JP2003505035A - 診断方法 - Google Patents

診断方法

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JP2003505035A
JP2003505035A JP2001511214A JP2001511214A JP2003505035A JP 2003505035 A JP2003505035 A JP 2003505035A JP 2001511214 A JP2001511214 A JP 2001511214A JP 2001511214 A JP2001511214 A JP 2001511214A JP 2003505035 A JP2003505035 A JP 2003505035A
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マリク、カリム
ブラウン、キース
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、変更ゲノムインプリンティングを検出することによる被験者における癌の検出の方法と、長期予後を推定する特定ヌクレオチド配列のメチル化状態の差を用いて、癌と診断された被験者の長期予後を測定する方法とを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、診断方法と、ウィルムズ腫抑制遺伝子（ＷＴ１）アンチセンス制御
領域を含むヌクレオチド配列と、制御領域のメチル化状態に基づいた疾病検出お
よび予後の方法と関する。
【０００２】 ウィルムズ腫（ＷＴ）は、腎臓の幹細胞の悪性形質転換から生じる小児期の胚
の腎臓腫瘍である。ＷＴは、１０，０００人に約１人の子供に生じ、最も一般的
な小児固形腫瘍の内の１つとなっている。
【０００３】 ヒトＷＴ１遺伝子は、染色体１１ｐ１３（Ｃａｌｌら、Ｃｅｌｌ ６０巻、５
０９−５２０頁（１９９０年）；Ｇｅｓｓｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４３巻、
７７４−７７８頁（１９９０年）；Ｃａｌｌら、米国特許番号第５，３５０，８
４０号（１９９４年））に存在し、６０キロベースの染色体領域に及ぶ１０個の
エキソンとしてゲノムで構成される。腫瘍抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子内欠失およ
び突然変異は、およそ１０％のウィルムズ腫で検出された。
【０００４】 腎形成、すなわち、腎臓発生の間に、ＷＴ１遺伝子発現は、非常に特異的な様
式で制御され、後腎の間葉細胞が未熟な上皮細胞に進行するにつれて増加し、細
胞がいっそう表現型で成熟になるにつれて減少する。卵巣および睾丸、並びに脊
椎索および脳における発現の証拠と共に、ヒト白血病細胞のＷＴ１発現と分化状
態の間の反比例は、ＷＴ１遺伝子産物の機能が、多様な細胞種における増殖およ
び／または分化にきわめて重要でありうることを強く示唆している。４個の亜鉛
フィンガーを含むＷＴ１タンパク質は、遺伝子における２個の選択的スプライシ
ング部位（ＩおよびＩＩ）から生じる４つのアイソフォームとして発現される。
スプライシングＩＩは、亜鉛フィンガードメイン内で生じ、それにより亜鉛フィ
ンガー３および４の間の３個のアミノ酸（ＫＴＳ）が、挿入または削除される。
ＫＴＳアミノ酸なしのＷＴ１タンパク質（ＷＴ１−ＫＴＳ）は、ＥＧＲ部位共通
配列（５’−ＧＣＧＧＧＧＧＣＧ−３’）に特異的に結合するのに対して、ＫＴ
ＳのあるＷＴ１タンパク質（ＷＴ１＋ＫＴＳ）は結合しない。インシュリン様成
長因子ＩＩ型（ＩＧＦ−ＩＩ）、血小板由来の成長因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、コ
ロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−
Ｒ）のような遺伝子のプロモーター領域における早期成長反応遺伝子（ＥＧＲ）
型部位に結合させることによって、ＷＴ１は、転写レプレッサーとして作用する
（Ｈａｓｔｉｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ２８巻、５２３−５５８頁（１９
９４年）、およびＭｅｎｋｅら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８１巻、１５
１−２１２頁（１９９８年）に概説）。
【０００５】 ヒトＷＴ１プロモーター領域が特徴付けられ、転写因子Ｓｐ１についての多
応答性部位を有するＴＡＴＡ配列がなく、ＣＣＡＡＴ配列がなく、ＧＣが豊富な
プロモーターのファミリーに属することがわかっている。ＥＧＲ／ＷＴ１共通配
列も、主要な転写開始部位の上流および下流において同定され（Ｈｏｆｍａｎｎ
ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８巻、３１２３−３１３２頁（１９９３年））、これらの
部位がＷＴ１自己抑制をさせる可能性があるという示唆が、ヒトプロモーターを
用いた一過性形質移入アッセイを用いて確認された（Ｍａｌｉｋら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４９巻、７５−７８頁（１９９４年））。
【０００６】 ウィルムズ腫になりやすい素因と一緒に腎臓および生殖器の異常によって特徴
付けられる疾病（Ｃｏｐｐｅｓら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７巻、８８６−８９５頁（
１９９３年）で検討された）であるＷＡＧＲ（ウィルムズ腫、無虹彩症、尿生殖
器異常および精神遅滞）症候群およびデニス−ドラッシュ症候群（ＤＤＳ）で示
されるとおり、ＷＴ１機能は、尿性器系の正常な発達に重要である。
【０００７】 腎臓ではない組織の分化におけるＷＴ１の関与についての証拠が蓄積してきて
いる。造血における役割が、ＨＬ６０細胞（Ｓｅｋｉｙａら、Ｂｌｏｏｄ ８３
巻、１８７６−１８８２頁（１９９４年））およびＫ５６２細胞（Ｐｈｅｌａｎ
ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５巻、６７７−６８６頁（１９９
４年））の化学的に誘導した分化の間のＷＴ１発現のダウンレギュレーションに
よって示唆される。正常な造血前駆細胞（Ｉｎｏｕｅら、Ｂｌｏｏｄ ８９巻、
１４０５−１４１２頁（１９９７年））に対して白血病細胞でＷＴ１発現が増大
すること、および白血病でＷＴ１突然変異が検出（Ｋｉｎｇ−Ｕｎｄｅｒｗｏｏ
ｄら、Ｂｌｏｏｄ ８７巻、２１７１−２１７９頁（１９９６年）；Ｋｉｎｇ−
ＵｎｄｅｒｗｏｏｄおよびＰｒｉｔｃｈａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ、Ｂｌｏｏｄ ９１
巻、２９６１−２９６８頁（１９９８年））されることは、白血球形成にＷＴ１
遺伝子が関与していることを強く示す。ＷＴ１発現の変化は、胸部癌でも示され
た（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９４巻、８１３２−８１３７頁（１９９７年））。
【０００８】 さらに、見かけのオープンリーディングフレームを有しないアンチセンスＷＴ
１ｍＲＮＡ転写産物が、胎児の腎臓およびＷＴで検出され、それによりこれらの
ｍＲＮＡについての調節的役割が示唆された（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ９巻、５８３−５９５頁（１９９４年）；Ｅｃｃｌｅｒら、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ９巻、２０５９−２０６３頁（１９９４年））。これらのｍＲＮＡのこ
のような機能の１つは、センスＷＴ１ｍＲＮＡとのＲＮＡ異種二本鎖の形成であ
り、それにより細胞のＷＴ１タンパク質の限定レベルが調節されうる。先に、発
明者らは、ＷＴ１により活性化されるイントロン１に配置されたアンチセンスＷ
Ｔ１プロモーターの同定を報告した。ＷＴ１のこの効果は、ＷＴ１プロモーター
で観察されるものに反比例であり、それによりアンチセンスプロモーター活性が
、ＷＴ１遺伝子調節に関与することが示唆される（Ｍａｌｉｋら、Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ １１巻、１５８９−１５９５頁（１９９５年））。さらに、異所性エキソ
ン１ＲＮＡの発現が、インビトロ系におけるＷＴ１の細胞内レベル（Ｍａｌｉｋ
ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１巻、１５８９−１５９５頁（１９９５年）；Ｍｏｏ
ｒｗｏｏｄら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １８５巻、３５２−３５９頁（１９９８年）
）に影響を及ぼし、それによりアンチセンスＷＴ１ＲＮＡについての調節的役割
を支持している。
【０００９】 ＷＴ１アンチセンス転写産物は、ＷＴ１タンパク質のレベルをアップレギュレ
ートし得（Ｍｏｏｒｗｏｏｄら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １８５巻、３５２−３５９
頁（１９９８年））、アンチセンスＲＮＡ転写の制御機構の異常は、ＷＴ１タン
パク質の不適切な一過性および空間的発現を生じ、腫瘍形成に寄与しうる。この
点に関して、ＷＴ１は、アデノウイルス形質転換体ラット腎臓細胞の腫瘍成長速
度を増大しうることに注意することは興味深い（Ｍｅｎｋｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ １２巻、５３７−５４６頁（１９９６年））。ＷＴ１アンチセンス調節領域
の後成修飾と、ＷＴ１過剰発現と、腎臓腫瘍形成との関係は、不明瞭なままであ
るが、予備研究は、ＷＴ１アンチセンス調節領域の高メチル化と低ＷＴ１タンパ
ク質との間に相関関係があり、低メチル化では逆の関係があることを示した。興
味深くは、ＷＴ１アンチセンスプロモーター遺伝子座は、ヒト胸部癌における高
メチル化配列として同定され（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７巻、
１０３０−１０３４頁（１９９６年））、胸部癌は、ＷＴ１の発現を減少させる
ことが示された（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ ＵＳＡ９４巻、８１３２−８１３７頁（１９９７年））。
【００１０】 発明者らは、ＷＴ１アンチセンスプロモーターのアンチセンス調節領域（ＡＲ
Ｒ）を同定し、ＡＲＲが、差分的にメチル化される領域の一部であることを示し
た。発明の基礎として特徴付けおよび利用されたＷＴ１ ＡＲＲは、先に記述さ
れたＷＴ１遺伝子配列（例えば、Ｃａｌｌら、米国特許番号第５，３５０，８４
０号（１９９４年））とは構造的にも機能的にも異なっている。さらに、発明者
らは、ＡＲＲメチル化のレベルとヒト細胞の病理状態との間の相関関係を見出し
た。特に、多様な癌細胞が、後成的変化に基づけば、その正常対応物と異なるこ
とが示される。
【００１１】 したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１に示される配列の一部を含む
か、配列番号１に示される配列から成るか、塩基置換、欠失および／または付加
による配列番号１の変異型の少なくとも一部を含む、ＷＴ１アンチセンス調節領
域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００１２】 本発明の第２の態様は、配列番号２に示される配列を含むか、配列番号２に示
される配列から成るか、塩基置換、欠失および／または付加による配列番号２の
変異型の少なくとも一部を含む、ＷＴ１アンチセンス調節領域をコードするヌク
レオチド配列を提供する。ＷＴ１アンチセンス調節領域は、配列番号２に太字で
示される配列か、塩基置換、欠失および／または付加によるそのような配列の変
異型の一部に限定されうる。
【００１３】 本発明の第３の態様は、配列番号１に示される配列の少なくとも一部を含むか
、塩基置換、欠失および／または付加による配列番号１の変異型の少なくとも一
部を含む、ＷＴ１アンチセンス調節領域の負の調節要素（ＮＲＥ）をコードする
ヌクレオチド配列を提供する。配列番号１で示されるヌクレオチド配列は、数種
のＷＴ１アンチセンス調節領域の負の調節要素を含みうる。
【００１４】 好ましくは、本発明の第１、第２または第３の態様によるヌクレオチド配列は
、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。任意の配列の一部が、好ましくは機能性があ
る。すなわち、それらは、対応の天然配列の生物学的機能を有する。
【００１５】 本発明の第４の態様は、ＷＴ１ ＡＲＲ領域中のヌクレオチド配列のような特
定のヌクレオチド配列の差分メチル化された状態を用いた、癌に罹っている被験
者における疾病検出、診断または予後の方法を提供する。ゲノムの後成的変化は
、局所的であり、例えばそれにより染色体１１ｐ１５上の多様な遺伝子座に影響
を及ぼす（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（付録）５９巻
、１７４３−１７４６頁（１９９９年））。したがって、メチル化による後成的
変化についての標的としての染色体１１ｐ１３領域の発明者らの同定では、１１
ｐ１３遺伝子レチクロカルビンおよびＰＡＸ６から誘導されたものを含めた１１
ｐ１３領域から得られる他のＤＮＡプローブ／ＤＮＡ配列も、本発明による方法
で検出目的のために使用しうることが示唆される。
【００１６】 特定のヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上の調節要素、好ましくは１つ
またはそれ以上の負の調節要素（ＮＲＥ）、例えば、ＡＲＲ内の１つまたはそれ
以上のＮＲＥでありうる。１または複数のＮＲＥ配列は、ＷＴ１遺伝子の一部、
または染色体１１ｐ１３領域の一部であり得、癌と診断された被験者における疾
病診断および予後の方法が、被験者におけるＷＴ１遺伝子または染色体１１ｐ１
３領域ＤＮＡ配列のＮＲＥまたはＡＲＲのメチル化状態を測定すること、および
ＮＲＥのメチル化状態を、被験者の診断および予測された長期回復予後と相関さ
せることを包含する。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の場合には、ＮＲＥ
の高メチル化は、被験者が、正の長期回復予後を示すことを示し、そしてＮＲＥ
の低メチル化は、被験者が、治療後に再発しやすくされることを示す。ウィルム
ズ腫の場合には、ＮＲＥの高メチル化は、被験者が、正の長期回復予後を示すこ
とを示し、そしてＮＲＥの低メチル化は、被験者が、治療後に再発しやすくされ
ることを示す。ウィルムズ腫では、低メチル化は、腫瘍で特異的に検出され、そ
して結腸直腸癌細胞系では、低メチル化は、腫瘍形成の可能性と相連する。しか
し、他の癌では、特定の１または複数のヌクレオチド配列の高メチル化は、癌細
胞の存在および／または治療後の再発に対する被験者の素因を示しうるのに対し
て、特定の１または複数ヌクレオチド配列の低メチル化は、癌細胞の不在および
／または被験者が正の長期回復予後を示すことを示しうる。例えば、図１（ｅ）
参照。診断用途は、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）および腎臓の明細胞肉
腫（ＣＣＳＫ）（図１Ｄ参照）のような他の腎臓腫瘍の高メチル化と反対に、Ｗ
Ｔにおける低メチル化により下線付けられる。
【００１７】 メチル化状態は、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＳｐｅＩおよびＫｐｎ１のような酵素を
組み合わせて用いて、ＷＴ１アンチセンス調節領域を制限切断することにより決
定されうる。Ｂｓｈ１２６Ｉは、ＢｓｔＵＩのアイソシゾマーである。Ｂｓｈ１
２３６Ｉは、ＣｐＧメチル化のない時のみ、制限配列ＣＧＣＧで切断する。メチ
ル化配列は、Ｂｓｈ１２３６Ｉによって制限されない。したがって、Ｂｓｈ１２
３６Ｉで制限されたヌクレオチド配列について得られる制限パターンは、ヌクレ
オチド配列中のＢｓｈ１２３６Ｉ部位がメチル化されているかどうかによって、
異なるバンドパターンを示す。他の市販で入手できる酵素も、使用でき、そして
１つまたはそれ以上が、メチル化および未メチル化ＤＮＡの間を区別できる。
【００１８】 メチル化状態は、ＰＣＲ基本のアッセイシステムを用いて測定されうる。この
ようなＰＣＲ基本のアッセイシステムは、メタ重亜硫酸ナトリウムの使用に関与
しうる。これは、全ての未メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する効果
を示す。好ましくは、ＰＣＲ反応は、ＷＴ１アンチセンス調節領域の少なくとも
一部を使用する以下のプライマーを使用する：
【００１９】 Ｔｆ：5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Ｔｒ：5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' ＴｆＮ：5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' （入れ子プライマー） ＴｒＮ：5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'（入れ子プライマー）
【００２０】 ＰＣＲ反応で使用される条件は、本明細書に後に記する条件と同じである。下
に記述されるとおり、その後、ＰＣＲ反応から得られるＰＣＲ産物は、クローニ
ングされ、配列決定されうる。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ））のようなベクターにクローニングされうる。代わりに、ＰＣＲ産物
を、直接配列決定してもよい。いったん配列決定されると、任意のメチル化シト
シン残基が、ヌクレオチド配列中で「Ｃ」として読み取りできるままであるのに
対して、未メチル化シトシンは、その配列でＴ残基として現れる。
【００２１】 入れ子ＰＣＲ反応は、以下のプライマーを包含する Ｔｆ：5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Ｔｒ：5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' ＴｆＮ：5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' （入れ子プライマー） ＴｒＮ：5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3' （入れ子プライマー）
【００２２】 本発明の第５の態様は、ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変化の検出か
ら成る、被験者由来の細胞における癌検出の方法を提供する。正常な組織が単対
立遺伝子で遺伝子を発現する場合、腫瘍特異的遺伝子の任意の二つの対立遺伝子
発現は腫瘍形成細胞増殖の存在を示しうる。代わりに、ある種の癌で、正常な組
織は二対立遺伝子で、そして癌は単対立遺伝子でありうる。さらに、メチル化変
化は、遺伝子投与に対する対立遺伝子の寄与と関係なく、サイレントなまたは増
強された遺伝子発現を通じた遺伝子発現の変化を伴いうる（Ｊｏｎｅｓ、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６巻、２４６３−２４６７頁（１９９６年）に概
説）。
【００２３】 ゲノムのインプリンティングの腫瘍特異的変更は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）によって検出されうる。これは、電気泳動ゲルでのＲＴ−ＰＣＲ産物の肉眼
分析による変更ゲノムインプリンティングの比較的早い検出を可能にする。
【００２４】 上記方法は、被験者におけるＷＴの検出に使用でき、ＷＴ−１遺伝子のような
ＷＴ−特異的遺伝子のゲノムインプリンティングの変更を検出しうる。 検出される変更ゲノムインプリンティングは、ゲノムインプリンティングの緩
和、インプリンティングの損失、またはインプリンティングの増加でありうる。
【００２５】 ＲＴ−ＰＣＲは、１つの対立遺伝子のみに制限部位を導入する対立遺伝子の多
型の両側で腫瘍特異的遺伝子配列にアニールするように設計された２つのプライ
マーを使用しうる。例えば、ＷＴの場合には、ＲＴ−ＰＣＲは、以下のプライマ
ーを使用しうる：
【００２６】 プライマー１：ＷＴ１８［CTTAGCACTTTCTTCTTGGC］ プライマー２：ＷＩＴＫＢＦ２［TTGCTCAGTGATTGACCAGG］ 本発明の第６の態様は、腫瘍特異的遺伝子のゲノムインプリンティングを変更
する工程から成る、特定の癌に罹っている被験者の治療方法を提供する。これは
、ゲノムインプリンティングの緩和、または緩和されたゲノムインプリンティン
グの逆行に関与しうる。
【００２７】 本発明の第７の態様は、本発明の第５の態様による方法を用いた診断用キット
、アッセイまたは監視方法を提供する。 本発明の第８の態様は、本発明の前述の態様による方法を使用して、ゲノムイ
ンプリンティングにおける腫瘍特異的変更を検出する工程と、ゲノムインプリン
ティングにおける検出変更を、ＷＴ１アンチセンス調節領域の差分メチル化と相
関させる工程とから成る、ＷＴ１アンチセンス調節領域のメチル化状態の検出方
法を提供する。例えば、ゲノムインプリンティングの緩和は、ＷＴ１アンチセン
ス調節領域の低メチル化と相関されうる。
【００２８】 本発明によるヌクレオチド配列、および疾病診断、検出および予後の方法を、
あくまで例として、添付の図１（Ａ）から３（Ｂ）まで、および配列番号１から
配列番号３までを参照しながら説明する。
【００２９】 配列番号１は、ＷＴ１ ＡＲＲのヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、ＷＴ−１をコードする遺伝子の負の調節要素のヌクレオチド配
列を示す。 配列番号３は、ＷＴ１アンチセンス領域のヌクレオチド配列（Ｇｅｓｓｌｅｒ
，Ｍ ＆ Ｂｒｕｎｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７巻：４９９−５０１頁（１９９
３年））を示す。ＲＴ−ＰＣＲプライマーは矢印として示され、エキソン配列は
太字で示される。
【００３０】 １．ＷＴ１ゲノム配列のクローニングおよび特徴付け ＷＴ１ｃＤＮＡおよびＷＴ１プロモーター領域を、それぞれ、ヒト胎児腎臓ｃ
ＤＮＡライブラリー（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびヒトＢ細胞
ゲノムライブラリー（λＳｈａ２００１、ケンブリッジのメティカル・リサーチ
・カウンシル（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ）のＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓによって供給された腎臓）からクロー
ニングした。各ライブラリーについて、プラークスクリーンフィルター（デュポ
ン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ））を、１×１０6ファージ（Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．およ
びＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０−１８２頁（１９
７７年））からｉｎ ｓｉｔｕで作成した。フィルターを、６５℃で６×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ***Ｄ
ＮＡでハイブリッド形成した。（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、６５℃）で
高いストリンジェンシーで洗浄を行った。ｃＤＮＡライブラリーについては、Ｐ
ＣＲ増幅によって得られた部分的ＷＴ１ｃＤＮＡを、プローブとして使用した。
ｃＤＮＡライブラリーから単離した全長ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を、ジデオキシ鎖
ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、７４巻、５４６３−５４６７頁（１９７７年））によって測定し、ｃＤＮＡの
５’末端から得られる７００ｂｐ断片を、ゲノムライブラリーをプローブするた
めに使用した。プローブは、ランダム・プライマー法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１１巻、４７−５４頁（１９８３年））により［α− 32 Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で放射線標識した。
【００３１】 ＷＴ１遺伝子の５’末端に対応するゲノムクローンを、サブクローニングし、
そして標準方法論による制限分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、１および２版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク（１９８９年））によって特徴付けた。ＤＮＡ配列を、ジデオキシ鎖ターミ
ネーター法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、７４巻、５４６３−５４６７頁（１９７７年））により、および製造業者
（ユーエスビー−アマシャム（ＵＳＢ−Ａｍｅｒｓｈａｍ））によって、Δｔａ
ｑサイクル配列決定により測定した。ＷＴ１遺伝子のイントロン１から得られる
ＤＮＡの機能性評価を、遺伝子発現を検出する種々のＴＷ１イントロン配列との
レポーター遺伝子構築物の一過性形質移入により行った（Ｍａｌｉｋ，Ｋ．ら、
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１１巻、１５８９−１５９５頁（１９９５年））。
【００３２】 ２．差分メチル化アッセイ ヒトゲノムＤＮＡを、標準フェノール−クロロホルム抽出法（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、分子クローニング、１および２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８
９年））により精製する。イントロン領域のＤＮＡ配列（図２参照）に基づいて
、制限酵素Ｂｓｈ１２３６Ｉ（エムビーアイ・フェルメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒ
ｍｅｎｔａｓ））による消化を、イントロン領域のメチル化を試験するために選
択した。この酵素は、ＣｐＧメチル化がない時にのみ制限配列ＣＧＣＧを切断す
る；メチル化配列は限定されない。我々の研究は、差分メチル化が、４つの強力
なＢｓｈ１２３６Ｉ部位を含有する８５０ｂｐのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ（ニュー・
イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））断
片内で好適に検出されることを確立した（図１参照）。これらの部位が、メチル
化されているか、またはメチル化されていないかによって、特徴付けられたバン
ドパターンは、ゲノムＤＮＡの消化の後にＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、およびＢｓｈ１
２３６Ｉの組合せで観察される。ササンブロッティングおよび放射線標識された
ＤＮＡプローブを用いたハイブリッド形成（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニ
ング、１および２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年））は、イント
ロン配列中のＫｐｎＩおよびＳｐｅＩ部位によって定義される（図１および２）
。
【００３３】 図１（Ｄ）は、適合した正常な腎臓およびウィルムズ腫サンプルのササンブロ
ットを示す。全てのＷＴサンプルは、異種接合体の損失を示さないと確認された
。さらに、適合した正常な腎臓およびＰＮＥＴまたはＣＣＳＫ ＤＮＡも示され
ている。
【００３４】 図１（Ｄ）で示されるとおり、差分メチル化のパターンは、正常な腎臓ＤＮＡ
とウィルムズ腫ＤＮＡ（パネルＡ）、可変の予後と正常なリンパ球とを有する患
者から得られる白血球細胞（パネルＢ）、および高度の腫瘍形成および非腫瘍形
成の結腸細胞系（パネルＣ）との間を首尾よく区別する。パネルＣに示された結
果は、この変化が、腫瘍形成過程に関連しうること、したがって、ウィルムズ腫
以外の癌に関連することを示唆する。
【００３５】 フィルムズ腫では、特定のヌクレオチド配列の低メチル化が腫瘍状態と相関す
る。しかし、他の癌では、この相関は、特定のヌクレオチド配列の高メチル化が
腫瘍細胞のメチル化状態に対応し、低メチル化は、正常な細胞を示すように逆転
され得る。この例は、図１（Ｅ）に、ＡＲＲメチル化状態における変化について
の正常な胸部組織ＤＮＡおよび胸部腫瘍ＤＮＡのサザンブロット分析と共に示さ
れる。攻撃性が種々に変わる４つの湿潤性腺管癌全てで、正常な胸部腫瘍ＤＮＡ
に比較してＷＴ１ ＡＲＲのメチル化が増大されることが示された。したがって
、正常な組織と腫瘍組織を比較する相対的差分メチル化は、診断的に利用されう
る。
【００３６】 ３．ＰＣＲに基づくアッセイ系 腫瘍細胞および正常細胞は、先に概説したとおりそれらの後成型によって区別
されうる。ＷＴ１アンチセンス調節領域のＤＮＡ配列の知識は、生物材料をほと
んど必要としない、サンプルのメチル化状態の測定を可能にするＰＣＲ基本のア
ッセイ系を開発することを可能にした。この方法は、メタ亜硫酸ナトリウム（メ
ルク）を用いたゲノムＤＮＡサンプルの処理によって制限酵素認識配列の一部で
ないＣｐＧジヌクレオチドを導入し、それにより、全ての未メチル化シトシン残
基をウラシルに変換することに関与する（Ｐａｕｌｉｎ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８巻、４７７７−４７９０頁（１９９８年
））。その後、ＷＴ１イントロン配列中の目的の特異的領域は、ＤＮＡの両方の
鎖に特異的なプライマーを用いて増幅されうる。得られたＰＣＲバンドは、ｐＧ
ＥＭ−Ｔ（プロメガ）のような市販で入手可能なベクターを用いて直接的に配列
決定またはクローニングされ、そしてＤＮＡ配列決定によって分析されうる。任
意のメチル化シトシン残基は、ＤＮＡ配列で「Ｃ」として読取可能なままである
のに対して、未メチル化シトシンは、「Ｔ」として現れる。
【００３７】 代わりに、亜硫酸ナトリウムで処理されたＤＮＡでのＰＣＲの第一周の後、一
般に差分メチル化されるとして示されたメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位に特異的
な配列（図２で囲まれた）、または未メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位に特異的な
配列（すなわち、Ｃ→Ｔ変換に特異的な）を含めた入れ子プライマーが使用され
、それによりＰＣＲ産物の可視化によるメチル化および非メチル化配列の間の区
別が可能となる。すなわち、メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位に特異的なプライマ
ーが使用される場合、ＰＣＲ産物は、サンプル中のＢｓｈ１２３６Ｉ部位がメチ
ル化される場合にのみ観察されるか、さもなければＰＣＲ増幅は起らない。
【００３８】 メチル化特異的ＰＣＲのために使用されうる代表的プライマーは、以下に示さ
れ、そしてＷＴ１配列に対するそれらのハイブリッド形成の位置は、最上の鎖の
増幅について図２で矢印によって示される。Ｃ→Ｔ変換について可能にするため
には：
【００３９】 Ｔｆ：5'-GGGTGGAGAGAAGGATATATTTAT-3' Ｔｒ：5 '-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' ＴｆＮ：5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' （入れ子プライマー） ＴｒＮ：5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'（入れ子プライマー）
【００４０】 がある。 代表的な一次増幅は、３ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加した緩衝液中に亜硫酸ナトリ
ウム処理ＤＮＡ１００ｎｇと共にアンプリタック（Ａｍｐｌｉｔａｑ）（パーキ
ン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を用いて行われる。増幅条件は、
３分間、９４℃で変性され、続いて、３０秒間９４℃での変性、３０秒間５０℃
でアニールし、そして９０秒間７２℃での伸長の３５回サイクルが行われる。７
２℃で５分間の最終伸長により、反応を完了させる。入れ子プライマーを用いた
二次ＰＣＲは、１／１００番目の一次ＰＣＲ反応および２４回サイクルを使用す
る以外は同じ条件を使用する。
【００４１】 ４．長期疾病予後と（ＮＲＥ）のメチル化状態の相関関係 本発明者らは、癌に罹っている被験者におけるＡＲＲのメチル化状態と、診断
および長期疾病予後との間の相関関係を検出した。診断能力は、未分化神経外胚
葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）および腎臓の明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）のような他の腎臓腫
瘍の高メチル化とは対照的に、ＷＴにおける低メチル化によって示される（図１
Ｄ参照）。高メチル化ＡＲＲを有するＡＭＬ被験者は、治療に十分に応答し、そ
して完全な回復をなした。しかし、未メチル化ＮＲＥを示し再発した被験者は、
治療に抵抗性があった。
【００４２】 したがって、ＮＲＥのメチル化状態は、長期間疾病に罹った予後の強力な早期
指標として使用されうる。未メチル化ＮＲＥを示す被験者は、再発の早期検出の
ための近視観察下で維持されうる。これは、回復についての彼らの可能性を最大
限にする。しかし、いったん何らかの再発が正常な日常の検査によって検出され
ると、これらの患者は、治療に十分に応答することが予測されるので、治療後の
このような近視観察の費用は、未メチル化ＮＲＥを有する被験者には必要でない
。
【００４３】 ＡＭＬを用いた試験的研究で、特定のヌクレオチド配列の高メチル化は、ＡＭ
Ｌを示す被験者の推定された正の長期予後に応答し、そして低メチル化は、治療
後に再発する被験者の素因に対応する。しかし、他の癌では、この相関関係は、
特定のヌクレオチド配列の高メチル化が治療後に再発する素因に対応し、低メチ
ル化が回復のための正の長期予後を示しうるように、逆転されうる。
【００４４】 したがって、被験者に適する治療の最高の方法に関する決定は、彼らの癌症状
の再発の事象における治療に被験者がいかに応答するよう予想されるかの知識に
基づく予測に照らして行われうる。
【００４５】 したがって、差分メチル化は、癌と診断された被験者についての長期予後を発
生する上での決定因子である。 ５．ＷＴ１遺伝子のゲノムインプリンティング 正常な腎臓細胞で観察されるＷＴ１対立遺伝子特異的メチル化パターンは、Ｗ
Ｔ１ ＡＲＲ／ＮＲＥ（アンチセンス調節領域／負の調節領域）のゲノムインプ
リンティング、およびウィルムズ腫におけるゲノムインプリンティングの腫瘍特
異的緩和があることを強く示す。
【００４６】 ゲノムインプリンティングは、それにより遺伝子の母系または父系のコピーが
、選択的に発現される現象であり、そしてＤＮＡのメチル化は、調節シグナルと
して役割を果す。このようなシグナルの損失は、正常な細胞成長に有害である可
能性のある遺伝子発現の変更投与に至らせる可能性がある。例えば、ＩＧＦ２遺
伝子は、ＩＧＦ２のゲノムインプリンティング制御の損失を示し、そしてＷＴで
過剰発現される（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（補足
）、５９巻：１７４３ｓ−１７４６ｓ頁（１９９９年））。ＩＧＦ２が成長因子
である場合、これは、腫瘍形成に関連した未制御増殖に容易に寄与しうる。
【００４７】 ＷＴ１ ＡＲＲ／ＮＲＥの分化メチル化が、ＷＴ１アンチセンスＲＮＡ（ＷＴ
１−ＡＳ）の対立遺伝子特異的発現を付随するかどうかを決定するために、逆転
写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は、胎児および正常な腎臓細胞、およびＷＴ細
胞で行われた。アンチセンスＷＴ１ ＲＮＡスプライシングのいずれかの側のプ
ライマー（配列３および図３Ａ参照）（Ｇｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．およびＢｒｕｎｓ
、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１７巻：４９９−５０１頁（１９９３年））は、ＲＴ−Ｐ
ＣＲのために使用された。
【００４８】 プライマー１：WT18 [CTTAGCACTTTCTTCTTGGC] プライマー２：WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] ＲＴ−ＰＣＲに使用された代表的反応条件は、５分間、６０℃に加熱して１μ
ｇの総ＲＮＡに逆方向プライマーをアニールし、続いて氷上で急冷し、続いて６
０分間、５０℃でスーパーＲＴ（エイチティー・バイオテクノロジーズ（ＨＴ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、英国ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＵＫ））逆転写酵素を用いて行われる逆転写を行うことであった。この後、以下
のＰＣＲサイクリングを行った；
【００４９】 ９５℃で３分（１サイクル）； ９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒（２サイクル）； ９４℃で１５秒、５８℃で３０秒、７２℃で６０秒（２サイクル）； ９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で６０秒（１０サイクル、アンチセン
ス産物について２０サイクル）；および ９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、１サイクル当たり２０秒の延長を伴う７２℃
で６０秒（２０サイクル）
【００５０】 のＰＣＲサイクルによって行われた。 得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＭｎＩＩを、ＰＣＲ混合液に直接添加し、３
７℃で６０分間インキュベートすることによって消化した。その後、ＰＣＲ産物
を、２％アガロースゲルで分離し、そしてその後、ハイブリッドＮ+膜上にアル
カリ性ブロットし、そして32Ｐ標識アンチセンスｃＤＮＡプローブでハイブリッ
ド形成させた。プローブの配列は、配列３中のＷＴ１８とＷＴＴＫＢＰ２の間に
太字で示される。以下のプライマーを、ＤＮＡ対照として使用した：
【００５１】 プライマー１：WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] プライマー２：WITKBR2 [TTGGCTGGAAAGCTTGCAGC]
【００５２】 利用されたＭｎＩＩ多型性（Ｇｒｕｂｂ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１
０巻：１６７７−１６８１頁（１９９５年））を、図３Ａで星印によって印を付
け、二つの対立遺伝子発現について２８５および２２２ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物
、または代わりに単対立遺伝子発現について２８６ｂｐまたは２２２ｂｐの選択
的に主要な対立遺伝子バンドを得た。
【００５３】 図２Ｂで示されるとおり、１つのメチル化および１つの未メチル化対立遺伝子
を有する正常な腎臓サンプルでのＷＴ１−ＡＳの発現は、一つの対立遺伝子から
起るのみであり、それによりゲノムインプリンティングが確認される。しかし、
ＷＴは、ＷＴ１−ＡＳの二つの対立遺伝子発現を示し、したがって、ＷＴでのイ
ンプリンティング制御の緩和が示される。したがって、両方のＷＴ１−ＡＳ対立
遺伝子の発現から生じる正味の増加は、ウィルムズ腫で検出される差分メチル化
パターンの追加のマーカーとしての役割を果たしうる。
【００５４】 この変更インプリンティングは、ＷＴ以外の癌で存在する可能性がある。した
がって、特定の遺伝子の変更インプリンティング制御は、患者における種々の癌
型の検出または診断のためのマーカーを提供しうる。さらに、ＤＮＡの後成性修
飾が可逆である場合、変更されたインプリンティング制御の検出および／または
メチル化変化の診断は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼの
ような酵素に基づく、または化合物による（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ａ．およびＬａｉ
ｒｄ Ｐ．Ｗ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１巻、１６３−１６７頁
（１９９９年））、治療上の戦略をも促進するにちがいない。これは、遺伝子発
現の制御を可能にし、そして適切な遺伝子制御次第である治療を許す。
【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）は、サザンブロッティングについてのメチル化の検出の
ために使用されたプローブを示し、図（Ｂ）は、３つの急性骨髄性白血病（ＡＭ
Ｌ）ＤＮＡおよび正常な末梢血リンパ球ＤＮＡのサザンブロットを示し、図１（
Ｃ）は、非腫瘍形成性および高度に腫瘍形成性の結腸直腸細胞系から得られるＤ
ＮＡのサザンブロットを示し、図１（Ｄ）は、適合した正常な腎臓およびＷＴサ
ンプル、適合した正常な腎臓およびＰＮＥＴまたはＣＣＳＫ ＤＮＡおよび胎児
腎臓対照のサザンブロットを示し、図１（Ｅ）は、ＡＲＲメチル化状態における
変化についての胸部腫瘍ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。
【図２】ＷＴ１ ＡＲＲのヌクレオチド配列を示す。プライマーハイブリッ
ド形成部位は、矢印によって示される。
【図３】図３（Ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲについて使用されるアンチセンスＷＴ
１ＲＮＡスプライシングのいずれかの側でのプライマーを示す模式図であり、図
３（Ｂ）は、アンチセンスＷＴ１ＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ産物のサザンブロットを
示す。
【００５６】
【配列表１】
【００５７】
【配列表２】
【００５８】
【配列表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/574 Ｄ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラウン、キース イギリス国 ＢＳ８ １ＴＤ ブリストル ユニバーシティー ウォーク スクール オブ メディカル サイエンシズ デパ ートメント オブ パソロジー クリック ユニット Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA09 HA11 HA12 HA17 HA20 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB26

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号１で示される配列の少なくとも一部を含むか、塩基置
    換、欠失および／または付加による配列番号１に示される配列の変異型の少なく
    とも一部を包む、ＷＴ１アンチセンス調節領域をコードするヌクレオチド配列。
  2. 【請求項２】ＷＴ１アンチセンス調節領域の負の調節要素（ＮＲＥ）をコー
    ドする請求項１に記載のヌクレオチド配列。
  3. 【請求項３】配列番号２に示される配列の少なくとも一部を含むか、塩基置
    換、欠失および／または付加による配列番号２で示されるヌクレオチド配列の変
    異型の少なくとも一部を含む、ＷＴ１アンチセンス調節領域の負の調節要素（Ｎ
    ＲＥ）。
  4. 【請求項４】ＮＲＥが、配列番号２に太字で示される配列を含むか、または
    塩基置換、欠失および／または付加によるそのような配列の変異型を含む請求項
    ３に記載のＷＴ１アンチセンス調節領域ＮＲＥ。
  5. 【請求項５】ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である請求項１乃至３のいずれ
    か一項に記載のヌクレオチド配列またはＮＲＥ。
  6. 【請求項６】請求項１乃至５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によ
    ってコードされるＲＮＡ配列。
  7. 【請求項７】ウィルムズ腫癌と診断された被験者における疾病診断および予
    後の方法であって、被験者における、またはその被験者に由来するサンプルにお
    ける、特定の１または複数のヌクレオチド配列の差分メチル化状態を測定する工
    程から成る方法。
  8. 【請求項８】特定の１または複数のヌクレオチド配列が、ＷＴ１アンチセン
    ス調節領域（ＡＲＲ）の部分を形成する請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】被験者から単離されたサンプル中のＷＴ１遺伝子の負の調節要
    素（ＮＲＥ）またはＡＲＲのメチル化状態を測定する工程と、ＮＲＥまたはＡＲ
    Ｒのメチル化状態を、被験者の診断および予想される長期回復予後と相関させる
    工程とから成る請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】ＮＲＥまたはＡＲＲの高メチル化は、被験者が正の長期回復
    予後を示すことを示し、ＮＲＥまたはＡＲＲの低メチル化は、被験者が治療後の
    再発になりやすい素因であることを示す請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】特定の１または複数のヌクレオチド配列の低メチル化は、被
    験者が正の長期回復予後を示すことを示し、特定の１または複数のヌクレオチド
    配列の高メチル化は、被験者が治療後の再発になりやすい素因であることを示す
    請求項７または請求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ＮＲＥが、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のヌクレオ
    チド配列である請求項７乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】メチル化状態が、制限消化分析によって検出される請求項７
    乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】少なくとも酵素Ｂｓｈ１２３６Ｉが、ＮＲＥを制限するため
    に使用される請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】メチル化状態が、ＰＣＲに基づくアッセイ系を使用して検出
    される請求項７乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】ＰＣＲアッセイ系が、ヌクレオチド配列の領域を増幅する以
    下のプライマー： Ｔｆ：5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Ｔｒ：5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' ＴｆＮ：5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' （入れ子プライマー） ＴｒＮ：5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'（入れ子プライマー） の内の少なくとも１つを使用する請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】増幅ヌクレオチド配列が、クローニングされ、配列決定され
    る請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】請求項１乃至６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を
    包含するプローブ。
  19. 【請求項１９】請求項１乃至６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、
    または請求項１８に記載のプローブを用いた診断用キット、アッセイまたは監視
    方法。
  20. 【請求項２０】請求項７乃至１７のいずれか一項に記載の方法を用いた診断
    用キット、アッセイまたは監視方法。
  21. 【請求項２１】特定の１または複数のヌクレオチド配列のメチル化状態を検
    出する工程から成る、被験者における、または被験者から単離されるサンプルに
    おける、癌検出の方法。
  22. 【請求項２２】特定の１または複数のヌクレオチド配列のメチル化状態を、
    被験者における癌細胞の存在または不在と相関させる工程から成る、請求項２１
    に記載の方法。
  23. 【請求項２３】特定の１または複数のヌクレオチド配列の低メチル化が、被
    験者における癌細胞の存在を示す請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変更を検出する工程
    から成る、被験者に由来する細胞における癌検出の方法。
  25. 【請求項２５】特定のヌクレオチド配列のメチル化状態を測定することによ
    って、ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的緩和を検出する工程から成る、請
    求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変更が、逆転写−Ｐ
    ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される請求項２４または請求項２５に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】癌が、ウィルムズ腫（ＷＴ）である請求項２４乃至２６のい
    ずれか一項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】アンチセンスＷＴ−１ＲＮＡ配列のゲノムインプリンティン
    グの緩和を検出する工程から成る、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】ＲＴ−ＰＣＲが、１つの対立遺伝子のみに制限部位を導入す
    る対立遺伝子の多型性の両側で腫瘍特異的遺伝子配列にアニールするように設計
    された２つのプライマーを使用する請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】ＲＴ−ＰＣＲが、以下のプライマー対 プライマー１：ＷＴ１８ CTTAGCACTTTCTTCTTGGC プライマー２：ＷＩＴＫＢＦ２ TTGCTCAGTGATTGACCAGG を使用する請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】腫瘍特異的遺伝子のゲノムインプリンティングを変更する工
    程から成る、特定の癌に罹っている被験者を治療する方法。
  32. 【請求項３２】腫瘍特異的遺伝子のゲノムインプリンティングが、特定のヌ
    クレオチド配列のメチル化状態を変更することによって変更される請求項３１に
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】ゲノムインプリンティングが、腫瘍特異的遺伝子のゲノムイ
    ンプリンティングを緩和するために変更される請求項３１または請求項３２に記
    載の方法。
  34. 【請求項３４】ゲノムインプリンティングが、腫瘍特異的遺伝子のゲノムイ
    ンプリンティングの緩和を逆転させるために変更される請求項３１または請求項
    ３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】請求項２４乃至３０のいずれか一項に記載の方法を用いた診
    断用キット、アッセイまたは監視方法。
  36. 【請求項３６】請求項２１乃至３０のいずれか一項に記載の方法を用いて、
    ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変更を検出する工程と、緩和したゲノム
    インプリンティングにおいて検出された変更を、ＷＴ１アンチセンス調節領域の
    差分メチル化と相関させる工程とから成る、ＷＴ１アンチセンス調節領域のメチ
    ル化状態の検出方法。
  37. 【請求項３７】ゲノムインプリンティングにおける変更が、ゲノムインプリ
    ンティングにおける緩和である請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】請求項７〜１７、２１〜３４、３６、３７のいずれか一項に
    記載の方法の結果に基づいて、治療の特別の経過を選択することから成る治療方
    法。
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