JP2003506041A - Human p53 mutation and yeast gene system for functional identification of human p53 mutation - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、変異を有するヒトｐ５３の単離されたポリペプチドに関する。これらの変異は毒性変異、スーパートランス活性化変異またはtox-サプレッサー変異であり得る。本発明はさらに、毒性、スーパートランス活性化、弱いトランス活性化およびtox-サプレッサー変異を同定する方法、ならびにヒトｐ５３における毒性、スーパートランス活性化およびtox−サプレッサー変異を模倣する化合物を同定する方法を提供する。また、スーパートランス活性化または毒性変異を含むポリペプチドを投与することによって細胞内で毒性を誘導する方法を提供する。   (57) [Summary] The present invention relates to isolated human p53 polypeptides having mutations. These mutations can be toxic mutations, supertransactivation mutations or tox-suppressor mutations. The present invention further provides methods for identifying toxicity, supertransactivation, weak transactivation and tox-suppressor mutations, and methods for identifying compounds that mimic toxicity, supertransactivation and tox-suppressor mutations in human p53. provide. Also provided is a method for inducing toxicity in cells by administering a polypeptide containing supertransactivation or a toxic mutation.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒトｐ５３の変異体およびｐ５３変異体の同定方法に関する。詳し
くは、本発明は、ヒトｐ５３変異体を含む単離ポリペプチドおよび該ポリペプチ
ドをコードする単離核酸に関する。本発明はさらに、毒性変異、過剰トランス活
性化（supertransactivating）変異または毒性−サプレッサー（tox-suppressor
）変異であるヒトｐ５３変異を検出する方法並びに毒性変異または過剰トランス
活性化変異を模倣した化合物、薬剤または相互作用因子、たとえばペプチドの同
定に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a mutant of human p53 and a method for identifying a p53 mutant. In particular, the invention relates to isolated polypeptides containing human p53 variants and isolated nucleic acids encoding the polypeptides. The invention further provides virulent mutations, supertransactivating mutations or virulence-suppressors.
3.) A method for detecting a human p53 mutation that is a mutation as well as the identification of compounds, drugs or interactors, such as peptides, that mimic toxic or hypertransactivating mutations.

【０００２】 （背景技術） 悪性形質転換に関連して最も一般的に不活化される遺伝子標的は、ガン抑制遺
伝子ｐ５３であり、これはゲノムの完全性を維持する細胞メカニズムの重要なレ
ギュレーターである（PrivesおよびHall）。通常、ＤＮＡ損傷、低酸素症、最適
状態に及ばない増殖条件、ヌクレオチドプールのアンバランス、および活性化さ
れたガン遺伝子を含む細胞のストレスはシグナル伝達カスケードを誘発し、この
シグナル伝達カスケードはｐ５３に集中して主として翻訳後修飾により該タンパ
ク質の一層高い安定性という結果となる（GiaccaおよびKastan；Meek）。このプ
ロセスでｐ５３の半減期は、一層大きな核保持へと導く正常なＭＤＭ２関連分解
経路の抑制のため（FreedmanおよびLevine）、およびｐ５３テトラマーの安定性
の協働した制御により、増大する（Stommel）。このことは核中の活性なｐ５３
レベルを迅速かつ一過性に増大させ、増殖の停止またはアポトーシスのいずれか
を引き起こす。BACKGROUND OF THE INVENTION The most commonly inactivated gene target associated with malignant transformation is the tumor suppressor gene p53, an important regulator of cellular mechanisms that maintain genomic integrity. (Prives and Hall). Usually, cellular damage, including DNA damage, hypoxia, suboptimal growth conditions, nucleotide pool imbalances, and activated oncogenes, triggers a signaling cascade that leads to p53. The focus is mainly on post-translational modification, which results in higher stability of the protein (Giacca and Kastan; Meek). In this process, the half-life of p53 is increased due to inhibition of the normal MDM2-related degradation pathway leading to greater nuclear retention (Freedman and Levine) and by the coordinated control of p53 tetramer stability (Stommel). . This means that active p53 in the nucleus
The levels are increased rapidly and transiently, causing either growth arrest or apoptosis.

【０００３】 ｐ５３により媒体されたストレス応答は、主として、幾つかのｐ５３機能性ド
メインが関与する（KoおよびPrives）配列特異的な転写活性化により起こる（Pr
rivesおよびHall）。ｐ５３のＮ末端から説明すると、最初の４３アミノ酸は主
要なトランス活性化ドメインを含む酸性領域に対応する；アミノ酸４３と７３と
の間の領域は第二のトランス活性化領域を表す（Venotらa）。次の領域（アミノ
酸９２まで）はプロリンに富んだ領域であり、アポトーシスの誘発に関与してお
り（Venotらb）、その後に配列特異的なＤＮＡ認識を担う大きなＤＮＡ結合ドメ
イン（アミノ酸１００〜３００）が続く。残りのカルボキシル末端部分は、核局
在および移送シグナル、オリゴマー形成ドメイン、および塩基性の（basic）制
御領域をコードしている。ｐ５３モノマーはペンタマーＤＮＡ配列（コンセンサ
ス５'−ＲＲＲＣＷ−３'）を認識し、完全な結合部位はヘッド・トゥ・ヘッドで
空間的に近接した２つのペンタマーからなる（McLureおよびLee, Choら）。該タ
ンパク質の転写的に活性な形態はテトラマーである。The stress response mediated by p53 is primarily caused by sequence-specific transcriptional activation involving several p53 functional domains (Ko and Prives) (Pr
rives and Hall). Starting from the N-terminus of p53, the first 43 amino acids correspond to the acidic region containing the major transactivation domain; the region between amino acids 43 and 73 represents the second transactivation region (Venot et al. ). The next region (up to amino acids 92) is a proline-rich region, which is involved in the induction of apoptosis (Venot et al. B), followed by a large DNA binding domain (amino acids 100-300) responsible for sequence-specific DNA recognition. ) Continues. The remaining carboxyl-terminal portion encodes nuclear localization and transport signals, oligomerization domains, and basic control regions. The p53 monomer recognizes a pentameric DNA sequence (consensus 5'-RRRCW-3 ') and the complete binding site consists of two pentamers spatially adjacent head-to-head (McLure and Lee, Cho et al.). The transcriptionally active form of the protein is the tetramer.

【０００４】 幾つかの下流のｐ５３活性化遺伝子（KoおよびPrivesに概説）は、プログラム
された細胞死の誘発（たとえば、bax, IGF-BP3, PIG3）、ＤＮＡ損傷に応答した
Ｇ１／ＳまたはＧ２／Ｍチェックポイントでの停止の誘発による細胞周期の制御
（たとえば、p21, GADD45, cyclin G）、およびｐ５３安定性／活性の修飾（MDM
2）と関係している。ヒトゲノムでの推定ｐ５３結合部位の探求に基づいたｐ５
３制御遺伝子の数は極めて多い（＞３０遺伝子）（Tokinoら）。様々な結合部位
に対するｐ５３の親和性の差異は、下流遺伝子の活性化の変わりやすさを与え（
Resnick L.ら、WangおよびPrives）、腫瘍において見出されるある種のｐ５３変
異体が何故に部分的なｐ５３応答を保持しているかを説明している（Ludvigら）
。Several downstream p53 activating genes (reviewed by Ko and Prives) have been shown to induce programmed cell death (eg bax, IGF-BP3, PIG3), G1 / S or G2 in response to DNA damage. / M control of cell cycle by inducing arrest at the checkpoint (eg p21, GADD45, cyclin G), and modification of p53 stability / activity (MDM
2) is related to. P5 based on the search for putative p53 binding sites in the human genome
The number of 3 regulatory genes is extremely large (> 30 genes) (Tokino et al.). Differences in p53 affinity for various binding sites confer variable activation of downstream genes (
Resnick L. et al., Wang and Prives), explain why certain p53 mutants found in tumors carry a partial p53 response (Ludvig et al.).
.

【０００５】 転写活性化の他に、ｐ５３はＴＡＴＡ結合タンパク質および関連因子と物理的
に相互作用することによって遺伝子発現に影響を及ぼすことができる（Koおよび
Prives, Oren fos）。他のタンパク質−タンパク質相互作用もまた、ｐ５３応答
を媒体するうえで重要な役割を果たしていることがありうる。ｐ５３と相互作用
するタンパク質の数は多いが、多くの場合、これら相互作用の生理的役割はわか
っていない（PrivesおよびHall）。さらに、ヌクレアーゼ活性および組換え体様
構造へのｐ５３結合によって明示されるように、ｐ５３はＤＮＡの代謝において
直接的な役割を果たしている（Deppert; Griffith）。In addition to transcriptional activation, p53 can affect gene expression by physically interacting with TATA-binding proteins and related factors (Ko and
Prives, Oren fos). Other protein-protein interactions may also play important roles in mediating the p53 response. Although the number of proteins that interact with p53 is large, in many cases the physiological role of these interactions is unknown (Prives and Hall). Furthermore, p53 plays a direct role in the metabolism of DNA as evidenced by nuclease activity and p53 binding to recombinant-like structures (Deppert; Griffith).

【０００６】 ヒト腫瘍の５０％近くがｐ５３変異を呈することから明示されるように、ｐ５
３機能の喪失は腫瘍の発生の際に高度に選択されている（Grennblatt）。大抵の
変化はＤＮＡ結合ドメイン中の単一のミスセンス変異（これはＤＮＡ結合を妨害
または低減させる）から生じ、一般に大抵のｐ５３不変残基で生じる（Walkerら
）。これら残基は、通常、ＤＮＡに直接接触するか、または大きなＤＮＡ結合ド
メインの正しい折り畳みおよび安定性に影響を及ぼす（Cho）。ミスセンス変異
に対する強い選択は、おそらく、野生型タンパク質との優性ネガティブな（domi
nant-negative）相互作用（部分的に不活性なへテロテトラマーを生成する）、
およびおそらく機能の獲得によるものである（Gualbertoら）。さらに、腫瘍細
胞は一般に核内に高レベルのｐ５３変異体タンパク質を蓄積する。これは、ＭＤ
Ｍ２によって媒体されるｐ５３レベルの負のフィードバック制御のためのシステ
ムが存在するからである。ｐ５３機能の喪失は、ＭＤＭ２遺伝子転写の低下およ
び変異体ｐ５３の蓄積に導く。機能性のｐ５３の不活化はまた、該タンパク質を
核外に封鎖してその安定性を低下させることによって、またはその上流または下
流の経路に関与する遺伝子の突然変異によっても達成されうる。Nearly 50% of human tumors display p53 mutations, as evidenced by p5
Loss of 3 function is highly selected during tumor development (Grennblatt). Most changes result from a single missense mutation in the DNA binding domain, which interferes with or reduces DNA binding, and generally occurs at most p53 invariant residues (Walker et al.). These residues normally make direct contact with DNA or affect the correct folding and stability of large DNA binding domains (Cho). Strong selection for missense mutations is probably due to dominant negative (domi) with wild-type proteins.
nant-negative) interaction (produces a partially inactive heterotetramer),
And probably due to the acquisition of functionality (Gualberto et al.). In addition, tumor cells generally accumulate high levels of p53 variant protein in the nucleus. This is MD
This is because there is a system for negative feedback control of p53 level mediated by M2. Loss of p53 function leads to reduced MDM2 gene transcription and accumulation of mutant p53. Inactivation of functional p53 can also be achieved by sequestering the protein out of the nucleus, reducing its stability, or by mutation of genes involved in its upstream or downstream pathways.

【０００７】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） 本発明では、以前に同定された幾つかのｐ５３の機能性の変異体をガラクトー
ス誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下に置き、その発現を様々に制御すること
ができる。増殖抑制は一般にトランス活性化と直接的に相関しており、野生型の
ｐ５３の過剰発現はコロニーサイズの重篤な低減を引き起こし、一方、トランス
活性化変異体は増殖に対してわずかな影響しか有していなかった。先端の欠失し
た（truncated）ｐ５３（テトラマーを形成できない）は明らかな増殖遅延を引
き起こさなかったが、一方、部分的な活性を保持した変異体は増殖に対して正常
なｐ５３と同様の影響を有していた。このことに基づき、ある種のｐ５３アレル
は増殖に対して野生型よりも強い影響を示すことができ、おそらく生存不能に導
くことが予想される。このことは、ＤＮＡ結合親和性の増大、特異性の変化、安
定性の増大、テトラマー形成へのシフト、あるいは一層強いタンパク質::タンパ
ク質相互作用にさえもよるものである。そのようなアレルは、哺乳動物細胞にお
いても野生型ｐ５３よりも一層有効に機能することが予想される。DISCLOSURE OF THE INVENTION Technical Problem to be Solved by the Invention In the present invention, several previously identified functional mutants of p53 were placed under the control of the galactose-inducible GAL1 promoter, Its expression can be regulated in various ways. Growth suppression is generally directly correlated with transactivation, with overexpression of wild-type p53 causing a severe reduction in colony size, whereas transactivating mutants have only a minor effect on growth. I didn't have it. Truncated p53 (incapable of forming a tetramer) caused no apparent growth retardation, whereas mutants that retained partial activity had similar effects on growth as normal p53. Had. Based on this, it is expected that certain p53 alleles may have a stronger effect on proliferation than wild type, presumably leading to nonviability. This is due to increased DNA binding affinity, altered specificity, increased stability, shift to tetramer formation, or even stronger protein :: protein interactions. It is expected that such alleles will function more effectively than wild-type p53 also in mammalian cells.

【０００８】 （その解決方法） 本発明は、酵母におけるそのような変異体のクラス、および酵母において致死
を、ヒト腫瘍細胞株において増殖抑制を引き起こす新規なｐ５３アレルを同定し
たものである。本発明はさらに、酵母で通常は検出できない様々な毒性のまたは
新規なｐ５３アレルを単離するのに用いることのできるスクリーニング系を提供
するものであり、これらアレルは新規な治療法を開発するうえで有用であること
がわかるであろう。The Solution The invention identifies a class of such mutants in yeast and a novel p53 allele that causes lethality in yeast and growth inhibition in human tumor cell lines. The present invention further provides screening systems that can be used to isolate a variety of toxic or novel p53 alleles that are not normally detectable in yeast, which alleles are useful for developing new therapeutic methods. You will find it useful.

【０００９】 本発明は酵母での新規なスクリーニング法を提供するものであり、該方法は野
生型に比べて転写活性の増大したｐ５３アレルの同定を可能にする。過剰なトラ
ンス活性化の転写活性を示すｐ５３アレルも提供される。それゆえ、本発明は、
ｐ５３による誘発の強度という点に関して（誘発の不在から過剰トランス活性化
にいたる）ｐ５３によって認識される種々のプロモーターについて、およびｐ５
３応答遺伝子の組み合わせについて（すなわち、ある遺伝子のスイッチが入れら
れ、別の遺伝子のスイッチが切られる）当業者がｐ５３の機能制御を調整するこ
とを可能にする。このことは、当業者がｐ５３応答経路を変えることを可能にし
、それゆえ環境の攻撃に応答した生物学的な結果を変えることを可能にする。過
剰トランス活性化変異体はｐ５３遺伝子療法における一層良い選択を代表すると
期待される。なぜなら、そのような変異体は高度に発現された内生のｐ５３腫瘍
変異体の存在下で生物学的活性を保持できるからである。The present invention provides a novel screening method in yeast, which allows identification of p53 alleles with increased transcriptional activity compared to wild type. Also provided are p53 alleles that exhibit hypertransactivating transcriptional activity. Therefore, the present invention
For the various promoters recognized by p53 in terms of the strength of induction by p53 (from absence of induction to hypertransactivation), and p5
It enables one of skill in the art to modulate the functional regulation of p53 for combinations of 3 responsive genes (ie one gene is switched on and another is switched off). This allows one of skill in the art to alter the p53 response pathway and therefore alter the biological consequences in response to environmental aggression. Hypertransactivating mutants are expected to represent a better choice in p53 gene therapy. Because such mutants can retain biological activity in the presence of highly expressed endogenous p53 tumor mutants.

【００１０】 一つの側面において、本発明は、変異Ｖ１２２Ａを含むヒトｐ５３の残基１１
７〜１２７を含む単離ポリペプチド、変異Ｃ２７７Ｗを含むヒトｐ５３の残基２
７２〜２８２を含む単離ポリペプチド、変異Ｃ２７７Ｒを含むヒトｐ５３の残基
２７２〜２８２を含む単離ポリペプチド、変異Ｆ３３８Ｌを含むヒトｐ５３の残
基３３３〜３４３を含む単離ポリペプチド、変異Ｖ１５７Ｉを含むヒトｐ５３の
残基１５３〜１６３を含む単離ポリペプチド、変異Ａ７６Ｔを含むヒトｐ５３の
残基７０〜８０を含む単離ポリペプチド、変異Ｔ１５０Ａを含むヒトｐ５３の残
基１４５〜１５５を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ１２１Ｃを含むヒトｐ５３の
残基１１５〜１２５を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ９６Ｐを含むヒトｐ５３の
残基９０〜１００を含む単離ポリペプチド、変異Ｈ１１５Ｒを含むヒトｐ５３の
残基１１０〜１２０を含む単離ポリペプチド、変異Ｃ１２４Ｙを含むヒトｐ５３
の残基１２０〜１３０を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ１２１Ｆを含むヒトｐ５
３の残基１１５〜１２５を含む単離ポリペプチド、変異Ｔ１２３Ａを含むヒトｐ
５３の残基１１８〜１２８を含む単離ポリペプチド、変異Ｃ１２４Ｆを含むヒト
ｐ５３の残基１２０〜１３０を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ２４０Ｎを含むヒ
トｐ５３の残基２３５〜２４５を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ１１６Ｔを含む
ヒトｐ５３の残基１１０〜１２０を含む単離ポリペプチド、変異Ｎ３４５Ｓを含
むヒトｐ５３の残基３４０〜３５０を含む単離ポリペプチド、変異Ｔ１２３Ｓを
含むヒトｐ５３の残基１１８〜１２８を含む単離ポリペプチド、変異Ｄ１８４Ｇ
を含むヒトｐ５３の残基１８０〜１９０を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ１２１
Ｆを含むヒトｐ５３の残基１１５〜１２５を含む単離ポリペプチド、変異Ｎ２８
８Ｋを含むヒトｐ５３の残基２８３〜２９３を含む単離ポリペプチド、変異Ｅ１
９８Ｖを含むヒトｐ５３の残基１９３〜２０３を含む単離ポリペプチド、変異Ｈ
１１５Ｒを含むヒトｐ５３の残基１１０〜１２０を含む単離ポリペプチド、変異
Ｗ９１Ｒを含むヒトｐ５３の残基８５〜９５を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ９
６Ｐを含むヒトｐ５３の残基９０〜１００を含む単離ポリペプチド、変異Ｓ１１
６Ｔを含むヒトｐ５３の残基１１０〜１２０を含む単離ポリペプチド、変異Ｎ２
２８Ｋを含むヒトｐ５３の残基２２５〜２３５を含む単離ポリペプチド、変異Ｔ
１１８Ａを含むヒトｐ５３の残基１１３〜１２３を含む単離ポリペプチド、変異
Ｔ１２３Ｐを含むヒトｐ５３の残基１１８〜１２８を含む単離ポリペプチド、変
異Ｌ１３７Ｒを含むヒトｐ５３の残基１３２〜１４２を含む単離ポリペプチド、
変異Ｍ１６０Ｔを含むヒトｐ５３の残基１５５〜１６５を含む単離ポリペプチド
、変異Ｎ２３９Ｙを含むヒトｐ５３の残基２３５〜２４５を含む単離ポリペプチ
ド、変異Ｅ２８５Ａを含むヒトｐ５３の残基２８０〜２９０を含む単離ポリペプ
チド、変異Ａ７６Ｔおよび変異Ｖ１２２Ａを含むヒトｐ５３の残基５０〜１５０
を含む単離ポリペプチド、変異Ｗ９１Ｃ、変異Ｃ１２４Ｒ、変異Ｑ１３６Ｋ、お
よび変異Ｔ１５０Ａを含むヒトｐ５３の残基５０〜２００を含む単離ポリペプチ
ド、変異Ｃ１２４Ｒ、変異Ｑ１３６Ｋ、および変異Ｔ１５０Ａを含むヒトｐ５３
の残基１００〜２００を含む単離ポリペプチドを提供する。本発明はまた、上記
変異の組み合わせを含むヒトｐ５３の変異体ポリペプチドをも提供する。 本発明はまた、本発明の変異体ポリペプチドのいずれかをコードする単離核酸
を提供する。In one aspect, the invention provides for residue 11 of human p53 containing the mutation V122A.
An isolated polypeptide comprising 7-127, residue 2 of human p53 containing the mutation C277W
72-282, an isolated polypeptide containing residues 272-282 of human p53 containing the mutation C277R, an isolated polypeptide containing residues 333-343 of human p53 containing the mutation F338L, mutation V157I Including residues 153 to 163 of human p53 containing, a polypeptide containing residues 70 to 80 of human p53 containing the mutation A76T, containing residues 145 to 155 of human p53 containing the mutation T150A. Isolated polypeptide, isolated polypeptide containing residues 115-125 of human p53 containing mutation S121C, isolated polypeptide containing residues 90-100 of human p53 containing mutation S96P, human p53 containing mutation H115R An isolated polypeptide comprising residues 110-120, human p53 containing the mutation C124Y
Isolated polypeptide comprising residues 120-130 of human p5 containing the mutation S121F
Isolated polypeptide containing residues 115-125 of 3, human p containing mutation T123A
An isolated polypeptide containing residues 118-128 of 53, an isolated polypeptide containing residues 120-130 of human p53 containing the mutation C124F, an isolated polypeptide containing residues 235-245 of human p53 containing the mutation S240N. Peptide, isolated polypeptide containing residues 110-120 of human p53 containing mutation S116T, isolated polypeptide containing residues 340-350 of human p53 containing mutation N345S, residue 118 of human p53 containing mutation T123S Polypeptide containing ~ 128, mutation D184G
Isolated polypeptide comprising residues 180-190 of human p53, including mutation S121
An isolated polypeptide comprising residues 115-125 of human p53 containing F, mutation N28
An isolated polypeptide comprising residues 283 to 293 of human p53, including 8K, mutant E1
An isolated polypeptide comprising residues 193-203 of human p53 containing 98V, mutation H
An isolated polypeptide containing residues 110-120 of human p53 containing 115R, an isolated polypeptide containing residues 85-95 of human p53 containing the mutation W91R, mutation S9
An isolated polypeptide comprising residues 90-100 of human p53 containing 6P, mutation S11
An isolated polypeptide comprising residues 110-120 of human p53 containing 6T, mutation N2
An isolated polypeptide comprising residues 225-235 of human p53, including 28K, mutant T
Isolated polypeptide containing residues 113-123 of human p53 containing 118A, isolated polypeptide containing residues 118-128 of human p53 containing mutant T123P, residues 132-142 of human p53 containing mutant L137R. An isolated polypeptide comprising
An isolated polypeptide containing residues 155 to 165 of human p53 containing the mutation M160T, an isolated polypeptide containing residues 235 to 245 of human p53 containing the mutation N239Y, residues 280 to 290 of human p53 containing the mutation E285A. 50-150 of human p53, including isolated polypeptide comprising A76T and mutation V122A
An isolated polypeptide comprising mutations W91C, mutation C124R, mutation Q136K, and mutation T150A, and an isolated polypeptide comprising residues 50-200 of human p53, mutation C124R, mutation Q136K, and mutation T150A.
And an isolated polypeptide comprising residues 100-200 of. The invention also provides variant polypeptides of human p53 that include combinations of the above mutations. The invention also provides an isolated nucleic acid encoding any of the variant polypeptides of the invention.

【００１１】 本発明はまたヒトｐ５３遺伝子において過剰トランス活性化変異を検出する方
法をも提供し、該方法は、（ａ）リポーター遺伝子を含む酵母菌体を得、その際
、該リポーター遺伝子はヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列に連結しており、（ｂ
）該酵母菌体にヒトｐ５３をコードする核酸を導入し、その際、該核酸はヒトｐ
５３コード配列に連結したＧＡＬ１を含む誘導性プロモーターを含んでおり、（
ｃ）該酵母菌体を、炭素源としてのラフィノース上にプレーティングし、ついで
（ｄ）プレート上のコロニーを同定し、その際、野生型のｐ５３を発現している
コロニーは赤いコロニーを生成し、ｐ５３において過剰トランス活性化変異を発
現しているコロニーは白色またはピンク色のコロニーを生成すること、を含む。The present invention also provides a method for detecting a hypertransactivating mutation in the human p53 gene, which method comprises (a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene, wherein the reporter gene is human. linked to the DNA sequence to which p53 binds, (b
) Introducing a nucleic acid encoding human p53 into the yeast cell, wherein the nucleic acid is human p53
It contains an inducible promoter containing GAL1 linked to the 53 coding sequence, (
c) Plating the yeast cells on raffinose as a carbon source, and then (d) identifying colonies on the plate, where colonies expressing wild-type p53 produce red colonies. , Colonies expressing a hypertransactivating mutation in p53 produce white or pink colonies.

【００１２】 本発明はまた、ヒトｐ５３遺伝子において毒性の変異を検出する方法を提供し
、該方法は、（ａ）リポーター遺伝子を含む酵母菌体を得、その際、該リポータ
ー遺伝子はヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列に連結しており、（ｂ）該酵母菌体
に、該酵母菌体で未同定のヒトｐ５３をコードする核酸を導入し、その際、該核
酸はヒトｐ５３コード配列に連結したＧＡＬ１を含む誘導性プロモーターを含ん
でおり、（ｃ）該酵母菌体を、各グルコース、ラフィノースまたはガラクトース
上にプレーティングし、ついで（ｄ）プレート上のコロニーを同定し、その際、
野生型のｐ５３を発現しているコロニーは、グルコース上で赤いコロニー、ラフ
ィノース上で赤いコロニーおよびガラクトース上で白色コロニーを生成し、ｐ５
３において毒性の変異を発現しているコロニーは、グルコース上で赤いコロニー
、ラフィノース上で赤いコロニーまたは白色コロニーを生成するかまたはコロニ
ーを生成せず、ガラクトース上でコロニーを生成しない、を含む。The present invention also provides a method for detecting a toxic mutation in the human p53 gene, which method comprises (a) obtaining yeast cells containing a reporter gene, wherein the reporter gene is human p53. (B) A nucleic acid encoding human p53 which has not been identified in the yeast cell is introduced into the yeast cell, and the nucleic acid is linked to the human p53 coding sequence. Containing an inducible promoter containing GAL1, (c) plating the yeast cells on each glucose, raffinose or galactose, and then (d) identifying colonies on the plate,
Colonies expressing wild-type p53 produced red colonies on glucose, red colonies on raffinose and white colonies on galactose, p5.
Colonies expressing virulent mutations in 3 included red colonies on glucose, red or white colonies on raffinose or no colonies, and no colonies on galactose.

【００１３】 本発明はさらに、ａ）酵母菌（細胞）において未同定のヒトｐ５３をコードし
、そのヒトｐ５３コード配列に連結されたオン−オフプロモーターを含む核酸を
酵母菌に導入し、ｂ）合成酵母培地において、該プロモーター誘導物質の存在お
よび非存在下において、この酵母をインキュベートし、そしてｃ）野生型ｐ５３
を発現する酵母が、該プロモーター誘導物質の存在下または非存在下において増
殖、並びにｐ５３における有毒な突然変異（変異）型を発現する酵母が、該プロ
モーター誘導物質の存在下において増殖することで、有毒な突然変異型を同定す
ることを含む、ヒトＰ５３遺伝子における有毒な突然変異型を検出する方法を提
供する。The present invention further comprises: a) introducing into the yeast a nucleic acid encoding an unidentified human p53 in yeast (cell) and containing an on-off promoter linked to the human p53 coding sequence; Incubating the yeast in synthetic yeast medium in the presence and absence of the promoter inducer, and c) wild-type p53
Is expressed in the presence or absence of the promoter inducer, and yeast expressing a toxic mutant (mutant) form of p53 is grown in the presence of the promoter inducer, Provided is a method for detecting a toxic mutant form in the human P53 gene, which comprises identifying a toxic mutant form.

【００１４】 また、本発明は有毒な突然変異型を含むヒトｐ５３を細胞に投与することによ
って、その細胞に毒性を誘導する方法を提供する。さらに本方法は超トランス活
性化突然変異型を含むヒトｐ５３を細胞に投与することによって、その細胞に毒
性を誘導する方法も提供する。The present invention also provides a method for inducing toxicity to a cell by administering human p53 containing a toxic mutant form to the cell. The method further provides a method of inducing toxicity to a cell by administering human p53 containing a hypertrans-activating mutant to the cell.

【００１５】 また、本発明はａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列に連結されているレポー
ター遺伝子を含む酵母菌を得、ｂ）酵母菌において無毒な突然変異型または野生
型ヒトｐ５３をコードし、その無毒な突然変異型または野生型ヒトｐ５３のコー
ド配列に連結されている誘導性のプロモーターを含む核酸を酵母菌に導入し、ｃ
）その酵母菌に化合物を導入し、ｄ）グルコース、ラフィノースまたはガラクト
ースのいずれか上において、この酵母菌を培養し、そしてｅ）野生型または無毒
な突然変異型ｐ５３を発現するコロニーの増殖を阻害し、グルコース上において
赤色コロニー、ラフィノース上において赤色コロニーまたは白色コロニーあるい
は無コロニー、およびガラクトース上において無コロニーを形成する有毒な突然
変異型に擬似する化合物を同定することを含む、有毒なｐ５３突然変異型に擬似
し得る化合物をスクリーニングする方法も提供する。The present invention also provides a) a yeast comprising a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds, b) encoding a mutant or wild-type human p53 that is non-toxic in yeast. A nucleic acid containing an inducible promoter linked to the coding sequence of the non-toxic mutant or wild-type human p53 is introduced into yeast, and c
) Introducing a compound into the yeast, d) culturing the yeast on either glucose, raffinose or galactose, and e) inhibiting the growth of colonies expressing wild-type or non-toxic mutant p53. And a toxic mutant of p53, which identifies a toxic mutant that forms a red colony on glucose, a red or white or no colony on raffinose, and a colony on galactose. Also provided are methods of screening for compounds that can mimic types.

【００１６】 また、本発明はａ）酵母菌における無毒な突然変異型または野生型ヒトｐ５３
をコードし、その無毒な突然変異型または野生型ヒトｐ５３のコード配列に連結
されているオン−オフプロモーターを含む核酸を酵母菌に導入し、ｂ）その酵母
菌に化合物を導入し、ｃ）人工酵母培地において、該プロモーター誘導物質の存
在下および非存在下において、この酵母菌をインキュベートし、そしてｄ）該プ
ロモーター誘導物質の存在下において酵母の増殖を阻害することによって、有毒
な突然変異型に擬似する化合物を同定することを含む有毒なｐ５３突然変異型に
擬似し得る化合物をスクリーニングする方法も提供する。The present invention also relates to a) a nontoxic mutant or wild-type human p53 in yeast.
A non-toxic mutant or wild-type human p53-containing nucleic acid containing an on-off promoter linked to the coding sequence of the human p53 is introduced into a yeast, b) the compound is introduced into the yeast, and c). A toxic mutant by incubating the yeast in artificial yeast medium in the presence and absence of the promoter inducer and d) inhibiting yeast growth in the presence of the promoter inducer Also provided are methods of screening for compounds that can mimic toxic p53 mutants, including identifying compounds that mimic.

【００１７】 本発明はさらに、ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列に連結されているレポ
ーター遺伝子を含む酵母菌を得、ｂ）酵母菌における野生型または非−超トラン
ス活性化突然変異型ヒトｐ５３をコードし、非−超トランス活性化突然変異型ま
たは野生型ヒト５３のコード配列に連結されている誘導性のプロモーターを含む
核酸を酵母菌に導入し、ｃ）化合物およびラフィノースにおいてこの酵母菌を培
養し、そしてｄ）ｐ５３の非存在下においては影響を及ぼさず、ｐ５３における
超トランス活性化突然変異型に擬似することで、白色またはピンク色コロニーを
形成する化合物を同定することを含むヒトｐ５３遺伝子における超トランス活性
化突然変異型に擬似し得る化合物をスクリーニングする方法を提供する。The invention further comprises: a) obtaining a yeast comprising a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds, and b) wild-type or non-supertransactivating mutant human p53 in yeast. A nucleic acid encoding a non-hypertransactivating mutant or a wild-type human 53 and containing an inducible promoter linked to the coding sequence of the human 53 is introduced into the yeast, and c) the compound and raffinose Culturing, and d) identifying human p53, which has no effect in the absence of p53 and mimics a hypertransactivating mutant in p53, forming a white or pink colony. Provided is a method of screening for compounds that can mimic a hypertransactivating mutation in a gene.

【００１８】 発明の詳細な記載 本発明の好ましい態様の以下の詳細な記載およびここに含まれる実施例を参照
することによって、本発明をより容易に理解することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention may be understood more readily by reference to the following detailed description of preferred embodiments of the invention and the examples included therein.

【００１９】 本願化合物および方法を開示、記載する前に、本発明は、特定のタンパク質ま
たは特定の方法に限定されないと理解されるものである。また、ここに使用され
る技術は、単に、具体的な態様を記載するためのものであって、限定を意図する
ものではないと理解されるものである。Before disclosing and describing the compounds and methods of the present application, it is to be understood that this invention is not limited to particular proteins or particular methods. Also, it is understood that the technology used herein is merely for the purpose of describing specific embodiments and is not intended to be limiting.

【００２０】 本明細書および添付した請求の範囲において使用される単数形「a」および「a
n」および「the」は、その文脈が明らかに別の意味を示していない限り、複数形
の対象物を包含する。As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” and “a
"n" and "the" include plural forms of the object, unless the context clearly dictates otherwise.

【００２１】 本明細書において「含む（comprising）」は、少なくとも特定された要素が存
在することを意味する。「含む（comtaining）」は、少なくとも特定された要素
が存在することを意味する。As used herein, “comprising” means that at least the specified element is present. “Containing” means that at least the specified element is present.

【００２２】 ヒトｐ５３突然変異体 本発明は、ヒトｐ５３の突然変異体を提供する。これらの突然変異体は、ある
特定の表現型をもたらし、増加したＤＮＡ結合親和性、ＤＮＡの交換、ｐ５３応
答性エレメントに対する改変された特異性、増加した安定性、ｐ５３の四量体形
態へのシフト、さらには、より強力なまたはまだ特定されていないタンパク質間
相互作用を通じて、その効果を発揮し得る。Human p53 Mutants The present invention provides mutants of human p53. These mutants confer a particular phenotype and have increased DNA binding affinity, DNA exchange, altered specificity for p53 responsive elements, increased stability, tetrameric form of p53. The effects may be exerted through shifts and even stronger or yet unspecified protein-protein interactions.

【００２３】 これらの突然変異体には、ヒトｐ５３の毒性の毒性突然変異体が含まれる。「
毒性」とは、野生型ｐ５３よりも強力な、細胞の増殖阻害を示し、細胞死をもた
らす突然変異したヒトｐ５３を意味する。この毒性突然変異体は、トランス活性
化能（即ち、例えば、本発明の酵母発現系において測定されるように、ｐ５３結
合ドメインを含むプロモーターエレメントへのその突然変異体の結合を介する、
レポーター遺伝子の転写を誘導する能力）を有するまたは有することなく、強力
な増殖阻害を示す、または細胞死をもたらし得る。細胞死はアポトーシス、アポ
トーシスに関与する遺伝子の転写、ネクローシスをもたらす可能性のある遺伝子
の不適切な転写、または細胞死の他のメカニズム、あるいはＤＮＡの損傷によっ
て起こり得る。[0023] These mutants include toxic mutants of human p53 that are toxic. "
By "toxic" is meant mutated human p53 that exhibits stronger cell growth inhibition than wild-type p53 and results in cell death. This virulent mutant is capable of transactivating (ie, via binding of the mutant to a promoter element containing a p53 binding domain, eg, as measured in the yeast expression system of the invention,
With or without the ability to induce transcription of a reporter gene, it may exhibit strong growth inhibition or lead to cell death. Cell death can occur through apoptosis, transcription of genes involved in apoptosis, improper transcription of genes that can lead to necrosis, or other mechanisms of cell death, or DNA damage.

【００２４】 本明細書において使用される「アポトーシス」は、病理学的な細胞死またはネ
クローシスとは異なった独特の形態的・構造的特徴を有する、プログラムされた
細胞死を意味する。アポトーシスの過程は、アポト−シス小体（apoptotic body
）の形成につながる核の断片化（fragmentation）と細胞質出芽によって特徴付
けられる。これらのアポトーシス小体は、近傍のマクロファージによって貪食さ
れ破壊される。細胞の断片化は、細胞内容物の放出にはつながらず、また、アポ
トーシス小体の貪食は炎症にはつながらない。その結果として、細胞死は、隣接
する細胞または組織に対する損傷を伴うことなく起り得る。As used herein, “apoptosis” refers to programmed cell death, which has distinctive morphological and structural characteristics distinct from pathological cell death or necrosis. The process of apoptosis is apoptotic body
) Is characterized by nuclear fragmentation and cytoplasmic sprouting. These apoptotic bodies are phagocytosed and destroyed by neighboring macrophages. Cell fragmentation does not lead to the release of cell contents, and phagocytosis of apoptotic bodies does not lead to inflammation. As a result, cell death can occur without damage to adjacent cells or tissues.

【００２５】 本発明によって同定された突然変異体のさらなるクラスは、スーパートランス
活性化突然変異体またはスーパートランス活性化因子である。「スーパートラン
ス活性化（超トランス活性化）」または「スーパートランス活性化因子」は、野
生型ｐ５３と比較して、増加した転写活性化を有するｐ５３突然変異体を意味す
る。これらのスーパートランス活性化突然変異体によって、細胞において野生型
ｐ５３と比べてより強力な増殖阻害をもたらし、細胞死にもつながり得る。した
がって、いくつかのスーパートランス活性化突然変異体は毒性変異体でもある。A further class of mutants identified according to the present invention are supertransactivating mutants or factors. By "supertransactivation (supertransactivation)" or "supertransactivator" is meant a p53 mutant with increased transcriptional activation as compared to wild-type p53. These supertrans-activating mutants lead to more potent growth inhibition in cells as compared to wild-type p53 and may also lead to cell death. Therefore, some supertrans-activating mutants are also toxic mutants.

【００２６】 スーパートランス活性化因子の活性は、スーパートランス活性化因子タンパク
質発現のレベルにおける変化ならびにスーパートランス活性化因子との相互作用
に対して存在する応答性エレメントの種類といった、ある特定の条件下で調節す
ることができる。この活性の例を表７に示す。ここには、いくつかのスーパート
ランス活性化因子が、発現のレベルおよび／または応答性エレメントに対する選
択性に依存して変化したレベルの活性を有することが示されている。The activity of supertransactivator is determined under certain conditions, such as changes in the level of supertransactivator protein expression as well as the types of responsive elements present for interaction with supertransactivator. Can be adjusted with. An example of this activity is shown in Table 7. It is shown here that some supertransactivators have altered levels of activity depending on the level of expression and / or the selectivity for responsive elements.

【００２７】 スーパートランス活性化突然変異体は、一般的な腫瘍突然変異体が示すドミナ
ントネガティブ効果に対して優性である。即ち、野生型ｐ５３に対して、一般的
な腫瘍突然変異体が示すトランス活性化に対するドミナントネガティブ効果を、
スーパートランス活性化突然変異が打ち勝つ。「ドミナントネガティブ」とは、
野生型ｐ５３および突然変異体ｐ５３の両方の存在下で、ｐ５３突然変異体によ
って生じる表現型が観察されることを意味する。Supertrans-activating mutants dominate the dominant negative effects exhibited by common tumor mutants. That is, the dominant negative effect on transactivation exhibited by general tumor mutants against wild-type p53 is
Super trans-activating mutations overcome. What is "dominant negative"?
This means that in the presence of both wild-type p53 and mutant p53, the phenotype produced by the p53 mutant is observed.

【００２８】 本発明はさらに、ｔｏｘ−サプレッサー突然変異体を提供する。「ｔｏｘ−サ
プレッサー」は、ｐ５３における毒性突然変異によって生じた細胞の毒性の表現
型を抑制することが可能な、ｐ５３における突然変異を意味する。「抑制する」
は、毒性ｐ５３突然変異の作用の減少から、毒性作用がもはや現れない毒性表現
型の完全な逆転までの、作用の範囲を意味する。ｔｏｘ−サプレッサー突然変異
は、細胞に対するその毒性突然変異体の作用の抑制につながる、毒性ｐ５３にお
ける第２の突然変異または別のｐ５３における突然変異であり得る。例えば、毒
性ｐ５３が、細胞に投与したときに細胞死をもたらすと同定された場合、第２の
突然変異をその毒性ｐ５３に導入することができる。その第２の突然変異がその
毒性ｐ５３突然変異体の作用を抑制するならば、細胞の増殖が観察され、毒性突
然変異の作用、即ち、強力な増殖阻害または細胞死、が抑制される。The present invention further provides tox-suppressor mutants. By "tox-suppressor" is meant a mutation in p53 capable of suppressing the virulent phenotype of cells caused by a toxic mutation in p53. "Suppress"
Means the range of effects from the reduction of the effects of toxic p53 mutations to the complete reversal of the toxic phenotype at which toxic effects are no longer apparent. The tox-suppressor mutation can be a second mutation in virulent p53 or another mutation in p53 that leads to suppression of the action of the virulent mutant on cells. For example, if a toxic p53 is identified that results in cell death when administered to a cell, a second mutation can be introduced into that toxic p53. If the second mutation suppresses the action of the toxic p53 mutant, cell proliferation is observed and the action of the toxic mutation, ie strong growth inhibition or cell death, is suppressed.

【００２９】 他の突然変異体には、野生型ｐ５３と類似した転写能を保持しているｐ５３突
然変異体、およびトランス活性化することができない、即ち、ｐ５３ＤＮＡ結合
エレメントに結合して遺伝子、例えば酵母発現アッセイにおけるレポーター遺伝
子、の転写を誘導することができないｐ５３突然変異体であるｐ５３のトランス
−マイナス突然変異、が含まれる。Other mutants include p53 mutants that retain a transcriptional capacity similar to wild-type p53, and are unable to transactivate, ie, bind to a p53 DNA binding element, such as a gene, eg Included is a trans-minus mutation in p53, a p53 mutant that is unable to induce transcription of a reporter gene in a yeast expression assay.

【００３０】 本願のｐ５３突然変異体は、ｐ５３の構造と機能との間の関連性を取り扱う機
会を提供する。例えば、いくつかのＬ１ループの突然変異は、転写活性の喪失、
スーパートランス活性（super-trans）、毒性および既知の突然変異の抑制を含
む、特定の異なる活性を有する。これらのｐ５３突然変異体もまた、機能性ドメ
インや相互作用を解析するのに有用である。例えば、super-transまたは毒性突
然変異体は、第２の突然変異の存在によって改変することができる。例えば同じ
遺伝子における切取り（truncation）など。さらに、ＤＮＡ結合ドメインの異な
る領域における、または四量体化ドメインにおける、毒性またはスーパートラン
ス活性化突然変異を組み合わせて更なる活性な変異体を得ることができる。The p53 mutants of the present application provide the opportunity to address the link between p53 structure and function. For example, some L1 loop mutations result in loss of transcriptional activity,
It has certain different activities, including super-trans activity, toxicity and suppression of known mutations. These p53 mutants are also useful for analyzing functional domains and interactions. For example, a super-trans or virulent mutant can be modified by the presence of a second mutation. For example, truncation in the same gene. In addition, virulent or supertransactivating mutations in different regions of the DNA binding domain or in the tetramerization domain can be combined to yield additional active variants.

【００３１】 本願の突然変異体は優性を試験する機会を提供する。本発明は、突然変異体の
発現レベルを変えることによって、優性のレベルを調べることができることを示
す。これを遺伝子間抑制（intragenic suppression）について行った。本発明は
さらに、遺伝子間抑制（intergenic suppression）の優性も示すが、これは１つ
の発現レベルでのみ行った。変化した優性レベルを有する突然変異体が突然変異
体の可変発現（variable expression）を用いて明らかになった。さらに、突然
変異体は、ヒト組織由来のｐ５３突然変異体を調べるために用いることもできる
。例えば、同定された突然変異（スーパートランス活性化または毒性）の１つと
、ヒト組織に由来する可能性のある突然変異を含む、キメラを作製することがで
きる（組換えを伴う形質転換によって）。このように、天然に存在する突然変異
を、同定された突然変異を逆転または修飾する能力について試験（またはスクリ
ーニング）することができる。この遺伝子間抑制／優性スクリーニングは、ｐ５
３癌突然変異を調べるための重要なツールを提供する。The mutants of the present application provide the opportunity to test for dominance. The present invention shows that by varying the expression level of mutants, the level of dominance can be investigated. This was done for intragenic suppression. The present invention also shows the predominance of intergenic suppression, which was done at only one expression level. Mutants with altered dominant levels were revealed using the variable expression of the mutants. In addition, the mutants can also be used to investigate p53 mutants from human tissues. For example, a chimera can be created (by transformation with recombination) that contains one of the identified mutations (supertransactivation or virulence) and a mutation that may be derived from human tissue. In this way, naturally occurring mutations can be tested (or screened) for the ability to reverse or modify the identified mutations. This intergenic suppression / dominance screen is based on p5
3 Provides important tools for investigating cancer mutations.

【００３２】 本願の突然変異体は、同じタイプのさらに強力な突然変異体を作製するために
使用することもできる。ある突然変異体が同定されれば、次に、最初の突然変異
の影響力さらに増大させることができる、第２の部位での突然変異を生じさせる
ことが考えられる。例えば、スーパートランス活性化突然変異は、１個の突然変
異のスーパートランス突然変異体よりもさらに低い転写のレベルでもそれを検出
することが可能な、第２の突然変異によってさらに増大させることができ、スー
パー−スーパートランス活性化突然変異体を得ることができる。同様に、増殖を
阻害する毒性変異体にさらに突然変異を施して致死的な突然変異体を作製するこ
とができる、またはより低い発現レベルで致死性をもたらすことができる。The mutants of the present application can also be used to make more potent mutants of the same type. Once a mutant is identified, it is then conceivable to generate a mutation at the second site that can further increase the impact of the first mutation. For example, the supertrans-activating mutation can be further augmented by a second mutation, which allows it to be detected at even lower levels of transcription than the supertrans mutant of one mutation. , Super-supertrans-activating mutants can be obtained. Similarly, virulent mutants that inhibit growth can be further mutated to create lethal mutants, or lethal effects can be achieved at lower expression levels.

【００３３】 本願の突然変異体はさらに、恐らくは、毒性作用を消す、毒性作用をもたらす
、またはスーパートランス活性化作用をもたらすもしくは消す、といった、ｐ５
３の野生型または突然変異体と化学物質または薬物との相互作用を試験する機会
を提供する。The mutants of the present application may further p5, possibly abolishing toxic effects, producing toxic effects, or producing or eliminating supertrans-activating effects.
It provides an opportunity to test the interaction of 3 wild-type or mutants with chemicals or drugs.

【００３４】 具体的には、本発明はヒトｐ５３の突然変異体ポリペプチドを提供する。これ
らのポリペプチドは、大きさが、ヒトｐ５３の１０アミノ酸の長さから完全長ま
での範囲であり得る。特に、本発明は、突然変異Ｖ１２２Ａを含むヒトｐ５３の
１１７〜１２７番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｃ２７７Ｗを
含むヒトｐ５３の２７２〜２８２番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然
変異Ａ７６Ｔを含むヒトｐ５３の７０〜８０番の残基を含む単離されたポリペプ
チド、突然変異Ｃ２７７Ｒを含むヒトｐ５３の２７２〜２８２番の残基を含む単
離されたポリペプチド、突然変異Ｔ１５０Ａを含むヒトｐ５３の１４５〜１５５
番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｓ１２１Ｃを含むヒトｐ５３
の１１５〜１２５番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｃ１２４Ｙ
を含むヒトｐ５３の１２０〜１３０番の残基を含む単離されたポリペプチド、突
然変異Ｃ１２４Ｆを含むヒトｐ５３の１２０〜１３０番の残基を含む単離された
ポリペプチド、突然変異Ｎ２８８Ｋを含むヒトｐ５３の２８３〜２９３番の残基
を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｆ３３８Ｌを含むヒトｐ５３の３３３
〜３４３番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｔ１２３Ｓを含むヒ
トｐ５３の１１８〜１２８番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｅ
１９８Ｖを含むヒトｐ５３の１９３〜２０３番の残基を含む単離されたポリペプ
チド、突然変異Ｈ１１５Ｒを含むヒトｐ５３の１１０〜１２０番の残基を含む単
離されたポリペプチド、突然変異Ａ７６Ｔおよび突然変異Ｖ１２２Ａを含むヒト
ｐ５３の５０〜１５０番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｗ９１
Ｃ、突然変異Ｃ１２４Ｒ、突然変異Ｑ１３６Ｋおよび突然変異Ｔ１５０Ａを含む
ヒトｐ５３の５０〜２００番の残基を含む単離されたポリペプチド、突然変異Ｃ
１２４Ｒ、突然変異Ｑ１３６Ｋおよび突然変異Ｔ１５０Ａを含むヒトｐ５３の１
００〜２００番の残基を含む単離されたポリペプチドを提供する。本発明のｐ５
３突然変異体ポリペプチドを定義するために本発明において用いた座標は、公開
されたヒトｐ５３の配列(Zakut-Houri R., Bienz-Tadmor B., Givol D., Oren M
. 1985.“Human p53 cellular tumor antigen: cDNA sequence and expression
in COS cells” EMBO J. 4: 1251-1255)に基づいている。このZakut-Houriらの
参考文献は、その全内容が本明細書の一部を構成する。In particular, the present invention provides mutant polypeptides of human p53. These polypeptides can range in size from the 10 amino acid length of human p53 to full length. In particular, the present invention provides an isolated polypeptide comprising residues 117-127 of human p53 containing the mutation V122A, an isolated polypeptide comprising residues 272-282 of human p53 containing the mutation C277W. Polypeptide, isolated polypeptide containing residues 70-80 of human p53 containing the mutation A76T, isolated polypeptide containing residues 272-282 of human p53 containing the mutation C277R 145-155 of human p53 containing the peptide, mutation T150A
Polypeptide containing the residue No., human p53 containing the mutation S121C
Isolated polypeptide comprising residues 115-125 of C12Y, mutation C124Y
An isolated polypeptide comprising residues 120-130 of human p53, comprising an isolated polypeptide comprising residues 120-130 of human p53 comprising a mutation C124F, comprising a mutation N288K. An isolated polypeptide containing residues 283 to 293 of human p53, 333 of human p53 containing mutation F338L
~ An isolated polypeptide comprising residues 343, an isolated polypeptide comprising residues 118-128 of human p53 containing the mutation T123S, mutation E
An isolated polypeptide comprising residues 193 to 203 of human p53 containing 198V, an isolated polypeptide comprising residues 110 to 120 of human p53 containing mutation H115R, a mutation A76T and An isolated polypeptide comprising residues 50-150 of human p53 containing mutation V122A, mutation W91
An isolated polypeptide comprising residues 50-200 of human p53, including C, mutation C124R, mutation Q136K and mutation T150A, mutation C
1 of human p53 containing 124R, mutation Q136K and mutation T150A
An isolated polypeptide comprising residues 00-200 is provided. P5 of the present invention
The coordinates used in the present invention to define the 3 mutant polypeptides are based on the published sequence of human p53 (Zakut-Houri R., Bienz-Tadmor B., Givol D., Oren M.
1985. “Human p53 cellular tumor antigen: cDNA sequence and expression
in COS cells ”EMBO J. 4: 1251-1255). This Zakut-Houri et al. reference is hereby incorporated by reference in its entirety.

【００３５】 本発明のポリペプチドに関して、本明細書において用いられる「単離された」
および／または「精製された」は、自然界においてそのポリペプチドが通常それ
を伴っている天然に存在する物質を、実質的に含まないポリペプチドを意味する
。また、本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、核酸によってコード
されるアミノ酸に対応したアミノ酸から構成される分子を意味する。本発明のポ
リペプチドは、突然変異体のヒトｐ５３タンパク質の全長アミノ酸配列または少
なくとも５アミノ酸の長さのその断片からなる。本発明のポリペプチドまたはそ
の断片は、それが自然に得られる細胞からそのポリペプチドを単離または精製す
ることによって得るか、またはその突然変異体のヒトｐ５３ポリペプチドをコー
ドする外来の核酸の発現によって得ることができる。“Isolated” as used herein with respect to the polypeptides of the present invention
And / or "purified" means a polypeptide that is substantially free of naturally occurring substances with which it is normally associated in nature. Further, as used herein, "polypeptide" means a molecule composed of amino acids corresponding to the amino acids encoded by nucleic acids. The polypeptides of the present invention consist of the full-length amino acid sequence of a mutant human p53 protein or a fragment thereof at least 5 amino acids in length. The polypeptide of the present invention or a fragment thereof is obtained by isolating or purifying the polypeptide from cells from which it is naturally obtained, or expressing a foreign nucleic acid encoding a mutant human p53 polypeptide thereof. Can be obtained by

【００３６】 これらのポリペプチドは、当分野においてよく知られた数多くの手法のいずれ
かにおいて得ることもできる。ポリペプチドを製造する１つの方法は、２つのペ
プチドまたはポリペプチドを、タンパク質化学の技術によってつなぎ合わせるこ
とである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
）化学のいずれかを用い、現在入手可能な実験装置を使用して化学的に合成する
ことができる(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)。当業者は、具体
的なタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを標準的な化学反応によ
って合成することができるということを容易に予想することができる。例えば、
あるペプチドまたはポリペプチドは、合成してもその合成用樹脂から切断しない
が、ハイブリッドしたペプチドの他の断片は合成した後に、次いでその樹脂から
切断し、それにより他の断片において官能基でブロックされた末端の基を露出さ
せる。ペプチド縮合反応によって、これら２つの断片を、それぞれ、それらのカ
ルボニルとアミノ末端でペプチド結合により共有結合で連結し、より大きなポリ
ペプチドを形成する (Grant, ASynthetic Peptides: A User Guide, W. H. Free
man and Co., N. Y. (1992) および Bodansky and Trost, Ed., APrinciples of
Peptide Synthesis, Springer-Verlag Inc., N. Y. (1993))。あるいは、ペプ
チドまたはポリペプチドを、上記のようにしてインビボで別個に合成することが
できる。単離したら、これらの個々のペプチドまたはポリペプチドを、同様のペ
プチド縮合反応により、連結し、大きなタンパク質を形成することができる。These polypeptides can also be obtained in any of the numerous ways well known in the art. One method of producing a polypeptide is to join two peptides or polypeptides together by protein chemistry techniques. For example, peptides or polypeptides are chemically synthesized using either Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) or Boc (tert-butyloxycarbonyl) chemistry using currently available laboratory equipment. (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). One of ordinary skill in the art can readily expect that peptides or polypeptides corresponding to a particular protein can be synthesized by standard chemistry. For example,
A peptide or polypeptide does not cleave from its synthetic resin upon synthesis, but other fragments of the hybridized peptide are synthesized and then cleaved from the resin, thereby blocking the functional group in the other fragment. Expose the end groups. These two fragments are covalently linked by a peptide bond at their carbonyl and amino termini, respectively, to form a larger polypeptide by a peptide condensation reaction (Grant, ASynthetic Peptides: A User Guide, WH Free.
man and Co., NY (1992) and Bodansky and Trost, Ed., APrinciples of
Peptide Synthesis, Springer-Verlag Inc., NY (1993)). Alternatively, the peptides or polypeptides can be separately synthesized in vivo as described above. Once isolated, these individual peptides or polypeptides can be joined by similar peptide condensation reactions to form large proteins.

【００３７】 例えば、クローニングまたは合成されたペプチド断片の酵素的なライゲーショ
ンによって、比較的短いペプチド断片を連結して大きなペプチド断片、ポリペプ
チドまたはタンパク質ドメイン全体を製造することが可能である(Abrahmsen et
al. Biochemistry, 30: 4151 (1991))。あるいは、合成したペプチドの本来の化
学的ライゲーションを利用して、大きなペプチドまたはポリペプチドを短いペプ
チド断片から合成的に構築することができる。この方法は２工程の化学反応から
なる(Dawson et al. A Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,
Science, 266 : 776-779 (1994))。最初の工程は、保護されていない合成ペプチ
ド−％−チオエステルと、アミノ末端のＣｙｓ残基を含む別の保護されていない
ペプチド断片との化学選択的（chemoselective）な反応であり、チオエステル結
合した中間体を最初の共有結合生成物として得る。反応条件を変えることなく、
この中間体は、自発的で急速な分子内反応を受けて、天然のペプチド結合をその
ライゲーション部位に形成する。この天然の化学的ライゲーション法のタンパク
質分子の全合成への応用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製によっ
て説明されている(Clark-Lewis et al. FEBS Lett., 307: 97 (1987), Clark-Le
wis et al., J. Biol. Chem., 269: 16075 (1994), Clark-Lewis et al. Bioche
mistry, 30: 3128 (1991), およびRajarathnam et al. Biochemistry, 29: 1689
(1994))。Relatively short peptide fragments can be joined to produce large peptide fragments, polypeptide or whole protein domains, for example by enzymatic ligation of cloned or synthesized peptide fragments (Abrahmsen et al.
al. Biochemistry, 30: 4151 (1991)). Alternatively, large peptides or polypeptides can be synthetically constructed from short peptide fragments utilizing the natural chemical ligation of the synthesized peptides. This method consists of a two-step chemical reaction (Dawson et al. A Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,
Science, 266: 776-779 (1994)). The first step is a chemoselective reaction of an unprotected synthetic peptide-%-thioester with another unprotected peptide fragment containing the amino-terminal Cys residue, a thioester-linked intermediate. The body is obtained as the first covalent product. Without changing the reaction conditions
This intermediate undergoes a spontaneous and rapid intramolecular reaction to form the natural peptide bond at its ligation site. The application of this natural chemical ligation method to the total synthesis of protein molecules has been explained by the preparation of human interleukin 8 (IL-8) (Clark-Lewis et al. FEBS Lett., 307: 97 (1987). ), Clark-Le
wis et al., J. Biol. Chem., 269: 16075 (1994), Clark-Lewis et al. Bioche
mistry, 30: 3128 (1991), and Rajarathnam et al. Biochemistry, 29: 1689.
(1994)).

【００３８】 別法として、保護されていないペプチド断片を化学的に連結することができ、
この場合、化学的ライゲーションの結果としてペプチド断片間で形成したその結
合は非天然（非ペプチド）の結合である(Schnolzer et al. Science, 256: 221
(1992))。この方法は、完全な生物学的な活性を有するタンパク質ドメインのア
ナログならびに大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられてきた
(deLisle Milton et al. Techniques in Protein Chemistry IV, Academic Pre
ss, New York, pp. 257-267 (1992))。Alternatively, the unprotected peptide fragment can be chemically linked,
In this case, the bond formed between the peptide fragments as a result of chemical ligation is a non-natural (non-peptide) bond (Schnolzer et al. Science, 256: 221).
(1992)). This method has been used to synthesize protein domain analogs with full biological activity as well as large quantities of relatively pure proteins.
(deLisle Milton et al. Techniques in Protein Chemistry IV, Academic Pre
ss, New York, pp. 257-267 (1992)).

【００３９】 突然変異ヒトｐ５３ポリペプチドを、ペプチドの標準的な化学合成方法によっ
て、ポリペプチドのタンパク質加水分解による切断によって、および目的の部分
をコードした核酸からの合成によって得ることができる。例えば、ヒトｐ５３ポ
リペプチドのフラグメントは、突然変異Ｖ１２２Ａを含有する１１７〜１２７残
基を含むアミノ酸配列を含むことができる。同様に、目的の突然変異体を含む突
然変異ヒトｐ５３ポリペプチドの他のフラグメントを得ることができる。該ポリ
ペプチドは、天然に存在するアミノ酸を同様な性質を有するアミノ酸によって置
き換える保存的な置換を含むことができる。Mutant human p53 polypeptides can be obtained by standard methods of chemical synthesis of peptides, by proteolytic cleavage of the polypeptide, and by synthesis from nucleic acid encoding the moiety of interest. For example, a fragment of human p53 polypeptide can include an amino acid sequence that includes residues 117-127 containing the mutation V122A. Similarly, other fragments of mutant human p53 polypeptides, including mutants of interest, can be obtained. The polypeptide can include conservative substitutions that replace naturally occurring amino acids with amino acids of similar properties.

【００４０】 従って、望む改変および変化を本発明の突然変異ｐ５３ポリペプチドの核酸お
よび／またはアミノ酸配列中で行なうことができて、更に同様のまたはそれ以外
の望む性質を有するタンパク質を得る。それらの変化を天然の単離物中で生じさ
せたり、または部位特異的突然変異誘発を用いて合成的に導入することができる
ので、そのための方法（例えば、ミスマッチ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
）は当該分野でよく知られている。Accordingly, the desired modifications and alterations can be made in the nucleic acid and / or amino acid sequences of the mutant p53 polypeptides of the invention, yet yield proteins with similar or other desired properties. Since those changes can be made in natural isolates or can be introduced synthetically using site-directed mutagenesis, methods therefor (eg, mismatch-polymerase chain reaction (PCR)).
) Is well known in the art.

【００４１】 例えば、機能的活性を相当に失わずに、特定のアミノ酸を突然変異ヒトｐ５３
ポリペプチド中の他のアミノ酸で置換することができる。それはタンパク質の生
物学的な機能的活性を決めるタンパク質の相互作用能力および性質であるので、
特定のアミノ酸配列の置換を突然変異ヒトｐ５３アミノ酸配列（または、当然の
ことながら、基礎となる核酸配列）中で行なうことができ、それにもかかわらず
、同様の性質を有する突然変異ヒトｐ５３ポリペプチドを得ることができる。従
って、生物学的な有用性もしくは活性を相当に失わず、かつできるだけそれらの
有用性および活性を増大させて、突然変異ヒトｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配
列（または、基礎となる核酸配列）中で様々な変化を行なうことができることを
企図する。For example, specific amino acids are mutated in human p53 without appreciable loss of functional activity.
Other amino acids in the polypeptide can be substituted. Because it is the protein's interactive capacity and properties that determine the biological functional activity of the protein,
A specific amino acid sequence substitution can be made in the mutant human p53 amino acid sequence (or, of course, the underlying nucleic acid sequence), nevertheless, a mutant human p53 polypeptide having similar properties. Can be obtained. Thus, there is no significant loss of biological utility or activity, and as much as possible increase in their utility and activity, in the amino acid sequence (or underlying nucleic acid sequence) of the mutant human p53 polypeptide. It is contemplated that various changes can be made.

【００４２】 本明細書では、本明細書で提供し、企図するポリペプチドに選択的にまたは特
異的に結合する純粋な抗体を提供する。該抗体（ポリクリーナル抗体またはモノ
クローナル抗体）を本明細書で提供し、企図するいずれかのポリペプチドに産生
することができる。該ポリペプチドは共に、天然に存在したり、組換えのポリペ
プチドおよびそれらの免疫原性フラグメントである。該抗体を診断学、処置また
は予防接種などの技術または方法において使用することができる。Provided herein is a pure antibody that selectively or specifically binds to a polypeptide provided herein. The antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) can be provided herein and raised against any contemplated polypeptide. The polypeptides are both naturally occurring or recombinant polypeptides and immunogenic fragments thereof. The antibody can be used in techniques or methods such as diagnostics, treatment or vaccination.

【００４３】 ｐ５３をコードした核酸 本発明は更に、突然変異ヒトｐ５３ポリペプチドをコードした核酸を提供する
。本明細書で使用する用語「核酸」とは、１本鎖または複数鎖の分子を意味し、
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのいずれかの組み合わせ（それは、それら
核酸ヘの改変物を含む）を意味する。核酸は、コード鎖もしくはその補体、また
はそれらのいずれかの組み合わせを意味し得る。核酸は本明細書において記載す
る新規な遺伝子のいずれかについて天然に存在する配列（現在の変異コドンを除
く）と配列の点で同一であったり、または天然に存在する配列中に見られるアミ
ノ酸と同一のアミノ酸（非変異アミノ酸として）をコードした別のコドンを含む
ことができる。これらの核酸を、それぞれの典型的な構造から改変することもで
きる。それらの改変としては、例えばメチル化した核酸、硫黄（この場合には、
モノチオリン酸（phosphothionate）デオキシヌクレオチドを与える）、セレン
（この場合には、セレノリン酸（phosphoselenoate）デオキシヌクレオチドを与
える）またはメチル基（この場合には、リン酸メチル（methylphosponate）デオ
キシヌクレオチドを与える）のいずれかを用いた、リン酸残基上での非架橋の酸
素の置換を含むが、これらに限定しない。Nucleic Acid Encoding p53 The invention further provides a nucleic acid encoding a mutant human p53 polypeptide. The term "nucleic acid" as used herein means a single-stranded or multi-stranded molecule,
It means DNA or RNA, or any combination thereof, including modifications to these nucleic acids. Nucleic acid may mean the coding strand or its complement, or any combination thereof. The nucleic acid is identical in sequence to a naturally occurring sequence (excluding the current mutated codons) for any of the novel genes described herein, or with an amino acid found in the naturally occurring sequence. Another codon can be included that encodes the same amino acid (as a non-mutated amino acid). These nucleic acids can also be modified from their typical structure. These modifications include, for example, methylated nucleic acid, sulfur (in this case,
Either monothiophosphoric acid (providing phosphothionate deoxynucleotides), selenium (in this case giving selosenophosphate deoxynucleotides) or methyl group (in this case giving methylphosponate deoxynucleotides) Including but not limited to the substitution of non-bridging oxygen on the phosphate residue with or.

【００４４】 同様に、本明細書に開示し、企図する核酸および該核酸のフラグメントを含む
化合物をも提供することを、当該分野の当業者は認めるであろう。例えば、核酸
を含む化合物は、典型的な核酸の誘導体（例えば、末端もしくは内部のレポータ
ー分子および／または非典型的な塩基もしくは糖を含有する核酸を含むように改
変された核酸）であり得る。これらのレポーター分子としては、例えば同位体お
よび非同位体のレポーター分子を含むが、これらに限定しない。従って、欠損、
増幅、複製、発現、精製、取り込みなどを助けることができるいずれの分子を核
酸構築物に加えることができる。Similarly, one of ordinary skill in the art will recognize that there are also provided compounds disclosed herein, including the contemplated nucleic acids and fragments of such nucleic acids. For example, a compound containing a nucleic acid can be a derivative of a typical nucleic acid, such as a nucleic acid modified to include a terminal or internal reporter molecule and / or a nucleic acid containing an atypical base or sugar. These reporter molecules include, but are not limited to, isotopic and non-isotopic reporter molecules, for example. Therefore, the defect,
Any molecule that can aid in amplification, replication, expression, purification, uptake, etc. can be added to the nucleic acid construct.

【００４５】 目的のあるタンパク質をコードした核酸、または該核酸の領域を構築し、改変
し、または単離した後に、次いで該核酸を適当なベクター（これは、野生型およ
び／または改変したタンパク質のインビボまたはインビトロ合成を指向すること
ができる）中でクローニングすることができる。該ベクターは、挿入した遺伝子
または核酸の転写を指向して、調節する必要な機能的要素を有すると企図する。
これらの機能的要素としては、例えばプロモーター、プロモーターの上流もしく
は下流領域（例えば、プロモーターの転写活性を調節することができるエンハン
サー）、複製起点、該プロモーターに近接するインサートのクローニングを容易
にするための適当な制限部位、抗生物質耐性遺伝子または他のマーカー（これは
、ベクターを含有する細胞を選別するように機能することができる）、またはイ
ンサート、ＲＮＡスプライス接合部、転写終結領域を含有するベクター、または
インサート遺伝子もしくはハイブリッド遺伝子の発現を容易にするように機能し
得るいずれかの他の領域を含むが、これらに限定しない（一般的には、Sambrook
らを参照）。After constructing, modifying, or isolating the nucleic acid encoding the protein of interest, or a region of the nucleic acid, the nucleic acid is then transformed into a suitable vector (which may be of the wild-type and / or modified protein). (Which can be directed to in vivo or in vitro synthesis). It is contemplated that the vector has the necessary functional elements to direct and regulate the transcription of the inserted gene or nucleic acid.
These functional elements include, for example, a promoter, a region upstream or downstream of the promoter (for example, an enhancer capable of regulating the transcriptional activity of the promoter), an origin of replication, and a clone for facilitating cloning of an insert adjacent to the promoter. A vector containing suitable restriction sites, antibiotic resistance genes or other markers (which can function to sort cells containing the vector), or inserts, RNA splice junctions, transcription termination regions, Or any other region capable of functioning to facilitate expression of the insert gene or hybrid gene, but is not limited thereto (generally Sambrook
See also).

【００４６】 核酸インサートの発現に有用な当該分野の当業者にとって知られる多数のＥ．
Ｃｏｌｉ（大腸菌）発現ベクターが存在する。使用に適当な他の微生物宿主とし
ては、桿菌（例えば、枯草菌）および他の腸内細菌（例えば、サルモネラ菌、セ
ラチア菌および多数のシュードモナス種）を含む。これらの原核生物宿主中では
、宿主細胞と適合し得る発現コントロール配列（例えば、複製起点）を典型的に
含む発現ベクターを製造することもできる。加えて、多数の様々なよく知られて
いるプロモーターのいずれかが存在しており、例えばラクトースプロモーター系
、トリプトファン（ＴＰ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系ま
たは他のプロモーター（例えば、λファージ由来）を挙げられる。それらのプロ
モーターは典型的に発現を制御し（場合によりオペレーター配列と一緒に）、そ
して例えば転写および翻訳を開始し、完結するためにリボソームとの結合部位配
列を有するであろう。必要ならば、アミノ末端メチオニンを、Ｍｅｔコドン５’
および下流の核酸インサートとのインフレームの挿入によって得ることができる
。該核酸インサートのカルボキシ末端伸張もまた、標準的なオリゴヌクレオチド
突然変異誘発法を用いて除去することができる。A number of E. coli known to those of skill in the art useful for the expression of nucleic acid inserts.
There is a Coli expression vector. Other microbial hosts suitable for use include bacilli (eg Bacillus subtilis) and other enterobacteria (eg Salmonella, Serratia and many Pseudomonas species). In these prokaryotic hosts, it is also possible to produce expression vectors, which typically contain expression control sequences compatible with the host cell (eg, an origin of replication). In addition, any of a number of different well known promoters exist, such as the lactose promoter system, tryptophan (TP) promoter system, β-lactamase promoter system or other promoters (eg, from λ phage). Can be mentioned. Those promoters will typically control expression (optionally with operator sequences) and will have ribosome binding site sequences to initiate and complete transcription and translation, for example. If necessary, add the amino terminal methionine to the Met codon 5 ′.
And by insertion in frame with downstream nucleic acid inserts. The carboxy terminal extension of the nucleic acid insert can also be removed using standard oligonucleotide mutagenesis methods.

【００４７】 加えて、酵母菌の発現を使用することができる。酵母菌の発現システムにはい
くつかの利点が存在する。第１に、酵母菌分泌システムにおいて産生したタンパ
ク質は正確なジスルフィドの対形成を示すという証拠が存在する。第２に、翻訳
後のグリコシル化は、酵母菌分泌システムによって効率的に行なわれる。サッカ
ロミセス・セレビシエ プレプロα因子リーダー領域（これは、ＭＦ−１遺伝子
によってコードされる）は通常、酵母菌からの直接のタンパク質分泌を指向する
のに使用することができる（Brakeらによる「∝−Factor-Directed Synthesis a
nd Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae」、P
roc. Nat. Acad. Sci., 81; 4642-4646 (1984)）。プレプロα−因子のリーダー
領域は、シグナルペプチドおよびプロセグメント（これは、ＫＥＸ２遺伝子によ
ってコードされた酵母菌プロテアーゼに対する認識領域を含む）を含む。この酵
素は、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側上の前駆タ
ンパク質を切断する。核酸コード配列はインフレーム中で、プレプロα因子リー
ダー領域と融合することができる。次いで、この構築物を強い転写プロモーター
（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターおよび解糖プロモーター
）の制御下におく。核酸をコードした配列に対して、翻訳終結コドンが続き、続
いて転写終結シグナルが続く。或いは、核酸をコードした配列を第２のプロテイ
ンをコードした配列（例えば、Ｓｊ２６またはβ−ガラクトシダーゼ）と融合さ
せ、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にす
るために使用することができる。融合タンパク質の成分を分離するために、プロ
テアーゼ切断部位の挿入を、酵母菌中での発現に使用する構築物について適用す
ることができる。効率的な翻訳後のグリコシル化および組換えタンパク質の発現
をまたバキュロウイルスシステム中で達成することができる。In addition, yeast expression can be used. There are several advantages to yeast expression systems. First, there is evidence that the proteins produced in the yeast secretion system show correct disulfide pairing. Second, post-translational glycosylation is efficiently performed by the yeast secretion system. The Saccharomyces cerevisiae prepro alpha factor leader region, which is encoded by the MF-1 gene, can usually be used to direct protein secretion directly from yeast (Brake et al., "∝-Factor"). -Directed Synthesis a
nd Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae 」, P
roc. Nat. Acad. Sci., 81; 4642-4646 (1984)). The leader region of the prepro α-factor contains a signal peptide and a prosegment, which contains the recognition region for the yeast protease encoded by the KEX2 gene. This enzyme cleaves a precursor protein on the carboxyl side of the Lys-Arg dipeptide cleavage signal sequence. The nucleic acid coding sequence may be fused in frame with the prepro alpha factor leader region. This construct is then placed under the control of a strong transcription promoter (eg, alcohol dehydrogenase I promoter and glycolytic promoter). The sequence encoding the nucleic acid is followed by a translation termination codon, followed by a transcription termination signal. Alternatively, the nucleic acid-encoding sequence can be fused to a second protein-encoding sequence (eg, Sj26 or β-galactosidase) and used to facilitate purification of the fusion protein by affinity chromatography. Insertion of a protease cleavage site can be applied to the construct used for expression in yeast to separate the components of the fusion protein. Efficient post-translational glycosylation and recombinant protein expression can also be achieved in the baculovirus system.

【００４８】 哺乳動物の細胞により、重要な翻訳後の改変（例えば、折りたたみおよびシス
テインの対形成）、加えて複雑な炭水化物の付加および活性タンパク質の分泌を
好む環境下でのタンパク質の発現が可能とする。哺乳動物細胞中での活性プロテ
インの発現に有効なベクターは、強いウイルスプロモーターとポリアデニル化シ
グナルとの間のプロテインコード配列の挿入によって特徴づけられる。該ベクタ
ーは、ヒグロマイシン耐性、ゲンタミン耐性、または選択マーカーとしての使用
に適当な他の遺伝子もしくは表現型を与える遺伝子、或いは遺伝子の増幅に対し
て耐性であるメトトレキセートを含む。配列をコードしたキメラタンパク質を、
メトトレキセート耐性をコードベクターを用いてチャイニーズハムスターの卵巣
（ＣＨＯ）セルラインに、或いは適当な選択マーカーを用いて他のセルラインに
導入することができる。形質転換細胞中でのベクターＤＮＡの存在は、サザンブ
ロット分析によって確認することができる。インサートコード配列に対応するＲ
ＮＡの産生はノーザンブロット分析によって確認することができる。無傷のヒト
プロテインを分泌することができる多数の適当な宿主セルラインが当該分野にお
いて開発されており、これらとしては例えば、ＣＨＯセルライン、ヒーラ細胞、
ミエローマセルライン、ジャーカット細胞などを含む。これらの細胞についての
発現ベクターとしては、発現コントロール配列（例えば、複製起点、プロモータ
ー、エンハンサー）、および必要な情報プロセシング部位（例えば、ＲＮＡスプ
ライシング部位、ポリアデニル化部位））、および転写終結配列を含むことがで
きる。好ましい発現コントロール配列としては、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４
０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターを挙
げられる。目的の核酸セグメントを含有するベクターを、よく知られている方法
（これは、細胞宿主の種類によって変わる）によって宿主に転移することができ
る。例えば、塩化カルシウム形質転換法は通常、原核生物細胞についても用いら
れ、一方でリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはトランスフェクショ
ンまたはエレクトロポレーションを媒介するリポフェクチンは、他の細胞宿主に
ついて使用することができる。Mammalian cells allow for significant post-translational modifications (eg, folding and cysteine pairing), as well as expression of proteins in environments that favor the addition of complex carbohydrates and the secretion of active proteins. To do. Vectors effective for expression of active proteins in mammalian cells are characterized by the insertion of a protein coding sequence between the strong viral promoter and the polyadenylation signal. The vector comprises a gene conferring hygromycin resistance, gentamine resistance, or other genes or phenotypes suitable for use as a selectable marker, or methotrexate resistant to amplification of the gene. The chimeric protein encoding the sequence,
Methotrexate resistance can be introduced into the Chinese hamster ovary (CHO) cell line using a coding vector or into other cell lines using an appropriate selectable marker. The presence of vector DNA in transformed cells can be confirmed by Southern blot analysis. R corresponding to the insert coding sequence
The production of NA can be confirmed by Northern blot analysis. A number of suitable host cell lines capable of secreting intact human proteins have been developed in the art, including, for example, CHO cell lines, HeLa cells,
Includes myeloma cell lines, Jurkat cells, etc. Expression vectors for these cells should include expression control sequences (eg, origins of replication, promoters, enhancers), and necessary information processing sites (eg, RNA splicing sites, polyadenylation sites), and transcription termination sequences. You can Preferred expression control sequences include immunoglobulin gene, SV4
0, promoters derived from adenovirus, bovine papilloma virus and the like. The vector containing the nucleic acid segment of interest can be transferred into the host by well-known methods, which depend on the type of cell host. For example, the calcium chloride transformation method is also commonly used for prokaryotic cells, while calcium phosphate, DEAE dextran or lipofectin which mediates transfection or electroporation can be used for other cell hosts.

【００４９】 哺乳動物中での遺伝子または核酸の発現についての別のベクター（これらは、
ヒトγインターフェロン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、凝固因子ＶＩ
ＩＩ、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸球性主要
塩基性プロテイン）を使用することができる。更に、該ベクターとしては、哺乳
動物の細胞（例えば、ＣＯＳ−７）中での挿入された核酸の発現に適当なＣＭＶ
プロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを含むことができる。Alternative vectors for expression of genes or nucleic acids in mammals (these are
Human γ interferon, tissue plasminogen activator, coagulation factor VI
II, hepatitis B virus antigen, protease Nexinl, and eosinophilic major basic protein) can be used. Further, the vector may be a CMV suitable for expression of the inserted nucleic acid in mammalian cells (eg COS-7).
A promoter sequence and a polyadenylation signal can be included.

【００５０】 昆虫細胞をも、哺乳動物のプロテインの発現を可能とする。バキュロウイルス
ベクターを用いて昆虫細胞中で産生された組換えプロテインを、野生型プロテイ
ンと場合と同様に、翻訳後の改変を行なう。簡単に言えば、昆虫細胞中での活性
プロテインの発現に有用なバキュロウイルスベクターは、主要な閉鎖プロテイン
であるポリヘドリンをコードした遺伝子について、オートグラフィカ・カリフォ
ルニカ・核ポリヘドリンウイルス（ＡｃＮＰＶ）プロモーターのプロテインをコ
ードした配列の下流を挿入することによって特徴づけられる。培養された昆虫細
胞（例えば、スポドプテラ・フリギペルダセルライン）を、ウイルスとプラスミ
ドＤＮＡとの混合物と一緒にトランスフェクトして、ウイルス子孫をプレートす
る。ポリヘドリン遺伝子の欠失および挿入による失活は、閉鎖陰性ウイルスの産
生を引き起こしてプラークを形成し、このものは野生型の閉鎖陰性ウイルスのプ
ラークと著しく区別される。これらの特徴的なプラークの形態学は、組換えウイ
ルスの視覚的なスクリーニング（ここでは、ＡｃＮＰＶ遺伝子を選別したハイブ
リッド遺伝子と置き換える）が可能とする。Insect cells also allow expression of mammalian proteins. Recombinant proteins produced in insect cells using the baculovirus vector are post-translationally modified as with wild-type proteins. Briefly, a baculovirus vector useful for expressing active proteins in insect cells is the Autographica californica nuclear polyhedrin virus (AcNPV) promoter for the gene encoding polyhedrin, the major closing protein. Characterized by inserting downstream of the protein-encoding sequence. Cultured insect cells (eg, Spodoptera frugiperda cell line) are co-transfected with a mixture of virus and plasmid DNA to plate virus progeny. Inactivation by deletion and insertion of the polyhedrin gene causes the production of occlusion-negative virus to form plaques, which are significantly distinguished from plaques of wild-type occlusion-negative virus. These characteristic plaque morphologies allow visual screening of recombinant viruses, where the AcNPV gene is replaced with a selected hybrid gene.

【００５１】 別法として、本発明の遺伝子または核酸を、上記の挿入した遺伝子の形質転換
を指向し、調節する１つ以上の機能性の要素を操作可能に結合することができて
、該遺伝子または核酸を発現することができる。例えば、遺伝子または核酸をバ
クテリアまたはファージプロモーターに操作可能に結合し、インビトロでの遺伝
子または核酸の転写を指向するのに使用することができる。更なる例としては、
連関させた転写−翻訳システム中で、本明細書において提供した遺伝子または核
酸を使用することを含む。該システムにおいて、遺伝子は転写を指向し、それに
よって産生するＲＮＡを翻訳のための鋳型として使用して、ポリペプチドを産生
する。当該分野の当業者は、これらの反応の産物を多数の応用（例えば、標識化
したＲＮＡのプローブとしての使用および抗体を得るためにポリペプチドの使用
）において、または該ポリペプチドを細胞もしくは被験者に投与する方法におい
て使用することができる。Alternatively, the gene or nucleic acid of the invention may be operably linked to one or more functional elements that direct and regulate the transformation of the inserted gene. Alternatively, the nucleic acid can be expressed. For example, a gene or nucleic acid can be operably linked to a bacterial or phage promoter and used to direct transcription of the gene or nucleic acid in vitro. As a further example,
Using a gene or nucleic acid provided herein in a linked transcription-translation system. In the system, the gene directs transcription and the resulting RNA is used as a template for translation to produce the polypeptide. One of ordinary skill in the art will appreciate that the products of these reactions may be used in a number of applications, such as the use of labeled RNA as a probe and the use of polypeptides to obtain antibodies, or the use of the polypeptides in cells or subjects. It can be used in the method of administration.

【００５２】 ベクターと組み合わせるか、または適当な配列に操作可能に結合させて、遺伝
子または核酸を発現させることは、インビボまたはインビトロのどちらでによっ
ても可能である。インビボ合成は、ベクターのための宿主細胞として機能する原
核生物細胞または真核生物細胞を形質転換することを含む。別法として、遺伝子
または核酸の発現を、インビトロ発現システムにおいて生じることができる。例
えば、インビトロ転写システムは商業的に入手することができ、これは通常、比
較的に大量のｍＲＮＡを製造するのに使用される。それらのインビトロ転写シス
テムにおいて、目的の遺伝子をコードした核酸を転写プロモーターに近接する発
現ベクターにクローニングする。例えば、ブルースクリプトＩＩクローニングお
よび発現ベクターは、強い原核生物転写プロモーターによって隣接された多数の
クローニング部位を含む（ストラタジーンクローングシステム、ラホーヤ、ＣＡ
）。ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡのインビトロ合成に必要な全ての試薬（例えば、ブ
ルースクリプトベクター）を含むキットを入手することができる（スタラタジー
ンクローニングシステム、ラホーヤ、ＣＡ）。次いで、このようなシステムによ
ってインビトロで産生するＲＮＡをインビトロで翻訳して、目的のプロテインを
得る（スタラタジーンクローニングシステム、ラホーヤ、ＣＡ）。Expression of a gene or nucleic acid, either in combination with a vector or operably linked to appropriate sequences, is possible either in vivo or in vitro. In vivo synthesis involves transforming a prokaryotic or eukaryotic cell that functions as a host cell for the vector. Alternatively, expression of the gene or nucleic acid can occur in an in vitro expression system. For example, in vitro transcription systems are commercially available and are commonly used to produce relatively large amounts of mRNA. In those in vitro transcription systems, the nucleic acid encoding the gene of interest is cloned into an expression vector adjacent to the transcription promoter. For example, Bluescript II cloning and expression vectors contain multiple cloning sites flanked by strong prokaryotic transcription promoters (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA).
). A kit containing all reagents necessary for in vitro synthesis of RNA from a DNA template (eg, Bluescript vector) is available (Starata Gene Cloning System, La Jolla, CA). The RNA produced in vitro by such a system is then translated in vitro to obtain the protein of interest (Starata Gene Cloning System, La Jolla, CA).

【００５３】 エクスビボ方法を使用する場合には、当該分野でよく知られれる標準的なプロ
トコールに従って、細胞または組織を取り出し、体外で保持することができる。
本発明の核酸をいずれかの遺伝子運搬機構（例えば、ウイルスが媒介する遺伝子
運搬、リン酸カルシウムが媒介する遺伝子運搬、エレクトロポレーション、マイ
クロインジェクションまたはタンパクリポソーム）によって細胞に導入すること
ができる。次いで、該形質導入された細胞を注入するか（例えば、医薬的に許容
し得る担体中で）、または細胞もしくは組織の種類についての標準的な方法毎に
、被験者に同じ位置に移植し直すことができる。様々な細胞の被験者への移植ま
たは注入のための標準的な方法については知られている。When using the ex vivo method, cells or tissues can be removed and maintained in vitro according to standard protocols well known in the art.
The nucleic acids of the invention can be introduced into cells by any gene delivery mechanism (eg, virus mediated gene delivery, calcium phosphate mediated gene delivery, electroporation, microinjection or protein liposomes). The transduced cells are then infused (eg, in a pharmaceutically acceptable carrier) or re-implanted into the subject at the same location per standard methods for cell or tissue types. You can Standard methods are known for transplantation or infusion of various cells into a subject.

【００５４】 本発明の核酸をも、インビトロの遺伝子治療法（米国特許第５，３９９，３４
６号）で使用することができる。遺伝子治療に関しては、核酸は遺伝子産物をコ
ードするヌクレオチド配列を含むことができる。このことは、欠損的な遺伝子産
物の代わりに機能を回復させ、そして欠損的な遺伝子産物が原因で異常に機能し
た細胞に正常な機能を回復させることを意図する。別法として、核酸は、以前に
細胞中に存在していなかったり、または以前に治療濃度で細胞中に存在していな
い遺伝子産物をコードすることができる。外因性の遺伝子産物の存在または外因
性の遺伝子産物の濃度の増加により、細胞および／または被験者に治療学的な利
点を分け与える。The nucleic acids of the invention may also be used in in vitro gene therapy methods (US Pat. No. 5,399,34).
No. 6) can be used. For gene therapy, the nucleic acid can include a nucleotide sequence that encodes a gene product. This is intended to restore function in place of the defective gene product, and restore normal function to cells that have abnormally functioned due to the defective gene product. Alternatively, the nucleic acid can encode a gene product that was not previously present in the cell or was not previously present in the cell at therapeutic concentrations. The presence of the exogenous gene product or the increased concentration of the exogenous gene product confers therapeutic benefit to the cell and / or subject.

【００５５】 インビボ投与の場合には、細胞は被験者中に存在することがあり得て、該核酸
を医薬的に許容し得る担体として投与することができる。被験者は細胞中で核酸
を選択的に発現することが望まれるいずれかの動物であり得る。好ましい実施態
様において、本発明の動物はヒトである。加えて、本発明の方法によって治療す
ることができる非ヒト動物は例えば、ネコ、イヌ、鳥、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツ
ジ、モルモット、スナネズミおよびウサギ、並びに本明細書に記載する方法に従
って、細胞中での核酸の選択的な発現を行なうことができるいずれかの他の動物
を含むが、これらの限定しない。For in vivo administration, the cells can be present in a subject and the nucleic acid can be administered as a pharmaceutically acceptable carrier. The subject can be any animal in which it is desired to selectively express the nucleic acid in cells. In a preferred embodiment, the animals of the invention are humans. In addition, non-human animals that can be treated by the methods of the invention include, for example, cats, dogs, birds, horses, cows, goats, sheep, guinea pigs, gerbils and rabbits, and cells according to the methods described herein. Including, but not limited to, any other animal capable of selective expression of a nucleic acid in.

【００５６】 外因性のＤＮＡを被験者の細胞に導入することを含む上記の方法（例えば、遺
伝子の形質導入またはトランスフェクション）において、本発明の核酸は裸ＤＮ
Ａの形態であったり、該核酸は細胞内部での核酸の発現のために、細胞に核酸を
運搬するためのベクターであり得る。該ベクターは商業的に入手可能な製品（例
えば、アデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies社、ラヴァル、ケベ
ック、カナダ））であり得る。細胞への核酸またはベクターの運搬は様々な機構
によることができる。例えば、商業的に入手可能な製品（例えば、リポフェクチ
ン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、カイズ
バーグ、ＭＤ）、スーパーフェクト（登録商標、Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、西
独）およびトランスフェクタム（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ．社
、マディソン、ＷＩ）、並びに当該分野で一般的な方法に従って開発された他の
リポソームによって運搬を行なうことができる。加えて、本発明の核酸またはベ
クターをエレクトロポレーション（該方法はＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社（サンデ
ィエゴ、ＣＡ）から入手することができる）、およびソノポレーション機（Ｉｍ
ａＲｘ Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．タスカルーサ、ＡＺ）によ
ってインビロで運搬することができる。In the above methods (eg, gene transduction or transfection) that involve introducing exogenous DNA into the cells of a subject, the nucleic acid of the invention is naked DN.
It may be in the form of A or the nucleic acid may be a vector for delivering the nucleic acid to the cell for expression of the nucleic acid inside the cell. The vector may be a commercially available product (eg, adenovirus vector (Quantum Biotechnologies, Laval, Quebec, Canada)). Delivery of nucleic acids or vectors to cells can be by a variety of mechanisms. For example, commercially available products (eg, Lipofectin®, Lipofectamine®, GIBCO-BRL, Kaisberg, MD), Superfect® (Qiagen, Hilden, West Germany) and Transfectam. (Registered trademark, Promega Biotec., Madison, Wis.), As well as other liposomes developed according to methods common in the art.In addition, the nucleic acids or vectors of the invention are electroporated. (The method is available from Genetronics, San Diego, CA), and a sonoporation machine (Im
aRx Pharmaceutical Corp. It can be transported in vitro by Tuscaloosa, AZ).

【００５７】 一例として、ベクターの供給はウイルス系、例えば組換えレトロウイルスゲノ
ムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系により行うことがで
きる。次いで、組換えレトロウイルスを用いて感染させることにより感染細胞に
核酸を供給することができる。哺乳動物細胞に核酸を導入する的確な方法は、も
ちろんレトロウイルスベクターの使用に限らない。この方法には、アデノウイル
スベクター、アデノ関連ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、
シュードタイプのレトロウイルスベクター、およびポックスウイルスベクター、
例えばワクシニアウイルスベクターの使用を含む他の技術を広く利用できる。物
理的トランスダクション技術、例えばリポソーム供給およびレセプター介在性お
よび他のエンドサイトーシスも用いることができる。本発明はこれらまたは他の
あらゆる一般に用いられる遺伝子伝達法と組み合わせて用いることができる。By way of example, the vector supply can be effected by a viral system, for example a retroviral vector system capable of packaging the recombinant retroviral genome. The infected cells can then be supplied with nucleic acid by infection with the recombinant retrovirus. The exact method of introducing the nucleic acid into mammalian cells is, of course, not limited to the use of retroviral vectors. This method includes adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, lentivirus vectors,
Pseudotyped retrovirus vector, and poxvirus vector,
Other techniques are widely available, including, for example, the use of vaccinia virus vectors. Physical transduction techniques such as liposome delivery and receptor-mediated and other endocytosis can also be used. The present invention can be used in combination with these or any other commonly used gene transfer method.

【００５８】 本発明の核酸および核酸供給ビークル(例えば、ウイルス; リポソーム、プラ
スミド、ベクター)は、対象にin vivo投与するために医薬的に許容される担体中
にありうる。「医薬的に許容される」とは、いかなる望ましくない生物学的効果
や医薬組成物中に含まれるあらゆる他の成分と有害な相互作用を生じることなく
核酸またはビークルと一緒に対象に投与してよい、生物学的でない（そうでなけ
れば望ましくない）物質を意味する。担体はもちろん、当業者がよく知っている
であろうように、活性成分のあらゆる分解を最小限にし、対象における副作用を
最小限にするように選ばれよう。The nucleic acids and nucleic acid delivery vehicles (eg, viruses; liposomes, plasmids, vectors) of the invention can be in a pharmaceutically acceptable carrier for in vivo administration to a subject. "Pharmaceutically acceptable" refers to the administration to a subject together with a nucleic acid or vehicle without causing any unwanted biological effect or deleterious interaction with any other ingredients contained in the pharmaceutical composition. Means a good, non-biological (or otherwise undesirable) substance. The carrier will, of course, be chosen to minimize any degradation of the active ingredient and minimize side effects in the subject, as would be well known to those of skill in the art.

【００５９】 核酸またはビークルは経口的、非経口的（例えば静脈内）、筋肉内注射、腹腔
内注射、経皮的、生体外、または局所的に投与することができよう。必要な核酸
またはベクターの正確な量は、対象ごとに、対象の種、年齢、体重、および一般
状態、処置すべきあらゆる障害の重症度やメカニズム、用いる特定の核酸やビー
クル、その投与方法などに応じて変化するであろう。The nucleic acid or vehicle could be administered orally, parenterally (eg intravenously), intramuscularly, intraperitoneally, transdermally, ex vivo or topically. The exact amount of nucleic acid or vector required will vary from subject to subject depending on the subject's species, age, weight, and general condition, the severity and mechanism of any disorder to be treated, the particular nucleic acid or vehicle used, its mode of administration, etc. Will change accordingly.

【００６０】 スクリーニング法 さらに本発明は、ヒトp53の毒性、スーパートランス活性化(supertransactiva
ting）およびtox-サプレッサー突然変異を確認するためのスクリーニング法を提
供する。Screening Method The present invention further provides for the toxicity, supertransactiva of human p53.
ting) and tox-suppressor mutations.

【００６１】 具体的には、本発明は、a)ヒトp53と結合するDNA配列と結合するレポーター遺
伝子を含む酵母細胞を含み、b)ヒトp53コーディング配列と結合するGAL１を含む
誘導可能なプロモーターを含む、ヒトp53を発現する核酸を酵母細胞に導入し、c
)炭素源としてラフィノース上に工程b)の酵母細胞をプレーティングし、プレー
ト上のコロニーを同定する（ここで、野生型p53を発現するコロニーは赤色コロ
ニーを生じ、p53中にスーパートランス活性化突然変異を発現する白色または桃
色コロニーを生じる。）。Specifically, the present invention comprises a) a yeast cell containing a reporter gene that binds to a DNA sequence that binds to human p53, and b) an inducible promoter that contains GAL1 that binds to the human p53 coding sequence. A nucleic acid expressing human p53 is introduced into a yeast cell, and c
) Plating the yeast cells of step b) on raffinose as a carbon source and identifying colonies on the plate (where colonies expressing wild-type p53 give rise to red colonies and supertransactivation suddenly into p53). This produces white or pink colonies that express the mutation.).

【００６２】 本発明においてGAL1プロモーターは、GAL1、またはGAL1-10プロモーターのあ
らゆる他の断片または単位であり得る。本発明において、「プレーティング」に
は複製のプレーティングも含むことができる。本発明の酵母株は、炭素源を含む
プレート上、および炭素源を含む液体培養中で培養することができる。炭素源に
ラフィノースを用いるとは、ラフィノースが主な炭素源であることを意味するが
、培地はプレートでも液体培養でも得られる結果に有意な影響を及ぼさない微量
の他の炭素源を含むかもしれない。The GAL1 promoter in the present invention can be GAL1 or any other fragment or unit of the GAL1-10 promoter. In the present invention, “plating” can include duplicate plating. The yeast strain of the present invention can be cultivated on a plate containing a carbon source and in a liquid culture containing a carbon source. Using raffinose as a carbon source means that raffinose is the major carbon source, but the medium may contain trace amounts of other carbon sources that do not significantly affect the results obtained in the plate or in liquid culture. Absent.

【００６３】 本スクリーニング法において、p53の発現の変化はGAL1プロモーターを用い、
培地中の炭素源を変化させることにより達成される。特に、GAL1プロモーターは
、ラフィノースを唯一の炭素源に用いると、グルコース抑制系が除去されるが該
プロモーターは誘導されないため、基礎レベルの発現をもたらす。この状況では
、p53レベルは、野生型がレポーター遺伝子（この場合はADE2）の効率的な転写
を活性化できず、コロニーの色が赤色のままであるほど低い。すなわち、リボソ
ーマル遺伝子クラスター(RGC)配列との結合がより強いかまたは安定性が増加す
るため、野生型より効率的なトランス活性化を行うp53スーパートランス活性化
突然変異は、白色酵母コロニーを生じ、ラフィノース上で簡単に確認することが
できる。本発明方法におけるグルココルチコイド反応性エレメント系およびPHO5
のような他の誘導可能なプロポーター系の使用も本発明により予期される（Vect
ors for Expression of cloned genes in yeast: regulation, overproduction
and underproduction. Jane. C. Schneider and Leonard Guarente in Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology; Methods in Enzymology Edited by C
hristine Guthrie and Gerald R. Fink; Volume 194 pp 373-388.)。本発明方法
は適切なインデューサーの存在下であらゆる誘導可能なプロモーター系を利用す
るのに適合しうる。In the present screening method, the expression change of p53 uses the GAL1 promoter,
This is achieved by changing the carbon source in the medium. In particular, the GAL1 promoter results in a basal level of expression when raffinose is used as the sole carbon source because it eliminates the glucose repression system but does not induce the promoter. In this situation, p53 levels are so low that the wild type fails to activate efficient transcription of the reporter gene (ADE2 in this case) and the colony color remains red. That is, the p53 supertransactivating mutation, which provides more efficient transactivation than the wild type, results in white yeast colonies, as it has stronger binding or increased stability with the ribosomal gene cluster (RGC) sequence. You can easily check it on Raffinose. Glucocorticoid-responsive element system and PHO5 in the method of the present invention
The use of other inducible promoter systems, such as
ors for Expression of cloned genes in yeast: regulation, overproduction
and underproduction. Jane. C. Schneider and Leonard Guarente in Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology; Methods in Enzymology Edited by C
hristine Guthrie and Gerald R. Fink; Volume 194 pp 373-388.). The method of the invention may be adapted to utilize any inducible promoter system in the presence of a suitable inducer.

【００６４】 利用することができる他のレポーター遺伝子には、それぞれHIS3、LEU2および
URA3が欠損した酵母株においてHIS3、LEU2、URA3が含まれる。これらレポーター
遺伝子を利用する場合は、非常に低レベルの誘導でp53変異体を発現するコロニ
ーを選択し（GAL1の制御下およびラフィノース培地上）、それぞれヒスチジン、
ロイシン、およびウラシルを欠くプレート上での増殖を見つけることによりスク
リーニングを行うことができる。以下の方法は、異なるレポーターを利用するこ
とによりスーパートランス活性化突然変異を検出するために提供される。ヒトp5
3遺伝子のスーパートランス活性化突然変異の検出方法は、ヒトp53と結合するDN
A配列と結合するHIS3レポーター遺伝子を含む酵母細胞を得、ヒト53コーディン
グ配列と結合するGAL1を含む誘導可能なプロモーターを含む、ヒトp53をコード
する核酸を該酵母細胞に導入し、該酵母細胞を炭素源としてラフィノース上、お
よびヒスチジンを欠く合成培地中の少量のガラクトースおよびラフィノース上に
プレーティングし、プレート上のコロニーを確認することを含む（ここで、p53
のトランス活性化突然変異を発現する正常サイズのコロニーは、ラフィノース上
、またはヒスチジンを含まないラフィノースおよび少量のガラクトース培地上で
増殖し、野生型p53を発現する細胞はほとんどまたはまったく増殖しない。）。Other reporter genes that can be utilized include HIS3, LEU2 and
URA3-deficient yeast strains include HIS3, LEU2 and URA3. When using these reporter genes, colonies expressing p53 mutants with very low levels of induction were selected (under GAL1 control and on raffinose medium) and their histidine,
Screening can be done by finding growth on plates lacking leucine and uracil. The following method is provided to detect supertransactivating mutations by utilizing different reporters. Human p5
A method for detecting supertransactivating mutations in the three genes is based on DN binding to human p53.
Obtaining a yeast cell containing a HIS3 reporter gene that binds to the A sequence, including an inducible promoter containing GAL1 that binds to the human 53 coding sequence, and introducing a nucleic acid encoding human p53 into the yeast cell, the yeast cell Plating on raffinose as a carbon source and on a small amount of galactose and raffinose in a synthetic medium lacking histidine to identify colonies on the plate (where p53
Normal-sized colonies expressing the transactivating mutation of Ra. Nouris grown on raffinose or raffinose without histidine and a small amount of galactose medium, with little or no wild-type p53 expressing cells. ).

【００６５】 ヒトp53と結合するDNA配列と結合するURA3レポーター遺伝子を含む酵母細胞を
得、ヒト53コーディング配列と結合するGAL1を含む誘導可能なプロモーターを含
む、ヒトp53をコードする核酸を該酵母細胞に導入し、該酵母細胞を炭素源とし
てラフィノース上、およびウラシルを欠く合成培地中の少量のガラクトースおよ
びラフィノース上にプレーティングし、プレート上のコロニーを確認することを
含む（ここで、p53のトランス活性化突然変異を発現する正常サイズのコロニー
は、ラフィノース上、またはウラシルを含まないラフィノースおよび少量のガラ
クトース培地上で増殖し、野生型p53を発現する細胞はほとんどまたはまったく
増殖しない。）ヒトp53遺伝子のスーパートランス活性化突然変異の検出方法も
提供する。A yeast cell containing a URA3 reporter gene that binds to a DNA sequence that binds to human p53 is obtained, and a nucleic acid encoding human p53 that contains an inducible promoter that includes GAL1 that binds to the human 53 coding sequence is added to the yeast cell. And plating the yeast cells on raffinose as a carbon source and on a small amount of galactose and raffinose in a synthetic medium lacking uracil to identify colonies on the plate (where p53 trans Normal size colonies expressing activating mutations grow on raffinose, or raffinose without uracil and a small amount of galactose medium, with little or no growth of cells expressing wild-type p53.) Human p53 gene Also provided is a method for detecting a supertrans-activating mutation in Escherichia coli.

【００６６】 さらに、ヒトp53と結合するDNA配列と結合するLEU2レポーター遺伝子を含む酵
母細胞を得、ヒト53コーディング配列と結合するGAL1を含む誘導可能なプロモー
ターを含む、ヒトp53をコードする核酸を該酵母細胞に導入し、該酵母細胞を炭
素源としてラフィノース上、およびロイシンを欠く合成培地中の少量のガラクト
ースおよびラフィノース上にプレーティングし、プレート上のコロニーを確認す
ることを含む（ここで、p53のトランス活性化突然変異を発現する正常サイズの
コロニーは、ラフィノース上、またはロイシンを含まないラフィノースおよび少
量のガラクトース培地上で増殖し、野生型p53を発現する細胞はほとんどまたは
まったく増殖しない。）ヒトp53遺伝子のスーパートランス活性化突然変異の検
出方法も提供する。Further, a yeast cell containing a LEU2 reporter gene that binds to a DNA sequence that binds to human p53 is obtained, and a nucleic acid encoding human p53 that contains an inducible promoter that includes GAL1 that binds to the human 53 coding sequence is Introducing into yeast cells, plating the yeast cells on raffinose as a carbon source, and a small amount of galactose and raffinose in a synthetic medium lacking leucine, and identifying colonies on the plate (where p53 Normal-sized colonies expressing the transactivating mutation of Ramanose grow on raffinose, or on leucine-free raffinose and a small amount of galactose medium, and little or no cells expressing wild-type p53 grow. Also provided is a method for detecting supertransactivating mutations in the p53 gene.

【００６７】 スーパートランス活性化突然変異p53sを検出するための本スクリーニング法を
利用することにより、変化した配列特異性を有する突然変異体を単離し、分析す
ることができる。この突然変異体は、いくつかのp53反応性エレメントに対する
スーパートランス活性化活性を有し、他のわずかに異なるp53反応性エレメント
のDNA認識に欠陥があるかもしれない。該アレルは、p53下流経路を機能的に分析
し、癌の抑制やアポトーシス遺伝子のような遺伝子の特異的活性化にもっとも関
連する成分を理解するのに有用かもしれない。これらスーパートランス活性化突
然変異体は、野生型様p53活性および腫瘍細胞のアポトーシスの回復のための化
学療法との併用療法に用いることもできるかもしれない。スーパートランス活性
化の優性を用いて種々の腫瘍突然変異の優性な負の影響を打ち消すことができる
。By utilizing this screening method to detect supertransactivating mutant p53s, mutants with altered sequence specificity can be isolated and analyzed. This mutant has supertransactivating activity for some p53-responsive elements and may be defective in DNA recognition of other slightly different p53-responsive elements. The allele may be useful in functionally analyzing the p53 downstream pathway and understanding the components most relevant to the specific activation of genes such as cancer suppression and apoptotic genes. These supertrans-activating mutants could also be used in combination therapy with chemotherapy for the restoration of wild-type-like p53 activity and tumor cell apoptosis. The dominance of supertransactivation can be used to counter the dominant negative effects of various tumor mutations.

【００６８】 種々のp53反応性エレメントを用いた種々の発現レベルでのスーパートランス
活性化p53突然変異体によるトランス活性化の測定は、ヒトp53と結合する第一DN
A配列と結合するレポーター遺伝子を含む第一酵母細胞を得、ヒトp53コーディン
グ配列と結合するGAL1を含む誘導可能なプロモーターを含む、ヒトp53をコード
する核酸を該第一酵母細胞に導入し、ヒトp53と結合する第二DNA配列と結合する
レポーター遺伝子を含む第二酵母細胞を得、ヒトp53コーディング配列と結合す
るGAL1を含む誘導可能なプロモーターを含む、ヒトp53をコードする核酸を該第
二酵母細胞に導入し、該第一および第二酵母細胞を各々グルコース、ラフィノー
ス、ラフィノース＋ガラクトース、およびラフィノース＋より多量のガラクトー
ス上にプレーティングし、プレート上のコロニーを確認し（ここで、白色または
桃色コロニーはトランス活性化が起こったことを示す）、p53による種々のレベ
ルの発現下で第一および第二DNA配列のスーパートランス活性化レベルを測定す
ることにより達成することができる。レポーターが3XRGCエレメントと結合して
いるコントロールも含むことができる。Measurement of transactivation by supertransactivating p53 mutants at different levels of expression using different p53 responsive elements was determined by first DN binding to human p53.
Obtaining a first yeast cell containing a reporter gene that binds to the A sequence, including an inducible promoter containing GAL1 that binds to human p53 coding sequence, and introducing a nucleic acid encoding human p53 into the first yeast cell, human A second yeast cell containing a reporter gene that binds to a second DNA sequence that binds to p53 is obtained, and a nucleic acid encoding human p53, which contains an inducible promoter that includes GAL1 that binds to a human p53 coding sequence, is used as the second yeast. Introduced into cells and plating the first and second yeast cells onto glucose, raffinose, raffinose + galactose, and raffinose + more galactose, respectively, to identify colonies on the plate (where white or pink Colonies indicate transactivation), the first and second DNA sequences under varying levels of expression by p53. It can be achieved by measuring the super transactivation level. A control in which the reporter is bound to the 3XRGC element can also be included.

【００６９】 該アッセイは２つ以上の反応性エレメントを用いて組むことができる。例えば
、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16またはそれ以上の反応性
エレメントに対するp53突然変異の効果を比較するアッセイを上記方法を用いて
行うことができる。実際に、あらゆるp53反応性エレメントを本スクリーニング
法に用いることができる。例えば、p53と結合するDNA配列は3xRGC反応性エレメ
ント、PIG3反応性エレメント、p21反応性エレメント、bax反応性エレメント、ま
たはp53と結合する他のDNA配列であり得る。酵母細胞をグルコース、ラフィノー
ス、ラフィノースおよびガラクトース、およびラフィノースおよびより多量のガ
ラクトース上にプレーティングし、種々の発現レベルの条件下でトランス活性化
を測定する。発現レベルはグルコースで最も低く、ラフィノースでやや高く、ラ
フィノースおよびガラクトースではるかに高い。ラフィノースおよびより多量の
ガラクトースとは、ラフィノースおよびガラクトースの濃度よりガラクトースの
濃度が高いことを意味する。ラフィノースを含むプレートに加えるガラクトース
の量は、種々の量のp53の発現を得るために微量から2.0%ガラクトースまで変化
させることができる。例えば、酵母細胞を、グルコース、グルコースおよびラフ
ィノース、グルコースおよび0.003%ガラクトース、およびグルコースおよび0.01
5%ガラクトース上にプレーティングすることができる。この例では、0.015%ガラ
クトースは0.003%ガラクトース以上である。別の例では、酵母細胞を、グルコー
ス、グルコースおよびラフィノース、グルコース＋0.005%ガラクトース、および
グルコースおよび0.016%ガラクトース上にプレーティングすることができる。発
現レベルを変化させることにより、当業者は反応性エレメント、例えば3xRGC、P
IG3、p21またはbaxのトランス活性化の違いを検出することができる。このアッ
セイにより当業者は特定のp53突然変異体が低発現レベルである反応性エレメン
トをスーパートランス活性化し、高発現レベルで別の反応性エレメントをスーパ
ートランス活性化するかどうかを決定することができよう。このアッセイでは、
特定の反応性エレメントまたは反応性エレメントのサブセットに対して選択的な
突然変異体を同定することもできる。このスクリーニングアッセイは、p53反応
性エレメントのスーパートランスアクチベーターの選択性を決定するのに他の誘
導可能なプロモーターを用て行うこともできる。The assay can be set up using two or more reactive elements. For example, an assay that compares the effect of p53 mutations on 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or more reactive elements can be performed using the above method. Can be done using. Virtually any p53 responsive element can be used in the present screening method. For example, the DNA sequence that binds p53 can be a 3xRGC responsive element, a PIG3 responsive element, a p21 responsive element, a bax responsive element, or another DNA sequence that binds p53. Yeast cells are plated on glucose, raffinose, raffinose and galactose, and raffinose and higher amounts of galactose, and transactivation measured under conditions of varying expression levels. Expression levels are lowest in glucose, slightly higher in raffinose, and much higher in raffinose and galactose. Raffinose and higher amounts of galactose mean that the concentration of galactose is higher than that of raffinose and galactose. The amount of galactose added to the plate containing raffinose can be varied from traces to 2.0% galactose to obtain varying amounts of p53 expression. For example, yeast cells were treated with glucose, glucose and raffinose, glucose and 0.003% galactose, and glucose and 0.01
It can be plated on 5% galactose. In this example 0.015% galactose is greater than or equal to 0.003% galactose. In another example, yeast cells can be plated on glucose, glucose and raffinose, glucose + 0.005% galactose, and glucose and 0.016% galactose. By varying the expression level, one of skill in the art will appreciate that reactive elements such as 3xRGC, P
Differences in IG3, p21 or bax transactivation can be detected. This assay allows one of skill in the art to determine whether a particular p53 mutant supertransactivates a reactive element at low expression levels and another at high expression levels. See. In this assay,
Mutants selective for a particular reactive element or subset of reactive elements can also be identified. This screening assay can also be performed with other inducible promoters to determine the selectivity of the supertransactivator of the p53 responsive element.

【００７０】 例えば、当業者が上記アッセイを行い、突然変異体S121F（表７）に対応する
プレートをみる場合は、１）3XRGC反応性エレメントについては、白色コロニー
が2%ラフィノースプレート、2%ラフィノース＋0.003%ガラクトースプレート、お
よび2%ラフィノース＋0.015%ガラクトースプレートに見られる、２）PIC3エレメ
ントについては、白色コロニーが2%ラフィノースプレート、2%ラフィノース＋0.
003%ガラクトースプレート、および2%ラフィノース＋0.015%ガラクトースプレー
トに見られる、３）p21反応性エレメントについては、白色コロニーが2%ラフィ
ノース＋0.015%ガラクトースプレートに見られる、４）baxエレメントについて
は、桃色コロニーが2%ラフィノース＋0.003%ガラクトースプレート、および2%ラ
フィノース＋0.015%ガラクトースプレートに見られる。すなわち、当業者は、S1
21F突然変異体は、野生型に比べて低レベルの発現で3XRGC反応性エレメント、PI
C3エレメント、およびbaxエレメントについてスーパートランス活性化するがp21
エレメントについては活性化しないと結論するであろう。この情報に基づいて、
当業者は特定の突然変異体p53sを選択し、その特定の反応性エレメントをトラン
ス活性化する能力に基づいて特定経路を標的にすることができる。例えば、PIG3
経路について増加した、またはスーパートランス活性化活性を示す突然変異体を
用いて該経路を調節（modulate)し、p21経路に対するスーパートランス活性化活
性を示すものを利用してp21経路を調節することができる。同じスーパートラン
ス活性化活性は低レベルの発現である反応性エレメントを、または高レベルで別
の反応性エレメントをトランス活性化することができるので、当業者はスーパー
トランスアクチベーターの量を変化させることにより同じ突然変異を有する１ま
たはそれ以上の反応性エレメントを標的にすることができるかもしれない。For example, if one of skill in the art performed the above assay and looked at the plate corresponding to mutant S121F (Table 7), 1) for the 3XRGC reactive element, white colonies were 2% raffinose plate, 2% raffinose plate. Found on + 0.003% galactose plates and 2% raffinose + 0.015% galactose plates, 2) For PIC3 elements, white colonies are 2% raffinose plates, 2% raffinose + 0.
Found on 003% galactose plates and 2% raffinose + 0.015% galactose plates, 3) for p21 reactive elements, white colonies found on 2% raffinose + 0.015% galactose plates, 4) for bax elements , Pink colonies are found on 2% raffinose + 0.003% galactose plates, and 2% raffinose + 0.015% galactose plates. That is, those skilled in the art
The 21F mutant had a lower level of expression than the wild type 3XRGC responsive element, PI.
Supertransactivates C3 element and bax element, but p21
One would conclude that the element does not activate. Based on this information
One of skill in the art can select a particular mutant p53s and target a particular pathway based on its ability to transactivate a particular reactive element. For example, PIG3
Mutants with increased or supertransactivating activity for the pathway may be used to modulate the pathway, and those exhibiting supertransactivating activity for the p21 pathway may be used to modulate the p21 pathway. it can. Those skilled in the art will be able to vary the amount of supertransactivator, as the same supertransactivating activity can transactivate a reactive element with low levels of expression or another reactive element with high levels. May target one or more reactive elements with the same mutation.

【００７１】 また、p５３変異体の同定について上記したように、このスクリーニング方法
はまた、regl−５０１変異体を含む酵母株を用いて行うことができる。従って、
この発明は、種々の発現濃度および種々のp５３応答成分を用いて、p５３変異体
をスーパートランス活性化(supertransactivate)することによるトランス活性化
(transactivation)の測定方法であって、レポーター遺伝子−ここでレポーター
遺伝子はヒトp５３が結合している第１のＤＮＡ配列に結合している−を含む第
１のregl-５０１変異体酵母細胞を得；第１のregl-５０１変異体酵母細胞にヒト
ｐ５３をコードしている核酸−ここで、この核酸はヒトｐ５３コード配列に結合
しているＧＡＬ１を含む誘発可能プロモーターを含む−を導入し；レポーター遺
伝子−ここで、このレポーター遺伝子はヒトｐ５３が結合している第２のＤＮＡ
配列に結合している−を含む第２のregl-５０１変異体酵母細胞を得；第２のreg
l-５０１変異体酵母細胞にヒトｐ５３をコードしている核酸−ここで、この核酸
はヒトｐ５３コード配列に結合しているＧＡＬ１を含む誘発可能プロモーターを
含む−を導入し；第１および第２の酵母細胞を、グルコース、およびグルコース
および漸増濃度のガラクトースの各々に播種し、平板上のコロニーを同定するが
、白またはピンク色のコロニーはスーパートランス活性化が起こったことを示し
；ｐ５３による種々の発現濃度における第１および第２のＤＮＡ配列のスーパー
トランス活性化の程度を測定することを特徴とする方法を提供する。対照はまた
、レポーターが３ＸＲＧＣ成分に結合しているものを含んでいてもよい。酵母細
胞はグルコースおよび漸増濃度のガラクトースに播種し、種々の発現濃度条件下
でのトランス活性化を測定することを特徴とする方法を提供する。この試験は、
グルコース、グルコースおよび第１の濃度のガラクトース、グルコースおよび第
１の濃度より高い第２の選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第２の濃度
より高い第３の選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第３の濃度より高い
第４の選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第４の濃度より高い第５の選
択濃度のガラクトース；グルコースおよび第５の濃度より高い第６の選択濃度の
ガラクトース；等に細胞を播種して行い、細胞をグルコースとガラクトースの漸
増濃度のガラクトースを含む平板に播種される。Also, as described above for identification of p53 mutants, this screening method can also be performed using yeast strains containing the regl-501 mutant. Therefore,
This invention provides transactivation by supertransactivating p53 mutants using different expression levels and different p53 response components.
A method for measuring (transactivation), comprising obtaining a first regl-501 mutant yeast cell comprising a reporter gene, wherein the reporter gene is bound to a first DNA sequence to which human p53 is bound. A first regl-501 mutant yeast cell is introduced with a nucleic acid encoding human p53, wherein the nucleic acid comprises an inducible promoter comprising GAL1 linked to a human p53 coding sequence; Gene-wherein this reporter gene is a second DNA to which human p53 is bound.
A second regl-501 mutant yeast cell containing-bonded to the sequence;
1-501 mutant yeast cells are introduced with a nucleic acid encoding human p53, wherein the nucleic acid contains an inducible promoter containing GAL1 linked to the human p53 coding sequence; first and second Yeast cells were seeded on glucose, and glucose and increasing concentrations of galactose, respectively, and colonies on the plate were identified, white or pink colonies indicating supertransactivation; To measure the degree of supertransactivation of the first and second DNA sequences at an expression level of. Controls may also include those in which the reporter is bound to the 3XRGC component. Yeast cells are seeded with glucose and increasing concentrations of galactose and a method characterized by measuring transactivation under various expression concentration conditions is provided. This test is
Glucose, glucose and galactose in a first concentration, glucose and galactose in a second selected concentration higher than the first concentration; glucose, and galactose in a third selected concentration higher than the second concentration, than glucose and a third concentration High fourth selection concentration galactose; glucose and a fifth selection concentration galactose higher than the fourth concentration; glucose and a sixth selection concentration galactose higher than the fifth concentration; Cells are seeded on plates containing increasing concentrations of galactose with glucose and galactose.

【００７２】 スーパートランス活性化因子(supertransactivator)は、ゆっくり発現される
ときに成長に影響を示すものと、もう１つは成長に明らかな影響を示さないもの
(例えば、ＡＤＨ１プロモーターを用いるとき)の２つに分類される。本発明はま
たスーパートランス活性化因子が過去に確認された優性トランス活性化欠損変異
体より優性な方法で作用し得るという証拠を提供する。従って、このスーパート
ランス活性化因子は、通常誘発欠陥ｐ５３が野生型ｐ５３による誘発を阻害する
場合に誘発欠陥ｐ５３の存在下でさえもレポーター遺伝子の誘発をもたらし得る
。下記の表は、ＡＤＨ１の制御下、すなわち、適度の発現でのスーパートランス
活性化変異を以下に示す：Super transactivators have an effect on growth when they are slowly expressed, and one that has no apparent effect on growth.
(For example, when using the ADH1 promoter). The present invention also provides evidence that supertransactivators may act in a dominant manner over previously identified dominant transactivation deficient mutants. Thus, this supertransactivator can result in induction of the reporter gene even in the presence of induced defect p53, where normally induced defect p53 inhibits induction by wild-type p53. The table below shows the supertransactivating mutations under the control of ADH1, ie with moderate expression:

【表１】 [Table 1]

【００７３】 これらの方法はＡＤＨ１以外のプロモーターから発現されるｐ５３に適用され
得る(すなわち、種々の発現濃度)。These methods can be applied to p53 expressed from promoters other than ADH1 (ie varying expression levels).

【００７４】 本発明の方法によれば、数種のスーパートランス活性化変異体が同定され得る
。スーパートランス活性化変異に関するプロトコルおよび結果のいくつかの具体
例の詳細な記載を実施例に記載する。According to the method of the present invention, several supertransactivating mutants can be identified. A detailed description of some specific examples of protocols and results for supertransactivating mutations is provided in the examples.

【００７５】 本発明はさらに、ヒトｐ５３遺伝子中の有毒な変異の検出方法であって：a)レ
ポーター遺伝子を含む酵母細胞を得るが、ここでレポーター遺伝子はヒトp５３
が結合しているＤＮＡ配列に結合されており；b)酵母細胞に、ヒトp５３を発現
する核酸を導入するが、ここで、核酸はヒトp５３コード配列に結合されている
誘発可能なＧＡＬ１プロモーターを含んでおり；c)グルコース、ラフィノースま
たはガラクトースの各々に段階b)の酵母細胞を播種し；d)平板上のコロニーを分
析するが、野生型p５３を発現するコロニーは、グルコースの平板上赤色コロニ
ー、ラフィノース平板上赤色コロニーおよびガラクトース平板上白色コロニーを
生じ、有毒p５３を発現するコロニーはグルコース平板上赤色コロニー、ラフィ
ノース平板上赤色コロニーまたは白色コロニーまたはコロニーを生じず、ガラク
トース平板上コロニーを生じないことを特徴とする方法を提供する。有毒変異体
は、野生型が赤色であるとき、発現濃度によって白色または赤色コロニーを生じ
得る。これらの変異体はスーパートランス性および有毒であると判断される。The invention further provides a method of detecting a toxic mutation in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing the reporter gene, wherein the reporter gene is human p53.
B) is introduced into a yeast cell with a nucleic acid expressing human p53, wherein the nucleic acid comprises an inducible GAL1 promoter linked to the human p53 coding sequence. C) glucose, raffinose or galactose are each seeded with the yeast cells of step b); d) the colonies on the plate are analyzed, but colonies expressing wild type p53 are red colonies on the glucose plate. , Red colonies on raffinose plates and white colonies on galactose plates, colonies expressing toxic p53 do not produce red colonies on glucose plates, red colonies on raffinose plates or white colonies or colonies on galactose plates Is provided. Toxic mutants can produce white or red colonies when the wild type is red, depending on the expression level. These variants are judged to be supertransgenic and toxic.

【００７６】 有毒変異の検出方法において、有毒変異体はラフィノース平板上赤色または白
色コロニーまたはコロニーを生じない。有毒変異は、ラフィノース上野生型p５
３によって産生する白色コロニーより小さな白色コロニーをラフィノース上に産
生し得る。In the method of detecting toxic mutations, the toxic mutant does not give rise to red or white colonies or colonies on raffinose plates. Toxic mutation is wild type p5 on raffinose
White colonies smaller than the white colonies produced by 3 can be produced on raffinose.

【００７７】 別法として、有毒変異の検出方法は、上記の段階b)の酵母細胞をグルコースま
たはガラクトースの各々に播種することによって行うことができる。有毒変異が
存在する場合、ガラクトース平板上にはコロニーが現れないであろう。Alternatively, the method of detecting toxic mutations can be carried out by seeding the yeast cells of step b) above with glucose or galactose, respectively. If the toxic mutation is present, no colonies will appear on the galactose plate.

【００７８】 有毒p５３変異はまた、オン−オフプロモーターなどの他のプロモーター系を
用いて検出することができる。例えば、本発明はヒトp５３遺伝子中の有毒変異
の検出方法であって：酵母細胞に細胞中の未確認のヒトp５３をコードする核酸
を導入するが、ここで、核酸はヒトp５３コード配列に結合されたオン−オフプ
ロモーターを含むものであり；b)プロモーターの誘発剤の存在下または不存在下
合成酵母培地中で酵母細胞をインキュベートし；c)有毒変異体を分析するが、こ
こで、野生型p５３を発現する酵母はプロモーターの誘発剤の存在下または不存
在下で生長し、p５３中に有毒変異を発現する酵母はプロモーターの誘発剤の存
在下で生長することを特徴とする方法を提供する。有毒変異を検出するために用
いられ得るオン−オフプロモーターの例にはＣＵＰ１オン−オフプロモーターが
含まれ、誘発の程度は５０−１００倍であり、プロモーターは培地中の銅の添加
によって誘発され得る。ＣＰＵ１プロモーターを用いるとき、銅はヒトp５３コ
ード配列に結合されたプロモーターの誘発剤として働く。同様に、いずれのプロ
モーターおよびプロモーターの誘発剤も本発明の方法に用いることができる。Toxic p53 mutations can also be detected using other promoter systems such as on-off promoters. For example, the invention is a method for detecting a toxic mutation in the human p53 gene, which comprises introducing into a yeast cell a nucleic acid encoding an unidentified human p53 in a cell, wherein the nucleic acid is linked to the human p53 coding sequence. An on-off promoter; b) incubating yeast cells in synthetic yeast medium in the presence or absence of an inducer of the promoter; c) analyzing virulent mutants, wherein wild type Yeast expressing p53 grows in the presence or absence of a promoter inducer, and yeast expressing a toxic mutation in p53 grows in the presence of a promoter inducer. . Examples of on-off promoters that can be used to detect toxic mutations include the CUP1 on-off promoter, the degree of induction is 50-100 fold, and the promoter can be induced by the addition of copper in the medium. . When using the CPU1 promoter, copper acts as an inducer of the promoter linked to the human p53 coding sequence. Similarly, any promoter and promoter inducer can be used in the methods of the invention.

【００７９】 本発明の方法によって、いくつかの変異が有毒であると確認された。有毒p５
３変異体に関するプロトコルのおよび結果の具体例の詳細な記載を実施例に記載
する。Several mutations have been identified as toxic by the method of the present invention. Toxic p5
A detailed description of the protocol and specific examples of results for the 3 variants is provided in the examples.

【００８０】 本発明はさらに、ヒトp５３遺伝子中の有毒サプレッサーの検出方法であって
、有毒変異が上記の方法によって検出され、さらに、酵母に第２の核酸を導入す
るが、第２の核酸はp５３変異体を発現し、第２の核酸はヒトp５３コード配列に
機能可能に結合されたプロモーターを含むことを特徴とする方法を提供する。第
２の核酸中の変異が有毒表現型を逆転させるものであれば、第２の核酸は有毒サ
プレッサー変異を含む。The present invention further provides a method for detecting a toxic suppressor in the human p53 gene, wherein the toxic mutation is detected by the above method, and further the second nucleic acid is introduced into yeast, wherein the second nucleic acid is Provided is a method of expressing a p53 variant, wherein the second nucleic acid comprises a promoter operably linked to the human p53 coding sequence. The second nucleic acid comprises a toxic suppressor mutation if the mutation in the second nucleic acid reverses the toxic phenotype.

【００８１】 別法として、第２の変異が、検出された有毒変異を含む核酸中に導入され得る
。ついで、両方の変異を含むこの核酸はついで酵母細胞中にされ得る。有毒変異
を含む核酸中の第２の変異が有毒表現型を逆転させるならば、第２の変異は有毒
サプレッサー変異である。Alternatively, a second mutation can be introduced into the nucleic acid containing the detected toxic mutation. This nucleic acid containing both mutations can then be placed in yeast cells. If the second mutation in the nucleic acid containing the toxic mutation reverses the toxic phenotype, then the second mutation is a toxic suppressor mutation.

【００８２】 本発明はさらに、ヒトp５３遺伝子中の優性変異の検出方法であって、p５３中
の変異が検出され、さらに酵母細胞に第２の核酸を導入するが、第２の核酸はヒ
トp５３コード配列に機能可能に結合されたプロモーターを含み、第２の核酸は
野生型ヒトp５３を細胞中に発現し、それによって、変異が優性か劣性かを判定
することを特徴とする方法を提供する。もし、観察された表現型が変異の表現型
であれば、変異は優性変異であると判定される。The present invention further provides a method for detecting a dominant mutation in the human p53 gene, wherein the mutation in p53 is detected and a second nucleic acid is further introduced into the yeast cell, wherein the second nucleic acid is human p53. A second nucleic acid expressing a wild-type human p53 in a cell comprising a promoter operably linked to a coding sequence, thereby providing a method of determining whether a mutation is dominant or recessive . If the observed phenotype is a phenotype of the mutation, then the mutation is determined to be a dominant mutation.

【００８３】 本発明の方法は重要なp５３腫瘍ホットスポットのトランス活性化に対する優
性不活性効果を克服し得るp５３変異形の直接分離を提供する。これはp５３優性
変異体を既に発現する株を任意に生じたPp５３変異形で形質転換し、低濃度のp
５３発現の野生型表現型を選択することによって行うことができた。これは優性
p５３変異を阻止するためのp５３アレルの開発に非常に有効である。The method of the present invention provides direct isolation of p53 variants that can overcome the dominant inactive effect on transactivation of important p53 tumor hotspots. This was done by transforming a strain already expressing the p53 dominant mutant with the arbitrarily generated Pp53 mutant and
This could be done by selecting the wild-type phenotype of 53 expression. This is dominant
It is very effective in developing p53 alleles to block p53 mutations.

【００８４】 本発明のスクリーニング方法はまたregl-５０１変異(Hovlandら)を含む酵母株
を用いることによって行い得る。株がグルコースの標準量中で生長し得るように
ＧＡＬプロモーターのグルコース抑止が欠けており、誘発の濃度でほぼ直線的増
加がガラクトースの漸増量の添加によって行われる。この変異は異種ＥcoＲ１エ
ンドヌクレアーゼ(Lewisら)を含む種々の遺伝子の酵母中の発現濃度を制御する
ために用いられてきた。Lewisらの文献をすべてこの明細書の記載とする。The screening method of the present invention can also be performed by using a yeast strain containing the regl-501 mutation (Hovland et al.). The GAL promoter lacks glucose repression so that the strain can grow in a standard amount of glucose, and a nearly linear increase in the concentration of induction is achieved by the addition of increasing amounts of galactose. This mutation has been used to control the expression level in yeast of various genes including the heterologous EcoR1 endonuclease (Lewis et al.). All of Lewis et al. Are referred to in this specification.

【００８５】 例えば、本発明は、ヒトp５３遺伝子中のスーパートランス活性化変異の検出
方法であって：レポーター遺伝子を含むregl-５０１変異酵母細胞を得るが、レ
ポーター遺伝子はヒトp５３が結合しているＤＮＡ配列に結合されており；この
酵母細胞に、ヒトｐ５３をコードしている核酸を導入するが、核酸はヒトｐ５３
コード配列に結合されたＧＡＬ１を含む誘発可能なプロモーターを含み；酵母細
胞をグルコースおよびグルコースおよびガラクトースの漸増濃度上に播種し；平
板上のコロニーを同定するが、ｐ５３中にスーパートランス活性化変異を発現す
るコロニーは白色またはピンクのコロニーを生じることを特徴とする方法を提供
する。For example, the present invention provides a method of detecting a supertrans-activating mutation in the human p53 gene, which comprises obtaining a regl-501 mutant yeast cell containing a reporter gene, the reporter gene being bound by human p53. Is linked to a DNA sequence; a nucleic acid encoding human p53 is introduced into the yeast cell, the nucleic acid being human p53.
Contains an inducible promoter containing GAL1 linked to the coding sequence; yeast cells were seeded on glucose and increasing concentrations of glucose and galactose; colonies on plates were identified, but with a supertransactivating mutation in p53. The expressing colonies provide white or pink colonies.

【００８６】 この検定は、グルコース、グルコースおよび第１選択濃度のガラクトース、グ
ルコースおよびその第１濃度よりも高いガラクトースの第２選択濃度のガラクト
ース；グルコースおよび第２濃度よりも高い第３選択濃度のガラクトース；グル
コースおよび第３濃度よりも高い第４選択濃度のガラクトース；グルコースおよ
び第４濃度よりも高い第５選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第５濃度
よりも高い第６選択濃度のガラクトースなどに別個に細胞を培養し、これにより
細胞がグルコースおよび、グルコースと増加濃度のガラクトースとを含有する平
板上にて培養することによって、行うことができる。This assay consists of glucose, glucose and a first selected concentration of galactose, glucose and a second selected concentration of galactose above the first concentration of galactose; glucose and a third selected concentration of galactose above the second concentration. Glucose and a fourth selective concentration of galactose higher than the third concentration; glucose and a fifth selective concentration of galactose higher than the fourth concentration; glucose and a sixth selective concentration of galactose higher than the fifth concentration, etc. Can be carried out by culturing the cells, and thereby culturing the cells on a plate containing glucose and glucose and an increased concentration of galactose.

【００８７】 本発明はさらに、ヒトｐ５３遺伝子の毒性突然変異を検出するための方法であ
って、ヒトｐ５３遺伝子が結合するＤＮＡ配列と連結されているレポーター遺伝
子を含有するｒｅｇｌ−５０１突然変異酵母細胞を入手し； この酵母細胞に、
ヒトｐ５３コード化配列と連結しているＧＡＬ１を含有する誘導プロモーターを
含有する、未確定のヒトｐ５３を細胞においてコードしている核酸を導入し；
得られた酵母細胞を、グルコース、またはグルコースおよび選択濃度のガラクト
ースそれぞれにて培養し； コロニーを平板上にて同定することを含む方法を提
供する、ここでは、野生型ｐ５３を発現するコロニーはグルコースにおいて赤色
コロニーを、グルコースおよび選択濃度のガラクトースにおいて赤色コロニーを
、グルコースおよび高濃度のガラクトースにおいて白色コロニーを産生し、また
ｐ５３に毒性突然変異を発現するコロニーはグルコースにおいて赤色コロニーを
産生し、グルコースおよび選択濃度のガラクトースにおいて赤色コロニーまたは
白色コロニーを産生しまたはコロニーを産生せず、グルコースおよび高濃度のガ
ラクトースにおいてコロニーを産生しない。The invention further provides a method for detecting a toxic mutation of the human p53 gene, which comprises a regl-501 mutant yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which the human p53 gene binds. To this yeast cell,
Introducing a nucleic acid encoding an undetermined human p53 in a cell containing an inducible promoter containing GAL1 linked to a human p53 coding sequence;
The resulting yeast cells are cultured in glucose, or glucose and galactose at selected concentrations, respectively; a method is provided that comprises identifying the colonies on a plate, wherein the colony expressing wild-type p53 is glucose. Colonies producing red colonies at glucose and selected concentrations of galactose, white colonies at glucose and high concentrations of galactose, and colonies expressing virulent mutations at p53 produced red colonies at glucose, glucose and It produces red or white colonies or no colonies at selected concentrations of galactose and no colonies at glucose and high concentrations of galactose.

【００８８】 ｒｅｇｌ−５０１突然変異酵母細胞を利用することにより、ｐ５３誘導レベル
の増大は、ガラクトース濃度を増大させることにより制御することができる。当
業者ならば、グルコース、およびグルコースと選択濃度のガラクトースとにおい
て細胞を培養することに基づく上述のスクリーニング検定を行うことができる。
選択濃度は、ガラクトースの増大濃度であり得る。そうするに当たり、当業者は
、ガラクトース濃度を必要に応じて変化させ、毒性突然変異を観察することがで
きる。例えば、細胞を、グルコース、グルコースおよび選択濃度のガラクトース
、およびグルコースおよび高濃度のガラクトースにおいて培養すればよい。グル
コースにおいて赤色コロニーが観察され、グルコースおよびガラクトースにおい
て赤色または白色コロニーが観察され、およびグルコースおよび高濃度ガラクト
ースにおいてコロニーが観察されなかったなら、毒性突然変異が同定されたこと
になる。グルコースにおいて赤色コロニーが観察され、グルコースおよび選択濃
度のガラクトースにおいてコロニーが観察されず、およびグルコースおよび高濃
度ガラクトースにおいてコロニーが観察されなかった場合も、毒性突然変異が同
定されたことになる。しかし、毒性効果の進行を観察するため、選択濃度を変え
ることにより、低レベル発現のｐ５３において低い毒性効果を観察し得る。グル
コース、グルコースおよび選択濃度の低いガラクトース、およびグルコースおよ
び高濃度のガラクトースにおいてその同じ毒性突然変異体を培養することにより
、毒性表現型の逐次進行を観察することができ、それは、グルコースにおける赤
色コロニーを観察し、グルコースおよびガラクトースにおける赤色または白色コ
ロニーを観察し、およびグルコースおよび高濃度ガラクトースにおけるコロニー
無しを観察することによって行う。細胞を死滅させることなく細胞成長を観察で
きるに充分なｐ５３を産生するために、いずれのガラクトース濃度が充分である
かが分かるまで、選択濃度を変動させればよい。この検定は、グルコース、グル
コースおよび第１選択濃度のガラクトース、グルコースおよびその第１濃度より
も高いガラクトースの第２選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第２濃度
よりも高い第３選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第３濃度よりも高い
第４選択濃度のガラクトース；グルコースおよび第４濃度よりも高い第５選択濃
度のガラクトース；グルコースおよび第５濃度よりも高い第６選択濃度のガラク
トースなどに別個に細胞を培養し、これにより細胞がグルコースおよび、グルコ
ースと増加濃度のガラクトースとを含有する平板上にて培養することにより、行
うことができる。By utilizing the regl-501 mutant yeast cells, the increased level of p53 induction can be controlled by increasing the galactose concentration. One of ordinary skill in the art can perform the screening assays described above based on culturing cells on glucose and glucose and galactose at selected concentrations.
The selective concentration can be an increasing concentration of galactose. In doing so, one of ordinary skill in the art can vary the galactose concentration as needed and observe toxic mutations. For example, cells may be cultured in glucose, glucose and a selective concentration of galactose, and glucose and a high concentration of galactose. If red colonies were observed on glucose, red or white colonies were observed on glucose and galactose, and no colonies were observed on glucose and high concentrations of galactose, then a virulent mutation was identified. A virulent mutation was also identified if red colonies were observed on glucose, no colonies on glucose and galactose at selected concentrations, and no colonies on glucose and high concentrations of galactose. However, in order to observe the progression of toxic effects, low toxic effects can be observed in low level expression of p53 by varying the selection concentration. By culturing glucose, glucose and low selective concentrations of galactose, and that same virulent mutant in glucose and high concentrations of galactose, a sequential progression of the toxic phenotype can be observed, which leads to red colonies in glucose. By observing, observing red or white colonies on glucose and galactose, and observing no colonies on glucose and concentrated galactose. The selection concentration may be varied until it is known which galactose concentration is sufficient to produce sufficient p53 to observe cell growth without killing the cells. This assay comprises glucose, glucose and a first selected concentration of galactose, glucose and a second selected concentration of galactose above its first concentration; galactose; glucose and a third selected concentration of galactose above a second concentration; glucose and The cells are separately cultured in a fourth selection concentration of galactose higher than the third concentration; glucose and a fifth selection concentration of galactose higher than the fourth concentration; glucose and a sixth selection concentration of galactose higher than the fifth concentration. , Thereby culturing the cells on a plate containing glucose and glucose and increasing concentrations of galactose.

【００８９】 本発明はまた、減少したトランス活性化（transactivation）能力を有するp53
変異体（これは、正常体、スーパートランス活性化変異体または非機能型変異体
に対して、減弱（weak）p53変異体と称される）の認識を提供する。例えば、変
異P250Lは、この変異体が高い構成的レベルでADH1プロモーターから発現される
場合には、プロモーター3xRGCに対しては低いトランス活性化を示し、BAXプロモ
ーターに対してはほとんどトランス活性化を示さない。本発明のスクリーニング
方法によるか、または腫瘍中で同定されている変異体p53の配列を介してかのい
ずれかによりp53変異体を同定する際には、減弱トランス活性化活性についてこ
の変異体を以下の工程によりスクリーニングすることができる：ヒトp53が結合
するDNA配列に連結されているレポーター遺伝子を含有する酵母細胞を得る工程
、ヒトp53コード配列に連結されている構成性プロモーター（例えば、ADH1）を
含む、ヒトp53をコードする核酸を酵母細胞に導入する工程、酵母細胞をグルコ
ース上にプレーティングする工程、およびプレート上のコロニーを同定する工程
であって、ここで、ADH1構成性発現条件下では白色コロニーを生じる野生型p53
と比較すると、減弱トランス活性化変異を発現するコロニーはピンクのコロニー
を生じる工程。減弱変異体は発現が高ければ高いほど白色のコロニーを生じ得る
。また、より高いレベルのp53の発現は、GAL1プロモーターおよび高レベルのガ
ラクトースでの誘導を使用して達成され得る。例えば、GAL1プロモーターが使用
されて上昇した濃度でのガラクトース存在下で誘導される場合、減弱トランスア
クチベーターは、高濃度のガラクトース（すなわち、高レベルの発現を誘導する
、高濃度のガラクトースを含むグルコースプレート上）でさえトランス活性化し
得ないので同定することができる。p53が結合するDNA配列は、3xRGC、p21、bax
またはp53が結合する任意の他の配列であり得る。本発明の方法で利用され得る
他の構成性プロモーターもまた、意図される。これらとしては、PGKおよび高レ
ベルのGPD系 (Vectors for constitutive and inducible gene expression in y
east. Mark Schena, Didier PicardおよびKeith R. Yamamoto、Guide to Yeast
Genetics and Molecular Biology; Methods in Enzymology、Christine Guthrie
およびGerald R. Fink編; 194巻 378-398頁)が挙げられる。任意の構成性プロモ
ーターが、本発明での使用のために適合され得る。The present invention also p53, which has a reduced transactivation capacity.
It provides recognition of mutants, which are referred to as weak p53 mutants relative to normal, supertransactivating mutants or non-functional mutants. For example, the mutation P250L shows low transactivation for the promoter 3xRGC and almost transactivation for the BAX promoter when the mutant is expressed at high constitutive levels from the ADH1 promoter. Absent. When identifying a p53 mutant either by the screening method of the invention or through the sequence of a mutant p53 identified in a tumor, this mutant is Can be screened by the step of: obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds, a constitutive promoter linked to the human p53 coding sequence (eg ADH1) Including a step of introducing a nucleic acid encoding human p53 into yeast cells, a step of plating the yeast cells on glucose, and a step of identifying colonies on the plate, wherein under ADH1 constitutive expression conditions. Wild-type p53 producing white colonies
Colonies expressing attenuating transactivating mutations produce pink colonies when compared to. Attenuating mutants can give rise to whiter colonies with higher expression. Also, higher levels of p53 expression can be achieved using induction with the GAL1 promoter and high levels of galactose. For example, when the GAL1 promoter is used and is induced in the presence of galactose at elevated concentrations, attenuating transactivators produce high levels of galactose (ie glucose containing high levels of galactose, which induces high levels of expression). Even on the plate) it cannot be transactivated and can therefore be identified. The DNA sequences to which p53 binds are 3xRGC, p21, bax
Or it can be any other sequence to which p53 binds. Other constitutive promoters that may be utilized in the methods of the invention are also contemplated. These include PGK and high-level GPD systems (Vectors for constitutive and inducible gene expression in y
east. Mark Schena, Didier Picard and Keith R. Yamamoto, Guide to Yeast
Genetics and Molecular Biology; Methods in Enzymology, Christine Guthrie
And Gerald R. Fink, Vol. 194, pp. 378-398). Any constitutive promoter can be adapted for use in the present invention.

【００９０】 本発明の研究では、同一のPCRフラグメント中に複数の変異体が発生すること
を減少させるために、標準的なPCR反応を選択してp53改変体を作製した。変異誘
発性PCR条件の使用により、より広いスペクトルの「スーパートランス」対立遺
伝子の作製を可能とすることができた。また、このスクリーニングを使用するこ
とにより、ある腫瘍サンプル中で観察されるp53変異体の機能特性のより良い理
解を導きうるかもしれない。In the present study, standard PCR reactions were selected to generate p53 variants in order to reduce the occurrence of multiple variants in the same PCR fragment. The use of mutagenic PCR conditions could allow the production of a broader spectrum of "supertrans" alleles. Also, the use of this screen may lead to a better understanding of the functional properties of p53 variants observed in certain tumor samples.

【００９１】 本発明はさらに、以下の工程による毒性p53を模倣しうる化合物のスクリーニ
ング方法を提供する：ヒトp53が結合するDNA配列に連結されているレポーター遺
伝子を含有する酵母細胞を入手する工程、非毒性変異体または野生型ヒトp53を
コードする核酸であって、ヒトp53コード配列に連結されている、GAL1を含む誘
導性プロモーターを含む核酸を酵母細胞に導入する工程、酵母細胞に化合物を導
入する工程、グルコース、ラフィノースまたはガラクトースのそれぞれの上に酵
母細胞をプレーティングする工程、および、野生型または非毒性変異体p53を発
現するコロニーの成長を予防して、グルコース上では赤色コロニー、ラフィノー
ス上では赤色コロニー、白色コロニーまたはコロニー無し、そしてガラクトース
上ではコロニー無しを提供する、毒性変異体を模倣する化合物を同定する工程。The invention further provides a method of screening for compounds capable of mimicking toxic p53 by the steps of: obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds, A step of introducing a nucleic acid encoding a non-toxic mutant or wild-type human p53, which is linked to a human p53 coding sequence and contains an inducible promoter containing GAL1, into a yeast cell, and introducing the compound into the yeast cell The steps of plating yeast cells on glucose, raffinose or galactose, respectively, and preventing the growth of colonies expressing the wild-type or non-toxic mutant p53 on the red colonies on glucose, raffinose. For red colonies, white colonies or no colonies, and no colonies on galactose Identifying a providing mimics toxic variant compounds.

【００９２】 あるいは、毒性変異体を模倣する化合物は、グルコースおよびガラクトース各
々の上に酵母細胞をプレーティングすることにより同定することができる。ここ
で、毒性変異を模倣する化合物はガラクトース上ではコロニーの成長を生じず、
p53を有さない細胞がガラクトース上で増殖することができる。Alternatively, compounds that mimic virulent variants can be identified by plating yeast cells on glucose and galactose, respectively. Here, a compound that mimics a toxic mutation does not cause colony growth on galactose,
Cells without p53 can grow on galactose.

【００９３】 また、毒性変異体を模倣する化合物の検出はオン−オフ（on-off）プロモータ
ーの使用を通じて達成することができる。以下の工程を含む毒性p53変異を模倣
し得る化合物のスクリーニング方法は、この１例である：ａ）非毒性変異体また
は野生型ヒトp53コード配列に連結されているオンーオフプロモーターを含む、
非毒性変異体または野生型ヒトp53をコードする核酸を酵母細胞中に導入する工
程；ｂ）化合物を酵母細胞に導入する工程；ｃ）プロモーターのインデューサー
存在下または非存在下で、合成酵母倍地中で酵母細胞をインキュベートする工程
；およびｄ）毒性変異を模倣する化合物を同定してプロモーターに対するインデ
ューサー存在下での酵母の増殖を予防する工程。Detection of compounds that mimic virulent mutants can also be accomplished through the use of on-off promoters. An example of this is a method of screening for compounds that can mimic virulent p53 mutations, which comprises the following steps:
Introducing a nucleic acid encoding a non-toxic mutant or wild-type human p53 into yeast cells; b) Introducing a compound into yeast cells; c) Synthetic yeast fold in the presence or absence of a promoter inducer Incubating yeast cells in the ground; and d) identifying compounds that mimic virulent mutations to prevent yeast growth in the presence of an inducer to the promoter.

【００９４】 上に記載したように、適切なオン−オフプロモーターは、銅存在下で誘導性で
あるCUP1プロモーターである。任意の誘導性プロモーターが本発明の方法で利用
され得る。As described above, a suitable on-off promoter is the CUP1 promoter, which is inducible in the presence of copper. Any inducible promoter can be utilized in the methods of the invention.

【００９５】 本発明はまた、以下の工程を含む、ヒトp53遺伝子におけるスーパートランス
活性化変異を模倣し得る化合物のスクリーニング方法を提供する：ヒトp53が結
合するDNA配列に連結されているレポーター遺伝子を含む酵母細胞を入手する工
程；ヒト非スーパートランス活性化変異体または野生型p53コード配列に連結さ
れている誘導性GAL1プロモーターを含む、野生型または変異体ヒトp53をコード
する核酸を酵母細胞に導入する工程、酵母細胞および化合物をラフィノース上に
プレーティングする工程、およびp53におけるスーパートランス活性化変異体を
模倣して白色またはピンクのコロニーを生じる、p53の非存在下では影響を有さ
ない化合物を同定する工程。The present invention also provides a method for screening a compound capable of mimicking a supertrans-activating mutation in the human p53 gene, comprising the steps of: reporting a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds. Obtaining a yeast cell containing: introducing into a yeast cell a nucleic acid encoding wild-type or mutant human p53, which comprises an inducible GAL1 promoter linked to a human non-supertrans-activating mutant or wild-type p53 coding sequence , Yeast cells and compounds are plated on raffinose, and compounds that have no effect in the absence of p53 that mimic supertrans-activating mutants in p53 yielding white or pink colonies. The process of identifying.

【００９６】 本発明の酵母細胞は、酵母株を作製するか、酵母株を購入するか、または任意
の他の供給源から酵母株を受け入れることにより得ることができる。ヒトp53を
コードする核酸を標的化組み込みにより酵母染色体に導入するか、あるいは核酸
の発現を生じるプラスミドトランスフォーメーションのような方法を介して導入
することができる。本発明のレポーター遺伝子は細胞のゲノム中に安定に組み込
まれ得るか、あるいはこのレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の安定な組み
込みのための配列を含まず、かつレポーター遺伝子の発現を生じるプラスミドを
介して導入され得る。The yeast cells of the present invention can be obtained by making yeast strains, purchasing yeast strains, or receiving yeast strains from any other source. The nucleic acid encoding human p53 can be introduced into the yeast chromosome by targeted integration or can be introduced via methods such as plasmid transformation which results in expression of the nucleic acid. The reporter gene of the invention can be stably integrated into the genome of the cell, or the reporter gene does not contain a sequence for stable integration of the reporter gene and is introduced via a plasmid which results in expression of the reporter gene. Can be done.

【００９７】 本発明において意図される変異体p53と他のタンパク質と間のタンパク質−タ
ンパク質相互作用を同定するために、従来的な酵母ツーハイブリッドアッセイを
利用することができる。これらの手順は、市販のキット (例えば、Matchmaker*
from Clontech, Palo Alto, CA)を使用し、「バイト（bait）」（本実施例にお
いては変異体p53核酸の全体または一部）をDNA結合タンパク質（例えば、GAL4）
に縮合する工程、「標的」（例えば、cDNAライブラリー）を活性化タンパク質（
例えば、VP-16の活性化エレメントドメイン）に縮合する工程を包含する。次い
で、両方の構築物を、（本実施例においてはGAL4結合エレメントの制御下で）選
択マーカー遺伝子を含む酵母細胞に形質転換する。従って、GAL4-バイト構築物
と相互作用するタンパク質またはタンパク質フラグメントのｃDNAを含む酵母コ
ロニーのみが検出される。標的構築物のcDNAを陽性コロニーから、GAL4−バイト
構築物と相互作用するタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードするcD
NAを単離するために使用される従来的な方法により単離する。Conventional yeast two-hybrid assays can be utilized to identify protein-protein interactions between mutant p53 contemplated in the present invention and other proteins. These procedures are based on commercially available kits (e.g. Matchmaker *
from Clontech, Palo Alto, Calif., and used a “bait” (in this example, all or part of the mutant p53 nucleic acid) as a DNA binding protein (eg, GAL4).
The step of condensing the "target" (eg, cDNA library) with the activating protein (
For example, the step of condensing the activation element domain of VP-16) is included. Both constructs are then transformed into yeast cells containing the selectable marker gene (under the control of the GAL4 binding element in this example). Therefore, only yeast colonies containing cDNAs of proteins or protein fragments that interact with the GAL4-bait construct are detected. CDNA of the target construct from a positive colony, a cDNA encoding a protein or protein fragment that interacts with the GAL4-bite construct.
Isolate by conventional methods used to isolate NA.

【００９８】 処置方法 本発明はまた、細胞に対して毒性の変異またはスーパートランス活性化変異を
含むヒトp53を、細胞に投与することにより、細胞において毒性を誘発する方法
を提供する。細胞に対して毒性の変異体を含むヒトp53は、V122A、V274I、C277W
、C277R、F338L、V157IまたはG279Rからなる群から選択することができる。また
、細胞に対して毒性の変異を含むヒトp53は、以下のものであり得る：変異V122A
および変異A76Tを含む変異体p53、または変異W91C、変異C124R、変異Q136K、変
異T150Aおよび変異T150Aを含む変異体p53、または変異C124R、変異Q136Kおよび
変異T150Aを含む変異体p53。スーパートランス活性化変異体を含むヒトp53は、
以下からなる群から選択され得る：S96P、H115R、S121C、S121F、T123A、C124Y
、C124F、Q167R、E171K、H178Y、S183L、D184Y、T231I、P191L、S240N、S116T、
N288K、F338L、S215T、T123S、N345S、D184G、E198V、T230I、V274A、W91R、H11
5R、S96P、S116T、N228K、T118A、T123P、L137R、A159T、M160T、I162V、D184G
、N210S、S215T、T230I、I232V、N239Y、N268S、E285A、C124R、Q136K、T150A、
A76T。Method of Treatment The present invention also provides a method of inducing toxicity in a cell by administering human p53 containing a mutation toxic to the cell or a supertrans-activating mutation to the cell. Human p53 containing mutants that are toxic to cells are V122A, V274I, C277W
, C277R, F338L, V157I or G279R. Also, human p53 containing a mutation that is toxic to cells can be: Mutation V122A
And mutant p53 containing mutation A76T, or mutant p53 containing mutation W91C, mutation C124R, mutation Q136K, mutation T150A and mutation T150A, or mutant p53 containing mutation C124R, mutation Q136K and mutation T150A. Human p53, which contains a supertrans-activating mutant,
It may be selected from the group consisting of: S96P, H115R, S121C, S121F, T123A, C124Y.
, C124F, Q167R, E171K, H178Y, S183L, D184Y, T231I, P191L, S240N, S116T,
N288K, F338L, S215T, T123S, N345S, D184G, E198V, T230I, V274A, W91R, H11
5R, S96P, S116T, N228K, T118A, T123P, L137R, A159T, M160T, I162V, D184G
, N210S, S215T, T230I, I232V, N239Y, N268S, E285A, C124R, Q136K, T150A,
A76T.

【００９９】 本発明はまた、プロモーターに連結されている毒性の変異体p53をコードする
核酸を細胞に導入し、それにより毒性変異体p53を細胞内で発現させ、増殖阻害
または細胞死を起こさせる工程により、細胞に毒性を誘発する方法を提供する。
さらに、本発明は、プロモーターに連結されているスーパートランス活性な変異
体p53をコードする核酸を細胞に導入し、その結果として細胞内でスーパートラ
ンス活性な変異体p53を細胞内で発現させて細胞死を起こすかまたは増殖を阻害
することにより、増殖を阻害する方法または細胞内で毒性を誘発する方法を提供
する。高発現で増殖を阻害する毒性変異体またはスーパートランス活性化変異体
をコードする核酸は、以下からなる群から選択される変異をコードする核酸を含
み得る：V122A、V274I、C277W、C277R、F338L、V157I、W91C、C124R、Q136K、T1
50AまたはG279R。毒性の変異体をコードする核酸は、変異V122Aおよび変異A76T
をコードする核酸、または変異W191C、変異C124R、変異Q136Kおよび変異T150Aを
コードする核酸、または変異C124R、変異Q136Kおよび変異T150Aをコードする核
酸。スーパートランス活性化変異をコードする核酸は、以下からなる群から選択
される変異をコードする核酸を含みうる：S96P、H115R、S121C、S121F、T123A、
C124Y、C124F、Q167R、E171K、H178Y、S183L、D184Y、T231I、P191L、S240N、S1
16T、N288K、F338L、S215T、T123S、N345S、D184G、E198V、T230I、V274A、W91R
、H115R、S96P、S116T、N228K、T118A、T123P、L137R、A159T、M160T、I162V、D
184G、N210S、S215T、T230I、I232V、N239Y、N268S、E285A、C124R、Q136K、T15
0A、A76T。The present invention also introduces into a cell a nucleic acid encoding a toxic mutant p53 linked to a promoter, whereby the toxic mutant p53 is expressed intracellularly and causes growth inhibition or cell death. The steps provide a method of inducing toxicity in a cell.
Furthermore, the present invention introduces into a cell a nucleic acid encoding a supertrans-active mutant p53 linked to a promoter, and as a result, expresses the supertrans-active mutant p53 in the cell and Methods of inhibiting proliferation or inducing intracellular toxicity by causing death or inhibiting proliferation are provided. A nucleic acid encoding a toxic mutant or a supertrans-activating mutant that inhibits growth at high expression may include a nucleic acid encoding a mutation selected from the group consisting of: V122A, V274I, C277W, C277R, F338L, V157I, W91C, C124R, Q136K, T1
50A or G279R. The nucleic acids encoding the toxic mutants are Mutant V122A and Mutant A76T.
Or a nucleic acid encoding the mutation W191C, the mutation C124R, the mutation Q136K and the mutation T150A, or a nucleic acid encoding the mutation C124R, the mutation Q136K and the mutation T150A. The nucleic acid encoding the supertrans-activating mutation may include a nucleic acid encoding a mutation selected from the group consisting of: S96P, H115R, S121C, S121F, T123A,
C124Y, C124F, Q167R, E171K, H178Y, S183L, D184Y, T231I, P191L, S240N, S1
16T, N288K, F338L, S215T, T123S, N345S, D184G, E198V, T230I, V274A, W91R
, H115R, S96P, S116T, N228K, T118A, T123P, L137R, A159T, M160T, I162V, D
184G, N210S, S215T, T230I, I232V, N239Y, N268S, E285A, C124R, Q136K, T15
0A, A76T.

【０１００】 毒性またはスーパートランス活性化変異を使用して、既知の腫瘍変異または既
知の優性致死（dominant negative）変異を克服することができる。例えば、毒
性またはスーパートランス活性化変異を使用して、癌患者に存在する変異または
癌を引き起こす変異を克服し、それにより増殖阻害または癌細胞の致死を導くこ
とができる。Toxic or supertrans-activating mutations can be used to overcome known tumor mutations or known dominant negative mutations. For example, virulent or supertrans-activating mutations can be used to overcome mutations that are present or cause cancer in cancer patients, thereby leading to growth inhibition or killing of cancer cells.

【０１０１】 上記のように、本発明の核酸をインビボ遺伝子治療技術に利用することができ
る。p53の細胞への投与の、文献中の例は多数存在する (GallagherおよびBrown,
1999 Annual Review of Oncology, 10 (2) 139-150)。毒性変異体をコードする
核酸を、ウィルス送達系、非ウィルス送達系、裸の（naked）DNAとして、または
リポソームを介して細胞へと送達することができる。ウィルス送達の例としては
、ウィルスベクターが感染細胞のゲノム中に安定に組み込まれて、そしてトラン
スダクションに細胞***を必要とする、レトロウィルス送達が挙げられる。レト
ロウィルスベクターは、認可されている遺伝子移入臨床プロトコルのほとんどで
使用されている (Roth and Cristiano, 1997 J. Natl. Cancer Inst., 89: 21-3
9)。As mentioned above, the nucleic acids of the invention can be utilized in in vivo gene therapy techniques. There are numerous examples in the literature of p53 administration to cells (Gallagher and Brown,
1999 Annual Review of Oncology, 10 (2) 139-150). Nucleic acids encoding toxic variants can be delivered to cells as viral delivery systems, non-viral delivery systems, naked DNA, or via liposomes. Examples of viral delivery include retroviral delivery, where the viral vector is stably integrated into the genome of infected cells and requires cell division for transduction. Retroviral vectors are used in most of the approved gene transfer clinical protocols (Roth and Cristiano, 1997 J. Natl. Cancer Inst., 89: 21-3.
9).

【０１０２】 p53置換療法で利用されている別のウィルス送達方法は、５型アデノウィルス
に基づくアデノウィルス送達方法である(RothおよびCristiano)。５型アデノウ
ィルスに加えて、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4およびAAV6のような他のアデノウィル
スが利用され得る。アデノウィルスは、広範な細胞型に対して高い効率でトラン
スダクションすることができ、活発に増殖している細胞に限定されない。アデノ
ウィルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれないので、一過的な発現ベクターであ
り、それゆえレトロウィルス導入の場合のような挿入変異誘発を引き起こす危険
性を有していない。発現が一過性であるので、生物に対して有害であるかもしれ
ない毒性変異体の継続的な発現の可能性を伴うことなく、細胞に対して毒性の変
異体p53の送達を達成することができ、これは細胞死または不可逆的な増殖停止
を生じる。Another viral delivery method utilized in p53 replacement therapy is the adenovirus delivery method based on adenovirus type 5 (Roth and Cristiano). In addition to adenovirus type 5, other adenoviruses such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 and AAV6 can be utilized. Adenovirus can transduce with high efficiency to a wide range of cell types and is not limited to actively growing cells. Since adenovirus is not integrated into the host cell genome, it is a transient expression vector and therefore does not carry the risk of causing insertional mutagenesis as in the case of retroviral transfer. To achieve delivery of mutant p53 that is toxic to cells without the possibility of continued expression of toxic mutants that may be harmful to the organism, since expression is transient Can result in cell death or irreversible growth arrest.

【０１０３】 単純ヘルペスウィルス (HSV) のような他のウィルスベクターも同様に、遺伝
子治療のために利用することができる。脳腫瘍の遺伝子治療のためのHSVの利用
が、文献で多数報告されており (McKieら、1996 British Journal of Cancer, 7
4: 745-752) 、機能的なp53タンパク質の細胞内送達を媒介するためには、ビリ
オンタンパク質との縮合タンパク質として製剤化されたHSVタンパク質VP22単独
で十分である (Phelanら、1998: Nature Biotechnology 16: 440-443）。Other viral vectors such as herpes simplex virus (HSV) can be utilized for gene therapy as well. The use of HSV for gene therapy of brain tumors has been extensively reported in the literature (McKie et al., 1996 British Journal of Cancer, 7
4: 745-752), the HSV protein VP22 alone formulated as a condensation protein with a virion protein is sufficient to mediate intracellular delivery of functional p53 protein (Phelan et al., 1998: Nature Biotechnology 16: 440-443).

【０１０４】 非ウィルス性送達方法としては、直接的なDNA注入およびカチオン脂質媒介性
遺伝子移入が挙げられる。フェーズＩ臨床試験は、DNA、より具体的には裸の（
すなわち、ウィルスベクターまたは合成ベクターを伴わない）野生型p53の、第
１期または第２期の肝腫瘍のいずれかを有する患者への、直接的な経皮筋肉内注
射を利用している(Habibら、1996 Cancer Detection and Prevention 20: 103-1
07; Fricker J. 1996 Molec. Med. Today 2: 361; Habib NA. 1997 4: 329-330)
。Non-viral delivery methods include direct DNA injection and cationic lipid mediated gene transfer. Phase I clinical trials use DNA, more specifically naked (
That is, using a direct transcutaneous intramuscular injection of wild-type p53 (without viral or synthetic vectors) to patients with either stage 1 or stage 2 liver tumors (Habib Et al., 1996 Cancer Detection and Prevention 20: 103-1.
07; Fricker J. 1996 Molec. Med. Today 2: 361; Habib NA. 1997 4: 329-330)
.

【０１０５】 カチオン脂質媒介性送達は、哺乳動物細胞により効率よくエンドサイトーシス
され得る、目的のトランスジーンを保有するプラスミドDNAと複合体化したカチ
オンリポソームの使用に関する。カチオン送達は比較的非毒性であり、おそらく
非免疫原性であるので、転移性の腫瘍の処置に必要であるかもしれない変異体p5
3の複数回投与が可能となる。ヌードマウスで増殖させたヒト乳癌に、リポソー
ムp53複合体を直接注入する研究では、第１期腫瘍の退化だけでなく、腫瘍再発
および転移の予防もまた、生じた (Nuら、1997 Human Gene Therapy 8: 177-185
)。Cationic lipid-mediated delivery involves the use of cationic liposomes complexed with plasmid DNA carrying the transgene of interest, which can be efficiently endocytosed by mammalian cells. Mutant p5 may be required for the treatment of metastatic tumors because cation delivery is relatively non-toxic and probably non-immunogenic
Multiple doses of 3 are possible. Direct injection of liposomal p53 complexes into human breast cancer grown in nude mice resulted in not only regression of stage 1 tumors but also prevention of tumor recurrence and metastasis (Nu et al., 1997 Human Gene Therapy. 8: 177-185
).

【０１０６】 さらに、本発明は、抗癌療法を投与することをさらに含む、毒性のヒトp53、
または毒性のp53をコードする核酸を投与することにより細胞内において毒性を
誘発する方法を提供する。抗癌療法としては、外科手術、化学療法、放射線療法
、免疫療法またはそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。化学療法剤の例と
しては、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびＳ−１が挙げられる。免疫
療法としては、インターロイキン−２およびインターロイキン−αの投与が挙げ
られる。Furthermore, the present invention provides a toxic human p53, which further comprises administering an anti-cancer therapy,
Alternatively, a method for inducing toxicity in a cell by administering a nucleic acid encoding toxic p53 is provided. Anti-cancer therapy may include surgery, chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy or any combination thereof. Examples of chemotherapeutic agents include cisplatin, 5-fluorouracil and S-1. Immunotherapy includes administration of interleukin-2 and interleukin-α.

【０１０７】 本発明を以下の実施例においてより詳細に説明する。本発明は多数の修飾およ
び改変が当業者に明らかであるので、この実施例は単なる例示を目的とする。The invention is explained in more detail in the examples below. This example is for purposes of illustration only, as the present invention is susceptible to numerous modifications and variations.

【０１０８】 （実施例） 酵母菌株、プラスミド、培地および試薬 ハプロイドS.cereviciae菌株ｙＩＧ３９７（Ｍａｔａ ａｄｅ２−１ ｌｅｕ
２−３，１１２ ｔｒｐ１−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１−１００ ｕ
ｒａ３−１ ＵＲＡ３ ３ｘＲＧＣ：：ＣＹＣ１：：ＡＤＥ２）を独自に構築し
て、Richard Iggo（Flamamら）によってｐ５３のトランスアクチベーションを
評価した。菌株は、最小ＣＹＣ１プロモーターのコントロール下に、ＡＤＥ２の
組み込まれたコピーを含む。３コピーのリボソーム遺伝子クラスター（ＲＧＣ）
に見出されたヒトｐ５３応答ＤＮＡエレメントをプロモーターの上流領域に挿入
する。したがって、ＡＤＥ２は、ｐ５３転写コントロール下にあり、ｐ５３によ
るトランスアクチベーション対立遺伝子は、適当なプレート上で酵母形質転換体
の色に基づいて容易に評点をつけることができる。野生型ｐ５３を発現している
コロニーは、制限量のアデニンを含んでいるプレート上では白色コロニーを生じ
ているアデニン原栄養体のように成長するが、非機能性ｐ５３を発現する場合、
小さい赤いコロニーが見られる。幾つかの実験では、菌株Ｔ３３４（Sclafani）
およびＳ１(Tranら)を用いて、ｐ５３の効果をテストし、それらをｙＩＧ３９７
誘導体と交配することによってディプロイドを得た。ハプロイド菌株、ＹＰＨ−
ｐ２１（ＭＡＴαｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒ
ｐ１−Δ６３ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１ ＵＲＡ３ ｐ２１：：ｐ
ＣＹＣ１：：ＡＤＥ２）（ｐ２１ ｐ５３結合サイトは、ｐ２１プロモーターの
２．４ｋｂ上流に見られる２０量体配列である）、およびＹＰＨ−ｂａｘ（ＭＡ
Ｔαｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−Δ６３
ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１ ＵＲＡ３ ｂａｘ：：ｐＣＹＣ１：：
ＡＤＥ２）（ｂａｘ ｐ５３結合サイトは、ｐ５３プロモーターの４８６−４４
８ｂｐ上流に見られる３９量体配列である）も本発明に用いた。それらによって
、ｙＩＧ３９７におけるｐ５３のトランスアクチベーション機能を評価すること
ができるが、ＡＤＥ２転写をコントロールするｐ５３応答エレメントが、それぞ
れｐ２１およびｂａｘプロモーターエレメントに変更された（Flamanら）。Example Yeast strains, plasmids, media and reagents Haploid S. cereviciae strain yIG397 (Mata ade 2-1 leu)
2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100 u
Ra3-1 URA3 3xRGC :: CYC1 :: ADE2) was independently constructed to assess p53 transactivation by Richard Iggo (Flamam et al.). The strain contains an integrated copy of ADE2 under the control of the minimal CYC1 promoter. Three-copy ribosomal gene cluster (RGC)
The human p53-responsive DNA element found in 1. is inserted into the upstream region of the promoter. Therefore, ADE2 is under p53 transcriptional control, and transactivation alleles by p53 can be easily scored on the appropriate plates based on the color of yeast transformants. Colonies expressing wild-type p53 grow like adenine prototrophs giving rise to white colonies on plates containing limiting amounts of adenine, but when expressing non-functional p53,
Small red colonies are visible. In some experiments, strain T334 (Sclafani)
And S1 (Tran et al.) Were used to test the effects of p53 and test them with yIG397
The diploid was obtained by mating with the derivative. Haploid strain, YPH-
p21 (MATαura3-52 lys2-801 ade2-101 tr
p1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 URA3 p21 :: p
CYC1 :: ADE2) (the p21 p53 binding site is a 20-mer sequence found 2.4 kb upstream of the p21 promoter), and YPH-bax (MA
Tαura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63
his3-Δ200 leu2-Δ1 URA3 bax :: pCYC1 ::
ADE2) (bax p53 binding site is 486-44 of p53 promoter).
A 39-mer sequence found 8 bp upstream) was also used in the present invention. They allow the evaluation of p53 transactivation function in yIG397, but the p53 response element controlling ADE2 transcription was changed to p21 and bax promoter elements, respectively (Flaman et al.).

【０１０９】 プラスミドｐＬＳ７６は、構成ＡＤＨ１プロモーターのコントロール下に完全
ヒトｐ５３ ｃＤＮＡをコードする。該プラスミドは、ｐＲＳ３１５（ＬＥＵ２
）に基づいている。ｐＬＳ８９は、強誘導ＧＡＬ１プロモーターのコントロール
下にｐ５３ ｃＤＮＡをコードする酵母発現ベクターである。ｐ５３−における
Ｂｓｍ１：：ＳｔｕＩ欠失以外はＰＬＳ７６と同一であるプラスミドｐＲＤＩ２
２−およびｐＬＳ８９（ＢｓｍＩ：：ＳｔｕＩ消化およびゲル精製後）を用いて
、前述したように（Flamamら）ギャップリペアクローニングを行った。簡単に述
べると、１２４位および１１２２位間のｐ５３ ｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ
増幅をｙＩＧ３９７に、直線ギャッププラスミドとともに共形質転換した。ＰＣ
Ｒ産物および直線プラスミドの両末端がオーバーラップするので、（それぞれ５
’および３’において７５および８０ｂｐ）、インビボ相同組換えは、完全ｐ５
３ ｃＤＮＡおよび環状発現ベクターを再構築することができる。Plasmid pLS76 encodes a fully human p53 cDNA under the control of the constitutive ADH1 promoter. The plasmid is pRS315 (LEU2
) Is based on. pLS89 is a yeast expression vector encoding p53 cDNA under the control of the strongly inducible GAL1 promoter. Plasmid pRDI2 identical to PLS76 except for the Bsm1 :: StuI deletion in p53-
Gap repair cloning was performed as previously described (Flamam et al.) Using 2- and pLS89 (after BsmI :: StuI digestion and gel purification). Briefly, PCR of p53 cDNA fragment between positions 124 and 1122
The amplification was cotransformed into yIG397 with the linear gap plasmid. PC
Since both ends of the R product and the linear plasmid overlap,
75 and 80 bp in'and 3 '), in vivo homologous recombination results in complete p5
3 cDNA and circular expression vectors can be reconstructed.

【０１１０】 ＣＭＶプロモーター下にヒトｐ５３ ｃＤＮＡをコードするプラスミドｐＣＭ
Ｖ−Ｎｅｏ−ＢａｍおよびｐＣ５３−ＳＮ３（Bakerら、１９９０、“野生型ｐ
５３によるヒト結腸直腸癌腫細胞増殖”Science、２４９：９１２−９１５）を
用いて哺乳動物細胞における発現実験を行った。ＳｇｒａＩ−ＳｔｕＩ ｐ５３
部分をｐＬＳ８９誘導体の同じフラグメントと置き換えて特異的突然変異体ｐ５
３ｓを構築した。プラスミドＰＧ１３は、ルシフェラーゼ遺伝子のｐ５３転写コ
ントロールを許す１３コピーのｐ５３応答エレメントを含む。プラスミドＭＧ１
５は、ｐ５３結合サイトの突然変異したコピーをもつコントロールベクターであ
る（Kernら）。ＰＧ１３およびＭＧ１５を用いて、哺乳動物細胞におけるｐ５３
のトランスアクチベーションをテストした。プラスミドｐＧＬ１０１２および１
１３８は、それぞれｂａｘ応答エレメントおよびｐ２１プロモーターから２．４
ｋｂ領域およびルシフェラーゼ遺伝子を含む。Plasmid pCM encoding human p53 cDNA under CMV promoter
V-Neo-Bam and pC53-SN3 (Baker et al., 1990, "wild type p.
Human colorectal carcinoma cell proliferation by S. 53 "Science, 249: 912-915) was used to perform expression experiments in mammalian cells. SgraI-StuI p53.
Replacing part with the same fragment of the pLS89 derivative, the specific mutant p5
3s was constructed. Plasmid PG13 contains 13 copies of the p53 response element that allows p53 transcriptional control of the luciferase gene. Plasmid MG1
5 is a control vector with a mutated copy of the p53 binding site (Kern et al.). P53 in mammalian cells using PG13 and MG15
Was tested for transactivation. Plasmids pGL1012 and 1
138 is 2.4 from the bax response element and the p21 promoter, respectively.
It contains the kb region and the luciferase gene.

【０１１１】 １％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロース（ＹＰＤ）または２００
ｍｇ／１のアデニンを添加したもの（ＹＰＤＡ）または適当な場合選択性培地中
で酵母菌株を培養した。ｐ５３のトランスアクチベーションは、一般に、５ｍｇ
／ｌのアデニンを含む合成培地において測定さえた。炭素源として２％がラクト
ースを含む（ＹＰＧＡＬ）プレートにおいて成長阻害を分析した。ｐ５３毒性対
立遺伝子の転写ポテンシャルを決定するために、炭素源として２％のラフィンノ
ース（Ｓｉｇｍａ）および可変低量のガラクトースを含むプレートを用いた。ラ
フィンノースの存在下、ＧＡＬ１プロモーターを抑制し、ガラクトースの添加に
よって誘発することができる。1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose (YPD) or 200
Yeast strains were cultivated in the addition of mg / 1 adenine (YPDA) or where appropriate in selective medium. Transactivation of p53 is generally 5 mg
It was even measured in a synthetic medium containing / l adenine. Growth inhibition was analyzed on plates containing 2% lactose as carbon source (YPGAL). To determine the transcriptional potential of the p53 virulent allele, plates containing 2% raffinose (Sigma) as a carbon source and variable low amounts of galactose were used. In the presence of raffinose, the GAL1 promoter can be repressed and induced by the addition of galactose.

【０１１２】 ランダム突然変異誘発実験、酵母におけるＰＣＲ組込み、ＤＮＡ回収および分析 最適反応条件下でＴＡＱ Ｌｏｎｇ Ｐｌｕｓ ポリメラーゼミックス（Stratag
ene）を用いるＰＣＲ反応のテンプレートとしてプラスミドｐＬＳ８９を用いた
。ユニバーサルプライマーｐＲＳａおよびｐＲＳｃを用いて、ｐ５３ ＣＤＮＡ
、そのＧＡＬ１プロモーターおよび酵母選択マーカーＴＲＰ１のための配列を含
む５ｋｂのフラグメントを作成した。該プライマーもまた、フラグメントの特異
的染色体組込みが起こるためのＬＹＳ２配列に対応する５０ｂｐのテールがあっ
た。ＰＣＲ反応物を沈降精製して、ＬｉＡｃプロトコルにより、ｙＩＧ３９７コ
ンピテント細胞の形質転換に用いた。トリプトファンを含まない合成培地で形質
転換物を選択し、リジン栄養要求性についてテストした。次いで、ｐ５３依存性
成長阻害およびトランスアクチベーションをテストするために、精製したＴＲＰ
−ｌｙｓ２クローンを低アデニンガラクトースプレートでテストした。 標準的方法によってゲノムＤＮＡを調製し、１２４および１１２２間のｐ５３
フラグメントをＰＣＲ増幅し、ｐＬＳ８９におけるｇａｐリペアを用いてクロー
ニングして酵母における表現型を確認し、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーを用い
て配列決定した。Random mutagenesis experiments, PCR integration in yeast, DNA recovery and analysis TAQ Long Plus polymerase mix (Stratag) under optimal reaction conditions.
The plasmid pLS89 was used as a template for the PCR reaction using ene). P53 CDNA using the universal primers pRSa and pRSc
, A 5 kb fragment containing the GAL1 promoter and the sequence for the yeast selectable marker TRP1 was generated. The primer also had a 50 bp tail corresponding to the LYS2 sequence for specific chromosomal integration of the fragment to occur. The PCR reaction was pellet purified and used to transform yIG397 competent cells according to the LiAc protocol. Transformants were selected on synthetic medium without tryptophan and tested for lysine auxotrophy. Purified TRP was then tested to test p53-dependent growth inhibition and transactivation.
The lys2 clone was tested on low adenine galactose plates. Genomic DNA was prepared by standard methods, p53 between 124 and 1122
The fragment was PCR amplified, cloned using the gap repair in pLS89 to confirm the phenotype in yeast and sequenced using the ABI373 automated sequencer.

【０１１３】 ウエスタンブロット 組み込まれたｐ５３をもつｙＩＧ３９７誘導体またはｐ５３発現プラスミドを
もつ形質転換体を選択的グルコース培地にて一夜培養した。細胞を洗浄し、ガラ
クトース含有培地で希釈してＧＡＬ１プロモーターを誘発した。種々の時点でア
リコートを集めた。滅菌酸洗浄ガラスビーズ（０．４５〜０．６ｍｍ）を含む細
胞溶解緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；１ｍＭのＥＤＴＡ
；０．１％のＳＤＳ；１ｘプロテアーゼインヒビターカクテル、ロシュ）にてタ
ンパク質抽出物を調製した。標準的プロトコルにしたがってブラッドフォードア
ッセイ（バイオラド）を行い、タンパク質濃度を測定した。プレキャストＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル（ＰＡＧＥ−ＯＮＥ、オウル・セパレーション・システムズ）を
用いて電気泳動を行った。使用説明書にしたがってセミドライエレクトロブロッ
ター（オウル・セパレーション・システムズ）を用いてＰＶＤＦ膜（イモビロン
−Ｐ、ミリポア）にタンパク質を移した。ｐＡｂ１８０１およびＤＯ−１モノク
ローナル抗体（サンタ・クルーズ）を１：２０００希釈して用いてｐ５３を検出
した。プロトコルにしたがってＥＣＬキット（アマーシャム）を用いて免疫検出
を行った。Western Blot Transformants with the yIG397 derivative with integrated p53 or p53 expression plasmid were cultured overnight in selective glucose medium. The cells were washed and diluted with medium containing galactose to induce the GAL1 promoter. Aliquots were collected at various time points. Cell lysis buffer (100 mM sodium phosphate, pH 7.0; 1 mM EDTA) containing sterile acid washed glass beads (0.45-0.6 mm).
Protein extracts were prepared with 0.1% SDS; 1x protease inhibitor cocktail, Roche). The Bradford assay (BioRad) was performed according to standard protocols to measure protein concentration. Precast SDS
-PAGE gel (PAGE-ONE, Owl Separation Systems) was used for electrophoresis. Proteins were transferred to PVDF membranes (Immobilon-P, Millipore) using a semi-dry electroblotter (Owl Separation Systems) according to the manufacturer's instructions. p53 was detected using pAb1801 and DO-1 monoclonal antibody (Santa Cruz) diluted 1: 2000. Immunodetection was performed using the ECL kit (Amersham) according to the protocol.

【０１１４】 Ｓａｏｓ―２細胞におけるトランスフェクション、ルシフェラーゼアッセイおよ
びウエスタンブロット 骨肉腫誘導ｐ５３ヌル細胞系ＳＡＯＳ−２を用いてｐ５３発現実験を行った。
１５％ＦＢＳ血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地（ギブコ）にて細胞を培養した。
Ｔ２５ｃｍ^２の細胞培養フラスコに接種し、リポフェクチン試薬（ギブコ）によ
て６０％コンフルエンスにてトランスフェクトした。安定したトランスフェクシ
ョンのために、精製したプラスミドＤＮＡ１．５ｇを用いた。完全培地に回収し
、リポフェクチンを除去した１日後、０．５ｍｇ／ｍｌにてＧ４１８（ギブコ）
による選択を行った。２〜３週間後コロニーを染色した。 ５０〜１００ｎｇのｐ５３発現プラスミドおよび１．５ｇのＰＧ１３またはＭ
Ｇ１５を用いて遷移トランスフェクション体中のｐ５３トランスアクチベーショ
ンアッセイを行った。細胞を回収し、溶解し、タンパク質抽出物を定量した。ル
シフェラーゼ・アッセイ・システム（プロメガ）を用いる単光子モニタープログ
ラムを用いてシンチレーションカウントを行うことにより、ルシフェラーゼ活性
を測定した。同じまたは同様に得られたタンパク質を用いてウエスタンブロット
分析を行った。ｃ−１９モノクローナル抗体（サンタ・クルーズ）を用いてｐ２
１を検出した。内部ローディングおよびトランスファーコントロールとして-チ
ュービュリンを用い、モノクローナル抗体（シグマ）によって検出した。Transfection in Saos-2 cells, luciferase assay and Western blot p53 expression experiments were performed using the osteosarcoma-induced p53 null cell line SAOS-2.
The cells were cultured in McCoy's 5A medium (Gibco) containing 15% FBS serum.
T25 cm ² cell culture flasks were inoculated and transfected with Lipofectin reagent (Gibco) at 60% confluence. 1.5 g of purified plasmid DNA was used for stable transfection. One day after collecting in complete medium and removing lipofectin, G418 (Gibco) at 0.5 mg / ml
Made a selection by. Colonies were stained after 2-3 weeks. 50-100 ng p53 expression plasmid and 1.5 g PG13 or M
The p53 transactivation assay in transition transfectants was performed using G15. Cells were harvested, lysed and protein extract quantified. Luciferase activity was measured by performing scintillation counting using a single photon monitor program using the Luciferase Assay System (Promega). Western blot analysis was performed with the same or similarly obtained proteins. p2 using c-19 monoclonal antibody (Santa Cruz)
1 was detected. As internal loading and transfer control-using tubulin, detected by monoclonal antibody (Sigma).

【０１１５】 野生型および突然変異ｐ５３のＧＡＬ１下のコントロール：毒性ｐ５３突然変異
の同定 酵母中にｐ５３が発現する結果として、高度に発現された場合、成長の低減化
が得られる。本発明は、発現が低い状態においても、この表現型を増強しうるｐ
５３突然変異体を同定することを追求した。このために、突然変異誘発性ＰＣＲ
法を用いてｐ５３突然変異体を作成した。完全ヒトｐ５３ｃＤＮＡをＧＡＬ１プ
ロモーターおよび酵母染色体への標的化組込みを可能にする酵母ＤＮＡ領域とと
もに増幅した。ｐ５３が過剰発現するとプラスミドが損失されるので、プラスミ
ド上で回収されるよりもむしろ、ｐ５３フラグメントを染色体（ＬＹＳ２遺伝子
座にて）に組み込んだ。回収されたｐ５３遺伝子の約１５％が、トランスアクチ
ベーションの低下を示す条件（すなわち、遺伝子当たりの１つの検出可能な突然
変異の平均よりも少ない）を用いた。Control under wild-type and mutant p53 under GAL1: Identification of virulent p53 mutations As a result of the high expression of p53 in yeast, reduced growth is obtained. The present invention is able to enhance this phenotype even under low expression.
We sought to identify 53 mutants. For this, mutagenic PCR
The method was used to generate p53 mutants. The fully human p53 cDNA was amplified with the GAL1 promoter and a yeast DNA region allowing targeted integration into the yeast chromosome. Since p53 overexpression results in plasmid loss, the p53 fragment was integrated into the chromosome (at the LYS2 locus) rather than recovered on the plasmid. Conditions were used in which about 15% of the recovered p53 genes showed reduced transactivation (ie, less than the average of one detectable mutation per gene).

【０１１６】 細胞をガラクトース（および少量のアデニン）含有プレートに植えた場合、検
査した形質転換体のほとんどは、野生型ｐ５３の誘発に一致する、小さな白いコ
ロニーを形成した。約１０％のクローンにおいて、より大きい赤いコロニーが見
られた。このような単離物は、突然変異ｐ５３を発現しているか、またはｐ５３
ｃＤＮＡをもたない可能性があった。少数の単離物（１０００個の形質転換物
当たり約１個）は、唯一の炭素源としてガラクトースを含む培地に植えてもコロ
ニーを形成しなかった。これらの後者のクローンは細胞を、Ｇａｌ１プロモータ
ーの誘発レベルを低くしうるラフィンノース培地に移した場合に成長した。ラフ
ィンノース培地へガラクトースを添加しても非成長表現型が得られた。これらの
単離物（ｙＩＲｐ５３−１９、図１）の１つをさらに調べた。When cells were plated on galactose (and a small amount of adenine) plates, most of the transformants examined formed small white colonies consistent with induction of wild-type p53. Larger red colonies were seen in approximately 10% of the clones. Such isolates express the mutant p53, or p53
There was a possibility that it had no cDNA. A small number of isolates (approximately 1 in 1000 transformants) did not form colonies when plated in medium containing galactose as the sole carbon source. These latter clones grew when the cells were transferred to raffinose medium, which can reduce the induction level of the Gal1 promoter. A non-growing phenotype was also obtained when galactose was added to the raffinose medium. One of these isolates (yIRp53-19, Figure 1) was further investigated.

【０１１７】 サザン分析では、非成長ｐ５３突然変異体（ｙＩＲｐ５３−１９）がＬＹＳ２
遺伝子座に正確に組込まれたことが明らかになった。ｐ５３の誘発もまた正常で
あった。他の２つのトランスアクチベーション不全突然変異体（ｙＩＲｐ５３−
７および−９）、野生型単離物（ｙＩＲ５３−５）およびｐＬＳ８９プラスミド
からの野生型ｐ５３を発現しているクローンに加えてこの突然変異体を、ガラク
トース中で２または４時間成長させ、ｐ５３モノクローナル抗体の組み合わせを
用いてｐ５３のレベルをウエスタンブロッティングによって測定した（図２）。
ｙＩＲｐ５３−１９は、全長ｐ５３を示したが、その発現レベルはわずかに減少
した。このことは、該タンパク質の毒性効果に関連しているかもしれない。この
結果は、成長がないことが、ｐ５３の過剰の誘発によるものではないことを示唆
している。さらに、フィルムの過剰露出によって見ることができる減損バンドも
また菌株間で比較することができ、タンパク質の安定性における差異が、成長が
ないことに起因するものではないことを示唆している。プロテアーゼ欠損菌株か
ら得られた抽出物においても減損は著しいので、減損は、抽出操作によるもので
はない。In Southern analysis, the non-growing p53 mutant (yIRp53-19) was LYS2.
It was revealed that it was correctly integrated into the locus. Induction of p53 was also normal. The other two transactivation deficient mutants (yIRp53-
7 and -9), wild type isolate (yIR53-5) and clones expressing wild type p53 from the pLS89 plasmid, this mutant was grown in galactose for 2 or 4 hours to give p53. Levels of p53 were measured by Western blotting using a combination of monoclonal antibodies (Figure 2).
yIRp53-19 displayed full length p53, but its expression level was slightly reduced. This may be related to the toxic effect of the protein. This result suggests that lack of growth is not due to the induction of p53 excess. Furthermore, the depleted bands visible by overexposure of the film can also be compared between strains, suggesting that the differences in protein stability are not due to lack of growth. The loss was not due to the extraction procedure, as the loss obtained from the protease-deficient strain was significant.

【０１１８】 組込みプロセスが酵母ゲノムに炭素源としてガラクトースを用いる場合に成長
を阻止するという突然変異を作成することはありそうもない。これを調べるため
に、ｙＩＲｐ５３−１９を他の菌株と交配した。ハプロイドと同様に、ディプロ
イド細胞は、ガラクトースでは成長しなかった。しかし、もとのハプロイドクロ
ーンとは異なり、ＬＹＳ２遺伝子のホモ接合体に対する機会に匹敵する、復帰突
然変異体が頻繁にあった（すなわち、有害なｐ５３突然変異の損失）。It is unlikely that the integration process will create mutations that arrest growth when using galactose as the carbon source in the yeast genome. To investigate this, yIRp53-19 was crossed with other strains. Like haploids, diploid cells did not grow on galactose. However, unlike the original haploid clones, there were frequent revertants (ie loss of deleterious p53 mutations), comparable in opportunity to homozygotes for the LYS2 gene.

【０１１９】 ヌクレオチド１２４〜１１２２の間のｙＩＲｐ５３−１９単離物におけるｐ５
３遺伝子の領域をゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。次いで、ｙＩＧ３
９７細胞へのギャップリペアを用いて、ＰＣＲ配列を含むＧＡＬ１ｐ５３発現プ
ラスミドを再構築した。グルコースにおいて形質転換体を選択した。５日後のガ
ラクトースプレートでは成長が見られなかったが、プラスミド上の野生型ｐ５３
をもつ細胞は成長を示した。したがって、ＰＣＲによって増幅されたｐ５３フラ
グメントが、非成長表現型の原因であるということが推断された。しかし、顕微
鏡で調べた場合、もとの単離物と比べて、細胞はガラクトース上で少量の***を
経験し、約５０〜１００個の細胞を含む異常な微小クローンを生じた。この表現
型は、プラスミド安定性によるものかあるいは交差給餌によるもののようである
。P5 in the yIRp53-19 isolate between nucleotides 124-1122
Regions of 3 genes were amplified by PCR from genomic DNA. Then yIG3
GAL1p53 expression plasmid containing the PCR sequence was reconstructed using gap repair to 97 cells. Transformants were selected on glucose. No growth was seen on the galactose plate after 5 days, but wild type p53 on the plasmid
The cells with a. Showed growth. Therefore, it was inferred that the p53 fragment amplified by PCR was responsible for the non-growth phenotype. However, when examined microscopically, the cells underwent a minor division on galactose compared to the original isolate, giving rise to aberrant microclones containing approximately 50-100 cells. This phenotype appears to be due to plasmid stability or cross-feeding.

【０１２０】 非成長ｐ５３対立遺伝子ｙＩＲｐ５３−１９の発現は、細胞***を阻止し、致死
性になる ｐ５３の誘発が単純に発育停止または細胞死の原因となるかどうかを決定する
ために、ガラクトース誘発の条件下におけるサバイバルを試験した。組込まれた
ｙＩＲｐ５３−１９を含む細胞をガラクトース上で成長させ、ｐ５３の誘発を抑
制するために種々の時点でグルコースプレートに植えた。最初の２４時間におい
て、野生型ｐ５３細胞（ｙＩＲｐ５３−５）は、ｐ５３を含まないコントロール
菌株と比べて穏やかな成長阻止を示し、グルコース上で高いプレーティング効力
を示した（図３）。それに対して、ｙＩＲｐ５３−１９細胞は、細胞力価におい
て増加を示さず、生存可能な細胞の絶対数において明らかな減少を示した（図３
）。ガラクトースにインキュベートした２４時間後、細胞の７％のみがコロニー
を生じた。Expression of the non-growth p53 allele yIRp53-19 blocks cell division and becomes lethal To determine whether induction of p53 simply causes stasis or cell death, galactose induction. Survival was tested under these conditions. Cells containing the integrated yIRp53-19 were grown on galactose and plated on glucose plates at various time points to suppress p53 induction. In the first 24 hours, wild-type p53 cells (yIRp53-5) showed mild growth arrest compared to control strains lacking p53 and high plating potency on glucose (Fig. 3). In contrast, yIRp53-19 cells showed no increase in cell titer and a clear decrease in absolute viable cell number (Fig. 3).
). After 24 hours of incubation in galactose, only 7% of the cells developed colonies.

【０１２１】 ガラクトース培地における細胞成長および***を顕微鏡的にも審査した。グル
コース上で新たに成長したコロニーからの細胞を水に懸濁し、洗浄し、簡単に音
波処理し、ガラクトースプレートに植えた。シンガー顕微鏡システムを用いて細
胞***およびコロニー形成を観察し、プレーティング後の種々の時点で写真を撮
った。野生型ｐ５３を発現している細胞は、１０時間の間に２〜３回***し、最
終的に、過剰発現ｐ５３の阻害効果を特徴とする、小さいコロニーを形成した。
これは、ｙＩＧ５３−１９細胞と対照的であった。細胞の大きさは増大したが、
細胞のほとんどは***しなかった。特徴的な最終抑制表現型はなかった。少しの
細胞が、１０時間の時点で発芽毛状体を示したが、それ以上の***は見られなか
った。これらの結果から、誘発性発現システムが、ｐ５３遺伝子の毒性突然変異
を単離したことが示された。Cell growth and division in galactose medium was also examined microscopically. Cells from newly grown colonies on glucose were suspended in water, washed, sonicated briefly and plated on galactose plates. Cell division and colony formation were observed using a singer microscopy system and photographed at various time points after plating. Cells expressing wild-type p53 divided 2-3 times in 10 hours, eventually forming small colonies characterized by the inhibitory effect of overexpressed p53.
This was in contrast to yIG53-19 cells. The size of the cells increased,
Most of the cells did not divide. There was no characteristic final suppressive phenotype. A few cells showed germinated ciliates at 10 hours, but no further division was seen. These results showed that the inducible expression system isolated a virulent mutation of the p53 gene.

【０１２２】 毒性突然変異ｐ５３−１９はトランス活性化を欠く。 標準的レポーター系をトランス活性化するｙＩＲｐ５３−１９の能力を試験す
るため、ｐ５３の発現を大きく減少させ、致死性を防いだ。炭素源として２％ラ
フィノースと少量のガラクトース（０．００６％および０．０１５％）を含有す
る、アデニンを制限した平板上で細胞を増殖させた。これにより、増殖を可能と
し、生じるコロニーの色に基づいて、可能なトランス活性化機能を検出する機会
が提供できる。これらの条件の下、ｙＩＲｐ５３−５クローンの野生型ｐ５３は
、白色コロニーの出現で示されるＡＤＥ２レポーター遺伝子の転写を導いた。ｙ
ＩＲｐ５３−１９では赤色コロニーのみが観察された。すなわち、ｐ５３−１９
は、リボソーム遺伝子クラスター（ＲＧＣ）反応性エレメントを含むプロモータ
ーでｐ５３のトランス活性化能を変化させると見られる。（以下に記載のごとく
、ヒト細胞における結果に基づき、ｐ５３−１９変異体はいくらかのトランス活
性化能を保持する。） ｐ５３−１９の１２４から１１２２の塩基領域のＤＮＡ配列は３６５における
ＴからＣ、８８７におけるＡからＧへの２つの塩基対の置換を示し、Ｖ１２２Ａ
およびＨ２９６Ｒのアミノ酸変化をもたらせた。表現型が単一の変化によるもの
か、組み合せによるものかを同定するため、突然変異を別々にテストした。相当
する領域をＰＣＲで増幅し、ＧＡＬ１発現プラスミド（上記参照）中にギャップ
修復によりクローンした。細胞をガラクトース上でインキュベートした場合、Ｈ
２９６Ｒ変異体の発現は、発現した野生型ｐ５３について見られると同様な増殖
減少をもたらした。しかし、ｐ５３−Ｖ１２２Ａ変異体は、最初の単離物の表現
型と同様に、増殖を全く妨げた。観察された表現型が株依存性か否かを確認する
ため、ｐ５３−Ｖ１２２Ａ発現の効果を３つの異なる株バックグラウンド（１つ
はプロテアーゼ欠損）でテストし、相当する結果を得た。 個々のｐ５３−Ｖ１２２Ａおよびｐ５３−Ｈ２９６Ｒ変異体をＡＤＨ１構成的
プロモーターを含むプラスミドにクローンすることにより、これら変異体各々の
毒性インパクトをさらに試験した。これは、ｐ５３発現の通常レベルと、野生型
ｐ５３による増殖阻害のないことを誘導する。Ｈ２９６ＲはＡＤＥ２レポーター
の正常なトランス活性化を示し（形質転換体は白色）、増殖は阻害されなかった
。ギャップ修復によるｐ５３−Ｖ１２２Ａ領域のクローンの試みは何ら正常サイ
ズのコロニーを生成しなかった。代わりに、インキィベーション４〜５日後に検
出できる微小コロニーが目視されたのみだった。別のアプローチとして、ｐ５３
Ｖ１２２Ａ遺伝子がＡＤＨ１プロモーターの制御下に置かれているプラスミドを
構築した。このプラスミドによる形質転換は、５０個以下の細胞を含む微小コロ
ニーのみをもたらし、その多くが４〜５日後に大きくなった。これらの微小コロ
ニーの頻度が、対照プラスミドで得られた正常なコロニーの頻度と匹敵するので
、形質転換を受ける能力は影響されなかった。すなわち、ｐ５３−Ｖ１２２Ａ変
異体は、通常の発現下でも酵母中で毒性である。The toxic mutation p53-19 lacks transactivation. To test the ability of yIRp53-19 to transactivate the standard reporter system, p53 expression was greatly reduced, preventing lethality. Cells were grown on adenine restricted plates containing 2% raffinose as carbon source and a small amount of galactose (0.006% and 0.015%). This allows growth and provides the opportunity to detect possible transactivating functions based on the color of the resulting colonies. Under these conditions, the wild-type p53 of the yIRp53-5 clone led to the transcription of the ADE2 reporter gene indicated by the appearance of white colonies. y
In IRp53-19, only red colonies were observed. That is, p53-19
Appears to alter the transactivating ability of p53 at promoters containing ribosomal gene cluster (RGC) responsive elements. (As described below, based on the results in human cells, the p53-19 mutant retains some transactivating ability.) The DNA sequence of the 124 to 1122 base region of p53-19 is T to C at 365. , Two base pair substitutions of A to G at 887, V122A
And H296R amino acid changes. Mutations were tested separately to identify whether the phenotype was due to a single change or a combination. The corresponding region was amplified by PCR and cloned into the GAL1 expression plasmid (see above) by gap repair. When cells were incubated on galactose, H
Expression of the 296R mutant resulted in a reduction in proliferation similar to that seen for the expressed wild type p53. However, the p53-V122A mutant completely prevented growth, similar to the phenotype of the original isolate. To confirm whether the observed phenotype was strain-dependent, the effect of p53-V122A expression was tested in three different strain backgrounds (one protease deficient) with comparable results. The toxic impact of each of these variants was further tested by cloning the individual p53-V122A and p53-H296R variants into a plasmid containing the ADH1 constitutive promoter. This induces normal levels of p53 expression and no growth inhibition by wild-type p53. H296R showed normal transactivation of the ADE2 reporter (transformants are white) and growth was not inhibited. Attempts to clone the p53-V122A region by gap repair did not produce any normal size colonies. Instead, only detectable microcolonies were visible after 4-5 days of incubation. Another approach is p53
A plasmid was constructed in which the V122A gene was placed under the control of the ADH1 promoter. Transformation with this plasmid yielded only microcolonies containing up to 50 cells, many of which grew after 4-5 days. The frequency of these microcolonies was comparable to that of normal colonies obtained with the control plasmid, so the ability to undergo transformation was not affected. That is, the p53-V122A mutant is toxic in yeast even under normal expression.

【０１２３】 ｐ５３Ｖ１２２Ａ毒性突然変異は野生型ｐ５３より優性である。 Ｖ１２２Ａ変異体タンパク質の相互作用および優位性を野生型および他のｐ５
３変異体タンパク質と共に試験した。一対の区別してマークしたＧＡＬ１発現プ
ラスミドを含む形質転換体を生じさせた。以下のｐ５３機能性変異体および野生
型ｐ５３を、Ｖ１２２Ａと組み合せてテストした：Ｐ１５１Ｓ、Ｐ１５２Ｌ、Ｐ
１７７Ｈ、Ｒ２１３Stop、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｙ、Ｇ２７９Ｅ、Ｑ３３１Stop
。Ｖ１２２Ａと野生型ｐ５３の共発現も非増殖表現型をもたらした。テトラマー
を形成できない２つのトランケーションはＶ１２２Ａ毒性を軽減しなかった。ト
ランス活性化を欠損するミスセンス突然変異全てがＶ１２２Ａ毒性作用のほんの
わずかの軽減をもたらした。これらの変異体タンパク質をそれら自体に発現させ
た場合、これらは増殖にほとんど影響を及ぼさない（表１）。 Ｖ１２２Ａ突然変異の優位性を示唆する増殖の減少が見られらが、毒性５３タ
ンパク質の十分なホモテトラマーが生成し、増殖を妨げる可能性がある。ｐ５３
タンパク質の量を減少させるため、ＡＤＨ１プロモーターの制御下のｐ５３を含
む形質転換体を生じさせた。両方の発現プラスミドを含む形質転換体は回収でき
なかった点でＶ１２２Ａ毒性は野生型ｐ５３より優性であった。しかし、２つの
ＤＮＡ結合変異体Ｐ１７７ＨおよびＧ２７９ＥはＶ１２２Ａ毒性を軽減し、わず
かに不規則な赤色コロニーを出現させる。これは、欠損タンパク質との相互作用
がＶ１２２Ａの毒性作用を打ち消すことを示している（表１）。野生型ｐ５３の
結果と共に、このことは、Ｖ１２２Ａの毒性作用はＤＮＡ結合を要求し、これは
タンパク質がホモテトラマーであるか、正常なＤＮＡ結合ｐ５３タンパク質と結
合した場合に起こることを示している。The p53V122A virulence mutation is dominant over wild-type p53. V122A mutant protein interactions and predominantly wild-type and other p5
Tested with 3 mutant proteins. Transformants containing a pair of differentially marked GAL1 expression plasmids were generated. The following p53 functional mutants and wild type p53 were tested in combination with V122A: P151S, P152L, P.
177H, R213Stop, S241F, C242Y, G279E, Q331Stop
. Co-expression of V122A and wild-type p53 also resulted in a non-proliferative phenotype. Two truncations that failed to form a tetramer did not reduce V122A toxicity. All missense mutations lacking transactivation resulted in only a slight reduction in V122A toxic effects. When these mutant proteins are expressed on their own, they have little effect on proliferation (Table 1). Although there is a reduction in growth suggesting a predominance of the V122A mutation, it is possible that sufficient homotetramers of the toxic 53 protein are produced and prevent growth. p53
To reduce the amount of protein, transformants containing p53 under the control of the ADH1 promoter were generated. V122A toxicity was predominant over wild-type p53 in that transformants containing both expression plasmids could not be recovered. However, the two DNA-binding mutants P177H and G279E reduce V122A toxicity and produce slightly irregular red colonies. This indicates that the interaction with the defective protein counteracts the toxic effect of V122A (Table 1). Together with the wild-type p53 results, this indicates that the toxic effect of V122A requires DNA binding, which occurs when the protein is a homotetramer or binds to the normal DNA binding p53 protein.

【０１２４】 第２部位ＤＮＡ結合突然変異がＶ１２２Ａ毒性を軽減する。 ＤＮＡ結合およびトランス活性化の毒性インパクトに対する重要性を試験する
ため第２部位突然変異をｐ５３Ｖ１２２Ａ対立遺伝子に導入した。二重変異体を
高発現ＧＡＬ１プラスミドまたは中発現ＡＤＨ１プラスミドにクローンした。Ｑ
３３１Stop突然変異と共に形成された二重突然変異は、ＧＡＬ１プロモーターか
ら発現させた場合、増殖欠陥の多くの緩和をもたらした。Ｖ１２２Ａと、Ｐ１７
７Ｈ、Ｍ２４６Ｌ、Ｅ２５８Ｋ、Ｇ２７９ＥおよびＲ２８２Ｑとの間で形成した
全ての二重突然変異が、ＧＡＬ１プロモーターから発現させた場合にＶ１２２Ａ
の毒性作用を減少させた（表２）。ＡＤＨ１プロモーターからの少ない発現によ
る抑制はなかった。これらのトランス活性化突然変異は、それら自体で発現させ
た場合、増殖を抑制しない。Ｐ１７７ＨおよびＧ２７９Ｅとの二重突然変異は、
野生型ｐ５３で見られる増殖に匹敵するコロニー増殖を示した。これらのコロニ
ーは赤色で、該二重突然変異タンパク質がＡＤＥ２レセプターをトランス活性化
できなかったことを示した。（野生型ｐ５３と比べて）コロニー増殖を大きく減
少した二重変異体Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２Ｑでさえも赤い微小コロニーを生じた
。本発明者らは、該Ｖ１２２Ａ突然変異が、他のトランス活性化突然変異とin c
isで組み合わさっても、増殖の抑制を起こすと結論する。また、それは他の公知
のトランス活性化変異体に復帰しない。A second site DNA binding mutation reduces V122A toxicity. A second site mutation was introduced in the p53V122A allele to test the importance of DNA binding and transactivation on the toxic impact. The double mutant was cloned into the high expressing GAL1 plasmid or the medium expressing ADH1 plasmid. Q
The double mutation formed with the 331 Stop mutation resulted in many alleviation of growth defects when expressed from the GAL1 promoter. V122A and P17
All double mutations formed with 7H, M246L, E258K, G279E and R282Q are V122A when expressed from the GAL1 promoter.
Reduced the toxic effects of (Table 2). There was no repression due to low expression from the ADH1 promoter. These transactivating mutations do not suppress growth when expressed on their own. Double mutations with P177H and G279E
It showed colony growth comparable to that seen with wild-type p53. These colonies were red, indicating that the double mutein was unable to transactivate the ADE2 receptor. Even the double mutant V122A :: R282Q, which greatly reduced colony growth (compared to wild-type p53), produced red microcolonies. We have found that the V122A mutation is in c with other transactivating mutations.
We conclude that even if combined with is, it causes suppression of proliferation. Also, it does not revert to other known transactivating mutants.

【０１２５】 酵母に対して毒性なさらなるｐ５３変異体の同定 変異体がｙＩＧ３９７細胞中の低コピーセントロメアプラスミドから発現され
た場合、毒性作用も見られるとして、１２４〜１１２２塩基（アミノ酸４２〜３
７４）の間のｐ５３ｃＤＮＡ領域に相当するＰＣＲ生成物をギャップ修復により
セントロメアプラスミドにクローンして毒性ｐ５３変異体の探索を拡大した。５
０００形質転換体のうち、５単離物が、ＧＡＬ１プロモーターから高発現した場
合に「非増殖」表現型を示すと同定された。これらを表３に示す。Ｖ１２２Ａ変
異体と同様、中発現構成的ＡＤＨ１プロモーターの制御下に、増殖抑制ｐ５３変
異体遺伝子を位置させる試み（すなわち、プラスミドｐＲＤＩ−２２へのギャッ
プ修復）は不成功に終わった。このように、これらの変異体ｐ５３も酵母に毒性
である。 コロニー２および３はＶ１２２Ａ突然変異を含んでいた。変異体クローン４は
２つの突然変異、すなわち、１つはコドン２７４で他は２７７の突然変異を含ん
でいた。両方のコドンにin vivoでｐ５３ミスセンス突然変異が見られたとして
も、Ｖ２７４Ｉアミノ酸変化はｐ５３腫瘍データベースに２回だけ表れ、Ｃ２７
７Ｗは新規である。変異体クローン５も２つの塩基置換を含み、ＤＮＡ結合ドメ
インのコドン２７７（Ｃ２７７Ｒ）およびテトラマー重合ドメインのコドン３３
８（Ｆ３３８Ｌ）でアミノ酸変化をもたらした。両方の変化もｐ５３腫瘍データ
ベースでは新規であるが、Ｃ２７７Ｒはin vitroおよびin vivoＤＮＡ結合に特
異的に影響するとして先に記載されている（Thukral et al; Saller et al.）。
変異体クローン６は単一の塩基対置換を有し、Ｇ２７９Ｒアミノ酸変化をもたら
した。コドン２７９突然変異は腫瘍中で同定され、ｐ５３腫瘍データーベースに
おけるＧ２７９Ｒアミノ酸変化６例がある。他の研究において、Ｇ２７９Ｅ変化
は、ガラクトース誘導プロモーターから過剰発現される場合、増殖にほとんど影
響しないトランス活性化変異体であることが判明した。 クローン５における２つのアミノ酸変化（Ｃ２７７ＲおよびＦ３３８Ｌ）をさ
らに試験した。ＧＡＬ１プロモーター制御下の個々の変異体ｐ５３を含むセント
ロメアプラスミドを構築した。ガラクトース上でのＣ２７７Ｒ変異体の発現は二
重変異体とほぼ同じ増殖抑制をもたらした。Ｆ３３８Ｌ変異体の過剰発現は、表
現型的に野生型ｐ５３ど同様であった（白色コロニーおよび穏当な増殖抑制）。Identification of Additional p53 Mutants that are Toxic to Yeast If the mutants were expressed from the low copy centromere plasmid in yIG397 cells, a toxic effect was also seen, with 124-1122 bases (amino acids 42-3).
The PCR product corresponding to the p53 cDNA region between 74) was cloned into the centromere plasmid by gap repair to expand the search for toxic p53 mutants. 5
Of the 000 transformants, 5 isolates were identified as exhibiting a "non-growing" phenotype when highly expressed from the GAL1 promoter. These are shown in Table 3. As with the V122A mutant, attempts to position the growth-suppressing p53 mutant gene under the control of the moderately expressed constitutive ADH1 promoter (ie, gap repair to plasmid pRDI-22) were unsuccessful. Thus, these mutant p53s are also toxic to yeast. Colonies 2 and 3 contained the V122A mutation. Mutant clone 4 contained two mutations, one with codon 274 and the other with 277. Even if p53 missense mutations were found in both codons in vivo, the V274I amino acid change appeared only twice in the p53 tumor database, and the C27
7W is new. Mutant clone 5 also contains two base substitutions, codon 277 (C277R) of the DNA binding domain and codon 33 of the tetramer polymerization domain.
8 (F338L) caused an amino acid change. Both changes are novel in the p53 tumor database, but C277R has been previously described as specifically affecting in vitro and in vivo DNA binding (Thukral et al; Saller et al.).
Mutant clone 6 had a single base pair substitution, resulting in a G279R amino acid change. Codon 279 mutations were identified in tumors, with 6 cases of G279R amino acid changes in the p53 tumor database. In other studies, the G279E alteration was found to be a transactivating mutant that had little effect on growth when overexpressed from a galactose-inducible promoter. Two amino acid changes in clone 5 (C277R and F338L) were further tested. A centromere plasmid containing the individual mutant p53 under the control of the GAL1 promoter was constructed. Expression of the C277R mutant on galactose resulted in almost the same growth inhibition as the double mutant. Overexpression of the F338L mutant was phenotypically similar to wild-type p53 (white colonies and moderate growth suppression).

【０１２６】 種々の反応エレメントに対する毒性ｐ５３変異体のトランス活性化能 低非毒性レベルで発現させた場合、毒性変異体の何れもが、ＲＧＣ反応性エレ
メントの３コピーを含む人工最少酵母プロモーターの転写を活性化できなかった
。この結果は、ＤＮＡ結合、トランス活性化および増殖抑制／毒性との直接的リ
ンクの観察とは対照的である。回収された毒性対立遺伝子が配列認識を変える可
能性を試験した。例えば、いくつかのプロモーターエレメントについてトランス
活性化欠如を示し得たが、他のものについては、野生型または増強された活性さ
えも示し得た。毒性ｐ５３対立遺伝子が、ｐ２１：：ＡＤＥ２またはｂａｘ：：
ＡＤＥ２レセプターを含む株におけるＧＡＬ１プロモーター制御下で発現された
。ｙＩＧ３９７で見られたように、全ての変異体の適度ないし高レベルの発現は
毒性であった。トランス活性化を評価するために、ＧＡＬ１発現プラスミドでの
形質転換体を、低アデニンおよび単独炭素源としてのラフィノースまたはラフィ
ノースおよび種々の量のガラクトース含有平板選択培地上で培養した（図４）。
低アデニンのグルコース平板およびアデニンなしのラフィノース平板を使用し、
トランス活性化が実際にタンパク質発現に反映していること、白／ピンクコロニ
ーが表現型的にアデニン原栄養株であることをチェックした。驚くべきことに、
ｙＰＨ−ｐ２１において、ｐ５３−Ｇ２７９Ｒを除いて、全ての毒性ｐ５３対立
遺伝子がラフィノース平板上で転写を活性化した。同じ低発現では野生型ｐ５３
による活性化がないので、これらの変異体はｐ２１に対してスーパートランスと
考えられた。ｐ５３−Ｇ２７９Ｒはまた、転写を活性化できるが、タンパク質発
現の高レベルにおいてであり（ラフィノース＋０．００３％ガラクトース）、野
生型ｐ５３と区別できない。より高い発現レベルで（≧０．５％ガラクトース）
、全ての毒性変異体で増殖が完全に抑制された。 毒性変異体は、それらのｂａｘ：：ＡＤＥ２レセプターをトランス活性化する
能力も試験した。ｐ２１と異なり、変異体の何れも、低発現条件下（ラフィノー
スのみ上で）ＡＤＥ２の活性化を示さなかった。しかし、少量のガラクトース（
０．００３％）の存在下、ｐ５３−Ｖ１２２Ａ変異体は明るいピンク色のコロニ
ーを生じ、野生型および他の変異体は赤色コロニーのみを生じた。より高いレベ
ルの野生型ｐ５３の発現は白色コロニーを生じた。Ability of toxic p53 mutants to transactivate various response elements When expressed at low non-toxic levels, all of the toxic mutants transcribed an artificial minimal yeast promoter containing 3 copies of the RGC responsive element. Could not be activated. This result is in contrast to the observation of a direct link with DNA binding, transactivation and growth inhibition / toxicity. The possibility that the recovered virulent allele would alter sequence recognition was tested. For example, it could show lack of transactivation for some promoter elements, but for others it could show wild-type or even enhanced activity. The virulent p53 allele is either p21 :: ADE2 or bax ::
It was expressed under the control of the GAL1 promoter in strains containing the ADE2 receptor. Moderate to high level expression of all mutants was toxic, as seen with yIG397. To assess transactivation, transformants with the GAL1 expression plasmid were cultured on low adenine and raffinose as the sole carbon source or raffinose and various selective amounts of galactose-containing plate selective medium (FIG. 4).
Using low adenine glucose plates and radenose plates without adenine,
We checked that transactivation actually reflected in protein expression and that white / pink colonies were phenotypically adenine prototrophs. Amazingly,
In yPH-p21, all virulent p53 alleles, except p53-G279R, activated transcription on raffinose plates. Wild-type p53 with the same low expression
These mutants were considered to be supertrans to p21, as there was no activation by P. p53-G279R can also activate transcription, but at high levels of protein expression (raffinose + 0.003% galactose) and is indistinguishable from wild-type p53. At higher expression levels (≧ 0.5% galactose)
, All the virulent mutants suppressed the growth completely. Toxic mutants were also tested for their ability to transactivate the bax :: ADE2 receptor. Unlike p21, none of the mutants showed activation of ADE2 under low expression conditions (on raffinose only). However, a small amount of galactose (
(0.003%), the p53-V122A mutant produced light pink colonies, and the wild type and other mutants produced only red colonies. Higher levels of wild-type p53 expression resulted in white colonies.

【０１２７】 本発明は、種々の毒性変異体間のトランス活性化能における微妙な差異が、３
つの異なるｐ５３反応性エレメント（ＲＧＣ、ｐ２１およびｂａｘ）とｐ５３の
可変発現を使用して特徴付けられることを示すものである。高いレベルの発現で
は毒性であるが、ｐ５３対立遺伝子はプロモーター選択性と、いくつかのｐ５３
反応性エレメントについて増強されたトランス活性化を示す。また、in vitro（
Wieczorek et al.）およびヒト細胞（Ludwig et al.; Thornborrow et al.）に
見られるｂａｘおよびｐ２１反応性エレメントに対する野生型ｐ５３の相対的Ｄ
ＮＡ結合親和性の差異は、低タンパク質発現条件を用いるこの酵母系において反
復される。The present invention has demonstrated that subtle differences in transactivating ability between various virulent mutants have resulted in 3
It is shown to be characterized using three different p53 responsive elements (RGC, p21 and bax) and variable expression of p53. Although toxic at high levels of expression, the p53 allele is associated with promoter selectivity and some p53
Shown is enhanced transactivation for reactive elements. Also, in vitro (
Wieczorek et al.) And relative D of wild-type p53 to bax and p21 responsive elements found in human cells (Ludwig et al .; Thornborrow et al.).
The difference in NA binding affinity is repeated in this yeast system using low protein expression conditions.

【０１２８】 ｐ５３−Ｖ１１２Ａによるｐ２１およびｂａｘトランス活性化についてのｐ５３
腫瘍変異体の遺伝子内抑制 ｐ５３−Ｖ１１２Ａは、ｐ２１またはｂａｘ応答配列のいずれかを含む最小酵
母プロモーターのトランス活性化の増強を示したので、このアミノ酸変化が、ト
ランス活性化の消失を引き起こすＤＮＡ結合ドメイン中他所のｐ５３腫瘍変異を
相殺することが予想され得る。いくつかの二重変異体を、ＧＡＬ１プロモーター
下で、高発現レベルで、ｙＰＨ−ｐ２１およびｙＰＨ−ｂａｘ株中で発現させた
。二重変異体ｐ５３−Ｖ１２２Ａ：：Ｐ２５２Ｌおよびｐ５３−Ｖ１２２Ａ：：
Ｒ２８２Ｑのみがｂａｘ：：ＡＤＥ２レポーターをトランス活性化させることが
でき、それらは小コロニー表現型も示した。これに反して、いくつかの二重変異
体はｙＰＨ−ｐ２１において白色またはピンク色のコロニーを生じ（表４）、こ
れはｐ２１応答配列に対するＶ１２２Ａ ｐ５３のスーパートランス性質に一致
した。驚くべきことに、短縮型ｐ５３−Ｖ１２２Ａ：：Ｑ３３１Ｓｔｏｐもピン
ク色のコロニーを生じた。ｐ２１およびｂａｘ応答配列に対するｐ５３の相対的
結合親和性によって、種々のｐ５３変異を再活性化させる能力の差が説明され得
る。ｙＰＨ株におけるトランス活性化の結果に照らして見れば、ｐ５３腫瘍変異
体と組合せて過剰発現させた場合にｐ５３−Ｖ１２２Ａが増殖阻害を保持すると
いう観察は、この対立遺伝子が混合四量体において優性ネガティブｐ５３変異体
に耐容性を示し、ＤＮＡ結合およびトランス活性化機能を保持し得ることを示唆
する。P53 for p21 and bax transactivation by p53-V112A
Intragenic Suppression of Tumor Variants p53-V112A showed enhanced transactivation of the minimal yeast promoter containing either p21 or bax responsive elements, so this amino acid change results in DNA binding causing loss of transactivation. It can be expected to offset p53 tumor mutations elsewhere in the domain. Several double mutants were expressed in the yPH-p21 and yPH-bax strains at high expression levels under the GAL1 promoter. Double mutants p53-V122A :: P252L and p53-V122A ::
Only R282Q was able to transactivate the bax :: ADE2 reporter, which also showed a small colony phenotype. In contrast, some double mutants produced white or pink colonies in yPH-p21 (Table 4), consistent with the supertrans nature of V122A p53 to the p21 responsive element. Surprisingly, the truncated p53-V122A :: Q331Stop also produced pink colonies. The relative binding affinity of p53 for the p21 and bax response elements may explain the difference in ability to reactivate various p53 mutations. In light of the results of transactivation in the yPH strain, the observation that p53-V122A retains growth inhibition when overexpressed in combination with the p53 tumor mutant, indicates that this allele is dominant in mixed tetramers. It is tolerated by negative p53 mutants, suggesting that it may retain DNA binding and transactivating functions.

【０１２９】 ｐ５３−Ｖ１２２Ａの発現はヒト細胞の増殖を妨げる 酵母中でｐ５３−Ｖ１２２Ａが独特の表現型を示したので、本発明者らはこの
新規なｐ５３変異体が哺乳動物細胞中で同様の表現型を生じるかどうかを研究し
た。ヒトｐ５３−ヌル細胞株ＳＡＯＳ−２の一過性および安定トランスフェクシ
ョンでの発現の結果を検討した。プラスミドｐＣ５３−ＳＮ３（参照）に基く一
連の発現ベクターをＶ１２２Ａ対立遺伝子および他の変異の発現用に構築した。
短縮型モノマー形態（Ｖ１２２Ａ：：Ｑ３３１Ｓｔｏｐ）および２つの二重変異
体（Ｖ１２２Ａ：：Ｇ２７９Ｅ；Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２Ｑ）を分析に含めた。
標準的な手順を使用して細胞をトランスフェクトし、ｐ５３の発現をウエスタン
ブロットによって確認した（図６参照）。Expression of p53-V122A Prevents Growth of Human Cells Since p53-V122A showed a unique phenotype in yeast, we found that this novel p53 mutant was similar in mammalian cells. It was investigated whether it caused a phenotype. The results of transient and stable transfection expression of the human p53-null cell line SAOS-2 were examined. A series of expression vectors based on the plasmid pC53-SN3 (reference) was constructed for expression of the V122A allele and other mutations.
A truncated monomer form (V122A :: Q331Stop) and two double mutants (V122A :: G279E; V122A :: R282Q) were included in the analysis.
Cells were transfected using standard procedures and p53 expression was confirmed by Western blot (see Figure 6).

【０１３０】 ｐ５３ Ｖ１２２Ａプラスミドによる増殖抑制は高く、野生型ｐ５３のものに
匹敵した（図５）。モノマー誘導体（Ｖ１２２Ａ：：Ｑ３３１ｓｔｏｐ）は増殖
抑制を示さなかった。このことは、Ｖ１２２Ａの効果に四量体化が必要とされる
ことを示唆する。興味深いことに、二重変異体Ｖ１２２Ａ：：Ｇ２７９Ｅによっ
て、野生型ｐ５３に近いレベルのコロニー形成阻害が引き起こされが、Ｇ２７９
Ｅ変異単独では、コントロールプラスミドに比較して有意にはコロニー形成は低
下しなかった。従って、酵母における結果と同様に、トランス活性化の欠損（Ｇ
２７９Ｅ変化に起因する）によって、増殖に対するＶ１２２Ａの効果は抑制され
ず、わずかに低下するのみである。ｐ５３腫瘍変異体Ｒ２８２Ｑおよび二重変異
体Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２Ｑも増殖抑制アッセイにおいて検討した。Ｒ２８２Ｑ
は、ｐ２１を誘導する能力によって判断したところ、部分的に機能を保持してい
ることが以前に示された。その観察に一致して、Ｒ２８２Ｑ変異体は高い増殖抑
制を示した。二重変異体Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２ＱおよびＲ２８２Ｑ単独によっ
て、匹敵する増殖抑制がもたらされた（図５）。Growth inhibition by the p53 V122A plasmid was high, comparable to that of wild-type p53 (FIG. 5). The monomer derivative (V122A :: Q331stop) did not show growth inhibition. This suggests that the effect of V122A requires tetramerization. Interestingly, the double mutant V122A :: G279E caused a level of colony formation inhibition close to that of wild-type p53, but G279.
The E mutation alone did not significantly reduce colony formation compared to the control plasmid. Therefore, similar to the result in yeast, transactivation deficiency (G
(Due to the 279E change), the effect of V122A on proliferation is not suppressed, only slightly reduced. The p53 tumor mutant R282Q and the double mutant V122A :: R282Q were also examined in a growth inhibition assay. R282Q
Was previously shown to be partially functional as judged by its ability to induce p21. Consistent with that observation, the R282Q mutant showed high growth inhibition. The double mutants V122A :: R282Q and R282Q alone resulted in comparable growth inhibition (FIG. 5).

【０１３１】 また、優性に作用するｐ５３ Ｖ１２２Ａの能力を、大過剰（１：４の比）の
種々の変異体ｐ５３タンパク質との同時トランスフェクションによって検討した
。Ｖ１２２Ａ変異体も野生型ｐ５３もＧ２７９ＥおよびＲ２８２Ｑに対して有意
な優性効果を示さなかった。The ability of p53 V122A to act dominantly was also examined by co-transfection with a large excess (1: 4 ratio) of various mutant p53 proteins. Neither the V122A mutant nor wild-type p53 showed a significant dominant effect on G279E and R282Q.

【０１３２】 哺乳動物細胞における野生型とｐ５３ Ｖ１２２Ａタンパク質との類似性から
、それらがｐ２１遺伝子の誘導に対して同様に作用するかどうかについてさらに
研究した（図６）。野生型ｐ５３によってｐ２１はかなり誘導された。ｐ５３−
Ｖ１２２Ａ変異体による誘導はずっと少なかった。予想どおり、Ｇ２７９Ｅ変異
体単独ではｐ２１の誘導はほとんど生じず、同様の結果はＶ１２２Ａ：：Ｇ２７
９Ｅ変異体を用いて観察された。この二重変異体によって上記のように高い増殖
抑制が生じたことを指摘すべきである（図５および表５参照）。従って、ｐ５３
−Ｖ１２２Ａ変異体は野生型タンパク質とは、ｐ２１標的遺伝子を誘導する能力
がかなり異なる。中程度のレベルのｐ２１がＲ２８２Ｑ変異体タンパク質によっ
て誘導されたが、二重変異体Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２Ｑは低下した誘導を示した
（図６）。この結果は、Ｖ１２２ＡはＳａｏｓ−２細胞における転写活性化が少
なくとも部分的に欠損しており、細胞増殖を単独で、または二重変異体で、ｐ２
１非依存的に抑制することを示唆する。The similarity of wild-type and p53 V122A proteins in mammalian cells further investigated whether they act similarly on the induction of the p21 gene (FIG. 6). P21 was significantly induced by wild-type p53. p53-
There was much less induction with the V122A mutant. As expected, the G279E mutant alone resulted in little induction of p21 and similar results were obtained with V122A :: G27.
Observed with the 9E mutant. It should be pointed out that this double mutant resulted in high growth inhibition as described above (see Figure 5 and Table 5). Therefore, p53
The -V122A mutant differs significantly from the wild-type protein in its ability to induce the p21 target gene. Moderate levels of p21 were induced by the R282Q mutant protein, while the double mutant V122A :: R282Q showed reduced induction (FIG. 6). This result indicates that V122A is at least partially deficient in transcriptional activation in Saos-2 cells, cell proliferation alone or in the double mutant, p2
1 suggests that the inhibition is independent.

【０１３３】 ｐ５３−Ｖ１２２Ａのトランス活性化能力をまた、プラスミドベースのルシフ
ェラーゼレポーターアッセイを使用して試験した。Ｓａｏｓ−２細胞を、ルシフ
ェラーゼレポーターおよびｐ５３発現プラスミドの両方で同時トランスフェクト
し、トランスフェクションの２４時間後にタンパク質抽出物を調製した。ｐ２１
プロモーターについて試験した場合、ｐ５３−Ｖ１２２Ａは野生型活性を示し、
二重変異体ｐ５３−Ｖ１２２Ａ：：Ｇ２７９Ｅは再活性化されなかった（図７、
パネルＡ）。しかし、ｐ５３−Ｖ１２２Ａは、ｂａｘ応答配列について、野生型
ｐ５３に比較してより高レベルでルシフェラーゼを誘導した（図７、パネルＢ）
。この効果はｐ５３の発現の差に起因するのではない。なぜなら、ウエスタンブ
ロットによって、Ｖ１２２Ａ対立遺伝子に対して同様のまたは幾分低下したｐ５
３タンパク質が示されたからである。驚くべきことに、ｐ５３−Ｖ１２２Ａは野
生型ｐ５３と同程度にＰＧ１３を用いたルシフェラーゼ活性の誘導に有効であっ
た（１３ｘＲＧＣ−ＲＥ：：ｌｕｃ）（図７、パネルＣ）。さらに、ｐ５３−Ｇ
２７９Ｅはこのアッセイにおいて不活性であったが、ｐ５３−Ｖ１２２Ａ：：Ｇ
２７９Ｅは活性であった。ＭＤＭ２：：ルシフェラーゼレポーター系を用いて試
験した場合、ｐ５３−Ｖ１２２ＡおよびＧ２７９Ｅとの二重変異体は野生型のよ
うに活性であった。The transactivating ability of p53-V122A was also tested using a plasmid-based luciferase reporter assay. Saos-2 cells were co-transfected with both the luciferase reporter and the p53 expression plasmid and protein extracts were prepared 24 hours after transfection. p21
P53-V122A shows wild-type activity when tested for promoters,
The double mutant p53-V122A :: G279E was not reactivated (Fig. 7,
Panel A). However, p53-V122A induced higher levels of luciferase for the bax response element compared to wild-type p53 (FIG. 7, panel B).
. This effect is not due to the differential expression of p53. Because Western blot revealed a similar or somewhat reduced p5 to the V122A allele.
This is because 3 proteins are shown. Surprisingly, p53-V122A was as effective in inducing luciferase activity with PG13 as wild-type p53 (13xRGC-RE :: luc) (Figure 7, panel C). Furthermore, p53-G
279E was inactive in this assay, but p53-V122A :: G
279E was active. Double mutants with p53-V122A and G279E were as active as wild type when tested with the MDM2 :: luciferase reporter system.

【０１３４】 酵母およびヒト細胞中での種々の毒性およびスーパートランス変異体の結果の
比較のまとめを表５に示す。酵母および哺乳動物細胞における応答の間には、特
に酵母およびヒト細胞中に配置した場合の応答配列の差および発現系の差で、一
般的な相関がある。A summary of comparative results of various virulence and supertrans mutants in yeast and human cells is shown in Table 5. There is a general correlation between responses in yeast and mammalian cells, particularly in response elements and expression systems when placed in yeast and human cells.

【０１３５】 ｐ５２ Ｖ１２２Ａ変異の致死効果 酵母は野生型ｐ５３および腫瘍細胞由来の種々のｐ５３変異体の機能評価に有
用な系であることが判明した。ｐ５３によって認識されるヒト遺伝子由来のプロ
モーターエレメントを利用する酵母中のレポーター系を使用することによって、
ｐ５３の機能ドメイン（すなわち、トランス活性化およびＤＮＡ結合）の精査が
可能になった。以前、ｐ５３は野生型酵母の増殖を阻害でき、この阻害はそのＤ
ＮＡ結合能力に関連することが示された（３０）。ＤＮＡ結合ドメインの異なる
領域におけるいくつかの毒性変異体を単離して、本発明は、ｐ５３変異体が酵母
のみならず哺乳動物細胞においても増殖を阻害するより高い能力を有して生成可
能であることを示す。ｐ５３変異体の以前の研究には、構成性ＡＤＨ１プロモー
ターの制御下でのタンパク質発現が一般に含まれていた。Lethal effect of p52 V122A mutation Yeast was found to be a useful system for functional evaluation of wild-type p53 and various tumor cell-derived p53 mutants. By using a reporter system in yeast that utilizes promoter elements derived from the human gene recognized by p53,
Probing the functional domains of p53 (ie transactivation and DNA binding) has become possible. Previously, p53 was able to inhibit the growth of wild-type yeast, this inhibition
It has been shown to be associated with NA binding capacity (30). By isolating several toxic mutants in different regions of the DNA binding domain, the present invention allows the p53 mutants to be generated with greater ability to inhibit growth in mammalian cells as well as yeast. Indicates that. Previous studies of p53 mutants generally included protein expression under the control of the constitutive ADH1 promoter.

【０１３６】 本発明以前には、酵母中で致死的なｐ５３変異体は報告されていなかった。発
現された変異体ｐ５３に応答しての***能力の迅速な損失に生存性の損失が続い
た。インビトロで生成したかまたは腫瘍から回収したｐ５３変異の特徴付けには
、一般にｐ５３の構成性プロモーターカセットへのｐ５３のクローン化が含まれ
ていた。本明細書に示すように、このレベルの発現は毒性ｐ５３変異体の増殖を
妨げるようである。従って、低発現かまたは誘導性プロモーターの使用によるか
のいずれかの条件を使用してのみ、そのような変異体を単離することが可能であ
る。構成性ＡＤＨ１プロモーターを用いる中程度レベルの発現でさえ細胞増殖を
妨げた。このことによってなぜこのクラスのｐ５３変異体が以前に単離されなか
ったかが説明される。ＧＡＬ１プロモーターは理想的であることが判明した。な
ぜなら、その発現レベルは増殖に使用される糖補充物によって変動させることが
できるからである。この特徴も、本明細書において、転写のスーパーインデュー
サーである新規ｐ５３変異体を特徴付けるために使用している。Prior to the present invention, no lethal p53 mutant in yeast was reported. A rapid loss of mitotic capacity in response to the expressed mutant p53 was followed by a loss of viability. Characterization of p53 mutations generated in vitro or recovered from tumors generally included cloning of p53 into the constitutive promoter cassette of p53. As shown herein, this level of expression appears to prevent the growth of virulent p53 mutants. Therefore, it is possible to isolate such variants only using conditions that are either low expression or by the use of inducible promoters. Even moderate levels of expression using the constitutive ADH1 promoter prevented cell proliferation. This explains why this class of p53 variants was not previously isolated. The GAL1 promoter turned out to be ideal. Because its expression level can be varied depending on the sugar supplement used for growth. This feature is also used herein to characterize a novel p53 mutant that is a transcription superinducer.

【０１３７】 ウエスタンブロット分析に基けば、発現タンパク質は正常には酵母およびヒト
細胞中で安定である。酵母中で種々のｐ５３機能性変異体と一緒にＶ１２２Ａ変
異体タンパク質を同時発現させた結果によって、それが野生型および変異体ｐ５
３と相互作用できることが示される。野生型ｐ５３と同時発現させた場合Ｖ１２
２Ａ変異体は増殖に対する強い優性効果を有するが、ＤＮＡ結合変異の存在下で
はその効果はずっと少ない。同様に、Ｖ１２２Ａであり、四量体化ドメインを欠
損する二重変異体は毒性ではない。ＤＮＡ接触または適正な折りたたみに関与す
る部位での変化したアミノ酸を有する二重変異体もまたＶ１２２Ａの致死効果を
低下させた。The expressed proteins are normally stable in yeast and human cells based on Western blot analysis. The co-expression of the V122A mutant protein with various p53 functional mutants in yeast resulted in wild-type and mutant p5
It is shown that it can interact with 3. V12 when co-expressed with wild-type p53
The 2A mutant has a strong dominant effect on proliferation, but its effect is much less in the presence of DNA binding mutations. Similarly, the double mutant that is V122A and lacks the tetramerization domain is not toxic. Double mutants with altered amino acids at sites involved in DNA contact or proper folding also reduced the lethal effect of V122A.

【０１３８】 ｐ５３−Ｖ１２２Ａ変異体は使用したＲＧＣ酵母レポーター系における転写が
完全に欠損している。これは、増殖が完全には損なわれない、二重変異体を用い
た低レベルの転写の条件下で示された。レポーター系にはｐ２１のようなプロモ
ーターエレメントより低い結合親和性を有するＲＧＣ結合部位を利用したので、
Ｖ１２２Ａ変異体が特異性の変化を導いた可能性がある。単純に低下した結合能
力が存在した場合、この変異体が増殖に対して野生型ｐ５３より高い効果を有す
ることはなさそうである。この位置の近くの変異体Ｓ１２１Ｆが記載されている
。しかし、これは配列特異性のわずかな変化のみを示した（Freeman et al.）。The p53-V122A mutant is completely defective in transcription in the RGC yeast reporter system used. This was shown under conditions of low level transcription with the double mutant, where growth was not completely impaired. Since the reporter system utilized an RGC binding site that has a lower binding affinity than promoter elements such as p21,
It is possible that the V122A mutant led to a change in specificity. It is unlikely that this mutant would have a greater effect on growth than wild-type p53 if simply reduced binding capacity was present. A variant S121F near this position has been described. However, it showed only slight changes in sequence specificity (Freeman et al.).

【０１３９】 驚くべきことに、本研究において同定した毒性変異体対立遺伝子の全ては、３
コピーのＲＧＣ ｐ５３応答配列を含む最小酵母プロモーターのトランス活性化
を欠損しているようであった。変異体の唯一の効果がｐ５３のＤＮＡ結合能力を
低下させることであれば、ＤＮＡ結合のトランス活性化と野生型および変異体ｐ
５３による増殖阻害との間の表現型の相関に基けば、毒性は生じそうにない。ｂ
ａｘおよびｐ２１応答配列についてのトランス活性化の分析によって、全ての毒
性ｐ５３変異体がいくつかのプロモーターエレメントについてのトランス活性化
能力を保持しているだけでなく、野生型ｐ５３に比較して増強された「スーパー
トランス」活性を有するようであることが明らかになった。特に、ｐ５３−Ｖ１
２２Ａは、野生型ｐ５３とは異なり、非常に低レベルの発現でｂａｘ：：ＡＤＥ
２およびｐ２１：：ＡＤＥ２の転写を活性化した。ｐ５３−Ｇ２７９Ｒは試験し
たいずれのプロモーターエレメントについてもトランス活性化の増強を示さなか
ったが、ｐ２１：：ＡＤＥ２について正常なトランス活性化を示し、中程度また
は高い発現で明らかに毒性を示した。この変異体は異なるｐ５３応答配列に対す
る高いＤＮＡ結合親和性を有し得る。Surprisingly, all of the virulent mutant alleles identified in this study contained 3
It appeared to lack transactivation of the minimal yeast promoter containing a copy of the RGC p53 responsive element. If the only effect of the mutant is to reduce the DNA binding capacity of p53, transactivation of DNA binding and wild type and mutant p
Based on the phenotypic correlation between growth inhibition by 53, toxicity is unlikely to occur. b
Analysis of transactivation for the ax and p21 response elements revealed that not only all virulent p53 mutants retain their transactivating ability for some promoter elements, but were enhanced compared to wild-type p53. It was revealed that it seems to have "supertrans" activity. In particular, p53-V1
22A differs from wild-type p53 in bax :: ADE with very low levels of expression.
2 and p21 :: ADE2 transcription was activated. p53-G279R did not show enhanced transactivation for any of the promoter elements tested, but showed normal transactivation for p21 :: ADE2 and was clearly toxic at moderate or high expression. This variant may have a high DNA binding affinity for different p53 responsive elements.

【０１４０】 トランス活性化の増強されたｐ５３変異体は、ＤＮＡ結合ドメイン中の他所の
非機能性変異を遺伝子内で抑制することができる可能性がある。抑制の程度は、
所定の応答配列に対するｐ５３の相対親和性および非機能性変異によって導入さ
れた動揺の程度によっても影響されそうである。ｐ５３−Ｖ１２２Ａは実際、ｐ
２１：：ＡＤＥ２について多数の非機能性腫瘍変異体を再活性化することができ
た（表６参照）。２つの変異のみがｂａｘ：：ＡＤＥ２トランス活性化について
部分的にまたは完全に再活性化され、予想どおりどの二重変異体もＲＧＣ：：Ａ
ＤＥ２について活性ではなかった（表１参照）。A p53 mutant with enhanced transactivation may be able to suppress non-functional mutations elsewhere in the DNA binding domain within the gene. The degree of suppression is
It is also likely affected by the relative affinity of p53 for a given response element and the degree of perturbation introduced by the non-functional mutation. p53-V122A is actually p
It was possible to reactivate many non-functional tumor variants for 21 :: ADE2 (see Table 6). Only two mutations were partially or completely reactivated for bax :: ADE2 transactivation, and as expected, any double mutant showed RGC :: A.
It was not active for DE2 (see Table 1).

【０１４１】 本発明は、酵母中でｐ５３の毒性変異体を選択することによって、関連する変
化した機能特性を示すｐ５３変異体の単離が容易になることを示す。酵母中での
ｐ５３機能アッセイは、ヒト腫瘍から単離された不活化変異の特徴付けにおいて
信頼性があり、高感度であることが繰り返し実証された。しかし、ヒト細胞にお
けるわずかなまたは増強した機能変異の効果に対する酵母アッセイの予測可能性
を評価する必要があった。ヒト腫瘍細胞株におけるこれらの実験によって、ｐ５
３−Ｖ１２２Ａ変異体が生物学的機能を保持し、腫瘍ｐ５３変異体を部分的に再
活性化し、ｂａｘ応答配列についての一過性ルシフェラーゼアッセイにおけるト
ランス活性化の増強を示すことが示される。The present invention shows that selecting virulent mutants of p53 in yeast facilitates the isolation of p53 mutants with associated altered functional properties. The p53 functional assay in yeast has repeatedly been demonstrated to be reliable and sensitive in characterizing inactivating mutations isolated from human tumors. However, it was necessary to assess the predictability of yeast assays for the effects of subtle or enhanced functional mutations in human cells. These experiments in human tumor cell lines showed that p5
It is shown that the 3-V122A mutant retains biological function and partially reactivates tumor p53 mutants, showing enhanced transactivation in a transient luciferase assay for bax response elements.

【０１４２】 Ｖ１２２Ａ単一変異体は、ヒトＳａｏｓ−２細胞のコロニー形成を阻止する能
力に関して野生型ｐ５３と区別することができなかった。酵母における結果と同
様に、この変異は、二重変異としてＧ２７９Ｅと組み合わせた場合、Ｇ２７９Ｅ
単独と比較してコロニー形成能を低下させた。ｐ５３−Ｖ１２２Ａタンパク質は
、野生型ｐ５３と比較してｐ２１の合成を誘発する能力を多少保持したが、Ｖ１
２２Ａ：：Ｇ２７９Ｅ二重変異体は、ｐ２１誘発をほとんど示さなかった。二重
変異体Ｖ１２２Ａ：：Ｒ２８２Ｑもまた、ｐ２１の合成を減少させたが、Ｒ２８
２Ｑを発現させた場合にはほぼ正常レベルであった。酵母およびヒト細胞の両方
におけるｐ５３−Ｖ１２２Ａ発現の効果を表５にまとめて示す。The V122A single mutant was indistinguishable from wild-type p53 with respect to its ability to block colonization of human Saos-2 cells. Similar to the results in yeast, this mutation, when combined with G279E as a double mutation, G279E
The colony forming ability was decreased as compared with the case of using it alone. The p53-V122A protein retained some ability to induce p21 synthesis compared to wild-type p53, but V1
The 22A :: G279E double mutant showed little p21 induction. The double mutant V122A :: R282Q also reduced the synthesis of p21, whereas R28
When 2Q was expressed, the level was almost normal. The effects of p53-V122A expression in both yeast and human cells are summarized in Table 5.

【０１４３】 ｐ５３−Ｖ１２２Ａは、Ｓａｏｓ−２細胞において野生型ｐ５３と比較してよ
り高い内因性ｐ２１の誘発を示さず、ｐ５３−Ｇ２７９Ｅを完全には再活性化し
なかった。しかしながら、二重変異体は、トランスフェクションの４８時間後、
多少のｐ２１誘発を示した。ｐ２１応答配列についてのルシフェラーゼ検定は、
ｐ５３−Ｖ１２２Ａに対する活性の増強が観察されなかったという点でウェスタ
ンブロットの結果を確認した。酵母および哺乳動物細胞におけるｐ２１レポータ
ー系は、哺乳動物細胞が２種類のｐ５３応答配列を含むｐ２１プロモーターの大
きなフラグメントを含んでおり、ｐ５３独立経路において調節され得る点で異な
っていた。それに対して、酵母系は５'ｐ２１応答配列だけを利用する。これら
２つの応答配列に対するｐ５３の親和性は異なっており（Thornborrow et al.）
、ｐ２１発現に対する各々の相対的な関与は、十分には特徴付けられない。P53-V122A did not show higher induction of endogenous p21 in Saos-2 cells compared to wild-type p53 and did not completely reactivate p53-G279E. However, the double mutant was found 48 hours after transfection
It showed some p21 induction. The luciferase assay for the p21 responsive element is
The results of Western blotting were confirmed in that no enhancement of activity against p53-V122A was observed. The p21 reporter system in yeast and mammalian cells differed in that mammalian cells contained a large fragment of the p21 promoter containing two p53 responsive elements and could be regulated in the p53 independent pathway. In contrast, the yeast system utilizes only the 5'p21 response element. The affinities of p53 for these two response elements are different (Thornborrow et al.).
, Their relative contribution to p21 expression is not well characterized.

【０１４４】 ルシフェラーゼ検定において、ｐ５３−Ｖ１２２Ａは、１３ｘＲＧＣ：：ｌｕ
ｃについて完全なトランス活性を保持しており、Ｇ２７９Ｅ変異を再活性化させ
た。かかる効果は、３ｘＲＧＣ：：ＡＤＥ２を有する酵母においては見られなか
った。この差異は、ｐ５３応答配列の異なるコピー数および哺乳動物レポーター
プラスミドの高コピー数によって説明できる。酵母におけるレポーター系は、ゲ
ノムにおいて単一コピーとして組込まれる。ｐ５３−Ｖ１２２Ａは、ｂａｘ：：
ｌｕｃレポーター系に対して野生型ｐ５３よりも約４倍高いルシフェラーゼ活性
を示した。同一抽出物におけるｐ５３タンパク質のレベルは類似していた。ｐ５
３−Ｖ１２２Ａは、ｂａｘ：：ｌｕｃについてのＧ２７９Ｅ変異を再活性化しな
かった。この場合、哺乳動物レポーターおよび酵母レポータにおいて同一のｐ５
３結合配列を用い、単一変異体および二重変異体の両方に対するトランス活性化
の結果は、非常に類似している。かくして、Ｖ１２２ＡがＤＮＡ結合活性を多少
保持しており、配列選択性を変更した可能性があるという示唆は、酵母および哺
乳動物細胞の両方の結果と一致している。In the luciferase assay, p53-V122A was labeled with 13xRGC :: lu.
It retained full transactivity for c and reactivated the G279E mutation. No such effect was seen in yeast with 3xRGC :: ADE2. This difference can be explained by the different copy number of the p53 responsive element and the high copy number of the mammalian reporter plasmid. The reporter system in yeast is integrated as a single copy in the genome. p53-V122A has bax ::
It showed about 4-fold higher luciferase activity than the wild-type p53 against the luc reporter system. The levels of p53 protein in the same extract were similar. p5
3-V122A did not reactivate the G279E mutation for bax :: luc. In this case, the same p5 in the mammalian reporter and the yeast reporter
With 3 linked sequences, the transactivation results for both single and double mutants are very similar. Thus, the suggestion that V122A retains some DNA binding activity and may have altered sequence selectivity is consistent with the results in both yeast and mammalian cells.

【０１４５】 稀なｐ５３変異および関連 位置Ｖ１２２は、２０種類の種から分析されたｐ５３タンパク質配列の間で不
変である（Soussi and May）。Cho et al. から得たｐ５３ ＤＮＡ結合ドメイン
の結晶構造をベースとして、それは、大きなＬ１ループ内に含まれる。このルー
プ中の残基１２０は、ＤＮＡとの実質的な接触をもたらす。該タンパク質のこの
領域における残基は高度に保存されるが、いくつかのヒト腫瘍関連ｐ５３変異体
がこの領域に見られる。一般的に配列保存性と腫瘍におけるｐ５３変更の発生率
との間には強い相互関係がある（Walker et al.）ので、このことは予期しない
ことである。単一Ｖ１２２Ｌ変異体は報告されているが、Ｖ１２２Ａ腫瘍変異は
、同定されていない（１０.０００エントリーよりも多く含んでいるｐ５３デー
タベースのサーチに基づいた、Hainaut et al.）。しかしながら、機能的に変更
されるＬ１ループにおけるｐ５３変種を発生させる可能性はあった。Rare p53 Mutations and Related Position V122 is invariant among p53 protein sequences analyzed from 20 species (Soussi and May). Based on the crystal structure of the p53 DNA binding domain obtained from Cho et al., It is contained within the large L1 loop. Residue 120 in this loop makes a substantial contact with the DNA. Residues in this region of the protein are highly conserved, but some human tumor-associated p53 variants are found in this region. This is unexpected as there is generally a strong correlation between sequence conservation and the incidence of p53 alterations in tumors (Walker et al.). A single V122L mutant has been reported, but no V122A tumor mutation has been identified (Hainaut et al., Based on a search of the p53 database containing more than 10,000 entries). However, it was possible to generate a p53 variant in the functionally altered L1 loop.

【０１４６】 コドン２７７および２７９での変異は、また、毒性を引き起こした。アミノ酸
Ｃ２７７およびＧ２７９は、ｐ５３タンパク質配列の間で不変である。システイ
ン２７７は、ｐ５３／ＤＮＡ結晶構造をベースとして主要な溝においてＤＮＡ配
列と直接接触し（Cho et al.）、このコドンでのアミノ酸変化は、変更されたＤ
ＮＡ結合特異性を示す（Gagnebin et al.；Thukral et al.；および Saller et
al.）。Ｃ２７７Ｒ変化およびＣ２７７Ｗ変化のいずれも腫瘍において同定され
ていない。Ｃ２７７Ｒ変更を有するｐ５３変異体は、最近、哺乳動物細胞におい
て一時的に発現した場合にｐ２１およびＭＤＭ２の転写を活性化することが示さ
れた；しかしながら、増殖に対するその影響は、報告されなかった。該変異体は
、特異的合成ｐ５３応答配列からのトランス活性化の欠損を示し、Ｓａｏｓ−２
細胞におけるアポトーシス誘発の欠損を有していた（Saller et al.）。ｐ５３
−Ｃ２７７Ｗ変異タンパク質のインビトロＤＮＡ結合活性を、遠位ｐ２１応答配
列だけを用いてバンドシフト検定で評価した；欠損は観察されなかった（Chene
et al.）。Mutations at codons 277 and 279 also caused toxicity. Amino acids C277 and G279 are invariant between the p53 protein sequences. Cysteine 277 makes direct contacts with the DNA sequence in the major groove based on the p53 / DNA crystal structure (Cho et al.), And the amino acid change at this codon is altered by D
Show NA binding specificity (Gagnebin et al .; Thukral et al .; and Saller et al.
al.). Neither C277R nor C277W changes have been identified in tumors. The p53 mutant with the C277R alteration was recently shown to activate transcription of p21 and MDM2 when transiently expressed in mammalian cells; however, its effect on proliferation was not reported. The mutant exhibits a loss of transactivation from a specific synthetic p53 responsive element, Saos-2
It had an apoptosis-induced defect in cells (Saller et al.). p53
The in vitro DNA binding activity of the -C277W mutein was evaluated in a band shift assay using only the distal p21 response element; no defects were observed (Chene
et al.).

【０１４７】 これらの研究においてＧ２７９Ｒが毒性ｐ５３変種として単離されたことは興
味深いことである。なぜなら、この変異は、ｐ５３腫瘍データベースにおいて数
回現れるからである。一の可能性は、酵母におけるｐ５３−Ｇ２７９Ｒ致死が、
哺乳動物細胞において腫瘍進行と適合する部分欠損ｐ５３応答を活性化する変更
された配列認識から生じることである。ｐ５３−Ｇ２７９ＲによるＲＧＣまたは
ｂａｘのトランス活性化は、本研究において観察されなかったが、ｐ２１：：Ａ
ＤＥ２の正常なトランス活性化があった。この研究において用いたＧ２７９Ｅを
包含するｐ５３トランス活性化機能（４４）を弱めることができるいくつかの腫
瘍変異がＧ２７９で同定された。明らかに、同一のＧ２７９位置での異なるアミ
ノ酸変化は、酵母に対して劇的に異なる作用を及ぼすことができる。例えば、Ｇ
２７９Ｒとは異なって、過剰発現ｐ５３−Ｇ２７９Ｅは、小さな増殖阻害効果だ
けを有していた。It is of interest that G279R was isolated as a virulent p53 variant in these studies. Because this mutation appears several times in the p53 tumor database. One possibility is that p53-G279R lethality in yeast is
It results from altered sequence recognition that activates a partially defective p53 response compatible with tumor progression in mammalian cells. Transactivation of RGCs or bax by p53-G279R was not observed in this study, but p21 :: A
There was normal transactivation of DE2. Several tumor mutations were identified in G279 that could impair the p53 transactivating function (44), including G279E used in this study. Apparently, different amino acid changes at the same G279 position can have dramatically different effects on yeast. For example, G
Unlike 279R, overexpressed p53-G279E had only a small growth inhibitory effect.

【０１４８】 毒性ｐ５３変異の利用性 この研究により、腫瘍変異を研究し利用する種々のアプローチに有用であり得
る一群の変異体が明らかになった。Utility of Toxic p53 Mutations This study revealed a group of mutants that may be useful in various approaches to study and exploit tumor mutations.

【０１４９】 一のアプローチは、酵母においてｐ５３の影響を大きく増大させるｐ５３変異
体を同定することである。Ｖ１２２Ａ変異は、毒性のある唯一のｐ５３変異では
ない。付加的な単一アミノ酸の変化がｐ５３致死を引き起こすことが見出された
（表３を参照のこと）。いくつかの変異は、Ｌ１ループにおける残基に影響を及
ぼすが、他の変異は、ＤＮＡ結合ドメインおよび４量体化ドメインに影響を及ぼ
す。該変異体は、毒性変異体のいくつかが転写能を保持していたので、機能的に
識別することができた。One approach is to identify p53 mutants that greatly enhance the effects of p53 in yeast. The V122A mutation is not the only virulent p53 mutation. An additional single amino acid change was found to cause p53 lethality (see Table 3). Some mutations affect residues in the L1 loop, while others affect the DNA binding domain and the tetramerization domain. The mutants could be functionally distinguished as some of the toxic mutants retained transcriptional ability.

【０１５０】 ｐ５３クラスの毒性変異体についていくつかの用途がある。しかしながら、野
生型ｐ５３よりもドミナントネガティブな可能性を有する内因性変異タンパク質
の存在は、効力を制限し、別のアプローチが提供される。Ｐ５３−Ｖ１２２Ａの
ような毒性対立遺伝子は、より有効な、かつ、より特異的な付加利益をもたらす
ことができる。例えば、ｐ２１誘発がｂａｘ不活性化と比較してあまり有効でな
い場合、細胞は、排除のアポトーシスモードに、より向けられる。さらに、低下
したｐ２１誘発は、一般に用いられる化学療法薬との併用治療法は、チェックポ
イント制御応答がないので、より有効である。There are several uses for virulent variants of the p53 class. However, the presence of endogenous muteins, which have the potential to be more dominant negative than wild-type p53, limits efficacy and provides another approach. Toxic alleles such as P53-V122A can provide more effective and more specific additional benefits. For example, if p21 induction is less effective compared to bax inactivation, the cells are more targeted to the apoptotic mode of elimination. Moreover, reduced p21 induction is more effective in combination therapy with commonly used chemotherapeutic agents, as there is no checkpoint control response.

【０１５１】 酵母における毒性ｐ５３変種は、変更されたプロモーター認識を示すので、そ
れらは、下流ｐ５３経路の機能的精査に、および新規ｐ５３標的の同定に有用で
ある。変更されたＤＮＡ配列特異性を利用して、かかるｐ５３変異を用いてトラ
ンスフェクトされた細胞において優先的に活性化されるレポーター系を構築する
ことができた。Since toxic p53 variants in yeast show altered promoter recognition, they are useful for functional dissection of the downstream p53 pathway and for the identification of novel p53 targets. The altered DNA sequence specificity could be used to construct a reporter system that is preferentially activated in cells transfected with such p53 mutations.

【０１５２】 ｐ５３は、癌の発症を予防するのに重要な役割を果たし、変異体ｐ５３に関連
するほとんどの腫瘍は、高度に過剰発現したミスセンス変異体ｐ５３を含んでい
るので、腫瘍細胞に対するｐ５３機能の再活性化または修復は、有望な癌治療ア
プローチである（Gallagher）。特異的に標的とする変異体ｐ５３腫瘍細胞を標
的とする種々のストラテジーが試みられた。例えば、ｐ５３チェックポイント機
能の不在下でのみ複製することができる欠損アデノウイルスが臨床試験下にある
（Bischoff et al.）。毒性遺伝子の選択的誘発を駆動するための高レベルの変
異タンパク質を利用するという考案もまた試験された（Costa et al.）。別法と
して、変更された塩基対認識を有する腫瘍変異体を用いて、毒素を特異的に誘発
することができた（Gagnebin et al.）。P53 plays an important role in preventing the development of cancer, and most tumors associated with mutant p53 contain the highly overexpressed missense mutant p53, and therefore p53 on tumor cells. Reactivation or repair of function is a promising cancer therapeutic approach (Gallagher). Various strategies have been attempted to target specifically targeted mutant p53 tumor cells. For example, defective adenoviruses that are able to replicate only in the absence of p53 checkpoint function are under clinical trials (Bischoff et al.). The idea of utilizing high levels of muteins to drive the selective induction of virulence genes was also tested (Costa et al.). Alternatively, tumor mutants with altered base pair recognition could be used to specifically induce toxins (Gagnebin et al.).

【０１５３】 ｐ５３−Ｖ１２２Ａ変異、および変異体が付加的な以前から存在する一般的な
腫瘍型変異（すなわち、Ｖ１２２Ａ：：Ｇ２７９Ｅ）を有する場合でさえ毒性を
引き起こすことがあるいくつかの他の変異部位の同定は、変異タンパク質の機能
的結果を修飾し、それを毒素に変えることができる化学物質、ペプチド、小分子
または他の物質があることを示唆している。変異体ｐ５３と関連するほとんどの
腫瘍が高度に過剰発現したミスセンス変異体ｐ５３を含んでいるので、これらの
化学物質は、腫瘍を標的とすることができる。腫瘍を標的するストラテジーの例
は、文献に開示されている。本発明者らが同定したｐ５３毒性変異体の数、いく
つかの既知の腫瘍変異との相互作用、およびヒト細胞における固有の結果は、ｐ
５３に基づくいくつかの治療態様、ならびにｐ５３機能の分析および下流経路の
精査に有用である。The p53-V122A mutation, and some other mutations that can cause toxicity even when the mutant has an additional pre-existing common tumor type mutation (ie, V122A :: G279E). The identification of the site suggests that there are chemicals, peptides, small molecules or other substances that can modify the functional consequences of the mutant protein and turn it into a toxin. Since most tumors associated with mutant p53 contain the highly overexpressed missense mutant p53, these chemicals can be targeted to the tumor. Examples of strategies for targeting tumors are disclosed in the literature. The number of p53 virulent mutants we have identified, their interaction with several known tumor mutations, and the unique results in human cells are:
It is useful for several 53-based therapeutic modalities, as well as for analysis of p53 function and probing of downstream pathways.

【０１５４】 スーパートランス活性化変異体 ＧＡＬ１プロモーターによる可変発現を用いる転写活性化の増加を伴うｐ５３
対立遺伝子を発現する酵母コロニーの単離および特徴付け ｐ５３変異または翻訳後修飾と関連するプロモーター特異性および結合親和性
の変化の認識は、ｐ５３構造／機能関係を理解し、腫瘍変異を分類するのに有用
であり、癌治療法の開発に導くことができる。本発明は、酵母におけるヒトｐ５
３の可変性発現を利用して、変更されたプロモーター選択性および親和性に対応
する新規表現型を示す変異体についてのスクリーンを開発することである。ＤＮ
Ａ結合ドメインおよび４量体化ドメインをコードするｐ５３ ｃＤＮＡ領域をラ
ンダムＰＣＲ変異誘発法に付し、酵母中での組換えにより、発現レベルを容易に
変化させることができるＧＡＬ１プロモーターを有するベクター中に直接クロー
ン化した。ＲＧＣ応答配列に対するトランス活性化（スーパートランス）が野生
型レベルよりも大きいことを示すｐ５３変種を直接同定する新しい簡単なスクリ
ーンを開発した。このスクリーンで得られたｐ５３変異体は全て、ＤＮＡ結合ド
メインに位置していた。アミノ酸１１５と１２４との間のＬ１ループ領域には６
つあった。これらのスーパートランス変異体は、ヒト腫瘍において観察されなか
った。種々のプロモーター上でのスーパートランスＰ５３変異体のパネルのトラ
ンス活性化能を、Ｐ５３応答配列、ＲＧＣ、ＰＩＧ３、ｐ２１およびｂａｘを用
いて評価した。ＲＧＣ応答配列の配列は、5'GACCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCT（
配列番号１）であり；ｐ２１応答配列の配列は、5'GAACATGTCCCAACATGTTG（配列
番号２）であり；ｂａｘ配列の配列は、5'TCACAAGTTAGAGACAAGCCTGGGCGTGGGCTAT
ATT（配列番号３）であり；Ｐｉｇ３応答配列の配列は、5'AGCTTGCCCACCCATGCTC
CAGCTTGCCCACCCATGCTC（配列番号４）である。広範囲に及ぶ種々の生物学的応答
を有することができるｐ５３変異体を生じることができることを示唆する、強度
およびプロモーター特異性に基づいていくつかの誘発パターンが見出された。興
味深いことには、酵母における別の分析は、野生型ｐ５３を阻害したドミナント
ネガティブｐ５３変異体の存在下でさえトランス活性化機能を保持することがで
きたことを示した。多くの変異体がＤＮＡ接触部位から遠位のタンパク質位置に
あるアミノ酸に影響を及ぼした。ヒト細胞における実験は、増殖抑制および種々
のプロモーターに対する効果に関して酵母における結果と十分に相互に関連して
いた。これらの新規ｐ５３変異体を用いて、ｐ５３下流経路を精査することがで
き、ｐ５３とＤＮＡとの特異的な相互作用を理解することができ、癌遺伝子治療
プロトコールにおいて野生型ｐ５３に取って代わることができる。Supertrans-activating mutant p53 with increased transcriptional activation using variable expression with the GAL1 promoter
Isolation and Characterization of Yeast Colonies Expressing Alleles Recognition of alterations in promoter specificity and binding affinity associated with p53 mutations or post-translational modifications are important in understanding p53 structure / function relationships and classifying tumor mutations. And can lead to the development of cancer treatment methods. The present invention relates to human p5 in yeast.
3 is to exploit the variable expression of 3 to develop a screen for mutants that exhibit a novel phenotype corresponding to altered promoter selectivity and affinity. DN
The p53 cDNA region encoding the A-binding domain and the tetramerization domain was subjected to random PCR mutagenesis, into a vector having a GAL1 promoter whose expression level can be easily changed by recombination in yeast. Directly cloned. A new simple screen was developed to directly identify p53 variants that show greater transactivation (supertrans) to the RGC response element than wild-type levels. All p53 mutants obtained with this screen were located in the DNA binding domain. 6 in the L1 loop region between amino acids 115 and 124
There was These supertrans mutants were not observed in human tumors. The transactivating ability of a panel of supertrans P53 mutants on different promoters was evaluated using the P53 responsive element, RGC, PIG3, p21 and bax. The sequence of the RGC response element is 5'GACCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCT (
SEQ ID NO: 1); the sequence of the p21 response sequence is 5'GAACATGTCCCAACATGTTG (SEQ ID NO: 2); the sequence of the bax sequence is 5'TCACAAGTTAGAGACAAGCCTGGGCGTGGGCTAT.
ATT (SEQ ID NO: 3); the sequence of the Pig3 response sequence is 5'AGCTTGCCCACCCATGCTC
CAGCTTGCCCACCCATGCTC (SEQ ID NO: 4). Several induction patterns have been found based on strength and promoter specificity, suggesting that p53 variants may be generated that may have a wide variety of biological responses. Interestingly, another analysis in yeast showed that the transactivating function could be retained even in the presence of dominant-negative p53 mutants that inhibited wild-type p53. Many variants affected amino acids at protein positions distal to the DNA contact site. Experiments in human cells have been fully correlated with the results in yeast regarding growth inhibition and effects on various promoters. These novel p53 mutants can be used to probe the p53 downstream pathway, understand specific interactions between p53 and DNA, and replace wild-type p53 in cancer gene therapy protocols You can

【０１５５】 酵母系統、プラスミド、培地および試薬を上記のように毒性変異体のために得
た。ヌクレオチド１２４と１１２２との間のヒトｐ５３ ｃＤＮＡを、最適反応
条件下でプルーフリーディング活性を伴わないＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを用
いてＰＣＲ増幅した。Yeast strains, plasmids, media and reagents were obtained for virulent mutants as described above. The human p53 cDNA between nucleotides 124 and 1122 was PCR amplified using TAQ DNA polymerase without proofreading activity under optimal reaction conditions.

【０１５６】 非精製増幅産物を用いて、酵母系統ｙＩＧ３９７においてＧＡＰ修復クローニ
ングを行った。ＰＣＲ増幅のアリコートをｐＲＤＩ−２２プラスミドにおけるＧ
ＡＰ修復に用いた。酵母における相同組換えは、適度なＡＤＨ１プロモーターを
用いてｐ５３ ｃＤＮＡを転写する構成的ｐ５３発現プラスミドを再構成する。
形質転換体をプラスミドマーカーについて選択し、ｐ５３トランス活性化機能を
アデニンを制限したプレート上で試験する。ｙＩＧ３９７系統は、その転写が呈
色アッセイによってモニターできるｐ５３−依存性レポーター遺伝子、ＡＤＥ２
を含有するので、これが可能である。その酵母プロモーターの上流活性化配列が
欠失し、ヒトリボソーム遺伝子クラスター（Ribosomal Gene Cluster）（ＲＧＣ
）において本来見出されるｐ５３結合配列の３コピーと置き換わったので、ＡＤ
Ｅ２の転写はｐ５３を必要とする。野生型ｐ５３はエス・セレビシエ（S. cerev
isiae）においても転写因子として作用することが示されたので、野生型ｐ５３
を発現する酵母形質転換体コロニーはａｄｅ＋表現型を有し、正常な大きさの白
色コロニーを生産するが、非機能的ｐ５３を発現する形質転換体は、ａｄｅ−で
あって、より小さい赤色コロニーを生産するであろう。色は、アデニン生合成に
おける中間体の蓄積に起因する。この色の識別はまた、おそらく、温度感受性の
ような部分的機能を保持するｐ５３対立遺伝子の発現のために、中間表現型の同
定を可能にする（すなわち、ピンク色のコロニー）。ＰＣＲ産物は野生型ｐ５３
を鋳型配列として用いて得られたので、ｐＲＤＩ−２２におけるＧＡＰ修復後の
赤色コロニーのパーセンテージは、ポリメラーゼエラーによって生じたランダム
なｐ５３機能的変異の頻度を示す。発明者らの実験において、１５〜２０パーセ
ントの赤色コロニーが見出された（図８、パネルＡ）。構成的発現プラスミドに
おけるＧＡＰ修復クローニングは、非機能的ｐ５３対立遺伝子の単離に適当であ
るが、それは、野生型ｐ５３と「スーパー」トランス活性化能力を有するｐ５３
対立遺伝子変種とを区別することができない。GAP repair cloning was performed in yeast strain yIG397 using the unpurified amplification product. An aliquot of PCR amplification was taken for G in the pRDI-22 plasmid.
Used for AP repair. Homologous recombination in yeast reconstitutes a constitutive p53 expression plasmid that transcribes p53 cDNA using the moderate ADH1 promoter.
Transformants are selected for plasmid markers and tested for p53 transactivating function on adenine restricted plates. The yIG397 line has a p53-dependent reporter gene, ADE2, whose transcription can be monitored by a colorimetric assay.
This is possible because it contains The upstream activating sequence of the yeast promoter is deleted, and the human ribosomal gene cluster (RGC
), It was replaced with 3 copies of the p53 binding sequence originally found in
Transcription of E2 requires p53. Wild-type p53 is S. cerev
isiae), it was shown that it also acts as a transcription factor.
Yeast transformant colonies that express A. deficient have an ade + phenotype and produce white colonies of normal size, while transformants that express non-functional p53 are ade-, smaller red colonies. Will produce. The color is due to the accumulation of intermediates in adenine biosynthesis. This color discrimination also allows the identification of intermediate phenotypes (ie, pink colonies), probably due to the expression of p53 alleles that retain partial functions such as temperature sensitivity. PCR product is wild-type p53
Was used as the template sequence, the percentage of red colonies after GAP repair in pRDI-22 indicates the frequency of random p53 functional mutations caused by polymerase error. In our experiments, 15-20 percent of red colonies were found (Figure 8, panel A). GAP repair cloning in a constitutive expression plasmid is suitable for the isolation of non-functional p53 alleles, which have p53 with wild-type p53 and "super" transactivating ability.
Indistinguishable from allelic variants.

【０１５７】 この制限を回避するために、ｐＧＡＬ１発現プラスミド、ｐＬＳ８９を用い、
異なる炭素供給源を含有するプレート上に形質転換体を播種することによるｐ５
３の種々の発現を利用して、ＧＡＰ修復クローニングを行った。ｐＬＳ８９で形
質転換されたｙＩＧ３９７細胞は、ＧＡＬ１プロモーターが抑制されるグルコー
スプレート上で暗赤色のコロニーを生産する。同じクローンは、ＧＡＬ１プロモ
ーターがグルコースによって抑制されないが、誘発されないラフィノースプレー
ト上でより明るい赤色のコロニーを生産する。ガラクトースプレート上で、コロ
ニーは代わりに白色であるが、野生型ｐ５３過剰発現に起因する阻害効果の結果
として、増殖が制限される。ｐ５３タンパク質レベルは、異なる糖における増殖
後に細胞を回収してウェスタンブロットによってチェックした。ｐＧＡＬ１およ
びｐＡＤＨ１に駆動される発現もまた比較した。免疫検出は、ガラクトース上で
のｐＧＡＬ１ ｐ５３発現がグルコース上でのｐＡＤＨ１発現より約３倍高いこ
とを確定した。グルコースおよびラフィノース培養において、ｐＧＡＬ１に駆動
されるｐ５３発現は各々、検出不可能であるか、またはほとんど検出されなかっ
た。ｐＧＡＬ１発現プラスミドにおけるＧＡＰ修復クローニングおよびラフィノ
ース上での培養は、野生型ｐ５３とトランス活性化に対して「スーパー」野生型
ｐ５３との間の区別を可能にしうると考えられた。野生型ｐ５３は該条件下で明
赤色コロニーを生産するので、ピンクまたは白色コロニーを同定できる可能性は
、「スーパー」野生型ｐ５３の単離を導きうる。図８、パネルＢに示されるよう
に、ラフィノースプレート上で白色（およびピンク色）のコロニーを記録するこ
とができる。それらの頻度は、非機能的ｐ５３変異体（すなわち、図８、パネル
Ａの赤色コロニー）の頻度の約５％であり、または形質転換体の総数の約０．７
−１％である。置換がｐ５３ｃＤＮＡ（５４２ｂｐ、Flaman）における転写活性
化機能に影響を及ぼす塩基対の数を見積もり、ランダムなポリメラーゼエラーを
想定すると、約３０個の「スーパートランス」ｐ５３対立遺伝子が調査された３
０００〜１０，０００個のコロニーの間で、該アプローチを用いて生じることが
できたと評価された。４つの独立した実験において、１８個の白色コロニーおよ
び７個のピンク色コロニーを単離および分析した。To circumvent this restriction, the pGAL1 expression plasmid, pLS89, was used,
P5 by plating transformants on plates containing different carbon sources
GAP repair cloning was performed using 3 different expressions. yIG397 cells transformed with pLS89 produce dark red colonies on glucose plates in which the GAL1 promoter is repressed. The same clone produces brighter red colonies on raffinose plates where the GAL1 promoter is not repressed by glucose but not induced. On galactose plates, the colonies are instead white, but their growth is limited as a result of the inhibitory effect due to wild-type p53 overexpression. p53 protein levels were checked by Western blot after harvesting cells after growth on different sugars. Expressions driven by pGAL1 and pADH1 were also compared. Immunodetection established that pGAL1 p53 expression on galactose was approximately 3-fold higher than pADH1 expression on glucose. In glucose and raffinose cultures, pGAL1-driven p53 expression was either undetectable or barely detectable, respectively. It was thought that GAP repair cloning in the pGAL1 expression plasmid and culturing on raffinose could allow discrimination between wild-type p53 and “super” wild-type p53 for transactivation. Since wild-type p53 produces bright red colonies under these conditions, the possibility of identifying pink or white colonies could lead to the isolation of "super" wild-type p53. White (and pink) colonies can be recorded on raffinose plates, as shown in FIG. 8, panel B. Their frequency is about 5% of the frequency of non-functional p53 mutants (ie, red colonies in Figure 8, panel A), or about 0.7 of the total number of transformants.
-1%. Approximately 30 "supertrans" p53 alleles were investigated, assuming the number of base pairs whose substitutions affect the transcriptional activation function in the p53 cDNA (542 bp, Flaman) and assuming random polymerase errors.
It was estimated that between 000 and 10,000 colonies could be generated using the approach. Eighteen white and seven pink colonies were isolated and analyzed in four independent experiments.

【０１５８】 表現型が研究下のｐ５３領域に起因し、例えば、細胞内のプラスミドコピー数
の変化に依存しないことを確かめるために、プラスミドをレスキューし、同じｐ
５３フラグメントを増幅するために用いた。ギャップ修復を繰り返し、表現型を
全単離株において確認した。典型的な結果を図９に示す。「スーパートランス」
対立遺伝子での、および対照として野生型ｐ５３でのＧＡＰ修復形質転換体を各
々、同じプレートの左および右半分に播種した。「スーパー」トランス活性化ｐ
５３によって生産されるほとんど全てのコロニーはより大きく、白色である。目
に見える小さい赤色のコロニー（表示する写真におけるコロニー）は、おそらく
、ｐ５３インサートまたは増幅の間に生じる非機能的ｐ５３変異を伴わずにライ
ゲートしたベクターを示す。野生型ｐ５３を同じ実験条件でＰＣＲ増幅する場合
に得られる頻度と比較したそれらの低い頻度（５％未満）は、おそらく、「スー
パートランス」対立遺伝子が、表現型として野生型を維持しているいくつかの第
二部位ミスセンス変異を許容できることを示す。To confirm that the phenotype is due to the p53 region under study and is not dependent, for example, on changes in plasmid copy number within the cell, the plasmid was rescued and the same p
Used to amplify the 53 fragment. The gap repair was repeated and the phenotype was confirmed in all isolates. Typical results are shown in Figure 9. "Super Trance"
GAP repair transformants at allele and with wild-type p53 as a control were plated on the left and right halves of the same plate, respectively. "Super" trans activation p
Almost all colonies produced by 53 are larger and white. The small red colonies visible (colonies in the pictures shown) probably represent the ligated vector without the p53 insert or a non-functional p53 mutation occurring during amplification. Their low frequency (less than 5%) compared to that obtained when PCR-amplifying wild-type p53 in the same experimental conditions is probably due to the "supertrans" allele maintaining the wild-type as a phenotype. We show that some second site missense mutations can be tolerated.

【０１５９】 次いで、ｐＧＡＬ１プロモーターの制御下での「スーパートランス」ｐ５３単
離株の表現型をグルコースおよびガラクトースプレートにおいて試験した（図１
０）。過剰発現において、全てのこれらのｐ５３変種が酵母の増殖を減少し、い
くつかの場合、増殖しない表現型を生じた。該結果は、エス・セレビシエにおけ
るｐ５３発現に起因する増殖阻害が部分的にＤＮＡ結合およびトランス活性化能
力と相関するという発明者らの以前の観察（Inga and Resnick）と一致する。野
生型ｐ５３は増殖阻害を引き起こし、一方、非機能的腫瘍変異体はほとんど影響
を及ぼさない。本明細書に報告される「スーパートランス」変異体の表現型は、
ＤＮＡ結合が酵母の増殖に対する影響と相関するという仮定を確かにする。しか
しながら、「スーパートランス」ｐ５３変種は、致死変異体ｐ５３−Ｖ１２２Ａ
と比べて別個の表現型を有し、改変された機能特性を有するｐ５３対立遺伝子の
別のカテゴリーを考えられなければならない。The phenotype of the “supertrans” p53 isolates under the control of the pGAL1 promoter was then tested on glucose and galactose plates (FIG. 1
0). Upon overexpression, all these p53 variants reduced yeast growth and in some cases resulted in a non-growing phenotype. The results are consistent with our previous observations (Inga and Resnick) that growth inhibition due to p53 expression in S. cerevisiae partially correlates with DNA binding and transactivating ability. Wild-type p53 causes growth inhibition, whereas non-functional tumor variants have little effect. The phenotypes of the "supertrans" mutants reported herein are:
Confirms the hypothesis that DNA binding correlates with effects on yeast growth. However, the "supertrans" p53 variant is a lethal mutant p53-V122A.
Another category of p53 alleles with distinct phenotypes as compared to and with altered functional properties must be considered.

【０１６０】 ２５個のｐ５３「スーパートランス」対立遺伝子の構成的発現の表現型結果を
、それらをＡＤＨ１発現プラスミドへ移入して試験した。２５対立遺伝子のうち
、２１個が大きな白色コロニーを生産した。本来は全てラフィノース上で白色コ
ロニーとして単離されるそれらのうち４つが、ｐＡＤＨ１下で発現される場合に
酵母増殖を妨げた。野生型と比較して高い転写活性化能力を有するｐ５３変種は
野生型ｐ５３から区別不可能であるので、またはそれらは酵母の増殖を妨げるの
で、該結果は、それらが元のｐ５３機能的アッセイにおいて同定されないことを
確かにする。The phenotypic consequences of constitutive expression of the 25 p53 "supertrans" alleles were tested by transfecting them into the ADH1 expression plasmid. Of the 25 alleles, 21 produced large white colonies. Four of them, originally isolated as white colonies on raffinose, prevented yeast growth when expressed under pADH1. Since the p53 variants with higher transcriptional activation capacity compared to wild type are indistinguishable from wild type p53, or because they interfere with yeast growth, the result is that they are in the original p53 functional assay. Make sure it is not identified.

【０１６１】 次いで、この改変または「改善」された機能を導くｐ５３ｃＤＮＡにおける分
子改変の性質を決定するために、ｐ５３「スーパートランス」クローンを配列決
定した。配列決定結果は、グルコース（ｐＡＤＨ１プラスミド）、ラフィノース
またはガラクトース（ｐＧＡＬ１プラスミド）プレート上での各対立遺伝子の表
現型効果と共に表６に報告される。全ての分析された単離株は、研究下の領域に
おいて少なくともミスセンス変異を含有した。いくつかの場合、同じ塩基対置換
が２つの独立したクローンにおいて見出された。７つのクローンが２または３個
のアミノ酸変化を示した。いくつかの場合、これらの単離株における表現型の原
因となる変異は、他のクローンにおける単一変化としてのその影響に基づいて示
すことができる。The p53 "supertrans" clone was then sequenced to determine the nature of the molecular alterations in the p53 cDNA leading to this altered or "improved" function. The sequencing results are reported in Table 6 along with the phenotypic effect of each allele on glucose (pADH1 plasmid), raffinose or galactose (pGAL1 plasmid) plates. All analyzed isolates contained at least missense mutations in the area under study. In some cases the same base pair substitutions were found in two independent clones. Seven clones showed 2 or 3 amino acid changes. In some cases, the phenotypic causative mutation in these isolates can be demonstrated based on its effect as a single change in other clones.

【０１６２】 １８個の白色および７個のピンク色のスーパートランスクローンのｐ５３ｃＤ
ＮＡにおける変異の性質は、ＤＮＡ配列決定によって決定できる。アミノ酸変化
および腫瘍における同じコドンで報告された同一の変異の数が表６に示される。
２５個の独立したクローンのうち、２６個の異なるアミノ酸変化があり、１７個
の変異体が単一アミノ酸変化を含有し、このことは、スーパートランス変異の数
が飽和されていないことを示唆した。したがって、本発明は、本発明の方法をス
クリーンすることによって将来同定されるいずれかのスーパートランス活性化変
異を意図する。Ｌ１ループは、スーパートランスｐ５３変異体のホットスポット
領域である（４つの部位に７つの異なる変化がある）。18 white and 7 pink supertransclones p53cD
The nature of the mutations in NA can be determined by DNA sequencing. The number of amino acid changes and the same mutations reported at the same codon in the tumor are shown in Table 6.
Of the 25 independent clones, there were 26 different amino acid changes and 17 mutants contained a single amino acid change, suggesting that the number of supertrans mutations was not saturated. . Thus, the present invention contemplates any supertransactivating mutations identified in the future by screening the methods of the present invention. The L1 loop is the hotspot region of the supertrans p53 mutant (7 different changes at 4 sites).

【０１６３】 ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（Ｃｈｏ）の結晶構造に基づく影響を受けたアミノ
酸の位置もまた表６に報告する。突然変異誘発プロトコールはより大きな領域を
含んだが、スーパートランスｐ５３を導く全ての変異がＤＮＡ結合ドメインにお
いてアミノ酸変化を有し、このことは、変異がＤＮＡ結合に対する直接の影響を
有しうることを示唆する。実際、数個の変異がＬ１ループ−シート−ヘリックス
モチーフならびにＬ２およびＬ３ループに位置し、それらが影響を及ぼすアミノ
酸はそのＤＮＡの近くにある（＜８Ａ）（図１８参照）。他の変異は、タンパク
質：：ＤＮＡインターフェースから離れており、β−サンドイッチに位置するア
ミノ酸に影響を及ぼし、その安定性を増加しうる。これらの変異体が特異的な応
答エレメントに関してのみ増加したトランス活性化を示すという観察は、アミノ
酸変化が間接的に、一般的な単量体／４量体安定性に影響を及ぼす代わりに、Ｄ
ＮＡ認識に影響を及ぼすことを示す。少なくとももう１つ別のアミノ酸変化と共
にではあるが、４量化ドメインにおいて２つの配列改変が見出された。これらの
２つの変異を分離し、ＧＡＬ１プロモーターの制御下で試験した。Ｆ３３８Ｌお
よびＮ３４５Ｓの両方が、ラフィノースプレート上で赤色コロニーを生産した。
Ｎ３４５Ｓは、野生型ｐ５３から表現型によって区別できなかったが、Ｆ３３８
Ｌは、いっそう大きい増殖阻害を導いた。該改変されたタンパク質がガラクトー
ス上で過剰発現された場合、インキュベーションの５日後に、野生型ｐ５３を含
有するコロニーの大きさの約４分の１の大きさを有する小さなコロニーが出現し
た。構成的ＡＤＨ１プロモーターの制御下で、Ｆ３３８Ｌは野生型ｐ５３として
出現した。４量化ドメインにおける該アミノ酸変化が、４量体安定性に影響を及
ぼし、酵母においてわずかに増加した毒性を導く可能性がある。以前に報告され
たように、酵母におけるｐ５３過剰発現に起因する増殖阻害または毒性は４量化
を必要とする。The positions of the affected amino acids based on the crystal structure of the p53 DNA binding domain (Cho) are also reported in Table 6. Although the mutagenesis protocol included a larger region, all mutations leading to supertrans p53 have amino acid changes in the DNA binding domain, suggesting that the mutations may have a direct effect on DNA binding. To do. In fact, several mutations are located in the L1 loop-sheet-helix motif and the L2 and L3 loops, the amino acids that they influence are near their DNA ( < 8A) (see Figure 18). Other mutations can affect the amino acids located away from the protein :: DNA interface and located in the β-sandwich, increasing their stability. The observation that these mutants show increased transactivation only for specific response elements suggests that amino acid changes indirectly affect general monomer / tetramer stability, but D
It shows that it affects NA recognition. Two sequence alterations were found in the tetramerization domain, but with at least one more amino acid change. These two mutations were isolated and tested under the control of the GAL1 promoter. Both F338L and N345S produced red colonies on raffinose plates.
N345S was phenotypically indistinguishable from wild-type p53, but F338
L led to greater growth inhibition. When the modified protein was overexpressed on galactose, after 5 days of incubation, small colonies appeared with a size of approximately one-fourth the size of the colonies containing wild-type p53. Under the control of the constitutive ADH1 promoter, F338L appeared as wild-type p53. The amino acid changes in the tetramerization domain can affect tetramer stability and lead to slightly increased toxicity in yeast. As previously reported, growth inhibition or toxicity due to p53 overexpression in yeast requires tetramerization.

【０１６４】 表６における右のカラムは、「スーパートランス」変化が観察されたヌクレオ
チド位置における欠失およびアミノ酸変化の両方のｐ５３データベースにおける
存在を報告する。該研究において単離されたアミノ酸変化と同一のアミノ酸変化
のデータベースにおける存在もまた報告する。増加した転写活性化を示すｐ５３
対立遺伝子変種のほとんどは、非常に大きいイン・ビボデータベース（１９９９
年４月リリースにおいて１４，０００エントリー）において新規であり、一般に
、それらは腫瘍における変異のコールドスポットに影響を及ぼす。１８個の「ス
ーパートランス」アミノ酸変化のうち７つがまた、データベースにおいて報告さ
れていた。これらのうち、４つがたった１つの腫瘍試料中で見出されたが、他の
３つ（Ｈ１７８Ｙ、Ｔ２３０ＩおよびＶ２７４Ａ）は異なる腫瘍試料および組織
において検出された。The right column in Table 6 reports the presence in the p53 database of both deletions and amino acid changes at the nucleotide positions where "supertrans" changes were observed. We also report the presence in the database of amino acid changes that are identical to the amino acid changes isolated in the study. P53 showing increased transcriptional activation
Most of the allelic variants are very large in vivo databases (1999).
(14,000 entries in April release), they generally affect the cold spot of mutations in tumors. Seven of the 18 "supertrans" amino acid changes were also reported in the database. Of these, four were found in only one tumor sample, while the other three (H178Y, T230I and V274A) were detected in different tumor samples and tissues.

【０１６５】 酵母におけるこれらの対立遺伝子の増加したトランス活性化能力を確かめるた
めに、記載のｐ５３「スーパートランス」対立遺伝子のいくつかをβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子に基づく遺伝子リポーターアッセイによって試験した。簡単に言
えば、ｐ５３発現のためにｐＧＡＬ１プラスミドおよびｐ５３制御下でβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を含有する２ミクロンのベクターを含有する二重形質転換体
を選択した。同じＲＧＣ配列は、ｐ５３結合および該ベクター中での転写活性化
を媒介する。下記の「スーパートランス」対立遺伝子を試験した：Ｓ１２１Ｆ（
ｗ３）、Ｔ１２３Ａ（ｗ４）、Ｃ１２４Ｙ（ｗ６）、Ｄ１８４Ｇ（ｐ３）、Ｓ２
４０Ｎ（ｗ１５）および構築された二重変異体Ｎ２８８Ｋ：：Ｆ３３８Ｌ（ｗ１
７−ｄ）。β−ガラクトシダーゼ活性は、炭素供給源としてラフィノースを含有
する液体選択培地中での増殖８時間後に決定した（図１１）。「スーパートラン
ス」対立遺伝子は、野生型ｐ５３と比べて非常に高いレベルでβ−ガラクトシダ
ーゼを誘導した。該結果は、発明者らが開発した新規な酵母アッセイにより、野
生型を超える高いトランス活性化能力を有するｐ５３対立遺伝子を単離できると
いう観察を確かにする。To confirm the increased transactivating capacity of these alleles in yeast, some of the described p53 "supertrans" alleles were tested by the β-galactosidase gene-based gene reporter assay. Briefly, double transformants containing the pGAL1 plasmid and a 2 micron vector containing the β-galactosidase gene under p53 control were selected for p53 expression. The same RGC sequence mediates p53 binding and transcriptional activation in the vector. The following "supertrans" alleles were tested: S121F (
w3), T123A (w4), C124Y (w6), D184G (p3), S2
40N (w15) and the constructed double mutant N288K :: F338L (w1
7-d). β-galactosidase activity was determined after 8 hours of growth in liquid selective medium containing raffinose as carbon source (FIG. 11). The "supertrans" allele induced β-galactosidase at very high levels compared to wild-type p53. The results confirm the observation that the novel yeast assay developed by the inventors can isolate p53 alleles with high transactivating capacity over wild type.

【０１６６】 ＡＤＥ２およびβ−Ｇａｌ受容体はいずれも、ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメイン中
の単一アミノ酸変化が酵母におけるヒトｐ５３ ＤＮＡのトランスアクチベーシ
ョン活性を大いに増強することを確認するものである。これらの変異がスクリー
ニング（３ｘＲＧＣ）に使用されるｐ５３陽性エレメントに対するＤＮＡ結合ド
メインのアフィニティーを増大させることがありうる。あるいはまた、変異はｐ
５３コンホーメーションに対する安定化効果を有し、蛋白：蛋白相互作用に影響
する可能性がある。フラフィノース培地中の野生型ｐ５３および４種のスーパー
トランス変異体の量は、ウェスタンブロットによれば増大していた。すべての変
異体は野生型ｐ５３と比較すると比較可能な程度にわずかに減少していた（図１
２）。そのわずかな減少は、低い発現状態であっても酵母増殖に対するスーパー
トランスアリールの微小な影響があるためかもしれない。ＧＡＬ１，１０プロモ
ーターが抑制された場合（グルコース培地中で）、蛋白量は著しく減少し、より
均質となった（ｗｔおよびＴ１２３Ａのみが示される）。この結果は、スーパー
トランス表現型がｐ５３量の増加によるものではないことを示す。Both the ADE2 and β-Gal receptors confirm that a single amino acid change in the p53 DNA binding domain greatly enhances the transactivation activity of human p53 DNA in yeast. It is possible that these mutations increase the affinity of the DNA binding domain for the p53 positive element used in the screen (3xRGC). Alternatively, the mutation is p
It has a stabilizing effect on the 53 conformation and may affect protein: protein interactions. The amount of wild-type p53 and the four supertrans mutants in the furafinose medium was increased by Western blot. All mutants were slightly reduced in comparison to wild-type p53 (Fig. 1).
2). The slight decrease may be due to the minor effect of supertransaryl on yeast growth even at low expression conditions. When the GAL1,10 promoter was repressed (in glucose medium), the amount of protein was significantly reduced and more homogenous (only wt and T123A are shown). This result indicates that the supertrans phenotype is not due to increased p53 levels.

【０１６７】 異なる発現レベルのスーパートランスｐ５３変異体および種々のｐ５３応答性エ
レメントを用いた場合のトランスアクチベーション ＡＤＥ２受容体上流のＲＧＣ応答エレメントを用いてスーパートランスアリー
ルが同定されたので、そのスーパートランス効果の一般性を評価することが重要
である。同じＡＤＥ２受容体を用いて、ＲＧＣ以外にもＰ２１、ｂａｘおよびＰ
ＩＧ３応答性エレメントに関してトランスアクチベートする能力について多くの
アリールが試験された（２６）。また、ラフィノースおよび少量のガラクトース
の組み合わせを用いると、ｐ５３誘導が種々のレベルとなった。試験した９種の
変異体のうち、ＲＧＣおよびＰＩＧ３応答性エレメントに対するスーパートラン
ス応答は同様であった（表７）。ｐ２１応答性エレメントに関してスーパートラ
ンスである変異体はなかったが、３種の変異体はｂａｘエレメントに関して増大
したトランスアクチベーションを示した。すべてのスーパートランス変異体は、
高レベル発現された４種の応答性エレメントに対して野生型レベルのトランスア
クチベーション能力を保持していたが（２％ラフィノース＋０．０１５％ガラク
トース）、野生型ｐ５３とは異なり、それらは高い誘導状態において増殖を完全
に妨害した（ラフィノース＋０．５％ガラクトース）。この結果は、ＡＤＨ１プ
ロモーター制御下での中庸のスーパートランスアリール発現は、野生型ｐ５３と
は区別されない白色コロニー表現型を生じさせうることを示唆する。表６のすべ
ての変異体に関してＡＤＨ１発現プラスミドが構築され、グルコースプレート上
にてｙＩＧ３９７中で試験された。Ｓ２４０Ｎを除くすべての変異体は増殖を妨
害し、白色コロニーを生じた。かくして、ｐ５３がＡＤＨプロモーターにより構
成的に発現される場合には、スーパートランスアリールは同定され得ない。Transactivation with Different Expression Levels of Supertrans p53 Variants and Various p53 Responsive Elements As the supertransaryl was identified using the RGC response element upstream of the ADE2 receptor, its supertrans effect. It is important to evaluate the generality of. Using the same ADE2 receptor, in addition to RGC, P21, bax and P
Many aryls have been tested for their ability to transactivate IG3 responsive elements (26). Also, the combination of raffinose and a small amount of galactose resulted in varying levels of p53 induction. Of the 9 mutants tested, the supertrans response to RGC and PIG3 responsive elements was similar (Table 7). None of the mutants were supertrans for the p21 responsive element, but the three mutants showed increased transactivation for the bax element. All Supertrans mutants
While retaining wild-type levels of transactivation capacity for the four highly expressed responsive elements (2% raffinose + 0.015% galactose), unlike wild-type p53, they have a high induction state. Growth was completely blocked (raffinose + 0.5% galactose). This result suggests that moderate supertransaryl expression under the control of the ADH1 promoter can give rise to a white colony phenotype indistinguishable from wild-type p53. ADH1 expression plasmids were constructed for all variants in Table 6 and tested in yIG397 on glucose plates. All mutants except S240N interfered with growth and produced white colonies. Thus, supertransaryl cannot be identified when p53 is constitutively expressed by the ADH promoter.

【０１６８】 ｐ５３「スーパートランス」アリールの優性ポテンシャル試験 いくつかのｐ５３腫瘍変異および特に、腫瘍中の変異ホットスポットは、ヘテ
ロ接合体において野生型よりも優性な負の表現型であると考えられる。一般的に
は、この効果は、これらの変異体が野生型とともにヘテロ４量体を形成し、それ
らの機能を低下あるいは減損させる能力により説明される。野生型と比較して増
大したトランスアクチベーションを示すｐ５３アリールが得られたので、我々は
、「スーパートランス」アリールがｐ５３腫瘍変異の優性な負の表現型に対して
耐性であるかどうかを調べた。Dominant Potential Testing of p53 "Supertrans" Aryl Some p53 tumor mutations, and in particular mutation hotspots in tumors, appear to be the dominant negative phenotype over wild-type in heterozygotes. In general, this effect is explained by the ability of these mutants to form heterotetramers with wild type and reduce or impair their function. Having obtained p53 aryls with increased transactivation compared to wild type, we investigated whether "supertrans" aryls were resistant to the dominant negative phenotype of p53 tumor mutations. .

【０１６９】 構成的なＡＤＨ１プロモーターの制御下でｐ５３アリールを発現するプラスミ
ドを構築した。異なるマーカーを付して酵母中にこれらのベクターを形質転換し
、そうしない場合にはｐ５３変異を発現する同じベクターを酵母中に形質転換し
た。A plasmid was constructed expressing the p53 aryl under the control of the constitutive ADH1 promoter. These vectors were transformed into yeast with different markers, otherwise the same vector expressing the p53 mutation was transformed into yeast.

【０１７０】 二重形質転換体を選択し、ＡＤＥ２に基づく色のアッセイを用いてトランスア
クチベーションを試験した。この表現型分析の例を図１３に示し、結果を表８に
まとめる。５種のスーパートランスアリールを、６種のｐ５３優性−負の腫瘍変
異体に対して試験した。腫瘍ならびに野生型またはスーパートランス発現プラス
ミドのいずれかを含む酵母形質転換体を二重選択プレート上で得た。６種の腫瘍
変異体のうち５種が野生型活性を示した（ピンク色）（表８）。興味深いことに
、Ｓ１２１Ｆ、Ｔ１２３ＡおよびＶ２７４Ａスーパートランス変異体は優性な負
の表現型に対して耐性であった（白色コロニー）。Ｓ２４０Ｎ変異体は、ＡＤＨ
１プロモーター制御下かつ野生型ｐ５３存在下で発現された場合には、増殖を妨
害し、この表現型を改善しなかった。ｐ５３腫瘍変異体の同時発現により白色コ
ロニーの外界を呈し、混合４量体が形成される可能性があり、ＤＮＡ結合活性が
部分的に影響を受けるが、トランスアクチベーションが保持されることが示唆さ
れた。種々の腫瘍変異体と組み合わせて試験した場合、Ｈ１７８Ｙ変異体は野生
型ｐ５３と同様であった。同時に、コロニー色は野生型ｐ５３発現コロニーと思
われる色に近く、Ｓ２４０Ｎもまた、ｐ５３優性変異の負の効果に耐性があるこ
とが示唆された。Double transformants were selected and tested for transactivation using an ADE2-based color assay. An example of this phenotypic analysis is shown in Figure 13 and the results are summarized in Table 8. Five supertransaryls were tested against six p53 dominant-negative tumor variants. Yeast transformants containing tumor as well as either wild type or supertrans expression plasmids were obtained on dual selection plates. Of the 6 tumor variants, 5 showed wild-type activity (pink) (Table 8). Interestingly, the S121F, T123A and V274A supertrans mutants were resistant to the dominant negative phenotype (white colonies). The S240N mutant is ADH
When expressed under the control of one promoter and in the presence of wild-type p53, it interfered with growth and did not improve this phenotype. The co-expression of p53 tumor mutants may lead to the appearance of white colonies and may form mixed tetramers, suggesting that DNA binding activity is partially affected but transactivation is retained. It was The H178Y mutant was similar to wild-type p53 when tested in combination with various tumor mutants. At the same time, the colony color was close to that expected for wild-type p53-expressing colonies, suggesting that S240N is also resistant to the negative effects of the p53 dominant mutation.

【０１７１】 優性に関するスーパートランス対腫瘍変異体の試験を、ｂａｘ応答エレメント
を用いて繰り返した。なぜなら、それはｐ５３に対して低い結合アフィニティー
を示し、野生型よりも優性な負の表現型が強いからである（表９）。２種のスー
ｐｓ−トランス変異体を、５種の優性な負の変異に対して試験した。興味深いこ
とに、白色の野生型ｐ５３は腫瘍変異によって完全に阻害され、Ｓ１２１Ｆおよ
びＴ１２３Ａはいずれも活性を完全に保持していた。Testing of supertrans vs. tumor variants for dominance was repeated with the bax response element. Because it shows a low binding affinity for p53 and a stronger dominant negative phenotype than the wild type (Table 9). The two soups-trans mutants were tested against the five dominant negative mutations. Interestingly, white wild-type p53 was completely inhibited by the tumor mutation and both S121F and T123A fully retained activity.

【０１７２】 また本発明は、ｐ５３により調節される異なる経路を識別するｐ５３アリール
を提供する。例えば、定義されたｐ５３により調節される遺伝子のトランスアク
チベーションを優先的に促進し、その一方で正常あるいは低下した他の活性を保
持しているｐ５３変異体が同定される。かくして、その系は、ｐ５３による誘導
強度に関連してｐ５３により認識される種々のプロモーター（強度は無しからス
ーパートランスに至るものまで）ならびにｐ５３応答性遺伝子の組み合わせ（す
なわち、オンのものもあれば、オフのものもある）に関して、ｐ５３機能を「適
合」させる機会を提供する。このことは、ｐ５３応答性経路を変化させる機会を
提供し、それゆえ、環境の攻撃に応答した生物学的結果を提供する。新たな（変
異した）形態のｐ５３により認識されうる新たなプロモーター応答性エレメント
が同定される。その系は、他の（すなわち、通常の腫瘍ｐ５３）変異体とともに
発現された場合に優性である変異ｐ５３を同定または適合させる機会も提供する
。The invention also provides p53 aryls that distinguish between different pathways regulated by p53. For example, p53 mutants are identified that preferentially promote transactivation of defined p53-regulated genes, while retaining normal or reduced other activity. Thus, the system is a combination of various promoters recognized by p53 (ranging from no strength to supertrans) as well as p53-responsive genes (ie some on) in relation to the strength of induction by p53. , Some of them are off). This provides the opportunity to alter the p53 responsive pathway and therefore the biological consequences in response to environmental aggression. New promoter responsive elements are identified that can be recognized by the new (mutated) form of p53. The system also provides the opportunity to identify or match mutant p53 that is dominant when expressed with other (ie, normal tumor p53) mutants.

【０１７３】 ｐ２１およびｂａｘ応答性エレメントに関するスーパ−トランスｐ５３変異体
ならびにＲＧＣに関するさらなるスーパートランスｐ５３変異体が単離されてい
る。これらの変異を表１０に示す。Ｌ１およびＬ３ループ、Ｈ２ヘリックス、さ
らにはストランドＳ４およびＳ１０におけるアミノ酸変化が確認された。いくつ
かの変異は、ｂａｘおよびｐ２１の両方あるいはｂａｘおよびＲＧＣに関してス
ーパ−トランス表現型を示したが、他のものは応答性エレメントに対してより特
異的であると思われた。これまで同定されたすべてのスーパートランスアリール
に関するトランスアクチベーション分析のまとめを表１１に示す。トランスアク
チベーションおよびスーパートランスアクチベーションの異なるパターンが観察
された（「パターン」は、変異ｐ５３によりオンまたはオフされたプロモーター
エレメント、各プロモーターエレメントに対する応答レベル、ならびにｐ５３変
異体の潜在的毒性をまとめるものである）。いくつかの変異体は一定の応答性エ
レメントに対して強い特異性を示すが、他のものは、試験したすべてのエレメン
トに関して野生型よりも活性があると思われる。これらの後者の変異はフォール
ディング安定性を増大させ、あるいはさらなるＤＮＡコンタクトを導入する可能
性があるが、特異性に影響することはない。Ｌ１ループ中の同じ位置（１２１、
１２３および１２４）での異なるアミノ酸変化は異なるパターンのトランスアク
チベーション特異性およびアフィニティーを示した。Super-trans p53 variants for p21 and bax responsive elements and additional supertrans p53 variants for RGCs have been isolated. These mutations are shown in Table 10. Amino acid changes in the L1 and L3 loops, the H2 helix, as well as the strands S4 and S10 were confirmed. Some mutations showed a super-trans phenotype with both bax and p21 or with bax and RGC, while others appeared to be more specific for responsive elements. A summary of transactivation analysis for all supertransaryls identified to date is shown in Table 11. Different patterns of transactivation and supertransactivation were observed ("pattern" summarizes the promoter elements turned on or off by mutant p53, the level of response to each promoter element, and the potential toxicity of p53 mutants. ). Some variants show strong specificity for certain responsive elements, while others appear to be more active than wild type for all elements tested. These latter mutations may increase folding stability or introduce additional DNA contacts, but do not affect specificity. Same position in L1 loop (121,
Different amino acid changes at 123 and 124) showed different patterns of transactivation specificity and affinity.

【０１７４】 ヒト細胞中のｐ５３「スーパートランス」アリールの発現 酵母において得られた結果は、ｐ５３結合エレメントとしてヒトＲＧＣ配列を
用いる遺伝子レポーターアッセイにおいて我々が単離したアリールが増大したト
ランスアクチベーション能力を有することを、確信を持って示すものである。そ
のうえ、いくつかの「スーパートランス」アリールが通常には見られず、あるい
はこれまで腫瘍において観察されていないという事実は、それらがｐ５３の生物
学に関して重要な機能を失っているという可能性に対する議論となる。いくつか
の場合において、変化した特異性は増大したトランスアクチベーションを説明す
るが、すべてのｐ５３下流遺伝子が等しく活性化されうるとは限らないという可
能性を残す。そのうえ、酵母特異的因子がｐ５３のトランスアクチベーションを
モジュレーションしうる可能性があり、逆に、酵母がヒト細胞におけるｐ５３に
より媒介されるトランスアクチベーションにおいて付加的な役割を果たす可能性
がある。この理由に関して、ｐ５３「スーパートランス」アリールはヒト細胞に
おいても調べる必要がある。本発明の変異およびスクリーニング方法はヒトにお
いてｐ５３活性をさらに調べる際の貴重な研究ツールである。Expression of p53 “supertrans” aryl in human cells The results obtained in yeast show that the aryl we have isolated has an increased transactivation capacity in a gene reporter assay using the human RGC sequence as the p53 binding element. It shows with certainty. Moreover, the fact that some "supertrans" aryls are not normally found or have not previously been observed in tumors argues for the possibility that they have lost a significant function with respect to p53 biology. Becomes In some cases, the altered specificity accounts for increased transactivation, but leaves the possibility that not all p53 downstream genes can be equally activated. Moreover, it is possible that yeast-specific factors may modulate the transactivation of p53 and, conversely, yeast may play an additional role in p53-mediated transactivation in human cells. For this reason, p53 "supertrans" aryls also need to be investigated in human cells. The mutation and screening methods of the present invention are valuable research tools for further studying p53 activity in humans.

【０１７５】 それゆえ、５種のスーパートランス変異体をｐ５３ヌルＳａｏｓ−２腫瘍細胞
において試験して、ヒト細胞において発現された場合のそれらの生物学的効果を
評価した。強力なＣＭＶプロモーターから発現されたｐ５３変異体で細胞をトラ
ンスフェクションした。図１４に示すように、Ｓ１２１Ｆ、Ｃ１２４ＹおよびＳ
２４０Ｎ変異体は野生型ｐ５３よりもいくぶん大きな増殖抑制を引き起こした（
５−７％に対して１３％コロニー形成）。Ｖ２７４Ａ変異体は増殖を抑制できず
、この変異体は酵母におけるトランスアクチベーションに関し、３７℃で温度感
受性であった。Therefore, five supertrans mutants were tested in p53 null Saos-2 tumor cells to assess their biological effect when expressed in human cells. Cells were transfected with p53 mutants expressed from the strong CMV promoter. As shown in FIG. 14, S121F, C124Y, and S
The 240N mutant caused a somewhat greater growth inhibition than wild-type p53 (
13% colony formation vs. 5-7%). The V274A mutant was unable to suppress growth and it was temperature sensitive at 37 ° C for transactivation in yeast.

【０１７６】 野生型ｐ５３による増殖抑制は、優性な負のｐ５３腫瘍変異体の過剰発現によ
り改善されうる（図１４および図１５）。酵母における上記実験から示唆される
ように、スーパートランスアリールはこの阻害に対して耐性であるかもしれない
。このことを調べるために、変異体Ｇ２７９Ｅに対する野生型またはスーパート
ランス（Ｓ１２１ＦおよびＴ１２３Ａ）の割合をプラスミド比１：４として同時
トランスフェクション実験を行った。予想通り、優性な負のＧ２７９Ｅ腫瘍変異
体は野生型ｐ５３の活性を減じ、そのことはＧ２７９Ｅが存在する場合にコロニ
ー形成がずっと多くなることにより明らかである（１３％に対して５０％；図５
参照）。さらに、このことは、スーパートランス活性化変異が優性な負の変異に
打ち勝つことができることを示すものである。Growth inhibition by wild-type p53 can be improved by overexpression of a dominant negative p53 tumor variant (FIGS. 14 and 15). Supertransaryl may be resistant to this inhibition, as suggested by the above experiments in yeast. To investigate this, co-transfection experiments were performed with a ratio of wild type or supertrans (S121F and T123A) to mutant G279E at a plasmid ratio of 1: 4. As expected, the dominant negative G279E tumor mutant diminished the activity of wild-type p53, as evidenced by the much higher colonization in the presence of G279E (50% vs. 13%; Figure). 5
reference). Furthermore, this indicates that the supertrans-activating mutation can overcome the dominant negative mutation.

【０１７７】 Ｔ１２３Ａ＋Ｇ２７９Ｅに関して同様の効果が観察された。Ｇ２７９Ｅの存在
は、Ｓ１２１Ｆにより誘導される増殖欠陥の改善においてより小さい効果を有す
るように思われる。Similar effects were observed for T123A + G279E. The presence of G279E appears to have a smaller effect in ameliorating S121F-induced proliferative defects.

【０１７８】 ｂａｘ、ＭＤＭ２およびｐ２１応答性エレメントを有するルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子をトランスアクチベートする種々の変異体の能力も調べた。２種の
プラスミド（１つはｐ５３発現用、もう１つはレポーター遺伝子を含む）をＳａ
ｏｓ−２細胞中にトランスフェクションし、ルシフェラーゼの誘導を調べた。ｂ
ａｘ応答性エレメントは酵母において使用したのと同じものであったが、ｐ２１
およびＭＤＭ２エレメントはＳａｏｓ−２細胞において使用された完全なｐ２１
およびＭＤＭ２プロモーターとは異なるものであった。図１６に示すように、Ｖ
２７４Ａは、３７℃において酵母での結果から予想されるようなトランスアクチ
ベーションを示さなかったが、それは温度感受性であった。Ｓ１２１Ｆ変異体は
、増殖抑制が非常に強いにもかかわらず、ルシフェラーゼレポーターを活性化で
きなかった。レベルは異なるが、他の３種のスーパースーパートランス変異体Ｔ
１２３Ａ、Ｃ１２４ＹおよびＳ２４０Ｎはすべて、試験した応答性エレメントに
関係なく、ルシフェラーゼを誘導することができた。最強の応答は野生型ｐ５３
よりもいくぶん強力であったが、それはＭＤＭ２プロモーターにを用いた場合に
見られた。一過性トランスフェクションにおけるｐ５３蛋白発現レベルはウェス
タンブロット分析によれば同等であった（図１７）。予想されたように、Ｖ２７
４Ａ変異体はより耐性であり、蛋白量はより多かった。ｐ２１に対する抗体を用
いて、内在性ｐ２１自身のプロモーターから内在性ｐ２１を誘導する、種々のｐ
５３アリールの能力を試験した。Ｓ１２１Ｆ変異体はｐ２１誘導において部分的
な欠陥を示した。Ｔ１２３Ａ、Ｃ１２４ＹおよびＳ２４０Ｎはすべてｐ２１を誘
導し、野生型ｐ５３と同様であったが、Ｖ２７４Ａは完全に欠陥があると思われ
た。かくして、Ｓａｏｓ−２細胞中にて部分的なｐ２１応答性エレメント（表７
および１２）ならびに内在性ｐ２１プロモーターを用いた場合の、酵母における
結果は同等であった。The ability of various mutants to transactivate the luciferase reporter gene with bax, MDM2 and p21 responsive elements was also examined. Sa plasmids of two types (one for p53 expression and the other containing the reporter gene)
The luciferase induction was examined by transfection into os-2 cells. b
The ax responsive element was the same as that used in yeast, but p21
And the MDM2 element is the complete p21 used in Saos-2 cells.
And the MDM2 promoter. As shown in FIG.
274A did not show the transactivation at 37 ° C as expected from the yeast results, but it was temperature sensitive. The S121F mutant was unable to activate the luciferase reporter despite very strong growth inhibition. Levels differ, but the other three Super Super Trans mutants T
123A, C124Y and S240N were all able to induce luciferase regardless of the responsive element tested. Wild type p53 is the strongest response
Although somewhat more potent, it was seen with the MDM2 promoter. The p53 protein expression level in transient transfection was comparable by Western blot analysis (FIG. 17). As expected, V27
The 4A mutant was more resistant and had higher protein content. Antibodies against p21 are used to induce endogenous p21 from the promoter of endogenous p21 itself.
The ability of the 53 aryl was tested. The S121F mutant showed a partial defect in p21 induction. T123A, C124Y and S240N all induced p21, similar to wild type p53, but V274A appeared to be completely defective. Thus, in Saos-2 cells partial p21 responsive elements (Table 7).
And 12) and with the endogenous p21 promoter the results in yeast were comparable.

【０１７９】 ｐ５３機能の部分的なまたは完全な廃止をもたらすｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン
における突然変異により引き起こされるプロモーター特異性および親和性の欠損
または変化は、腫瘍成長の鍵となる事象である。たとえ数個の主要なホットスポ
ットが観察されたとしても、ｐ５３腫瘍突然変異はＤＮＡ結合ドメイン全体に起
こる(ヘルナンデス-ブサード(Hernandez-Boussard)ら)。これは、おそらくその
構造(ループ-シート-ヘリックスを支持するβ-サンドウィッチ骨格と、ＤＮＡと
接触する２つのＺｎ^２＋配位ループとからなる(チョー(Cho)ら))が不活化突然変
異に対して非常に感受性が高いからである。最近のインビトロ研究は、ｐ５３突
然変異をより良好に分類し、かつタンパクの構造/機能に対する限定されたアミ
ノ酸変化の効果を理解することを目的としたｐ５３コアドメインの折り畳み安定
性およびＤＮＡ結合活性に対する大きい一群の腫瘍突然変異の効果を定量的に取
り扱っている(ブルロック(Bullock)ら(1997)、ブルロック(Bullock)ら(2000))。
同じアプローチは、プロモーター要素に対するＤＮＡ結合親和性に影響を与える
ことなく、かつ第２部位サプレッサー突然変異による腫瘍突然変異体の機能的な
再活性化の機構を理解することなく、ｐ５３ＤＮＡ結合ドメインのより安定な変
異体を設計する試みに応用された(ニコロヴァ(Nikolova)ら(1998)；ニコロヴァ(
Nikolova)ら(2000))。Defects or alterations in promoter specificity and affinity caused by mutations in the p53 DNA binding domain that result in partial or complete abolition of p53 function are key events in tumor growth. The p53 tumor mutation occurs throughout the DNA binding domain, even though several major hotspots are observed (Hernandez-Boussard et al.). This was probably due to inactivating mutations in its structure (β-sandwich backbone supporting the loop-sheet-helix and two Zn ²⁺ coordination loops in contact with DNA (Cho et al.)). Because it is very sensitive. Recent in vitro studies have aimed to better classify p53 mutations and to understand the effects of limited amino acid changes on protein structure / function on folding stability and DNA binding activity of the p53 core domain. It quantitatively deals with the effects of a large group of tumor mutations (Bullock et al. (1997), Bullock et al. (2000)).
The same approach was followed for the p53 DNA-binding domain without affecting the DNA-binding affinity for promoter elements and understanding the mechanism of functional reactivation of tumor mutants by second-site suppressor mutations. It was applied in an attempt to design stable mutants (Nikolova et al. (1998); Nikolova (
Nikolova) et al. (2000)).

【０１８０】 一般的に用いられる酵母のｐ５３機能アッセイ(フラマン(Flaman)、イシオカ(
Ishioka)、フレボーグ(Frebourg)、ディ・コモ(Di Como)、ブラヒマン(Brachman
n))が構成的な中程度のＡＤＨ１プロモータの制御下で上記タンパクを発現する
ことに注目することは興味深い。これらのアッセイを用いれば、すべての「スー
パートランス」対立遺伝子は野生型ｐ５３であると見なされるか、あるいはゼロ
増殖表現型ゆえに失われているだろう(表６を参照)。A commonly used yeast p53 functional assay (Flaman, Isioca (
Ishioka, Frebourg, Di Como, Brachman
It is interesting to note that n)) expresses the protein under the control of the constitutive intermediate ADH1 promoter. Using these assays, all "supertrans" alleles would either be considered wild-type p53, or would have been lost due to the zero growth phenotype (see Table 6).

【０１８１】 酵母における更なる分析は、「スーパートランス」対立遺伝子がゼロ増殖表現
型をもたらしたが、野生型ｐ５３は中程度の増殖阻害をもたらしたことを示した
。２つの異なる単離物は、中程度に発現された場合でさえ増殖を妨害した。この
条件では、野生型ｐ５３は効果がない。これらの結果は、酵母における増殖阻害
が部分的にはｐ５３のＤＮＡ結合可能性と相関すること、ならびに、親和性また
は配列選択性の変化のいずれかがコロニー形成に対しておよび致死率に対しても
悪影響をもたらし得るという仮説を確認する。致死的なｐ５３変異体の選択は、
おそらく異常な機能を示す新規なｐ５３変異体を同定する別の相補的なアプロー
チとして見なすことができる。Further analysis in yeast showed that the "supertrans" allele resulted in a zero growth phenotype, while wild-type p53 resulted in moderate growth inhibition. Two different isolates interfered with growth even when expressed moderately. Under this condition, wild-type p53 has no effect. These results indicate that growth inhibition in yeast partially correlates with p53 DNA-binding potential, and that either changes in affinity or sequence selectivity are associated with colony formation and mortality. Confirm the hypothesis that can also have adverse effects. The selection of lethal p53 mutants is
It can be viewed as another complementary approach to identify novel p53 mutants that probably exhibit aberrant function.

【０１８２】 増大した転写活性化を示すｐ５３対立遺伝子の発見に伴う予想は、それらが野
生型ｐ５３に比べて、一般的な腫瘍突然変異体の優勢な負の効果に対する耐性が
高いかもしれないということである。この優勢な負の効果は、ヘテロ接合性に見
ることができ、ミスセンスｐ５３突然変異体の強いインビボ選択を説明しうる。
混合四量体においては、野生型に比べてＤＮＡ結合親和性の高いサブユニットが
依然として、トランス活性化を可能にするｐ５３応答性要素と十分な相互作用を
媒介することができるということは考えられる。あるいは、発現の生理学的レベ
ルでは、転写活性化を達成することが要求される最少量の「スーパートランス」
ホモ四量体(野生型のもの(ヘテロ接合性および同等の安定性の場合、全タンパク
の統計学的に１/１６)ではない)を獲得することができるであろう。野生型より
ｐ５３突然変異体の優位性を評価するために本来開発された簡単なアッセイを用
いて、我々はいくつかの「スーパートランス」対立遺伝子のトランス活性化の可
能性に対する一連の優勢な腫瘍突然変異体の効果を試験した。ここに与えられた
データは、確かに「スーパートランス」対立遺伝子が同等の中程度の発現レベル
で腫瘍突然変異体の負の効果を克服することができることを示唆する。この結果
は、様々なｐ５３応答性要素についてこの特徴を示す「スーパートランス」対立
遺伝子が、腫瘍細胞に対するｐ５３活性を復活させることを目的としたアプロー
チにおける野生型ｐ５３の代わりとして治療に大きい価値を有するかもしれない
ことを示す。最近のデータは、高度に発現された内生の突然変異体が外来の野生
型タンパクの効果を阻害するので、ヒト癌細胞における野生型ｐ５３遺伝子治療
が失敗しうることを示唆する。増大した転写活性化を有するｐ５３対立遺伝子は
、突然変異体に対してより耐性を示し、この治療のより良好な結果をもたらすか
もしれない。The expectation with the discovery of p53 alleles that show increased transcriptional activation is that they may be more resistant to the predominant negative effects of common tumor mutants compared to wild-type p53. That is. This predominant negative effect can be seen in heterozygosity and may explain the strong in vivo selection of missense p53 mutants.
In mixed tetramers, it is conceivable that subunits with higher DNA binding affinity than wild type may still mediate sufficient interactions with p53-responsive elements that enable transactivation. . Alternatively, at the physiological level of expression, the minimal amount of "supertrans" required to achieve transcriptional activation.
It would be possible to obtain a homotetramer, not the wild type (statistically 1/16 of the total protein for heterozygosity and comparable stability). Using a simple assay originally developed to assess the predominance of p53 mutants over the wild type, we show a set of predominant tumors for possible transactivation of several "supertrans" alleles. The effect of the mutant was tested. The data presented here certainly suggest that the "supertrans" allele is able to overcome the negative effects of tumor mutants at comparable moderate expression levels. This result indicates that the "supertrans" alleles that characterize this p53 responsive element for various p53 responsive elements have great therapeutic value as an alternative to wild-type p53 in an approach aimed at restoring p53 activity against tumor cells. Indicates that it may be. Recent data suggest that wild-type p53 gene therapy in human cancer cells may fail because highly expressed endogenous mutants block the effects of foreign wild-type protein. The p53 allele with increased transcriptional activation may be more resistant to the mutant, leading to better outcomes of this treatment.

【０１８３】 ｐ５３対立性変異体における増大した転写可能性を選択する本発明のアプロー
チは、３つのｐ５３応答性要素を利用している。そのうち２つだけがｐ５３調節
遺伝子のプロモーターに対応する(ｂａｘおよびｐ２１)。突然変異体のいくつか
は、少なくとも２つの応答性要素について増強された活性を示した(表６、１０
、１１、１２を参照)が、その他は１つの要素に対してより特異的であるようで
あった。突然変異体の多くは腫瘍で検出されていない。このことはこれらタンパ
クが野生型のような腫瘍サプレッサー活性を保持し、異なる機能的特徴を有する
かもしれないことを示唆する。教示したこれらアッセイには、更なるｐ５３応答
性要素を利用することができる。The inventive approach of selecting for increased transcriptional potential in p53 allelic variants utilizes three p53 responsive elements. Only two of them correspond to the promoters of the p53 regulated gene (bax and p21). Some of the mutants showed enhanced activity for at least two responsive elements (Tables 6, 10).
, 11, 12), but the others appeared to be more specific for one element. Many of the mutants have not been detected in tumors. This suggests that these proteins retain wild-type-like tumor suppressor activity and may have different functional characteristics. Additional p53 responsive elements can be utilized in these taught assays.

【０１８４】 ４つの対立遺伝子(Ｓ１２１Ｆ、Ｔ１２３Ａ、Ｃ１２４Ｙ、Ｓ２４０Ｎ)を用い
た研究はそれらが野生型ｐ５３と同様に増殖を抑制することができることを示す
。このことは関連する生物学的性質が失われていることを示す。逆に、Ｖ２７４
Ａが腫瘍ｐ５３突然変異体であるという事実は、その機能が損なわれていること
を示唆する。酵母にて様々な温度で試験した場合、Ｖ２７４Ａは３７℃でトラン
ス活性化が欠けていた。このことはＶ２７４Ａがヒト細胞で発現した場合に機能
的でないことと一致している。「スーパートランス」および優勢な突然変異体(
過剰な突然変異体)の組合せを用いた同時トランスフェクション実験は、ｐ５３-
Ｓ１２１ＦがＤＮＡ結合突然変異体(ｐ５３-Ｇ２７９Ｅ)の優勢な負の効果に耐
性を有することを示す(図１５)。Studies with the four alleles (S121F, T123A, C124Y, S240N) show that they can suppress proliferation as well as wild-type p53. This indicates that the relevant biological properties have been lost. Conversely, V274
The fact that A is a tumor p53 mutant suggests that its function is impaired. V274A lacked transactivation at 37 ° C when tested in yeast at various temperatures. This is consistent with V274A not being functional when expressed in human cells. "Super Trance" and the dominant mutant (
The co-transfection experiment with the combination of (excessive mutants) was p53-
We show that S121F is resistant to the predominant negative effect of the DNA binding mutant (p53-G279E) (Figure 15).

【０１８５】 ここに与えられたアッセイは、腫瘍試料における潜在性ｐ５３突然変異体のス
クリーニング手段として用いることができる。それらは一般的なｐ５３機能アッ
セイでは検出されなくなりうるからである。新規なまたは稀な突然変異は、最近
、腫瘍試料における直接的な配列決定により同定され、ヒト細胞において野生型
のようなトランス活性化機能を有することが示されている(スミス(Smith)ら)。
弱いトランス活性化欠損を示すｐ５３突然変異は、最近、膀胱癌組織において本
発明の酵母スクリーニングで同定された。The assay provided herein can be used as a screening tool for potential p53 mutants in tumor samples. Because they can go undetected in common p53 functional assays. New or rare mutations have recently been identified by direct sequencing in tumor samples and shown to have a wild-type-like transactivating function in human cells (Smith et al.). .
A p53 mutation exhibiting a weak transactivation deficiency was recently identified in the yeast screen of the present invention in bladder cancer tissue.

【０１８６】 さらに、このアッセイは、下流遺伝子の調節の変化したパターンを示す新規な
ｐ５３対立遺伝子の生成および特徴付けに有用であり、また、ｐ５３応答性経路
のインビボでの機能に関する詳細な分析および付加的なｐ５３調節遺伝子の同定
に有用である。完全なヒトｐ５３タンパクおよび様々な四量体応答性要素を用い
た低い発現でのトランス活性化分析は、ｐ５３-ＤＮＡ結合特異性/親和性および
安定性のより良好な理解を与える。このアプローチは、ｐ５３折り畳み安定性お
よびＤＮＡ結合親和性を取り扱った最近のインビトロ研究(ブルロック(Bullock)
ら；ニコロヴァ(Nikolova)ら)を補足することができる。In addition, this assay is useful for the generation and characterization of novel p53 alleles that show altered patterns of regulation of downstream genes, and also for detailed analysis and in vivo function of the p53 responsive pathway. Useful for identifying additional p53 regulated genes. Transactivation analysis at low expression with the fully human p53 protein and various tetramer responsive elements gives a better understanding of p53-DNA binding specificity / affinity and stability. This approach is based on a recent in vitro study dealing with p53 folding stability and DNA binding affinity (Bullock).
Et al .; Nikolova et al.) Can be supplemented.

【０１８７】 様々なレベルのｐ５３発現に対する酵母アッセイの感度は、ｐ５３機能を増強
するか、あるいは減少させる化合物(すなわち、化学薬品、小さい分子またはペ
プチド)または興味深い因子を同定するのに用いることができるであろう。この
ような薬剤は、ｐ５３腫瘍突然変異体を機能的に再活性化することもできるかも
しれない(フォスター(Foster)ら；セリヴァノヴァ(Selivanova)ら)。あるいは、
ｐ５３機能の一時的な不活性化は治療的価値も有しうる(コマロフ(Komarov)ら)
。最後に、ここに与えられ、本発明の方法に従って同定されたアポトーシス経路
の導入に関して選択性を示すスーパートランスｐ５３対立遺伝子は、野生型ｐ５
３に比べて、機能的ｐ５３が腫瘍組織に直接送達される条件下での癌遺伝子治療
(サラー(Saller)ら；ヴィニャルズ(Vinyals)ら；スウィッシャー(Swisher)ら)に
対するより高い治療効果を有しうる。The sensitivity of yeast assays to varying levels of p53 expression can be used to identify compounds (ie, chemicals, small molecules or peptides) or factors of interest that enhance or decrease p53 function. Will. Such agents may also be able to functionally reactivate p53 tumor mutants (Foster et al .; Selivanova et al.). Alternatively,
Temporary inactivation of p53 function may also have therapeutic value (Komarov et al.)
. Finally, the supertrans p53 allele presented here and showing selectivity for the introduction of the apoptotic pathway identified according to the method of the present invention is a wild-type p5.
Cancer gene therapy under conditions in which functional p53 is delivered directly to tumor tissue as compared to 3
(Saller et al .; Vinyals et al .; Swisher et al.) May have a higher therapeutic effect.

【０１８８】 酵母およびＳａｏｓ-２細胞における応答の要約を表１２に示す。酵母におけ
る増殖阻害/毒性とヒト細胞における増殖抑制との間の非常に良好な相関が観察
された。Ｖ２７４Ａ突然変異の唯一の例外は、突然変異体が３７℃で温度感受性
を有するという観察により説明される。酵母アッセイとＳａｏｓ-２におけるル
シフェラーゼレポーターとを用いたトランス活性化の結果も比較した。たとえ酵
母およびヒトのレポーター構築物における応答性要素が配置およびコピー数の点
で異なっていたとしても、スーパートランス活性化表現型は容易に再現できなく
ても応答の類似性が観察された。酵母におけるトランス活性化の結果は、内生ｐ
２１遺伝子の導入に関する分析ともよく相関する。A summary of responses in yeast and Saos-2 cells is shown in Table 12. A very good correlation between growth inhibition / toxicity in yeast and growth inhibition in human cells was observed. The only exception to the V274A mutation is explained by the observation that the mutant is temperature sensitive at 37 ° C. The results of transactivation using the yeast assay and the luciferase reporter in Saos-2 were also compared. Even though the responsive elements in the yeast and human reporter constructs differed in arrangement and copy number, similar responses were observed even though the supertrans-activated phenotype was not readily reproducible. The result of transactivation in yeast is the endogenous p
It also correlates well with the analysis of 21 gene transfers.

【０１８９】 ヒトスーパートランスおよび毒性ｐ５３突然変異体を調べるために開発された
方法は、非ヒトｐ５３遺伝子を調べるのに用いることもできる。マウスｐ５３野
生型ならびにＲ２７０ＣおよびＴ１２２Ｌ突然変異体(ヒトアミノ酸位置２７３
および１２５に対応する)に関する実施例を表１３に示す。Ｔ１２２Ｌは、マウ
スの皮膚癌に見出されており、酵母において毒性であり、ｂａｘおよびｐ２１に
対してスーパートランスであるが、ＲＧＣについては減少する。The methods developed for examining human supertrans and virulent p53 mutants can also be used to examine non-human p53 genes. Mouse p53 wild type and R270C and T122L mutants (human amino acid position 273
(Corresponding to 125 and 125) is shown in Table 13. T122L has been found in skin cancers in mice, is toxic in yeast, is supertrans to bax and p21, but is diminished for RGCs.

【０１９０】 このシステムは、コンセンサスプロモーター要素により多数の下流遺伝子を調
節する遺伝子(マスター遺伝子)の修飾に関する特異的で広範囲に応用可能なアプ
ローチを提供する。それゆえ、それは特異的な経路を調節することができうる。
調節可能なプロモーターは、ｐ５３について記載したものと同様のレポーターに
含めることができる。マスター遺伝子の変化から生じる経路特異性の例は、大腸
菌のｌｅｘＡ(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J Mol Biol),19
87年1月5日；193(1)：27-40)について見出される。不安定なｌｅｘＡ４１(ｔｓ
ｌ-１)タンパクによるＳＯＳ遺伝子の示差的な抑制は大腸菌Ｋ-１２における「
スプリット表現型」を引き起こす(ピーターソン，ケイ・アール(Peterson K.R.)
、マウント，ディー・ダブリュー(Mount D.W.))。This system provides a specific and widely applicable approach for the modification of genes (master genes) that regulate multiple downstream genes with consensus promoter elements. Therefore, it may be able to regulate specific pathways.
The regulatable promoter can be included in a reporter similar to that described for p53. An example of pathway specificity resulting from alteration of the master gene is E. coli lexA (J Mol Biol, 19
January 5, 1987; 193 (1): 27-40). Unstable lexA41 (ts
The differential suppression of the SOS gene by the 1-1 protein was confirmed in Escherichia coli K-12.
Causes the "split phenotype" (Peterson KR)
, Mount DW).

【０１９１】 本発明はｐ５３が様々な効果を有し得ることを示している。野生型はそれが作
動させる設定数のｐ５３プロモーター(各プロモーターは所定の程度まで作動さ
れる)を有するのに対し、本発明は、ｐ５３遺伝子の突然変異と、様々な発現レ
ベルにおけるｐ５３突然変異体の特徴付けとを組み合わせて酵母をスクリーニン
グ手段として用いることにより、ｐ５３応答のパターンが変化することを示す。The present invention shows that p53 can have various effects. Whereas the wild type has a set number of p53 promoters that it activates (each promoter is activated to a certain degree), the present invention provides mutations in the p53 gene and p53 mutants at various expression levels. It is shown that the pattern of p53 response is changed by using yeast as a screening tool in combination with the characterization of.

【０１９２】 本願を通じて様々な刊行物が参照される。これら刊行物の開示内容は、本発明
が関係する技術分野の水準をより十分に説明するために、出典を示すことにより
、その全部が本願明細書の一部をなす。Throughout this application various publications are referenced. The disclosure of these publications is hereby incorporated by reference in their entirety in order to more fully describe the state of the art to which this invention pertains.

【０１９３】 引用文献： ベーカーら、(1990) Suppression of human colorectal carcinoma cell growth
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Nat. Med. 2,1143-1146;

【０１９４】[0194]

【表２】 [Table 2]

【表３】 [Table 3]

【表４】 [Table 4]

【表５】 [Table 5]

【表６】 [Table 6]

【表７】 [Table 7]

【表８】 [Table 8]

【表９】 [Table 9]

【表１０】 [Table 10]

【表１１】 [Table 11]

【表１２】 [Table 12]

【表１３】 [Table 13]

【表１４】 [Table 14]

【表１５】 [Table 15]

【表１６】 [Table 16]

【表１７】 [Table 17]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 酵母に組み込まれたｐ５３対立遺伝子の表現型分析。ＬＹＳ２に
組み込まれたＧＡＬ１制御下にあるｐ５３または突然変異型ｐ５３を有するｙＩ
Ｇ３９７の形質転換体をＹＰＤおよびＹＰＧＡＬプレート上に筋状にのばし、３
０℃にて３日間インキュベートした。クローンｙＩＲｐ５３−５は、ＡＤＥ２レ
ポーター遺伝子に隣接するプロモーターを転写において活性化するｐ５３の能力
によりガラクトース上において白くなる点で野生型ｐ５３の表現型を示す。クロ
ーン７および９はｐ５３突然変異体のように（赤色コロニーおよび非常に制限さ
れた増殖遅延）振舞った。クローンｙＩＲｐ５３−１９はガラクトース上におい
て増殖できなかった。FIG. 1 Phenotypic analysis of p53 alleles integrated in yeast. YI with p53 or mutated p53 under the control of GAL1 integrated into LYS2
G397 transformants were streaked on YPD and YPGAL plates, and 3
Incubated at 0 ° C for 3 days. Clone yIRp53-5 exhibits a wild-type p53 phenotype in that it becomes white on galactose due to the ability of p53 to activate the promoter adjacent to the ADE2 reporter gene in transcription. Clones 7 and 9 behaved like the p53 mutant (red colonies and very restricted growth retardation). Clone yIRp53-19 was unable to grow on galactose.

【図２】 野生型ｐ５３と比べて、有毒なｐ５３タンパク質は全長を有し、
わずかに発現を減少させる。有毒な突然変異型ｐ５３を含む細胞をガラクトース
培地においてインキュベートし、抽出物を２または４時間後に調製した。レーン
当たりタンパク質抽出物２０ｇを流した。ｐ５３は抗体ｐＡｂ１８０１およびＤ
Ｏ−１（Santa Cruz）を用いて検出した。ＹＩＲｐ５３−５、７および１９はｐ
５３の全長を示したのに対し、ｐ５３はクローン−９において切断されていた。
低位置のバンドはプロテアーゼ欠乏性株から得られた抽出物中の物質という訳で
はないので、劣化によるものであろう。FIG. 2. Compared with wild type p53, the toxic p53 protein has full length,
Expression is slightly reduced. Cells containing the toxic mutant p53 were incubated in galactose medium and extracts were prepared 2 or 4 hours later. 20 g of protein extract was run per lane. p53 is the antibody pAb1801 and D
It detected using O-1 (Santa Cruz). YIRp53-5, 7 and 19 are p
The full length of 53 was shown, whereas p53 was truncated in clone-9.
The low band is probably due to degradation, as it is not a substance in the extract obtained from protease deficient strains.

【図３】 発現された突然変異型ｐ５３の致死効果。クローンｙＩＲｐ５３
−５、ｙＩＲｐ５３−１９およびｐ５３要素を欠くその親株を、グルコース培地
において一晩中増殖させ、洗浄し、１０^６細胞／ｍｌに希釈し、ガラクトース培
地において２４時間増殖させた。必要な時に部分標本をとり、タイターを測定し
、細胞をグルコースに蒔き、生存度を評価した。この曲線は３回の実験について
の平均と標準誤差である。四角は菌数に相当し、三角は生存度に相当する。FIG. 3. Lethal effect of expressed mutant p53. Clone yIRp53
-5, yIRp53-19 and its parent strain lacking p53 elements were grown overnight in glucose medium, washed, diluted to 10 ⁶ cells / ml and grown in galactose medium for 24 hours. Aliquots were taken when needed, titers were measured and cells were plated on glucose to assess viability. This curve is the mean and standard error for three experiments. Squares correspond to bacterial counts and triangles correspond to viability.

【図４】 ｙＰＨ−ｂａｘおよびｙＰＨ−ｐ２１株における有毒なｐ５３突
然変異型のトランス活性化能の評価。これらｐ５３対立遺伝子の高レベルでの発
現は増殖を阻害するので、ＧＡＬ１プロモーターを誘導状態ではないが、脱抑圧
状態に維持するためにラフィノースを炭素源として用いた。この野生型ｐ５３の
低レベルでの発現はトランス活性化の突然変異型のように見える。ガラクトース
を種々の量で添加することによって、ｐ５３発現は直線状ではないとしても増加
する。３つの有毒なｐ５３突然変異型（＃２、４、５）はｐ２１::ＡＤＥ２レポ
ーター系において増大したトランス活性化を示した:コロニーはラフィノースの
みを含むプレート上において白い。また、１つの突然変異型（＃２＝ｐ５３−Ｖ
１２２Ａ）はｂａｘ::ＡＤＥ２においても増大したトランス活性化を示す。全て
の有毒なｐ５３は０.５％または高ガラクトース（２％を示す）にて増殖を阻害
する。突然変異型数は表３に相当する。FIG. 4: Evaluation of transactivating ability of virulent p53 mutants in yPH-bax and yPH-p21 strains. Raffinose was used as a carbon source to maintain the GAL1 promoter in an uninducible but derepressed state, as the high level expression of these p53 alleles inhibits growth. The low level expression of this wild-type p53 appears to be a transactivating mutant. Addition of varying amounts of galactose increases p53 expression, if not linear. Three virulent p53 mutants (# 2,4,5) showed increased transactivation in the p21 :: ADE2 reporter system: colonies are white on plates containing raffinose only. In addition, one mutant type (# 2 = p53-V
122A) also shows increased transactivation in bax :: ADE2. All toxic p53 inhibits growth at 0.5% or high galactose (indicating 2%). The number of mutation types corresponds to Table 3.

【図５】 Ｓａｏｓ−２細胞において発現されたｐ５３による増殖抑制。Ｓ
ａｏｓ−２細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下にある種々のｐ５３対立遺伝子
を含むｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍに基づくプラスミドＤＮＡ１.５ｇを用いて、
リポフェクションすることでトランスフェクションした。このコロニーの相対平
均数および少なくとも３回の実験の標準誤差を表す。パーゼンテージはベクター
コントロールを用いたトランスフェクションにおいて得られたコロニー数との比
較である。FIG. 5: Growth inhibition by p53 expressed in Saos-2 cells. S
aos-2 cells were transformed with 1.5 g of plasmid DNA based on pCMV-Neo-Bam containing various p53 alleles under the control of CMV promoter.
Transfection was performed by lipofection. The relative average number of this colony and the standard error of at least 3 experiments are represented. Percentage is a comparison with the number of colonies obtained in transfection with vector control.

【図６】 Ｓａｏａ−２細胞におけるｐ５３Ｖ １２２Ａによるｐ２１誘導
分析。Ｓａｏｓ−２細胞をリポフェクション試薬を用いて、野生型ｐ５３または
突然変異型を含むｐＣＭＶに基づくプラスミドによって一過性にトランスフェク
トした。発現プラスミド１００ｎｇをトランスフェクトした。細胞を４８時間後
に回収し、抽出物を調製し、抽出物５０−１５０μｇをそれぞれのレーンに流し
た。トランスファーした後、ｐ２１およびα−チューブリンの誘導をそれぞれ検
出するためにそのメンブレンを４０ＫＤマーカーに相当する位置にて切り取った
。ｐ５３を検出するために、そのメンブレンをはがし、再びプローブした。FIG. 6: p21 induction analysis by p53V 122A in Saoa-2 cells. Saos-2 cells were transiently transfected with pCMV-based plasmids containing wild-type p53 or mutants using lipofection reagents. 100 ng of expression plasmid was transfected. Cells were harvested after 48 hours, extracts were prepared and 50-150 μg of extract was run in each lane. After transfer, the membrane was cut at the position corresponding to the 40KD marker to detect the induction of p21 and α-tubulin, respectively. The membrane was stripped and probed again to detect p53.

【図７】 Ｓａｏｓ−２細胞におけるルシフェラーゼレポーターのｐ５３誘
導。ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイをｐ５３−Ｖ１２２Ａお
よびｐ５３の二重突然変異型の潜在的なトランス活性化の能力を評価するために
用いた。パネルＡおよびＢ：プラスミドｐＧＬ１０１２およびｐＧＬ１１３８は
、それぞれルシフェラーゼ遺伝子についての最小プロモーターに隣接するｂａｘ
およびｐ２１応答因子を含む。パネルＣ：プラスミドＰＧ１３はＲＧＣｐ５３応
答因子の１３コピーを含む。一過性トランスフェクションはｐ５３発現プラスミ
ド５０または１００ｎｇおよびレポータープラスミド１μｇを用いて行なった。
細胞をトランスフェクションの２４時間後に回収した。FIG. 7. p53 induction of luciferase reporter in Saos-2 cells. A luciferase-based gene reporter assay was used to assess the potential for potential transactivation of p53-V122A and p53 double mutant forms. Panels A and B: Plasmids pGL1012 and pGL1138 each contain a bax flanking the minimal promoter for the luciferase gene.
And p21 response factor. Panel C: Plasmid PG13 contains 13 copies of RGCp53 responsive element. Transient transfections were performed with 50 or 100 ng of p53 expression plasmid and 1 μg of reporter plasmid.
Cells were harvested 24 hours after transfection.

【図８】 増大したトランス活性化を示すｐ５３突然変異体の新規スクリー
ニング。ＰＣＲを用いて作製したｐ５３ｃＤＮＡを直接、ｐＡＤＨ１（パネルＡ
）およびｐＧＡＬ１（パネルＢ）発現ベクターにクローニングし、酵母において
組み換えることで得られた形質転換体を示す。 パネルＡ：低アデニンを含むグルコースプレート上において、ｐＡＤＨ１下にあ
る野生型ｐ５３発現は白色コロニーを導く。ｐ５３トランス活性化突然変異型は
小さい赤色コロニーを産出する。 パネルＢ：低アデニンを含むラフィノースプレート上において、ｐＧＡＬ１下の
発現は、野生型ｐ５３が赤色コロニーを産出するので低い。白色コロニー（矢印
）は潜在的に増大した転写活性能力を有するｐ５３対立遺伝子を明らかにし得る
。FIG. 8. Novel screen for p53 mutants showing increased transactivation. The p53 cDNA prepared using PCR was directly transformed into pADH1 (panel A
) And pGAL1 (panel B) expression vector, and the transformant obtained by recombination in yeast is shown. Panel A: Wild-type p53 expression under pADH1 leads to white colonies on glucose plates with low adenine. The p53 transactivating mutant produces small red colonies. Panel B: On raffinose plates containing low adenine, expression under pGAL1 is low as wild-type p53 produces red colonies. White colonies (arrows) may reveal p53 alleles with potentially increased transcriptional activation capacity.

【図９】 ヌクレオチド１２４から１１２２由来のｐ５３ ｃＤＮＡ断片は
増大したトランス活性化を引き起こす。左側：ＧＡＰはテンプレートとしてレス
キューｐ５３プラスミドを用いて作製したＰＣＲ断片のｐＧＡＬ１プラスミドに
おけるクローニングを修復し、酵母において増大したトランス活性化を示す。右
側：野生型ｐ５３を同種の実験についてテンプレートとして用いた。発現が低い
ので炭素源してのラフィノース上において細胞を増殖させる。FIG. 9. The p53 cDNA fragment from nucleotides 124 to 1122 causes increased transactivation. Left side: GAP repairs the cloning in the pGAL1 plasmid of a PCR fragment made using the rescue p53 plasmid as template and shows increased transactivation in yeast. Right: wild-type p53 was used as a template for the same kind of experiment. The low expression allows cells to grow on raffinose as a carbon source.

【図１０】 野生型ｐ５３と比較して増大したトランス活性化を明らかにす
る種々のｐ５３突然変異型の発現の表現型分析。野生型ｐ５３を発現するｐＧＡ
Ｌ１プラスミド（上）または３つの異なる「超トランス」対立遺伝子を有する形
質転換体をグルコース（左）、ラフィノース（中央）およびガラクトース（右）
のプレート上において試験した。「超（スーパー）トランス」対立遺伝子は、野
生型ｐ５３よりも増殖を阻害する。FIG. 10. Phenotypic analysis of expression of various p53 mutants revealing increased transactivation compared to wild-type p53. PGA expressing wild-type p53
Transformants carrying the L1 plasmid (top) or three different "supertrans" alleles were labeled with glucose (left), raffinose (center) and galactose (right).
On a plate. The "super" trans allele inhibits growth more than wild-type p53.

【図１１】 新規ｐ５３対立遺伝子の潜在的に増大したトランス活性化能力
をβ−ガラクトシダーゼ誘導によって確認する。β−ガラクトシダーゼ活性はラ
フィノース液体培地において８時間、増殖させた後に測定した。FIG. 11 confirms the potentially increased transactivating capacity of the novel p53 allele by β-galactosidase induction. β-galactosidase activity was measured after growing in raffinose liquid medium for 8 hours.

【図１２】 野生型ｐ５３および超トランス突然変異型ｐ５３タンパク質発
現レベルの比較。タンパク質抽出物は、ｐＧＡＬ１ ｐ５３発現プラスミドを含
むｙＩＧ３９７形質転換体のグルコース（レーン１、２）またはラフィノース（
レーン３−１２）培養物から調製した。タンパク質抽出物１０μｇをレーン３、
５、７、９、１１に流した。５０μｇをレーン１、２、４、６、８、１０、１２
に流した。ｐ５３をＤＯ−１およびｐＡｂ−１８０１抗体によって検出した。FIG. 12 Comparison of wild-type p53 and hypertrans mutant p53 protein expression levels. The protein extracts were glucose (lanes 1 and 2) or raffinose (lanes 1 and 2) of yIG397 transformants containing the pGAL1 p53 expression plasmid.
Lane 3-12) Prepared from culture. 10 μg of protein extract in lane 3,
Shed on 5, 7, 9, 11. 50 μg in lanes 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12
Shed to. p53 was detected by DO-1 and pAb-1801 antibodies.

【図１３】 ｐ５３−Ｔ１２３Ａはｐ５３−Ｇ２７９Ｅの主要な（劣性）ネ
ガティブ表現型に耐性である。 パネルＡ．ＡＤＨ１プロモーター下にある野生型およびｐ５３−Ｇ２７９Ｅを発
現する２つのベクターを有する酵母形質転換体。ピンク色コロニーは主要なネガ
ティブ突然変異型の表現型を示す。 パネルＢ．ＡＤＨ１プロモーター下にあるｐ５３−Ｔ１２３Ａおよびｐ５３−Ｇ
２７９Ｅを発現する２つのベクターを有する酵母形質転換体。コロニーは白く、
野生型ｐ５３活性を示す。FIG. 13. p53-T123A is resistant to the major (recessive) negative phenotype of p53-G279E. Panel A. A yeast transformant with two vectors expressing p53-G279E and wild type under the ADH1 promoter. Pink colonies show a major negative mutant phenotype. Panel B. P53-T123A and p53-G under the ADH1 promoter
A yeast transformant with two vectors expressing 279E. Colonies are white,
Wild-type p53 activity is shown.

【図１４】 ヒトＳａｏｓ−２細胞における野生型および超トランスｐ５３
対立遺伝子による増殖抑制。 Ｓａｏｓ−２細胞をＣＭＶプロモーターの制御下にある種々のｐ５３対立遺伝子
を含むベクター１μｇを用いて、リポフェクションによりトランスフェクトした
。Ｇ４１８耐性コロニーの相対平均数および少なくとも３回の実験についての標
準誤差を表す。FIG. 14: Wild type and supertrans p53 in human Saos-2 cells.
Growth suppression by allele. Saos-2 cells were transfected by lipofection with 1 μg of vector containing various p53 alleles under the control of the CMV promoter. Represents the relative mean number of G418 resistant colonies and standard error for at least 3 experiments.

【図１５】 主要なネガティブ腫瘍突然変異体の存在下における野生型およ
び超トランスｐ５３対立遺伝子による増殖抑制。 Ｓａｏｓ−２細胞を指示されたｐ５３対立遺伝子を発現する同一ベクター２５０
ｎｇおよびＧ２７９Ｅ突然変異型を発現するｐＣＭＶに基づくベクター１μｇ（
即ち、１：４）を用いて同時トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性コロニーを選択
した。相対平均数および３回の独立した実験についての標準誤差を示す。FIG. 15. Growth inhibition by wild type and supertrans p53 alleles in the presence of major negative tumor mutants. Same vector 250 expressing the indicated p53 allele in Saos-2 cells
ng and 1 μg of a pCMV-based vector expressing the G279E mutant (
That is, 1: 4) was co-transfected and G418 resistant colonies were selected. Relative mean number and standard error for 3 independent experiments are shown.

【図１６】 Ｓａｏｓ−２細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイ
による超トランスｐ５３対立遺伝子によるトランス活性化分析。 それぞれの突然変異型およびコントロールベクターについてのルシフェラーゼ活
性は、野生型ｐ５３を用いて得られる活性と比較して示す。ＭＤＭ２およびｐ２
１プロモーター並びにｂａｘ応答因子をパネルＡ、ＢおよびＣそれぞれにおいて
試験した。Ｆｕ遺伝子を用いる一過性トランスフェクトは１２穴プレート培養に
おいて、ｐ５３発現プラスミド２０ｎｇおよびレポータープラスミド５００ｎｇ
を用いて行なった。細胞をトランスフェクションの４８時後に回収した。FIG. 16. Transactivation analysis with supertrans p53 allele by luciferase reporter assay in Saos-2 cells. Luciferase activity for each mutant and control vector is shown relative to the activity obtained with wild-type p53. MDM2 and p2
One promoter and bax response factor were tested in panels A, B and C respectively. Transient transfection with Fu gene was carried out in 12-well plate culture in 20 ng p53 expression plasmid and 500 ng reporter plasmid.
Was performed using. Cells were harvested 48 hours after transfection.

【図１７】 Ｓａｏｓ−２細胞における野生型および超トランスｐ５３対立
遺伝子によるｐ５３レベルおよび内因性ｐ２１誘導。 図７のルシフェラーゼアッセイにおいて用いたのと同じ抽出物中のｐ５３および
ｐ２１タンパク質レベルをウェスタンブロットによって測定した。それぞれのレ
ーンにタンパク質１００μｇを流した。トランスファーした後、ｐ２１およびｐ
５３それぞれを検出するために、そのメンブレンを４０ＫＤマーカーの相当する
位置にて切り出した。FIG. 17. p53 levels and endogenous p21 induction by wild-type and supertrans p53 alleles in Saos-2 cells. P53 and p21 protein levels in the same extracts used in the luciferase assay of Figure 7 were measured by Western blot. 100 μg of protein was run in each lane. After transfer, p21 and p
In order to detect each of the 53, the membrane was cut out at the corresponding position of the 40KD marker.

【図１８】 ｐ５３ＤＮＡ結合ドメインにおける超トランス突然変異型の局
在。表１に記載の超トランス突然変異型の位置を結晶構造に基づく単量体のＤＮ
Ａ結合ドメインの内のリボン表示にて示す。FIG. 18. Localization of the hypertrans mutant in the p53 DNA binding domain. The DN of the monomer based on the crystal structure based on the position of the super-trans mutant shown in Table 1
It is shown by the ribbon display in the A-binding domain.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 ４Ｃ０８７ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アルベルト・インガ アメリカ合衆国27514ノースカロライナ州 チャペル・ヒル、アパートメント・ナンバ ー17ジー、ブッカー・クリーク・ロード 2525番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA80 CA04 DA03 HA17 4B063 QA08 QA17 QQ07 QQ68 QR43 QR76 QX01 4C084 AA02 AA07 BA02 BA08 BA18 BA22 BA23 CA18 CA53 CA56 DA27 DA35 NA14 ZB211 ZB261 ZC411 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZB21 ZB26 ZC41 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA28 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61P 35/00 C07K 14/82 4C087 43/00 105 C12Q 1/02 4H045 C07K 14/82 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, B , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU , CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Alberto Inga, USA 27514, Chapel Hill, North Carolina, Apartment Number 17 G, Booker Leak Road 2525 No. F-term (reference) 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA80 CA04 DA03 HA17 4B063 QA08 QA17 QQ07 QQ68 QR43 QR76 QX01 4C084 AA02 AA07 BA02 BA08 BA18 BA22 BA23 CA18 CA53 CA56 DA27 DA35 NA14 ZB211 ZB261 ZC411 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZB21 ZB26 ZC41 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA28 FA74

Claims (62)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 変異Ｖ１２２Ａを有するヒトｐ５３の残基１１７から１２７
を含む単離されたポリペプチド。1. Residues 117 to 127 of human p53 having the mutation V122A.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項２】 変異Ｃ２７７Ｗを有するヒトｐ５３の残基２７２から２８２
を含む単離されたポリペプチド。2. Residues 272 to 282 of human p53 having the mutation C277W.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項３】 変異Ｃ２７７Ｒを有するヒトｐ５３の残基２７２から２８２
を含む単離されたポリペプチド。3. Residues 272 to 282 of human p53 having the mutation C277R.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項４】 変異Ｆ３３８Ｌを有するヒトｐ５３の残基３３３から３４３
を含む単離されたポリペプチド。4. Residues 333 to 343 of human p53 having the mutation F338L.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項５】 変異Ｖ１５７Ｉを有するヒトｐ５３の残基１５３から１６３
を含む単離されたポリペプチド。5. Residues 153 to 163 of human p53 having the mutation V157I
An isolated polypeptide comprising: 【請求項６】 変異Ａ７６Ｔを有するヒトｐ５３の残基７０から８０を含む
単離されたポリペプチド。6. An isolated polypeptide comprising residues 70 to 80 of human p53 having the mutation A76T. 【請求項７】 変異Ｔ１５０Ａを有するヒトｐ５３の残基１４５から１５５
を含む単離されたポリペプチド。7. Residues 145 to 155 of human p53 having the mutation T150A.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項８】 変異Ｓ１２１Ｃを有するヒトｐ５３の残基１１５から１２５
を含む単離されたポリペプチド。8. Residues 115 to 125 of human p53 having the mutation S121C.
An isolated polypeptide comprising: 【請求項９】 変異Ｓ９６Ｐを有するヒトｐ５３の残基９０から１００を含
む単離されたポリペプチド。9. An isolated polypeptide comprising residues 90 to 100 of human p53 having the mutation S96P. 【請求項１０】 変異Ｈ１１５Ｒを有するヒトｐ５３の残基１１０から１２
０を含む単離されたポリペプチド。10. Residues 110 to 12 of human p53 having the mutation H115R.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項１１】 変異Ｃ１２４Ｙを有するヒトｐ５３の残基１２０から１３
０を含む単離されたポリペプチド。11. Residues 120 to 13 of human p53 with the mutation C124Y.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項１２】 変異Ｓ１２１Ｆを有するヒトｐ５３の残基１１５から１２
５を含む単離されたポリペプチド。12. Residues 115 to 12 of human p53 having the mutation S121F.
An isolated polypeptide comprising 5. 【請求項１３】 変異Ｔ１２３Ａを有するヒトｐ５３の残基１１８から１２
８を含む単離されたポリペプチド。13. Residues 118 to 12 of human p53 having the mutation T123A.
An isolated polypeptide comprising 8. 【請求項１４】 変異Ｃ１２４Ｆを有するヒトｐ５３の残基１２０から１３
０を含む単離されたポリペプチド。14. Residues 120 to 13 of human p53 with the mutation C124F.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項１５】 変異Ｓ２４０Ｎを有するヒトｐ５３の残基２３５から２４
５を含む単離されたポリペプチド。15. Residues 235 to 24 of human p53 with the mutation S240N.
An isolated polypeptide comprising 5. 【請求項１６】 変異Ｓ１１６Ｔを有するヒトｐ５３の残基１１０から１２
０を含む単離されたポリペプチド。16. Residues 110 to 12 of human p53 having the mutation S116T.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項１７】 変異Ｎ３４５Ｓを有するヒトｐ５３の残基３４０から３５
０を含む単離されたポリペプチド。17. Residues 340 to 35 of human p53 having the mutation N345S.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項１８】 変異Ｔ１２３Ｓを有するヒトｐ５３の残基１１８から１２
８を含む単離されたポリペプチド。18. Residues 118 to 12 of human p53 having the mutation T123S.
An isolated polypeptide comprising 8. 【請求項１９】 変異Ｄ１８４Ｇを有するヒトｐ５３の残基１８０から１９
０を含む単離されたポリペプチド。19. Residues 180 to 19 of human p53 with the mutation D184G.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項２０】 変異Ｎ２８８Ｋを有するヒトｐ５３の残基２８３から２９
３を含む単離されたポリペプチド。20. Residues 283 to 29 of human p53 with the mutation N288K
An isolated polypeptide comprising 3. 【請求項２１】 変異Ｅ１９８Ｖを有するヒトｐ５３の残基１９３から２０
３を含む単離されたポリペプチド。21. Residues 193 to 20 of human p53 with the mutation E198V
An isolated polypeptide comprising 3. 【請求項２２】 変異Ｈ１１５Ｒを有するヒトｐ５３の残基１１０から１２
０を含む単離されたポリペプチド。22. Residues 110 to 12 of human p53 having the mutation H115R.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項２３】 変異Ｗ９１Ｒを有するヒトｐ５３の残基８５から９５を含
む単離されたポリペプチド。23. An isolated polypeptide comprising residues 85 to 95 of human p53 having the mutation W91R. 【請求項２４】 変異Ｓ９６Ｐを有するヒトｐ５３の残基９０から１００を
含む単離されたポリペプチド。24. An isolated polypeptide comprising residues 90 to 100 of human p53 having the mutation S96P. 【請求項２５】 変異Ｓ１１６Ｔを有するヒトｐ５３の残基１１０から１２
０を含む単離されたポリペプチド。25. Residues 110 to 12 of human p53 having the mutation S116T.
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項２６】 変異Ｎ２２８Ｋを有するヒトｐ５３の残基２２５から２３
５を含む単離されたポリペプチド。26. Residues 225 to 23 of human p53 with the mutation N228K
An isolated polypeptide comprising 5. 【請求項２７】 変異Ｔ１１８Ａを有するヒトｐ５３の残基１１３から１２
３を含む単離されたポリペプチド。27. Residues 113 to 12 of human p53 having the mutation T118A
An isolated polypeptide comprising 3. 【請求項２８】 変異Ｔ１２３Ｐを有するヒトｐ５３の残基１１８から１２
８を含む単離されたポリペプチド。28. Residues 118 to 12 of human p53 having the mutation T123P
An isolated polypeptide comprising 8. 【請求項２９】 変異Ｌ１３７Ｒを有するヒトｐ５３の残基１３２から１４
２を含む単離されたポリペプチド。29. Residues 132 to 14 of human p53 having the mutation L137R
An isolated polypeptide comprising 2. 【請求項３０】 変異Ｍ１６０Ｔを有するヒトｐ５３の残基１５５から１６
５を含む単離されたポリペプチド。30. Residues 155 to 16 of human p53 having the mutation M160T
An isolated polypeptide comprising 5. 【請求項３１】 変異Ｎ２３９Ｙを有するヒトｐ５３の残基２３５から２４
５を含む単離されたポリペプチド。31. Residues 235 to 24 of human p53 with the mutation N239Y
An isolated polypeptide comprising 5. 【請求項３２】 変異Ｅ２８５Ａを有するヒトｐ５３の残基２８０から２９
０を含む単離されたポリペプチド。32. Residues 280 to 29 of human p53 with the mutation E285A
An isolated polypeptide comprising 0. 【請求項３３】 変異Ａ７６Ｔおよび変異Ｖ１２２Ａを有するヒトｐ５３の
残基５０から１５０を含む単離されたポリペプチド。33. An isolated polypeptide comprising residues 50 to 150 of human p53 with mutation A76T and mutation V122A. 【請求項３４】 変異Ｗ９１Ｃ、変異Ｃ１２４Ｒ、変異Ｑ１３６Ｋ、および
変異Ｔ１５０Ａを有するヒトｐ５３の残基５０から２００を含む単離されたポリ
ペプチド。34. An isolated polypeptide comprising residues 50 to 200 of human p53 having mutation W91C, mutation C124R, mutation Q136K, and mutation T150A. 【請求項３５】 変異Ｃ１２４Ｒ、変異Ｑ１３６Ｋ、および変異Ｔ１５０Ａ
を有するヒトｐ５３の残基１００から２００を含む単離されたポリペプチド。35. Mutation C124R, mutation Q136K, and mutation T150A
An isolated polypeptide comprising residues 100 to 200 of human p53 having: 【請求項３６】 請求項１〜３６に記載のいずれかのポリペプチドをコード
する単離された核酸。36. An isolated nucleic acid encoding the polypeptide of any of claims 1-36. 【請求項３７】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
検出する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含む酵母
細胞を得； ｂ）ヒト５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモーター
を含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）炭素源としてのラフィノースにその酵母細胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに野生型ｐ５３を発現するコロニーは赤
色コロニーを生じ、ｐ５３におけるスーパートランス活性化変異を発現するコロ
ニーは白色またはピンク色コロニーを生じる）することを含む方法。37. A method for detecting supertransactivating mutations in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) a human 53 coding sequence. A nucleic acid encoding human p53 containing an inducible promoter containing GAL1 linked to is introduced into the yeast cell; c) plating the yeast cell on raffinose as a carbon source; d) identifying colonies on the plate (Where colonies expressing wild-type p53 give rise to red colonies, and colonies expressing a supertrans-activating mutation in p53 give rise to white or pink colonies). 【請求項３８】 ヒトｐ５３遺伝子における毒性変異を検出する方法であっ
て、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含む酵母
細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、細胞において未同定のヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に
導入し； ｃ）グルコース、ラフィノースまたはガラクトースのそれぞれにその酵母細胞を
プレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに野生型ｐ５３を発現するコロニーはグ
ルコース上で赤色コロニー、ラフィノース上で赤色コロニーおよびガラクトース
上で白色コロニーを生じ、ｐ５３における毒性変異を発現するコロニーはグルコ
ース上で赤色コロニーを生じ、ラフィノース上で赤色コロニーまたは白色コロニ
ーを生じるか、あるいはコロニーなしであり、ならびにガラクトース上でコロニ
ーなしである）することを含む方法。38. A method for detecting a toxic mutation in the human p53 gene, which comprises: a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) linking to a human p53 coding sequence. A non-identified human p53-encoding nucleic acid in a cell containing an inducible promoter including GAL1; c) plating the yeast cell on glucose, raffinose or galactose, respectively; d) on a plate (Here, a wild-type p53-expressing colony produces a red colony on glucose, a red colony on raffinose and a white colony on galactose, and a colony expressing a virulent mutation on p53 produces a red colony on glucose. Occurs and red colonies on raffinose. The method comprising the or produce white colonies, or no colonies, and without colonies on galactose) to. 【請求項３９】 ヒトｐ５３遺伝子における毒性変異を検出する方法であっ
て、 ａ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたオン−オフプロモーターを含む、
細胞において未同定のヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｂ）合成酵母培地中、そのプロモーターに関する誘導物質の存在および不存在下
で、その酵母細胞をインキュベートし； ｃ）毒性変異体を同定（ここに野生型ｐ５３を発現する酵母はそのプロモーター
に関する誘導物質の存在または不存在下で生育し、ｐ５３における毒性変異を発
現する酵母はそのプロモーターに関する誘導物質の存在下で生育する）すること
を含む方法。39. A method for detecting a toxic mutation in the human p53 gene, comprising: a) an on-off promoter linked to the human p53 coding sequence.
Introducing into the yeast cell a nucleic acid encoding human p53 unidentified in the cell; b) incubating the yeast cell in a synthetic yeast medium in the presence and absence of an inducer for its promoter; c) a toxic mutation Identification of the body (where yeast expressing wild-type p53 grows in the presence or absence of inducer for its promoter, yeast expressing virulent mutations in p53 grows in the presence of inducer for its promoter) A method including: 【請求項４０】 レポーター遺伝子がＡＤＥ２である、請求項３７または３
８に記載の方法。40. The method according to claim 37 or 3, wherein the reporter gene is ADE2.
The method according to 8. 【請求項４１】 変異を検出し、さらに、 ａ）野生型ヒトｐ５３コーディング配列と作動可能に連結されたプロモーターを
含む第二の核酸をその酵母細胞に導入し、ここにこの第二の核酸は細胞において
野生型ヒトｐ５３を発現させ、これにより変異が優性であるか、あるいは劣性で
あるかが測定されることを含む、請求項３７または３８に記載の方法。41. Detecting a mutation and further comprising: a) introducing into the yeast cell a second nucleic acid comprising a promoter operably linked to a wild-type human p53 coding sequence, wherein the second nucleic acid is 39. The method of claim 37 or 38, comprising expressing wild-type human p53 in the cell and determining whether the mutation is dominant or recessive. 【請求項４２】 毒性変異を検出し、さらに変異体ｐ５３コーディング配列
と作動可能に連結されたプロモーターを含む、変異体ｐ５３を発現する第二の核
酸を含み、これにより第二の核酸における変異が毒性表現型を復帰させることを
含む、請求項３７または３８に記載の方法。42. A second nucleic acid expressing a mutant p53, which comprises a promoter for detecting a toxic mutation and further operably linked to the mutant p53 coding sequence, whereby a mutation in the second nucleic acid is generated. 39. The method of claim 37 or 38 comprising restoring a virulent phenotype. 【請求項４３】 細胞に毒性変異を有するヒトｐ５３を投与することにより
、細胞において毒性を誘導する方法。43. A method for inducing toxicity in a cell by administering human p53 having a toxic mutation to the cell. 【請求項４４】 プロモーターと連結された毒性変異体ｐ５３をコードする
核酸を細胞内へ導入することによって毒性変異を有するヒトｐ５３を投与し、こ
れによりその細胞において毒性変異体ｐ５３を発現させ、細胞死を生じさせる、
請求項４３に記載の方法。44. A human p53 having a toxic mutation is administered by introducing into a cell a nucleic acid encoding the toxic mutant p53 linked to a promoter, thereby expressing the toxic mutant p53 in the cell, and Cause death,
The method of claim 43. 【請求項４５】 毒性変異体をコードする核酸が以下からなる群から選択さ
れる変異をコードする核酸を含む、請求項４４に記載の方法： V122A, V274I, C277W, A76T, C277R, F338L, V157I, W91C, C124R, Q136K, T150A, または G279R。45. The method of claim 44, wherein the nucleic acid encoding the toxic variant comprises a nucleic acid encoding a mutation selected from the group consisting of: V122A, V274I, C277W, A76T, C277R, F338L, V157I. , W91C, C124R, Q136K, T150A, or G279R. 【請求項４６】 スーパートランス活性化変異を有するヒトｐ５３を細胞に
投与することによって、細胞において毒性を誘導する方法。46. A method for inducing toxicity in a cell by administering to the cell human p53 having a supertrans-activating mutation. 【請求項４７】 プロモーターと連結されたスーパートランス活性化変異体
ｐ５３をコードする核酸を細胞に導入することによって、スーパートランス活性
化変異を有するヒトｐ５３を投与し、これによりスーパートランス活性化変異体
ｐ５３を細胞内で発現させ、毒性を生じさせる、請求項４６に記載の方法。47. Human p53 having a supertransactivating mutation is administered by introducing into a cell a nucleic acid encoding a supertransactivating mutant p53 linked to a promoter, whereby a supertransactivating mutant is administered. 47. The method of claim 46, wherein p53 is expressed intracellularly and causes toxicity. 【請求項４８】 スーパートランス活性化変異をコードする核酸が以下から
なる群から選択される変異をコードする核酸を含む、請求項４７に記載の方法：
S96P, H115R, S121C, S121F, T123A, C124Y, C124F, Q167R, E171K, H178Y, S18
3L, D184Y, T231I, P191L, S240N, S116T, N288K, F338L, S215T, T123S, N345S
, D184G, E198V, T230I, V274A, W91R, H115R, S96P, S116T, N228K, T118A, T1
23P, L137R, A159T, M160T, I162V, D184G, N210S, S215T, T230I, I232V, N239
Y, N268S, E285A, C124R, Q136K, T150A, A76T。48. The method of claim 47, wherein the nucleic acid encoding the supertrans-activating mutation comprises a nucleic acid encoding a mutation selected from the group consisting of:
S96P, H115R, S121C, S121F, T123A, C124Y, C124F, Q167R, E171K, H178Y, S18
3L, D184Y, T231I, P191L, S240N, S116T, N288K, F338L, S215T, T123S, N345S
, D184G, E198V, T230I, V274A, W91R, H115R, S96P, S116T, N228K, T118A, T1
23P, L137R, A159T, M160T, I162V, D184G, N210S, S215T, T230I, I232V, N239
Y, N268S, E285A, C124R, Q136K, T150A, A76T. 【請求項４９】 さらなる抗癌治療を施すことをさらに含む、請求項４３ま
たは４６に記載の方法。49. The method of claim 43 or 46, further comprising administering an additional anti-cancer therapy. 【請求項５０】 毒性ｐ５３変異を模倣することができる化合物に関してス
クリーニングする方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含む酵母
細胞を得； ｂ）非毒性変異体または野生型ヒト５３コーディング配列と連結された誘導性プ
ロモーターを含む、細胞において非毒性変異体または野生型ヒトｐ５３をコード
する核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）化合物をその酵母細胞に導入し； ｄ）グルコース、ラフィノースまたはガラクトースのそれぞれにその酵母細胞を
プレートし； ｅ）野生型または非毒性変異体ｐ５３を発現するコロニーの生育を妨げ、グルコ
ース上で赤色コロニーを生じ、ラフィノース上で赤色コロニーまたは白色コロニ
ーを生じるか、あるいはコロニーなしであり、ならびにガラクトース上でコロニ
ーなしにする毒性変異を模倣する化合物を同定することを含む方法。50. A method of screening for compounds capable of mimicking a toxic p53 mutation, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) a non-toxic mutation. A nucleic acid encoding a non-toxic mutant or wild-type human p53 in a cell comprising an inducible promoter linked to the somatic or wild-type human 53 coding sequence; and c) introducing the compound into the yeast cell. D) plating the yeast cells on glucose, raffinose or galactose, respectively; e) impeding the growth of colonies expressing wild-type or non-toxic mutant p53, resulting in red colonies on glucose and red on raffinose. Produces colonies or white colonies, or no colonies, Which method comprises identifying a compound that mimics the toxicity mutations without colonies on galactose. 【請求項５１】 毒性ｐ５３変異を模倣することができる化合物に関してス
クリーニングする方法であって、 ａ）非毒性変異体または野生型ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたオン−
オフプロモーターを含む、細胞において非毒性変異体または野生型ヒトｐ５３を
コードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｂ）化合物をその酵母細胞に導入し； ｃ）人工酵母培地中、そのプロモーターに関する誘導物質の存在および不存在下
、その酵母細胞をインキュベートし； ｄ）毒性変異を模倣し、これによりプロモーターに関する誘導物質の存在下で酵
母の生育を妨げる化合物を同定することを含む方法。51. A method of screening for compounds capable of mimicking a toxic p53 mutation, comprising: a) a non-toxic mutant or an on-linker linked to a wild-type human p53 coding sequence.
Introducing into the yeast cell a nucleic acid encoding a non-toxic variant or wild-type human p53 in the cell, including an off-promoter; b) introducing the compound into the yeast cell; c) induction of the promoter in an artificial yeast medium. Incubating the yeast cells in the presence and absence of a substance; d) identifying a compound that mimics a toxic mutation, thereby impeding yeast growth in the presence of an inducer for the promoter. 【請求項５２】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
模倣することができる化合物に関してスクリーニングする方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含む酵母
細胞を得； ｂ）非スーパートランス活性化変異体または野生型ヒト５３コーディング配列と
連結された誘導性プロモーターを含む、細胞において野生型または非スーパート
ランス活性化変異体ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）その酵母細胞および化合物をラフィノースにプレートし； ｄ）ｐ５３におけるスーパートランス活性化変異を模倣して白色またはピンク色
コロニーを生じさせ、ｐ５３の不存在下では影響を有さない化合物を同定するこ
とを含む方法。52. A method of screening for compounds capable of mimicking a supertransactivating mutation in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds. B) a nucleic acid encoding a wild-type or non-supertransactivating mutant human p53 in a cell comprising an inducible promoter linked to a non-supertransactivating mutant or wild-type human 53 coding sequence into the yeast cell; C) plating the yeast cells and compounds on raffinose; d) compounds that mimic supertrans-activating mutations in p53 to give white or pink colonies and have no effect in the absence of p53. A method comprising identifying. 【請求項５３】 種々の発現レベルで、種々のｐ５３応答因子を伴うスーパ
ートランス活性化ｐ５３変異体によるトランス活性化を測定する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合する第一のＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含
む第一の酵母細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその第一の酵母細胞に導入し； ｃ）ヒトｐ５３が結合する第二のＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含
第二の酵母細胞を得； ｄ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその第二の酵母細胞に導入し； ｅ）グルコース、ラフィノース、ラフィノースおよびガラクトース、およびラフ
ィノースおよびより大量のガラクトースのそれぞれに第一および第二の酵母細胞
をプレートし； ｆ）プレート上のコロニーを同定（ここに白色またはピンク色コロニーはスーパ
ートランス活性化が生じたことを示す）し；ならびに、 ｇ）ｐ５３による種々の発現レベル下、第一および第二のＤＮＡ配列のスーパー
トランス活性化のレベルを測定することを含む方法。53. A method for measuring transactivation by supertransactivating p53 mutants with different p53 responsive factors at different expression levels, comprising: a) a first DNA sequence to which human p53 binds; Obtaining a first yeast cell containing a linked reporter gene; b) introducing into the first yeast cell a nucleic acid encoding human p53 containing an inducible promoter containing GAL1 linked to a human p53 coding sequence. C) obtaining a second yeast cell containing a reporter gene linked to a second DNA sequence to which human p53 binds; d) a human p53 containing an inducible promoter containing GAL1 linked to a human p53 coding sequence. Introducing into the second yeast cell a nucleic acid encoding: e) glucose, raffinose, raffinose and galactose, And first and second yeast cells on raffinose and higher amounts of galactose, respectively; f) identify colonies on the plate (white or pink colonies indicate supertransactivation has occurred). And g) measuring the level of supertransactivation of the first and second DNA sequences under varying levels of expression by p53. 【請求項５４】 第一および第二の酵母細胞をグルコース、ラフィノース、
ラフィノースおよび０．００３％ガラクトース、およびラフィノースおよび０．
０１５％ガラクトースのそれぞれにプレートする、請求項５３に記載の方法。54. The first and second yeast cells are treated with glucose, raffinose,
Raffinose and 0.003% galactose, and raffinose and 0.
54. The method of claim 53, plating on each of 015% galactose. 【請求項５５】 変異を検出し、さらにａ）優性ネガティブｐ５３腫瘍変異
体コーディング配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第二の核酸をそ
の酵母細胞へ導入し、ここに第二の核酸は細胞において優性ネガティブｐ５３腫
瘍変異体を発現し、これにより変異が優性であるか、あるいは劣性であるかが測
定されることを含む、請求項３７に記載の方法。55. A mutation is detected and a) a second nucleic acid comprising a) a promoter operably linked to a dominant negative p53 tumor mutant coding sequence is introduced into the yeast cell, wherein the second nucleic acid is 38. The method of claim 37, comprising expressing a dominant negative p53 tumor variant in the cell, thereby determining whether the mutation is dominant or recessive. 【請求項５６】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
検出する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含むｒｅ
ｇ１−５０１変異体酵母細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）グルコースおよびグルコースおよび増加濃度のガラクトースにその酵母細胞
をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここにｐ５３におけるスーパートランス活性
化変異を発現するコロニーは白色またはピンク色コロニーを生じる）することを
含む方法。56. A method for detecting a supertrans-activating mutation in the human p53 gene, which comprises a) a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds.
obtaining a g1-501 mutant yeast cell; b) introducing into the yeast cell a nucleic acid encoding human p53 containing an inducible promoter containing GAL1 linked to a human p53 coding sequence; c) glucose and glucose and enrichment. Plating the yeast cells to a concentration of galactose; d) identifying colonies on the plate, where colonies expressing the supertrans-activating mutation in p53 yield white or pink colonies. 【請求項５７】 ヒトｐ５３遺伝子における毒性変異を検出する方法であっ
て、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含むｒｅ
ｇ１−５０１変異体酵母細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、細胞において未同定のヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に
導入し； ｃ）グルコース、またはグルコースおよび選択濃度のガラクトースにその酵母細
胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに野生型ｐ５３を発現するコロニーはグ
ルコース上で赤色コロニーを生じ、グルコースおよび選択濃度のガラクトース上
で赤色コロニーを生じ、ならびにグルコースおよびより高い濃度のガラクトース
上で白色コロニーを生じ、ｐ５３における毒性変異を発現するコロニーはグルコ
ース上で赤色コロニーを生じ、グルコースおよび選択濃度のガラクトース上で赤
色コロニーまたは白色コロニーを生じるか、あるいはコロニーなしであり、なら
びにグルコースおよびより高い濃度のガラクトース上でコロニーなしである）す
ることを含む方法。57. A method for detecting a toxic mutation in the human p53 gene, which comprises a) a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds.
obtaining a g1-501 mutant yeast cell; b) introducing into said yeast cell a nucleic acid encoding human p53 which has not been identified in the cell and which comprises an inducible promoter comprising GAL1 linked to a human p53 coding sequence; Plate the yeast cells on glucose, or glucose and a selective concentration of galactose; d) identify the colonies on the plate (where colonies expressing wild-type p53 produce red colonies on glucose, glucose and a selective concentration of galactose). Yields red colonies above and white colonies on glucose and higher concentrations of galactose, colonies expressing virulent mutations in p53 yield red colonies on glucose, red colonies on glucose and selected concentrations of galactose or Grow white colonies Luke, or no colonies, and the method comprising a a) is no colonies on galactose glucose and higher concentrations. 【請求項５８】 弱いトランス活性化活性を有するｐ５３変異体を同定する
方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含む酵母
細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＡＤＨ１のような構成性プロモー
ターを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）グルコースにその酵母細胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに、ＡＤＨ１構成性発現下、白色コロニ
ーを生じる野生型ｐ５３と比較した場合、弱いトランス活性化変異を発現するコ
ロニーはピンク色コロニーを生じる）することを含む方法。58. A method for identifying a p53 variant having weak transactivating activity, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) coding for human p53. A nucleic acid encoding human p53 containing a constitutive promoter such as ADH1 linked to a sequence is introduced into the yeast cell; c) the yeast cell is plated on glucose; d) the colonies on the plate are identified (here And colonies expressing a weak transactivating mutation give rise to pink colonies when compared to wild-type p53 which produces white colonies under ADH1 constitutive expression). 【請求項５９】 種々の発現レベルで、種々のｐ５３応答因子を伴うスーパ
ートランス活性化ｐ５３変異体によるトランス活性化を測定する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合する第一のＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含
む第一のｒｅｇ１−５０１変異体酵母細胞を得； ｂ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその第一の酵母細胞に導入し； ｃ）ヒトｐ５３が結合する第二のＤＮＡ配列と連結されたレポーター遺伝子を含
む第二のｒｅｇ１−５０１変異体酵母細胞を得； ｄ）ヒトｐ５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモータ
ーを含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその第二の酵母細胞に導入し； および増加濃度のガラクトース； ｆ）プレート上のコロニーを同定（ここに白色またはピンク色コロニーはスーパ
ートランス活性化が生じたことを示す）し；ならびに、 ｇ）ｐ５３による種々の発現レベル下、第一および第二のＤＮＡ配列のスーパー
トランス活性化のレベルを測定することを含む方法。59. A method for measuring transactivation by a supertransactivating p53 mutant with various p53 response factors at various expression levels, comprising: a) a first DNA sequence to which human p53 binds; Obtaining a first reg1-501 mutant yeast cell containing a linked reporter gene; b) a human p53-encoding nucleic acid comprising an inducible promoter containing GAL1 linked to a human p53 coding sequence; C) obtaining a second reg1-501 mutant yeast cell containing a reporter gene linked to a second DNA sequence to which human p53 binds; d) GAL1 linked to a human p53 coding sequence. A human p53-encoding nucleic acid containing an inducible promoter comprising: Lactose; f) identify colonies on plates (where white or pink colonies indicate that supertransactivation occurred); and g) under different expression levels by p53, first and second. A method comprising measuring the level of supertransactivation of a DNA sequence. 【請求項６０】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
検出する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたＬＥＵ２レポーター遺伝子を
含む酵母細胞を得； ｂ）ヒト５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモーター
を含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）炭素源としてのラフィノース；およびラフィノース＋少量のガラクトース（
ロイシンを欠く合成培地中）にその酵母細胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに、ｐ５３におけるトランス活性化変異
を発現する正常サイズのコロニーはラフィノース上あるいはラフィノース＋少量
のガラクトース培地（ロイシンを欠く）上で生育し、野生型ｐ５３を発現する細
胞は生育しないか、あるいは生育に乏しい）することを含む方法。60. A method of detecting a supertransactivating mutation in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a LEU2 reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) coding for human 53. A nucleic acid encoding human p53, which contains an inducible promoter containing GAL1 linked to a sequence, is introduced into the yeast cell; c) raffinose as a carbon source; and raffinose + a small amount of galactose (
Plating the yeast cells in synthetic medium lacking leucine); d) identifying colonies on the plate (where normal size colonies expressing transactivating mutations in p53 are on raffinose or raffinose + a small amount of galactose medium). Cells growing on (lacking leucine) and expressing wild-type p53 either do not grow or have poor growth). 【請求項６１】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
検出する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたＨＩＳ３レポーター遺伝子を
含む酵母細胞を得； ｂ）ヒト５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモーター
を含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）炭素源としてのラフィノース；およびラフィノース＋少量のガラクトース（
ヒスチジンを欠く合成培地中）にその酵母細胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに、ｐ５３におけるトランス活性化変異
を発現する正常サイズのコロニーはラフィノース上あるいはラフィノース＋少量
のガラクトース培地（ヒスチジンを欠く）上で生育し、野生型ｐ５３を発現する
細胞は生育しないか、あるいは生育に乏しい）することを含む方法。61. A method for detecting a supertransactivating mutation in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a HIS3 reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) human 53 coding. A nucleic acid encoding human p53, which contains an inducible promoter containing GAL1 linked to a sequence, is introduced into the yeast cell; c) raffinose as a carbon source; and raffinose + a small amount of galactose (
Plate the yeast cells in synthetic medium lacking histidine); d) identify colonies on the plate (where normal size colonies expressing transactivating mutations in p53 are on raffinose or raffinose + a small amount of galactose medium). Growing on (lacking histidine) and cells expressing wild-type p53 either do not grow or grow poorly). 【請求項６２】 ヒトｐ５３遺伝子におけるスーパートランス活性化変異を
検出する方法であって、 ａ）ヒトｐ５３が結合するＤＮＡ配列と連結されたＵＲＡ３レポーター遺伝子を
含む酵母細胞を得； ｂ）ヒト５３コーディング配列と連結されたＧＡＬ１を含む誘導性プロモーター
を含む、ヒトｐ５３をコードする核酸をその酵母細胞に導入し； ｃ）炭素源としてのラフィノース；およびラフィノース＋少量のガラクトース（
ウラシルを欠く合成培地中）にその酵母細胞をプレートし； ｄ）プレート上のコロニーを同定（ここに、ｐ５３におけるトランス活性化変異
を発現する正常サイズのコロニーはラフィノース上あるいはラフィノース＋少量
のガラクトース培地（ウラシルを欠く）上で生育し、野生型ｐ５３を発現する細
胞は生育しないか、あるいは生育に乏しい）することを含む方法。62. A method of detecting a supertransactivating mutation in the human p53 gene, comprising: a) obtaining a yeast cell containing a URA3 reporter gene linked to a DNA sequence to which human p53 binds; b) coding for human 53. A nucleic acid encoding human p53, which contains an inducible promoter containing GAL1 linked to a sequence, is introduced into the yeast cell; c) raffinose as a carbon source; and raffinose + a small amount of galactose (
Plate the yeast cells in synthetic medium lacking uracil); d) identify colonies on the plate (where normal size colonies expressing transactivating mutations in p53 are on raffinose or raffinose plus a small amount of galactose medium). Cells growing on (lacking uracil) and expressing wild-type p53 either do not grow or have poor growth).