JP2003507337A - チロシンキナーゼｒａｆおよびｒａｓを用いて脈管形成を調節するために有用な方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｒａｆおよび／またはＲａｓタンパク質、修飾ＲａｆまたはＲａｓタンパク質、およびこうしたものをコードする核酸を用いて組織における脈管形成を調節するための方法を記載する。詳細には、本発明は、不活性Ｒａｆおよび／またはＲａｓタンパク質、またはそれらをコードする核酸を用いて脈管形成を抑制するための方法、あるいは活性Ｒａｆおよび／またはＲａｓタンパク質、またはそれらをコードする核酸を用いて脈管形成を増強するための方法を記載する。本発明は、ＲａｆまたはＲａｓタンパク質あるいはそれらの修飾形をコードする核酸を提供するための遺伝子伝達系の使用も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願に関する説明） 本出願は、２０００年７月５日出願の米国仮特許出願番号６０／２１５，９５
１および１９９９年８月１３日出願の米国仮特許出願番号６０／１４８，９２４
に対する優先権を主張するものである。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、一般には医薬品の分野に関するものであり、詳細にはプロテインキ
ナーゼＲａｆまたはＲａｓ、ＲａｆまたはＲａｓの変異体を用い、Ｒａｆまたは
Ｒａｓを調節する試薬を用い、およびそれらをコードする核酸を用いて組織の脈
管形成を調節するための方法および組成物に関する。

【０００３】 （発明の背景） 脈管形成は、組織への新しい血管の成長を含む組織血管新生の過程であり、新
生血管新生とも呼ばれる。この過程は、内皮細胞および平滑筋細胞の侵潤によっ
て媒介される。この過程は、血管が既存の血管から新芽形成し得る、血管の新た
な成長が前駆細胞から生じる（脈管形成）、または存在する小血管の直径が拡張
するという３つの方法のいずれかで進行すると考えられている。Ｂｌｏｏｄら、
Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）
。

【０００４】 脈管形成は、新生児成長における重要な課程であるが、創傷治癒においても、
また組織炎症、関節炎、腫瘍の成長、糖尿病性網膜症、網膜の新生血管形成によ
る黄斑変性、および同様の状態を含む多種多様な臨床的疾患の病因においても重
要である。脈管形成に関連するこれらの臨床的症状は、脈管形成性疾患と呼ばれ
る。Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７（１９８７）
。脈管形成は、創傷治癒および黄体成長周期において発生するが、一般に、成人
または成熟組織には存在しない。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
８：１４０８−１４１０（１９９０）を参照のこと。

【０００５】 脈管形成の抑制は腫瘍の成長を制限するために有用な治療法になるであろうと
いうことが提案されている。（１）βＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）など
の「脈管形成分子」の放出の抑制、（２）抗βＦＧＦ抗体の使用などによる脈管
形成分子の中和、（３）ビトロネクチン受容体α_ｖβ_３の抑制因子の使用、およ
び（４）脈管形成促進（angiogenic stimuli）に対する内皮細胞の応答の阻害
による脈管形成の抑制が提案されている。この後者の戦略は注目されており、Ｆ
ｌｏｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：８９−９６（１９９２）
には、コラゲナーゼ抑制剤、基底膜交替阻害剤、脈管形成抑制ステロイド、真菌
由来脈管形成抑制剤、血小板第４因子、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミン
および金チオリンゴ酸などの関節炎薬、ビタミンＤ_３類似体、α−インターフェ
ロン、および脈管形成を抑制するために用いられる可能性があるこれらに類する
ものなどを含む幾つかの内皮細胞応答阻害剤が記載されている。提案されている
その他の脈管形成抑制剤については、Ｂｌｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ．，１０３２：８９−１１８（１９９０）、Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）、Ｉｎｇｂｅｒら、Ｌａｂ
．Ｉｎｖｅｓｔ．５９：４４−５１（１９８８）、および米国特許第５，０９２
，８８５号、第５，１１２，９４６号、第５，１９２，７４４号、第５，２０２
，３５２号、第５，７５３，２３０号および第５，７６６，５９１号を参照のこ
と。しかし、前述の参考文献に記載されている脈管形成抑制剤の中には、Ｒａｆ
タンパク質を含むものはない。

【０００６】 脈管形成が起るには、腫瘍細胞が侵入および転移形成中に用いるものと類似し
た方式で、内皮細胞がまず分解し、血管基底膜を交差しなければならない。

【０００７】 脈管形成は、血管インテグリンと細胞外基質タンパク質との間の相互作用に依
存することが以前に報告されている。Ｂｒｏｏｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：
５６９−５７１（１９９４）。さらに、脈管形成血管細胞の計画細胞死（アポト
ーシス）は、この相互作用によって開始され、これは、血管インテグリンα_ｖβ _３ の一定の拮抗体によって阻害されるであろうということが報告されている。Ｂ
ｒｏｏｋら、Ｃｅｌｌ，７９：１１５７−１１６４（１９９４）。より最近では
、ビトロネクチン受容体（α_ｖβ_５）に対する基質メタロプロテイナーゼ−２（
ＭＭＰ−２）の結合は、α_ｖβ_５拮抗体を用いて阻害することができ、その結果
、プロテイナーゼの酵素作用を抑制することができることが報告されている。Ｂ
ｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，８５：６８３−６９３（１９９６）。

【０００８】 （発明の開示） 本発明は、脈管形成がプロテインキナーゼＲａｆ（本明細書中において、一般
的に、Ｒａｆとも呼ぶ）の活性に依存する組織における脈管形成の調節を考える
ものである。

【０００９】 疾病状態に関連する組織における脈管形成を調節するための組成物および方法
を考える。脈管形成調節量のＲａｆタンパク質を含む組成物を脈管形成の調節に
応じる疾病状態について治療を受ける組織に投与する。Ｒａｆタンパク質を供給
する組成物は、精製タンパク質、生物活性タンパク質の断片、組換え生成Ｒａｆ
タンパク質もしくはタンパク質の断片もしくは融合タンパク質、またはＲａｆタ
ンパク質を発現するための遺伝子／核酸発現ベクターを含むことができる。

【００１０】 Ｒａｆタンパク質が不活性化されるかまたは阻害される場合、その調節は、脈
管形成の抑制である。Ｒａｆタンパク質が活性であるかまたは活性化される場合
、その調節は、脈管形成の増強である。

【００１１】 治療すべき組織は、脈管形成の調節が望ましいあらゆる組織であることができ
る。脈管形成抑制は、有害な新生血管形成を発生させる病んだ組織の治療に有用
である。こうした組織の例には、炎症組織、固形腫瘍、転移、最狭窄を被る組織
、およびこれらに類する組織が挙げられる。

【００１２】 増強作用は、卒中、心筋梗塞後のまたは慢性潰瘍に関連するものなどの低酸素
組織を有する患者、糖尿病またはその他の状態のために異常、すなわち血行不良
がある虚血肢を有する患者の組織を治療するために有用である。治癒しない、従
って、血管細胞の増殖および新生血管形成の増大が有益であり得る慢性創傷の患
者も治療することができる。

【００１３】 本明細書中に記載するような修飾アミノ酸配列を含むＲａｆタンパク質の使用
が特に好ましい。Ｒａｆ−ｃａａｘおよびその発現をコードする核酸構成体など
のＲａｆ融合タンパク質を含む幾つかの特に有用な修飾Ｒａｆタンパク質を本明
細書中に記載する。これらは本発明の範囲内である。

【００１４】 本発明は、核酸、Ｒａｆタンパク質をコードする核酸セグメントを有する核酸
、およびコドン３７５にリジンを除くいずれかのアミノ酸残基を有するＲａｆタ
ンパク質を含むウイスル性または非ウイルス性遺伝子導入ベクター、および製薬
上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成の
抑制に適する医薬組成物も包含する。特に好ましい実施形態は、Ｒａｆ Ｋ３７
５Ｍと呼ばれている、以下の実施例に記載するＲａｆタンパク質を用いる。もう
一つの不活性Ｒａｆ構成体は、カルボキシ末端部分が欠失したＲａｆタンパク質
をコードする核酸である。一つの好ましい実施形態では、不活性Ｒａｆタンパク
質であるＲａｆ １−３０５と呼ばれているＲａｆタンパク質を用いる。

【００１５】 キナーゼ活性を有するＲａｆタンパク質をコードするセグメントを有する核酸
を含むウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクターおよびそのための製
薬上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成
を促進すること（stimulating）に適する医薬組成物も考えられる。好ましい核
酸は、Ｒａｆ−ｃａａｘである抑制性Ｒａｆ融合タンパク質をコードする。もう
一つの抑制性Ｒａｆ構成体は、タンパク質のアミノ末端部分が欠失したＲａｆタ
ンパク質をコードする核酸を含有する。一つの好ましい実施形態は、Ｒａｆ ３
０６−６４８と呼ばれている、以下の実施例に記載するＲａｆタンパク質を用い
る。

【００１６】 本発明は、さらに、本明細書中に記載するように、Ｒａｆをシグナル化する役
割のために、本明細書中において、一般に、Ｒａｓとも呼ぶ小ＧＴＰアーゼＲａ
ｓによって組織における脈管形成を調節することをも意図している。Ｒａｓおよ
びＲａｆの調節を併用して、組織における脈管形成を調節することも考えられる
。こうした複合調節は、タンパク質、または修飾タンパク質をコードする核酸の
複合製剤の脈管形成調節量を一回で投与する形態を取ることもできるし、または
個々の投薬量を別々に投与する形態を取ることもできる。

【００１７】 調節がＲａｓタンパク質によるＲａｆ媒介脈管形成路に関係する場合、疾病状
態に関係する組織における脈管形成を調節するための組成物および方法を考える
。脈管形成調節量のＲａｓタンパク質を含む組成物を脈管形成の調節に応答する
疾病状態について治療を受ける組織に投与する。Ｒａｓタンパク質を供給する組
成物は、精製タンパク質、生物活性Ｒａｓタンパク質の断片、組換え生成Ｒａｓ
タンパク質もしくはタンパク質断片もしくは融合タンパク質、またはＲａｓタン
パク質を発現するための遺伝子／核酸発現ベクターを含むことができる。

【００１８】 Ｒａｓタンパク質が不活性化されるかまたは阻害される場合、その調節は、脈
管形成の抑制である。Ｒａｓタンパク質が活性であるかまたは活性化される場合
、その調節は、脈管形成の増強である。Ｓ１７Ｎ ＲａｓまたはＶ１２Ｃ４０
Ｒａｓなどの優性陰性Ｒａｓタンパク質のために用いる医薬組成物および方法を
Ｒａｆ系統のタンパク質に関するものと類似の方法で用いるために考える。本発
明のさらに進んだ側面において、Ｇ１２Ｖ ＲａｓまたはＶ１２Ｓ３５Ｒａｓな
どの優性活性Ｒａｓタンパク質のために用いる医薬組成物および方法をＲａｆ系
統のタンパク質に関するものに匹敵する用途のために考える。

【００１９】 Ｒａｆタンパク質またはＲａｆタンパク質を発現することができるヌクレオチ
ド配列、およびＲａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質を発現することができ
るヌクレオチド配列を含む脈管形成調節量の医薬組成物を投与することを含む、
疾病状態に関連する組織における脈管形成を調節するための方法をさらに考える
。こうした方法において、所望の調節が脈管形成の抑制である場合は、Ｒａｆま
たはＲａｓの一方または両方が不活性である。所望の調節が脈管形成の促進であ
る場合は、ＲａｆまたはＲａｓの一方または両方が活性である。

【００２０】 （図面の簡単な説明） 本開示のタンパク質を形成構成する図において： 図１Ａ〜１Ｄは、エコトロピックパッケージングされたレトロウイルスがマウ
ス細胞にのみを感染させることを示すものである。エコトロピックパッケージン
グ細胞は、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子をコードするレトロウイ
ルス構成体でトランスフェクションし、２４時間後に上澄み液を回収した。ウイ
ルスを含有する上澄み液をマウス由来線維芽細胞（図１Ａ）、マウス由来内皮細
胞（図１Ｂ）ヒト上皮腺癌細胞（図１Ｃ）、またはヒト黒色腫細胞（図１Ｄ）の
いずれかの上に２４時間定置し、標準法を用いてβ−Ｇａｌ活性を視覚化した。

【００２１】 図２は、マウス内皮細胞株において、βＦＧＦ誘導Ｒａｆ活性の増大が、Ｒａ
ｆ Ｋ３７５Ｍでの事前の感染によってブロックされることを示すものである。
エコトロピックパッケージング細胞を、欠損Ｒａｆキナーゼ遺伝子をコードする
レトロウイルス構成体でトランスフェクションし、２４時間後に上澄み液を回収
した。ウイルスを含有する上澄み液をマウス内皮細胞上に２４時間定置した。そ
の後、細胞をβＦＧＦで５分間処理して、溶解した。Ｒａｆキナーゼ活性は、放
射活性標識^３２Ｐを有するＭＥＫ基質をホスホリル化する免疫沈降Ｒａｆキナー
ゼの能力によって定量した。反応混合物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分別し、
走査濃度計測を用いて定量した。

【００２２】 図３Ａ〜３Ｂは、マウス皮下脈管形成モデルにおいて、変異不活性Ｒａｆ Ｋ
３７５Ｍが、βＧＦＧ誘発脈管形成をブロックすることを示すものである。脈管
形成は、Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍを発現するレトロウイルス発現パッケージング細胞
を伴う、または伴わない４００ｎｇ／ｍＬのβＦＧＦを含有する２５０ｕＬの氷
冷成長因子誘導マトリゲルをマウス側腹部に皮下注射することによって誘発した
。５日後、内皮特異的ＦＩＴＣ接合Ｂａｎｄｅｉｒｉｅａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｃ
ａ Ｂ５レクチンを尾静脈経由で注射し、３０分間循環させて、取り外した。そ
の後、脈管形成組織を除去し、抽出して、蛍光含量について分析することによっ
て、脈管形成を定量した（図３Ａ）。新生血管形成は、光学切片法によって確認
した（図３Ｂ）。

【００２３】 図４Ａ〜４Ｂは、変異活性Ｒａｆが、マウス皮下脈管形成モデルにおける脈管
形成を促進することを示すものである。脈管形成は、ＧＦＰ対照またはアミノ末
端欠失Ｒａｆキナーゼ（Ｒａｆ３０６〜６４８）を発現するレトロウイルス発現
パッケージング細胞を含有する２５０ｕＬの氷冷成長因子誘導マトリゲルをマウ
ス側腹部に皮下注射することによって誘発した。５日後、脈管形成組織を除去し
、抽出して、蛍光含量について分析することによって、脈管形成を定量した（図
４Ａ）。新生血管形成は、切片法およびメイソンのトリクロームを用いる染色法
によって確認した（図４Ｂ）。

【００２４】 図５Ａ〜５Ｄは、腫瘍へのＲａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼのレトロウイルス伝達
が、内皮特異的な方式でアポトーシスを誘発することを示すものである。ヒトの
腫瘍を無胸腺ｗｅｈｉ（ν／ν）マウスの側腹部に皮下注射して、移植した。腫
瘍が１００ｍｍ^３に達した時、１０^６ｐｆｕのエコトロピックパッケージングさ
れたＲａｆ Ｋ３７５Ｍを含有する培養上澄み液を腫瘍内に注射した。４８時間
後、腫瘍を回収し、切り出して、免疫組織化学法を実施した。内皮細胞は、ｖＷ
Ｆ発現によって同定し（図５Ａ）、一方、フラッグタグマーカーを用いて、Ｒａ
ｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼ遺伝子に感染した細胞を示した（図５Ｂ）。これらの各
マーカーは、アポトーシス細胞を示すＴＵＮＥＬマーカーと共に局在するように
見える。（図５Ｃおよび５Ｄ）。

【００２５】 図６Ａ〜６Ｂは、Ｒａｆ Ｋ３７５キナーゼ遺伝子の内皮伝達が、腫瘍の成長
を抑制し、腫瘍の退縮を促進することを示すものである。ヒトの腫瘍を無胸腺ｗ
ｅｈｉ（ν／ν）マウスの側腹部に皮下注射して、１００ｍｍ^３に成長させた。
この時点で、腫瘍隣接部にＲａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼを発現するパッケージン
グ細胞の単独注射を行うか、またはウイルス上澄み液の一連の腫瘍内注射を開始
した。この戦略によって、対照ＧＦＰ遺伝子の注射では見られなかった腫瘍の急
速な退縮が生じた（図６Ａ）。この退縮は、急速に発生し、実験の間中維持され
た（図６Ｂ）。

【００２６】 図７は、イントロンが欠失下完全コード配列であるヒトｃ−Ｒａｆをコードす
るｃＤＮＡ配列を示すものである。この配列は、遺伝子バンク受入番号Ｘ０３４
８４（ＧＩ＝３５８４１、ＨＳＲＡＦＲ）によって入手できる（配列番号１）。

【００２７】 図８は、図７に示した核酸配列の中で示されるヒトｃ−Ｒａｆのコード配列に
関するコードされた翻訳アミノ酸残基配列を示すものである（配列番号２）。

【００２８】 図９は、脈管形成が、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の活性化依存する
ことを示すものである。Ｒａｓ活性は、Ｒａｓプルダウン検定法によって測定さ
れるようにβＦＧＦに暴露したニワトリ絨耗尿膜（ＣＡＭ）溶解物中で高めた。
日齢１０日のニワトリ胚からのＣＡＭを、ＰＢＳか３０ナノグラム（ｎｇ）のβ
ＦＧＦのいずれかで飽和したフィルターディスクを用いて局所的に刺激した。５
分後、ＣＡＭ組織の一部を切除し、溶解緩衝液中で均一化した後、ＲａｆのＲａ
ｓ結合ドメインをコードするＧＳＴ融合ペプチドにより沈降される容積によって
、Ｒａｓ活性を決定した。活性ＲａｓのみがＲａｆに結合するため、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に接合するＲａｆのＲａｓ結合ドメイン
から成る組換えタンパク質が発生した。次に、組織溶解物から活性Ｒａｓを沈降
させることができるセファロースビーズにＧＳＴを接合させた。

【００２９】 図１０は、野生型ヒトＲａｓ（Ｈ−Ｒａｓを含まない）のｃＤＮＡコードドメ
インのヌクレオチド配列を示すものである（配列番号３）。ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ１
始原腫瘍遺伝子についての完全コード配列は、遺伝子バンク（ＧＩ＝１９０８９
０、ＨＵＭＲＡＳＨ）を通して入手できる（配列番号５）。

【００３０】 図１１は、図１０に示した野生型ヒトＲａｓ（Ｈ−Ｒａｓを含まない）のｄＤ
ＮＡヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸残基配列を示す（配列番号
４）。

【００３１】 図１２は、変異ヌルＲａｓでの感染が、ＣＡＭにおける成長因子誘発性脈管形
成をブロックしたことを示すものである。変異ヌルＲａｓ、Ｓ１７Ｎ Ｒａｓ（
位置１７のＳｅｒがＡｓｎに置換されている野生型Ｈ−Ｒａｓ）をコードする１
５マイクロリットル（ｕＬ）の高力価ニワトリ肉腫レトロウイルス、ＲＣＡＳ（
Ａ）を、図９に記載したように、βＦＧＦで刺激されるようＣＡＭ上のフィルタ
ーディスクに局所的に塗付した。脈管形成は、７２時間後、血管分枝点をカウン
トすることによって評価した。

【００３２】 図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を選択的に活
性化する変異Ｒａｓ構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５での感染は、脈管形成を誘発
し、これに対してＰＩ３Ｋ経路を選択的に活性化する変異構成体、Ｒａｓ Ｖ１
２Ｃ４０は、脈管形成を誘発しないことを、略図およびグラフでそれぞれ示すも
のである。Ｒａｓ構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５を活性化するＲａｆ−ＭＥＫ−
ＥＲＫ、またはＲａｓ構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０を活性化するＰＩ３キナー
ゼをコードする１５ｕＬの高力価ＲＣＡＳ（Ａ）ウイルスをフィルターディスク
に局所的に塗付し、結果を図１２において説明したように評価した。

【００３３】 図１４は、ヒトＲａｆ（Ｈ−Ｒａｆを含まない）のカルボキシ末端をコードす
るヌクレオチド配列が、Ｋ−Ｒａｓ膜局在化ドメインの２０のアミノ酸残基配列
をコードするヌクレオチド配列と融合する、融合タンパク質Ｒａｆ−ｃａａｘを
コードするヌクレオチド配列を示すものである（配列番号６）。

【００３４】 図１５は、Ｒａｆ−ｃａａｘ、図１４に示した融合ヌクレオチド配列から発生
する融合タンパク質のアミノ酸残基配列を示すものである（配列番号７）。

【００３５】 図１６Ａ〜１６Ｅおよび図１６Ｆは、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ９８０５９が、変異
活性ＲａｓまたはＲａｆのいずれかによって誘発された脈管形成をブロックする
ことを、写真およびグラフでそれぞれ示すものである。活性Ｒａｓ構成体、Ｒａ
ｓ Ｖ１２（Ｇ１２Ｖとも呼ばれる）、および活性化Ｒａｆ構成体、Ｒａｆ−ｃ
ａａｘをコードするウイルスを、図１２において説明したように、フィルターデ
ィスクに局所的に塗付した。２４時間後、一（１）ナノモルのＭＥＫ阻害剤、Ｐ
Ｄ９８０５９をディスクに添加した。その後、図１２において説明したように、
ＣＡＭを評価した。プロットしたデータは、２０の胚の平均±ＳＥである。

【００３６】 図１７Ａ〜１７Ｆおよび１７Ｇは、それぞれ、ＲａｓではなくＲａｆによって
誘発される脈管形成がインテグリンのブロックによる抑制に対して無反応である
ことを写真およびグラフで示すものである。変異活性ＲａｓおよびＲａｆ構成体
の両方による感染によって顕著な脈管形成が誘発されるが、Ｒａｓによって誘発
される脈管形成のみがα_ｖβ_３インテグリンブロック抗体によって抑制された。
日齢１０日のニワトリ胚からのＣＡＭはＰＢＳ（対照）、βＦＧＦ、ＲＣＡＳ（
Ａ）レトロウイスル構成体Ｇ１２Ｖ−ＲａｓまたはＲａｆ−ｃａａｘのいずれか
で飽和したフィルターディスクを用いて、図９および１２において説明したよう
に刺激した。ＬＭ６０９、インテグリンα_ｖβ_３に対するモノクローナル抗体を
２４時間後に静脈内伝達し、７２時間後、血管分枝点の分析によって脈管形成を
評価した。代表的なＣＡＭを挿入写真で示す。データは、２０の胚の平均±ＳＥ
である。

【００３７】 図１８Ａ〜１８Ｄおよび１８Ｅは、それぞれ、ＣＡＭの変異ヌルフォーカス癒
着キナーゼ、ＦＲＮＫとの共感染によって、Ｒａｓはブロックされたが、Ｒａｆ
誘発性脈管形成はブロックされなかったことを写真およびグラフで示すものであ
る。Ｒａｓ Ｖ１２またはＲａｆ−ｃａａｘをコードするＲＣＡＳ（Ａ）ウイル
スは、ＦＡＫ関連ヌルキナーゼ（ＦＲＮＫ）をコードするＲＣＡＳ（Ｂ）ウイル
スと共に、図１２において説明したようにＣＡＭフィルターディスクに局所的に
塗付した。データは、２０の胚の平均±ＳＥである。

【００３８】 図１９Ａおよび図１９Ｂ〜１９Ｇは、それぞれ、ＦＲＮＫが、マウス皮下脈管
形成モデルにおいてβＦＧＦおよびＲａｓ（Ｒａｆではない）誘発性脈管形成を
ブロックしたことをグラフおよび写真で示すものである。脈管形成は、４００ｎ
ｇ／ｍＬのβＦＧＦかまたは記載の遺伝子を発現するモロニーレトロウイルス発
現パッケージング細胞のいずれかを含有する２５０ｕＬの氷冷成長因子誘導マト
リゲルをマウスの側腹部に皮下注射することによって誘発した。ＦＲＮＫレトロ
ウイルスは、ｖｓｖ．ｇ被覆タンパク質を用いてパッケージングされた高力価ウ
イルスとしてマトリゲルに添加した。５日後、内皮特異的ＦＩＴＣ接合Ｂａｎｄ
ｅｉｒｉｅａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａ Ｂ５レクチンを尾静脈経由で注射し、循
環させた。その後、脈管形成組織を除去し、抽出して、蛍光含量について分析す
ることによって、脈管形成を定量した。

【００３９】 図２０Ａおよび２０Ｂは、ＣＡＭと、変異ヌルフォーカス癒着キナーゼ、ＦＲ
ＮＫとの共感染によって、ＲａｆのＲａｓ誘導活性化がブロックされたことを示
すものである。２４時間後に脈管形成組織の一部を切除して、可溶化し、Ｒａｆ
を免疫沈降させて、キナーゼ死ＭＥＫをポスポリル化する能力によってＲａｆ活
性を評価したこと以外は、図１８において説明したようにＣＡＭを処理した。図
２０Ａは、結果の上の組合せのもとで評価した全Ｒａｆタンパク質に対する免疫
沈降活性を示すものである。図２０Ｂは、これらの条件のもとでの活性Ｒａｆ測
定の結果をグラフで表すものである。

【００４０】 （発明の詳細な説明） Ａ．定義 アミノ酸残基：ポリペプチドのそのペプチド結合部における化学的消化（加水
分解）によって生じたアミノ酸。本明細書中に記載するアミノ酸残基は、好まし
くは「Ｌ」異性体である。しかし、望ましい機能特性がポリペプチドによって保
持される限り、「Ｄ」異性体の残基を一切のＬ−アミノ酸残基に代えて用いるこ
とができる。ＮＨ_２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指
す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を
指す。標準ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２
−５９（１９６９）に記載、３７ＣＦＲ§１．８２２（ｂ）（２）に採用）に準
拠。

【００４１】 本明細書中では、すべてのアミノ酸残基配列が左右の配向がアミノ末端のカル
ボキシ末端への通常の方向である式によって表されることにご留意いただきたい
。さらに、アミノ酸前記配列の始めまたは終わりのダッシュは、一つ以上のアミ
ノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことにご留意いただきたい。

【００４２】 ポリペプチド：近接アミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチ
ドによって互いに結合したアミノ酸残基の線状配列を指す。

【００４３】 ペプチド：本明細書中で用いる時、ポリペプチドの場合のように互いに結合し
た約５０個以下のアミノ酸残基の線状配列を指す。

【００４４】 環状ペプチド：典型的なペプチドの場合のように幾つかのアミド結合を含むヘ
テロ原子環構造を有する化合物を指す。環状ペプチドは、線状ペプチドのｎ−末
端が線状ペプチドの末端カルボキシレートとアミド結合を形成した「頭−尾」環
化線状ポリペプチドであることもできるし、あるいはポリマーが、ホモデティッ
クまたはヘテロデティックであり、環を閉じるためにアミド結合、および／また
はジスルフィドブリッジ、チオエステル、チオアミド、グアニジノ、およびこれ
らに類する結合などのその他の結合を含む環状構造を含むこともできる。

【００４５】 タンパク質：ポリペプチドの場合のように互いに結合した５０個より多いアミ
ノ酸残基の線状配列を指す。

【００４６】 融合タンパク質：典型的なペプチド結合によって機能するように連結された（
「融合した」）少なくとも二つの異なるポリペプチドドメインを含むポリペプチ
ドを指し、この場合、二つのドメインは、自然界では融合が見られないペプチド
に該当する。

【００４７】 合成ペプチド：自然発生タンパク質およびそれらの断片を含まないペプチド結
合によって互いに連結したアミノ酸残基の化学生成鎖を指す。

【００４８】 Ｂ．一般的考察 本発明は、一般に、脈管形成がプロテインキナーゼＲａｆタンパク質によって
媒介されるという発見、および脈管形成を増強するためまたは抑制するために、
それぞれ、活性または不活性Ｒａｆタンパク質のいずれかを供給することによっ
て、脈管形成を調節することができるという発見に関する。本発明は、Ｒａｓタ
ンパク質がＲａｆに作用し、その結果、脈管形成を調節することができるという
発見にも関する。

【００４９】 この発見は、脈管形成、新しい血管の形成が多様な疾病過程において果たす役
割のため、重要である。他方で、疾病状態に関連する組織が組織増殖のために脈
管形成を必要とする場合には、脈管形成を抑制し、それによって病んだ組織の増
殖を抑制することが望ましい。傷ついた組織が組織の増殖および治癒のために脈
管形成を必要とする場合には、脈管形成を増強または促進し、それによって組織
の治癒および増殖を促進することが望ましい。

【００５０】 新しい血管の成長が病んだ組織に関連する病理学の原因である場合、またはそ
れに寄与する場合には、脈管形成の抑制によって疾病の有害作用が低減されるで
あろう。脈管形成を抑制することによって、人が疾病に介在し、症状を改善して
、場合によっては疾病を治癒することができる。

【００５１】 脈管形成の抑制的調節の恩恵を受けるであろう疾病および新生血管形成に関連
する組織の例には、癌、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症などの眼病、炎症性
疾患、再狭窄、およびこれに類するものが挙げられる。有害組織の増殖を持続さ
せるために新しい血管の成長が必要とされる場合には、脈管形成の抑制によって
組織に対する血液の供給を低下させ、その結果、血液供給必要量に基づく組織質
量の低下に寄与する。特に好ましい例には、腫瘍が厚さ数ミリメートルを越えて
成長するために、および固形腫瘍転移の定着のために新生血管形成を継続的に要
する腫瘍の成長が挙げられる。

【００５２】 新しい血管の成長が組織の治癒に寄与する場合には、脈管形成の増強が治癒を
助長する。こうした例には、異常、すなわち、糖尿病またはその他の疾病状態の
結果として血行不良がある虚血肢の患者の治療が挙げられる。治癒しない、従っ
て血管細胞増殖および新生血管形成の増大の恩恵を受ける可能性がある慢性創傷
の患者も考えられる。

【００５３】 本発明の方法は、治療が脈管形成に対して非常に選択的であり、他の生物学的
過程に対してはそうではないため、一部に有効である。

【００５４】 前に説明したように、脈管形成には、「新芽形成」を含む組織の新生血管形成
、脈管形成、または血管拡大を含む多様な過程が含まれ、これらの脈管形成過程
のすべてが、Ｒａｆタンパク質のみまたはＲａｓタンパク質との両方による影響
を受ける。外傷性創傷治癒、黄体形成および胚形成を除いて、大部分の脈管形成
過程は、疾病過程に関係し、従って、本治療法の使用は、疾病に対して選択的で
あり、有害な副作用を有さないと考えられる。

【００５５】 Ｃ．Ｒａｆタンパク質 本発明に用いるプロテインキナーゼＲａｆタンパク質は、使用目的に依存して
変化し得る。用語「Ｒａｆタンパク質」または「Ｒａｆ」は、活性または不活性
いずれかの形態の多様な形態のプロテインキナーゼＲａｆタンパク質を集合的に
指すために用いる。

【００５６】 「活性Ｒａｆタンパク質」は、脈管形成を増強、促進、活性化、誘発または増
大させる多様な形態のあらゆるＲａｆタンパク質を指す。脈管形成の増強を測定
するための検定物質を本明細書中に記載するが、これを制限と解釈しないでいた
だきたい。脈管形成レベルが、Ｒａｆを検定系に添加していない対照のレベルよ
り少なくとも１０％大きい、好ましくは２５％大きい、さらに好ましくは５０％
大きい場合、タンパク質は、活性とみなす。増強を測定するための好ましい検定
物質は、ＭＥＫ基質が^３２Ｐでホスホリル化される実施例に記載するようなイン
ビトロＲａｆキナーゼである。例となる活性Ｒａｆタンパク質は、実施例に記載
する。

【００５７】 「不活性Ｒａｆタンパク質」は、脈管形成を抑制、低下、阻害または制限する
多様な形態のあらゆるＲａｆタンパク質を指す。脈管形成の抑制を測定する検定
物質を本明細書中に記載するが、これを制限と解釈しないでいただきたい。脈管
形成レベルが、外因性Ｒａｆを検定系に添加していない対照のレベルより少なく
とも１０％低い、好ましくは２５％低い、さらに好ましくは５０％低い場合、タ
ンパク質は、不活性とみなす。抑制を測定するための好ましい検定物質は、ＭＥ
Ｋ基質が^３２Ｐでホスホリル化される実施例に記載するようなインビトロＲａｆ
キナーゼである。例となる不活性Ｒａｆタンパク質は、実施例に記載する。

【００５８】 本発明に有用なＲａｆタンパク質は、組織を含む天然源からの単離、組換えＤ
ＮＡ発現および精製による生産、およびこれらに類するものを含むあらゆる多様
な方法で生成することができる。Ｒａｆタンパク質は、対象となる組織に遺伝子
治療系を導入し、その後、組織内でタンパク質を発現させることによって、「イ
ンシトゥ」で生じることもできる。

【００５９】 Ｒａｆタンパク質をコードする遺伝子は、当該技術分野において既知の多様な
方法によって調製することができ、本発明は、この点に関して制限するものとみ
なさないでいただきたい。例えば、天然由来のＲａｆは、哺乳動物、鳥、ウイル
ス、およびこれらに類する種からの多様な同族体を含むことがよく知られており
、遺伝子は、タンパク質を発現するあらゆる組織からｃＤＮＡクローニング法を
用いて容易にクローニングすることができる。本発明に用いるために好ましいＲ
ａｆは、ｃ−Ｒａｆと呼ばれている哺乳動物または鳥の同族体などの細胞タンパ
ク質である。ヒトｃ−Ｒａｆが特に好ましい。本発明のさらに好ましいＲａｆタ
ンパク質は、構造上活性であるが、Ｒａｓ媒介活性化に依存しないＲａｆの融合
タンパク質である。こうしたＲａｆタンパク質は、融合タンパク質であり得る。
好ましいＲａｓ非依存性Ｒａｆタンパク質は、Ｒａｆ−ｃａａｘであり、これは
、実施例においてさらに説明するようなＫ−Ｒａｓ膜局在化ドメインと野生型Ｒ
ａｆのカルボキシ末端融合タンパク質である。

【００６０】 Ｄ．Ｒａｓタンパク質 本発明に用いるためのＲａｓ系統ＧＴＰアーゼは、使用目的に依存して変化し
得る。用語「Ｒａｓタンパク質」または「Ｒａｓ」は、活性または不活性いずれ
かの形態の多様な形態のＲａｓタンパク質を集合的に指すために本明細書中では
用いる。

【００６１】 「活性Ｒａｓタンパク質」は、脈管形成を増強、促進、活性化、誘発または増
大させる多様な形態のあらゆるＲａｓタンパク質を指す。Ｒａｓによる脈管形成
の増強を測定するための検定物質を本明細書中に記載するが、これを制限と解釈
しないでいただきたい。脈管形成レベルが、Ｒａｓを検定系に添加していない対
照のレベルより少なくとも１０％大きい、好ましくは２５％大きい、さらに好ま
しくは５０％大きい場合、タンパク質は、活性とみなす。例となる活性Ｒａｓタ
ンパク質は、Ｖ１２とも呼ばれるＲａｓ Ｇ１２Ｖ、およびＲａｓ Ｖ１２Ｓ３
５であり、これら両方は、実施例でさらに説明する。

【００６２】 「不活性Ｒａｓタンパク質」は、脈管形成を抑制、阻害、遅延または停止させ
る多様な形態のあらゆるＲａｓタンパク質を指す。脈管形成の抑制を測定する検
定物質を本明細書中に記載するが、これを制限と解釈しないでいただきたい。脈
管形成レベルが、外因性Ｒａｓを検定系に添加していない対照のレベルより少な
くとも１０％低い、好ましくは２５％低い、さらに好ましくは５０％低い場合、
タンパク質は、不活性とみなす。例となる不活性Ｒａｓタンパク質には、Ｒａｓ Ｓ１７Ｎ（または時としてＮ１７）と呼ばれるヌル変異Ｒａｓ、およびＶ１２
Ｃ４０が挙げられ、これら両方は、実施例においてさらに説明する。

【００６３】 本発明に有用なＲａｓタンパク質は、組織を含む天然源からの単離、組換えＤ
ＮＡ発現および精製による生産、およびこれらに類するものを含むあらゆる多様
な方法で生成することができる。Ｒａｓタンパク質は、対象となる組織に遺伝子
治療系を導入し、その後、組織内でタンパク質を発現させることによって、「イ
ンシトゥ」で生じることもできる。

【００６４】 Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子は、当該技術分野において既知の多様な
方法によって調製することができる。本発明は、この点に関して制限するものと
みなさないでいただきたい。例えば、天然由来のＲａｓは、哺乳動物、鳥、ウイ
ルス、およびこれらに類する種からの多様な同族体を含むことがよく知られてお
り、遺伝子は、タンパク質を発現するあらゆる組織からｃＤＮＡクローニング法
を用いて容易にクローニングすることができる。

【００６５】 集合形のＲａｓタンパク質は、Ｒａｆタンパク質について本明細書中で説明す
る同じ多様な実施形態において用いることができることは、本発明の教示からお
わかりいただけよう。従って、Ｒａｓタンパク質を用いるための詳細は、繰り返
さない。例えば、Ｒａｓは、脈管形成を調節するために活性形態で存在すること
もあるし、または不活性形態で存在することもあり、あるいは、Ｒａｓは、ベク
ター伝達系の使用によるＲａｓタンパク質生成物の核酸発現によって、および多
様な医薬品（治療用）組成物形態で、および本発明を実施するための製品形態で
供給されることもある。列挙したＲａｆ系試薬の代わりにＲａｓ系試薬を用いて
脈管形成を調節する方法も考えられる。

【００６６】 Ｅ．ＲａｆまたはＲａｓタンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子および
発現系 本発明は、本発明において特に使用する幾つかのヌクレオチド配列を記載する
。これらは、本発明に有用なＲａｆまたはＲａｓタンパク質をコードする核酸配
列、ならびに多様なＤＮＡセグメント、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子、および
Ｒａｆおよび／またはＲａｓタンパク質の発現のために構成されるベクターを定
義する。

【００６７】 従って、本発明のＤＮＡ分子（セグメント）は、全構造遺伝子、構造遺伝子の
断片、および本明細書中でさらに説明するような転写単位をコードする配列を含
むことができる。

【００６８】 好ましいＤＮＡセグメントは、本明細書中で定義するようなＲａｆタンパク質
をコードするヌクレオチド配列、またはその生物活性断片である。

【００６９】 もう一つの好ましいＤＮＡセグメントは、本明細書中で定義するようなＲａｓ
タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその生物活性断片である。生
物活性に関しては、発現されたタンパク質が、配位結合などの細胞中で見られる
無傷タンパク質の生物活性、または活性形態の場合には酵素活性の少なくとも一
部を有するであろうことを意味する。

【００７０】 好ましいｃ−Ｒａｆおよびｈ−Ｒａｓのアミノ酸残基配列およびヌクレオチド
配列は、実施例において説明する。

【００７１】 好ましいＤＮＡセグメントは、本明細書中に記載するＲａｆまたはＲａｓタン
パク質に対応するアミノ酸残基配列またはそれらの部分と実質的に同じであり、
好ましくは本質的にそれらから成るアミノ酸残基配列をコードする。代表的なお
よび好ましいＤＮＡセグメントは、実施例においてさらに説明する。

【００７２】 タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝子コードによって
、タンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に直接
関係づけられる。従って、構造遺伝子またはＤＮＡセグメントは、それがコード
するアミノ酸残基配列、すなわち、タンパク質またはポリペプチドによって定義
することができる。

【００７３】 遺伝子コードの重要、且つ、よく知られている特徴は、その重剰性である。す
なわち、タンパク質を作るために用いられる大部分のアミノ酸では、一つより多
いヌクレオチド暗号トリプレット（コドン）によって、特定のアミノ酸残基をコ
ードまたは指定することができる。従って、多数の異なるヌクレオチド配列によ
って、アミノ酸残基配列をコードすることができる。こうしたヌクレオチド配列
は、すべての生物において結果的に同じアミノ酸残基配列を生じることができる
ため、機能的に同等である。時として、プリンまたはピリミジンのメチル化変異
体が所定のヌクレオチド配列に組み込まれることがある。しかし、こうしたメチ
ル化は、いずれにせよコード関係には影響を及ぼさない。

【００７４】 核酸は、ポリリボヌクレオチドにせよ、ポリデオキシリボヌクレオチドにせよ
、すなわち、ＲＮＡにせよ、ＤＮＡにせよ、あるいはそれらの類似体であるにせ
よ、なんらかのポリヌクレオチドまたは核酸断片である。一定の分子生物学的方
法には１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが好ましいが、好ましい実施形態において、
核酸分子は、二重鎖のＤＮＡのセグメント、すなわちＤＮＡセグメントの形態で
ある。

【００７５】 ＤＮＡセグメントは、化学合成法および組換えアプローチを含む多数の手段に
よって、好ましくはクローニングまたは複製連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産さ
れる。ＲａｆまたはＲａｓタンパク質のすべてまたは一部のみをコードするＤＮ
Ａセグメントは、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１（１９８１）のホスホトリエステル
法によって、または自動合成法を用いることによって容易に合成することができ
る。加えて、より大きなＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントを規定するオリ
ゴヌクレオチド群を合成し、続いてハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドをラ
イゲーションして、完全なセグメントを造るなど、よく知られた方法によって容
易に調製することができる。別法には、ＲａｆまたはＲａｓタンパク質をコード
する膜を包含すると考えられるｃＤＮＡライブラリーに基づき用いられる一対の
オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによる好ましいＤＮＡセグメント
の単離が挙げられる。

【００７６】 勿論、化学合成により、天然アミノ酸残基配列をコードする塩基の代わりに適
する塩基を用いることによって、あらゆる望ましい修飾を簡単に行うことができ
る。この方法はよく知られており、本明細書中に記載する多様な、異なる、「修
飾された」ＲａｆまたはＲａｓタンパク質の生成に容易に適用することができる
。

【００７７】 さらに、ＲａｆまたはＲａｓタンパク質をコードする構造遺伝子から本質的に
成るＤＮＡセグメントは、その後、特定部位のまたはランダムな突然変異誘発な
どによって修飾して、あらゆる望ましい置換を導入することができる。Ｒａｆま
たはＲａｓタンパク質の多様な対立型およびＲａｆまたはＲａｓタンパク質をコ
ードする遺伝子も本発明における使用に適するものと考えられる。

【００７８】 １．ＲａｆまたはＲａｓ遺伝子のクローニング 本発明のＲａｆまたはＲａｓ遺伝子は、多様な生化学的方法によって、適する
ゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源からクローニングする
ことができる。これらの遺伝子のクローニングは、実施例に記載する、また当該
技術分野において既知の一般法によって行うことができる。

【００７９】 本発明の方法における使用に適するＲａｆまたはＲａｓ遺伝子をクローニング
するための核酸源には、これらのタンパク質を発現すると考えられる組織からの
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの形態でのメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）を挙げることができる。好ましい組織は、ヒト肺組織であるが、その他
一切の適する組織を用いることができる。

【００８０】 好ましいクローニング法には、標準法を用いたｃＤＮＡライブラリーの作成、
および本明細書中に記載するヌクレオチド配列に基づく対になったオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によるＲａｆコードまたはＲａｓコードヌ
クレオチド配列の単離が含まれる。あるいは、本明細書中に記載する核酸配列に
基づくハイブリダイゼイションプローブを用いる通常の核酸ハイブリダイゼイシ
ョン法によって、所望のｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー
から特定し、単離することができる。適するＲａｆコードまたはＲａｓコード核
酸を単離およびクローニングするその他の方法は、当業者には容易に明らかとな
るものである。

【００８１】 ２．発現ベクター 本発明は、本明細書中に記載するＲａｆおよび／またはＲａｓタンパク質をコ
ードするＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を考える。発現
可能なｒＤＮＡは、本発明のＲａｆまたはＲａｓコードＤＮＡセグメントにベク
ターを機能するように（フレーム内で、発現可能に）連結させることによって、
生産することができる。ＲａｆコードおよびＲａｓコード核酸が存在し、それ自
体にまたは別のプロモータに機能するように連結された複合発現が構築されるこ
とが想像される。このように、組換えＤＮＡ分子は、自然界では通常ともに見ら
れないヌクレオチド配列の少なくとも二つの核酸（すなわち、遺伝子およびベク
ター）を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。

【００８２】 本発明のＤＮＡセグメントが機能するように連結されるベクターの選択は、当
該技術分野においてよく知られているように、直接的には、所望の機能的特性、
例えばタンパク質発現、および形質転換すべき宿主細胞に依存する。組換えＤＮ
Ａ分子を構築する技術分野における典型的な考え。本発明が考慮するベクターは
、それが機能するように連結されるベクターＤＮＡセグメントに含まれる構造遺
伝子の複製、好ましくは発現も命じることが少なくともできる。

【００８３】 原核および真核発現ベクターは、ベクター構築の技術分野における通常の技術
者にはよく知られており、ＡｕｓｅｂｅｌらによってＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に、およびＳａｍｂｒｏｏｋらによ
ってＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１
９８９）に記載されている。これらの文献は、本明細書中で言及する一般組換え
ＤＮＡ法の多くも記載している。

【００８４】 一つの実施形態において、本発明が考慮するベクターには、原核レプリコン、
すなわち、それで形質転換された細菌宿主細胞などの原核宿主細胞の染色体外に
おいて組換えＤＮＡ分子を直接自律複製し、維持する能力を有するＤＮＡが含ま
れる。こうしたレプリコンは、当該技術分野においてよく知られている。加えて
、原核レプリコンを含むこうした実施形態は、その発現がそれで形質転換された
細菌宿主に耐薬物性を付与する遺伝子も含む。典型的な細菌耐薬物性遺伝子は、
アンピシリンまたはテトラサイクリンに耐性を付与するものである。

【００８５】 原核レプリコンを含むこうしたベクターは、それらによって形質転換された大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞において構造遺伝子の発現（転写およ
び翻訳）を命じることができる原核プロモータも含むことができる。プロモータ
は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能ならしめ、転写を生じさせるＤＮＡ配列に
よって形成された発現調節要素である。プロモータまたはその他のこうした調節
性核酸配列は、所望の発現調節および／または作用に依存して誘導または構成す
ることができる。細菌宿主に適合するプロモータ配列は、典型的に、本発明のＤ
ＮＡセグメントを挿入するために都合が良い制限部位を含むプラスミドベクター
に供給される。こうしたベクタープラスミドの典型は、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（カルフォルニア州、リッチモンド）から入手できるｐＵＣ８
、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カルフ
ォルニア州、サンディエゴ）から入手できるｐＲＳＥＴ、およびＰｈａｍａｃｉ
ａ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から入手できるｐＫＫ２２３である
。

【００８６】 真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合するものも
本発明の組換えＤＮＡ分子を形成するために用いることができる。真核細胞発現
ベクターは、当該技術分野においてよく知られており、幾つかの市場供給源から
入手することができる。典型的に、こうしたベクターは、所望のＤＮＡセグメン
トを挿入するために都合が良い制限部位を含んで供給される。こうしたベクター
の典型は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−
１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃３１２５５）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、実施例に記載する好ましいベクター、および
これに類する真核発現ベクターである。

【００８７】 本発明の文脈において、遺伝子発現に特に好ましい系には、遺伝子伝達成分、
すなわち、対象となる組織に遺伝子を伝達する能力が含まれる。適するベクター
は、所望のタンパク質を発現するように設計製作され、予め選択した標的組織を
感染させることができる特徴を有する組換えＤＮＡウイルス、アデノウイルスま
たはレトロウイルスベクターなどの「感染性」ベクターである。本明細書中に記
載するレトロウイルスベクター系が特に好ましい。

【００８８】 発現を命じるために組換えウイルスまたはウイルス要素を利用する哺乳動物細
胞系を設計製作することができる。例えば、アデノウイスル発現を用いると、ポ
リペプチドのコード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、遅延
プロモータおよび３連リーダー配列にライゲーションすることができる。その後
、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルス
ゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ
１またはＥ３）における挿入によって、生存可能であり、感染宿主においてポリ
ペプチドを発現することができる組換えウイルスを生じることとなろう（例えば
、Ｌｏｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３
６５５−３６５９（１９８４）を参照のこと）。あるいは、ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモータを用いることができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９（１９
８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９：８５７−８６４（１９８
４）；Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
．７９：４９２７−４９３１（１９８２）を参照のこと）。染色体外因子のよう
な複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイルス系ベクターには、特に興味深いもの
がある（Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：４８６（１９８
１））。このＤＮＡが標的細胞に侵入するとすぐに、プラスミドは、細胞１個あ
たり約１００から２００のコピーを複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は、宿
主の染色体へのプラスミドの組込みを必要とせず、そのため高レベルの発現を生
じる。これらのベクターは、ネオ遺伝子などのプラスミドにおける選択可能マー
カーを含むことによって、安定した発現のために用いることができる。あるいは
、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞におけるポリペプチドコードヌクレオチド
配列の発現を導入および命じることができるベクターとして用いるために修飾す
ることができる（Ｃｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，８１：６３４９−６３５３（１９８４））。高レベルの発現は、メタロチオ
ニンＩＩＡプロモータおよび熱ショックプロモータを含む（しかし、これらに限
定されない）導入可能なプロモータを用いて達成することもできる。

【００８９】 最近、ヒト卵巣癌保有ヌードマウスにおけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモータ 対 ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ発動チミジンキナー
ゼ（ＴＫ）遺伝子療法の長期生存者が研究されている。アデノウイルス媒介ＣＭ
Ｖプロモータ発動単純性疱疹ウイルスＴＫ遺伝子療法の細胞致死有効度が、ＲＳ
Ｖ発動療法より２〜１０倍有効であることがわかった。（Ｔｏｎｇら、Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ １８（１）：９３−９７（１９９９））。低レベルの発現に続き誘
導可能な高レベルの発現を必要とする遺伝子療法の適用のためのキメラプロモー
タの設計も説明されている（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｒａ
ｐｙ ７：１８８３−１８９３（１９９６））。

【００９０】 組換えタンパク質の長期高収率生産には、安定した発現が好ましい。複製のウ
イルス起原を含む発現ベクターを用いるのではなく、適する発現調節要素（例え
ば、プロモータおよびエンハンサ配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位
など）および選択可能マーカーによって調節されたｃＤＮＡを用いて宿主細胞を
形質転換することができる。上述したように、組換えプラスミドにおける選択可
能マーカーによって、選択物に耐性が付与されると共に、細胞がプラスミドをそ
れらの染色体に安定に組み込み、成長して、フォーカスを形成することができ、
これを次々にクローニングして、細胞株に拡大することができる。

【００９１】 例えば、異なるＤＮＡの導入後、設計製作細胞を放置して、栄養強化培地中で
１〜２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。それぞれｔｋ⁻、ｈｇｐ
ｒｔ⁻、ａｐｒｔ⁻細胞内で用いることができる、単純性疱疹ウイルスジミジン
キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））、ヒポキサ
ンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，４８：２０２６（１９６２）
）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ
，２２：８１７（１９８０））遺伝子を含む（しかし、これらに限定されない）
多数の選択系を用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性付与遺伝子を選択
の基準として用いることができる。例えば、メトトレキセートに耐性を付与する
ｄｈｆｒのための遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１）；マイコフ
ェノール酸に耐性を付与するｇｐｔのための遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））
；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を付与するｎｅｏのための遺伝子（Ｃｏｌ
ｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８
１））；およびハイグロマイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏのための遺伝子（
Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））。最近、その他の
選択可能遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
することができるｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用す
ることができるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：８０４（１９８８））；およびオルチニン脱炭酸酵素
抑制剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに耐性を付与
するＯＤＣ（オルチニン脱炭酸酵素）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．，Ｉｎ：Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新情報），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編集（１９８７））が説明されている。

【００９２】 ヒト遺伝子療法のために考慮される最も重要なベクターは、レトロウイルス起
原から誘導される（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７
（Ｓｕｐ．１）：３１−３２（１９９７）；Ｂａｎｋら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ
１８（１２）：９９９−１００７（１９９６）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０（１）：３５−４７（１９９８））。遺伝子伝達の治
療上の可能性およびアンチセンス療法は、多様な組織を治療するための多くのベ
クター系の開発を刺激してきた（脈管系：Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｆｕｎｄａｍ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１（２）：９７−１１０（１９９７）；Ｆｅｌ
ｄａｍａｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：３９１−４０４（
１９９７）；Ｖａｓｓａｌｌｉら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）
：４５９−６９（１９９７）；Ｂａｅｋら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２（３）：２
９５−３０５（１９９８）、腎臓：Ｌｉｅｎら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐ
ｐｌ．６１：Ｓ８５−８（１９９７）、肝臓：Ｆｅｒｒｙら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．９（１４）：１９７５−８１（１９９８）、筋肉：Ｍａｒｓｈａｌ
ｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８（３）：３６０−５（１９９
８））。これらの組織に加えて、ヒト遺伝子療法の重要な標的は、癌、それ自体
の腫瘍または関係組織である（Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，１７（４Ｂ）：２８８７−９０（１９９７）；Ｓｐｅａｒら、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１３３−４７（１９９８））。

【００９３】 本発明の方法における使用に容易に適合し得るウイルス遺伝子療法ベクター系
の特定の例を以下に簡単に記載する。レトロウイルス遺伝子伝達は、Ｆｅｄｅｒ
ｓｐｉｅｌおよびＨｕｇｈｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
５２：１７９−２１４（１９９８））によって最近再考察されており、これは、
ニワトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルス系統（Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９３：４９３１（１９
９６）；Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ，９１：１１２４１（１９９４））を詳細に説明している。ＡＬＶおよび
マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含むレトロウイルスベクターは、Ｓｖｏｂｏ
ｄａによってさらに説明されている（Ｇｅｎｅ ２０６：１５３−１６３（１９
９８））。

【００９４】 修飾レトロウイルス／アデノウイルス発現系は、本発明の方法の実施に容易に
適合し得る。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）系は、Ｋａｒａｖａｎａ
ｓら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２
８：７−３０（１９９８）によって再考察されている。アデノウイルス発現系は
、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＆
Ｈｏｅｆｆｌｅｒ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カルフォルニア集、
サンディエゴ、第５章、１１２〜１５７頁（１９９９）において、Ｖｏｎ Ｓｅ
ｇｇｅｒｎおよびＮｅｍｅｒｏｗによって再考察されている。

【００９５】 タンパク質発現系は、インビボおよびインビトロの両方で有効に用いられるこ
とが実証されている。例えば、単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ）タイプ１アンプリ
コンベクターによるヒト扁平上皮癌への有効遺伝子伝達が説明されている（Ｃａ
ｒｅｗら、１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１７６：４０４−４０８）。単純
性疱疹ウイルスは、神経系への遺伝子伝達に用いられている（Ｇｏｉｎｓら、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．３（Ｓｕｐ．１）：Ｓ８０−８（１９９７））。ＨＳ
Ｖ−ＴＫを用いる自殺型標的ベクターが固形腫瘍に関して試験されている（Ｓｍ
ｉｌｅｙら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（８）：９６５−７７（１９９７
））。単純性疱疹ウイルスタイプ１ベクターは、結腸癌細胞に関する癌遺伝子療
法に用いられている（Ｙｏｏｎら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２８（３）：３６６−
７４（１９９８））。肝実質細胞を治療するためのＨＳＶ／ＡＡＶ（アデノ関連
ウイルス）ハイブリッドを含むハイブリッドベクターは、トランスフェクション
の時間の長さを延長するように開発されている（Ｆｒａｅｆｅｌら、Ｍｏｌ．Ｍ
ｅｄ．，３（１２）：８１３−８２５（１９９７））。

【００９６】 ワクシニアウイルスは、その大きなゲノムのため、ヒト遺伝子療法のために開
発されている（Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら、Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．
Ａｍ．，７（３）：５７５−８８（１９９８））。プリンヌクレオチドピロホス
ホリラーゼを発現するチミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルスは、腫瘍志向型
遺伝子療法ベクターとして用いるために説明されている（Ｐｕｈｌｍａｎら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，１０：６４９−６５７（１９９９））
。

【００９７】 アデノ関連ウイルス２（ＡＶＶ）は、ヒト遺伝子療法に用いるために説明され
ているが、ＡＡＶは、哺乳動物細胞における最適な複製およびパッケージングの
ためにヘルパーウイルス（アデノウイルスまたは疱疹ウイルスなど）を必要とす
る（Ｓｎｏｅｃｋら、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，５（６）：５１４−２０（１
９９７）；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．，９（５）：４７０−５（１９９８））。しかし、感染性組換えＡＶＶのイン
ビトロパッケージングが説明されており、これによって、この系により期待がも
たれる（Ｄｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，４：１１６７−１１７２（
１９９７））。エコトロピックレトロウイルス受容体ｃＤＮＡのＡＡＶ媒介伝達
によって、ヒトの樹立および初代細胞のエコトロピックレトロウイルス導入が可
能となることが示されている（Ｑｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，７１（７
）：５６６３−５６６７（１９９７））。ヒト野生型ｐ５３を発現するＡＡＶベ
クターを用いる癌遺伝子療法が実証されている（Ｑａｚｉｌｂａｓｈら、Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，４：６７５−６８２（１９９７））。ＡＡＶベクターを
用いる血管細胞への遺伝子伝達も示されている（Ｍａｅｄａら、Ｃａｒｄｉｏｖ
ａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ．，３５：５１４−５２１（１９９７））。ＡＡＶは、
肝臓志向型遺伝子療法に適するベクターとして実証されている（Ｘｉａｏら、Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１２）：１０２２２−６（１９９８））。脳組織および
中枢神経系の遺伝子療法に用いるためのＡＡＶベクターは、実証されている（Ｃ
ｈａｍｂｅｒｌｉｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７９３（１−２）：１６９−７
５（１９９８）；Ｄｒｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，５（６）：８２
０−７（１９９８））。ＡＡＶベクターは、また、肺の遺伝子療法およびヒト嚢
胞性線維症上皮細胞への伝達のためのアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）と比較
されている（Ｔｅｒａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１１）：８９０４
−１２（１９９８））。

【００９８】 中間世代のレトロウイルス生産細胞によって機能的に組み込ませる非組込みＡ
ｄＶを作るために有用な質の各ウイルスを組み込むキメラＡｄＶ／レトロウイル
ス遺伝子療法ベクター系（Ｆｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．
，１５（９）：８６６−７０（１９９７）；Ｂｉｌｂａｏら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．
，１１（８）：６２４−３４（１９９７））。この強力な新世代の遺伝子療法ベ
クターを、癌を標的にした遺伝子療法に適応させている（Ｂｉｌｂａｏら、Ａｄ
ｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４５１：３６５−７４（１９９８））。ヒト
平伏茎癌細胞の皮下腫瘍結節の成長が抑制されたｐ５３を発現するＡｄＶの単独
注射（Ａｓｇａｒｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，７１（３）：３７７−８
２（１９９７））。進行性非小細胞肺癌の患者における野生型ｐ５３のＡｄＶ媒
介遺伝子伝達は、説明されている（Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ．，９：２０７５−１０８２（１９９８））。この同じ癌は、Ａ
ｄＶベクターにより媒介されるｐ５３遺伝子置換療法の対象となっている（Ｒｏ
ｔｈら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２５（３ Ｓｕｐｐｌ ８）：３３−７（
１９９８））。ｐ５３のＡｄＶ媒介遺伝子伝達は、インビボでの内皮細胞分化お
よび脈管形成を抑制する（Ｒｉｃｃｉｏｎｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（６）
：７４７−５４（１９９８））。転移性黒色腫のための免疫療法として、黒色腫
抗原ｇｐ７５のアデノウイルス媒介発現も説明されている（Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉ
ｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，５：９７５−９８３（１９９８））。Ａ
ｄＶは、エコトロピックレトロウイルスでのヒト細胞の感染を助長し、レトロウ
イルス感染効率を上げる（Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
，５（５）６２１−９（１９９８））。ＡｄＶベクターは、血管平滑筋細胞（Ｌ
ｉら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｅｎｇ１）．，１１０（１２）：９５０−４（
１９９７））、扁平上皮癌細胞（Ｇｏｅｂｅｌら、Ｏｔｏｌａｒｙｎｏｌ Ｈｅ
ａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．，１１９（４）：３３１−６（１９９８））、食道
癌細胞（Ｓｅｎｍａｒｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，７８（３）：３６６
−７１（１９９８））、メサンギウム細胞（Ｎａｈｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ
ｉｇ．Ｍｅｄ．，４６（５）：２０４−９（１９９８））、グリア細胞（Ｃｈｅ
ｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８（１６）：３５０４−７（１９９８））、
および動物の関節（Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２５（９）：１
６６６−７３（１９９８））への遺伝子伝達のために用いられている。より最近
では、ＡｃＶによって媒介されるカテーテルに基づく囲心遺伝子伝達が実証され
ている（Ｍａｒｃｈら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２２（１ Ｓｕｐｐｌ
１）：Ｉ２３−９（１９９９））。固有調節遺伝要素でのＡｄＶ系の操作によっ
て、インビボでのＡｄＶ媒介の調節可能な標的遺伝子発現を可能にする（Ｂｕｒ
ｃｉｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）．，９６（２）：３５５−６０（１９９９））。

【００９９】 アルファウイルスは、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス誘導ベ
クターと共に用いるために適する発現カセットでの形質転換に適するパッケージ
ング細胞株を用いて、ヒト遺伝子療法適用のために開発されている（Ｐｏｌｏら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：４５９８−４６０
３（１９９９））。非細胞変性フラビウイルスレプリコンＲＮＡに基づく系も開
発されている（Ｖａｒｎａｖｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５５（２）：３６
６−７５（１９９９））。自殺型ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子含有シンドビスウイルスベ
クターは、腫瘍細胞内に細胞特異的に標的を定めるために用いられている（Ｉｉ
ｊｉｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，８０（１）：１１０−８（１９９８
））。

【０１００】 ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）系レトロウイルスも遺伝子療法ベクターと
して有望である（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ．，９：２５１７−２５２５（１９９８））。フォーミーウイルスベクター
は、自殺型遺伝子療法のために設計されている（Ｎｅｓｔｌｅｒら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．，４（１１）：１２７０−７（１９９７））。組換えマウスサイトメ
ガロウイルスおよびプロモータ系も高レベルの発現のためにベクターとして用い
られている（Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，７３（１）：３
１−９（１９９８）；Ｔｏｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１８（１）：９３−７
（１９９８））。

【０１０１】 仙台ウイルス系ベクターの生成によって、非分割細胞への遺伝子伝達を実行可
能にしている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａ
ｓｅ，５４（１）：６１−８（１９９８））。

【０１０２】 非分割体細胞の形質転換を可能にするその他の努力において、レンチウイルス
ベクターが調査されている。複製欠陥ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）系ベクタ
ーを用いる嚢胞性線維症の遺伝子治療が説明されている（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：２２６１−２２６８（１９９７））
。レンチウイルスベクターによって肝臓および筋肉に伝達される遺伝子の持続的
発現も示されている（Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１７（３）：３１
４−７（１９９７））。しかし、安全性への関心は非常に強く、改善されたベク
ターの開発が急速に進んでいる（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（２）：９
９４−１００４（１９９８））。ＨＩＶ ＬＴＲおよびＴａｔの調査は、ベクタ
ーを開発するためのゲノムの構造についての重要な情報をもたらす（Ｓａｄａｉ
ｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，５４（２）：１１８−２８（１９９８））。
このように、有効なＨＩＶ系ベクターに関する遺伝学的要件は、現在、より良く
理解されている（Ｇａｓｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（３）：１８２８−３
４（１９９９））。自己不活性化ベクター、または条件パッケージング細胞株が
説明されている（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１２）
：９８７３−８０（１９９８）；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（
１０）：８１５０−７（１９９８）；Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１
１）：８４６３−７１（１９９８）；およびＫａｕｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２
４９（１）：１６７−７４（１９９８））。ＨＩＶベクターによるヒトリンパ球
およびＣＤ３４＋細胞の有効な導入が示されている（Ｄｏｕｇｌａｓら、Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：９３５−４５（１９９９）；Ｍｉｙｏｓ
ｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３（５４０２）：６８２−６（１９９９））。ネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）レンチウイルスベクターによる非分割ヒト細胞の
有効な導入が説明されており、これによってＨＩＶ系ベクターを用いることに関
連する安全上の関心が最小になる（Ｐｏｅｓｃｈｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，４（３）：３５４−３５７（１９９８））。ＦＩＶベクターによる
ヒト血液単核細胞の増殖性感染が示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．，７３（３）：２４９−８（１９９９））。

【０１０３】 多くのウイルスベクターは取り扱いが難しく、挿入されるＤＮＡに対する容量
が制限されるが、これらの制限および不利点は、対処されている。例えば、単純
化ウイルスパッケージング細胞株に加えて、ヒト疱疹ウイルス、単純性疱疹ウイ
ルスタイプ１（ＨＳＶ−１）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）か
ら誘導されるミニウイルスベクターは、遺伝基質の操作およびウイルスベクター
の生成を単純化するように開発されている（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
，７０（１２）：８４２２−８４３０（１９９６））。アダプタープラスミドが
ヘルパー非依存性レトロウイルスベクターへの異種ＤＮＡの挿入を単純化するこ
とは、以前に示されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６１（１０）：３００４−
３０１２（１９８７））。

【０１０４】 幾つかの非ウイルスベクターも説明されているので、ウイルスベクターが、遺
伝子療法を果たすための唯一の手段ではない。上皮成長因子／ＤＮＡポリプレッ
クス（ＥＧＦ／ＤＮＡ）の使用に基づく標的化非ウイルス遺伝子伝達ベクターは
、有効で特異的な遺伝子伝達をもたらすことが示されている（Ｃｒｉｓｔｉａｎ
ｏ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：３２４１−３２４６（１９９８）
）。カチオン性リポソームを用いる脈管系および中枢神経系の遺伝子療法は、実
証されている（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１４（５）：２８１
−９７（１９９７））。カチオン性リポソームを用いる膵臓炎の一時的な遺伝子
療法も果たされている（Ｄｅｎｈａｍら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２７（６）：８
１２−２０（１９９８））。遺伝子伝達のためのキトサン系ベクター／ＤＮＡ複
合体は有効であることが示されている（Ｅｒｂａｃｈｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅ
ｓ．，１５（９）：１３３２−９（１９９８））。テルプレックス系に基づく非
ウイルスＤＮＡ伝達ベクターが説明されている（Ｋｉｍら、５３（１−３）：１
７５−８２（１９９８））。ウイルス粒子被覆リポソーム複合体を用いて、遺伝
子伝達を果たすこともできる（Ｈｉｒａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１（１）：１１２−８（１９９７））。

【０１０５】 チミジンキナーゼ遺伝子をコードする非ウイルスＴ７ベクターを直接腫瘍に注
射することによる癌遺伝子療法が説明されている（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：７２９−７３６（１９９８））。プラスミドＤＮ
Ａ製剤は、直接注射遺伝子伝達に重要である（Ｈｏｒｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．，６（５）：６５６−７３（１９９５））。修飾プラスミドベクター
は、特に、直接注射用に改造されている（Ｈａｒｔｉｋｋａら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒ．７（１０）：１２０５−１７（１９９６））。

【０１０６】 このように、多種多様な遺伝子伝達／遺伝子治療ベクターおよび構成体が当該
技術分野において知られている。こうしたベクターは、本発明の方法における使
用に合わせて容易に作り変えられる。組換えＤＮＡ／分子生物学技術を用いて、
核酸セグメント（活性または不活性のいずれか）をコードする機能するように連
結されたＲａｆまたはＲａｓを、選択した発現／伝達ベクターに挿入する適切な
操作によって、本発明の実施のために多くの同等のベクターを生じることができ
る。

【０１０７】 Ｆ．脈管形成を調節するための方法 一つの側面において、本発明は、疾病過程または状態に関連する組織における
脈管形成を調節し、これによって、脈管形成に依存する組織における事象に影響
を及ぼすための方法を提供する。一般に、本方法は、疾病過程または状態に関連
するまたは被る組織に、Ｒａｆタンパク質あるいは活性または不活性Ｒａｆを発
現する核酸ベクターを含む脈管形成調節量の組成物を投与することを含む。

【０１０８】 さらなる方法は、疾病過程または状態に関連する組織に、Ｒａｓタンパク質あ
るいは活性または不活性Ｒａｓを発現する核酸ベクターを含む脈管形成調節量の
組成物を投与することを含む。もう一つの方法側面は、疾病過程または状態に関
連する組織に、脈管形成調節量のＲａｆおよびＲａｓタンパク質あるいは活性ま
たは不活性ＲａｆおよびＲａｓを発現する一つ以上の核酸ベクターを投与するこ
とを含む。

【０１０９】 皮膚、筋肉、腸、結合組織、脳組織、神経細胞、関節、骨、および脈管形成の
促進によって血管が侵入するこれらに類する組織を含むあらゆる多様な組織、ま
たは器質化した組織から成る器官は、疾病状態での脈管形成を持続させることが
できる。

【０１１０】 本発明の多くの実施例において、本発明に従って治療されるべき患者は、ヒト
の患者であるが、本発明は、すべての哺乳類について有効である。この文脈にお
いて、「患者」は、ヒトの患者、ならびに脈管形成を含む疾病に関連する組織の
治療が望まれるあらゆる哺乳動物種、特に、農業用および家庭用哺乳動物種の獣
医の患者、哺乳類である。

【０１１１】 このように、本発明を具体化する方法は、Ｒａｆおよび／またはＲａｓタンパ
ク質あるいはＲａｆおよび／またはＲａｓタンパク質を発現するための核酸ベク
ターを含む治療上有効な量の生理学的に許容できる組成物を患者に投与すること
を含む。

【０１１２】 ＲａｆまたはＲａｓタンパク質の投与についての投薬量範囲は、本明細書中で
さらに説明するように、タンパク質の形態およびその力価に依存し、脈管形成お
よび脈管形成によって媒介される病状を改善する望ましい効果をもたらすのに十
分多い量である。投薬量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、および
これらに類するものなどの有害な副作用をもたらすほど多くてはならない。一般
に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別および疾病の程度によって変化し、当業
者によって決定され得る。万一なんらかの合併症がある場合には、医師個人が投
薬量を調整することもできる。

【０１１３】 治療上有効な量は、治療を受ける組織において計れる程度の脈管形成の調節を
ひき起こすのに十分な、ＲａｆまたはＲａｓタンパク質、あるいは（活性または
不活性の）ＲａｆまたはＲａｓタンパク質をコードする核酸の量、すなわち、脈
管形成調節量である。脈管形成の調節は、本明細書中に記載するようなＣＡＭ検
定、腫瘍細胞の検査、または当業者には既知のその他の方法によってインビトロ
で測定またはモニターすることができる。

【０１１４】 ＲａｆまたはＲａｓタンパク質、あるいはこうしたタンパク質を発現する核酸
ベクターは、注射によって、または時間をかけて徐々に注入することによって非
経口的に投与することができる。典型的に、治療すべき組織には、全身投与によ
って体内において接近することができ、従って、最も多くの場合、治療用組成物
の静脈内投与によって治療するが、標的となる組織が標的分子を含む可能性があ
る場合には、その他の組織および送達手段が考慮される。従って、本発明の組成
物は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、キャビティー内投与、
経皮投与することができ、また所望とあらば、蠕動手段によって送達することが
できる。

【０１１５】 ＲａｆまたはＲａｓタンパク質あるいはＲａｆまたはＲａｓタンパク質を発現
する核酸ベクターを含有する治療用組成物は、通常、例えば、単位用量の注射の
ような静脈内投与をすることができる。本発明の治療用組成物に関して用いる場
合、用語「単位用量」は、患者に対する単位投薬量として適する物理的に個別の
単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の作
用物質を必要な生理学的に許容され得る希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと
共に含有する。

【０１１６】 一つの好ましい実施形態において、作用物質は、１回分の投薬量で静脈内投与
される。局所投与は、直接注射によって、または標的器官系の微小循環系を分離
することによって解剖学的に分離したコンパートメント、循環系における再潅流
、または病んだ組織に関連する脈管系の標的領域に対するカテーテルに基づく一
時的閉塞を利用することによって達成することができる。

【０１１７】 組成物は、投薬処方に適合するように、また治療に有効な量で投与される。投
与すべき量およびタイミングは、治療を受ける患者、有効成分を利用する患者の
系、および所望の治療効果の度合いに依存する。投与することが必要な有効成分
の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個人に固有のものである。しかし、全
身適用に適する投薬量範囲は、本明細書中で開示しており、投与の経路に依存す
る。投与に適する養生法も可変的であるが、典型的には、最初の投与後、一時間
以上の間隔で後続注射またはその他の投与により投薬を繰り返す。あるいは、イ
ンビボ療法用に指定された範囲の血液中濃度を維持するのに十分な持続点滴静脈
内注射が考えられる。

【０１１８】 １．脈管形成の抑制 脈管形成の抑制が重要である、脈管形成疾患と呼ばれる多様な疾病があり、こ
うした疾病には、免疫性および非免疫性炎、慢性関節リウマチおよび乾癬などの
炎症性疾患、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム斑における
毛細血管増殖および骨粗しょう症などの血管の不適切なまたは不適当な侵潤に関
連する疾患、ならびに固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増
殖症、血管腫、カポジ肉腫および腫瘍の成長を持続させるために新生血管形成を
必要とするこれらに類する癌などの癌関連疾患が挙げられるが、それらに限定さ
れない。

【０１１９】 従って、疾病状態に関連する組織における脈管形成を抑制する方法は、病状を
改善し、疾病によっては、疾病の治癒に寄与することができる。一つの実施形態
において、本発明は、疾病状態に関連する組織、それ自体における脈管形成の抑
制を考える。組織における脈管形成の程度、従って、本発明によって達成される
抑制の程度は、多様な方法によって評価することができる。

【０１２０】 従って、一つの実施形態において、治療を受ける組織は炎症を起こした組織で
あり、炎症を起こした組織の新生血管形成がある場合、抑制される脈管形成は、
炎症を起こした組織の脈管形成である。この特定の方法には、慢性関節リウマチ
の患者などにおける関節炎組織、免疫性または非免疫性炎組織、感染組織などに
おける脈管形成の抑制が挙げられる。

【０１２１】 もう一つの実施形態において、治療を受ける組織は、糖尿病性網膜症、黄斑変
性または血管新生緑内障などの網膜疾患を病む患者の網膜組織であり、網膜組織
の新生血管形成がある場合、抑制される脈管形成は、網膜組織の脈管形成である
。

【０１２２】 さらなる実施形態において、治療を受ける組織は、固形腫瘍、転移、皮膚癌、
乳腺癌、血管腫または血管線維腫およびこれらに類する癌の患者の腫瘍組織であ
り、腫瘍組織の新生血管形成がある場合、抑制される脈管形成は、腫瘍組織の脈
管形成である。本発明の方法によって治療できる典型的な固形腫瘍組織には、肺
、膵臓、乳腺、結腸、喉頭、卵巣およびこれらに類する組織が挙げられる。新生
血管形成が腫瘍の成長において重要な役割を果たすため、腫瘍組織の脈管形成の
抑制は、特に好ましい実施形態である。腫瘍組織の新生血管形成が不在の場合、
腫瘍組織は必要な栄養を得ることができず、成長が低速し、さらなる成長が停止
し、退縮して、結局、壊死することとなり、結果的に腫瘍を殺すこととなる。

【０１２３】 言い換えれば、本発明は、本発明の方法に従って腫瘍の脈管形成を抑制するこ
とにより腫瘍の新生血管形成を抑制する方法を規定する。類似して、本発明は、
本脈管形成抑制法を実施することによって腫瘍の成長を抑制する方法を提供する
。

【０１２４】 本方法は、転移の形成に対しても特に有効であるが、それは、（１）それらの
形成は、転移癌細胞が原発腫瘍から出ることができるように原発腫瘍の脈管形成
を求めるため、および（２）続発部位におけるそれらの定着が、転移の成長を持
続させるために新生血管形成を必要とするためである。

【０１２５】 さらにその上の実施形態において、本発明は、固形腫瘍に向けた、転移の定着
を制御するための通常の化学療法などのその他の療法と共に本方法の実施を考え
る。脈管形成抑制剤の投与は、典型的には化学療法中またはその後で行われるが
、腫瘍組織が脈管形成を誘発することによる有害な侵攻に反応して、腫瘍組織へ
の血液供給および栄養の供給によって回復しりであろう場合には、化学療法の養
生法の後で脈管形成を抑制することが好ましい。加えて、転移に対する予防とし
て固形腫瘍が除去されている場合、外科手術後に脈管形成抑制法を施すことが好
ましい。

【０１２６】 本発明法を腫瘍新生血管形成の抑制に適用することに関するかぎり、本方法は
、腫瘍組織の成長の抑制、腫瘍転移形成の抑制、および定着した腫瘍の退縮にも
適用することができる。

【０１２７】 再狭窄は、血管形成の成功を妨げる経皮経管冠動脈形成部位の組織への平滑筋
細胞（ＳＭＣ）の移行および増殖の過程である。再狭窄中のＳＭＣの移行および
増殖は、本方法によって抑制される脈管形成の過程であると考えることができる
。従って、本発明は、血管形成処置後の患者において、本方法に従って脈管形成
を抑制することによって再狭窄を抑制することも考える。際狭窄の抑制には、環
状血管壁に再狭窄の危険があるため、典型的には血管形成処置後に、典型的には
約２〜約２８日間、さらに典型的には処置後最初の約１４日間、不活性化チロシ
ンキナーゼを投与する。

【０１２８】 疾病状態に関連する組織における脈管形成を抑制するために、および従って、
脈管形成関連疾病の治療のための方法を実施するためにも、本方法は、脈管形成
が発生している、または発生する危険がある組織を、不活性化Ｒａｆタンパク質
またはそのタンパク質を発現するベクターを含む治療上有効な寮の組成物と接触
させることを含む。脈管形成の抑制および腫瘍の退縮は、治療用組成物との最初
の接触後７日という早さで発生する。不活性ＲａｆまたはＲａｓタンパク質に対
する追加のまたは持続的な暴露は、７日〜６週間が好ましく、好ましくは１４日
〜約２８日である。調節効果がより早く検出できる場合には、より短い期間の暴
露が有用であり得るが、投与して、少なくとも１２時間、後続暴露することが好
ましい。

【０１２９】 ２．脈管形成の増強 脈管形成を促進または増強することが望ましい場合には、組織への活性Ｒａｆ
またはＲａｓタンパク質の投与が有用である。投与の経路およびタイミングは、
抑制のために本明細書中で上に記載した方法に相当する。

【０１３０】 Ｇ．治療用組成物 本発明は、本明細書中に記載する治療法を実施するために有用な治療用組成物
を考える。本発明の治療用組成物は、生理学的に許容できる担体と共に、有効成
分としてそれに溶解または分散した本明細書中に記載するようなＲａｆまたはＲ
ａｓタンパク質あるいはＲａｆまたはＲａｓタンパク質を発現することができる
ベクターを含有する。好ましい実施形態において、治療目的で哺乳類またはヒト
の患者に投与する時、治療用組成物は、免疫原性ではない。

【０１３１】 本明細書中で用いる用語「製薬上許容され得る」、「生理学的に許容できる」
およびそれらの文法上の語尾変化は、それらを組成物、担体、希釈剤および試薬
に適用する場合、同義で用い、悪心、眩暈、急性胃蠕動およびこれらに類するも
のなどの望ましくない生理学的影響を生じることなく、それらの材料を哺乳類に
または哺乳類の表面に投与することができることを表す。

【０１３２】 その中に溶解または分散した有効成分を含有する薬理組成物の調製は、当該技
術分野においてより理解されており、処方によって限定する必要はない。典型的
に、こうした組成物は、溶液または懸濁液のように注射可能に調製されるが、使
用の前に溶液または懸濁液にするのに適する固体剤形を調製することもできる。
製剤は、乳剤にすることもできるし、リポソーム組成物として提供することもで
きる。

【０１３３】 有効成分は、製薬上許容され得る、有効成分と相溶性の、および本明細書中に
記載する治療法において用いるために適する量の賦形剤と混合することができる
。適する賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、
エタノールまたはその他、およびそれらの混合物である。加えて、所望とあらば
、組成物は、有効成分の有効性を向上させる湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤およ
びこれらに類するものなどの補助物質を少量含有することができる。

【０１３４】 本発明の治療用組成物は、その中の成分の製薬上許容され得る塩を含むことが
できる。製薬上許容され得る塩は、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、あ
るいは酢酸、酒石酸、マンデル酸およびこれらに類するものなどの有機酸を用い
て生成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とで生成される）を含む。
遊離カルボキシル基とで生成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム
、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピル
アミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカ
インおよびこれらに類するものなどの有機塩基から誘導することもできる。

【０１３５】 生理学的に許容できる担体は、当該技術分野においてよく知られている。液状
担体の例は、有効成分および水の他に材料を含有しない、あるいは生理学的ｐＨ
値でのリン酸ナトリウム、生理食塩水またはそれら両方（リン酸緩衝生理食塩水
など）を含有する無菌水溶液である。その上さらに、水性担体は、一つ以上の緩
衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよびカリウムなどの塩、デキストロース、ポリ
エチレングリコールおよびその他の溶質を含むことができる。

【０１３６】 液体組成物は、水に加えて、および水を除外して、液層を含むこともできる。
こうした追加の液層の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油乳
濁液である。

【０１３７】 治療用組成物は、脈管形成調節量の本発明のＲａｆまたはＲａｓタンパク質、
または有効量のＲａｆまたはＲａｓタンパク質を発現するのに十分な組換えＤＮ
Ａ発現ベクターを含有し、典型的には、全治療用組成物の重量に対して少なくと
も０．１重量％の量のＲａｆまたはＲａｓタンパク質を含有するように処方され
る。重量％は、全組成物に対するＲａｆタンパク質の重量比である。従って、例
えば、０．１重量％は、全組成物１００ｇに対してＲａｆまたはＲａｓタンパク
質０．１ｇである。ＤＮＡ発現ベクターに関しては、投与量は、発現ベクター、
治療を受ける組織、および考えられるこれらに類するものの特性に依存する。投
与するのに適する量は、ベクターの量、または予想される発現タンパク質の量に
よって測定することができる。

【０１３８】 Ｈ．製品（ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ） 本発明は、本発明のＲａｆまたはＲａｓタンパク質を提供するためのラベル付
容器である製品も考える。製品は、包装材料および包装材料内に収容される薬剤
を含む。

【０１３９】 製品中の薬剤は、ＲａｆまたはＲａｓタンパク質を供給するために適する本発
明の一切の組成物であり、開示されている指標に従って本発明中に記載するよう
な製薬上許容され得る形態に処方する。従って、組成物は、Ｒａｆおよび／また
はＲａｓタンパク質あるいはＲａｆおよび／またはＲａｓタンパク質を発現する
ことができるＤＮＡ分子を含むことができる。製品は、本明細書中で示す状態の
治療に用いるために十分な量の薬剤を単位投薬量または複数回用の投薬量で含有
する。

【０１４０】 包装材料は、それらの中に収容される薬剤を、例えば、脈管形成の抑制または
増強によって助長される状態およびこれらに類する本明細書中に開示する状態を
治療するために使用することを示すラベルを含む。ラベルは、使用についての説
示、および市販するために求められる可能性があるような関連情報をさらに含む
ことができる。包装材料は、薬剤を保管するための容器（複数を含む）を含むこ
とができる。

【０１４１】 本明細書中で用いる用語「包装材料」は、ガラス、プラスチック、紙、フォイ
ル、および薬剤を固定された手段の範囲内で保持することができるこれらに類す
るものなどの材料を指す。従って、例えば、包装材料は、プラスチックまたはガ
ラス製バイアル、積層体の封筒、および薬剤を含む医薬組成物を収容するために
用いられるこれらに類する容器であることができる。

【０１４２】 好ましい実施形態において、包装材料は、製品の内容物およびその中に収容さ
れている薬剤の使用を説明する具体的な表示であるラベルを含む。

【０１４３】 実施例 本発明に関する以下の実施例は例示的であり、もちろん本発明を特に
限定するとみなすべきではない。さらに現在既知であるか、将来開発される、本
発明のそのような変形は、当業者の権限内であり、以下で請求する本発明の範囲
内に入ると考えられる。

【０１４４】 １．ｃ−Ｒａｆ発現作成物の調製 本発明の方法によって、血管形成を調節するのに有用な発現作成物を調製する
ために、ｃ−Ｒａｆ ｃＤＮＡを操作し、発現作成物／ベクター内に挿入する。

【０１４５】 野生種（すなわち内在性）ヒトｃ−Ｒａｆをコード化するｃＤＮＡ配列は、図
７に示す核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１、ヌクレオチド１３０．．．２０
７６）に表され、Ｒａｆタンパク質のコード化翻訳アミノ酸残基配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．：２）は図８に示されている。

【０１４６】 本発明は、血管形成を調節する２種類のｃ−Ｒａｆ機能について説明する。前
に述べたように、１種類は血管形成を増加させるＲａｆ分子を含むため、活性タ
ンパク質と考えられる。血管形成を誘起する野生種Ｒａｆは各種の突然変異とと
もに、本発明で示されている。

【０１４７】 この状況で、血管成長を誘起するために、インビボでの腫瘍重量を増加させる
能力に関して機能する野生種ｃ−Ｒａｆの１つの好ましい突然変異は、Ｒａｆの
アミノ酸残基３０６−６４８（Ｒａｆ３０６−６４８）のみが発現されるＲａｆ
突然変異作成物である。この作成物は、全体の調節キナーゼドメインを欠失して
いるため、構成的に活性なＲａｆタンパク質と呼ばれる。

【０１４８】 Ｒａｆの突然変異は血管形成に対する正反対の調節効果を有することが示され
ており、血管形成を刺激する代わりに阻害する。そのような突然変異は、不活性
Ｒａｆ突然変異と呼ばれる。この阻害活性を付与する突然変異を持つタンパク質
は、成長因子刺激から生じる向上したＲａｆ活性と同様に、Ｒａｆの内在性活性
から発生することを含めて、新血管形成を阻害するという点で優性陰性Ｒａｆタ
ンパク質とも呼ばれる。したがって、本発明の野生種ｃ−Ｒａｆのある突然変異
も、血管成長を阻止するその能力に関して、優性陰性遺伝子として機能するため
、たとえば、インビボでの腫瘍重量が減少する。

【０１４９】 Ｒａｆ作成物の阻害例は、リジンアミノ酸残基３７５が別のアミノ酸、好まし
くはメチオニン（すなわちＲａｆ Ｋ３７５Ｍ）に突然変異されるＲａｆ突然変
異である。キナーゼドメインにおける点突然変異は、ＡＴＰ結合を防止し、血管
細胞および腫瘍細胞の情報伝達および増殖に関係するキナーゼ依存性Ｒａｆ機能
も阻害する。別の阻害性Ｒａｆ突然変異体は、キナーゼドメインを欠失する、切
断Ｒａｆタンパク質（すなわちＲａｆ１−３０５）の形のアミノ酸残基１−３０
５を含む。

【０１５０】 点突然変異に関して、望ましい阻害または刺激活性で生じる突然変異は、本発
明での使用を考慮される。Ｒａｆタンパク質の望ましい調節効果が無傷である限
り、望ましいＲａｆタンパク質（突然変異またはその断片）と発現されたアミノ
酸タグ、抗原エピトープ、蛍光タンパク質または他のそのようなタンパク質、あ
るいはペプチドを組合わせた融合タンパク質作成物も考慮される。

【０１５１】 ｃＤＮＡで望ましいｃ−Ｒａｆ突然変異を生成するには、当業者に既知の標準
の特定部位突然変異誘発手順を用いた。望ましい突然変異を含むよう設計された
ＰＣＲプライマーも、次のクローニングステップを促進するために、制限部位を
用いて設計された。ニワトリ、ヒトならびに同族体の既知のｃＤＮＡ配列および
それに続く新たな作成物の形成に基づくＰＣＲ増幅技法によって、Ｒａｆコード
化核酸配列のフラグメント全体は、核酸作成物から切除された。

【０１５２】 特に図７に示す野生種Ｒａｆ ｃＤＮＡ配列は、本発明の原理を証明するため
にＲａｆ突然変異体を作成する複数の方法で改良された。これらの突然変異体は
、本明細書で述べるレトロウィルス発現系に挿入された。

【０１５３】 Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍと呼ばれる第１の突然変異Ｒａｆは、アミノ酸残基位置３
７５のリジンがメチオニンで置換された野生種ヒトＲａｆ内で作成された。Ｒａ
ｆ Ｋ３７５Ｍは、本明細書で定義される「不活性」Ｒａｆタンパク質である。

【０１５４】 Ｒａｆ ３０６−６４８と呼ばれる第２の突然変異体は、アミノ末端部が削除
された野生種ヒトＲａｆ内で作成され、切断されたカルボキシ末端残基３０６−
６４８を残した。Ｒａｆ ３０６−６４８は本明細書で定義された「活性」Ｒａ
ｆタンパク質である。

【０１５５】 Ｒａｆ １−３０５と呼ばれる第３の突然変異Ｒａｆは、カルボキシ末端部が
削除された野生種ヒトＲａｆで作成され、切断アミノ酸末端残基１−３０５を残
した。Ｒａｆ １−３０５は本明細書で定義された「活性」Ｒａｆタンパク質で
ある。

【０１５６】 本発明のＲａｆまたはＲａｓタンパク質の発現に使用される別の発現ベクター
も、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，１７３，４１４号、第５，４３６
，１４６号、第５，５８９，３７７号、第５，６７０，４８８号に記載されたア
デノウィルスベクターを含む。ＲａｆまたはＲａｓ調節タンパク質の送達の別の
方法には、米国特許第５，６７５，９４５号に記載された非ウィルスベクター系
によるＲａｆまたはＲａｓ ｃＤＮＡの送達と、米国特許第５，５８９，４６６
号に記載された裸のＤＮＡとしてのｃＤＮＡ自体の送達が含まれる。本発明の作
成物の送達も、ウィルスベクターの局所投与に限定されず、ウィルスベクター調
製物も血管底への全身送達のために静脈注射されるか、皮下注射、組織内注射な
どを行うこともできる。これらのベクターも、たとえば腫瘍の局部注射による新
血管形成増加部位を標的とすることができる。

【０１５７】 インビトロ発現タンパク質も、タンパク質またはポリペプチドの送達に有用な
方法によって、選択されたＲａｆまたはＲａｓタンパク質発現および精製の後の
送達について考慮される。そのような方法の１つは、米国特許第４，３５６，１
６７号、第５，５８０，５７５号、第５，５４２，９４３号および第５，６４３
，５９９号で述べられるようなリポソーム送達を含む。本発明のＲａｆまたはＲ
ａｓタンパク質の発現および／または送達で使用する、他のベクターおよびタン
パク質送達系は、当業者に既知である。

【０１５８】 ２．ヒト腫瘍モデル 本発明の有効性を証明するために、ヒト腫瘍細胞を無胸腺症マウスの脇腹に皮
下移植し、約１００ｍｍ^３まで増殖させた。この異種移植モデルにおいて、移植
片周囲のマウス内皮細胞は、正常な血管形成シグナルに反応する増殖中のヒト腫
瘍内へ増殖する脈管構造を形成し、腫瘍は血管形成されるようになる。したがっ
て、マウス内皮細胞によって微細血管が形成され、これに対して腫瘍組織自体は
ヒト細胞を含む。

【０１５９】 ３．レトロウィルス送達ベクターはマウス血統細胞に感染し、ヒト腫瘍細胞に
は感染しない Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈのレトロウィルス発現ベクター系を用いて、本明細書で説
明するＲａｆの作成物を含むエコトロフィックレトロウィルスを作成した。感染
レトロウィルスの組織特異性を証明するために、図１の凡例に示すようなエコト
ロフィックパッケージング細胞を用いて、β−ガラクトシダーゼを発現するレト
ロウィルス発現ベクター作成物をパッケージした。

【０１６０】 マウス内皮細胞であるマウス３Ｔ３、ヒト上皮腺癌ＬＳ１７４細胞およびヒト
メラノーマＭ２１細胞をインビトロで培養し、それぞれエコトロフィックパッケ
ージしたレトロウィルスに曝露した。マウス細胞のみが検出可能なβ−ガラクト
シダーゼを発現し、マウス細胞のみが本発現系のエコトロフィックパッケージさ
れたレトロウィルスに感染したことが示された。

【０１６１】 ４．不活性ＲａｆキナーゼはインビトロでＲａｆキナーゼ活性を阻害する 不活性Ｒａｆキナーゼの細胞効果を証明するために、βＦＧＦによって誘起さ
れたマウス上皮細胞を用いたインビトロモデルを用いた。マウス上皮細胞へのβ
ＦＧＦ投与によるＲａｆ活性の正常な誘起は、これらの細胞が、図２の凡例に示
すような不活性Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼ作成物を発現する最初にレトロウィ
ルス作成物に感染されたときに阻害された。図２のデータは、不活性Ｒａｆキナ
ーゼを発現するベクターに細胞が最初に感染したときに、Ｒａｆキナーゼ活性の
量は実質的に減少していることを示している。

【０１６２】 ５．不活性Ｒａｆキナーゼはインビボでの血管形成を阻害する 血管形成のインビボマウス皮下モデルを用いて、不活性Ｒａｆキナーゼの効果
を研究した。そのために、図３の凡例に示すような不活性Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキ
ナーゼタンパク質を生成するレトロウィルスを発現する細胞とともに、または単
独で、βＦＧＦを注射することによって、マウスに血管形成を誘起した。図３に
示すように、不活性Ｒａｆキナーゼの存在は実質的に、血管形成指数を低下させ
た。

【０１６３】 ６．活性Ｒａｆキナーゼはインビボでの血管形成を誘起する 血管形成のマウス皮下モデルを用いて、活性Ｒａｆキナーゼの効果を研究した
。そのために、図４の凡例に示すような活性Ｒａｆ ３０６−６４８キナーゼを
生成するレトロウィルスを発現する細胞を注射して、血管形成を誘起した。図４
に示すように、突然変異的に活性なＲａｆキナーゼはインビボでの血管形成を誘
起する。

【０１６４】 ７．不活性Ｒａｆキナーゼはアポトーシスを誘起する 上述したマウス異種移植モデルを用いて、不活性Ｒａｆのインビボ効果を研究
した。そのために、図５の凡例に示すように、１５０万個のヒト腺癌ＬＳ１７４
細胞を注射してモデルを作成した。約１００ｍｍ^３の腫瘍塊のせ異性に続いて、
不活性Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼを発現するレトロウィルスを腫瘍塊に注射し
、４８時間後に腫瘍塊の切片に対して免疫組織化学法を行った。図５（フラッグ
タグ）に示す結果は、レトロウィルス感染が内皮固有であることを示しており、
さらにｖＷＦ菌株によって、上皮細胞がレトロウィルス感染に対して共存された
ことを示している。染色データを組合わせると、内皮細胞、ウィルス感染および
アポトーシス発生がすべて共存していることが示され、不活性Ｒａｆタンパク質
のウィルス送達が内皮固有であり、不活性Ｒａｆがアポトーシスを誘起すること
を示している。

【０１６５】 ８．不活性Ｒａｆキナーゼは腫瘍縮退を誘起する 上述したマウス異種移植モデルを用いて、不活性Ｒａｆの腫瘍縮退に対するイ
ンビボ効果を研究した。そのために、図６の凡例に示すようにモデルを作成し、
不活性Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼをウィルス上澄またはウィルス発現細胞とし
て指示どおりに与えた。生成した腫瘍は、不活性Ｒａｆキナーゼの導入時に迅速
に縮退するのがわかった。

【０１６６】 ９．血管形成はＲａｆ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の活性化に依存する 成長因子受容体とインテグリン受容体連結および活性化の、血管形成の調節に
関与する有糸***促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）／細胞外シグ
ナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）カスケードの活性化に対する相互作用を決定するた
めに、以下の実施例９〜１１の研究を実施した。インテグリン仲介細胞付着によ
るＭＡＰＫカスケードの活性化は、Ａｐｌｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅ
ｖ．， ５０：１９７−２６３（１９９８）が概観したように、多くの研究所に
よって研究されている。階層的ＥＲＫカスケードは、小型のグアノシントリホス
フェート（ＧＴＰａｓｅ）Ｒａｓを補充する有糸***促進因子および成長因子の
受容体を持つ細胞膜で開始する。Ｒａｓは次にプロテインキナーゼのＲａｆに結
合し、それを膜に補充することによってＲａｆを活性化し、Ｒａｆはまだ明らか
になっていない機構で活性化される。活性化されたＲａｆは次に、ＭＥＫ（ＭＡ
ＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）をリン酸化および活性化する。次いでＭＥＫは、ＥＲＫ
１およびＥＲＫ２をリン酸化および活性化し、これらは次に核に転座し、転写因
子をトランス活性化して、変化した遺伝子発現によって増殖、分化または有糸分
裂を行う（Ｔｉｂｂｌｅｓら、Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，
５５：１２３０−１２５４（１９９９））。

【０１６７】 成長因子および／またはインテグリンシグナル伝達によって仲介される、Ｒａ
ｆの活性化におけるＲａｓの上流調節は本研究の主題であるが、シグナル伝達気
泡はまだ完全に理解されていない（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ．， ２７５：８８５４−８８６２（２０００）；Ｈｏｗｅら、Ｊ． Ｂｉ
ｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：２７２６８−２７２７４（１９９８）を参照）
。しかし、さらに重要なことに、細胞膜受容体信号伝達を通じて血管形成を調節
するＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードの活性化は、本発明以前には述
べられていない。

【０１６８】 Ａ．ＲａｓはβＦＧＦへの曝露によって生じる それゆえ、血管形成がＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路に依存するかどう
かを最初に評価するために、Ｒａｓプルダウン検定法で決定されたように、βＦ
ＧＦに曝露させたヒヨコ漿尿膜（ＣＡＭ）ライゼート中でＲａｓ活性を測定した
。

【０１６９】 正常な胚血管形成によって成熟した血管が生成された後に、血管形成をＣＡＭ
上で誘起することができる。血管形成は、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ
， ３２９：６３０（１９８７）およびＡｕｓｐｒｕｎｋら、Ａｍ． Ｊ． Ｐ
ａｔｈｏｌ．， ７９：５９７（１９７５）で述べられているように、特定のサ
イトカインまたは腫瘍フラグメントに反応して誘起されることが示されている。
ＣＡＭはヒヨコ胚から調製し、次に血管形成の誘起とその阻害を行った。１０日
齢のヒヨコ胚はＭｃＩｎｔｙｒｅ Ｐｏｕｌｔｒｙ（カリフォルニア州レイクサ
イド）より入手し、湿度６０％で３７℃にてインキュベートした。小型の工作用
ドリル（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｅｍｅｒｓｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社の部門、ウィスコ
ンシン州ラシーン）を用いて、卵の端の気嚢真上に殻を破って小孔を開けた。第
２の孔は、卵の太い側の殻の、以前に卵をロウソクにすかして判定した胚血管を
避けた領域にドリルで開けた。最初の孔に負圧を加えると、ＣＡＭ（漿尿膜）が
卵殻膜から引き離され、ＣＡＭ上に偽気嚢が作成された。小型モデル研削砥石を
用いて、下がったＣＡＭの上の殻から１．０センチメートル（ｃｍ）×１．０ｃ
ｍ平方の窓を切除した。小窓によって、下にあるＣＡＭに直接触れられるように
なった。

【０１７０】 次に、血管形成が収まる胚発生１０日目に、生じたＣＡＭ調製物を使用した。
したがって後者の調製物は、必要な場合に以下で説明するように、サイトカイン
処理または腫瘍接触に反応した新たな血管形成の誘起について、本発明で使用し
た。

【０１７１】 １）成長因子によって誘起された血管形成 血管形成はサイトカインまたは成長因子によって誘起されることが示されてい
る。血管形成は、組換え塩基性線維芽細胞成長因子（βＦＧＦ）または血管内皮
細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を含むＨａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩溶液、ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州
グランドアイランド）すなわちＨＢＳＳで平衡にした５ミリメートル（ｍｍ）×
５ｍｍのＷｈａｔｍａｎフィルタディスクを、９日または１０日齢のヒヨコ胚の
ＣＡＭ上に、血管を避けた領域に配置して誘起し、窓は後でテープで封をした。
他の成長因子も血管成長の誘起に有効である。血管形成阻害が拮抗剤、たとえば
ＬＭ６０９モノクローナル抗体などの静脈注射によって評価される検定法の場合
、血管形成は、線維芽細胞増殖培地中のβＦＧＦまたはＶＥＧＦによって最初に
誘起し、次に実施例１０に述べるように阻害剤を投与する。血管形成は７２時間
後に顕微鏡写真法によって監視した。

【０１７２】 １０日齢ヒヨコ胚によるＣＡＭは、ＰＢＳまたは３０ナノグラム（ｎｇ）のβ
ＦＧＦのどちらかによって飽和させたフィルタディスクによって局所的に刺激し
た。５分後、ＣＡＭ組織を切開し、溶解緩衝液中で均質化し、次に、ＲａｆのＲ
ａｓ結合ドメインをコード化するＧＳＴ融合ペプチドによって沈殿される能力に
よって、Ｒａｓ活性を決定した。活性ＲａｓのみがＲａｆに結合するため、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に結合されたＲａｆのＲａｓ結合
ドメインより成る組換えタンパク質が生成した。これに対してＧＳＴはセファロ
ースビードに結合し、組織ライゼートから活性Ｒａｓを沈殿させることができた
。

【０１７３】 結果を図９に示すが、βＦＧＦに曝露したＣＡＭライゼート中のＲａｓ活性は
、Ｒａｓプルダウン検定法によって決定されたように上昇した。したがってＲａ
ｓは、ＣＡＭ中でβＦＧＦに曝露させることによって誘起される。ＣＡＭの血管
由来の血管形成におけるＲａｓの役割は、実施例１０で述べるようにさらに評価
する。

【０１７４】 Ｂ．Ｒａｓは血管形成に必要である 次に、血管形成がＣＡＭ調製物中でのＲａｓの活性化に依存するかどうかを判
定するために、ＣＡＭを優性陰性Ｒａｓ突然変異体Ｓ１７Ｎ Ｒａｓを発現させ
る目的で、以下に述べるようにＲａｓのβＦＧＦ活性化と組合わせて、ＲＣＡＳ
レトロウィルス調製物に曝露した。この突然変異体は、ＧＴＰに対して優先的親
和性を有するＧＤＰと結合し、そのためＲａｓ−ＧＥＦを隔離することによって
内在性Ｒａｓ活性化を阻害する突然変異体を与えることが示されている。それゆ
え、ＣＡＭ血管形成モデルでの突然変異体の使用により、血管形成でのＲａｓの
役割を評価する方法が与えられる。

【０１７５】 Ｓ１７Ｎ Ｒａｓ突然変異体は、前に述べた標準の特定部位突然変異誘発によ
って、位置１７にあるセリン（Ｓ）残基のコード化トリプレットを、アスパラギ
ン（Ｎ）をコード化するコドンによって置換して、野生種ヒトＲａｓ（Ｗｔ Ｈ
−Ｒａｓ）配列から作成される。このような突然変異体は、たとえばＳｔｅｗａ
ｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５：８８５４−８８６２（２００
０）によって、他者が述べている。

【０１７６】 優性陰性発現作成物のレトロウィルス作成物を調製するために、ｗｔ Ｈ−Ｒ
ａｓに対してこのような突然変異誘起を行い、それをコード化する核酸配列を図
１０に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３）。図１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４
）は、図１０に示す野生種ヒトＲａｓ（ｗｔ Ｈ−Ｒａｓ）のｃＤＮＡヌクレオ
チド配列によってコード化されるアミノ酸残基配列を示す。以下に述べるのと同
様に、Ｓ１７Ｎ Ｒａｓを作成する目的でｗｔ Ｈ−Ｒａｓ ｃＤＮＡ内で望ま
しい突然変異を発生させるために、当業者に既知の標準の特定部位突然変異誘発
手順を使用した。望ましい突然変異を含むよう設計されたＰＣＲプライマーも、
次のクローニングステップを促進するために制限部位を持つように設計された。
ニワトリ、ヒトなどのＲａｓ同族体の既知のｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲ増幅技
法およびその後の新たな作成物の形成によって、Ｒａｓコード化核酸配列のセグ
メント全体を核酸作成物から削除できる。ＰＣＲによって作成されたすべての突
然変異作成物も、クローンの予測ＤＮＡ配列を確認するために、ＰＣＲによって
配列決定できる。

【０１７７】 次に生じた突然変異Ｒａｓ配列を、本明細書で述べるレトロウィルス発現ベク
ター作成物として調製した。本発明で使用するための好ましい発現作成物の１つ
は、ＲＣＡＳ（Ａ）作成物である。この発現ベクターは、力価を向上させるため
に強化ブライアンポリメラーゼ（ＢＰ）を含む、一連の複製適格性ニワトリ肉腫
ウィルスに基づいており、正常なニワトリ細胞上で発現されるＡ型エンベロープ
グルコプロテインに対して特異性である（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ， ５２：１７９−２１４（１９９７）で概説されている；Ｈｕｇ
ｈｅｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：３００４−３０１２（１９８７）；Ｆｅ
ｋｅｔｅ＆Ｃｅｐｋｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． １３：２
６０４−２６１３（１９９３）；Ｉｔｏｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２
：２９１−３００（１９９６）；およびＳｔｏｔｔら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２４：６６０−６６６（１９９８）も参照）。本明細書ではＲＣＡＳと呼
ぶ、ＲＣＡＳ（Ａ）の完全な配列は、当業者に既知であり、データベースで利用
できる。

【０１７８】 ５マイクログラム（ｕｇ）の調製ＲＣＡＳ作成物を次に、ニワトリ固定化線維
芽細胞系、ＤＦ−１（ミネソタ大学Ｄｏｕｇ Ｆｏｓｔｅｒより寄贈）に形質移
入した。この細胞系は初期ヒヨコ胚線維芽細胞と同様に、ウィルス作成が可能で
あるが、ＤＦ−１細胞系はより高い力価を生成した。ウィルス上澄は、無血清Ｃ
ＬＭ培地［組成：ＤＭＳＯ、ギ酸、グルタミン酸およびＭＥＭビタミン溶液を補
充したＦ−１０培地ベース］中でサブコンフルエントＤＦ−１産生細胞系から収
集した。３５ミリリットルのウィルス上澄を、４℃にて２時間、２２，０００ｒ
ｐｍにて超遠心分離法によって濃縮した。これらの濃縮ウィルスペレットを、元
の体積の１００倍の無血清ＣＬＭ培地によって再懸濁させ、分割して、−８０℃
で保存した。ＲＣＡＳ−ＧＦＰと呼ばれる緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード
化するヌクレオチド配列を持つ対照ウィルスベクターの連続希釈、４８−７２時
間インキュベートした初期ヒヨコ胚線維芽細胞に対する感染によって力価を評価
した。濃縮後に得られたウィルスストックの力価は日常的に１０^８Ｉｕ／ｍｌを
超えた。

【０１７９】 ウィルスストックを用いたＣＡＭアッセイの場合、酢酸コルチゾンに浸した直
径６ｍｍのＷｈａｔｍａｎフィルタディスクを、３ｍｇの酢酸コルチゾンの９５
％エタノール溶液に３０分間浸漬して調製した。ディスクは層流フード内で乾燥
させて、次に２０μｌのウィルスストックに、ディスク１枚当たり１０分間浸漬
した。これらのディスクは１０日齢ヒヨコ胚のＣＡＭに当て、セロハンテープで
封をして、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートした。次に偽ＰＢＳまたは
成長因子を５μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＡＭ組織へのウィルス追加としての体積１
５マイクロリットル（ｕｌ）の適切なウィルスストック中のＣＡＭに加えた。７
２時間後、ＣＡＭを収穫し、ディスク下のＣＡＭの分岐点数の二重盲検計数によ
って決定した血管形成指数の変化を検査した。キナーゼ検定法の場合、ディスク
下の組織はＲＩＰＡで収集し、モータグラインダで均質化し、前に実施例４で述
べたようにＲａｆを決定した。免疫蛍光検査研究では、ディスク下のＣＡＭ組織
をＯＣＴ内で凍結し、低温保存し、４ｕｍで切断し、アセトン中で１分間固定し
、３％標準ヤギ血清で１時間インキュベートし、次いで以前述べたようにウサギ
一次抗体中でインキュベートし（Ｅｌｉｃｅｉｒｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉ
ｏｌ．， １４０：１２５５−１２６３（１９９８））、ＰＢＳ中で洗浄し、蛍
光二次抗体を用いて検出した。

【０１８０】 図１２に示す結果は、突然変異体ヌルＲＡＳであるＳ１７Ｎによる感染がＣＡ
Ｍでの成長因子誘起の血管形成を阻止したことをグラフで明らかにしているが、
血管形成を誘起するためにβＦＧＦに曝露しなかったＣＡＭには何の効果もなか
った。したがって、ＲａｓはβＦＧＦ誘起血管形成に必要である。

【０１８１】 Ｃ．Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路によるＲａｓシグナル伝達は、重要な血管形
成調節因子である 血管形成の調節におけるＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のＲａｓの役割をさらに
評価するために、上述したように別のＨ−Ｒａｓ突然変異タンパク質をＣＡＭ調
製物中で使用し、その結果を以下と図１３に示す。この状況で、本発明は血管形
成を調節できる２種類のＲａｓ機能について述べる。Ｒａｆタンパク質について
以前説明したように、１種類は血管形成を増進させるＲａｓ分子を含み、そのた
めに活性タンパク質と見なされる。野生種Ｒａｓは各種の突然変異とともに、血
管形成を誘起することが本発明に示されている。

【０１８２】 この状況でインビボで血管成長を誘起し、それゆえ腫瘍重量を増加させる能力
に関して機能する野生種Ｈ−Ｒａｓの好ましい突然変異の１つは、アミノ酸（ａ
ａ）残基位置１２に、グリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に変える点突然変異を含む
、Ｖ１２とも呼ばれるＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異体である。この突然変異Ｒａｓ
は構成的に活性である。

【０１８３】 本発明で構成性血管形成活性剤として述べられている別のＨ−Ｒａｓ突然変異
タンパク質は、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５であり、ここでは位置１２のグリシンがバ
リン（Ｖ）に変更され、位置３５のトレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）に変更され
、両方の突然変異がＲａｓ Ｖ１２Ｓ３５で生じた。この突然変異Ｈ−Ｒａｓタ
ンパク質は、図１３Ａに示すようにＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を選択的にのみ
活性化することが示されている。

【０１８４】 血管形成のＨ−Ｒａｓ陰性調節因子はＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０突然変異体であり
、ここで位置１２のグリシンはＲａｓ Ｖ１２Ｓ３５でと同様にバリン（Ｖ）に
変更されたが、他の突然変異は位置４０で、ここでチロシン残基（Ｙ）がシステ
イン（Ｃ）に変更されて、それゆえ両方の突然変異がＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０で生
じた。この突然変異Ｈ−Ｒａｓは、ＡｋｔおよびＲａｃをＰ１−３キナーゼ（図
１３Ａに示すＰ１３Ｋ）経路を選択的に活性化することが知られている。それゆ
えＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０はＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路で機能せず、血管形成を
刺激しないどころか、むしろ阻害する。血管形成に対する阻害活性を付与する突
然変異を有するタンパク質も、成長因子刺激から生じる高いＲアｓ活性と同様に
Ｒａｓの内在性活性から生じるものを含め、新血管形成を阻害するという点で、
優性陰性Ｒａｓタンパク質と呼ばれる。したがって、本発明の野生種Ｈ−Ｒａｓ
のある突然変異も、血管成長を阻止し、そのためにインビボでの腫瘍重量を減少
させるという能力に関して、優性陰性として機能することができる。３種類のＨ
−Ｒａｓ作成物および突然変異タンパク質は、Ｊｏｎｅｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ， ２７１：８１０−８１２（１９９６）が以前に述べている。

【０１８５】 点突然変異に関して、望ましい阻害または刺激活性を生じる突然変異は、本発
明での使用について考慮される。（以下の実施例に示すような）望ましいＲａｓ
（またはＲａｆタンパク質）（突然変異またはそのフラグメント）と、発現アミ
ノ酸タグ、抗原エピトープ、蛍光タンパク質、またはそのような他のタンパク質
またペプチドを組合わせた融合タンパク質作成物も、Ｒａｓタンパク質の望まし
い調節効果が無傷である限り考慮される。

【０１８６】 血管形成のシグナル伝達経路活性化における追加のＲａｓ突然変異タンパク質
の役割を評価するために、それぞれのレトロウィルス発現作成物を上述にように
調製した。１５ｕｌの高力価の、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ活性化Ｒａｓ作成物を
コード化するＲＣＡＳ（Ａ）ウィルスであるＲａｓ Ｖ１２Ｓ３５または、Ｒａ
ｓ作成物を活性化するＰＩ３キナーゼをコード化するＲＣＡＳ（Ａ）ウィルスで
あるＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０は、１０日齢ＣＡＭ調製物中のフィルタディスクに局
所的に塗布し、シグナル伝達経路の選択的活性化の点で、突然変異Ｒａｓタンパ
ク質の血管形成に対する効果について、上述のように結果を評価した。

【０１８７】 図１３Ａおよび図１３Ｂは、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を選択的に
活性化する突然変異Ｒａｓ作成物であるＲａｓ Ｖ１２Ｓ３５による感染が血管
形成を誘起したが、これに対して、ＰＩ３Ｋ経路を突然変異作成物であるＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０は誘起しなかったことを、図とグラフで示している。したがって
これらの結果によって、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５タンパク質が血管形成刺激剤であ
り、血管形成のＲａｓ仲介活性化は、Ｈ−Ｒａｓ突然変異体Ｖ１２Ｃ４０が使用
するＰ１３Ｋ経路によってではなく、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の活性化によ
って生じることが確認された。

【０１８８】 Ｄ．ＲａｓまたはＲａｓ独立Ｒａｆ誘起血管形成にどちらにも、ＭＥＫ−ＥＲ
Ｋ経路のＭＥＫ成分が必要である 血管形成調節において、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路でのＲａｓおよびＲａｆ
の独立した役割をさらに評価するために、Ｒａｆ−Ｃａａｘと呼ばれ、Ｒａｓ結
合不在時に構成的および酵素的に活性であることが知られる原形質膜を標的とす
るＲａｆ突然変異タンパク質を、ＭＥＫ活性化の既知の阻害剤であるＰＤ９８０
５９とともに、本明細書で述べるようにＣＡＭ調製物で使用した。図１４は融合
タンパク質Ｒａｆ−ｃａａｘをコード化する核酸配列を示し、ここでヒトＲａｆ
（ｗｔ Ｈ−Ｒａｆ）のカルボキシ末端をコード化する核酸配列は、Ｋ−ｒａｓ
膜局在化ドメインの２０個のアミノ酸残基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６）を
コード化するヌクレオチド配列に融合されている。図１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．：７）は、図１４に示した融合ヌクレオチド配列から生じた融合タンパク質で
ある、Ｒａｆ−ｃａａｘのアミノ酸残基配列を示す。融合タンパク質は、Ｌｅｅ
ｖｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３６９：４１１−４１４（１９９４）およびＳｔ
ｏｋｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６４：１４６３−１４６７（１９９４）によ
って述べられている。

【０１８９】 Ｒａｆによって誘起された血管形成とともに、Ｒａｓ独立Ｒａｆ誘起血管形成
を評価するために、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９を上述のようにＣＡＭ調
製物中で使用した。実施例９Ｃで述べたように調製した、活性化Ｒａｓ作成物で
あるＲａｓ Ｖ１２（Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ）および活性化Ｒａｆ作成物であるＲａ
ｆ−ｃａａｘをコード化するウィルスは、実施例９Ｂで述べたようにフィルタデ
ィスクに局所的に塗布した。２４時間後、１ナノモルのＭＥＫ阻害剤、ＰＤ９８
０５９をディスクに加えた。次にＣＡＭを実施例９Ｂおよび図１２で述べたよう
に評価した。プロットしたデータは、胚２０個の平均±標準誤差である。

【０１９０】 図１６Ａ−１６Ｅおよび図１６Ｆはそれぞれ、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０
５９が、突然変異活性Ｒａｓ（図１６Ｂ）またはＲａｆ（図１６Ｄ）のいずれか
によって誘起された血管形成（図１６Ｃおよび図１６Ｅ）を阻止したことを図と
グラフで示している。したがってＲａｓおよびＲａｆは両方とも、ＭＥＫ−ＥＲ
Ｋ経路によって血管形成を誘起する。プロットしたデータは、個別に処理したＣ
ＡＭの写真による結果をグラフで表している。

【０１９１】 １０．ＲａｓではなくＲａｆに誘起された血管形成は、インテグリン遮断によ
る阻害に不応性である インテグリンシグナル伝達が、血管形成を生じるＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−Ｅ
ＲＫ経路を活性化する方法を判断するために、α_νβ_３インテグリン遮断抗体の
存在下で、突然変異活性ＲａｓおよびＲａｆ作成物によるＣＡＭ検定法を実施し
た。１０日齢のヒヨコ胚によるＣＡＭを、図９および１２で述べたようにＰＢＳ
（対照）、βＦＧＦ、ＲＣＡＳ（Ａ）レトロウィルス作成物Ｇ１２Ｖ−Ｒａｓま
たはＲａｆ−ｃａａｘのいずれかで飽和したフィルタディスクを用いて刺激した
。インテグリンα_νβ_３に対するモノクローナル抗体であるＬＭ６０９は、２４
時間後に静脈送達し、血管形成は７２時間後に血管分岐点分析によって評価した
。代表的なＣＡＭは挿入図に示す。データは、胚２０個の平均±標準誤差である
。

【０１９２】 図１７Ａ〜１７Ｆおよび図１７Ｇはそれぞれ、ＲａｓではなくＲａｆによって
誘起された血管形成が、インテグリン社団による阻害に不応性であることを図と
グラフで示している。突然変異活性ＲａｓおよびＲａｆ作成物の両方による感染
は、図１７Ｂおよび図１７でそれぞれ示されるように顕著な血管形成を誘起した
が、図１７Ｅに示すように、Ｒａｓ誘起血管形成のみがα_νβ_３インテグリン遮
断抗体によって阻害された。検定法で使用するＲａｆ構成物はＲａｓ独立性であ
るため、Ｒａｆ誘起血管形成のインテグリン阻害の欠如は、インテグリン信号伝
達がＲａｆのＲａｓ仲介活性化の間か前に生じることを示している。プロットし
たデータは、個別に処理したＣＡＭの写真の結果をグラフで示している。

【０１９３】 １１．病巣付着キナーゼによるＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の調節 Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ血管形成経路の成長因子受容体活性化の役割
を判断するために、不活性病巣付着キナーゼであるＦＲＮＫと呼ばれる突然変異
ヌル病巣付着キナーゼの存在下で、Ｒａｓ Ｖ１２またはＲａｆ−ｃａａｘ発現
タンパク質のいずれかを用いて、上述したようにＣＡＭ血管形成検定法を実施し
た。

【０１９４】 上述したように調製した、Ｒａｓ Ｖ１２またはＲａｆ−ｃａａｘをコード化
するＲＣＡＳ（Ａ）ウィルスは、ＦＡＫ関連ヌルキナーゼ（ＦＲＮＫ）をコード
化するＲＣＡＳ（Ｂ）ウィルスとともに、実施例９Ｂ（図１２）で述べたように
ＣＡＭフィルタディスクに局所的に塗布した。データは胚２０個の平均±標準誤
差である。

【０１９５】 結果は図１８Ａ〜１８Ｄおよび１８Ｅに示す。１８Ａ〜１８Ｄは、ＣＡＭの突
然変異ヌル病巣付着キナーゼＦＲＮＫとの同時感染がＲａｓを遮断したことを図
で示している；しかし、未処理Ｒａｓ（図１８Ａ）、未処理Ｒａｆ（図１８Ｃ）
およびＦＲＮＫ処理Ｒａｆ（図１８Ｄ）と比較した図１８Ｂの少数の血管によっ
て示されるように、Ｒａｆ誘起血管形成は遮断しなかった。プロットしたデータ
は、個別に処理したＣＡＭの写真による結果をグラフで示している。

【０１９６】 ＣＡＭ検定法のデータは、以前述べたように調製した、マウス皮下血管形成モ
デルで確認された。血管形成は、４００ｎｇ／ｍｌのβＦＧＦまたは説明した遺
伝子を発現するＭｏｌｏｎｅｙレトロウィルス発現パッケージング細胞を含む２
５０ｕｌの氷冷成長因子削減マトリゲルを、マウスの脇腹に皮下注射して誘起し
た。高い力価のウィルスがｖｓｖ ｇコートタンパク質によってパッケージされ
ているため、ＦＲＮＫレトロウィルスをマトリゲルに追加した。５日後、内皮特
異性ＦＩＴＣ結合Ｂａｎｄｅｉｒｉｅａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａ Ｂ５レクチン
を尾血管から注射し、循環させた。次に血管形成組織を除去、抽出および検定す
ることによって、蛍光含量について血管形成を定量化した。

【０１９７】 図１９Ａおよび１９Ｂ〜１９Ｇはそれぞれ、マウス皮下血管形成モデルにおい
て、ＦＲＮＫがβＦＧＦおよび、ＲａｆではなくＲａｓ誘起血管形成を遮断した
ことをグラフと図で示している。

【０１９８】 キナーゼ活性化がＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路で生じるレベルを確認
するために、ＣＡＭをレトロウィルス発現ＦＲＮＫ、突然変異ヌル病巣付着キナ
ーゼと、Ｒａｓ Ｇ１２ＶまたはＲａｆ−ｃａａｘのどちらかとともに同時感染
させた。ＣＡＭは、２４時間後に血管形成組織を切除、可溶化し、Ｒａｆ免疫沈
降させ、キナーゼ死滅ＭＥＫをリン酸化する能力によってＲａｆ活性を評価する
ことを除いて、図１８に示すように処理した。図２０Ａおよび２０Ｂは、ＣＡＭ
と突然変異ヌル病巣付着キナーゼＦＲＮＫの同時感染が、ＲａｆのＲａｓ誘起活
性化を遮断したことを示している。図２０Ａは、結果の上の各組合せで検定した
、総Ｒａｆタンパク質に対する免疫沈降活性Ｒａｆタンパク質を示している。図
２０Ｂは、これらの条件下での活性Ｒａｆ測定の結果をグラフにプロットしてい
る。したがって、ＦＲＮＫはＲａｆ活性を直接阻害しないが、むしろＲａｓによ
ってＲａｆの活性を阻害している。

【０１９９】 １２．考察 上の研究は、インビボでの血管形成にはＲａｆキナーゼが必要かつ十分である
ことを示している。さらに、突然変異によって不活性であるＲａｆキナーゼを成
長する血管にターゲティングすると、局所的な内皮アポトーシスを誘起する。同
じターゲティングは血管形成も抑制し、、事前に存在していたヒト腫瘍の抑制、
さらには縮退さえ生じる。

【０２００】 突然変異不活性形のＲａｆキナーゼ（Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍ）をコード化する遺
伝子のレトロウィルス送達によって、生体胚での腫瘍血管形成に対する実質的な
影響が証明された。重要なことに、使用したレトロウィルスベクターは、マウス
系統の増殖細胞に特異的に感染する。したがって、ヒト腫瘍異種移植片の血管区
画のみが感染した（図１および４）。不活性Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼの送達
は、インビトロでの成長因子誘起Ｒａｆキナーゼ活性を抑制し、インビボでの成
長因子誘起血管形成を遮断する（図２および３）。これに対して、突然変異活性
形のＲａｆキナーゼ（Ｒａｆ３０６−６４８）のレトロウィルス送達は、インビ
ボでの血管形成を誘起するのに十分であった（図４）。さらに、マウスの腫瘍に
対する不活性Ｒａｆキナーゼを発現するウィルスの送達は、内皮特異的な方法で
アポトーシスを誘起することがわかった（図５）。最後に、ヒト腫瘍を接種し、
不活性Ｒａｆを発現するウィルスで処理した動物は、迅速な腫瘍縮退を受け、こ
れは実験の期間を通して維持された（図６）。したがって、Ｒａｆキナーゼは血
管形成に十分かつ必要であり、このキナーゼのターゲティングは血管形成を抑制
し、血管形成依存性疾患を予防する。

【０２０１】 実施例９〜１１で述べ、図９、１２、１３および１６〜２０で示したように、
マウスとニワトリにおける上述の血管形成検定法の結果として、本発明は、血管
形成活性剤タンパク質であるＲａｆ−ｃａａｘ、Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ Ｒａｓおよ
びＲａｓ Ｖ１２Ｓ３５と、血管形成阻害剤タンパク質であるＲａｓ Ｓ１７Ｎ
およびＲａｓ Ｖ１２Ｃ４０を提供する。さらに本研究は、ＲａｓがＲａｆの活
性化に必要であるが、インテグリン仲介シグナル伝達が、Ｒａｆ活性化の下流で
はなく、その間か、前に相互作用することを示す、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−Ｅ
ＲＫ経路のＲａｓ仲介活性化を理解するための基礎を提供する。

【０２０２】 上述の明細書は当業者が、本発明を実施するのに十分であるが、、本明細書で
示し、説明した以外の本発明の各種変更は、上述の説明から当業者には明らかと
なり、添付請求項の範囲内となる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本開示のタンパク質を形成構成する図において：

【図１】 第１図は、エコトロピックパッケージングされたレトロウイルスがマウス細胞
にのみを感染させることを示すものである。Ａ：ウイルスを含有する上澄み液を
マウス由来線維芽細胞、Ｂ：マウス由来内皮細胞、Ｃ：ヒト上皮腺癌細胞、Ｄ：
ヒト黒色腫細胞。

【図２】 第２図は、マウス内皮細胞株において、βＦＧＦ誘導Ｒａｆ活性の増大が、Ｒ
ａｆ Ｋ３７５Ｍでの事前の感染によってブロックされることを示すものである
。

【図３】 第３図は、マウス皮下脈管形成モデルにおいて、変異不活性Ｒａｆ Ｋ３７５
Ｍが、βＦＧＦ誘発脈管形成をブロックすることを示すものである。Ａ：脈管形
成の定量、Ｂ：新生血管形成の光学切片法による確認。

【図４】 第４図は、変異活性Ｒａｆが、マウス皮下脈管形成モデルにおける脈管形成を
促進することを示すものである。Ａ：脈管形成の定量、Ｂ：新生血管形成の切片
法およびメイソンのトリクロームを用いる染色法による確認。

【図５】 第５図は、腫瘍へのＲａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼのレトロウイルス伝達が、内
皮特異的な方式でアポトーシスを誘発することを示すものである。Ａ：ｖＷＦ発
現による内皮細胞の同定、Ｂ：Ｒａｆ Ｋ３７５Ｍキナーゼ遺伝子感染細胞、Ｃ
及びＤ：各マーカーのアポトーシス細胞を示すＴＵＮＥＬマーカーと共に局在す
るように見える。

【図６】 第６図は、Ｒａｆ Ｋ３７５キナーゼ遺伝子の内皮伝達が、腫瘍の成長を抑制
し、腫瘍の退縮を促進することを示すものである。Ａ：対照ＧＦＰ遺伝子の注射
では見られなかった腫瘍の急速な退縮、Ｂ：この退縮の急速な発生及び実験期間
中の維持。

【図７】 第７図は、イントロンが欠失した完全コード配列であるヒトｃ−Ｒａｆをコー
ドするｃＤＮＡ配列を示すものである。

【図８】 第８図は、第７図に示した核酸配列の中で示されるヒトｃ−Ｒａｆのコード配
列に関するコードされた翻訳アミノ酸残基配列を示すものである（配列番号２）
。

【図９】 第９図は、脈管形成が、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の活性化依存す
ることを示すものである。

【図１０】 第１０図は、野生型ヒトＲａｓ（Ｈ−Ｒａｓを含まない）のｃＤＮＡコードド
メインのヌクレオチド配列を示すものである（配列番号３）。

【図１１】 第１１図は、第１０図に示した野生型ヒトＲａｓ（Ｈ−Ｒａｓを含まない）の
ｃＤＮＡヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸残基配列を示す（配列
番号４）。

【図１２】 第１２図は、変異ヌルＲａｓでの感染が、ＣＡＭにおける成長因子誘発性脈管
形成をブロックしたことを示すものである。

【図１３Ａ】 第１３Ａ図は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を選択的に活性化する変
異Ｒａｓ構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５での感染は、脈管形成を誘発し、これに
対してＰＩ３Ｋ経路を選択的に活性化する変異構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０は
、脈管形成を誘発しないことを、略図でそれぞれ示すものである。

【図１３Ｂ】 第１３Ｂ図は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を選択的に活性化する変
異Ｒａｓ構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５での感染は、脈管形成を誘発し、これに
対してＰＩ３Ｋ経路を選択的に活性化する変異構成体、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０は
、脈管形成を誘発しないことを、グラフでそれぞれ示すものである。

【図１４】 第１４図は、ヒトＲａｆ（Ｈ−Ｒａｆを含まない）のカルボキシ末端をコード
するヌクレオチド配列が、Ｋ−Ｒａｓ膜局在化ドメインの２０のアミノ酸残基配
列をコードするヌクレオチド配列と融合する、融合タンパク質Ｒａｆ−ｃａａｘ
をコードするヌクレオチド配列を示すものである（配列番号６）。

【図１５】 第１５図は、Ｒａｆ−ｃａａｘ、第１４図に示した融合ヌクレオチド配列から
発生する融合タンパク質のアミノ酸残基配列を示すものである（配列番号７）。

【図１６】 第１６図は、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ９８０５９が、変異活性ＲａｓまたはＲａｆ
のいずれかによって誘発された脈管形成をブロックすることを、写真（Ａ〜Ｅ）
およびグラフ（Ｆ）でそれぞれ示すものである。

【図１７】 第１７図は、それぞれ、ＲａｓではなくＲａｆによって誘発される脈管形成が
インテグリンのブロックによる抑制に対して無反応であることを写真（Ａ〜Ｆ）
およびグラフ（Ｇ）で示すものである。

【図１８】 第１８図は、それぞれ、ＣＡＭの変異ヌルフォーカス癒着キナーゼ、ＦＲＮＫ
との共感染によって、Ｒａｓはブロックされたが、Ｒａｆ誘発性脈管形成はブロ
ックされなかったことを写真（Ａ〜Ｄ）およびグラフ（Ｅ）で示すものである。

【図１９】 第１９図は、それぞれ、ＦＲＮＫが、マウス皮下脈管形成モデルにおいてβＦ
ＧＦおよびＲａｓ（Ｒａｆではない）誘発性脈管形成をブロックしたことをグラ
フ（Ａ）および写真（Ｂ〜Ｇ）で示すものである。

【図２０Ａ】 第２０Ａ図は、ＣＡＭと、変異ヌルフォーカス癒着キナーゼ、ＦＲＮＫとの共
感染によって、ＲａｆのＲａｓ誘導活性化がブロックされたことを示すものであ
る。結果の上の組合せのもとで評価した全Ｒａｆタンパク質に対する免疫沈降活
性を示す。

【図２０Ｂ】 第２０Ｂ図は、ＣＡＭと、変異ヌルフォーカス癒着キナーゼ、ＦＲＮＫとの共
感染によって、ＲａｆのＲａｓ誘導活性化がブロックされたことを示すものであ
る。本明細書に記載した条件のもとでの活性Ｒａｆ測定の結果をグラフで表すも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/06 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チエレツシユ，デイビツド・エイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・92024、 エンシニタス、ローン・ヒル・レイン・ 3277 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB01 BB13 BB15 BB31 CC01 CC03 EE60 4C084 AA02 AA03 AA16 DC25 MA02 NA13 NA14 ZA33 ZA36 ZA96 ZB15 ZB26

Claims (67)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 包装材料および前記包装材料内に収容された医薬組成物を含
   む製品であって、前記医薬組成物は疾病状態に関連する組織における脈管形成を
   調節することができ、前記包装材料は脈管形成を調節することによって疾病状態
   を治療するために前記医薬組成物を用いることができるということを示すラベル
   を含み、および、前記医薬組成物はＲａｆタンパク質またはＲａｆタンパク質を
   発現することができるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、前
   記製品。
2. 【請求項２】 前記Ｒａｆタンパク質が活性Ｒａｆタンパク質であり、およ
   び前記調節が脈管形成を増強するものである、請求項１に記載の製品。
3. 【請求項３】 前記活性Ｒａｆタンパク質が野生型Ｒａｆである、請求項２
   に記載の製品。
4. 【請求項４】 前記活性Ｒａｆタンパク質が融合タンパク質である、請求項
   ３に記載の製品。
5. 【請求項５】 前記活性Ｒａｆ融合タンパク質がＲａｆ−ｃａａｘである、
   請求項４に記載の製品。
6. 【請求項６】 前記組織が血行不良を有する、請求項２に記載の製品。
7. 【請求項７】 前記Ｒａｆタンパク質が不活性Ｒａｆタンパク質であり、前
   記調節が脈管形成を抑制するものである、請求項１に記載の製品。
8. 【請求項８】 前記不活性Ｒａｆタンパク質が、位置３７５のアミノ酸がリ
   ジンではないように残基３７５に変異を有する、請求項７に記載の製品。
9. 【請求項９】 前記組織が炎症を起こしており、前記状態が関節炎または慢
   性関節リウマチである、請求項７に記載の製品。
10. 【請求項１０】 前記組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移である、請求項７
    に記載の製品。
11. 【請求項１１】 前記投与が化学療法と共に行われる、請求項１０に記載の
    製品。
12. 【請求項１２】 前記組織が網膜組織であり、前記状態が網膜症、糖尿病性
    網膜症または黄斑変性である、請求項７に記載の製品。
13. 【請求項１３】 前記組織が冠動脈管形成術部位にあり、前記状態が再狭窄
    である、請求項７に記載の製品。
14. 【請求項１４】 前記投与が、静脈内投与、経皮投与、関節滑液嚢内投与、
    筋肉内投与、または経口投与を含む、請求項１に記載の製品。
15. 【請求項１５】 前記投与が一回用量の静脈内投与を含む、請求項１に記載
    の製品。
16. 【請求項１６】 前記医薬組成物がリポソームをさらに含む、請求項１に記
    載の製品。
17. 【請求項１７】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現することが
    できるウイルス発現ベクターを含む、請求項１に記載の製品。
18. 【請求項１８】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現することが
    できる非ウイルス性発現ベクターを含む、請求項１に記載の製品。
19. 【請求項１９】 疾病状態に関連する組織における脈管形成を調節するため
    の方法であって、Ｒａｆタンパク質またはＲａｆタンパク質を発現することがで
    きるヌクレオチド配列を含む脈管形成調節量の医薬組成物を前記組織に投与する
    ことを含む、前記方法。
20. 【請求項２０】 前記Ｒａｆタンパク質が活性Ｒａｆタンパク質であり、前
    記調節が脈管形成を増強するものである、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記活性Ｒａｆタンパク質が野生型Ｒａｆである、請求項
    ２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記活性Ｒａｆタンパク質が融合タンパク質である、請求
    項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記活性Ｒａｆ融合タンパク質がＲａｆ−ｃａａｘである
    、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記組織が血行異常を有する、請求項２０に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記Ｒａｆタンパク質が不活性Ｒａｆタンパク質であり、
    前記調節が脈管形成を抑制するものである、請求項１９に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記不活性Ｒａｆタンパク質が、位置３７５のアミノ酸が
    リジンではないように残基３７５に変異を有する、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記組織が炎症を起こしており、前記状態が関節炎または
    慢性関節リウマチである、請求項２５に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移である、請求項２
    ５に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記投与が化学療法と共に行われる、請求項２８に記載の
    方法。
30. 【請求項３０】 前記組織が網膜組織であり、前記状態が網膜症、糖尿病性
    網膜症または黄斑変性である、請求項２５に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記組織が冠動脈管形成術部位にあり、前記組織には再狭
    窄についての危険がある、請求項２５に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記投与が、静脈内投与、経皮投与、関節滑液嚢内投与、
    筋肉内投与、または経口投与を含む、請求項１９に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記投与が一回用量の静脈内投与を含む、請求項１９に記
    載の方法。
34. 【請求項３４】 前記医薬組成物がリポソームをさらに含む、請求項１９に
    記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現することが
    できるレトロウイルス発現ベクターを含む、請求項１９に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現することが
    できる非ウイルス性発現ベクターを含む、請求項１９に記載の方法。
37. 【請求項３７】 キナーゼ活性を有するＲａｆタンパク質をコードする核酸
    セグメントを有する核酸を含むウイルス性遺伝子導入ベクター、および製薬上許
    容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成を促進
    するための医薬組成物。
38. 【請求項３８】 キナーゼ活性を有するＲａｆタンパク質をコードする核酸
    セグメントを有する核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクター、および製薬上
    許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成を促
    進するための医薬組成物。
39. 【請求項３９】 キナーゼ活性を有さないＲａｆタンパク質をコードする核
    酸セグメントを有する核酸を含むウイルス性遺伝子導入ベクター、および製薬上
    許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成を抑
    制するための医薬組成物。
40. 【請求項４０】 キナーゼ活性を有さないＲａｆタンパク質をコードする核
    酸セグメントを有する核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクター、および製薬
    上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成を
    抑制するための医薬組成物。
41. 【請求項４１】 キナーゼ活性を有する治療量のＲａｆタンパク質、および
    製薬上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形
    成を促進するための医薬組成物。
42. 【請求項４２】 キナーゼ活性を有さない治療量のＲａｆタンパク質、およ
    び製薬上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管
    形成を抑制するための医薬組成物。
43. 【請求項４３】 包装材料および前記包装材料内に収容された医薬組成物を
    含む製品であって、前記医薬組成物は疾病状態に関連する組織における脈管形成
    を調節することができ、前記包装材料は脈管形成を調節することによって疾病状
    態を治療するために前記医薬組成物を用いることができるということを示すラベ
    ルを含み、および、前記医薬組成物は、Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク
    質を発現することができるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む
    、前記製品。
44. 【請求項４４】 前記Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質をコードす
    るオリゴヌクレオチドが、抑制性Ｒａｓタンパク質である、請求項４３に記載の
    製品。
45. 【請求項４５】 前記抑制性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０である、請求
    項４４に記載の製品。
46. 【請求項４６】 前記抑制性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｓ１７Ｎである、請求項４
    ４に記載の製品。
47. 【請求項４７】前記Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質をコードする
    オリゴヌクレオチドが、促進性Ｒａｓタンパク質である、請求項４３に記載の製
    品。
48. 【請求項４８】 前記促進性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｇ１２Ｖである、 請求項
    ４７に記載の製品。
49. 【請求項４９】 前記促進性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５である、 請
    求項４７に記載の製品。
50. 【請求項５０】 疾病状態に関連する組織における脈管形成を調節するため
    の方法であって、Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質をコードするヌクレ
    オチド配列を含む脈管形成調節量の医薬組成物を前記組織に投与することを含む
    、前記方法。
51. 【請求項５１】 前記Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質をコードす
    るオリゴヌクレオチドが、不活性Ｒａｓタンパク質である、請求項５０に記載の
    方法。
52. 【請求項５２】 前記不活性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０である、請求
    項５１に記載の方法。
53. 【請求項５３】 前記不活性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｓ１７Ｎである、請求項５
    １に記載の方法。
54. 【請求項５４】 前記Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質をコードす
    るオリゴヌクレオチドが、活性Ｒａｓタンパク質である、請求項５０に記載の方
    法。
55. 【請求項５５】 前記活性Ｒａｓが、Ｒａｓ ＧＶ１２である、請求項５４
    に記載の方法。
56. 【請求項５６】 前記活性Ｒａｓが、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５である、請求項
    ５４に記載の方法。
57. 【請求項５７】 製薬上許容され得る担体または賦形剤中の、脈管形成調節
    活性を有するＲａｓタンパク質をコードする核酸セグメントを有する核酸を含む
    ウイルス性遺伝子導入ベクターを含む、標的哺乳動物組織における脈管形成を調
    節するための医薬組成物。
58. 【請求項５８】 前記Ｒａｓタンパク質が脈管形成抑制活性を有する、標的
    哺乳動物における脈管形成を抑制するための請求項５７に記載の医薬組成物。
59. 【請求項５９】 前記Ｒａｓタンパク質が、Ｒａｓ Ｖ１２Ｃ４０である、
    請求項５８に記載の医薬組成物。
60. 【請求項６０】 前記Ｒａｓタンパク質が、Ｒａｓ Ｓ１７Ｎである、請求
    項５８に記載の医薬組成物。
61. 【請求項６１】 前記Ｒａｓタンパク質が、脈管形成活性化活性を有する、
    請求項５７に記載の医薬組成物。
62. 【請求項６２】 前記Ｒａｓタンパク質が、Ｒａｓ Ｇ１２Ｖである、請求
    項６１に記載の医薬組成物。
63. 【請求項６３】 前記Ｒａｓタンパク質が、Ｒａｓ Ｖ１２Ｓ３５である、
    請求項６１に記載の医薬組成物。
64. 【請求項６４】 脈管形成調節活性を有するＲａｓタンパク質をコードする
    核酸セグメントを有する核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクター、および製
    薬上許容され得る担体または賦形剤を含む、標的哺乳動物組織における脈管形成
    を調節するための医薬組成物。
65. 【請求項６５】 疾病状態に関連する組織における脈管形成を調節する方法
    であって、Ｒａｆタンパク質またはＲａｆタンパク質を発現することができるヌ
    クレオチド配列、およびＲａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質を発現するこ
    とができるヌクレオチド配列を含む、脈管形成調節量の医薬組成物を前記組織に
    投与することを含む、前記方法。
66. 【請求項６６】 前記調節が脈管形成の抑制であり、前記Ｒａｆタンパク質
    およびＲａｓタンパク質の少なくとも一方が不活性である、請求項６５に記載の
    方法。
67. 【請求項６７】 前記調節が脈管形成の促進であり、前記Ｒａｆタンパク質
    およびＲａｓタンパク質の少なくとも一方が活性である、請求項６５に記載の方
    法。