JP2003506100A - Ｒａｄ５１関連分子および方法を用いる癌治療および診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示する方法は、癌を処置、診断、予測する方法、癌についての処置に対して患者に感受性を与える方法、癌についての処置の予想的帰結を提供する方法、アポトーシスを誘発する方法である。組成物、薬剤、キットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、Ｒａｄ５１阻害剤およびＲａｄ５１発現検出剤を広く利用して癌を
診断、予想および治療するための組成物および方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 乳癌は、西欧先進国で女性における最も頻度の高い悪性癌である。腫瘍抑制遺
伝子のコード配列であるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２における生殖細胞系変異は
家族性表現系の６５％以上を占めるが、これらの遺伝子における変異は散発性症
例においてとしてはまれである (Feunteun, J., Mol. Med. Today 4:263-270 (1
998)。しかし、ＢＲＣＡ１機能は、腫瘍細胞におけるＢＲＣＡ１タンパク質レベ
ルの下方調節により散発性乳癌では失われている(Yoshikawa, K., et al., clin
. Canc. Res. 5:1249-1261 (1999); Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 21:23
6-240 (1999); Dobrovic, A. and Simpfendorfer, D., Canc. Res. 57:3347-335
0 (1997; Mancini, D.N., et al., Oncogene 16:1161-1169 (1998))。ＢＲＣＡ
１は、ＤＮＡ損傷に応答する経路に直接関与する(Zhang, H., et al., 細胞 92:
433-436 (1998))。このポリペプチドは、複数タンパク質複合体の一部であって
、これにはＲａｄ５１(Scully, R., et al., Cell 88:265-275 (1997))、相同組
替およびＤＮＡ二本鎖開裂の修復の鍵酵素も含まれる(Feunteun, J., Mol. Med.
Today 4:263-270 (1998); Baumann, P. and West, S.C., Trends Biochem. Sci
. 23:247-251 (1998))。

【０００３】 癌の治療に関して、腫瘍細胞が化学療法および／または放射線治療に耐性とな
る能力は、進行した段階の充実性腫瘍を治療するために確立された治療方法の効
力を妨げる重大な問題の一つであると考えられる。癌細胞の悪性の表現型に関す
るこれらの重要な局面は、古典的な単層細胞培養よりも３次元的(３Ｄ)細胞系に
よって、より一層確実性を増す (参考のため、以下を参照：Mueller-Klieser, W
., Am. J. Physiol. 273:C1109-1123 (1997); Kunz-Schughart, L.A., et al.,
Int. J. Exp. Path. 79:1-23 (1998))。３Ｄ増殖は、種々のヒト腫瘍細胞系の
転移可能性を高め(Raz, A and Ben-e'ev, A., Science 221:1307-1310 (1983))
、単層として増殖した同細胞と比較して放射線および化学耐性の該レベルを増加
させる(Mueller-Klieser, W., Am. J. Physiol. 273:C1109-1123 (1997))。永久
な遺伝子改変それだけでは、単層培養と比較して３Ｄ培養では化学的耐性の増加
には関与し得ない、というのは、該表現型が単層としていくつかの細胞倍加後に
喪失するからである(Luo, C., et al., Exp. 細胞 Res. 243:282-289 (1998))。
近年、球状物として増殖した腫瘍細胞中のＰ−糖タンパクの上方調節が発表され
た(Wartenberg, M., et al., Int. J. Cancer 75:855-863 (1998))。しかし、標
準的な耐性遺伝子は、３Ｄ培養において化学耐性の獲得に関与するだけとは限ら
ないようである(Desoize, B., et al., Anticancer Res. 18:4147-4158 (1998))
。

【０００４】 ＤＮＡ修復機構に関して、相同組替えはＤＮＡ二本鎖開裂の修復に関与する機
構のひとつである。これらの過程を触媒する主要因子の１つが、Ｒａｄ５１遺伝
子産物である。チキン細胞におけるＲａｄ５１遺伝子の誘発された***は、ＤＮ
Ａ二本鎖開裂の蓄積に伴い細胞死をもたらす(Sonoda, E., et al., EMBO J., 17
:598-608 (1998))。Ｒａｄ５１発現が高くなると、ヒト腫瘍細胞の放射線耐性を
強める(Yanagisawa, T., et al., Oral Oncol. 334:524-528 (1998); Vispe, S.
, et al., Nucl. Acids Res. 26:2859-2864 (1998))。腫瘍細胞の単層培養をＲ
ａｄ５１特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置すると、放射性活
性が付与される(Ohnishi, t., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 245:3
19-324 (1998))。

【０００５】 ＤＮＡの相同性組替は遺伝的多様性および進化の推進力の一つであるが、しか
し一方、同機構はＤＮＡ二本鎖開裂の修復に伴ってゲノムの安定性の維持する。
recＡ遺伝子産物は、Escherichia coli類のような原核生物における相同性組換
え過程を触媒する主要な因子の一つと知られている。真核生物において、タンパ
ク質のＲａｄ５１ファミリーのメンバーは、E. coli ＲecＡと驚くべき構造的お
よび機能的ホモロジーを共有する。細菌および酵母において、ＲecＡ/Ｒａｄ５
１欠失は、全体的な細胞生存率に影響を与えないで、組替え速度の低下およびγ
照射に対する高感受性を導く。対照的に、機能的Ｒａｄ５１を欠損するマウスの
胚は、原腸形成の直前の分化中で早死を導き、Ｒａｄ５１欠損哺乳動物細胞系を
確立する力を失っている(Lim, D.S. & Hasty, P., Mol 細胞 Biol 16:7133-43 (
1996); Tsuzuki, T., et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:6236-40 (1996))。
条件によって、Ｒａｄ５１欠損チキン細胞は、細胞死の前に二本鎖開裂物を蓄積
する(Sonoda, E., et al., Embo J 17:598-608 (1998))。これらの結果からす
ると、細菌および酵母とは対照的に、Ｒａｄ５１は脊髄動物での細胞生存に重要
であり、細胞性ホメオスタシスの維持に関与する。

【０００６】 Ｒａｄ５１は、ＢＲＣＡ１(Scully, R., et al., Cell 88:265-75 (1997b))
およびＢＲＣＡ２(Sharan, S.K., et al., Nature 386:804-10 (1997))、即ち乳
癌および卵巣癌の遺伝的表現型を持たないポリペプチドのようないくつかの腫瘍
サプレッサー類と物理的に相互作用する。機能性ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２
を欠損するマウス胚は、Ｒａｄ５１欠損マウス胚と似た表現型を示す (Hakem, R
., et al., Cell 85:1009-23 (1996); Suzuki, A., et al., Genes Dev 11:124
2-52 (1997); Chen, J.J., et al., Mol Cell 2:317-28 (1998); Chen, J.J.,
et al., Cancer Res 59:1752s-1756s (1999b))。さらに、ＢＲＣＡ１およびＢＲ
ＣＡ２の接合子のない胚は、細胞周期阻害剤 p２１^waf1の活性化を示すことも観
察された(Hakem, R., et al., Cell 85:1009-23 (1996); Suzuki, A., et al.,
Gene Dev 11:1242-52 (1997))。

【０００７】 一般的に、腫瘍抑制遺伝子 p５３は、p２１^Waf1発現の最も顕著なレギュレー
ターである。p５３は、ＤＮＡ完全性を制御することによりゲノムの安定性を維
持し、適切には、細胞周期を停止することによって、またはアポトーシスによる
細胞死を誘発することにより反応する(参照：(Janus, F., et al., Cell Mol L
ife Sci 55:12-27 (1999))。また、p５３はＲａｄ５１とタンパク質複合体を形
成し、インビトロでの細菌性ホモログＲecＡの生物化学的活性を抑制する(Stuer
zbecher, H.W., et al., Embo J 15:1992-2002 (1996)。機能的 p５３を欠損す
る細胞は、ゲノム不安定性を起こし、高い相同性組替え率を示すが(Bertrand, P
., et al., Oncogene 14:1117-22 (1997); Mekeel, K.L., et al., Oncogene 1
4:1847-57 (1997))、これは、相同性組換えの過程での p５３の制御機能を示唆
する。

【０００８】 本明細書では、癌の治療および処置に関する診断、予想、予測的帰結を与える
方法および組成物、およびＲａｄ５１に関連した組成物および経路を利用する方
法および組成物について述べる。

【０００９】 （本発明の要約） 上記概説した目的に従って、本発明は、数多くの診断および予想方法、予測的
帰結方法および癌を治療するための方法を提供する。アポトーシスを阻害および
誘発する方法も提供する。

【００１０】 本発明のひとつの態様において、癌に関して、個体を診断する方法を提供する
。一つの実施態様において、該方法は、個体からのサンプル中のＲａｄ５１の発
現レベルを測定すること；また該レベルと対照レベルとを比較すること（そこで
該対照レベルからの変化は癌を示す）を包含する。該サンプルは、球状物中で培
養した組織サンプルまたは細胞であることが好ましい。様々な癌は、該方法によ
って診断し得る。その診断は、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、リン
パ腫および皮膚癌を含むが、これに限定されない。

【００１１】 Ｒａｄ５１の発現は、Ｒａｄ５１タンパク質または核酸のレベルにより決定し
得るが、タンパク質の方が好ましい。ひとつの態様において、該レベルは、ポリ
クローナル抗体の使用により測定する。好ましくは、該レベルはモノクローナル
抗体を用いて測定する。一つの態様において、該抗体は、真核生物のＲａｄ５１
、好ましくは哺乳類Ｒａｄ５１に対するものである。もしくは、Ｒａｄ５１の発
現は、Ｒａｄ５１の核酸レベルによって測定する。

【００１２】 本発明の別の態様において、個体の癌を予想する方法を提供する。ひとつの態
様において、該方法は、個体からのサンプル中のＲａｄ５１の発現レベルを測定
すること; 予想を提供できるように癌の重篤度を示す対照と該レベルとを比較す
ることからなる。一般的に、上記個体のＲａｄ５１の発現レベルが高いほど、該
患者が治療なしに生存し得る時間が短い。

【００１３】 また、本明細書中で提供するものは、主要組織サンプル中の癌細胞を同定する
ための方法である。ひとつの実施態様において、該方法は、目的の主要組織サン
プル中のＲａｄ５１のレベルを測定すること; およびＲａｄ５１のレベルを癌で
ない組織サンプルと比較することからなり、そこで該レベルにおける差異は目的
の組織サンプル中に癌細胞が存在することを示す。

【００１４】 本発明の別の態様において、組織サンプル中のＲａｄ５１発現に関する正常ま
たは異常レベルを検出するためのキットを提供する。該キットは、Ｒａｄ５１を
検出するための結合剤、すなわち検出し得る標識；およびＲａｄ５１の正常レベ
ルまたは癌の種々の重篤度でのＲａｄ５１発現を示す対照を包含する。

【００１５】 本明細書中で提供するものは、癌に罹っている個体を治療するための方法であ
り、その方法は、該個体においてＲａｄ５１活性を阻害することを含む。Ｒａｄ
５１阻害剤は、該個体に癌を阻害する有効量で投与するのが好ましい。

【００１６】 ひとつの実施態様において、Ｒａｄ５１またはＲａｄ５１阻害剤を、機能不全
p５３を含む細胞に与える。本明細書中に示すように、p５３は本明細書中で提供
される方法で存在することを要しない。そのため、一つの態様においては、p５
３はＲａｄ５１阻害剤と同時に投与から除外する。

【００１７】 また、本明細書中で提供するものは、癌を罹っている個体において放射線およ
びＤＮＡ障害化学療法剤への感受性を誘発するための方法であり、該個体におけ
るＲａｄ５１活性を阻害する投与を含む。ひとつの実施態様において、Ｒａｄ５
１阻害剤を含む組成物は、該感受性を誘発するために有効な量を該個体に投与す
る。

【００１８】 本発明の別の態様において、該細胞にＲａｄ５１を投与することからなる、細
胞にアポトーシスを誘発する方法を提供する。ひとつの実施態様において、その
細胞は癌細胞である。

【００１９】 本明細書中で提供するものは、癌治療についての予測的帰結を測定する方法で
ある。本明細書中でいう予測的帰結とは、ある症状に対して治療が有効であるか
どうかを示す用語である。ひとつの実施態様において、該方法は、患者の組織サ
ンプル中のＲａｄ５１の発現レベルを測定すること、および該レベルと、個体が
化学療法または放射線治療に対して持つ耐性を示す対照とを相関させることを含
む。Ｒａｄ５１のレベルが高ければ高いほど、概して、患者は高い耐性を示す。

【００２０】 さらに、本明細書中で提供するものは、細胞でのアポトーシスを阻害する方法
であり、細胞でのＲａｄ５１の過剰発現を誘発することを含む。過剰発現とは、
通常の非感染細胞で見出される以上の発現を意味する。過剰発現の誘発は、Ｒａ
ｄ５１タンパク質、Ｒａｄ５１核酸を投与することを含む多様な方法によって、
またはＲａｄ５１発現を間接的に刺激することによっておこり得る。好ましくは
、誘発はＲａｄ５１核酸を投与による。ひとつの実施態様において、核の局在化
シグナルを核酸と結合させる。

【００２１】 また、本明細書中で提供するものは、細胞においてＲａｄ５１の過剰発現を誘
発することを含む細胞の生存性を高める方法である。

【００２２】 さらに、Ｒａｄ５１の発現を調節する薬剤についてスクリーニング方法を提供
する。ひとつの実施態様において、該方法は、球状物で細胞を培養すること、該
球状物に候補薬剤を添加すること、そして該候補薬剤の添加前後のＲａｄ５１の
発現レベルを測定することからなる方法であって、発現レベルの変化は該候補薬
剤がＲａｄ５１発現を調節することを示す。該薬剤が発現を阻害するのが好まし
い。球状物は有効な処置を決定するのに使用し得る。さらに、該球状物は、Ｒａ
ｄ５１活性を調節する薬剤を同定するのに使用してもよい。

【００２３】 （図面の詳細な説明） 図１Ａ−１Ｆは、免疫組織化学法（図１Ａ−１Ｄ）およびウエステンブロット
法（図１Ｅ−１Ｆ）による単層細胞培養中のＲａｄ５１とｐ５３の発現レベルの
比較を示す。より具体的には、図１Ａ−１Ｄは、膵臓癌細胞系におけるＲａｄ５
１（図１Ｂおよび１Ｄ）およびｐ５３（図１Ａおよび１Ｃ）についての組織細胞
化学を示す。細胞系８１８−４（図１Ａ−１Ｂ）およびＢＸＰＣ−３（図１Ｃ−
１Ｄ）の免疫染色にはそれぞれ、Ｒａｄ５１についてモノクローナル抗体１Ｇ８
、およびｐ５３についてモノクローナル抗体ＰＡｂ１８０１を使用した。染色前
に細胞を３.７％中性緩衝ホルマリンで固定し、０.２％リトンＸ−１００で透過
性とした。Ｒａｄ５１およびｐ５３タンパク質の視覚化にはペルオキシダーゼに
ついての基質としてジアミノベンジディン４塩酸を用い、ヘマラムで対染色した
。倍率：１０００倍。図１Ｅ−１Ｆは、膵臓腫瘍細胞系における完全長Ｒａｄ５
１（図１Ｆ）およびｐ５３（図１Ｅ）タンパク質を示す。８１８−４およびＢＸ
ＰＣ−３膵臓細胞系由来の全タンパク質抽出物５０μｇにおけるＲａｄ５１およ
びｐ５３についてのウエステンブロット法では、Ｒａｄ５１についてモノクロナ
ール１Ｇ８およびｐ５３についてモノクロナールＤＯ−１検出を用いた。曝露時
間は、Ｒａｄ５１タンパク質検出のためには約２０分間、ｐ５３のためには４５
秒であった。

【００２４】 図２Ａ−２Ｈは、球状に成長したヒト膵臓癌細胞におけるＲａｄ５１タンパク
質の蓄積を示す。特に、図２Ａ−２Ｆは、球状に成長したＰａｎｃＴＵ−Ｉおよ
び８１８−４細胞を示し、免疫組織化学法で分析したものである。球状物を採取
し、ホルマリンで固定し、パラフィンで固床化した。Ｒａｄ５１の検出にはモノ
クロナール抗体１Ｇ８を使用し、視覚化にはペルオキシダーゼについての基質と
してジアミノベンジディン４塩酸を用い、ヘマラムで対染色した。倍率：表示の
とおり。図２Ｇ−２Ｈは、ＰａｎｃＴＵ−Ｉ（図２Ｇ）および８１８−４（図２
Ｈ）膵臓細胞系由来の全分解物５０μｇにおけるＲａｄ５１についてのウエステ
ンブロット分析を示し、単層（レーンａ）および球状（レーンｂ）として成長し
たものであり、Ｒａｄ５１検出についてモノクロナール１Ｇ８を用いた。

【００２５】 図３Ａ−３Ｈは、膵臓癌細胞におけるＲａｄ５１発現の比較を示す。単層とし
て、正常位移植後のＳＣＩＤマウス中の腫瘍、膵臓腺癌の種々の腫瘍標本におい
て成長したものである。Ｒａｄ５１発現の測定は下記における免疫組織化学法に
よる：Ａ−Ｂ）Ｐａｎｃ−ＴＵＩ単層細胞、Ｃ−Ｅ）正常位移植後のＳＣＩＤマ
ウス中の腫瘍として成長するＰａｎｃ−ＴＵＩ、Ｆ−Ｈ）ヒト膵臓腺癌の種々の
標本。標本を採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンで固床化した。Ｒａｄ５
１の検出にはモノクロナール抗体１Ｇ８を使用し、視覚化にはペルオキシダーゼ
についての基質としてジアミノベンジディン４塩酸を用い、ヘマラムで対染色し
た。倍率：上記に同じ。

【００２６】 図４は、ペプチド競合によるＲａｄ５１免疫組織化学についての特異性を示す
。より具体的には、図４は、１Ｇ８エピトープに対応するペプチドを用いる競合
試験を示す。Ｒａｄ５１をモノクローナル抗体１Ｇ８で染色した。競合ペプチド
１０−ＡＤＴＳＶＥＥＥＳＦＣＰＱＰ−２５の存在（図４Ａ）および不存在（図
４Ｂ）においてである。Ｒａｄ５１の視覚化にはペルオキシダーゼについての基
質としてジアミノベンジディン４塩酸を用いた。倍率：２００倍。

【００２７】 図５は、非同位体ＲＮＡＳＥ解裂アッセイ（ＮＩＲＣＡ）用いるＲａｄ５１コ
ード配列についての変異分析を示す。負対照：ハイブリダイズされたセンスおよ
びアンチセンスの野生型Ｒａｄ５１ｍＲＮＡについてのＮＩＲＣアッセイ；正対
照：Ｒａｄ５１の野生型センスおよびインビトロ生成の点変異（アンチセンス）
を用いるＲＮＡＳＥ解裂；Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＦ：真正の野生型Ｒａｄ
５１ｍＲＮＡにそれぞれハイブリダイズした膵臓腫瘍細胞系Ｃａｐａｎ−１およ
びＨＰＡＦから単離されたＲａｄ５１ｍＲＮＡについてのＮＩＲアッセイ；Ａ）
ＲＮＡＳＥ消化のない対照；Ｂ）、Ｃ）、Ｄ）供給者からの酵素によるＲＮＡＳ
Ｅ１、２、３による消化；ｗｔ：野生型Ｒａｄ５１ｍＲＮＡ；ｍｔ：変異型Ｒａ
ｄ５１ｍＲＮＡ；Ｓ：センスｍＲＮＡ；ＡＳ：アンチセンスｍＲＮＡ。ＲＮＡ断
片の分析を２％アガロースゲル上で行い、臭化エチジウムで染色した。フッ素−
Ｓ造影系を用いるゲルの反転プリントで表す。

【００２８】 図６は、Ｒａｄ５１過剰発現の生物学的結果を示す。特に、図６Ａは、ｐ５３
レベルがＲａｄ５１の過剰発現により影響を受けないことを示す。ＵｉＲａｄ５
１およびＵｉＬａｃＺ細胞をプレートに置き、２４時間放置した。このときに、
異所性タンパク質の産生が１μＭムリステロンＡで誘発され、非誘発細胞がムリ
ステロンＡのために使用する溶媒である１％エタノールを受容した。ＵＶ照射を
追加の２４時間後に行い、その２４時間後に細胞を採取した。等しい数の細胞を
ｐ５３タンパク質検出のためのウエステンブロット法にかけた。図６Ｂは、Ｒａ
ｄ５１の過剰発現がＤＮＡ二本鎖開裂に対する耐性を付与することを示す。Ｕｉ
Ｒａｄ５１細胞を等しい細胞数でプレートに置き、２４時間付着するに任した。
異所性タンパク質の産生が１μＭムリステロンＡで誘発され、非誘発細胞が１％
エタノールを受容した。誘発２４時間後に細胞を表示濃度のカリケアミシンγ_１ で１６時間処理し、完全培地中で３回洗い、７２時間回復に任せた。ついで、細
胞をクリスタルバイオレットで染色した。細胞の生存をＧＳ７００密度計（Bior
ad, Munich) を用いて定量した。

【００２９】 図７は、ヒトｒａｄ５１遺伝子の５'領域についてのマップを示す。調節性領
域：半開き線、エキソン：黒色、イントロン：斜線；ヌクレオチド７００から１
５６０を表示；推測の因子結合部位を箱囲み。

【００３０】 図８Ａ−Ｌは、腫瘍の等級付けに関するＲａｄ５１、ｐ５３、Ｋｉ６７−抗原
、ＢＲＣＡ１の発現を示す。種々の組織学的等級（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３）の侵襲性
管状癌腫からの標本を集め、モノクローナル抗体１Ｇ８（抗Ｒａｄ５１）、Ｄｏ
−１（抗ｐ５３）、ＭＩＢ−１（抗Ｋｉ６７−抗原）、ＡＢ−１（抗ＢＲＣＡ１
）で染色した。ヘマルムで対染色した。

【００３１】 図９は、Ｒａｄ５１、ｐ５３、Ｋｉ６７−抗原、ＢＲＣＡ１の発現と確立して
いる腫瘍評価基準との相関を示すグラフである。ｒ_ｓ：スペアマンｓランク相関
率；^＊／^＊＊／^＊＊＊：ｐ＜０.０５／０.０１／０.００１；Ｔ：腫瘍の大きさ
；Ｎ：結節状態；Ｇ：組織学的等級付け；ＥＳ：エストロゲン受容体状態；ＰＳ
：プロゲステロン受容体状態；ＰＣＩ：陽性染色細胞インデックス；ＩＲＳ：免
疫反応スコアー（Remmele and Stegner, 1987) ；ＳII：染色強度インデックス
。

【００３２】 図１０Ａ−１０Ｄは、ＢＲＣＡ１の代表的染色パターンを示す。侵襲性管状乳
癌の種々の標本のＢＣＲＡ１発現についての染色にモノクローナル抗体ＡＢ−１
を用いた。（０）：ＢＣＲＡ１特異的染色なし（メイヤーのヘマルム対染色によ
る青色核）；（１）：１０％以上の腫瘍細胞が弱いＢＣＲＡ１染色（灰色）を示
す；（２）：１０％以上の褐色の腫瘍細胞核を有する明確なＢＣＲＡ１染色；（
３）：１０％以上の腫瘍細胞核の強い褐色の染色。

【００３３】 図１１Ａ−１１Ｃは、Ｒａｄ５１の異所性発現がＵｉＲａｄ５１細胞において
細胞周期の停止を起こすことを示す。より具体的には、図１１Ａは、ＵｉＲａｄ
５１細胞が異所性Ｒａｄ５１タンパク質を誘発的に過剰発現することを示す。細
胞のムリステロンＡの存在または不存在での成長をそれぞれ＋および−で表す。
等しい細胞数の分解物を各レーンに用い、モノクローナル抗体１Ｇ８を用いてＲ
ａｄ５１タンパク質についてウエステンブロット法で分析した。図１１Ｂは、Ｕ
Ｖ照射に応答するＧ_１およびＧ_２／ＭにおけるＵｉＬａｃＺおよびＵｉＲａｄ５
１細胞の停止を示す。細胞をＵＶ刺激し、５４時間後に採取し、フローサイトメ
トリーにより分析した。図１１Ｃは、Ｒａｄ５１の過剰発現が細胞周期の停止を
誘発することを示す。細胞をムリステロンＡの存在または不存在で表示の時間培
養し、フローサイトメトリーによる細胞周期の分析にかけた。

【００３４】 図１２Ａ−１２Ｃは、Ｒａｄ５１の異所性発現がｐ２１^Ｗａｆ１タンパク質の
発現をｐ５３活性化なしに転写的に誘発することを示す。より具体的には、図１
２Ａは、Ｒａｄ５１がｐ２１^Ｗａｆ１タンパク質の発現を開始することを示す。
ＵｉＲａｄ５１細胞をプレートに置き、２４時間放置した。このときに、レーン
１および２に示す細胞が非誘発細胞がムリステロンＡのために使用する溶媒であ
る１％エタノールを受容し、一方、レーン３および４に示す細胞がムリステロン
Ａで補足された。ＵＶ照射を追加の２４時間後に行い（レーン２および４）、そ
の２４時間後に細胞を採取した。等しい数の細胞をモノクローナル抗体６Ｂ６（
ファルミゲン）によるｐ２１^Ｗａｆ１タンパク質検出のためのウエステンブロッ
ト法にかけた。図１２Ｂは、Ｒａｄ５１がｗａｆ−１プロモーター転写活性化を
誘発することを示す。等しい数の非誘発ＵｉＬａｃＺおよびＵｉＲａｄ５１細胞
をレポータープラスミドＷＷＰ−Ｌｕｃ（el Deiry, W.S., et al., Cell 75: 8
17-25 (1993)) でトランスフェクトした。細胞をポナステロンＡで表示の４８時
間で誘発した。細胞分解物をタンパク質含量について調整し、ルシフェラーゼ活
性を検定した。誤差バーは３倍の標準偏差を表す。図１２Ｃは、Ｒａｄ５１が転
写因子としてｐ５３の活性化を開始しないことを示す。ＵｉＲａｄ５１青色細胞
を接種し、２４時間放置し、ついで１μＭムリステロンＡで４０時間処理した。
ＵＶ照射を採取の１６時間前に行った。β−ガラクトシダーゼ活性を２回検定し
た。

【００３５】 図１３Ａ−１３Ｃは、Ｒａｄ５１誘発の細胞周期停止が長いＲａｄ５１の過
剰発現後になくなることを示す。特に、図１３Ａは、Ｒａｄ５１停止ＵｉＲａｄ
５１細胞がＲａｄ５１の過剰発現にもかかわらず細胞周期に再び入ることを示す
。細胞をムリステロンＡで表示の時間誘発し、細胞周期期の分布をフローサイト
メトリーで調べた。Ｇ_１：灰色、Ｓ：黒色、Ｇ／Ｍ：斜線。図１３Ｂは、 ｐ２
１^{Ｗａｒｆ１}タンパク質レベルが減少し、細胞が増殖に再び入ることを示す。図
１３Ａから誘導した等しい数の細胞をモノクローナル抗体６Ｂ６（ファルミゲン
）によるｐ２１^Ｗａｆ１発現分析のためウエステンブロット法にかけた。図１３
Ｃは、Ｒａｄ５１がｗａｆ−１プロモーター転写活性化を適応後に誘発しないこ
とを示す。等しい数の非誘発および適応のＵｉＲａｄ５１細胞をレポータープラ
スミドＷＷＰ−Ｌｕｃ（el Deiry, W.S., et al., Cell 75: 817-25 (1993)) で
トランスフェクトした。細胞をポナステロンＡで表示の４８時間で誘発した。細
胞分解物をタンパク質含量について調整し、ルシフェラーゼ活性を検定した。「
非誘発」および「誘発」は、トラスフェクト後の４８時間でのポナステロンＡ処
理に関する。「非適応」：細胞をＷＷＰ−Ｌｕｃでのトランスフェクト（参照、
図１２Ｃ）後のみポナステロンＡで処理した；「適応」：細胞をトランスフェク
ト前に２８日以上ポナステロンＡで処理した；「継続的処理」：適応細胞をＷＷ
Ｐ−Ｌｕｃのトランスフェクトまで途切れないで処理した；「非継続的処理」：
適応細胞のトランスフェクト前４８時間で終る処理を行った。誤差バーは３倍の
標準偏差を表す。

【００３６】 図１４−１４Ｂは、Ｒａｄ５１過剰発現に対する適応がＵＶ開始細胞周期の停
止経路に影響を及ぼさないことを示す。特に、図１４Ａは、適応された細胞にお
けるＲａｄ５１の再誘発が細胞周期の停止をもたらさないことを示す。ポナステ
ロンＡを長時間誘発（＞２８日）のＵｉＲａｄ５１細胞から１４日で（パネル１
）除去し、または除去１１日後の７２時間で再誘発し（パネル２）、細胞をフロ
ーサイトメトリーで分析した。パネル３および４：細胞をそれぞれパネル１およ
び２のように処理したが、加えて細胞を採取２４時間前にＵＶ照射した。図１４
Ｂは、ｐ５３が適応された細胞のＵＶ照射後に蓄積することを示す。細胞を（Ａ
）のように処理した。各アリコートをウエステンブロット法のために分解した。
等しい細胞数の分解物を各レーンに適用し、ポリクローナルヒツジ抗ｐ５３血清
を用いてｐ５３タンパク質について分析した。レーン番号は図１４Ａのパネル番
号に対応する。

【００３７】 （本発明の詳細な説明） 本発明は、Ｒａｄ５１が多数の細胞性機能を担う中心的な役割に関連する一連
の知見に関する。この機能は疾患状態に関与する機能を含む。特に、本明細書中
の記載は、Ｒａｄ５１を阻害するための組成物および方法であり、そしてＲａｄ
５１阻害剤を用いてさらに以下に明確にするように、Ｒａｄ５１活性関連障害の
治療方法に関する。アポトーシスの調節に関する方法も提供する。さらに、Ｒａ
ｄ５１関連障害の診断、予測に加えて、治療の予測的帰結に関する方法も提供す
る。Ｒａｄ５１に関連のある他の組成物および方法も記載する。

【００３８】 ひとつの実施態様において、最初の個体についての最初の組織型、すなわち診
断および予測が必要とされるサンプル組織においてＲａｄ５１の発現レベルを最
初に測定することを含む方法を提供する。ひとつの実施態様において、この試験
を、球状物として培養した１以上の細胞または主要組織サンプルで行い得る。最
初の個体すなわち患者は、疾病状態についてのリスクの存在が危惧されている者
であり、一般的にはヒトが対象である。当業者には既知のように、該患者は、例
えばヒトの疾病についての動物モデルの開発または評価においては動物であって
もよい。即ち、哺乳動物を含む他の動物、齧歯動物 (マウス、ラット、ハムスタ
ーおよびモルモット) などの哺乳動物、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ
、ヒツジ、ブタなどを含む畜産動物および霊長類動物(サル、チンパンジー、オ
ランウータンおよびゴリラを含む) は、患者の定義内に含まれる。

【００３９】 当業者には既知のように、試験する組織型は、問題とする疾病状態に依存する
。即ち、例えば、潜在的癌性組織を試験すると、それは、乳組織、皮膚細胞、膵
臓、前立腺、結腸、充実性腫瘍、脳組織などを包含する。好ましい態様において
、問題とする疾病状態は癌であり、組織サンプルは潜在的癌組織型である。特に
注目するものは、乳、皮膚、脳、結腸、膵臓、前立腺および他の充実性悪性腫瘍
である。

【００４０】 本明細書中でいうＲａｄ５１発現は、タンパク質または核酸レベルで発現の全
ての形態を意味する。好ましくは、発現レベルは、タンパク質レベルで測定し、
核酸レベルは測定から除く。

【００４１】 Ｒａｄ５１の発現レベルを測定すると、診断または予想を決定するために対照
と比較することができる。その対照は、別の個体からのサンプルまたは同じ個体
の別組織からのサンプルのような影響を受けていないサンプルについての別の対
照試験であってもよい。もしくは、試験される個体に類似する個体おけるＲａｄ
５１の「正常」範囲のレベルを示す、チャート、表、ダイアグラムであってもよ
い。あるケースでは、重症度は、１つ以上の対照をもち、試験結果と対照との差
異がどの程度かを測定することによって決定してもよい。対照を超える試験結果
において、Ｒａｄ５１のレベルが高いほど癌の重症度を示す。あるいは、多くの
対照を準備して、結果を、あらかじめ決められた癌の重症度を示す対照と対にで
きる。重症度を測定することによって、予測も提供し得る。

【００４２】 変化、好ましくは増加は、一般的に少なくとも約５％〜約５０％以上であり、
、より好ましくは２０％〜１００％、時には２００％以上の増加、時には３００
％以上の増加、時には４００％以上の増加、時にはまた５００％以上増加および
時には７５０％以上の増加である。一般的にこの効果をみるためには、少なくと
も約１００個の細胞を検査すべきであって、少なくとも約５００個の細胞が好ま
しく、少なくとも約１０００個の細胞が特に好ましい。

【００４３】 Ｒａｄ５１の発現レベルは、種々の方法で測定し得る。好ましい実施態様にお
いて、Ｒａｄ５１に結合する標識結合剤を使用する。本明細書中で「標識」とは
、化合物が、少なくとも１つの元素、アイソトープまたは化合物の検出を可能に
するように結合する化学的化合物を有することを意味する。一般的に、標識は３
つに分類できる: a)アイソトープ標識、これは放射性活性または重いアイソトー
プであってもよい; b)免疫標識、これは抗体または抗原であってもよい；c)染色
または蛍光染料である。この標識は、いずれかの部分で化合物に組込まれている
。好ましい標識は蛍光または放射活性標識である。該結合剤は、直接に標識され
得るか、または最初の結合剤に結合する標識した二次剤の使用を通じて間接的に
標識され得る。球状物または組織サンプルは、当業者に既知の技術を用いて実施
例に記載のように、細胞性またはイン・シチュ染色として既知のように調製し得
る。

【００４４】 好ましい実施態様において、Ｒａｄ５１タンパク質を検出するために使用する
該結合剤は抗体である。該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の
いずれかであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。一般的には、必須
ではないが、評価中の特定のＲａｄ５１に対する抗体を用いるのが好ましい；即
ち、ヒト患者の評価にはヒトＲａｄ５１に対する抗体を用いる。しかし、異種の
哺乳類Ｒａｄ５１分子間のホモロジーが非常に高いので(例えば、ヒトおよびト
リでは７３％同一性)、異なる動物を評価するために、動物のある型に由来のＲ
ａｄ５１に対する抗体を使用することは可能である(ヒトの組織を評価するため
のマウス抗体など)。即ち、好ましい実施態様において、真核生物のＲａｄ５１
に対して生じた抗体を用いるが、哺乳類 Ｒａｄ５１に対して生じた抗体が特に
好ましい。即ち、酵母、ヒト、ネズミ、霊長類および鳥類のＲａｄ５１タンパク
質に対する抗体が特に好ましい。さらに、当業者には既知のように、抗体を生成
するために使用した該タンパク質は、完全長タンパク質である必要はない; 検出
可能なサンプルＲａｄ５１に対して十分な免疫反応性がある限り、断片および誘
導体を使用してもよい。一方、視覚化し得る十分な親和性でＲａｄ５１と結合す
る別の結合剤を用いてもよい。別の態様において、発現レベルは、Ｒａｄ５１の
ｍＲＮＡレベルを測定することによって決定する。

【００４５】 本発明の別の態様において、Ｒａｄ５１発現および／または活性を阻害する方
法を提供する。本発明のひとつの態様において、少なくとも１つのＲａｄ５１生
物学的または生物化学的活性を阻害するための方法を提供する。該方法は、Ｒａ
ｄ５１含有組成物にＲａｄ５１阻害剤を与えることを含む。組該成物は、Ｒａｄ
５１およびＲａｄ５１活性を可能にする条件でＤＮＡやＡＴＰなどのＲａｄ５１
結合剤を含むインビトロ溶液であり得る。別の実施態様において、該組成物は細
胞である。好ましい実施態様では、Ｒａｄ５１阻害剤は小分子である。

【００４６】 本明細書中で使用するＲａｄ５１生物学的または生物化学活性は、ＤＮＡ依存
性のＡＴＰアーゼ活性、Ｒａｄ５１ fociの形成、核酸鎖交換、ＤＮＡ結合、核
タンパク質フィラメント形成、ＤＮＡ対合およびＤＮＡ修復からなる群から選択
し得る。ＤＮＡの修復および組換えは、一般的に生物学的活性であると考えられ
る。ＤＮＡ修復は、二本鎖開裂修復、一本鎖アニーリングまたは反復後の組換え
的修復であり得る。

【００４７】 さらに以下に詳細に説明するように、本発明の別の態様において、Ｒａｄ５１
阻害剤は細胞増殖を阻害する。さらに以下に詳細に述べる別の態様において、Ｒ
ａｄ５１阻害剤はそれを含む細胞をつくる。この細胞は、放射および／または化
学治療剤に対する感受性がさらに高くなっている。さらに別の態様において、Ｒ
ａｄ５１阻害剤は、以下詳細に説明するように、アポトーシスを誘発する。

【００４８】 ひとつの態様において、Ｒａｄ５１阻害剤またはＲａｄ５１阻害剤活性を持つ
薬剤または組成物は、Ｒａｄ５１核酸の発現または翻訳、またはＲａｄ５１ペプ
チドの生物学的活性を、少なくとも３０％、より好ましくは４０％、より好まし
くは５０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％および最も好まし
くは９５％まで阻害する薬剤または組成物と本明細書では定義する。本明細書中
のひとつの態様では、Ｒａｄ５１阻害剤は、Ｒａｄ５１核酸の発現または翻訳、
またはＲａｄ５１タンパク質の活性を１００％まで阻害する。ひとつの態様にお
いて、阻害とは、Ｒａｄ５１阻害剤を含まない対照と比較して、Ｒａｄ５１活性
のなんらかの検出をなし得る低下と定義する。

【００４９】 ひとつの態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、細胞を放射線に増感させ、そし
てインビボでの組換えにも影響を与える、ＲecＡおよび／または阻害剤などのＲ
ａｄ５１ホモログ阻害剤を含む。これはＲａｄ５１を阻害すると以前には知られ
ていなかった。ひとつの実施態様において、本明細書でのＲａｄ５１は、Ｒａｄ
５１およびそのホモログ、好ましくはヒトホモログを意味する。ひとつの実施態
様においては、Ｒａｄ５１は非ヒトホモログを除く。Ｒａｄ５１ホモログは酵母
および哺乳動物におけるＲecＡおよびＲａｄ５１ホモログを包含する。E. coli
ＲｅｃＡと酵母Ｒａｄ５１に相同な遺伝子は哺乳類を含む真核生物の全ての群か
ら単離されている（Morita, et al., PNAS USA 90:6577-6580 (1993); Shinohar
a, et al., Nature Genet. 4:239-243 (1993); Heyer, Experentia, 50:223-233
(1994); Maeshima, et al., Gene 160:195-200 (1995)）。 ヒトＲａｄ５１ホ
モログはＲａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、ＸＲＣＣ２およびＸＲＣ
Ｃ３を包含する（Albala, et al., Genomics 46:476-479 (1997); Dosanjh, et
al., Nucleic Acids Res 26:1179(1998); Pittman, et al., Genomics 49:103-1
1 (1998); Cartwright, et al., Nucleic Acids Res 26:3084-3089 (1998); Liu
, et al., Mol Cell 1:783-793 (1998)）。好ましい実施態様において、本明細
書中で提供されるＲａｄ５１阻害剤は、ＲｅｃＡまたは別のＲａｄ５１ホモログ
を阻害すること、そして放射線に対する細胞の感受性を誘発することも以前には
知られていなかった。ひとつの実施態様において、本明細書中で使用されたＲａ
ｄ５１はそのホモログを除く。

【００５０】 Ｒａｄ５１阻害剤は、直接的または間接的にＲad５１を阻害するが、好ましく
はＲａｄ５１核酸またはタンパク質の少なくとも一部との相互作用によって直接
的にＲａｄ５１を阻害することができる。さらに、本明細書中の該阻害剤は、個
々にまたは各々を組み合わせて利用し得る。

【００５１】 好ましい実施態様において、小分子は、好ましくは４ｋダルトン(kd)またはそ
れ以下である。別の実施態様において、小分子は、３kd、２kdまたは１kd以下で
ある。 別の実施態様において、小分子は８００ダルトン(Ｄ)、５００Ｄ、３０
０Ｄ、２００Ｄまたは１００Ｄである。

【００５２】 ひとつの実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、無機または有機分子である
。好ましい実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、タンパク質との構造的相互
作用に必要な官能基を含む小さな有機分子であって、特に水素結合および通常少
なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ま
しくは少なくとも２つの官能性化学基を含む。Ｒａｄ５１阻害剤は、１以上の化
学的官能基で置換した環式炭素またはヘテロ環構造および／または芳香族または
ポリ芳香族構造を含んでもよい。さらに以下に詳細に述べるように、Ｒａｄ５１
阻害剤は、ヌクレオチド、ヌクレオチド、およびヌクレオシドおよびヌクレオチ
ドアナログを含むことも可能である。本明細書中で使用するヌクレオチドはＸＹ
Ｐを意味し、ＸＹＰ中、ＸはＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡ(塩基はウラシル、チミン
、グアニン、シトシンまたはアデニンの各々)であってもよく、ＹはＭ、Ｄまた
はＴ (モノ、ジまたはトリの各々)であってもよい。別の実施態様において、ヌ
クレオチドは、キサンタニン、ハイポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニ
ンなどを包含してもよい。本明細書中で使用したようなアナログは、化学的に修
飾された誘導体およびヌクレオチドおよびヌクレオチドを包含する。ひとつの実
施態様において、メチルメタンスルホネートは除く。

【００５３】 本発明のある態様において、Ｒａｄ５１阻害剤はヌクレオチドジホスフェート
である。好ましい実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、ＡＤＰ、ＧＤＰ、Ｃ
ＤＰ、ＵＤＰおよびＴＤＰからなる群から選択する。好ましい態様において、Ａ
ＤＰを除く。

【００５４】 本発明の別の態様において、Ｒａｄ５１阻害剤はヌクレオチドアナログである
。 好ましい実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、フッ化アルミニウムと複
合体化したヌクレオチドジホスフェートである。ひとつの実施態様において、Ｒ
ａｄ５１阻害剤は、ＡＤＰ.ＡｌＦ４、ＧＤＰ.ＡｌＦ４、ＣＤＰ.ＡｌＦ４、Ｕ
ＤＰ.ＡｌＦ４及びＴＤＰ.ＡｌＦ４からなる群から選択する。

【００５５】 本発明のさらなる別の態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、非加水分解性のヌ
クレオチドである。好ましい実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、ＡＴＰγ
Ｓ、 ＧＴＰγＳ、ＵＴＰγＳ、ＣＴＰγＳ、ＴＴＰγＳ、ＡＤＰγＳ、ＧＤＰ
γＳ、ＵＤＰγＳ、ＣＤＰγＳ、ＴＤＰγＳ、ＡＭＰγＳ、ＧＭＰγＳ、ＵＭＰ
γＳ、ＣＭＰγＳ、ＴＭＰγＳ、ＡＴＰ-ＰＮＰ、ＧＴＰ-ＰＮＰ、ＵＴＰ-ＰＮ
Ｐ、ＣＴＰ-ＰＮＰ、ＴＴＰ-ＰＮＰ、ＡＤＰ-ＰＮＰ、ＧＤＰ-ＰＮＰ、ＵＤＰ-
ＰＮＰ、ＣＤＰ-ＰＮＰ、ＴＤＰ-ＰＮＰ、ＡＭＰ-ＰＮＰ、ＧＭＰ-ＰＮＰ、ＵＭ
Ｐ-ＰＮＰ、ＣＭＰ-ＰＮＰおよびＴＭＰ-ＰＮＰからなる群から選択する。好ま
しい態様において、ＡＤＰγＳを除く。

【００５６】 別の実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤はＤＮＡ小溝結合剤である。好まし
い実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、ジスタマイシン、ネトロプシン、ビ
ス−ベンゾイミダゾールおよびアクチノマイシンからなる群から選択する。

【００５７】 また別の実施態様において、Ｒａｄ５１阻害剤はペプチドである。本明細書中
で「ペプチド」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパ
ク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含するものである。該
タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド
様構造から構成され得る。即ち、本明細書中で使用した「アミノ酸」または「ペ
プチド残基」とは、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。
例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノレルシンは、本発明の目的
に関してアミノ酸とみなす。また、「アミノ酸」は、イミノ酸残基、例えば、プ
ロリンおよびヒドロキシプロリンも包含する。該側鎖は、(Ｒ)または(Ｓ)配置の
いずれに存在してもよい。好ましい態様において、アミノ酸は、(Ｓ)またはＬ配
置で存在してもよい。天然に存在しない側鎖を用いる場合、例えばインビボ分解
を防御または回避するために、非アミノ酸置換基を用いてもよい。

【００５８】 該ペプチドは、天然に存在するものであっても、天然に存在するタンパク質の
断片であってもよい。即ち、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、または
ランダムもしくはタンパク質様(proteinaceous)細胞抽出物の直接的分解物を使
用してもよい。即ち、原核生物および真核生物のタンパク質は、Ｒａｄ５１阻害
剤であり得る。Ｒａｄ５１阻害剤は、細菌、菌類、ウイルスおよび哺乳類起源か
らのペプチドであってもよいが、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好まし
い。

【００５９】 好ましい態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は、約５〜約３０個のアミノ酸のペ
プチドであって、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個のアミ
ノ酸が特に好ましい。該ペプチドは、天然に存在するタンパク質の分解物であっ
てもよく、上記記載のようなランダムペプチドまたは「バイアス」ランダムペプ
チドであってもよい。本明細書中の「ランダム化」または文法上等価物は、主に
ランダムヌクレオチドおよびアミノ酸各々を含む各核酸および各ペプチドを意味
する。一般的にこれらのランダムペプチド(または以下に示す核酸)は、化学的に
合成し、どの部分でも、全てのヌクレオチドまたはアミノ酸を組み入れ得る。合
成過程は、ランダム化タンパク質または核酸を生成するように構築し、該配列の
長さ以上の起こり得る組合わせ物の全てまたは殆どの形態とすることができる。

【００６０】 好ましいペプチドは、p５３およびＲａｄ５１抗体を含み、限定でないが、p５
３のアミノ酸の９４〜１６０および２６４〜３１５およびＲａｄ５１抗体断片を
含む。

【００６１】 好ましい態様において、Ｒａｄ５１阻害剤は核酸である。本明細書中の「核酸
」または「オリゴヌクレオチド」または文法上等価物は、少なくとも２つのヌク
レオチドが一緒に共有結合したものを意味する。本発明の核酸は、一般的にホス
ホジエステル結合を含むが、いくつかの場合では、以下に詳細に示したように核
酸アナログは、例えば、リンアミド(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):192
5 (1993)) およびその引例; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprin
zl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids
Res. 14:3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et
al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); and Pauwels et al., Chemica Scri
pta 26:141 91986))、ホスホロチオエート (Mag et al., Nucleic acids Res. 1
9:1437 (1991); および U.S. Patent No. 5,644,048)、ホスホロジオエート(Bri
u et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989))、O-メチルホスホロアミデート
結合(参照；Eckstein, oligonucleotides and analogue: A Practical Approach
, Oxford University Press) およびペプチド核酸骨格および結合(参照；Egholm
, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl.
31:1008 (1992); Nielsen, Nature 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature
380:207 (1996))、出典明示により全ての引例を本明細書の一部とする)を含む別
の骨格を示し得るものを含む。他のアナログ核酸は、陽性骨格(Denpcy et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); 非イオン性骨格 (U.S. Patent N
os. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 and 4,469,863; Kiedrowshi
et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al.,
J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., nucleotide & nucle
otide 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbo
hydrate amodification in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Da
n Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994
); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:
743 (1996))および非リボース骨格; U.S. Patent Nos. 5,235,033 および 5,034
,506 に記載の文献および Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Car
bohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P.
Dan Cookを包含する。１以上の炭素環式糖を含む核酸は、核酸の定義内に含まれ
る(参照；Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp169-176 (1995))。いくつかの
核酸アナログは、Rawls, C & E News p. 35 (June 2, 1997)に記載されている。 本明細書中で引用した文献は、出典明示により本明細書中の一部とする。リボ
ース・ホスフェート骨格に関するこれらの修飾は、標識のような付加成分の付加
を容易にするか、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期に
関する増加を容易にし得る。さらに、ＰＮＡを含有する天然に存在する核酸とア
ナログの混合物を作り得る。一方、異なる核酸アナログの混合物および天然に存
在する核酸とアナログとの混合物も作り得る。該核酸は一本鎖または二本鎖で存
在するか、特別には二本鎖または一本鎖配列の両方の部分を含む。該核酸はＤＮ
Ａであってもよく、ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドの両方で
あってもよく、その場合、核酸はデオキシリボおよびリボヌクレオチドの全ての
組み合わせとウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キ
サンタニン、ハイポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基
の全ての組み合わせを包含する。

【００６２】 一つの態様として、Ｒａｄ５１阻害剤はＲａｄ５１と結合すると解するが、広
く一般的にＲａｄ５１を活性化する薬剤、例えば、組換え活性やＤＮＡ修復など
の過程においてＲａｄ５１が普通に結合するＤＮＡを除く。

【００６３】 タンパク質について一般的には、核酸Ｒａｄ５１阻害剤は天然に存在する核酸
、ランダム核酸または「バイアス化」ランダム核酸であってもよい。例えば、原
核生物または真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上記に説明したよ
うに使用してもよい。

【００６４】 Ｒａｄ５１阻害剤は、当業者には既知のように、合成または天然化合物のライ
ブラリィを包含する多岐に渡る起源から得られる。いくつかの技術は、ランダム
化したオリゴヌクレオチドの発現を含む有機化合物および生物分子に関する多種
のランダム化および直接合成を利用し得る。一方、細菌、菌類、植物および動物
抽出物の形態にある天然化合物のライブラリィは入手可能であるかまたは簡単に
作り得る。さらに、天然または合成的に生成したライブラリィおよび化合物は、
従来の化学的、物理的および生物化学的手段によって簡単に修飾し得る。既知の
医薬製剤は、構造アナログを生成するために直接的にまたはランダムに化学的修
飾を目的とし得る。

【００６５】 好ましい実施態様において、該方法は、インビトロおよびインビボ適用の両方
を含むが、インビボが好ましい。従って、好ましい態様において、該方法は、生
理学的環境下で、Ｒａｄ５１を含むサンプルに、好ましくは細胞にＲａｄ５１阻
害剤を投与することを包含する。

【００６６】 Ｒａｄ５１阻害剤を投与される細胞は、様々な細胞であってよい。好ましい細
胞は哺乳類であるが、より好ましくはヒトである。該細胞は、癌細胞および以下
に記載のＨＩＶのようなウイルスに感染した細胞を含む病状細胞のような、Ｒａ
ｄ５１阻害を必要とする部位におけるいかなる細胞であってよい。

【００６７】 投与は多くの方法で行い得る。Ｒａｄ５１阻害剤の細胞への添加は他の阻害剤
について当業者に既知のように行い、核局在化シグナル（ＮＬＳ）の使用を含む
。核局在化シグナル(ＮＬＳ)の使用を包含してもよい。ＮＬＳは一般的に短く、
陽性に電荷を帯びた(塩基性) ドメインであって、細胞の核に出現する全タンパ
ク質を振分けるのに機能するものである。 多数のＮＬＳアミノ酸配列は、１つ
の基本的なＮＬＳの物質を含むと報告されている。例えば、ＳＶ４０ (サルのウ
イルス)巨大Ｔ抗原 (Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val), Kalderon (1984), et al.
, Cell 39:499-509; ヒトレチノイン酸受容体β核局在化シグナル(ＡＲＲＲＲＰ
); ＮＦκＢ p５０ (ＥＥＶＱＲＫＲＱＫＬ; Ghosh et al., Cell 62:1019 (199
0); ＮＦκＢｐ６５ (ＥＥＫＲＫＲＴＹＥ; Nolan et al., Cell 64:961 (1991)
); およびその他のもの(参照、例えばBoulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-5
8 (1994))、出典明示により本明細書の一部とする) および２つの基本的なＮＬ
Ｓの例示、ツメガエル(アフリカツメガエル)タンパク質、ヌクレオプラスミン(A
la Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys L
eu Asp), Dingwall, et al., Cell 30:449-458, 1982 and Dingwall, et al., J
. Cell Biol., 107:641-849; 1988)である。多くの局在化に関する研究によれば
、合成ペプチドに組込まれたか、またはレポータータンパク質または通常細胞核
を標的としない他の分子に移植されたＮＬＳは、これらの分子を核内に集める。
例えば、Dingwall, and Laskey, Ann, Rev. Cell Biol. 2:367-390, 1986; Bonn
erot, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6795-6799, 1987; Galileo, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:458-462, 1990を参照。

【００６８】 細胞中にＲａｄ５１阻害剤を導入するために利用し得る多様な技術がある。こ
の技術は、阻害剤が、意図する宿主の細胞でインビトロまたはインビボの培養細
胞に移入されるかどうかによって変化する。インビトロでの哺乳類細胞中への阻
害剤の移入に適当な技術には、リポソーム、エレクトロポーレーション、マイク
ロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストリン、リン酸カルシウム沈
殿方法などが含まれる。現在好ましいインビボ移入技術は、ウイルスによる (通
常はレトロウイルス)ベクターおよびウイルスコートタンパク質-リポソーム介在
トランスフェクション(Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210 (19
93))を含む。特定のまたは他のリポソーム、修飾エレクトロポーレーション、化
学処置またはピエゾ(Piezo)注入技術が特に好ましい。

【００６９】 該阻害性薬剤は、経口的、全身的、局所的、経腸的、例えば、皮下、腹膜内、
血管内などの種々の方法で投与し得る。ひとつの実施態様において、該阻害剤は
、手術の操作中に腫瘍部分 (または腫瘍除去) に適用する。導入方法によって、
該化合物は多様に製剤し得る。製剤中の治療上活性な化合物の濃度は、約０.１
〜１００重量％の範囲であり得る。一般的に、治療上必要な量を用い、例えば、
細胞性増殖の阻害に達し、放射線治療または化学的治療増感またはアポトーシス
を誘発するのに使用する。

【００７０】 Ｒａｄ５１阻害性分子は、医薬上または生理学上許容し得る担体ビヒクルとの
混合物で組み合わせ得る。医薬製剤は、所望により、凍結乾燥化製剤または水溶
液の形態にある生理学的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤 (Remington'
s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と、所望の純
度を有する活性成分とを混合して貯蔵用に調製する。許容し得る担体、賦形剤ま
たは安定化剤は、患者に対して用いる用量および濃度では無毒性であり、緩衝液
、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン;
低分子量(約１０残基以下)のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミ
ン、ゼラチンまたはイムノグロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロ
リドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンま
たはリジン；単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含
むその他の炭化水素；キレート剤、例えばＥＤＴＡ; 糖アルコール、例えばマン
ニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／ま
たは非イオン性海面活性剤、例えばＴween、ＰluronicsまたはＰＥＧを包含する
。

【００７１】 該医薬組成物は、多様な形態、例えば、顆粒剤、エーロゾル、錠剤、丸薬、座
剤、カプセル、懸濁剤、軟膏、ローションおよびその他の形態で調製し得る。医
薬グレードの有機または無機担体および／または希釈剤は、治療上有効な化合物
を含む組成物を構成するために使用し得る経口または経腸用に適当である。当業
者に既知の希釈剤は、水性媒体、植物および動物の油および脂肪を包含する。安
定化剤、湿潤化および乳化剤、浸透圧を変えるための塩類または十分なｐＨ値を
保障するための緩衝液および皮膚浸透上昇剤を、補助剤として使用し得る。

【００７２】 ある状況下では、標的細胞を標的とする薬剤と阻害剤、例えば、細胞表面膜タ
ンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリ
ガンドなどを準備することが望まれる。リポソームを用いる場合、エンドサイト
ーシスと関連した細胞表面の膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化およ
び／または取込みを利用するために使用し得る。例えば、キャップシドタンパク
質または特定の細胞型に対する回帰線的その断片、循環中のインターナリゼーシ
ョンを進行するタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内の半
減期を上げるタンパク質である。受容体介在エンドサイトーシスの技術は、例え
ば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); and Wagner et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)らによって述べられている。

【００７３】 本発明の医薬組成物に関する用量および所望の薬剤濃度は、目的とする特定の
使用によって変化する。適切な用量または投与経路の決定は、一般的な医師によ
く知られている。動物実験は、ヒト治療に対する有効用量の測定について信頼性
のある指針を提供する。種間の有効用量のスケーリングは、Mordenti, J. and C
happell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxic
okinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press,
New York pp. 42-96 (1989)によって提案されている原則に従って行い得る。

【００７４】 好ましい実施態様において、該方法は、Ｒａｄ５１阻害剤の阻害効果を同定す
ることを含む。例えば、二重鎖開裂修復、相同組替えに対する効果の測定、電離
照射に対する感受性、クラススイッチ組替え、細胞性阻害、アポトーシスの誘発
などである。アッセイは、Park, J. Biol. Chem. 270(26):15467 (1995) and Li
et al., PNAS USA 93:10222 (1996), Shinohara et al., supra, (1992)（出典
明示により本明細書の一部とする）に記載されている。さらに、アッセイについ
ては実施例で下記に説明する。

【００７５】 本明細書中で提供する実施態様において、本発明は、細胞増殖阻害を必要とす
る疾病状態を処置する方法を提供する。好ましい実施態様において、疾病状態は
、本明細書中に記載したＲａｄ５１発現、Ｒａｄ５１の翻訳または生物学的活性
の少なくとも１つの阻害を必要とする。当業者に既知のように、疾病状態とは、
個体が疾病しているか、疾病を進行させるリスクのどちらかを意味する。

【００７６】 本発明で提供される方法と組成物により治療し得る病気とは、過剰増殖の疾病
を包含するが、これらに限定されるものではない。より詳しくは、本方法は、限
定されるものではないが、癌（さらに以下で検討）、早期老化、自己免疫疾患、
関節炎、組織片移植拒絶反応、炎症性腸疾患、医療処置（外科手術、血管形成術
などを含むが、これらに限定されるものではない）後に誘発される増殖などの治
療に使用し得る。このように、ひとつの実施態様において、本明細書記載の発明
はこれら疾病のいずれか一つに罹患しているか、または罹患しそうな細胞または
個体に適用することを包含する。

【００７７】 本発明にて提供される組成物および方法は、特に、癌、例えば、皮膚、***、
脳などの充実性腫瘍、子宮頚部癌、膵臓癌、睾丸癌などの治療に有用である。よ
り詳しくは、本発明の組成物と方法により治療し得る癌は以下のとおりであるが
、これらに限定されるものではない： 心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋
腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫； 肺臓：気管支原性癌（偏平上皮細胞、未分化小細胞、未分化巨細胞、腺癌）、
肺胞（気管支原性）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫
； 胃腸：食道（偏平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リン
パ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌、膵島細胞腫、グルカゴノーマ、ガストリノ
ーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ腺腫）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド
腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、線維腫）、大腸（
腺癌、管状腺癌、絨毛腺癌、過誤腫、平滑筋腫）； 生殖泌尿器：腎臓（腺癌、ウイルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病
）、膀胱および尿道（偏平上皮細胞癌、移行型白血球癌、腺癌）、前立腺（腺癌
、肉腫）、睾丸（精上皮腫、奇形腫、胚癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、腸細胞癌、
線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；

【００７８】 肝臓：肝臓癌（肝細胞癌）、肝内胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血
管腫； 骨：骨原発性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユ
ーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊
索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液線維腫、類
骨骨腫および巨細胞腫瘍； 神経系：頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫
、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、脳室上衣芽
細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、神
経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、グリオーマ、肉腫
）； 婦人科：子宮（子宮内膜癌）、頚管（子宮頚管癌、前腫瘍頚管形成異常）、卵
巣（卵巣癌［漿液嚢胞癌、ムチン嚢胞癌、未分類癌］、顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍
、セルトリ−ライジッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（偏平
上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（澄明細胞癌、偏平
上皮細胞癌、ブドウ状肉腫［胚横紋筋肉腫］、ファロピオ管（癌）； 血液系：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球白血病、慢
性リンパ球白血病、骨髄増殖疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］； 皮膚：悪性メラノーマ、基底細胞癌、偏平上皮細胞癌、カポジ肉腫、奇胎形成
異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および 副腎：神経芽細胞腫。 このように、本明細書に示す用語「癌細胞」は上記に確認した症状のいずれか
に罹患した細胞を包含する。

【００７９】 個体すなわち患者は、一般にヒトを対象とするが、当業者も認めるように、患
者は同様に動物であってもよい。従って、他の動物とは、哺乳動物、例えば、げ
っ歯類（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットを包含する）、ネコ、イ
ヌ、ウサギ、畜産動物としてのウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど、また霊長
類（サル、チンパンジー、オランウータンおよびゴリラを包含する）などであっ
て、これらも患者の定義内に包含される。好適な態様において、個体は細胞増殖
の阻害を必要としている。より好ましくは、個体は癌に罹患しているか、または
細胞過剰増殖の症状にある。

【００８０】 本発明により提供される組成物は、前記のように、生理学的に許容し得る担体
と共に宿主に投与することができる。好適な投与方法は、全身投与するか、また
は腫瘍空洞または脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与するものである。

【００８１】 ひとつの実施態様において、本発明のＲａｄ５１阻害剤はアルキル化剤、ＤＮ
Ａ架橋剤、鎖内および鎖間化合物、シスプラチンおよび関連化合物ならびに放射
線に対する感受性を誘発する。誘発された感受性（増感または過敏性）は、放射
線またはアルキル化剤に対する細胞の耐容性により測定することができる。例え
ば、測定し得る感受性すなわち毒性による感受性は、少なくとも２０％上昇した
とき、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、よ
り好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは１００％ないし２００％
またはそれ以上に上昇したときに生じる。

【００８２】 本発明の実施態様において、本発明により提供されるＲａｄ５１阻害剤を投与
することを含む方法は、さらにアルキル化剤の投与または放射線の照射を含む。
本適用の目的において、電離性放射線という用語は、放射線のすべての形状を意
味するものとし、これらに限定されるものではないが、アルファ、ベータおよび
ガンマ線および紫外線を包含し、細胞またはウイルスの遺伝子物質を直接または
間接的に損傷し得るものである。照射処置という用語は、対象のサンプルを電離
性放射線に暴露することを意味し、放射線感受性という用語は、細胞または個体
が緩和なまたは医学的に受容可能な（すなわち、非致死性の診断または治療線量
）電離性放射線に暴露された後に、異常な不利な結果を示すものをいう。アルキ
ル化剤とはＢＣＮＵおよびＣＣＮＵを包含する。さらに、放射増感剤(例えば、
キサンチンおよびカフェインを含むキサンチン誘発体)をＲａｄ５１阻害剤の適
用前後に用い得る。

【００８３】 本発明の一実施態様において、本発明により提供されるＲａｄ５１阻害剤は、
細胞の増殖阻害を必要とする病気の個体の生存時間を延長するために投与する。
好適な態様において、個体はさらに放射線照射またはアルキル化剤の投与を受け
る。

【００８４】 一般的に、結合部位はＲａｄ５１の断片と阻害剤を併用して同定する。ひとつ
の実施態様において、断片は、アミノ酸１２５から２２０の間である。ひとつの
実施態様において、Ｒａｄ５１の１２５−２２０は、５−２５アミノ酸の断片に
断片化し、ついで別々またはランダム組換において試験して、標準的な結合技術
によって結合部位を決定する。

【００８５】 以下の実施例により、上記発明に使用する方法をより詳細に説明し、同時に、
本発明の様々な態様を実施するために企図される最良の形態を明らかにする。理
解すべきことは、これらの実施例が本発明の真の範囲を決して限定するものでは
なく、むしろ説明を目的として提供されるということである。本明細書に引用し
た文献はすべてその全文を出典明示により本明細書の一部とする。

【００８６】 実施例１：Ｒａｄ５１をヒト膵臓腺癌で過剰発現させる 単層と比較して球状として培養した腫瘍細胞におけるヒトＲａｄ５１タンパク
質の発現レベルを分析する。ヒト膵臓癌細胞系の３Ｄ増殖を同じ細胞系の核培養
で行う。Ｒａｄ５１の同様の蓄積がヒト膵臓癌細胞のＳＣＩＤマウスへの異所性
移植後に誘発される。膵臓癌の悪性表現型に関するこの所見の臨床的意味が、野
生型Ｒａｄ５１も高レベルでヒト膵臓癌にインシトゥで蓄積することから強調さ
れる。機能的分析によると、ｒａｄ５１遺伝子の５'調節性領域が準備の整った
遺伝子由来のＴＡＴＡなしでＧＣに富むエレメントを含み、Ｒａｄ５１の過剰発
現がＤＮＡ二本鎖開裂の誘発後に細胞生存を高める。

【００８７】 材料および方法 細胞培養 ヒト膵臓癌細胞系８１８−４、Ｃｏｌｏ−３５７、ＳＷ−８５０、ＱＵＩＰ−
１、ＢＸＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、ＨＰＡＦ、ＰａｎｃＴＵ−II、ＰＴ４５−
Ｐ１、Ｐａｎｃ８９（Kalthoff, H., et al., Oncogene 8:289-298 (1993)）、
ＵｉＲａｄ５１、ＵｉＬａｃＺを、湿潤インキュベーターに３７℃で５％二酸化
炭素および９５％空気で１０％胎児ウシ血清（PAA, Colbe, Germany) 補充ＤＭ
ＥＭ中に保持した。ハイブリドーマ細胞系１Ｇ８を（Buchhop, S., et al., Hyb
ridoma 15:205-210 (1996)）記載のように成育した。抗体の産生のためにミニＰ
ＥＲＭバイオリアクター（Heraeus, Osterode, Germany) を販売者の指示どおり
使用した。エクジソン同族ムリステロンＡおよびポナステロンＡ、それぞれ（in
vitrogen) を１ｍＭで絶対エタノールに溶解し最終濃度１μＭで用いて、異所性
Ｒａｄ５１（ＵｉＲａｄ５１）またはβ−ガラクトシダーゼ（ＵｉＬａｃＺ）の
発現を誘発した。非誘発対照に同量のエタノールを補充した。ＵＶ処理のために
、培地を除去し、細胞に１秒間、３１２ｎｍバルブを備えたＴＦＬ−２０Ｍトラ
ンスイルミネーター（Biometra, Goettingen, Germany) で照射した。生物学的
目盛り検定によると、これは約２７０Ｊ／ｍ^２に相当する。細胞を新鮮な培地で
成育せしめ、非照射対照とした。カリケラミシンγ_１（Wyeth-Ayers reseach, P
earl River, NY, USA) を絶対エタノールに１００μＭで溶かし、−８０℃で保
存した。化学的感受性を調べるために、細胞をカリケラミシンγ_１の増加する濃
度で１６時間処理し、３７℃の標準状態で７２時間で回復せしめ、クリスタルバ
イオレットで染色した。

【００８８】 抗体 ハイブリドーマ細胞系１Ｇ８を前に記載されているように（Buchhop, S., et
al., Hybridoma 15:205-210 (1996)）単離した。モノクローナル抗体１Ｇ８はＲ
ａｄ５１タンパク質を特異的に認識する。J. Gerdes 教授（Forschungszentrum
Borstel, Germany）から好意的に増殖マーカータンパク質ＫＩ−６７に対するモ
ノクローナル抗体ＭＩＢ−１の提供を受けた。モノクローナル抗ｐ５３は Diano
va, Hamburg, Germany の提供による。Roche Biochemicals, Mannheim, Germany
がポリクローナルヒツジ抗ｐ５３血清を提供した。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ (Amersham Buchler KG, Braunschweig, Germany) およびＨＲＰ結合ロバ抗
ヒツジＩｇＧ (SigmaAldrich Chemie, Steinheim, Germany) を第２抗体として
使用した。

【００８９】 免疫組織化学 免疫組織化学的染色のために、膵臓管状腺腫患者からの４１の外科的切除標本
（３８ホイップル標本および３左膵臓切除）をＷＨＯ (Kloppel, G., et al., H
istological typing of tumours of the exocrine pancreas. Second edition.
WHO International histological classification of tumours, Springer Ver
lag, Berlin ( 1996)) の評価基準にしたがって分類した。患者の平均年齢は５
９.７歳（４５−７５）であった。腫瘍段階はｐＴ２（ｎ＝６）、ｐＴ３（ｎ＝
２９）、ｐＴ４（ｎ＝６）であった。組織学的に、６例が等級１、２４例が等級
２、１１例が等級３であった。標本を中性緩衝ホルマリン（４％）で固定し、パ
ラフィン中に固床化した。連続する５ｐｍ厚の切片をスライドガラス上に置き、
キシレンで脱ワックスし、アルコールに通し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗った
。抗原の繰り返し処理として切片をクエン酸緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７.２）に浸し、加圧クッカー中で圧をかけて３分間煮沸した。この
処理につづいて、内因性ペルオキシダーゼ活性を、０.３％過酸化水素ＰＢＳ中
での１０分間インキュベーションによりブロックした。切片を種々の抗体ととも
に１時間室温で湿潤箱中でインキュベートした。ＰＢＳで洗った後、ビオチン化
抗マウス抗体（Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA) を３０分間室温
で加えた。ＰＢＳで洗った後、切片をＡＢＣコンプレックス（Vector Laborator
ies Inc.) とともにインキュベートし、次いでペルオキシダーゼの基質としてＤ
ＡＢ（ジアミノベンジディン４塩酸、Vector Laboratories Inc.）を用いて染色
した。対染色に Mayers ヘマルム (Merck, Darmstasdt, Germany)を使用した。

【００９０】 ウエステンブロット法 培養細胞を氷冷ＰＢＳで洗った。ついで、細胞タンパク質をＳＤＳ分解緩衝液
(25mM Tris−HCl (pH 6.5)、1% SDS、5% β−メルカプトエタノール、0.1% ブ
ロモフェノール青、5% グリセロール) 中に抽出した。音波破壊および煮沸の後
に、等しい量の全タンパク質（ＢＣＡタンパクアッセイにより測定、Pierce, Ro
ckford, USA) を１１.５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに入れた。ＰＶＤＦ膜
(Biorad, Munich, Germany) への移行後に、関連タンパク質の検出を上記の抗
体で行った。超シグナル基質系 (Pierce, Rockford, USA) を化学ルミネッセン
ス検出に用いた。

【００９１】 ＮＩＲＣアッセイ 非同位性ＲＮＡＳＥ解裂アッセイを、誤対合検出キットII (Ambion, Texas, U
SA) の製造者指針にしたがって行った。簡単にいうと、全細胞ＲＮＡの培養細胞
の製造に Quiagen (Hilden, Germany) 提供の RNeasy キットを使用した。１チ
ューブ反応 (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 中での逆転写およびＰ
ＣＲを、下記のＰＣＲ反応用の「外プライマー対」を用いて行った。ついでこの
反応のアリコートを表のプライマーを用いて整列ＰＣＲにかけた。このプライマ
ーはＳＰ６またはＴ７プロモーター配列を含む。ＰＣＲ産物をインビトロでＴ７
またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで転写し、それぞれセンスおよびアンチセンス
ＲＮＡプローブを作った。センスＲＮＡ産物を野生型対照からのアンチセンスと
ハイブリダイズした。また、その逆を行った。ハイブリダイズしたサンプルを、
キットによるＲＮアーゼとの３回反応で処理した。解裂産物の分析を臭化エチジ
ウム染色アガロースゲル（２％）で、フッ素−Ｓ造影系 (Biorad, Munich, Germ
any) を使用して行った。

【００９２】 Ｒａｄ５１変異分析のために、下記のプライマーをＲａｄ５１コード領域のヌ
クレオチド１から１０２０の増幅に使用した。 外 5'−プライマー : ATGGCAATGCAGATGCAGCTTGAAGC、 3'−プライマー : TCAAGTCTTTGGCATCTCCCACTCC； 整列ＰＣＲについて： 5'−プライマー：GATAATACGACTCACTATAGGGAAGAAGAAAGCTTTG、3'−プライマー：T
CATTTAGGTGACACTATAGGAAGACAGGGAGAGTC、

【００９３】 −２３２から１２８９の領域を増幅するために、下記のプライマーを使用した。 外 5'−プライマー：CCGCGCGCAGCGGCCAGAGACCG、 3'−プライマー：GTCAAAGATACTTCATACCCCTCC； ヌクレオチドの−１９０から７０３の整列ＰＣＲについて： 5'−プライマー：GATAATACGACTCACTATAGGGCGCTTCCCGAGGC、 3'−プライマー：TCATTTAGGTGACACTATAGGACCCGAGTAGTCTGTTC、

【００９４】 ３４６から１１２３の整列ＰＣＲについて： 5'−プライマー：GATAATACGACTCACTATAGGGAATTGAGACTGGAT、 3'−プライマー：TCATTTAGGTGACACTATAGGAATAAACATTTTAGATC、 Ｒａｄ５１配列に下線を引いてある。

【００９５】 ゲノムｒａｄ５１クローンの単離および特性解明 ヒトゲノムＰＡＣライブラリィ (RPCI1,35 Human PAC Library No.: 704, Pie
ter de Jong, Rosewell Park Cancer Institute) はドイツヒトゲノム計画の資
源センター／主要データーベース （Berlin, Germany）から好意的に提供を受け
た。このライブラリィのスクリーニングをヒトゲノムＤＮＡから増幅されたラン
ダム標識ＰＣＲ断片でｒａｄ５１特異的プライマー 5'−ATGGCAATGCAGATGCAGCTT
GAAGC−3' および 5'−TGGCTTCACTAATTCCCTTA−3' を用いて行った。ＰＣＡクロ
ーン RPCIP704I24767 を同定したところｒａｄ５１配列を含有していた。単離し
たクローンを制限酵素 PstI、HindIII、EcoRI/EcoRVで断片化し、pBluescript S
K ベクター (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) 中にサブクローンした。標
的遺伝子断片について陽性のクローンをハイボンド−Ｃ ニトロセルロース膜 (A
mersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) で取りだし、ヒトｒａｄ５１
ｃＤＮＡ配列 (DDBI accession no. D14134; Yoshimura, Y., et al., Nucl. Ac
ids. Res. 21:1665 (1993)) に及ぶオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンにより同定した。陽性サブクローンからのＤＮＡを、Qiagen DNA 精製キッ
ト (Qiagen, Hilden, Germany) で抽出し、MWG 自動シクエンサー (LI−COR LI
−4200 system, MWG AG Biotech, Munich, Germany) で配列決定した。推測プロ
モーターおよびエキソンの可能性ある転写因子結合部位上流の分析にプログラム
・プロモーター・スキャンII (Prestridge, 1995) を用いた。イントロン−エキ
ソン接合の測定を神経ネットワークによるスプライス部位推定 (NNSPLICE0.9; R
eese, M.G., et al., J. Comp. Biol. 4:311-323 (1997)) により行った。

【００９６】 結果 球状体として培養されたヒト膵臓癌細胞系におけるＲａｄ５１タンパク質の蓄積 細胞周期の進行においてＲａｄ５１タンパク質レベルの小さい変異のみが起き
る (Yamamoto, A., et al., Mol. Gene. Genet. 251:1-12 (1996); Chen, F., e
t al., Mutat. Res. 384:205-211 (1997))。 ヒト線維芽細胞の不死化はＲａｄ
５１ｍＲＮＡ発現レベルの３ないし４倍の増加を伴う (Xia, S.J., et al., Mo
l. Cell Biol. 17:7151-7158 (1997))。 しかし、単一の腫瘍実体から誘導され
た種々のヒト腫瘍細胞系におけるＲａｄ５１タンパク質レベルについては記載さ
れていない。したがって、まず、よく特徴解明されているヒト膵臓癌細胞系のパ
ネル (818-4, Colo-357, SW-850, QCP-1, BXPC-3, Capan-1, HPAF, Panc-TU-I,
Panc TU-II, PT 45-P1, Panc 89; (Kalthoff, H., et al., Oncogene 8:289-298
(1993)) のＲａｄ５１タンパク質量を免疫細胞化学法およびウエステンブロッ
ト法で比較した。図１に、８１８−４およびＢＸＰＣ３細胞におけるＲａｄ５１
タンパク質およびｐ５３の染色強度およびサブ細胞位置付けを比較して示す。両
細胞系でＲａｄ５１ポリペプチドの核染色は８１８−４細胞におけるｐ５３のシ
グナル強度に類似して弱かった。一方、過剰発現変異ｐ５３について非常に強い
シグナルをＢＸＰＣ−３で認めた。低倍率の検査では、これら細胞系の個々の細
胞間に両ポリペプチドの染色強度に僅かな相違しか認めなかった。染色強度の相
違がＲａｄ５１およびｐ５３の定量的相違を反映していることを確かめるために
、タンパク質レベルをウエステンブロット法で調べた（図１Ｂ）。この試験にお
いて、５０μｇの全タンパク質抽出物を各レーンに用いた。全タンパク質抽出物
のＢＸＰＣ−３における変異ｐ５３量を各レーンに用いた。ＢＸＰＣ−３におけ
る変異ｐ５３量が８１８−４におけるｐ５３に比して少なくとも１０倍の率で増
加する。Ｒａｄ５１では、このような２細胞系における相違がなかった。免疫細
胞化学法により観測された染色強度は細胞におけるＲａｄ５１およびｐ５３タン
パク質の量と相関する。さらに、試験したすべての細胞系間でＲａｄ５１に大き
い相違を認めなかった（データを示さず)。これらの結果からすると、膵臓癌細
胞系は非常に低いレベルのＲａｄ５１タンパク質を表し、免疫細胞化学法でほと
んど検出できず、これらの細胞における野生型ｐ５３に匹敵しない。

【００９７】 ３Ｄ増殖がＲａｄ５１の発現に影響を及ぼすがどうかを調べるために、８１８
−４およびＰａｎｃＴＵ１細胞を球状として成育せしめた。図２Ａは、Ｒａｄ５
１が腫瘍細胞核のサブ集団において単層培養基に比して非常に高いレベルで蓄積
することを示す。Ｒａｄ５１を過剰発現する細胞の割合に関する細胞系間の相違
は、ＰａｎｃＴＵ−１について約５−１０％、８１８−４について３０％以上で
ある。各々の細胞系におけるＲａｄ５１過剰発現とｐ５３の遺伝子状態との間に
明らかな相関性はなかった（データは示さず)。単層および球状として成育した
ＰａｎｃＴＵ−１および８１８−４におけるＲａｄ５１についてのウエステンブ
ロット法は免疫細胞化学のデータを確認した（図２Ｂ）。Ｒａｄ５１に反し、ｐ
５３の発現は細胞培養条件による影響を受けない（データは示さず)。ウエステ
ンブロット法による定量では、単層と球状の間にＲａｄ５１について約５倍の差
異がある。Ｒａｄ５１が８１８−４細胞の２０％でしか過剰発現されないことか
ら、過剰発現球状細胞におけるＲａｄ５１レベルが単層に比して２５倍増加する
といえる。

【００９８】 ＳＣＩＤマウスへの正常位移植後のＰａｎｃＴＵ−Ｉ細胞におけるＲａｄ５１の
蓄積 これらの結果の生物学的意味をさらに明らかにし、球状細胞におけるＲａｄ５
１の蓄積がインビボ条件でも生じるかどうかを調べるために、Ｒａｄ５１発現を
正常位外来移植モデルで調べた。１０^６ＰａｎｃＴＵ−ＩをＳＣＩＤマウスの膵
臓に接種した。接種２１日後にマウスを殺した。ＰａｎｃＴＵ−Ｉ腫瘍を固定し
、パラフィンで固床化し、免疫組織化学法のために準備した。パラフィン固床化
が試験結果に影響するのを除外するために、単層として成育したＰａｎｃＴＵ−
Ｉ細胞を砕いた後に遠心分離で採取し、固定化、パラフィン固床化、組織化学的
分析に関して同じ技術条件で行った。高レベルのＲａｄ５１タンパク質発現をＰ
ａｎｃＴＵ−Ｉ腫瘍でのみ検出したが（図３、パネルＢ）、単層として成育した
細胞では検出しなかった（図３、パネルＡ）。これらのデータによると、Ｒａｄ
５１の高レベル発現はインビトロおよびインビボでの３次元ネットワークとして
成育した腫瘍細胞の独特の特性を表す。

【００９９】 ヒト膵臓腺腫における野生型Ｒａｄ５１タンパク質の過剰発現 これらの結果をさらに確認するために、Ｒａｄ５１発現をヒト膵臓腺腫のパラ
フィン固床化標本で調べた。図３のパネルＣに示すように、Ｒａｄ５１タンパク
質が腫瘍細胞核おいて高レベルで蓄積する。Ｒａｄ５１の過剰発現は腫瘍細胞に
限定され、周りの組織の核では認められなかった。同じ染色条件で、Ｋｉ６７の
ような核抗原およびｐ５３も腫瘍細胞集団中に容易に検出できた。腫瘍標本にお
けるＲａｄ５１とｐ５３の発現間に明らかな相関があった（データは示さず)。
強度の染色はＲａｄ５１に高い特異性がある。抗体が認識するエピトープに対応
するペプチド (Buchhop, S., et al., Hybridoma. 15:205-210 (1996)) ととも
に抗Ｒａｄ５１モノクローナル１Ｇ８を前インキュベートすると、染色反応を完
全にブロックするからである（図４）。Ｒａｄ５１陽性腫瘍細胞の割合は種々の
標本間で５％からほぼ５０％であった。５％以上の腫瘍細胞核が球状または外来
移植体と同じ強さに染色されたときに、腫瘍標本を陽性とした。この判定基準に
よると、４１膵臓腺腫標本のうち２７（６６％）がＲａｄ５１タンパク質を高レ
ベルで発現した。

【０１００】 Ｒａｄ５１タンパク質の過剰発現はＲａｄ５１コード配列における変異の結果で
はない この試験で用いた１３膵臓癌細胞系および１２腫瘍標本をＲａｄ５１コード配
列における変異について調べた。高度の感受性で特異的な非同位体ＲＮアーゼ解
裂アッセイ（ＮＩＲＣＡ）を変異スクリーニングに使用した。ＮＩＲＣＡは、野
生型と変異型ｍＲＮＡ間の交差ハイブリダイゼーション後に誘導された二本鎖Ｒ
ＮＡ分子中の単一誤対合をＲＮＡＳＥ解裂により検出する。ｍＲＮＡはＰＴ−Ｐ
ＣＲにより増幅されたｃＤＮＡのインビトロ転写によりつくられる。ｐ５３コー
ド配列における変異のスクリーニングについての市販アッセイ系を用いて、既知
の点変異 (Kalthoff, H., et al., Oncogene 8:289-298 (1993)) を、この試験
で使用するヒト膵臓癌細胞系において確実に検出した。Ｒａｄ５１変異検出につ
いてのアッセイの機能性を確認するために、インビトロ変異形成によりつくられ
たＲａｄ５１点変異体に相当するｍＲＮＡを野生型Ｒａｄ５１転写体とハイブリ
ダイズさせた。試験結果を図５に示す。ハイブリダイズされたセンスおよびアン
チセンス野生型Ｒａｄ５１ｍＲＮＡのＲＮＡＳＥ消化後に減成は起きなかった（
陰性対照）。他方、野生型と変異型のＲａｄ５１ｍＲＮＡ間の交差ハイブリダイ
ゼーションでＲＮＡＳＥ消化後の明白で特異的な解裂パターンが生じた（陽性対
照）。これらの対照からして、このアッセイをＲａｄ５１コード配列における変
異の特異的検出に適用できる。１３の異なる膵臓癌細胞系および１２の膵臓腺腫
標本をＮＩＲＣＡ使用でＲａｄ５１変異についてスクリーンしたが、変異を認め
なかった。このデータに基づくと、ヒト膵臓腫瘍細胞系および腫瘍標本の球状物
における過剰発現Ｒａｄ５１タンパク質は野生型Ｒａｄ５１タンパク質を表すと
いえる。

【０１０１】 Ｒａｄ５１の過剰発現はＤＮＡ二本鎖開裂に対する耐性を付与する 細胞中のＲａｄ５１量の調節についての生物学的結果を容易に監視できるモデ
ルシステムをつくるために、ヒト骨肉腫細胞系Ｕ−２ＯＳを親細胞系として使用
し、Ｒａｄ５１を誘発的に発現するクローンＵｉＲａｄ５１を確立した。対照と
して、クローンＵｉＲａｄ５１をつくる誘発性大腸菌β−ガラクトシダーゼを開
発した。これらの細胞をムリステロンＡまたはポナステロンＡで処理すると、昆
虫ステロイドホルモン、エクジソンの同族体が夫々の異所性タンパク質の発現を
誘発する (Miska, et al.、投稿中）。すべての細胞クローンが野生型ｐ５３を
発現し、このものは蓄積して活性となり、ＤＮＡ損傷に応答して細胞周期の停止
を誘発する。このシステムを使用して、Ｒａｄ５１過剰発現とＤＮＡ二本鎖開裂
に対する細胞応答との関連を解明した。Ｒａｄ５１の過剰発現がｐ５３レベルに
影響するかどうかを調べるために、ＵｉＲａｄ５１およびＵｉＬａｃＺについて
誘発細胞と非誘発細胞とを比較した。ウエステンブロット法での分析によると、
Ｒａｄ５１の誘発およびβ−ガラクトシダーゼはそれぞれ、ｐ５３レベルに対す
る作用を有しなかった（図６Ａ）。ＵｉＲａｄ５１およびＵｉＬａｃＺの両者と
もＵＶ照射に応答してその細胞周期を停止するが、細胞死はなかった（データは
示さず）。

【０１０２】 Ｒａｄ５１の過剰発現はＵＶ照射によるＤＮＡ損傷に応答してｐ５３の蓄積を
妨害しない（図６Ａ）。理論に縛られるわけでないが、Ｒａｄ５１の過剰発現が
ＵＶ照射に対する耐性を与えないのは、ＵＶ誘発のＤＮＡ損傷が切除修復により
明らかに矯正されることに（データは示さず）よると思える。これは意外なこと
でない。一方、相同性組換えはＤＮＡ二本鎖開裂（ＤＳＢ）の修復メカニスムの
ひとつである。Ｒａｄ５１の高レベル発現が細胞の生存のために好適がどうかを
調べるために、なんらの調節物なしにＤＳＢを誘発するカリケアミシンγ１を用
いた。ＵｉＲａｄ５１細胞を１６時間、種々の濃度の薬物で処理し、７２時間の
回収後に細胞を固定した。非誘発と誘発（カリケアミシンγ１処理のない）の対
照の細胞数の相違は、Ｒａｄ５１の過剰発現がＧ_１およびＧ_２／Ｍにおける一時
的な細胞周期の停止を誘発すること (Miska, et al.、投稿中）に起因し得る。
大きい細胞死がカリケアミシンγ１の濃度増加にしたがっておきる（図６Ｂ）。
しかし、Ｒａｄ５１の過剰発現は、元のレベルでの発現細胞に比して生存割合を
有意に強化する。

【０１０３】 ヒトｒａｄ５１のプロモーター領域は保管されている遺伝子の特性を示す 最近の証拠によると、Ｒａｄ５１の発現は転写レベルで調節される (Xia, et
al., Mol. Cell Biol., 17:7151-7158 (1997); Ohnishi, et al., Biochem. Bi
ophys. Res. Commun. 245:319-324 (1998)) 。このことからして、ヒトｒａｄ５
１遺伝子の５−調節性領域を調べるにいたった。この遺伝子の５'−領域の８.１
ｋｂＤＮＡ断片の配列決定を行なった (GenBank accession number: AF203691)
。５'−ＵＴＲが第１エキソンを含み、３.３ｋｂヌクレオチド配列が第１イント
ロンを含む。翻訳開始コドンは第２エキソンの開始直近に位置する。推定調節性
領域はＡＴＧの５.４ｋｂ上流にある。この領域のヌクレオチド配列の分析は、
ＲＮＡポリメラーゼII仲介転写に関与することが知られている共通配列を提示す
る。ＡＰ−２、ＳｐＩ、Ｅｓｔ−１、ｃ−Ｍｙｃについての結合モチーフを同定
した。ＴＡＴＡ様またはイニシエーター・エレメント配列は認めなかった（図７
）。このデータは、ヒトｒａｄ５１遺伝子がＴＡＴＡのないＧＣに富む保管遺伝
子ファミリーに属することを示す。

【０１０４】 膵臓腺腫は化学物および放射耐性の腫瘍の典型と考えられている。われわれの
研究では、試験したすべての膵臓癌細胞系でのＲａｄ５１の弱い発現のみを、細
胞が単層として成長したときに、認めた。このデータは、単層細胞系におけるＲ
ａｄ５１発現についての以前の発表 (Yamamoto et al., Oral. Oncol. 34:524-5
28 (1996); Chen et al., Mutat. Res. 384:205-211b (1997); Xia et al., Mo
l. Cell Biol. 17:7151-7158 (1997)) を確認する。腫瘍細胞をＳＣＩＤマウス
において球状物または外移植体として成長さすと、異なる結果となる。この条件
では、Ｒａｄ５１タンパク質は細胞のサブ集団の核に高レベルで蓄積する。さら
に、ヒト膵臓腺腫の標本における腫瘍もＲａｄ５１過剰発現を示す。コード配列
においてなんらの変異も検出しなかったので、過剰発現のタンパク質が野生型Ｒ
ａｄ５１を表示していると断言できる。要約すると、われわれのデータはＲａｄ
５１に、ヒト癌において過剰発現されたＤＮＡ修復関連遺伝子をもたらす。さら
に、球状物または外移植体のような３Ｄ系はヒト膵臓癌におけるＲａｄ５１の発
現状態を確実に反映している。

【０１０５】 球状物のウエステンブロット法分析によると、単層培養細胞系に比して約５倍
増加していた。細胞の約２０％のみがＲａｄ５１を過剰発現することを考慮する
と、このサブ集団でのレベルは少なくとも２５の係数で上昇していることになる
。

【０１０６】 癌細胞は野生型よりも変異型のｐ５３を高レベルで顕著に発現するが、Ｒａｄ
５１タンパク質の過剰発現はコード領域での変化に関係しない。ｒａｄ５１発現
の上方調節は主要なヒト線維芽細胞の不死化での転写レベルについて報告されて
いる (Xia et al., Mol. Cell Biol. 17:7151-7158 (1997)。５−調節性領域に
ついてのわれわれの分析からすると、ｒａｄ５１遺伝子は、保管遺伝子からの既
知のＴＡＴＡなしＧＣに富むプロモーターを含有するようである。球状物培養の
内部細胞層に共通の酸素不足などの栄養欠失はＲａｄ５１過剰発現を開始すると
思えない（データは示さず）。

【０１０７】 実施例２：乳癌はＲａｄ５１の過剰発現を伴う 哺乳類の侵襲性管癌腫の腫瘍標本における野生型Ｒａｄ５１タンパク質の過剰
発現について記載する。百以上の腫瘍標本の統計学的分析によると、Ｒａｄ５１
過剰発現は腫瘍の等級に有意に相関する。このデータは、哺乳類の侵襲性管癌腫
の診断のためのマーカーとしてＲａｄ５１過剰発現を定性化する。分化していな
い腫瘍におけるＢＲＣＡ１タンパク質の下方調節に加えて、Ｒａｄ５１の過剰発
現が散在性乳癌の病因に関与していることを示す。

【０１０８】 患者、材料、方法 患者 試験の実施に、散在性侵襲性管乳癌腫がある１０７人の女性患者（平均年齢：
５８才）からのパラフィン固床化腫瘍標本を使用した。腫瘍の大きさは平均２６
ｍｍ。ＴＮＭ分類で３６例がカテゴリーＴ１、４４例がＴ２、６例がＴ３、１９
例がＴ４であった。４８例で腋窩リンパ結節転移を検出しなかったが、４９例が
結節陽性であった。２患者のＴ分類および１０患者の結節状態は不明であった。
すべての腫瘍標本を１人の病理学者（Ｓ．Ｋ）が Elston and Ellis 等級つけ判
定基準 (Elston, C.W. and Ellis, I.O., Histopathology 19:403-410 (1991))
にしたがって再検した。癌腫の２８がＧ１、４９がＧ２、３０がＧ３とされた。
ホルモン受容体状態を調べるために、各パラフィン固床化腫瘍サンプルの連続切
片の免疫染色にエストロゲン受容体（クローン１Ｄ５）およびプロゲステロン受
容体（クローン１Ａ６：DAKO, Hamburg, Germany) に対するモノクローナル抗体
を使用した。０から１２の免疫反応スコアーを Remmele and Stegner (Remmele,
W. and Stegner, H.E., Pathologe 8:138-140 (1987)) にしたがい計算した。

【０１０９】 抗体 パラフィン固床化組織においてＲａｄ５１タンパク質を特異的に認識するマウ
スのモノクローナル抗体１Ｇ８を、以前の報告 (Buchhop, S., et al., Hybrido
ma 15:205-210 (1996); Maacke et al., 投稿中)) のように単離した。増殖マー
カーＫｉ６７抗原に対するモノクローナル抗体ＭＩＢ−１は J. Gerdes 教授 (F
orschungszentrum Borstel, Germany) から好意的に提供を受けた。モノクロー
ナル抗ｐ５３抗体ＤＯ−１は Dianova (Hamburg, Germany) から、ＢＲＣＡ１に
対するモノクローナル抗体ＡＢ−１(MS110 (Wilson, C.A., et al., Nat. Genet
. 21:236-240 (1999)) は Calbiochem (Schwalbach, Germany) から購入した。

【０１１０】 免疫組織化学 組織切片を中性緩衝ホルマリン（４％）で固定し、パラフィン中に固床化した
。連続する４μｍ厚の切片をキシレンで脱ワックスし、アルコールを通し、リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗った。抗原の繰り返し処理の改善のために、切片をクエ
ン酸緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.２）に浸し、加圧クッカ
ー中で圧をかけて３分間煮沸した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３.５％過
酸化水素ＰＢＳ中での５分間インキュベーションによりブロックした。細胞を T
riton-X 100 で５分間透過した後、標本をウマ血清中で、ついでアビジンおよび
ビオチン（Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA) でブロックした。切
片を種々の抗体とともに１時間室温で湿潤室でインキュベートした。ＰＢＳで洗
った後、ビオチン化抗マウス抗体（Vector Laboratories Inc., Burlingame, US
A)を３０分間室温で加えた。切片をＡＢＣコンプレックス（Vector Laboratorie
s Inc.) とともにインキュベートし、次いでペルオキシダーゼの基質としてＤＡ
Ｂ（ジアミノベンジディン４塩酸、Vector Laboratories Inc.）を用いて染色し
た。対染色に Mayers ヘマルム (Merck, Darmstasdt, Germany)を使用した。Ｂ
ＲＣＡ１についてこの染色プロトコールを Wilson et al. (Wilson, C.A., et a
l., Nat. Genet. 21:236-240 (1999)) にしたがって改変した。この改変法に使
用する抗原取りだし液を DAKO, (Hamburg, Germany) から購入した。抗体のイン
キュベーションを一夜４℃で行った。

【０１１１】 影像分析 染色された標本を Olympus BX40 顕微鏡 (Olympus Optical CO. GmbH, Hambur
g, Germany) で調べた。影像の数値化に AnalysisPro 2.10.200 ソフトウエアー
(SIS Software GmbH, Muenster, Germany) を用いた。Ｒａｄ５１、ｐ５３、Ｋ
ｉ６７−抗原について、陽性染色細胞インデックス (PCI; 10) を PiClick 影像
分析 (S. Opitz, 未公表) で定量化した。スライド当り１０００の代表的腫瘍を
分析し、独立の２人の観察者がＰＩＣを評価した。

【０１１２】 ＢＲＣＡ１の検査に、Wilson et al. (Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 2
1:236-240 (1999)) によりつくられた評価基準に基づくスコアーシステムを使用
した。最初に最も強い染色の領域を低倍率で調べた。ついで、ＢＲＣＡ１染色強
度の分類に次の評価基準を用いた。(0): ＢＲＣＡ１特異的染色なし (メイヤー
ヘマルム対染色による青色核); (1): １０％以上の腫瘍細胞核が弱いＢＲＣＡ１
染色 (灰色) を表す; (2): １０％以上の褐色腫瘍細胞核を有する明白なＢＲＣ
Ａ１染色 ; (3) : １０％以上の腫瘍細胞核の強い褐色染色。

【０１１３】 統計分析 ＳＰＳＳヴァージョン８ソフトウエアーを統計分析に使用した。Ｒａｄ５１と
生物学的および病理学的評価基準との関連を Spearman's ランク相関係数 (r₃)
で評価した。有意差検定のために異なる群を Kruskal and Wallis によるＨ検定
で全体的に比較した。対の各群における有意差を Bonferroni's 修正の Mann an
d Whitney's Ｕ検定で確認した。

【０１１４】 ＮＩＲＣアッセイ 非同位性ＲＮＡＳＥ解裂アッセイを、誤対合検出キットII (Ambion, Texas, U
SA) の製造者指針にしたがって行った。簡単にいうと、全細胞RNAの培養細胞の
製造に Quiagen (Hilden, Germany) 供給の RNeasy キットを使用した。１チュ
ーブ反応 (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 中での逆転写およびＰＣ
Ｒを、下記のＰＣＲ反応用の「外プライマー対」を用いて行った。ついでこの反
応のアリコートを表のプライマーを用いて整列ＰＣＲにかけた。このプライマー
はＳＰ６またはＴ７プロモーターを含む。ＰＣＲ産物をインビトロでＴ７または
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで転写し、それぞれセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
プローブを作った。センスＲＮＡ産物を野生型対照からのアンチセンスとハイブ
リダイズした。また、その逆を行った。ハイブリダイズしたサンプルを、キット
によるＲＮアーゼとの３回の異なる反応で処理した。解裂産物の分析を臭化エチ
ジウム染色アガロースゲル（２％）で、フッ素−Ｓ造影系 (Biorad, Munich, Ge
rmany) を使用して行った。Ｒａｄ５１変異分析のために、下記のプライマーを
Ｒａｄ５１コード領域４の増幅に使用した（Ｒａｄ５１領域に下線）。

【０１１５】 外プライマー ： 5'−プライマー ： ATGGCAATGCAGATGCAGCTTGAAGC、 3'−プライマー ： TCAAGTCTTTGGCATCTCCCACTCC； 5'−プライマー ： CCGCGCGCAGCGGCCAGAGACCG、 3'―プライマー ： GTCAAAGATACTTCATACCCCTCC；

【０１１６】 整列 PCR について： 5'−プライマー ： GATAATACGACTCACTATAGGGAAGAAGAAAGCTTTG、 3'−プライマー ： TCATTTAGGTGACACTATAGGAAGACAGGGAGAGTC、 5'−プライマー ： GATAATACGACTCACTATAGGGCGCTTCCCGAGGC； 3'−プライマー：TCATTTAGGTGACACTATAGGACCCGAGTAGTCTGTTC； 5'−プライマー：GATAATACGACTCACTATAGGGAATTGAGACTGGAT、 3'−プライマー：TCATTTAGGTGACACTATAGGAATAAACATTTTAGATC。

【０１１７】 結果 ＤＮＡ修復経路において、組換え法が働いて遺伝子の安定性を保持し得るが、
制御されないか増加されると、遺伝子の不安定化および悪性形質転換が生じるこ
とがある。Ｒａｄ５１タンパク質の発現が上皮原の悪性度で変化しているかを調
べるために、哺乳類の侵襲性管状癌腫を免疫組織化学法で分析した。その結果に
よると、Ｒａｄ５１は腫瘍細胞核において（図８）、***形成からとられた正常
の***組織（ｎ＝６）および線維細胞の乳腺症からの組織（ｎ＝１０）（示さず
）に比して過剰発現されている。腫瘍細胞をＲａｄ５１について陽性（暗褐色染
色）または陰性のいずれかに分類できる。このパターンは陽性細胞インデックス
（ＰＣＩ（１０））によるＲａｄ５１発現の分類を可能にする。最初に分析した
侵襲性管状***癌腫標本の小切片において、Ｒａｄ５１のＰＣＩは０％から６８
％の範囲であった。

【０１１８】 確立している腫瘍評価基準との相関を調べるために、Ｒａｄ５１のＰＣＩを侵
襲性管状乳癌の１０７標本のパネルで調べた。下記の表１は、確立している腫瘍
評価基準の標本と比較したＲａｄ５１のＰＣＩについての統計学的分析である。
対応のランク相関係数を図９に示す。Ｒａｄ５１過剰発現と腫瘍等級との間に明
白な相関関係があり、係数 r_s=0.535 (Spearman によるランク相関) は統計的に
有意であった (p<0.001) 。さらに、Ｒａｄ５１のＰＣＩは腫瘍のエストロゲン
受容体状態に逆相関した (r_s−0.352； p<O.001)。Ｒａｄ５１の過剰発現を、２
つの確立されているマーカータンパク質、腫瘍抑制物質ｐ５３および増殖タンパ
ク質Ｋｉ６７抗原の発現とも比較した。Ｒａｄ５１とｐ５３のＰＣＩには有意の
直接相関がなかったが、Ｒａｄ５１とＫｉ６７抗原の発現には高い有意の相関関
係があった (r_s=0.563 ; p<O.001)。図８は、腫瘍の等級についてＲａｄ５１、
ｐ５３、Ｋｉ６７抗原の代表的例を示す。

【０１１９】 上記の乳癌におけるＲａｄ５１発現の変化は、Ｒａｄ５１コード配列における
変異の結果ではない。１４代表的乳癌サンプルのパネルの分析に、材料および方
法で記載した高感度特異的変異検出の非同位体ＲＮＡＳＥ解裂アッセイ（ＮＩＲ
ＣＡ）を用いた。Ｒａｄ５１変異を認めなかった（データは示さず）。要約する
と、ＰＣＩで分類された侵襲性管状乳癌における組換え因子Ｒａｄ５１過剰発現
は、腫瘍等級付けおよびホルモン受容体状態のような臨床腫瘍評価基準と相関す
る。腫瘍でのＲａｄ５１がタンパク質の野生型形態を表すから、過剰発現は腫瘍
細胞における後成変化の結果である。

【０１２０】 最近、後成現象が散在性乳癌におけるＢＲＣＡ１発現の下方制御に関与すると
いわれている (Yoshikawa, K., et al., clin. Canc. Res. 5:1249-1261 (1999)
; Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-240 (1999); Dobrovic, A. and
Simpfendorfer, D., Canc. Res. 57:3347-3350 (1997); Mancini, D.N., et al.
, Oncogene 16:1161-1169 (1998))。したがって、ＢＲＣＡ１発現の検査を乳癌
標本の集成物について、ＡＢ−１(Calbiochem, Schwalbach, Germany)、パラフ
ィン固床組織で最適の結果をもたらすモノクローナル抗ＢＲＣＡ１抗体 (Wilson
, C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-140 (1999)) で行った。Wilsonらと同様
に、われわれは細胞核にのみ限定されたＢＲＣＡ１染色を認めた。時折の追加的
な細胞質染色が分析した９８標本のうち僅か２例であった。Ｒａｄ５１に反して
、ＢＲＣＡ１染色強度における差異は弱い褐色から黒褐色の範囲にあり微妙であ
った。Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-240 (1999) により確立され
ている評価に基づくスコアーシステムを用いてＢＲＣＡ１を検査した。図１０は
、ＢＲＣＡ１についてのこのスコアーシステムの代表的染色パターンを示す。図
８は、腫瘍等級に関するＢＲＣＡ１発現の例を示す。１０８の腫瘍標本の統計的
分析は、Wilson ら(Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-240 (1999)に
より最初に発表されたＢＲＣＡ１発現と腫瘍等級との逆相関を確認する（図９）
。Ｒａｄ５１過剰発現とＢＲＣＡ１の消失とが必ずしも相関しないが（図９）、
データは評価基準と腫瘍の等級付けの相関をはっきりさせる。

【０１２１】 表１ 侵襲性管状乳癌におけるＲａｄ５１の統計学的分析 n：例数；n_c：特定クラスの例数；PCI：陽性染色された細胞インデックス；IR
S：免疫反応スコアー (Remmele and Stegner, 1987)；SII：染色強度インデック
ス；nn：必要でない試験；ns：有意でない；*/**/***：p<0.05/0.01/0.001 (必
要に応じ Bonferroni 修正を採用)；H検定：Kruskal and Wallisによる；U検定
：Mann and Whitneyによる。

【０１２２】

【表１】

【表２】

【０１２３】 腫瘍の発達には、癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における変異の蓄積を伴う
。さらに、癌関連遺伝子は、散在性乳癌におけるＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子につ
いて最近発表されているように (Wilson, C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-2
40 (1999))、後成性メカニズムによっても制御不調となり得る。ＢＲＣＡ１の生
物学的機能は詳細にはわかっていないが、経路を介してのＤＮＡ二本鎖（ＤＳＢ
）修復に関与しているようである (Feunteun, J., Mol. Med. Today 4:263-270
(1998)) 。この経路は相同性組換えに依存する (Hendrickson, E.A., Am. J. Hu
m. Genet. 61:795-800 (1997))。ＢＲＣＡ１タンパク質は、相同性組換えの主要
酵素であるＲａｄ５１との複合体中に見られる (Scully, R., et al., Cell 88:
265-275 (1997))。

【０１２４】 この研究は、腫瘍細胞における野生型Ｒａｄ５１タンパク質の過剰発現と侵襲
性管状乳癌の腫瘍等級付けとの間に統計学的に有意の正の相関を示す。前の報告
の確認において、ＢＲＣＡ１発現は腫瘍の等級付けと逆相関を示した (Wilson,
C.A., et al., Nat. Genet. 21:236-240 (1999))。Ｒａｄ５１のＰＣＩとＢＲＣ
Ａ１スコアーとの間に直接の相関がないようであるが、Ｒａｄ５１の過剰発現が
脱分化の際に増加し、一方ＢＲＣＡ１発現が減少するという結果は、両現象が腫
瘍の進行に利点を付与していることを示す。

【０１２５】 ネズミの胚形成におけるＢＲＣＡ１の消失は、細胞周期の停止またはアポトー
シスとなるｐ５３依存性経路の活性化を引き起こすＤＮＡ損傷の蓄積をもたらす
。ＢＲＣＡ１およびｐ５３に非接合のマウス胚で細胞の生存が増加する (Hakem,
R., et al., Cell 85:1009-1023 (1996); Hakem, R., et al., Nat. Genet. 16
:298-302 (1997); Xu, X., et al., Nat. Genet. 22:37-43 (1999))。われわれ
の考えでは、ＢＲＣＡ１欠損乳癌細胞におけるＤＮＡ損傷の蓄積は、ｐ５３機能
の不活性化のような寛大な事象が生じて損傷細胞の除去を防がなければ、アポト
ーシス経路を誘発する (Crook, T., et al., Lancet 350:638-639 (1997))。ｐ
５３機能の消失はＢＲＣＡ１半接合トランスジェニックマウスにおける乳癌の発
達を促進する (Xu, X., et al., Nat. Genet. 22:37-43 (1999))。このモデル系
において、われわれの考えでは、ＢＲＣＡ１の不活化が腫瘍抑制遺伝子およびオ
ンコジーンを含むすべての遺伝子の変異割合の増加をもたらす。野生型ｐ５３は
この表現型の形成に拮抗作用する。これは、ｐ２１を経る細胞周期の停止または
アポトーシス性細胞死を誘発することによる (Xu, X., et al., Nat. Genet. 22
:37-43 (1999); Sourvinos, G. and Spandidos, D.A., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 245:75-80 (1998))。われわれの考えでは、Ｒａｄ５１の過剰発現も
腫瘍の進行について寛大な事象である。このことがＤＮＡ損傷の保持を助け、損
傷が細胞生存の耐容性レベルでＢＲＣＡ１の下方調節で蓄積し、その阻害がアポ
トーシスに導くからである。このように、ＢＲＣＡ１の下方調節および／または
野生型Ｒａｄ５１の過剰発現として発揮されるタンパク質発現についての後成調
節不調が散在性乳癌の発達に関与する。

【０１２６】 実施例３：Ｒａｄ５１がｐ５３非依存性細胞周期制御経路を誘発する 材料および方法 細胞培養 細胞系ＵｉＲａｄ５１、過剰発現のＲａｄ５１タンパク質およびＵｉＬａｃＺ
、β−ガラクトシダーゼを調製した。簡単にいうと、Ｒａｄ５１ｃＤＮＡ (Stue
rzbecher, H.W., et al., Embo J 15:1992-2002 (1996)) をプラスミドｐＩＮＤ
中へ挿入し、改変 pVgRxR (Invitrogen, de Schelp, the Netherlands, S.M, an
d H.W.S., in preparation) でもって U―2 OS 細胞 (Ponten, J. & Saksela, E
., Int J Cancer 2:434-47 (1967)) 中に CaPO₄ 沈澱法 (Graham, F.L. & Eb, A
.J.v.d., Virology 52:456-67 (1973))で共トランスフェクトした。 G418 (500
μg/ml, Life Technologies, Egenstein, Germany) および Zeocin (250 μg/m
l, Invitrogen) に耐性のクローンを、Ｒａｄ５１過剰発現により広がり試験し
た環のクローニングにより免疫組織化学法で採取した。細胞集団での可能な異質
性を排除するために、元のＵｉＲａｄ５１培養基をサブクローンした。Ｒａｄ５
１誘発に応答する成長遅延が１２サブクローン中７で保持された。ＵｉＲａｄ５
１のサブクローン２についてさらに試験した。ＵｉＲａｄ５１（サブクローン２
）からの細胞系ＵｉＲａｄ５１青の確立を、ｐ５３転写活性化についての大腸菌
β−ガラクトシダーゼレポーター pRGC△FosLacZ (Frebourg, T., et al., Canc
er Res 52:6976-8 (1992)) およびハイドロマイシン耐性を付与するプラスミド
pDSP Hygro; (Pfarr, D.S., et al., Dna 4:461-7 (1985))の安定なトランスフ
ェクトで行った。ＵｉＲａｄ５１青細胞を８０μｇ／ｍｌハイドロマイシンＢ(R
oche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) で選択し、４０μｇ／ｍｌ
で保持した。すべての細胞を、１０％ウシ胎児血清補充のダルベッコ修飾イーグ
ル培地 (DMEM, Life Technologies, Egenstein, Germany)で成育した。エクジソ
ン同族体、ムリステロンＡおよびポナステロンＡそれぞれを絶対エタノールに１
ｍＭ溶かし最終濃度１μＭで用いて、異所性Ｒａｄ５１またはβ−ガラクトシダ
ーゼの発現を誘発した。非誘発対照に同量のエタノールを補充した。ＵＶ処理の
ために、培地を除去し、細胞に１秒間、３１２ｎｍバルブを備えたＴＦＬ−２０
Ｍトランスイルミネーター（Biometra, Goettingen, Germany) で照射した。生
物学的目盛り検定によると、これは約２７０Ｊ／ｍ^２に相当する。細胞を新鮮な
培地で成育せしめ、非照射対照とした。カリケラミシンγ_１（Wyeth-Ayers rese
ach, Pearl River, NY, USA) を絶対エタノールに１００μＭで溶かし、−８０
℃で保存した。エトポシド溶液 (Vepesid J) は Bristol GmbH, Munchen, Germa
ny から購入した。

【０１２７】 細胞周期の分析 細胞を表示の時間トリプシン処理し、遠心分離で集め、洗浄し、ＰＢＳ中に再
懸濁した。細胞懸濁液２００μｌのアリコートを１ｍｌの氷冷７０％エタノール
に移し、使用まで４℃で保存した。固定細胞を遠心分離で集め、ＰＢＳで洗い、
４００μｇ／ｍｌのＤＮアーゼなしＲＮアーゼでの消化を攪拌しながら１時間室
温で行った。ヨウ化プロポジウムを最終濃度１５μｇ／ｍｌで加えた。３０,０
００事象のＦＡＣスキャンについての分析に「細胞フィット」細胞周期分析ソフ
トウエアー (version 2.0; Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) を用いた
。

【０１２８】 ウエステンブロット法 等しい数の細胞をペレットにとり、２ｘＳＤＳサンプル緩衝液 (5% SDS；125m
M Tris/Cl、pH 6,8；10% グリセロール；0,02 % ブロモフェノール青、12,5% 新
たな添加β−メルカプトエタノール)中で分解し、１０分間煮沸し、核酸を 260
U ベンゾナーゼ (Merck, Darmstadt, Germany)で３０分間３７℃で除去した。移
転は基本的に (Towbin, H., et al., Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4 (1979
)) に記載のように行った。Ｒａｄ５１をモノクローナル抗体１Ｇ８(Buchhop et
al., 1996)で、ｐ２１^Waf1 をモノクローナル抗体６Ｂ６(Pharmingen, Hamburg
, Germany)で、ｐ５３をポリクローナルヒツジ抗血清で検出した。ペルオキシダ
ーゼ結合第２抗体は Amersham (Braunschweig, Germany) から供給された。シグ
ナルを化学ルミネセンス基質 Super Signal Ultra (Pierce, Rockford, IL, USA
) で作った。

【０１２９】 β−ガラクトシダーゼ・アッセイ 細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで１度洗い、１００μｌアッセイ緩衝液 (60
mM Na₂ HPO₄；40mM NaH₂PO₄；10mM KCl；lmM MgSO₄) 中に再懸濁し、３回の凍結
−解凍サイクル (−70℃/+37℃) で分解した。全タンパク質含量の測定をビキノ
ン酸 (BCA) 法で供給者 (Pierce) のプロトコールにしたがって行い、タンパク
質濃度をアッセイ緩衝液の追加で等しくした。アリコートを、５０ｍＭのβ−メ
ルカプトエタノール含有のアッセイ緩衝液で稀釈し、調整して６.７ｍｇ／ｍｌ
オルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシダーゼ (ONPG；Sigma, Deisenhofen,
Germany) 含有とし、３７℃で１時間インキュベートした。Na₂CO₃ を最終濃度１
４３ｍＭで加え、反応を停止し、ＯＤの読みを４２０ｎｍで取った。

【０１３０】 ルシフェラーゼ・アッセイ 細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗い、細胞分解緩衝液 (Promega, Mannhei
m, Germany) で分解した。タンパク質含有について細胞分解物の検査に BCA ア
ッセイキット (Pierce) を用いた。このものを分解緩衝液で稀釈し同じタンパク
質レベルの含有とした。ルシフェラーゼ活性を、Steady−Glo（商標）アッセイ
キット (Promega) を Microlumate LB 96P luminom eter ( KG & GB erthold ,
Freiburg, Germany) 中で供給者の説明どおりに用いて、３回測定した。

【０１３１】 結果 Ｒａｄ５１の高レベル発現の応答における成長遅延および細胞周期停止 ヒト骨肉腫細胞系Ｕ−２ＯＳを親細胞系として使用し、Ｒａｄ５１を誘発的に
発現するクローンＵｉＲａｄ５１を作った。対照として、クローンＵｉＬａｃＺ
を産生する誘発性大腸菌β−ガラクトシダーゼを確立した。細胞をムリステロン
ＡまたはポナステロンＡ、昆虫ステロイドホルモンエクジソンの同族体で処理す
ると、各々の異所性タンパク質の発現を誘発する。ラットで得た実験からこれら
の変態昆虫ホルモンの薬理学的作用を除外できる (Masuoka, M., et al., Jap.
J. Pharmac. 20:142-156 (1970))。図１１Ａは、異所性タンパク質のムリステ
ロンＡ処理による誘発を示す。等しい細胞数をこの分析および定量評価に要する
すべての他の試験における各レーンに用いた。示した試験における短い曝露時間
により異所性タンパク質のみが可視となった。Ｒａｄ５１の高レベル発現が細胞
増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、成長曲線を記録した。Ｕ−２ＯＳ
親細胞の増殖はムリステロンＡ処理により影響を受けず、ステロイド処理のみで
この細胞系に影響を与えないが、ＵｉＬａｃＺ対照の成長はわずかに遅延した。
おそらく異所的に発現されたタンパク質の高い合成割合によるのであろう。一方
、Ｒａｄ５１発現の誘発がＵｉＲａｄ５１の重大な成長遅延を起こし、また、非
処理ＵｉＲａｄ５１細胞が２倍の約２４時間で指数的に増殖した。アネキシンＶ
FLUOS (Roche Biochemicals, Mannheim, Germany) およびヨウ化プロピジウム
染色による測定でＲａｄ５１過剰発現に応答した細胞死を認めなかった(データ
は示さず）。

【０１３２】 親細胞系Ｕ２−ＯＳが正常の２倍体線維芽細胞に匹敵するレベルで野生型ｐ５
３を発現することはよく知られている (Diller, L., et al., Mol Cell Biol 1
0:5772-81 (1990))。サイクリン依存性キネーゼの阻害剤、ｐ２１^Waf1のＤＮＡ
損傷に応答してまたは異所性発現に際して、ＵＳ−ＯＳ細胞がＧ_１およびＧ_２／
Ｍで停止する (van Oijen et al., 1998)。新たに確立した細胞クローンＵｉＬ
ａｃＺおよびＵｉＲａｄ５１が遺伝子毒性ストレスに細胞周期の停止をもって応
答するかを調べるために、細胞をエトポシドで処理するか、Ｗ照射した。処理５
６時間後の細胞周期の分析によると、両細胞クローンはＧ_１およびＧ_２／Ｍで細
胞周期を停止した（図１１Ｂ）。ＤＮＡ二本鎖開裂（ＤＳＢ）誘発剤カリケアミ
シンγ１での処理はＧ_２／Ｍでのみでの細胞周期の停止をもたらし、細胞は血清
欠損後にＧ_１でのみ停止する (データは示さず）。これらの制御試験によると、
細胞周期制御メカニズムはこの試験で使用したすべての細胞クローンで不傷性の
ようである。Ｒａｄ５１過剰発現の２６時間以内にＳ期のＵｉＲａｄ５１細胞の
数が５３.８％から１８.３％に下がり、５６時間でその最小のわずか１３％とな
る（図１１Ｃ）。非誘発対照において、５５.１％、５１.７％、４０.５％の細
胞をそれぞれの時点でＳ期に認めた (データは示さず）。Ｒａｄ５１誘発の２６
時間内で、Ｇ_２／Ｍ細胞のフラクションが１６.４％から４６.０％に増加し、一
方、非誘発対照では１６.９％から１３.９％になった。一方、Ｇ_１の細胞フラク
ションは誘発細胞 (29.8%, 35.1%, 46.7%, 0h, 26h, 56h) において、非誘発対
照 (27.4%, 34,3%, 36,4%) に比してわずかに増加したのみであった。非誘発Ｕ
ｉＲａｄ５１およびＵｉＬａｃＺについて、Ｇ_１細胞の増加は長い培養に際し細
胞密度に依存する。しかし、このことは誘発ＵｉＲａｄ５１細胞には当てはまら
ない。この細胞がもはや増殖しないからである。したがって結論として、Ｒａｄ
５１の高レベル発現はＧ_１およびＧ_２／Ｍ期で細胞増殖の停止を誘発する。Ｕｉ
Ｒａｄ５１細胞を２４時間誘発せしめ、ついでムリステロンＡの不存在でさらに
５０時間培養すると、Ｒａｄ５１レベルが処理中止１６時間以内に正常となるが
、細胞周期の停止はなお継続した (データは示さず）。これは、細胞周期の停止
が一旦おきると、高レベルのＲａｄ５１は少なくとも続く５０時間で細胞増殖を
防ぐために必要でないことを示す。

【０１３３】 Ｒａｄ５１はｐ２１^Warfを waf-1 プロモーターの活性化によりｐ５３非依存的
に誘発する サイクリン依存性キネーゼの阻害剤、ｐ２１^Waf1 は細胞周期の停止を仲介す
る (el Deiry, W.S., et al., Cell 75:817-25 (1993))。ｐ２１^Waf1 の過剰発
現は、ＵｉＲａｄ５１およびＵｉＬａｃＺの作成に用いた系であるＵ２−ＯＳ細
胞においてＧ_１およびＧ_２／Ｍ停止を起こすのに十分である (van Oijen, M., e
t al., Am J. Clin Pathol 110:24-31 (1998))。ｐ２１^Waf1 がＲａｄ５１依存
性細胞周期停止に関与しているかどうかを調べるために、ｐ２１^Waf1 タンパク
質含量をウエステンブロット法で測定した。正常な状態で、ＵｉＲａｄ５１細胞
は、ＵＶ照射で増加する（図１２Ａ、レーン２）低レベルのｐ２１^Waf1 を含有
する（図１２Ａ、レーン１）。ｐ２１^Waf1 タンパク質の高レベルまでの蓄積が
異所性Ｒａｄ５１の発現に応答して４８時間で認めた（図１２Ａ、レーン３）。
異所性Ｒａｄ５１発現および追加のＵＶ照射の両方を用いたときに、ｐ２１^Waf1 のさらなる増加がなかった（図１２Ａ、レーン２）。ＵｉＬａｃＺ対照細胞に
おいてｐ２１^Waf1 発現レベルに対するムリステロンＡ処理の影響はなく、ＵＶ
照射はｐ２１^Waf1 誘発をもたらした (データは示さず）。したがって、Ｒａｄ
５１の過剰発現は、ｐ２１^Waf1 の誘発に相関する細胞周期の停止を誘発するの
に十分である。

【０１３４】 waf-1 遺伝子が転写レベルで活性化されるので (el Deiry, W.S., et al., Ce
ll 75:817-25 (1995))、レポーター・プラスミド WWP−Luc (el Deiry, W.S., e
t al., Cell 75:817-25 (1993)) を用いて、指数的に発現されたＲａｄ５１に対
する応答について waf-1 プロモーターを調べた。この構築体は waf-1 プロモー
ターの末端２.４ｋｂ部分の制御下でホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を有する。
タンパク質データに適合して、ＵｉＲａｄ５１におけるポナステロンＡ処理に対
するルシフェラーゼ活性が増加したが、ＵｉＬａｃＺ細胞では増加しなかった（
図１２Ｂ）。追加の対照はｐＧＬ３ (Promega, Mannheim, Germany) での両細胞
系のトランスフェクトを含む。このベクターを、プロモーターなしのルシフェラ
ーゼ遺伝子を提供するＷＷＷＰ−Ｌｕｃの構築に用いた (データは示さず）。ト
ランスフェクト効率についての対照は必要でない。細胞が１バッチでトランスフ
ェクトされるからである。半分をポナステロンＡで誘発し、残りをエタノールで
偽誘発した。さらに、下記するように、適応ＵｉＲａｄ５１細胞においてＷＷＷ
Ｐ−ＬｕｃはＲａｄ５１過剰発現に応答しない（図１３Ｃ）。このデータによる
と、Ｒａｄ５１の過剰発現は waf-1 プロモーターを特異的に活性化し、Ｒａｄ
５１応答エレメントがレポーター構築体に用いられた２.４ｋｂ領域内に位置す
る。

【０１３５】 waf-1 プロモーターの活性化を起こす主要な調節物質の１つはｐ５３であり、
ｐ５３依存性細胞周期の停止がにｐ２１^Waf1 より少なくとも部分的に仲介され
る (el Deiry, W.S., et al., Cell 75:817-25 (1993))。Ｒａｄ５１がｐ２１^{Wa f1} を誘発するのにｐ５３のトランスアクチベーター活性を必要とするかどうか
を調べるために、細胞系ＵｉＲａｄ５１青をＵｉＲａｄ５１から、高度にｐ５３
特異的レポーター pRGCΔfos-LacZ (Frebourg, T., et al., Cancer Res 52:697
6-8 (1992)) の安定な組込みにより作った。すなわち、β−ガラクトシダーゼに
よる基質解裂を、この細胞クローンにおけるｐ５３トランスアクチベーター活性
の直接的測定に使用できる。ＵｉＲａｄ５１青におけるムリステロンＡ依存性Ｒ
ａｄ５１過剰発現をウエステンブロット法で確かめ、Ｒａｄ５１依存性細胞周期
の停止があった (データは示さず）。予想されるように、ＵＶ照射ＵｉＲａｄ５
１青細胞は、非照射対照に比して上昇したレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を
示し、この条件でｐ５３がトランスアクチベーターとして働くようになることを
意味する（図１２Ｃ）。他方、ムリステロンＡによるＲａｄ５１発現の誘発は基
礎レベルを越えるβ−ガラクトシダーゼ活性の増加をもたらさない。これらの結
果から、Ｒａｄ５１がｐ５３トランスアクチベーター活性に非依存性のｐ２１^{Wa f1} 発現の促進を起こすといえる。

【０１３６】 高レベルのＲａｄ５１に適合する細胞 異所性Ｒａｄ５１発現の５６時間後に、わずか１３％の細胞がＳ期で見られる
。ＵｉＲａｄ５１細胞をムリステロンＡの存在で培養したとき、Ｓ期の細胞フラ
クションが７８時間で１５％に、１５２時間で２１％に再び増加した（図１３Ａ
）。誘発ＵｉＲａｄ５１の長時間培養（２８日）は、Ｒａｄ５１がずーと高レベ
ルで作られていたにもかかわらず、細胞周期の停止からの完全な開放をもたらし
た。この条件で４０％という多いＳ期細胞をフローサイトメトリーで検出した。
これは非処置培養における３８％に匹敵する。細胞は時間および再入増殖ととも
に高レベルのＲａｄ５１に適合する。細胞周期の停止からの開放はｐ２１^Waf1
タンパク質レベルの低下と平行した（図１３Ｂ）。ｐ２１^Waf1 レベルの増加は
２４時間後にすでに見られ (データは示さず）、その量は誘発後５６時間および
７８時間で最高になり、その後非常に低い基礎レベルに低下する。このように、
Ｒａｄ５１はｐ２１^Waf1 の可逆的でｐ５３非依存性の誘発によって一時的に細
胞周期の停止を起こす。

【０１３７】 適合の基本メカニズムをさらに検討するために、waf-1 プロモーター活性をレ
ポーター構築体ＷＷＷＰ−Ｌｕｃの一時的トランスフェクト後に分析し、その４
８時間後に検定した。適合ＵｉＲａｄ５１において細胞は２８日で誘発されてい
た。適合細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは対照細胞で検出可能レベル
を越えない（図１２Ｂと比較)。アッセイの４８時間前での適合細胞からの薬物
の除去は、基礎レベル上のルシフェラーゼ活性を変化させなかった（図１３Ｃ、
コラム３)。ここで、ｐ２１^Waf1 の発現がＲａｄ５１過剰発現からの回復期後に
適合細胞において再促進されるかどうかという疑問が生じる。時間経過試験で、
指数的に発現されたＲａｄ５１タンパク質がムリステロンＡの除去１６時間後に
完全に低下することを確認した (データは示さず）。したがって、適合細胞が薬
物の不存在で回復され、ＷＷＷＰ−Ｌｕｃでトランスフェクトされ、そしてＲａ
ｄ５１発現が次の４８時間で再誘導された（図１３Ｃ、コラム６）。対照として
細胞をトランスフェクト後非誘導のままとした（図１３Ｃ、コラム５）。データ
は、Ｒａｄ５１過剰発現の第２回に応答して waf-1 プロモーターが再活性化さ
れないことを示す。ｐ２１^Waf1 の発現がＲａｄ５１による細胞周期の停止に関
与しているとすると、適合細胞におけるＲａｄ５１の再誘発が細胞増殖にに影響
を及ぼしているはずはないと考えられる。この仮説を検証するために、適合細胞
をムリステロンＡの不存在で２日 (データは示さず）または１１日培養し、７２
時間での再誘発をフローサイトメトリーで調べた（図１４Ａ、パネル１）。対照
として、適合細胞を細胞周期分析の前の１４日間誘発しなかった。再誘発細胞と
対照細胞の細胞周期分布は識別できない。したがって、高レベルのＲａｄ５１の
ない１１日間は、Ｒａｄ５１による細胞周期の停止を再形成するのに十分でない
。waf-1 プロモーター活性化の消失およびＲａｄ５１の高レベル発現への適合後
の細胞周期の停止からして、他のｐ２１^Waf1 仲介細胞増殖制御経路も影響を受
けるかどうかを選別できた。細胞を図１４Ａパネル１および２のように処置した
が、採取２４時間前にＵＶ照射した。フローサイトメトリーによると、適合細胞
はＵＶ照射に反応して、非適合細胞と同様に、Ｇ_１およびＧ_２／Ｍで停止する（
図１４Ａ、パネル３および４）。

【０１３８】 上記のように、Ｒａｄ５１はｐ５３非依存性の非適合細胞において一時的な細
胞周期の停止を誘発する。非適合で非誘導のＵｉＲａｄ５１細胞において、ＵＶ
照射に応答の、ｐ５３依存性でｐ２１^Waf1 仲介細胞周期の停止は無傷のままで
ある。すなわち、ｐ５３が蓄積し（表示せず）、転写因子として活性化され（図
１２Ｃ）、ｐ２１^Waf1 が蓄積し（図１２Ａ）、そして細胞がＧ_１およびＧ_２／
Ｍで停止する（図１１Ｂ）。ＵＶ照射に応答するｐ５３蓄積がＲａｄ５１への適
合により影響を受けるかどうかを調べるために、図１４Ａに示す細胞のアリコー
トをｐ５３レベルの測定に使用した（図１４Ｂのレーン番号は図１４Ａのパネル
番号Ｊに対応する）。ウエステンブロット法によると、ＵＶ照射に応答して蓄積
するｐ５３の能力はなお無傷のままである。結論として、ｐ５３依存性経路はＲ
ａｄ５１の高レベル発現への適合により影響を受けていない。さらに、血清依存
性が保存されている。血清除去後に適合ＵｉＲａｄ５１がＧ_１で、非適合、非誘
導のＵｉＲａｄ５１およびＵｉＬａｃＺが蓄積するように、蓄積するからである
（データは示さず）。したがって、Ｒａｄ５１起因の細胞周期調節経路のみがＲ
ａｄ５１過剰発現への適合により影響を受けるようである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−１Ｆは、免疫組織化学法（図１Ａ−１Ｄ）およびウエス
テンブロット法（図１Ｅ−１Ｆ）による単層細胞培養中のＲａｄ５１とｐ５３の
発現レベルの比較を示す。

【図２】 図２Ａ−２Ｈは、球状に成長したヒト膵臓癌細胞におけるＲａｄ
５１タンパク質の蓄積を示す。

【図３】 図３Ａ−３Ｈは、膵臓癌細胞におけるＲａｄ５１発現の比較を示
す。

【図４】 図４は、ペプチド競合によるＲａｄ５１免疫組織化学についての
特異性を示す。

【図５】 図５は、非同位体ＲＮＡＳＥ解裂アッセイ（ＮＩＲＣＡ）用いる
Ｒａｄ５１コード配列についての変異分析を示す。

【図６】 図６は、Ｒａｄ５１過剰発現の生物学的結果を示す。

【図７】 図７は、ヒトｒａｄ５１遺伝子の５'領域についてのマップを示
す。

【図８】 図８Ａ−Ｌは、腫瘍の等級付けに関するＲａｄ５１、ｐ５３、Ｋ
ｉ６７−抗原、ＢＲＣＡ１の発現を示す。

【図９】 図９は、Ｒａｄ５１、ｐ５３、Ｋｉ６７−抗原、ＢＲＣＡ１の発
現と確立している腫瘍評価基準との相関を示すグラフである。

【図１０】 図１０Ａ−１０Ｄは、ＢＲＣＡ１の代表的染色パターンを示す
。

【図１１】 図１１Ａ−１１Ｃは、Ｒａｄ５１の異所性発現がＵｉＲａｄ５
１細胞において細胞周期の停止を起こすことを示す。

【図１２】 図１２Ａ−１２Ｃは、Ｒａｄ５１の異所性発現がｐ２１^{Ｗａｆ １} タンパク質の発現をｐ５３活性化なしに転写的に誘発することを示す。

【図１３】 図１３Ａ−１３Ｃは、Ｒａｄ５１誘発の細胞周期停止が長いＲ
ａｄ５１の過剰発現後になくなることを示す。

【図１４】 図１４−１４Ｂは、Ｒａｄ５１過剰発現に対する適応がＵＶ開
始細胞周期の停止経路に影響を及ぼさないことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１５４，６１６ (32)優先日 平成11年９月17日(1999．9．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５４，４９５ (32)優先日 平成11年12月６日(1999．12．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５５，３００ (32)優先日 平成11年12月６日(1999．12．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA45 CA01 CA09 DA03 GA11 HA12 4B063 QA19 QQ08 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS33 QS34 QX01 4C084 AA02 AA17 BA44 NA05 NA14 ZB21 ZB26

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌について個体を診断する方法であって、 ａ）個体からのサンプル中のＲａｄ５１発現レベルを測定し； ｂ）該レベルを対照レベルと比較する（該対照からの変化が癌を表す）； ことを含む方法。
2. 【請求項２】 癌を、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、リンパ腫
   、皮膚癌よりなる群から選択する、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 Ｒａｄ５１発現レベルをＲａｄ５１タンパク質レベルにより
   測定する、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 該レベルをポリクローナル抗体の使用により測定する、請求
   項１の方法。
5. 【請求項５】 該レベルをモノクローナル抗体の使用により測定する、請求
   項１の方法。
6. 【請求項６】 該抗体が真核性Ｒａｄ５１に対するものである、請求項４ま
   たは５の方法。
7. 【請求項７】 該真核性抗体が哺乳類のＲａｄ５１である、請求項６の方法
   。
8. 【請求項８】 Ｒａｄ５１発現レベルをＲａｄ５１核酸レベルにより測定す
   る、請求項１の方法。
9. 【請求項９】 癌について個体を診断する方法であって、 ａ）個体からのサンプル中のＲａｄ５１発現レベルを測定し； ｂ）該レベルを、診断し得るように癌の重篤度を表す対照レベルと比較する； ことを含む方法。
10. 【請求項１０】 癌を、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、リンパ
    腫、皮膚癌よりなる群から選択する、請求項９の方法。
11. 【請求項１１】 Ｒａｄ５１発現レベルをＲａｄ５１タンパク質レベルによ
    り測定する、請求項９の方法。
12. 【請求項１２】 該レベルをポリクローナル抗体の使用により測定する、請
    求項９の方法。
13. 【請求項１３】 該レベルをモノクローナル抗体の使用により測定する、請
    求項９の方法。
14. 【請求項１４】 該抗体が真核性Ｒａｄ５１に対するものである、請求項１
    ２または１３の方法。
15. 【請求項１５】 該真核性抗体が哺乳類のＲａｄ５１である、請求項１４の
    方法。
16. 【請求項１６】 Ｒａｄ５１発現レベルをＲａｄ５１核酸レベルにより測定
    する、請求項９の方法。
17. 【請求項１７】 主要な組織サンプル中の癌細胞を同定する方法であって、
    ａ）問題の主要な組織サンプル中のＲａｄ５１レベルを測定し； ｂ）該Ｒａｄ５１レベルを非癌組織サンプルと比較する； （該レベルの差異が問題の組織サンプル中の癌細胞の存在を表す） ことを含む方法。
18. 【請求項１８】 細胞または組織中の正常または異常のＲａｄ５１発現レベ
    ルを検出するためのキットであって、 ａ）Ｒａｄ５１についての結合剤； ｂ）検出可能な標識； ｃ）Ｒａｄ５１発現の正常レベルまたは癌の種々の重篤度におけるＲａｄ５１発
    現を表す対照； を含む方法。
19. 【請求項１９】 癌を有する個体を処置する方法であって、Ｒａｄ５１阻害
    剤を該個体に、該個体の癌を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法。
20. 【請求項２０】 該Ｒａｄ５１阻害剤を、小分子およびペプチドよりなる群
    から選択する、請求項１９の方法。
21. 【請求項２１】 癌を有する個体における放射線およびＤＮＡ障害化学療法
    剤に対する感受性を誘発する方法であって、該個体にＲａｄ５１阻害剤を含む組
    成物を、該感受性を誘発するのに有効な量で投与することを含む方法。
22. 【請求項２２】 該Ｒａｄ５１阻害剤を、小分子およびペプチドよりなる群
    から選択する、請求項２１の方法。
23. 【請求項２３】 細胞中でアポトーシスを誘発する方法であって、該細胞に
    Ｒａｄ５１阻害剤を投与することを含む方法。
24. 【請求項２４】 該細胞が癌細胞である、請求項２３の方法。
25. 【請求項２５】 該Ｒａｄ５１阻害剤を、小分子およびペプチドよりなる群
    から選択する、請求項２３の方法。
26. 【請求項２６】 癌についての処置の予測的帰結を決定する方法であって、
    患者の組織サンプル中のＲａｄ５１発現レベルを測定し、該レベルを、患者が化
    学療法剤または放射線の処置に対して有することになろう耐性を表す対照と比較
    する； ことを含む方法。
27. 【請求項２７】 アポトーシスを阻害する方法であって、細胞中のＲａｄ５
    １過剰発現を誘発することを含む方法。
28. 【請求項２８】 誘発がＲａｄ５１核酸の投与による、請求項２７の方法。
29. 【請求項２９】 細胞の生存を高める方法であって、細胞中のＲａｄ５１過
    剰発現を誘発することを含む方法。
30. 【請求項３０】 誘発がＲａｄ５１核酸の投与による、請求項２９の方法。
31. 【請求項３１】 Ｒａｄ５１発現を調節する薬剤のスクリーニング方法であ
    って、球状物での細胞を培養し、候補薬剤を該球状物に加え、Ｒａｄ５１発現レ
    ベルを該候補薬剤の添加の前後に測定すること（変化が該候補薬剤によるＲａｄ
    ５１発現の調節を表す）を含む方法。
32. 【請求項３２】 該発現が阻害されている、請求項３１の方法。