptides of the present invention may be routinely modified by the addition of cysteine or biotin to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide, and techniques known in the art modified one or more of these. It can be applied to generate multimers containing polypeptides (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety). In addition, techniques known in the art can be applied to produce liposomes containing the polypeptide components desired to be included in the multimers of the invention (see, eg, US Pat. No. 5,478,925). See
Which is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０２９６】 あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子工学技術を用いて生成
され得る。１つの実施形態において、本発明の多量体中に含まれるポリペプチド
は、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の融合タンパク
質技術を用いて組換え的に産生される（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。特
定の実施形態において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプ
チドをコードする配列に連結し、次いで、もともとのＣ末端からＮ末端（リーダ
ー配列を欠く）へと逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌク
レオチドに、さらに連結することによって生成される（例えば、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援
用される）。別の実施形態において、本明細書中に記載されるかまたはさもなく
ば当該分野で公知の組換え技術が適用されて、膜貫通ドメイン（あるいは疎水性
ペプチドまたはシグナルペプチド）を含む本発明の組換えポリペプチドを生成し
、そしてこれは、膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る（例えば、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体
が参考として援用される）。Alternatively, the multimers of the present invention can be produced using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the polypeptides comprised in the multimers of the invention are recombinantly produced using the fusion protein techniques described herein or otherwise known in the art. (For example, US Pat. No. 5,478,925.
No., which is hereby incorporated by reference in its entirety). In a particular embodiment, the polynucleotide encoding the homodimer of the invention is
A polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention is ligated to a sequence encoding a linker polypeptide and then the translation product of the polypeptide is transferred in the reverse direction from the original C-terminus to the N-terminus (lacking the leader sequence). Produced by further ligation to a synthetic polynucleotide that encodes (eg, US Pat.
478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In another embodiment, recombinant techniques described herein or otherwise known in the art have been applied to include a set of the invention comprising a transmembrane domain (or hydrophobic peptide or signal peptide). A modified polypeptide, which can be incorporated into liposomes by membrane reconstitution techniques (eg,
See US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety).

【０２９７】 （脈管形成ポリペプチドの生物学的活性） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストをアッセイに
使用して、１つ以上の生物学的活性について試験し得る。脈管形成ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのアゴニストもしくはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示す
場合、脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドはその生物学的活性に関連
した疾患に関与し得るようである。従って、脈管形成ポリペプチドを使用して、
関連した疾患を処置し得る。以下に記述した生物学的活性は、脈管形成タンパク
質の「所望の活性」に含まれる。Biological Activity of Angiogenic Polypeptides Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used in an assay for one or more biological processes. Can be tested for biological activity. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are active in a particular assay, the angiogenic polynucleotides or polypeptides are associated with a disease associated with their biological activity. Seems to be involved in. Therefore, using angiogenic polypeptides,
Related diseases can be treated. The biological activities described below are included in the "desired activity" of an angiogenic protein.

【０２９８】 （免疫活性） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫細胞
の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免
疫系の欠損または障害の処置において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ば
れるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、
好中球およびマクロファージ）ならびにリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリン
パ球）を生成する。これら免疫の欠損または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓ
ｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、後天的（例えば
、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患ま
たは障害のマーカーまたはディテクターとして使用され得る。(Immune Activity) Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, activate or inhibit the proliferation, differentiation, or recruitment (chemotactic) of immune cells. By doing so, it may be useful in the treatment of immune system deficiencies or disorders. Immune cells develop through a process called hematopoiesis, from pluripotent stem cells to myeloid cells (platelets, red blood cells,
It produces neutrophils and macrophages) and lymphoid cells (B and T lymphocytes). The etiology of these immune deficiencies or disorders may be genetic, physical (s
may be acquired (eg, cancer or some autoimmune disorder), acquired (eg, due to chemotherapy or toxin) or infectious. Further, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used as markers or detectors of certain immune system diseases or disorders.

【０２９９】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞
の欠損または障害の処置または検出において有用であり得る。脈管形成ポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の
造血細胞の減少に関連した障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造
血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。免疫学的欠損症候群
の例としては、血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガン
マグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジ
ョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リ
ンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィス
コット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙
げられるが、これらに限定されない。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be useful in treating or detecting hematopoietic cell defects or disorders. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are pluripotent in attempts to treat disorders associated with the reduction of certain (or many) types of hematopoietic cells. It can be used to increase the differentiation and proliferation of hematopoietic cells, including stem cells. Examples of immunological deficiency syndromes include blood protein disorders (eg, agammaglobulinemia, hypogammaglobulinemia), ataxia-telangiectasia, unclassified immunodeficiency, Di George syndrome, HIV infection, HTLV-BLV infection, leukocyte adhesion deficiency syndrome, lymphopenia, phagocytic bactericidal dysfunction, severe combined immunodeficiency (SCID), viscot-oldrich disorder, anemia, thrombocytopenia, or hemoglobinuria. , But not limited to these.

【０３００】 さらに、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストをま
た使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）
を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大にすることにより、
脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、血
液凝固障害（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板障害（例えば
、血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置し
得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る脈管形成ポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、凝血を阻害または溶
解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作または瘢痕の処置において
、重要であり得る。In addition, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, may also be used to induce hemostatic activity (stop bleeding) or thrombolytic activity (clot formation). )
Can be adjusted. For example, by increasing hemostatic or thrombolytic activity,
Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are used to impair blood coagulation (eg, fibrinogenemia, factor deficiency), blood platelet disorders (eg, , Thrombocytopenia), or wounds resulting from trauma, surgery or other causes. Alternatively, angiogenic polynucleotides or polypeptides that can reduce hemostatic or thrombolytic activity, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to inhibit or lyse blood clots. These molecules may be important in the treatment of heart attack (infarction), stroke or scarring.

【０３０１】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、自己
免疫障害の処置または検出において、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、
免疫細胞によって、自己を外来性物質として不適切に認識することから生じる。
この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って
、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害し得る脈管形成ポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の防止
において効果的な治療であり得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, may also be useful in treating or detecting autoimmune disorders. Many autoimmune disorders
It results from inappropriate recognition of self as a foreign substance by immune cells.
This improper recognition triggers an immune response that results in the destruction of host tissue. Therefore, administration of angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, capable of inhibiting the immune response, particularly T cell proliferation, differentiation or chemotaxis, is associated with autoimmune disorders. It can be an effective treatment in prevention.

【０３０２】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ライ
ター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス
、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、お
よび自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、これらに限定されない。Examples of autoimmune disorders that may be treated or detected include Addison's disease, hemolytic anemia, antiphospholipid syndrome, rheumatoid arthritis, dermatitis, allergic encephalomyelitis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, Graves. Disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, neuritis, ophthalmitis, bullous pemphigoid, pemphigus, multiple endocrine disorders, purpura, Reiter's disease, Stiffman syndrome, autoimmune thyroiditis, systemic Lupus erythematosus, autoimmune pulmonary inflammation, Guyan-Barre syndrome, insulin-dependent diabetes mellitus, and autoimmune inflammatory eye disease.

【０３０３】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、脈管形成ポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る。さらに、これらの分子を使
用して、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症または血液型不適合性を
処置し得る。Similarly, asthma (particularly allergic asthma) or other respiratory problems,
Allergic reactions and conditions can also be treated with angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides. In addition, these molecules may be used to treat anaphylaxis, hypersensitivity to antigenic molecules or blood group incompatibility.

【０３０４】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用し
て、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または防止し
得る。器官拒絶は、免疫応答を介する移植組織の宿主免疫細胞破壊によって起こ
る。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与しているが、この場合、外来性の
移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または
走化性を阻害する、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは
脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニ
ストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る
。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are also used to treat and / or prevent organ rejection or graft versus host disease (GVHD). obtain. Organ rejection occurs by host immune cell destruction of transplanted tissue via an immune response. Similarly, the immune response is also involved in GVHD, where foreign transplanted immune cells destroy host tissue. Administration of angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, that inhibit the immune response, particularly T cell proliferation, differentiation or chemotaxis, prevents organ rejection or GVHD Can be an effective treatment in.

【０３０５】 同様に、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストをま
た使用して、炎症を調節し得る。例えば、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害
し得る。これらの分子を使用して、感染に関連する炎症（例えば、敗血症ショッ
ク、敗血症、もしくは全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関
連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超
急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカイン
が誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病ま
たはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症
を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し得る。Similarly, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, may also be used to modulate inflammation. For example, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can inhibit proliferation and differentiation of cells involved in the inflammatory response. Using these molecules, infection-related inflammation (eg, septic shock, sepsis, or systemic inflammatory response syndrome (SIRS)), ischemia-reperfusion injury-related inflammation, endotoxin lethal-related inflammation, arthritis Inflammation associated with, inflammation associated with complement-mediated hyperacute rejection, inflammation associated with nephritis, inflammation associated with cytokine- or chemokine-induced lung injury, inflammation associated with inflammatory bowel disease, Crohn's disease or cytokine ( For example, inflammatory conditions, both chronic and acute, can be treated, including inflammation resulting from overproduction of TNF or IL-1).

【０３０６】 （過増殖障害） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、
新生物を含む過増殖障害を処置または検出し得る。脈管形成ポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、直接的または間接的な相互作用を介して
この障害の増殖を阻害し得る。あるいは、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、過増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。Hyperproliferative Disorders Using angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides,
Hyperproliferative disorders, including neoplasms, can be treated or detected. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can inhibit the growth of this disorder through direct or indirect interactions. Alternatively, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can proliferate other cells that can inhibit hyperproliferative disorders.

【０３０７】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過増殖障害の抗原性の質を増大させ
ることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、
過増殖障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答
を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免
疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過増殖障害を処置する方
法であり得る。For example, by increasing the immune response, in particular by increasing the antigenic quality of the hyperproliferative disorder, or by proliferating, differentiating or recruiting T cells.
Hyperproliferative disorders can be treated. This immune response can be augmented by either enhancing an existing immune response or initiating a new immune response. Alternatively, reducing the immune response may also be a method of treating hyperproliferative disorders, such as chemotherapeutic agents.

【０３０８】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置
または検出され得る過増殖障害の例としては、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵
臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、
眼、頭および首、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、
脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限
定されない。Examples of hyperproliferative disorders that may be treated or detected by angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides include abdomen, bone, breast, digestive system, liver, Pancreas, peritoneum, endocrine glands (adrenal gland, parathyroid gland, pituitary gland, testis, ovary, thymus, thyroid gland),
Eyes, head and neck, nerves (central and peripheral), lymphatic system, pelvis, skin, soft tissue,
Includes, but is not limited to, neoplasms located in the spleen, thorax, and genitourinary organs.

【０３０９】 同様に、他の過増殖障害もまた、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、あるいは脈管形成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアゴニストもし
くはアンタゴニストにより処置または検出され得る。このような過増殖障害の例
としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障害、パラプロテイン血症、紫
斑病、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症
、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過増殖疾患、さらに上記に列挙さ
れている器官系に位置している新生物が挙げられるが、これらに限定されない。Similarly, other hyperproliferative disorders can also be treated or detected with angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides. Examples of such hyperproliferative disorders include hypergammaglobulinemia, lymphoproliferative disorders, paraproteinemia, purpura, sarcoidosis, Sézary syndrome, Waldenstrom macroglobulinemia, Goscher's disease, histiocytes Proliferative diseases, and any other hyperproliferative disease, as well as neoplasms located in the organ systems listed above, are not limited.

【０３１０】 （心臓血管障害） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは脈管形成ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、
四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障害を処置し得る。Cardiovascular disorders Using angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides,
Cardiovascular disorders may be treated, including peripheral arterial disease such as limb ischemia.

【０３１１】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。Cardiovascular disorders include arterio-arterial fistulas.
stula), arteriovenous fistula, cerebral arteriovenous birth defects, congenital heart defects (congeni)
cardiovascular abnormalities such as tal heart defects, pulmonary valve atresia, and Scimitar syndrome. Congenital heart defects include aortic coarctation, tricentric heart, coronary vessel anomalies
, Cross heart, right thoracic heart, patent ductus arteri
oss), Ebstein's anomaly, Eisenmenger complex, left ventricular underdevelopment syndrome, left thoracic heart, tetralogy of Fallot, transposition of the great arteries, bilateral right ventricle origin, tricuspid valve closure, residual arterial canal , And heart septal deficiency
ts) (e.g., aortopulmonary separation)
eptal defect, endocardial bed deficiency, Luthambache syndrome, trilogy of Fallot, ventricular heart septal defect (ventricular heart sep
tal defects)).

【０３１２】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。Cardiovascular disorders also include arrhythmias, carcinoid heart disease, high cardiac output (hi
gh cardiac output, low cardiac output (low cardiac)
output), cardiac tamponade, endocarditis (including bacterial), cardiac aneurysm,
Cardiac arrest, congestive heart failure, congestive cardiomyopathy, paroxysmal dyspnea, edema, cardiac hypertrophy, congestive cardiomyopathy, left ventricular hypertrophy, right ventricular hypertrophy, post-infarction (post-inf)
arcion heart rupture), ventricular septal rupture, heart valve disease,
Myocardial disease, myocardial ischemia, endocardial effusion, epicarditis (including infarct and tuberculosis),
Pneumopericardial disease, postpericardiotomy syndrome, right heart disease, rheumatic heart disease, ventricular dysfunction, hyperemia, cardiovascular pregnancy complications
and heart diseases such as scimitar syndrome, cardiovascular syphilis, and cardiovascular tuberculosis.

【０３１３】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。The arrhythmia includes sinus arrhythmia, atrial fibrillation, atrial flutter, bradycardia, premature contraction, Adams-Stokes syndrome, leg block, sinoatrial block, long QT syndrome (long).
QT syndrome), collateral contraction, Lone-Ganning-Levine syndrome, Maheme-type pre-excita
tion syndrome), Wolff-Parkinson-White syndrome, sinus dysfunction syndrome, tachycardia, and ventricular fibrillation. As tachycardia, paroxysmal tachycardia,
Supraventricular tachycardia, ventricular intrinsic rhythm promotion, atrioventricular nodal reentry tachycardia (atrioventri
circular nodal reentry tachycardia), ectopic atrial tachycardia, ectopic junction tachycardia, sinoatrial nodal reentry tachycardia
dal reentry tachycardia), sinus tachycardia, torsade
De pointe, and ventricular tachycardia.

【０３１４】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。Heart valve diseases include aortic insufficiency, aortic stenosis, and murmur (hea).
r murmurs), aortic valve prolapse, mitral valve prolapse, tricuspid valve prolapse, mitral valve dysfunction, mitral valve stenosis, pulmonary valve atresia, pulmonary valve dysfunction, pulmonary valve stenosis, tricuspid Includes atresia, tricuspid dysfunction, and tricuspid stenosis.

【０３１５】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。Cardiomyopathy includes alcoholic cardiomyopathy, congestive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, subvalvular aortic stenosis, subvalvular pulmonary stenosis, restricted cardiomyopathy, Chagas cardiomyopathy, intracardiac Membrane fibroelasticity, endocardial myocardial fibrosis, Keens syndrome, myocardial reperfusion injury, and myocarditis.

【０３１６】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。Myocardial ischemia includes angina, coronary aneurysm, coronary atherosclerosis, coronary thrombosis, coronary vasospasm, myocardial infarction, and myocardial stunnin.
g) such as coronary artery disease.

【０３１７】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。Cardiovascular diseases also include aneurysms, angiogenesis, hemangiomatosis, bacterial hemangiopathies, Hippel-Lindau Disease.
), Klipel-Tornone-Weber syndrome, Sturgi-Weber syndrome,
Vasomotor edema, aortic disease, Takayasu arteritis, aortitis, Leuriche syndrome,
Arterial occlusive disease, arteritis, arteritis, polyarteritis nodosa, cerebrovascular disease, diabetic vasculopathy, diabetic retinopathy, embolism, thrombosis, erythromelalgia, hemorrhoids, liver Venous obstruction disorder, hypertension, hypotension, ischemia, peripheral vascular disorder, phlebitis, pulmonary vein occlusion disease, hypertension, hypotension, ischemia, peripheral vascular disease, phlebitis, pulmonary vein occlusion disease, Raynaud's disease, CREST syndrome, Retinal vein occlusion, Scimitar syndrome, superior vena cava syndrome, telangiectasia, ataxia tela
vascular diseases such as hereditary hemorrhagic telangiectasia, varicocele, varicose veins, varicose ulcers, vasculitis, and venous insufficiency.

【０３１８】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。Aneurysms include dissecting aneurysms, pseudoaneurysms, infected aneurysms, ruptured aneurysms, aortic aneurysms, cerebral aneurysms, coronary aneurysms, cardiac aneurysms, and iliac aneurysms. Is mentioned.

【０３１９】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。Arterial occlusion disease includes arteriosclerosis, intermittent claudication, carotid stenosis, fibromuscular dysplasia, mesenteric vascular occlusion, Moyamoya disease, renal artery occlusion, retinal artery occlusion, and occlusive thrombosis. Sexual vasculitis.

【０３２０】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。Cerebrovascular disorders include carotid artery disease, cerebral amyloid angiopathy, cerebral aneurysm, cerebral anoxia, cerebral arteriosclerosis, cerebral arteriovenous congenital abnormality, cerebral artery disease, cerebral embolism and thrombosis, Carotid artery thrombosis, sinus thrombosis, Wallenberg syndrome, cerebral hemorrhage, epidural hematoma, subdural hematoma, subarachnoid hemorrhage
Morrage), cerebral infarction, cerebral ischemia (including transient), subclavian stealing syndrome, periventricular leukomalac
ia), vascular headache, cluster headache, migraine, and vertebro.
basallar) dysfunction.

【０３２１】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。Embolisms include air embolisms, amniotic fluid embolisms, cholesterol embolisms, toe cyanosis syndrome, fat embolisms, pulmonary embolisms, and thromboembolisms. As thrombosis, coronary artery thrombosis, hepatic vein thrombosis, retinal vein occlusion, carotid artery thrombosis,
Includes sinus thrombosis, Wallenberg syndrome, and thrombophlebitis.

【０３２２】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。Ischemia includes cerebral ischemia, ischemic colitis, and partition syndrome (compartme).
nt syndrome, anterior compar
ment syndrome), myocardial ischemia, reperfusion injury, and peripheral limb ischemia. Vasculitis includes aortitis, arteritis, Behcet.
t) Syndrome, Churg-Strauss Syndrome, Mucocutaneous Lymph Node Syndrome, Obstructive Thrombotic Vasculitis, Hypersensitivity Vasculitis, Schoenline-Henoho Purpura (Schoenl)
ein-Henoch purpura), allergic cutaneous vasculitis and Wegener's granulomatosis.

【０３２３】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、危険な四
肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効である。実施例において示さ
れるように、実験的に誘導された虚血ウサギ後肢への脈管形成ポリヌクレオチド
およびポリペプチドの投与は、血圧比、血流、血管造影的スコア、および毛細管
密度を回復し得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are particularly effective for the treatment of dangerous limb ischemia and coronary artery disease. As shown in the Examples, experimentally induced administration of angiogenic polynucleotides and polypeptides to the hindlimb of ischemic rabbits can restore blood pressure ratio, blood flow, angiographic score, and capillary density. .

【０３２４】 脈管形成ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与さ
れ得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局
所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、
ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または
坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル
送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知
である。脈管形成ポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、薬学的組成物
の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でよ
り詳細に記載される。Angiogenic polypeptides can be administered using any method known in the art, including direct needle injection at the site of delivery, intravenous injection, topical administration, catheter infusion. , Biolistic injection, particle accelerator,
Gel foam sponge depots, other commercial depot substances, osmotic pumps, oral or suppository solid pharmaceutical formulations, intra-operative decanting or topical application, aerosol delivery include, but are not limited to. Such methods are known in the art. Angiogenic polypeptides can be administered as part of a pharmaceutical composition, described in more detail below. Methods of delivering polynucleotides are described in more detail herein.

【０３２５】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移を含む異常な新生血管形成、
関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬により支配される。例えば、Ｍｏｓ
ｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら
、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａ
ｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（
１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．
Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋ
ｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を
参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態
に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有
意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。Anti-Angiogenic Activity The naturally occurring equilibrium between endogenous stimulators and inhibitors of angiogenesis is the equilibrium in which the inhibitory effects predominate. Rastinejad et al., Cell 5
6: 345-355 (1989). In rare cases where neovascularization occurs under normal physiological conditions (eg, wound healing, organ regeneration, embryogenesis, and female reproductive processes), angiogenesis is tightly regulated and spatial and temporal. It is specified. Conditions for pathological angiogenesis (eg, characterizing solid tumor growth)
Below, there is no control over these adjustments. Unregulated angiogenesis becomes pathological and maintains the progression of many neoplastic and non-neoplastic diseases. Many serious diseases are caused by abnormal neovascularization, including solid tumor growth and metastasis.
It is dominated by arthritis, some types of eye disorders, and psoriasis. For example, Mos
es et al., Biotech. 9: 630-634 (1991); Folkman et al., N. et al. Engl. J. Med. 333: 1757-1763 (1995); A
uerbach et al. Microvasc. Res. 29: 401-411 (
1985); Folkman, Advances in Cancer Res.
Edit, Klein and Weinhouse, Academic Pr
ess, New York, pp. 175-203 (1985); Patz, Am.
J. Opthalmol. 94: 715-743 (1982); and Folk.
See review by man et al., Science 221: 719-725 (1983). In many pathological conditions, the process of angiogenesis contributes to the disease state. For example, significant data has been accumulated that suggests that solid tumor growth depends on angiogenesis. Folkman and Klagsbrun, Sc
ience 235: 442-447 (1987).

【０３２６】 本発明は、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストの
投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニス
トを用いて処置し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾
患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害
の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌ
ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照の
こと）が挙げられるが、これらに限定されない。The present invention provides for the treatment of diseases or disorders associated with neovascularization by the administration of angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides. Malignant and metastatic conditions that can be treated with the polynucleotides and polypeptides of the invention, or agonists or antagonists, include malignant diseases, solid tumors, and cancers described herein, as well as others known in the art. (For a review of such disorders, see Fishman et al., Medicine, 2nd Edition, JBL.
ippincott Co. , Philadelphia (1985)), but is not limited thereto.

【０３２７】 本発明の脈管形成ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（脈管形成アゴニスト
および／またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関
連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新
生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未
熟児網膜症、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、
および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａ
ｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧ
ａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８
）による総説を参照のこと。Ocular disorders associated with neovascularization that can be treated with the angiogenic polynucleotides and polypeptides of the present invention, including angiogenic agonists and / or antagonists, include: Without limitation: neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, retinoblastoma, post lens fibroplasia, uveitis, retinopathy of prematurity, corneal transplant neovascularization, as well as other inflammatory diseases of the eye, ocular tumor,
And diseases associated with choroidal or iris neovascularization. For example, Waltma
n et al., Am. J. Ophthal. 85: 704-710 (1978) and G.
artner et al., Surv. Ophthal. 22: 291 to 312 (1978)
) See the review article.

【０３２８】 さらに、本発明の脈管形成ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（脈管形成ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）で処置され得る障害としては、
以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維
腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性
瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群
、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。Further, disorders that can be treated with the angiogenic polynucleotides and polypeptides of the present invention (including angiogenic agonists and / or antagonists) include:
These include but are not limited to: hemangiomas, arthritis, psoriasis, angiofibromas, atherosclerotic plaques, delayed wound healing, granulation, hemophilic joints, hyperplastic scars, pseudoarthral fractures, and Aussler. -Osler-Weber syndrome, pyogenic granuloma, scleroderma, trachoma, and vascular adhesion.

【０３２９】 さらに、本発明の脈管形成ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（脈管形成ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）で処置され得る障害および／ま
たは状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血
液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポー
ジ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、およ
び化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿
病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体
後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉ
ｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロ
イド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状
側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇
形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管
形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆
粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、
胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例え
ば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）と
しての新脈管形成を有する疾患、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）。 （細胞レベルでの疾患） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置
または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患
には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン
依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫
、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫
、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌
、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自
己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁
性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病
、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性
関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイ
ルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、なら
びに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の脈管
形成ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に
上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を
阻害するために使用される。Further, disorders and / or conditions that may be treated with the angiogenic polynucleotides and polypeptides of the present invention, including angiogenic agonists and / or antagonists, include, but are not limited to: : Solid tumors, blood born tumors (eg leukemia), tumor metastases, Kaposi's sarcoma, benign tumors (eg hemangiomas, acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma and purulent granulomas), chronic joints Rheumatism, psoriasis, ocular angiogenic disorders (eg, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, macular degeneration, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, post lens fibroplasia, rubeosis, retinoblastoma, and uveal membrane) Flame (uvieti
s)), delayed wound healing, endometriosis, angiogenesis, granulation, hyperplastic scar (keloid), pseudoarticular fracture, scleroderma, trachoma, vascular adhesion, myocardial angiogenesis, coronary Collaterals, cerebral collaterals, arteriovenous malformations, ischemic extremity angiogenesis, Austler-Weber syndrome, plaque neovascularization, telangiectasia, hemophilic joints, angiofibromas, Fibromuscular dysplasia, wound granulation, Crohn's disease, atherosclerosis, birth control drugs (to control menstruation,
By preventing angiogenesis necessary for embryo implantation, a consequence of pathogenicity (eg, disease with angiogenesis as cat scratch disease (Rochele minalia quintosa), ulcer (Helicobacter pylor).
i), Bartonellosis and bacterial hemangiomas). Diseases at the cellular level Diseases associated with increased cell survival or inhibition of apoptosis that can be treated or detected by angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides include: Cancer (eg, follicular lymphoma, carcinoma with p53 mutation, and hormone-dependent tumor, which are: colon cancer, heart tumor, pancreatic cancer, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, lung cancer, intestine Cancer, testicular cancer, gastric cancer, neuroblastoma, myxoma, myoma, lymphoma, endothelial tumor, osteoblastoma, giant cell tumor of the bone, osteosarcoma, chondrosarcoma, adenoma, breast cancer, prostate cancer, Kaposi's sarcoma and ovary Cancer, including but not limited to; autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto thyroiditis, gall) Juvenile cirrhosis, Behcet's disease, Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-related glomerulonephritis and rheumatoid arthritis) and viral infections (eg herpesvirus, poxvirus and adenovirus), Inflammation, graft versus host disease, acute graft rejection, as well as chronic graft rejection. In a preferred embodiment, the angiogenic polynucleotides, polypeptides, and / or antagonists of the invention are used to inhibit the growth, progression, and / or metastasis of cancer, particularly those listed above. It

【０３３０】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置
あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、
悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げら
れるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白
血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および
赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性
）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例え
ば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマ
クログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線
維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮
肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫
、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓
癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺
癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細
胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精
巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄
芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、
乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、お
よび網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。Additional diseases or conditions associated with increased cell survival that can be treated or detected by angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides include:
Malignant disease progression and / or metastasis and related disorders such as, but not limited to, leukemia (acute leukemia (eg, acute lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia (myeloblastic, promyelocytic, promyelocytic). Including leukemia, myelomonocytic, monocytic and erythroleukemia) and chronic leukemia (eg chronic myelogenous (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia), polycythemia vera, lymphoma (Eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's disease), multiple myeloma, Waldenstrom macroglobulinemia, heavy chain disease, and solid tumors (sarcomas and carcinomas (eg, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma). , Osteogenic sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendothelioma, periosteoma, mesothelioma, Tumors, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary gland Cancer, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchial carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung cancer, small cell lung cancer, Bladder cancer, epithelial cancer, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pineocytoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma,
(Including but not limited to oligodendrogliomas, menangiomas, melanomas, neuroblastomas, and retinoblastomas)).

【０３３１】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置
あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられ
る：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋
萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した
疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状
腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、
クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎な
らびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、
対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じ
るようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆
汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性
肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック
、悪液質ならびに食欲不振。Diseases associated with increased apoptosis that can be treated or detected by angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, include: AIDS; neurodegeneration Disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration and brain tumors or previously associated disorders); autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto) Thyroiditis, biliary cirrhosis, Behcet's disease,
Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-related glomerulonephritis and rheumatoid arthritis), myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia),
Graft-versus-host disease, ischemic injury (such as that caused by myocardial infarction, stroke and reperfusion injury), liver injury (eg hepatitis-related liver injury, ischemia / reperfusion injury, cholestosis ( Bile duct injury) and liver cancer); toxic-induced liver disease (as caused by alcohol), septic shock, cachexia and anorexia.

【０３３２】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト
もしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために
上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生およ
び皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するためのプロセスが提供される。脈
管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を含む創
傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創
傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷
、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ
滞潰瘍、熱への曝露または化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態
（例えば、***、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法
および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症）
。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドもしくはポリペプチド、また
は脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタ
ゴニストは、皮膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。Wound Healing and Epithelial Cell Proliferation According to yet a further aspect of the invention, an angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of an angiogenic polynucleotide or polypeptide, for therapeutic purposes, eg, Processes are provided for utilization to stimulate epithelial cell proliferation and basal keratinocytes for the purpose of wound healing, as well as to stimulate hair follicle production and skin wound healing. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be clinically useful in stimulating wound healing, including: surgical wounds, excisional wounds, Deep wounds (including dermal and epidermal damage), ocular tissue wounds, tooth tissue wounds, oral wounds, diabetic ulcers, skin ulcers, elbow ulcers, arterial ulcers, venous stasis ulcers, fever Exposure to or chemical burns, and other abnormal wound healing conditions (eg, uremia, malnutrition, vitamin deficiency, and systemic treatment with steroids, radiotherapy and antineoplastic drugs and antimetabolites). Related complications)
. Angiogenic polynucleotides or polypeptides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to promote skin recovery after skin loss.

【０３３３】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（
ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の接着を増大するため、および創傷床から
の再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、脈管形成ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのア
ゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への接着を増大するために使用され得る
、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ
）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、
無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚
胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片
、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異
種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａ
ｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−テ
ィールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植
片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植
皮片、分層皮膚移植片。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管
形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト
は、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用
され得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used in wound bed (
It can be used to increase the adhesion of skin grafts to the wound bed and to stimulate re-epithelialization from the wound bed. The following are types of implants in which angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides can be used to increase adhesion to the wound bed: autograft, Artificial skin, allograft
), Autograft, autoepdermographic graft,
Avascular graft, Blair-Brown graft, bone graft, embryonic tissue graft, dermal graft, delayed graft, skin graft, epidermal graft, fascia graft, full-thickness skin graft. , Xenografts, xenografts, homografts
ft), proliferative implants, lamellar implants, reticular implants, mucosal implants, Olie-Tielsch implants, omental grafts, patch implants, stalk implants, whole. Layered grafts, split-thickness skin grafts, split-thickness skin grafts. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides can be used to promote skin strength and improve the appearance of aged skin.

【０３３４】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、
および肺、***、膵臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および
大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。脈管形成ポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チドのアゴニストまたはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅ
ｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐ
ｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚
、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。脈
管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチドもし
くはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラチノサ
イト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can also induce hepatocyte proliferation,
And is thought to result in changes in epithelial cell proliferation in the lung, breast, pancreas, stomach, small intesting, and colon. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can bind to epithelial cells (eg, sebocytes (se
follicles, hair follicles, liver parenchymal cells, alveolar epithelial cells type II p
neuocytes, mucin-producing goblet cells, and other epithelial cells, and their progenitors contained in the skin, lungs, liver, and gastrointestinal tract). Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides can promote proliferation of endothelial cells, keratinocytes, and basal keratinocytes.

【０３３５】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストはまた、照射、化学療
法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用さ
れ得る。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、小腸粘膜上
で細胞保護的な効果を有し得る。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタ
ゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉ
ｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides can also be used to reduce the toxic side effects of intestine resulting from irradiation, chemotherapy treatments or viral infections. . Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides may have a cytoprotective effect on the small intestinal mucosa. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides may also be associated with mucositis resulting from chemotherapy and viral infections.
This can stimulate healing of the tis) (oral mucosa).

【０３３６】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全
なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、
汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさら
に使用され得る。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、表
皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼
痛性の水疱を生じる下にある真皮に対する表皮の接着における欠損）を処置する
ために使用され得る。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形
成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは
また、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならび
により迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるた
めに使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎
）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って
、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面
化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、およ
び炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。脈管形成ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの
アゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘膜の産生に対
して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取されたかまたは
外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
のアゴニストまたはアンタゴニストは、脈管形成ポリペプチドの発現下に関連す
る疾患を処置するために使用され得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, provide sufficient regeneration of the skin in full and partial thickness skin defects, including burns (ie, Hair follicles,
Sweat glands, and regrowth of the sebaceous glands), and other skin defects such as psoriasis. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, cause epidermolysis bullosa, a frequent open and painful blistering by promoting re-epithelialization of these lesions It can be used to treat defects in the adhesion of the epidermis to the underlying dermis). Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, also treat gastric and duodenal ulcers, and scar formation of the mucosal lining and more rapid glandular and duodenal mucosa. Can be used to help healing by regeneration of the inner lining of. Inflammatory bowel disease (eg, Coulomb's disease and ulcerative colitis) are diseases that result in the disruption of the mucosal surface of the small or large intestine, respectively. Accordingly, angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, promote resurfacing of mucosal surfaces to aid in faster healing and in the inflammatory bowel. It can be used to prevent the progression of the disease. Treatment with angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides is expected to have a significant effect on mucosal production throughout the gastrointestinal tract, and , Can be used to protect against harmful substances that have been ingested or after surgery. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides can be used to treat diseases associated with the expression of angiogenic polypeptides.

【０３３７】 さらに、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る
。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、急性また
は慢性の肺損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そし
て肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば
、気管支上皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞
の進行性の損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から
生じる）は、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを
使用して効果的に処置され得る。また、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するた
めに使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮
迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防することを助
け得る。Further, the angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of the angiogenic polynucleotide or polypeptide,
It can be used to prevent and cure damage to the lungs due to various pathological conditions. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can stimulate proliferation and differentiation to prevent or treat acute or chronic lung injury, and alveoli and It may promote repair of bronchiola epithelium. For example, emphysema (which results in the progressive loss of alveoli) and inhalation injuries (ie, resulting from smoke inhalation and burns), which results in necrosis of bronchial epithelium and aveoli, are angiogenic. Polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be effectively treated. Also, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to stimulate the proliferation and differentiation of alveolar epithelial cell type II, which is immature. It can help treat or prevent diseases such as hyaline membrane disease in infants (eg, infant respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia).

【０３３８】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、肝実質細
胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝臓疾患および病状（例えば、
肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセ
トアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、
および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処
置するために使用され得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can stimulate hepatocyte proliferation and differentiation, and, thus, liver diseases and conditions (eg,
Fulminant liver failure caused by cirrhosis, hepatitis virus and toxic substances (ie acetaminophen, carbon tetrachloride,
And other known in the art hepatic toxins) resulting in liver damage).

【０３３９】 さらに、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病
およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくつかの島細胞機能が残って
いる場合、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
その疾患の持続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持
するために使用され得る。また、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしく
はアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植におけ
る補助として使用され得る。Further, the angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of the angiogenic polynucleotide or polypeptide,
It can be used to treat or prevent the onset of diabetes mellitus. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, in patients newly diagnosed with type I diabetes and type II diabetes if some islet cell function remains Is
It can be used to maintain the islet function so as to alleviate, delay or prevent the persistent onset of the disease. Also, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used as an adjunct in islet cell transplantation to improve or promote islet cell function.

【０３４０】 （感染性疾患） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、感染因子
を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させること
によって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させること
によって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させ
るか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あ
るいは、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた
、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。Infectious Diseases Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to treat or detect infectious agents. For example, infectious diseases can be treated by increasing the immune response, particularly by increasing the proliferation and differentiation of B and / or T cells. The immune response can be elevated by either raising an existing immune response or initiating a new immune response. Alternatively, the angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of the angiogenic polynucleotide or polypeptide, may also directly inhibit the infectious agent without necessarily eliciting an immune response.

【０３４１】 ウイルスは、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形
成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニスト
により処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例
である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウ
イルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイル
ス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイル
ス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コ
ロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウ
イルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）
、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイ
ルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば
、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス
科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（
例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、
レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これら
の科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または
症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）
、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型
、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例えば、
ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎
、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚
病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。脈管形成ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ドのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾
患が処置または検出され得る。A virus is an example of an infectious agent that can cause a disease or condition that can be treated or detected by an angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of an angiogenic polynucleotide or polypeptide. Examples of viruses include, but are not limited to, the following DNA and RNA viruses and viridae: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Calcivirus. Family, Sarcoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae (hepatitis), Herpesviridae (eg cytomegalovirus, herpes simplex, herpes zoster)
, Mononegavirus (for example, Paramyxoviridae, measles virus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (for example, influenza), Papovaviridae, Parvoviridae, Picornavirus, Poxviridae (for example, , Smallpox or vaccinia), Reoviridae (
For example, rotavirus), retroviridae (HTLV-I, HTLV-II,
Lentivirus), and Togaviridae (eg, Rubivirus). Viruses that enter these families can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: arthritis, bronchiolitis.
, Encephalitis, ocular infections (eg conjunctivitis, keratitis), chronic fatigue syndrome, hepatitis (A, B, C, E, chronic active, delta), meningitis, opportunistic infections (eg ,
AIDS), pneumonia, Burkitt lymphoma, chickenpox, hemorrhagic fever, measles, mumps, parainfluenza, rabies, common cold, polio, leukemia, rubella, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, capoge, warts), And viremia. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to treat or detect any of these conditions or diseases.

【０３４２】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ脈管形成ポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのア
ゴニストもしくはアンタゴニストによって処置または検出され得る細菌性因子あ
るいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科なら
びに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例
えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒ
ｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例え
ば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａ
ｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、
Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、
Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉ
ａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔ
ｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅ
ａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒ
ｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、およびＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃａｌ、。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに
限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（
結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連
した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例
えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラ
チフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテ
リア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹
、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅ
ｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、***症、創傷感染症。脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの
症状もしくは疾患を処置または検出し得る。Similarly, a bacterial or fungal agent that can cause a disease or condition and that can be treated or detected by an angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of an angiogenic polynucleotide or polypeptide is , But not limited to the following Gram-negative and Gram-positive bacteria and bacteria families and fungi: Actinomycetales (eg, Corynebacterium, Mycobacterium, Nor.
cardia), Aspergillosis, Bacilraceae (eg, Anthrax, Clostridium), Bacteroidacea
e, Blastomycosis, Bordetella, Borrelia,
Brucellosis, Candidiasis, Campylobacter
r, Coccidioidomycosis, Cryptococcosis,
Dermatocycleses, Enterobacteriaceae (Kl
ebsiella, Salmonella, Serratia, Yersini
a), Erysipelothrix, Helicobacter, Legio
nellosis, Leptospirosis, Listeria, Myco
plasmales, Neisseriaceae (eg, Acinet
obter, Gonorrhea, Menigococcal), Past
eurellacea infections (eg Actinobacillus, He
amophilus, Pasteurella), Pseudomonas, R
ickettsiaceae, Chlamydiaceae, and Staph
ylococcal ,. These bacterial or fungal families can cause diseases or conditions including, but not limited to: bacteremia, endocarditis, eye infections (
Conjunctivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis, opportunistic infections (eg, AIDS-related infections), periungual inflammation, prosthesis-related infections, Reiter's disease, respiratory tract infections (eg, pertussis or empyema), sepsis , Lyme disease, cat scratch disease, dysentery, paratyphoid fever, food poisoning, typhoid fever, pneumonia, gonorrhea, meningitis, chlamydia, syphilis, diphtheria, lei disease, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulinum poisoning, gangrene, tetanus, impetigo Rash, rheumatic fever, scarlet fever, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg cellulitis, dermatomycosis (de)
rmatocycles)), toxemia, urinary tract infection, wound infection. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to treat or detect any of these conditions or diseases.

【０３４３】 さらに、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストによ
り処置または検出され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状として
は以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメー
バ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症
（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛
虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノ
ソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症。これらの寄生生
物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得
る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛
虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア
、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニス
トもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置また
は検出し得る。In addition, the parasite factor-caused diseases or conditions that may be treated or detected by angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides include the following families or classes: Include, but are not limited to: amebiasis, babesiosis, coccidiosis, cryptosporidiosis, dinuclear amebiasis (Dientamoebiasis), copulation, ectoparasite, giardia flagellosis, helminthosis, leishmaniasis, Theileriosis, toxoplasmosis, trypanosomiasis, and Trichomonas disease. These parasites can cause a variety of diseases or conditions including, but not limited to: scabies, scrub typhus, ocular infections, intestinal diseases (eg, dysentery, giardia giardiasis), liver diseases, lungs. Diseases, opportunistic infections (eg, AIDS-related), malaria, pregnancy complications, and toxoplasmosis. Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used to treat or detect any of these conditions or diseases.

【０３４４】 好ましくは、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形
成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニスト
を使用する処置は、患者に有効量の脈管形成ポリペプチドを投与するか、または
患者から細胞を取り出して、脈管形成ポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そ
して操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであ
り得る。さらに、脈管形成ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の
抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。Preferably, the treatment with the angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of the angiogenic polynucleotide or polypeptide, administers to the patient an effective amount of the angiogenic polypeptide, or Either by removing the cells from the patient, supplying the cells with angiogenic polynucleotides, and returning the engineered cells to the patient (ex vivo treatment). In addition, angiogenic polypeptides or polynucleotides can be used as antigens in vaccines to elicit an immune response against infectious diseases.

【０３４５】 （再生） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、細
胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、
先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨
粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）
、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン
損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。Regeneration Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, are used to differentiate, proliferate, and attract cells to induce tissue regeneration. Get (Scien
Ce 276: 59-87 (1997)). With tissue regeneration
Birth defects, trauma (wounds, burns, incisions, or ulcers), aging, diseases (eg, osteoporosis, osteoarthritis, periodontal disease, liver failure)
, Surgery including cosmetic surgery, fibrosis, reperfusion injury, or repair, replacement, or protection of tissue damaged by systemic cytokine damage.

【０３４６】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。Tissues that can be regenerated using the present invention include the following: Organs (eg,
Pancreas, liver, intestine, kidney, skin, endothelium), muscle (smooth muscle, skeletal muscle, or myocardium),
Tissues of the vascular system (including blood vessels and lymph vessels), nerves, hematopoiesis, and skeleton (bones, cartilage, tendons, and ligaments). Preferably, regeneration occurs without or with reduced scarring. Regeneration can also include angiogenesis.

【０３４７】 さらに、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大
させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明の、脈管形成ポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにお
いて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、
および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例と
しては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍
が挙げられる。Further, the angiogenic polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of the angiogenic polynucleotide or polypeptide,
It can increase the regeneration of tissues that are difficult to heal. For example, increasing tendon / ligament regeneration speeds recovery time after injury. The angiogenic polynucleotides or polypeptides of the invention, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, may also be used prophylactically in an attempt to avoid injury. Specific diseases that can be treated include tendinitis, carpal tunnel syndrome,
And other tendon or ligament defects. Further examples of tissue regeneration of non-healing wounds include ulcers associated with decubitus ulcers, vascular insufficiency, surgical wounds, and traumatic wounds.

【０３４８】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために脈
管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用することに
よって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾
患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例えば、
脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。
詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法また
は他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば
、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、
およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、脈管形成ポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを用いて処置され得る。Similarly, nerve and brain tissue is also regenerated by using angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, to proliferate and differentiate neural cells. Can be done. Diseases that can be treated using the present methods include central and peripheral nervous system diseases, neuropathy, or mechanical and traumatic disorders (eg,
Spinal cord disorders, head trauma, cerebrovascular disease, and stroke).
In particular, diseases associated with peripheral nerve injury, peripheral neuropathy (eg resulting from chemotherapy or other medical therapies), localized neuropathy, and central nervous system diseases (eg Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington). Disease, amyotrophic lateral sclerosis,
And Shy-Drager syndrome) can all be treated with angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides.

【０３４９】 （走化性） 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活
性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細
胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の
部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次
いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し
得る。Chemotaxis Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can have chemotactic activity. Chemotactic molecules allow cells (eg, monocytes, fibroblasts, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, epithelial cells and / or endothelial cells) to move to specific sites in the body (eg, Site of inflammation, infection, or hyperproliferation). The recruited cells may then repel and / or heal the particular trauma or abnormality.

【０３５０】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の細
胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中
の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過
剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使
用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創
傷および他の外傷を処置し得る。走化性分子としての脈管形成ポリペプチドはま
た、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。Angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can increase the chemotactic activity of particular cells. These chemotactic molecules are then used to treat inflammation, infection, hyperproliferative disorders, or any immune system disorder by increasing the number of cells targeted to specific locations in the body. obtain. For example, chemotactic molecules can be used to treat wounds and other trauma to tissues by attracting immune cells to the injured location. Angiogenic polypeptides as chemotactic molecules can also attract fibroblasts, which can be used to treat wounds.

【０３５１】 脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または脈管形成ポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストが走化性活性
を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するため
に使用され得る。従って、脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たは脈管形成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアン
タゴニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。It is also contemplated that angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, may inhibit chemotactic activity. These molecules can also be used to treat disorders. Thus, angiogenic polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of angiogenic polynucleotides or polypeptides, can be used as inhibitors of chemotaxis.

【０３５２】 （結合活性） 脈管形成ポリペプチドは、脈管形成ポリペプチドに結合する分子、または脈管
形成ポリペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得
る。このポリペプチドとこの分子との結合は、結合した脈管形成ポリペプチドま
たは分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、また
は減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タ
ンパク質（例えば、レセプター）、または低分子が挙げられる。Binding Activity Angiogenic polypeptides can be used to screen for molecules that bind, or are bound by, angiogenic polypeptides. The binding of the polypeptide to the molecule can activate (agonist), increase, inhibit (antagonist), or decrease the activity of the bound angiogenic polypeptide or molecule. Examples of such molecules include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg receptors), or small molecules.

【０３５３】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、脈管形成ポリペプチ
ドを、分泌タンパク質としてかまたは細胞膜上にかのいずれかに発現する適切な
細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、脈管
形成ポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞
膜）を、好ましくは、この脈管形成ポリペプチドまたはこの分子のいずれかの結
合、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化
合物と接触させる。Preferably, screening for these molecules involves producing appropriate cells that express the angiogenic polypeptide, either as a secreted protein or on the cell membrane. Preferred cells include mammals, yeast, Dr
osophila, or E. cells derived from E. coli. The cells that express the angiogenic polypeptide (or the cell membrane containing the expressed polypeptide) are then preferably conjugated, stimulated, or activated with either the angiogenic polypeptide or the molecule. A test compound potentially containing a molecule for observing inhibition is contacted.

【０３５４】 アッセイは、脈管形成ポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、
ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセ
イにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへ
の結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。The assay may simply test binding of a candidate compound to an angiogenic polypeptide,
Here binding is detected by the label or in an assay for competition with the labeled competitor. In addition, the assay can test whether a candidate compound produces a signal generated by binding to this polypeptide.

【０３５５】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、脈管形成ポリペプチドを含む溶液と混合する工程
、脈管形成ポリペプチド／分子の活性または結合を測定する工程、および脈管形
成ポリペプチド／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し
得る。Alternatively, the assay can be performed with cell-free preparations, polypeptides / molecules attached to a solid support, chemical libraries, or a mixture of natural products. The assay also comprises mixing the candidate compound with a solution containing the angiogenic polypeptide, measuring the activity or binding of the angiogenic polypeptide / molecule, and the activity or binding of the angiogenic polypeptide / molecule. , Can simply include the step of comparing to a standard.

【０３５６】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）における脈管形成ポリ
ペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、脈管形成ポリペプチドへの
直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についての脈管形成ポリペ
プチドとの競合によって、脈管形成ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得
る。Preferably, the ELISA assay may use monoclonal or polyclonal antibodies to measure the level or activity of angiogenic polypeptides in a sample (eg, a biological sample). An antibody may measure the level or activity of an angiogenic polypeptide by either directly or indirectly binding to the angiogenic polypeptide or by competing with the angiogenic polypeptide for a substrate.

【０３５７】 さらに、脈管形成ポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポ
リアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用
いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対
する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、および
このＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そして
このポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクト
するために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされ
た細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。この
ポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位
のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。In addition, the receptors to which angiogenic polypeptides bind are determined by a number of methods known to those of skill in the art (eg, ligand panning and FACS sorting (Coliga).
n et al., Current Protocols in Immun. , 1 (2),
Chapter 5 (1991)). For example, expression cloning is used when polyadenylated RNA is prepared from cells responsive to this polypeptide, eg, NIH3T3 cells, which are known to contain multiple receptors for FGF family proteins, And SC-3 cells, and a cDNA library made from this RNA are pooled and used to transfect COS cells or other cells that are not responsive to the polypeptide. Transfected cells growing on glass slides are exposed to the polypeptides of the invention after labeling them. The polypeptide may be labeled by various means, including iodination or encapsulation of recognition sites for site-specific protein kinases.

【０３５８】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。After immobilization and incubation, slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified and subpools are prepared and retransfected using an iterative subpooling and rescreening process to ultimately yield a single clone encoding the putative receptor.

【０３５９】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され
得る。微小配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。As an alternative approach for receptor identification, labeled polypeptides can be photoaffinity-linked or extracted with a preparation expressing the receptor molecule, photoaffinity. The crosslinked material is separated by PAGE analysis and exposed to X-ray film. A labeled complex containing the receptor for the polypeptide can be excised,
It can be separated into peptide fragments and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from microsequencing is used to design a set of degenerate oligonucleotide probes to screen a cDNA library to identify the gene encoding the putative receptor.

【０３６０】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。The invention further provides methods of screening compounds to identify those that modulate the action of the polypeptides of the invention. An example of such an assay involves combining mammalian fibroblasts, a polypeptide of the invention, the compound to be screened and 3 [H] thymidine under cell culture conditions in which the fibroblasts normally grow. . Control assays are performed in the absence of the compound to be screened to obtain, and compared to the amount of fibroblast proliferation in the presence of the compound, 3 in each case [H] thymidine incorporation of The determination can determine whether the compound stimulates proliferation. The amount of fibroblast proliferation is 3 [H
] Measured by liquid scintillation chromatography, which measures thymidine incorporation. Both agonist and antagonist compounds can be identified by this procedure.

【０３６１】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。In another method, a mammalian cell or membrane preparation expressing a receptor for a polypeptide of the invention is incubated with a labeled polypeptide of the invention in the presence of the compound. The ability of the compound to enhance or block this interaction can then be measured. Alternatively, the response and receptor of a known second messenger system according to the interaction of the compound to be screened is measured and the ability of the compound to bind to the receptor and elicit a second messenger response is measured to Determine if it is a potential agonist or antagonist. Such second messenger systems include, but are not limited to, cAMP guanylate cyclase, ion channels or phosphoinositide hydrolysis.

【０３６２】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、脈管形成ポリペプチ
ド／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者
における特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さら
に、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの脈管形成ポリペプチド
の産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。従って、本発明は、以下の工
程を含む脈管形成ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を包含する：（
ａ）候補結合化合物を脈管形成ポリペプチドとともにインキュベートする工程；
および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工
程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化
合物を脈管形成ポリペプチドとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的
活性をアッセイする工程、および（ｂ）脈管形成ポリペプチドの生物学的活性が
改変されているか否かを決定する工程。All of these above assays can be used as diagnostic or prognostic markers. Molecules discovered using these assays can be used to treat or treat diseases by activating or inhibiting angiogenic polypeptides / molecules or to produce a particular result in a patient (eg, blood vessel growth). Can be used. In addition, the assay can discover factors that can inhibit or enhance the production of angiogenic polypeptides from properly engineered cells or tissues. Accordingly, the invention includes a method of identifying a compound that binds to an angiogenic polypeptide, comprising the steps of:
a) incubating the candidate binding compound with an angiogenic polypeptide;
And (b) determining whether binding has occurred. Further, the invention includes a method of identifying an agonist / antagonist comprising the steps of: (a) incubating a candidate compound with an angiogenic polypeptide, (b) assaying biological activity, And (b) determining whether the biological activity of the angiogenic polypeptide is modified.

【０３６３】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１、３、
５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に含まれる配列ま
たはその相補鎖に対応する核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス
配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配
列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ
（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮ
Ａを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アン
チセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０
（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。
３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４
１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１
３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまた
はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。Antisense and Ribozymes (Antagonists) In certain embodiments, the antagonists according to the invention are SEQ ID NOs: 1, 3,
A nucleic acid corresponding to the sequence contained in 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 or its complementary strand. In one embodiment, the antisense sequences are produced internally by the organism, and in another embodiment the antisense sequences are administered separately (eg, O'Connor, J. Neurochem.
56: 560 (1991)). Oligodeoxynucleo
tides as Antisense Inhibitors of Gen
e Expression, CRC Press, Boca Raton, FL
(1988). Antisense DNA or RN using antisense technology
Gene expression may be regulated through A or through the formation of triple helices. Antisense technology is described in, for example, Okano, J. et al. Neurochem. 56: 560
(1991); Oligodeoxynucleotides as Anti
sense Inhibitors of Gene Expression,
CRC Press, Boca Raton, FL (1988).
Triple helix formation is described, for example, in Lee et al., Nucleic Acids Rese.
arch 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 24.
1: 456 (1988); and Dervan et al., Science, 251: 1.
300 (1991). These methods are based on the binding of polynucleotides to complementary DNA or RNA.

【０３６４】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。For example, the 5'coding portion of the polynucleotide encoding the mature polypeptide of the invention can be used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10-40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to regions of the gene involved in transcription, thereby inhibiting transcription and production of receptors. The antisense RNA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and blocks translation of the mRNA molecule into a receptor polypeptide.

【０３６５】 １つの実施形態において、本発明の脈管形成アンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写
され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは
、脈管形成アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、
それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保
持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野に
おいて標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動
物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミ
ド、ウイルスなどであり得る。脈管形成タンパク質をコードする配列またはその
フラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該
分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導
性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモー
ター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０
４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプ
ロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０
））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メ
タロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６
：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。In one embodiment, the angiogenic antisense nucleic acids of the invention are produced intracellularly by transcription from a foreign sequence. For example, the vector or a portion thereof is transcribed to produce the antisense nucleic acid (RNA) of the invention. Such vectors include sequences encoding angiogenic antisense nucleic acids. Such a vector
It may remain episomal or become chromosomally integrated, as long as it can be transcribed to produce the desired antisense RNA. Such vectors can be constructed by recombinant DNA technology methods standard in the art. The vector can be a plasmid, virus, etc. known in the art used for replication and expression in vertebrate cells. Expression of sequences encoding angiogenic proteins or fragments thereof may be by any promoter known in the art to act in vertebrate, preferably human cells. Such promoters can be inducible or constitutive. Such promoters include the SV40 early promoter region (Bernoist and Chamber, Nature, 29:30.
4-310 (1981)), a promoter contained in the 3'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797 (1980).
)), The herpes thymidine promoter (Wagner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 78: 1441-1445 (1981)), regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature, 296).
: 39-42 (1982)) and the like, but are not limited thereto.

【０３６６】 本発明のアンチセンス核酸は、脈管形成遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一
部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要
ではない。本明細書中で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列
は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成
する配列を意味し；従って、脈管形成タンパク質をコードするＲＮＡ転写物を標
的化する、二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試
験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力
は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、
ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基が脈管形成ＲＮＡとミスマ
ッチし、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そ
してなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために
標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。The antisense nucleic acids of the invention include sequences complementary to at least a portion of the RNA transcript of the angiogenic gene. However, perfect complementarity, although preferred, is not necessary. A sequence “complementary to at least a portion of RNA” referred to herein means a sequence that has sufficient complementarity to hybridize with RNA and forms a stable duplex; Thus, in the case of double-stranded antisense nucleic acids that target RNA transcripts that encode angiogenic proteins, single strands of double-stranded DNA can be tested or triplex formation can be assayed. The ability to hybridize depends on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid. Typically,
The longer the hybridizing nucleic acid, the more bases will mismatch with the angiogenic RNA, which may include stable duplexes (or possibly triplexes) and still form. One of skill in the art can ascertain the degree of mismatch tolerance by using standard procedures to determine the melting temperature of the hybridizing complex.

【０３６７】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３
５を参照のこと。従って、図３Ａ〜３Ｃに示す脈管形成タンパク質の５’または
３’の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、脈管形
成タンパク質をコードする内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプロ
ーチに使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチド
は、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的
なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビター
であるが、本発明に従って使用され得る。脈管形成ｍＲＮＡの５’領域、３’領
域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず
、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして
好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定
の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少
なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０
ヌクレオチドである。Oligonucleotides that are complementary to the 5'end of the message (eg, 5'untranslated sequences up to and including the AUG start codon) should work most efficiently in inhibiting translation. is there. However, sequences complementary to the 3'untranslated sequences of mRNAs have likewise been shown to be effective in inhibiting translation of mRNAs. Generally, Wagner, R .; , 1994, Nature 372: 333-33.
See 5. Thus, oligonucleotides complementary to either the 5'or 3'untranslated noncoding regions of the angiogenic proteins shown in Figures 3A-3C inhibit translation of the endogenous mRNA encoding the angiogenic protein. It can be used for antisense approaches. Oligonucleotides complementary to the 5'untranslated region of the mRNA should include the complement of the AUG start codon. Antisense oligonucleotides complementary to the mRNA coding region, although less efficient inhibitors of translation, can be used in accordance with the present invention. Whether designed to hybridize to the 5'region, 3'region or coding region of angiogenic mRNA, the antisense nucleic acid should be at least 6 nucleotides in length, and preferably 6 Is an oligonucleotide ranging from about 50 nucleotides in length. In certain aspects, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.
It is a nucleotide.

【０３６８】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸
骨格で改変されて、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒ
ｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５
２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参
照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４
（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切
断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ
ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
６：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏ
ｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を含み
得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド
、ハイブリダイゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切
断剤など）に結合体化され得る。The polynucleotides of the present invention may be DNA, or RNA, or chimeric mixtures, or derivative or modified versions thereof, single-stranded, or double-stranded. The oligonucleotide may be modified, for example, with a base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone to improve molecular stability, hybridization, and the like.
This oligonucleotide can be attached to other additional groups such as peptides (eg, to target host cell receptors in vivo), or to factors that facilitate transport across cell membranes (eg, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl.
． Acad. Sci. U. S. A. 86: 6553-6556; Lemaitr.
e et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-65
2; PCT Publication No. WO88 / 09810 (published December 15, 1988), or the blood-brain barrier (eg, PCT Publication No. WO89 / 10134).
(Published April 25, 1988)), hybridization-triggered cleaving agent.
agent) (eg, Krol et al., 1988, BioTechniques,
6: 958-976), or an intercalating agent (eg, Zo.
n, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549). To this end, the oligonucleotide can be conjugated to another molecule, such as a peptide, hybridization-triggered cross-linking agent, transport agent, hybridization-triggered cleavage agent, and the like.

【０３６９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。Antisense oligonucleotides may include at least one modified base moiety, which is selected from the group including, but not limited to: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5 -Chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2
-Thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D-galactosylcueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine,
2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D- Mannosyl cuocosine, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2
-Methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v
), Wybutoxosine, pseudouracil, queocin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxy. Acetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil,
3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3)
w, and 2,6-diaminopurine.

【０３７０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。Antisense oligonucleotides may also include at least one modified sugar moiety selected from the group including, but not limited to: arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and hexose.

【０３７１】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises at least one modified phosphate backbone selected from the group including, but not limited to: phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoro. Amidothioates, phosphoramidates, phosphorodiamidates, methylphosphonates, alkyl phosphotriesters, and formacetals or analogs thereof.

【０３７２】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行に延びる（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、
２’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１
５：３２７−３３０）。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide is an a-anomeric oligonucleotide. The a-anomeric oligonucleotide forms specific double-stranded hybrids with complementary RNA, whose strands run parallel to each other as opposed to the normal b-unit (Gautier et al., 1987, Nucl. Ac.
ids Res. , 15: 6625-6641). This oligonucleotide is
Is it a 2'-0-methyl ribonucleotide (Inoue et al., 1987, Nuc.
l. Acids Res. , 15: 6131-6148), or chimeric RNA.
-A DNA analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 21).
5: 327-330).

【０３７３】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）により合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８
８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４
５１）などの使用により調製され得る。Polynucleotides of the invention may be prepared using standard methods known in the art (eg, automated D
NA synthesizer (such equipment is Biosearch, Applied Bios
commercially available from systems, etc.). For example, phosphorothioate oligonucleotides are described by Stein et al.
8, Nucl. Acids Res. 16: 3209) and methyl phosphonate oligonucleotides can be synthesized as controlled pore glass (contr).
Old porous glass polymer support (Sarin et al., 1988)
, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 7448-74
51) and the like.

【０３７４】 一方、脈管形成タンパク質をコードするコード領域配列に相補的なアンチセン
スヌクレオチドが、使用され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンス
ヌクレオチドが最も好ましい。On the other hand, antisense nucleotides complementary to the coding region sequences encoding angiogenic proteins may be used, with antisense nucleotides complementary to the transcribed, untranslated region being most preferred.

【０３７５】 本発明に従う潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、１９９０年１０月４日に公開された国際出願公開番号ＷＯ
９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２
２５（１９９０）を参照のこと）。部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断する
リボザイムは、脈管形成タンパク質をコードするｍＲＮＡを破壊するために使用
され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型
リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接境域によって指示
される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の
２つの塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボ
ザイムの構築および作製は、当該分野において周知であり、そしてＨａｓｅｌｏ
ｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８
）においてより十分に記載される。脈管形成タンパク質（配列番号１、３、５、
７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３）をコードするヌク
レオチド配列中において、多数の潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位
が存在する。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が、脈管形成タンパク質
をコードするｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置するように；すなわち、効率を増
大させ、そして非機能的なｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように操作
される。Potential antagonists according to the present invention also include catalytic RNA, ie ribozymes (eg International Application Publication No. WO published Oct. 4, 1990).
90/11364; Sarver et al., Science 247: 1222-12.
25 (1990)). Ribozymes that cleave mRNAs at site-specific recognition sequences can be used to destroy mRNAs encoding angiogenic proteins, although the use of hammerhead ribozymes is preferred. Hammerhead ribozymes cleave mRNAs at positions dictated by flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the target mRNA has the following two base sequences: 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is well known in the art, and Haselo
ff and Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988).
) Is more fully described in. Angiogenic proteins (SEQ ID NOs: 1, 3, 5,
There are a number of potential hammerhead ribozyme cleavage sites in the nucleotide sequences encoding 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21 and 23). Preferably, the ribozyme is such that the cleavage recognition site is located near the 5'end of the mRNA encoding the angiogenic protein; ie, increased efficiency and intracellular accumulation of non-functional mRNA transcripts. Are manipulated to minimize.

【０３７６】 アンチセンスアプローチにおけるのと同様に、本発明のリボザイムは、修飾さ
れたオリゴヌクレオチドから構成され得（例えば、安定性の改善、標的化などの
ために）、そしてインビボで脈管形成タンパク質を発現する細胞に送達されるべ
きである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスをコードする
ＤＮＡの導入についての上記と同様の様式で細胞に導入され得る。送達の好まし
い方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーターまた
はｐｏｌＩＩプロモーター）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築
物を使用して、その結果、トランスフェクトされた細胞は、脈管形成タンパク質
をコードする内因性のメッセージを破壊し、そしてこれらの翻訳を妨害するのに
十分な量のリボザイムを産生することを包含する。リボザイムは、アンチセンス
分子とは違って触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要であ
る。As in the antisense approach, the ribozymes of the invention can be composed of modified oligonucleotides (eg, for improved stability, targeting, etc.) and in vivo angiogenic proteins. Should be delivered to cells expressing. The ribozyme-encoding DNA construct can be introduced into cells in a manner similar to that described above for the introduction of antisense-encoding DNA. A preferred method of delivery uses a DNA construct that "encodes" the ribozyme under the control of a strong constitutive promoter (eg, the pol III or pol II promoter), so that the transfected cells are angiogenic. It involves destroying the endogenous messages encoding proteins and producing sufficient amounts of ribozymes to interfere with their translation. Ribozymes, unlike antisense molecules, are catalytic, so lower intracellular concentrations are required for efficiency.

【０３７７】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織上で
の本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の新脈管形成を刺激し、そ
れにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍の形成または増殖において
）遅延または防止する。Antagonist / agonist compounds are utilized to grow and proliferate the polypeptides of the invention on neoplastic cells and tissues.
eration) effect may be hindered. That is, it stimulates tumor angiogenesis, thereby slowing or preventing aberrant cell growth and proliferation (eg, in tumor formation or proliferation).

【０３７８】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患をも予防し得、
そして水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手
術後の上皮レンズ細胞の増殖をも予防する。本発明のポリペプチドのマイトジェ
ン活性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要
求され得る。Antagonists / agonists may also be utilized to prevent hypervascular disorders,
It also prevents the proliferation of epithelial lens cells after extracapsular cataract surgery. Prevention of the mitogenic activity of the polypeptides of the invention may also be required in cases such as restenosis after balloon angioplasty.

【０３７９】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
をも予防し得る。Antagonists / agonists may also be utilized to prevent the growth of scar tissue during wound healing.

【０３８０】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
も処置し得る。Antagonists / agonists may also be utilized to treat the diseases described herein.

【０３８１】 （他の活性） 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種
々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因
する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。これらの
ポリペプチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再
形成を刺激し得る。Other Activities The polypeptides of the invention are responsible for various disease states (eg, thrombosis, arteriosclerosis, and other cardiovascular conditions) as a result of their ability to stimulate vascular endothelial cell proliferation. Can be used in a procedure for stimulating the revascularization of ischemic tissue. These polypeptides may also be utilized to stimulate angiogenesis and limb remodeling as discussed above.

【０３８２】 本発明のポリペプチドをまた、傷害、熱傷、手術後組織修復、および瘢痕に起
因する創傷の処置にも利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞
（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それ
ゆえダメージを受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進する能力を有
するからである。The polypeptides of the present invention may also be utilized in the treatment of wounds due to injury, burns, post-operative tissue repair, and scarring. Because they are mitogenic for a variety of cells of different origin (eg fibroblasts and skeletal muscle cells) and therefore have the ability to promote repair or replacement of damaged or diseased tissue. Is.

【０３８３】 本発明のポリペプチドをまた使用して、ニューロンの成長を刺激し、そして特
定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキ
ンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンのダメージを
処置および予防し得る。脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対
するアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力
を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または
骨の移植片における補助のために利用され得る。The polypeptides of the present invention may also be used to stimulate neuronal growth and to inhibit neuronal development in specific neuronal disorders or neurodegenerative conditions such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and AIDS-related complexes. Damage can be treated and prevented. Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, may have the ability to stimulate chondrocyte proliferation, thus enhancing bone and periodontal remodeling, and tissue graft or bone. Can be used for assistance in implants.

【０３８４】 本発明のポリペプチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することに
より、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。The polypeptides of the present invention may also be utilized to prevent aging of the skin due to sunburn by stimulating keratinocyte proliferation.

【０３８５】 脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび
／またはアンタゴニストをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または
始原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, can also be utilized to maintain pre-transplant organs or can be used to support cell culture of primordial tissue.

【０３８６】 本発明のポリペプチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。The polypeptides of the present invention may also be utilized to induce tissues of mesodermal origin for differentiation in early embryos.

【０３８７】 脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび
／またはアンタゴニストはまた、先に議論されるように、造血系統に加えて胚性
幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, can also increase or decrease differentiation or proliferation of embryonic stem cells in addition to hematopoietic lineages, as discussed above.

【０３８８】 脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび
／またはアンタゴニストはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色
、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容
外科））を調節するために使用され得る。同様に、脈管形成タンパク質、ならび
に脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、異
化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼ
す哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, can also be used to characterize mammals (eg, height, weight, hair color, eye color, skin, percentage of adipose tissue, pigmentation). , Size, and shape (eg, cosmetic surgery). Similarly, angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, are used to regulate mammalian metabolism that affects catabolism, anabolic activity, processing, utilization, and energy storage. obtain.

【０３８９】 脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび
／またはアンタゴニストは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉ
ｃ）リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖
能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレ
ベルもしくは内分泌レベル、食欲、***、記憶、ストレス、または他の認知の質
に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するた
めに使用され得る。Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, are found in biorhythms, caricadi.
c) Rhythm, depression (including depressive disorder), tendency to violence, resistance to pain, fertility (preferably by activin or inhibin-like activity), hormone or endocrine levels, appetite, libido, memory, stress , Or other effects on cognitive quality, and may be used to alter a mammal's mental or physical condition.

【０３９０】 脈管形成タンパク質、ならびに脈管形成タンパク質に対するアゴニストおよび
／またはアンタゴニストはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパ
ク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加また
は減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。Angiogenic proteins, as well as agonists and / or antagonists to angiogenic proteins, can also, for example, store capacity, fat content, lipids, proteins, carbohydrates, vitamins, minerals, cofactors, or other nutritional components. It can be used as a food additive or preservative to increase or decrease.

【０３９１】 上記に列挙される用途は、広範な種々の宿主において使用される。このような
宿主としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウサ
ギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミ
ニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、
非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は哺乳動物である。最も好まし
い実施形態において、宿主は、ヒトである。The applications listed above are used in a wide variety of hosts. Such hosts include, but are not limited to, humans, mice, rabbits, goats, guinea pigs, camels, horses, mice, rats, hamsters, pigs, micro pigs, chickens, goats, cows. , Sheep, dogs, cats,
Non-human primates, and humans. In a particular embodiment, the host is a mouse, rabbit, goat, guinea pig, chicken, rat, hamster, pig, sheep, dog or cat. In a preferred embodiment, the host is a mammal. In the most preferred embodiment, the host is human.

【０３９２】 （治療用途） 本発明の脈管形成タンパク質は、脈管およびリンパ管内皮細胞についての強力
なマイトジェンである。従って、脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活
性な部分を、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともに使用して、脈管
形成を促進することにより脈管の外傷を処置し得る。例えば、冠状動脈バイパス
手術が行われた場合に、移植された組織の増殖を刺激するため。創傷治癒を促進
するため、特に、損傷組織を脈管再生するためまたは虚血の間および新たな毛細
管形成が所望される場合に側副枝の血流を刺激するために、脈管形成ポリペプチ
ドまたはその生物学的に活性な部分が、アゴニストおよび／またはアンタゴニス
トとともに、やはり使用され得る。かなり厚みのある（ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎ
ｅｓｓ）創傷（例えば、褥瘡、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む皮膚潰瘍
）を処置するために、脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が
、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともに、使用され得る。さらに、
脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび／
またはアンタゴニストとともに使用して、かなり厚みのある火傷および傷害が修
復され得、ここでは、皮膚移植片または組織弁を使用して、このような火傷およ
び傷害が修復される。脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は
また、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともに、形成外科における使
用のために（例えば、裂傷、火傷、または他の外傷の修復のために）使用され得
る。さらに脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニス
トおよび／またはアンタゴニストとともに使用して、眼に対する創傷および傷害
の治癒を促進し得、そして眼の疾患を処置し得る。Therapeutic Uses The angiogenic proteins of the present invention are potent mitogens for vascular and lymphatic endothelial cells. Thus, angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may be used with agonists and / or antagonists to treat vascular trauma by promoting angiogenesis. For example, to stimulate the growth of transplanted tissue when coronary artery bypass surgery is performed. Angiogenic polypeptides for promoting wound healing, especially for revascularizing damaged tissue or for stimulating collateral blood flow during ischemia and when new capillary formation is desired. Alternatively, biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists. Quite thick (full-thickn
ess) for treating wounds (eg, skin ulcers including pressure ulcers, venous ulcers, and diabetic ulcers), an angiogenic polypeptide or a biologically active portion thereof together with an agonist and / or antagonist, Can be used. further,
Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may be used as agonists and / or
Alternatively, it can be used with an antagonist to repair fairly thick burns and injuries, where a skin graft or tissue flap is used to repair such burns and injuries. Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists for use in plastic surgery (eg, for repair of lacerations, burns, or other trauma). obtain. Additionally, angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may be used with agonists and / or antagonists to promote healing of wounds and injuries to the eye and to treat ocular diseases.

【０３９３】 これらの同じ系に沿って、脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な
部分を、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともにやはり使用して、損
傷した骨組織、歯周組織または靱帯組織の増殖を誘導し得る。脈管形成ポリペプ
チドまたはその生物学的に活性な部分はまた、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストとともに、例えば、歯周病または外傷により損傷した歯の支持組織（セ
メント質および歯周靱帯を含む）を再生するために使用され得る。Along these same systems, angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof are also used with agonists and / or antagonists to repair damaged bone, periodontal or ligament tissue. It can induce proliferation. Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, along with agonists and / or antagonists, also regenerate tooth supporting tissue (including cementum and periodontal ligament) damaged, for example, by periodontal disease or trauma. Can be used to

【０３９４】 新脈管形成は、創傷を清潔かつ感染しないように維持するにおいて重要である
ので、脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、アゴニストお
よび／またはアンタゴニストとともに、手術と関連づけて、ならびに切開および
切断の修復後に使用され得る。脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性
な部分はまた、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともに、感染の危険
性が高い腹部創傷を処置するために使用され得る。Since angiogenesis is important in maintaining the wound clean and free of infection, the angiogenic polypeptide or biologically active portion thereof, along with agonists and / or antagonists, may be used in conjunction with surgery. It can be used in association and after repair of incisions and cuts. Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to treat abdominal wounds at high risk of infection.

【０３９５】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともに、脈管移植手術における内皮化（ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）促進のために使用され得る。移植材料または合成材
料のいずれかを用いる脈管移植片の場合には、脈管形成ポリペプチドまたはその
生物学的に活性な部分は、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともに、
移植片の表面に、または接合部に適用されて、脈管内皮細胞の増殖を促進し得る
。脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにやはり使用して、心筋梗塞の結果として生じた
心筋組織の損傷を修復し得る。脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性
な部分を、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともにやはり使用して、
虚血後の心血管系を修復し得る。脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活
性な部分を、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとともにやはり使用して
、冠動脈疾患ならびに末梢脈管疾患およびＣＮＳ脈管疾患の結果として損傷した
脈管組織を処置し得る。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, along with agonists and / or antagonists, may be endothelized in vascular transplant surgery.
It can be used to promote eliaization. In the case of vascular grafts using either transplant or synthetic materials, the angiogenic polypeptide or biologically active portion thereof may be combined with an agonist and / or antagonist,
It can be applied to the surface of the graft or at the junction to promote proliferation of vascular endothelial cells. The angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to repair myocardial tissue damage resulting from myocardial infarction. Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, also used with agonists and / or antagonists,
It can repair the cardiovascular system after ischemia. Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, also used with agonists and / or antagonists, to treat vascular tissue damaged as a result of coronary artery disease and peripheral vascular disease and CNS vascular disease. obtain.

【０３９６】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにやはり使用して、体内に移植される人工プロテ
ーゼまたは天然の器官をコーティングして、移植材料の拒絶を最小化し、そして
移植された材料の脈管形成を刺激し得る。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, also used with agonists and / or antagonists, to coat artificial prostheses or natural organs to be implanted in the body to reject transplanted materials. Can be minimized and stimulate angiogenesis of the implanted material.

【０３９７】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分はまた、アゴニストお
よび／またはアンタゴニストとともに、例えば、アテローム硬化症の間に生じる
外傷からもたらされる傷害の脈管組織修復のために使用され得、そして脈管組織
が損傷されるバルーン血管形成術後に必要とされ得る。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof are also used with agonists and / or antagonists, eg, for vascular tissue repair of injuries resulting from trauma occurring during atherosclerosis. And may be needed after balloon angioplasty where vascular tissue is damaged.

【０３９８】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにやはり使用して、末梢動脈疾患を処置し得る。
従って、さらなる局面において、脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活
性な部分を、アゴニストとともに利用して、末梢動脈疾患を処置するためのプロ
セスが提供される。好ましくは、アゴニストと同時に処理された脈管形成ポリペ
プチドは、末梢動脈疾患を緩和または処置する目的で、個体に投与される。適切
な用量、処方、および投与経路は、以下に記載される。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to treat peripheral arterial disease.
Thus, in a further aspect, there is provided a process for utilizing an angiogenic polypeptide or biologically active portion thereof together with an agonist to treat peripheral arterial disease. Preferably, the angiogenic polypeptide co-treated with the agonist is administered to an individual for the purpose of alleviating or treating peripheral arterial disease. Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０３９９】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにまた使用して、リンパ組織およびリンパ管の内
皮機能（例えば、リンパ管の損失、リンパ管の閉塞およびリンパ管腫を処置する
ために）を促進し得る。脈管形成ポリペプチドを、アゴニストとともにまた使用
して、リンパ球産生を刺激し得る。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to induce endothelial function in lymphoid tissues and vessels (eg, loss of lymphatic vessels, blockage of lymphatic vessels). And to treat lymphangioma). Angiogenic polypeptides can also be used with agonists to stimulate lymphopoiesis.

【０４００】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにまた使用して、新生児における血管腫を処置し
得る。従って、さらなる局面において、新生児において血管腫を処置するために
、アゴニストおよび／またはアンタゴニストと同時に処理された脈管形成ポリペ
プチドを利用するためのプロセスが提供される。好ましくは、アゴニストと同時
に処理された脈管形成ポリペプチドは、新生児における血管腫を軽減または処置
するために個体に投与される。適切な用量、処方および投与経路は以下に記載さ
れる。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to treat hemangiomas in newborns. Thus, in a further aspect there is provided a process for utilizing angiogenic polypeptides co-treated with an agonist and / or antagonist to treat hemangiomas in a neonate. Preferably, the angiogenic polypeptide co-treated with the agonist is administered to an individual to reduce or treat hemangiomas in the newborn. Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０４０１】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにまた使用して、未成熟な新生児における異常な
網膜の発達を予防または処置し得る。従って、さらなる局面において、未成熟な
新生児において異常な網膜の発達を処置するために、脈管形成ポリペプチドを、
アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとともに利用するためのプロセスを
提供する。好ましくは、アゴニストまたはアンタゴニストと同時に処理した脈管
形成ポリペプチドは、未成熟な新生児において異常な網膜の発達を軽減または処
置するために個体に投与される。適切な用量、処方および投与経路は以下に記載
される。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to prevent or treat abnormal retinal development in immature neonates. Thus, in a further aspect, an angiogenic polypeptide is administered to treat abnormal retinal development in an immature neonate.
Provide a process for utilization with either agonists or antagonists. Preferably, the angiogenic polypeptide co-treated with an agonist or antagonist is administered to an individual to reduce or treat abnormal retinal development in immature neonates. Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０４０２】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともに使用して、ミルロイ病および早発性リンパ水腫
を含む原発性（特発性）リンパ水腫を処置し得る。従って、さらなる局面におい
て、ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む原発性（特発性）リンパ水腫を処
置するために、脈管形成ポリペプチドを、アゴニストとともに使用するためのプ
ロセスを提供する。好ましくは、アゴニストと同時に処理された脈管形成ポリペ
プチドは、ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む原発性（特発性）リンパ水
腫を軽減または処置するために個体に投与される。脈管形成ポリペプチドをアゴ
ニストとともにまた使用して、動物において、水腫を処置し得、そして血圧に作
用し得る。適切な用量、処方および投与経路は以下に記載される。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof are used with agonists and / or antagonists to treat primary (idiopathic) lymphedema, including Milroy's disease and early-onset lymphedema. obtain. Thus, in a further aspect, there is provided a process for using angiogenic polypeptides with agonists to treat primary (idiopathic) lymphedema, including Milroy's disease and early-onset lymphedema. Preferably, the angiogenic polypeptide co-treated with the agonist is administered to an individual to reduce or treat primary (idiopathic) lymphedema, including Milroy's disease and early-onset lymphedema. Angiogenic polypeptides can also be used with agonists to treat edema and affect blood pressure in animals. Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０４０３】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、アゴニストおよび
／またはアンタゴニストとともにまた使用して、（Ｉ）リンパ節およびリンパ管
の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および手術、ならびに（ｉｉｉ）
外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を含む２次的な（閉鎖性の
）寿命を処置し得る。従って、さらなる局面において、（Ｉ）リンパ節およびリ
ンパ管の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および手術、ならびに（ｉ
ｉｉ）外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を含む２次的な（閉
鎖性の）寿命を処置するために脈管形成ポリペプチドを、アゴニストとともに利
用するためのプロセスを提供する。好ましくは、脈管形成ポリペプチドは、（Ｉ
）リンパ節およびリンパ管の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および
手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）
を含む２次的な（閉鎖性の）寿命のために、アゴニストと同時に個体に投与され
る。適切な用量、処方および投与経路は以下に記載される。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof, also used in conjunction with agonists and / or antagonists, (I) removal of lymph nodes and vessels, (ii) radiation therapy in the treatment of cancer. And surgery, and (iii)
Secondary (closed) lifespans can be treated, including the lifetime resulting from trauma and infection. Thus, in a further aspect, (I) removal of lymph nodes and vessels, (ii) radiation therapy and surgery in the treatment of cancer, and (i
ii) Provide a process for utilizing angiogenic polypeptides with agonists to treat secondary (closed) life span, including life time resulting from trauma and infection. Preferably, the angiogenic polypeptide has (I
) Removal of lymph nodes and vessels, (ii) radiation therapy and surgery in the treatment of cancer, and (iii) lifetime resulting from trauma and infection
Due to secondary (closed) life span including Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０４０４】 脈管形成ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をまた、アゴニストお
よび／またはアンタゴニストとともに使用して、カポージ肉腫を処置し得る。従
って、さらなる局面において、カポージ肉腫を処置するためにアゴニストととも
に脈管形成ポリペプチドを利用するためのプロセスを提供する。好ましくは、脈
管形成ポリペプチドは、カポージ肉腫を軽減または処置するために個体に投与さ
れる。適切な用量、処方物および投与経路は以下に記載される。Angiogenic polypeptides or biologically active portions thereof may also be used with agonists and / or antagonists to treat Kaposi's sarcoma. Accordingly, in a further aspect, there is provided a process for utilizing an angiogenic polypeptide with an agonist to treat Kaposi's sarcoma. Preferably, the angiogenic polypeptide is administered to an individual to reduce or treat Kaposi's sarcoma. Suitable doses, formulations and routes of administration are described below.

【０４０５】 脈管形成ポリペプチドのアンタゴニストは、癌および腫瘍増殖を支持するため
に必要な脈管形成を阻害することによって癌を処置するために使用され得る。Antagonists of angiogenic polypeptides can be used to treat cancer by inhibiting the angiogenesis necessary to support cancer and tumor growth.

【０４０６】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するための遺伝子治療方
法に関する。この遺伝子治療法は、本発明の脈管形成ポリペプチドの発現を達成
するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）
配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標的組
織によるこのポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメントに
作動可能に連結された、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であり
、例えば、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９０／１１０９２を参照のこ
と。Gene Therapy Methods Another aspect of the present invention relates to gene therapy methods for treating disorders, diseases, and conditions. This method of gene therapy uses nucleic acid (DNA, RNA, and antisense DNA or RNA) to achieve expression of the angiogenic polypeptides of the invention.
Introducing the sequence into an animal. This method requires a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide operably linked to a promoter and any other genetic element necessary for the expression of this polypeptide by the target tissue. Techniques for such gene therapy and delivery are known in the art, see, eg, WO 90/11092, incorporated herein by reference.

【０４０７】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで脈管形成ポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチドで
処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。
例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ
ｔ．，８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅ
ｒｒａｎｔｉｎｉ、Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４
６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：
２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ
．ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓ
ａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１
２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらの文献
は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態では、操作される細胞
は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈周囲の組織への直接注射によ
って、またはカテーテル注射によって患者に再度導入され得る。Thus, for example, a cell derived from a patient may have a polynucleotide (DNA or R that contains a promoter operably linked to an angiogenic polynucleotide ex vivo.
NA) and the engineered cells are then provided to the patient to be treated with the polypeptide. Such methods are well known in the art.
For example, Belldegrun, A .; Et al., J. Natl. Cancer Ins
t. , 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M .; Et al., C
ancer Research, 53: 1107-1112 (1993); Fe
rrantini, M .; Et al., J. Immunology 153: 4604-4.
615 (1994); Kaido, T .; Et al., Int. J. Cancer 60:
221-229 (1995); Ogura, H .; Et al, Cancer Rease
rch 50: 5102-106 (1990); Santodonato, L.
． Et al., Human Gene Therapy 7: 1-10 (1996); S.
antodonato, L .; Et al., Gene Therapy 4: 1246-1.
255 (1997); and Zhang, J. et al. -F. Et al, Cancer Gen
e Therapy 3: 31-38 (1996). These documents are incorporated herein by reference. In one embodiment, the engineered cells are arterial cells. The arterial cells can be reintroduced into the patient by direct injection into the arteries, tissues surrounding the arteries, or by catheter injection.

【０４０８】 以下でより詳細に考察するように、脈管形成ポリヌクレオチド構築物は、注射
可能な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮
膚、肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。脈管形成ポリ
ヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアにて送達さ
れ得る。As discussed in more detail below, angiogenic polynucleotide constructs can be delivered by any method that delivers an injectable substance to cells of an animal, such as tissue (heart, muscle, skin, lung, liver, etc. ) Injection into the interstitial space)). The angiogenic polynucleotide construct can be delivered in a pharmaceutically acceptable liquid or aqueous carrier.

【０４０９】 １つの実施形態では、脈管形成ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドと
して送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞
への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（
ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈殿
剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、脈管形成ポリヌクレオチドはま
た、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは、当
業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書
中に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９
，４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。[0409] In one embodiment, the angiogenic polynucleotide is delivered as a naked polynucleotide. The term "naked" polynucleotide, DNA or RNA refers to any delivery vehicle (that acts to assist, facilitate or facilitate entry into cells.
(Including viral sequences, viral particles, liposomal formulations, lipofectin, precipitants, etc.). However, angiogenic polynucleotides can also be delivered in liposomal formulations, and lipofectin formulations and the like can be prepared by methods well known to those of skill in the art. Such methods are described, for example, in US Pat. Nos. 5,593,972 and 5,589, incorporated herein by reference.
, 466 and 5,580,859.

【０４１０】 遺伝子治療方法において使用される脈管形成ポリヌクレオチドベクター構築物
は好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない、
構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な
ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；な
らびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１
、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易
に明白である。The angiogenic polynucleotide vector construct used in the gene therapy method is preferably not integrated into the host genome and does not contain sequences that allow replication.
It is a construct. Suitable vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; Phar
pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Macia; and pEF1 / V5, pcDNA3.1 available from Invitrogen.
, And pRc / CMV2. Other suitable vectors will be readily apparent to those of skill in the art.

【０４１１】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、脈管形成ＤＮＡの発現を駆動す
るために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモー
ター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモータ
ー（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（
ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メ
タロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモー
ター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジン
キナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）
；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモン
プロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、所与の脈管形成タンパク
質をコードするそれぞれの遺伝子についてネイティブなプロモーターであり得る
。Any strong promoter known to those of skill in the art can be used to drive the expression of angiogenic DNA. Suitable promoters include adenovirus promoters (eg, adenovirus major late promoter); or heterologous promoters (eg, cytomegalovirus (CMV) promoter); RS virus (
RSV) promoter; inducible promoter (eg, MMT promoter, metallothionein promoter); heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI promoter; human globin promoter; viral thymidine kinase promoter (eg, herpes simplex thymidine kinase promoter).
Retrovirus LTR; b-actin promoter; and human growth hormone promoter; The promoter can also be the native promoter for each gene encoding a given angiogenic protein.

【０４１２】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。Unlike other gene therapy techniques, one major advantage of introducing a naked nucleic acid sequence into a target cell is the transient nature of polynucleotide synthesis in that cell. Studies have shown that non-replicating DNA sequences can be introduced into cells to provide for production of the desired polypeptide for a period of up to 6 months.

【０４１３】 脈管形成ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、
細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織
のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔ
ｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の
裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャン
ネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、
以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、
これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポ
リヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非***細胞に送達され
、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または
完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）に
おいて達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、
そして発現する能力において、特に適格である。Angiogenic polynucleotide constructs are used in tissues in animals (muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, Includes intestines, testes, ovaries, uterus, rectum, nervous system, eyes, glands, and connective tissue)
Can be delivered to the interstitial space of the. This interstitial space is the space between the reticulated fibers of organ tissue,
Liquid mucopolysaccharide matrix between cells, elastic fibers in the walls of blood vessels or chambers, collagen fibers of fibrotic tissue, or connective tissue sheath muscle cells (connective cells).
Includes the same matrix within the issue enheasing muscle cell) or in the lacunae of the bone. This is likewise the space occupied by circulating plasma and lymphatic fluid of the lymphatic channels. Delivery of muscle tissue to the interstitial space
Preferred for reasons discussed below. The polynucleotide construct of the present invention comprises
It can be conveniently delivered by injection into the tissue containing these cells. The polynucleotide constructs of the present invention are preferably delivered to and expressed in differentiated, persistent, non-dividing cells, which delivery and expression may be in undifferentiated cells or cells that are not fully differentiated ( (Eg, blood stem cells or dermal fibroblasts). Muscle cells in vivo take up a polynucleotide,
And it is particularly qualified in its ability to develop.

【０４１４】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。For naked nucleic acid sequence injections, an effective dosage of DNA or RNA is about 0.05.
It ranges from mg / kg body weight to about 50 mg / kg body weight. Preferably, this dosage is about 0.005 mg / kg to about 20 mg / kg, and more preferably about 0.05 mg / kg to about 5 mg / kg. Of course, as the skilled artisan will appreciate, this dosage will vary depending on the tissue site of injection. Suitable and effective dosages of nucleic acid sequences can be readily determined by those of ordinary skill in the art and may depend on the condition being treated and the route of administration.

【０４１５】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸の脈管形成ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用
いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。The preferred route of administration is by the parenteral route of injection into the interstitial space of tissues. However, other parenteral routes may also be used, including, for example, inhalation of aerosol formulations, especially for delivery to lung or bronchial tissues, throat or mucous membranes of the nose, among others. In addition, the naked angiogenic DNA construct can be delivered to the arteries during angioplasty by the catheter used in this procedure.

【０４１６】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。Naked polynucleotides can be any method known in the art including, but not limited to, direct needle injection at the delivery site, intravenous injection, topical administration, catheter injection, and so-called “gene gun”. Delivered by. These methods of delivery are known in the art.

【０４１７】 裸のＶＥＧＦ−２核酸配列はインビボで投与され得、ウサギの大腿動脈におい
てＶＥＧＦ−２ポリペプチドの首尾良い発現を生じることが示されている。The naked VEGF-2 nucleic acid sequence can be administered in vivo and has been shown to produce successful expression of VEGF-2 polypeptide in the femoral artery of rabbits.

【０４１８】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。The constructs can also be delivered using delivery vehicles such as viral sequences, viral particles, liposomal formulations, lipofectin, precipitants and the like. Such delivery methods are known in the art.

【０４１９】 特定の実施形態において、脈管形成ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調
製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カ
チオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を
包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で
強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カ
チオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で
参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中
で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写
因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介するこ
とが示されている。[0419] In certain embodiments, the angiogenic polynucleotide construct is complexed in a liposome preparation. Liposomal preparations for use in the present invention include cationic (positively charged), anionic (negatively charged) and neutral preparations. However, cationic liposomes are particularly preferred because they can form a robust charge complex between the cationic liposomes and the polyanionic nucleic acid. Cationic liposomes, in functional form, are plasmid DNA (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. S, incorporated herein by reference).
ci. USA (1987) 84: 7413-7416); mRNA (Malone et al., Proc. Natl. Acad. S, incorporated herein by reference).
ci. USA (1989) 86: 6077-6081); and purified transcription factors (Debs et al., J. Biol. Che, incorporated herein by reference).
m. (1990) 265: 10189-10192) have been shown to mediate intracellular delivery.

【０４２０】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと）より入
手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。Cationic liposomes are readily available. For example, N [1-2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-triethylammonium (DOTM
A) Liposomes are particularly useful, and are available under the trademark Lipofectin® from GIBCO BRL, Grand Island, N.F. Y. (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sc, incorporated herein by reference.
i. USA (1987) 84: 7413-7416). Other commercially available liposomes include transfectase (tra
nsfectace) (DDAB / DOPE) and DOTAP / DOPE (B
oehringer).

【０４２１】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。Other cationic liposomes can be prepared from readily available materials using techniques well known in the art. DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy)-
For a description of the synthesis of 3- (trimethylammonio) propane) liposomes, see, eg, PCT Publication No. WO 90/11092, which is incorporated herein by reference. The preparation of DOTMA liposomes is described in the literature and is described, for example, in P. et al. Felgner et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417. Similar methods can be used to prepare liposomes from other cationic lipid substances.

【０４２２】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。Similarly, anionic and neutral liposomes can be prepared, for example, by Avant.
It is readily available from i Polar Lipids (Birmingham, Ala.) or can be easily prepared using readily available materials.
Such substances include, among others, phosphatidylcholine, cholesterol, phosphatidylethanolamine, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC).
), Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE). These substances also
It can be mixed with DOTMA starting material and DOTAP starting material in suitable proportions. Methods of using these materials to form liposomes are well known in the art.

【０４２３】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴が、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。For example, commercially, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) were used in various combinations with the addition of cholesterol. Even without, conventional liposomes can be produced. Therefore,
For example, DOPG / DOPC vesicles can be prepared by drying 50 mg each of DOPG and DOPC under a stream of nitrogen gas into a sonicated vial. The sample is placed under vacuum pump overnight and hydrated the next day with deionized water. This sample was then placed in a capped vial using a Heat Systems Model 350 sonicator equipped with an inverted cup (bath type) probe at maximum setting while the bath was circulating at 15 EC. Sonicate for 2 hours. Alternatively, negatively charged vesicles can be prepared without sonication to generate multilamellar vesicles or extruded through nucleopore membranes to separate unilamellar vesicles of different sizes. Can be generated. Other methods are known and available to those of skill in the art.

【０４２４】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和するこ
とによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単
膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭ
ＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソ
ームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｎ
ａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し
、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリ
ポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非
常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を
見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用
される方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕ
ｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４
８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７；エーテル注入（Ｄ
ｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅ
ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３
４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，
Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４
５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰａｐ
ａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で
参考として援用される。As the liposome, there are multilamellar vesicles (MLV), small unilamellar vesicles (SUV).
Alternatively, large unilamellar vesicles (LUVs) may be mentioned, SUVs being preferred. Various liposome-nucleic acid complexes are prepared using methods well known in the art. For example,
Straubinger et al., Method, incorporated herein by reference.
Sof Immunology (1983), 101: 512-527. For example, MLVs containing nucleic acids can be prepared by depositing a thin film of phospholipids on the walls of glass tubes and then hydrating with a solution of the substance to be encapsulated. SUVs are prepared by long-term sonication of MLVs, producing a homogeneous population of unilamellar vesicles. Pre-formed M to be encapsulated
Add to suspension of LV, then sonicate. When using liposomes containing cationic lipids, dry lipid membranes should be treated with sterile water or 10 mM Tris / N.
Resuspend in a suitable solution, such as an isotonic buffered solution such as aCl, sonicate, then mix the preformed liposomes directly with the DNA. Due to the binding of the positively charged liposomes to the cationic DNA, the liposomes and DNA form a very stable complex. SUVs find use with small nucleic acid fragments. LUVs are prepared by many methods well known in the art. A commonly used method is Ca 2+ -EDTA chelation (Papahadjopou).
los et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394: 4.
83; Wilson et al., Cell (1979)) 17:77; ether injection (D.
eamer, D.E. And Bangham, A .; , Biochim. Biophy
s. Acta (1976) 443: 629; Ostro et al., Biochem. B
iophys. Res. Commum. (1977) 76: 836; Fulle.
y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:33.
48); detergent dialysis (Enoch, H. and Strittmatter,
P. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:14.
5); and reverse phase evaporation (REV) (Fraley et al., J. Biol.
． Chem. (1980) 255: 10431; Szoka, F .; And Pap
ahadjopuulos, D.A. , Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1978) 75: 145; Schaefer-Ridder et al., Scie.
No. (1982) 215: 166), which are incorporated herein by reference.

【０４２５】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。Generally, the ratio of DNA to liposomes is from about 10: 1 to about 1:10. Preferably, the ratio is about 5: 1 to about 1: 5. More preferably, the ratio is from about 3: 1 to about 1: 3. Even more preferably, the ratio is about 1: 1.

【０４２６】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。US Pat. No. 5,676,954 (incorporated herein by reference) reports the injection of genetic material complexed with cationic liposome carriers into mice. U.S. Pat. Nos. 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466.
No. 5,693,622, No. 5,580,859, No. 5,703.
055 and WO 94/9469, which are incorporated herein by reference, provide cationic lipids for use in transfecting DNA into cells and mammals. U.S. Pat. No. 5,589,466,
No. 5,693,622, No. 5,580,859, No. 5,703,05
No. 5 and WO 94/9469, which are incorporated herein by reference, provide methods of delivering DNA-cationic lipid complexes to mammals.

【０４２７】 特定の実施形態において、脈管形成タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ
を含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作
する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては
、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられ
るが、これらに限定されない。In a particular embodiment, an RNA comprising a sequence encoding an angiogenic protein
Are used to engineer cells ex vivo or in vivo. The retrovirus capable of inducing a retrovirus plasmid vector includes Moloney murine leukemia virus, splenic necrosis virus, Rous sarcoma virus, Harvey sarcoma virus, chicken leukemia virus, gibbon ape leukemia virus, human immunodeficiency virus, myeloproliferative sarcoma virus, and Breast cancer viruses are included, but are not limited to.

【０４２８】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株に
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０
）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２
、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ
−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限
定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージ
ング細胞に形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション
、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定され
ない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソ
ームにカプセル化し得るか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。This retroviral plasmid vector is used to transduce packaging cell lines to form producer cell lines. Examples of packaging cells that can be transfected are incorporated herein by reference in their entirety,
Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990)
) PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12 as described in
, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP + E
-86, GP + envAm12 and DAN cell lines, but are not limited thereto. The vector can transduce the packaging cells by any means known in the art. Such means, electroporation, the use of liposomes, and CaPO 4 precipitation include, but are not limited to. In one alternative, the retroviral plasmid vector can be encapsulated in liposomes or can be lipid bound and then administered to a host.

【０４２９】 このプロデューサー細胞株は、脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのような
レトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらか
において、真核生物細胞に形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は
、脈管形成タンパク質を発現する。This producer cell line produces infectious retroviral vector particles containing a polynucleotide encoding an angiogenic protein. Such retroviral vector particles can then be used to transduce eukaryotic cells either in vitro or in vivo. The transduced eukaryotic cells express angiogenic proteins.

【０４３０】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれる脈管形成
ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデ
ノウイルスは、それが脈管形成タンパク質をコードし、そして発現し、それと同
時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化される
ように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染
色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が
軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優
れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔ，Ａ．Ｒ．ら、（
１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）
。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１
−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されてい
る（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：
４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３
〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しよ
うとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。In certain other embodiments, angiogenic polynucleotides contained in adenovirus vectors are used to engineer cells ex vivo or in vivo. Adenovirus can be engineered such that it encodes and expresses angiogenic proteins and at the same time is inactivated with respect to its ability to replicate in the normal lytic viral life cycle. Adenovirus expression is achieved without integration of the viral DNA into the host cell chromosome, resulting in less worry about insertional mutagenesis. In addition, adenovirus has been used for many years as a live intestinal vaccine with excellent safety features (Schwartzet, AR et al., (
1974) Am. Rev. Respir. Dis. , 109: 233-238).
. Finally, adenovirus-mediated gene transfer leads to α-1 in the lungs of cotton rats.
-Demonstrated in a number of examples including the transfer of antitrypsin and CFTR (Rosenfeld, MA et al., (1991) Science, 252:
431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143.
~ 155). Moreover, extensive research seeking to establish adenovirus as a causative agent in human cancers was uniformly negative (Green, M. et al. (1979).
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 6606).

【０４３１】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。Suitable adenovirus vectors useful in the present invention are, for example, Koz.
arsky and Wilson, Curr. Opin. Genet. Devel
． 3: 499-503 (1993); Rosenfeld et al., Cell, 68.
: 143-155 (1992); Engelhardt et al., Human Gen.
et. Ther. 4: 759-769 (1993); Yang et al., Nature.
e Genet, 7: 362-369 (1994); Wilson et al., Natu.
Re, 365: 691-692 (1993); and US Pat. No. 5,652,2.
24, which are hereby incorporated by reference. For example, the adenovirus vector Ad2 is useful and can be propagated in human 293 cells. These cells contain the adenovirus E1 region and constitutively express Ela and Elb, which complement the defective adenovirus by providing the product of the gene deleted from this vector. . In addition to Ad2, a variety of other adenoviruses (eg, Ad3, Ad5, and Ad7) are also useful in the present invention.

【０４３２】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰ
プロモーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが
、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１からＬ５までのすべてまたは一
部のうちの１つ以上にて欠失され得る。[0432] Preferably, the adenovirus used in the present invention is replication defective. Replication-defective adenoviruses require the help of helper viruses and / or packaging cell lines to form infectious particles. The resulting virus is capable of infecting cells and contains a promoter (eg, HARP of the invention).
It is capable of expressing the polynucleotide of interest operably linked to a promoter) but is incapable of replicating in most cells. Replication-defective adenoviruses have the following genes:
It may be deleted at one or more of E1a, E1b, E3, E4, E2a or all or part of L1 to L5.

【０４３３】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、***中では
ない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。
３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組
み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。その
ようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特
許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７
８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８
，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。In certain other embodiments, adeno-associated virus (AAV) is used to engineer the cells ex vivo or in vivo. AAV is a naturally occurring defective virus that requires a helper virus to produce infectious particles (
Muzyczka, N .; Curr. Topics in Microbiol
． Immunol. , 158: 97 (1992)). AAV is also one of the few viruses that can integrate its DNA into cells that are not dividing.
Vectors containing AAV as small as 300 base pairs can be packaged and can integrate, but space for exogenous DNA is limited to about 4.5 kb. Methods of generating and using such AAV are known in the art. For example, US Pat. Nos. 5,139,941, 5,173,414 and 5,354,67.
No. 8, No. 5,436, 146, No. 5,474, 935, No. 5, 478.
, 745 and 5,589,377.

【０４３４】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、脈管形成ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで
、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含
む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウ
イルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘル
パーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウ
イルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトラ
ンスフェクトおよび感染されると、それらは脈管形成ポリヌクレオチド構築物を
含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボ
のいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞に形質導入する。
この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれた脈管形成ポリヌクレオチド構築
物を含み、そして脈管形成タンパク質を発現する。For example, an AAV vector suitable for use in the present invention contains all the sequences necessary for DNA replication, encapsidation, and host cell integration. Sam
Brook et al., Molecular Cloning: A Laborator.
y Manual, Cold Spring Harbor Press (19
The angiogenic polynucleotide construct is inserted into this AAV vector using standard cloning methods, such as those found in 89). The recombinant AAV vector is then transfected into packaging cells infected with helper virus using any standard technique, including lipofection, electroporation, calcium phosphate precipitation and the like. Suitable helper viruses include adenovirus, cytomegalovirus, vaccinia virus, or herpes virus. Once the packaging cells are transfected and infected, they produce infectious AAV viral particles that contain the angiogenic polynucleotide construct. These viral particles are then used to transduce eukaryotic cells, either ex vivo or in vivo.
The transduced cell contains an angiogenic polynucleotide construct integrated into its genome and expresses an angiogenic protein.

【０４３５】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、脈管形成タンパク質をコードし
ている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在
しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベル
で発現する、遺伝子の活性化を含む。Another method of gene therapy is homologous recombination (see, eg, US Pat. No. 5,641,6).
70, published June 24, 1997; International Publication No. WO 96/29411, 19
Published September 26, 1996; International Publication No. WO94 / 12650, August 4, 1994
Published: Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
6: 8932-8935 (1989); and Zijlstra et al., Nature.
342: 435-438 (1989)), operably linking the heterologous regulatory region and the endogenous polynucleotide sequence (eg, a sequence encoding an angiogenic protein). Including. The method involves activation of a gene that is present in the target cell but is normally not expressed in that cell or is expressed at a lower level than desired.

【０４３６】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターは、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、本発明の脈管形成タンパク質
の所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それ
ゆえ、相同組換えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結され
る。Polynucleotide constructs are made using standard techniques known in the art. This construct contains a promoter with targeting sequences flanking the promoter. Suitable promoters are described herein. The targeting sequence is sufficiently complementary to the endogenous sequence to allow homologous recombination between the promoter-targeting sequence and the endogenous sequence. The targeting sequence is located sufficiently close to the 5'end of the desired endogenous polynucleotide sequence of the angiogenic protein of the invention so that upon homologous recombination, the promoter will render the endogenous sequence operable. Be connected.

【０４３７】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。The promoter and targeting sequence can be amplified using PCR. Preferably, the amplified promoter contains additional restriction enzyme sites at the 5'and 3'ends. Preferably, the 3'end of the first targeting sequence contains the same restriction enzyme sites as the 5'end of the amplified promoter, and the 5'end of the second targeting sequence contains the 3'end of the amplified promoter. Includes the same restriction sites as the termini. The amplified promoter and targeting sequences are digested and ligated together.

【０４３８】 裸のポリヌクレオチドとしてか、または上記により詳細に記載されるようなリ
ポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈
殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、このプ
ロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、局
所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモー
ター−標的化配列を送達し得る。この方法を、以下により詳細に記載する。Either as a naked polynucleotide or with a transfection facilitating agent such as liposomes, viral sequences, viral particles, whole viruses, lipofections, precipitants, etc. as described in more detail above. And deliver the promoter-targeting sequence construct to cells. The P promoter-targeting sequence may be delivered by any method, including direct needle injection, intravenous injection, topical administration, catheter infusion, particle accelerators and the like. This method is described in more detail below.

【０４３９】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、脈管形成タンパク質をコー
ドする内在性配列は、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプ
ロモーターは、内在性脈管形成配列の発現を駆動する。The promoter-targeting sequence construct is taken up by cells. Homologous recombination occurs between this construct and the endogenous sequence, such that the endogenous sequence encoding the angiogenic protein is placed under the control of this promoter. This promoter then drives the expression of the endogenous angiogenic sequence.

【０４４０】 本発明の脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成
タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと共に投与され得る。Polynucleotides encoding angiogenic proteins of the invention can be administered with other polynucleotides that encode other angiogenic proteins.

【０４４１】 好ましくは、本発明の脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
、そのタンパク質の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含む。代表的に、この
シグナル配列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは
５’末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシ
グナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そし
てトランスフェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当
該分野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。Preferably, the polynucleotide encoding the angiogenic polypeptide of the present invention comprises a secretory signal sequence that facilitates secretion of the protein. Typically, the signal sequence is located in the coding region of the polynucleotide, expressed towards or at the 5'end of the coding region of the polynucleotide. The signal sequence may be homologous or heterologous to the polynucleotide of interest and homologous or heterologous to the transfected cells. In addition, the signal sequence can be chemically synthesized using methods known in the art.

【０４４２】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量で１つ以上の分子が
発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使用
され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティッ
ク（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲ
ルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質
、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（
錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティング適用または局所
適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿し
た裸のプラスミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注
入は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。Any mode of administration of any of the polynucleotide constructs described above may be used, so long as the mode of administration expresses one or more molecules in an amount sufficient to provide a therapeutic effect. This includes direct needle injection, systemic injection, catheter injection, biolistic injector, particle accelerator (ie "gene gun"), gel foam sponge depot, other commercially available depot materials, osmotic pressure. Pumps (eg Alza minipumps), solids for oral or suppository (
Tablets or pills) pharmaceutical formulations, and intra-operative decanting or topical applications. For example, direct injection of calcium phosphate-precipitated naked plasmid into rat liver and rat spleen or direct injection of protein-coated plasmid into the portal vein resulted in gene expression of foreign genes in rat liver (Kaneda).
Et al., Science, 243: 375 (1989)).

【０４４３】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、そして好ましくは数
ミリメートルで注射することをいう。The preferred method of local administration is by direct injection. Preferably, the recombinant molecule of the present invention complexed with the delivery vehicle is administered by direct injection into the arterial region or locally within the arterial region. Topical administration of the composition within the arterial region refers to injection of the composition into the artery several centimeters, and preferably several millimeters.

【０４４４】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。Another method of topical administration is to contact the polynucleotide constructs of the invention within or around a surgical wound. For example, a patient can undergo surgery and the polynucleotide construct can be coated on the tissue surface inside the wound or the construct can be injected into the tissue area inside the wound.

【０４４５】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するためのリガンドを含むリ
ポソームを含む。Therapeutic compositions useful for systemic administration include a recombinant molecule of the present invention complexed with a targeted delivery vehicle of the present invention. Suitable delivery vehicles for use in systemic administration include liposomes containing a ligand for targeting the vehicle to a particular site.

【０４４６】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
る能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成
することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、
当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げら
れる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌク
レオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。Preferred methods of systemic administration include intravenous injection, aerosol, oral and transdermal (topical) delivery. Intravenous injections may be performed using methods standard in the art. Aerosol delivery may also be performed using methods standard in the art (eg, Stribling, incorporated herein by reference).
Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 189: 11277-1.
1281 (1992)). Oral delivery can be accomplished by complexing the polynucleotide constructs of the present invention to a carrier capable of withstanding degradation by digestive enzymes in the intestine of the animal. Examples of such carriers include:
Mention may be made of plastic capsules or tablets, such as those known in the art. Topical delivery may be accomplished by mixing a lipophilic reagent (eg DMSO) that is capable of passing into the skin with a polynucleotide construct of the present invention.

【０４４７】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。Determining the effective amount of a substance to be delivered can be determined, for example, by the chemical structure and biological activity of the substance, the age and weight of the animal, the exact condition requiring treatment and its severity, and administration. It may depend on a number of factors, including the pathway. The frequency of treatment is
It depends on many factors such as the amount of polynucleotide construct administered per dose and the health and medical history of the subject. The exact amount, frequency of dosing and timing of dosing will be determined by the attending physician or veterinarian.

【０４４８】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。The therapeutic compositions of the present invention may be administered to any animal, preferably mammals and birds. Preferred mammals include humans, dogs, cats, mice, rats,
Rabbits, sheep, cows, horses and pigs are mentioned, with humans being particularly preferred.

【０４４９】 （薬学的組成物） 脈管形成のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびにアゴニストおよびアン
タゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。このような
組成物は、治療的に有効な量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴ
ニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキ
ャリアには、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロー
ル、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない
。この処方物は、投与の様式に適合するべきである。Pharmaceutical Compositions Angiogenic polypeptides, polynucleotides, and agonists and antagonists can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide or agonist or antagonist and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The formulation should suit the mode of administration.

【０４５０】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を入れた１以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品または
生物学的生成物の製造、使用、または販売を監督する政府機関によって規定され
る形式の通知書が付随し得る。この通知書は、ヒト投与についての製造、使用、
および販売の監督官庁の認可を反映する。さらに、この薬学的組成物は、他の治
療化合物とともに使用され得る。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers containing one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the invention. Such containers may be accompanied by a notice in the form prescribed by a governmental agency that oversees the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products. This notice states that manufacturing, use,
And reflects the approval of the marketing authority. In addition, the pharmaceutical composition can be used with other therapeutic compounds.

【０４５１】 この薬学的組成物は、都合のよい様式で（例えば、局所的、静脈内、腹腔内、
筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻内、または皮内の経路で）投与され得る。この薬学的
組成物は、特異的な徴候の処置および／または予防のために有効である量で投与
される。一般的に、この薬学的組成物は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量
で、そして大部分の場合において、これは、１日あたり約８ｇｍ／Ｋｇ体重を超
えない量で投与される。大部分の場合において、この投薬量は、投与の経路、症
状などを考慮に入れて、毎日約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である
。The pharmaceutical composition may be administered in a convenient fashion (eg, topical, intravenous, intraperitoneal,
Can be administered intramuscularly, intratumorally, subcutaneously, intranasally, or intradermally). The pharmaceutical composition is administered in an amount that is effective for the treatment and / or prevention of specific symptoms. Generally, the pharmaceutical composition is administered in an amount of at least about 10 mg / kg body weight, and in most cases, no more than about 8 gm / Kg body weight per day. In most cases, this dosage will be from about 10 mg / kg body weight to about 1 mg / kg body weight daily, taking into account the route of administration, symptoms, etc.

【０４５２】 脈管形成ポリペプチド、ならびにポリペプチドである、アゴニストまたはアン
タゴニストはまた、このようなポリペプチドのインビボでの発現によって、本発
明に従って使用され得る。このことは、しばしば、上記のように、「遺伝子治療
」と呼ばれる。Angiogenic polypeptides, as well as polypeptides, agonists or antagonists can also be used in accordance with the present invention by in vivo expression of such polypeptides. This is often referred to as "gene therapy", as described above.

【０４５３】 従って、例えば、細胞（例えば、骨髄細胞）は、このポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、
次いで、この操作された細胞は、このポリペプチドで処置される患者に提供され
る。このような方法は、当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリ
ペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用による、当該分野
で公知の手順によって操作され得る。Thus, for example, a cell (eg, bone marrow cell) can be engineered ex vivo with a polynucleotide (DNA or RNA) encoding the polypeptide,
The engineered cells are then provided to the patient treated with the polypeptide. Such methods are well known in the art. For example, cells can be engineered by procedures known in the art by the use of retroviral particles containing RNA encoding the polypeptides of the present invention.

【０４５４】 同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボでのポリ
ペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。当該分野において公知のよう
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を産生
するためのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビ
ボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法によっ
て本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発
明の教示より、当業者に明らかであるはずである。例えば、操作する細胞につい
ての発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外（例えば、アデノウイルス）であ
り得、これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後に、インビボで細胞を操作
するために使用され得る。Similarly, cells may be engineered in vivo for expression of the polypeptide in vivo, eg, by procedures known in the art. As is known in the art, producer cells for producing retroviral particles containing RNA encoding a polypeptide of the invention may be used to engineer cells in vivo and for expression of the polypeptide in vivo. Can be administered to. These and other methods for administering the polypeptides of the present invention by such methods should be apparent to those of ordinary skill in the art in view of the teachings of the present invention. For example, the expression vehicle for the engineered cell can be other than a retroviral particle, such as an adenovirus, which can be used to engineer the cell in vivo after combination with a suitable delivery vehicle.

【０４５５】 本明細書中上記で言及した、レトロウイルスプラスミドベクターが由来するレ
トロウイルスは、以下を含み得るがこれらに限定されない：モロニーマウス白血
病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス
、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス）、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳
動物腫瘍ウイルス。１つの実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。The retroviruses from which the retroviral plasmid vectors referred to herein above may include, but are not limited to: Moloney murine leukemia virus, splenic necrosis virus, retroviruses (eg, Rous sarcoma virus). , Hervey Sarcoma Virus, Avian Leukemia Virus, Gibbon Leukemia Virus, Human Immunodeficiency Virus), Adenovirus, Myeloproliferative Sarcoma Virus, and Mammalian Tumor Virus. In one embodiment, the retroviral plasmid vector is derived from Moloney murine leukemia virus.

【０４５６】 本発明のベクターは、１以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロ
モーターには以下が含まれるがこれらに限定されない：レトロウイルスＬＴＲ：
ＳＶ４０プロモーター：およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９
８９）において記載されている）、または他の任意のプロモーター（例えば、真
核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーター（ヒストンプロモーター、ｐ
ｏｌ ＩＩＩプロモーター、およびｂ−アクチンプロモーターを含むがこれらに
限定されない））。使用され得る他のウイルスプロモーターには以下が含まれる
がこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター。適切なプロモー
ターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。Vectors of the invention include one or more promoters. Suitable promoters that may be used include, but are not limited to: Retroviral LTR:
SV40 promoter: and human cytomegalovirus (CMV) promoter (Miller et al., Biotechniques 7: 980-990 (19).
89)), or any other promoter (eg cellular promoter such as eukaryotic cell promoter (histone promoter, p.
ol III promoter, and b-actin promoter). Other viral promoters that can be used include, but are not limited to: adenovirus promoter, thymidine kinase (T
K) promoter, and B19 parvovirus promoter. Selection of the appropriate promoter will be apparent to those of skill in the art from the teachings contained herein.

【０４５７】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
にある。使用され得る適切なプロモーターには、以下が含まれるがこれらに限定
されない：アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロ
モーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター
（例えば、ＭＭＴプロモーター）；メタロチオネインプロモーター；熱ショック
プロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビ
ンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純疱疹チ
ミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中上記の改変
レトロウイルスＬＴＲを含む）；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーター。このプロモーターはまた、本発明のポリペプチドをコード
する遺伝子を制御するネイティブなプロモーターであり得る。The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention is under the control of a suitable promoter. Suitable promoters that can be used include, but are not limited to, adenovirus promoters (eg, adenovirus major late promoter); or heterologous promoters (eg, cytomegalovirus (CMV)).
) Promoter); RS virus (RSV) promoter; inducible promoter (for example, MMT promoter); metallothionein promoter; heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI promoter; human globin promoter; viral thymidine kinase promoter (for example, herpes simplex thymidine kinase promoter) ); Retrovirus LTRs (including modified retrovirus LTRs herein above); b-actin promoter; and human growth hormone promoter. The promoter can also be the native promoter that controls the gene encoding the polypeptide of the invention.

【０４５８】 レトロウイルスプラスミドベクターが使用されて、パッケージング細胞株に形
質導入して、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｍｉｌｌｅ
ｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４（１９９０）（こ
れは、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるような、Ｐ
Ｅ５０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−
１９−１７−Ｈ２、ｙＣＲＥ、ｙＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ
１２、およびＤＡＮの細胞株。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段を
通してパッケージング細胞株に形質導入し得る。このような手段には、エレクト
ロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が含まれるがこれら
に限定されない。１つの代替として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リ
ポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質と結合され得、次いで、宿主に
投与され得る。Retroviral plasmid vectors are used to transduce packaging cell lines to form producer cell lines. Examples of packaging cells that can be transfected include, but are not limited to: Mille
R., et al., Human Gene Therapy 1: 5-14 (1990), which is incorporated herein by reference in its entirety.
E501, PA317, y-2, y-AM, PA12, T19-14X, VT-
19-17-H2, yCRE, yCRIP, GP + E-86, GP + envAm
12, and the DAN cell line. The vector may transduce the packaging cell line through any means known in the art. Such means, electroporation, the use of liposomes, and are included CaPO 4 precipitated without limitation. As one alternative, the retroviral plasmid vector can be encapsulated in liposomes or associated with lipids and then administered to the host.

【０４５９】 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レ
トロウイルスベクターを生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター
粒子が使用されて、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞に形質
導入され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸
配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞には、以下が含まれるがこれら
に限定されない：胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維
芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞。The producer cell line produces an infectious retroviral vector containing a nucleic acid sequence encoding a polypeptide. Such retroviral vector particles can then be used to transduce eukaryotic cells either in vitro or in vivo. Transduced eukaryotic cells express a nucleic acid sequence encoding a polypeptide. Eukaryotic cells that can be transduced include, but are not limited to, embryonic stem cells, embryonal cancer cells, as well as hematopoietic stem cells, hepatocytes, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, And bronchial epithelial cells.

【０４６０】 （診断アッセイ） 本発明はまた、脈管形成タンパク質をコードする核酸配列における変異の存在
に関する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部と
しての、脈管形成タンパク質をコードする遺伝子の使用に関する。Diagnostic Assays The invention also encodes angiogenic proteins as part of a diagnostic assay for detecting a disease or susceptibility to a disease associated with the presence of a mutation in a nucleic acid sequence encoding an angiogenic protein. The use of the gene to do.

【０４６１】 脈管形成タンパク質をコードする遺伝子における変異を有する個体は、種々の
技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（
例えば、血液）、尿、唾液、組織生検、および剖検材料から得られ得る。ゲノム
ＤＮＡは、検出のための直接使用され得るか、または分析の前にＰＣＲ（Ｓａｉ
ｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６（１９８６））を使用して酵素
的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のために使用され得
る。例として、脈管形成タンパク質をコードする核酸に対して相補的であるＰＣ
Ｒプライマーは、その変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、
欠失および挿入は、正常な遺伝子型に対して比較した増幅産物のサイズの変化に
よって検出され得る。点変異は、増幅したＤＮＡを、脈管形成タンパク質をコー
ドする放射性標識したＲＮＡ、または代替的に、脈管形成タンパク質をコードす
るＲＮＡに特異的な放射性標識したアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさ
せることによって、同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化
または融解温度の違いによって、一致していない二重鎖から区別され得る。Individuals with mutations in the gene encoding the angiogenic protein can be detected at the DNA level by a variety of techniques. Nucleic acid for diagnosis is
For example, blood), urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy material. Genomic DNA can be used directly for detection, or PCR (Sai) prior to analysis.
ki et al., Nature 324: 163-166 (1986)). RNA or cDNA may also be used for the same purpose. As an example, PC is complementary to a nucleic acid encoding an angiogenic protein
The R primer can be used to identify and analyze the mutation. For example,
Deletions and insertions can be detected by a change in the size of the amplification product compared to the normal genotype. Point mutations allow the amplified DNA to hybridize with radiolabeled RNA encoding angiogenic proteins, or, alternatively, radiolabeled antisense DNA sequences specific for RNA encoding angiogenic proteins. Can be identified by Perfectly matched sequences can be distinguished from unmatched duplexes by differences in RNase A digestion or melting temperatures.

【０４６２】 ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は、変性剤の存在下または非存在下で、
ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動的な移動度の変化の検出によって達成さ
れ得る。小さな配列の欠失および挿入は、高解像度のゲル電気泳動によって可視
化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲル上
で区別され得る。ここで、異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、ゲル中で、そ
れらの特異的な融解温度および部分的な融解温度に従って異なる位置において遅
れる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）
を参照のこと）。Genetic testing based on differences in DNA sequence was performed in the presence or absence of denaturing agents,
This can be accomplished by detection of electrophoretic mobility changes of the DNA fragment in the gel. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. DNA fragments of different sequences can be distinguished on a denaturing formamide gradient gel. Here, the mobilities of different DNA fragments are delayed at different positions in the gel according to their specific and partial melting temperatures (eg Myers et al., Science 230: 1242 (1985)).
checking).

【０４６３】 特定の位置での配列の変化もまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮ
ａｓｅおよびＳ１保護）または化学的切断法によって示され得る（例えば、Ｃｏ
ｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８５））。Sequence changes at specific positions can also be associated with nuclease protection assays (eg, RN
ase and S1 protection) or chemical cleavage methods (eg Co
tton et al., PNAS, USA 85: 4397-4401 (1985)).

【０４６４】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フ
ラグメント長多型（ＲＦＬＰ））、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティング
のような方法によって達成され得る。Thus, the detection of specific DNA sequences may include hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing or the use of restriction enzymes (eg, restriction fragment length polymorphism (RFLP)), and genomic DNA. It can be achieved by methods such as Southern blotting.

【０４６５】 より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異誘発もまた
、インサイチュ分析によって検出され得る。In addition to the more conventional gel electrophoresis and DNA sequencing, mutagenesis can also be detected by in situ analysis.

【０４６６】 本発明はまた、種々の組織における脈管形成タンパク質の変化したレベルを検
出するための診断アッセイに関する。なぜなら、通常のコントロール組織サンプ
ルと比較したタンパク質の過剰発現は、疾患（例えば、異常な細胞増殖）の存在
またはその疾患に対する感受性を検出し得るからである。宿主由来のサンプル中
の脈管形成タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者
に周知であり、そしてこれには、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイ
が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）、第６章、（１９９１）
）は、最初に、脈管形成タンパク質抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクロ
ーナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がモノクロー
ナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、検出可能な試薬（例え
ば、放射能、蛍光、またはこの場合においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵
素）が結合される。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパ
ク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベ
ートされる。次いで、ディッシュ上のいかなる遊離のタンパク質結合部位も、非
特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることに
よって覆われる。次に、モノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体がポリ
スチレンディッシュに結合したいかなる脈管形成タンパク質とも結合する時間の
間、ディッシュ中でインキュベートされる。すべての非結合モノクローナル抗体
は、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたレポータ
ー抗体は、ディッシュ中に置かれ、これは、レポーター抗体の、脈管形成タンパ
ク質に結合したモノクローナル抗体への結合を生じる。次いで、未結合のレポー
ター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加さ
れ、そして所定の時間の期間で発色した色の量は、標準曲線に対して比較した場
合に、患者サンプルの所定の容量中に存在する脈管形成タンパク質の量の尺度で
ある。The present invention also relates to diagnostic assays for detecting altered levels of angiogenic proteins in various tissues. This is because overexpression of the protein compared to normal control tissue samples can detect the presence or susceptibility to a disease (eg, abnormal cell proliferation). Assays used to detect levels of angiogenic proteins in a sample from a host are well known to those of skill in the art and include radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot analysis, ELISA assays, and A "sandwich" assay is included. ELISA assay (Coligan et al., Current Pro
tocols in Immunology 1 (2), Chapter 6, (1991)
) Initially comprises the step of preparing an antibody (preferably a monoclonal antibody) specific for the angiogenic protein antigen. In addition, a reporter antibody is prepared against the monoclonal antibody. A detectable reagent (eg, radioactivity, fluorescence, or horseradish peroxidase enzyme in this case) is attached to the reporter antibody. The sample is removed from the host and incubated on a solid support (eg, polystyrene dish) that binds the proteins in the sample. Any free protein binding sites on the dish are then covered by incubation with a non-specific protein (eg bovine serum albumin). The monoclonal antibody is then incubated in the dish for the time that the monoclonal antibody binds to any angiogenic protein bound to the polystyrene dish. All unbound monoclonal antibody is washed out with buffer. A reporter antibody conjugated to horseradish peroxidase is placed in the dish, which results in the binding of the reporter antibody to the monoclonal antibody bound to the angiogenic protein. Unbound reporter antibody is then washed away. The peroxidase substrate is then added to the dish and the amount of color developed over a period of time is the amount of angiogenic protein present in a given volume of patient sample when compared against a standard curve. Is a measure of.

【０４６７】 競合アッセイが利用され得、ここでは脈管形成タンパク質に特異的な抗体が固
体支持体に結合されている。次いで、本発明のポリペプチドは、例えば、放射能
によって標識され、そして宿主由来のサンプルが固体支持体を通過し、そして検
出された標識の量（例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって
検出される）は、サンプル中の脈管形成タンパク質の量と相関し得る。Competitive assays may be utilized in which an antibody specific for angiogenic protein is attached to a solid support. A polypeptide of the invention is then labeled, eg, by radioactivity, and a sample from the host is passed through a solid support, and the amount of label detected (eg, detected by liquid scintillation chromatography) is , Can be correlated with the amount of angiogenic protein in the sample.

【０４６８】 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンド
イッチ」アッセイにおいて、脈管形成タンパク質は、固体支持体を通過し、そし
て固体支持体に結合している抗体に結合する。次いで、第２の抗体が脈管形成タ
ンパク質に結合する。次いで、標識されかつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は
、固体支持体を通過し、そして第２の抗体に結合し、次いで量が定量され得る。The “sandwich” assay is similar to the ELISA assay. In the "sandwich" assay, angiogenic proteins pass through the solid support and bind to the antibody bound to the solid support. The second antibody then binds to the angiogenic protein. A third antibody, labeled and specific for the second antibody, then passes through the solid support and binds to the second antibody, and the amount can then be quantified.

【０４６９】 （ポリヌクレオチドの同定） 本発明の配列はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト染色
体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。
さらに、染色体上の特定の部位を同定する必要性が現在存在する。実際の配列デ
ータ（反復多型のデータ）に基づく染色体マーキング試薬は、染色***置のマー
キングのために現在ほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色体
へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子とそれらの配列とを相関付ける際の重
要な第１の工程である。Polynucleotide Identification The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. The sequence is specifically targeted to and can hybridize with a particular location on an individual human chromosome.
Moreover, there is a current need to identify specific sites on the chromosome. Chromosome marking reagents based on actual sequence data (data for repeat polymorphisms) are currently scarcely available for marking chromosomal locations. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating disease-associated genes with their sequences.

【０４７０】 手短には、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２
５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得る。ｃＤＮＡのコ
ンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡにおける１より多くのエキソンにまた
がらないプライマーを迅速に選択し、それによって増幅プロセスは複雑にされる
。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッド
のＰＣＲスクリーニングのために使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を
含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを産生する。Briefly, the sequences are PCR primers derived from cDNA (preferably 15-2
5 bp) can be mapped to the chromosome. Computer analysis of the cDNA is used to rapidly select primers that do not span more than one exon in genomic DNA, thereby complicating the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Only hybrids containing the human gene corresponding to the primer will produce an amplified fragment.

【０４７１】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割
り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
本発明を使用して、特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールからのフ
ラグメントのパネルで、サブローカリゼーションが、類似の様式で達成され得る
。その染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピングストラ
テジーには、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別され
た（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色
体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる
プレ選択が含まれる。PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for assigning specific DNA to specific chromosomes. Using the present invention with the same oligonucleotide primers, sublocalization can be achieved in a similar fashion with panels of fragments from specific chromosomes or pools of large genomic clones. Other mapping strategies that may also be used to map to that chromosome include in situ hybridization, prescreening with labeled flow-sorted chromosomes, and construction of chromosome-specific cDNA libraries. Preselection by hybridization to

【０４７２】 中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色***置を提
供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブ
とともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参
照のこと。Fluorescence in situ hybridization (“FISH”) of cDNA clones to metaphase chromosome spreads can be used to provide the correct chromosomal location in one step. This technique can be used with probes derived from cDNA as short as 50 or 60 bp. For a review of this technology, see Verma et al., Human.
Chromosomes: A Manual Of Basic Techni
ques, Pergamon Press, New York (1988).

【０４７３】 一旦、配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝子マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例
えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見い
出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関
係を、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical position of that sequence on the chromosome can be correlated to genetic map data. Such data can be found, for example, in V.I. McKusick, Mendelian Inheritance
In Man (Johns Hopkins University, Welc
h Medical Library) (available online from Medical Library). The relationship between genes and diseases that map to the same chromosomal region is then identified via linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes).

【０４７４】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。[0474] It is then necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in normal individuals, the mutation may be the causative agent of the disease.

【０４７５】 物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現状の分解能を用いて、
疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられたｃＤＮＡは、５０と５００の
間の潜在的な原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング
分解能および２０ｋｂあたり１つの遺伝子を仮定している。） 罹患した個体および罹患していない個体の比較は、一般的に、染色体における
構造的変更（例えば、欠失または転座）を探索することを第１に含み、この変更
は、染色体のスプレッドから可視的であるか、またはそのｃＤＮＡ配列に基づく
ＰＣＲを用いて検出可能である。最終的に、何人かの個体からの遺伝子の完全な
配列決定は、変異の存在を確認しかつ多型性からの変異を区別するために必要と
される。Using the current resolution of physical and genetic mapping techniques,
A cDNA correctly located in a chromosomal region associated with disease can be one of between 50 and 500 potential causative genes. (This assumes a mapping resolution of 1 megabase and one gene per 20 kb.) Comparisons of affected and unaffected individuals generally show structural alterations in chromosomes (eg, deletions). Or translocation), the alteration being visible from the chromosomal spread or detectable using PCR based on its cDNA sequence. Finally, complete sequencing of genes from some individuals is needed to confirm the presence of mutations and distinguish mutations from polymorphisms.

【０４７６】 一般的に本発明を記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
より、より容易に理解される。この実施例は、例示のために提供されるが、限定
することを意図しない。Having generally described the invention, the invention will be more readily understood by reference to the following examples. This example is provided for purposes of illustration and not intended to be limiting.

【０４７７】 （実施例） （実施例１：脈管形成タンパク質のインビトロ発現） （実施例１Ａ：脈管形成タンパク質の細菌性発現および精製） 脈管形成タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、プロセスされたタンパク質の
５’配列（シグナルペプチド配列を不足する）およびこの遺伝子に対するベクタ
ー３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
この遺伝子に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’配列および３’配
列に付加する。このＰＣＲ産物を、ｐＱＥ６０にクローニングし得る（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ９１３１１）。Examples Example 1: In Vitro Expression of Angiogenic Proteins Example 1A: Bacterial Expression and Purification of Angiogenic Proteins DNA sequences encoding angiogenic proteins were processed. Amplification was carried out using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5'sequence of the protein (lacking the signal peptide sequence) and the vector 3'sequence for this gene.
Additional nucleotides corresponding to this gene are added to the 5'and 3'sequences, respectively. This PCR product can be cloned into pQE60 (Qiag
en, Inc. Chatsworth, CA 91311).

【０４７８】 制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ６０における制限酵素部位に対応
する。ｐＱＥ−６０は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、複製の細菌起源（ｏｒｉ）
、ＩＰＴＧ調節可能プロモーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、
６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、ｑＱＥ６０をＮｃｏ
ＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ６０中にライゲートし、
そしてヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）をコードする配列と
インフレームに挿入する。次いで、このライゲーション混合物を使用して、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載される手順により、Ｑｉａｇｅｎより入手可能
なＥ．ｃｏｌｉ鎖Ｍ１５／ｒｅｐ４を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、複数
のプラスミドｐＲＥＰ４の複製を含み、このプラスミドは、ｌａｃＩリプレッサ
ーを発現し、かつまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。形質転換体を
、それらがＬＢプレート上で増殖する能力によって同定し、そしてアンピシリン
／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制
限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／
ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地の液体培地で
一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。このＯ／Ｎ培養物を用いて、１：１００から１：２
５０の比で大きな培養物を接種する。この細胞を、０．４と０．６との間の吸光
度６００（Ｏ．Ｄ．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル
−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭまで添加する。ＩＰＴ
Ｇは、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することにより、Ｐ／Ｏをクリアにし、遺
伝子発現の増大をもたらすことを誘導する。細胞をもう３〜４時間増殖させる。
次いで細胞を遠心分離により採集した。この細胞ペレットを、カオトロピズム剤
６ＭグアニジンＨＣｌ中に溶解する。明澄化の後、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質によってしっかりと結合させる条件下でニッケルキレートカラム上でのクロ
マトグラフィーにより、この溶液から可溶化脈管形成タンパク質を精製する（Ｈ
ｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７〜
１８４（１９８４））。このタンパク質を、６ＭグアニジンＨＣｌ ｐＨ５．０
中でカラムから溶出し、そして再生の目的のために３モル濃度のグアニジンＨＣ
ｌ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ミリモル濃度のグルタチオン（還元型
）および２ミリモル濃度のグルタチオン（酸化型）に調節する。１２時間のこの
溶液中のインキュベーションの後、このタンパク質を１０ミリ濃度のリン酸ナト
リウムに透析する。The restriction enzyme site corresponds to the restriction enzyme site in the bacterial expression vector pQE60. pQE-60 is antibiotic resistant (Amp r ), bacterial origin of replication (ori)
, An IPTG regulatable promoter (P / O), a ribosome binding site (RBS),
It encodes a 6-His tag and a restriction enzyme site. Next, change qQE60 to Nco
Digested with I and BglII. The amplified sequence was ligated into pQE60,
It is then inserted in frame with the sequences encoding the histidine tag and the ribosome binding site (RBS). This ligation mixture was then used to
mbrook, J.M. Et al., Molecular Cloning: A Labor.
atory Manual, Cold Spring Laboratory
Press, (1989), by the procedure described in E. coli available from Qiagen. The E. coli chain M15 / rep4 was transformed. M15 / rep4 contains the replication of multiple plasmids pREP4, which expresses the lacI repressor and also confers kanamycin resistance (Kan r ). Transformants were identified by their ability to grow on LB plates and ampicillin / kanamycin resistant colonies were selected. Plasmid DNA was isolated and confirmed by restriction analysis. Clones containing the desired construct were cloned into Amp (100 μg /
ml) and Kan (25 μg / ml) in LB medium liquid medium supplemented overnight (O / N). Using this O / N culture, 1: 100 to 1: 2
Inoculate a large culture at a ratio of 50. The cells are grown to an absorbance 600 (OD 600 ) between 0.4 and 0.6. IPTG (“Isopropyl-BD-thiogalactopyranoside”) is then added to a final concentration of 1 mM. IPT
G induces by clearing P / O by inactivating the lacI repressor, leading to increased gene expression. Allow cells to grow for another 3-4 hours.
The cells were then harvested by centrifugation. The cell pellet is dissolved in the chaotropic agent 6M guanidine HCl. After clarification, the solubilized angiogenic protein is purified from this solution by chromatography on a nickel chelate column under conditions that allow it to be tightly bound by a protein containing a 6-His tag (H
ochuli, E .; Et al., J. Chromatography 411: 177-
184 (1984)). This protein was added to 6M guanidine HCl pH 5.0.
Eluted from the column in, and for regeneration purposes, 3 molar concentrations of guanidine HC
1, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced) and 2 mM glutathione (oxidized). After 12 hours of incubation in this solution, the protein is dialyzed against 10 millimolar sodium phosphate.

【０４７９】 上記のベクターに加えて、本発明は、さらに、脈管形成ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたファージプロモーターおよびプロ
モーターエレメントを含む発現ベクター（ｐＨＥ４ａといわれる）（ＡＴＣＣ登
録番号２０９６４５、１９９８年２月２５日に寄託）を含む。このベクターは、
以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
遺伝子、２）複製のＥ．ｃｏｌｉ起源、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４
）２つのラックオペレーター配列、５）Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、お
よび６）ラクトースオペロンレセプター遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製の起源（ｏ
ｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来す
る。プロモーター配列およびオペレーター配列は、合成的に作成される。In addition to the above vector, the present invention further provides an expression vector (referred to as pHE4a) (referred to as pHE4a) that includes a phage promoter and promoter elements operably linked to a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide. No. 209645, deposited on February 25, 1998). This vector
Includes: 1) Neomycin phosphotransferase gene as a selectable marker, 2) E. coli for replication. E. coli origin, 3) T5 phage promoter sequence, 4
) 2 rack operator sequences, 5) Shine-Delgarno sequence, and 6) lactose operon receptor gene (lacIq). Origin of replication (o
riC) is derived from pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). The promoter and operator sequences are made synthetically.

【０４８０】 ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１
８を有するベクターを制限し、ゲル上で制限された産物を走らせ、そしてより大
きなフラグメント（スタッファーフラグメントは、約３１０塩基対であるべきで
ある）を単離することによってｐＨＥａに挿入され得る。ＤＮＡ挿入物を、上記
のＰＣＲプロトコルに従って、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およＸｂａＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８（３’プライマー）についての制限部位を
有するＰＣＲプライマーを用いて作製する。ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そし
て適合可能な酵素で制限する。この挿入物およびベクターを、標準プロトコルに
従って連結する。DNA was transformed with NdeI and XbaI, BamHI, XhoI or Asp71.
It can be inserted into pHEa by restricting the vector with 8 and running the restricted product on a gel and isolating the larger fragment (the stuffer fragment should be about 310 base pairs). The DNA insert was digested with NdeI (5 ′ primer) and XbaI, Ba according to the PCR protocol above.
It is generated using PCR primers with restriction sites for mHI, XhoI or Asp718 (3 'primer). The PCR insert is gel purified and restricted with compatible enzymes. The insert and vector are ligated according to standard protocols.

【０４８１】 操作されたベクターを、細菌系におけるタンパク質を発現するために上記のプ
ロトコルにおいて容易に置換され得る。Engineered vectors can be readily replaced in the above protocol to express proteins in bacterial systems.

【０４８２】 （実施例１Ｂ：バキュロウイルス発現系における脈管形成タンパク質のクロー
ニングおよび発現） 全長脈管形成タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列お
よび３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する
。 増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離
する。次いで、このフラグメントを、エンドヌクレアーゼでそれぞれ消化し、そ
して１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントをＦ２と名付けた
。Example 1B: Cloning and Expression of Angiogenic Proteins in Baculovirus Expression System A DNA oligonucleotide encoding a full-length angiogenic protein was generated by PCR oligonucleotides corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. Amplify using primers. The amplified sequence was transferred to a commercial kit (“Geneclean” BIO 101
Inc. , La Jolla, Ca. ) Is used to isolate from a 1% agarose gel. The fragments were then each digested with endonuclease and repurified on a 1% agarose gel. This fragment was named F2.

【０４８３】 ベクターｐＡ２（下記に考察される、ｐＶＬ９４１ベクターの改変形）を、バ
キュロウイルス発現系を使用するこのタンパク質の発現のために使用する（概説
として、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、１９８７、Ａ
ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅ
ｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。この
発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウ
イルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続いて、制
限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉの認識部位を含む。シミア
ンウイルスＳＶ４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために
用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、ポリヘドリン
遺伝子のポリアデニル化シグナルを続けた。ポリヘドリン配列を、同時トランス
フェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス
配列によって両側に隣接させた。多くの他のバキュロウイルスベクター、例えば
、ｐＲＧ１、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１を、ｐＡ２の代わ
りに使用し得る（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１〜３９）。The vector pA2 (discussed below, a modified version of the pVL941 vector) is used for expression of this protein using the baculovirus expression system (for review, Summers, MD and Smith, G. E., 1987, A.
manual of methods for baculovirus v
vectors and insect cell culture process
dues, Texas Agricultural Experimenta
l Station Bulletin No. 1555). This expression vector contains the strong polyhedrin promoter of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), followed by recognition sites for the restriction endonucleases Bam HI and Xba I. The polyadenylation site of simian virus SV40 is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, E. The β-galactosidase gene from E. coli was inserted in the same direction as the polyhedrin promoter, followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. The polyhedrin sequence was flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination of co-transfected wild type viral DNA. Many other baculovirus vectors, such as pRG1, pAc373, pVL941 and pAcIM1 may be used in place of pA2 (Luckow, VA and Summers, MD, V.
irology, 170: 31-39).

【０４８４】 当該分野で公知の手順を用いて、このプラスミドを制限酵素で消化し、次いで
、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を
用いて、ＤＮＡを１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本
明細書中でＶ２と命名する。This plasmid is digested with restriction enzymes and then dephosphorylated with calf intestinal phosphatase using procedures known in the art. Then, a commercially available kit ("
Geneclean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca) is used to isolate DNA from a 1% agarose gel. This vector DNA is designated herein as V2.

【０４８５】 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換し、プラスミドを
含有する細菌を、それぞれの制限酵素を用いて同定する。クローン化フラグメン
トの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 are ligated with T4 DNA ligase. Then E. E. coli DH5α cells are transformed and the plasmid-containing bacteria are identified using the respective restriction enzymes. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing.

【０４８６】 ５μｇのプラスミドを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）
）を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏ
ｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。5 μg of plasmid was treated with the lipofection method (Felgner et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987).
) Of 1.0 μg of commercially available linearized baculovirus (“BaculoGo
ld baculovirus DNA ", Pharmingen, San D
iego, CA. ) And co-transfection with.

【０４８７】 １μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドを、
５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ
．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌
ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレ
ース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次い
で、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３
５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
７１１）に滴下する。このプレートを前後に揺り動かして、新たに添加した溶液
を混合する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートする。５時間後
、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清
を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーター
に戻し、そして２７℃で４日間培養を続ける。1 μg BaculoGold viral DNA and 5 μg plasmid
50 μl of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc.
． , Gaithersburg, MD) in sterile wells of a microtiter plate. Afterwards 10 μl Lipofectin and 90 μl Grace's medium were added, mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The transfection mixture is then added to 3 ml with 1 ml Grace's medium without serum.
Sf9 insect cells (ATCC CRL 1 seeded in 5 mm tissue culture plates
711). The plate is rocked back and forth to mix the newly added solution. The plates are then incubated at 27 ° C for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution is removed from the plate and 1 ml Grace's insect medium supplemented with 10% fetal bovine serum is added. The plate is returned to the incubator and the culture is continued at 27 ° C. for 4 days.

【０４８８】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記
載されるようにプラークアッセイを行う。改変形として、青く染色されたプラー
クの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲル
を用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、９〜１０頁により配布
される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイドにおいても見い出
され得る）。After 4 days, the supernatants are collected and plaque assayed as described by Summers and Smith (supra). As a variant, "Blue Gal" (Life Techno), which allows easy isolation of blue-stained plaques.
logs Inc. , Gaithersburg). (A detailed description of the "plaque assay" can also be found in Life Techn.
logistics Inc. , Gaithersburg, pages 9-10, and can also be found in user guides for insect cell culture and baculovirology).

【０４８９】 連続希釈の４日後、このウイルスを細胞に添加し、青く染色されたプラークを
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒
天を、２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に再懸濁
する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルス
を含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種された昆虫Ｓｆ９細胞に感染させるた
めに用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを
４℃で保存する。Four days after serial dilution, the virus is added to the cells and blue-stained plaques are picked with an Eppendorf pipette tip. The agar containing the recombinant virus is then resuspended in Eppendorf tubes containing 200 μl Grace's medium. The agar is removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus is used to infect insect Sf9 cells seeded in 35 mm dishes. After 4 days, the supernatants of these culture dishes are harvested and then they are stored at 4 ° C.

【０４９０】 Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる
。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）２の組換えバキュロウイルスで感染させる。６
時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９
００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの［35Ｓ］−メチオニン
および５μＣｉの［35Ｓ］−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加する。細胞
をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、そし
て標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによ
り可視化する。Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells are infected with multiplicity of infection (MOI) 2 of recombinant baculovirus. 6
After hours, the medium was removed and SF9 depleted of methionine and cysteine
00 II medium (Life Technologies Inc., Gaith
ersburg). After 42 hours, 5 μCi [ 35 S] -methionine and 5 μCi [ 35 S] -cysteine (Amersham) are added. Cells are incubated for a further 16 hours, then cells are harvested by centrifugation and labeled proteins visualized by SDS-PAGE and autoradiography.

【０４９１】 精製されたタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列のマイクロ配列を使用して
産生された脈管形成タンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。The amino-terminal sequence of the angiogenic protein produced can be determined using microsequences of the amino-terminal amino acid sequence of the purified protein.

【０４９２】 （実施例１Ｃ：哺乳動物細胞における組換え脈管形成タンパク質の発現） （ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） プラスミドＸ−ＨＡ（Ｘは、目的の脈管形成タンパク質を表す）の発現は、以
下を含むベクターｐｃＤＮＡ３／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する：
（１）ＳＶ４０複製起点；（２）アンピシリン耐性遺伝子；（３）Ｅ．ｃｏｌｉ
複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０イン
トロン、およびポリアデニル化部位。脈管形成タンパク質の前駆体全体をコード
するＤＮＡフラグメントおよびその３’末端にインフレームで融合したＨＡタグ
を、このベクターのポリリンカー領域にクローン化する。従って、この組換えタ
ンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの指向下である。このＨＡタグは、以前に
記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープ（Ｉ．Ｗｉ
ｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、
Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７
６７）に対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、このＨＡエピトープ
を認識する抗体を用いる組換えタンパク質の簡単な検出を可能にする。Example 1C: Expression of Recombinant Angiogenic Proteins in Mammalian Cells (Cloning and Expression in COS Cells) Expression of plasmid X-HA (X represents the angiogenic protein of interest) Derived from the vector pcDNA3 / Amp (Invitrogen) containing:
(1) SV40 origin of replication; (2) ampicillin resistance gene; (3) E. coli
Origin of replication; (4) CMV promoter followed by polylinker region, SV40 intron, and polyadenylation site. The DNA fragment encoding the entire precursor of the angiogenic protein and the HA tag fused in frame to its 3'end are cloned into the polylinker region of this vector. Therefore, this recombinant protein expression is under the control of the CMV promoter. This HA tag is derived from an epitope (I. Wi) from the previously described influenza hemagglutinin protein.
lson, H .; Niman, R .; Heighten, A .; Cherenson,
M. Conony, and R.M. Lerner, 1984, Cell 37: 7.
67). Fusion of the HA tag to the target protein allows easy detection of the recombinant protein with an antibody that recognizes this HA epitope.

【０４９３】 プラスミド構築ストラテジーは以下のように記載される： 脈管形成ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、以下の２つのプライマーを
使用するＰＣＲにより構築した：５’プライマーは、Ｂａｍ ＨＩ部位、続いて
開始コドンから始まる１８ヌクレオチドのコード配列を含み；３’配列プライマ
ーは、Ｘｈｏ Ｉ部位、翻訳終止コドン、ＨＡタグそして最後に１８ヌクレオチ
ドの脈管形成ポリペプチドコード配列（終止コドンを含まない）に、相補的な配
列を含む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｂａｍ ＨＩ部位、コード配列、続いて、イ
ンフレームに融合されたＨＡタグ、このＨＡタグの隣りの翻訳終結終止コドン、
そしてＸｈｏ Ｉ部位を含む。The plasmid construction strategy is described as follows: The DNA sequence encoding the angiogenic polypeptide was constructed by PCR using the following two primers: 5 ′ primer, Bam HI site followed by Contains a coding sequence of 18 nucleotides starting from the start codon; , Including complementary sequences. Therefore, the PCR product contains a Bam HI site, the coding sequence, followed by the HA tag fused in frame, the translation termination stop codon next to the HA tag,
And contains the Xho I site.

【０４９４】 このＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡ３／Ａｍｐ
を、それぞれの制限酵素で消化し、そして連結する。この連結混合物を、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
１１０９９、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７から入手可能）に形質転換す
る。この形質転換した培養物を、アンピシリン培地プレート上にプレーティング
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し
、制限分析によって正確なフラグメントの存在について試験する。組換え脈管形
成ポリペプチドの発現について、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法に
よってこの発現ベクターでトランスフェクトする。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ
．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））。Ｘ−ＨＡタンパク質の発現を
、放射標識および免疫沈降法によって検出する。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａ
ｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９））。細胞を、トランスフェクションの２日後に、８時間、35Ｓ−システイ
ンで標識する。次いで、培養培地を回収し、そして細胞を、界面活性剤（ＲＩＰ
Ａ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％
ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５；Ｗｉｌ
ｓｏｎ，Ｉ．ら、同書３７：７６７（１９８４））で溶解した。細胞溶解物およ
び培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。次いで、沈
降されたタンパク質を、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。This PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNA3 / Amp
Are digested with the respective restriction enzymes and ligated. This ligation mixture was transformed into E. c
oli strain SURE (Stratagene Cloning Systems,
11099, available from La Jolla, CA 92037). The transformed culture is plated on ampicillin medium plates and resistant colonies are selected. Plasmid DNA is isolated from transformants and tested for the presence of the correct fragment by restriction analysis. For expression of recombinant angiogenic polypeptides, COS cells are transfected with this expression vector by the DEAE-DEXTRAN method. (J. Sambrook, E
． Fritsch, T .; Maniatis, Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Cold Spring La
laboratory Press, (1989)). Expression of X-HA protein is detected by radiolabeling and immunoprecipitation. (E. Harlow, D. La
ne, Antibodies: A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press (19
89)). Cells are labeled with 35 S-cysteine for 8 hours 2 days after transfection. The culture medium is then collected and the cells are washed with detergent (RIP
A buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1%
NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH 7.5; Wil
son, I.S. Et al., Ibid., 37: 767 (1984)). Both cell lysates and culture media are precipitated with HA-specific monoclonal antibodies. The precipitated proteins are then analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.

【０４９５】 （他の哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現） 脈管形成ポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要な
シグナルが挙げられる。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、コザック
配列、ならびにＲＮＡスプライシングのドナー部位およびアクセプター部位に隣
接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期プロモータ
ーおよび後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩ
ＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞エレメント（例えば、ヒト
アクチンプロモーター）もまた、使用され得る。Cloning and Expression in Other Mammalian Cells Angiogenic polypeptides can be expressed in mammalian cells. Representative mammalian expression vectors include promoter elements that mediate the initiation of mRNA transcription, protein coding sequences, and signals necessary for termination of transcription and polyadenylation of the transcript. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanking the donor and acceptor sites of RNA splicing. Very efficient transcription is achieved by the SV40-derived early and late promoters, retroviruses (eg RSV, HTLVI, HI).
VI) derived long terminal repeats (LTRs), and the cytomegalovirus (CMV) early promoter. However, cellular elements such as the human actin promoter can also be used.

【０４９６】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬ
およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲ
ＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、
ならびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターが挙げられる。使用され得
る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞および
Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞
、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、なら
びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。Expression vectors suitable for use in practicing the present invention include, for example, pSVL
And pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pR
SVcat (ATCC 37152), pSV2DHFR (ATCC 3714)
6), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport2.0,
And vectors such as pCMVSport3.0. Mammalian host cells that can be used include human Hela cells, 293 cells, H9 cells and Jurkat cells, mouse NIH3T3 cells and C127 cells, Cos1 cells, Cos7 cells and CV1 cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells, and Chinese hamster ovary (CHO) cells are mentioned.

【０４９７】 あるいは、脈管形成ポリペプチドは、染色体に組み込まれた脈管形成ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。Ｄ
ＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択可能なマーカー
を用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定およ
び単離を可能にする。Alternatively, the angiogenic polypeptide can be expressed in stable cell lines containing a polynucleotide encoding the angiogenic polypeptide integrated into a chromosome. D
Co-transfection with selectable markers such as HFR, gpt, neomycin, hygromycin allows the identification and isolation of transfected cells.

【０４９８】 脈管形成ポリペプチドをコードするトランスフェクトされた遺伝子はまた、大
量のコードされたタンパク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒド
ロ葉酸還元酵素）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを
有する細胞株の開発に有用である。（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）
：Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参
照のこと）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）で
ある（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９
１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９
−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培
地中で増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株
は、染色体に組み込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使
用される。The transfected gene encoding an angiogenic polypeptide can also be amplified to express large amounts of the encoded protein. The DHFR (dihydrofolate reductase) marker is useful for developing cell lines that carry hundreds or even thousands of copies of the gene of interest. (For example, Alt et al., J. Biol. Che.
m. 253: 1357-1370 (1978); Hamlin et al., Bioche.
m. et Biophys. Acta, 1097: 107-143 (1990).
: Page et al., Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Another useful selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (199).
1); Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169.
-175 (1992)). These markers are used to grow mammalian cells in selective medium and select the cells with the highest resistance. These cell lines contain the amplified gene integrated into the chromosome. Chinese hamster ovary (CHO) cells and NSO cells are often used for protein production.

【０４９９】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハンサ
ー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラ
グメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵
素切断部位を有する多重クローニング部位は、脈管形成ポリペプチドをコードす
る遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはまた、ラットプレプロインス
リン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、
ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。Expression vectors pC4 (ATCC Accession No. 209646) and pC6 (AT), which are derivatives of plasmid pSV2-DHFR (ATCC Accession No. 37146).
CC Accession No. 209647) is for Rous sarcoma virus (Cullen et al., Mol.
electrical and Cellular Biology, 438-447 (
March 1985)), a strong promoter (LTR), and a fragment of the CMV enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)). For example, multiple cloning sites with BamHI, XbaI, and Asp718 restriction enzyme cleavage sites facilitate cloning of the gene encoding the angiogenic polypeptide. The vector also includes the 3'intron of the rat preproinsulin gene, polyadenylation and termination signals, and
Contains the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter.

【０５００】 具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、適切な制限酵素によ
って消化し、次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼ（
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、このベクターを１％
アガロースゲルから単離する。Specifically, for example, plasmid pC6 or pC4 is digested with appropriate restriction enzymes and then calf intestinal phosphatase (
dephosphorylation using a phosphate). Then add 1% of this vector
Isolate from agarose gel.

【０５０１】 全長脈管形成タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列
および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅す
る。天然に存在するシグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、こ
のベクターは、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列を使用しない場合、このベクターは、細胞からのタンパク質を
分泌することを試みて異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、Ｗ
Ｏ９６／３４８９１を参照のこと）。The cDNA sequence encoding the full length angiogenic protein is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5'and 3'sequences of this gene. If a naturally occurring signal sequence is used to produce the secreted protein, the vector does not require a second signal peptide. Alternatively, if a naturally occurring signal sequence is not used, the vector may be modified to include a heterologous signal sequence in an attempt to secrete the protein from the cell (eg, W
O96 / 34891).

【０５０２】 次いで、増幅フラグメントを、適切な制限酵素を用いて消化し、市販のキット
（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ．）を使用して１％アガロースゲル上で精製する。次いで、単離されたフラグ
メントおよび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで消化する。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ブルー細胞を形質転換し、そしてプラスミド
ｐＣ６またはｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素
分析を使用して同定する。The amplified fragment was then digested with the appropriate restriction enzymes and a commercially available kit (“Geneclean”, BIO 101 Inc., La Jolla, C.
a. ) Is used to purify on a 1% agarose gel. The isolated fragment and dephosphorylated vector are then digested with T4 DNA ligase. E. c
oli HB101 or XL-1 blue cells are transformed and bacteria containing the fragment inserted into plasmid pC6 or pC4 are identified using, for example, restriction enzyme analysis.

【０５０３】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐ
ＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは
、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与す
る酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処
理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍ
ｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニン
グプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日
後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度
（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、
６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、最高濃度の
メトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５
μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレート
に移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られる
まで繰り返す。脈管形成ポリペプチドの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR gene are used for transfection. 5 μg of expression plasmid pC6 or pC4 was added to 0.5 μg of plasmid pC6 using lipofectin (Felgner et al., Supra).
Co-transfect with SVneo. Plasmid pSV2-neo contains the dominant selectable marker, the Tn5-derived neo gene encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418. Cells are seeded in α-minus MEM supplemented with 1 mg / ml G418. After 2 days, cells were trypsinized and treated with 10, 25, or 50 ng / ml methotrexate and 1 m.
Seed in hybridoma cloning plates (Greiner, Germany) in α-MEM supplemented with g / ml G418. After about 10-14 days, single clones were trypsinized and then using different concentrations of methotrexate (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM).
Seed in 6-well Petri dishes or 10 ml flasks. Clones growing at the highest concentration of methotrexate were then selected for higher concentrations (1 μM, 2 μM, 5 μM).
μM, 10 mM, 20 mM) in a new 6-well plate containing methotrexate. The same procedure is repeated until clones are obtained that grow at a concentration of 100-200 μM. Expression of angiogenic polypeptides is analyzed, for example, by SDS-PAGE and Western blot, or by reverse phase HPLC analysis.

【０５０４】 （実施例２：脈管形成ポリペプチドをコードするゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法に従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、
１３、１５、１７、１９、２１または２３にそれぞれ対応するｃＤＮＡ配列につ
いて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする。Example 2 Isolation of Genomic Clones Encoding Angiogenic Polypeptides Human Genome P1 Library (Genomic Systems, Inc.)
According to the method of Sambrook et al., SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,
Screen by PCR with primers selected for the cDNA sequence corresponding to 13, 15, 17, 19, 21 or 23, respectively.

【０５０５】 （実施例３：脈管形成ポリペプチドの組織分布） 脈管形成タンパク質のｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決
定する。例えば、目的の脈管形成タンパク質をコードする遺伝子に特異的なプロ
ーブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って
、Ｐ32で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカ
ラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、
製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した
標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。Example 3 Tissue Distribution of Angiogenic Polypeptides Tissue distribution of mRNA expression of angiogenic proteins, particularly Sambrook.
Determine using the protocol for Northern blot analysis described by K. et al. For example, a probe specific to a gene encoding an angiogenic protein of interest is labeled with a rediprime ™ DNA labeling system (A
Label with P 32 using the Mersham Life Science) according to the manufacturer's instructions. After labeling, the probe was loaded onto a CHROMA SPIN-100 ™ column (Clontech Laboratories, Inc.) using
Purify according to manufacturer's protocol number PT1200-1. The purified labeled probe is then used to test various human tissues for mRNA expression.

【０５０６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに露出し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。Multiple Tissue Northern (MTN) Blots (Clontech) containing different human tissues (H) or human immune system tissues (IM) were used with ExpressHyb ™ Hybridization Solution (Clontech), manufacturer's protocol number P.
Test with labeled probe according to T1190-1. After hybridization and washing, the blots are mounted and exposed to film overnight at -70 ° C and the film developed according to standard procedures.

【０５０７】 （実施例４：脈管形成タンパク質の染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、それぞれ、配列番号１、３、５、
７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。Example 4 Chromosomal Mapping of Angiogenic Proteins A set of oligonucleotide primers was added to SEQ ID NOs: 1, 3, 5, respectively.
Design according to the sequence at the 5'end of 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 or 23. This primer preferably spans about 100 nucleotides.
This primer set is then used for polymerase chain reaction under the following set of conditions: 95 ° C for 30 seconds; 56 ° C for 1 minute; 70 ° C for 1 minute. This cycle is repeated 32 times and then once at 70 ° C. for 5 minutes. Somatic cell hybrid panel containing individual chromosomes or chromosome fragments (Bios, Inc)
In addition, human, mouse, and hamster DNA are used as templates. Reactions are analyzed on either an 8% polyacrylamide gel or a 3.5% agarose gel. Chromosome mapping is performed for about 100 in specific somatic cell hybrids.
Determined by the presence of the bp PCR fragment.

【０５０８】 （実施例５：封入体からの脈管形成ポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、脈管形成ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された脈管形成ポリペプチドを精製するために使用され得
る。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。Example 5: Purification of Angiogenic Polypeptides from Inclusion Bodies Another method below is that, when angiogenic polypeptides are present in the form of inclusion bodies,
E. It can be used to purify angiogenic polypeptides expressed in E. coli. Unless otherwise specified, all the following steps are performed at 4-10 ° C.

【０５０９】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液へと分散させる。E. After completion of the production phase of the E. coli fermentation, the cell culture is cooled to 4-10 ° C. and the cells are harvested by continuous centrifugation at 15,000 rpm (Heraeus Sepatech). Based on the expected yield of protein per unit weight of cell paste and the amount of purified protein required, an appropriate amount of cell paste (by weight) was added to 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.
4. Suspend in buffer solution containing 4. The cells are dispersed into a homogenous suspension using a high shear mixer.

【０５１０】 次いで、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃ
ｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に
２回、４０００〜６０００ｐｓｉでその溶液を通すことによって細胞を溶解させ
る。次いでそのホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａ
Ｃｌ溶液と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペ
レットを、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．４を使用して再度洗浄する。Next, a microfluidizer (Mic
rofluidics, Corp. Or APV Gaulin, Inc. Lyse the cells by passing the solution twice at 4000-6000 psi. The homogenate is then treated with Na to a final concentration of 0.5 M NaCl.
Mix with Cl solution followed by centrifugation at 7000 xg for 15 minutes. The obtained pellet was treated with 0.5 M NaCl, 100 mM Tris, 50 mM EDTA,
Wash again using pH 7.4.

【０５１１】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。The resulting washed inclusion bodies were treated with 1.5M guanidine hydrochloride (GuHCl) to
Solubilize for 4 hours. After centrifugation at 7000 xg for 15 minutes, the pellet is discarded, and the polypeptide-containing supernatant is incubated at 4 ° C overnight to allow additional Gu.
Allows HCl extraction.

【０５１２】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。Following high speed centrifugation (30,000 xg) to remove insoluble particles, Gu
HCl solubilized protein was extracted with GuHCl extract, 50 mM sodium, pH
Refold by rapid mixing with 20 volumes of buffer containing 4.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA with vigorous stirring. The refolded diluted protein solution is kept at 4 ° C. without mixing for 12 hours before further purification steps.

【０５１３】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。このカラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩
衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣ
ｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に
モニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する
。To clarify the refolded polypeptide solution, a pre-prepared tangential filtration unit (eg, with a 0.16 μm membrane filter with appropriate surface area, equilibrated with 40 mM sodium acetate, pH 6.0) (eg, Filtro
n) is used. The filtered sample is treated with a cation exchange resin (eg, Poros).
HS-50, Perseptive Biosystems). The column was washed with 40 mM sodium acetate, pH 6.0, and 250 mM, 500 mM, 1000 mM, and 1500 mM NaC in the same buffer.
With l, elute in a stepwise fashion. The absorbance of the eluate at 280 nm is continuously monitored. Fractions are collected and further analyzed by SDS-PAGE.

【０５１４】 次いで脈管形成ポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合
する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン交換樹脂カ
ラム（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）および弱アニオン交換樹脂カラム（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔ
ｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の直列のセットにロードする。カラムを４０ｍ
Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢
酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２
０カラムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ６．５の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の一定Ａ280モニタリン
グ下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明す
る）ポリペプチドを含む画分をプールする。Fractions containing angiogenic polypeptides are then pooled and mixed with 4 volumes of water. Then, the diluted sample was treated with a strong anion exchange resin column (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) prepared in advance.
) And a weak anion exchange resin column (Poros CM-20, Persept).
Ive Biosystems) in series. 40m column
Equilibrate with M sodium acetate, pH 6.0. Both columns are washed with 40 mM sodium acetate, pH 6.0, 200 mM NaCl. Then CM-2
0 column to 10 column volumes linear gradient (0.2 M NaCl, 50 mM sodium acetate, pH 6.0 to 1.0 M NaCl, 50 mM sodium acetate, p
H6.5 range). Fractions are collected under constant A 280 monitoring of the eluate. Fractions containing the polypeptide (eg, as determined by 16% SDS-PAGE) are then pooled.

【０５１５】 得られた脈管形成ポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５
％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合
、大きな混入バンドは何も、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルから観察されないはずである。精製脈管形成タンパク質はまた、エンドトキ
シン／ＬＰＳ混入について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬ
アッセイによって０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。The resulting angiogenic polypeptide is 95% soluble after the refolding and purification steps described above.
It should show a purity higher than%. When 5 μg of purified protein is loaded, there is no large contaminating band, Coomassie blue stained 16% SDS-PAGE
It should not be observed from the gel. Purified angiogenic proteins can also be tested for endotoxin / LPS contamination, and typically LPS content is LAL.
Less than 0.1 ng / ml by assay.

【０５１６】 （実施例６：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的アプローチを使用して、脈管形成タンパク質のＮ末端またはＣ末
端欠失変異体をクローン化し得る。一般的に、約１５〜２５ヌクレオチドの２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、
１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のポリヌクレオチドの所望の５
’位および３’位から誘導する。そのプライマーの５’位および３’位は、その
脈管形成ポリペプチドをコードする所望のポリヌクレオチドフラグメントに基づ
いて決定する。開始コドンおよび終止コドンを、必要な場合はそれぞれ５’プラ
イマーおよび３’プライマーに付加して、そのポリヌクレオチドフラグメントに
よりコードされる脈管形成ポリペプチドフラグメントを発現させる。Example 6: Construction of N-terminal and / or C-terminal deletion mutants The following general approach can be used to clone N-terminal or C-terminal deletion mutants of angiogenic proteins. . Generally, two oligonucleotide primers of about 15-25 nucleotides are provided with SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, respectively.
The desired 5 of 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 polynucleotides
Derived from the'position 3 '. The 5'and 3'positions of the primer are determined based on the desired polynucleotide fragment encoding the angiogenic polypeptide. A start codon and a stop codon are added to the 5'and 3'primers, respectively, if necessary to express the angiogenic polypeptide fragment encoded by the polynucleotide fragment.

【０５１７】 所望のベクター中での脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドフ
ラグメントのクローニングを容易にするための、制限部位を含むさらなるヌクレ
オチドもまた、５’プライマー配列および３’プライマー配列に付加し得る。脈
管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを、本明細書中
で考察されるかまたは当該分野で公知の、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーおよび条件を使用して、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡクローンから増幅す
る。本発明の適切なポリヌクレオチドフラグメントによりコードされる脈管形成
ポリペプチドフラグメントは、全長ポリペプチドと同じ一般的様式で発現および
精製され得るが、慣用的改変が必要であり得、それは、特定のフラグメントと全
長ポリペプチドとの間の化学的特性および物理的特性における差異に起因する。Additional nucleotides, including restriction sites, were also added to the 5'and 3'primer sequences to facilitate cloning of the polynucleotide fragment encoding the angiogenic polypeptide in the desired vector. obtain. A polynucleotide fragment encoding an angiogenic polypeptide is amplified from a genomic DNA or cDNA clone using appropriate PCR oligonucleotide primers and conditions discussed herein or known in the art. . An angiogenic polypeptide fragment encoded by a suitable polynucleotide fragment of the invention may be expressed and purified in the same general manner as the full length polypeptide, but may require routine modification, which is specific fragmentation. Due to differences in chemical and physical properties between the and full-length polypeptides.

【０５１８】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドをと
もに連結する。脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメン
トを、好ましくは脈管形成ポリペプチドフラグメントコード領域がプロモーター
の下流に位置する様式で、制限した発現ベクター中に挿入する。この連結混合物
を、標準的手順を使用しかつ本明細書中実施例に記載されるように、コンピテン
トＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、
そしてクローン化したＤＮＡの正体を制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定
により確認する。The amplified polynucleotide fragment and expression vector are digested with a restriction enzyme that recognizes the site in the primer. The digested polynucleotides are then ligated together. The polynucleotide fragment encoding the angiogenic polypeptide is inserted into the restricted expression vector, preferably in such a manner that the angiogenic polypeptide fragment coding region is located downstream of the promoter. This ligation mixture was transformed into competent E. coli using standard procedures and as described in the Examples herein. E. coli. Isolation of plasmid DNA from resistant colonies,
The identity of the cloned DNA is then confirmed by restriction analysis, PCR, and DNA sequencing.

【０５１９】 （実施例７：脈管形成ポリペプチドのタンパク質融合物） 脈管形成ポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタ
グ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への脈管
形成ポリぺプチドの融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−
８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およ
びアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。脈管形成ポリぺプ
チドに融合した核局在化シグナルは、そのタンパク質を特定の細胞内位置へと標
的化し得る。一方、共有結合ヘテロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質
の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を
有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質
と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上
記の融合タンパク質の全ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説す
る以下のプロトコル、または実施例に記載されるプロトコルを改変することによ
って作製され得る。Example 7: Protein Fusion of Angiogenic Polypeptides Angiogenic polypeptides are preferably fused to other proteins. These fusion proteins can be used in various applications. For example, fusion of an angiogenic polypeptide to a His tag, HA tag, protein A, IgG domain, and maltose binding protein facilitates purification (see Example 5; EP.
A 394,827; Traunecker et al., Nature, 331: 84-.
86 (1988) also). Similarly, fusions to IgG-1, IgG-3, and albumin increase half-life in vivo. A nuclear localization signal fused to an angiogenic polypeptide can target the protein to specific intracellular locations. On the other hand, covalent heterodimers or homodimers may increase or decrease the activity of the fusion protein. Fusion proteins can also create chimeric molecules that have more than one function. Finally, fusion proteins may increase the solubility and / or stability of fusion proteins as compared to non-fusion proteins. All forms of the above fusion proteins can be made by modifying the protocol below, which outlines the fusion of polypeptides to IgG molecules, or the protocol described in the Examples.

【０５２０】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅し得る。これらのプライマー
はまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニング
を容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。Briefly, the human Fc portion of an IgG molecule can be PCR amplified using primers spanning the 5'and 3'ends of the sequences described below. These primers should also have convenient restriction enzyme sites which facilitate cloning into an expression vector, preferably a mammalian expression vector.

【０５２１】 例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）を使用する場合、ヒトＦｃ部分は、
ＢａｍＨＩクローニング部位に連結し得る。３’ＢａｍＨＩ部位を破壊すべきで
あることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターを、ＢａｍＨＩ
を用いて再び制限し、ベクターを線状化し、そしてＰＣＲによって単離した脈管
形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、このＢａｍＨＩ部位に連結
する。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニングするが、そうしなけ
れば、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。For example, when using pC4 (accession number 209646), the human Fc portion is
It can be ligated into the BamHI cloning site. Note that the 3'BamHI site should be destroyed. Next, the vector containing the human Fc portion was added to BamHI.
Re-restrict with, linearize the vector, and ligate a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide isolated by PCR to this BamHI site. Note that the polynucleotide is cloned without a stop codon, otherwise the fusion protein will not be produced.

【０５２２】 天然に存在するシグナル配列を分泌タンパク質を産生するために使用する場合
、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在す
るシグナル配列が使用しない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むように
改変し得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域：When the naturally occurring signal sequence is used to produce a secreted protein, pC4 does not require a second signal peptide. Alternatively, if the naturally occurring signal sequence is not used, the vector may be modified to include a heterologous signal sequence (see, eg, WO 96/34891). Human IgG Fc region:

【０５２３】[0523]

【化１】 （配列番号３０）。[Chemical 1] (SEQ ID NO: 30).

【０５２４】 （実施例８：抗体の産生） （実施例８Ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製し得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、脈管
形成ポリペプチドを発現する細胞を、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘
導するために動物に投与する。好ましい方法において、脈管形成タンパク質の調
製物を調製し、そして精製して、天然の夾雑物を実質的に含まないようにする。
次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このよう
な調製物を、動物に導入する。Example 8: Production of Antibodies Example 8A. Hybridoma Technology The antibodies of the invention can be prepared by a variety of methods. (Current Pro
See tocols, Chapter 2). As one example of such a method, cells expressing an angiogenic polypeptide are administered to an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. In a preferred method, an angiogenic protein preparation is prepared and purified to be substantially free of natural contaminants.
Such preparations are then introduced into animals to produce polyclonal antisera of greater specific activity.

【０５２５】 最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはその
タンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイ
ブリドーマ技術を使用して調製し得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような手順は
、動物（好ましくはマウス）を、脈管形成ポリペプチドで、またはより好ましく
は分泌される脈管形成ポリペプチド発現細胞で、免疫する。このようなポリペプ
チド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養し得るが；１０％ウシ
胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミ
ノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地において培養することが
好ましい。In the most preferred method, the antibodies of the invention are monoclonal antibodies (or protein binding fragments thereof). Such monoclonal antibodies may be prepared using hybridoma technology (Koehler et al., Nature 25.
6: 495 (1975); Koehler et al., Eur. J. Immunol. 6
: 511 (1976); Koehler et al., Eur. J. Immunol. 6:
292 (1976); Hammerling et al .: Monoclonal Ant.
ibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevi
er, N.N. Y. , Pp. 563-681 (1981)). Generally, such a procedure immunizes an animal, preferably a mouse, with angiogenic polypeptides, or more preferably with secreted angiogenic polypeptide-expressing cells. Such polypeptide expressing cells may be cultured in any suitable tissue culture medium; supplemented with 10% fetal bovine serum (inactivated at about 56 ° C) and containing about 10 g / l non-essential amino acids, It is preferable to culture in Earle modified Eagle medium supplemented with about 1,000 U / ml penicillin and about 100 μg / ml streptomycin.

【０５２６】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫細胞株と融合する。
任意の適切な骨髄腫細胞株を、本発明に従って用い得る；しかし、ＡＴＣＣから
入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後、得ら
れるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いでＷａｎ
ｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１
））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次いで、この
ような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、この脈管形成ポリぺプチド
に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。The splenocytes of such mice are extracted and fused with the appropriate myeloma cell line.
Any suitable myeloma cell line may be used in accordance with the present invention; however, it is preferred to use the parental myeloma cell line (SP2O) available from the ATCC. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium and then Wan
ds et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)
)) And clone by limiting dilution. The hybridoma cells obtained through such selection are then assayed to identify clones secreting antibodies capable of binding the angiogenic polypeptide.

【０５２７】 あるいは、脈管形成ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順にて生成し得る。このような方法は、抗体
それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能で
あるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用し
て、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞
を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞
を、脈管形成タンパク質特異的抗体に結合する能力が脈管形成ポリペプチドによ
ってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニング
する。このような抗体は、脈管形成タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタ
イプ抗体を含み、そしてそれを使用して動物を免疫して、さらなる脈管形成ポリ
タンパク質特異的抗体の形成を誘導し得る。Alternatively, additional antibodies capable of binding to angiogenic polypeptides may be generated using anti-idiotype antibodies in a two-step procedure. Such a method takes advantage of the fact that the antibody itself is the antigen and therefore it is possible to obtain an antibody that binds to the second antibody. According to this method, protein-specific antibodies are used to immunize animals, preferably mice. The splenocytes of such animals are then used to produce hybridoma cells. The hybridoma cells are then screened to identify clones producing antibodies that can be blocked by angiogenic polypeptides for their ability to bind to angiogenic protein-specific antibodies. Such antibodies include anti-idiotypic antibodies against angiogenic protein-specific antibodies, and can be used to immunize animals to induce the formation of additional angiogenic polyprotein-specific antibodies.

【０５２８】 本発明の抗体のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび
他のフラグメントを、本明細書中に開示される方法に従って使用し得ることが、
理解される。このようなフラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生
するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のよ
うな酵素を使用して、タンパク質分解性切断により代表的には産生する。あるい
は、分泌脈管形成タンパク質結合フラグメントを、組換えＤＮＡ技術の適用また
は合成化学を介して生成し得る。Fab and F (ab ′) 2 fragments and other fragments of the antibodies of the invention may be used according to the methods disclosed herein,
To be understood. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (to produce Fab fragments) or pepsin (to produce F (ab ') 2 fragments). . Alternatively, secretory angiogenic protein binding fragments may be generated through the application of recombinant DNA technology or synthetic chemistry.

【０５２９】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生し得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であ
る。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２
（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）
；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７
１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）
。For in vivo use of antibodies in humans, it may be preferable to use "humanized" chimeric monoclonal antibodies. Such antibodies can be produced by using genetic constructs derived from hybridoma cells which produce the monoclonal antibodies described above. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. (For a review, see Morrison, Science 229: 1202.
(1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986).
Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neube.
rger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 870267.
1; Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Ne.
Uberger et al., Nature 314: 268 (1985)).
.

【０５３０】 （実施例８Ｂ．ｓｃＦｖｓのライブラリーからの脈管形成ポリペプチドに対す
る抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝ていても曝さ
れていなくてもよい脈管形成ポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメン
トの大ライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。Example 8B. Isolation of Antibody Fragments Against Angiogenic Polypeptides from a Library of scFvs The naturally occurring V gene isolated from human PBL was unexposed with or without donor exposure. Construct into large libraries of antibody fragments containing reactivity to optionally angiogenic polypeptides (see, eg, US Pat. No. 5,885,793, which is incorporated herein by reference in its entirety). That).

【０５３１】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓ
のライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュー
するため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に接種し、そして振盪しながらＯ．Ｄ．＝０
．８まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵに接種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩ
Ｉ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで
３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間イン
キュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そ
してペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５
０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。
ファージをＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。Library Rescue From human PBL RNA to scFvs as described in WO 92/01047.
Build a library of. To rescue the phage displaying the antibody fragment, about 10 9 E. coli carrying the phagemid were rescued. 50m using E.coli
1 × 2 × TY (containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin) (2 × TY-AMP-GLU) and inoculated with shaking. D. = 0
． Grow to 8. Using 5 ml of this culture, 50 ml of 2xTY-AMP
-GLU was inoculated and 2 x 10 8 TU of Δ gene 3 helper (M13 Δ gene II
I, see WO92 / 01047) and the cultures are incubated for 45 minutes at 37 ° C. without shaking and then for 45 minutes at 37 ° C. with shaking. This culture was incubated for 10 minutes at 4000 rpm. p. m. Centrifuge at 2 ° C., and pellet the pellet with 2 liters of 2 × TY (100 μg / ml ampicillin and 5 ml).
Reconstitute in 0 μg / ml kanamycin) and grow overnight.
Phages are prepared as described in WO92 / 01047.

【０５３２】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００回
転／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００
ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させる。ファージ粒子
を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精
製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター
（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、最終濃度約１
０13形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）を得る。M13Δ gene III is prepared as follows: M13Δ gene III helper phage does not encode gene III protein. Therefore, phage displaying antibody fragments (phagemids) have greater binding avidity for antigen. During phage morphogenesis, infectious M13Δ gene III particles are made by growing helper phage in cells carrying the pUC19 derivative that supplies the wild-type gene III protein. The culture is incubated for 1 hour at 37 ° C without shaking and then for another hour at 37 ° C with shaking. Cells were spun down (IEC-Centra 8,400 rpm for 10 minutes), 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml.
2 × TY broth containing 2 kanamycin (2 × TY-AMP-KAN) 300
Resuspend in ml and grow overnight at 37 ° C with shaking. Phage particles were purified and concentrated from the culture medium by two PEG precipitations (Sambrook et al., 1990), resuspended in 2 ml PBS, and passed through a 0.45 μm filter (Minisart NML; Sartorius) to a final concentration of approximately. 1
0 13 transduction units / ml (ampicillin resistant clones) are obtained.

【０５３３】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／
ｍｌのいずれかの本発明のポリペプチド４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する
。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次
いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、そ
して、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベートし
、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエ
チルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりフ
ァージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃
で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数
増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グ
ルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプ
レートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘ
ルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次
いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目お
よび４回目については、チューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２
０回、およびＰＢＳで２０回に増加する。(Paning of Library) 100 μg / ml or 10 μg / ml of Immunotubes (Nunc) was used.
4. Coat overnight in PBS with 4 ml of any of the polypeptides of the invention. Tubes are blocked with 2% Marvel-PBS for 2 hours at 37 ° C and then washed 3 times in PBS. Approximately 10 13 TU of phage are applied to the tubes and incubated for 30 minutes at room temperature with tumbling up and down on a turntable, then left to stand for a further 1.5 hours. Tube with PBS 0.1% Twee
Wash 10 times with n-20 and 10 times with PBS. Phages were eluted by adding 1 ml of 100 mM triethylamine and spinning up and down for 15 minutes on a rotating disc, then adding 0.5 ml of 1.0 M Tris-HCl, to the solution.
Immediately neutralize at pH 7.4. Next, the eluted phages were incubated with the bacteria at 37 ° C.
Phage was used to incubate 10 ml of mid-log phase E. E. coli TG1. Then E. E. coli is plated on TYE plates containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin. The resulting bacterial library is then rescued with Δ gene 3 helper phage as described above to prepare phage for the next round of selection. This process was then repeated for all four rounds of affinity purification, for the third and fourth round the tube washes were washed with PBS, 0.1% Tween-20 for 2 times.
Increase 0 times and 20 times with PBS.

【０５３４】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンを
ＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと
）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。Characterization of Binders Phage eluted from the third and fourth rounds of selection were used to transform E. coli. coli
Infect HB2151 and generate soluble scFv from a single colony for assay (Marks et al., 1991). 50 mM bicarbonate, pH 9.
The ELISA is performed with microtiter plates coated with either 10 pg / ml of the polypeptide of the invention in 6. Positive clones in the ELISA are further characterized by PCR fingerprinting (see, eg, WO92 / 01047) followed by sequencing.

【０５３５】 （実施例９：スクリーニングアッセイのための脈管形成タンパク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべき脈管形成ポリぺプチドを含有する上清を
産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリーニング
アッセイにおいて使用され得る。Example 9: Production of angiogenic proteins for screening assays The following protocol produces a supernatant containing angiogenic polypeptides to be tested. This supernatant can then be used in the screening assay described in Examples 14-21.

【０５３６】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用し得る）。ポ
リ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食
塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残すべ
きであり、そしてプレートは２週間まで前に予めポリリジンでコーティングし得
る。First, poly-D-lysine (644 587 Boehringer-Man).
nheim) stock solution (1 mg / ml in PBS) in PBS (17-516F Biowhittaker without calcium or magnesium).
Dilute to 20 to make working solution 50 μg / ml. 200 μl of this solution
Add to each well (24-well plate) and incubate for 20 minutes at room temperature. Make sure the solution is distributed over each well (Note: a 12 channel pipettor can be used with tips on every other channel). Aspirate the poly-D-lysine solution and rinse with 1 ml PBS (phosphate buffered saline). PBS should remain in the wells just prior to plating the cells, and the plates may be pre-coated with polylysine up to 2 weeks.

【０５３７】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。293T cells (passing P + 20 and carrying no cells) were treated with 2 × 10 5 cells / well in 0.5 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (4.
5 G / L glucose and L-glutamine (12-604F Biowhit
10% heat-inactivated FBS (14-503F Biowhi)
ttaker) / 1 × Penstrep (17-602E Biohitter)
plate). Allow cells to grow overnight.

【０５３８】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組ん
で（ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによっ
て、時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間
を過ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから
吸引除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。
次いで、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１
つおきにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤ
ＮＡ／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに
、次いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で
６時間インキュベートする。The next day, in a sterile solution basin, 300 μl lipofectamine (1
8324-012 Gibco / BRL) and 5 ml Optimem I (
31985070 Gibco / BRL) / 96 well plate are mixed together. Using a small volume of multi-channel pipettor, approximately 2 μg of the expression vector containing the polynucleotide insert produced by the method described in Examples 8-10 was placed in appropriately labeled 96-well round bottom plates. Aliquot. 50 μl Lipofectamine / Opti using multi-channel pipettor
Add the mem I mixture to each well. Mix gently by pipetting up and down gently. Incubate for 15-45 minutes at room temperature. After about 20 minutes, add 150 μl Optimem I to each well using a multichannel pipettor. As a control, one plate of vector DNA lacking the insert should be transfected with each set of transfections. Preferably, the transfection should be tag-teaming the following tasks. By tag teaming, the time effort is halved, and the cells do not spend too much time on PBS. First, Person A aspirates the medium from the four 24-well plates of cells, and then Person B rinses each well with 0.5-1 ml PBS.
Mr. A then aspirates the PBS rinse and Mr. B uses channel 1
Use a 12-channel pipettor with tips every other 200 μl of D
The NA / Lipofectamine / Optimem I complex is added to each row on a 24-well plate, first in the odd wells, then in the even wells. Incubate at 37 ° C for 6 hours.

【０５３９】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2
Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ
ｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2 Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−
７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ
ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
トオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
チン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グ
ルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６
．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン
２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５
ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８
．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ
−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４
０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１
．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファ
ン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２
Ｈ2Ｏ；および９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビ
オチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化
コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３
．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ
；０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビ
ン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．
６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／
ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌの
プトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；
０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；
０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合
体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と
複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；１０ｍｇ／Ｌの酢酸レチナール
と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調
製する。２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて容量オスモル濃度
を３２７ｍＯｓｍに調節する（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭ
ＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地
を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニ
カル中に収集する。While incubating the cells, 1% BSA in DMEM with 1 × penstrep or HGS CHO-5 medium (116.6).
mg / CaCl 2 (anhydrous) of L; 0.00130mg / L CuSO 4 -5H 2
O; 0.050 mg / L of Fe (NO 3) 3 -9H 2 O; 0.417mg / L of F
eSO 4 -7H 2 O; 311.80 mg / L KCl; 28.64 mg / L Mg
Cl 2 ; 48.84 mg / L MgSO 4 ; 6995.50 mg / L NaCl;
2400.0 mg / L NaHCO 3 ; 62.50 mg / L NaH 2 PO 4 —H 2 O; 71.02 mg / L Na 2 HPO 4 ; 0.4320 mg / L ZnSO 4 −
7H 2 O; 0.002 mg / L arachidonic acid; 1.022 mg / L cholesterol; 0.070 mg / L DL-α-tocopherol acetate; 0.0520 m
g / L linoleic acid; 0.010 mg / L linolenic acid; 0.010 mg / L myristic acid; 0.010 mg / L oleic acid; 0.010 mg / L palmitooleic acid (palmic acid); 0 0.010 mg / L palmitic acid; 100 mg / L Pluronic F-68; 0.010 mg / L stearic acid; 2.20 mg / L Tween 80; 4551 mg / L D-glucose; 130.85 mg / mL L- alanine; 147.50mg / ml of L- arginine -HCl; 7.50mg / ml of L- asparagine -H 2 O; 6
． 65 mg / ml of L- aspartic acid; 29.56mg / ml of L- cystine 2HCl-H 2 O; 31.29mg / ml of L- cystine-2HCl; 7.35
mg / ml L-glutamic acid; 365.0 mg / ml L-glutamine; 18
． 75 mg / ml glycine; 52.48 mg / ml L-histidine-HCl
-H 2 O; 106.97mg / ml of L- isoleucine; 111.45mg / m
1 L-leucine; 163.75 mg / ml L-lysine HCl; 32.34 m
g / ml L-methionine; 68.48 mg / ml L-phenylalanine; 4
0.0 mg / ml L-proline; 26.25 mg / ml L-serine; 101
． 05 mg / ml L-threonine; 19.22 mg / ml L-tryptophan; 91.79 mg / ml L-tyrosine-2Na-2.
H 2 O; and 99.65 mg / ml L-valine; 0.0035 mg / L biotin; 3.24 mg / L D-Ca pantothenic acid; 11.78 mg / L choline chloride; 4.65 mg / L Folic acid; 15.60 mg / L i-inositol; 3
． 02 mg / L niacinamide; 3.00 mg / L pyridoxal HCl
0.031 mg / L pyridoxine HCl; 0.319 mg / L riboflavin; 3.17 mg / L thiamine HCl; 0.365 mg / L thymidine;
680 mg / L vitamin B 12 ; 25 mM HEPES buffer; 2.39 mg / L
L Na hypoxanthine; 0.105 mg / L lipoic acid; 0.081 mg / L putrescine sodium-2HCl; 55.0 mg / L sodium pyruvate;
0.0067 mg / L sodium selenite; 20 μM ethanolamine;
0.122 mg / L ferric citrate; Methyl-B-cyclodextrin complexed with 41.70 mg / L linoleic acid; Methyl-B-cyclo complexed with 33.33 mg / L oleic acid Dextrin; methyl-B-cyclodextrin complexed with 10 mg / L retinal acetate). Adjust the osmolarity to 327 mOsm with 2 mM glutamine and 1 × Penstrep (1 L DM for 10% BSA stock solution).
100 g of BSA (81-068-3 Bayer) was dissolved in EM). Media is filtered and 50 μl collected in 15 ml polystyrene conical for endotoxin assay.

【０５４０】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。The transfection reaction is terminated at the end of the incubation time, preferably in tag teams. Person A aspirates off the transfection medium, while person B adds 1.5 ml of the appropriate medium to each well. Incubate at 37 ° C for 45 or 72 hours depending on the medium used:
45% for 1% BSA or 72 hours for CHO-5.

【０５４１】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１０〜１
２に記載するアッセイにおいて使用し得る。On day 4, 600 μl using a 300 μl multichannel pipettor
Aliquot into 1 ml deep well plate and 2 ml of remaining supernatant
Aliquot into deep wells of. The supernatant from each well was then added to Examples 10-1.
It can be used in the assay described in 2.

【０５４２】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、脈管形成ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質とし
て）か、または他のタンパク質の発現を誘導する脈管形成ポリぺプチドによって
（このポリペプチドは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来すること
が特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によ
って特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。If the activity is obtained in any of the assays described below using the supernatant, then the activity may be obtained directly from the angiogenic polypeptide (eg, as a secreted protein) or other protein. It is specifically understood that it is derived from either by an angiogenic polypeptide that induces the expression of, which is then secreted into the supernatant. Thus, the invention further provides methods for identifying proteins in supernatants characterized by activity in a particular assay.

【０５４３】 （実施例１０：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定するスクリー
ニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変し得る。Example 10: Screening Assay to Identify Changes in Small Molecule Concentrations and Membrane Permeability Binding of ligands to receptors alters intracellular levels of small molecules such as calcium, potassium, sodium and pH. It is known to cause, as well as to change the membrane potential. These changes can be measured in assays that identify the supernatant that binds to the receptor on a particular cell. The following protocol describes an assay for calcium, but this protocol is easily modified to detect changes in potassium, sodium, pH, membrane potential, or any other small molecule detectable by a fluorescent probe. You can

【０５４４】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−３の代わりに使用し得る。The following assay measures changes in fluorescent molecules (Molecular Probes) that bind small molecules using a fluorimetric imaging plate reader (“FLIPR”). Obviously, any fluorescent molecule that detects small molecules could be used in place of the calcium fluorescent molecule, fluo-3, as used herein.

【０５４５】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。For adherent cells, seed cells at 10,000-20,000 cells / well in Co-star black 96-well plates with clear bottoms. CO 2 the plate
Incubate in incubator for 20 hours. The adherent cells were treated with 200 μl of HBSS (Hank's Balanced Salt) in a Biotek washer.
Wash twice with Solution, leaving 100 μl of buffer after the last wash.

【０５４６】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。A stock solution of 1 mg / ml fluo-3 was added to 10% pluronic acid (pluro acid).
nic acid) Made of DMSO. To load the cells with fluo-3,
12 μg / ml fluo-3 (50 μl) is added to each well. The plate is incubated for 60 minutes at 37 ° C. in a CO 2 incubator. The plate is washed 4 times with HBSS in the Biotek washer, leaving 100 μl of buffer.

【０５４７】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３の１０％プルロ
ン酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ Ｗ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。For non-adherent cells, the cells are spun down from the culture medium. 50 cells
Resuspend to 2-5 × 10 6 cells / ml with HBSS in a ml conical tube. 4 μl of 1 mg / ml fluo-3 10% pluronic acid DMSO solution is added per 1 ml of cell suspension. Then, place the tube in a 37 ° C water bath for 30-6
Leave for 0 minutes. The cells were washed twice with HBSS and resuspended at 1 × 10 6 cells / ml,
Then, dispense 100 μl / well to the microplate. Plate 100
Centrifuge at 0 rpm for 5 minutes. Next, plate the Denley Cell W
After washing once with 200 μl in ash, 100 μl final volume by aspiration step
To

【０５４８】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。For non-cell based assays, each well contains a fluorescent molecule such as fluo-3. The supernatant is added to the wells and the change in fluorescence is detected.

【０５４９】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、脈管形成ポ
リペプチドまたは脈管形成ポリペプチドによって誘導される分子のいずれかであ
る分子によって引き起こされる、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じた、細胞外シグ
ナル伝達事象を示す。To measure the fluorescence of intracellular calcium, the FLIPR is set up for the following parameters: (1) System gain is 300-800 mW; (2)
Exposure time is 0.4 seconds; (3) camera F / stop is F / 2;
(4) Excitation is 488 nm; (5) Emission is 530 nm; and (6)
Sample addition is 50 μl. An increase in luminescence at 530 nm results in an extracellular signaling event resulting in an increase in intracellular Ca ++ concentration caused by a molecule that is either an angiogenic polypeptide or a molecule induced by an angiogenic polypeptide. Indicates.

【０５５０】 （実施例１１：チロシンキナーゼ活性を同定するスクリーニングアッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸***促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。Example 11 Screening Assays to Identify Tyrosine Kinase Activity Protein tyrosine kinases (PTKs) represent a diverse group of transmembrane and cytoplasmic kinases. Within the receptor protein tyrosine kinase (RPTK) family, there is a range of receptors for mitogenic and metabolic growth factors, including PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF and the insulin receptor subfamily. In addition, there is a large RPTK family whose corresponding ligands are unknown. RPTK ligands include primarily secreted low molecular weight proteins, but also membrane-bound and extracellular matrix proteins.

【０５５１】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質
ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカ
インスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ
−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介
する。Activation of RPTK by a ligand involves ligand-mediated receptor dimerization, which results in transphosphorylation of receptor subunits and activation of cytoplasmic tyrosine kinases. As cytoplasmic tyrosine kinase, src family (
Examples include receptor-associated tyrosine kinases of src, yes, lck, lyn, fyn), and non-receptor bound and cytosolic protein tyrosine kinases such as the Jak family. These members include cytokine superfamily (eg, interleukins, interferons, GM
-CSF and leptin).

【０５５２】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、脈管形成ポ
リペプチドまたは脈管形成ポリペプチドによって誘導される分子がチロシンキナ
ーゼシグナル伝達経路を活性化し得るか否か同定は興味深い。従って、以下のプ
ロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこのよ
うな分子を同定する。Due to the wide variety of known factors that can stimulate tyrosine kinase activity, it is not possible to identify whether angiogenic polypeptides or molecules induced by angiogenic polypeptides can activate the tyrosine kinase signaling pathway. Interesting. Therefore, the following protocol is designed to identify such molecules that can activate the tyrosine kinase signaling pathway.

【０５５３】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。Target cells (eg, primary keratinocytes) were purchased from Nalge Nunc (Naperville, IL) at a density of approximately 25,000 cells / well 96.
Seed wells Loprodyne Silent Screen Plate. The plates are sterilized by rinsing twice with 100% ethanol for 30 minutes, rinsed with water and then dried overnight. Several plates were loaded with 100 ml of cell culture grade type I collagen (50 mg / ml), gelatin (2%) or polylysine (
50 mg / ml) (all of these are Sigma Chemicals (St. L.
ouis, MO) or at Becton Dickinso
n (Bedford, MA) 10% Matrigel or calf serum for 2 hours, rinsed with PBS and stored at 4 ° C. Growth medium was seeded at 5,000 cells / well and manufactured by the manufacturer Alamar Biosie.
nces, Inc. (Sacramento, CA), as described by ala
Cell proliferation is assayed on these plates by indirect quantification of cell number after 48 hours using marBlue. Becton Dickinson
(Bedford, MA) using Falcon plate cover # 3071
Cover the Loprodyne Silent Screen Plate. Fal
The con Microtest III cell culture plate may also be used in some proliferation experiments.

【０５５４】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．
１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した
プロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し
、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真
空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉｆｏ
ｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底の０
．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホルドの底の９６ウェル捕獲
／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明澄化し
た抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物を取
り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。To prepare extracts, A431 cells are seeded (20,000 / 200 ml / well) on nylon membranes of Loprodyne plates and cultured overnight in complete medium. The cells are incubated in serum-free basal medium for 24 hours to make them rest. 5-2 (50 ng) of EGF (60 ng / ml) or the supernatant produced in Example 12
After treatment for 0 minutes, the medium was removed and 100 ml of extraction buffer (20 mM HEP
ES pH 7.5, 0.15M NaCl, 1% Triton X-100, 0.
1% SDS, 2 mM Na 3 VO 4 , 2 mM Na 4 P 2 O 7 and Boeheri
nger Mannheim (Indianapolis, IN) mixture of protease inhibitors (# 1836170)) is added to each well, and the plate is shaken on a rotary shaker for 5 minutes at 4 ° C. The plate is then placed in a vacuum transfer manifold (vacuum transfer manifold).
ld) and place the extract at the bottom of each well using house vacuum.
． Filter through a 45 mm membrane. The extracts are collected in a vacuum well bottom 96-well capture / assay plate and immediately placed on ice. To obtain a clarified extract by centrifugation, solubilize with detergent for 5 minutes, then remove the contents of each well and centrifuge at 16,000 xg for 15 minutes at 4 ° C.

【０５５５】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。The filtered extract is tested for levels of tyrosine kinase activity. Although many methods of detecting tyrosine kinase activity are known, one of the methods is described herein.

【０５５６】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞***キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。Generally, the tyrosine kinase activity of the supernatant is evaluated by determining its ability to phosphorylate tyrosine residues on a particular substrate (biotinylated peptide). Biotinylated peptides that can be used for this purpose include PSK1 (cell division kinase cd
and amino acids 6-20 of c2-p34) and PSK2 (corresponding to amino acids 1-17 of gastrin). Both peptides are substrates for a series of tyrosine kinases and are available from Boehringer Mannheim.

【０５５７】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ2+（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。The tyrosine kinase reaction is set up by adding the following components in order. First, after adding 10 μl of 5 μM biotinylated peptide, ATP / Mg 2+ (
5 mM ATP / 50 mM MgCl 2 10 μl, 5 × assay buffer (40
mM imidazole hydrochloride, pH 7.3, 40 mM β-glycerophosphate, 1 mM
EGTA, 100 mM MgCl 2 , 5 mM MnCl 2 , 0.5 mg / ml
BSA) 10 μl, sodium vanadate (1 mM) 5 μl and finally water 5 μl. The components are mixed gently and the reaction mixture is preincubated for 2 minutes at 30 ° C. The reaction is started by adding 10 μl of control enzyme or filtered supernatant.

【０５５８】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、その反応物を氷上に置く。Next, the tyrosine kinase assay reaction is stopped by adding 10 μl of 120 mM EDTA and the reaction is placed on ice.

【０５５９】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。Tyrosine kinase activity is measured by transferring a 50 μl aliquot of the reaction mixture to a microtiter plate (MTP) module and incubating at 37 ° C. for 20 minutes. As a result, streptavidin (streptava)
din) Coat 96-well plate with biotinylated peptide.
Wash MTP module 4 times with 300 μl / well PBS. Next, anti-phosphotyrosine conjugated to horseradish peroxidase (phospotyro).
Sine) antibody (anti-P-Tyr-POD (0.5 u / ml)) (75 μl) is added to each well and then incubated at 37 ° C. for 1 hour. Wash wells as above.

【０５６０】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。Next, a peroxidase substrate solution (Boehringer Mannheim)
) Add 100 μl and incubate at room temperature for at least 5 minutes (up to 30 minutes). The absorbance of the sample at 405 nm is measured using an ELISA reader. The level of bound peroxidase activity was quantified using an ELISA reader, which reflects the level of tyrosine kinase activity.

【０５６１】 （実施例１２：リン酸化活性を同定するスクリーニングアッセイ） 実施例１１に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８Ｍ
ＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異
的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子
、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分
子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒ
ｋ−２を置き換えることにより検出し得る。Example 12: Screening Assay to Identify Phosphorylation Activity [0561] As a potential alternative and / or complement to the protein tyrosine kinase activity assay described in Example 11, major intracellular signals. Assays that detect activation (phosphorylation) of transduction intermediates can also be used.
For example, as described below, one particular assay is Erk-1 and Erk-2.
Tyrosine phosphorylation of the kinase can be detected. However, Raf, JNK, p38M
Phosphorylation of other molecules such as AP, Map Kinase Kinase (MEK), MEK Kinase, Src, Muscle Specific Kinase (MuSK), IRAK, Tec and Janus, as well as any other phosphoserine, phosphotyrosine or phosphothreonine molecule. , Erk-1 or Er in these molecules in the following assay
It can be detected by replacing k-2.

【０５６２】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。Ａ４３１細胞を２０，
０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィルタープレートに播種し、
増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢
餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１２で得た上清５０μｌで
５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物を濾過して直接アッセイ
プレート中に入れる。Specifically, the wells of a 96-well ELISA plate were loaded with Protein G (1 μg /
ml) 0.1 ml to coat at room temperature (RT) for 2 hours to make an assay plate. The plates are then rinsed with PBS and blocked with 3% BSA / PBS for 1 hour at RT. Next, the protein G plate was subjected to Erk-1 and E.
Two commercially available monoclonal antibodies against rk-2 (100 ng / well) (S
Ant Cruz Biotechnology) (RT for 1 hour). (This step can be easily modified by replacing the monoclonal antibody that detects any of the molecules described above to detect other molecules). After rinsing 3-5 times with PBS, plates are stored at 4 ° C until use. 20 A431 cells,
000 / well in 96-well Loprodyne filter plate,
Culture overnight in growth medium. The cells are then starved for 48 hours in basal medium (DMEM) and then treated with EGF (6 ng / well) or 50 μl of the supernatant from Example 12 for 5-20 minutes. The cells are then solubilized and the extract filtered and placed directly into the assay plate.

【０５６３】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦ
ＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量
する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、脈管形成ポリペプチド
または脈管形成ポリペプチドによって誘導される分子によるリン酸化を示す。After incubation with the extract for 1 hour at RT, the wells are rinsed again. Commercially available MAP kinase preparation (10 ng / well) as a positive control
In place of the A431 extract. The plates are then loaded with Erk-1 and E.
Treatment with a commercially available polyclonal (rabbit) antibody (1 μg / ml) that specifically recognizes a phosphorylated epitope of rk-2 kinase (1 hour at RT). The antibody is biotinylated by standard procedures. Next, the bound polyclonal antibody was combined with Europium streptavidin and Europium fluorescence enhancer and Wallac DELF.
Quantification by continuous incubation (time-resolved fluorescence) in an IA instrument. An increase in fluorescent signal above background is indicative of phosphorylation by the angiogenic polypeptide or a molecule induced by the angiogenic polypeptide.

【０５６４】 （実施例１３：脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子における変化の決定
方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、それぞれの脈管形成ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列における目的の領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲのテンプレー
トとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶液を使用し、９５℃
で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０℃で６０〜１２０秒
間の３５サイクルからなる。Example 13: Method for Determining Alterations in Genes Encoding Angiogenic Polypeptides RNA isolated from whole families or individual patients presenting a phenotype of interest (eg, disease) is isolated. To do. CDNA is then generated from these RNA samples using protocols known in the art (see Sambrook).
This cDNA is then used as a template for PCR with primers surrounding the region of interest in the nucleotide sequence encoding the respective angiogenic polypeptide. Suggested PCR conditions are described in Sitransky, D .; And S
Science 252: 706 (1991) using a buffer solution at 95 ° C.
For 30 seconds; 52-58 ° C for 60-120 seconds; and 70 ° C for 60-120 seconds for 35 cycles.

【０５６５】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。脈管形成ポリペ
プチドをコードする遺伝子の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もま
た決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次に、疑わしい変
異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果
を確認する。次に、脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子において疑わしい
変異を有するＰＣＲ産物を、クローン化しかつ配列決定して、直接配列決定の結
果を確認する。Next, the PCR product was subjected to SequiTherm Polymerase (Epi
Center Technologies) and sequenced using primers labeled with T4 polynucleotide kinase at the 5'end. The intron-exon boundaries of selected exons of the gene encoding the angiogenic polypeptide are also determined and the genomic PCR product is analyzed to confirm the results. The PCR product with the suspected mutation is then cloned and sequenced to confirm the direct sequencing results. The PCR product with the suspicious mutation in the gene encoding the angiogenic polypeptide is then cloned and sequenced to confirm the direct sequencing results.

【０５６６】 脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ
．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクロ
ーン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない脈管形成ポリ
ペプチドをコードする遺伝子における変異により同定する。The PCR product of the gene encoding the angiogenic polypeptide was transformed into Holton, T
． A. And Graham, M .; W. , Nucleic Acids Rese
arch, 19: 1156 (1991) and cloned into a T-tail vector and cloned into T7 polymerase (United States Biochemi).
cal). Affected individuals are identified by mutations in genes encoding angiogenic polypeptides that are not present in unaffected individuals.

【０５６７】 ゲノム再配置もまた、脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子における改変
を決定する方法として観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、
ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，
Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１
）に記載のようにＦＩＳＨを行う。脈管形成ポリペプチドをコードするゲノムの
遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１
ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。Genomic rearrangements are also observed as a way to determine alterations in the gene encoding the angiogenic polypeptide. The genomic clone isolated according to Example 2 was
Digoxigenin deoxy-uridine 5'-triphosphate (Boehringer M
nick translation, and Johnson,
Cg. Et al., Methods Cell Biol. 35: 73-99 (1991).
FISH is performed as described in (). A large excess of human cot-1 due to specific hybridization to the genetic locus encoding the angiogenic polypeptide.
Hybridization with a labeled probe is performed using DNA.

【０５６８】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐ
ｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａ
ｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（プローブによってハイブリダイズした）脈管形成ポ
リペプチドをコードする遺伝子のゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および
転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。Chromosomes are counterstained with 4,6-diamino-2-phenylidole and propidium iodide, producing a combination of C and R bands. Alignment images for accurate mapping can be obtained by triple band filter set (Chroma T
technology, Brattleboro, VT) and cooled charge coupled device cameras (Photometrics, Tucson, AZ) and tunable excitation wavelength filters (Johnson, Cv. et al., Genet. Anal. Tech. App.
l. , 8:75 (1991)). ISee Gra
physical Program System (Inovision Corp)
image acquisition, analysis, and chromosome segment length measurement using the S. Oration, Durham, NC). Chromosomal changes in the genomic region of the gene encoding the angiogenic polypeptide (hybridized by the probe) are identified as insertions, deletions and translocations. These changes are used as diagnostic markers for related diseases.

【０５６９】 （実施例１４：生物学的サンプル中の脈管形成ポリペプチドの異常レベルを検
出する方法） 脈管形成ポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そして脈管形成ポ
リペプチドレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特
定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以
下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解さ
れる。Example 14 Method for Detecting Abnormal Levels of Angiogenic Polypeptides in Biological Samples Angiogenic polypeptides can be detected in biological samples, and angiogenic polypeptide levels If an increase or decrease in is detected, the polypeptide is a marker of a particular phenotype. It is understood that there are numerous detection methods, and therefore one of skill in the art can modify the following assays to suit their particular needs.

【０５７０】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中の脈管形成ポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレー
トのウェルを、脈管形成ポリペプチドに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１
０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポ
リクローナルのいずれかであって、実施例８に記載の方法により産生される。ウ
ェルに対する脈管形成ポリペプチドの非特異的結合が減少するように、このウェ
ルをブロックする。For example, an antibody sandwich ELISA is used to detect angiogenic polypeptides in a sample, preferably a biological sample. The wells of the microtiter plate are plated with a specific antibody to the angiogenic polypeptide to a final concentration of 0.2-1.
Coat with 0 μg / ml. This antibody is either monoclonal or polyclonal and is produced by the method described in Example 8. The wells are blocked so that non-specific binding of angiogenic polypeptides to the wells is reduced.

【０５７１】 次に、コーティングしたウェルを、脈管形成ポリペプチド含有サンプルを用い
てＲＴで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈
を使用して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水
で三回洗浄し、非結合脈管形成ポリペプチドを除去する。The coated wells are then incubated with the angiogenic polypeptide-containing sample at RT for more than 2 hours. Preferably, serial dilutions of the sample should be used to confirm the results. The plate is then washed three times with deionized or distilled water to remove unbound angiogenic polypeptide.

【０５７２】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。Next, 50 μl of the specific antibody-alkaline phosphatase conjugate was added to 25-400 n.
Add at a concentration of g and incubate at room temperature for 2 hours. Plates are washed again three times with deionized or distilled water to remove unbound conjugate.

【０５７３】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）に脈管形成ポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光
または吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中の脈管形成ポリペプ
チド濃度を補間する。Add 75 μl of 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) or p-nitrophenyl phosphate (NPP) substrate solution to each well and incubate at room temperature for 1 hour. Reactions are measured by microtiter plate reader. A standard curve is constructed using serial dilutions of control samples and the angiogenic polypeptide concentration is plotted on the X-axis (log scale) and the fluorescence or absorbance is plotted on the Y-axis (linear scale). A standard curve is used to interpolate the concentration of angiogenic polypeptides in the sample.

【０５７４】 （実施例１５：処方） 本発明はまた、有効量の治療剤を被験体に投与することによって、疾患、障害
および／または状態（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患、障
害および／または状態）を処置および／または予防する方法を提供する。治療剤
は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（フラグメントおよび改変体を
含む）、それらのアゴニストまたはアンタゴニスト、ならびに／あるいはそれら
に対する抗体を意味する。Example 15: Formulation The present invention also provides a disease, disorder and / or condition (eg, any one disclosed herein) by administering to a subject an effective amount of a therapeutic agent. Methods for treating and / or preventing the above diseases, disorders and / or conditions) are provided. The therapeutic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier type (eg, a sterile carrier),
By polynucleotides or polypeptides of the present invention (including fragments and variants), their agonists or antagonists, and / or antibodies to them.

【０５７５】 治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部
位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施
基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方お
よび投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような
考慮を行って決定される。Therapeutic agents will take into account the clinical condition of the individual patient (particularly the side effects of treatment with the therapeutic agent alone), the site of delivery, the mode of administration, the dosing regimen and other factors known to those of skill in the art, and medical practice ( Formulated and dosed in a manner that adheres to the good medical practice. Therefore, the "effective amount" intended in the present specification is determined by taking such a consideration into consideration.

【０５７６】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。As a general proposition, the total pharmaceutically effective amount of the therapeutic agent administered parenterally per dose is in the range of about 1 μg / kg / day to 10 mg / kg / day of patient body weight,
This is at therapeutic discretion, as described above. More preferably, for the hormone, the dose is at least 0.01 mg / kg / day, most preferably between about 0.01 mg / kg / day and about 1 mg / kg / day for humans. In the case of continuous administration, the therapeutic agent is typically about 1 μg / kg / hour to about 50 μg / kg.
Administered by either 1 to 4 injections per day or by continuous subcutaneous infusion (eg using a minipump) at a dosing rate of / hour. Intravenous bag solutions may also be used. The duration of treatment required to observe changes and the post-treatment interval at which a response occurs is:
It seems to change depending on the desired effect.

【０５７７】 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈
剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口
的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注
入を含む投与の様式をいう。The therapeutic agent may be administered orally, rectally, parenterally, intracistemally.
y), vaginal, intraperitoneal, topical (such as by powder, ointment, gel, drops, or transdermal patch), buccal or oral or nasal spray. "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation auxiliary of any type. The term "parenteral" as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.

【０５７８】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａ
ｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッ
チによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬
学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、
希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非
経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射およ
び注入を含む投与の様式をいう。The therapeutic agents of the present invention are also suitably administered by a sustained release system. Suitable examples of sustained release therapeutic agents include oral, rectal, parenteral, intracistema.
ly), vaginal, intraperitoneal, topical (such as by powder, ointment, gel, drops, or transdermal patch), buccal or oral or nasal spray. "Pharmaceutically acceptable carrier" means a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler,
Diluent, encapsulant or formulation auxiliary of any type. The term "parenteral" as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.

【０５７９】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまた
はマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性
物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、お
よび貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。The therapeutic agents of the invention are also suitably administered by a sustained release system. Suitable examples of sustained release therapeutic agents are suitable polymeric substances (eg semipermeable polymer matrices in the form of shaped articles (eg films or microcapsules)), suitable hydrophobic substances (eg in acceptable quality oils). As an emulsion) or an ion exchange resin, and a poorly soluble derivative (eg, a poorly soluble salt).

【０５８０】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。Sustained-release matrices include polylactide (US Pat. No. 3,773,919).
No., EP 58,481), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-5.
56 (1983)), poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (Lang)
er et al. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (19
81), and Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (19
82)), ethylene vinyl acetate (Langer et al., Ibid.) Or poly-D.
-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP133,988) is mentioned.

【０５８１】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：
ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９
８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３
，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国
特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１
０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型で
あり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択
された割合が、最適な治療剤のために調整される。Sustained-release therapeutic agents also include liposome-encapsulated compositions of the invention (generally, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
); Treat et al., Liposomes in the Therapy of
Infectious Disease and Center, Lopez
-Berstein and Fidler (ed.), Liss, New Yo
rk, pages 317-327 and 353-365 (1989)). Liposomes containing therapeutic agents can be prepared by methods known per se:
DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (19).
80); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143.
, 949; EP 142, 641; Japanese Patent Application No. 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545 and EP 1
02,324. Usually, liposomes are small (about 200-800 Å) unilamellar form, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol and the selected proportion is adjusted for the optimal therapeutic agent. It

【０５８２】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。In yet a further embodiment, the therapeutic agents of the invention are delivered by pump (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biome.
d. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery.
88: 507 (1980); Saudek et al., N. et al. Engl. J. Med. Three
21: 574 (1989)).

【０５８３】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。Another controlled release system is the Langer (Science 249: 1527-15).
33 (1990)).

【０５８４】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。For parenteral administration, in one embodiment, the therapeutic agent will generally be administered to the recipient in the desired degree of purity, pharmaceutically acceptable carrier, ie, the dosage and concentration employed. Formulated by mixing in a unit dosage injectable form (solution, suspension or emulsion) with a non-toxic and compatible with the other ingredients of the formulation. For example, the formulation preferably does not include oxidizing agents and other compounds known to be deleterious to therapeutic agents.

【０５８５】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。In general, the formulations are prepared by contacting the therapeutic agent with a liquid carrier, a finely divided solid carrier, or both, in a uniform and intimate contact. The product is then shaped, if desired, into the desired formulation. Preferably the carrier is a parenteral carrier, more preferably a solution that is isotonic with the blood of the recipient. Examples of such carrier vehicles include water, saline, Ringer's solution and dextrose solution. Non-aqueous vehicles such as fixed oils and ethyl oleate are also useful herein, as are liposomes.

【０５８６】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are not toxic to the recipients at the dosages and concentrations used, and include such substances as phosphates, citrates, succinates, acetic acid and other organic acids or their salts. Buffers such as; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides (eg, polyarginine or tripeptides); proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; polyvinylpyrrolidone. Hydrophilic polymers such as; glycine, glutamic acid, aspartic acid or amino acids such as arginine; cellulose or its derivatives, mono-, di-, and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA ; Sugar sugars such as mannitol or sorbitol Lumpur; counterions such as sodium; and / or polysorbate include nonionic surfactants such as poloxamers or PEG.

【０５８７】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。The therapeutic agent is typically about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml, preferably 1
It is formulated in such a vehicle at a concentration of -10 mg / ml and a pH of about 3-8. It is understood that the use of the particular excipients, carriers or stabilizers described above will result in the formation of polypeptide salts.

【０５８８】 治療的投与に用いられる任意の治療剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。Any therapeutic agent used for therapeutic administration can be sterile. Sterility is easily achieved by filtration through a sterile filtration membrane (eg 0.2 micron membrane). Generally, the therapeutic agent is placed in a container having a sterile access port, such as an intravenous solution bag or vial with a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

【０５８９】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。
凍結乾燥したポリペプチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製
する。Therapeutic agents are typically stored in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules or vials, as an aqueous solution or as a lyophilized formulation for reconstitution.
As an example of a lyophilized formulation, sterile filtered 1% (w / v) into 10 ml vials.
) Fill 5 ml of aqueous polypeptide solution and freeze-dry the resulting mixture.
The lyophilized polypeptide is reconstituted with bacteriostatic water for injection to prepare an infusion solution.

【０５９０】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。The invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more of the ingredients of the therapeutic agents of the invention. A notice in the form of a government agency that regulates the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products may accompany such containers, which notice may include government notices regarding manufacture, use, or sale for human administration. Indicates approval by the institution. In addition, therapeutic agents may be used in combination with other therapeutic compounds.

【０５９１】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗ
ｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイル
ス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂
犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向する
ワクチン。組み合わせは、付随的にか（例えば、混合物として、別々であるが同
時にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは
、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーション
（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々である
が同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手
順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物
または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。The therapeutic agents of the present invention can be administered alone or in combination with an adjuvant. Adjuvants that may be administered with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, alum, alum and deoxycholic acid (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS2.
1 (Genentech, Inc.), BCG, and MPL. In certain embodiments, therapeutic agents of the invention are administered in combination with alum. In another specific embodiment, the Therapeutic Agents of the invention are administered in combination with QS21. Additional adjuvants that may be administered with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, monophosphoryl lipid immunomodulators, Adj.
uVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, aluminum salt, MF-59, and Virosomal adjuvant technology. Vaccines that may be administered with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, MMR (measles, mumps, rubella), polio, chickenpox, tetanus / diphtheria, A. Hepatitis B, hepatitis B, influenza B, whooping cough (w
Vaccines directed against protection against hoofing cough, pneumonia, influenza, Lyme disease, rotavirus, cholera, yellow fever, Japanese encephalitis, polimyelitis, rabies, typhoid fever, and pertussis. Combinations can be administered either concomitantly (eg, as a mixture, separately but simultaneously or in parallel); or sequentially. This includes a presentation in which the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, when administered to the same individual via separate intravenous lines). It also includes procedures. "Combination" administration further comprises the separate administration of one of the compounds or agents given first, followed by the second.

【０５９２】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；ま
たは逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治
療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々
であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与さ
れる手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与
えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。Therapeutics of the invention can be administered alone or in combination with other therapeutic agents. Therapeutic agents that may be administered with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, other members of the TNF family, chemotherapeutic agents, antibiotics, steroidal and non-steroidal anti-inflammatory agents. , Conventional immunotherapeutic agents, cytokines and / or growth factors. The combination can be administered either, for example, simultaneously as a mixture, separately but simultaneously or in parallel; or sequentially. This includes a presentation in which the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and also in procedures where the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, to the same individual via separate intravenous lines). Also includes. "Combination" administration further comprises the separate administration of one of the compounds or agents given first, followed by the second.

【０５９３】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、Ｔ
ＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮ
Ｆ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βの状態で
見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４
−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４
３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（
ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際
公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔ
ｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および
神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０
、可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ
、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９
７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国
際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９
４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国
際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２
０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、
ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態の
ＣＤ１５３。In one embodiment, Therapeutics of the invention are administered in combination with members of the TNF family. TNF molecules that can be administered with the therapeutic agents of the invention, T
NF-related or TNF-like molecules include, but are not limited to: soluble forms of TNF-α, lymphotoxin-α, (LT-α, TN.
Also known as F-β), LT-β (found in the complex heterotrimer LT-α2-β), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4,
-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (International Publication Number WO96 / 14
328), AIM-I (International Publication No. WO97 / 33899), endokine (
endokine) -α (International Publication Number WO98 / 07880), TR6 (International Publication Number WO98 / 30694), OPG, and Neutrokine (neut).
rokine) -α (International Publication No. WO98 / 18921), OX40, and nerve growth factor (NGF), and soluble forms of Fas, soluble forms of CD30.
, Soluble form of CD27, soluble form of CD40 and soluble form of 4-IBB
, TR2 (International Publication Number WO96 / 34095), DR3 (International Publication Number WO9)
7/33904), DR4 (International Publication Number WO98 / 32856), TR5 (International Publication Number WO98 / 30693), TR6 (International Publication Number WO98 / 3069).
4), TR7 (International Publication Number WO98 / 41629), TRANS, TR9 (International Publication Number WO98 / 56892), TR10 (International Publication Number WO98 / 542).
02), 312C2 (International Publication No. WO98 / 06842), and TR12,
And soluble form of CD154, soluble form of CD70, and soluble form of CD153.

【０５９４】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
ＺTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲTM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ）。本
発明の治療剤と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル））
、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗
レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するた
め、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤
との任意の組み合わせで使用され得る。In certain embodiments, Therapeutics of the invention are administered in combination with antiretroviral agents, nucleoside reverse transcriptase inhibitors, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors and / or protease inhibitors. Examples of nucleoside reverse transcriptase inhibitors that can be administered in combination with the therapeutic agent of the present invention include the following:
Not limited to: RETROVIR ™ (Zidovudine / AZT), VIDE
Z ™ (Didanocin / ddI), HIVID ™ (Zalcitabine / ddC), ZER
IT ™ (stavudine / d4T), EPIVIR ™ (lamivudine / 3TC), and COMBIVIR ™ (zidovudine / lamivudine). Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors that may be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, VIRAMUNE ™ (nevirapine), RESCRI.
PTOR ™ (delavirdine), and SUSTIVA ™ (efavirenz). Protease inhibitors that can be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include:
Including but not limited to: CRIXIVAN TM (indinavir), NORVIR TM (ritonavir), INVIRASE TM (saquinavir))
, And VIRACCEPT ™ (Nelfinavir). In certain embodiments, an antiretroviral agent, nucleoside reverse transcriptase inhibitor, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, and / or protease inhibitor is for treating AIDS and / or for preventing or treating HIV infection. , And can be used in any combination with the therapeutic agents of the invention.

【０５９５】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の治療剤は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置ま
たは予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺ
ＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴ
ＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複
合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡ
ＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯ
ＬTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明
の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感
染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTMとの任意の組
み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和
見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩ
ＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治
療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡ
ＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺ
ＯＬＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本
発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を
予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／またはＦＡ
ＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染
を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／
またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感染を予防的に処置または予
防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの
任意の組み合わせで使用される。In other embodiments, Therapeutics of the invention may be administered in combination with anti-opportunistic infection agents. Anti-opportunistic infection agents that may be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to, TRIMETHOP.
RIM-SULFAMETHOXAZOLE ™ , DAPSONE ™ , PENTA
MIDINE ™ , ATOVAQONE ™ , ISONIAZID ™ , RIFAM
PIN ™ , PYRAZINAMIDE ™ , ETHAMBUTOL ™ , RIFAB
UTIN ™ , CLARITHROMYCIN ™ , AZITHROMYCIN ™ ,
GANCICLOVIR ™ , FOSCARNET ™ , CIDOFOVIR ™ , F
LUCONAZOLE ™ , ITRACONAZOLE ™ , KETOCONAZO
LE ™ , ACYCLOVIR ™ , FAMCICOLVIR ™ , PYRIMETH
AMINE ™ , LEUCOVORIN ™ , NEUPOGEN ™ (filgrastim / G-CSF), and LEUKINE ™ (sargramostin (sargra
mostim) / GM-CSF). In certain embodiments, the Therapeutic Agents of the present invention are used to treat or prevent opportunistic Pneumocystis carinii pneumonia infection prophylactically.
OLE ™ , DAPSONE ™ , PENTAMIDINE ™ , and / or AT
Used in any combination with OVAQUONE ™ . In another specific embodiment, the therapeutic agents of the invention are ISONIAZID ™ , RIFA for prophylactically treating or preventing opportunistic Mycobacterium avium combined infections.
MPIN ™ , PYRAZINAMIDE ™ , and / or ETHAMBUTO
Used in any combination with L ™ . In another particular embodiment, the therapeutic agents of the invention are RIFABUTIN ™ , CLARIT for the prophylactic treatment or prevention of opportunistic Mycobacterium tuberculosis infections.
Used in combination with HRMYCIN ™ , and / or AZITHROMYCIN ™ . In another particular embodiment, the therapeutic agents of the invention are administered to GANCI to prophylactically treat or prevent opportunistic cytomegalovirus infections.
Used in any combination with CLOVIR ™ , FOSCARNET ™ , and / or CIDOFOVIR ™ . In another particular embodiment, the therapeutic agents of the invention are FLUCONA for the prophylactic treatment or prevention of opportunistic fungal infections.
ZOLE ™ , ITRACONAZOLE ™ , and / or KETOCONAZ
Used in any combination with OLE ™ . In another particular embodiment, the therapeutic agents of the invention are ACYCLOVIR ™ and / or FA for the prophylactic treatment or prevention of opportunistic herpes simplex virus type I and / or type II infections.
Used in any combination with MCICOLVIR ™ . In another particular embodiment, the therapeutic agents of the invention are PYRIMETHAMINE ™ and / or for the prophylactic treatment or prevention of opportunistic Toxoplasma gondii infection.
Or used in any combination with LEUCOVORIN ™ . In another particular embodiment, the Therapeutics of the invention are used in any combination with LEUCOVORIN ™ and / or NEUPOGEN ™ to prophylactically treat or prevent opportunistic bacterial infections.

【０５９６】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。In a further embodiment, the Therapeutic Agents of the invention are administered in combination with antiviral agents. Antiviral agents that may be administered with the therapeutic agents of the present invention include acyclovir, ribavirin, amantadine, and remantidine (remantidine).
Tidine), but is not limited thereto.

【０５９７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、
マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファン
ピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げら
れるが、これらに限定されない。In a further embodiment, the therapeutic agents of the invention are administered with an antibiotic. Antibiotics that can be administered with the therapeutic agent of the present invention include amoxicillin, β
-Lactamase, aminoglycoside, β-lactam (glycopeptide), β-lactamase, clindamycin, chloramphenicol, cephalosporin, ciprofloxacin, ciprofloxacin, erythromycin, fluoroquinolones,
Macrolide antibiotics, metronidazole, penicillins, quinolones, rifampin, streptomycin, sulfonamides, tetracyclines, trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, and vancomycin are included without limitation.

【０５９８】 本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。Conventional non-specific immunosuppressive agents that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include steroids, cyclosporine, cyclosporine analogs, cyclophosphamide methylprednisone, prednisone, azathioprine, FK-506, 15-deoxysperm. Guarin (15-deoxyspergualin), and response T
Other immunosuppressive agents that act by suppressing the function of cells include, but are not limited to.

【０５９９】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴTM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。In certain embodiments, Therapeutics of the invention are administered in combination with immunosuppressive agents. Immunosuppressant preparations that can be administered with the therapeutic agents of the invention include ORT
HOCLONE TM (OKT3), SANDIMMUNE TM / NEORAL TM / S
ANGDYA ™ (cyclosporine), PROGRAF ™ (tacrolimus), CE
Examples include, but are not limited to, LLCCEPT ™ (mycophenolate), azathioprine, glucocorticosteroids, and RAPAMUNE ™ (sirolimus). In certain embodiments, immunosuppressive agents may be used to prevent rejection of organ or bone marrow transplants.

【０６００】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶ
ＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTM およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。In a further embodiment, the Therapeutics of the invention are administered alone or in combination with one or more intravenous immunoglobulin preparations. Intravenous immunoglobulin preparations that may be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include GAMMAR ™ , IV
Examples include, but are not limited to, EEGAM ™ , SANDOGLOBULIN ™ , GAMMAGARD S / D ™ and GAMIMUNE ™ . In certain embodiments, therapeutic agents of the invention are administered in combination with an intravenous immunoglobulin preparation in transplantation therapy (eg, bone marrow transplant).

【０６０１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質と組合せて投与され
る。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質としては、テトラサイクリン、
メトロニダゾール、アンモキシシリン、βラクタマーゼ、アミノグリコシド、マ
クロライド、キノロン、フルオロキノロン、セファロスポリン、エチロマイシン
、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限
定されない。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with an antibiotic. Antibiotics that may be administered with the compositions of the present invention include tetracycline,
Examples include, but are not limited to, metronidazole, amoxicillin, beta-lactamase, aminoglycosides, macrolides, quinolones, fluoroquinolones, cephalosporins, etilomycin, ciprofloxacin, and streptomycin.

【０６０２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered alone or in combination with an anti-inflammatory agent. Anti-inflammatory agents that can be administered with the therapeutic agent of the present invention include glucocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory agents, aminoarylcarboxylic acid derivatives, arylacetic acid derivatives, arylbutyric acid derivatives, arylcarboxylic acids, arylpropionic acid derivatives, pyrazoles, Pyrazolones, salicylic acid derivatives, thiazinecarboxamides, e-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrin
e), bendazac, benzydamine, bucolome, diphenpyramide, ditazole, emorfazone, guaiazulene, nabumetone, nimesulide, orgothein, oxaseprol, paranyline, perisoxal,
Examples include pifoxime, procazone, proxazole, and tenidap,
It is not limited to these.

【０６０３】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。In another embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with a chemotherapeutic agent. Chemotherapeutic agents that may be administered with the therapeutic agents of the invention include antibiotic derivatives (eg, doxorubicin, bleomycin, daunorubicin, and dactinomycin); anti-estrogens (eg, tamoxifen); antimetabolites (eg, fluorouracil, 5). -FU, methotrexate, floxuridine, interferon alpha-2b, glutamic acid, plicamycin
, Mercaptopurine, and 6-thioguanine); cytotoxic agents (eg, carmustine, BCNU, lomustine, CCNU, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, estramustine, hydroxyurea, procarbazine, mitomycin, busulfan, cis-platin). , And vincristine sulfate); hormones (eg, medroxyprogesterone, estramustine sodium phosphate, ethinyl estradiol, estradiol, megestrol acetate, methyltestosterone, diethylstilbestrol diphosphate, chlorotrianisene, and test lactone); Nitrogen mustard derivatives (eg mephalen, chlorambucil, mechlorethamine Roger emissions mustard) and thiotepa); steroids and combinations (e.g., betamethasone sodium); and others (
Examples include, but are not limited to, dicarbazine, asparaginase, mitoten, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, and etoposide.

【０６０４】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。In certain embodiments, Therapeutics of the invention are administered in combination with CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) or in any combination of the components of CHOP. In another embodiment, the Therapeutic Agents of the invention are administered in combination with Rituximab. In a further embodiment, the therapeutic agents of the invention are Rituxmab and CHOP.
Or with any combination of Rituxmab and CHOP components.

【０６０５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意
のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１
７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに
限定されない）と共に投与され得る。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with a cytokine. ILs include cytokines that can be administered with the therapeutic agents of the invention.
2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13
, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-γ and TNF-α, but are not limited thereto. In another embodiment, the therapeutic agent of the present invention comprises any interleukin (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4.
, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1
1, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-1
7, IL-18, IL-19, IL-20 and IL-21).

【０６０６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質とし
ては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム誘導増殖因子
（Ｇｉｌｉｏｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ
）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（
ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導増
殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示され
るような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２
（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような
血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号
に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ
９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ
−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内
皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示
されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ
１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が
挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考とし
て援用される。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with angiogenic proteins. Angiogenic proteins that may be administered with the compositions of the present invention include Glioma Derived Growth Factor (GDGF) as disclosed in EP-399816.
); Platelet-derived growth factor-A (as disclosed in European Patent EP-682110).
PDGF-A); Platelet Induced Growth Factor-B (PDGF-B) as disclosed in European Patent EP-283217; Placental Growth Factor (PIGF) as disclosed in WO92 / 06194; Hauser et al. , Gorth Fact
ors, 4: 259-268 (1993) placental growth factor-2.
(PIGF-2); vascular endothelial growth factor (VEGF) as disclosed in WO 90/13649; vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) as disclosed in European Patent EP-506477; Vascular Endothelial Growth Factor-2 (VEGF-2) as disclosed in International Publication Number WO 96/39515; International Publication Number WO
Vascular Endothelial Growth Factor B-186 (VEGF) as disclosed in 96/26736.
-B186); vascular endothelial growth factor-D (VEGF-D) as disclosed in WO98 / 02543; vascular endothelial growth factor-D (VEGF as disclosed in WO98 / 07832). -D); and German patent DE
Examples include, but are not limited to, vascular endothelial growth factor-E (VEGF-E) as disclosed in 19639601. The above references are incorporated herein by reference.

【０６０７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子とし
ては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ
−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、Ｆ
ＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが
、これらに限定されない。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with fibroblast growth factor. Fibroblast growth factors that can be administered with the composition of the present invention include FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF.
-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, F
GF-12, FGF-13, FGF-14, and FGF-15 include, but are not limited to.

【０６０８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。In a further embodiment, the compositions of this invention are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimes (eg, radiation treatment).

【０６０９】 （実施例１６：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の脈管形成ポリペ
プチドまたはそれらのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。Example 16: Method for Treating Decreased Levels of Polypeptides The present invention relates to a method for treating an individual in need of increasing levels of a polypeptide of the invention in the body, the method comprising: Administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of angiogenic polypeptides or agonists thereof.

【０６１０】 さらに、個体における脈管形成ポリペプチドの標準または正常発現レベルの低
下により引き起こされる状態は、脈管形成ポリペプチドを、好ましくは分泌形態
で投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、脈
管形成ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方
法は、このような個体に、このような個体で脈管形成ポリペプチドの活性レベル
を増加させる量の脈管形成ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包
含する。Further, it is understood that conditions caused by reduced normal or normal expression levels of angiogenic polypeptides in an individual can be treated by administering the angiogenic polypeptide, preferably in secreted form. . Thus, the invention also provides a method of treating an individual in need of increased levels of angiogenic polypeptides. The method comprises the step of administering to such an individual a pharmaceutical composition comprising an amount of angiogenic polypeptide that increases the level of activity of the angiogenic polypeptide in such individual.

【０６１１】 例えば、脈管形成ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、
１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペ
プチドは分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、
実施例１５に提供されている。For example, a patient with reduced levels of angiogenic polypeptides may be
The daily dose of 0.1 to 100 μg / kg is taken for 6 consecutive days. Preferably the polypeptide is in secreted form. The exact details of the dosing and formulation-based regimen are:
Provided in Example 15.

【０６１２】 （実施例１７：脈管形成ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内における本発明の脈管形成ポリペプチドのレベルを減少さ
せる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の脈
管形成ポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、脈管
形成ポリペプチド特異的抗体である。Example 17: Method of Treating Elevated Levels of Angiogenic Polypeptides The present invention also provides for treating an individual in need of having reduced levels of angiogenic polypeptides of the present invention in the body. Regarding the method, the method comprises administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of an antagonist of angiogenic polypeptides. Preferred antagonists for use in the present invention are angiogenic polypeptide-specific antibodies.

【０６１３】 アンチセンス技術を使用して脈管形成ポリペプチドの産生を阻害する。この技
術は、ガンのような様々な病因に起因する脈管形成ポリペプチド、好ましくは分
泌形態の脈管形成ポリペプチドのレべルを低下させる方法の１つの例である。Antisense technology is used to inhibit the production of angiogenic polypeptides. This technique is one example of a method of reducing the level of angiogenic polypeptides, preferably secreted forms of angiogenic polypeptides, due to various etiologies such as cancer.

【０６１４】 例えば、脈管形成ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に
、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３
．０ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性
があれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌク
レオチドの処方は、実施例１５に提供されている。For example, in patients diagnosed with abnormally elevated levels of angiogenic polypeptides, antisense polynucleotides were administered at 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 3
． It is administered intravenously at 0 mg / kg / day for 21 days. If well tolerated, the procedure is repeated after a 7 day washout period. Formulations of antisense polynucleotides are provided in Example 15.

【０６１５】 （実施例１８：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、脈管形成ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を
患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から
得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。小塊の組
織を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。この
フラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間
後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして
新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有
するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間イン
キュベートする。Example 18 Treatment Method Using Gene Therapy—Ex Vivo One method of gene therapy is to implant into a patient fibroblasts capable of expressing angiogenic polypeptides. Fibroblasts are generally obtained from a subject by skin biopsy. The resulting tissue is placed in tissue culture medium and divided into small pieces. The nodule of tissue is placed on the wet surface of the tissue culture flask and approximately 10 pieces are placed in each flask. The flask is inverted and tightly closed, then left overnight at room temperature. After 24 hours at room temperature, the flask is inverted, the tissue mass remains fixed at the bottom of the flask and fresh medium (eg Ham's F12 medium containing 10% FBS, penicillin and streptomycin) is added. The flask is then incubated at 37 ° C for approximately 1 week.

【０６１６】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。At this point, fresh medium is added and then replaced every few days. After culturing for another two weeks, a monolayer of fibroblasts appears. Trypsinize the monolayer and scale up to a larger flask.

【０６１７】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。The Moloney murine sarcoma virus long flanking pMV-7 (Ki
rschmeier, P .; T. Et al., DNA, 7: 219-25 (1988)) is digested with EcoRI and HindIII and then treated with calf intestinal phosphatase. The linear vector is fractionated on an agarose gel and purified using glass beads.

【０６１８】 脈管形成ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそ
れぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得
る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマ
ーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線
状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメント
を連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ
１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティ
ングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する。The cDNAs encoding the angiogenic polypeptides correspond to the 5'and 3'terminal sequences described in Example 1, respectively, with primers and with appropriate restriction sites and start / stop codons, as required. PCR primers can be used for amplification. Preferably, the 5'primer contains an EcoRI site and the 3'primer contains a HindIII site. Equal amounts of Moloney murine sarcoma virus linear backbone and amplified EcoRI and HindIII fragments were added to T4.
Add together in the presence of DNA ligase. The resulting mixture is maintained under suitable conditions for ligating the two fragments. Then, using the ligation mixture, the bacterial HB
Transform 101. It is then plated on agar containing kanamycin to confirm that the vector has the gene of interest inserted correctly.

【０６１９】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子を含むＭ
ＳＶベクターを培地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入す
る。このとき、パッケージング細胞は脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子
を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞をプロデュ
ーサー細胞という）。Amphoteric pA317 or GP + am12 packaging cells were
Dul with 10% Calf Serum (CS), Penicillin and Streptomycin
Grow to confluent density in tissue culture in becco modified Eagles medium (DMEM). Next, M containing the gene encoding the angiogenic polypeptide
The SV vector is added to the medium and the packaging cells are transduced with the vector. At this time, the packaging cells produce infectious viral particles containing a gene encoding an angiogenic polypeptide (here, the packaging cells are referred to as producer cells).

【０６２０】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓ
のような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要で
ある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、脈管形
成タンパク質が産生されているか否かを決定する。次に、操作された線維芽細胞
を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエン
トに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。Fresh medium was added to the transduced producer cells and the medium was then added to 10c.
Harvest from m-plate confluent producer cells. The spent medium containing infectious viral particles is filtered through a Millipore filter to remove detached producer cells and then used to infect fibroblasts. Media is removed from the subconfluent plates of fibroblasts and quickly replaced with media from producer cells. This medium is removed and replaced with fresh medium. If the virus titer is high, virtually all fibroblasts will be infected and no selection is required. If the titer is very low, neo or his
It is necessary to use a retroviral vector with a selectable marker such as Once the fibroblasts have been efficiently infected, the fibroblasts are analyzed to determine if angiogenic proteins are being produced. The engineered fibroblasts are then transplanted into the host either alone or after being grown to confluence on Cytodex 3 microcarrier beads.

【０６２１】 （実施例１９：脈管形成ポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子を使用する
遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、脈管形成ポリペプチドをコードする内
因性配列を、例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日
出願）；国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；
国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９
３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５
〜４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに
作動可能に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが
、その細胞中で発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される
、遺伝子の活性化を包含する。Example 19: Gene Therapy Using Endogenous Genes Corresponding to Angiogenic Polynucleotides Another method of gene therapy according to the present invention is the use of endogenous sequences encoding angiogenic polypeptides, eg, U.S. Patent No. 5,641,670 (filed June 24, 1997); International Publication No. WO 96/29411 (published September 26, 1996);
International Publication No. WO 94/12650 (published on August 4, 1994); Kolle
r et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8932-89.
35 (1989); and Zijlstra et al., Nature, 342: 435.
~ 438 (1989), operably linked to the promoter via homologous recombination. The method involves activation of a gene that is present in the target cell but is not expressed in the cell or is expressed at a lower level than desired.

【０６２２】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、脈管形成ポリペプチドをコードする内
因性遺伝子配列の５’非コード配列と相同である。この標的配列は、この遺伝子
の５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこ
の内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、
ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’
末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化
配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み
、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同
じ制限酵素部位を含む。この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を
、適切な制限酵素で消化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化した
プロモーターおよび消化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でと
もに加える。生じた混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下
で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール
抽出およびエタノール沈殿を行う。A polynucleotide construct is made that contains a promoter and targeting sequence. This target sequence is homologous to the 5'non-coding sequence of the endogenous gene sequence encoding the angiogenic polypeptide, which is flanked by the promoters. The target sequence is sufficiently close to the 5'end of the gene so that the promoter is operably linked to the endogenous sequence upon homologous recombination. This promoter and targeting sequence
It can be amplified using PCR. Preferably, the amplified promoter is 5 '
It contains different restriction enzyme sites on the ends and the 3'end. Preferably, the 3'end of the first targeting sequence contains the same restriction enzyme sites as the 5'end of the amplified promoter, and the 5'end of the second targeting sequence is the 3'end of the amplified promoter. Contains the same restriction enzyme sites as. The amplified promoter and amplified targeting sequence are digested with the appropriate restriction enzymes followed by treatment with calf intestinal phosphatase. The digested promoter and digested targeting sequence are added together in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions suitable for ligation of these two fragments. The construct is size fractionated on an agarose gel, followed by phenol extraction and ethanol precipitation.

【０６２３】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともにも投与し得る。送達のためのこのよ
うな方法は、当該分野で公知である。In this example, the polynucleotide construct is administered as a naked polynucleotide via electroporation. However, the polynucleotide construct may also be administered with a transfection facilitating agent (eg, liposomes, viral sequences, viral particles, precipitating agents, etc.). Such methods for delivery are known in the art.

【０６２４】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性遺伝子配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中にお
ける脈管形成ポリペプチド発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野
で公知の他の任意の方法により、検出され得る。Once the cells have been transfected, homologous recombination will occur at the promoter and will be operably linked to the endogenous gene sequence. This results in angiogenic polypeptide expression in this cell. Expression can be detected by immunological staining or any other method known in the art.

【０６２５】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。Fibroblasts are obtained from a subject by skin biopsy. The obtained tissue is DMEM +
Place in 10% fetal bovine serum. Exponentially growing or early stationary phase fibroblasts are trypsinized and rinsed from the surface of the plastic with nutrient medium. An aliquot of cell suspension is removed for counting and the remaining cells are subjected to centrifugation. The supernatant is aspirated and the pellet is mixed with 5 ml of electroporation buffer (20 mM HEPES pH 7.3, 137 mM NaCl, 5 mM K).
Cl, 0.7 mM Na 2 HPO 4 , 6 mM dextrose). The cells are recentrifuged, the supernatant aspirated, and the cells resuspended in electroporation buffer containing 1 mg / ml acetylated bovine serum albumin. This final cell suspension contains approximately 3 × 10 6 cells / ml. Electroporation should be performed immediately after resuspension.

【０６２６】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、脈管形成タンパ
ク質をコードする遺伝子が配置される遺伝子座に標的化するためのプラスミドを
構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈ
ｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末
端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅す
る。２つの脈管形成タンパク質非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の
脈管形成タンパク質非コード配列（脈管形成タンパク質フラグメント１）を、５
’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅する；
他方の脈管形成タンパク質非コード配列（脈管形成タンパク質フラグメント２）
を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増
幅する。このＣＭＶプロモーターおよび脈管形成タンパク質フラグメントを、適
切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；脈管形成タンパク
質フラグメント１−ＸｂａＩ；脈管形成タンパク質フラグメント２−ＢａｍＨＩ
）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。Plasmid DNA is prepared according to standard techniques. For example, to construct a plasmid for targeting to the locus where the gene encoding the angiogenic protein is located, the plasmid pUC18 (MBI Fermentas, Amh is used.
erst, NY) is digested with HindIII. The CMV promoter is amplified by PCR with an XbaI site at the 5'end and a BamHI site at the 3'end. Two angiogenic protein non-coding sequences are amplified via PCR: one angiogenic protein non-coding sequence (angiogenic protein fragment 1)
Amplify with a HindIII site at the'end and an XbaI site at the 3'end;
Non-angiogenic protein non-coding sequence (angiogenic protein fragment 2)
Is amplified with a BamHI site at the 5'end and a HindIII site at the 3'end. The CMV promoter and angiogenic protein fragment were loaded with the appropriate enzymes (CMV promoter-XbaI and BamHI; angiogenic protein fragment 1-XbaI; angiogenic protein fragment 2-BamHI.
) Digest and ligate together. The resulting ligation product is digested with HindIII and ligated with the HindIII digested pUC18 plasmid.

【０６２７】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。Plasmid DNA was loaded onto a sterile cuvette (B
io-Rad). Final DNA concentration is generally at least 120μ
g / ml. Then 0.5 ml of the cell suspension (containing approximately 1.5 × 10 6 cells) is added to the cuvette and the cell suspension and DNA solution are gently mixed. Electroporation is performed using a Gene-Pulser instrument (Bio-Rad). The capacitance and voltage are set to 960 μF and 250-300 V, respectively. Increasing the voltage reduces cell survival, but dramatically increases the proportion of viable cells that stably integrate the introduced DNA into their genome. Given these parameters, the pulse time is about 14-2
0 mSec should be observed.

【０６２８】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か
、またはサイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃ
ａｒｒｉｅｒ）ビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれか
で、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで
、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。The electroporated cells are maintained at room temperature for approximately 5 minutes, then the contents of the cuvette are gently removed using a sterile transfer pipette. The cells were placed in a 10 cm dish containing pre-warmed nutrient medium (D containing 15% bovine serum).
MEM) 10 ml directly and incubate at 37 ° C. The next day, the medium was aspirated and replaced with 10 ml of fresh medium and an additional 16-24
Incubate for hours. The engineered fibroblasts were then placed in the host either alone or in cytodex 3 microcarriers.
Inject either after growing to confluency on the beads. Here, the fibroblasts produce the protein product. The fibroblasts can then be introduced into a patient as described above.

【０６２９】 （実施例２０：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、脈管形成ポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への脈管形成ポリペプチドをコード
する裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列
の導入に関する。脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロ
モーター、または標的組織による脈管形成ポリペプチドの発現に必要な任意の他
の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および
送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９
２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１
号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．
３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒｏｍ
ｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６）；
Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９
０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。Example 20: Method of Treatment Using Gene Therapy-In Vivo Another aspect of the invention is the use of in vivo gene therapy methods to treat disorders, diseases and conditions. This gene therapy method involves the introduction of naked nucleic acid (DNA, RNA, and antisense DNA or RNA) sequences encoding angiogenic polypeptides into an animal to increase or decrease the expression of angiogenic polypeptides. Regarding The polynucleotide encoding the angiogenic polypeptide can be operably linked to a promoter, or any other genetic element required for expression of the angiogenic polypeptide by the target tissue. Techniques and methods for such gene therapy and delivery are known in the art, eg, WO 90/1109.
2, WO98 / 11779; US Pat. Nos. 5,693,622 and 5,705,151.
No. 5,580,859; Tabata et al., Cardiovasc. Res.
35 (3): 470-479 (1997); Chao et al., Pharmacol.
Res. 35 (6): 517-522 (1997); Wolff, Neurom.
uscul. Disord. 7 (5): 314-318 (1997), Schw.
artz et al., Gene Ther. 3 (5): 405-411 (1996);
Tsurumi et al., Circulation 94 (12): 3281-329.
0 (1996) (incorporated herein by reference).

【０６３０】 脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド構築物は、
注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉
、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入）によって送達され得る。さら
に、このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリ
ア中で送達され得る。A polynucleotide construct comprising a gene encoding an angiogenic polypeptide comprises:
It may be delivered by any method that delivers the injectable substance to cells of the animal, such as injecting the interstitial space of tissue (heart, muscle, skin, lung, liver, intestine, etc.). Further, the polynucleotide construct can be delivered in a pharmaceutically acceptable liquid or aqueous carrier.

【０６３１】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドはまた、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（
例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。The term “naked” polynucleotide, DNA or RNA refers to any delivery vehicle (viral sequence, viral particle, liposomal formulation, lipofectin, or lipofectin that acts to assist, facilitate, or facilitate entry into cells. (Including a precipitating agent) is not included. However, the polynucleotide encoding the angiogenic polypeptide may also be a liposome formulation (which may be prepared by methods well known to those skilled in the art).
For example, Felgner P. et al. L. (1995) Ann. NY Acad. S
ci. 772: 126-139 and Abdaleh B .; Et al (1995) B
iol. Cell 85 (1): 1-7)).

【０６３２】 この遺伝子治療方法において使用される脈管形成ポリペプチドをコードする遺
伝子を含むポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み
込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意
の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺
伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点
は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によっ
て、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリ
ペプチドの産生を提供し得ることが示された。The polynucleotide vector construct containing the gene encoding the angiogenic polypeptide used in this method of gene therapy is preferably one that does not integrate into the host genome and does not contain sequences that allow replication. Any strong promoter known to those of skill in the art can be used to drive the expression of DNA. Unlike other gene therapy techniques, one major advantage of introducing a naked nucleic acid sequence into a target cell is the transient nature of polynucleotide synthesis in that cell. Studies have shown that non-replicating DNA sequences can be introduced into cells to provide for the production of desired polypeptides for periods of up to 6 months.

【０６３３】 脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド構築物は、
動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、
血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系
、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の
間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官組織の細網線維、血管または室の壁
における弾性線維、線維性組織におけるコラーゲン線維に間にある）、あるいは
結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様
に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である
。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それ
らは、これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それ
らは、好ましくは、分化した持続性の非***細胞に送達され、そしてその細胞に
おいて発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化してい
ない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る
。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力
において、特に適格である。A polynucleotide construct comprising a gene encoding an angiogenic polypeptide is
Tissues in animals (muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph,
Blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gall bladder, stomach, intestine, testis, ovary, uterus, rectum, nervous system, eye, gland, and connective tissue). The interstitial spaces of this tissue are intercellular fluids, mucopolysaccharide substrates (between reticulum fibers of organ tissue, elastic fibers in walls of blood vessels or chambers, collagen fibers in fibrous tissue), or connective tissue sheath muscle cells. Includes the same matrix in the interior or in the hiatus of the bone. This is likewise the space occupied by circulating plasma and lymphatic fluid of the lymphatic channels. Delivery of muscle tissue to the interstitial space is preferred for the reasons discussed below. They can be conveniently delivered by injection into the tissue containing these cells. They are preferably delivered to and expressed in differentiated, persistent, non-dividing cells, which delivery and expression can be effected on undifferentiated cells or cells that are not fully differentiated (eg, blood stem cells). Or skin fibroblasts). In vivo, muscle cells are particularly qualified for their ability to take up and express polynucleotides.

【０６３４】 脈管形成ポリペプチドをコードする裸のポリヌクレオチド注入のために、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ
体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約
２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５
ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の
組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によっ
て容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ま
しい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、
他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織
、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、脈管形成ポリペプチドをコードする遺伝子を含む裸のポリヌクレオチ
ド構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって
動脈に送達され得る。For injection of naked polynucleotides encoding angiogenic polypeptides, DN
An effective dosage of A or RNA is about 0.05 g / kg body weight to about 50 mg / kg.
In the weight range. Preferably, this dosage is from about 0.005 mg / kg to about 20 mg / kg, and more preferably from about 0.05 mg / kg to about 5.
mg / kg. Of course, as the skilled artisan will appreciate, this dosage will vary according to the tissue site of injection. Suitable and effective dosages of nucleic acid sequences can be readily determined by those of ordinary skill in the art and may depend on the condition being treated and the route of administration. The preferred route of administration is by the parenteral route of injection into the interstitial space of tissues. But,
Other parenteral routes may also be used, including inhalation of aerosol formulations, especially for delivery to the mucosa of the lungs or bronchial tissues, throat, or nose, among others. In addition, naked polynucleotide constructs containing genes encoding angiogenic polypeptides can be delivered to arteries during angioplasty by the catheter used in this procedure.

【０６３５】 インビボでの筋肉における脈管形成ポリペプチドをコードする注入ポリヌクレ
オチドの用量応答効果を、以下のようにして決定する。脈管形成ポリペプチドを
コードするｍＲＮＡの生成のための適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ
方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり
得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのい
ずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。The dose response effect of infused polynucleotides encoding angiogenic polypeptides in muscle in vivo is determined as follows. Appropriate template DNA for the production of mRNA encoding an angiogenic polypeptide may be prepared using standard recombinant DNA.
Prepare according to methodology. Template DNA, which can be either circular or linear, is either used as naked DNA or complexed with liposomes. The mouse quadriceps is then injected with varying amounts of template DNA.

【０６３６】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。脈管形成ポリペプチドをコードす
る鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針
を通して１分間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝
に、約０．２ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位
の上で行い、そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。To 5-6 week old female and male Balb / C mice, 0.3 ml of 2.5%
Anesthetize by intraperitoneal injection of Avertin. A 1.5 cm incision is made in the anterior thigh and the quadriceps are visualized directly. Template DNA encoding angiogenic polypeptides was placed in 0.1 ml of carrier in a 1 cc syringe through a 27-gauge needle for 1 minute, about 0.5 cm from the distal insertion site of the muscle, at approximately 0 knees. Implant at a depth of 0.2 cm. Sutures are made over the injection site for future localization and the skin is closed with stainless steel clips.

【０６３７】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、タ
ンパク質発現について組織化学的に染色する。タンパク質発現についてのタイム
コースは、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な
様式で行い得る。注入後の筋肉中の脈管形成ポリペプチドをコードするＤＮＡの
持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよ
びＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウス
における上記実験の結果は、脈管形成ポリペプチドをコードする裸のＤＮＡを用
いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを
推定するために使用し得る。After a suitable incubation time (eg 7 days), muscle extracts are prepared by cutting out whole quads. Every 5th 15 μm section of an individual quadriceps is histochemically stained for protein expression. The time course for protein expression can be done in a similar fashion, except that four animals from different mice are harvested at different times. Persistence of DNA encoding angiogenic polypeptides in muscle after injection can be determined by Southern blot analysis after preparation of total cellular DNA and HIRT supernatants from injected and control mice. The results of the above experiments in mice can be used to estimate appropriate dosages and other treatment parameters in humans and other animals using naked DNA encoding angiogenic polypeptides.

【０６３８】 （実施例２１：脈管形成タンパク質トランスジェニック動物） 脈管形成ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃ
ｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、
サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、ト
ランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において
、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子
治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のため
に用いられる。当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明
のポリヌクレオチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始
系統（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイ
クロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；
Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１
９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９）
）；生殖系列（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または
胚へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または
胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレ
オチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１
９９３）を参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への
核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに***媒介遺伝
子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９）
）；などを含むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本
明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−
２２９（１９８９）を参照のこと。Example 21: Angiogenic Protein Transgenic Animals Angiogenic polypeptides can also be expressed in transgenic animals. Mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, mini pig (mic
ro-pig), goats, sheep, cows and non-human primates (eg, baboons,
Animals of any species, including but not limited to monkeys and chimpanzees), can be used to produce transgenic animals. In certain embodiments, techniques described herein or otherwise known in the art are used for expression of a polypeptide of the invention in humans as part of a gene therapy protocol. Any technique known in the art can be used to introduce a transgene (ie, a polynucleotide of the invention) into an animal to produce a founder line of transgenic animals. Such techniques are described in Pronuclear Microinjection (Patterson et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 40: 691-698 (1994); Carver et al.,
Biotechnology (NY) 11: 1263-1270 (1993);
Wright et al., Biotechnology (NY) 9: 830-834 (1).
991); and Hoppe et al., U.S. Pat. No. 4,873,191 (1989).
); Germline (Van der Putten et al., Proc. Natl. Aca).
d. Sci. USA 82: 6148-6152 (1985)), retrovirus-mediated gene transfer into blastocysts or embryos; gene targeting in embryonic stem cells (Th.
Ompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)); electroporation of cells or embryos (Lo, 1983, Mol Cell. Biol.
3: 1803-1814 (1983)); introduction of the polynucleotide of the present invention using a gene gun (for example, Ulmer et al., Science 259: 1745 (1).
993)); introduction of the nucleic acid construct into embryonic pluripotent stem cells and retransfer of these stem cells into blastocysts; and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57: 717-723). (1989)
); And the like, but are not limited thereto. For a review of such techniques, see Gordon, "Transge," which is incorporated herein by reference in its entirety.
nic Animals ", Intl. Rev. Cytol. 115: 171-
229 (1989).

【０６３９】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。本発明は
、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、ならびにいく
つかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する動物（すな
わち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つの導入遺伝
子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−尾タンデム
型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子はまた、例え
ば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に
選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に
必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者
に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に
組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。Any technique known in the art can be used to generate transgenic clones containing a polynucleotide of the present invention (eg, cultured, quiescently induced embryonic cells, fetal cells or adult cells). Nuclear Transfer of Cell-Derived Enucleated Oocytes to the Nucleus (Campell et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wil
mut et al., Nature 385: 810-813 (1997))). The present invention provides transgenic animals that carry the transgene in all their cells, as well as animals that carry the transgene in some (but not all) of the cells (ie, mosaic animals or chimeras). The transgene can be integrated as one transgene or as multiple copies such as concatemers (eg, head-to-head tandem or head-to-tail tandem). This transgene is also described, for example, in the teaching of Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sc.
i. USA 89: 6232-6236 (1992)) and can be selectively introduced into and activated by specific cell types. The regulatory sequences required for such cell type-specific activation depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those of skill in the art. Targeting of the gene is preferred when it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene.

【０６４０】 手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換え
を介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型にお
いてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要と
される調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明ら
かである。この節に引用される文書の各々の内容は、本明細書中でその全体が参
考として援用される。Briefly, if such a technique is utilized, a vector containing several nucleotide sequences homologous to the endogenous gene may be transferred to the endogenous gene via homologous recombination with the chromosomal sequence. Is designed to destroy the function of the nucleotide sequence. Transgenes can also be selectively introduced into specific cell types, and thus, for example, Gu et al. (Gu et al., Science.
265: 103-106 (1994)), the endogenous gene is inactivated only in the introduced cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those of skill in the art. The contents of each of the documents cited in this section are hereby incorporated by reference in their entireties.

【０６４１】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。Once a transgenic animal is produced, expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques to confirm that transgene integration has occurred by analysis of animal tissue. The level of transgene mRNA expression in the tissues of transgenic animals was also determined by Northern blot analysis, in situ hybridization analysis and reverse transcriptase P of tissue samples obtained from the animals.
It can be assessed using techniques including, but not limited to CR (rt-PCR). Samples of transgenic gene expressing tissues can also be evaluated immunocytochemically or immunohistochemically using antibodies specific for the transgene product.

【０６４２】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。Once founder animals are generated, they can be crossed, inbred, outbred or crossed to generate colonies of particular animals. Examples of such mating strategies include, but are not limited to: Founder outcrosses with more than one integration site to establish another lineage; additive expression of each transgene. By effect, inbreeding of separate strains to produce composite transgenics expressing higher levels of the transgene; a given routine for both enhancing expression and eliminating the need for screening animals by DNA analysis. Hybridization of heterozygous transgenic animals that produce animals homozygous for the site of integration; crossing of separate homozygous strains to generate complex heterozygous or homozygous lines; and to the desired experimental model Mating to place the transgene on a suitable different background.

【０６４３】 本発明のトランスジェニック動物は、脈管形成ポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常な脈管形成ポリペプチドの発現に関連する状態および／または障害の
研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物につい
てのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を
有する。The transgenic animals of the present invention are characterized by detailed biological functions of angiogenic polypeptides, studies of conditions and / or disorders associated with aberrant angiogenic polypeptide expression, and such conditions. And / or have applications including, but not limited to, animal model systems useful in screening for compounds that are effective in ameliorating the disorder.

【０６４４】 （実施例２２：脈管形成タンパク質のノックアウト動物） 内因性脈管形成タンパク質遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用
して脈管形成タンパク質および／またはそのプロモーターをコードする遺伝子を
不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍ
ｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；Ｔｈｏ
ｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこ
と；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば
、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいず
れか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレ
オチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／または
ネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用し、インビボで本発明のポ
リペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、
当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノックア
ウトを生じるために使用する。標的化された相同性組換えを介した、このＤＮＡ
構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプロー
チは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化された遺伝子を有する動物の子
孫を作製するために使用され得る研究および農業分野に特に適する（例えば、Ｔ
ｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８
９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、当業者に明白な、適切な
ウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位
に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適
合され得る。Example 22: Angiogenic Protein Knockout Animals Endogenous angiogenic protein gene expression also encodes angiogenic proteins and / or their promoters using targeted homologous recombination. Can be reduced by inactivating or "knocking out" a gene (eg, Sm
ities et al., Nature 317: 230-234 (1985); Tho
mas and Capecchi, Cell 51: 503-512 (1987).
See Thompson et al., Cell 5: 313-321 (1989); each of which is hereby incorporated by reference in its entirety). For example, a variant, non-functional polynucleotide (or completely unrelated DNA) of the invention flanked by DNA homologous to an endogenous polynucleotide sequence (either the coding or regulatory region of this gene). Sequence) can be used with or without a selectable marker and / or a negative selectable marker to transfect cells expressing a polypeptide of the invention in vivo. In another embodiment,
Techniques known in the art are used to generate knockouts in cells that contain the gene of interest but do not express it. This DNA via targeted homologous recombination
Insertion of the construct results in inactivation of the targeted gene. Such an approach is particularly suited to the research and agricultural fields where modifications to embryonic stem cells may be used to produce animal progeny carrying inactivated targeted genes (eg, T
home and Capecchi 1987 and Thompson 198.
9, see above). However, this approach is suitable for use in humans when recombinant DNA constructs are directly administered or targeted to the required site in vivo using appropriate viral vectors, which will be apparent to those skilled in the art. Can be routinely adapted.

【０６４５】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドと関連する内因性の調節配列を破壊するために、組換
えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドの
コード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロ
モーター／エンハンサーの制御下に配置し、脈管形成ポリペプチドの発現および
好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分
泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身
的に導入し得る。In a further embodiment of the invention, a cell genetically engineered to express a polypeptide of the invention, or a cell genetically engineered not to express a polypeptide of the invention (eg, a knockout), Administer to patients in vivo. Such cells can be obtained from patients (ie, animals, including humans) or MHC compatible donors, and can be fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelial cells, etc. Can be included, but is not limited to. The cells can be transformed, for example, by transduction (using a viral vector and preferably a vector that integrates the transgene into the cell genome) or transfection procedures (plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc. Use, including but not limited to the use of an endogenous regulatory sequence associated with the coding sequence and / or the polypeptide of the invention to introduce the coding sequence of the polypeptide of the invention into a cell. To disrupt, genetic engineering is done in vitro using recombinant DNA technology. The coding sequence of the polypeptide of the invention may be placed under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and preferably secretion of the angiogenic polypeptide. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the invention can be introduced systemically into the patient, eg, in circulation or intraperitoneally.

【０６４６】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。Alternatively, the cells can be incorporated into a matrix and transplanted into the body (
For example, genetically engineered fibroblasts can be transplanted as part of a skin graft); genetically engineered endothelial cells can be transplanted as part of a lymphoid or vascular graft (eg Anderson et al., US Patent) No. 5,399,349 and Mu
See Lligan and Wilson, US Pat. No. 5,460,959. Each of these is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０６４７】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。If the cells to be administered are non-self or non-MHC compatible cells, they may be administered using well known techniques that interfere with the development of a host immune response against this transduced cell. For example, the cells can be introduced in a capsular form, which does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system, while permitting exchange of components with the immediate extracellular environment.

【０６４８】 本発明の脈管形成タンパク質ノックアウト動物は、脈管形成ポリペプチドの生
物学的機能の詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、なら
びにこのような状態および／または障害を寛解させる場合に有効な化合物のスク
リーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定されない用途を
有する。The angiogenic protein knockout animals of the present invention are characterized by a detailed description of the biological function of angiogenic polypeptides, studies of conditions and / or disorders associated with aberrant expression, and such conditions and / or It has applications including, but not limited to, animal model systems useful in screening compounds that are effective in ameliorating the disorder.

【０６４９】 （実施例２３：脈管形成ポリペプチドの生物学的効果） （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ）ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃ
ｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの
増殖培地で維持する。真皮性微小血管内皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得る。増殖アッセイについては、ヒト
肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地
中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養し得る。次いでこの細胞を０．１％
ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベートする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培
地を置換した後、細胞を試験タンパク質と３日間インキュベートする。Ａｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔ
ｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるように各ウェルに添加する。この細胞を４
時間インキュベートする。細胞生存度をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読
取りにより測定する。ＰＧＥ2アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６
ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳ
Ａ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれを伴わ
ずに、ＦＧＦ−２または脈管形成ポリペプチドと２４時間インキュベートする。
上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ
）によりＰＧＥ2についてアッセイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺
線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養
する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩＬ−１αとともに
、またはそれを伴わずに、ＦＧＦ−２または脈管形成ポリペプチドと２４時間イ
ンキュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。Example 23 Biological Effects of Angiogenic Polypeptides Fibroblast and Endothelial Cell Assays Human lung fibroblasts were cloned.
(San Diego, CA) and maintained in growth medium from Clonetics. Dermal microvascular endothelial cells were applied to Cell Applicati
ons (San Diego, CA). For proliferation assays, human lung fibroblasts and dermal microvascular endothelial cells can be cultured at 5,000 cells / well in 96 well plate growth medium for 1 day. This cell is then 0.1%
Incubate in BSA basal medium for 1 day. After replacing the medium with fresh 0.1% BSA medium, the cells are incubated with the test protein for 3 days. Alam
ar Blue (Alamar Biosciences, Sacrament
o, CA) to each well to a final concentration of 10%. 4 this cell
Incubate for hours. Cell viability is measured by reading on a CytoFluor fluorescence reader. For the PGE 2 assay, human lung fibroblasts were added to 96
Culture in well plates for 1 day at 5,000 cells / well. 0.1% BS
After converting the medium to A basal medium, cells are incubated with FGF-2 or angiogenic polypeptide with or without IL-1α for 24 hours.
Supernatants were collected and EIA kit (Cayman, Ann Arbor, MI.
) For PGE 2 . For the IL-6 assay, human lung fibroblasts are cultured in 96-well plates for 1 day at 5,000 cells / well. After converting the medium to 0.1% BSA basal medium, cells are incubated with FGF-2 or angiogenic polypeptides with or without IL-1α for 24 hours. Supernatant was collected and ELISA kit (Endogen,
(Cambridge, MA) for IL-6.

【０６５０】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または脈管形成ポリペプチドとともに基礎培地
中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、脈管形成ポリペプチドでの刺激に匹
敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。Human lung fibroblasts were cultured with FGF-2 or angiogenic polypeptides in basal medium for 3 days, then Alam to assess the effect on fibroblast proliferation.
Add ar Blue. FGF-2 should show a stimulation of 10 to 2500 ng / ml which could be used comparable to stimulation with angiogenic polypeptides.

【０６５１】 （実施例２４：血管内皮細胞の増殖への脈管形成ポリペプチドの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。脈管形成ポリペプチドおよび陽性コントロール（例えば、ＶＥＧＦ
および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４日目および６日
目に、培地を置換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞
数を決定する。Example 24 Effect of Angiogenic Polypeptides on Proliferation of Vascular Endothelial Cells On day 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were supplemented with 4% fetal bovine serum (FBS).
), 16 units / ml heparin, and 50 units / ml endothelial cell growth supplement (ECGS, Biotechnique, Inc.).
Seed in medium at a density of 2-5 × 10 4 cells per 35 mm dish. On day 2, this medium was added to M199 containing 10% FBS, 8 units / ml heparin.
Replace with. Angiogenic polypeptides and positive controls (eg VEGF
And basic FGF (bFGF)) is added at various concentrations. On days 4 and 6, the medium is replaced. On day 8, cell numbers are determined using a Coulter Counter.

【０６５２】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、脈管形成ポリペプチドが血管内皮細胞を増殖し得
ることを示す。An increase in HUVEC cell number indicates that angiogenic polypeptides can proliferate vascular endothelial cells.

【０６５３】 本実施例において記載される研究は、脈管形成ポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活
性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／また
はアンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The studies described in this example tested activity of angiogenic polypeptides. However, one of skill in the art would readily modify the exemplified studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６５４】 （実施例２５：血管内皮細胞の増殖への脈管形成ポリペプチドの刺激効果） 増殖因子の***促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ１６５または０．５％ＦＢＳ中の
脈管形成ポリペプチド）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭ
Ｓ混合物（１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間イ
ンキュベートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸収を測
定する。コントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸収
を差し引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施する
。Ｌｅａｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１
２〜５１８（１９９４）を参照のこと。Example 25: Stimulatory Effect of Angiogenic Polypeptides on Proliferation of Vascular Endothelial Cells A colorimetric assay using the electron-coupled reagent PMS (phenazine methosulfate) for evaluation of mitogenic activity of growth factors. An analytical MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) 2H-tetrazolium) assay was performed (CellTiter).
96 AQ, Promega). Cells are seeded in 96-well plates (5,000 cells / well) in 0.1 mL serum-supplemented medium and allowed to attach overnight. 0
． After 12 hours serum starvation in 5% FBS, conditions (bFGF, VEGF165 or angiogenic polypeptides in 0.5% FBS) with or without Heparin (8 U / ml) were added to the wells for 48 hours. To do. 20mg MTS / PM
S mixture (1: 0.05) is added per well and allowed to incubate at 37 ° C. for 1 hour, after which the absorbance at 490 nm is measured in an ELISA plate reader. Background absorption of control wells (medium, no cells) is subtracted, and 7 wells are run in parallel for each condition. Leak et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A: 51
2-518 (1994).

【０６５５】 本実施例において記載される研究は、脈管形成ポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活
性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／また
はアンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The studies described in this example tested activity of angiogenic polypeptides. However, one of skill in the art would readily modify the exemplified studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６５６】 （実施例２６：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。Example 26: Inhibition of PDGF-induced vascular smooth muscle cell proliferation stimulating effect HAoSMC proliferation can be measured, for example, by BrdUrd incorporation. Briefly, subconfluent quiescent cells grown on 4-chamber slides were
Transfect with RP or FITC labeled AT2-3LP. The cells are then pulsed with 10% bovine serum and 6 mg / ml BrdUrd. 24
After hours, immunocytochemistry is performed by using the BrdUrd staining kit (Zymed Laboratories). Briefly, the cells are incubated with biotinylated mouse anti-BrdUrd antibody for 2 hours at 4 ° C. after exposure to denaturing solution, followed by streptavidin-peroxidase and diaminobenzidine.

【０６５７】 ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微鏡試験のために標本にし、そ
してＢｒｄ Ｕｒｄ−陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ係数は、総細胞数に対
するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算される。さらに、個々の細胞につ
いて、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用により、ＢｒｄＵｒｄ染色（
核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を実行する。Ｈａｙａｓｈｉ
ｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３６）：２１９８５〜２１９９
２（１９９６）を参照のこと。After counterstaining with hematoxylin, the cells are mounted for microscopic examination and Brd Urd-positive cells are counted. The BrdUrd coefficient is calculated as the ratio of BrdUrd-positive cells to the total cell number. Furthermore, BrdUrd staining (for individual cells by simultaneous use of bright and dark UV fluorescence illumination (
Simultaneous detection of nuclear) and FITC uptake (cytoplasm) is performed. Hayashi
da et al. Biol. Chem. 6: 271 (36): 21985-2199.
2 (1996).

【０６５８】 本実施例において記載した研究は、脈管形成ポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活性
（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／または
アンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The studies described in this example tested the activity of angiogenic polypeptides.
However, one of skill in the art would readily modify the exemplified studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６５９】 （実施例２７：内皮遊走の刺激） 本実施例は、脈管形成ポリペプチドがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可
能性を探索するために用いられ得る。Example 27: Stimulation of Endothelial Migration This example can be used to explore the potential of angiogenic polypeptides to stimulate lymphoid endothelial cell migration.

【０６６０】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：
２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタ
ー（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、
そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希
釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期
継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離
を達成するのに必要な最小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チャ
ンバとの間のフィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９
９中に懸濁した２．５×１０5細胞を上部コンパートメントに播種する。次いで
この装置を、５％ＣＯ2を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキ
ュベートして細胞を遊走させた。インキュベーション期間後、このフィルターを
取り出し、そして非遊走細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン
（ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そ
してＧｉｅｍｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，Ｍｃ
Ｇｒａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無作
為の高出力視野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべて
の群を４連で実行する。The Endothelial Cell Migration Assay is Performed Using a 48-Well Microchemotactic Chamber (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD; Falk).
W., J. et al. Immunological Methods 1980; 33:
239-247). Polycarbonate filter without polyvinylpyrrolidone, which has a pore size of 8 μm (Nucleopore Corp. Cam.
(Bridge, MA) coated with 0.1% gelatin for at least 6 hours at room temperature,
Then it is dried under sterile air. Test substances are diluted to the appropriate concentration in M199 supplemented with 0.25% bovine serum albumin (BSA) and 25 μl of the final dilution is placed in the bottom chamber of the modified Boyden device. Subconfluent, early passage (2-6) HUVEC or BMEC cultures are washed and trypsinized for the minimum time required to achieve cell detachment. After placing the filter between the bottom and top chamber 50 μl M19 containing 1% FBS
2.5 × 10 5 cells suspended in 9 are seeded in the upper compartment. The device was then incubated for 5 hours at 37 ° C. in a chamber moistened with 5% CO 2 to allow the cells to migrate. After the incubation period, the filter is removed and the top side of the filter with non-migrated cells is scraped with a rubber policeman. The filter is fixed with methanol and stained with Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter, Mc.
(Grow Park, IL). Migration is quantified by counting 3 random high power fields (40x) of cells in each well. Then run all groups in quadruplicate.

【０６６１】 本実施例において記載した研究は、脈管形成ポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、脈管形成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活性
（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／または
アンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The studies described in this example tested activity of angiogenic polypeptides.
However, one of skill in the art would readily modify the exemplified studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６６２】 （実施例２８：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮による一酸化窒素の放出は、血管内皮弛緩の介在物質であると考えら
れてる。従って、脈管形成ポリペプチドの活性は、脈管形成ポリペプチドに応答
する内皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。Example 28: Stimulation of nitric oxide production by endothelial cells The release of nitric oxide by vascular endothelium is believed to be a mediator of vascular endothelial relaxation. Therefore, the activity of angiogenic polypeptides can be assayed by measuring nitric oxide production by endothelial cells in response to angiogenic polypeptides.

【０６６３】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）および脈管形成ポリペプチドへの４時間の曝露の後のコ
ンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の
一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により定量して、硝酸還元酵素による一
酸化硝酸由来の硝酸の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出の際の
脈管形成ポリペプチドの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。Nitric oxide was starved for 24 hours, followed by varying levels of positive control (
For example, in a 96-well plate of confluent microvascular endothelial cells after 4 hours of exposure to VEGF-1) and angiogenic polypeptides. Nitric oxide in the medium is quantified by using the Griess reagent to measure the total amount of nitrite after reduction of nitric acid derived from nitric oxide by nitrate reductase. The effect of angiogenic polypeptides on nitric oxide release is tested in HUVEC.

【０６６４】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋Ｋ2ＳＯ4 検定標準（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）曲線を、ＫＩおよび
Ｈ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（０、５、１０、２５、５
０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって得る
。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセンティックなＮＯ気体から
のＮＯを測定することにより、事前に決定する（１０５０）。この培養培地を取
り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水で２回
洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍｌの濾過したＫｒｅｂｓ
−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレートを、３７℃に温度を
維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブをウェルに垂直に挿入して
、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の２ｍｍ下で保持する。Ｓ
−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性コントロールとして用い
る。放出したＮＯの量を、１×１０6内皮細胞あたりのピコモル濃度として表す
。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）における４〜６の測定値の
平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。Briefly, NO release from cultured HUVEC monolayers was measured using a NO meter (Iso
-NO, World Precision Instruments Inc.
) (1049) connected to a NO-specific polarographic electrode.
Calibration of the NO element is performed according to the following formula: 2KNO 2 + 2KI + 2H 2 SO 4 62NO + I 2 + 2H 2 O + K 2 SO 4 A standard calibration curve is graded in a calibration solution containing KI and H 2 SO 4. Concentration of KNO 2 (0, 5, 10, 25, 5
0, 100, 250, and 500 nmol / L). The specificity of the Iso-NO electrode for NO is pre-determined by measuring NO from authentic NO gas (1050). The culture medium is removed and the HUVECs are washed twice with Dulbecco phosphate buffered saline. The cells were then treated with 5 ml of filtered Krebs in a 6-well plate.
-Dip in the Henseleit solution, and place the cell plate in a slide warmer (Lab Line Instrumen) to maintain the temperature at 37 ° C.
ts Inc. ) Hold. The NO sensor probe is inserted vertically into the well, keeping the tip of the electrode 2 mm below the surface of the solution before adding different conditions. S
-Nitrosoacetylpenicillamine (SNAP) is used as a positive control. The amount of NO released is expressed as picomolar concentration per 1 × 10 6 endothelial cells. All reported values are the average of 4-6 measurements in each group (number of cell culture wells). Leak et al., Biochem. and Biophys. Res.
Comm. 217: 96-105 (1995).

【０６６５】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質の活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのア
ゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。 （実施例２９：新脈管形成における索形成に対する脈管形成ポリペプチドの効果
） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。The studies described in this example tested activity of angiogenic proteins.
However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists, and / or antagonists of angiogenic polypeptides. obtain. Example 29: Effect of angiogenic polypeptides on cord formation in angiogenesis Another process in angiogenesis is cord (c) characterized by endothelial cell differentiation.
ord) formation. This bioassay measures the ability of microvascular endothelial cells to form capillary-like structures (hollow structures) when cultured in vitro.

【０６６６】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５継
代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プ
レートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ
Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃にて３
０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコートしたウェ
ルに播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液または脈管形成ポリペプチド（
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの
細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌ
ｅｒ ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッ
セイを三連で行った。CADMEC (microvascular endothelial cells) were used as proliferating cells (passage 2) in Cell.
Applications Inc. Buy from Cell Applicat
Cultures in Ions' CADMEC Growth Medium and used at passage 5. For in vitro angiogenesis assay, wells of a 48-well cell culture plate were placed in Cell Applications'Attachment.
Use a Factor Medium (200 ml / well) at 37 ° C for 3
Coat for 0 minutes. CADMECs are seeded in wells coated with 7,500 cells / well and cultured overnight in Growth Medium. Then this Gr
owth Medium with control buffer or angiogenic polypeptide (
300 mg Cell Applicati containing 0.1-100 ng / ml)
Replace with ons' Chord Formation Medium, and culture the cells for an additional 48 hours. The number and length of the capillary-like chords are calculated by Boeckel.
Quantification through the use of an ER VIA-170 video image analyzer. All assays were done in triplicate.

【０６６７】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。本
実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質の活性を試験した。しか
し、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、この脈管形成ポリペプチ
ドのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。Commercially available (R & D) VEGF (50 ng / ml) is used as a positive control. b-estradiol (1 ng / ml) is used as a negative control. Appropriate buffer (no protein) is also used as a control. The studies described in this example tested activity of angiogenic proteins. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to determine the activity of a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide (eg, gene therapy), the activity of an agonist and / or antagonist of the angiogenic polypeptide. Can be tested.

【０６６８】 （実施例３０：ニワトリ絨毛尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した
系である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。脈
管形成ポリペプチドのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）および日
本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｕｔｕｒｎｉｘ）の受精卵を、
３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化
したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。発生の４日目
に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について調べ、そしてこ
の卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１３日目までイン
キュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉ
ｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無塩成長因子を蒸
留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペットで移す。風乾
後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３％グルタルアル
デヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２Ｍカコジル酸ナ
トリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８］を用いて写真
撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために包埋する。コン
トロールを、キャリアディスクのみを用いて行う。Example 30: Angiogenic effect on chicken chorioallantoic membrane Chori chorioallantoic membrane (CAM) is a well established system for testing angiogenesis. Angiogenesis in the CAM can be easily visualized and quantified. The ability of angiogenic polypeptides to stimulate angiogenesis in the CAM can be tested.
Fertilized eggs of White Leghorn chicken (Gallus gallus) and Japanese quail (Coturnix couturnix),
Incubate at 37.8 ° C and 80% humidity. 16 day old chicken differentiated CAM and 13 day old quail embryos are studied in the following manner. On the fourth day of development, windows are made in the eggshell of chicken eggs. The embryos are examined for normal development and the eggs are sealed with Cellotape®. These are further incubated until day 13. Thermanox cover glass (Nunc, Napervi
Ile, IL) is cut into discs with a diameter of about 5 mm. Sterile and salt-free growth factor is dissolved in distilled water, and about 3.3 mg / 5 ml is pipetted onto the disc. After air drying, the inverted disc is applied to the CAM. After 3 days, the specimens are fixed in 3% glutaraldehyde and 2% formaldehyde and rinsed with 0.12M sodium cacodylate buffer. These are photographed using a stereomicroscope [Wild M8] and embedded for semi-thin and ultra-thin sectioning as described above. Controls are performed with the carrier disc only.

【０６６９】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to determine the activity of a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide (eg, gene therapy), the activity of an agonist and / or antagonist of an angiogenic polypeptide. You can test.

【０６７０】 （実施例３１：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） 脈管形成ポリペプチドのインビトロ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様
構造の、マウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセ
ル中に新しい脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍ
ａｔｒｉｇｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混
合物は凝固する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り
除き、そして新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。Example 31: Angiogenesis Assay Using Matrigel Implants in Mice An in vitro angiogenesis assay of angiogenic polypeptides was performed using a preexisting capillary network-like, mouse extracellular matrix material (Matrigel). ) To determine the ability to form new vessels in the implanted capsules. Liquid M at 4 ℃
It is mixed with atrigel and then the mixture is injected subcutaneously into mice, where the mixture solidifies. After 7 days, Matrigel's solid "plugs" are removed and tested for the presence of new blood vessels. Matrigel, Bec
ton Dickinson Labware / Collaborative
Purchase from Biomedical Products.

【０６７１】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌで脈管形成ポリペプチドと混合し、冷３ｍｌシ
リンジ中に引き抜く。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、腹部の中腹側面
の２つの部位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０
．５ｍｌ／部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌプラグを取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維
組織を取り除く）。同じ全プラグを中性緩衝化１０％ホルムアミド中に固定し、
パラフィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後
、組織学的試験のために切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異な
る領域由来の断面をプロセスする。選択した切片をｖＷＦの存在について染色す
る。このアッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎ
ｇ／ｍｌ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基礎レベルを
決定する。Matrigel material is a liquid when thawed at 4 ° C. This Matrix
1 is mixed with angiogenic polypeptide at 150 ng / ml at 4 ° C. and drawn into a cold 3 ml syringe. Female C57B1 / 6 mice, approximately 8 weeks old, are injected with a mixture of Matrigel and experimental protein at two sites on the midventral aspect of the abdomen (0
． 5 ml / site). After 7 days, the mice were sacrificed by cervical dislocation and Matrig
Remove the el plug and wash (ie, remove all attached membrane and fibrous tissue). Fix the same whole plug in neutral buffered 10% formamide,
After embedding in paraffin and staining with Masson's Trichrome, it is used to prepare sections for histological examination. Process cross sections from three different regions of each plug. Selected sections are stained for the presence of vWF. The positive control for this assay was bovine basic FGF (150n
g / ml). Matrigel alone is used to determine the basal level of angiogenesis.

【０６７２】 本実施例において記載される研究は脈管形成タンパク質活性を試験した。しか
し、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドの
アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to determine the activity of a polynucleotide encoding an angiogenic polypeptide (eg, gene therapy), the activity of an agonist and / or antagonist of an angiogenic polypeptide. You can test.

【０６７３】 （実施例３２：ウサギ下肢モデルにおける虚血のレスキュー） 脈管形成ポリペプチドの虚血に対するインビボでの効果を研究するため、ウサ
ギ後肢虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓら、Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿
動脈の外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および
外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生
じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １
４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後の
回復および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０日）後１０日目に、
ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、脈管形成ポリペプチ
ドを含む５００ｍｇの裸の発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒら、
Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒ
ｃ，Ｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））
に記載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移
入技術により、トランスフェクトする。脈管形成ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを処置に用いる場合、５００ｍｇの脈管形成ポリペプチドまたはコントロール
の単回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動
脈中に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定す
る：（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）
血流および逆流−停止ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全な
拡張性状態の間の血流（これはまた、血管量の間接的測定）、そして逆流は、最
大ＦＬ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ
ｉｃ Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。スコアを、オ
ーバーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ ｇｒｉｄ）内の円の百分率（ウサ
ギ大腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛
細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−側副毛細血管の数は、後肢から得た光学顕微
鏡用切片において決定した。Example 32: Rescue of ischemia in a rabbit lower extremity model To study the in vivo effect of angiogenic polypeptides on ischemia, a rabbit hindlimb ischemia model was previously described (Takeshita, S et al Am J
． Pathol 147: 1649-1660 (1995)) by surgical removal of one femoral artery. Resection of the femoral artery results in retrograde propagation of thrombus and occlusion of the external iliac artery. As a result, blood flow to the ischemic limb is dependent on collateral vessels originating from the internal iliac artery (Takeshita et al. Am J. Pathol 1
47: 1649-1660 (1995)). 10 day intervals allow post-surgical recovery of rabbits and development of endogenous collateral vessels. On the 10th day after surgery (day 0),
After performing a baseline angiography, the internal iliac artery of the ischemic limb was treated with 500 mg naked expression plasmid containing the angiogenic polypeptide (Riessen, R et al.
Hum Gene Ther. 4: 749-758 (1993); Lecler.
c, R et al. Clin. Invest. 90: 936-944 (1992)).
Transfect by arterial gene transfer technique using a hydrogel coated balloon catheter as described in. DN encoding an angiogenic polypeptide
When A is used for treatment, a single bolus of 500 mg of angiogenic polypeptide or control is delivered through the infusion catheter for 1 minute into the internal iliac artery of the ischemic limb. On day 30, various parameters are measured in these rabbits: (a) BP ratio-ischemic limb systolic blood pressure to normal limb systolic blood pressure ratio; (b).
Blood Flow and Reflux-Stop FL: Blood Flow During Non-Expanding State, and Maximum FL: Blood Flow During Full Diastolic State (which is also an Indirect Measurement of Vascular Volume), and Reflux is Maximum It is reflected in the ratio of FL: stop FL; (c) angiographic value (angiograph)
ic Score) -This is measured by angiography of the collateral vessels. Scores are determined by the percentage of circles in the overlaying grid (using transverse opacified arteries divided by the total number m of rabbit thighs); (d) capillary density-number of collateral capillaries. , Determined in light microscopy sections obtained from the hind limbs.

【０６７４】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６７５】 （実施例３３：本発明のポリペプチドの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然発症高血圧ラット（Ｓ
ＨＲ）における、脈管形成ポリペプチドの血圧に影響する能力を、試験する。漸
増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）の脈管形
成ポリペプチドを、１３〜１４週齢の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に投与す
る。データを、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用いて
行い、そして統計的な有意性を、ｐ＜０．０５ 対 緩衝液単独への応答として
定義する。(Example 33: Effect of the polypeptide of the present invention on vasodilation) Since dilation of vascular endothelium is important for lowering blood pressure, spontaneous hypertensive rats (S
The ability of angiogenic polypeptides in HR) to influence blood pressure is tested. Increasing doses (0, 10, 30, 100, 300, and 900 mg / kg) of angiogenic polypeptides are administered to 13-14 week old spontaneously hypertensive rats (SHR). Data are expressed as mean +/- SEM. Statistical analysis is performed using a two-tailed t-test and statistical significance is defined as p <0.05 vs. response to buffer alone.

【０６７６】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６７７】 （実施例３４：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
の脈管形成タンパク質の発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて
研究する。Example 34: Rat ischemic skin flap model Evaluation parameters include skin blood flow, skin temperature, and factor VIII immunohistochemistry or endothelial alkaline phosphatase reaction. Expression of angiogenic proteins during cutaneous ischemia is studied using in situ hybridization.

【０６７８】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚 ｂ）虚血皮膚創傷 ｃ）通常の創傷。[0678]   The work in this model is divided into three parts:   a) Ischemic skin   b) Ischemic skin wound   c) Normal wound.

【０６７９】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる。The experimental protocol includes: a) 3 × 4 cm single stalk full thickness single pedicles.
A full-thickness random skin flap (a muscle flap over the lower back of the animal) is generated.

【０６８０】 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ） ｃ）次の種々の投薬範囲の脈管形成ポリペプチドによる、切除創傷（創傷後の
０、１、２、３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。B) Make an excisional wound on ischemic skin (skin flap) (diameter 4-6 mm) c) Excisional wound (0, 1, 2 after wounding) with different dose ranges of angiogenic polypeptides. Local treatment on days 3, 4): 1 mg-100 mg d) for histological, immunohistochemical, and in situ studies,
Wound tissue is collected 3, 5, 7, 10, 14, and 21 days after wounding.

【０６８１】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６８２】 （実施例３５：末梢動脈疾患モデル） 脈管形成ポリペプチドを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の
周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以
下を含む： ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方
の片側の後肢は、コントロールの役割をする。Example 35: Peripheral Arterial Disease Model Angiogenic treatment with angiogenic polypeptides is a novel therapeutic strategy to obtain restoration of blood flow around ischemia in the case of peripheral arterial disease. . The experimental protocol includes: a) One unilateral femoral artery is ligated to create the hindlimb ischemic muscle, the other unilateral hindlimb serves as a control.

【０６８３】 ｂ）脈管形成タンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間、
送達する。B) Angiogenic protein in a dosage range of 20 mg to 500 mg intravenously and / or intramuscularly three times per week (probably more) for 2-3 weeks,
To deliver.

【０６８４】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、脈管形成タンパク質の発現の分
析ならびに組織学のために、１、２、および３週間目に収集する。生検もまた、
他方の片側の対側後肢の正常な筋肉において行う。C) This ischemic muscle tissue is collected at 1, 2, and 3 weeks after ligation of the femoral artery for analysis of angiogenic protein expression and histology. The biopsy is also
On the normal muscle of the other contralateral hind limb.

【０６８５】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６８６】 （実施例３６：虚血性心筋疾患モデル） 脈管形成ポリペプチドを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の
新しい血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。脈管形成タンパ
ク質の発現の変化を、インサイチュで調査する。実験プロトコルは、以下を含む
： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。Example 36: Ischemic Myocardial Disease Model Angiogenic polypeptides are evaluated as potent mitogens that can stimulate collateral vessel development and reconstitute new blood vessels after coronary artery occlusion. . Changes in the expression of angiogenic proteins will be investigated in situ. The experimental protocol includes: a) The heart is exposed via a left thoracotomy in the rat. Immediately, the left coronary artery,
Occlusate with fine suture (6-0) and close the rib cage.

【０６８７】 ｂ）脈管形成タンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜４週間、
送達する。B) Angiogenic proteins in a dosage range of 20 mg to 500 mg intravenously and / or intramuscularly three times per week (probably more) for 2-4 weeks,
To deliver.

【０６８８】 ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定およびインサイチュウ分析のため
に取り出しそして横断切片化する。C) Thirty days after surgery, the heart is removed and cross sectioned for morphometry and in situ analysis.

【０６８９】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６９０】 （実施例３７：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、脈管形成ポリペプチドの、新生血管形成に対する効果を示
す。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍｍで
ある） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇ（ｕｇ）の脈管形成ポリペプチドを含む小丸剤を、ポケ
ット内に配置する ｅ）脈管形成ポリペプチドでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲
内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。Example 37: Rat Corneal Wound Healing Model This animal model shows the effect of angiogenic polypeptides on neovascularization. The experimental protocol includes: a) making a long incision of 1-1.5 mm from the center of the cornea into the stromal layer b) inserting a spatula under the lip of the incision facing the outer edge of the eye c ) Make a pocket (the base of which is 1-1.5 mm from the edge of the eye) d) Place pellets containing 50 ng-5 μg (ug) of angiogenic polypeptide in the pocket e ) Treatment with angiogenic polypeptides may also be applied topically to corneal wounds within a dosage range of 20 mg to 500 mg (daily treatment for 5 days).

【０６９１】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチド
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。The studies described in this example tested angiogenic protein activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), the activity of agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. You can

【０６９２】 （実施例３８：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） 脈管形成ポリペプチドが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷
治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける
全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の
十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである
。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依
存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（
１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
３６：１２３５（１９９０））。Example 38: Diabetic Mice and Glucocorticoid Impaired Wound Healing Model A. Diabetes db + / db + Mouse Model To demonstrate that angiogenic polypeptides promote the healing process, wound healing. The genetically diabetic mouse model of is used. The full thickness wound healing model in db + / db + mice is a well characterized, clinically relevant, and reproducible model of impaired wound healing. Healing of diabetic wounds depends on granulation tissue formation and re-epithelialization rather than contraction (Gartner, MH et al., J. Surg. Res. 52: 389 (
1992); Greenhalgh, D .; G. Et al., Am. J. Pathol. 1
36: 1235 (1990)).

【０６９３】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体（ｄｂ＋）上の単一の常染色体性の劣性変異を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎ
ｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１
９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７
（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：
４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３
１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖
症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐
性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７
（１９７８））。This diabetic animal has many of the characteristic properties observed in type II diabetes mellitus. Homozygous (db + / db +) mice have their normal heterozygous (
db + / + m) obese compared to littermates. Mutant diabetes (db + / db +)
Mice carry a single autosomal recessive mutation on chromosome 4 (db +) (C
oleman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:28
3-293 (1982)). Animals exhibit polyphagia, polydipsia, and polyuria. Mutant diabetic mice (db + / db +) have elevated blood glucose, elevated or normal insulin levels, and suppressed cell-mediated immunity (Ma.
ndel et al. Immunol. 120: 1375 (1978); Debra.
y-Sachs, M .; Et al., Clin. Exp. Immunol. 51 (1): 1
-7 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:
46-55 (1985)). Peripheral neuropathy, myocardial complications, and microvascular injury,
Basement membrane thickening and glomerular filtration abnormalities have been described in these animals (N
orido, F.F. Et al., Exp. Neurol. 83 (2): 221-232 (1
984); Robertson et al., Diabetes 29 (1): 60-67.
(1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40 (4):
460-473 (1979); Coleman, D .; L. Diabetes 3
1 (Supplement): 1-6 (1982)). These homozygous diabetic mice develop hyperglycemia and are resistant to insulin, similar to human type II diabetes (Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375-1377).
(1978)).

【０６９４】 これらの動物において観察した特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿
病において観察される治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ
ら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０）
）。The characteristics observed in these animals suggest that the healing in this model may be similar to that observed in human diabetes (Greenhalgh).
Et al., Am. J. of Pathol. 136: 1235-1246 (1990)
).

【０６９５】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いた（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入する
。研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を
与える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。Genetically diabetic female C57BL / KsJ (db + / db +) mice and their non-diabetic (db + / + m) heterozygous littermates were used in this study (J
acksson Laboratories). These animals are purchased at 6 weeks of age. The study will start at 8 weeks of age. Animals are housed individually and given food and water ad libitum. All operations are performed using aseptic technique. This experiment, Human Ge
nome Sciences, Inc. Institutional Ani
mal Care and Use Committee and the G
uidelines for the Care and Use of La
Follow the Animal Health rules and guidelines.

【０６９６】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間、この創傷を開放しておく
。処置の適用は、創傷させた日から５日間連続で、局所的に受ける。処置の前に
、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。The wound protocol was based on previously reported methods (Tsuboi, R. and Rif.
kin, D.M. B. J. Exp. Med. 172: 245-251 (1990)
). Briefly, on the day of wounding, animals were treated with A dissolved in deionized water.
Anesthetize with intraperitoneal injection of vertin (0.01 mg / mL), 2,2,2-tribromoethanol and 2-methyl-2-butanol. The dorsal area of the animal is shaved and the skin is washed with 70% ethanol solution and iodine. The surgical area is dried with sterile gauze before wounding. Then, an 8 mm full-thickness wound
It is prepared using a Keyes tissue punch. Immediately after wounding, the surrounding skin is gently stretched to remove the spread of the wound. The wound is left open during the experiment. The application of treatment is topically applied for 5 consecutive days from the day of wounding. Prior to treatment, the wound is gently washed with sterile saline and gauze sponge.

【０６９７】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎ測径器（ｃ
ａｌｉｐｅｒ）を用いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見え
ず、そして創傷を連続した上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。The wounds are visually inspected and photographed at a fixed distance on the day of surgery and at 2 day intervals thereafter. Wound closure is determined by daily measurements on days 1-5 and 8. Calibrated wounds Jameson calipers (c
aliper) and measure horizontally and vertically. A wound is considered healed when granulation tissue is no longer visible and the wound is covered by continuous epithelium.

【０６９８】 脈管形成ポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる投薬範囲（１日あたり
創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）の脈管形成ポリペプチドを用いて投与する。ビ
ヒクルコントロール群に、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。The angiogenic polypeptide is administered in the vehicle for 8 days with different dosing ranges (4 mg to 500 mg per wound per day) of the angiogenic polypeptide. The vehicle control group received 50 mL of vehicle solution.

【０６９９】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で、１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。Animals are euthanized on day 8 with an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (300 mg / kg). The wound and surrounding skin are then collected for histology and immunohistochemistry. Tissue specimens are placed in 10% neutral buffered formalin in a tissue cassette between biopsy sponges for further processing.

【０７００】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群： １）ビヒクルプラシーボコントロール、 ２）脈管形成ポリペプチド。Three groups of 10 animals each (5 diabetic and 5 non-diabetic controls): 1) vehicle placebo control, 2) angiogenic polypeptides.

【０７０１】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、脈管形成ポリペプチドを用いる処
置によって改変したかどうかを評価する。この評価として、細胞蓄積、炎症細胞
、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証が挙げられる
（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２
３５（１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉ
ｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。Wound closure is analyzed by measuring the area on the horizontal and vertical axes and obtaining the total area of the wound. Contraction is then assessed by establishing the difference between the area of the initial wound (day 0) and the area after treatment (day 8). This wound area on day 1 is 64 mm 2 (size corresponding to the skin punch). Calculations are performed using the following formula: [Open Area on Day 8]-[Open Area on Day 1] / [Open Area on Day 1] Specimens are fixed in 10% buffered formalin and paraffin. The embedded mass is cut perpendicular to the wound surface (5 mm) and cut using a Reichert-Jung microtome. Routine hematoxylin-eosin (H & E) staining is performed on transverse sections of bisected wounds. Histological examination of wounds is used to assess whether the healing process and morphological appearance of repaired skin have been modified by treatment with angiogenic polypeptides. This assessment includes verification of the presence of cell accumulation, inflammatory cells, capillaries, fibroblasts, re-epithelialization, and epidermal maturation (Greenhalgh, DG et al. Am. J. Pathol. 136: 12).
35 (1990)). Blind observer with graduated lens micrometer
used by the N. Observer.

【０７０２】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いてポリクローナルウ
サギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コン
トロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。ケ
ラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上皮
形成の程度を評価することによって決定する。Tissue sections are also immunohistochemically stained with a polyclonal rabbit anti-human keratin antibody using the ABC Elite detection system. Human skin is used as a positive tissue control, while non-immune IgG is used as a negative control. Keratinocyte proliferation is determined by assessing the extent of wound re-epithelialization using a calibrated lens micrometer.

【０７０３】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムで抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を用いることにより実証する
。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして働き得、そしてヒト脳組織を、陰
性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱落および非免疫マ
ウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位は、０〜８のスケ
ール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増殖を反映するよ
り高い側）の増殖の程度に基づく。Proliferating Cell Nuclear Antigen / Cyclin (PCNA) in Skin Preparations
Demonstrate by using anti-PCNA antibody (1:50) in the ite detection system. Human colon cancer can serve as a positive tissue control, and human brain tissue can be used as a negative tissue control. Each specimen contains sections with omission of primary antibody and replacement with non-immune mouse IgG. The rank of these sections is based on the extent of proliferation on a scale of 0-8 (lower scale reflecting slight proliferation to higher side reflecting vigorous proliferation).

【０７０４】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。Experimental data are analyzed using a one-tailed t-test. A p-value of <0.05 is considered significant.

【０７０５】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．、Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉ
ｄｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏ
ｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ，Ｚ．ら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチ
コイドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ、Ｒ．Ｈ．ら、
Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細
胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させること
、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈ
ｌ，Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅ
ａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉ
ｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によっ
て創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、
ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ
．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎ
ｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ
Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）
；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：２２２９−２２３３（１９８９））。B. Steroidopathic Rat Model Inhibition of wound healing by steroids has been well documented in various in vitro and in vivo systems (Wahl, SM, Glucocorticoi).
ds and Wound healing: Anti-Inflammato
ry Steroid Action: Basic and Clinical
Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S .; M. Et al, J
． Immunol. 115: 476-481 (1975); Werb, Z .; ,
J. Exp. Med. 147: 1684-1694 (1978)). Glucocorticoids inhibit angiogenesis, vascular permeability (Ebert, RH et al.,
An. Intern. Med. 37: 701-705 (1952)), fibroblast proliferation, and collagen synthesis (Beck, L.S. et al., Grows Fact.
ors. 5: 295-304 (1991); Haynes, B .; F. Et al., J. C
lin. Invest. 61: 703-797 (1978)), as well as causing a transient reduction in circulating monocytes (Haynes, BF.
Et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wah.
l, S. M. , "Glucocorticoids and wound he
"aling": Antiflammery Steroid Acti
on: Basic and Clinical Aspects, Academ
Wound healing is delayed by ic Press, New York, 280-302 (1989)). Systemic administration of steroids for impaired wound healing
This is a well-established phenomenon in rats (Beck, L.S. et al., Grow.
th Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes, B.
． F. Et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978).
Wahl, S .; M. , "Glucocorticoids and woun
d healing ": Antiflammery Steroid
Action: Basic and Clinical Aspects, Ac
academic Press, New York, 280-302 (1989).
Pierce, G .; F. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 2229-2233 (1989)).

【０７０６】 脈管形成ポリペプチドが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治
癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除
皮膚創傷に対する脈管形成ポリペプチドの複数の局所適用の効果を評価する。To demonstrate that angiogenic polypeptides can accelerate the healing process, multiple angiogenic polypeptides for full-thickness cutaneous wounds in rats, where healing is impaired by systemic administration of methylprednisolone. Evaluate the effect of topical application of.

【０７０７】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実施例に
用いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラット
の治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／
ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして適宜、
食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔ
ｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏ
ｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って
行う。Young adult male Sprague Dawley rats (weight 250-300 g)
) (Charles River Laboratories) is used in this example. The animals are purchased at 8 weeks of age. The start of the study is 9 weeks of age. The healing response in rats was determined by systemic administration of methylprednisolone (17 mg /
kg / rat, intramuscular). Keep animals individually and, if appropriate,
Give food and water. All operations are performed using aseptic technique. This research, Hum
Institutional of an Genome Sciences, Inc.
Animal Care and Use Committee and t
he Guidelines for the Care and Use o
f Follow the rules and guidelines of Laboratory Animals.

【０７０８】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する
。試験物質の適用を、創傷させ、続けてメチルメチルプレドニゾロン投与した日
から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を
滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。The wound protocol follows Section A above. On the day of wounding, the animals were given ketamine (5 m
g / kg) and xylazine (5 mg / kg) by intramuscular injection. The dorsal area of the animal is shaved and the skin is washed with 70% ethanol and iodine solution. The surgical area is dried with sterile gauze before wounding. 8 mm full thickness wounds are created using a Keyes tissue punch. The left side of the wound is opened during the experiment. The application of the test substance is given topically once a day for 7 consecutive days starting from the day of wounding and subsequent administration of methylmethylprednisolone. Prior to treatment, the wound is gently washed with sterile saline and gauze sponge.

【０７０９】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷
を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。Wounds are visually inspected and photographed at a fixed distance on the day of wounding and at the end of treatment. Wound closure is determined by daily measurements on days 1-5 and on day 8. Wounds are measured horizontally and vertically using a calibrated Jameson caliper. A wound is considered healed when granulation tissue is no longer visible and the wound is covered by continuous epithelium.

【０７１０】 脈管形成ポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、脈管形成ポリペプチドの異な
る用量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。
ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。動物を、８日目
にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で安楽死さ
せる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集する。組織標本を
、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カセット内で１０％
中性緩衝化ホルマリン中に置く。The angiogenic polypeptides are administered in the vehicle for 8 days with different dose ranges of angiogenic polypeptides (4 mg to 500 mg per wound per day).
The vehicle control group received 50 mL of vehicle solution. Animals are euthanized on day 8 with an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (300 mg / kg). The wound and surrounding skin are then collected for histology. The tissue specimens are 10% in a tissue cassette between biopsy sponges for further processing.
Place in neutral buffered formalin.

【０７１１】 各々１０匹の動物（メチルメチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コル
チコイドを用いない５匹）の４つの群を評価する： １）非処置群、 ２）ビヒクルプラシーボコントロール、 ３）脈管形成ポリペプチド処置群。Four groups of 10 animals each (5 with methylmethylprednisolone and 5 without glucocorticoid) are evaluated: 1) untreated group, 2) vehicle placebo control, 3) vascular. Forming polypeptide treatment group.

【０７１２】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。Wound closure is analyzed by measuring the area on the vertical and horizontal axes and obtaining the total area of the wound. Closure is then assessed by establishing the difference between the area of the initial wound (day 0) and the area after treatment (day 8). This wound area on day 1 is 64 mm 2 (size corresponding to the skin punch). The calculation is performed using the following formula: [Open area on day 8]-[Open area on day 1] / [Open area on day 1].

【０７１３】 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片に対して行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒
プロセスおよび形態的な外見が、脈管形成ポリペプチドによって改善したか否か
の評価を可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉ
ｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を決定する。Specimens are fixed in 10% buffered formalin and paraffin-embedded sections are cut perpendicular to the wound surface (5 mm) and cut using an Olympus microtome. Routine hematoxylin-eosin (H & E) staining is performed on bisection wound cross sections. Histological examination of wounds allows evaluation of whether the healing process and morphological appearance of repaired skin was improved by angiogenic polypeptides. Blind observer with graduated lens micrometer
used by the wounded observer to determine the gap distance of the wound.

【０７１４】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。Experimental data is analyzed using a one-tailed t-test. A p-value of <0.05 is considered significant.

【０７１５】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質における活性を試験
した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチ
ド（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／また
はアンタゴニストをコードするポリペプチドの活性を試験し得る。The studies described in this example tested activity on angiogenic proteins. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polypeptides that encode angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. obtain.

【０７１６】 （実施例３９：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立における脈管形成ポリ
ペプチドの治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを
作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積の量の定量、リンパの脈
管構造、総血漿タンパク質の量の定量、および組織病理学により測定される。急
性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢
性進行は、３〜４週間まで続く。Example 39: Lymphedema Animal Model The purpose of this experimental approach was to identify lymphangiogenesis (lymph) in the rat hind limb.
to develop a suitable and consistent model of lymphedema to test the therapeutic effects of angiogenic polypeptides in reestablishing the vascular and lymphatic circulation. Efficacy is measured by quantifying the amount of swelling volume in the affected limb, lymphatic vasculature, quantifying the amount of total plasma proteins, and histopathology. Acute lymphedema is observed for 7-10 days. Perhaps more importantly, the chronic progression of edema lasts up to 3-4 weeks.

【０７１７】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へと色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に
、０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素
の注射の後、周径測定および体積測定を行う。Prior to beginning surgery, blood samples are drawn for protein concentration analysis.
Male rats (weighing approximately 350 g) are dosed with pentobarbital. Then, the right limb is shaved from the knee to the hip joint. Wipe the shaved area with gauze soaked in 70% EtOH. Blood is drawn for serum total protein testing. After measuring the circumference and volume, mark two measurement levels (0.5 cm above the heel, midpoint of the back of the foot) and then inject the dye into the foot. The endothelium of both right and left dorsal foot is injected with 0.05 ml of 1% Evan's Blue. Then, after the dye is injected into the paw, circumference measurement and volume measurement are performed.

【０７１８】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管が位置決めされるよ
うに環状に行う。鉗子および止血鉗子を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置決め後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置決めする。次いで、この領域の主要なリンパ管を、電気凝固または縫合結紮す
る。Using the knee joint as a landmark, a limb groin incision is made in an annulus so that the femoral vessels are positioned. The flaps are dissected and separated using forceps and hemostats. After positioning the femoral vessel, lymphatic vessels that run alongside and below the vessel are positioned. The major lymphatic vessels in this area are then electrocoagulated or suture ligated.

【０７１９】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置決める。
次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の遠位
血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随す
る脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。Using a microscope, the muscles of the back of the limb (semitendinosus)
And around the adductor muscle). The popliteal lymph nodes are then positioned.
The two proximal lymphatic vessels and two distal lymphatic vessels as well as the distal blood supply of the popliteal node are ligated with sutures. The popliteal lymph nodes and any associated adipose tissue are then removed by cutting connective tissue.

【０７２０】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。Take care to manage any mild bleeding that occurs with this procedure. After occlusion of lymphatic vessels, flaps are placed on the liquid skin (Vetbond) (AJ Buck).
Seal by using. Separate skin edges are sealed to the underlying muscle tissue leaving a gap of about 0.5 cm around the leg. The skin may also be anchored by suturing to the underlying muscle when needed.

【０７２１】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。To avoid infection, animals are individually housed with mesh (no bedding). Recovered animals are checked daily through the optimal edema peak. This peak typically occurs up to 5-7 days. The plateau edema peak is then observed. To assess the intensity of lymphedema, the circumference and volume of two designated locations on each limb are measured before the procedure and daily for 7 days. The effect of plasma proteins on lymphedema is determined, and it is also investigated whether protein analysis is a useful test perimeter. The weights of both control and edematous limbs are evaluated at two points. The analysis is performed in a blind manner.

【０７２２】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。Circumference measurement: Under short-term gas anesthesia to prevent movement of the limb, the circumference of the limb is measured using a tape measure. Measurements are made on the talar and dorsal paw by two different persons and then these two readings are averaged. Readings are taken from both control and edematous limbs.

【０７２３】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々顕著なレベ
ルまで装置中に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。Volumetric: On the day of surgery, animals are anesthetized with pentobarbital and tested prior to surgery. For daily volume measurements, animals are placed under short-term halothane anesthesia (rapid immobilization and quick recovery), both legs shaved, and the legs marked equally with water-resistant markers. The legs are first soaked in water, then soaked in the device to each significant level, and then Buxco hydrops software (Chen / Victor
or)). The data is recorded by one person, while the other is soaked in the marked area of the leg.

【０７２４】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。Blood-Plasma Protein Measurements: Blood is drawn prior to surgery, centrifuged, and serum separated, then the total protein and Ca 2+ comparisons are concluded.

【０７２５】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮で切断し、そして秤量する。２回目の秤量を
、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行う
。Limb Weight Comparison: After blood is drawn, the animal is prepared for tissue collection.
The limb is cut with a quillitine, then both the experimental and control legs are ligated and weighed. A second weighing is performed by removing the tibio-cakaneal joint and weighing the foot.

【０７２６】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。本実施例において記載される研
究は、脈管形成ポリペプチド活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究
を容易に改変して、脈管形成ポリペプチド（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポ
リペプチドのアゴニスト、および／またはアンタゴニストをコードするポリヌク
レオチドの活性を試験し得る。Histological preparation: The transverse muscle located behind the knee (popliteal) area was excised and placed in a metal mold, filled with freezeGel, soaked in cold methylbutane and -80 EC until cut into labeled sample bags. Place it. Upon cutting, the muscle is observed under the fluorescent microscope for lymphatic vessels. The studies described in this example tested angiogenic polypeptide activity. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. obtain.

【０７２７】 （実施例４０：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の脈管形成ポリペプチドによる抑
制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。Example 40 Suppression of TNFα-Induced Adhesion Molecule Expression by Angiogenic Polypeptides Recruitment of lymphocytes to areas of inflammation and angiogenesis is associated with cell surface adhesion molecules (CAM) on lymphocytes. It relates to specific receptor-ligand interactions with the vascular endothelium. This adhesion process is associated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-) in both normal and pathological settings.
1), and following a multistep cascade involving endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (E-selectin) expression in endothelial cells (EC). Expression of these and other molecules on the vascular endothelium determines the efficiency with which leukocytes can adhere to the local vasculature and overflow into local tissues during the development of the inflammatory response. Local concentrations of cytokines and growth factors are involved in regulating the expression of these CAMs.

【０７２８】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＭＡの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。Tumor necrosis factor α (TNF-α), a potent pro-inflammatory cytokine, is a stimulator of all three CMA in endothelial cells and may be involved in a wide variety of inflammatory responses, often resulting in disease. Bring physical results.

【０７２９】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する脈管形成ポリペプチドの潜在能
力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを
使用する）を使用して、脈管形成ファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同
時刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測
定する。この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、
プールした索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレ
プトマイシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにお
いて維持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、
９６ウェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになる
まで播種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／
ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄
し、そして所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７
℃にて処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現につ
いて評価する。The potential of angiogenic polypeptides to mediate the suppression of TNF-α-induced CAM expression can be tested. Using a modified ELISA assay, which uses EC as a solid phase adsorbent, of CAM expression in TNF-α-processed protein EC when co-stimulated with members of the angiogenic family of proteins. Measure the quantity. To perform this experiment, human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) cultures were
Growth medium (EGM-2; Clonetics, San) obtained from pooled cord collections and supplemented with 10% FCS and 1% penicillin / streptomycin.
Diego, CA) and maintained in a humidified incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 . HUVEC at a concentration of 1 × 10 4 cells / well in EGM medium,
Seed in 96 well plates at 37 ° C. for 18-24 hours or until confluent. Subsequently, the monolayer was treated with 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml.
Wash 3 times with serum free solution of RPMI-1640 supplemented with ml streptomycin and for 24 hours 37 with predetermined cytokines and / or growth factors.
Treated at ° C. After incubation, the cells are then evaluated for CAM expression.

【０７３０】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。次いで、固定液をウェル
から除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用いて
１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈
した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ
−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＡＣＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎおよび抗Ｅ−セレクチン−
Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストック抗体の１：
１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境において、３７℃にて３０分間イ
ンキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用い
て３回洗浄する。Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are grown to confluence in standard 96-well plates. Growth medium is removed from the cells and replaced with 90 μl 199 medium (10% FBS). Samples for testing and positive or negative controls are added to the plate in triplicate (10 μl volume). The plates are incubated at 37 ° C. for either 5 hours (selectin and integrin expression) or 24 hours (integrin expression only). Aspirate the plate to remove the medium and 100 μl of 0.1%
Paraformaldehyde-PBS (with Ca ++ and Mg ++) is added to each well. Hold the plate for 30 minutes at 4 ° C. The fixative is then removed from the wells and the wells are washed once with PBS (+ Ca, Mg) + 0.5% BSA and drained. Do not dry this well. 10 μl of diluted primary antibody is added to the test and control wells. Anti-ICAM
-1-Biotin, anti-VACM-1-Biotin and anti-E-selectin-
Biotin at a concentration of 10 μg / ml (1: 0.1 of 0.1 mg / ml stock antibody).
10 dilution). The cells are incubated for 30 minutes at 37 ° C in a humidified environment. Wells are washed 3 times with PBS (+ Ca, Mg) + 0.5% BSA.

【０７３１】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。Then, 20 μl of diluted ExtrAvidin-Alkaline Ph
Add osphotase (1: 5,000 dilution) to each well and at 37 ° C.
Incubate for 30 minutes. Wells with PBS (+ Ca, Mg) + 0.5
Wash 3 times with% BSA. 1 tablet of p-nitrophenol phosphate (p
NPP) is dissolved in 5 ml of glycine buffer (pH 10.4). 100 μl of pNPP substrate in glycine buffer is added to each test well. Triplicate standard wells were transferred to ExtrAvidin-Alkaline Pho in glycine buffer.
Working dilution of spotase (1: 5
000 (10 0 )> 10 −0.5 > 10 −1 > 10 −1.5 ). 5 μl of each dilution was added to triplicate wells and the resulting AP content in each well was 5.
50 ng, 1.74 ng, 0.55 ng, and 0.18 ng. Then 100
μl of pNPP reagent must be added to each standard well. The plate must be incubated at 37 ° C for 4 hours. 3M NaO
Add 50 μl volume of H to all wells. The results are quantified on a plate reader at 405 nm. The background subtraction option is used on blank wells filled with glycine buffer only. The template is set up to show the concentration of AP conjugate in each standard well [5.50].
ng; 1.74 ng; 0.55 ng; 0.18 ng]. Results are shown as the amount of bound AP conjugate in each sample.

【０７３２】 本実施例において記載される研究は、脈管形成タンパク質における活性を試験
した。しかし、当業者は、例示した研究を容易に改変して、脈管形成ポリペプチ
ド（例えば、遺伝子治療）、脈管形成ポリペプチドのアゴニスト、および／また
はアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドの活性を試験し得る。The studies described in this example tested activity on angiogenic proteins. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the studies illustrated to test the activity of polynucleotides encoding angiogenic polypeptides (eg, gene therapy), agonists and / or antagonists of angiogenic polypeptides. obtain.

【０７３３】 （実施例４１：モノクローナル抗体産生のためのマウス免疫化） 動物を個々に収容し、そして適宜、食物および水を与える。全ての操作を、無
菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍ
ａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。Example 41 Mouse Immunization for Monoclonal Antibody Production Animals are housed individually and given food and water ad libitum. All operations are performed using aseptic technique. This experiment was performed on Human Genome Science.
s, Inc. Institutional Animal Care and
Use Committee and the Guidelines for
the Care and Use of Laboratory Anim
Do as per al's rules and guidelines.

【０７３４】 ３５０μｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（または、他の中性緩衝溶液）中のタ
ンパク質の濃度を希釈し、０．４３ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。０
．３５ｍｌのフロイント完全アジュバントで、２つの３ｃｃガラスシリンジおよ
び使い捨て三方コック（Ｂａｔｅｒカタログ番号２Ｃ６２４０）を使用して、１
０分間アジュバンドおよびタンパク質溶液を乳化する。乳濁液を特性について試
験するために、５０μｌの乳濁液をビーカー中の冷水の表面に置く。その乳濁液
がそのままの白色の液滴として残らない場合、次いで、さらなる混合が必要とさ
れる。Dilute the concentration of protein in 350 μl of phosphate buffer solution (PBS) (or other neutral buffer solution) to a final protein concentration of 0.43 mg / ml. 0
． 35 ml Freund's Complete Adjuvant, using two 3 cc glass syringes and a disposable 3-way cock (Bater Catalog # 2C6240), 1
Emulsify the adjuvant and protein solution for 0 minutes. To test the emulsion for properties, 50 μl of emulsion are placed on the surface of cold water in a beaker. If the emulsion does not remain as intact white droplets then further mixing is required.

【０７３５】 乳濁液を全て、１つのシリンジに汲出し、そして２７ゲージ針を使用して、４
〜８部位（例えば、腋窩および鼠径部領域、頚部の後ろ、ならびに背中に沿って
）の間に分散させて、総量２００μｌの乳濁液をマウスに皮下注射する。All emulsions were pumped into one syringe and 4 using a 27 gauge needle.
Mice are injected subcutaneously subcutaneously in a total volume of 200 μl dispersed between ~ 8 sites (eg, the axilla and groin regions, behind the neck, and along the back).

【０７３６】 ２〜３週間後、フロイント不完全アジュバント（フロイント完全アジュバント
とは異なる）に交換して上記注射を繰り返す。After 2-3 weeks, the above injections are repeated, replacing with Freund's incomplete adjuvant (different from Freund's complete adjuvant).

【０７３７】 さらに２〜３週間後、フロイント不完全アジュバントを確実に使用して、３回
目の注射を上記に概説するように与える。After an additional 2-3 weeks, make sure to use Freund's incomplete adjuvant and give a third injection as outlined above.

【０７３８】 ３回目の注射の１０〜１４日後、尾静脈出血によりマウスから１００〜２００
μｌの血液を得る。その血液を３７℃にて６０分間インキュベートし、次いで、
一晩４℃にて冷却させる。４℃でのインキュベートに続いて、血液を１０分間遠
心する。血清を新たな管に移し、そしてマウス血清力価について試験する。力価
が低いことが分かった場合、腹腔内（ｉｐ）注射が隔週間隔で与えられ得る。腹
腔内注射のために、１匹のマウスあたり２００〜４００μｌのＰＢＳの容積中に
、１匹のマウスあたり１０〜２０μｇのタンパク質を調製する。１ｃｃシリンジ
および２６ゲージ針を使用して、マウスにその溶液を注射する。注射の１０〜１
４日後、２回目の尾出血を行い、そしてマウス血清力価について再試験する。10- 14 days after the third injection, 100-200 from mice by tail vein bleeding.
Obtain μl of blood. Incubate the blood for 60 minutes at 37 ° C, then
Allow to cool overnight at 4 ° C. Following incubation at 4 ° C, blood is centrifuged for 10 minutes. Serum is transferred to a new tube and tested for mouse serum titer. If the titer is found to be low, intraperitoneal (ip) injections may be given biweekly. For intraperitoneal injections, prepare 10-20 μg protein per mouse in a volume of 200-400 μl PBS per mouse. Mice are injected with the solution using a 1 cc syringe and a 26 gauge needle. 10-1 of injection
Four days later, a second tail bleed is taken and retested for mouse serum titer.

【０７３９】 （実施例４２：マウス血清力価ＥＬＩＳＡ） ５０μｌ／ウェルの精製した抗原（ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプ
レートをコーティングする。パラフィルムでこのＥＬＩＳＡプレートを覆い、そ
し４℃にて一晩、加湿チャンバ中でインキュベートする。インキュベーション後
、１回の洗浄につき２００μｌ／ウェルのＰＢＳでこのプレートを４回洗浄する
。１ウェルあたり２００μｌの３％ＢＳＡで、室温にて６０分間ブロッキングす
る。ブロッキング溶液を振盪する。Example 42: Mouse Serum Titer ELISA Coat ELISA plates with 50 μl / well of purified antigen (2 μg / ml in PBS). Cover the ELISA plate with Parafilm and incubate overnight at 4 ° C. in a humid chamber. After incubation, wash the plate 4 times with 200 μl / well PBS per wash. Block with 200 μl of 3% BSA per well for 60 minutes at room temperature. Shake the blocking solution.

【０７４０】 ０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈された、１０-2、１０-3、１０-4、
１０-5、１０-6および１０-7の希釈度の血清サンプルを５０μｌ／ウェルで２つ
のウェルに添加する。緩衝液のブランクならびに、上記希釈のポジティブコント
ロール血清およびネガティブコントロール血清を含む。室温にて１〜２時間イン
キュベートする。ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）で、２５０
μｌ／ウェルで４回洗浄する。10 −2 , 10 −3 , 10 −4 diluted in PBS containing 0.1% BSA
Serum samples at dilutions of 10 −5 , 10 −6 and 10 −7 are added to two wells at 50 μl / well. Includes buffer blank and positive and negative control sera at the above dilutions. Incubate at room temperature for 1-2 hours. 250 with PBST (PBS with 0.05% tween)
Wash 4 times with μl / well.

【０７４１】 ５０μｌ／ウェルのビオチン化抗マウスＩｇＧを、ＰＢＳＴ（０．１％ＢＳＡ
および２％ウマ血清を含む）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加する。室温にて
３０〜６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで４回プレートを洗浄する。50 μl / well of biotinylated anti-mouse IgG was added to PBST (0.1% BSA).
And 2% horse serum) at a concentration of 0.5 μg / ml. Incubate for 30-60 minutes at room temperature. Wash plate 4 times with PBST.

【０７４２】 ５０μｌ／ウェルのＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒカタログ番号ＰＫ−６１００）
をプレートに添加し、そして室温にて３０分間インキュベートする。プレートを
ＰＢＳＴで６回洗浄する。50 μl / well ABC reagent (Vector Catalog No. PK-6100)
Is added to the plate and incubated for 30 minutes at room temperature. Wash plate 6 times with PBST.

【０７４３】 ５ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に１個の二塩酸テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）錠剤
（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−３４０５）を溶解することによりＥＬＩＳＡ検出
のための基質を調製する。５ｍｌの０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（２５．７ｍ
ｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム（二塩基）、２４．３ｍｌの０．１Ｍクエン酸（
一水和物）、ｐＨ５．０）を添加する。２μｌの新鮮な３０％過酸化水素を添加
し、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、そして即座に使用する。 インキュベー
ションおよびプレートの洗浄に続いて、１００μｌの基質溶液を添加し、そして
室温にて約１５〜３０分間インキュベートする。反応を２５μｌ／ウェルの２Ｍ
Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止し、そして３０分以内にコントロールに対
して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取る。The substrate for ELISA detection is prepared by dissolving one tetramethylbenzidine (TMB) dihydrochloride (TMB) tablet (Sigma catalog number T-3405) in 5 ml ddH 2 O. 5 ml of 0.1 M phosphate citrate buffer (25.7 m
l 0.2 M sodium phosphate (dibasic), 24.3 ml 0.1 M citric acid (
Monohydrate), pH 5.0) is added. Add 2 μl of fresh 30% hydrogen peroxide, vortex and use immediately. Following incubation and washing of the plate, 100 μl of substrate solution is added and incubated at room temperature for about 15-30 minutes. Reaction is 25 μl / well of 2M
Stop by adding H 2 SO 4 and read plate at 450 nm against control within 30 minutes.

【０７４４】 （実施例４３：ハイブリドーマ生成のための融合プロトコール） 融合工程の１週間前、Ｐ３Ｘ増殖培地（１×ＤＭＥＭ ０％（Ｇｉｂｃｏカタ
ログ番号１１９６５−０１９）、５〜１０％胎仔ウシ血清、１×Ｌ−グルタミン
（Ｂｉｏｇｌｕｉｄｓカタログ番号３００）、および１×ピルビン酸ナトリウム
（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｅｓカタログ番号３３３））を作製する。新しいバイアルの
Ｐ３Ｘマウス骨髄腫細胞を、６ウェル皿の１ウェルに解凍し（解凍プロトコル（
後述）を参照のこと）、そしてＰ３Ｘ増殖培地中でその細胞の展開を開始した。
次の日、生存率が良好である場合、１００ｍｍ皿に移す。細胞密度は、１０6細
胞／ｍｌい上を超えてはならない。さらに、これらの細胞の膜は、ざらざらに見
えるべきではない。融合手順の日までに、５〜８×１０5細胞／ｍｌで６〜８皿
あるべきである。いくらかのＰ３Ｘ細胞をＨＡＴ培地中で試すことは良案である
。全ての細胞は、４日前後以内で死ぬ。そうでなければ、Ｐ３Ｘ細胞を、復帰変
異体を除去するために、１５ｕｇ／ｍｌの８−アザグアニン含有Ｐ３Ｘ培地中で
増殖されるべきである。Example 43: Fusion Protocol for Hybridoma Generation One week prior to the fusion step, P3X growth medium (1 × DMEM 0% (Gibco Catalog No. 11965-019), 5-10% fetal bovine serum, 1 X L-Glutamine (Biofluids Catalog No. 300), and 1X sodium pyruvate (Biofluides Cat No. 333)). Thaw fresh vials of P3X mouse myeloma cells into 1 well of a 6-well dish (thaw protocol (
(See below)), and the expansion of the cells was started in P3X growth medium.
The next day, if viability is good, transfer to a 100 mm dish. Cell densities should not exceed 10 6 cells / ml or more. Moreover, the membranes of these cells should not look rough. By the day of the fusion procedure, there should be 6-8 dishes at 5-8 × 10 5 cells / ml. It is a good idea to try some P3X cells in HAT medium. All cells die within about 4 days. Otherwise, P3X cells should be grown in P3X medium containing 15 ug / ml 8-azaguanine to remove revertants.

【０７４５】 融合手順の４日前、マウスを約１０μｌの高純度タンパク質の腹腔内注射で免
疫化するべきである。Four days before the fusion procedure, mice should be immunized with an intraperitoneal injection of approximately 10 μl of high purity protein.

【０７４６】 融合の１日前、Ｐ３Ｘ細胞を分割し、そして細胞が健康であり、かつ次の日ま
でに対数期で増殖するために必要とされるので、それらに新鮮培地を与えた。One day prior to fusion, P3X cells were split and given fresh medium as the cells were healthy and needed to grow in exponential phase by the next day.

【０７４７】 融合手順の日、５０ｍｌのＰ３Ｘ培地、ＰＥＧ溶液およびＨＡＴ培地（１×Ｄ
ＭＥＭ ０％、２０％胎仔ウシ血清、４％Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ−ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ ＨＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）、１×Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×
ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ０２６２）、１×０．０５Ｍ ２ＭＥおよび
１×ペニシリン−ストレプトマイシン）を３７℃の水浴に置いた。利用可能な約
１００ｍｌの冷ＤＭＥＭ ０％を用意する。On the day of the fusion procedure, 50 ml P3X medium, PEG solution and HAT medium (1 × D
MEM 0%, 20% fetal bovine serum, 4% Hybridoma Supplem
ent-BM Conditioned HI (Boehringer-Mannhe
im), 1 × L-glutamine, 1 × NEAA, 1 × sodium pyruvate, 1 ×
HAT (Sigma Catalog No. H0262), 1 × 0.05M 2ME and 1 × penicillin-streptomycin) were placed in a 37 ° C. water bath. Prepare approximately 100 ml of cold DMEM 0% available.

【０７４８】 あり得る汚染について全てのＰ３Ｘプレートを調べ、そして細胞の健康状態を
評価する。４つのプレートまたはフラスコからの細胞を再懸濁し、５０ｍｌのチ
ューブに合わせる。２００×Ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引する。１０
ｍｌのＤＭＥＭ ０％で各チューブを再懸濁し、そしてプールする。トリパンブ
ルー生存染色（生存度は、９０％を超えているはずである）を用いて生細胞を計
数する。細胞総数は２〜４×１０7細胞であるべきである。十分な細胞数でなけ
れば、より多くのプレートでこのプロセスを繰り返す。さらなる工程に必要とな
るまで、周囲室温（ＡＲＴ）に細胞を静置する。All P3X plates are checked for possible contamination and cell health assessed. Resuspend cells from 4 plates or flasks and combine into 50 ml tubes. Centrifuge at 200 × G for 10 minutes. Aspirate the supernatant. 10
Resuspend each tube with ml DMEM 0% and pool. Viable cells are counted using trypan blue viability stain (viability should be greater than 90%). The total number of cells should be 2-4 × 10 7 cells. If not enough cells, repeat this process with more plates. Leave cells at ambient room temperature (ART) until needed for further steps.

【０７４９】 フードの準備をし、ここで以下を用いて脾臓を取り出す：７０％ ＥｔＯＨ、
滅菌機器（ふるいおよび吸引用ゴムカップ（ｐｌｕｎｇｅｒ）を含む）、２つの
ペトリ皿（１０ｍｌ ＤＭＥＭ ０％を含む）および１５ｍｌ遠心チューブ（２
）。Prepare the hood, where the spleen is removed using the following: 70% EtOH,
Sterilization equipment (including sieve and suction rubber cup), 2 Petri dishes (with 10 ml DMEM 0%) and 15 ml centrifuge tubes (2
).

【０７５０】 マウスを屠殺し、次いで、脾臓を屠体から採取する。ＤＭＥＭ ０％を含むペ
トリ皿に脾臓を入れる。１０ｍｌのＤＭＥＭ ０％を含む他方の皿にはふるいを
入れ、そしてプレートのふたで覆う。滅菌ピンセットを用いて脾臓をふるいに移
し、そして細胞が培地中にばらばらに出てくるように、針付きシリンジを用いて
脾臓を細断する。次いで、他の吸引ゴムカップを用いて、脾臓を穏やかにふるい
を通して入れる。ふるいを通して脾臓器官組織をすりつぶすことは避ける。なぜ
なら、このことにより、大量の線維芽細胞増殖が生じるからである。Mice are sacrificed and spleens are then harvested from carcass. Place the spleen in a Petri dish containing 0% DMEM. The other dish containing 10 ml DMEM 0% is sieved and covered with a plate lid. The spleen is transferred to a sieve using sterile forceps, and the spleen is shredded using a syringe with a needle so that the cells come out into the medium in pieces. The spleen is then gently sifted through using another suction rubber cup. Avoid grinding splenic organ tissue through a sieve. This is because this causes a large amount of fibroblast proliferation.

【０７５１】 ふるいを取り除き、そして脾臓細胞懸濁物を１５ｍｌ 遠心チューブに移す。
残りの細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ ０％で皿から洗い出し、そしてチューブに添加
する。チューブを５分間静置し、そして大きな細片を底に沈ませる。次いで、細
片を除いて、細胞懸濁物を第２の１５ｍｌのチューブに移す。細胞を２００×Ｇ
で１０分間遠心分離する。ｓ／ｎを吸引し、そして５ｍｌのＤＭＥＭ ０％で脾
臓細胞を再懸濁する。さらに５ｍｌのＤＭＥＭ ０％を添加し、そして全容量を
５０ｍｌのチューブに移す。The sieve is removed and the spleen cell suspension is transferred to a 15 ml centrifuge tube.
The remaining cells are washed out of the dishes with 5 ml DMEM 0% and added to the tubes. Let the tube sit for 5 minutes and allow a large strip to sink to the bottom. The debris is then removed and the cell suspension is transferred to a second 15 ml tube. 200 x G cells
Centrifuge for 10 minutes. Aspirate s / n and resuspend spleen cells in 5 ml DMEM 0%. An additional 5 ml DMEM 0% is added and the total volume is transferred to a 50 ml tube.

【０７５２】 １０μｌの脾臓細胞懸濁物を取り出し、そしてリンパ球を計数するためにこれ
に５００μｌのトリパンブルーを加える（注意：正常の脾臓には、確実に１０8
はリンパ球が存在する）。Remove 10 μl of spleen cell suspension and add 500 μl trypan blue to it to count lymphocytes (Note: for normal spleen ensure that 10 8
Are lymphocytes).

【０７５３】 （融合） 脾臓細胞を含む５０ｍｌの遠心チューブに十分なＰ３Ｘ細胞を添加して、リン
パ球 対 Ｐ３Ｘ細胞の比を５：１にする（例えば、１０8リンパ球に関しては
、２×１０7のＰ３Ｘ細胞が必要である）。ＤＭＥＭ ０％で総容量を４５〜５
０ｍｌにし、そして２００×Ｇで１０分間遠心分離する。タイマー付きの移動フ
ード、温めたＰＥＧ、温めたＰ３Ｘ培地、および約３８〜４０℃の水を入れたビ
ーカーを用意する。Ｐ３Ｘ−リンパ球ペレットから上清を全て吸引し、そしてチ
ューブを軽く叩いてペレットをばらばらにするようにする。小さな水浴にチュー
ブを入れる。穏やかに浸透しながら融合チューブを温めた水中で維持し、１分間
にわたり１ｍｌのＰＥＧを滴下する。次いで、１〜２分間、時折振盪して静置さ
せておく。その後、１ｍｌのＰ３Ｘ培地を１分間にわたり滴下する。次いで、３
ｍｌのＰ３Ｘ培地を１分間にわたり滴下し、引き続き１０ｍｌのＰ３Ｘ培地を１
分間にわたり滴下する。(Fusion) Add sufficient P3X cells to a 50 ml centrifuge tube containing spleen cells to give a lymphocyte to P3X cell ratio of 5: 1 (eg, 2 × 10 8 for 10 8 lymphocytes). 7 P3X cells are required). Total volume 45-5 with 0% DMEM
Bring to 0 ml and centrifuge at 200 × G for 10 minutes. Prepare a moving hood with a timer, warm PEG, warm P3X medium, and a beaker with water at approximately 38-40 ° C. Aspirate all of the supernatant from the P3X-lymphocyte pellet and tap the tube to break up the pellet. Place the tube in a small water bath. The fusion tube is kept in warm water with gentle infusion and 1 ml PEG is added dropwise over 1 minute. Then, shake occasionally and let stand for 1-2 minutes. Then, 1 ml of P3X medium is added dropwise for 1 minute. Then 3
ml P3X medium is added dropwise over 1 minute, and then 10 ml P3X medium is added to 1 ml.
Add dropwise over minutes.

【０７５４】 Ｐ３Ｘ培地を総容量が４５ｍｌになるまで穏やかに添加する。１０分間チュー
ブを静置しておき、次いで２００×Ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、
そしてペレットを５ｍｌ以下のＨＡＴ培地中に穏やかに再懸濁する。細胞懸濁物
を４００ｍｌのＨＡＴ培地を含むボトルに移し、そして渦を巻かせて混合する。
いくらかの細胞懸濁物を滅菌リザーバに注ぐ。Gently add P3X medium to a total volume of 45 ml. Leave the tube to stand for 10 minutes, then centrifuge at 200 × G for 10 minutes. Aspirate the supernatant,
The pellet is then gently resuspended in 5 ml or less of HAT medium. The cell suspension is transferred to a bottle containing 400 ml HAT medium and vortexed to mix.
Pour some cell suspension into a sterile reservoir.

【０７５５】 フィルターを通したチップ付きの１２チャンネルピペットを用いて、９６ウェ
ルプレートに細胞を配置する（２００μｌ／ウェル）。プレートをインキュベー
ター中に置く。プレートをハイブリドーマ増殖または汚染について毎日モニター
する。３日間プレートをインキュベートする。最初の供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）（
培地交換）は、８連多岐管（８−ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍａｎｉｆｏｌｄ）を用い
て各ウェルの約半分の培地を吸引し、そして１００〜１５０μｌ／ウェルのＨＴ
培地と交換することにより、約７日目までに行う。最初のスクリーニングが融合
していないリンパ球により生成される任意の抗体を希釈するために役立つ前には
、約１週間に１回供給する。このリンパ球は、培養物中で２週間後に抗体を生成
し続けていることが見出された。多くのウェルまたは全てのウェルが、コロニー
がウェルの半分を超えて満たし、そして上清の色がオレンジ／黄色に変化した場
合は、融合して２週間後以内に、スクリーニングするためにサンプリングできる
状態にある。Place cells in 96-well plates (200 μl / well) using a 12-channel pipette with a filtered tip. Place the plate in the incubator. Plates are monitored daily for hybridoma growth or contamination. Incubate the plate for 3 days. First feeding (
Medium exchange) was performed by aspirating approximately half of the medium in each well using an 8-position manifold, and 100-150 μl / well of HT.
Perform by about 7 days by replacing with medium. Feed approximately once a week before the initial screen serves to dilute any antibody produced by unfused lymphocytes. The lymphocytes were found to continue to produce antibodies in culture after 2 weeks. If many or all wells are filled with colonies in more than half of the wells and the color of the supernatant changes to orange / yellow, then within 2 weeks of fusion, ready for sampling for screening It is in.

【０７５６】 （実施例４４：マウスハイブリドーマのＥＬＩＳＡスクリーニング） マウスハイブリドーマをスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎ ２「Ｕ」底マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．０１１−０１０−３５５５））を５０μｌ／ウェルの抗原（２μｇ／
ｍｌ ＰＢＳ）でコーティングする。ＥＬＩＳＡプレートをプラスチックシール
で覆い、そして４℃で一晩インキュベートする。インキュベーションの後、１回
の洗浄につき２００μｌ／ウェルのＰＢＳで、プレートを４回洗浄する。３％
ＢＳＡ（２００μｌ／ウェル）で６０分間室温でブロックする。ブロッキング溶
液を振って落とす。Example 44: ELISA Screening of Mouse Hybridomas To screen mouse hybridomas, an ELISA plate (I
mmulon 2 "U" Bottom Microtiter Plate (Dynatech Ca
t. No. 011-010-3555)) 50 μl / well of antigen (2 μg /
ml PBS). Cover the ELISA plate with a plastic seal and incubate overnight at 4 ° C. After incubation, wash the plate 4 times with 200 μl / well PBS per wash. 3%
Block with BSA (200 μl / well) for 60 minutes at room temperature. Shake off blocking solution.

【０７５７】 ハイブリドーマ上清１５０μ／ウェルをＣｏｒｎｉｎｇ９６ウェルアッセイプ
レートに添加し、次いで、各上清５０μｌをＣｏｒｎｉｎｇアッセイプレートか
らＥＬＩＳＡプレートに移す。培養培地ならびに陽性マウス血清および陰性マウ
ス血清のコントロールをブランクに含める。室温で１〜２時間または４℃で一晩
インキュベートする。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）（２５
０μｌ／ウェル）で４回洗浄する。150 μl / well of hybridoma supernatant is added to Corning 96 well assay plates, then 50 μl of each supernatant is transferred from the Corning assay plates to the ELISA plates. Include culture medium and positive and negative mouse serum controls in the blank. Incubate for 1-2 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. PBST (PBS containing 0.05% Tween) (25
Wash 4 times with 0 μl / well).

【０７５８】 ５０μｌ／ウェルのビオチン化抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（０．１〜０．３％
ＢＳＡおよび１％ウマ血清を含有するＰＢＳＴ中で０．５μｇ／ｍｌの濃度）を
添加する。室温で３０〜６０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで４
回洗浄する。50 μl / well of biotinylated anti-mouse IgG H + L (0.1-0.3%
0.5 μg / ml in PBST containing BSA and 1% horse serum). Incubate at room temperature for 30-60 minutes. Plate 4 with PBST
Wash twice.

【０７５９】 ５０μｌ／ウェルのＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＫ−６１０
０）をプレートに添加し、そして室温で３０分間インキュベートする。プレート
を６回ＰＢＳＴで洗浄する。50 μl / well of ABC reagent (Vector Cat. No. PK-610)
0) is added to the plate and incubated for 30 minutes at room temperature. Wash plate 6 times with PBST.

【０７６０】 テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．Ｔ−３４０５）１つを５ｍｌのｄｄＨ2Ｏに溶解することによりＥＬ
ＩＳＡ検出の基質を調製する。５ｍｌの０．１Ｍ リン酸クエン酸緩衝液（２５
．７ｍｌの０．２Ｍ 二塩基リン酸ナトリウム、２４．３ｍｌの０．１Ｍ クエ
ン酸一水和物，ｐＨ５．０）を添加する。２μｌの新たな３０％ 過酸化水素を
添加し、ボルテックスし、そして直ぐに使用する。Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) tablets (Sigma Ca
t. No. T-3405) EL by dissolving one in 5 ml of ddH 2 O
Prepare a substrate for ISA detection. 5 ml of 0.1 M phosphate citrate buffer (25
． 7 ml 0.2 M sodium phosphate dibasic, 24.3 ml 0.1 M citric acid monohydrate, pH 5.0) are added. Add 2 μl of fresh 30% hydrogen peroxide, vortex and use immediately.

【０７６１】 プレートのインキュベーションおよび洗浄の後、１００μｌの基質溶液を添加
し、室温で約１５〜３０分間インキュベートする。２５μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ 2 ＳＯ4を添加することにより反応を停止し、そしてプレートをコントロールに対
して３０分以内に４５０ｎｍで読みとる。[0761]   After incubation and washing of the plate, add 100 μl of substrate solution
And incubate at room temperature for about 15-30 minutes. 25 μl / well of 2M H 2 SOFourThe reaction was stopped by adding
And read at 450 nm within 30 minutes.

【０７６２】 （実施例４５：培養上清から得られたモノクローナル抗体の相対的親和性試験
） （Ａ．抗原コーティング濃度の決定） 約１ｍｌの抗原（ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌ）を作製する。微量希釈（ｍｉｃｒｏ
ｄｉｌｕｔｉｏｎ）チューブに移す。９つの微量希釈チューブの各々に０．５ｍ
ｌのＰＢＳを入れ、次いで、４μｇ／ｍｌチューブから開始して、チューブから
チューブへ０．５ｍｌ移すことにより１／２の段階希釈を行う。ここで、４、２
、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６、０．０３、０．０１５および
０．００７５μｇ／ｍｌを含むチューブが得られる。プレートの各６ウェルを上
記の濃度でコーティングする（５０μｌ／ウェル）。Example 45: Relative Affinity Test of Monoclonal Antibodies Obtained from Culture Supernatant (A. Determination of Antigen Coating Concentration) About 1 ml of antigen (4 μg / ml in PBS) is prepared. Microdilution (micro
Dilution) Transfer to a tube. 0.5m in each of 9 microdilution tubes
Make 1 serial dilution by adding 1 l PBS, then starting from a 4 μg / ml tube and transferring 0.5 ml from tube to tube. Where 4, 2
Tubes containing 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.03, 0.015 and 0.0075 μg / ml are obtained. Coat each 6 well of the plate with the above concentration (50 μl / well).

【０７６３】 プレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション
の後、１回の洗浄あたり、プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄す
る。３％ ＢＳＡ（２００μｌ／ウェル）で６０分間室温でブロックする。ブロ
ッキング溶液を振って落とす。Cover plate and incubate overnight at 4 ° C. After incubation, the plates are washed 4 times with 200 μl / well PBS per wash. Block with 3% BSA (200 μl / well) for 60 minutes at room temperature. Shake off blocking solution.

【０７６４】 抗原に対して陽性のマウス血清の力価曲線を調べる。力価曲線のちょうど頂部
の血清希釈物を決定する。０．１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中のこの希釈物の陽性マ
ウス血清を行Ｂ〜Ｄの列２〜１１に添加する（５０μｌ／ウェル）。行Ｅ〜Ｇの
列２〜１１に上記希釈物の陰性コントロール血清を含める。４℃で一晩インキュ
ベートする。インキュベーション後、陽性コントロール血清値から陰性コントロ
ール血清値を差し引く。平均値（Ｏ．Ｄ．４５０）を抗原濃度に対して線形スケ
ールでプロットする。最大未満のＯ．Ｄ．を示した抗原コーティング濃度を決定
する。これは、相対的アフィニティーアッセイについて使用するためのコーティ
ング濃度である。The titer curve of mouse sera positive for the antigen is examined. Determine the serum dilution just above the titer curve. Add positive mouse sera of this dilution in PBS containing 0.1% BSA to rows 2 to columns 2-11 (50 μl / well). Columns 2-11 of rows E-G contain the negative control sera from the above dilutions. Incubate at 4 ° C overnight. After incubation, subtract the negative control serum value from the positive control serum value. Mean values (OD450) are plotted on a linear scale against antigen concentration. Less than maximum O. D. Determine the antigen coating concentration indicated. This is the coating concentration for use with the relative affinity assay.

【０７６５】 （Ｂ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｋ
ｉｔ 「Ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ」（Ｃａｔ．Ｎｏ．１３３３ １５１
を用いたハイブリドーマ上清サンプルのマウスＩｇＧ濃度の測定） コーティング緩衝液濃縮液をｄｄＨ2Ｏで１／１０に希釈する。１０〜２０ｍ
ｌが必要である。捕捉抗体のアリコートを得る。３つのチューブのコーティング
後緩衝液濃縮液（ブロッキング溶液）を解凍する。標準物質に関しては１２ウェ
ルが、試験する各上清に関しては４〜６ウェルが必要である。５０μｌ／ウェル
のコーティング容量を想定して、必要な希釈捕捉抗体のｍｌ数を計算する。以下
の割合で捕捉抗体を希釈する：２５μｌの捕捉Ａｂ ＝ Ｘμｌの捕捉Ａｂ １ｍｌのコーティング緩衝液 コーティング緩衝液のｍｌ数 Ｎｕｎｃプレートをこの溶液でコーティングし、振盪機上で室温で３０分間イ
ンキュベートする。濃縮コーティング後緩衝液をｄｄＨ2Ｏ中で１／１０に希釈
する。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．９％ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗ
ｅｅｅｎ ２０）で洗浄し、そして２００μｌ／ウェルのコーティング後緩衝液
（ブロッキング溶液）で１５分間室温でブロックする。ＩｇＧ標準をコーティン
グ後緩衝液（ブロッキング溶液）へと以下の濃度に希釈する：コーティング後緩
衝液中、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５および０．００
６２５μｇ／ｍｌ。(B. Boehringer Mannheim Biochemica K
it "Mouse-IgG ELISA" (Cat. No. 1333 151)
Measurement of Mouse IgG Concentration of Hybridoma Supernatant Sample Using Sample) The coating buffer concentrate is diluted 1/10 with ddH 2 O. 10-20m
l is required. Obtain an aliquot of capture antibody. After coating the three tubes, thaw the buffer concentrate (blocking solution). Twelve wells are required for standards and 4-6 wells for each supernatant tested. Assuming a coating volume of 50 μl / well, calculate the required ml of diluted capture antibody. Dilute capture antibody in the following proportions: 25 μl capture Ab = X μl capture Ab 1 ml coating buffer ml coating buffer Nunc plates are coated with this solution and incubated for 30 minutes at room temperature on a shaker. After concentrated coating, the buffer is diluted 1/10 in ddH 2 O. Plates in ELISA wash buffer (0.9% NaCl, 0.1% Tw
Wash with een 20) and block with 200 μl / well post-coating buffer (blocking solution) for 15 minutes at room temperature. Dilute IgG standards into post-coating buffer (blocking solution) to the following concentrations: 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 and 0.00 in post-coating buffer.
625 μg / ml.

【０７６６】 上清をブロッキング緩衝液に希釈して、１／１００および１／１０００の終濃
度にする。ブロッキング工程の後、プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェル
の希釈ＩｇＧ標準および希釈上清を２連で添加する。振盪機上で室温で３０分間
インキュベートする。The supernatant is diluted in blocking buffer to a final concentration of 1/100 and 1/1000. After the blocking step, the plates are washed and 50 μl / well diluted IgG standard and diluted supernatant are added in duplicate. Incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker.

【０７６７】 以下の割合に従って、コーティング後緩衝液（ブロッキング溶液）に結合溶液
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を希釈する：５０μｌの結合溶液 ＝ Ｘμｌの結合溶液 １ｍｌのブロッキング溶液 ブロッキング溶液のｍｌ数 プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの結合溶液を添加する。振盪機上
でプレートを室温で３０分間インキュベートする。Dilute the conjugate solution in post-coating buffer (blocking solution) according to the following ratio: 50 μl binding solution = X μl binding solution 1 ml blocking solution ml blocking solution Wash plate, Then add 50 μl / well of binding solution. Incubate the plate on a shaker for 30 minutes at room temperature.

【０７６８】 基質錠剤１錠を５ｍｌの基質緩衝液に溶解する。プレートを洗浄し、そして５
０μｌ／ウェルの基質を添加する。振盪機上でプレートを室温で３０分間インキ
ュベートし、そして４０５ｎｍで読みとる。One substrate tablet is dissolved in 5 ml of substrate buffer. Wash plate, and 5
Add 0 μl / well of substrate. Incubate the plate on a shaker for 30 minutes at room temperature and read at 405 nm.

【０７６９】 （Ｃ．相対的アフィニティーアッセイ） 適切なＥＬＩＳＡプレートを予め決定した抗原濃度で４℃で一晩コーティング
する。プレートを上記のようにブロックする。ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡに１／
３段階希釈物の試験上清を作製する。C. Relative Affinity Assay Coat appropriate ELISA plates at a predetermined antigen concentration at 4 ° C. overnight. Block plate as above. PBS + 0.1% BSA 1 /
Make test supernatants of 3 serial dilutions.

【０７７０】 上清サンプルの希釈物５０μｌ／ウェル（希釈していないサンプルを含む）を
ＥＬＩＳＡプレートに２連または３連で添加する。陽性コントロールは、抗原コ
ーティング濃度を決定するために使用した濃度と同じ濃度の陽性コントロールマ
ウス血清の数ウェルからなる。陰性コントロールは、希釈緩衝液の数ウェルから
なる。プレートを覆い、そして４℃でインキュベートする。Add 50 μl / well of the supernatant sample (containing undiluted sample) to the ELISA plate in duplicate or triplicate. The positive control consisted of several wells of positive control mouse serum at the same concentration used to determine the antigen coating concentration. Negative controls consist of several wells of dilution buffer. Cover plate and incubate at 4 ° C.

【０７７１】 ４パラメーター曲線適合において平均値（Ｏ．Ｄ．４５０）に対して各上清の
ＩｇＧ濃度をプロットする。より左側にある上清の曲線が、最も高いアフィニテ
ィーを有する上清である。The IgG concentration of each supernatant is plotted against the mean value (OD450) in a 4-parameter curve fit. The curve of the supernatant to the left is the supernatant with the highest affinity.

【０７７２】 （実施例４６：マウスにおける腹水生成） ハイブリドーマ細胞は健康的であるべきであり、腹水生成のためには対数増殖
期にあるべきである。細胞を１５ｍｌのチューブに移し、そして計数する。４×
１０6細胞を含む容量を決定し、第２のチューブにその容量を移し、そして細胞
を遠心分離する。ペレットを０．９ｍｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡化塩類溶液）
中で再懸濁し、そしてエッペンドルフチューブに移す。Example 46 Ascites Production in Mice Hybridoma cells should be healthy and in the exponential growth phase for ascites production. Transfer cells to a 15 ml tube and count. 4x
Determine the volume containing 10 6 cells, transfer the volume to a second tube, and centrifuge the cells. Pellet 0.9 ml HBSS (Hanks balanced salt solution)
Resuspend in and transfer to an Eppendorf tube.

【０７７３】 １ｃｃのシリンジを細胞懸濁物で満たし、そして以下のようにマウスにＩＰ注
射する：最初の細胞数が４×１０6である場合は、０．２ｃｃ／マウス、および
最初の細胞数が３×１０6である場合は、０．３ｃｃ／マウス。腹が非常に膨張
し、そして触った場合にわずかにバルーンのように感じられる場合（通常は９日
目または１０日目までであるが、ときおり１４日目程度に遅くなる）、「マウス
を穿刺する（ｔａｐ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ）」ときである。Fill a 1 cc syringe with cell suspension and IP inject into mice as follows: 0.2 cc / mouse if the initial cell number is 4 × 10 6 and initial cell number. Is 3 × 10 6 , 0.3 cc / mouse. If the belly is very distended and feels slightly balloon-like to the touch (usually by day 9 or 10, but sometimes as late as day 14) It is time to “tap the mouse”.

【０７７４】 （Ａ．穿刺法（ｔａｐｐｉｎｇ）） マウスを左手に保定し、そしてアルコールパッドを用いてマウスの左後肢の真
上の腹部領域を拭く。口の開いた１５ｍｌの遠心チューブの上でマウスを保定し
ながら、１９ゲージの針を腹に挿入する。腹水は、遠心チューブに針の端部から
直ぐにしたたり始めるはずである。平均的なマウスは３〜６ｍｌの腹水を生じる
はずである。A. Tapping Mice are retained in the left hand and an alcohol pad is used to wipe the abdominal area just above the left hind limb of the mice. A 19 gauge needle is inserted into the abdomen while retaining the mouse on a 15 ml centrifuge tube with an open mouth. Ascites should begin to drip into the centrifuge tube from the end of the needle. The average mouse should produce 3-6 ml of ascites.

【０７７５】 （Ｂ．腹水の処理および保存） 群における各マウスから採取した腹水をプールし（全て同じハイブリドーマを
注射した）、そして室温で１〜２時間静置するか、または３７℃に１５〜３０分
間配置する。次いで、腹水を４℃に一晩配置し、血餅を形成させる。凝固した腹
水を１０分間遠心分離する。液体の腹水を５０ｍｌの遠心チューブに移し、そし
て−２０℃で保存する。その後の穿刺物を、この５０ｍｌのチューブに加え得る
。全てのマウスを屠殺したとき、プールした腹水を融解し、再びスピンし、そし
て−２０℃または−７０℃での長期保存のためにアリコートに分ける。腹水は、
ＥＬＩＳＡにより力価測定される。B. Treatment and storage of ascites Ascites collected from each mouse in the group was pooled (all injected with the same hybridoma) and left at room temperature for 1-2 hours or at 37 ° C for 15- 15 hours. Place for 30 minutes. The ascites is then placed at 4 ° C overnight to allow clot formation. Centrifuge the solidified ascites for 10 minutes. Transfer liquid ascites to a 50 ml centrifuge tube and store at -20 ° C. Subsequent puncture can be added to the 50 ml tube. When all mice are sacrificed, pooled ascites is thawed, spun again, and aliquoted for long-term storage at -20 ° C or -70 ° C. Ascites
Titered by ELISA.

【０７７６】 （実施例４７：マウスハイブリドーマおよびミエローマの凍結および融解のた
めのプロトコル） （Ａ．凍結） 凍結される細胞は、健康であり、対数増殖期にあり、そして約５〜８×１０5
細胞／ｍｌの濃度であるべきである。６ウェルプレートまたはフラスコからの細
胞を再懸濁し、１５ｍｌのチューブに移し、そして計数する。総細胞数を計数し
、そして１〜３×１０6細胞／バイアルに分けて、凍結するバイアル数を決定す
る。[0776] (Example 47: Mouse hybridoma and protocols for freezing and thawing myeloma) (A. frozen) cells to be frozen is healthy, is in the logarithmic growth phase, and from about 5 to 8 × 10 5
There should be a concentration of cells / ml. Cells from 6 well plates or flasks are resuspended, transferred to 15 ml tubes and counted. The total number of cells is counted and divided into 1-3 × 10 6 cells / vial to determine the number of frozen vials.

【０７７７】 ５〜１０分間、２００〜３００×Ｇで細胞をペレットにする。上清をペレット
から吸引し、そして十分な冷却凍結培地（ＤＭＥＭ中５０％ ＦＢＳ、１０％
ＤＭＳＯ；またはＯｒｉｇｅｎ ＤＭＳＯ Ｆｒｅｅｚｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＧ
ＥＮ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＧ−５０−０７１５）中に再懸濁して
、１ｍｌあたりの細胞／バイアルの所望の数を達成する（細胞密度は、５×１０ 5 〜１×１０7細胞／バイアルの範囲であるべきである）。細胞懸濁物を冷却バイ
アル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に直ぐ移し（１ｍｌ／バイアル）、そして氷上に配置
する。バイアルを速度制御冷凍庫に移し、−７０℃の冷凍庫に一晩配置する。長
期間保存のために、２４時間後にバイアルを液体窒素タンクに移すか、または−
１３０℃の冷凍庫に移す。[0777]   Pellet cells at 200-300 x G for 5-10 minutes. Pellet the supernatant
Aspirated from, and sufficient chilled freezing medium (50% FBS in DMEM, 10%
DMSO; Origen DMSO Freeze Medium (IG
EN), Fisher Cat. No. IG-50-0715)
Achieve the desired number of cells / vial per ml (cell density is 5 x 10 Five ~ 1 x 107Should be in the range of cells / vial). By cooling the cell suspension
Immediately transfer to cryovial (1 ml / vial) and place on ice
To do. Transfer vials to rate controlled freezer and place in -70 ° C freezer overnight. Long
Transfer vials to liquid nitrogen tanks after 24 hours for long term storage, or-
Transfer to a freezer at 130 ° C.

【０７７８】 （Ｂ．融解） １０ｍｌの冷却培地（例えば、Ｐ３Ｘ培地）を１５ｍｌのチューブに添加する
。凍結細胞の冷却バイアルを取り出し、そして融解の準備ができるまでドライア
イス上で保持する。３７℃の水浴中で細胞を迅速に融解する。融解の間バイアル
を保持し、そしてごくわずかな氷がバイアル中に残っているだけになるまで、穏
やかに振盪し続ける。内容物を４℃を超えて温めてはならない。アルコールで冷
却バイアルの外側を拭く。滅菌パスツールピペットを用いて冷却バイアルの端部
に触れることなく、バイアル中の細胞懸濁物を１０ｍｌの冷却培地に移す。２０
０〜３００×Ｇで５〜１０分間スピンする。上清を吸引し、そして６ｍｌのＨＴ
クローニング培地（前出）中にペレットを再懸濁する。６ウェルディッシュのう
ちの１つのウェルに移す。生存性を２４時間後に評価する。生存性は、５０％未
満ではないはずである。(B. Thaw) Add 10 ml of chilled medium (eg P3X medium) to a 15 ml tube. Remove frozen vials of frozen cells and keep on dry ice until ready for thawing. Thaw cells rapidly in a 37 ° C water bath. Hold the vial during thaw and continue to shake gently until only a small amount of ice remains in the vial. Do not warm the contents above 4 ° C. Wipe the outside of the cooling vial with alcohol. Transfer the cell suspension in the vial to 10 ml of chilled medium using a sterile Pasteur pipette without touching the edge of the chilled vial. 20
Spin at 0-300 x G for 5-10 minutes. Aspirate supernatant and 6 ml HT
Resuspend the pellet in cloning medium (supra). Transfer to one well of a 6-well dish. Viability is assessed after 24 hours. Viability should not be less than 50%.

【０７７９】 （実施例４８：脈管形成タンパク質活性についてのインビトロアッセイ） 以下のアッセイを設計して、脈管形成タンパク質活性（好ましくは、ＶＥＧＦ
−２活性）を検出する。例えば、Ｆｌｔ−４レセプターの細胞外ドメイン（配列
番号２７）（本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇａｌｌａｎｄら
，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（２）：４７５−４７８（１９９２）をコードするヌ
クレオチドを、Ｆｌｋ−１の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（配列番号２
８）（その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｉｔｈ
ら，ＥＭＢＯ Ｊ １５（１８）：４９１９−４９２７（１９９６））をコード
するヌクレオチドに融合することによりキメラレセプターを生成する。従って、
このキメラレセプターは、それぞれ、配列番号２８のアミノ酸７６５〜１３５６
に融合された配列番号のアミノ酸１〜７７５を含む。Example 48: In Vitro Assay for Angiogenic Protein Activity The following assay is designed to design angiogenic protein activity (preferably VEGF).
-2 activity) is detected. For example, the extracellular domain of the Flt-4 receptor (SEQ ID NO: 27) (nucleotides encoding Galland et al., Genomics 13 (2): 475-478 (1992), which is incorporated herein by reference in its entirety). , Flk-1 transmembrane and intracellular domains (SEQ ID NO: 2
8) (Davis-Smith, which is incorporated herein by reference in its entirety).
Et al., EMBO J 15 (18): 4919-4927 (1996)) to produce a chimeric receptor. Therefore,
This chimeric receptor has amino acids 765 to 1356 of SEQ ID NO: 28, respectively.
SEQ ID NOs: fused to amino acids 1-775.

【０７８０】 あるいは、キメラレセプターを上記に概説したように設計し得るが、その全体
が本明細書中に参考として援用される、Ｐａｃｉｆｉｃｉら，ＪＢＣ ２６９（
３）：１５７１−１５７４（１９９４）において議論されるように、Ｆｌｋ−１
の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの代わりに、エリスロポエチンレセプタ
ー（ＥＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換する（具体的には
図１を参照のこと）。Alternatively, the chimeric receptor may be designed as outlined above, but which is hereby incorporated by reference in its entirety, Pacifici et al., JBC 269 (
3): 1571-1574 (1994), Flk-1
The erythropoietin receptor (EPOR) is replaced by the transmembrane and intracellular domains of erythropoietin receptor (EPOR) (see FIG. 1 for details).

【０７８１】 キメラレセプターをコードする得られたＤＮＡを、議論されるように（前出）
、適切な哺乳動物発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、または細菌発
現ベクター（例えば、ｐＣ４、ｐＣＤＮＡ３、またはｐＡ２のような）にクロー
ニングする。キメラレセプターの発現に使用され得る哺乳動物宿主細胞としては
、ＮＩＨ３Ｔ３（前出）、または前Ｂ細胞株ＢａＦ３（本明細書中にその全体が
参考として援用される、Ａｃｈｅｎら，ＰＮＡＳ ９５（２）：５４８−５５３
（１９９８））が挙げられる。The resulting DNA encoding the chimeric receptor is discussed, supra.
, Into a suitable mammalian, baculovirus, or bacterial expression vector (such as pC4, pCDNA3, or pA2). Mammalian host cells that can be used for expression of the chimeric receptor include NIH3T3 (supra), or the pre-B cell line BaF3 (Achen et al., PNAS 95 (2), incorporated herein by reference in its entirety). : 548-553
(1998)).

【０７８２】 活性について試験するために、脈管形成タンパク質を、キメラレセプターを発
現する細胞株またはその抽出物と接触させ得る。次いで、キメラレセプターに結
合する脈管形成タンパク質を、キメラレセプターにより伝達された任意の得られ
たシグナルを測定することにより検出し得る。To test for activity, angiogenic proteins can be contacted with a cell line expressing the chimeric receptor or an extract thereof. Angiogenic proteins that bind to the chimeric receptor can then be detected by measuring any resulting signal transmitted by the chimeric receptor.

【０７８３】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。It will be appreciated that the present invention may be practiced other than as described in detail in the foregoing description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and are therefore within the scope of the appended claims.

【０７８４】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表が参考として援用され
る、さらに、米国特許出願第０８／２０７，４１２号（現在、米国特許第第５，
８１７，４８５号として発行）および同０８／８０３，９２６号は、本明細書中
にその全体が参考として援用される。Full disclosure of each document cited in the background of the invention, detailed description and examples, including patents, patent applications, academic literature, abstracts, laboratory manuals, books or other disclosures.
Are incorporated herein by reference. In addition, the sequence listing is incorporated by reference, and further, US patent application Ser. No. 08 / 207,412 (currently US Pat.
No. 817,485) and No. 08 / 803,926, which are incorporated herein by reference in their entirety.

【０７８５】[0785]

【表３】 ＡＴＣＣ受託番号９７１４９ 第２頁 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。[Table 3] ATCC Deposit No. 97149, page 2 (Canada) The applicant is required to file a Canadian patent under the application or until the application is refused or abandoned and cannot be recovered or withdrawn until the Patent Office Commissioner ( Requesting that the Commissioner of Patents) permit the donation of a sample of the deposited biological material referred to in the application only to an independent expert nominated by the Commissioner, the applicant Prior to the completion of the regulatory preparations for the publication of, the fact must be notified in writing to the International Bureau.

【０７８６】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Norway) Applicants hereby agree that the application of samples is not subject to specialization in the art until the application has been published (by the Norwegian Patent Office) or has been decided by the Norwegian Patent Office without publication. Claim that it will only be done to the house. A request to this effect shall be made by the applicant to the Norwegian Patent Office before the time when the application is made publicly available under section 22 and section 33 (3) of the Norwegian Patent Act. If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert is a list of certified experts prepared by the Norwegian Patent Office (list of
any of those listed in "recognized experts", or
It can be any person approved by the applicant in the individual case.

【０７８７】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。(Australia) The Applicant hereby states that the provision of a sample of microorganisms is
Alternatively, before the abandonment, rejection or withdrawal of the application, a person who is a person skilled in the art who has no interest in the invention (skilled addre)
It is to be announced that it will only be performed for Ssee) (Australian Patent Law No. 3.25 (3)).

【０７８８】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。(Finland) The applicant hereby states that the application is (Patent and Control Committee (National
That samples will only be provided to experts in the art until published (by Board of Patents and Regulations) or until a decision by the National Patent and Legal Commission is made without publication. ,Claim.

【０７８９】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号９７１４９ 第３頁 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(UK) Applicant hereby claims that the provision of a sample of microorganisms is made available only to professionals. A request to this effect must be made by the applicant to the International Bureau before the regulatory preparations for the international publication of the application are complete. ATCC Deposit No. 97149, page 3 (Denmark) The applicant hereby refuses to provide samples until the application has been published (by the Danish Patent Office) or has been decided by the Danish Patent Office without publication. Claim that it is done only to experts in the art. A request to this effect shall be filed by the applicant with the Danish Patent Office before the time when the application is made publicly available under Articles 22 and 33 (3) of the Danish Patent Act. If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert is a list of certified experts prepared by the Danish Patent Office (list of).
any of those listed in "recognized experts", or
It can be any person approved by the applicant in the individual case.

【０７９０】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局Temp
Tempに対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ
ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／Ｒ
Ｏ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者に
よるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するも
のとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト
（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意
の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり
得る。(Sweden) Applicants hereby advise that the application of a sample shall be prioritized in the art until the application has been published (by the Swedish Patent Office) or has been decided by the Swedish Patent Office without publication. Claim that it will only be done to the house. A request to this effect must be made by the applicant before the expiration of 16 months from the priority date.
It should be done for Temp (preferably PCT Applicant's
Form PCT / R described in Annex Z of Volume I of Guide
O / 134). If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert may be any person listed on the list of recognized experts prepared by the Swedish Patent Office or, in the individual case, any person approved by the applicant.

【０７９１】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。(Netherlands) Applicants hereby agree that until the issue date of the Dutch patent, or until the date when the application is rejected, withdrawn or lapped, the microorganism is specialized under the provisions of Patent Law 31F (1). Claim that it will only be done in the form of sample delivery to the house. A request for this shall be made by the applicant before the Dutch industrial property right before the date on which the application is made publicly available under Article 22C or Article 25 of the Dutch Patent Act, whichever is earlier. It shall be submitted to the Bureau.

【０７９２】[0792]

【表４】 ＡＴＣＣ受託番号７５６９８ 第２頁 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。[Table 4] ATCC Deposit No. 75698, page 2 (Canada) The applicant is required to file a Canadian patent under the application, or until the application is refused or abandoned and cannot be recovered or withdrawn until the Commissioner of the Patent Office ( Requesting that the Commissioner of Patents) permit the donation of a sample of the deposited biological material referred to in the application only to an independent expert nominated by the Commissioner, the applicant Prior to the completion of the regulatory preparations for the publication of, the fact must be notified in writing to the International Bureau.

【０７９３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Norway) Applicants hereby agree that the application of samples shall be deemed to be until the application has been published (by the Norwegian Patent Office) or determined by the Norwegian Patent Office without publication. Claim that it will only be done to the house. A request to this effect shall be made by the applicant to the Norwegian Patent Office before the time when the application is made publicly available under section 22 and section 33 (3) of the Norwegian Patent Act. If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert is a list of certified experts prepared by the Norwegian Patent Office (list of
any of those listed in "recognized experts", or
It can be any person approved by the applicant in the individual case.

【０７９４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。(Australia) The Applicant hereby states that the provision of a sample of microorganisms is
Alternatively, before the abandonment, rejection or withdrawal of the application, a person who is a person skilled in the art who has no interest in the invention (skilled addre)
It is to be announced that it will only be performed for Ssee) (Australian Patent Law No. 3.25 (3)).

【０７９５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。(Finland) Applicant hereby states that the application (Patent and Control Committee (National
That samples will only be provided to experts in the art until published (by Board of Patents and Regulations) or until a decision by the National Patent and Legal Commission is made without publication. ,Claim.

【０７９６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号７５６９８ 第３頁 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(UK) The applicant hereby claims that the provision of a sample of microorganisms is made available only to professionals. A request to this effect must be made by the applicant to the International Bureau before the regulatory preparations for the international publication of the application are complete. ATCC Deposit No. 75698, page 3 (Denmark) Applicants hereby submit samples until the application has been published (by the Danish Patent Office) or determined by the Danish Patent Office without publication. Claim that it is done only to experts in the art. A request to this effect shall be filed by the applicant with the Danish Patent Office before the time when the application is made publicly available under Articles 22 and 33 (3) of the Danish Patent Act. If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert is a list of certified experts prepared by the Danish Patent Office (list of).
any of those listed in "recognized experts", or
It can be any person approved by the applicant in the individual case.

【０７９７】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Sweden) Applicants hereby advise that the application of samples shall be prioritized in the art until the application has been published (by the Swedish Patent Office) or has been decided by the Swedish Patent Office without publication. Claim that it will only be done to the house. A request to this effect shall be filed by the applicant with the International Bureau not later than 16 months from the priority date (preferably PCT Applicant's Gui).
Form PCT / RO / 13 described in Annex Z of Volume I of de
4). If such a claim is made by the applicant, any claim for the provision of the sample by a third party shall indicate the expert used. The expert is a list of certified experts (lis) prepared by the Swedish Patent Office.
any of the persons listed in to of recognized experts),
Alternatively, it may be any person approved by the applicant in the individual case.

【０７９８】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。(Netherlands) Applicants hereby agree that until the issue date of the Dutch patent, or until the date when the application is rejected, withdrawn or lapped, the microorganism is specialized under the provisions of Patent Act 31F (1). Claim that it will only be done in the form of sample delivery to the house. A request for this shall be made by the applicant before the Dutch industrial property right before the date on which the application is made publicly available under Article 22C or Article 25 of the Dutch Patent Act, whichever is earlier. It shall be submitted to the Bureau.

【０７９９】 以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲によって含ま
れるような本発明の範囲を限定することを意味しない。The following drawings are illustrative of embodiments of the invention and are not meant to limit the scope of the invention as covered by the claims.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１Ａ〜１Ｅは、ＶＥＧＦ２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１５）および
推定アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、このうちの約２３個は、リーダー配列を示す。アミノ酸に
関する標準的な一文字の略語を使用する。配列決定は、モデル３７３自動化ＤＮ
Ａシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用い
て実施した。配列決定の精度は９７％よりも大きいと予想される。1A-1E show the full-length nucleotide sequence of VEGF2 (SEQ ID NO: 15) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 16). This polypeptide contains about 419 amino acid residues, of which about 23 represent a leader sequence. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing is model 373 automated DN
It was performed using an A sequencer (Applied Biosystems, Inc.). Sequencing accuracy is expected to be greater than 97%.

【図２】 図２Ａ〜２Ｄは、生物学的に活性な形態のＶＥＧＦ２のヌクレオチド配列（配
列番号２５）および推定アミノ酸配列（配列番号２６）を示す。このポリペプチ
ドは、約３５０個のアミノ酸残基を含み、このうちの最初の約２４個のアミノ酸
は、リーダー配列を示す。2A-2D show the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 25) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) of the biologically active form of VEGF2. This polypeptide contains about 350 amino acid residues, of which the first about 24 amino acids represent the leader sequence.

【図３】 図３Ａ〜３Ｃは、ＰＤＧＦ−Ａ（配列番号２）、ＰＤＧＦ−Ｂ（配列番号４）
、ＰｌＧＦ（配列番号６）、ＰｌＧＦ−２（配列番号８）、ＧＤＧＦ（配列番号
１０）、ＶＥＧＦ（配列番号１２）、ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号１４）、ＶＥＧＦ
−２（配列番号１６）、ＶＥＧＦ−３（配列番号１８）、ＶＥＧＦ−Ｄ（配列番
号２０）、ＶＥＧＦ−Ｄ１（配列番号２２）、およびＶＥＧＦ−Ｅ（配列番号２
４）の間のアミノ酸配列相同性の模式図である。箱型の領域は、保存配列および
８個の保存システイン残基の位置を示す。3A-3C are PDGF-A (SEQ ID NO: 2), PDGF-B (SEQ ID NO: 4).
, PlGF (SEQ ID NO: 6), PlGF-2 (SEQ ID NO: 8), GDGF (SEQ ID NO: 10), VEGF (SEQ ID NO: 12), VEGF-A (SEQ ID NO: 14), VEGF
-2 (SEQ ID NO: 16), VEGF-3 (SEQ ID NO: 18), VEGF-D (SEQ ID NO: 20), VEGF-D1 (SEQ ID NO: 22), and VEGF-E (SEQ ID NO: 2)
FIG. 4 is a schematic diagram of amino acid sequence homology between 4). Boxed regions indicate the positions of conserved sequences and 8 conserved cysteine residues.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１３年１２月１１日（２００１．１２．１１）[Submission date] December 11, 2001 (2001.12.11)

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１８４[Name of item to be corrected] 0184

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０１８４】 本発明の脈管形成タンパク質は、全て構造的に関連する。全８つのシステイン
が、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの全てのメンバー内で保存されていることは
特に重要である（図３Ａ〜３Ｄの囲まれた領域を参照のこと）。さらに、ＰＤＧ
Ｆ／ＶＥＧＦファミリーのサイン、ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣ（配列番号２９
）は、本明細書中に開示される全ての脈管形成タンパク質で保存される（図３Ａ
〜３Ｄを参照のこと）。The angiogenic proteins of the present invention are all structurally related. It is particularly important that all eight cysteines are conserved within all members of the VEGF / PDGF family (see boxed regions in Figures 3A-3D). Furthermore, PDG
F / VEGF family signature, PXCVXXXRCXGCC (SEQ ID NO: 29
Is conserved in all angiogenic proteins disclosed herein (FIG. 3A).
~ 3D).

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１８７[Name of item to be corrected] 0187

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０１８７】 図３Ａ〜３Ｄのそれぞれの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
、以下を含み得る：それぞれの成熟ポリペプチドのコード配列のみ；それぞれの
成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダーま
たは分泌配列、あるいはプロタンパク質配列）；それぞれの成熟ポリペプチドの
コード配列（および、必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配列（
例えば、イントロン、または成熟ポリペプチドのコード配列の５’側および／ま
たは３’側の非コード配列）。The polynucleotide encoding each mature polypeptide of FIGS. 3A-3D may include: coding sequence of each mature polypeptide only; coding sequence of each mature polypeptide and additional coding sequences (eg, A leader or secretory sequence, or a proprotein sequence); the coding sequence (and optionally further coding sequence) and non-coding sequence of each mature polypeptide (
(For example, introns, or non-coding sequences 5'and / or 3'of the mature polypeptide coding sequence).

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１８９[Correction target item name] 0189

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０１８９】 本発明はさらに、図３Ａ〜３Ｄの推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオ
チドの改変体に関する。このポリヌクレオチドの改変体は、このポリヌクレオチ
ドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはこのポリヌクレオチドの天然に存在
しない改変体であり得る。The present invention further relates to variants of the polynucleotides described herein above which encode fragments, analogs and derivatives of the polypeptides having the deduced amino acid sequences of Figures 3A-3D. The variant of the polynucleotide can be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１９０[Correction target item name] 0190

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０１９０】 従って、本発明は、図３Ａ〜３Ｄに示されるのと同じそれぞれの成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびに図３Ａ〜３Ｄのポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログをコードする、このようなポリヌクレオチド
の改変体を含む。このようなヌクレオチド改変体としては、欠失改変体、置換改
変体、および付加または挿入改変体が挙げられる。Accordingly, the present invention thus encodes a polynucleotide encoding the same respective mature polypeptides shown in Figures 3A-3D, as well as fragments, derivatives or analogs of the polypeptides of Figures 3A-3D, thus Various polynucleotide variants. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and addition or insertion variants.

【手続補正５】[Procedure Amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０２２７[Name of item to be corrected] 0227

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０２２７】 （脈管形成ポリペプチド） 本発明はさらに、図３Ａ〜３Ｄの推測されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に
関する。Angiogenic Polypeptides The present invention further relates to polypeptides having the deduced amino acid sequences of Figures 3A-3D, as well as fragments, analogs and derivatives of such polypeptides.

【手続補正６】[Procedure correction 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０２３０[Correction target item name] 0230

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０２３０】 構造的ドメインまたは機能的ドメインによって特徴付けられた脈管形成ポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドのフラグメントはまた、好ましい。このようなフ
ラグメントは、αへリックスおよびαへリックス形成領域、βシートおよびβシ
ート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親
水性領域、疎水性領域、α−両親媒性領域、β−両親媒性領域、可撓性領域、表
面形成領域、基質結合領域および高抗原性指標領域を含む。保存ドメインに含ま
れる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もし
くは２４のポリペプチドフラグメントは、特に本発明によって意図される（図３
Ａ〜３Ｄを参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオ
チドフラグメントもまた、意図される。Fragments of angiogenic polypeptides and polynucleotides characterized by structural or functional domains are also preferred. Such fragments include α-helix and α-helix forming regions, β-sheet and β-sheet forming regions, turns and turn-forming regions, coils and coil-forming regions, hydrophilic regions, hydrophobic regions, α-amphipathic regions. , Β-amphipathic region, flexible region, surface forming region, substrate binding region and high antigenicity indicator region. Polypeptide fragments of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24 contained in the conserved domain are specifically contemplated by the present invention (FIG. 3).
See A-3D). Moreover, polynucleotide fragments encoding these domains are also contemplated.

【手続補正７】[Procedure Amendment 7]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３６７[Name of item to be corrected] 0367

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【０３６７】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３
５を参照のこと。従って、図３Ａ〜３Ｄに示す脈管形成タンパク質の５’または
３’の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、脈管形
成タンパク質をコードする内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプロ
ーチに使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチド
は、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的
なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビター
であるが、本発明に従って使用され得る。脈管形成ｍＲＮＡの５’領域、３’領
域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず
、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして
好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定
の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少
なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０
ヌクレオチドである。Oligonucleotides that are complementary to the 5'end of the message (eg, 5'untranslated sequences up to and including the AUG start codon) should work most efficiently in inhibiting translation. is there. However, sequences complementary to the 3'untranslated sequences of mRNAs have likewise been shown to be effective in inhibiting translation of mRNAs. Generally, Wagner, R .; , 1994, Nature 372: 333-33.
See 5. Thus, oligonucleotides complementary to either the 5'or 3'untranslated noncoding regions of the angiogenic proteins shown in Figures 3A-3D inhibit translation of the endogenous mRNA encoding the angiogenic protein. It can be used for antisense approaches. Oligonucleotides complementary to the 5'untranslated region of the mRNA should include the complement of the AUG start codon. Antisense oligonucleotides complementary to the mRNA coding region, although less efficient inhibitors of translation, can be used in accordance with the present invention. Whether designed to hybridize to the 5'region, 3'region or coding region of angiogenic mRNA, the antisense nucleic acid should be at least 6 nucleotides in length, and preferably 6 Is an oligonucleotide ranging from about 50 nucleotides in length. In certain aspects, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.
It is a nucleotide.

【手続補正８】[Procedure Amendment 8]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】図３[Name of item to be corrected] Figure 3

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図３】 図３Ａ〜３Ｄは、ＰＤＧＦ−Ａ（配列番号２）、ＰＤＧＦ−Ｂ（配列番号４）
、ＰｌＧＦ（配列番号６）、ＰｌＧＦ−２（配列番号８）、ＧＤＧＦ（配列番号
１０）、ＶＥＧＦ（配列番号１２）、ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号１４）、ＶＥＧＦ
−２（配列番号１６）、ＶＥＧＦ−３（配列番号１８）、ＶＥＧＦ−Ｄ（配列番
号２０）、ＶＥＧＦ−Ｄ１（配列番号２２）、およびＶＥＧＦ−Ｅ（配列番号２
４）の間のアミノ酸配列相同性の模式図である。箱型の領域は、保存配列および
８個の保存システイン残基の位置を示す。3A-3D are PDGF-A (SEQ ID NO: 2), PDGF-B (SEQ ID NO: 4).
, PlGF (SEQ ID NO: 6), PlGF-2 (SEQ ID NO: 8), GDGF (SEQ ID NO: 10), VEGF (SEQ ID NO: 12), VEGF-A (SEQ ID NO: 14), VEGF
-2 (SEQ ID NO: 16), VEGF-3 (SEQ ID NO: 18), VEGF-D (SEQ ID NO: 20), VEGF-D1 (SEQ ID NO: 22), and VEGF-E (SEQ ID NO: 2)
FIG. 4 is a schematic diagram of amino acid sequence homology between 4). Boxed regions indicate the positions of conserved sequences and 8 conserved cysteine residues.

【手続補正９】[Procedure Amendment 9]

【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing

【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All drawings

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図１】 [Figure 1]

【図２】 [Fig. 2]

【図３】 [Figure 3]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 9/04 ４Ｃ０８４ 7/06 9/06 ４Ｈ０４５ 9/04 9/08 9/06 9/10 9/08 １０１ 9/10 9/12 １０１ 11/00 9/12 11/06 11/00 13/12 11/06 17/00 １０１ 13/12 17/02 17/00 １０１ 19/02 17/02 21/04 19/02 25/00 21/04 25/16 25/00 25/28 25/16 29/00 25/28 １０１ 29/00 31/00 １０１ 31/04 31/00 31/12 31/04 35/00 31/12 37/02 35/00 37/06 37/02 43/00 １０５ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/515 43/00 １０５ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/515 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/24 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 フ， ジン−シャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040， マウンテン ビュー， ナンバー420， オルテガ アベニュー 550 (72)発明者 カオ， リャン アメリカ合衆国 メリーランド 20814， ベゼスダ， スイート 820エス， プ ークス ヒル ロード 5225 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ05 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR74 QR80 QS05 4B064 AG13 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA01 DA27 DA41 DA58 ZA012 ZA022 ZA152 ZA162 ZA222 ZA362 ZA382 ZA392 ZA402 ZA422 ZA432 ZA452 ZA512 ZA532 ZA552 ZA592 ZA812 ZA892 ZA902 ZA942 ZA962 ZB072 ZB112 ZB152 ZB212 ZB262 ZB312 ZB332 ZB352 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (51) Int.Cl. 7 Identification Code FI Theme Coat (Reference) A61P 7/04 A61P 9/04 4C084 7/06 9/06 4H045 9/04 9/08 9/06 9 / 10 9/08 101 9/10 9/12 101 11/00 9/12 11/06 11/00 13/12 11/06 17/00 101 13/12 17/02 17/00 101 19/02 17/02 21/04 19/02 25/00 21/04 25/16 25/00 25/28 25/16 29/00 25/28 101 29/00 31/00 101 31/04 31/00 31/12 31/04 35/00 31/12 37/02 35/00 37/06 37/02 43/00 105 37/06 C07K 14/515 43/00 105 16/22 C07K 14/515 C12N 1/15 16/22 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/02 5/10 1/68 C12P 21/02 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z 1/68 33 / 53 DG01N 33/15 33/68 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 A61K 37/2 4 33/68 C12N 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT , SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL , IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, A, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA , UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Rosen, Craig A. United States Maryland 20882, Leightonsville, Rolling Hill Road 22400 (72) Inventor Ruben, Stephen M. United States Maryland 20832, Ornay, Heritage Hills Drive 18528 (72) Inventor Hu, Jin-shan United States California 94040, Mountain View, Number 420, Ortega Avenue 550 (72) Inventor Khao, Liang United States Maryland 20814, Bethesda, Suite 820 es, up Kusu Hill Road 5225 F-term (reference) 2G045 AA40 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ05 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR74 QR80 QS05 4B064 AG13 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 ZA ZA ZA 522 ZA 522 ZA 522 ZA 522 ZA 152 ZA 152 DA 02 DA 01 DA 27 DA 41 ZA452 ZA512 ZA532 ZA552 ZA592 ZA812 ZA892 ZA902 ZA942 ZA962 ZB072 ZB112 ZB152 ZB212 ZB262 ZB312 ZB332 ZB352 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘのポリヌクレオチドフラグメントであって、配列番号Ｘにハ
イブリダイズし得る、ポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド
であって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチドであ
って、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドで
あって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配
列番号Ｘにハイブリダイズし得る、生物学的活性を有する、ポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号Ｘの改変体である、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号Ｘの対立遺伝子改変体である、ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号Ｙの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
クレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。1. An isolated nucleic acid molecule, which comprises: (a) a polynucleotide fragment of SEQ ID NO: X that is capable of hybridizing to SEQ ID NO: X; (b) SEQ ID NO: Y. (C) a polynucleotide encoding a polypeptide domain of SEQ ID NO: Y, which hybridizes to SEQ ID NO: X. (D) a polynucleotide that encodes the polypeptide epitope of SEQ ID NO: and is capable of hybridizing to SEQ ID NO: X; (e) a polynucleotide that encodes the polypeptide of SEQ ID NO: Organism that is a nucleotide and is capable of hybridizing to SEQ ID NO: X (F) a polynucleotide that is a variant of SEQ ID NO: X; (g) a polynucleotide that is an allelic variant of SEQ ID NO: X; (h) a species homologue of SEQ ID NO: Y (I) a polynucleotide capable of hybridizing to any one of the polynucleotides specified in (a) to (h) under stringent conditions, wherein the polynucleotide is Has a nucleotide sequence that is at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of a polynucleotide that does not hybridize under stringent conditions to a nucleic acid molecule that has a nucleotide sequence with only A residues or only T residues. An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、分泌タンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the polynucleotide fragment comprises a nucleotide sequence encoding a secreted protein. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｙとして同
定される配列をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号Ｘにハイブリダ
イズし得る、ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。3. The isolated of claim 1, wherein the polynucleotide fragment comprises a nucleotide sequence that encodes a sequence identified as SEQ ID NO: Y and is capable of hybridizing to SEQ ID NO: X. Nucleic acid molecule. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｘの全体の
ヌクレオチド配列であって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る配列を含む、請
求項１に記載の単離された核酸分子。4. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the polynucleotide fragment comprises the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: X, which sequence is hybridizable to SEQ ID NO: X. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。5. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, wherein the nucleotide sequence comprises consecutive nucleotide deletions from either the C-terminus or the N-terminus. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。6. The isolated nucleic acid molecule of claim 3, wherein the nucleotide sequence comprises consecutive nucleotide deletions from either the C-terminus or the N-terminus. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
ー。7. A recombinant vector comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 1. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
胞を作製する方法。8. A method of making a recombinant host cell comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 1. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
。9. A recombinant host cell produced by the method of claim 8. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。10. The recombinant host cell of claim 9, which comprises a vector sequence. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ； （ｅ）配列番号Ｙの分泌形態； （ｆ）配列番号Ｙの全長タンパク質； （ｇ）配列番号Ｙの改変体； （ｈ）配列番号Ｙの対立遺伝子改変体；あるいは （ｉ）配列番号Ｙの種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
単離されたポリペプチド。11. An isolated polypeptide comprising: (a) a polypeptide fragment of SEQ ID NO: Y; (b) a polypeptide fragment of SEQ ID NO: Y having biological activity; (c) a sequence. (D) polypeptide epitope of SEQ ID NO: (e) secreted form of SEQ ID Y; (f) full-length protein of SEQ ID Y; (g) variant of SEQ ID Y; A) an allelic variant of SEQ ID NO :; or (i) a species homolog of SEQ ID Y, comprising an amino acid sequence at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of:
Isolated polypeptide. 【請求項１２】 前記分泌形態または前記全長タンパク質が、Ｃ末端または
Ｎ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の単離
されたポリペプチド。12. The isolated polypeptide of claim 11, wherein the secreted form or the full-length protein comprises a contiguous amino acid deletion from either the C-terminus or the N-terminus. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
合する、単離された抗体。13. An isolated antibody that specifically binds to the isolated polypeptide of claim 11. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
組換え宿主細胞。14. Expressing the isolated polypeptide of claim 11.
Recombinant host cell. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。15. A method for producing an isolated polypeptide, comprising: (a) culturing the recombinant host cell of claim 14 under conditions such that the polypeptide is expressed. A step; and (b) recovering the polypeptide. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
ド。16. A polypeptide produced by the method of claim 15. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和するための方法であ
って、請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチ
ドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。17. A method for preventing, treating or ameliorating a medical condition, wherein a therapeutically effective amount of the polypeptide of claim 11 or the polynucleotide of claim 1 is administered to a mammalian subject. A method comprising the step of administering to. 【請求項１８】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。18. A method of diagnosing a pathological condition or susceptibility to a pathological condition in a subject, comprising: (a) determining the presence or absence of a mutation in the polynucleotide of claim 1. And (b) diagnosing a pathological condition, or susceptibility to a pathological condition, based on the presence or absence of the mutation. 【請求項１９】 被験体において病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
在または量を決定する工程；および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。19. A method of diagnosing a pathological condition or susceptibility to a pathological condition in a subject, comprising: (a) the presence of expression of the polypeptide of claim 11 in a biological sample. Or a step of determining the amount; and (b) diagnosing a pathological condition or susceptibility to the pathological condition based on the presence or amount of expression of the polypeptide. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
を同定する方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する
工程、 を包含する、方法。20. A method of identifying a binding partner for the polypeptide of claim 11, comprising: (a) contacting the polypeptide of claim 11 with a binding partner;
And (b) determining whether the binding partner results in the activity of the polypeptide. 【請求項２１】 配列番号ＹのｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。21. A gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: Y. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号Ｘを発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。22. A method of identifying activity in a biological assay, comprising:
Wherein the method comprises: (a) expressing SEQ ID NO: X in cells; (b) isolating the supernatant; (c) detecting activity in a biological assay; and (d) ) Identifying a protein in the supernatant that has the activity. 【請求項２３】 請求項２０に記載の方法によって産生される、産物。23. A product produced by the method of claim 20.
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