JP2003504315A - 血管新生標的免疫複合体 - Google Patents
血管新生標的免疫複合体Info
- Publication number
- JP2003504315A JP2003504315A JP2001508226A JP2001508226A JP2003504315A JP 2003504315 A JP2003504315 A JP 2003504315A JP 2001508226 A JP2001508226 A JP 2001508226A JP 2001508226 A JP2001508226 A JP 2001508226A JP 2003504315 A JP2003504315 A JP 2003504315A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immune complex
- cells
- human
- tumor
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌、慢性関節リウマチ、滲出性形態の黄斑変性、及びアテローム性動脈硬化症のような血管新生に関連する疾患を治療するための免疫複合体を提供する。
【解決手段】 当該免疫複合体は、典型的には、ヒンジを含めたヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域、あるいは患者に投与したとき、標的細胞に対して細胞溶解性免疫応答又は細胞傷害作用を誘発することができる他のエフェクタードメイン（１つ又はそれ以上）から成る。エフェクタードメインは、リシン−３４１がアラニンに又はセリン−３４４がアラニンに置換された第ＶＩＩ因子のような、高い親和性と特異性で組織因子に結合するが血液凝固を開始させない、第ＶＩＩ因子突然変異体を含む標的ドメインに複合されている。
Description
【０００１】
本発明は、癌、慢性関節リウマチ、滲出性形態の黄斑変性、及びアテローム性
動脈硬化症のような新しい血管の増殖（血管新生：ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）に関連する疾患を有する患者を治療するための免疫複合体試薬の設
計、合成及び投与に関する。本発明の免疫複合体の標的は、新生血管系の内皮細
胞によって発現される膜内外レセプタ組織因子である。組織因子はまた、多くの
型の腫瘍細胞によっても発現される。それ故、本発明の治療方法は広い範囲の固
体腫瘍に対する免疫療法において特に有効である。治療試薬は、標的ドメインと
エフェクタードメインから成る免疫複合体である（図１）。標的ドメインは、高
い親和性と特異性で組織因子に結合するが、血液凝固を開始させない、突然変異
形態の第ＶＩＩ因子である。エフェクタードメインはＩｇＧ１免疫グロブリンの
Ｆｃ領域である。
動脈硬化症のような新しい血管の増殖（血管新生：ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）に関連する疾患を有する患者を治療するための免疫複合体試薬の設
計、合成及び投与に関する。本発明の免疫複合体の標的は、新生血管系の内皮細
胞によって発現される膜内外レセプタ組織因子である。組織因子はまた、多くの
型の腫瘍細胞によっても発現される。それ故、本発明の治療方法は広い範囲の固
体腫瘍に対する免疫療法において特に有効である。治療試薬は、標的ドメインと
エフェクタードメインから成る免疫複合体である（図１）。標的ドメインは、高
い親和性と特異性で組織因子に結合するが、血液凝固を開始させない、突然変異
形態の第ＶＩＩ因子である。エフェクタードメインはＩｇＧ１免疫グロブリンの
Ｆｃ領域である。
【０００２】
典型的には血管内皮細胞に対して特異的な成長因子の放出が引き金となる様々
な疾患において、病的血管形成、すなわち周辺組織中の脈管からの血管増殖の誘
導が認められる。病的血管形成は、固体腫瘍の成長と転移を可能にし、眼障害に
おける視覚機能不全を引き起こし、炎症性疾患における白血球の血管外遊出を促
進し、及び／又はアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患の結果に影響を
及ぼす、血管新生をもたらしうる。集合的に、これらは時に血管形成性疾患と称
される。
な疾患において、病的血管形成、すなわち周辺組織中の脈管からの血管増殖の誘
導が認められる。病的血管形成は、固体腫瘍の成長と転移を可能にし、眼障害に
おける視覚機能不全を引き起こし、炎症性疾患における白血球の血管外遊出を促
進し、及び／又はアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患の結果に影響を
及ぼす、血管新生をもたらしうる。集合的に、これらは時に血管形成性疾患と称
される。
【０００３】
固体腫瘍の生存と成長は新生血管系の発生に決定的に依存するので、癌は主要
な血管形成性疾患である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３３３，１７５７−１７６３）。多くの癌は段階的に進行し、一次腫
瘍細胞の増殖から始まって、腫瘍細胞の循環系への侵入、播種した転移部位でコ
ロニー形成、そして癌による死亡の大部分の原因である転移した腫瘍細胞の増殖
へと進行する（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．とＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９
９３）ＴＩＧ９，１４１−１４３）。癌は、疾患が転移段階に達するまでしばし
ば検出されないままであるため、血管下部構造と転移性腫瘍細胞を根絶すること
ができる癌療法が特に望ましい。
な血管形成性疾患である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３３３，１７５７−１７６３）。多くの癌は段階的に進行し、一次腫
瘍細胞の増殖から始まって、腫瘍細胞の循環系への侵入、播種した転移部位でコ
ロニー形成、そして癌による死亡の大部分の原因である転移した腫瘍細胞の増殖
へと進行する（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．とＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９
９３）ＴＩＧ９，１４１−１４３）。癌は、疾患が転移段階に達するまでしばし
ば検出されないままであるため、血管下部構造と転移性腫瘍細胞を根絶すること
ができる癌療法が特に望ましい。
【０００４】
血管形成はまた、慢性関節リウマチにおいても重要な役割を果たす（Ｓｚｅｋ
ａｎｅｚ，Ｚ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４６，２７−４１）
。慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界中ですべての人種民族群において起こる慢
性全身性炎症性疾患であり、主として滑膜性の連結及びしばしば様々な他の器官
を侵す。ＲＡの滑膜組織は広汎に血管新生される。ＲＡでは、炎症白血球が血管
の内皮層を通して滑膜内に遊出し、滑膜の炎症、そして最終的には関節の破壊を
もたらす。
ａｎｅｚ，Ｚ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４６，２７−４１）
。慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界中ですべての人種民族群において起こる慢
性全身性炎症性疾患であり、主として滑膜性の連結及びしばしば様々な他の器官
を侵す。ＲＡの滑膜組織は広汎に血管新生される。ＲＡでは、炎症白血球が血管
の内皮層を通して滑膜内に遊出し、滑膜の炎症、そして最終的には関節の破壊を
もたらす。
【０００５】
血管形成は、視力の破滅的喪失をもたらす眼疾患の大半の基礎となる（Ｆｉｒ
ｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９３，９７６４−９７６９）。５５歳以上の個人における失明の主要
な原因は滲出性（「湿性」）形態の加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）であり、５５歳
未満では増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）である。ＡＲＭＤとＰＤＲはそれぞれ
脈絡膜と網膜の血管新生に関する基本型の疾患であるが、他の変性又は炎症状態
も、選択的にいずれかの血管系の新血管形成を引き起こしうる（同上）。
ｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９３，９７６４−９７６９）。５５歳以上の個人における失明の主要
な原因は滲出性（「湿性」）形態の加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）であり、５５歳
未満では増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）である。ＡＲＭＤとＰＤＲはそれぞれ
脈絡膜と網膜の血管新生に関する基本型の疾患であるが、他の変性又は炎症状態
も、選択的にいずれかの血管系の新血管形成を引き起こしうる（同上）。
【０００６】
それ故、これらの疾患状態、特に癌の治療への１つのアプローチは、主として
新しい血管の増殖を阻害することによって、新生血管系の機能又は成長を抑える
ことであった（Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．とＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｇ．Ｊ．（１
９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，５７−６４）。血管を標的することに
はいくつかの利点がある。まず第一に、血管への損傷は血流を停止させることが
でき、癌に適用すると、多くの依存性腫瘍細胞の死の引き金となりうる。第二に
、標的細胞が血流に近接しており、薬物送達が促進される。第三に、血管内皮細
胞においては治療耐性の突然変異が起こりにくい。
新しい血管の増殖を阻害することによって、新生血管系の機能又は成長を抑える
ことであった（Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．とＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｇ．Ｊ．（１
９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，５７−６４）。血管を標的することに
はいくつかの利点がある。まず第一に、血管への損傷は血流を停止させることが
でき、癌に適用すると、多くの依存性腫瘍細胞の死の引き金となりうる。第二に
、標的細胞が血流に近接しており、薬物送達が促進される。第三に、血管内皮細
胞においては治療耐性の突然変異が起こりにくい。
【０００７】
薬剤、抗体及び遺伝子治療に基づくアプローチを含めて、数多くの抗血管形成
療法が提案されてきた。これらは、メタロプロテイナーゼ阻害因子、ポリ硫酸ペ
ントサン及びＴＮＰ−４７０、チロシンキナーゼの選択的阻害因子、そしてアン
ギオスタチン及びエンドスタチンのペプチド阻害因子を含む（同上、及びその中
で引用される総説）。これらは典型的には、脈管形成の様々な段階、すなわち基
底膜の分解、内皮細胞の移動、内皮細胞の増殖、及び管形成の段階で新血管形成
を妨げる。血管形成だけでなく、血管形成性疾患状態において既に形成された新
生血管系も標的する、改善された治療法を開発することが望ましいであろう。
療法が提案されてきた。これらは、メタロプロテイナーゼ阻害因子、ポリ硫酸ペ
ントサン及びＴＮＰ−４７０、チロシンキナーゼの選択的阻害因子、そしてアン
ギオスタチン及びエンドスタチンのペプチド阻害因子を含む（同上、及びその中
で引用される総説）。これらは典型的には、脈管形成の様々な段階、すなわち基
底膜の分解、内皮細胞の移動、内皮細胞の増殖、及び管形成の段階で新血管形成
を妨げる。血管形成だけでなく、血管形成性疾患状態において既に形成された新
生血管系も標的する、改善された治療法を開発することが望ましいであろう。
【０００８】
本発明は癌、慢性関節リウマチ、滲出性形態の黄斑変性、及びアテローム性動
脈硬化症を含めて、新しい血管の増殖（新生血管系）に関連する疾患のための新
規治療を提供するものである。また、本発明はこれらの疾患状態において認めら
れる血管形成を抑制するだけでなく、新生血管系構造も破壊する、新生血管標的
療法を提供するものである。
脈硬化症を含めて、新しい血管の増殖（新生血管系）に関連する疾患のための新
規治療を提供するものである。また、本発明はこれらの疾患状態において認めら
れる血管形成を抑制するだけでなく、新生血管系構造も破壊する、新生血管標的
療法を提供するものである。
【０００９】
これらやその他の目的は、組織因子に選択的に結合する標的ドメインと、標的
細胞に対する細胞溶解応答又は細胞傷害性応答を動員するエフェクタードメイン
を含む免疫複合体を含有する組成物を提供する、本発明によって実現される。典
型的な免疫療法の処置では、各々が、組織因子に結合するが血液凝固を開始させ
ない、リシン−３４１がアラニンに置換された、及び／又はセリン−３４４がア
ラニンに置換された第ＶＩＩ因子のような、ヒト第ＶＩＩ因子の突然変異形態を
含む標的ドメインに複合した、ヒンジを含めたヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦ
ｃ領域であるエフェクタードメインを持つ、２つの同一の鎖の二量体として構築
される少なくとも１つの免疫複合体を含む組成物を、血管新生に関連する疾患を
有する患者に有効量で投与する。組織因子は、正常血管系ではなく腫瘍新生血管
系の裏側にある内皮細胞によって、また多くの型の腫瘍細胞によっても発現され
るので、本発明の第ＶＩＩ因子免疫複合体は広い範囲の固体腫瘍に対する免疫療
法において特に有効である。新生血管系での凝固を活性化する及び／又は新生血
管系に組織因子又は組織因子突然変異体を導入するというこれまでに記述されて
いる発明（米国特許第６，００１，９７８号においてＥｄｇｉｎｇｔｏｎとＭｏ
ｒｒｉｓｓｅｙが述べているような）は、組織因子は新生血管系の内皮細胞によ
って特異的に発現されるのであるから無意味であり、本発明は２つの主要な点で
これらの発明と異なっている：組織因子は、血液凝固プロセスのイニシエーター
としてではなく、本発明の免疫複合体によって仲介される細胞溶解免疫応答を誘
導するための標的として使用され、血液凝固経路を活性化せずに新生血管系を破
壊する細胞溶解免疫応答が開始される。
細胞に対する細胞溶解応答又は細胞傷害性応答を動員するエフェクタードメイン
を含む免疫複合体を含有する組成物を提供する、本発明によって実現される。典
型的な免疫療法の処置では、各々が、組織因子に結合するが血液凝固を開始させ
ない、リシン−３４１がアラニンに置換された、及び／又はセリン−３４４がア
ラニンに置換された第ＶＩＩ因子のような、ヒト第ＶＩＩ因子の突然変異形態を
含む標的ドメインに複合した、ヒンジを含めたヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦ
ｃ領域であるエフェクタードメインを持つ、２つの同一の鎖の二量体として構築
される少なくとも１つの免疫複合体を含む組成物を、血管新生に関連する疾患を
有する患者に有効量で投与する。組織因子は、正常血管系ではなく腫瘍新生血管
系の裏側にある内皮細胞によって、また多くの型の腫瘍細胞によっても発現され
るので、本発明の第ＶＩＩ因子免疫複合体は広い範囲の固体腫瘍に対する免疫療
法において特に有効である。新生血管系での凝固を活性化する及び／又は新生血
管系に組織因子又は組織因子突然変異体を導入するというこれまでに記述されて
いる発明（米国特許第６，００１，９７８号においてＥｄｇｉｎｇｔｏｎとＭｏ
ｒｒｉｓｓｅｙが述べているような）は、組織因子は新生血管系の内皮細胞によ
って特異的に発現されるのであるから無意味であり、本発明は２つの主要な点で
これらの発明と異なっている：組織因子は、血液凝固プロセスのイニシエーター
としてではなく、本発明の免疫複合体によって仲介される細胞溶解免疫応答を誘
導するための標的として使用され、血液凝固経路を活性化せずに新生血管系を破
壊する細胞溶解免疫応答が開始される。
【００１０】
従来の製薬組成物中での精製免疫複合体蛋白質の使用、あるいは分泌形態の免
疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担うベクター系の使用を含む、当該免疫複合
体の全身又は局所投与の方法も開示する。本発明に従った治療は、１つ又はそれ
以上の型の精製免疫複合体蛋白質の有効量の、周期的又は持続的な静脈内又は腫
瘍内注入、あるいは他の部位での注入を含むが、これらに限定されない。代替的
な実施態様は、分泌形態の１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化
するｃＤＮＡを担う発現ベクターの有効量の、静脈内又は腫瘍内注入、あるいは
他の部位での注入によって患者を治療することを含む。後者の例は、分泌形態の
本発明の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う複製欠損アデノウイルスベク
ター又はアデノ関連ウイルスベクターの、静脈内又は腫瘍内注入、あるいは他の
部位での注入によって患者を治療することを含む。
疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担うベクター系の使用を含む、当該免疫複合
体の全身又は局所投与の方法も開示する。本発明に従った治療は、１つ又はそれ
以上の型の精製免疫複合体蛋白質の有効量の、周期的又は持続的な静脈内又は腫
瘍内注入、あるいは他の部位での注入を含むが、これらに限定されない。代替的
な実施態様は、分泌形態の１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化
するｃＤＮＡを担う発現ベクターの有効量の、静脈内又は腫瘍内注入、あるいは
他の部位での注入によって患者を治療することを含む。後者の例は、分泌形態の
本発明の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う複製欠損アデノウイルスベク
ター又はアデノ関連ウイルスベクターの、静脈内又は腫瘍内注入、あるいは他の
部位での注入によって患者を治療することを含む。
【００１１】
癌の免疫療法のような一部の実施態様では、本発明の免疫複合体を、異なる標
的ドメインを持つもう１つの型の免疫複合体と共に投与する。これらは典型的に
は、腫瘍細胞、血管内皮細胞、病的状態の滑膜における侵襲細胞で発現される細
胞表面分子に選択的に結合する、ヒトｓｃＦｖ又はＶＨ融合ファージライブラリ
ーから単離された一本鎖Ｆｖ又はＶＨ分子断片である。
的ドメインを持つもう１つの型の免疫複合体と共に投与する。これらは典型的に
は、腫瘍細胞、血管内皮細胞、病的状態の滑膜における侵襲細胞で発現される細
胞表面分子に選択的に結合する、ヒトｓｃＦｖ又はＶＨ融合ファージライブラリ
ーから単離された一本鎖Ｆｖ又はＶＨ分子断片である。
【００１２】
抗血管系免疫複合体療法は、血管形成の活性状態にある増殖中の腫瘍のような
ある種の疾患状態で形成される新生血管系と異なって、正常な成体哺乳類血管系
は一般に静止状態（女性の生殖周期や創傷治癒のような特定のプロセスを除く）
にあるという所見に基づく。それ故、静止状態にある血管内皮細胞と増殖性血管
内皮細胞との分子的な相違が病的血管系についての標的として使用できると考え
られる。
ある種の疾患状態で形成される新生血管系と異なって、正常な成体哺乳類血管系
は一般に静止状態（女性の生殖周期や創傷治癒のような特定のプロセスを除く）
にあるという所見に基づく。それ故、静止状態にある血管内皮細胞と増殖性血管
内皮細胞との分子的な相違が病的血管系についての標的として使用できると考え
られる。
【００１３】
静止状態から、癌で認められるような病的血管系における血管形成状態へのス
イッチは、通常、腫瘍細胞によって分泌され、血管内皮細胞上の血管内皮細胞成
長因子（ＶＥＧＦ）レセプタに高い親和性と特異性で結合する、ＶＥＧＦによっ
て活性化される。血管内皮細胞上のレセプタへのＶＥＧＦの結合によって活性化
されるもう１つの応答は、血漿第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合して血液凝固を開
始させる、膜内外レセプタである組織因子の発現である。結合ＶＥＧＦを持つ血
管内皮細胞だけが組織因子を発現するので、腫瘍血管系についての推定上の標的
は、血液中を循環する第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合するはずである、内皮細胞
上で発現される組織因子である。
イッチは、通常、腫瘍細胞によって分泌され、血管内皮細胞上の血管内皮細胞成
長因子（ＶＥＧＦ）レセプタに高い親和性と特異性で結合する、ＶＥＧＦによっ
て活性化される。血管内皮細胞上のレセプタへのＶＥＧＦの結合によって活性化
されるもう１つの応答は、血漿第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合して血液凝固を開
始させる、膜内外レセプタである組織因子の発現である。結合ＶＥＧＦを持つ血
管内皮細胞だけが組織因子を発現するので、腫瘍血管系についての推定上の標的
は、血液中を循環する第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合するはずである、内皮細胞
上で発現される組織因子である。
【００１４】
本発明は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに複合した標的ドメインから成る免疫
複合体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と免疫系の補体経路による標的細胞へ
の細胞溶解応答を仲介するという所見に基づく（Ｗａｎｇ，Ｂ．ら（１９９９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１６２７−１６３２）
。正常組織中に存在する安定な血管ではなく、増殖する血管の内側表面で発現さ
れる細胞表面レセプタ組織因子と、その天然のリガンドである第ＶＩＩ因子との
間の結合は高い特異性と親和性を示すので（Ｈｕ，Ｚ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，８１６１−８１６６）、本発明
は、血管新生に関連する疾患の治療のための新しい免疫療法プロトコールを提供
する。組織因子は多くの型の腫瘍細胞によっても発現されるので（Ｃａｌｌａｎ
ｄｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ，７０，１１９４−１２０１）、
本発明はまた、癌の治療のための高い有効性を提供する。
複合体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と免疫系の補体経路による標的細胞へ
の細胞溶解応答を仲介するという所見に基づく（Ｗａｎｇ，Ｂ．ら（１９９９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１６２７−１６３２）
。正常組織中に存在する安定な血管ではなく、増殖する血管の内側表面で発現さ
れる細胞表面レセプタ組織因子と、その天然のリガンドである第ＶＩＩ因子との
間の結合は高い特異性と親和性を示すので（Ｈｕ，Ｚ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，８１６１−８１６６）、本発明
は、血管新生に関連する疾患の治療のための新しい免疫療法プロトコールを提供
する。組織因子は多くの型の腫瘍細胞によっても発現されるので（Ｃａｌｌａｎ
ｄｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ，７０，１１９４−１２０１）、
本発明はまた、癌の治療のための高い有効性を提供する。
【００１５】
しかし、組織因子への第ＶＩＩ因子免疫複合体の結合は血管内凝固の播種を引
き起こす可能性があるので、本発明の好ましい実施態様では、組織因子への親和
性に影響を及ぼさずに凝固を抑制する第ＶＩＩ因子突然変異体を使用する。組織
因子に結合するが血液凝固を開始させないこれらの免疫複合体は、組織因子への
結合に関して内因性第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と競合する。この競合は免疫複合体
を強く支持する（Ｈｕら、前出）。免疫複合体は２つの第ＶＩＩ因子標的ドメイ
ン（図１）を含み、単量体の内因性第ＶＩＩ因子分子が欠乏したアビディティ（
結合活性）効果を与えるからである。多くの好ましい実施態様では、第ＶＩＩ因
子が組織因子に結合したときに血液凝固プロセスを開始させる蛋白分解活性を遮
断するため、ヒト第ＶＩＩ因子の活性部位を、Ｌｙｓ−３４１及び／又はＳｅｒ
−３４４をアラニンで置換する部位特定突然変異誘発によって突然変異させる。
標的ドメインとエフェクタードメインのどちらもヒトソースから誘導できるので
、ヒト患者における重要な免疫拒絶反応は最小限に抑えられる。
き起こす可能性があるので、本発明の好ましい実施態様では、組織因子への親和
性に影響を及ぼさずに凝固を抑制する第ＶＩＩ因子突然変異体を使用する。組織
因子に結合するが血液凝固を開始させないこれらの免疫複合体は、組織因子への
結合に関して内因性第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と競合する。この競合は免疫複合体
を強く支持する（Ｈｕら、前出）。免疫複合体は２つの第ＶＩＩ因子標的ドメイ
ン（図１）を含み、単量体の内因性第ＶＩＩ因子分子が欠乏したアビディティ（
結合活性）効果を与えるからである。多くの好ましい実施態様では、第ＶＩＩ因
子が組織因子に結合したときに血液凝固プロセスを開始させる蛋白分解活性を遮
断するため、ヒト第ＶＩＩ因子の活性部位を、Ｌｙｓ−３４１及び／又はＳｅｒ
−３４４をアラニンで置換する部位特定突然変異誘発によって突然変異させる。
標的ドメインとエフェクタードメインのどちらもヒトソースから誘導できるので
、ヒト患者における重要な免疫拒絶反応は最小限に抑えられる。
【００１６】
本発明の一般的な実施においては、図１に示すような免疫複合体を、各々が標
的ドメインに複合したエフェクタードメインを持つ、２本の鎖を含む蛋白質二量
体として構築する。それらが、免疫複合体と結合したときその標的に対して細胞
傷害性を示すかぎり、いくつかのタイプのエフェクタードメインが使用できる。
本発明の多くの典型的な免疫複合体蛋白質は、エフェクタードメインとして、Ｉ
ｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を持つ。ここで使用するとき、これは、Ｆｃ領
域と同じ生物学的機能を示す変異体及びトランケートバージョンを含む。他の実
施態様では、エフェクタードメインは、放射性標識又は光活性化色素分子、例え
ばレーザー光線によって活性化される色素のような細胞傷害性物質でありうる。
エフェクタードメインは、上述したように組織因子に結合するが血液凝固を開始
させない、突然変異形態の第ＶＩＩ因子を含む標的ドメインに複合される。
的ドメインに複合したエフェクタードメインを持つ、２本の鎖を含む蛋白質二量
体として構築する。それらが、免疫複合体と結合したときその標的に対して細胞
傷害性を示すかぎり、いくつかのタイプのエフェクタードメインが使用できる。
本発明の多くの典型的な免疫複合体蛋白質は、エフェクタードメインとして、Ｉ
ｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を持つ。ここで使用するとき、これは、Ｆｃ領
域と同じ生物学的機能を示す変異体及びトランケートバージョンを含む。他の実
施態様では、エフェクタードメインは、放射性標識又は光活性化色素分子、例え
ばレーザー光線によって活性化される色素のような細胞傷害性物質でありうる。
エフェクタードメインは、上述したように組織因子に結合するが血液凝固を開始
させない、突然変異形態の第ＶＩＩ因子を含む標的ドメインに複合される。
【００１７】
本発明の免疫複合体蛋白質は、癌、慢性関節リウマチ、滲出性（「湿性」）形
態の黄斑変性、又はアテローム性動脈硬化症のような血管新生に関連する疾患を
有する患者に投与される。投与は、治療に関わる病的状態のタイプに依存して、
局所又は全身的でありうる。ここで使用するとき、「患者」の語はヒトあるいは
他の種の両方を含む；本発明はそれ故、医学適用と獣医学適用の両方を持つ。獣
医学的組成物及び治療においては、対応する種から誘導される標的及びエフェク
タードメインを用いて免疫複合体を構築する。
態の黄斑変性、又はアテローム性動脈硬化症のような血管新生に関連する疾患を
有する患者に投与される。投与は、治療に関わる病的状態のタイプに依存して、
局所又は全身的でありうる。ここで使用するとき、「患者」の語はヒトあるいは
他の種の両方を含む；本発明はそれ故、医学適用と獣医学適用の両方を持つ。獣
医学的組成物及び治療においては、対応する種から誘導される標的及びエフェク
タードメインを用いて免疫複合体を構築する。
【００１８】
投与は、例えば、精製免疫複合体又は複製欠損アデノウイルスベクター、ある
いは分泌形態の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う他のウイルスベクター
の静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、滑液包内、眼内、プラーク内、又は皮内注入
のような、当該技術において既知の何らかの方法を通して実施しうる。他の投与
経路は、液体等の非経口投与でありうる。好ましい実施態様では、１つ又はそれ
以上の免疫複合体蛋白質の静脈内又は腫瘍内注入、又は他の部位での注入によっ
て、あるいは分泌形態の１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化す
るｃＤＮＡを担う１つ又はそれ以上の発現ベクターの静脈内又は腫瘍内注入、又
は他の部位での注入によって患者を治療する。一部の実施態様では、分泌形態の
１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化するｃＤＮＡを担う１つ又
はそれ以上の複製欠損アデノウイルスベクター、あるいは１つ又はそれ以上のア
デノ関連ウイルスベクターの有効量の静脈内又は腫瘍内注入によって患者を治療
する。複製欠損アデノウイルスベクターを用いる方法を下記で説明する。多くの
典型的な実施態様は、分泌形態の免疫複合体をコード化するベクターの有効量の
腫瘍内及び／又は筋肉内注入を含む。癌のためにベクターを用いる場合、ベクタ
ーの腫瘍内注入は、ベクターが主として注入した腫瘍の細胞に感染するため、静
脈内注入に比べて重要な安全上の恩恵を提供する。
いは分泌形態の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う他のウイルスベクター
の静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、滑液包内、眼内、プラーク内、又は皮内注入
のような、当該技術において既知の何らかの方法を通して実施しうる。他の投与
経路は、液体等の非経口投与でありうる。好ましい実施態様では、１つ又はそれ
以上の免疫複合体蛋白質の静脈内又は腫瘍内注入、又は他の部位での注入によっ
て、あるいは分泌形態の１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化す
るｃＤＮＡを担う１つ又はそれ以上の発現ベクターの静脈内又は腫瘍内注入、又
は他の部位での注入によって患者を治療する。一部の実施態様では、分泌形態の
１つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質をコード化するｃＤＮＡを担う１つ又
はそれ以上の複製欠損アデノウイルスベクター、あるいは１つ又はそれ以上のア
デノ関連ウイルスベクターの有効量の静脈内又は腫瘍内注入によって患者を治療
する。複製欠損アデノウイルスベクターを用いる方法を下記で説明する。多くの
典型的な実施態様は、分泌形態の免疫複合体をコード化するベクターの有効量の
腫瘍内及び／又は筋肉内注入を含む。癌のためにベクターを用いる場合、ベクタ
ーの腫瘍内注入は、ベクターが主として注入した腫瘍の細胞に感染するため、静
脈内注入に比べて重要な安全上の恩恵を提供する。
【００１９】
免疫複合体蛋白質の注入を含む投与は、免疫複合体蛋白質又は蛋白質の組合せ
が製薬上許容される担体に分散又は可溶化されている組成物を用いる。一部の場
合には、各々のベクターが分泌形態の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う
、発現ベクターｐＭＫ３３／ヒグロマイシンでトランスフェクションしたショウ
ジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ）Ｓ２細胞において、又は発現ベクターｐｃＤ
ＮＡ３．１でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞において、又はバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系におい
て、免疫複合体を合成する。
が製薬上許容される担体に分散又は可溶化されている組成物を用いる。一部の場
合には、各々のベクターが分泌形態の免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担う
、発現ベクターｐＭＫ３３／ヒグロマイシンでトランスフェクションしたショウ
ジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ）Ｓ２細胞において、又は発現ベクターｐｃＤ
ＮＡ３．１でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞において、又はバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系におい
て、免疫複合体を合成する。
【００２０】
治療処置を生じさせるために必要な免疫複合体の量は、それ自体では固定され
ておらず、必然的に、製薬担体と共に投与される組成物中の成分の濃度、下記で
詳述する免疫系応答を増強する投与組成物中の補助化合物、そして治療する患者
の年齢、体重及び臨床状態に依存する。好ましい組成物は、患者に対して許容さ
れない毒性を生じることなく有効量の免疫複合体を供給送達する。本発明の製薬
組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、安定剤、防腐剤、分散剤、及び対
象とする製剤の種類を考慮した当該技術において常套的な他の物質も含みうる。
ておらず、必然的に、製薬担体と共に投与される組成物中の成分の濃度、下記で
詳述する免疫系応答を増強する投与組成物中の補助化合物、そして治療する患者
の年齢、体重及び臨床状態に依存する。好ましい組成物は、患者に対して許容さ
れない毒性を生じることなく有効量の免疫複合体を供給送達する。本発明の製薬
組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、安定剤、防腐剤、分散剤、及び対
象とする製剤の種類を考慮した当該技術において常套的な他の物質も含みうる。
【００２１】
癌に適用するときには、本発明は、ヒト腫瘍細胞又は腫瘍血管系内皮細胞、又
はその両方を特異的に標的する標的ドメインと、標的細胞に対する細胞溶解性免
疫応答又は細胞傷害作用を活性化するエフェクタードメインを持つ免疫複合体を
使用する。上述したように、、血液凝固を開始させない突然変異体ヒト第ＶＩＩ
因子に複合した、ヒンジを含めたＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域をエフェク
タードメインとして持つ免疫複合体は、それらが腫瘍血管系と腫瘍細胞の両方で
発現される組織因子を標的するので、多くの癌の治療において特に有効である。
一部の実施態様では、癌患者の末梢血リンパ球から誘導されるｓｃＦｖ又はＶＨ 融合ファージライブラリーをこれまでに記述されている腫瘍細胞に対してパニン
グすることによって単離される（Ｃａｉ，ＸとＧａｒｅｎ，Ａ．（１９９７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，９２６１−９２６６）、
抗ヒト腫瘍細胞ｓｃＦｖ又はＶＨ抗体断片を標的ドメインとして持つ免疫複合体
のような、腫瘍を選択的に標的するもう１つのクラスの免疫複合体を患者に投与
することによって治療効果をさらに高めることができる。上述したように同時に
又は連続的に投与される免疫複合体の組合せは、標的細胞の細胞溶解を増強する
共力作用が認められる場合に特に有益である。
はその両方を特異的に標的する標的ドメインと、標的細胞に対する細胞溶解性免
疫応答又は細胞傷害作用を活性化するエフェクタードメインを持つ免疫複合体を
使用する。上述したように、、血液凝固を開始させない突然変異体ヒト第ＶＩＩ
因子に複合した、ヒンジを含めたＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域をエフェク
タードメインとして持つ免疫複合体は、それらが腫瘍血管系と腫瘍細胞の両方で
発現される組織因子を標的するので、多くの癌の治療において特に有効である。
一部の実施態様では、癌患者の末梢血リンパ球から誘導されるｓｃＦｖ又はＶＨ 融合ファージライブラリーをこれまでに記述されている腫瘍細胞に対してパニン
グすることによって単離される（Ｃａｉ，ＸとＧａｒｅｎ，Ａ．（１９９７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，９２６１−９２６６）、
抗ヒト腫瘍細胞ｓｃＦｖ又はＶＨ抗体断片を標的ドメインとして持つ免疫複合体
のような、腫瘍を選択的に標的するもう１つのクラスの免疫複合体を患者に投与
することによって治療効果をさらに高めることができる。上述したように同時に
又は連続的に投与される免疫複合体の組合せは、標的細胞の細胞溶解を増強する
共力作用が認められる場合に特に有益である。
【００２２】
癌の治療においては、様々な癌、特に黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣
癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭部及び頚部の癌、膵癌、膀胱癌、及び肺癌を含め
た原発又は転移性固体腫瘍を治療するために抗腫瘍性免疫複合体が使用される。
免疫複合体は腫瘍血管系、特に血管内皮細胞、及び／又は腫瘍細胞を標的するた
めに使用しうる。腫瘍血管系は、次のような、免疫療法のためのいくつかの利点
を提供する。（ｉ）組織因子を含めた血管標的のいくつかはすべての腫瘍につい
て同じではずである。（ｉｉ）血管系に標的される免疫複合体は、それらの標的
に達するために腫瘍塊に浸潤する必要がない。（ｉｉｉ）各々の血管は、その生
存が血管の機能的完全性に依存する数多くの腫瘍細胞を養っているので、腫瘍血
管系を標的することは治療応答の増幅を生じるはずである。（ｉｖ）血管系は免
疫複合体に対する耐性を発現しにくいと考えられる。それには血管の内側にある
内皮細胞層全体の変化を必要とするからである。新しい血管の増殖を阻害する、
これまでに記述された抗血管形成法と異なって、本発明の免疫複合体は新生血管
系に対する細胞溶解応答を誘発する。
癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭部及び頚部の癌、膵癌、膀胱癌、及び肺癌を含め
た原発又は転移性固体腫瘍を治療するために抗腫瘍性免疫複合体が使用される。
免疫複合体は腫瘍血管系、特に血管内皮細胞、及び／又は腫瘍細胞を標的するた
めに使用しうる。腫瘍血管系は、次のような、免疫療法のためのいくつかの利点
を提供する。（ｉ）組織因子を含めた血管標的のいくつかはすべての腫瘍につい
て同じではずである。（ｉｉ）血管系に標的される免疫複合体は、それらの標的
に達するために腫瘍塊に浸潤する必要がない。（ｉｉｉ）各々の血管は、その生
存が血管の機能的完全性に依存する数多くの腫瘍細胞を養っているので、腫瘍血
管系を標的することは治療応答の増幅を生じるはずである。（ｉｖ）血管系は免
疫複合体に対する耐性を発現しにくいと考えられる。それには血管の内側にある
内皮細胞層全体の変化を必要とするからである。新しい血管の増殖を阻害する、
これまでに記述された抗血管形成法と異なって、本発明の免疫複合体は新生血管
系に対する細胞溶解応答を誘発する。
【００２３】
本発明の免疫複合体はまた、慢性関節リウマチ、滲出性（「湿性」）形態の黄
斑変性、アテローム性動脈硬化症、及び血管新生に関連する他の疾患を治療する
ためにも有効でありうる。ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインに複合した、
突然変異ヒト第ＶＩＩ因子によって組織因子に標的される免疫複合体を投与する
ことは、慢性関節リウマチにおいて滑膜に侵襲し、組織因子を発現する血管内皮
細胞に対して、細胞溶解性免疫応答をもたらしうる。同様に、第ＶＩＩ因子免疫
複合体はまた、滲出性（「湿性」）形態の黄斑変性を治療するためにも有効であ
りうる。この標的状態においても広汎な血管新生が認められるからである。本発
明の免疫複合体はまた、プラークにおいて組織因子を発現する細胞に対して細胞
溶解性免疫応答を生じさせることにより、アテローム性動脈硬化症の治療のため
にも有効でありうる。
斑変性、アテローム性動脈硬化症、及び血管新生に関連する他の疾患を治療する
ためにも有効でありうる。ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインに複合した、
突然変異ヒト第ＶＩＩ因子によって組織因子に標的される免疫複合体を投与する
ことは、慢性関節リウマチにおいて滑膜に侵襲し、組織因子を発現する血管内皮
細胞に対して、細胞溶解性免疫応答をもたらしうる。同様に、第ＶＩＩ因子免疫
複合体はまた、滲出性（「湿性」）形態の黄斑変性を治療するためにも有効であ
りうる。この標的状態においても広汎な血管新生が認められるからである。本発
明の免疫複合体はまた、プラークにおいて組織因子を発現する細胞に対して細胞
溶解性免疫応答を生じさせることにより、アテローム性動脈硬化症の治療のため
にも有効でありうる。
【００２４】
要約すると、本発明に従った全体的な免疫療法プログラムは、血液凝固を引き
起こすことなく、新生血管内皮細胞及び腫瘍細胞で発現される組織因子に高いア
ビディティと特異性で結合する、突然変異した活性部位を持つ第ＶＩＩ因子を標
的ドメインとして含む免疫複合体を構築することを含む。ＩｇＧ１免疫グロブリ
ンのＦｃ領域をエフェクタードメインとして含む免疫複合体は、ＮＫ細胞と補体
によって標的細胞の溶解を仲介し、新生血管系の破壊をもたらす。本発明の重要
な利点は、内因性第ＶＩＩ因子単量体分子と異なって、２つの第ＶＩＩ因子標的
ドメインを含む免疫複合体が、組織因子を発現する細胞に対して外因性第ＶＩＩ
因子よりも有意に強い結合を示し、過剰の天然リガンドの存在下で成功裡に競合
するという事実である。下記の実施例２は、少なくとも約１０倍モル過剰の天然
リガンドの存在下で成功裡に競合した免疫複合体を例示しているが、本発明はよ
り低い又はより高い親和性を示す他の実施態様を包含する。組織因子に対する外
因性第ＶＩＩ因子の結合は既知の最も特異的且つ強力な反応の１つであり、ピコ
モル範囲のＫｄを示す。それにもかかわらず、本発明は、１個の免疫複合体分子
中に２つの第ＶＩＩ因子配列を持つというアビディティ作用の結果として、組織
因子への第ＶＩＩ因子の通常の結合を有意に改善する。このアビディティ作用は
本発明の免疫複合体の標的と結合を増強するので、それらは外因性第ＶＩＩ因子
と有効に競合し、結合がより長く持続されるため、誘発される免疫応答が増強さ
れる。新生血管系及び／又は、癌の場合には患者の型の腫瘍細胞に結合するｓｃ
Ｆｖ又はＶＨ抗体断片である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンの
Ｆｃ領域であるエフェクタードメインを持つもう１つの免疫複合体を、補助療法
として患者に投与することによってさらに最大化されうる。
起こすことなく、新生血管内皮細胞及び腫瘍細胞で発現される組織因子に高いア
ビディティと特異性で結合する、突然変異した活性部位を持つ第ＶＩＩ因子を標
的ドメインとして含む免疫複合体を構築することを含む。ＩｇＧ１免疫グロブリ
ンのＦｃ領域をエフェクタードメインとして含む免疫複合体は、ＮＫ細胞と補体
によって標的細胞の溶解を仲介し、新生血管系の破壊をもたらす。本発明の重要
な利点は、内因性第ＶＩＩ因子単量体分子と異なって、２つの第ＶＩＩ因子標的
ドメインを含む免疫複合体が、組織因子を発現する細胞に対して外因性第ＶＩＩ
因子よりも有意に強い結合を示し、過剰の天然リガンドの存在下で成功裡に競合
するという事実である。下記の実施例２は、少なくとも約１０倍モル過剰の天然
リガンドの存在下で成功裡に競合した免疫複合体を例示しているが、本発明はよ
り低い又はより高い親和性を示す他の実施態様を包含する。組織因子に対する外
因性第ＶＩＩ因子の結合は既知の最も特異的且つ強力な反応の１つであり、ピコ
モル範囲のＫｄを示す。それにもかかわらず、本発明は、１個の免疫複合体分子
中に２つの第ＶＩＩ因子配列を持つというアビディティ作用の結果として、組織
因子への第ＶＩＩ因子の通常の結合を有意に改善する。このアビディティ作用は
本発明の免疫複合体の標的と結合を増強するので、それらは外因性第ＶＩＩ因子
と有効に競合し、結合がより長く持続されるため、誘発される免疫応答が増強さ
れる。新生血管系及び／又は、癌の場合には患者の型の腫瘍細胞に結合するｓｃ
Ｆｖ又はＶＨ抗体断片である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンの
Ｆｃ領域であるエフェクタードメインを持つもう１つの免疫複合体を、補助療法
として患者に投与することによってさらに最大化されうる。
【００２５】
ここで示す実施例は本発明をさらに例示し、説明するものであり、いかなる意
味においても限定と解釈されるべきではない。本発明の免疫複合体及び成分モノ
クローナル抗体を生成し、特徴づけるために使用する方法の一部は、Ｃａｉ，Ｘ
．とＧａｒｅｎ，Ａ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９２，６５３７−６５４１、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，６２８０−６２８５、及び上記で引用した１９９７年
の参考文献の中で、ＷＯ９７／０２４７９号として１９９７年１月２３日に公開
され、１９９８年４月２７日に提出され、２０００年４月２７日に承認された特
許願通し番号第０８／９８３，６０７号として現在米国で審理中である、Ｙａｌ
ｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙとＧａｒｅｎ及びＣａｉへのＰＣＴ／ＩＢ９６／０１
０３２号の中で、上記で引用したＷａｎｇらの中で、及び上記で引用したＨｕ，
Ｚ．らの中で記述されている。
味においても限定と解釈されるべきではない。本発明の免疫複合体及び成分モノ
クローナル抗体を生成し、特徴づけるために使用する方法の一部は、Ｃａｉ，Ｘ
．とＧａｒｅｎ，Ａ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９２，６５３７−６５４１、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，６２８０−６２８５、及び上記で引用した１９９７年
の参考文献の中で、ＷＯ９７／０２４７９号として１９９７年１月２３日に公開
され、１９９８年４月２７日に提出され、２０００年４月２７日に承認された特
許願通し番号第０８／９８３，６０７号として現在米国で審理中である、Ｙａｌ
ｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙとＧａｒｅｎ及びＣａｉへのＰＣＴ／ＩＢ９６／０１
０３２号の中で、上記で引用したＷａｎｇらの中で、及び上記で引用したＨｕ，
Ｚ．らの中で記述されている。
【００２６】
実施例１
ヒトＩｇＧ１のＦｃエフェクタードメインに複合したヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）標的ドメインを含む免疫複合体をこの実施例において合成し、試験する。最
初に、ワクチン接種した黒色腫患者の抗体リストから誘導した、ｓｃＦｖ融合フ
ァージライブラリーからの黒色腫特異的クローンとしてｓｃＦｖ標的ドメインを
単離した（上記で引用したＣａｉとＧａｒｅｎの参考文献の中で詳細に述べられ
ている）。精製免疫複合体は融合ファージクローンと同様の結合特異性を示した
：ヒト黒色腫に対しては結合が起こったが、ヒトメラノサイトあるいは他のいく
つかの型の正常細胞及び腫瘍細胞に対しては結合が生じなかった。
ｖ）標的ドメインを含む免疫複合体をこの実施例において合成し、試験する。最
初に、ワクチン接種した黒色腫患者の抗体リストから誘導した、ｓｃＦｖ融合フ
ァージライブラリーからの黒色腫特異的クローンとしてｓｃＦｖ標的ドメインを
単離した（上記で引用したＣａｉとＧａｒｅｎの参考文献の中で詳細に述べられ
ている）。精製免疫複合体は融合ファージクローンと同様の結合特異性を示した
：ヒト黒色腫に対しては結合が起こったが、ヒトメラノサイトあるいは他のいく
つかの型の正常細胞及び腫瘍細胞に対しては結合が生じなかった。
【００２７】
試験材料及び方法
細胞培養
永久ヒト黒色腫細胞系統Ａ２０５８（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及びＴＦ２をＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。ヒト微小血管内皮細胞と線維芽細胞の一次
培養を新生児***から吸い出し、８％ＦＢＳと２％ヒト周産期血清を補足したＲ
ＰＭＩ培地中で培養した；内皮細胞には３３ｍＭ ３−イソブチル−１−メチル
キサンテン（ＩＢＭＸ）と０．５ｍＭジブチリルｃＡＭＰをさらに補足した。新
生児***からのヒトメラノサイトの一次培養はＳｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈ
ｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって調製された。形質転換ヒト腎細胞２９
３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。（ｖ）ショウジョウバエ細
胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２）をＥｘ−ｃｅｌｌ ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１０％ＦＢＳ中２５℃で増殖させた。静止ＮＫ細胞をロ
イコホレシスと免疫的選択によって健常ドナーから単離し、単離後１８時間以内
に使用した；細胞の大部分（＞９７％）がＣＤ３−、ＣＤ５６＋及びＣＤ１６＋
であった。
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及びＴＦ２をＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。ヒト微小血管内皮細胞と線維芽細胞の一次
培養を新生児***から吸い出し、８％ＦＢＳと２％ヒト周産期血清を補足したＲ
ＰＭＩ培地中で培養した；内皮細胞には３３ｍＭ ３−イソブチル−１−メチル
キサンテン（ＩＢＭＸ）と０．５ｍＭジブチリルｃＡＭＰをさらに補足した。新
生児***からのヒトメラノサイトの一次培養はＳｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈ
ｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって調製された。形質転換ヒト腎細胞２９
３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。（ｖ）ショウジョウバエ細
胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２）をＥｘ−ｃｅｌｌ ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１０％ＦＢＳ中２５℃で増殖させた。静止ＮＫ細胞をロ
イコホレシスと免疫的選択によって健常ドナーから単離し、単離後１８時間以内
に使用した；細胞の大部分（＞９７％）がＣＤ３−、ＣＤ５６＋及びＣＤ１６＋
であった。
【００２８】
免疫複合体の調製
手順は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＣＨＯ細
胞へのトランスフェクション、又は発現ベクターｐＭＫ３３／ｐＭｔＨｙのショ
ウジョウバエ細胞へのトランスフェクションを含んだ；各々のベクターは分泌さ
れた免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担っていた（図１）。ｓｃＦｖ標的ド
メインについてのｃＤＮＡを、対応する融合ファージ（１）から次のようなＳａ
ｃＩ又はＢａｍＨＩ部位を含むＰＣＲプライマーを使用して合成した：ａ）ＧＴ
ＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧ
ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣ（配列番号：１）；ｂ）ＡＣＧ
ＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ
（配列番号：２）。ヒトＦｃエフェクタードメインは、次のようなＢａｍＨＩ又
はＳａｌＩ部位を含むＰＣＲプライマーを使用して、ヒト末梢血リンパ球から誘
導したｃＤＮＡライブラリーから合成した：ａ）ＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣ
ＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ（配列番号：
３）；ｂ）ＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧ
ＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧ（配列番号：４）。ＩｇＧ１リーダー
についてのｃＤＮＡを、次のようなＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ末端を含む２個の相
補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって合成した：ａ）ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴ
ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴ（配列番号：５
）；ｂ）ＣＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡ
ＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧ（配列番号：６）。
胞へのトランスフェクション、又は発現ベクターｐＭＫ３３／ｐＭｔＨｙのショ
ウジョウバエ細胞へのトランスフェクションを含んだ；各々のベクターは分泌さ
れた免疫複合体をコード化するｃＤＮＡを担っていた（図１）。ｓｃＦｖ標的ド
メインについてのｃＤＮＡを、対応する融合ファージ（１）から次のようなＳａ
ｃＩ又はＢａｍＨＩ部位を含むＰＣＲプライマーを使用して合成した：ａ）ＧＴ
ＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧ
ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣ（配列番号：１）；ｂ）ＡＣＧ
ＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ
（配列番号：２）。ヒトＦｃエフェクタードメインは、次のようなＢａｍＨＩ又
はＳａｌＩ部位を含むＰＣＲプライマーを使用して、ヒト末梢血リンパ球から誘
導したｃＤＮＡライブラリーから合成した：ａ）ＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣ
ＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ（配列番号：
３）；ｂ）ＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧ
ＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧ（配列番号：４）。ＩｇＧ１リーダー
についてのｃＤＮＡを、次のようなＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ末端を含む２個の相
補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって合成した：ａ）ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴ
ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴ（配列番号：５
）；ｂ）ＣＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡ
ＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧ（配列番号：６）。
【００２９】
分泌免疫複合体をコード化するこれら３つのｃＤＮＡを、最初に配列決定のた
めにクローニングベクターにライゲートし、次にＣＨＯ又はショウジョウバエＳ
２細胞へのトランスフェクションのために発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１及びｐ
ＭＫ３３／ｐＭｔＨｙにそれぞれライゲートした。ＣＨＯ細胞についてのトラン
スフェクション手順は、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させ、Ｓｕｐｅ
ｒｆｅｃｔＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて発現ベクター５μｇで形質移入するこ
とを含んだ。安定なトランスフェクタントをＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋Ｇ４１８
１ｍｇ／ｍｌ中で選択した。蛋白質の発現のために、トランスフェクションし
たＣＨＯ細胞を最初にＣＨＯ血清不含培地（Ｓｉｇｍａ）中での増殖に順応させ
、その後無血清培地中で懸濁液培養（２×１０５細胞／ｍｌ）として３日間増殖
させた。ショウジョウバエＳ２細胞についてのトランスフェクション手順は、Ｅ
ｘ−ｃｅｌｌ培地＋１０％ＦＢＳ中で細胞を増殖させ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて発現ベクター１０μｇで形質移入することを
含んだ。安定なトランスフェクタントをＥｘ−ｃｅｌｌ培地＋１０％ＦＢＳ＋ヒ
グロマイシン３００μｇ／ｍｌ中で選択し、無血清Ｅｘ−ｃｅｌｌ培地中懸濁液
培養としての増殖に順応させた。硫酸銅５００μＭを加えて、懸濁液培養におい
てコード化された免疫複合体の発現を誘導した。
めにクローニングベクターにライゲートし、次にＣＨＯ又はショウジョウバエＳ
２細胞へのトランスフェクションのために発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１及びｐ
ＭＫ３３／ｐＭｔＨｙにそれぞれライゲートした。ＣＨＯ細胞についてのトラン
スフェクション手順は、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させ、Ｓｕｐｅ
ｒｆｅｃｔＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて発現ベクター５μｇで形質移入するこ
とを含んだ。安定なトランスフェクタントをＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋Ｇ４１８
１ｍｇ／ｍｌ中で選択した。蛋白質の発現のために、トランスフェクションし
たＣＨＯ細胞を最初にＣＨＯ血清不含培地（Ｓｉｇｍａ）中での増殖に順応させ
、その後無血清培地中で懸濁液培養（２×１０５細胞／ｍｌ）として３日間増殖
させた。ショウジョウバエＳ２細胞についてのトランスフェクション手順は、Ｅ
ｘ−ｃｅｌｌ培地＋１０％ＦＢＳ中で細胞を増殖させ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて発現ベクター１０μｇで形質移入することを
含んだ。安定なトランスフェクタントをＥｘ−ｃｅｌｌ培地＋１０％ＦＢＳ＋ヒ
グロマイシン３００μｇ／ｍｌ中で選択し、無血清Ｅｘ−ｃｅｌｌ培地中懸濁液
培養としての増殖に順応させた。硫酸銅５００μＭを加えて、懸濁液培養におい
てコード化された免疫複合体の発現を誘導した。
【００３０】
トランスフェクションしたＣＨＯ又はショウジョウバエＳ２細胞によって分泌
された免疫複合体を、プロテインＡマトリックス（Ｐｉｅｒｃｅ）上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。
された免疫複合体を、プロテインＡマトリックス（Ｐｉｅｒｃｅ）上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。
【００３１】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定した免疫複合体の結合特異性
黒色腫細胞と対照細胞を非酵素的解離培地（Ｓｉｇｍａ）において採集し、Ｐ
ＢＳ／ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウムで洗って、免疫複合体（１μｇ／ｍｌ
）を加えたＰＢＳ／ＢＳＡ中で、又は対照として免疫複合体なしのＰＢＳ／ＢＳ
Ａ中でインキュベートした。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗い、蛍光標識抗ヒトＦｃ
γ鎖（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に４℃で３０分間インキュベートして、Ｂｅｃｔｏｎ
−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ＦＡＣｓｏｒｔ装置で分析した。
ＢＳ／ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウムで洗って、免疫複合体（１μｇ／ｍｌ
）を加えたＰＢＳ／ＢＳＡ中で、又は対照として免疫複合体なしのＰＢＳ／ＢＳ
Ａ中でインキュベートした。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗い、蛍光標識抗ヒトＦｃ
γ鎖（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に４℃で３０分間インキュベートして、Ｂｅｃｔｏｎ
−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ＦＡＣｓｏｒｔ装置で分析した。
【００３２】
免疫複合体による黒色腫細胞抽出物の免疫沈降反応
ヒト黒色腫細胞Ａ２０５８系統からの約１×１０７細胞のサンプルを、ＰＢＳ
中免疫複合体１０μｇ／ｍｌ、１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含
む溶液に懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い
、ＰＢＳ中１％ＮＰ−４０、免疫複合体１μｇ／ｍｌ及びＰＭＳＦ ０．２ｍＭ
を含む溶液に溶解した。溶解産物をマイクロヒュージにおいて１３，０００ＲＰ
Ｍで５分間遠心し、上清を回収して、回転装置でひと晩プロテイン−Ｇビーズと
共にインキュベートした。ビーズを採集し、ＰＢＳ中１％ＮＰ−４０を含む溶液
で２回、ＰＢＳで１回洗って、ビーズを採集し、ＰＡＧＥを負荷した緩衝液中で
煮沸して、ＰＡＧＥによって分析した。
中免疫複合体１０μｇ／ｍｌ、１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含
む溶液に懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い
、ＰＢＳ中１％ＮＰ−４０、免疫複合体１μｇ／ｍｌ及びＰＭＳＦ ０．２ｍＭ
を含む溶液に溶解した。溶解産物をマイクロヒュージにおいて１３，０００ＲＰ
Ｍで５分間遠心し、上清を回収して、回転装置でひと晩プロテイン−Ｇビーズと
共にインキュベートした。ビーズを採集し、ＰＢＳ中１％ＮＰ−４０を含む溶液
で２回、ＰＢＳで１回洗って、ビーズを採集し、ＰＡＧＥを負荷した緩衝液中で
煮沸して、ＰＡＧＥによって分析した。
【００３３】
マトリックス援用レーザー脱着イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び液
体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）蛋白質同定 クマシーブルーで染色した蛋白質バンドをゲルから切り出して、ｈｔｔｐ：／
／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｃｋ／ｇｅｌｄｉｇ３．ｈｔ
ｍに述べられているようにトリプシンで消化した。トリプシン消化物のサンプル
をＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＴｏｆＳｐｅｃＳＥでのＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析
した。ペプチド質量検索に必要な高レベルの精度を達成するために、１０６０．
５７のプロトン化モノ同位体質量を持つブラジキニン１００ｆｍｏｌ、及び２４
６５．２のプロトン化モノ同位体質量を持つＡＣＴＨクリップを内部標準として
使用した。生じたトリプシンペプチドのモノ同位体質量を、０．２ダルトンのマ
ストレランスを用いてＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムによりＯＷＬデータベースに
対して、及び０．０１５％のマストレランスを用いてＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃ
ｈプログラムによりＥＭＢＬ／非重複データベースに対して検索した。検索に使
用した他の重要な判定基準は、１４０−５６０Ｋｄａにわたる質量範囲、最大限
１つの開裂ミス、そしてタキソノミー（分類学）に関しては制限なしとした。蛋
白質化学及び質量分析試験はすべてＹａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷ．Ｍ．
Ｋｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ＆ ＨＨＭＩ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙにおいて実施した。ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌ
ｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｋｃ／でさらなる情報が入手できる。
体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）蛋白質同定 クマシーブルーで染色した蛋白質バンドをゲルから切り出して、ｈｔｔｐ：／
／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｃｋ／ｇｅｌｄｉｇ３．ｈｔ
ｍに述べられているようにトリプシンで消化した。トリプシン消化物のサンプル
をＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＴｏｆＳｐｅｃＳＥでのＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析
した。ペプチド質量検索に必要な高レベルの精度を達成するために、１０６０．
５７のプロトン化モノ同位体質量を持つブラジキニン１００ｆｍｏｌ、及び２４
６５．２のプロトン化モノ同位体質量を持つＡＣＴＨクリップを内部標準として
使用した。生じたトリプシンペプチドのモノ同位体質量を、０．２ダルトンのマ
ストレランスを用いてＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムによりＯＷＬデータベースに
対して、及び０．０１５％のマストレランスを用いてＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃ
ｈプログラムによりＥＭＢＬ／非重複データベースに対して検索した。検索に使
用した他の重要な判定基準は、１４０−５６０Ｋｄａにわたる質量範囲、最大限
１つの開裂ミス、そしてタキソノミー（分類学）に関しては制限なしとした。蛋
白質化学及び質量分析試験はすべてＹａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷ．Ｍ．
Ｋｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ＆ ＨＨＭＩ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙにおいて実施した。ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌ
ｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｋｃ／でさらなる情報が入手できる。
【００３４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に使用したトリプシン消化蛋白質バンドのサンプルを、
ＬＣＱイオントラップ質量分析計でも分析した。マストレランス２．０ダルトン
でのタンデム質量相関アルゴリズムを用いて、ＭＳ／ＭＳデータのＳｅｑｕｅｓ
ｔ検索を実施し、トリプシン消化物からのペプチドと、ＮＣＢＩ ｎｒデータベ
ースでの蛋白質についての再構築した理論上のスペクトルとの間に有意の類似性
が存在するかどうかを判定した。この手順についてのさらなる情報は、ｈｔｔｐ
：／／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｋｃ／ｐｒｏｃｈｅｍ．
ｈｔｍ＃ｍｓ／ｍｓｐｉで入手できる。
ＬＣＱイオントラップ質量分析計でも分析した。マストレランス２．０ダルトン
でのタンデム質量相関アルゴリズムを用いて、ＭＳ／ＭＳデータのＳｅｑｕｅｓ
ｔ検索を実施し、トリプシン消化物からのペプチドと、ＮＣＢＩ ｎｒデータベ
ースでの蛋白質についての再構築した理論上のスペクトルとの間に有意の類似性
が存在するかどうかを判定した。この手順についてのさらなる情報は、ｈｔｔｐ
：／／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｗｍｋｅｋｃ／ｐｒｏｃｈｅｍ．
ｈｔｍ＃ｍｓ／ｍｓｐｉで入手できる。
【００３５】
ＮＫ細胞及び補体によるヒト黒色腫細胞の免疫複合体依存性細胞溶解に関する
アッセイ カルセイン−ＡＭ保持手順を両方のアッセイに使用した。ヒト黒色腫細胞系統
又は一次ひと線維芽細胞のいずれかの標的細胞を非酵素的解離培地（Ｓｉｇｍａ
）中で培養フラスコから分離し、９６穴プレートに加えた（２×１０４細胞／穴
）。付着標的細胞をＰＢＳで１回洗い、その後免疫複合体（１μｇ／ｍｌ）を含
む又は対照として免疫複合体を含まない無血清培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中３
７℃で２０分間インキュベートした。次に標的細胞を無血清培地中３７℃で４０
分間、カルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｕ
ｇｅｎｅ，ＯＲ）７μＭで標識した。カルセイン−ＡＭは細胞に入り込む蛍光色
素であり、そこで酵素的に変化して、細胞が溶解するまで細胞内にとどまる。Ｎ
Ｋ細胞に関する細胞溶解アッセイについては、標識した標的細胞を、ＮＫ細胞対
標的細胞の指示されている比率を用いてヒトＮＫ細胞と共に３７℃で３〜４時間
インキュベートした。補体に関する細胞溶解アッセイについては、標識標的細胞
をヒト血清又は精製ウサギ補体成分（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に３７℃で１時間インキュベート
した。ＮＫ細胞又は補体とのインキュベーション後、標的細胞をＰＢＳで２回洗
い、残存する付着細胞中の蛍光（残留蛍光）をプレートリーダーで測定した。溶
解緩衝液（ホウ酸ナトリウム５０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐ
Ｈ９．０）により３７℃で３時間処理した後、標的細胞の残留蛍光を測定して、
標的細胞の達成可能な最大細胞溶解を判定した。ＮＫ細胞又は補体に接触しなか
った付着標的細胞の蛍光を測定して、最大残留蛍光を判定した。標的細胞の各サ
ンプルについての％細胞溶解を次のように算定した：（サンプル標的細胞の残留
蛍光−溶解標的細胞の残留蛍光）／（標的細胞の最大残留蛍光−溶解標的細胞の
残留蛍光）。
アッセイ カルセイン−ＡＭ保持手順を両方のアッセイに使用した。ヒト黒色腫細胞系統
又は一次ひと線維芽細胞のいずれかの標的細胞を非酵素的解離培地（Ｓｉｇｍａ
）中で培養フラスコから分離し、９６穴プレートに加えた（２×１０４細胞／穴
）。付着標的細胞をＰＢＳで１回洗い、その後免疫複合体（１μｇ／ｍｌ）を含
む又は対照として免疫複合体を含まない無血清培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中３
７℃で２０分間インキュベートした。次に標的細胞を無血清培地中３７℃で４０
分間、カルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｕ
ｇｅｎｅ，ＯＲ）７μＭで標識した。カルセイン−ＡＭは細胞に入り込む蛍光色
素であり、そこで酵素的に変化して、細胞が溶解するまで細胞内にとどまる。Ｎ
Ｋ細胞に関する細胞溶解アッセイについては、標識した標的細胞を、ＮＫ細胞対
標的細胞の指示されている比率を用いてヒトＮＫ細胞と共に３７℃で３〜４時間
インキュベートした。補体に関する細胞溶解アッセイについては、標識標的細胞
をヒト血清又は精製ウサギ補体成分（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に３７℃で１時間インキュベート
した。ＮＫ細胞又は補体とのインキュベーション後、標的細胞をＰＢＳで２回洗
い、残存する付着細胞中の蛍光（残留蛍光）をプレートリーダーで測定した。溶
解緩衝液（ホウ酸ナトリウム５０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐ
Ｈ９．０）により３７℃で３時間処理した後、標的細胞の残留蛍光を測定して、
標的細胞の達成可能な最大細胞溶解を判定した。ＮＫ細胞又は補体に接触しなか
った付着標的細胞の蛍光を測定して、最大残留蛍光を判定した。標的細胞の各サ
ンプルについての％細胞溶解を次のように算定した：（サンプル標的細胞の残留
蛍光−溶解標的細胞の残留蛍光）／（標的細胞の最大残留蛍光−溶解標的細胞の
残留蛍光）。
【００３６】
試験結果
抗黒色腫免疫複合体の合成と特性指摘
免疫複合体は、分泌についてのヒトＩｇＧ１リーダー、標的黒色腫細胞につい
てのヒトｓｃＦｖドメイン、及びヒトＩｇＧ１−Ｆｃエフェクタードメインをコ
ード化した（図１）。免疫複合体分子をトランスフェクションしたＣＨＯ及びシ
ョウジョウバエＳ２細胞において発現させ、Ｆｃドメインのヒンジ領域における
ジスルフィド架橋によって連結された二本鎖分子として培地から精製した（図１
）。各々が融合ファージクローンＥ２６−１又はＧ７１−１から誘導されたｓｃ
Ｆｖ標的ドメインを含む、２つの免疫複合体を合成した。免疫複合体Ｅ２６−１
及びＧ７１−１の結合特異性を、２つのヒト黒色腫細胞系統を用いた細胞選別（
ＦＡＣＳ）によって試験した；対照は、正常ヒトメラノサイト、線維芽細胞、微
小血管及び臍血管内皮細胞、及びヒト腎細胞系統２９３−ＥＢＮＡの一次培養で
あった。結果は、Ｅ２６−１及びＧ７１−１融合ファージクローンに関して得た
結果と一致して、免疫複合体は黒色腫細胞系統に強く結合するが、対照には結合
しないことを示した。黒色腫細胞への結合は、非酵素的解離培地（Ｓｉｇｍａ）
を使用して培養フラスコから細胞を採集したときに起こったが、解離培地がトリ
プシンを含むとき、又は解離した細胞をその後トリプシンで処理したときには結
合が起こらなかった。この所見は、免疫複合体についての同種黒色腫抗原が黒色
腫細胞の表面に位置することを示唆した。同じトリプシンへの接触が、細胞表面
分子ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣクラス−Ｉ及び組織因子に対する抗体の黒色腫細胞へ
の結合には影響を及ぼさなかったことから、上記抗原はトリプシンに対して例外
的に感受性であると思われる。
てのヒトｓｃＦｖドメイン、及びヒトＩｇＧ１−Ｆｃエフェクタードメインをコ
ード化した（図１）。免疫複合体分子をトランスフェクションしたＣＨＯ及びシ
ョウジョウバエＳ２細胞において発現させ、Ｆｃドメインのヒンジ領域における
ジスルフィド架橋によって連結された二本鎖分子として培地から精製した（図１
）。各々が融合ファージクローンＥ２６−１又はＧ７１−１から誘導されたｓｃ
Ｆｖ標的ドメインを含む、２つの免疫複合体を合成した。免疫複合体Ｅ２６−１
及びＧ７１−１の結合特異性を、２つのヒト黒色腫細胞系統を用いた細胞選別（
ＦＡＣＳ）によって試験した；対照は、正常ヒトメラノサイト、線維芽細胞、微
小血管及び臍血管内皮細胞、及びヒト腎細胞系統２９３−ＥＢＮＡの一次培養で
あった。結果は、Ｅ２６−１及びＧ７１−１融合ファージクローンに関して得た
結果と一致して、免疫複合体は黒色腫細胞系統に強く結合するが、対照には結合
しないことを示した。黒色腫細胞への結合は、非酵素的解離培地（Ｓｉｇｍａ）
を使用して培養フラスコから細胞を採集したときに起こったが、解離培地がトリ
プシンを含むとき、又は解離した細胞をその後トリプシンで処理したときには結
合が起こらなかった。この所見は、免疫複合体についての同種黒色腫抗原が黒色
腫細胞の表面に位置することを示唆した。同じトリプシンへの接触が、細胞表面
分子ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣクラス−Ｉ及び組織因子に対する抗体の黒色腫細胞へ
の結合には影響を及ぼさなかったことから、上記抗原はトリプシンに対して例外
的に感受性であると思われる。
【００３７】
免疫複合体についての同種黒色腫抗原の同定
ヒト黒色腫細胞系統Ａ２０５８からの培養細胞を免疫複合体Ｇ７１−１又はＥ
２６−１と平衡させ、細胞を界面活性剤で溶解した。溶解産物中の免疫複合体−
抗原複合体をプロテイン−Ｇビーズ上に採集し、ＰＡＧＥによって分析した。２
５０ｋｄａの見かけ分子量を持つ蛋白質バンドが黒色腫細胞において検出された
が、対照では検出されなかった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法による蛋白質バンドのトリ
プシン消化物を分析すると、対照ゲル切片の消化物には存在しなかった７５のペ
プチド塊が同定された。ＰｒｏＦｏｕｎｄによる蛋白質配列データベースの検索
は、ＭＣＳＰコア蛋白質中のペプチド塊と適合し、完全な蛋白質配列の２６％に
及ぶ５０のペプチド塊を生じた。この同定に関するＰｒｏＦｏｕｎｄの確率スコ
アは１．０であり、次に最も近いスコアは２．２Ｅ−６１であった。Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｓｅａｒｃｈによる検索では、４５のペプチドがＭＣＳＰコア蛋白質に適
合し、３８ペプチドがそれに続く最も近い適合であった。
２６−１と平衡させ、細胞を界面活性剤で溶解した。溶解産物中の免疫複合体−
抗原複合体をプロテイン−Ｇビーズ上に採集し、ＰＡＧＥによって分析した。２
５０ｋｄａの見かけ分子量を持つ蛋白質バンドが黒色腫細胞において検出された
が、対照では検出されなかった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法による蛋白質バンドのトリ
プシン消化物を分析すると、対照ゲル切片の消化物には存在しなかった７５のペ
プチド塊が同定された。ＰｒｏＦｏｕｎｄによる蛋白質配列データベースの検索
は、ＭＣＳＰコア蛋白質中のペプチド塊と適合し、完全な蛋白質配列の２６％に
及ぶ５０のペプチド塊を生じた。この同定に関するＰｒｏＦｏｕｎｄの確率スコ
アは１．０であり、次に最も近いスコアは２．２Ｅ−６１であった。Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｓｅａｒｃｈによる検索では、４５のペプチドがＭＣＳＰコア蛋白質に適
合し、３８ペプチドがそれに続く最も近い適合であった。
【００３８】
２５０ｋｄａ蛋白質のトリプシン消化物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によっても分析
した（Ｓｔｏｎｅ，Ｋ．Ｌ．ら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１９，１０４６−１０５２）。トリプシン消化物からのＭＳ／ＭＳデータのＳｅ
ｑｕｅｓｔ検索は、２個又はそれ以上のペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクト
ルと、ＮＣＢＩ ｎｒデータベースにおけるＭＣＳＰコア蛋白質からの２個又は
それ以上のペプチドについての再構築した理論上のＭＳ／ＭＳスペクトルの間で
有意の類似性を示した。
した（Ｓｔｏｎｅ，Ｋ．Ｌ．ら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１９，１０４６−１０５２）。トリプシン消化物からのＭＳ／ＭＳデータのＳｅ
ｑｕｅｓｔ検索は、２個又はそれ以上のペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクト
ルと、ＮＣＢＩ ｎｒデータベースにおけるＭＣＳＰコア蛋白質からの２個又は
それ以上のペプチドについての再構築した理論上のＭＳ／ＭＳスペクトルの間で
有意の類似性を示した。
【００３９】
２つの質量分析法の結果は、免疫複合体Ｇ７１−１及びＥ２６−１によって免
疫沈降した黒色腫蛋白質がＭＣＳＰコア蛋白質に適合することを示している。
疫沈降した黒色腫蛋白質がＭＣＳＰコア蛋白質に適合することを示している。
【００４０】
ＮＫ細胞及び補体によって仲介される黒色腫細胞の免疫複合体依存性細胞溶解
免疫系の細胞溶解経路の１つは、標的細胞に直接結合して、標的細胞の抗体依
存性溶解を引き起こすことができるＮＫ細胞を含む。ＮＫ細胞はまた、抗体のＦ
ｃエフェクタードメインに結合して、抗体の標的ドメインに結合する細胞の抗体
依存性溶解をもたらすことができる。この抗体依存性細胞を介する細胞溶解経路
（ＡＤＣＣ）は同時に、Ｆｃエフェクタードメインを含む免疫複合体の標的ドメ
インに結合する細胞の溶解も引き起こすはずである。免疫複合体Ｅ２６−１及び
Ｇ７１−１に依存するＡＤＣＣ応答を試験するため、黒色腫細胞と線維芽細胞を
蛍光色素カルセイン−ＡＭで標識し、標識細胞をヒトＮＫ細胞単独又はＮＫ細胞
と免疫複合体と共にインキュベートした。無傷のままで細胞中に保持された蛍光
色素の量を測定することによって細胞溶解を検定した。Ｅ２６−１についての結
果（図２）は、免疫複合体及びＮＫ細胞とのインキュベーション後、溶解黒色腫
細胞のパーセンテージが免疫複合体なしで得られる基線値を上回って上昇し、Ｎ
Ｋ細胞対黒色腫細胞の比率が２０／１でほぼ１００％に達した。黒色腫細胞の効
率的な溶解に対し、線維芽細胞は、免疫複合体及びＮＫ細胞とのインキュベーシ
ョン後細胞溶解の有意の上昇を示さなかった。Ｇ７１−１免疫複合体に関しても
同様の結果が得られた。
存性溶解を引き起こすことができるＮＫ細胞を含む。ＮＫ細胞はまた、抗体のＦ
ｃエフェクタードメインに結合して、抗体の標的ドメインに結合する細胞の抗体
依存性溶解をもたらすことができる。この抗体依存性細胞を介する細胞溶解経路
（ＡＤＣＣ）は同時に、Ｆｃエフェクタードメインを含む免疫複合体の標的ドメ
インに結合する細胞の溶解も引き起こすはずである。免疫複合体Ｅ２６−１及び
Ｇ７１−１に依存するＡＤＣＣ応答を試験するため、黒色腫細胞と線維芽細胞を
蛍光色素カルセイン−ＡＭで標識し、標識細胞をヒトＮＫ細胞単独又はＮＫ細胞
と免疫複合体と共にインキュベートした。無傷のままで細胞中に保持された蛍光
色素の量を測定することによって細胞溶解を検定した。Ｅ２６−１についての結
果（図２）は、免疫複合体及びＮＫ細胞とのインキュベーション後、溶解黒色腫
細胞のパーセンテージが免疫複合体なしで得られる基線値を上回って上昇し、Ｎ
Ｋ細胞対黒色腫細胞の比率が２０／１でほぼ１００％に達した。黒色腫細胞の効
率的な溶解に対し、線維芽細胞は、免疫複合体及びＮＫ細胞とのインキュベーシ
ョン後細胞溶解の有意の上昇を示さなかった。Ｇ７１−１免疫複合体に関しても
同様の結果が得られた。
【００４１】
ＮＫ細胞による溶解に対しての標的細胞の感受性は、ＩＣＡＭのような付着分
子の標的細胞表面での発現によって上昇し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現によって
低下する（Ｚａｍｉ，Ｌ．ら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，
１００−１０４及びＳｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，２３６１−２３６４）。これらの分子の
発現の差がＡＤＣＣアッセイにおける黒色腫細胞及び線維芽細胞の感受性の差に
寄与するかどうかを調べるため、黒色腫細胞及び線維芽細胞によるＩＣＡＭ−１
及びＭＨＣクラスＩ分子の発現をＦＡＣＳによって測定した。両方の分子の発現
は２つの細胞型において同様であり、ＮＫ細胞による黒色腫細胞の特異的溶解は
、黒色腫細胞で発現される同種抗原への免疫複合体の結合に依存することを示唆
した。
子の標的細胞表面での発現によって上昇し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現によって
低下する（Ｚａｍｉ，Ｌ．ら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，
１００−１０４及びＳｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，２３６１−２３６４）。これらの分子の
発現の差がＡＤＣＣアッセイにおける黒色腫細胞及び線維芽細胞の感受性の差に
寄与するかどうかを調べるため、黒色腫細胞及び線維芽細胞によるＩＣＡＭ−１
及びＭＨＣクラスＩ分子の発現をＦＡＣＳによって測定した。両方の分子の発現
は２つの細胞型において同様であり、ＮＫ細胞による黒色腫細胞の特異的溶解は
、黒色腫細胞で発現される同種抗原への免疫複合体の結合に依存することを示唆
した。
【００４２】
免疫系のもう１つの細胞溶解経路は、Ｃ１ｑ分子が標的細胞に結合した抗体の
Ｆｃ領域と反応したときに活性化される補体カスケードを含む（Ｂｒｕｇｅｍａ
ｎｎ Ｍ．ら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６，１３５１−１３６１）
。免疫複合体Ｅ２６−１及びＧ７１−１に依存する、黒色腫細胞に対する補体仲
介の細胞溶解応答を調べるため、上記で報告したＮＫ仲介の細胞溶解応答に関し
て使用したのと同じアッセイ手順を、１箇所変更を加えて使用した、すなわちＮ
Ｋ細胞の代わりに補体カスケードの成分を含むヒト血清又はウサギ血清を用いた
。結果（図３及び表１）は、免疫複合体とヒト血清又はウサギ血清とのインキュ
ベーション後、溶解した黒色腫細胞の分画が４％からほぼ１００％に上昇した。
黒色腫細胞の効率的な溶解に対して、線維芽細胞は免疫複合体及びヒト血清との
インキュベーション後溶解細胞分画の小さな上昇を示し、免疫複合体及びウサギ
血清とのインキュベーション後には有意の上昇を示さなかった。
Ｆｃ領域と反応したときに活性化される補体カスケードを含む（Ｂｒｕｇｅｍａ
ｎｎ Ｍ．ら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６，１３５１−１３６１）
。免疫複合体Ｅ２６−１及びＧ７１−１に依存する、黒色腫細胞に対する補体仲
介の細胞溶解応答を調べるため、上記で報告したＮＫ仲介の細胞溶解応答に関し
て使用したのと同じアッセイ手順を、１箇所変更を加えて使用した、すなわちＮ
Ｋ細胞の代わりに補体カスケードの成分を含むヒト血清又はウサギ血清を用いた
。結果（図３及び表１）は、免疫複合体とヒト血清又はウサギ血清とのインキュ
ベーション後、溶解した黒色腫細胞の分画が４％からほぼ１００％に上昇した。
黒色腫細胞の効率的な溶解に対して、線維芽細胞は免疫複合体及びヒト血清との
インキュベーション後溶解細胞分画の小さな上昇を示し、免疫複合体及びウサギ
血清とのインキュベーション後には有意の上昇を示さなかった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
考察
本試験については、２個のクローンからのｓｃＦｖ分子を、ヒトＩｇＧ１−Ｆ
ｃエフェクタードメインを含む免疫複合体を構築するための標的ドメインとして
使用した（図１）。２つの免疫複合体によってヒト黒色腫細胞から免疫沈降した
蛋白質を、黒色腫関連硫酸コンドロイチンプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）のコア
蛋白質として質量分析法によって同定した（Ｂｕｍｏｌ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｒｅｉｓ
ｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７９，１２４５−１２４９及びＢｕｍｏｌ，Ｔ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，１２７３３−１２７４１）。ＭＣＳＰ分子は最初ｍＡｂ
９．２．２７によって認識される同種抗原として同定されたが、これはいくつ
かの他のｍＡｂについての同種抗原であると思われる（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．
Ａ．＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９８７）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０
，３２３−３２７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら（１９８１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ２８，２９３−３００；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら（１９８３）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，１４６７−１４７２）。おそらくＭＣＳＰと同じであ
る、黒色腫抗原ＨＭＷ−ＭＡＡに結合するいくつかのｓｃＦｖ融合ファージクロ
ーンが、精製ＨＭＷ−ＭＡＡに対するパニングによって合成ヒトｓｃＦｖライブ
ラリーから同定されている（Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ａ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５８，２４１７−２４２５）。ＭＣＳＰ分子は主として大部分のヒト
黒色腫細胞の表面で発現されるが、グリア腫瘍の毛細管内皮細胞でも発現される
。ＭＣＳＰが、黒色腫細胞に対するパニングによって黒色腫患者のｓｃＦｖ融合
ファージライブラリーから単離された少なくとも２つの黒色腫特異的クローンに
ついての同種抗原であるという所見は、ＭＣＳＰがｉｎ ｖｉｖｏでの支配的な
黒色腫抗原であることを示唆する。
ｃエフェクタードメインを含む免疫複合体を構築するための標的ドメインとして
使用した（図１）。２つの免疫複合体によってヒト黒色腫細胞から免疫沈降した
蛋白質を、黒色腫関連硫酸コンドロイチンプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）のコア
蛋白質として質量分析法によって同定した（Ｂｕｍｏｌ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｒｅｉｓ
ｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７９，１２４５−１２４９及びＢｕｍｏｌ，Ｔ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，１２７３３−１２７４１）。ＭＣＳＰ分子は最初ｍＡｂ
９．２．２７によって認識される同種抗原として同定されたが、これはいくつ
かの他のｍＡｂについての同種抗原であると思われる（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．
Ａ．＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９８７）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０
，３２３−３２７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら（１９８１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ２８，２９３−３００；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら（１９８３）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，１４６７−１４７２）。おそらくＭＣＳＰと同じであ
る、黒色腫抗原ＨＭＷ−ＭＡＡに結合するいくつかのｓｃＦｖ融合ファージクロ
ーンが、精製ＨＭＷ−ＭＡＡに対するパニングによって合成ヒトｓｃＦｖライブ
ラリーから同定されている（Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ａ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５８，２４１７−２４２５）。ＭＣＳＰ分子は主として大部分のヒト
黒色腫細胞の表面で発現されるが、グリア腫瘍の毛細管内皮細胞でも発現される
。ＭＣＳＰが、黒色腫細胞に対するパニングによって黒色腫患者のｓｃＦｖ融合
ファージライブラリーから単離された少なくとも２つの黒色腫特異的クローンに
ついての同種抗原であるという所見は、ＭＣＳＰがｉｎ ｖｉｖｏでの支配的な
黒色腫抗原であることを示唆する。
【００４５】
２つの免疫複合体の治療上の潜在的効力の初期試験として、蛍光標識標的細胞
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞溶解アッセイを使用して、免疫複合体がＮＫ細
胞及び補体による溶解のためにヒト黒色腫細胞を標的する能力を調べた。両方の
免疫複合体が黒色腫に対するＮＫ細胞及び補体の細胞溶解活性の明らかな上昇を
もたらし、標的黒色腫細胞群の実質的に完全な溶解を生じさせたが、対照として
使用した線維芽細胞に関しては、溶解のごくわずかな上昇をもたらすか又は全く
上昇を生じさせなかった。ＮＫ細胞及び補体による黒色腫細胞と線維芽細胞の免
疫複合体非依存性細胞溶解の有意のバックグラウンドも存在した。これは、腫瘍
細胞、ＮＫ細胞及び補体を別々の個体から単離する同種異系アッセイについて予
想されるものである（Ｃｉｃｃｏｎｅ，Ｅ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１７５，７０９−７１８）。これらの成分はすべて自己由来であるので、癌患
者においてはこのバックグラウンドは低下するはずである。
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞溶解アッセイを使用して、免疫複合体がＮＫ細
胞及び補体による溶解のためにヒト黒色腫細胞を標的する能力を調べた。両方の
免疫複合体が黒色腫に対するＮＫ細胞及び補体の細胞溶解活性の明らかな上昇を
もたらし、標的黒色腫細胞群の実質的に完全な溶解を生じさせたが、対照として
使用した線維芽細胞に関しては、溶解のごくわずかな上昇をもたらすか又は全く
上昇を生じさせなかった。ＮＫ細胞及び補体による黒色腫細胞と線維芽細胞の免
疫複合体非依存性細胞溶解の有意のバックグラウンドも存在した。これは、腫瘍
細胞、ＮＫ細胞及び補体を別々の個体から単離する同種異系アッセイについて予
想されるものである（Ｃｉｃｃｏｎｅ，Ｅ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１７５，７０９−７１８）。これらの成分はすべて自己由来であるので、癌患
者においてはこのバックグラウンドは低下するはずである。
【００４６】
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解試験の結果は、免疫複合体が、腫瘍特異的ｓｃＦｖ又
はＶＨ標的ドメインが使用可能である黒色腫及び他の癌に関する免疫療法プロト
コールにおいて潜在的な役割を持つであろうことの予備的な証拠を提供する。Ｍ
ＣＳＰに結合するマウスｍＡｂ ９．２．２７による黒色腫免疫療法についての
限られた第Ｉ相臨床試験は、付随する毒性の証拠を伴わずに、腫瘍における抗体
の特異的局在を示した（Ｏｌｄｈａｒｎ，Ｒ．Ｋ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｏｎｃｏｌ．２，１２３５−１２４４）。より小さな分子サイズは腫瘍への侵
入を改善するはずであり、また分子がヒト由来であることは免疫拒絶反応を最小
限に抑えるはずであるので、ＭＣＳＰに結合するｓｃＦｖ免疫複合体は免疫療法
のためにマウスｍＡｂよりも有効であると考えられる。Ｇ７１−１及びＥ２６−
１免疫複合体は、それらのＶＨ配列の重要な相違（配列番号：１１と配列番号：
１２及び次の実施例参照）によって示唆されるように、おそらく異なるＭＣＳＰ
エピトープに結合し、それ故治療効果を高めるために一緒に投与することができ
るであろう。
はＶＨ標的ドメインが使用可能である黒色腫及び他の癌に関する免疫療法プロト
コールにおいて潜在的な役割を持つであろうことの予備的な証拠を提供する。Ｍ
ＣＳＰに結合するマウスｍＡｂ ９．２．２７による黒色腫免疫療法についての
限られた第Ｉ相臨床試験は、付随する毒性の証拠を伴わずに、腫瘍における抗体
の特異的局在を示した（Ｏｌｄｈａｒｎ，Ｒ．Ｋ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｏｎｃｏｌ．２，１２３５−１２４４）。より小さな分子サイズは腫瘍への侵
入を改善するはずであり、また分子がヒト由来であることは免疫拒絶反応を最小
限に抑えるはずであるので、ＭＣＳＰに結合するｓｃＦｖ免疫複合体は免疫療法
のためにマウスｍＡｂよりも有効であると考えられる。Ｇ７１−１及びＥ２６−
１免疫複合体は、それらのＶＨ配列の重要な相違（配列番号：１１と配列番号：
１２及び次の実施例参照）によって示唆されるように、おそらく異なるＭＣＳＰ
エピトープに結合し、それ故治療効果を高めるために一緒に投与することができ
るであろう。
【００４７】
実施例２
この実施例は、腫瘍血管系と腫瘍細胞の両方を標的する免疫療法治療が、ヒト
黒色腫の重篤な複合型免疫欠損マウス異種移植モデルにおいて有望な成績を示し
たことを報告する。手順は、各々がヒトＩｇＧ１のＦｃエフェクタードメイン領
域に複合した腫瘍標的ドメインから成る２つの免疫複合体の、ＳＣＩＤマウスへ
の全身送達を含んだ。エフェクタードメインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
及び補体による標的細胞に対しての細胞溶解性免疫応答を誘導する。免疫複合体
は、複製不全アデノウイルスベクターにおいて分泌分子としてコード化される。
黒色腫の重篤な複合型免疫欠損マウス異種移植モデルにおいて有望な成績を示し
たことを報告する。手順は、各々がヒトＩｇＧ１のＦｃエフェクタードメイン領
域に複合した腫瘍標的ドメインから成る２つの免疫複合体の、ＳＣＩＤマウスへ
の全身送達を含んだ。エフェクタードメインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
及び補体による標的細胞に対しての細胞溶解性免疫応答を誘導する。免疫複合体
は、複製不全アデノウイルスベクターにおいて分泌分子としてコード化される。
【００４８】
試験材料及び方法
細胞系統
黒色腫細胞系統ＬＸＳＮ、ＴＦ２及びＬＸＳＮ／ＶＥＧＦを、レトロウイルス
仲介のトランスフェクションとクローニングによってヒト黒色腫細胞系統ＹＵ−
ＳＩＴ１から誘導した。ＬＸＳＮ系統は対照レトロウイルスでトランスフェクシ
ョンされており、低レベルのＴＦを発現する。ＴＦ２系統はＴＦ ｃＤＮＡをコ
ード化するレトロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのＴＦ
を発現する。ＬＸＳＮ／ＶＥＧＦ系統はＶＥＧＦ ｃＤＮＡをコード化するレト
ロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのＶＥＧＦを発現する
。ヒト腎細胞系統２９３をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
仲介のトランスフェクションとクローニングによってヒト黒色腫細胞系統ＹＵ−
ＳＩＴ１から誘導した。ＬＸＳＮ系統は対照レトロウイルスでトランスフェクシ
ョンされており、低レベルのＴＦを発現する。ＴＦ２系統はＴＦ ｃＤＮＡをコ
ード化するレトロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのＴＦ
を発現する。ＬＸＳＮ／ＶＥＧＦ系統はＶＥＧＦ ｃＤＮＡをコード化するレト
ロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのＶＥＧＦを発現する
。ヒト腎細胞系統２９３をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
【００４９】
プラスミドベクター
ｓｃＦｖ（Ｇ７１−１）免疫複合体をコード化するプラスミドベクターの構築
を実施例１で述べた（配列番号：１１参照）。マウス第ＶＩＩ因子（ｍｆＶＩＩ
）免疫複合体をコード化するベクターの構築のために、５’プライマーＡＣＧＡ
ＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡ（配
列番号：７）及び３’プライマーＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＴ
ＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣ（配列番号：８）を使用して、マウス肝ｃ
ＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ
）からのＰＣＲによってｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡを増幅した。停止コドンを含まな
いリーダー及びコード化配列を含む、増幅したｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡを、ヒトＩ
ｇＧ１ Ｆｃドメインをコード化するｃＤＮＡと共にｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のフレーム内のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ
部位にクローニングした。ベクターＤＮＡをＨＢ１０１コンピテント細胞（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において増幅し、配列決定した。リシン−３
４１をアラニンコドンで置換することによってｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡの活性部位
を突然変異させた（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１４３７９−１４３８４）。突然変
異誘発の手順は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特定突然変異誘発マニュアル（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で述べられているように実施した。５’プライマーは
ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣ
ＣＣＡ（配列番号：９）であり、３’プライマーはＴＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ
ＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣ（配列番号：１０）で
あった。活性部位突然変異を有するｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡをｍｆＶＩＩａｓｍと
称する。ｍｆＶＩＩａｓｍ ｃＤＮＡを含むプラスミドをＨＢ１０１コンピテン
ト細胞に形質転換し、２×ＴＹ／カルベニシリン寒天上で形質転換コロニーを選
択した。プラスミドＤＮＡの配列は、ｍｆＶＩＩａｓｍ ＤＮＡにおけるｌｙｓ
−３４１コドン（ＡＡＧ）のアラニンコドン（ＧＣＧ）による置換を示した。
を実施例１で述べた（配列番号：１１参照）。マウス第ＶＩＩ因子（ｍｆＶＩＩ
）免疫複合体をコード化するベクターの構築のために、５’プライマーＡＣＧＡ
ＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡ（配
列番号：７）及び３’プライマーＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＴ
ＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣ（配列番号：８）を使用して、マウス肝ｃ
ＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ
）からのＰＣＲによってｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡを増幅した。停止コドンを含まな
いリーダー及びコード化配列を含む、増幅したｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡを、ヒトＩ
ｇＧ１ Ｆｃドメインをコード化するｃＤＮＡと共にｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のフレーム内のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ
部位にクローニングした。ベクターＤＮＡをＨＢ１０１コンピテント細胞（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において増幅し、配列決定した。リシン−３
４１をアラニンコドンで置換することによってｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡの活性部位
を突然変異させた（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１４３７９−１４３８４）。突然変
異誘発の手順は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特定突然変異誘発マニュアル（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で述べられているように実施した。５’プライマーは
ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣ
ＣＣＡ（配列番号：９）であり、３’プライマーはＴＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ
ＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣ（配列番号：１０）で
あった。活性部位突然変異を有するｍｆＶＩＩ ｃＤＮＡをｍｆＶＩＩａｓｍと
称する。ｍｆＶＩＩａｓｍ ｃＤＮＡを含むプラスミドをＨＢ１０１コンピテン
ト細胞に形質転換し、２×ＴＹ／カルベニシリン寒天上で形質転換コロニーを選
択した。プラスミドＤＮＡの配列は、ｍｆＶＩＩａｓｍ ＤＮＡにおけるｌｙｓ
−３４１コドン（ＡＡＧ）のアラニンコドン（ＧＣＧ）による置換を示した。
【００５０】
ＣＨＯ細胞における免疫複合体の合成
免疫複合体ｃＤＮＡをＣＨＯ細胞に形質移入し、クローンを単離するための手
順を実施例１で述べた。形質移入したＣＨＯ細胞をＣＨＯ血清不含培地（ＥＸ−
ＣＥＬＬ ３０１，ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で培養した；ｍｆＶＩＩ
ａｓｍ免疫複合体の合成のため、ＣＨＯ血清不含培地に最終濃度１μｇ／ｍｌま
でビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を補足した。免疫複合体をプロテインＡビーズ（
Ｐｉｅｒｃｅ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、濃縮し
て、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５ Ｂｉｏｍａｘ−５０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）を通しての遠心分離によって脱塩し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０
１０ｍＭに調整した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイ手順によって免疫複合体の
濃度を測定した。
順を実施例１で述べた。形質移入したＣＨＯ細胞をＣＨＯ血清不含培地（ＥＸ−
ＣＥＬＬ ３０１，ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で培養した；ｍｆＶＩＩ
ａｓｍ免疫複合体の合成のため、ＣＨＯ血清不含培地に最終濃度１μｇ／ｍｌま
でビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を補足した。免疫複合体をプロテインＡビーズ（
Ｐｉｅｒｃｅ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、濃縮し
て、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５ Ｂｉｏｍａｘ−５０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）を通しての遠心分離によって脱塩し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０
１０ｍＭに調整した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイ手順によって免疫複合体の
濃度を測定した。
【００５１】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
黒色腫細胞を非酵素的解離溶液（Ｓｉｇｍａ）中で採集し、洗って、ＴＢＳ／
ＢＳＡ／Ｃａ２＋（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５
０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭ、１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し
た。免疫複合体を加えて（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体については３７℃で３０分間、Ｇ７１−１免疫複合体については氷上で３０分
間、細胞をインキュベートした；対照細胞は免疫複合体を加えずにインキュベー
トした。インキュベーション後、細胞をＴＢＳ／ＢＳＡで洗い、蛍光標識抗ヒト
Ｆｃγ鎖（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に氷上で３０分間イ
ンキュベートし、ＢｅｃｋｔｏｎγＤｉｃｋｅｎｓｏｎ ＦＡＣｓｏｒｔ装置で
分析した。
ＢＳＡ／Ｃａ２＋（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５
０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭ、１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し
た。免疫複合体を加えて（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体については３７℃で３０分間、Ｇ７１−１免疫複合体については氷上で３０分
間、細胞をインキュベートした；対照細胞は免疫複合体を加えずにインキュベー
トした。インキュベーション後、細胞をＴＢＳ／ＢＳＡで洗い、蛍光標識抗ヒト
Ｆｃγ鎖（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に氷上で３０分間イ
ンキュベートし、ＢｅｃｋｔｏｎγＤｉｃｋｅｎｓｏｎ ＦＡＣｓｏｒｔ装置で
分析した。
【００５２】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクター系は、シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ及
びｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶと、バックボーンベクターｐＡｄＥａｓｙ−１から
成る（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５，２５０９−２５１４）。免疫複合体ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化してｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクターから単離し、次いでクレノウ断
片で消化して３’陥凹末端を埋め、その後Ｎｏｔ１で消化してｃＤＮＡ挿入物を
放出させ、それをアガロースゲル電気泳動によって精製した。シャトルベクター
は、最初にＫｐｎ１で消化し、次にクレノウ断片で消化して、その後Ｎｏｔ１で
消化した。免疫複合体ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に１６℃でひと晩イ
ンキュベートしてシャトルベクターにライゲートし、かかるシャトルベクターを
熱ショックによってＨＢ１０１コンピテント細胞に形質転換した。形質転換コロ
ニーを２×ＴＹ／カナマイシン寒天上で選択し、シャトルベクターを抽出して精
製した。精製シャトルベクターとｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ ＤＮＡをＰｍｅｌ
により３７℃で２時間消化した。シャトルベクターＤＮＡ ５００ｎｇとｐＡｄ
Ｅａｓｙ−１ ＤＮＡ １００ｎｇの混合物をＢＪ５１８３コンピテント細胞に
電気穿孔し、細胞を３７℃で１５分間振とうして、ＬＢ／カナマイシン寒天に接
種した。プレートを３７℃でひと晩インキュベートし、形質転換コロニーを単離
した。プラスミドＤＮＡをミニプレップから精製し、０．６％アガロースゲルで
の電気泳動によって組換えアデノウイルスＤＮＡに関してスクリーニングした。
びｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶと、バックボーンベクターｐＡｄＥａｓｙ−１から
成る（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５，２５０９−２５１４）。免疫複合体ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化してｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクターから単離し、次いでクレノウ断
片で消化して３’陥凹末端を埋め、その後Ｎｏｔ１で消化してｃＤＮＡ挿入物を
放出させ、それをアガロースゲル電気泳動によって精製した。シャトルベクター
は、最初にＫｐｎ１で消化し、次にクレノウ断片で消化して、その後Ｎｏｔ１で
消化した。免疫複合体ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に１６℃でひと晩イ
ンキュベートしてシャトルベクターにライゲートし、かかるシャトルベクターを
熱ショックによってＨＢ１０１コンピテント細胞に形質転換した。形質転換コロ
ニーを２×ＴＹ／カナマイシン寒天上で選択し、シャトルベクターを抽出して精
製した。精製シャトルベクターとｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ ＤＮＡをＰｍｅｌ
により３７℃で２時間消化した。シャトルベクターＤＮＡ ５００ｎｇとｐＡｄ
Ｅａｓｙ−１ ＤＮＡ １００ｎｇの混合物をＢＪ５１８３コンピテント細胞に
電気穿孔し、細胞を３７℃で１５分間振とうして、ＬＢ／カナマイシン寒天に接
種した。プレートを３７℃でひと晩インキュベートし、形質転換コロニーを単離
した。プラスミドＤＮＡをミニプレップから精製し、０．６％アガロースゲルで
の電気泳動によって組換えアデノウイルスＤＮＡに関してスクリーニングした。
【００５３】
免疫複合体をコード化する組換えアデノウイルスＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のトラ
ンスフェクションに関して上述したプロトコールに従って、１×１０５の２９３
細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの７日後に細胞を採集
し、３回の凍結−融解サイクルによってアデノウイルスを放出させ、１つの１５
０ｍｍ培養プレートに２９３細胞を感染させて増幅した。２日後、上述したよう
にアデノウイルスを採集し、２０の培養プレートに２９３細胞を感染させて再び
増幅した。増幅したアデノウイルスを２日後に採集し、ＣｓＣｌ中での遠心分離
によって精製した。最終的な収量は通常、２６０ｎｍでの吸光度から評価したと
き約１０１３ウイルス粒子であった；換算は、１Ｏ．Ｄ．単位＝１×１０１２粒
子である。精製アデノウイルスをＰＢＳで透析し、−８０℃で保存した。
ンスフェクションに関して上述したプロトコールに従って、１×１０５の２９３
細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの７日後に細胞を採集
し、３回の凍結−融解サイクルによってアデノウイルスを放出させ、１つの１５
０ｍｍ培養プレートに２９３細胞を感染させて増幅した。２日後、上述したよう
にアデノウイルスを採集し、２０の培養プレートに２９３細胞を感染させて再び
増幅した。増幅したアデノウイルスを２日後に採集し、ＣｓＣｌ中での遠心分離
によって精製した。最終的な収量は通常、２６０ｎｍでの吸光度から評価したと
き約１０１３ウイルス粒子であった；換算は、１Ｏ．Ｄ．単位＝１×１０１２粒
子である。精製アデノウイルスをＰＢＳで透析し、−８０℃で保存した。
【００５４】
ＳＣＩＤマウス実験
ＳＣＩＤマウスはＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの４週齢か
ら５週齢の雌性であった。マウスの右ひ腹に５×１０５のＴＦ２又はＬＸＳＮヒ
ト黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍が、皮膚表面下で触知可能な大きさ（〜５ｍ
ｍ３）又は皮膚表面より上のより大きなサイズ（〜５０ｍｍ３）に成長したあと
、尾静脈を通して免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクター、又は対照
として免疫複合体をコード化しないアデノウイルスベクターをマウスに注入した
。血液中に分泌される免疫複合体蛋白質の濃度を、一方の眼からの血液約０．１
ｍｌをヘパリン被覆した微小毛管に採集し、血液を遠心分離にかけて細胞を取り
出すことによって測定した。上清血漿を炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６で
希釈し、プロ結合アッセイプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の穴に分配して、プレート
を３７℃で２時間、次いで４℃でひと晩インキュベートした。穴をＰＢＳ中５％
脱脂乳で３０分間遮断し、ＰＢＳで３回洗って、５％脱脂乳中１：２０００に希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を穴に加えた。プレートを室温で
１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗って、ペルオキシダーゼ基質ＯＰＤを加
え、マイクロプレートリーダーにおいて４９０ｎｍで吸光度を測定した。蛋白質
標準は、プロテインＡビーズでのクロマトグラフィーによって精製したヒトＩｇ
Ｇ（Ｓｉｇｍａ）であった。
ら５週齢の雌性であった。マウスの右ひ腹に５×１０５のＴＦ２又はＬＸＳＮヒ
ト黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍が、皮膚表面下で触知可能な大きさ（〜５ｍ
ｍ３）又は皮膚表面より上のより大きなサイズ（〜５０ｍｍ３）に成長したあと
、尾静脈を通して免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクター、又は対照
として免疫複合体をコード化しないアデノウイルスベクターをマウスに注入した
。血液中に分泌される免疫複合体蛋白質の濃度を、一方の眼からの血液約０．１
ｍｌをヘパリン被覆した微小毛管に採集し、血液を遠心分離にかけて細胞を取り
出すことによって測定した。上清血漿を炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６で
希釈し、プロ結合アッセイプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の穴に分配して、プレート
を３７℃で２時間、次いで４℃でひと晩インキュベートした。穴をＰＢＳ中５％
脱脂乳で３０分間遮断し、ＰＢＳで３回洗って、５％脱脂乳中１：２０００に希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を穴に加えた。プレートを室温で
１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗って、ペルオキシダーゼ基質ＯＰＤを加
え、マイクロプレートリーダーにおいて４９０ｎｍで吸光度を測定した。蛋白質
標準は、プロテインＡビーズでのクロマトグラフィーによって精製したヒトＩｇ
Ｇ（Ｓｉｇｍａ）であった。
【００５５】
ＳＣＩＤマウスの皮膚に発現する腫瘍の大きさをカリパスにより二次元で測定
し、式、（幅）２（長さ）／２によって腫瘍容積を推定した。実験の最後に、マ
ウスを解剖して腫瘍を計量した。器官を損傷の形態学的証拠に関して検討し、組
織学的検査用にパラフィン切片を調製した。
し、式、（幅）２（長さ）／２によって腫瘍容積を推定した。実験の最後に、マ
ウスを解剖して腫瘍を計量した。器官を損傷の形態学的証拠に関して検討し、組
織学的検査用にパラフィン切片を調製した。
【００５６】
免疫組織化学
腫瘍と器官のパラフィン切片をＰＢＳ＋０．３％Ｈ２Ｏ２中で３０分間インキ
ュベートし、ＴＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中で３０分間遮断した。ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｃ
ａ２＋緩衝液中にｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体１０μｇ／ｍｌを含む溶液、又は
対照として免疫複合体を含まない緩衝液を切片に加え、３７℃で１時間インキュ
ベートした。同じ緩衝液で３回洗った後、切片をアルカリホスファターゼで標識
した抗ヒトγ鎖抗体と共に室温で１時間インキュベートして、青色を生じるＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴで染色し、メチルグリーンで対比染色した。
ュベートし、ＴＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中で３０分間遮断した。ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｃ
ａ２＋緩衝液中にｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体１０μｇ／ｍｌを含む溶液、又は
対照として免疫複合体を含まない緩衝液を切片に加え、３７℃で１時間インキュ
ベートした。同じ緩衝液で３回洗った後、切片をアルカリホスファターゼで標識
した抗ヒトγ鎖抗体と共に室温で１時間インキュベートして、青色を生じるＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴで染色し、メチルグリーンで対比染色した。
【００５７】
試験結果
免疫複合体の特性
ｓｃＦｖ（Ｇ７１−１）及び突然変異マウス第ＶＩＩ因子（ｍｆＶＩＩａｓｍ
）免疫複合体をＣＨＯ細胞において合成し、プロテインＡビーズでのアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって培地から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる先
の分析は、Ｇ７１−１免疫複合体が、おそらくＦｃドメインのヒンジ領域間のジ
スルフィド架橋によって結合した、２つの同じ鎖から成ることを示した（実施例
１）。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に関して同じ結果を得た。（配列番号：１１
及び配列番号：１２参照）。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は２つの標的ドメイン
を持つので、単量体内因性ｆＶＩＩ分子における１つの標的ドメインと比較して
、２個のＴＦ分子に協力的に結合し、ＴＦを発現する細胞に対して内因性ｆＶＩ
Ｉよりも強い結合をもたらすことができる。競合的ＦＡＣＳアッセイは、ヒトｆ
ＶＩＩａが、ヒト黒色腫細胞上のアクセス可能部位の半数への結合に関して等モ
ルベースでｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体と競合することを示した。これはおそら
く、免疫複合体上の標的ドメインの１つだけがこれらの部位でＴＦに結合するこ
とができるからであろう。残りの部位へのｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の結合は
、１０倍過剰のヒトｆＶＩＩａの存在下で競合することができず、免疫複合体分
子の両方の標的ドメインがこれらの部位で結合することができ、強いアビディテ
ィ効果をもたらすことを示唆した。黒色腫細胞上のＴＦ分子の約半分だけが第二
ＴＦ分子に十分に近接していて、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体上の両方の標的ド
メインについて協力的結合部位を形成すると思われる。
）免疫複合体をＣＨＯ細胞において合成し、プロテインＡビーズでのアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって培地から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる先
の分析は、Ｇ７１−１免疫複合体が、おそらくＦｃドメインのヒンジ領域間のジ
スルフィド架橋によって結合した、２つの同じ鎖から成ることを示した（実施例
１）。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に関して同じ結果を得た。（配列番号：１１
及び配列番号：１２参照）。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は２つの標的ドメイン
を持つので、単量体内因性ｆＶＩＩ分子における１つの標的ドメインと比較して
、２個のＴＦ分子に協力的に結合し、ＴＦを発現する細胞に対して内因性ｆＶＩ
Ｉよりも強い結合をもたらすことができる。競合的ＦＡＣＳアッセイは、ヒトｆ
ＶＩＩａが、ヒト黒色腫細胞上のアクセス可能部位の半数への結合に関して等モ
ルベースでｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体と競合することを示した。これはおそら
く、免疫複合体上の標的ドメインの１つだけがこれらの部位でＴＦに結合するこ
とができるからであろう。残りの部位へのｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の結合は
、１０倍過剰のヒトｆＶＩＩａの存在下で競合することができず、免疫複合体分
子の両方の標的ドメインがこれらの部位で結合することができ、強いアビディテ
ィ効果をもたらすことを示唆した。黒色腫細胞上のＴＦ分子の約半分だけが第二
ＴＦ分子に十分に近接していて、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体上の両方の標的ド
メインについて協力的結合部位を形成すると思われる。
【００５８】
免疫療法試験のための異種移植片を、それぞれ低レベル又は高レベルのＴＦを
発現するヒト黒色腫細胞系統ＬＸＳＮ及びＴＦ２から作製した。ＴＦ２細胞によ
るより高いレベルのＴＦ発現と一致して、ＦＡＣＳによって測定したとき、ｍｆ
ＶＩＩａｓｍ免疫複合体はＬＸＳＮ細胞よりもＴＦ２細胞とより広汎に結合する
。またｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を、高レベルのＶＥＧＦを生成する黒色腫細
胞系統ＬＸＳＮ／ＶＥＧＦから作製したヒト黒色腫異種移植片の切片への結合に
関して免疫組織化学によっても試験し、密に血管形成した異種移植片を生じた。
腫瘍血管内皮細胞並びに腫瘍細胞に対して結合が起こり（図４）、異種移植片に
おいて両方の細胞型によってＴＦが発現されることを示唆した。正常マウスの肝
臓、腎臓、肺及び脳の切片に関する免疫組織化学試験は、ＴＦが非腫瘍性組織の
血管内皮細胞によっては発現されないという他の証拠と一致して、ｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体がこれらの組織における血管内皮細胞とは結合しないことを示し
た。
発現するヒト黒色腫細胞系統ＬＸＳＮ及びＴＦ２から作製した。ＴＦ２細胞によ
るより高いレベルのＴＦ発現と一致して、ＦＡＣＳによって測定したとき、ｍｆ
ＶＩＩａｓｍ免疫複合体はＬＸＳＮ細胞よりもＴＦ２細胞とより広汎に結合する
。またｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を、高レベルのＶＥＧＦを生成する黒色腫細
胞系統ＬＸＳＮ／ＶＥＧＦから作製したヒト黒色腫異種移植片の切片への結合に
関して免疫組織化学によっても試験し、密に血管形成した異種移植片を生じた。
腫瘍血管内皮細胞並びに腫瘍細胞に対して結合が起こり（図４）、異種移植片に
おいて両方の細胞型によってＴＦが発現されることを示唆した。正常マウスの肝
臓、腎臓、肺及び脳の切片に関する免疫組織化学試験は、ＴＦが非腫瘍性組織の
血管内皮細胞によっては発現されないという他の証拠と一致して、ｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体がこれらの組織における血管内皮細胞とは結合しないことを示し
た。
【００５９】
免疫療法試験
ＳＣＩＤマウスへの全身送達のために、各々の免疫複合体をｐＡｄＥａｓｙ−
１に基づく複製不全アデノウイルスベクター系（Ｈｅら、前出）において分泌分
子としてコード化し、最初にヒト黒色腫細胞を皮下注入しておいたマウスの尾静
脈に前記ベクターを注入した。最初の免疫療法試験は、触知可能なＴＦ２異種移
植片を発現したマウスに、各々のベクターを別個に、及び両方のベクターを一緒
に注入することを含んだ。３つの注入全体を週に１回の間隔で投与し、最後の注
入から６日後に実験を終了した。１回目と２回目の注入後にＥＬＩＳＡによって
血液中の免疫複合体の濃度をモニターした（図５）。１回目の注入後の平均濃度
は、Ｇ７１−１免疫複合体については４ｍｇ／ｍｌ、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体については０．０４ｍｇ／ｍｌであり、合成の速度がＧ７１−１免疫複合体に
ついてはｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体よりも約１００倍高いことを示唆した。２
回目の注射後各々の免疫複合体の濃度が上昇し、付加的な細胞がアデノウイルス
に感染していたことを示した。皮膚表面に現われた腫瘍の大きさを二次元で測定
し、腫瘍容積を評価するための測定法を用いて、異種移植片の成長をモニターし
た（図６）。免疫複合体をコード化しないアデノウイルスを注入した対照マウス
では、腫瘍が比較的速い速度で持続的に成長し、２０日後に約２，０００ｍｍ３ の平均容積に達した。免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入したマウ
スでは、腫瘍の成長が阻害された；阻害はＧ７１−１免疫複合体よりもｍｆＶＩ
Ｉａｓｍ免疫複合体の方が強力であった。実験終了時にすべてのマウスが活動的
なままであり、健康と思われ、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び脳の組織学的検査は壊
死、凝固又は出血の証拠を示さなかった。剖検後の腫瘍重量は、推定腫瘍容積と
一致して、対照マウスでは免疫複合体で処置したマウスよりも低かった（図７）
。腫瘍重量の最強の低下は、両方の免疫複合体で処置したマウスで起こった。
１に基づく複製不全アデノウイルスベクター系（Ｈｅら、前出）において分泌分
子としてコード化し、最初にヒト黒色腫細胞を皮下注入しておいたマウスの尾静
脈に前記ベクターを注入した。最初の免疫療法試験は、触知可能なＴＦ２異種移
植片を発現したマウスに、各々のベクターを別個に、及び両方のベクターを一緒
に注入することを含んだ。３つの注入全体を週に１回の間隔で投与し、最後の注
入から６日後に実験を終了した。１回目と２回目の注入後にＥＬＩＳＡによって
血液中の免疫複合体の濃度をモニターした（図５）。１回目の注入後の平均濃度
は、Ｇ７１−１免疫複合体については４ｍｇ／ｍｌ、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体については０．０４ｍｇ／ｍｌであり、合成の速度がＧ７１−１免疫複合体に
ついてはｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体よりも約１００倍高いことを示唆した。２
回目の注射後各々の免疫複合体の濃度が上昇し、付加的な細胞がアデノウイルス
に感染していたことを示した。皮膚表面に現われた腫瘍の大きさを二次元で測定
し、腫瘍容積を評価するための測定法を用いて、異種移植片の成長をモニターし
た（図６）。免疫複合体をコード化しないアデノウイルスを注入した対照マウス
では、腫瘍が比較的速い速度で持続的に成長し、２０日後に約２，０００ｍｍ３ の平均容積に達した。免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入したマウ
スでは、腫瘍の成長が阻害された；阻害はＧ７１−１免疫複合体よりもｍｆＶＩ
Ｉａｓｍ免疫複合体の方が強力であった。実験終了時にすべてのマウスが活動的
なままであり、健康と思われ、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び脳の組織学的検査は壊
死、凝固又は出血の証拠を示さなかった。剖検後の腫瘍重量は、推定腫瘍容積と
一致して、対照マウスでは免疫複合体で処置したマウスよりも低かった（図７）
。腫瘍重量の最強の低下は、両方の免疫複合体で処置したマウスで起こった。
【００６０】
次の２つの実験は、免疫複合体の治療効果に影響を及ぼしうる２つのパラメー
タ、すなわち異種移植片の初期サイズと黒色腫細胞によるＴＦ発現のレベルを試
験するためにデザインされた。（ｉ）前記の免疫療法試験は、ヒトでの小さな腫
瘍に相当する、約５ｍｍ３の推定容積に成長した触知可能な黒色腫異種移植片に
関するものであった。より大きな異種移植片に対する免疫複合体の治療効果を調
べるため、ＴＦ２異種移植片を推定容積約５０ｍｍ３に成長させた後、２つのア
デノウイルスベクターの尾静脈注入を開始した。３週間の期間中マウスに４回注
入を行い、最後の注入から２日後に実験を終了した。免疫複合体をコード化する
アデノウイルスを注入したマウスにおける平均腫瘍容積は、実験開始時と実験終
了時でほぼ同じであったのに対し、対照アデノウイルスを注入したマウスでの平
均腫瘍容積は同じ期間中に約２７倍上昇した（図８）。これらの結果は、腫瘍の
成長が、大きな腫瘍に関しても小さな腫瘍と同じくらい有効に阻害されることを
示している。免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入した５匹のマウス
のうち１匹が、３回目の注入から５日後に死亡した；マウスが検査の時点までに
回収されなかったため、死亡の原因は判定できなかった。（ｉｉ）ｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体の効果に影響を及ぼしうる１つのパラメータはＴＦ発現のレベル
であり、これは種々の腫瘍間で異なる（Ｃａｌｌｅｎｄｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら（１９
９２）Ｃａｎｃｅｒ ７０，１１９４−１２０１）。異種移植片での黒色腫細胞
によるＴＦの発現が変化することの影響を調べるため、より高レベルのＴＦを発
現する関連系統ＴＦ２から作製した異種移植片との比較のために、黒色腫細胞系
統ＬＸＳＮを使用して低レベルのＴＦを発現する異種移植片を作製した（Ｂｒｏ
ｍｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９２，８２０５−８２０９）。異種移植片が触知可能な大きさに達した
後、次の３週間にわたってマウスにｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化する
アデノウイルス又は対照アデノウイルスの５回の注射を実施した（図１１）。対
照アデノウイルスを注入した５匹のマウスでは、異種移植片は持続的に成長し、
平均容積は最後の注入から２日後に１３５０ｍｍ３まで上昇した。同じ期間中、
ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を注入した５匹のマウスにおける異種移植片の平均
容積は２０ｍｍ３に上昇し、腫瘍の成長がＬＸＳＮとＴＦ２異種移植片について
同等であることを示した（図９と６の比較）。最後の注入の１日後に実施した剖
検は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入した５
匹のマウスのうち２匹において異種移植片が根絶されていたことを示した；他の
３匹のマウスにおける平均腫瘍重量が０．１１グラムであったのに対し、対照ア
デノウイルスを注入した５匹のマウスでは０．７５グラムの平均重量であった。
これら３匹のマウスから回収された小さな腫瘍は細胞壊死の広汎な領域を示した
が、対照マウスからのより大きな腫瘍においては壊死は生じなかった（図１０）
。この実験の終了時にはすべてのマウスが健康であると思われたが、解剖したマ
ウスの形態学的検査は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイ
ルスを注入した５匹のマウスにおいて肝臓と脾臓への損傷を明らかにした。肝と
脾の組織学的検査は、肝細胞の多くが腫脹し、脾が赤血球で広汎に浸潤されてい
ることを示した。腫脹した肝細胞は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化す
るアデノウイルスの３回の注入後の先の実験においても発生していたが、脾は正
常であり、脾臓の欠陥が最後の２回の注入経過で発現したことを示唆した。１匹
のマウスは硬膜下脳出血も有していたが、これは今回の実験からの他のマウスあ
るいはこれまでのいずれの実験においても起こっていなかった。この欠陥が脳血
管系で発現されたＴＦへのｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の結合によって誘発され
たのかどうかは不明である。
タ、すなわち異種移植片の初期サイズと黒色腫細胞によるＴＦ発現のレベルを試
験するためにデザインされた。（ｉ）前記の免疫療法試験は、ヒトでの小さな腫
瘍に相当する、約５ｍｍ３の推定容積に成長した触知可能な黒色腫異種移植片に
関するものであった。より大きな異種移植片に対する免疫複合体の治療効果を調
べるため、ＴＦ２異種移植片を推定容積約５０ｍｍ３に成長させた後、２つのア
デノウイルスベクターの尾静脈注入を開始した。３週間の期間中マウスに４回注
入を行い、最後の注入から２日後に実験を終了した。免疫複合体をコード化する
アデノウイルスを注入したマウスにおける平均腫瘍容積は、実験開始時と実験終
了時でほぼ同じであったのに対し、対照アデノウイルスを注入したマウスでの平
均腫瘍容積は同じ期間中に約２７倍上昇した（図８）。これらの結果は、腫瘍の
成長が、大きな腫瘍に関しても小さな腫瘍と同じくらい有効に阻害されることを
示している。免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入した５匹のマウス
のうち１匹が、３回目の注入から５日後に死亡した；マウスが検査の時点までに
回収されなかったため、死亡の原因は判定できなかった。（ｉｉ）ｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体の効果に影響を及ぼしうる１つのパラメータはＴＦ発現のレベル
であり、これは種々の腫瘍間で異なる（Ｃａｌｌｅｎｄｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら（１９
９２）Ｃａｎｃｅｒ ７０，１１９４−１２０１）。異種移植片での黒色腫細胞
によるＴＦの発現が変化することの影響を調べるため、より高レベルのＴＦを発
現する関連系統ＴＦ２から作製した異種移植片との比較のために、黒色腫細胞系
統ＬＸＳＮを使用して低レベルのＴＦを発現する異種移植片を作製した（Ｂｒｏ
ｍｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９２，８２０５−８２０９）。異種移植片が触知可能な大きさに達した
後、次の３週間にわたってマウスにｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化する
アデノウイルス又は対照アデノウイルスの５回の注射を実施した（図１１）。対
照アデノウイルスを注入した５匹のマウスでは、異種移植片は持続的に成長し、
平均容積は最後の注入から２日後に１３５０ｍｍ３まで上昇した。同じ期間中、
ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を注入した５匹のマウスにおける異種移植片の平均
容積は２０ｍｍ３に上昇し、腫瘍の成長がＬＸＳＮとＴＦ２異種移植片について
同等であることを示した（図９と６の比較）。最後の注入の１日後に実施した剖
検は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入した５
匹のマウスのうち２匹において異種移植片が根絶されていたことを示した；他の
３匹のマウスにおける平均腫瘍重量が０．１１グラムであったのに対し、対照ア
デノウイルスを注入した５匹のマウスでは０．７５グラムの平均重量であった。
これら３匹のマウスから回収された小さな腫瘍は細胞壊死の広汎な領域を示した
が、対照マウスからのより大きな腫瘍においては壊死は生じなかった（図１０）
。この実験の終了時にはすべてのマウスが健康であると思われたが、解剖したマ
ウスの形態学的検査は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイ
ルスを注入した５匹のマウスにおいて肝臓と脾臓への損傷を明らかにした。肝と
脾の組織学的検査は、肝細胞の多くが腫脹し、脾が赤血球で広汎に浸潤されてい
ることを示した。腫脹した肝細胞は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化す
るアデノウイルスの３回の注入後の先の実験においても発生していたが、脾は正
常であり、脾臓の欠陥が最後の２回の注入経過で発現したことを示唆した。１匹
のマウスは硬膜下脳出血も有していたが、これは今回の実験からの他のマウスあ
るいはこれまでのいずれの実験においても起こっていなかった。この欠陥が脳血
管系で発現されたＴＦへのｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の結合によって誘発され
たのかどうかは不明である。
【００６１】
考察
この実施例における免疫療法処置は、各々がヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖のＦｃ領域に
複合した腫瘍標的ドメインから成り、カメリド（Ｃａｍｅｌｉｄ）Ｈ鎖抗体に類
似したホモダイマー分子を形成する、２つの免疫複合体をＳＣＩＤマウスに全身
送達することを含んだ。１つの型の免疫複合体については、腫瘍標的ドメインは
、異種移植片において黒色腫細胞によって発現される黒色腫抗原ＭＣＳＰに結合
するヒトｓｃＦｖ分子Ｇ７１−１であった。他の型の免疫複合体では、腫瘍標的
ドメインは、腫瘍血管系内皮細胞によって発現されるマウスＴＦと異種移植片に
おいて黒色腫細胞によって発現されるヒトＴＦの両方の組織因子（ＴＦ）に特異
的且つ強力に結合するマウス第ＶＩＩ因子分子であった。第ＶＩＩ因子免疫複合
体のＴＦへの結合から起こりうる播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の危険性を低下さ
せるために、血液凝固経路を開始させるために必要な蛋白質分解活性を阻害する
、活性部位の突然変異をマウスｆＶＩＩ標的ドメイン（ｍｆＶＩＩａｓｍ）に導
入した。
複合した腫瘍標的ドメインから成り、カメリド（Ｃａｍｅｌｉｄ）Ｈ鎖抗体に類
似したホモダイマー分子を形成する、２つの免疫複合体をＳＣＩＤマウスに全身
送達することを含んだ。１つの型の免疫複合体については、腫瘍標的ドメインは
、異種移植片において黒色腫細胞によって発現される黒色腫抗原ＭＣＳＰに結合
するヒトｓｃＦｖ分子Ｇ７１−１であった。他の型の免疫複合体では、腫瘍標的
ドメインは、腫瘍血管系内皮細胞によって発現されるマウスＴＦと異種移植片に
おいて黒色腫細胞によって発現されるヒトＴＦの両方の組織因子（ＴＦ）に特異
的且つ強力に結合するマウス第ＶＩＩ因子分子であった。第ＶＩＩ因子免疫複合
体のＴＦへの結合から起こりうる播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の危険性を低下さ
せるために、血液凝固経路を開始させるために必要な蛋白質分解活性を阻害する
、活性部位の突然変異をマウスｆＶＩＩ標的ドメイン（ｍｆＶＩＩａｓｍ）に導
入した。
【００６２】
実施例１で報告した試験は、Ｇ７１−１免疫複合体が、ＮＫ細胞と補体による
培養ヒト黒色腫細胞の細胞溶解を仲介することを示した。ＳＣＩＤマウスは機能
的ＮＫ細胞と補体を産生する能力を保持するので、免疫複合体も、ＳＣＩＤマウ
スにおいて成長するヒト黒色腫異種移植片の標的腫瘍細胞及び血管内皮細胞の細
胞溶解を仲介することができると考えられる。免疫複合体のＳＣＩＤマウスへの
全身送達を、免疫複合体をコード化する複製欠損アデノウイルスベクターの尾静
脈注入によって実施した。免疫複合体は各注入後少なくとも１週間血液中に分泌
された。最初に低レベル又は高レベルのＴＦを発現するヒト黒色腫細胞系統をマ
ウスに皮下注射し、生じた異種移植片を小（〜５ｍｍ３）又は大（〜５０ｍｍ３ ）腫瘍に成長させた後、アデノウイルスベクターの注入を開始した。Ｇ７１−１
免疫複合体をコード化するアデノウイルスと別々に又は一緒に投与した、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスの多回注入により、３〜４
週間の実験期間中、すべての異種移植片のさらなる成長が妨げられた；一部のマ
ウスでは、異種移植片は完全に後退した。免疫複合体をコード化しないアデノウ
イルスを注入した対照マウスでは、異種移植片の平均容積は同じ期間中に約２５
倍に上昇した。免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクターの５回の注入
を受けたマウスでは、肝細胞の多くが腫脹し、脾が赤血球で浸潤されていた。こ
の欠陥は、肝又は脾細胞には結合しない分泌免疫複合体によって引き起こされた
ものではなかった。主要な原因はおそらく、主として静脈内注入されたアデノウ
イルスベクターに感染したマウス細胞である肝細胞による、コード化された免疫
複合体の持続的な高いレベルの合成である。アデノウイルスベクターを注入した
ＳＣＩＤマウスの血液中の免疫複合体濃度は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体より
もＧ７１−１免疫複合体の方が約１００倍高かったが、それにもかかわらずヒト
黒色腫異種移植片への阻害作用はｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の方がより強力で
あった。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の鍵となる利点は、Ｇ７１−１免疫複合体
が黒色腫細胞だけに結合するのに対して、腫瘍細胞と同様に腫瘍血管内皮細胞に
対しても結合が起こることである。ＴＦが正常血管系によっては発現されないの
で、腫瘍血管系への結合は腫瘍特異的であるはずである。ＴＦは、脳、肺及び腎
糸球体のような他のいくつかの正常組織によって発現されるが、血管壁はより大
きな血液成分を隣接細胞から分離するバリアを形成するので、これらのＴＦ分子
は内因性ｆＶＩＩ又はｆＶＩＩ免疫複合体にアクセスできない。しかし、腫瘍血
管は漏出性であり、腫瘍細胞によって発現されたＴＦへのアクセスを可能にする
。それ故、ヒトｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は、血管内皮細胞及び腫瘍細胞上でＴ
Ｆを発現する広いスペクトルのヒト腫瘍にとって有効な治療薬でありうる。ＴＦ
以外の腫瘍細胞標的に結合するヒトｓｃＦｖ免疫複合体を同時に投与することに
より、ヒトｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の治療効果を増強することができる。
培養ヒト黒色腫細胞の細胞溶解を仲介することを示した。ＳＣＩＤマウスは機能
的ＮＫ細胞と補体を産生する能力を保持するので、免疫複合体も、ＳＣＩＤマウ
スにおいて成長するヒト黒色腫異種移植片の標的腫瘍細胞及び血管内皮細胞の細
胞溶解を仲介することができると考えられる。免疫複合体のＳＣＩＤマウスへの
全身送達を、免疫複合体をコード化する複製欠損アデノウイルスベクターの尾静
脈注入によって実施した。免疫複合体は各注入後少なくとも１週間血液中に分泌
された。最初に低レベル又は高レベルのＴＦを発現するヒト黒色腫細胞系統をマ
ウスに皮下注射し、生じた異種移植片を小（〜５ｍｍ３）又は大（〜５０ｍｍ３ ）腫瘍に成長させた後、アデノウイルスベクターの注入を開始した。Ｇ７１−１
免疫複合体をコード化するアデノウイルスと別々に又は一緒に投与した、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスの多回注入により、３〜４
週間の実験期間中、すべての異種移植片のさらなる成長が妨げられた；一部のマ
ウスでは、異種移植片は完全に後退した。免疫複合体をコード化しないアデノウ
イルスを注入した対照マウスでは、異種移植片の平均容積は同じ期間中に約２５
倍に上昇した。免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクターの５回の注入
を受けたマウスでは、肝細胞の多くが腫脹し、脾が赤血球で浸潤されていた。こ
の欠陥は、肝又は脾細胞には結合しない分泌免疫複合体によって引き起こされた
ものではなかった。主要な原因はおそらく、主として静脈内注入されたアデノウ
イルスベクターに感染したマウス細胞である肝細胞による、コード化された免疫
複合体の持続的な高いレベルの合成である。アデノウイルスベクターを注入した
ＳＣＩＤマウスの血液中の免疫複合体濃度は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体より
もＧ７１−１免疫複合体の方が約１００倍高かったが、それにもかかわらずヒト
黒色腫異種移植片への阻害作用はｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の方がより強力で
あった。ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の鍵となる利点は、Ｇ７１−１免疫複合体
が黒色腫細胞だけに結合するのに対して、腫瘍細胞と同様に腫瘍血管内皮細胞に
対しても結合が起こることである。ＴＦが正常血管系によっては発現されないの
で、腫瘍血管系への結合は腫瘍特異的であるはずである。ＴＦは、脳、肺及び腎
糸球体のような他のいくつかの正常組織によって発現されるが、血管壁はより大
きな血液成分を隣接細胞から分離するバリアを形成するので、これらのＴＦ分子
は内因性ｆＶＩＩ又はｆＶＩＩ免疫複合体にアクセスできない。しかし、腫瘍血
管は漏出性であり、腫瘍細胞によって発現されたＴＦへのアクセスを可能にする
。それ故、ヒトｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は、血管内皮細胞及び腫瘍細胞上でＴ
Ｆを発現する広いスペクトルのヒト腫瘍にとって有効な治療薬でありうる。ＴＦ
以外の腫瘍細胞標的に結合するヒトｓｃＦｖ免疫複合体を同時に投与することに
より、ヒトｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の治療効果を増強することができる。
【００６３】
実施例３
この実施例は、ヒト皮膚及び転移性肺黒色腫のＳＣＩＤマウスモデル、及びマ
ウス黒色腫の免疫コンピテントマウスモデルにおいて検討した癌治療のためのプ
ロトコールの効果と安全性の試験を報告する。プロトコールは、標的新生血管系
内皮細胞及び腫瘍細胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導する、本発明の免疫複
合体をコード化する複製不全アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を含んだ。マ
ウスモデルの実験は、単独で又は一本鎖免疫複合体と共に第ＶＩＩ因子免疫複合
体を腫瘍内送達すると、正常器官への損傷の証拠を伴わずに、注入した腫瘍、そ
して同時に離れた非注入転移性腫瘍の成長の阻害と後退も生じさせることを示し
た。おそらく新生血管系内皮細胞上の組織因子に結合した第ＶＩＩ因子免疫複合
体によって仲介される、腫瘍新生血管系の広汎な破壊が存在した。組織因子は一
般に新生血管内皮細胞と腫瘍細胞で発現されるので、第ＶＩＩ因子免疫複合体は
広い範囲のヒト腫瘍に対する免疫療法のために使用することができる。
ウス黒色腫の免疫コンピテントマウスモデルにおいて検討した癌治療のためのプ
ロトコールの効果と安全性の試験を報告する。プロトコールは、標的新生血管系
内皮細胞及び腫瘍細胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導する、本発明の免疫複
合体をコード化する複製不全アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を含んだ。マ
ウスモデルの実験は、単独で又は一本鎖免疫複合体と共に第ＶＩＩ因子免疫複合
体を腫瘍内送達すると、正常器官への損傷の証拠を伴わずに、注入した腫瘍、そ
して同時に離れた非注入転移性腫瘍の成長の阻害と後退も生じさせることを示し
た。おそらく新生血管系内皮細胞上の組織因子に結合した第ＶＩＩ因子免疫複合
体によって仲介される、腫瘍新生血管系の広汎な破壊が存在した。組織因子は一
般に新生血管内皮細胞と腫瘍細胞で発現されるので、第ＶＩＩ因子免疫複合体は
広い範囲のヒト腫瘍に対する免疫療法のために使用することができる。
【００６４】
試験材料及び方法
細胞系統
ＬＸＳＮ、ＴＦ２及びＹｕｓａｃ２はヒト黒色腫細胞系統であり、Ｃａｋｉは
ヒト腎腫瘍細胞系統であり、ＬｎＣａｐはヒト前立腺癌細胞系統であり、Ａ２０
４はヒト神経線維芽細胞腫系統であり、Ｂ１６Ｆ１０はマウス黒色腫細胞系統で
あり、ＥＭＴ６はマウス乳腺癌細胞系統であり、ＢＴ２０はヒト乳癌細胞系統で
あり、Ｃｏｌｏ ３５７はヒト膵癌細胞系統であり、ＭＳはヒト胃癌細胞系統で
あり、２９３はアデノウイルスベクターをパッケージングするために使用される
ヒト腎細胞系統（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）である。培地は、ＬｎＣａｐを
除くすべての腫瘍系統についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳであった。ＬｎＣａｐは
ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳで培養した。
ヒト腎腫瘍細胞系統であり、ＬｎＣａｐはヒト前立腺癌細胞系統であり、Ａ２０
４はヒト神経線維芽細胞腫系統であり、Ｂ１６Ｆ１０はマウス黒色腫細胞系統で
あり、ＥＭＴ６はマウス乳腺癌細胞系統であり、ＢＴ２０はヒト乳癌細胞系統で
あり、Ｃｏｌｏ ３５７はヒト膵癌細胞系統であり、ＭＳはヒト胃癌細胞系統で
あり、２９３はアデノウイルスベクターをパッケージングするために使用される
ヒト腎細胞系統（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）である。培地は、ＬｎＣａｐを
除くすべての腫瘍系統についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳであった。ＬｎＣａｐは
ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳで培養した。
【００６５】
アデノウイルスベクター
１）ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコード化するアデノウイル
スベクターを作製し、精製するための上記実施例２で要約した手順を、次の修正
を加えて使用した。シャトルベクターＤＮＡをＰｍｅＩで消化した後、エタノー
ル沈殿ステップの代わりにアガロースゲルでの電気泳動によってＤＮＡを精製し
、その後ＱＩＡＥＸ ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡバンドを単離
した。２）精製した試料中のベクター濃度を、次のような感染粒子（ＩＰ）及び
感染単位（ＩＵ）についてのアッセイによって測定した。（ｉ）ＩＰアッセイは
、ベクター試料を溶解緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＳＤＳ）で２０倍に希釈し、２
６０ｎｍで吸光度を測定することを含む；ＩＰへの換算は、１Ｏ．Ｄ．単位＝１
×１０１２ＩＰである。（ｉｉ）ＩＵアッセイは、２９３細胞培養を連続希釈ベ
クター試料に感染させ、感染培養を２日間インキュベートして、細胞をベクター
ゲノムにおけるグリーン蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）遺伝子の発現に関して蛍光顕微鏡で検査することを含む
。ＧＦＰ遺伝子を発現する細胞数からＩＵ力価を算定する。ＩＰ及びＩＵ力価は
±１０％以内で一致した。
スベクターを作製し、精製するための上記実施例２で要約した手順を、次の修正
を加えて使用した。シャトルベクターＤＮＡをＰｍｅＩで消化した後、エタノー
ル沈殿ステップの代わりにアガロースゲルでの電気泳動によってＤＮＡを精製し
、その後ＱＩＡＥＸ ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡバンドを単離
した。２）精製した試料中のベクター濃度を、次のような感染粒子（ＩＰ）及び
感染単位（ＩＵ）についてのアッセイによって測定した。（ｉ）ＩＰアッセイは
、ベクター試料を溶解緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＳＤＳ）で２０倍に希釈し、２
６０ｎｍで吸光度を測定することを含む；ＩＰへの換算は、１Ｏ．Ｄ．単位＝１
×１０１２ＩＰである。（ｉｉ）ＩＵアッセイは、２９３細胞培養を連続希釈ベ
クター試料に感染させ、感染培養を２日間インキュベートして、細胞をベクター
ゲノムにおけるグリーン蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）遺伝子の発現に関して蛍光顕微鏡で検査することを含む
。ＧＦＰ遺伝子を発現する細胞数からＩＵ力価を算定する。ＩＰ及びＩＵ力価は
±１０％以内で一致した。
【００６６】
腫瘍細胞におけるｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の合成
腫瘍細胞を１５０ｍｍの皿でほぼ集密まで増殖させ、１０ＩＵ／細胞の感染多
重度でｍｆＶＩＩａｓｍをコード化するアデノウイルスに細胞を感染させた。感
染細胞を無血清培地で４日間培養し、培地１．５ｍｌをプロテインＡビーズ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ）の懸濁液１０μｌと混合して、４℃でひと晩回転流動した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ負荷緩衝液１５μｌ中８０℃で３分間ビーズを加熱して、結合ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体を溶出し、溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別して、
ニトロセルロース膜に移した。免疫複合体のバンドを、ヤギ抗ヒト又は抗マウス
ＩｇＧ（Ｆｃ特異的）プローブでの免疫染色によって検出した。
重度でｍｆＶＩＩａｓｍをコード化するアデノウイルスに細胞を感染させた。感
染細胞を無血清培地で４日間培養し、培地１．５ｍｌをプロテインＡビーズ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ）の懸濁液１０μｌと混合して、４℃でひと晩回転流動した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ負荷緩衝液１５μｌ中８０℃で３分間ビーズを加熱して、結合ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体を溶出し、溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別して、
ニトロセルロース膜に移した。免疫複合体のバンドを、ヤギ抗ヒト又は抗マウス
ＩｇＧ（Ｆｃ特異的）プローブでの免疫染色によって検出した。
【００６７】
免疫欠損マウスにおける免疫療法試験
４から５週齢の雌性Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒ
ｍｓ）を免疫欠損マウスに関するすべての実験に使用した。ヒト黒色腫細胞系統
ＬＸＳＮ又はＴＦの単層培養をＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で解離し、洗って、
ＰＢＳに再懸濁した。５×１０５細胞を右ひ腹に皮下注入して皮膚腫瘍を生成し
、６×１０５ＴＦ細胞を尾静脈に静脈内注入して転移性肺腫瘍を生成した。皮膚
腫瘍の大きさをカリパスにより二次元で測定し、腫瘍容積を（幅）２（長さ）／
２として評価した。皮膚腫瘍が約１００ｍｍ３の容積まで成長したときに、ヒト
Ｆｃエフェクタードメインを含むアデノウイルスベクターの腫瘍内注入を開始し
た。各々の注入ステップに関して、総容量５０μｌのベクター試料を腫瘍の３又
は４部位に注入した。実験の終了時に剖検を実施して血液サンプルを採集し、腫
瘍と正常器官を形態学的及び組織学的検査用に調製した。
ｍｓ）を免疫欠損マウスに関するすべての実験に使用した。ヒト黒色腫細胞系統
ＬＸＳＮ又はＴＦの単層培養をＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で解離し、洗って、
ＰＢＳに再懸濁した。５×１０５細胞を右ひ腹に皮下注入して皮膚腫瘍を生成し
、６×１０５ＴＦ細胞を尾静脈に静脈内注入して転移性肺腫瘍を生成した。皮膚
腫瘍の大きさをカリパスにより二次元で測定し、腫瘍容積を（幅）２（長さ）／
２として評価した。皮膚腫瘍が約１００ｍｍ３の容積まで成長したときに、ヒト
Ｆｃエフェクタードメインを含むアデノウイルスベクターの腫瘍内注入を開始し
た。各々の注入ステップに関して、総容量５０μｌのベクター試料を腫瘍の３又
は４部位に注入した。実験の終了時に剖検を実施して血液サンプルを採集し、腫
瘍と正常器官を形態学的及び組織学的検査用に調製した。
【００６８】
免疫コンピテントマウスにおける免疫療法試験
４から５週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を免疫コンピテントマウスに関するすべての実験に使
用した。Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞の単層培養をＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ
に懸濁し、洗って、ＰＢＳに再懸濁した。５×１０５細胞を右ひ腹に皮下注入し
て皮膚腫瘍を生成した。皮膚腫瘍が約１４０−３２５ｍｍ３の推定容積まで成長
したときに、マウスＦｃエフェクタードメインを含むｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体をコード化するアデノウイルスベクターの尾静脈注入を開始した。プロトコー
ルの効果と安全性をモニターするための手順は、ＳＣＩＤマウスについて上述し
たのと同じである。
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を免疫コンピテントマウスに関するすべての実験に使
用した。Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞の単層培養をＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ
に懸濁し、洗って、ＰＢＳに再懸濁した。５×１０５細胞を右ひ腹に皮下注入し
て皮膚腫瘍を生成した。皮膚腫瘍が約１４０−３２５ｍｍ３の推定容積まで成長
したときに、マウスＦｃエフェクタードメインを含むｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合
体をコード化するアデノウイルスベクターの尾静脈注入を開始した。プロトコー
ルの効果と安全性をモニターするための手順は、ＳＣＩＤマウスについて上述し
たのと同じである。
【００６９】
ＳＧＯＴアッセイ
マウスから血清サンプルを採集し、凍結して、標準診断キットを用いてグルタ
ミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼについてアッセイした。
ミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼについてアッセイした。
【００７０】
試験結果
この試験に使用した２つの免疫複合体は、腫瘍標的ドメインとエフェクタード
メインから成る（図１）。標的ドメインは、腫瘍血管内皮細胞及び腫瘍細胞で発
現されるＴＦに結合するが、血液凝固を開始させない（実施例）、突然変異マウ
ス第ＶＩＩ因子分子（ｍｆＶＩＩａｓｍ）、若しくはヒト黒色腫細胞で選択的に
発現されるその同種抗原に結合するｓｃＦｖ抗体Ｇ７１−１のいずれかである（
ＣａｉとＧａｒｅｎ，前出、及び実施例１）。エフェクタードメインは、標的細
胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導するヒト又はマウスＩｇＧ１免疫グロブリ
ンのＦｃ領域である（実施例１）。免疫複合体を送達するためのベクターは、分
泌形態の免疫複合体をコード化する複製不全アデノウイルスである（実施例１）
。実施例１において、免疫複合体をコード化するベクターのＳＣＩＤマウスへの
静脈内注入は腫瘍の成長を阻害したが、静脈内注入したベクターによる感染の主
要標的である肝臓への組織学的損傷を引き起こした。一次感染が肝細胞から腫瘍
細胞に再指令されうるかどうかを調べるため、ベクターをＳＣＩＤマウスにおい
て増殖するヒト皮膚黒色腫に腫瘍内注入し、ベクターゲノムに挿入したグリーン
蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子の発現によって腫瘍と肝臓におけるベクターの分布
をマッピングした（図１４）。腫瘍においては強いＧＦＰの発現が検出されたが
、肝臓では検出されず、注入した腫瘍がベクターによる感染の主要標的であるこ
とを示した。腫瘍におけるＧＦＰ発現のパターンは、注射針が横切る経路に隣接
する数層の腫瘍細胞に限定されると思われた。
メインから成る（図１）。標的ドメインは、腫瘍血管内皮細胞及び腫瘍細胞で発
現されるＴＦに結合するが、血液凝固を開始させない（実施例）、突然変異マウ
ス第ＶＩＩ因子分子（ｍｆＶＩＩａｓｍ）、若しくはヒト黒色腫細胞で選択的に
発現されるその同種抗原に結合するｓｃＦｖ抗体Ｇ７１−１のいずれかである（
ＣａｉとＧａｒｅｎ，前出、及び実施例１）。エフェクタードメインは、標的細
胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導するヒト又はマウスＩｇＧ１免疫グロブリ
ンのＦｃ領域である（実施例１）。免疫複合体を送達するためのベクターは、分
泌形態の免疫複合体をコード化する複製不全アデノウイルスである（実施例１）
。実施例１において、免疫複合体をコード化するベクターのＳＣＩＤマウスへの
静脈内注入は腫瘍の成長を阻害したが、静脈内注入したベクターによる感染の主
要標的である肝臓への組織学的損傷を引き起こした。一次感染が肝細胞から腫瘍
細胞に再指令されうるかどうかを調べるため、ベクターをＳＣＩＤマウスにおい
て増殖するヒト皮膚黒色腫に腫瘍内注入し、ベクターゲノムに挿入したグリーン
蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子の発現によって腫瘍と肝臓におけるベクターの分布
をマッピングした（図１４）。腫瘍においては強いＧＦＰの発現が検出されたが
、肝臓では検出されず、注入した腫瘍がベクターによる感染の主要標的であるこ
とを示した。腫瘍におけるＧＦＰ発現のパターンは、注射針が横切る経路に隣接
する数層の腫瘍細胞に限定されると思われた。
【００７１】
ｍｆＶＩＩａｓｍとＧ７１−１免疫複合体をコード化する２つのベクターの混
合物を、ＳＣＩＤマウスで増殖するヒト黒色腫皮膚腫瘍に注入し、その後５日間
腫瘍容積を測定することによって、腫瘍成長へのベクター投与の影響を検討した
。血液中に分泌されるＧ７１−１免疫複合体の力価がより高いことを相殺するた
め、混合物中のｍｆＶＩＩａｓｍベクター対Ｇ７１−１ベクターの比は５：１で
あった（実施例２）。注入に使用した２つのベクターの結合用量は、７×１０４ から６×１０９感染単位（ＩＵ）の範囲であった。対照に関しては、免疫複合体
をコード化していない空ベクターを６×１０９ＩＵの用量で注入した。腫瘍成長
の最強の阻害は、免疫複合体をコード化するベクターの最高用量で得られた。こ
のベクターの用量を下記のすべてのＳＣＩＤマウス実験に使用した。
合物を、ＳＣＩＤマウスで増殖するヒト黒色腫皮膚腫瘍に注入し、その後５日間
腫瘍容積を測定することによって、腫瘍成長へのベクター投与の影響を検討した
。血液中に分泌されるＧ７１−１免疫複合体の力価がより高いことを相殺するた
め、混合物中のｍｆＶＩＩａｓｍベクター対Ｇ７１−１ベクターの比は５：１で
あった（実施例２）。注入に使用した２つのベクターの結合用量は、７×１０４ から６×１０９感染単位（ＩＵ）の範囲であった。対照に関しては、免疫複合体
をコード化していない空ベクターを６×１０９ＩＵの用量で注入した。腫瘍成長
の最強の阻害は、免疫複合体をコード化するベクターの最高用量で得られた。こ
のベクターの用量を下記のすべてのＳＣＩＤマウス実験に使用した。
【００７２】
次の実験では、ｍｆＶＩＩａｓｍとＧ７１−１免疫複合体をコード化する２つ
のベクターの多回腫瘍内注入での投与が腫瘍成長に及ぼす阻害作用を１９日間モ
ニターした。アデノウイルスベクターの最後の注入から２日後のマウス血液中の
免疫複合体蛋白質力価は１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの範囲であり、これは静
脈内注入したベクターによって生じる力価の約４分の１である（実施例２）。こ
れらの腫瘍の平均容積は、２つのベクターの１回目の注入後１日以内に約７０％
低下し、その後実験の残りの期間中容積は上昇しなかった。空対照ベクターを注
入した腫瘍は持続的に成長し、実験終了時には、２つの免疫複合体をコード化す
るベクターを注入した腫瘍の３０ｍｍ３に対し、１９００ｍｍ３の平均容積に達
した。ベクターの静脈内注入に関する先の実験（実施例２）と一致して、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するベクターだけを注入した腫瘍は、両方のベ
クターを注入した腫瘍とほぼ同じくらい強力に阻害された。マウスは実験期間を
通じて活動的なままであり、最後の注入から２日後に実施した剖検では、すべて
の器官が形態学的及び組織学的に正常であると思われ、出血の証拠は存在しなか
った。免疫複合体をコード化するベクターを静脈内注入したＳＣＩＤマウスは肝
細胞への組織学的損傷を示したので（実施例２）、腫瘍内注入したＳＣＩＤマウ
スの肝を組織学的損傷、そして機能的損傷に関しても検討した。静脈内注入マウ
スからの肝切片で認められた重要な組織学的変化に対し、腫瘍内注入マウスから
の肝切片は比較的軽度の変化を示した（図１５）。剖検の際にマウスから採取し
た血清中のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ酵素（ＳＧＯＴ）のア
ッセイにより、肝機能をモニターした。対照マウスと免疫複合体をコード化する
ベクターを注入したマウスのＳＧＯＴレベルは正常範囲内（２１０±２８Ｕ／Ｌ
）のままであり、肝機能がそこなわれなかったことを示した。
のベクターの多回腫瘍内注入での投与が腫瘍成長に及ぼす阻害作用を１９日間モ
ニターした。アデノウイルスベクターの最後の注入から２日後のマウス血液中の
免疫複合体蛋白質力価は１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの範囲であり、これは静
脈内注入したベクターによって生じる力価の約４分の１である（実施例２）。こ
れらの腫瘍の平均容積は、２つのベクターの１回目の注入後１日以内に約７０％
低下し、その後実験の残りの期間中容積は上昇しなかった。空対照ベクターを注
入した腫瘍は持続的に成長し、実験終了時には、２つの免疫複合体をコード化す
るベクターを注入した腫瘍の３０ｍｍ３に対し、１９００ｍｍ３の平均容積に達
した。ベクターの静脈内注入に関する先の実験（実施例２）と一致して、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するベクターだけを注入した腫瘍は、両方のベ
クターを注入した腫瘍とほぼ同じくらい強力に阻害された。マウスは実験期間を
通じて活動的なままであり、最後の注入から２日後に実施した剖検では、すべて
の器官が形態学的及び組織学的に正常であると思われ、出血の証拠は存在しなか
った。免疫複合体をコード化するベクターを静脈内注入したＳＣＩＤマウスは肝
細胞への組織学的損傷を示したので（実施例２）、腫瘍内注入したＳＣＩＤマウ
スの肝を組織学的損傷、そして機能的損傷に関しても検討した。静脈内注入マウ
スからの肝切片で認められた重要な組織学的変化に対し、腫瘍内注入マウスから
の肝切片は比較的軽度の変化を示した（図１５）。剖検の際にマウスから採取し
た血清中のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ酵素（ＳＧＯＴ）のア
ッセイにより、肝機能をモニターした。対照マウスと免疫複合体をコード化する
ベクターを注入したマウスのＳＧＯＴレベルは正常範囲内（２１０±２８Ｕ／Ｌ
）のままであり、肝機能がそこなわれなかったことを示した。
【００７３】
ｍｆＶＩＩａｓｍとＧ７１−１免疫複合体をコード化するベクターを注入した
マウスから回収した腫瘍は、おそらくＴＦに結合したｍｆｖＶＩＩａｓｍ免疫複
合体によって誘導される、血管内皮細胞に対する細胞溶解性免疫応答の結果とし
て、血管がほとんど全く存在しなかった。
マウスから回収した腫瘍は、おそらくＴＦに結合したｍｆｖＶＩＩａｓｍ免疫複
合体によって誘導される、血管内皮細胞に対する細胞溶解性免疫応答の結果とし
て、血管がほとんど全く存在しなかった。
【００７４】
腫瘍内注入プロトコールの効果は、注入した皮膚腫瘍の阻害だけでなく、注入
のためにアクセスすることができない転移性腫瘍の抑制にも依存する。転移性腫
瘍への阻害作用を調べるため、ヒト黒色腫ＴＦ細胞を尾静脈に注入して、主とし
て肺への血液運搬性転移を生じさせたＳＣＩＤマウスモデルを使用した。同時に
ヒト黒色腫ＬＸＳＮ細胞をマウスに皮下注入し、１２日後に形成された皮膚腫瘍
に、２つの免疫複合体をコード化するベクター又は空対照ベクターを注入した。
次の８週間、週に２回のスケジュールで腫瘍内注入を続け、最後の注入から２日
後に剖検を行って、肺表面上の腫瘍結節の数を測定した（表２）。対照ベクター
を注入した２匹のマウスはそれぞれ１４個と２９個の肺結節を有しており、一方
２つの免疫複合体をコード化するベクターを注入した５匹のマウスに関しては、
３匹は全く肺結節がなく、２匹がそれぞれ１個と５個の結節を有していた。これ
らの結果は、２つの免疫複合体をコード化するベクターの腫瘍内注入が、注入し
た腫瘍と同様に遠隔転移性腫瘍の成長も阻害しうることを示している。
のためにアクセスすることができない転移性腫瘍の抑制にも依存する。転移性腫
瘍への阻害作用を調べるため、ヒト黒色腫ＴＦ細胞を尾静脈に注入して、主とし
て肺への血液運搬性転移を生じさせたＳＣＩＤマウスモデルを使用した。同時に
ヒト黒色腫ＬＸＳＮ細胞をマウスに皮下注入し、１２日後に形成された皮膚腫瘍
に、２つの免疫複合体をコード化するベクター又は空対照ベクターを注入した。
次の８週間、週に２回のスケジュールで腫瘍内注入を続け、最後の注入から２日
後に剖検を行って、肺表面上の腫瘍結節の数を測定した（表２）。対照ベクター
を注入した２匹のマウスはそれぞれ１４個と２９個の肺結節を有しており、一方
２つの免疫複合体をコード化するベクターを注入した５匹のマウスに関しては、
３匹は全く肺結節がなく、２匹がそれぞれ１個と５個の結節を有していた。これ
らの結果は、２つの免疫複合体をコード化するベクターの腫瘍内注入が、注入し
た腫瘍と同様に遠隔転移性腫瘍の成長も阻害しうることを示している。
【００７５】
【表２】
【００７６】
臨床環境でのプロトコールの効果に影響を及ぼしうるもう１つのパラメータは
、免疫複合体又はアデノウイルスベクターへの患者の免疫応答である。臨床用の
免疫複合体の標的及びエフェクタードメインはヒト蛋白質から誘導されることに
なるので、患者は免疫複合体に対して有意の免疫応答を示さないはずである。し
かし、アデノウイルスベクターはヒトにおいて、またマウスにおいても強い免疫
原性である。マウスにおけるアデノウイルスベクターへの免疫応答の影響を調べ
るため、マウス黒色腫皮膚腫瘍を担う免疫コンピテントマウスでプロトコールを
試験した。マウス黒色腫細胞をベクターに感染させることはできないので、実験
はベクターの腫瘍内注入ではなく静脈内注入を含んだ。また、マウス黒色腫細胞
はｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に結合するが、Ｇ７１−１免疫複合体には結合し
ないので、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体だけしか試験することができなかった。
この実験のための免疫複合体のＦｃエフェクタードメインは、マウスＩｇＧ１免
疫グロブリンから誘導した。結果は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化す
るアデノウイルスベクターの静脈内注入が、ＳＣＩＤマウスと同様に免疫コンピ
テントマウスにおいても黒色腫の成長阻害をもたらすことを示している（図１６
）。
、免疫複合体又はアデノウイルスベクターへの患者の免疫応答である。臨床用の
免疫複合体の標的及びエフェクタードメインはヒト蛋白質から誘導されることに
なるので、患者は免疫複合体に対して有意の免疫応答を示さないはずである。し
かし、アデノウイルスベクターはヒトにおいて、またマウスにおいても強い免疫
原性である。マウスにおけるアデノウイルスベクターへの免疫応答の影響を調べ
るため、マウス黒色腫皮膚腫瘍を担う免疫コンピテントマウスでプロトコールを
試験した。マウス黒色腫細胞をベクターに感染させることはできないので、実験
はベクターの腫瘍内注入ではなく静脈内注入を含んだ。また、マウス黒色腫細胞
はｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に結合するが、Ｇ７１−１免疫複合体には結合し
ないので、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体だけしか試験することができなかった。
この実験のための免疫複合体のＦｃエフェクタードメインは、マウスＩｇＧ１免
疫グロブリンから誘導した。結果は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化す
るアデノウイルスベクターの静脈内注入が、ＳＣＩＤマウスと同様に免疫コンピ
テントマウスにおいても黒色腫の成長阻害をもたらすことを示している（図１６
）。
【００７７】
ＴＦは一般に腫瘍血管内皮細胞、及びほとんどの転移性腫瘍細胞によっても発
現されるので、ｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は、ヒト黒色腫だけでなく広いスペク
トルの他のヒト腫瘍に対しても細胞溶解性免疫応答を仲介すると考えられる。こ
こで報告した試験で示すように、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するア
デノウイルスベクターのヒト腫瘍への腫瘍内注入は、免疫複合体の高い血液力価
を確立し、維持するための安全で有効なプロトコールであると思われる。しかし
、注入した腫瘍の細胞はアデノウイルスによる感染に感受性であり、コード化さ
れた免疫複合体を合成し、分泌することができるはずである。ヒト黒色腫、前立
腺癌、乳癌、膵癌、腎癌、胃癌及び神経芽細胞腫細胞系統、並びにマウス黒色腫
及び乳癌細胞系統から成る、ヒト及びマウスの腫瘍細胞系統のパネルを、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクターの宿主として試験
した。ヒト腫瘍細胞系統はすべてほぼ同じ量の免疫複合体蛋白質を産生し、分泌
したことから、腫瘍内注入プロトコールが黒色腫に加えて他の種類のヒト固体腫
瘍にも使用できることを示唆した。マウス腫瘍系統は、おそらくマウス細胞がア
デノウイルスベクターに感染しなかったために、免疫複合体蛋白質を生成するこ
とができなかった。
現されるので、ｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体は、ヒト黒色腫だけでなく広いスペク
トルの他のヒト腫瘍に対しても細胞溶解性免疫応答を仲介すると考えられる。こ
こで報告した試験で示すように、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するア
デノウイルスベクターのヒト腫瘍への腫瘍内注入は、免疫複合体の高い血液力価
を確立し、維持するための安全で有効なプロトコールであると思われる。しかし
、注入した腫瘍の細胞はアデノウイルスによる感染に感受性であり、コード化さ
れた免疫複合体を合成し、分泌することができるはずである。ヒト黒色腫、前立
腺癌、乳癌、膵癌、腎癌、胃癌及び神経芽細胞腫細胞系統、並びにマウス黒色腫
及び乳癌細胞系統から成る、ヒト及びマウスの腫瘍細胞系統のパネルを、ｍｆＶ
ＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクターの宿主として試験
した。ヒト腫瘍細胞系統はすべてほぼ同じ量の免疫複合体蛋白質を産生し、分泌
したことから、腫瘍内注入プロトコールが黒色腫に加えて他の種類のヒト固体腫
瘍にも使用できることを示唆した。マウス腫瘍系統は、おそらくマウス細胞がア
デノウイルスベクターに感染しなかったために、免疫複合体蛋白質を生成するこ
とができなかった。
【００７８】
考察
この実施例で述べた癌の免疫療法プロトコールは、腫瘍血管系及び腫瘍細胞に
対する細胞溶解性免疫応答を仲介する免疫複合体分子をコード化する、複製不全
アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を含む（図１）。ベクターに感染した細胞
はコード化された免疫複合体を合成し、それらは血液中に分泌されて、腫瘍血管
系内皮細胞及び腫瘍細胞上の同種標的に結合する。ベクターは主として肝細胞で
はなく注入された腫瘍の細胞に感染するので、ベクターの腫瘍内注入は静脈内注
入に比べて重要な安全上の利点を提供する。マウスの肝臓あるいは他のいずれの
器官も、反復腫瘍内注入から有意の損傷を示さなかった。黒色腫以外のいくつか
の型のヒト腫瘍細胞も、ベクターに感染してコード化された免疫複合体を合成し
、分泌することができる。それ故、ベクターの腫瘍内注入経路はヒト固体腫瘍に
一般的に適用しうる。注入のためにアクセス可能な腫瘍がない場合には、罹病性
の正常組織にベクターを注入することができるであろう。
対する細胞溶解性免疫応答を仲介する免疫複合体分子をコード化する、複製不全
アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を含む（図１）。ベクターに感染した細胞
はコード化された免疫複合体を合成し、それらは血液中に分泌されて、腫瘍血管
系内皮細胞及び腫瘍細胞上の同種標的に結合する。ベクターは主として肝細胞で
はなく注入された腫瘍の細胞に感染するので、ベクターの腫瘍内注入は静脈内注
入に比べて重要な安全上の利点を提供する。マウスの肝臓あるいは他のいずれの
器官も、反復腫瘍内注入から有意の損傷を示さなかった。黒色腫以外のいくつか
の型のヒト腫瘍細胞も、ベクターに感染してコード化された免疫複合体を合成し
、分泌することができる。それ故、ベクターの腫瘍内注入経路はヒト固体腫瘍に
一般的に適用しうる。注入のためにアクセス可能な腫瘍がない場合には、罹病性
の正常組織にベクターを注入することができるであろう。
【００７９】
腫瘍内注入プロトコールの治療効果をヒト皮膚黒色腫及び転移性肺黒色腫のＳ
ＣＩＤマウスモデルで試験した。試験は、異なる標的ドメインを含む２つの免疫
複合体を含んだ。１）１つの標的ドメインは、腫瘍新生血管系の血管を含めた増
殖する血管の内皮細胞によって、そしてまた大部分のヒト腫瘍細胞によっても発
現される膜内外レセプタ組織因子に高い親和性と特異性で結合する血液チモーゲ
ン第ＶＩＩ（ｆＶＩＩ）因子である。ｆＶＩＩ免疫複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで
標的細胞上の組織因子への結合に関して内因性第ＶＩＩ因子と競合するはずであ
る。２つの標的ドメインのアビディティ作用が組織因子の多数のコピーを発現す
る細胞への結合を増強するので、この競合はモノマー内因性分子に比べてホモダ
イマーである免疫複合体分子（図１）の方が圧倒的に有利である（実施例２）；
また、内因性第ＶＩＩ因子よりもベクターがコード化するｆＶＩＩ免疫複合体の
方が血液力価が高い。ＳＣＩＤマウスにおいて増殖するヒト腫瘍異種移植片を含
む実験には、マウスｆＶＩＩ標的ドメインを使用した、マウスｆＶＩＩ標的ドメ
インは、腫瘍細胞上のヒト組織因子及び腫瘍血管系のマウス内皮細胞上のマウス
組織因子の両方に緊密に結合するからである。播種性血管内凝固を引き起こす可
能性がある、ｆＶＩＩ免疫複合体が組織因子に結合することによる血液凝固経路
の開始を防ぐため、マウスｆＶＩＩ標的ドメインの活性部位に突然変異を導入し
た（ｍｆＶＩＩａｓｍ）。２）第二の標的ドメインは、ヒト黒色腫細胞によって
選択的に発現される硫酸コンドロイチンプロテオグリカンに結合する、一本鎖Ｆ
ｖ（ｓｃＦｖ）抗体Ｇ７１−１である（実施例１及び２）。免疫療法試験の結果
は、単独で又はＧ７１−１免疫複合体をコード化するベクターと共に、ｍｆＶＩ
Ｉａｓｍ免疫複合体をコード化するベクターを腫瘍内注入すると、注入した皮膚
腫瘍、そして同時に転移性肺腫瘍の成長も阻害することを示した（図１６及び表
２）。免疫複合体をコード化するベクターの腫瘍内注入後に存在する残留腫瘍組
織にはほとんど血管が存在せず（図１３）、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体が、腫
瘍新生血管系の広汎な破壊をもたらす強力な細胞溶解性免疫応答を誘導すること
を示唆した。
ＣＩＤマウスモデルで試験した。試験は、異なる標的ドメインを含む２つの免疫
複合体を含んだ。１）１つの標的ドメインは、腫瘍新生血管系の血管を含めた増
殖する血管の内皮細胞によって、そしてまた大部分のヒト腫瘍細胞によっても発
現される膜内外レセプタ組織因子に高い親和性と特異性で結合する血液チモーゲ
ン第ＶＩＩ（ｆＶＩＩ）因子である。ｆＶＩＩ免疫複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで
標的細胞上の組織因子への結合に関して内因性第ＶＩＩ因子と競合するはずであ
る。２つの標的ドメインのアビディティ作用が組織因子の多数のコピーを発現す
る細胞への結合を増強するので、この競合はモノマー内因性分子に比べてホモダ
イマーである免疫複合体分子（図１）の方が圧倒的に有利である（実施例２）；
また、内因性第ＶＩＩ因子よりもベクターがコード化するｆＶＩＩ免疫複合体の
方が血液力価が高い。ＳＣＩＤマウスにおいて増殖するヒト腫瘍異種移植片を含
む実験には、マウスｆＶＩＩ標的ドメインを使用した、マウスｆＶＩＩ標的ドメ
インは、腫瘍細胞上のヒト組織因子及び腫瘍血管系のマウス内皮細胞上のマウス
組織因子の両方に緊密に結合するからである。播種性血管内凝固を引き起こす可
能性がある、ｆＶＩＩ免疫複合体が組織因子に結合することによる血液凝固経路
の開始を防ぐため、マウスｆＶＩＩ標的ドメインの活性部位に突然変異を導入し
た（ｍｆＶＩＩａｓｍ）。２）第二の標的ドメインは、ヒト黒色腫細胞によって
選択的に発現される硫酸コンドロイチンプロテオグリカンに結合する、一本鎖Ｆ
ｖ（ｓｃＦｖ）抗体Ｇ７１−１である（実施例１及び２）。免疫療法試験の結果
は、単独で又はＧ７１−１免疫複合体をコード化するベクターと共に、ｍｆＶＩ
Ｉａｓｍ免疫複合体をコード化するベクターを腫瘍内注入すると、注入した皮膚
腫瘍、そして同時に転移性肺腫瘍の成長も阻害することを示した（図１６及び表
２）。免疫複合体をコード化するベクターの腫瘍内注入後に存在する残留腫瘍組
織にはほとんど血管が存在せず（図１３）、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体が、腫
瘍新生血管系の広汎な破壊をもたらす強力な細胞溶解性免疫応答を誘導すること
を示唆した。
【００８０】
上記の説明は、当業者が本発明をいかにして実施するかを教示するためのもの
であり、説明の読後に当業者に明白となるであろう本発明の明らかな修正及びバ
リエーションをすべて詳述することは意図されていない。しかしながら、そのよ
うな明らかな修正及びバリエーションはすべて、下記の特許請求の範囲によって
定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。特許請求の範囲は
、特に異なる記載がないかぎり、意図されている目的を達成するために有効な、
あらゆる順序での特許請求されている成分及び段階をカバーすることが意図され
ている。
であり、説明の読後に当業者に明白となるであろう本発明の明らかな修正及びバ
リエーションをすべて詳述することは意図されていない。しかしながら、そのよ
うな明らかな修正及びバリエーションはすべて、下記の特許請求の範囲によって
定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。特許請求の範囲は
、特に異なる記載がないかぎり、意図されている目的を達成するために有効な、
あらゆる順序での特許請求されている成分及び段階をカバーすることが意図され
ている。
【００８１】
本文中で引用する論文、特許及び特許出願、並びにそれらの中で引用される参
考文献は、明白にその全体が参照してここに組み込まれる。
考文献は、明白にその全体が参照してここに組み込まれる。
【配列表】
【図１】
図１は、本発明の免疫複合体分子の機構を例示する図表である。ＴＤ；標的ド
メイン。Ｈ：２つのジスルフィド架橋を持つＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領
域。ＣＨ２及びＣＨ３：ＩｇＧ１免疫グロブリンの定常領域。標的ドメインは、
典型的には突然変異した活性部位を持つヒト第ＶＩＩ因子、あるいはヒトｓｃＦ
ｖ又はＶＨ分子から成る。エフェクタードメインは、典型的には、非修飾である
か又は放射性分子又は光活性化色素分子のような細胞傷害性物質に複合した、ヒ
トＩｇＧ１のＦｃ領域から成る。
メイン。Ｈ：２つのジスルフィド架橋を持つＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領
域。ＣＨ２及びＣＨ３：ＩｇＧ１免疫グロブリンの定常領域。標的ドメインは、
典型的には突然変異した活性部位を持つヒト第ＶＩＩ因子、あるいはヒトｓｃＦ
ｖ又はＶＨ分子から成る。エフェクタードメインは、典型的には、非修飾である
か又は放射性分子又は光活性化色素分子のような細胞傷害性物質に複合した、ヒ
トＩｇＧ１のＦｃ領域から成る。
【図２】
図２は、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるヒト黒色腫細胞の免疫複合
体依存性溶解を示す棒グラフである。免疫複合体の標的ドメインは黒色腫特異的
ヒトｓｃＦｖ分子であり、エフェクタードメインはヒトＩｇＧ１免疫グロブリン
のＦｃ領域である。ヒト黒色腫細胞系統Ａ−２０５８及びヒト線維芽細胞対照を
蛍光色素、カルセイン−ＡＭで標識した。ＮＫ細胞単独（棒Ａ）又はｓｃＦｖ免
疫複合体Ｅ２６−１とＮＫ細胞（棒Ｂ）への接触後、無傷のままである黒色腫又
は線維芽細胞の分画を残留蛍光によって測定した。ＮＫエフェクター細胞対標的
細胞の比率（Ｅ／Ｔ）は３から２０の範囲であった。３つの完全なセットの実験
を黒色腫細胞と線維芽細胞の両方について実施した；各々の実験に関して、細胞
溶解アッセイを四重に実施した。図に示す棒は、３回の実験についての細胞溶解
アッセイの平均値を表わし、一般に１０％以内で一致した。％細胞溶解を実施例
１で述べたように算定した。ｓｃＦｖ免疫複合体Ｇ７１−１に関しても同様の結
果を得た。
体依存性溶解を示す棒グラフである。免疫複合体の標的ドメインは黒色腫特異的
ヒトｓｃＦｖ分子であり、エフェクタードメインはヒトＩｇＧ１免疫グロブリン
のＦｃ領域である。ヒト黒色腫細胞系統Ａ−２０５８及びヒト線維芽細胞対照を
蛍光色素、カルセイン−ＡＭで標識した。ＮＫ細胞単独（棒Ａ）又はｓｃＦｖ免
疫複合体Ｅ２６−１とＮＫ細胞（棒Ｂ）への接触後、無傷のままである黒色腫又
は線維芽細胞の分画を残留蛍光によって測定した。ＮＫエフェクター細胞対標的
細胞の比率（Ｅ／Ｔ）は３から２０の範囲であった。３つの完全なセットの実験
を黒色腫細胞と線維芽細胞の両方について実施した；各々の実験に関して、細胞
溶解アッセイを四重に実施した。図に示す棒は、３回の実験についての細胞溶解
アッセイの平均値を表わし、一般に１０％以内で一致した。％細胞溶解を実施例
１で述べたように算定した。ｓｃＦｖ免疫複合体Ｇ７１−１に関しても同様の結
果を得た。
【図３】
図３は、補体によるヒト黒色腫細胞の免疫複合体依存性溶解を示す棒グラフで
ある。手順は、ＮＫ細胞の代わりにヒト血清又は精製ウサギ補体成分を使用した
ことを除いて、図２の説明で述べたとおりであった。各々のアッセイについての
免疫複合体と補体試薬は実施例１、表１に示されているとおりであった。
ある。手順は、ＮＫ細胞の代わりにヒト血清又は精製ウサギ補体成分を使用した
ことを除いて、図２の説明で述べたとおりであった。各々のアッセイについての
免疫複合体と補体試薬は実施例１、表１に示されているとおりであった。
【図４】
図４は、ＳＣＩＤマウスで増殖させたヒト黒色腫異種移植片における腫瘍細胞
及び腫瘍血管内皮細胞への突然変異マウス第ＶＩＩ因子（ｍｆＶＩＩａｓｍ）免
疫複合体の結合に関する免疫組織化学アッセイを示す。第二抗体はＡＰで標識し
た抗ヒトγ鎖であり、ＡＰ基質は青色を生じるＢＣＩＰ／ＮＢＴであった；対比
染色はメチルグリーンであった。パネルＡ：異種移植片の広汎な血管形成を示す
、ヘマトキシリン＋エオシンで染色した対照。パネルＢ：血管内皮細胞と腫瘍細
胞の両方の強い染色を示す、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に関する免疫組織化学
。パネルＣ：ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体なしの免疫組織化学的対照。
及び腫瘍血管内皮細胞への突然変異マウス第ＶＩＩ因子（ｍｆＶＩＩａｓｍ）免
疫複合体の結合に関する免疫組織化学アッセイを示す。第二抗体はＡＰで標識し
た抗ヒトγ鎖であり、ＡＰ基質は青色を生じるＢＣＩＰ／ＮＢＴであった；対比
染色はメチルグリーンであった。パネルＡ：異種移植片の広汎な血管形成を示す
、ヘマトキシリン＋エオシンで染色した対照。パネルＢ：血管内皮細胞と腫瘍細
胞の両方の強い染色を示す、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体に関する免疫組織化学
。パネルＣ：ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体なしの免疫組織化学的対照。
【図５】
図５は、免疫複合体をコード化する複製不全アデノウイルスベクターの静脈内
注入後の、ＳＣＩＤマウスの血液中のＧ７１−１ ｓｃＦｖ及びｍｆＶＩＩａｓ
ｍ免疫複合体の濃度を示す折れ線グラフである。０日目と７日目に、Ｇ７１−１
免疫複合体をコード化する２×１０１１アデノウイルス（Ａ）又はｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体をコード化する４×１０１１アデノウイルス（Ｂ）をマウスに注
入した。コード化された免疫複合体の血液中の濃度をＥＬＩＳＡによって定量し
た。各点は、各々の群の５匹のマウスに関する濃度の平均値である。
注入後の、ＳＣＩＤマウスの血液中のＧ７１−１ ｓｃＦｖ及びｍｆＶＩＩａｓ
ｍ免疫複合体の濃度を示す折れ線グラフである。０日目と７日目に、Ｇ７１−１
免疫複合体をコード化する２×１０１１アデノウイルス（Ａ）又はｍｆＶＩＩａ
ｓｍ免疫複合体をコード化する４×１０１１アデノウイルス（Ｂ）をマウスに注
入した。コード化された免疫複合体の血液中の濃度をＥＬＩＳＡによって定量し
た。各点は、各々の群の５匹のマウスに関する濃度の平均値である。
【図６】
図６は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト黒色腫異種移植片の成長へのＧ７１−１
及びｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用を示す折れ線グラフである。各々の
曲線に関して、５匹のＳＣＩＤマウスに５×１０５ ＴＦ２細胞を皮下注入した
。異種移植片が触知可能な大きさに成長したとき、図に示す０日目と７日目に、
マウスにアデノウイルスの尾静脈注入を実施した。注入したアデノウイルスの量
は、対照については４×１０１１、Ｇ７１−１免疫複合体をコード化するアデノ
ウイルスについては２×１０１１、そしてｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード
化するアデノウイルスについては４×１０１１であった。推定腫瘍容積は各群の
５匹のマウスについての平均値である。
及びｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用を示す折れ線グラフである。各々の
曲線に関して、５匹のＳＣＩＤマウスに５×１０５ ＴＦ２細胞を皮下注入した
。異種移植片が触知可能な大きさに成長したとき、図に示す０日目と７日目に、
マウスにアデノウイルスの尾静脈注入を実施した。注入したアデノウイルスの量
は、対照については４×１０１１、Ｇ７１−１免疫複合体をコード化するアデノ
ウイルスについては２×１０１１、そしてｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード
化するアデノウイルスについては４×１０１１であった。推定腫瘍容積は各群の
５匹のマウスについての平均値である。
【図７】
図７は、図６及び実施例２で報告した実験からの異種移植片の腫瘍重量を示す
棒グラフである。２０日目、すなわちアデノウイルスの最後の注入から６日後に
、マウスから異種移植片を切除した。棒の高さは各群の５匹のマウスについての
平均重量である。
棒グラフである。２０日目、すなわちアデノウイルスの最後の注入から６日後に
、マウスから異種移植片を切除した。棒の高さは各群の５匹のマウスについての
平均重量である。
【図８】
図８は、ＳＣＩＤマウスにおける大きなヒト黒色腫異種移植片の成長へのＧ７
１−１及びｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用を示す折れ線グラフである。
各々のマウスに５×１０５の黒色腫細胞を皮下注入し、異種移植片を皮膚表面で
５０ｍｍ３の推定腫瘍容積まで成長させた（１日目）。１、６、１２及び１９日
目に、Ｇ７１−１免疫複合体をコード化する２×１０１１のアデノウイルスとｍ
ｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化する７×１０１１のアデノウイルスの混合
物を５匹のマウスの尾静脈に注入した。対照として５匹のマウスに免疫複合体を
コード化していない４×１０１１のアデノウイルスを注入した。推定腫瘍容積は
各群の５匹のマウスについての平均値である。免疫複合体をコード化するアデノ
ウイルスを注入したマウスのうちの１匹が１７日目に死亡していた；その後の日
にちに関する推定腫瘍容積は残りの４匹のマウスの平均値である。
１−１及びｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用を示す折れ線グラフである。
各々のマウスに５×１０５の黒色腫細胞を皮下注入し、異種移植片を皮膚表面で
５０ｍｍ３の推定腫瘍容積まで成長させた（１日目）。１、６、１２及び１９日
目に、Ｇ７１−１免疫複合体をコード化する２×１０１１のアデノウイルスとｍ
ｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化する７×１０１１のアデノウイルスの混合
物を５匹のマウスの尾静脈に注入した。対照として５匹のマウスに免疫複合体を
コード化していない４×１０１１のアデノウイルスを注入した。推定腫瘍容積は
各群の５匹のマウスについての平均値である。免疫複合体をコード化するアデノ
ウイルスを注入したマウスのうちの１匹が１７日目に死亡していた；その後の日
にちに関する推定腫瘍容積は残りの４匹のマウスの平均値である。
【図９】
図９は、低レベルの組織因子を発現するヒト黒色腫異種移植片の成長へのｍｆ
ＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用をプロットした折れ線グラフである。マウス
に５×１０５のＬＸＳＮ細胞を皮下注入し、異種移植片が触知可能な大きさに成
長したとき（０日目）、５匹のマウスにｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化
する９×１０１１のアデノウイルスを静脈内注入し、５匹のマウスに４×１０１ １ の対照アデノウイルスを注入した。７、１３、２１及び２４日に追加注入を行
い、２５日目に形態学的及び組織化学的検査のためにマウスを解剖した。推定腫
瘍容積は各群の５匹のマウスについての平均値である。
ＶＩＩａｓｍ免疫複合体の阻害作用をプロットした折れ線グラフである。マウス
に５×１０５のＬＸＳＮ細胞を皮下注入し、異種移植片が触知可能な大きさに成
長したとき（０日目）、５匹のマウスにｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化
する９×１０１１のアデノウイルスを静脈内注入し、５匹のマウスに４×１０１ １ の対照アデノウイルスを注入した。７、１３、２１及び２４日に追加注入を行
い、２５日目に形態学的及び組織化学的検査のためにマウスを解剖した。推定腫
瘍容積は各群の５匹のマウスについての平均値である。
【図１０】
図１０は、図９及び実施例２の説明で報告した実験からのヒト黒色腫異種移植
片の組織化学を示すものである。２５日目に異種移植片を切除し、パラフィンに
包埋して、切片をヘマトキシリン＋エオシンで染色した。パネルＡ：免疫複合体
をコード化していないアデノウイルスを注入した対照マウスからの異種移植片。
パネルＢ：ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入し
たマウスからの異種移植片。
片の組織化学を示すものである。２５日目に異種移植片を切除し、パラフィンに
包埋して、切片をヘマトキシリン＋エオシンで染色した。パネルＡ：免疫複合体
をコード化していないアデノウイルスを注入した対照マウスからの異種移植片。
パネルＢ：ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスを注入し
たマウスからの異種移植片。
【図１１】
図１１は、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍内注入したアデノウイルスベクターが
ヒト黒色腫の成長に及ぼす用量効果を示す折れ線グラフである。最初にマウスに
ヒト黒色腫細胞系統ＴＦ２を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている大き
さまで成長したとき、ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコード化す
る２つのアデノウイルスベクターの混合物を腫瘍に注入した。２つのベクターの
用量は次のとおりであった。○：７×１０８ＩＵ；▽：２×１０９ＩＵ；□：６
×１０９ＩＵ。対照である◇の用量については、免疫複合体をコード化していな
いアデノウイルス６×１０９ＩＵを注入した。
ヒト黒色腫の成長に及ぼす用量効果を示す折れ線グラフである。最初にマウスに
ヒト黒色腫細胞系統ＴＦ２を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている大き
さまで成長したとき、ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコード化す
る２つのアデノウイルスベクターの混合物を腫瘍に注入した。２つのベクターの
用量は次のとおりであった。○：７×１０８ＩＵ；▽：２×１０９ＩＵ；□：６
×１０９ＩＵ。対照である◇の用量については、免疫複合体をコード化していな
いアデノウイルス６×１０９ＩＵを注入した。
【図１２】
図１２は、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍内注入した高用量のアデノウイルスベ
クターがヒト黒色腫の成長に及ぼす作用を示す折れ線グラフである。最初にマウ
スにヒト黒色腫細胞系統ＴＦ２を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている
大きさまで成長したとき、次のアデノウイルスベクターの６×１０９ＩＵを注入
した：●、対照ベクター（３匹のマウス）；■、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を
コード化するベクター；△、ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコー
ド化する２つのベクターの混合物（６匹のマウス）。２、５、７、９、１１、１
３、１５及び１７日目に追加注入を実施した。各曲線上の点は、対応する群のす
べてのマウスについての測定値の平均（±２０％）である。
クターがヒト黒色腫の成長に及ぼす作用を示す折れ線グラフである。最初にマウ
スにヒト黒色腫細胞系統ＴＦ２を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている
大きさまで成長したとき、次のアデノウイルスベクターの６×１０９ＩＵを注入
した：●、対照ベクター（３匹のマウス）；■、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体を
コード化するベクター；△、ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコー
ド化する２つのベクターの混合物（６匹のマウス）。２、５、７、９、１１、１
３、１５及び１７日目に追加注入を実施した。各曲線上の点は、対応する群のす
べてのマウスについての測定値の平均（±２０％）である。
【図１３】
図１３は、ｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体の混合物をコード化す
るアデノウイルスベクター又は空アデノウイルスベクター対照を腫瘍内注入した
ＳＣＩＤマウスからの黒色腫の写真である。実験は上記図１２の説明及び実施例
３の中で述べられている。最後の注入から２日後に腫瘍を切除し、写真撮影した
。図の上部のものさしの原寸は１ｃｍである。
るアデノウイルスベクター又は空アデノウイルスベクター対照を腫瘍内注入した
ＳＣＩＤマウスからの黒色腫の写真である。実験は上記図１２の説明及び実施例
３の中で述べられている。最後の注入から２日後に腫瘍を切除し、写真撮影した
。図の上部のものさしの原寸は１ｃｍである。
【図１４】
図１４は、腫瘍内注入後の腫瘍内及び肝臓におけるアデノウイルスベクターの
分布を示す写真である。ＧＦＰ蛋白質をコード化するが免疫複合体をコード化し
ない対照ベクターは、ＳＣＩＤマウスで増殖するヒト黒色腫皮膚腫瘍の３つの部
位に注入した。総ベクター用量は６×１０９ＩＵであった。注入の４０時間後に
腫瘍と肝臓を切除し、蛍光光学系を備えた解剖顕微鏡下に無傷検査した。４８０
ｎｍの励起と６３０ｎｍの発光でＧＦＰシグナルが検出され、５７７ｎｍの励起
と６３０ｎｍの発光でバックグラウンドシグナルが検出された。パネルＡ：腫瘍
のＧＦＰ。パネルＢ：腫瘍のバックグラウンド。パネルＣ：肝臓のＧＦＰ。パネ
ルＤ：肝臓のバックグラウンド。パネルＡのものと同様の明るい蛍光スポットが
、おそらく注入部位に対応する、他の２箇所の腫瘍部位でも検出された。写真は
組織内の１つのレベルに焦点を合わせている。しかし、そのレベルの上と下に焦
点を合わせると腫瘍内でもＧＦＰスポットが検出でき、注射針が横切った経路に
隣接する腫瘍細胞だけがベクターによって感染する細胞であることを示唆した。
分布を示す写真である。ＧＦＰ蛋白質をコード化するが免疫複合体をコード化し
ない対照ベクターは、ＳＣＩＤマウスで増殖するヒト黒色腫皮膚腫瘍の３つの部
位に注入した。総ベクター用量は６×１０９ＩＵであった。注入の４０時間後に
腫瘍と肝臓を切除し、蛍光光学系を備えた解剖顕微鏡下に無傷検査した。４８０
ｎｍの励起と６３０ｎｍの発光でＧＦＰシグナルが検出され、５７７ｎｍの励起
と６３０ｎｍの発光でバックグラウンドシグナルが検出された。パネルＡ：腫瘍
のＧＦＰ。パネルＢ：腫瘍のバックグラウンド。パネルＣ：肝臓のＧＦＰ。パネ
ルＤ：肝臓のバックグラウンド。パネルＡのものと同様の明るい蛍光スポットが
、おそらく注入部位に対応する、他の２箇所の腫瘍部位でも検出された。写真は
組織内の１つのレベルに焦点を合わせている。しかし、そのレベルの上と下に焦
点を合わせると腫瘍内でもＧＦＰスポットが検出でき、注射針が横切った経路に
隣接する腫瘍細胞だけがベクターによって感染する細胞であることを示唆した。
【図１５】
図１５は、アデノウイルスベクターを静脈内又は腫瘍内注入したＳＣＩＤマウ
スからの肝せっっぺんを示す。静脈内実験は実施例２に述べられ、腫瘍内実験は
実施例３に述べられている。左側のパネルは対照ベクターを注入したものであり
、右側のパネルはｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコード化する２
つのベクターの混合物を注入したものである。最後の注入から２日後に肝臓を切
除し、ヘマトキシリンとエオシンで染色して、１００×の倍率で写真撮影した。
スからの肝せっっぺんを示す。静脈内実験は実施例２に述べられ、腫瘍内実験は
実施例３に述べられている。左側のパネルは対照ベクターを注入したものであり
、右側のパネルはｍｆＶＩＩａｓｍ及びＧ７１−１免疫複合体をコード化する２
つのベクターの混合物を注入したものである。最後の注入から２日後に肝臓を切
除し、ヘマトキシリンとエオシンで染色して、１００×の倍率で写真撮影した。
【図１６】
図１６は、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するアデノウイルスベクタ
ーの免疫コンピテントマウスへの静脈内注入がマウス皮膚黒色腫の成長に及ぼす
作用を示す折れ線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウス黒色腫細胞系統
Ｂ１６Ｆ１０を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている大きさまで成長し
たとき、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するベクター３×１０１０ＩＰ
を注入した。免疫複合体のＦｃドメインはマウスＩｇＧ１免疫グロブリンから誘
導した。５日目に再び１．５×１０１０ＩＰを腫瘍に注入した。
ーの免疫コンピテントマウスへの静脈内注入がマウス皮膚黒色腫の成長に及ぼす
作用を示す折れ線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウス黒色腫細胞系統
Ｂ１６Ｆ１０を皮下注入し、皮膚腫瘍が０日目に示されている大きさまで成長し
たとき、ｍｆＶＩＩａｓｍ免疫複合体をコード化するベクター３×１０１０ＩＰ
を注入した。免疫複合体のＦｃドメインはマウスＩｇＧ１免疫グロブリンから誘
導した。５日目に再び１．５×１０１０ＩＰを腫瘍に注入した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 19/02
Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 29/00 １０１
19/02 35/00
29/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 14/47
35/00 16/00
// Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02
16/00 37/465
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA03
EA02 EA04 GA11 GA25 HA08
HA17
4C084 AA02 AA13 CA53 CA56 CA59
DC14 MA66 NA14 ZA451
ZA961 ZB151 ZB261
4C085 AA13 BB11 BB36 DD22 DD23
DD32 EE01
4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 BC83
MA66 NA14 ZA45 ZA96 ZB15
ZB26
4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 CA40
DA75 EA20
Claims (20)
- 【請求項１】 各々が、組織因子に結合するが血液凝固を開始させない、第
ＶＩＩ因子の突然変異形態である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリ
ンのＦｃ領域であるエフェクタードメインを持つ、２つの同一の鎖の二量体とし
て構築される免疫複合体蛋白質を含む血管新生を特徴とする、病的状態の治療に
おいて有用な組成物。 - 【請求項２】 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、リシン−３４１がアラ
ニンに置換されたヒト第ＶＩＩ因子を含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、セリン−３４４がアラ
ニンに置換されたヒト第ＶＩＩ因子を含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】 各々が、新生血管系に結合するヒトｓｃＦｖ又はＶＨ抗体断
片である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域であるエフ
ェクタードメインを持つ、２つの同一の鎖の二量体として構築される第二免疫複
合体蛋白質をさらに含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項５】 各々が、特定の型の腫瘍細胞に結合するヒトｓｃＦｖ又はＶ Ｈ 抗体断片である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域で
あるエフェクタードメインを持つ、２つの同一の鎖の二量体として構築される第
二免疫複合体蛋白質をさらに含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項６】 免疫複合体蛋白質が発現ベクターにおける分泌分子としてコ
ード化される、請求項１から５のいずれか１項記載の組成物。 - 【請求項７】 発現ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請
求項６記載の組成物。 - 【請求項８】 発現ベクターがアデノ関連ウイルス発現ベクターである、請
求項６記載の組成物。 - 【請求項９】 組織因子に結合するが血液凝固を開始させない、第ＶＩＩ因
子の突然変異形態を含む標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ
領域を含む、少なくとも１つの型の免疫複合体蛋白質の有効量を、当該疾患を有
する患者に投与することを含む、血管新生に関連する疾患を治療するための方法
。 - 【請求項１０】 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、リシン−３４１がア
ラニンに置換されたヒト第ＶＩＩ因子を含む、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、セリン−３４４がア
ラニンに置換されたヒト第ＶＩＩ因子を含む、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 新生血管系又は腫瘍細胞に結合するヒトｓｃＦｖ又はＶＨ 抗体断片である標的ドメインに複合したＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域であ
るエフェクタードメインを持つ第二免疫複合体蛋白質を、補助療法として患者に
投与する、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 血管新生化腫瘍を含む癌、慢性関節リウマチ、及び滲出性
形態の黄斑変性から成る群から選択される疾患のための治療である、請求項９記
載の方法。 - 【請求項１４】 製薬上許容される担体中の免疫複合体蛋白質の投与によっ
て患者を治療する、請求項９〜１３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 １つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質の分泌形態をコ
ード化するｃＤＮＡを担う複製欠損アデノウイルスベクター又はアデノ関連ウイ
ルスベクターの投与によって患者を治療する、請求項９〜１３のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１６】 複製欠損アデノウイルスベクターを使用する、請求項１５
記載の方法。 - 【請求項１７】 リシン−３４１がアラニンに置換された天然第ＶＩＩ因子
、セリン−３４４がアラニンに置換された天然第ＶＩＩ因子、及びそれらの混合
物から成る群から選択されるヒト第ＶＩＩ因子の突然変異形態を含む標的ドメイ
ンに複合したヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、少なくとも１つの
型の免疫複合体蛋白質の有効量を当該患者に投与することを含む、患者における
癌を治療するための方法。 - 【請求項１８】 患者の型の腫瘍細胞に結合するヒトｓｃＦｖ又はＶＨ抗体
断片である標的ドメインに複合したヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域であ
るエフェクタードメインを持つ第二免疫複合体蛋白質を、補助療法として患者に
投与する、請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 製薬上許容される担体中の免疫複合体を投与することによ
って患者を治療する、請求項１７又は１８記載の方法。 - 【請求項２０】 １つ又はそれ以上の型の免疫複合体蛋白質の分泌形態をコ
ード化するｃＤＮＡを担う複製欠損アデノウイルスベクターを投与することによ
って患者を治療する、請求項１７又は１８記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14216199P | 1999-07-01 | 1999-07-01 | |
| US60/142,161 | 1999-07-01 | ||
| PCT/US2000/016481 WO2001002439A1 (en) | 1999-07-01 | 2000-06-14 | Neovascular-targeted immunoconjugates |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012213338A Division JP5745486B2 (ja) | 1999-07-01 | 2012-09-27 | 血管新生標的免疫複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003504315A true JP2003504315A (ja) | 2003-02-04 |
Family
ID=22498780
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001508226A Withdrawn JP2003504315A (ja) | 1999-07-01 | 2000-06-14 | 血管新生標的免疫複合体 |
| JP2012213338A Expired - Lifetime JP5745486B2 (ja) | 1999-07-01 | 2012-09-27 | 血管新生標的免疫複合体 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012213338A Expired - Lifetime JP5745486B2 (ja) | 1999-07-01 | 2012-09-27 | 血管新生標的免疫複合体 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1198479B1 (ja) |
| JP (2) | JP2003504315A (ja) |
| AT (1) | ATE398633T1 (ja) |
| AU (1) | AU775621B2 (ja) |
| CA (1) | CA2377381C (ja) |
| CY (1) | CY1110394T1 (ja) |
| DE (1) | DE60039240D1 (ja) |
| DK (1) | DK1198479T3 (ja) |
| ES (1) | ES2307517T3 (ja) |
| PT (1) | PT1198479E (ja) |
| WO (1) | WO2001002439A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007511604A (ja) * | 2003-11-18 | 2007-05-10 | アイコニック セラピューティクス インコーポレイティッド | キメラタンパク質の均質製剤 |
| WO2007141915A1 (ja) * | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Mebiopharm Co., Ltd. | リウマチ治療薬 |
| JP2020511140A (ja) * | 2017-03-14 | 2020-04-16 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 組織因子標的化ＩｇＧ３免疫複合体に関連する方法及び組成物 |
| JP2020537640A (ja) * | 2017-09-27 | 2020-12-24 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 組織因子標的化ｃａｒ−ｎｋ及びｃａｒ−ｔ細胞療法 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
| US7160540B2 (en) | 2000-06-30 | 2007-01-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods for detecting activity of clottings factors |
| AU2003208839A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-09-04 | Micromet Ag | De-immunized (poly)peptide constructs |
| EP1572078A4 (en) * | 2002-03-08 | 2006-08-09 | Univ Emory | NEW CURCUMINOID FACTOR VIIa CONSTRUCTS AS MEANS OF SUPPRESSING TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS |
| AU2003214023A1 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-22 | Novo Nordisk A/S | Dimeric tf antagonist comprising two factor vii polypeptides |
| EP1523504A2 (en) * | 2002-07-12 | 2005-04-20 | Novo Nordisk A/S | A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia |
| AU2003242506A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-02-02 | Novo Nordisk A/S | Tf antagonist |
| US7425328B2 (en) | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
| DK2077121T3 (da) * | 2003-05-06 | 2011-06-06 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Koagulationsfaktor VII-Fc kimære proteiner til behandling af hæmostatiske lidelser |
| AU2012203896B2 (en) * | 2003-05-06 | 2014-09-25 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Clotting Factor-Fc Chimeric Proteins to Treat Hemophilia |
| TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| WO2005025623A2 (en) * | 2003-07-28 | 2005-03-24 | Emory University | Ef-24-factor vii conjugates |
| EP2591099B1 (en) | 2010-07-09 | 2020-11-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric clotting factors |
| EP3402537B1 (en) | 2016-01-15 | 2021-01-06 | Rigshospitalet | Quantitative pet imaging of tissue factor expression using 18f-labelled active site inhibited factor vii |
| WO2017181145A1 (en) * | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Iconic Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating disorders associated with νeοvascularization |
| WO2018091058A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Rigshospitalet | 177-lu labeled active site inhibited factor vii |
| US20210069306A1 (en) * | 2019-08-15 | 2021-03-11 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5861374A (en) * | 1991-02-28 | 1999-01-19 | Novo Nordisk A/S | Modified Factor VII |
| US5877289A (en) * | 1992-03-05 | 1999-03-02 | The Scripps Research Institute | Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature |
| US6004554A (en) * | 1992-03-05 | 1999-12-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for targeting the vasculature of solid tumors |
| US5879672A (en) * | 1994-10-07 | 1999-03-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tie-2 ligand 1 |
| MX9700312A (es) * | 1994-07-11 | 1997-07-31 | Univ Texas | Metodos y composiciones para la coagulacion especifica en vasculatura. |
| WO1998031394A2 (en) * | 1997-01-22 | 1998-07-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tissue factor methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
-
2000
- 2000-06-14 AT AT00941443T patent/ATE398633T1/de active
- 2000-06-14 CA CA2377381A patent/CA2377381C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 DE DE60039240T patent/DE60039240D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 JP JP2001508226A patent/JP2003504315A/ja not_active Withdrawn
- 2000-06-14 ES ES00941443T patent/ES2307517T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 DK DK00941443T patent/DK1198479T3/da active
- 2000-06-14 WO PCT/US2000/016481 patent/WO2001002439A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-14 EP EP00941443A patent/EP1198479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 PT PT00941443T patent/PT1198479E/pt unknown
- 2000-06-14 AU AU56149/00A patent/AU775621B2/en not_active Expired
-
2008
- 2008-09-10 CY CY20081100974T patent/CY1110394T1/el unknown
-
2012
- 2012-09-27 JP JP2012213338A patent/JP5745486B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| JPN6010029366, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, 199902, Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．４, ｐ１６２７−１６３２ * |
| JPN6010029369, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, 1992, Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．２４, ｐ１１８３２−１１８３６ * |
| JPN6010029370, Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, 1995, Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．８, ｐ１６２９−１６３２ * |
| JPN6010029372, Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ, 1998, Ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．４, ｐ５９８−６０２ * |
| JPN6010029375, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, 1996, Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２, ｐ２０９−２１５ * |
| JPN6010029379, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ, 1998, Ｖｏｌ．１５２，Ｎｏ．２, ｐ３９９−４１１ * |
| JPN6010029380, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ, 1998, Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．７, ｐ１３７２−１３７８ * |
| JPN6010029383, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, 1996, Ｖｏｌ．９３，Ｎｏ．２５, ｐ１４３７９−１４３８４ * |
| JPN6010029386, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, 1998, Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．１５, ｐ８８２９−８８３４ * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007511604A (ja) * | 2003-11-18 | 2007-05-10 | アイコニック セラピューティクス インコーポレイティッド | キメラタンパク質の均質製剤 |
| WO2007141915A1 (ja) * | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Mebiopharm Co., Ltd. | リウマチ治療薬 |
| JP2020511140A (ja) * | 2017-03-14 | 2020-04-16 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 組織因子標的化ＩｇＧ３免疫複合体に関連する方法及び組成物 |
| JP7155144B2 (ja) | 2017-03-14 | 2022-10-18 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 組織因子標的化ＩｇＧ３免疫複合体に関連する方法及び組成物 |
| US11872194B2 (en) | 2017-03-14 | 2024-01-16 | Ohio State Innovation Foundation | Methods and compositions related to a tissue factor-targeting IGG3 immunoconjugates |
| JP2020537640A (ja) * | 2017-09-27 | 2020-12-24 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 組織因子標的化ｃａｒ−ｎｋ及びｃａｒ−ｔ細胞療法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1198479A4 (en) | 2004-10-20 |
| AU775621B2 (en) | 2004-08-05 |
| WO2001002439A1 (en) | 2001-01-11 |
| DK1198479T3 (da) | 2008-10-13 |
| CY1110394T1 (el) | 2015-04-29 |
| ATE398633T1 (de) | 2008-07-15 |
| JP5745486B2 (ja) | 2015-07-08 |
| AU5614900A (en) | 2001-01-22 |
| CA2377381C (en) | 2013-06-11 |
| JP2012255032A (ja) | 2012-12-27 |
| EP1198479A1 (en) | 2002-04-24 |
| EP1198479B1 (en) | 2008-06-18 |
| ES2307517T3 (es) | 2008-12-01 |
| DE60039240D1 (de) | 2008-07-31 |
| CA2377381A1 (en) | 2001-01-11 |
| PT1198479E (pt) | 2008-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5745486B2 (ja) | 血管新生標的免疫複合体 | |
| US8388974B2 (en) | Neovascular-targeted immunoconjugates | |
| AU2016263808B2 (en) | Trispecific binding proteins and methods of use | |
| US20190225702A1 (en) | Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use | |
| JP6113883B2 (ja) | 受容体に対する親和性が増大した変異型ｌｉｇｈｔ分子を使用する癌療法のための方法および組成物 | |
| JP2009507796A (ja) | デルタ様リガンド４のモジュレーターの利用及び同定方法 | |
| JP2004513876A (ja) | 抗−腫瘍剤としてのｔａｃｉ | |
| CA2347734A1 (en) | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation | |
| US11390666B2 (en) | Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins | |
| KR102654035B1 (ko) | 도펠 단백질 억제제 | |
| JP2002518342A (ja) | 抗原を変化させることにより免疫応答を産生する治療組成物 | |
| JP4344237B2 (ja) | 受容体、その使用、およびそのマウス抗体 | |
| JP4866006B2 (ja) | 抗体認識抗原 | |
| KR102207221B1 (ko) | 도펠-타겟팅 분자를 이용한 병리학적 신생혈관 생성을 억제하는 방법 | |
| CN117986365A (zh) | 一种抗犬pd-1单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070517 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100601 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100831 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100901 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100907 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100908 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101201 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110906 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111206 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111226 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120201 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120206 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20120206 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120208 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120201 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120206 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120112 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120229 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120531 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120927 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20121025 |