JP2003507345A - Method of delivering therapeutic agent using dextrin solution - Google Patents

Method of delivering therapeutic agent using dextrin solution

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Abstract

The invention herein described relates to the delivery of therapeutic agents and in particular genetic material, to an animal in combination with dextrin.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （発明の分野） 本発明は治療上の処置に関し、そして特にヒトを含めた動物被験体に対するそ
の被験体の体腔を経由した生物学的活性薬剤の送達に関する。薬剤は、様々な様
式で、例えば遺伝子治療および免疫治療に関連して活性であり得る。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to therapeutic treatments and, in particular, to the delivery of biologically active agents to animal subjects, including humans, through the body cavity of the subject. The agent may be active in various ways, eg in connection with gene therapy and immunotherapy.

【０００２】 （発明の背景） 生物学的活性薬剤は、経腸的（経口的、直腸的または舌下的）、または非経口
的（静脈内、皮下または吸入による）を含めて様々な方法で動物被験体中に導入
され得る。BACKGROUND OF THE INVENTION Biologically active agents can be administered in a variety of ways including enterally (orally, rectally or sublingually) or parenterally (intravenously, subcutaneously or by inhalation). It can be introduced into an animal subject.

【０００３】 本発明は、生物学的活性薬剤の非経口投与に関し、特に例えば腹膜あるいは眼
窩などの体腔を経由して動物被験体に生物学的活性薬剤を導入する工程によって
である。本明細書中以下において腹膜に言及するが、本発明は、他の体腔を経由
する生物学的活性薬剤の送達への適用を有すと理解されるべきである。The present invention relates to parenteral administration of biologically active agents, particularly by introducing the biologically active agent into an animal subject via a body cavity such as, for example, the peritoneum or the orbit. Although referred to herein below as the peritoneum, it should be understood that the present invention has application to the delivery of biologically active agents via other body cavities.

【０００４】 ある水溶性溶液の腹腔への導入工程は、腎不全に苦しむ患者の処置に有益とな
り得ることは公知である。そのような治療は、腹膜透析として公知である。その
溶液は、血漿中にある電解質と類似した電解質を含有している。その溶液はまた
、浸透物質、通常はブドウ糖、も含有している。この浸透物質は、腹膜を横切っ
て所望の程度の浸透圧を作り出すに十分な濃度で存在する。この浸透圧の影響下
、腹膜を横切って交換が行われ、正常な腎臓機能の欠乏により血液に蓄積された
老廃物、例えば尿素およびクレアチニンの血流からの回収が結果として行われる
。この交換が起こっている間、腹膜を横切って溶液から血液へのブドウ糖の純移
転もまた起こり、このことが溶液の浸透圧重量モル濃度低下を引き起こす。この
ため初期の溶液の浸透圧重量モル濃度は相当に高くされなければならない（十分
高い濃度のブドウ糖を使用して）。これはその溶液が、回収され、そして新鮮な
溶液によって交換されざるを得なくなる前に適切な時間透析を生じさせ続けるた
めである。It is known that the step of introducing an aqueous solution into the abdominal cavity may be beneficial in treating patients suffering from renal failure. Such treatment is known as peritoneal dialysis. The solution contains an electrolyte similar to that found in plasma. The solution also contains an osmotic agent, usually glucose. The osmotic agent is present in a concentration sufficient to create the desired degree of osmotic pressure across the peritoneum. Under the influence of this osmotic pressure, exchange takes place across the peritoneum, resulting in the recovery from the bloodstream of waste products accumulated in the blood due to lack of normal renal function, such as urea and creatinine. While this exchange is occurring, a net transfer of glucose from the solution to the blood across the peritoneum also occurs, which causes a decrease in the osmolality of the solution. For this reason the osmolality of the initial solution has to be increased considerably (using a sufficiently high concentration of glucose). This is because the solution continues to undergo dialysis for a suitable time before it has to be collected and replaced by fresh solution.

【０００５】 他の浸透物質は腹膜透析使用のため提案されてき、そして近年ではデキストリ
ン（グルコースのデンプン加水分解物ポリマー）が使用されてきた。デキストリ
ンは腹腔内に滴注されると、リンパ系を経由して緩徐に吸収され最終的に末梢循
環に到着する。デキストリンの構造は、循環中にアミラーゼがその分子をオリゴ
糖に破壊するような構造である。オリゴ糖はグルコースへのさらなる代謝によっ
て除去される。Other penetrants have been proposed for peritoneal dialysis use, and in recent years dextrin, a starch hydrolyzate polymer of glucose, has been used. When dextrin is instilled intraperitoneally, it is slowly absorbed via the lymphatic system and eventually reaches the peripheral circulation. The structure of dextrin is such that amylase destroys its molecule into oligosaccharides in circulation. Oligosaccharides are removed by further metabolism to glucose.

【０００６】 デキストリン溶液は腹膜を経由した身体への薬物の送達のための媒体として提
唱されてきた。ＧＢ−Ａ−２２０７０５０において、そのような溶液は、経腸的
投与では十分でない薬物の腹腔内投与のために提案されている。そのようなアプ
ローチはエリスロポエチンおよび成長ホルモンのようなペプチド薬物の送達に特
に有益であると記載されている。セファロスポリン抗体もまた言及される。水溶
液中のデキストリン濃度は、好ましくは０．５から１０％ ｗ／ｖであり、そし
てエリスロポエチンの送達のための組成物の例は約１０％ ｗ／ｖのデキストリ
ン濃度を有すると記載されている。Dextrin solutions have been proposed as a vehicle for delivery of drugs to the body via the peritoneum. In GB-A-2207050 such solutions have been proposed for intraperitoneal administration of drugs where enteral administration is not sufficient. Such an approach is described as being particularly beneficial for the delivery of peptide drugs such as erythropoietin and growth hormone. Cephalosporin antibodies are also mentioned. The dextrin concentration in the aqueous solution is preferably 0.5 to 10% w / v, and an example of a composition for delivery of erythropoietin is described as having a dextrin concentration of about 10% w / v.

【０００７】 遺伝子治療はとりわけ、特定の疾患の状態を予防または変化させるため患者の
特定の標的細胞への遺伝物質の伝達に関する。この処置は、治療遺伝物質の送達
に順応し、しばしばベクターと称される、キャリアまたは送達ビヒクルの使用を
包含する。これらのベクターは普通ウィルスであるが、非ウィルスベクターもま
た公知である。免疫遺伝子治療は遺伝子ベースワクチンの提供を含む免疫療法の
ための遺伝子の使用を包含する。Gene therapy relates, inter alia, to the transfer of genetic material to specific target cells of a patient to prevent or alter certain disease states. This treatment involves the use of carriers or delivery vehicles that are adapted to the delivery of therapeutic genetic material and are often referred to as vectors. These vectors are usually viruses, but non-viral vectors are also known. Immune gene therapy involves the use of genes for immunotherapy, including the provision of gene-based vaccines.

【０００８】 腹腔の中皮内層は広い表面を覆う細胞の内層を有する。腹腔中皮は優れたリン
パ系の排膿法を有し、また高分子の拡散を可能にする。ラットの腹腔中皮へのア
デノウイルス媒介遺伝子移入は可能であると示された（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、
Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
ｔｏ Ｄｅｌｉｖｅｒ α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙ
ｓｔｅｍｉｃ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， ９９４；１０：３６９−３７７））。The mesothelial lining of the abdominal cavity has a large surface lining of cells. The peritoneal mesothelium has excellent lymphatic drainage and allows macromolecules to diffuse. Adenovirus-mediated gene transfer into rat peritoneal mesothelium has been shown to be possible (Setoguchi et al.,
Intraperitoneal in vivo Gene Therapy
to Deliver α1-antitrypsin to the sy
structural circulation. (American Journal
l of Respiratory Cellular Molecular
Biology, 994; 10: 369-377)).

【０００９】 典型的に、遺伝子治療物質を体腔を経由して患者へ導入するため選択された媒
体は、緩衝化生理食塩水溶液、例えばウイルスのリン酸緩衝化生理食塩水（ｖＰ
ＢＳ）であってもよい。しかしながら、そのような溶液の使用は特に効果的であ
るとは、立証されておらず、溶液の安定性、体腔中の滞留時間および導入遺伝子
発現の有効性に関して問題が生じている。[0009] Typically, the vehicle of choice for introducing the gene therapy agent into the patient via the body cavity is a buffered saline solution, such as viral phosphate buffered saline (vP).
BS). However, the use of such solutions has not been proven to be particularly effective and problems have arisen with regard to solution stability, residence time in body cavities and effectiveness of transgene expression.

【００１０】 （発明の記載） 本発明は動物被験体への薬用の薬剤以外の治療薬剤の送達方法を提供する。そ
の方法は、動物被験体の体腔中に治療薬剤およびデキストリン溶液を導入する工
程を包含する。DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method of delivering a therapeutic agent other than a medicated agent to an animal subject. The method involves introducing a therapeutic agent and a dextrin solution into the body cavity of an animal subject.

【００１１】 従って、本発明は例えばＧＢ−Ａ−２２０７０５０が関係するような薬物の性
質を有する生物学的活性薬剤には関係しない。むしろ、遺伝子治療薬剤および免
疫治療薬剤のような間接的に作用する薬剤に関係する。後者としては例えば、サ
イトカイン遺伝子に関連する免疫治療薬剤が挙げられる。本発明が関する薬剤と
しては、ウイルス性および非ウイルス性ベクター、リポソーム／カチオン性の脂
質、ならびにインターロイキン−２と遺伝子のような生物学的活性薬剤との結合
体のような構成物によって保有された、または被包された遺伝子が挙げられる。
ベクターは、典型的にベクターによって保有された遺伝子の発現に適合される。Thus, the present invention does not relate to biologically active agents that have drug properties such as GB-A-2207050 is concerned. Rather, it relates to indirectly acting agents such as gene therapy agents and immunotherapeutic agents. Examples of the latter include immunotherapeutic agents related to cytokine genes. Agents with which the invention is concerned may be carried by constituents such as viral and non-viral vectors, liposomes / cationic lipids, and conjugates of interleukin-2 with biologically active agents such as genes. Or encapsulated genes.
The vector is typically adapted for expression of the gene carried by the vector.

【００１２】 典型的に、前記の適合としては、例としてであって制限としてではく、細胞／
組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供が挙げられ
る。これらのプロモーター配列は細胞／組織特異的、誘導的または構成的であり
得る。[0012] Typically, said adaptations include, but are not limited to, cells /
Providing a transcription control sequence (promoter sequence) that mediates tissue-specific expression can be mentioned. These promoter sequences can be cell / tissue specific, inducible or constitutive.

【００１３】 プロモーターは分野の認識用語であり、明瞭さのため、例としてだけ、そして
制限としてではなく提供される次のような特色を有する。エンハンサーエレメン
トは遺伝子の転写開始部位の５’側にしばしば見られるシス作用核酸配列である
（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’に見出されまたはイントロンの配列中
にさえ位置され得る）。エンハンサーはこのエンハンサーが連結する遺伝子の転
写速度を増加させるため機能する。エンハンサー活性はエンハンサーエレメント
に特異的に結合することが示されたトランス作用転写因子（ポリペプチド）に反
応する。転写因子の結合／活性（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｄａｖｉｄ Ｓ Ｌａｔｃｈｍａｎ， Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）は例えば中
間代謝産物（例えばグルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば光、熱）が
挙げられるが、それに限定されるわけではない多くの生理的／環境的な合図に反
応する。Promoter is a term of art recognized and has the following features, provided for clarity only, and not by way of limitation. Enhancer elements are cis-acting nucleic acid sequences often found 5'to the transcription start site of genes (enhancers can also be found 3'to the gene sequence or even located within intron sequences). Enhancers function by increasing the transcription rate of genes to which they are linked. Enhancer activity responds to trans-acting transcription factors (polypeptides) that have been shown to bind specifically to enhancer elements. Transcription factor binding / activity (Eukaryotic Transcript
Ion Factors, David S Latchman, Acade
mic Press Ltd, San Diego) include, but are not limited to, many physiological / environmental agents including, but not limited to, intermediate metabolites (eg glucose, lipids), environmental effectors (eg light, heat). Respond to a signal.

【００１４】 プロモーターエレメントはまた、転写開始部位を選択するように機能するいわ
ゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む
。これらの配列はまた、特にＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にす
るために機能するポリペプチドに結合する。Promoter elements also include so-called TATA boxes and RNA polymerase initiation selection (RIS) sequences that function to select transcription start sites. These sequences also bind to polypeptides that function specifically to facilitate transcription initiation selection by RNA polymerase.

【００１５】 適合はまた、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかの中の上記ベクター
の維持を容易にする選択マーカーおよび自律的複製配列の提供を包含する。自律
的に維持されたベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。エピソームベクタ
ーは大きなＤＮＡフラグメント（３０−５０ｋｂ ＤＮＡ）を取り込むことがで
きるのでエピソームベクター分子は望ましい。この型のエピソームベクターはＷ
Ｏ９８／０７８７６に記載されている。Adaptation also includes the provision of selectable markers and autonomously replicating sequences that facilitate the maintenance of the vector in either eukaryotic cells or prokaryotic hosts. Vectors that are maintained autonomously are called episomal vectors. Episomal vector molecules are desirable because episomal vectors can incorporate large DNA fragments (30-50 kb DNA). This type of episomal vector is W
O98 / 07876.

【００１６】 ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合は転写終止／ポリアデニ
ル化配列の提供を包含する。これはまた重シストロン化（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉ
ｃ）または複シストロン化（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現カセット中
に配列されたベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供も包含する。発現制御配列はまた、
いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）も含む。これらはマウス中でトランスジェ
ニック構築物としてアッセイする際に連結遺伝子に位置非依存性の、コピー数依
存発現を与える調節エレメントである。ＬＣＲは隣接する異質染色質のサイレン
シング効果から導入遺伝子を保護した調節エレメントを有する。Ｇｒｏｓｖｅｌ
ｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７），５１：９７５−９８５。Adaptations that facilitate expression of the vector-encoded gene include the provision of transcription termination / polyadenylation sequences. This is also a heavy cistronization (bicistroni)
c) or provision of an internal ribosome entry site (IRES) that functions to maximize expression of the gene encoded by the vector arranged in a multi-cistronic expression cassette. The expression control sequence also
It also includes the so-called locus control region (LCR). These are regulatory elements that confer position-independent, copy number-dependent expression on the linked genes when assayed in mice as transgenic constructs. LCRs have regulatory elements that protect the transgene from the silencing effects of adjacent heterochromatin. Grosvel
d et al., Cell (1987), 51: 975-985.

【００１７】 発現制御配列はまた、遍在性クロマチン開口エレメント（ＵＣＯＥ）を含む。
ＷＯ／ＧＢ００／０５３９３を参照のこと。ＵＣＯＥは遍在的に発現されるハウ
スキーピング遺伝子から独占的になる遺伝子座を横切ってオープンクロマチン構
造を樹立する原因である核酸エレメントである。これらのエレメントはＬＣＲに
由来しない。ＵＣＯＥは、クロマチンを開口するかまたは開口状態でクロマチン
を維持し、そして少なくとも２つの異なった組織型の細胞中の作動可能に連結さ
れた遺伝子の再現性のある発現を促進するポリヌクレオチドである。Expression control sequences also include the ubiquitous chromatin opening element (UCOE).
See WO / GB00 / 05393. UCOE is a nucleic acid element responsible for establishing an open chromatin structure across a locus that is exclusively from a ubiquitously expressed housekeeping gene. These elements are not derived from LCR. UCOEs are polynucleotides that open or maintain chromatin in the open state and promote reproducible expression of operably linked genes in cells of at least two different tissue types.

【００１８】 これらの適合は当該分野で周知である。一般に発現ベクター構築および組換え
ＤＮＡ技術に関して発表された著しい量の文献が存在する。以下を参照のこと：
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，
ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ， Ｆ （１９８７） ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；
ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９４）。These adaptations are well known in the art. In general there is a significant amount of literature published on expression vector construction and recombinant DNA technology. See below:
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harb
our Laboratory, Cold Spring Harbour,
NY and references therein; Marston, F (1987) DNA.
Cloning Technologies: A Practical App
roach Vol III IRL Press, Oxford UK;
DNA Cloning: FM Ausubel et al., Current P
rotocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, Inc. (1994).

【００１９】 ベクターは典型的にウイルスベースであり、そして以下を含む。例としてアデ
ノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチ
ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスがあるが、これらに制限され
るわけではない。Vectors are typically virus-based and include: Examples include, but are not limited to, adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, lentivirus, vaccinia virus, baculovirus.

【００２０】 ベクターはまた、非ウイルス性でもあり得、当業者に容易に利用可能な多くの
商業的な供給源から利用可能である。Vectors can also be non-viral and are available from many commercial sources readily available to those of skill in the art.

【００２１】 本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオ
チド配列を包含する。The present invention also includes antisense nucleotide sequences, including antisense oligonucleotides.

【００２２】 本明細書中で使用する場合、用語“アンチセンスオリゴヌクレオチド”または
“アンチセンス”はオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド
、修飾されたオリゴリボヌクレオチドまたは修復されたオリゴデオキシリボヌク
レオチドであるオリゴヌクレオチドを記述し、生理的条件下で特定の遺伝子を有
するＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、その結果そ
の遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチ
ドを記述する。アンチセンス分子は標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの際
に標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるように設計される。当業者はアンチセン
スオリゴヌクレオチドの正確な長さ、およびその標的との相補性の程度は、標的
の配列およびこの配列を含む特定の塩基を含む選択された特定の標的に依存する
ことを認識する。As used herein, the term “antisense oligonucleotide” or “antisense” is an oligoribonucleotide, oligodeoxyribonucleotide, modified oligoribonucleotide or repaired oligodeoxyribonucleotide. And oligonucleotides that hybridize under physiological conditions to DNA having a particular gene or mRNA transcript of that gene, thereby inhibiting transcription of that gene and / or translation of its mRNA. Antisense molecules are designed to prevent transcription or translation of the target gene upon hybridization with the target gene. One of skill in the art will recognize that the exact length of the antisense oligonucleotide and its degree of complementarity with its target will depend on the sequence of the target and the particular target selected, including the particular bases containing this sequence. .

【００２３】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で標的へ選択的に結
合できるように（言いかえれば、生理学的条件下で、標的細胞中の任意の他の配
列へよりも標的配列に実質的によりハイブリダイズするように）構築され、そし
て配列されることが、好ましい。The antisense oligonucleotide is capable of selectively binding to a target under physiological conditions (in other words, under physiological conditions, it binds to the target sequence more than any other sequence in the target cell). Constructed and arranged to be substantially more hybridizable).

【００２４】 阻害について十分に選択的にかつ強力であるために、そのようなアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、標的に相補的な、少なくとも７（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０−８４４，１９９６）お
よびより好ましくは少なくとも１５の連続した塩基を含むべきである。もっとも
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが２０から３０塩基の相補的配列
を含む。In order to be sufficiently selective and potent for inhibition, such antisense oligonucleotides should be at least 7 complementary to the target (Wagner et al., Na.
pure Biotechnology 14: 840-844, 1996) and more preferably at least 15 contiguous bases. Most preferably, the antisense oligonucleotide comprises a complementary sequence of 20 to 30 bases.

【００２５】 遺伝子もしくはｍＲＮＡ転写物のどんな領域に対してもアンチセンスなオリゴ
ヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態においてはこのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは翻訳開始、転写開始あるいはプロモーター部位のようなＮ
末端もしくは５’上流部位に対応する。加えて、３’非翻訳領域は標的になり得
る。この３’非翻訳領域はシス作動配列を含むことが公知であり、この配列はｍ
ＲＮＡ分子の安定化に関与するタンパク質の結合部位として機能する。これらの
シス作動部位はしばしば前記安定化タンパク質を結合するように機能するヘアル
ープ構造を形成する。安定性調節のこの形態の周知の例は、ヒストンのｍＲＮＡ
により示され、ヒストンのｍＲＮＡのアバンダンスは少なくとも部分的に転写後
に制御される。Although antisense oligonucleotides can be selected for any region of the gene or mRNA transcript, in a preferred embodiment the antisense oligonucleotides are N-like, such as translation initiation, transcription initiation or promoter sites.
It corresponds to the terminal or 5'upstream site. In addition, the 3'untranslated region can be targeted. This 3'untranslated region is known to contain a cis-acting sequence, which is m
It functions as a binding site for proteins involved in the stabilization of RNA molecules. These cis-acting sites often form hair loop structures that function to bind the stabilizing protein. A well-known example of this form of stability regulation is histone mRNA.
, The histone mRNA abundance is at least partially post-transcriptionally regulated.

【００２６】 用語“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、当該分野で周知である通常のオ
リゴヌクレオチド合成方法を使用してインビトロで生産される物質、あるいは発
現ベクター構築物を使用して組換え的に合成されるオリゴヌクレオチドのいずれ
かとして解釈される。修飾されたオリゴヌクレオチドは以下の様式で解釈される
。The term “antisense oligonucleotide” is produced in vitro using conventional oligonucleotide synthesis methods well known in the art, or recombinantly synthesized using expression vector constructs. Interpreted as any of the oligonucleotides. The modified oligonucleotide is interpreted in the following manner.

【００２７】 本明細書中で使用される場合、用語“修飾オリゴヌクレオチド”は、以下のよ
うなオリゴヌクレオチドのことを記述する； ｉ）少なくともヌクレオチドの２つが合成ヌクレオシド間結合（すなわち、ある
ヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のリン酸ジエステ
ル結合以外の結合）して共有結合的に連結されるオリゴヌクレオチド。代替的に
または好ましくは、この結合があるヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチド
の５’末端との結合、もしくはあるヌクレオチドの３’末端と別のヌクレオチド
の３’末端との結合であり得る；および／あるいは ｉｉ）通常核酸に結合されないある化学基がオリゴヌクレオチドあるいはオリゴ
リボヌクレオチドに共有結合的に結合されたオリゴヌクレオチド。好ましい合成
ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロ
ジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデ
ート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチドおよび
カルボキシメチルエステルである。As used herein, the term “modified oligonucleotide” describes an oligonucleotide as follows: i) at least two of the nucleotides are synthetic internucleoside linkages (ie An oligonucleotide that is covalently linked by a bond other than a phosphodiester bond between the 5'end and the 3'end of another nucleotide. Alternatively or preferably, the linkage may be a 5'end of one nucleotide to a 5'end of another nucleotide, or a 3'end of one nucleotide to a 3'end of another nucleotide; And / or ii) an oligonucleotide in which a chemical group not normally bound to a nucleic acid is covalently bound to an oligonucleotide or oligoribonucleotide. Preferred synthetic internucleoside linkages are phosphorothioates, alkylphosphonates, phosphorodithioates, phosphates, alkylphosphonothioates, phosphoramidates, carbamates, phosphate triesters, acetamidates, peptides and carboxymethyl esters.

【００２８】 用語“修飾オリゴヌクレオチド”はまた、共有結合的に修飾された塩基および
／あるいは糖を持ったオリゴヌクレオチドも含む。例えば、修飾オリゴヌクレオ
チドは３’位置の水酸基以外および５’位置のリン酸基以外で低分子量有機基と
共有結合的に結合した、バックボーン糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する
。このように、修飾オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含
み得る。加えて、修飾オリゴヌクレオチドはリボースの代わりにアラビノースな
どの糖を含み得る。修飾オリゴヌクレオチドはまた、Ｃ−５プロピン修飾塩基な
どの塩基アナログを含み得る（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ １４：８４０−８４４，１９９６）。The term “modified oligonucleotide” also includes oligonucleotides with covalently modified bases and / or sugars. For example, modified oligonucleotides include oligonucleotides that have a backbone sugar covalently linked to a low molecular weight organic group other than a hydroxyl group at the 3'position and a phosphate group at the 5'position. As such, the modified oligonucleotide may include a 2'-O-alkylated ribose group. In addition, modified oligonucleotides may include sugars such as arabinose instead of ribose. Modified oligonucleotides may also include base analogs such as C-5 propyne modified bases (Wagner et al. Nature Biotech).
14: 840-844, 1996).

【００２９】 従って、本発明は薬学的調製物を考慮する。その調製物は、天然および／もし
くは修飾アンチセンス分子を、薬学的に受容可能なキャリア（例えばポリマー、
リポソーム／カチオン性脂質）と共に含む。そのアンチセンス分子は、調節が有
益な治療効果を生じるタンパク質をコードする核酸に対して相補的であり、かつ
生理学的条件下でハイブリダイズ可能である。Accordingly, the present invention contemplates pharmaceutical preparations. The preparation comprises a natural and / or modified antisense molecule, a pharmaceutically acceptable carrier (eg, a polymer,
(With liposome / cationic lipid). The antisense molecule is complementary to a nucleic acid encoding a protein whose modulation produces a beneficial therapeutic effect, and is hybridizable under physiological conditions.

【００３０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物の一部として投与され得る
。そのような薬学的組成物は、当該分野で公知の任意の標準的な生理学的および
／あるいは薬学的に受容可能なキャリア（例えばリポソーム）と組み合わせたア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。この組成物は、滅菌され、そして患
者への投与のため治療的に効果のある量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含
むべきである。用語“薬学的に受容可能な”は、活性成分の生物学的活性の有効
性を妨げない無毒性物質を意味する。用語“生理学的に受容可能な”は、生体系
（細胞、細胞培養物、組織もしくは生物体など）に適合性のある無毒性物質をい
う。Antisense oligonucleotides can be administered as part of a pharmaceutical composition. Such pharmaceutical compositions may comprise antisense oligonucleotides in combination with any standard physiologically and / or pharmaceutically acceptable carrier (eg liposomes) known in the art. The composition should be sterile and should contain a therapeutically effective amount of the antisense oligonucleotide for administration to a patient. The term "pharmaceutically acceptable" means a non-toxic material that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredients. The term "physiologically acceptable" refers to a non-toxic material that is compatible with biological systems (such as cells, cell cultures, tissues or organisms).

【００３１】 加えて、遺伝子治療ベクターおよび／もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは典型的にキャリア（例えばポリマー、カチオン性脂質／リポソームなど）と
組み合わされる。In addition, gene therapy vectors and / or antisense oligonucleotides are typically combined with carriers (eg, polymers, cationic lipids / liposomes, etc.).

【００３２】 カチオン性脂質の使用（例えばリポソーム、Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７） Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８４：ｐ７４１３）は
ＤＮＡを細胞内に導入する通常の方法となっている。脂質のカチオン性ヘッドは
導入されるＤＮＡの負に荷電した核酸骨格に結合する。この脂質／ＤＮＡ複合体
は細胞膜に結合し、そして細胞の中に結合したＤＮＡを導入するため細胞と融合
する。リポソームに媒介されるＤＮＡ移入は既存の方法を超えたいくつかの利点
がある。例えば、従来の化学的方法になじまない細胞は、リポソームに媒介され
る移入を使用することによってより簡単にトランスフェクションされる。Use of Cationic Lipids (eg Liposomes, Felgner (1987) P
roc. Natl. Acad. Sci USA, 84: p7413) is a common method for introducing DNA into cells. The cationic head of the lipid binds to the negatively charged nucleic acid backbone of the introduced DNA. This lipid / DNA complex binds to the cell membrane and fuses with the cell to introduce the bound DNA into the cell. Liposome-mediated DNA transfer has several advantages over existing methods. For example, cells that are not familiar with conventional chemical methods are more easily transfected by using liposome-mediated transfer.

【００３３】 代替的には、ペプチドベーストランスフェクション薬剤が有効である。ＷＯ９
６／４１６０６を参照のこと。Alternatively, peptide-based transfection agents are effective. WO9
See 6/41606.

【００３４】 リポソームは脂質ベースの小包であり、この小包は選択された治療薬剤を被包
し、次いでこの薬剤は患者の中に導入される。このリポソームは純粋リン脂質あ
るいはリン脂質およびホスホグリセリドの混合物のいずれかから生産される。典
型的にリポソームは２００ｎｍ未満の直径で生産され得、これによりリポソーム
が肺毛細管床を通過可能としている。さらに、リポソームのこの生化学性質は、
選択された組織に接近するための、血管膜を横切る透過性を与える。リポソーム
は相対的に短い半減期を有している。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で表面
を覆ったリポソームを含むいわゆるＳＴＥＡＬＴＨ（商標登録）リポソームが開
発された。このＰＥＧ処理されたリポソームは患者に投与した際に有意な半減期
の増加を示す。加えて、ＳＴＥＡＬＴＨ（商標登録）リポソームは細網内皮系へ
の取り込み減少および選択された組織への蓄積増強がみられる。いわゆる免疫リ
ポソームがまた、開発された。このリポソームは選択された細胞／組織へのベク
ター送達の特異性を増加するために、１つの抗体あるいは複数の抗体と脂質ベー
スの小包とを組み合わせる。Liposomes are lipid-based packets that encapsulate the therapeutic agent of choice, which is then introduced into the patient. The liposomes are produced either from pure phospholipids or a mixture of phospholipids and phosphoglycerides. Typically liposomes can be produced with a diameter of less than 200 nm, allowing them to pass through the pulmonary capillary bed. Moreover, this biochemical property of liposomes
It provides permeability across the vascular membrane to access selected tissues. Liposomes have a relatively short half-life. So-called STEALTH® liposomes have been developed which include liposomes coated with polyethylene glycol (PEG). The PEG-treated liposomes show a significant half-life increase when administered to patients. In addition, STEALTH® liposomes have reduced uptake into the reticuloendothelial system and enhanced accumulation in selected tissues. So-called immunoliposomes have also been developed. The liposomes combine one or more antibodies with a lipid-based package to increase the specificity of vector delivery to selected cells / tissues.

【００３５】 送達手段としてのリポソームの使用はＵＳ ５５８０５７５およびＵＳ ５５
４２９３５に記述してある。The use of liposomes as delivery means is described in US 5580575 and US 55
42935.

【００３６】 用語“デキストリン”はグルコースポリマーを意味し、このグルコースポリマ
ーはデンプンの加水分解によって生産され、そしてこのグルコースポリマーは主
にα−１，４結合を用いて結合されているグルコースユニットからなる。典型的
にデキストリンはコムギ、コメ、トウモロコシおよびタピオカなどの様々な自然
産物から得られるデンプンの加水分解によって生産される。α−１，４結合に加
え、特定のデキストリンにはある割合のα−１，６結合があり得、その量はデン
プン開始物質に依存する。α−１，６結合の生分解速度は典型的にα−１，４結
合の生分解速度を下回るため、多くの適用のためにはα−１，６結合の割合は１
０％未満および好ましくは５％未満であることが好ましい。The term “dextrin” means a glucose polymer, which is produced by the hydrolysis of starch, and which glucose polymer consists mainly of glucose units linked using α-1,4 bonds. . Dextrins are typically produced by the hydrolysis of starch obtained from various natural products such as wheat, rice, corn and tapioca. In addition to α-1,4 linkages, a certain dextrin may have a proportion of α-1,6 linkages, the amount of which depends on the starch starting material. Since the rate of biodegradation of α-1,6 bonds is typically lower than that of α-1,4 bonds, the proportion of α-1,6 bonds is 1 for many applications.
It is preferably less than 0% and preferably less than 5%.

【００３７】 どんなデキストリンも異なる鎖長のポリグルコース分子の混合物である。結果
として、１種類の数値でそのようなポリマーの分子量を十分に特徴付け得ない。
従って、様々な平均が使用され、最も一般的に使用されるのは、重量平均分子量
（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）である。Ｍｗは特にポリマーの高分子量の
ものの含有量の変化に対して感受性があり、一方Ｍｎはポリマーの低分子量中の
ものの変化によって大きく影響する。Any dextrin is a mixture of polyglucose molecules of different chain length. As a result, one number cannot fully characterize the molecular weight of such polymers.
Therefore, various averages are used, the most commonly used are weight average molecular weight (Mw) and number average molecular weight (Mn). Mw is particularly sensitive to changes in the content of high molecular weight polymers, while Mn is greatly influenced by changes in the low molecular weight of polymers.

【００３８】 デキストリンのＭｗが１，０００から２００，０００の範囲内であることが好
ましく、より好ましくは２，０００から５５，０００の範囲内である。The Mw of dextrin is preferably in the range of 1,000 to 200,000, more preferably in the range of 2,000 to 55,000.

【００３９】 用語“重合度”（ＤＰ）もまた、ポリマー混合物に関連して使用され得る。ひ
とつのポリマー分子に対しては、ＤＰはポリマーユニットの数を意味する。ＤＰ
の異なる分子の混合物に対しては、重量平均ＤＰおよび数平均ＤＰがＭｗおよび
Ｍｎに対応する。加えて、ＤＰはまた、特定の数より多いあるいは特定の数より
少ないＤＰの特定の割合のポリマーを持ったポリマー混合物を参照することによ
って、ポリマーを特徴付けるために使用され得る。The term “degree of polymerization” (DP) may also be used in connection with polymer mixtures. For one polymer molecule, DP means the number of polymer units. DP
The weight average DP and number average DP correspond to Mw and Mn for a mixture of different molecules. In addition, DP can also be used to characterize polymers by reference to polymer blends with a certain proportion of polymer above or below a certain number of DP.

【００４０】 本発明において、好ましくはデキストリンが１２より大きいＤＰのポリマーを
１５％より多く含み、そしてより好ましくは１２より大きいＤＰのポリマーを５
０％より多く含む。In the present invention, preferably the dextrin comprises more than 15% DP polymer greater than 12, and more preferably 5 DP polymer greater than 12.
Contains more than 0%.

【００４１】 好ましくは、デキストリンは、溶液中に１０％未満の量で存在している。[0041]   Preferably, the dextrin is present in the solution in an amount less than 10%.

【００４２】 好ましくは、デキストリンが溶液中に以下から選択された量で存在する；１％
（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ
）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０
％（ｗ／ｖ）。Preferably, the dextrin is present in the solution in an amount selected from: 1%
(W / v), 2% (w / v), 3% (w / v), 4% (w / v), 5% (w / v
), 6% (w / v), 7% (w / v), 8% (w / v), 9% (w / v), 10
% (W / v).

【００４３】 より好ましくは、デキストリンが２から５重量％存在し、最も好ましくは約４
重量％存在する。More preferably, the dextrin is present in 2 to 5% by weight, most preferably about 4%.
% By weight is present.

【００４４】 本発明はまた、動物被験体への薬用の薬剤以外の治療薬剤の送達に適した組成
物を提供し、この組成物は治療薬剤の水溶液あるいは懸濁液およびデキストリン
を含有する。好ましくは、ヒトでの長いＩＰ居留時間に起因して４％デキストリ
ン溶液が送達ビヒクルとして使用される。The present invention also provides a composition suitable for delivery of a therapeutic agent other than a medicinal agent to an animal subject, the composition comprising an aqueous solution or suspension of the therapeutic agent and dextrin. Preferably, a 4% dextrin solution is used as the delivery vehicle due to the long IP residence time in humans.

【００４５】 さらに、本発明は薬用薬剤以外の治療薬剤を動物被験体中の標的細胞に送達す
るための本発明の組成物の使用を提供する。The present invention further provides the use of the composition of the present invention for delivering a therapeutic agent other than a medicinal agent to target cells in an animal subject.

【００４６】 （発明の詳細な説明） （材料および方法） トランスフェクションの効率に対するデキストリンの影響をモニターするため
２つのレポーター構築物を使用した。イコデキストリン（ｉｃｏｄｅｘｔｒｉｎ
）溶液にあるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）レポーター遺伝子を使用した。あるいはトランスフェクションの効率を
モニターするためＬａｃＺレポーターを使用した。Detailed Description of the Invention Materials and Methods Two reporter constructs were used to monitor the effect of dextrins on the efficiency of transfection. Icodextrin
) Green fluorescent protein (in adeno-associated virus (AAV) vector in solution
The GFP) reporter gene was used. Alternatively, the LacZ reporter was used to monitor the efficiency of transfection.

【００４７】 １×１０8から１×１０10ＰＮ／ｍｌのベクター濃度で、腹膜壁にある正常細
胞中での導入遺伝子発現を立証した。Transgene expression was demonstrated in normal cells in the peritoneal wall at vector concentrations of 1 × 10 8 to 1 × 10 10 PN / ml.

【００４８】 （実施例１） （ｉ） 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子をコードするｒＡＡ
Ｖを用いた組織培養細胞のトランスフェクション リポフェクチン／ペプチド６／ＤＮＡ複合体を使用して１０ｃｍの組織培養シ
ャーレ中の８０％コンフルエントなＢＨＫ細胞をプレートあたり合計３０μｇの
プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ｒＡＡＶベクタープラスミド（ＧＦ
Ｐをコード）とパッケージングプラスミド（必要な複製シグナルおよびパッケー
ジングシグナルをコード）の比は１：３とした。Example 1 (i) rAA Encoding a Green Fluorescent Protein (GFP) Reporter Gene
Transfection of tissue culture cells with V. Lipofectin / Peptide 6 / DNA complexes were used to transfect 80% confluent BHK cells in 10 cm tissue culture dishes with a total of 30 μg of plasmid DNA per plate. rAAV vector plasmid (GF
The ratio of P coding) to the packaging plasmid (coding the required replication and packaging signals) was 1: 3.

【００４９】 （ｉｉ） ヘルパーウイルスを用いた感染 トランスフェクション後５時間の細胞を完全培地中のヘルペスヘルパーウイル
スを使用して３の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。(Ii) Infection with helper virus Cells 5 hours after transfection were infected with herpes helper virus in complete medium at a multiplicity of infection (MOI) of 3.

【００５０】 （ｉｉｉ） 収穫 感染後約４２時間の細胞をかき取ることによって収穫し、３５００ｒｐｍで１
０分間回転させることによってペレット化し、そして緩衝液（１４０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ−
ｐＨ ７．４）１０ｍｌに再懸濁させた。細胞を溶解するためこの溶液をドライ
アイス／エタノール浴と３７℃水浴の間で４回凍結融解した。次いで、３５００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸からこの溶解液を清澄化した。(Iii) Harvesting Harvesting by scraping the cells about 42 hours post infection and 1 at 3500 rpm
Pellet by spinning for 0 min and buffer (140 mM Na
Cl, 5 mM KCl, 0.7 mM K 2 HPO 4 , 25 mM TrisHCl-
Resuspended in 10 ml pH 7.4). This solution was freeze-thawed 4 times between a dry ice / ethanol bath and a 37 ° C. water bath to lyse the cells. Then 3500
The lysate was clarified from cell debris by centrifugation at rpm for 10 minutes.

【００５１】 （ｉｖ） ｒＡＡＶのＣｓＣｌ密度勾配精製 １）前記清澄な溶解液に塩化セシウムを加えて１．４ｇ／ｍｌに調整し、ベック
マンウルトラクリア遠心チューブに分配した。 ２）それからこの産物をＳＷ４１Ｔｉローター、ベックマン超遠心分離機で４０
０００ｒｐｍおよび２０℃で２０から２４時間（“ＯＦＦ”位置を切断）回転し
た。 ３）側穿刺によってチューブの中間領域を集めた。 ４）密度を再調整し、そしてこの産物を移動させ、その後上記のように遠心分離
した。 ５）針を使用した側穿刺によって３画分（各約２ｍｌ）を密度勾配にわたって集
め、そしてこの溶液を滅菌容器に滴下した。(Iv) CsCl Density Gradient Purification of rAAV 1) Cesium chloride was added to the clear solution to adjust the concentration to 1.4 g / ml, and the solution was distributed to a Beckman Ultra Clear centrifuge tube. 2) Then this product was swirled in a SW41Ti rotor, Beckman ultracentrifuge at 40
Spin at 000 rpm and 20 ° C. for 20 to 24 hours (cut off “OFF” position). 3) The middle region of the tube was collected by side puncture. 4) Readjust the density and transfer the product, then centrifuge as above. 5) Three fractions (about 2 ml each) were collected over the density gradient by side puncture using a needle, and the solution was added dropwise to a sterile container.

【００５２】 （ｖ） イコデキストリンまたは生理食塩水に対する画分の透析 各画分を２つの等しい部分に分け、透析カセット（Ｓｌｉｄｅ Ａ−Ｌｙｚｅ
ｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、 １００００ ＭＷカットオフ）
を使用して、それぞれ５回交換する（各交換２リットル）デキストリンもしくは
生理食塩水に接触させ４℃で透析した。(V) Dialysis of fractions against icodextrin or saline Each fraction was divided into two equal parts and a dialysis cassette (Slide A-Lyze) was used.
r Dialysis Cassettes, 10,000 MW cut-off)
, And each was exchanged 5 times (2 liters for each exchange), and dialyzed at 4 ° C. in contact with dextrin or physiological saline.

【００５３】 （ｖｉ） ｒＡＡＶのためのアッセイ用画分 ９６ウェルディッシュ中のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞を、完全培地で
希釈された各画分５μｌで感染させ、感染を促進させるため野生型アデノウイル
ス（ｗｔ Ａｄ）を加えた。２４時間後、倒立蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現に
ついて細胞をスクリーニングした。最も多くのｒＡＡＶを含む画分を決定し、そ
して以下の実験に使用した。(Vi) Assay Fractions for rAAV Subconfluent HeLa cells in 96-well dishes were infected with 5 μl of each fraction diluted in complete medium and wild type adenovirus ( wt Ad) was added. After 24 hours, cells were screened for GFP expression using an inverted fluorescence microscope. The fraction containing the most rAAV was determined and used in the following experiments.

【００５４】 最も多くのｒＡＡＶを含む（デキストリンおよび生理食塩水中）画分を、小さ
なアリコートに分けた。これらのアリコートを−８０℃で保管した。The fraction containing the most rAAV (in dextrin and saline) was divided into small aliquots. These aliquots were stored at -80 ° C.

【００５５】 （実施例１結果） ｉ）４℃／３７℃での保存 ａ）サンプル２５μｌ（ｎ＝１）を各日解凍し、それぞれ４℃および３７℃で保
管した。７日後、これらの温度に曝されていないアリコート（０日目のサンプル
）と共にサンプルを滴定した。 ｂ）３７℃の実験を繰り返し、そしてイコデキストリンおよび生理食塩水の両方
についてサンプル（ｎ＝３）を９６時間および４０時間保管した。これらのサン
プルを、この温度に曝されていないアリコートと共に滴定した。 ｉｉ）凍結解凍の繰り返し ｒＡＡＶ／デキストリンおよびｒＡＡＶ／生理食塩水のアリコートのうち１つを
、ドライアイスおよび３７℃水浴間で、繰り返し凍結解凍し、そして０、１０お
よび２０凍結解凍サイクル後に、２５μｌのサンプル（ｎ＝３）を取った。次い
でサンプルを滴定した。Example 1 Results i) Storage at 4 ° C./37° C. a) Samples of 25 μl (n = 1) were thawed each day and stored at 4 ° C. and 37 ° C., respectively. After 7 days, samples were titrated with aliquots not exposed to these temperatures (day 0 samples). b) The 37 ° C. experiment was repeated and samples (n = 3) were stored for 96 and 40 hours for both icodextrin and saline. These samples were titrated with aliquots not exposed to this temperature. ii) Repeated freeze-thaw cycles One of the aliquots of rAAV / dextrin and rAAV / saline was freeze-thawed repeatedly between dry ice and 37 ° C. water bath, and after 0, 10 and 20 freeze-thaw cycles, 25 μl. A sample (n = 3) was taken. The sample was then titrated.

【００５６】 （滴定） １）細胞がサブコンフルエントであることを確実にするため、滴定実験の前にＨ
ｅＬａ細胞を９６ウェルディッシュに播種（２×１０4細胞／ウェル）した。 ２）各アリコートの１０μｌを使用して、全容量が１ｍｌになるように、完全培
地で１０倍連続希釈溶液を調製した； １０μｌのアリコ−トと９９０μｌの培地で１：１００希釈を与え、 この１０-2希釈溶液１００μｌを９００μｌの培地を含む第２のチューブへ移動
し１０-3希釈を与え、 この１０-3希釈溶液１００μｌを第３のチューブへ移動し、など。 ３）各希釈溶液の５０μｌを、１．５ｍｌチューブの第２のセットへ移動し、そ
して混合前にｗｔ Ａｄ（ストック５×１０9ｐｆｕ／ｍｌ）２μｌを加えた。 ４）細胞から培地を取り除き、そしてその細胞にｒＡＡＶ／ｗｔＡｄ混合物を加
えた。 ５）２４時間後、倒立蛍光顕微鏡を使用して緑色の細胞を数えた。 ６）以下のように力価を算出した： ３０個の緑色細胞／５０μｌ （１０-6希釈） ６００個の緑色細胞／１０００μｌ （１０-6希釈） 力価：６００×１０6／ｍｌ＝６×１０8／ｍｌ （異なる力価が記載された場合、それは希釈の違いから起こる。） 図１、２ａ、２ｂおよび３を参照のこと。(Titration) 1) To ensure that the cells are sub-confluent, H 2 before the titration experiment
The eLa cells were seeded in a 96-well dish (2 × 10 4 cells / well). 2) 10 μl of each aliquot was used to make a 10-fold serial dilution in complete medium to give a total volume of 1 ml; 10 μl aliquot and 990 μl of 1: 100 dilution were given, 10-2 moves the diluted solution 100μl to a second tube containing culture medium of 900μl give 10-3 dilution, to move the 10 -3 dilution 100μl to the third tube, and so on. 3) 50 μl of each diluted solution was transferred to the second set of 1.5 ml tubes and 2 μl wt Ad (stock 5 × 10 9 pfu / ml) was added prior to mixing. 4) The medium was removed from the cells and the rAAV / wtAd mixture was added to the cells. 5) After 24 hours, green cells were counted using an inverted fluorescence microscope. 6) The titer was calculated as follows: 30 green cells / 50 μl (10 −6 dilution) 600 green cells / 1000 μl (10 −6 dilution) Titer: 600 × 10 6 / ml = 6 × 10 8 / ml (if different titers are stated, it results from different dilutions). See Figures 1, 2a, 2b and 3.

【００５７】 ウイルスの安定性に影響なく、溶液を２０回まで凍結解凍することは、可能で
あった（図３を参照のこと）。It was possible to freeze and thaw the solution up to 20 times without affecting the stability of the virus (see Figure 3).

【００５８】 ４℃では、ウイルスの安定性に違いはない。しかし、３７℃では、デキストリ
ンと生理食塩水との間でウイルスの安定性に違いがある（図２ａ）。これは、９
６時間のデータからはっきりと明らかである（図２ｂ）。この温度および時間範
囲は、インビボでのトランスフェクションに大いに関連する。この違いは、統計
的に有意であることが示された（ｐ＝０．０４）。At 4 ° C, there is no difference in virus stability. However, at 37 ° C, there is a difference in viral stability between dextrin and saline (Fig. 2a). This is 9
It is clearly evident from the 6 hour data (Fig. 2b). This temperature and time range is highly relevant for transfection in vivo. This difference was shown to be statistically significant (p = 0.04).

【００５９】 （実施例２） アデノウイルスベクターＡｄ５．ＣＭＶ−ＬａｃＺを、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＵＳＡから得た。ウイルス滴定を、３つ
の異なる方法でモニターする： ｉ）ＯＤ260：１×１０11ウイルス性粒子／ｍｌ ｉｉ）ＴＣＩＤ50：１．６２×１０10ＴＣＩＤ／ｍｌ（ＴＣＩＤ50＝５０％組織
培養感染量）および ｉｉｉ）プラークアッセイ：３．２５×１０9ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成単位
）。Example 2 Adenovirus Vector Ad5. CMV-LacZ, Quantum Bi
otechnologies Inc. Obtained from USA. Viral titration is monitored in three different ways: i) OD 260 : 1 × 10 11 viral particles / ml ii) TCID 50 : 1.62 × 10 10 TCID / ml (TCID 50 = 50% tissue culture infectious dose) ) And iii) plaque assay: 3.25 × 10 9 PFU / ml (plaque forming units).

【００６０】 ＣＯＳ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中で、５×１０5細胞／ウ
ェルの細胞密度に培養した。細胞を標準細胞培養条件下で培養したが、熱変性し
たウシ胎仔血清を使用した。ウイルス株を、デキストリン中で最終ＭＯＩがデキ
ストリン中０、０．１、０．５、１、５または１０になるように、デキストリン
またはＰＢＳで調製した。デキストリンの最終濃度は４％である。COS cells were cultured in 96-well microtiter plates to a cell density of 5 × 10 5 cells / well. Cells were cultured under standard cell culture conditions, but heat-denatured fetal bovine serum was used. Virus strains were prepared with dextrin or PBS such that the final MOI in dextrin was 0, 0.1, 0.5, 1, 5 or 10 in dextrin. The final concentration of dextrin is 4%.

【００６１】 （実施例２結果） 図４ａを参照のこと。ウイルスベクター添加２４時間後、ウイルスの細胞変性
効果は、デキストリンがないときは、よりはっきり示される。図４ｂは、４％デ
キストリンの存在下、ＰＢＳ対照と比較して、生成されるβーガラクトシダーゼ
の量は増加することを示す。Example 2 Results See FIG. 4a. 24 hours after addition of viral vector, the cytopathic effect of the virus is more pronounced in the absence of dextrin. Figure 4b shows that in the presence of 4% dextrin, the amount of β-galactosidase produced is increased compared to the PBS control.

【００６２】 本発明の実施形態は、例としてのみ、そして以下の図を参照してここで記載さ
れる。Embodiments of the invention are described herein by way of example only and with reference to the following figures.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 図１は、ｒＡＡＶ／デキストリン（黒菱形）溶液サンプルおよびｒＡＡＶ／生
理食塩水（白四角）サンプルについての４℃での貯蔵中の時間に対してのウイル
スの安定性のグラフである。FIG. 1 is a graph of virus stability versus time during storage at 4 ° C. for rAAV / dextrin (filled diamonds) solution samples and rAAV / saline (open squares) samples. .

【図２】 図２は、ｒＡＡＶ／デキストリン（黒菱形）溶液サンプルおよびｒＡＡＶ／生
理食塩水（白四角）サンプルについての３７℃での貯蔵中の時間に対してのウイ
ルスの安定性のグラフである。FIG. 2 is a graph of virus stability over time during storage at 37 ° C. for rAAV / dextrin (filled diamonds) solution samples and rAAV / saline (open squares) samples. .

【図３】 図３は、ウイルス安定性に対する繰り返しの凍結解凍工程の影響を示すグラフ
である。FIG. 3 is a graph showing the effect of repeated freeze-thaw steps on virus stability.

【図４ａ】 図４は、ＡＤ５．ＣＭＶ−Ｌａｃ ｚ ベースベクターによるＣＯＳ細胞の
トランスフェクションに対するデキストリンの影響を図解する。図４ａは、感染
多重度（ＭＯＩ）に関する総タンパク質を測定することで、細胞生存力に対する
デキストリンの影響を示す。FIG. 4a shows AD5. 2 illustrates the effect of dextrin on transfection of COS cells with CMV-Lac z based vector. FIG. 4a shows the effect of dextrin on cell viability by measuring total protein for multiplicity of infection (MOI).

【図４ｂ】 図４は、ＡＤ５．ＣＭＶ−Ｌａｃ ｚ ベースベクターによるＣＯＳ細胞の
トランスフェクションに対するデキストリンの影響を図解する。図４ｂは、ＰＢ
Ｓ（白四角）と比較して増加したＭＯＩに関するβ−ガラクトシダーゼ活性に対
するデキストリン（黒菱形）の影響を示す。FIG. 4b shows AD5. 2 illustrates the effect of dextrin on transfection of COS cells with CMV-Lac z based vector. Figure 4b shows PB
The effect of dextrin (filled diamonds) on β-galactosidase activity for increased MOI compared to S (open squares) is shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／４８２，７９４ (32)優先日 平成12年１月13日(2000．1．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボイエス， ロバート ニコル イギリス国 ダブリュー１アール ９エイ ジェイ ロンドン， ハノーバー スクエ ア 17， エムエル ラボラトリーズ ピ ーエルシー Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA95 BB21 CC26 EE30 FF03 FF34 4C084 AA13 MA05 MA24 MA56 NA10 NA13 4C086 AA01 EA16 MA02 MA05 MA24 MA56 NA10 NA13 4C087 AA10 BC83 MA24 MA56 NA10 NA13 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (31) Priority claim number 09 / 482,794 (32) Priority date January 13, 2000 (January 13, 2000) (33) Priority claiming countries United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG , ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, C A, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM , DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, K E, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS , LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, R U, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM , TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Boyes, Robert Nicole             British W1 Earl 9A             Jay London, Hanover Squee             A 17, ML Laboratories Pi             -Elsie F term (reference) 4C076 AA19 AA95 BB21 CC26 EE30                       FF03 FF34                 4C084 AA13 MA05 MA24 MA56 NA10                       NA13                 4C086 AA01 EA16 MA02 MA05 MA24                       MA56 NA10 NA13                 4C087 AA10 BC83 MA24 MA56 NA10                       NA13

Claims (23)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 デキストリン溶液および遺伝物質を含有する組成物であって
、該デキストリンは１，０００から２００，０００の分子量を有する、組成物。1. A composition comprising a dextrin solution and genetic material, wherein the dextrin has a molecular weight of 1,000 to 200,000. 【請求項２】 前記デキストリンが２，０００から５５，０００の分子量を
有するデキストリンである、請求項１に記載の組成物。2. The composition according to claim 1, wherein the dextrin is a dextrin having a molecular weight of 2,000 to 55,000. 【請求項３】 前記遺伝物質が、少なくとも１つの治療核酸分子または該治
療核酸分子の有効部分が組み込まれたベクターである、請求項１または２に記載
の組成物。3. The composition according to claim 1 or 2, wherein the genetic material is a vector into which at least one therapeutic nucleic acid molecule or an effective portion of the therapeutic nucleic acid molecule has been incorporated. 【請求項４】 前記治療核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項３に記載の
組成物。4. The composition of claim 3, wherein the therapeutic nucleic acid molecule is genomic DNA. 【請求項５】 前記治療核酸分子がｃＤＮＡである、請求項３に記載の組成
物。5. The composition of claim 3, wherein the therapeutic nucleic acid molecule is cDNA. 【請求項６】 前記ベクターがウイルスベースのベクターである、請求項３
〜５のいずれか１項に記載の組成物。6. The vector of claim 3, wherein the vector is a virus-based vector.
6. The composition according to any one of 5 to 5. 【請求項７】 前記ウイルスベースのベクターが以下の群：アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスまたはバキュロウイ
ルスから選択される請求項６に記載の組成物。7. The composition of claim 6, wherein said virus-based vector is selected from the following group: adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, lentivirus or baculovirus. 【請求項８】 前記治療核酸分子がアンチセンス核酸分子である、請求項３
〜７のいずれか１項に記載の組成物。8. The therapeutic nucleic acid molecule is an antisense nucleic acid molecule.
8. The composition according to any one of items 7 to 7. 【請求項９】 前記治療核酸分子が少なくとも１つのキャリアおよび／また
は賦形剤と組み合わせられた、請求項３〜８のいずれか１項に記載の組成物。9. A composition according to any one of claims 3-8, wherein the therapeutic nucleic acid molecule is combined with at least one carrier and / or excipient. 【請求項１０】 前記キャリアまたは賦形剤がリポソームベースである、請
求項９に記載の組成物。10. The composition of claim 9, wherein the carrier or excipient is liposome-based. 【請求項１１】 前記デキストリンが、１０％に等しいかまたは１０％より
少ない、α １−６結合で結合されたグルコース分子を含有する、請求項１〜１
０のいずれか１項に記載の組成物。11. The dextrin contains glucose molecules linked by α 1-6 bonds equal to or less than 10%, 1 to 1.
0. The composition according to any one of 0. 【請求項１２】 前記デキストリンが、５％に等しいかは５％より少ない、
α １−６結合で結合されたグルコース分子を含有する、請求項１〜１０のいず
れか１項に記載の組成物。12. The dextrin is equal to or less than 5%,
The composition according to any one of claims 1 to 10, which comprises glucose molecules bound by α 1-6 bonds. 【請求項１３】 前記デキストリン溶液が、１２に等しいかまたは１２より
大きい重合度を有するポリマーを少なくとも１５％有する、請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載の組成物。13. The composition according to claim 1, wherein the dextrin solution has at least 15% of a polymer having a degree of polymerization equal to or greater than 12. 【請求項１４】 前記デキストリン溶液が、１２に等しいかまたは１２より
大きい重合度を有するポリマーを少なくとも５０％有する、請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載の組成物。14. The composition of any one of claims 1-12, wherein the dextrin solution has at least 50% of a polymer having a degree of polymerization equal to or greater than 12. 【請求項１５】 前記デキストリン溶液が少なくとも１０％（ｗ／ｖ）デキ
ストリンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。15. The composition of any one of claims 1-14, wherein the dextrin solution is at least 10% (w / v) dextrin. 【請求項１６】 前記デキストリン溶液が少なくとも５％（ｗ／ｖ）デキス
トリンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。16. The composition of any one of claims 1-14, wherein the dextrin solution is at least 5% (w / v) dextrin. 【請求項１７】 前記デキストリン溶液が４％（ｗ／ｖ）デキストリンであ
ることに特徴を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。17. The composition according to claim 1, wherein the dextrin solution is 4% (w / v) dextrin. 【請求項１８】 動物への遺伝病の処置に使用するための遺伝物質の同時、
連続的または別個の投与のための、医薬品を製造するためのデキストリンの使用
であって、ここで該デキストリンが、１，０００から２００，０００の分子量を
有する、デキストリンの使用。18. Simultaneous application of genetic material for use in the treatment of a genetic disease in an animal,
Use of dextrin for the manufacture of a medicament, for continuous or separate administration, wherein the dextrin has a molecular weight of 1,000 to 200,000. 【請求項１９】 前記動物がヒトである、請求項１８に記載の使用。19. The use according to claim 18, wherein the animal is a human. 【請求項２０】 処置されるべき哺乳動物の少なくとも１つの体腔内に治療
薬剤を送達する方法であって、該体腔内に、治療薬剤の調製物をデキストリン溶
液と同時に、連続的に、または別個に導入する工程を包含し、該治療薬剤が遺伝
物質であること、および該デキストリンが１，０００から２００，０００の分子
量を有することに特徴を有する、方法。20. A method of delivering a therapeutic agent into at least one body cavity of a mammal to be treated, wherein the therapeutic agent preparation is simultaneously, sequentially or separately in the dextrin solution. The method of claim 1, wherein the therapeutic agent is genetic material and the dextrin has a molecular weight of 1,000 to 200,000. 【請求項２１】 前記体腔が腹腔である、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the body cavity is the abdominal cavity. 【請求項２２】 前記体腔が眼窩である、請求項２０に記載の方法。22. The method of claim 20, wherein the body cavity is the orbit. 【請求項２３】 遺伝病の処置に使用するための医薬品を製造するための請
求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。23. Use of a composition according to any one of claims 1 to 17 for the manufacture of a medicament for use in the treatment of genetic diseases.
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