JP2003504083A - Donor-chain complementary pilin-adhesin broad-based vaccine - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ピリ線毛タンパク質配列および供与体相補配列を含む修飾ポリペプチド、同じく修飾ポリペプチドおよびピリンまたはピリン線毛タンパク質で形成された複合体が開示される。更に開示されるのは、細菌誘導疾病、とりわけ大腸菌などの腸内細菌によって生じる疾病を予防しおよびもしくは処置する手段としてこれらの新規なポリペプチドを使用する方法である。これらの修飾ピリ線毛誘導ポリペプチドと複合体をワクチンとして使用し、更に更なる研究同じく臨床目的のために抗体を生成する方法が開示される。加えて、更に前記ポリペプチドと複合体を含む抗細菌ワクチンの大規模産生のためのプロセスが開示される。 Abstract: Disclosed are modified polypeptides comprising a pili protein sequence and a donor complement sequence, as well as complexes formed with the modified polypeptide and pilin or pilin pilus protein. Also disclosed are methods of using these novel polypeptides as a means to prevent and / or treat bacterially induced diseases, especially those caused by intestinal bacteria such as E. coli. Methods for using these modified pili-derived polypeptides and conjugates as vaccines and generating antibodies for further study as well as clinical purposes are disclosed. In addition, a process is disclosed for the large-scale production of an antibacterial vaccine further comprising the polypeptide and a conjugate.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

本出願は、２０００年２月２３日出願された合衆国特許暫定出願番号６０／１
８４，４４２号、１９９９年７月１６日出願された合衆国特許暫定出願番号６０
／１４４，３５９号、および１９９９年７月１３日出願された合衆国特許暫定出
願番号６０／１４３，５８２号の優先権を主張し、これら３件の出願すべての開
示はその全体で引用例としてここに組み込まれている。This application is US Patent Provisional Application No. 60/1, filed February 23, 2000.
No. 84,442, US Provisional Application No. 60 filed on July 16, 1999
/ 144,359 and U.S. Provisional Application No. 60 / 143,582, filed July 13, 1999, the disclosures of all three of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Built into.

【０００２】 本発明は細菌性疾病を予防しまた処置するのに有用な免疫原ポリペプチドおよ
び複合体に関し、またこのようなポリペプチドと複合体を調製する方法に関する
。The present invention relates to immunogenic polypeptides and conjugates useful in preventing and treating bacterial diseases, and methods of preparing such polypeptides and conjugates.

【０００３】[0003]

【発明の背景技術】BACKGROUND OF THE INVENTION

新規に形成されたタンパク質鎖は外部の援助をしばしば必要としないプロセス
である生の配座を形成するために試験管内で速やかにフォールドでき、またここ
でタンパク質の三次元構造についての立体情報がアミノ酸配列に存在する。「シ
ャペロン」（分子シャペロン）と呼ばれるＡＴＰ依存性タンパク質は生体内でい
くつかのタンパク質のフォールディングを援助する。The newly formed protein chain can be rapidly folded in vitro to form the raw conformation, a process that often does not require external assistance, and where the stereo information about the three-dimensional structure of the protein is the amino acid. Present in the array. ATP-dependent proteins called "chaperones" (molecular chaperones) assist the folding of several proteins in vivo.

【０００４】 これとは逆に、その機能を実行するためにＡＴＰを必要としないもう一つのク
ラスのシャペロンが存在する。これらは細菌に見出されるＰａｐ−Ｄ状ペリプラ
ズムシャペロンを含む。ここで使用され特に他に言及されない限り、「シャペロ
ン」は以下に更に記載された際立った特徴を持つこの後者のクラスのペリプラズ
ムシャペロンを限定して意味する。On the contrary, there is another class of chaperones that does not require ATP to perform its function. These include the Pap-D-like periplasmic chaperones found in bacteria. As used herein and unless otherwise stated, "chaperone" means this latter class of periplasmic chaperones with the salient features described further below.

【０００５】 細菌種において、この後者のクラスのシャペロンは大規模オリゴマー構造の合
成、例えば腸内細菌科（例えば大腸菌など）の大抵の細菌で発現される癒着性線
維であるピリ線毛の構造を仲介する原因となる。In bacterial species, this latter class of chaperones is responsible for the synthesis of large-scale oligomeric structures, for example the structure of pili, a cohesive fiber expressed in most bacteria of the Enterobacteriaceae (eg E. coli). Cause mediation.

【０００６】 ピリ線毛はピリ線毛アセンブリに必要とされるいくつかの異なった構造タンパ
ク質よりなるヘテロポリマー構造である。フィブレエまたはフィブリルとも称さ
れるピリ線毛は、特に粘膜表面で宿主動物の各種組織の集落形成と感染にしばし
ば導く細菌の癒着性を促進する。このような癒着はＦｉｍＨがその一つの例であ
る「アドヘジン」と呼ばれるタンパク質のピリ線毛内での存在で加速される。Pilus pili is a heteropolymeric structure consisting of several different structural proteins required for pili assembly. Pili, also called fibrils or fibrils, promote colonization of various tissues of the host animal, especially on the mucosal surface, and the adhesion of bacteria, which often leads to infection. Such adhesion is accelerated by the presence of a protein called "adhesin" in which FimH is one example, in the pili.

【０００７】 異なった型のピリ線毛が認識されている。タイプ１ピリ線毛運搬細菌は膀胱上
皮細胞の糖脂質と糖タンパク質にあるＤ−マンノースを認識しそれと結合する。
ピリ線毛を形成するタンパク質はワクチンへの良き候補者とこれまで見られてき
た。Ｐピリ線毛は大腸菌の尿路病原菌性の染色体に見出されるｐａｐ（腎盂腎炎
関連ピリ線毛）遺伝子クラスターの１１個の遺伝子によりコード化される癒着性
小器官である。Ｐピリ線毛とタイプ１ピリ線毛は高度に保持されたシャペロン／
アッシャー経路を経由して生じる（タナッシ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１，２２３（１９８８）；ハン他、ＥＭＢＯ Ｊ．１５，３７９２（１
９９４））。Different types of pili are recognized. Type 1 pili carrying bacteria recognizes and binds to D-mannose in glycolipids and glycoproteins of bladder epithelial cells.
Proteins that form pili have been previously seen as good candidates for vaccines. P pili is an adhesive organelle encoded by 11 genes of the pap (pyelonephritis associated pili) gene cluster found on the uropathogenic chromosome of E. coli. P pili and type 1 pili are highly retained chaperones /
Occurs via the Usher pathway (Tanassi et al., Curr. Op. Microb
iol. 1, 223 (1988); Han et al., EMBO J. 15,3792 (1
994)).

【０００８】 タイプ１ピリ線毛はより厚くて堅いピリ線毛杆に結合する短く薄い尖微小線維
よりなる複合線維である（Ｃ．Ｃ．ブリントン，ジュニア，Ｔｒａｎｓ Ｎ．Ｙ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２７巻，１００３ページ（１９６５年）；ジョーンズ他全
米科学アカデミー紀要，９２巻，２０８１ページ（１９９５年））。ピリ線維は
その尖部にＦｉｍＨアドヘジンを持つ相同性ピリン（ＦｉｍＡ，ＦｉｍＦ，Ｆｉ
ｍＨおよびＦｉｍＧ）の整列した配列である。ＦｉｍＨとＦｉｍＧは複合体とし
て精製され、それがまたＦｉｍＨを含有する大量の先端微小線維を含む（ジョー
ンズ他（１９９５年））。杆は右まわりらせん形円柱に配設されたＦｉｍＡモノ
マーよりなる（ブリントン（１９６５年））。タイプ１ピリ線毛生物発生（Ｆｉ
ｍＡ−ＦｉｍＨ）に重要な遺伝子はｆｉｍオペロンに組織される（オルンドルフ
およびフォーコー，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー，１５９巻，７３６ペ
ージ（１９８４年））。より特異的には、ＦｉｍＨは粘膜表面に存在するマンノ
ース−オリゴ糖への結合を仲介する。かくしてＦｉｍＨは膀胱上皮のマンノシル
化受容体への癒着を仲介し、膀胱炎を起こす尿路病原体大腸菌の性能に重要なも
のとなる（マルベリ他、サイエンス，２８２巻，１４９４ページ（１９９８年）
；ランガーマン他，サイエンス，２７６巻，６０７ページ（１９９７年）；クロ
グフェルト他、感染と免疫，５８巻，１９９５ページ（（１９９０年）；コンネ
ル他、全米科学アカデミー紀要，９３巻，９８２７ページ（１９９６年）を参照
のこと）。[0008] Type 1 pili are fibrils composed of short and thin apical microfibrils that bind to thicker and stiff pili (CC Brington, Jr., Trans NY).
． Acad. Sci. 27, 1003 (1965); Journal of National Academy of Sciences, Jones, et al., 92, 2081 (1995)). Pili fibers are homologous pilins (FimA, FimF, Fi) having FimH adhesin at their apexes.
mH and FimG) aligned sequences. FimH and FimG were purified as a complex, which also contains large amounts of FimH-containing apical fibrils (Jones et al. (1995)). The rod consists of the FimA monomer arranged in a right-handed spiral cylinder (Brington (1965)). Type 1 pili formation (Fi
Genes important for (mA-FimH) are organized in the fim operon (Orndorf and Forko, Journal of Bacteriology, 159, 736 (1984)). More specifically, FimH mediates binding to mannose-oligosaccharides present on mucosal surfaces. Thus, FimH mediates adhesion of bladder epithelium to mannosylated receptors and is important for the performance of the uropathogen Escherichia coli that causes cystitis (Malberg et al., Science, 282, 1494 (1998)).
Langermann et al., Science, 276, 607 (1997); Krogfeld et al., Infection and Immunity, 58, 1995 ((1990); Connell et al., Bulletin of the National Academy of Sciences, 93, 9827 (1996). Year))).

【０００９】 ペリプラズムシャペロンのＰａｐ−Ｄ状上科は、疾病の展開の重要な初期段階
である宿主線維への多くの異なった病原性細菌の付着を仲介する３０個以上の異
なった癒着性表面小器官のアセンブリに指向する（ソトおよびハルトグレン，ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー，１８１巻，１０５９ページ（１９９９年）
）。始原型シャペロンであるＰａｐＤはＰピリ線毛のアセンブリに必要であり（
リンドバーグ他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー，１７１巻，６０５２ペ
ージ（１９８９年））、一方その相同体ＦｉｍＣはタイプ１ピリ線毛のアセンブ
リに指向する（ジョーンズ他、全米科学アカデミー紀要、９０巻，８３９７ページ
（１９９３年））。[0009] The Pap-D superfamily of periplasmic chaperones mediates the attachment of many different pathogenic bacteria to host fibers, an important early step in the development of the disease, with over 30 distinct cohesive surface microbes. Oriented to organ assembly (Soto and Hartgren, Journal of Bacteriology, 181, 1059 (1999))
). The prototypical chaperone PapD is required for the assembly of P pili (
Lindberg et al., Journal of Bacteriology, 171, p. 6052 (1989), while its homologue FimC is directed to the assembly of type 1 pili (Jones et al., Bulletin of the National Academy of Sciences, 90, 8397). Page (1993)).

【００１０】 大腸菌は無症候性細菌尿症、急性膀胱炎、急性腎盂腎炎の病例の８５％以上、
同じく再発性膀胱炎の６０％以上、また再発性腎盂腎炎感染症の少なくとも３５
％の原因となる尿路のもっとも一般的な病原体である。大腸***症と関連す
る高い発生数、維続した存続、およびそれにかかる高価な費用の故で、この疾病
に対する感受性を減少するための予防ワクチンの必要性が存在する。E. coli is more than 85% of the cases of asymptomatic bacteriuria, acute cystitis, acute pyelonephritis,
More than 60% of recurrent cystitis and at least 35 of recurrent pyelonephritis infection
It is the most common causative agent of the urinary tract. Due to the high incidence, persistence and high costs associated with colorectal infections, there is a need for preventive vaccines to reduce susceptibility to this disease.

【００１１】 多くの因子が大腸菌***症の獲得と進行に寄与する一方、尿路上皮の集落
形成が必要とされる初期段階であるということが広く受け入れられている。従っ
て大腸菌の尿路上皮へのピリ線毛仲介付着の***または予防は***症の進行
を予防しまたは遅らせる。While many factors contribute to the acquisition and progression of Escherichia coli urinary tract infections, it is widely accepted that urothelial colonization is an early stage required. Thus, disruption or prevention of pili-mediated attachment of E. coli to the urothelium prevents or slows the progression of urinary tract infections.

【００１２】 例えば前述のタイプ１ピリ線毛は膀胱の集落形成を開始し、膀胱炎を誘導する
のに重要であると考えられ、一方Ｐピリ線毛は感染を高め腎盂腎炎を必然的に起
こすのに役割を果すものと考えられている。かくしてピリ線毛は宿主組織に依存
する受容体に結合することにより、疾病の進化でしばしば基本的な第１段階であ
る細胞の表面への微生物付着を仲介する。For example, the above-mentioned type 1 pili is considered to be important for initiating bladder colonization and inducing cystitis, while P pili enhances infection and inevitably causes pyelonephritis. Is considered to play a role in. Thus, the pilus binds to a receptor that is dependent on the host tissue and mediates microbial attachment to the surface of cells, which is often the first step in the evolution of disease.

【００１３】 しかしピリ線毛ベイストワクチンの主な不利益は、ピリ線毛繊維の主な免疫優
性成分がしばしば抗原的に高く変化するものであり、従って細菌菌株の限定され
た数にのみ保護を与えるという事実である。これとは逆に、ＦｉｍＨなどのよう
なピリ線毛関連アドヘジンは異なった種と菌株の細菌の中でも相対的に保存され
たタンパク質である。かくしてＦｉｍＨは大腸菌の尿路病原菌株だけでなく広い
範囲のグラム陰性細菌の間でも相対的に保存されている。例えば腸内細菌上科の
多くの構成員はＦｉｍＨを産出し、ＦｉｍＨ抗原を組み込むワクチンは広い範囲
の保護を示さねばならない。However, the major disadvantage of pili-based bait vaccines is that the major immunodominant component of pili-filament fibers is often highly antigenically altered, thus protecting only a limited number of bacterial strains. The fact is to give. In contrast, pili-related adhesins such as FimH are relatively conserved proteins among bacteria of different species and strains. Thus, FimH is relatively conserved not only among uropathogenic strains of E. coli, but also among a wide range of Gram-negative bacteria. For example, many members of the Enterobacteriaceae superfamily produce FimH, and vaccines incorporating the FimH antigen must exhibit broad protection.

【００１４】 いずれかの種類のアドヘジンベイストワクチンの主な欠点は、アドヘジンがし
ばしばピリ線毛の少数成分に過ぎず、大量に生産できず、従って特に強い免疫原
作用を誘出しなくなるであろう。組換え技術はアドヘジンタンパク質を純粋な形
で産生するのに成功したが、それは対応するシャペロンが不在の場合には急速に
タンパク質分解で分解する。このようなアドヘジンはペリプラズムアドヘジン分
子の存在により容易に安定する（後者はまたアドヘジンの適切な合成に重要なも
のである）。The main drawback of either type of adhesin-based vaccine will be that adhesin is often only a minor component of pili and cannot be produced in large quantities and will therefore not elicit a particularly strong immunogenic effect. . Recombinant technology has succeeded in producing the adhesin protein in pure form, which is rapidly proteolytically degraded in the absence of the corresponding chaperone. Such adhesins are readily stabilized by the presence of periplasmic adhesin molecules (the latter also being important for the proper synthesis of adhesins).

【００１５】 大腸菌がその一つの例であるグラム陰性菌は特徴的な細胞表面配置を有する。
それはペプチドグリカン細胞壁で囲まれた内部形質膜を持ち、代わってこの細胞
壁は外膜で囲まれ、この外膜は多くの物質に対して透過性が高い。細胞壁と外膜
の間にはペリプラズム腔（細胞周辺腔）が存在する。外膜と交差して分泌または
アセンブリを運命付けられたタンパク質はその分泌およびまたはアセンブリの前
にペリプラズム腔内でフォールドしなければならない。シャペロンはしばしばこ
のペリプラズムに腔内で発見されるべきものである。ペリプラズム内で発見され
るものではアドヘジンＦｉｍＨとそのシャペロンＦｉｍＣが存在する。Gram-negative bacteria, of which E. coli is one example, have a characteristic cell surface arrangement.
It has an inner plasma membrane surrounded by the peptidoglycan cell wall, which in turn is surrounded by an outer membrane, which is highly permeable to many substances. A periplasmic space (periplasmic space) exists between the cell wall and the outer membrane. Proteins destined for secretion or assembly that cross the outer membrane must fold in the periplasmic space prior to their secretion and / or assembly. Chaperones are often to be found endoluminally in this periplasm. What is found within the periplasm is the adhesin FimH and its chaperone FimC.

【００１６】 この開示を通じて、ピリ線毛、ピリ、フィムブリウム、フィムブリエ、フィブ
リラムおよびフィブリラという用語は、これらの用語のいずれかを単数または複
数の形で偶発的な使用も含め互換的に使用されているが、いずれも開示された発
明の広がりを限定するものではない。Throughout this disclosure, the terms pili, pili, fimbria, fimbriae, fibrillam and fibrilla are used interchangeably including any of these terms in their singular or plural forms, including accidental use. However, neither limit the scope of the disclosed invention.

【００１７】 「ペリプラズムシャペロン」は共通結合エピトープの認識を介して（対応する
シャペロンがＦｉｍＣである）アドヘジン、とりわけＦｉｍＨを含む各種のタン
パク質、とりわけピリ線毛タンパク質で複合体を形成できる細菌のペリプラズム
に局在するタンパク質、として定義される。このようなシャペロンはＰａｐＤに
対する物性の類似性、特にアドヘジンなどのピリ線毛に対して結合するために免
疫グロブリン状フォールドを所有することにより特徴付けられる。シャペロンは
鋳型として役立ち、ペリプラズムに細菌細胞が運ばれるタンパク質は、とりわけ
そのようなタンパク質がピリ線毛などのようなオリゴマー構造を形成するよう意
図される場合に、その生の配座にフォールドする。シャペロン結合タンパク質と
シャペロンの会合は更にペリプラズム内で局在化するプロテアーゼによる分解か
らこの結合タンパク質を保護するのに役立ち、水溶液での溶解性を増加し、また
アセンブルするピリ線毛へのそれらの配列上の正しい組み込みに導く。A “periplasmic chaperone” refers to a bacterial periplasm capable of forming a complex with various proteins including adhesins (especially FimC), in particular FimH, through the recognition of consensus binding epitopes, in particular pili proteins. It is defined as a localized protein. Such chaperones are characterized by similar physical properties to PapD, particularly possessing immunoglobulin-like folds for binding to pili such as adhesin. Chaperones serve as templates and proteins that are transported to the periplasm by bacterial cells fold into their native conformation, especially when such proteins are intended to form oligomeric structures such as pili. The association of the chaperone-binding protein with the chaperone further helps protect this binding protein from degradation by proteases that localize within the periplasm, increasing its solubility in aqueous solution and their sequence into assembling pili. Leads to the correct incorporation above.

【００１８】 Ｘ線回折研究は各種アドヘジンとシャペロンタンパク質の構造内で見出される
異なったドメインを明らかにするのに役立った。始原型ペリプラズムシャペロン
であるＰａｐＤの結晶構造の解像は免疫グロブリンフォールドの全体のトポロジ
ーを持つ少なくとも２個のドメインを明らかにした（ホルムグレンおよびブラン
デン、ネイチャー、３４２巻、２４８ページ（１９８９年））。２個のドメイン
はヒンジ領域により結合され、これら２個のドメインの間で割れ目が作られるよ
うに配向される。更に他の業績はこの割れ目に突出する不変表面露出残基がサブ
ユニット結合ポケットを作ることを示唆した（スローニム他（１９９２年）ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，１１巻、４７４７−４７５６ページ）。細胞質シャペロンとは異な
り、ＰａｐＤは生状配座で標的構造を維持する（レッチャー他、（１９８９年）
ＥＭＢＯ Ｊ．，８巻、２７０３−２７０９ページ；ケーン他、（１９９１年）
）全米アカデミー紀要、８８巻、１０５８６-１０５９０ページ）。このような
ペリプラズムシャペロンはエフェクター機能、とりわけそのピリ線毛への組み込
みのためのサブユニットの外膜アセンブリ部位への標的化を有し、部分的には免
疫グロブリン状フォールドの存在により特徴付けられる。X-ray diffraction studies have helped to reveal the distinct domains found within the structures of various adhesins and chaperone proteins. Resolution of the crystal structure of the prototypical periplasmic chaperone PapD reveals at least two domains with the entire topology of the immunoglobulin fold (Holmgren and Branden, Nature, 342, 248 (1989)). .. The two domains are joined by a hinge region and are oriented so that a fissure is created between the two domains. Still other work suggested that invariant surface-exposed residues protruding in this cleft create a subunit-binding pocket (Slonim et al. (1992) EM.
BO J. 11: 4747-4756). Unlike cytoplasmic chaperones, PapD maintains its target structure in a conformational conformation (Lechter et al., (1989)
EMBO J.M. , 8: 2703-2709; Kane et al., (1991).
) Bulletin of the National Academy, 88, 10586-10590). Such periplasmic chaperones have effector functions, inter alia targeting of subunits to the outer membrane assembly site for their integration into pili and are characterized in part by the presence of immunoglobulin-like folds.

【００１９】 ｐａｐオペロンにある２個の遺伝子、ｐａｐＤとｐａｐＣはそれぞれシャペロ
ンとアッシャーをコードする。６個の遺伝子は構造ピリ線毛サブユニットである
ＰａｐＡ，ＰａｐＨ，ＰａｐＫ，ＰａｐＥ，ＰａｐＦおよびＰａｐＧをコード化
し、それらは付着先端部（ＰａｐＧ）を持つヘテロポリマー表面線維に役立てら
れる（ハルトグレン他、細胞、７３巻、８８７ページ（１９９３年））。ヒト腎
臓内のガラビオース受容体に結合するＰａｐＧの能力は腎盂腎炎の発病での重要
な事象である。ピリ線毛は２個の主要なるサブアセンブリよりなりその一つは右
回りらせん円柱に配置された反復ＰａｐＡサブユニットで作られた厚く硬い杆と
、もう一つは杆の遠位端部から伸びオープンらせん形状で配設された反復Ｐａｐ
Ｅサブユニットで主として構成された薄い弾性先端線維（先端フィブリラム）よ
り成る。先端フィブリラムの２個の成分であるＰａｐＫとＰａｐＦはアダプター
として作用する。ＰａｐＫはピリ線毛杆を先端フィブラムの底部に結合するもの
と考えられ、その長さを調節する。つまりその組み込みは成長を終結させ、ピリ
線毛杆の形成を有核化する。ＰａｐＦは可撓性先端フィブリラムの遠位端部にＰ
ａｐＧアドヘジンを結合させるものと見做される。Two genes in the pap operon, papD and papC, code for chaperones and ushers, respectively. The six genes encode structural pili subunits PapA, PapH, PapK, PapE, PapF and PapG, which are useful for heteropolymer surface fibers with cohesive tips (PapG) (Hartgren et al., Cell , 73, 887 (1993)). The ability of PapG to bind to the galabiose receptor in the human kidney is a key event in the pathogenesis of pyelonephritis. The pili consist of two major subassemblies, one thick and rigid rod made of repeating PapA subunits arranged in a clockwise spiral cylinder and the other extending from the distal end of the rod. Repeated Pap arranged in open spiral shape
It consists of thin elastic tip fibers (tip fibrillum) composed primarily of E subunits. Two components of the apical fibril, PapK and PapF, act as adapters. PapK is thought to attach the pili to the bottom of the apical fibrum and regulates its length. That is, its integration terminates growth and nucleates the formation of pili rods. PapF has a P at the distal end of the flexible tip fibril.
It is considered to bind the apG adhesin.

【００２０】 ＰａｐＤと同じように、ＦｉｍＣはアドヘジンＦｉｍＨなどのようなピリ線毛
サブユニットタンパク質を認識し結合するためにその免疫グロブリン状ドメイン
を使用する。Like PapD, FimC uses its immunoglobulin-like domain to recognize and bind pili subunit proteins such as the adhesin FimH.

【００２１】 他の複合体へテロオリゴマー小器官と同じようにピリ線毛の調整アセンブリは
生物発生の間と、内因性集合体サブユニットの間の早すぎる会合の予防の間に予
め定められた順序での個別サブユニットの正しい組み込みを必要とする。タイプ
１ピリ線毛生物発生はグラム陰性細菌内でアドヘジン−アシャー経路により組立
てられた３０個以上の付着性小器官のアセンブリに含まれる高度に促進された経
路を介して進行する（ソトおよびハルトグレン、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー、１８１巻、１０５９ページ（１９９９年））。アセンブリ構造は２個の
特殊なクラスのタンパク質、すなわちペリプラズムシャペロンペタンと外膜アッ
シャーより成る（タナッシ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，１
巻、２２３ページ（１９９８年）。その免疫グロブリン状フォールドを用いて、
ペリプラズムシャペロンＦｉｍＣはそのピリ線毛への組み込みに先立ちピリ線毛
サブユニットのそれぞれでペリプラズム複合体を形成する（ソトおよびハルトグ
レン（１９９９年））。更に遺伝子および構造研究は、シャペロンがすべてのＰ
ａｐＤ状シャペロンにより組立てられたすべてのサブユニットのＣ末端部分に存
在する高度に保存された主要素を認識することを示した（ハング他、ＥＭＢＯ
Ｊ．，１５巻、３７９２ページ（１９９６年）；ケーン他、サイエンス、２６２
巻、１２３４ページ（１９９３年）；ハルトグレン他、シャペロンとフォールデ
ィング触媒の分子生物学：調節、細胞機能およびメカニズム．，Ｂ．バカウ編（
ハーウッド・アカデミック・パブリッシャーズ、アムステルダム、（１９９９年
）６６１ページ所収）。Like other complex hetero-oligomer organelles, the regulatory assembly of pili is predetermined during biogenesis and prevention of premature association between the endogenous assembly subunits. Requires correct assembly of individual subunits in order. Type 1 pilus biogenesis proceeds in Gram-negative bacteria via a highly promoted pathway involved in the assembly of 30 or more adherent organelles assembled by the Adhesin-Asha pathway (Soto and Hartgren, Journal of Bacteriology, 181, 1059 pages (1999)). The assembly structure consists of two special classes of proteins, the periplasmic chaperone petans and the outer membrane asher (Tanassi et al., Curr. Opin. Microbial., 1
Volume, page 223 (1998). Using the immunoglobulin-like fold,
The periplasmic chaperone FimC forms a periplasmic complex at each of the pili subunits prior to its integration into pili (Soto and Hartgren (1999)). Further genetic and structural studies show that chaperones are all P
It was shown to recognize a highly conserved main element present in the C-terminal part of all subunits assembled by the apD-like chaperone (Hang et al., EMBO.
J. 15: 3792 (1996); Kane et al., Science, 262.
Vol., 1234 (1993); Hartgren et al., Molecular biology of chaperones and folding catalysts: regulation, cellular function and mechanism. , B. Bakau (
Harwood Academic Publishers, Amsterdam, (1999 page 661).

【００２２】 ＦｉｍＣのシャペロン活性は論証され、ＦｉｍＣはペリプラズムプレアセンブ
リ）複合体を形成するためにタイプ１ピリ線毛のアドヘジンであるＦｉｍＨに結
合することが示された。かくしてＦｉｍＨ−ＦｉｍＣ複合体はペリプラズムのマ
ンノース−セファロースクロマトグラフィーを使用して分離され、次いでＤ−マ
ンノースで溶離した（ジョーンズ他、（１９９３年）参照））。ＦｉｍＨはマン
ノース結合ドメインが生の状態にあり基質結合に接近できるようにＦｉｍＨ−Ｆ
ｉｍＣ複合体にフォールドされる。更にＦｉｍＣのアミノ酸配列は既知である（
ジョーンズ他（１９９３年）参照）。The chaperone activity of FimC has been demonstrated and it has been shown that FimC binds to the type 1 pili adhesin, FimH, to form the periplasmic preassembly) complex. The FimH-FimC complex was thus separated using periplasmic mannose-sepharose chromatography and then eluted with D-mannose (see Jones et al., (1993))). FimH has a mannose-binding domain in its native state and is accessible to substrate binding for FimH-F.
Folds into the imC complex. Furthermore, the amino acid sequence of FimC is known (
See Jones et al. (1993)).

【００２３】 始原型ペリプラズムシャペロンであるＰａｐＤの結晶構造は解決され（ホルム
グレンおよびブランデン、（ネイチャー、３４２巻，２４８ページ（１９８９年
））、２．０オングストローム解像に精製され、その表面に割れ目を形成するた
めにＬ形状に配向する２個の免疫グロブリン状ドメインを持つ分子を明らかにし
た。ペリプラズムシャペロン上科のすべての３０以上の構成員は２個のドメイン
のすべての特性を維持する保存された疎水性コアを持つ。ピリ線毛生物発生の間
に、ＰａｐＤはピリ線毛サブユニット上の相互作用表面と結合しそれにふたをし
、ペリプラズム内での早過ぎる集合を予防する。遺伝子、生化学および結晶学の
データの組合せは、ＰａｐＤのＧ１β鎖がピリ線毛サブユニットの高度に保存さ
れたＣＯＯＨ末端主要素とβジッパー相互作用を形成することを示した。ＣＯＯ
Ｈ末端は更にサブユニット−サブユニットアセンブリ相互作用のために主表面の
少なくとも部分と妥協し、これは主要アセンブリ表面の直接キャッピングが分子
基礎の一部であり、これによりペリプラズムシャペロンがピリ線毛サブユニット
の早過ぎるオリゴマー形成を予防することを示している。更にβジッパー相互作
用は鋳型仲介メカニズムを経由してサブユニットの生状形状へのフォールディン
グを促進することを定義されてきた（ソト他、ＥＭＢＯＪ．，１７巻：６１５５
ページ（１９９８））。The crystal structure of the prototypical periplasmic chaperone, PapD, has been solved (Holmgren and Branden, (Nature, 342, 248 (1989)), purified to 2.0 Angstrom resolution, and cracked on its surface. We have identified a molecule with two immunoglobulin-like domains that are oriented in an L-shape to form a conserved periplasmic chaperone of all over 30 members that retain all the properties of the two domains. During pili development, PapD binds to and caps the interacting surface on pili subunits, preventing premature assembly within the periplasm. The combination of biochemical and crystallographic data show that the G1β chain of PapD is a highly conserved CO of pili subunits. .COO showing the formation of a H-terminated main elements and β zipper interactions
The H-terminus also compromises at least a portion of the major surface for subunit-subunit assembly interactions, where direct capping of the major assembly surface is part of the molecular basis, which allows the periplasmic chaperone to bind to the pili subgroup. It is shown to prevent premature oligomerization of the unit. Furthermore, the β-zipper interaction has been defined to promote the folding of subunits into the green form via a template-mediated mechanism (Soto et al., EMBOJ., 17: 6155).
Page (1998)).

【００２４】 アドヘジンのワクチンとしての有効性は論証された一方、アドヘジンおよび他
のピリ線毛誘導タンパク質の大規模生産はそれが適切にフォールドされ安定した
構造を来たすようにアドヘジンと同時発現されねばならないという要件により複
雑なものと成る。従ってもしアドヘジンがシャペロンとの同時発現を必要とせず
またシャペロンまたは他のいずれかのタンパク質も決して必要とせず、それによ
り使用、とりわけワクチンとしての使用に供するために大規模生産が可能となる
ようにアドヘジンが産生されるならば、それはきわめて有利になるであろう。While the effectiveness of adhesin as a vaccine has been demonstrated, large-scale production of adhesin and other pili-inducing proteins must be co-expressed with adhesin so that it folds properly and results in a stable structure. Is complicated by the requirement. Thus if adhesin does not require co-expression with chaperones and never requires chaperones or any other protein, thus allowing large scale production for use, especially as a vaccine. If adhesin were produced, it would be extremely advantageous.

【００２５】[0025]

【本発明の概要】[Outline of the present invention]

本発明はピリ線毛タンパク質成分または部分、および供与体鎖成分または部分
より成る免疫原複合体およびポリペプチドに関し、ここでピリ線毛タンパク質と
供与体鎖はお互いに共有結合しまたは共有結合していない場合でもよい。The present invention relates to immunogenic complexes and polypeptides that comprise a pili protein component or moiety and a donor chain component or moiety, wherein the pili protein and donor chain are covalently or covalently linked to each other. Even if it doesn't exist.

【００２６】 本発明の目的はＦｉｍＨなどのアドヘジンまたはＰａｐＫなどのピリンを含む
細菌性ピリ線毛タンパク質から誘導されるアミノ酸配列、および供与体補体とし
て作用するもう一つのタンパク質の部分、とりわけ補体がＦｉｍＣまたはＰａｐ
Ｄなどのシャペロンまたはもう一つ別のサブユニットの部分、例えばＦｉｍＧま
たはＦｉｍＦであるサブユニットの部分を含むポリペプチドを提供することであ
る。The object of the present invention is to provide an amino acid sequence derived from a bacterial pili protein containing an adhesin such as FimH or a pilin such as PapK, and a portion of another protein which acts as a donor complement, especially complement. Is FimC or Pap
It is to provide a polypeptide comprising a chaperone such as D or a part of another subunit, eg a part of a subunit that is FimG or FimF.

【００２７】 特異的な実施例において、本発明は一本鎖免疫原ポリペプチドを形成するため
に、テトラペプチドなどのような短い介在配列により分解されるＦｉｍＧの最初
の１３残基より成る一本鎖のような供与体鎖に付着されるＦｉｍＨなどのピリン
タンパク質より成るポリペプチドを提供する。他の特異的な実施例は、一本鎖ポ
リペプチドを形成するために短いアミノ酸結合配列を経由してＰａｐＫのＣ端末
に付着されるＰａｐＤの配列でＰａｐＫを採用する類似の構造を含む。もち論本
発明はまた、ピリンの正しい形状が維持される限りにおいてピリンと供与体鎖セ
グメントが相互に非共有結合であるような構造をも含む。In a specific embodiment, the invention relates to a single 13 residue of FimG which is cleaved by a short intervening sequence such as a tetrapeptide to form a single chain immunogenic polypeptide. Provided is a polypeptide consisting of a pilin protein such as FimH attached to a donor chain such as a chain. Other specific examples include similar structures that employ PapK with the sequence of PapD attached to the C-terminus of PapK via a short amino acid binding sequence to form a single-chain polypeptide. Theory The present invention also includes structures in which the pilin and donor chain segments are non-covalently linked to each other so long as the correct shape of the pilin is maintained.

【００２８】 とりわけ望ましい実施例においては、本発明のポリペプチドまたはその複合体
はピリ線毛サブユニットおよびもう一つのピリ線毛サブユニットのＮ末端延長部
分から誘導される供与体鎖を含む。In a particularly preferred embodiment, a polypeptide of the invention or complex thereof comprises a pili subunit and a donor chain derived from the N-terminal extension of another pili subunit.

【００２９】 更になお本発明の目的は、疾病と戦い、とりわけワクチン接種により疾病を予
防する手段として修飾ピリ線毛ポリペプチドを含むワクチンを提供することであ
り、ここでこのような疾病はアドヘジン構造が誘導される細菌種とりわけ大腸菌
により引き起こされるものである。A still further object of the present invention is to provide a vaccine comprising a modified pili polypeptide as a means of combating disease, and in particular preventing it by vaccination, wherein such disease is an adhesin structure. Is caused by a bacterial species, especially Escherichia coli.

【００３０】 本発明の付加された目的は、アドヘジンまたはピリン構造が誘導される細菌、
とりわけ大腸菌により起こる疾病を治癒するために、ここで開示される修飾ピリ
線毛タンパク質構造に特異的な抗体を提供することである。An additional object of the invention is a bacterium in which an adhesin or pilin structure is induced,
Among other things, is to provide antibodies specific for the modified pili protein structure disclosed herein to cure diseases caused by E. coli.

【００３１】 更になお本発明の目的は、シャペロンなどのような対応するタンパク質を産生
する必要なしで、ワクチンとして使用するために遊離状態でまたはもう一つのピ
リンタンパク質との複合体のいずれかで大規模に修飾ピリ線毛タンパク質を合成
する方法を提供することである。このような方法は、それによりポリペプチド一
本鎖としてこのようなピリ線毛ベイスト（ピリンベイストおよびアドヘジンベイ
スト）ワクチンの産生を促進し、かくして時間、コストおよび生産の複雑性を削
減し、大規模のワクチンの生産を促進するであろう。Still further, the object of the present invention is to increase the size of the protein either free or in complex with another pilin protein for use as a vaccine, without the need to produce the corresponding proteins such as chaperones and the like. It is to provide a method for synthesizing modified pili proteins on a scale. Such a method thereby facilitates the production of such pilus-based (pyrine and adhesin-based) vaccines as a polypeptide single chain, thus reducing time, cost and production complexity and increasing scale. Will promote the production of this vaccine.

【００３２】 ［図面の簡単な説明］ 図１は大腸菌などの細菌のピリ線毛を構成する各種のＦｉｍタンパク質のアミ
ノ酸配列の比較を示す。ＦｉｍＨ，ＦｉｍＡ，ＦｉｍＦおよびＦｉｍＧの配列は
すべて対応する配列とドメインを示すために整列される。マンノース結合レクチ
ンドメインの終結部とＦｉｍＨにあるピリンドメインの出発部は配列の上の垂直
矢じり部で示される。タイプ１ピリンサブユニット（ＦｉｍＡ，ＦｉｍＦおよび
ＦｉｍＧ）はクラスタルＷ（コンピュータプログラム）を用いてＦｉｍＨのピリ
ンドメインと整列され（トンプソン他、核酸研究、２２巻，４６７３ページ（１
９９４年））、二次構造エレメントでのギャップを最小にするために手で調節さ
れる。ＦｉｍＨに対する配列番号付与はプレタンパク質の位置２２で出発する。
（ＦｉｍＨを含む）ピリ線毛サブユニットは内膜を交差する輸送の間に切断され
るアミノ末端シグナル配列でプレタンパク質として細胞質で発現される。我々の
地図で可視であるＦｉｍＨ内の最初の残基は遺伝子誘導配列でＰｈｅ²²に対応し
、これはＦｉｍＨ鎖の期待された出発点である。アドヘジンタンパク質内の残基
をシャペロン内の残基から区別するために、ＦｉｍＨ残基は残基番号の後に「Ｈ
」と表示されＦｉｍＣ残基は「Ｃ」と表示される。シャペロン結合に含まれる残
基は残基の上の円部で示される。炭水化物結合ポケットの残基はピリンサブユニ
ットでのＮＨ₂末端延長部を持つ大型ボックスで四角に囲まれる。すべてのピリ
ンサブユニットで見出される保存されたβジッパー主要素はＦβ鎖に対応する。
二次構造エレメントの範囲と用語は配列の下に示される。[Brief Description of Drawings] FIG. 1 shows a comparison of amino acid sequences of various Fim proteins constituting pili of bacteria such as Escherichia coli. The FimH, FimA, FimF and FimG sequences are all aligned to show the corresponding sequence and domain. The end of the mannose-binding lectin domain and the start of the pilin domain at FimH are indicated by vertical arrowheads above the sequence. The type 1 pilin subunits (FimA, FimF and FimG) are aligned with the pilin domain of FimH using cluster W (computer program) (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22: 4673 (1).
994)), manually adjusted to minimize gaps in secondary structure elements. The sequence numbering for FimH starts at position 22 of the preprotein.
The pili subunit (including FimH) is expressed in the cytoplasm as a preprotein with an amino-terminal signal sequence that is cleaved during transport across the inner membrane. The first residue in a visible our map FimH corresponds to Phe ²² gene-derived sequences, this is expected starting point for FimH chain. In order to distinguish the residues in the adhesin protein from those in the chaperone, the FimH residue is followed by a "H" after the residue number.
Is displayed and the FimC residue is displayed as “C”. The residues involved in the chaperone bond are indicated by the circle above the residue. Residue of the carbohydrate binding pocket surrounded by a square in a large box with the NH ₂ -terminal extension of at pilin subunits. The conserved β zipper major element found in all pilin subunits corresponds to the Fβ chain.
Ranges and terms for secondary structural elements are shown below the sequence.

【００３３】 図２はＦｉｍＣの配列を示す。サブユニット結合に含まれる残基は残基の上の
円部で示される。すべてのペリプラズムシャペロンと同一でありまたそこで保存
される残基はより暗い背景に対して設定される。二次構造エレメントの範囲と用
語は残基の下に示される。FIG. 2 shows the sequence of FimC. The residues involved in subunit binding are indicated by the circle above the residue. Residues identical to and conserved in all periplasmic chaperones are set against a darker background. Ranges and terms for secondary structural elements are shown below the residues.

【００３４】 図３はＦｉｍＨのマンノース結合ドメイン（図３Ａ）とピリンドメイン（図３
Ｂ）のβシートトポロジーダイアグラムを示す。Ｆ鎖はピリンドメインのＣ末端
端部にあり、かくしてＦｉｍＨ分子のＣ末端で現れるであろう。描かれた各鎖は
図１の対応する配列と容易に相関され、ここで鎖の命名はその鎖を作り上げる残
基を示す矢印の下で現れる。FIG. 3 shows the mannose-binding domain of FimH (FIG. 3A) and the pilin domain (FIG. 3).
The β sheet topology diagram of B) is shown. The F chain is at the C-terminal end of the pilin domain and thus will appear at the C-terminus of the FimH molecule. Each depicted chain is readily correlated with the corresponding sequence in Figure 1, where the chain designation appears below the arrow indicating the residues that make up that chain.

【００３５】 図４は（描かれたＧ１鎖と共に）矢印で描かれるようにＦｉｍＨは垂直にＦｉ
ｍＣが水平に配向されたＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体のモルスクリプト（Ｐ．Ｊ．
クローリス，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，２４巻，９４６ページ（１９９１年
））リボンダイアグラムを示す。上右部はＦｉｍＨのレクチンドメインに結合す
るＣ−ＨＥＧＡ分子のボールアンドスティック画像を示しこのドメインの尖端で
炭水化物結合部位の位置を示す。In FIG. 4, FimH is perpendicular to Fi (as depicted by the arrow (with the G1 chain drawn).
Morscript of FimC-FimH complex (PJ.
Cloris, J. Appl. Cryst. , 24, p. 946 (1991)) shows a ribbon diagram. The upper right shows a ball-and-stick image of the C-HEGA molecule binding to the lectin domain of FimH, showing the location of the carbohydrate binding site at the apex of this domain.

【００３６】 図５はＰピリ線毛サブユニット（ＰａｐＡ，ＰａｐＫ，ＰａｐＥおよびＰａｐ
Ｆ）の配列アラインメントを示す。ＰａｐＫの二次構造エレメントは整列された
配列の上部で示され、β鎖とらせん（αと３₁₀の両方を含む）を示される。Ｐａ
ｐＫの残基番号はＰａｐＫ配列の上に示される。ＰａｐＤのドメイン１と２に接
触する含まれる残基は四角で囲まれる。ピリンに厳重に保持された残基は残基番
号７，１４，５４，１４４および１５６の下で（標準一文字コードを用いて）Ｇ
，ＣおよびＹ残基の垂直四つ組として示される。FIG. 5 shows P pili subunits (PapA, PapK, PapE and Pap).
F) shows a sequence alignment. The secondary structural elements of PapK are shown at the top of the aligned sequences, indicating the β chain and the helix (including both α and 3 ₁₀ ). Pa
The pK residue number is shown above the PapK sequence. The included residues that contact domains 1 and 2 of PapD are boxed. Residues tightly retained by pilin are G (using the standard one-letter code) under residue numbers 7, 14, 54, 144 and 156.
, C and Y residues are shown as vertical quadruples.

【００３７】 図６はＰａｐＤの配列と二次構造説明を示す。残基番号は配列の上部に示され
、一方二次構造エレメントはその下部に示される。ＰａｐＫと接触する残基は四
角で囲まれる。FIG. 6 shows the PapD sequence and secondary structure description. Residue numbers are shown at the top of the sequence, while secondary structural elements are shown below it. Residues that make contact with PapK are boxed.

【００３８】 図７はジョーンズ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３巻，８４
６ページ（１９９３年））に記載された二次構造命名法に基づくＰａｐＫのトポ
ロジーを示す。ベータ鎖は矢印で示され、一方らせんは円柱で示される。Ｐａｐ
Ｄの挿入ベータ鎖はＧ１の図形で示される。FIG. 7 shows Jones, Curr. Op. Struct. Biol. , Volume 3, 84
6 shows the topology of PapK based on the secondary structure nomenclature described on page 6 (1993)). The beta strand is indicated by an arrow, while the helix is indicated by a cylinder. Pap
The inserted beta strand of D is shown in the G1 pattern.

【００３９】 図８はＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体の構造と二次構造表示の説明を示す。ここで
ＰａｐＫの分子表面はＧＲＡＳＰを用いて計算され示された（ニコルズ他、タン
パク質：遺伝学の構造と機能、１１巻，２８１ページ（１９９１年））。Ｐａｐ
Ｄの構造はリボンで示される。ＰａｐＤのＧ１鎖のＰａｐＫの表面にある溝への
挿入が示される。FIG. 8 shows the structure of the PapD-PapK complex and an explanation of the secondary structure representation. Here, the molecular surface of PapK was calculated and shown using GRASP (Nichols et al., Protein: Structure and function of genetics, Vol. 11, p. 281 (1991)). Pap
The structure of D is shown with a ribbon. Insertion of the G1 chain of PapD into the groove on the surface of PapK is shown.

【００４０】 図９は本発明の一つの実施例の一般的配置を示し、ここでＦｉｍＨは供与体鎖
相補ＦｉｍＨ（ｄｓｃＦｉｍＨ）を形成するためにテトラペプチド（標準一文字
アミノ酸コードを使用する−ＤＮＫＱ）リンカーを用いてＦｉｍＧの残基１−１
３に連結されている。この実施例の構築は実施例１に詳細に記載されている。FIG. 9 shows the general configuration of one embodiment of the present invention, where FimH is a tetrapeptide (using the standard one-letter amino acid code-DNKQ) to form the donor chain complement FimH (dscFimH). Residue 1-1 of FimG using a linker
It is connected to 3. The construction of this example is described in detail in Example 1.

【００４１】 図１０はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスがピリ線毛タンパク質とＣＦＡ／ＩＦＡで免疫
化された実験の結果を示す。ここで４週の追加免疫がＩＭ（筋肉内）で行われ、
次いで動物は大腸菌菌株ＮＵ１４の１１．３×１０⁷ＣＦＵ（コロニー形成単位
）の用量で尿道内で９週に攻撃された。FIG. 10 shows the results of an experiment in which C3H / HeJ mice were immunized with pili protein and CFA / IFA. Here, a 4-week booster is given IM (intramuscular),
The animals were then challenged in the urethra at week 9 with a dose of 11.3 × 10 ⁷ CFU (colony forming units) of E. coli strain NU14.

【００４２】 図１１はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスが左側に示された終点力価の指示された免疫原
を持つようにピリ線毛タンパク質および４週と１６週のＩＭ（筋肉内）追加免疫
で免疫化された実験の結果を示す。FIG. 11: C3H / HeJ mice were immunized with pili protein and 4 week and 16 week IM (intramuscular) boosts to have the indicated immunogens with endpoint titers shown on the left. The results of the conducted experiments are shown.

【００４３】 図１２はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスが指示されたピリ線毛タンパク質とＭＦ５９で
免疫化された実験の結果を示す。ここで４週と１６週の追加免疫がＩＭ（筋肉内
）で行われ、次いで動物は大腸菌菌株ＮＵ１４の７×１０⁷ＣＦＵ（コロニー形
成単位）の用量で１９週に尿道内で攻撃された。FIG. 12 shows the results of an experiment in which C3H / HeJ mice were immunized with the indicated pili protein and MF59. Here, 4 and 16 weeks of booster immunizations were given IM (intramuscularly), then the animals were challenged intraurethrally at 19 weeks with a dose of 7 × 10 ⁷ CFU (colony forming units) of E. coli strain NU14.

【００４４】[0044]

【発明の説明】DESCRIPTION OF THE INVENTION

本発明はポリペプチド、とりわけピリ線毛タンパク質、例えばアドヘジン，お
よびシャペロン断片またはピリン断片のいずれか、同じくその二量体複合体など
から形成される免疫原ポリペプチドに指向し、ここで前記複合体の成分はお互い
に共有結合している場合もありそうでない場合もある。このようなポリペプチド
、およびその複合体は補助タンパク質の必要性無しで純粋形態でまた機能的状態
で合成されるという利点を持つ。もっとも補助タンパク質も本発明の範囲内で特
異的な複合体を形成するために使用されることがある。The present invention is directed to an immunogenic polypeptide formed from a polypeptide, especially a pili protein, eg, adhesin, and either a chaperone fragment or a pilin fragment, also a dimeric complex thereof, wherein said complex The components of may or may not be covalently bonded to each other. Such polypeptides, and their conjugates, have the advantage of being synthesized in pure form and in a functional state without the need for auxiliary proteins. However, accessory proteins may also be used within the scope of the invention to form specific complexes.

【００４５】 ここで使用されるように、「ピリ線毛タンパク質」という用語はピリ線毛、と
りわけタイプ１ピリ線毛またはＰピリ線毛に存在するいずれかのタンパク質また
はポリペプチドを意味する。この用語はピリ線毛のすべてのサブユニットを包含
するがシャペロンは除かれる。というのは、それらがピリ線毛の形成には不可欠
であるけれども、この小器官への組み込みはされず、従って、そのサブユニット
ではないからである。またここで使用されるように「アドヘジン」という用語は
タンパク質、とりわけ特異的受容体結合特性を持つピリ線毛のサブユニットであ
り、例えば細胞表面、とりわけ粘膜細胞の表面、中でも哺乳類膀胱細胞の表面で
特異的に結合するマンノース運搬部位に特異的に結合するレクチン結合ドメイン
を持つＦｉｍＨなどのタンパク質を意味する。As used herein, the term “pilus protein” means any protein or polypeptide present in pili, especially type 1 pili or P pili. The term includes all subunits of pili but excludes chaperones. For, although they are essential for the formation of pili, they are not integrated into this organelle and are therefore not its subunits. Also as used herein, the term "adhesin" is a protein, especially a subunit of pili with specific receptor binding properties, such as the surface of cells, especially mucosal cells, especially mammalian bladder cells. It means a protein such as FimH having a lectin-binding domain that specifically binds to a mannose transporting site that specifically binds to.

【００４６】 ピリ線毛生物発生の間に、ＦｉｍＣまたはＰａｐＤのいずれかのシャペロンは
個別のピリ線毛サブユニットと結合し安定した複合体を形成する。シャペロンは
Ｌ形状分子を形成するためにお互いに指向する２個の免疫グロブリン状（Ｉｇ状
）ドメインよりなる（ホルムグレンおよびブランデン，ネイチャー，３４２，２
４８（１９８９）；ペルッキア他、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５
巻，８８５ページ（１９９８年））。ＦｉｍＨアドヘジンはピリンドメインと受
容体結合ドメインの両方を持つ。ＰａｐＫピリンとＦｉｍＨのピリンドメインは
Ｉｇ状フォールドを持つが基準Ｉｇフォールドに存在する第７末端β鎖（図３の
Ｇ鎖）を欠いている。この鎖の存在はピリンドメインの表面に沿って深い溝を産
生し、疎水性コアを露出させ、これによりシャペロン無しで発現された時にピリ
ンの不安定性の原因となる（下記の実施例を参照のこと）。かくしてシャペロン
サブユニット複合体においては、シャペロンのＧ１鎖は溝を専有しサブユニット
Ｃ末端Ｆ鎖と平行に走らせることにより不規則なＩｇフォールドを完成する。本
発明に従って、この「供与体鎖相補性」相互作用は同時にピリ線毛サブユニット
を安定させその相互作用面にキャップし、ペリプラズム内での二量体形成を阻止
する。更に本発明に従って、ピリ線毛生物発生の間に、一つのサブユニットの高
度に保存されたＮ末端延長部はここで「供与体鎖交換」として引用されるプロセ
スにより隣接サブユニットからシャペロンＧ１鎖を置換する。Ｎ末端鎖は次いで
完全に基準Ｉｇドメインの配置を含む成熟ピリ線毛を産出するために隣接サブユ
ニットのＦ鎖に逆平行に挿入し、そのそれぞれは隣接サブユニットのフォールド
への鎖に寄与する。During pilus biogenesis, chaperones of either FimC or PapD bind to individual pilus subunits to form stable complexes. Chaperones consist of two immunoglobulin-like (Ig-like) domains that are oriented towards each other to form an L-shaped molecule (Holmgren and Branden, Nature, 342, 2).
48 (1989); Percchia et al., Nature Structure. Biol. 5
Vol., Page 885 (1998)). FimH adhesin has both a pilin domain and a receptor binding domain. The PapK pilin and FimH pilin domains have an Ig-like fold but lack the seventh terminal β chain (G chain in Figure 3) present in the canonical Ig fold. The presence of this chain creates a deep groove along the surface of the pilin domain, exposing the hydrophobic core, which causes instability of pilin when expressed without chaperones (see Examples below). thing). Thus, in the chaperone subunit complex, the G1 chain of the chaperone occupies a groove and runs parallel to the subunit C-terminal F chain to complete an irregular Ig fold. In accordance with the present invention, this "donor strand complementarity" interaction simultaneously stabilizes the pili subunit and caps its interaction surface, blocking dimer formation within the periplasm. Further in accordance with the invention, during pilus biogenesis, the highly conserved N-terminal extension of one subunit is separated from the chaperone G1 chain from an adjacent subunit by a process herein referred to as "donor strand exchange". Replace. The N-terminal strand is then inserted antiparallel to the F strand of the adjacent subunit to yield a mature pili containing the complete arrangement of the canonical Ig domain, each of which contributes to the strand of the adjacent subunit into the fold. .

【００４７】 かくして更にここで開示される発明に従って、ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体など
で、あるいはＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体などでのピリンの全体構造に対するＦｉ
ｍＣまたはＰａｐＤなどのシャペロンの寄与は、このような複合体の構造をＸ線
解析により解明することで決定された（チョードリ他，尿路病原大腸菌からのＦ
ｉｍＣ−ＦｉｍＨシャペロン−アドヘジン複合体のＸ線構造，サイエンス，２８
５巻１０５８ページ；バーンハート他，ＰａｐＤ状シャペロンはピリンタンパク
質のフォールディングに関する欠失情報を提供する、全米科学アカデミー紀要、
１０巻，１０７３ページ／ｐｎａｓ．１３０１８３８９７（２０００年６月２０
日）オンライン刊行）これらすべての引用例の開示はその全体をここでの引用例
として組み込まれる）。ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体に対しては、結晶構造はセレ
ンメチオニルＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ結晶から収集された２．７Åに対しＭＡＤデー
タを使用して解明された。構造決定のために使用された結晶は細胞寸法がａ＝１
３９．０Å，ｂ＝１３９．０８Å，ｃ＝２１４．４９Å，およびβ＝８９．９７
Åである結晶群Ｃに属する。結晶構造はレクチンドメインの他の平らな表面にあ
るポケットの存在を明らかにした。このポケットは単一マンノースユニットを受
け入れるのに十分な大きさであり、ピリンドメインとの関係で遠位にあるドメイ
ンの突端部に位置している。ＦｉｍＨでは、ポケットの底部はＦｉｍＨ分子のＮ
末端により定義され、３ループ領域にあるＡｓｎ，Ｇｌｎ，およびＡｓｐ残基か
らの典型的な炭水化物で整列される。Thus, further in accordance with the invention disclosed herein, Fi to the overall structure of pilin, such as in a FimC-FimH complex or in a PapD-PapK complex.
The contribution of chaperones such as mC or PapD was determined by elucidating the structure of such complexes by X-ray analysis (F from Chordry et al., Uropathogenic E. coli).
X-ray structure of imC-FimH chaperone-adhesin complex, Science, 28
5, 1058; Barnhart et al., PapD-like chaperones provide deletion information on folding of pilin proteins, Bulletin of the National Academy of Sciences,
Volume 10, page 1073 / pnas. 130183897 (June 20, 2000)
(Japanese) Published online) The disclosures of all these references are incorporated by reference in their entirety). For the FimC-FimH complex, the crystal structure was solved using MAD data for 2.7Å collected from selenium methionyl FimC-FimH crystals. The crystals used for structure determination have a cell size of a = 1
39.0Å, b = 139.08Å, c = 214.49Å, and β = 89.97
Belongs to the crystal group C which is Å. The crystal structure revealed the presence of other flat surface pockets in the lectin domain. This pocket is large enough to accept a single mannose unit and is located at the tip of the domain distal to the pilin domain. In FimH, the bottom of the pocket is the N of the FimH molecule.
Defined by the ends and aligned with typical carbohydrates from Asn, Gln, and Asp residues that are in the 3 loop region.

【００４８】 この分析はＦｉｍＨがオールベータクラスの２個のドメインにフォールドされ
たことを示した。これらの領域は端部から端部まで整列され、このためＦｉｍＨ
分子は１００Å以上に広がる。ＦｉｍＨアドヘジンのアミノ末端ドメインは粘膜
細胞の表面に結合するために使用されるマンノース結合ドメインを含み、またＣ
末端端部はピリンドメインを形成し、これはアドヘジンをピリ線毛に固定するた
めに使用される。ＮＨ₂末端マンノース結合ドメインは残基１Ｈ−１５６Ｈより
成り、一方アドヘジンをピリ線毛に固定するために使用されるＣ末端ピリドメイ
ンは残基１６０Ｈ−２７９Ｈを含む（図１参照）。加えて延長リンカー（残基１
５７Ｈ−１５９Ｈ）は２個のドメインを結合する。This analysis showed that FimH was folded into two domains of the all beta class. These areas are aligned end-to-end, which is why FimH
The molecule spreads over 100Å. The amino-terminal domain of FimH adhesin contains a mannose binding domain used to bind to the surface of mucosal cells, and also C
The terminal end forms a pilin domain, which is used to anchor the adhesin to the pili. NH ₂ terminal mannose binding domain consists of residues IH-156H, whereas the C-terminal pyridinium domain used the adhesins to secure the pilus comprises residues 160H-279H (see FIG. 1). In addition, an extended linker (residue 1
57H-159H) binds two domains.

【００４９】 前に述べたように、ＦｉｍＣはお互いに約９０°で配向され２個のドメインの
間に深い割れ目を持つ２個の免疫グロブリン状ドメインを持つ。ＦｉｍＨのピリ
ンドメインはシャペロンの割れ目に結合するが第７番目のフォールドが欠失して
いるので（図３参照）、疎水性コアは露出されピリンドメインの末端部分はピリ
ンドメインの対向端部の代わりにお互いに隣り合わせに存在する。As mentioned previously, FimC has two immunoglobulin-like domains oriented at approximately 90 ° to each other with a deep crevice between the two domains. Since the pilin domain of FimH binds to the chaperone cleft but lacks the 7th fold (see Figure 3), the hydrophobic core is exposed and the terminal part of the pilin domain replaces the opposite end of the pilin domain. Exist next to each other.

【００５０】 かくしてＦｉｍＨのピリンドメインは数多くのシャペロンのＮＨ₂末端ドメイ
ンのように同じトポロジーを持つが、決定的な差はフォールドの第７鎖が欠失し
ていることである。同じような状況が他のピリ線毛タンパク質で例えばＦｉｍＧ
およびＦｉｍＦで起こるであろう。ＦｉｍＨ−ＦｉｍＣ複合体ではシャペロンの
Ｇ１鎖（すなわち第７鎖）はピリンのＡ鎖とＦ鎖の第２半部の間に挿入されるこ
とでピリンドメインを相補するために使用される。かくしてＦｉｍＨのＣ末端ま
たはＦ鎖（図１と３）はＦｉｍＣのＧ１β鎖で平行ベータプリーツ鎖相互作用を
形成し（図２）、また保存されたＦｉｍＣの残基Ａｒｇ^8CとＬｙｓ^112Cとの水素
結合を通じてシャペロン割れ目のすきまに固定されるＣＯＯＨ末端カルボキシル
基を持つ（上付き数字と文字は残基数と含まれるタンパク質の同定を引用する。
例えばＦｉｍＣ配列の「Ｃ」およびＦｉｍＨ配列の「Ｈ」である）。ＦｉｍＨ−
ＦｉｍＣ相互作用に含まれる残基は図１と図２で指示され、ここでこれらのタン
パク質のアミノ酸配列が示される。Thus, the pilin domain of FimH has the same topology as the NH ₂ -terminal domains of many chaperones, but the crucial difference is the deletion of the seventh strand of the fold. Similar circumstances apply to other pili proteins, such as FimG.
And FimF. In the FimH-FimC complex, the G1 chain of the chaperone (ie the 7th chain) is inserted between the A chain of the pilin and the second half of the F chain to be used to complement the pilin domain. Thus, the C-terminal or F chain of FimH (FIGS. 1 and 3) forms a parallel beta-pleated chain interaction with the G1β chain of FimC (FIG. 2), and also the hydrogens of the conserved FimC residues Arg ^8C and Lys ^112C. It has a COOH-terminal carboxyl group that is anchored in the gap of the chaperone cleft through conjugation (superscript numbers and letters refer to the number of residues and identification of the protein involved.
For example, "C" for the FimC sequence and "H" for the FimH sequence). FimH-
The residues involved in the FimC interaction are indicated in Figures 1 and 2 where the amino acid sequences of these proteins are shown.

【００５１】 シャペロンがアドヘジンの適切なフォールディングに指向するためにアドヘジ
ン、ここではＦｉｍＨに結合するプロセスは「供与体鎖相補」として引用され、
またアドヘジンのフォールドまたは構造を相補する鎖、例えばシャペロンＦｉｍ
ＣのＧ１β鎖などは「供与体鎖相補」セグメントまたは「供与体鎖」として引用
される。より特異的には、ペリプラズムシャペロンのＧ１βジッパーはＦｉｍＣ
で１０３，１０５，１０７の位置で溶媒露出疎水性残基の保存主要素を含む（図
２参照）。ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体では、これらの残基はＦｉｍＨの未完成の
疎水性コアを完成するために使用される。要約すると、ピリンドメインはそれを
完成させるためにシャペロンがそのＧ１鎖を与える未完成タンパク質ドメインで
ある。その結果、一つのクラスとしてのピリ線毛タンパク質、またはピリンは安
定性と、および生の三次元配座へのフォールディングとに必要とされる必要な立
体配置情報を欠いており、そのため必要な相補または補償する構造を提供するよ
うに、シャペロンＦｉｍＨの場合はＦｉｍＣの存在を必要とする。The process by which chaperones bind to adhesins, here FimH, to direct proper folding of the adhesins, is referred to as “donor strand complementation”,
Also, a strand complementary to the fold or structure of adhesin, such as chaperone Fim
The G1β chain of C and the like is referred to as the “donor chain complement” segment or “donor chain”. More specifically, the G1β zipper of the periplasmic chaperone is FimC.
At the positions 103, 105, and 107 contain a conserved major element of solvent-exposed hydrophobic residues (see Figure 2). In the FimC-FimH complex, these residues are used to complete the unfinished hydrophobic core of FimH. In summary, the pilin domain is an unfinished protein domain in which the chaperone provides its G1 chain to complete it. As a result, the pili proteins, or pilins, as a class lack the necessary conformational information required for stability and folding into the native three-dimensional conformation, and thus the required complementation. Alternatively, the presence of FimC is required in the case of the chaperone FimH to provide a compensating structure.

【００５２】 シャペロンのＧ１鎖は単にそれ自身をＦｉｍＨの溝（ＦとＡ２ラインの溝）に
挿入し、そのためＦｉｍＨのピリンドメインのＣ末端端部で同一配列の遺伝子操
作があたかもシャペロンが存在したかのように同一構造（すなわち同一全体形状
）を持つＦｉｍＨに帰着する。選択肢としてＦｉｍＧのＮ末端配列が使用される
が、何故ならそれが完全に正統なフォールドを形成し易いからである。同じよう
に供与体鎖はシャペロンＰａｐＤからの適切な鎖またはもう一つの適切なピリ線
毛サブユニット構造からの鎖をモデリングすることによりＰａｐＫに遺伝子操作
することができる。The G1 chain of the chaperone simply inserts itself into the groove of FimH (the groove of the F and A2 lines), so whether the chaperone was engineered with the same sequence at the C-terminal end of the pilin domain of FimH. As a result, FimH has the same structure (that is, the same overall shape). The N-terminal sequence of FimG is used as an option, as it tends to form a perfectly orthodox fold. Similarly, the donor chain can be engineered into PapK by modeling a suitable chain from the chaperone PapD or another suitable pili subunit structure.

【００５３】 ＦｉｍＨの供与体相補構造またはいずれか他のアドヘジンが分子の全体形状ま
たはかくして免疫応答を刺激する能力に必要であるために、シャペロン不在下で
は、組換え手段または他の方法のいずれかでの免疫原として、またかくして感染
源の予防および処置のためのワクチンとして使用される純粋な形態でこのような
アドヘジンを生成することは事実上不可能である。In the absence of chaperone, either recombinant means or other methods, because the donor complementary structure of FimH or any other adhesin is required for the overall shape of the molecule and thus its ability to stimulate an immune response. It is virtually impossible to produce such adhesins in pure form for use as immunogens in S. cerevisiae and thus vaccines for the prevention and treatment of infectious agents.

【００５４】 本発明に従って、推定上のピリ線毛タンパク質免疫原の構造から欠失した配列
は欠失シャペロン配列の位置を占めるために、適切な供与体鎖配列で補充される
。ここで開示されるように、このような配列と構造の例が提供される。また提供
されるものは、広範囲の細菌性ピリ線毛タンパク質、とりわけそれらが細菌性疾
病を予防およびもしくは処置するための組成物の開発のために使用される場合に
それを相補する供与体として使用する適切な配列の決定を促進するガイダンスを
提供するルールである。更に組換え手段によるこれらの欠失構造を供給すること
は有利なことであり、完全に活性な（すなわち免疫原の）アドヘジン分子または
複合体を生じる。According to the present invention, sequences deleted from the structure of the putative pili protein immunogen are supplemented with appropriate donor chain sequences to occupy positions of the deleted chaperone sequences. Examples of such sequences and structures are provided, as disclosed herein. Also provided are a wide range of bacterial pili proteins, especially for use as donors to complement them when they are used for the development of compositions for preventing and / or treating bacterial diseases. It is a rule that provides guidance to facilitate the determination of the appropriate sequence to perform. Furthermore, it is advantageous to provide these deleted structures by recombinant means, resulting in a fully active (ie immunogenic) adhesin molecule or complex.

【００５５】 ＦｉｍＡ、ＦｉｍＦ、およびＦｉｍＧすべてはＦｉｍＨピリンドメインに比べ
てＮ末端で約１０−２０アミノ酸の高度に保持された延長部を持つ。ＰａｐＤ−
ＰａｐＫ構造では、ＰａｐＫアミノ末端延長部は異常になり、最初のβ鎖はＦｉ
ｍＨピリンドメインであるのと同じように最初のシステインの後で始まる。本発
明の一つの実施例に従って、一つのサブセットのアミノ末端延長部が近接サブユ
ニットの欠失第７鎖を提供するための供与体鎖として使用される。このような隣
接サブユニットの使用は、完全な正統フォールドを産生し、一方シャペロンそれ
自身は非定型的フォールドを完成させるであろう。FimA, FimF, and FimG all have a highly conserved extension of approximately 10-20 amino acids at the N-terminus relative to the FimH pilin domain. PapD-
In the PapK structure, the PapK amino terminal extension is abnormal and the first β chain is Fi
It begins after the first cysteine as it is in the mH pilin domain. According to one embodiment of the present invention, a subset of amino terminal extensions is used as the donor strand to provide the deleted seventh strand of the contiguous subunits. Use of such flanking subunits will produce a complete orthodox fold, while the chaperone itself will complete the atypical fold.

【００５６】 更に本発明に従って結晶手順などはＰａｐＫがβサンドイッチ状に一緒に出て
くる２個のβシートを持つＰａｐＤのアミノ末端ドメインとして同じ全体可変領
域がＩｇ状フォールドを持つことを示す。しかしＰａｐＫのＩｇフォールドは不
完全でＣＯＯＨ末端第７鎖を欠いており、この第７鎖Ｇは正統Ｉｇフォールドで
はＦ鎖と逆平行Ｂシート相互作用を形成し、タンパク質の疎水性コアに貢献する
ものである。ＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体では、決失鎖はＰａｐＤにより提供され
、ＰａｐＤはすぐ前に記載したＦｉｍＨ−ＦｉｍＣ複合体で見出されたようなア
ナログ様式でＰａｐＫのＩｇフォールドを完成するためにそのＧ１β鎖を与える
ことが発見されている。しかしそこで産生されるＩｇフォールドは非定型的であ
り、ＰａｐＫのＦ鎖に対して与えられた鎖は逆平行よりも平行して走っているか
らである。ピリンのフォールドへのＧ１β鎖の挿入すなわち供与体鎖相補はＦｉ
ｍＨ−ＦｉｍＣ複合体の結晶構造で観察されたものに類似する。Furthermore, according to the present invention, crystallization procedures and the like show that the same whole variable region has an Ig-like fold as the amino-terminal domain of PapD with two β-sheets where PapK comes out together in a β-sandwich. However, the PapK Ig fold is defective and lacks the COOH-terminal seventh strand, and this seventh strand G forms an antiparallel B-sheet interaction with the F chain in the orthodox Ig fold and contributes to the hydrophobic core of the protein. It is a thing. In the PapD-PapK complex, the lost chain is provided by PapD, which is its G1β chain to complete the Igfold of PapK in an analog fashion as found in the FimH-FimC complex described immediately above. Have been found to give. However, the Ig folds produced there are atypical, as the given chain runs in parallel rather than antiparallel to the F chain of PapK. Insertion of the G1β chain into the fold of pilin, ie complementation of the donor chain
It is similar to that observed in the crystal structure of the mH-FimC complex.

【００５７】 ＰａｐＫの最初の８アミノ酸残基は不規則になり、ＰａｐＫのＩｇフォールド
は、Ｂ鎖のＣＯＯＨ末端残基との逆平行水素結合を作る短いβ鎖、Ａ１で始まる
（図７参照）。この短いβシート配置は、シャペロンのＧ１鎖との逆平行Ｂ鎖相
互作用を作り出すためにβサンドイッチのＡ鎖切替側に生じる３₁₀らせん回転の
挿入により遮断される。Ａ鎖およびＢ鎖は短いαらせんで接続され、Ｅ鎖に逆平
行に走るβサンドイッチの２個のβシートの一つの端部を形成するのはＢ鎖であ
る。Ｂ鎖に続き、構造はＣ１鎖を形成する短い３₁₀らせんを通じてβサンドイッ
チの一方の側に横断し、このＣ１鎖は次いでＦ鎖に逆平行に走る。The first 8 amino acid residues of PapK are disordered and the PapK Ig fold begins with a short β chain, A1, which makes an antiparallel hydrogen bond with the COOH terminal residue of the B chain (see FIG. 7). . This short β-sheet arrangement is blocked by the insertion of a 3 ₁₀ helix turn that occurs on the A-chain switching side of the β-sandwich to create an antiparallel B-chain interaction with the G1 chain of the chaperone. The A and B chains are connected by a short α helix, and it is the B chain that forms one end of the two β sheets of the β sandwich, which run antiparallel to the E chain. Following the B chain, the structure traverses one side of the β sandwich through a short 3 ₁₀ helix forming the C1 chain, which then runs antiparallel to the F chain.

【００５８】 ＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体の全包埋表面域は３４３４Ųであり、ＰａｐＤの
２個の対応する部位と相互作用するＰａｐＫの２個の異なる部位が存在する。Ｐ
ａｐＫのＫ１部位（図７参照）はＰａｐＤのドメイン１（図６のＤ１部位）と相
互作用し、Ｋ１はサブユニットの長さを走る深い溝を含む。この溝の端部はＡ鎖
とＦ鎖より成り、その基礎はＰａｐＫの疎水性コアにより形成される。この溝は
ＰａｐＫのＩｇフォールドにおける欠失Ｇ１β鎖の結果である。ＰａｐＤのＩｇ
フォールド（図６参照）でのＧ１β鎖の（Ｄ１部位での）残基１０１乃至１１２
はＫ１溝に挿入し溝の一方の側にＰａｐＫのＦ鎖にβジッパーを相互作用させる
（図７）。残基１０１乃至１０５は更に溝の一方の側でＡ２鎖とβジッパー相互
作用をさせる。Ｇ１鎖の挿入は更にＰａｐＤのＣ１、Ｆ１、Ｆ１、およびＧ１鎖
、ならびにＰａｐＫのＦ１とＣ１鎖を含む連続５鎖のβシートの形成に帰着する
。ＰａｐＤのＧ１β鎖にある交互疎水性残基は溝の疎水性塩基と相互作用する。
かくしてＰａｐＤのＧ１β鎖による供与体鎖相補はペリプラズムの水性環境への
露出からピリンの疎水性核を保護する。更にＰａｐＫのＫ２部位はＰａｐＤのＣ
ＯＯＨ末端ドメイン（ドメイン２）上の部位と相互作用する。かくしてＰａｐＤ
−ＰａｐＫ複合体構造では、ＰａｐＫのＦ鎖はシャペロンのＧ１β鎖がその中に
挿入しピリンで同じ構造的役割をとると考えられる溝の一つの側を形成する。The total embedding surface area of the PapD-PapK complex is 3434Å ² , and there are two different sites of PapK that interact with the two corresponding sites of PapD. P
The K1 site of apK (see FIG. 7) interacts with domain 1 of PapD (D1 site of FIG. 6) and K1 contains a deep groove running the length of the subunit. The ends of this groove consist of A and F chains, the basis of which is formed by the hydrophobic core of PapK. This groove is the result of a deleted G1β chain in the Ig fold of PapK. Ig of PapD
Residues 101 to 112 (at the D1 site) of the G1β chain in the fold (see FIG. 6)
Inserts into the K1 groove and causes the β-zipper to interact with the F chain of PapK on one side of the groove (FIG. 7). Residues 101-105 further allow β-zipper interaction with the A2 chain on one side of the groove. The insertion of the G1 chain further results in the formation of a continuous 5-chain β-sheet containing the C1, F1, F1, and G1 chains of PapD and the F1 and C1 chains of PapK. Alternating hydrophobic residues in the G1β chain of PapD interact with the groove hydrophobic bases.
Thus, donor chain complementation by the G1β chain of PapD protects the hydrophobic core of pilin from exposure of the periplasm to the aqueous environment. Furthermore, the K2 site of PapK is the C of PapD.
Interacts with a site on the OOH-terminal domain (domain 2). Thus PapD
In the -PapK complex structure, the F chain of PapK forms one side of the groove, which is thought to have the same structural role for pilin as the G1β chain of the chaperone inserts into it.

【００５９】 遺伝子、生化学および電子顕微鏡の各研究は、２個の保存主要素（Ｃ末端Ｆ鎖
とＮ末端主要素）にある残基がピリ線毛アセンブリに必要なサブユニット−サブ
ユニット相互作用に関与することを示した（ハン他、ＥＭＢＯ Ｊ．１５巻、３
７９２ページ（１９９６年）；ケーン他、サイエンス ２６２巻，１２３４ペー
ジ（１９９３年）；ハルトグレン他，シャペロンの分子生物学とフォールディン
グ触媒：調節、細胞機能およびメカニズム、Ｂ．ベーコー編（ハーウッド・アカ
デミック・パブリッシャーズ，アムステルダム，（１９９９年）６６１ページ参
照）。ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ結晶構造に基づくピリン配列のアラインメント（図１
参照）は、Ｎ末端主要素がＦｉｍＨピリンドメインで欠失しＰａｐＤ−ＰａｐＫ
で不規則となった１０−２０アミノ酸残基の一部であったことを明らかにした（
Ｐａｐタンパク質の類似のアラインメントは図４で示される）。この領域はシャ
ペロンのＧ１供与体鎖に類似の交互疎水性残基のパターンを含む。分子モデリン
グで示されるように、このようなサブユニットのＮ末端延長部はピリン溝へのは
めこみによりシャペロンのＧ１鎖の位置を占める。かくしてピリ線毛アセンブリ
の間に、Ｎ末端延長部での交互疎水性側鎖は本発明の供与体鎖交換メカニズムを
経由して、シャペロンのＧ１鎖によりピリンコアに供与された疎水性側鎖を取り
替えることができる。その正味の結果は、すべてのサブユニットがその隣接サブ
ユニットの免疫原状フォールドを完成するということである。Genetic, biochemical and electron microscopy studies have shown that residues in two conserved major elements (C-terminal F chain and N-terminal major element) are subunit-subunit interrequisites for pili assembly. It was shown to be involved in the action (Han et al., EMBO J. Vol. 15, 3
792 (1996); Kane et al., Science 262, 1234 (1993); Hartgren et al., Chaperone molecular biology and folding catalysts: regulation, cellular function and mechanism, B. et al. Edited by Bekoh (see Harwood Academic Publishers, Amsterdam, (1999) page 661). Alignment of pilin sequences based on the FimC-FimH crystal structure (Fig. 1
PapD-PapK in which the N-terminal major element is deleted in the FimH pilin domain.
It was clarified that it was a part of 10-20 amino acid residues that became irregular in (
A similar alignment of Pap proteins is shown in Figure 4). This region contains a pattern of alternating hydrophobic residues similar to the G1 donor chain of chaperones. As shown by molecular modeling, the N-terminal extension of such a subunit occupies the position of the G1 chain of the chaperone due to its fit into the pilin groove. Thus, during pili assembly, alternating hydrophobic side chains at the N-terminal extension replace the hydrophobic side chains donated to the pilin core by the G1 chain of the chaperone via the donor chain exchange mechanism of the present invention. be able to. The net result is that all subunits complete the immunogenic fold of their flanking subunits.

【００６０】 ＰａｐＫの不規則ＮＨ₂末端に対応するピリンのＮＨ₂末端部分はピリンのアセ
ンブリ表面を形成する。８ＮＨ₂末端残基はＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体で不規則
にされ、それらがアッシャーに位置を占める先行サブユニットの溝に自由に相互
作用する構造の主要部から突出する。本発明に従って、そのために、新入サブユ
ニットのＮＨ₂末端は先行サブユニットの溝に挿入し（そのプロセスがアッシャ
ーにより促進される）シャペロンのＧ１β鎖を置換する。このような「供与体鎖
交換」は、ピリ線毛において一つのサブユニットのＮＨ₂末端鎖が免疫原状フォ
ールドを完成し、それによりシャペロンがペリプラズムで行うのと同じだけ先行
サブユニットの疎水性コアを保護することを意味する。The NH ₂ -terminal portion of pilin, which corresponds to the disordered NH ₂ terminus of PapK, forms the assembly surface of pilin. 8NH ₂ terminal residue is irregular in PapD-PapK complex, they are projected from the main portion of the structure interacts freely in the groove of the leading sub units occupying positions in the asher. According to the invention, the NH ₂ terminus of the new subunit therefore inserts into the groove of the preceding subunit, replacing the G1β chain of the chaperone, the process of which is facilitated by Usher. Such a "donor strand exchange" is such that in the pili the NH ₂ terminal chain of one subunit completes the immunogenic fold, thereby causing the chaperone to undergo the hydrophobic core of the preceding subunit as much as it does in the periplasm. Means to protect.

【００６１】 本発明はかくしてＦｉｍＨなどのアドヘジン、またはＦｉｍＧとＦｉｍＡなど
の非アドヘジンを含むピリ線毛タンパク質に指向し、ここでＦｉｍＣなどのシャ
ペロン、またはピリ線毛アセンブリの間に供与体鎖交換メカニズムを経由するピ
リンにより通常供給される欠失断片はそのシャペロンまたはピリンから誘導され
るアミノ酸配列に加えられた。本発明に従って、この結果はＦｉｍＣのＧ１β鎖
（配列識別番号３と４）、またはＦｉｍＧ（配列識別番号５と６）またはＦｉｍ
Ｆ（配列識別番号７と８）、あるいは関連するピリンの他の類似の配列を遺伝子
操作することにより、アドヘジンなどのピリ線毛タンパク質のＣＯＯＨ末端への
前進または復帰（すなわち反転）配列配向のいずれかで達成され、それによりシ
ャペロンおよびまたは供与体鎖相補の要件を除く。例えば、ピリ線毛タンパク質
がＦｉｍＨなどのアドヘジンである場合には、Ｃ末端β鎖の追加は免疫原フォー
ルドを完成させ、かくしてシャペロンなどのいずれかの型の補助タンパク質の必
要を除去する。かくして例えばＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体のピリンのフォールド
に二次構造エレメントを供与することにより、シャペロンはピリンの安定性に寄
与するだけでなく、ペリプラズムにある他のピリンをシャペロン結合サブユニッ
トの溝への結合から防護する。Ｐピリ線毛、ＰａｐＧはアドヘジンであることに
注目しなければならない。The present invention is thus directed to pili proteins that include adhesins such as FimH, or non-adhesins such as FimG and FimA, wherein a chaperone such as FimC or a donor strand exchange mechanism during pili assembly. The deletion fragment normally supplied by pilin via was added to the amino acid sequence derived from the chaperone or pilin. According to the invention, this result is the G1β chain of FimC (SEQ ID NOS: 3 and 4), or FimG (SEQ ID NOS: 5 and 6) or Fim.
Either F (SEQ ID NOS: 7 and 8), or other similar sequences of the related pilins, either forward or reverse (ie, inverted) sequence orientation to the COOH terminus of pili proteins such as adhesins. , Thereby eliminating the requirement for chaperones and / or donor strand complementation. For example, where the pili protein is an adhesin such as FimH, the addition of the C-terminal β chain completes the immunogenic fold, thus eliminating the need for any type of accessory protein such as chaperones. Thus, for example, by donating a secondary structural element to the fold of the pilin of the PapD-PapK complex, the chaperone not only contributes to the stability of pilin but also allows other pilins in the periplasm to enter the groove of the chaperone-binding subunit. Protect from binding. It should be noted that P-pilus, PapG, is an adhesin.

【００６２】 トポロジー必要条件と制約のため、またタンパク質が遺伝子操作されまたβ鎖
が「供与」されることに依存し、供与体配列はピリ線毛タンパク質配列が「相補
」されることに関して前進または復帰（すなわち反転）アミノ酸配列配向で遺伝
子操作することができる。しかしこの供与体鎖が逆平行配向でピリ線毛鎖の回り
をフォールドし、ループを描いて出発点に戻らなければならないために、このよ
うな供与体相補構造は前進または復帰配向で供与体鎖で遺伝子操作できる。前進
または復帰配向でのどちらで遺伝子操作されるかは、鎖を準備するのに使用され
る配列の源に依存し、例えばＦｉｍＧのＮ末端配列がＦｉｍＨを相補するのにど
こで使用されるかなどのように、供与体鎖が対応するシャペロンのＧ１鎖からの
相手であるか、または隣接サブユニットのＮ末端鎖でモデリングされるかどうか
に依存する。もし前進配向で遺伝子操作されるなら、供与体鎖のＮ末端残基はピ
リ線毛タンパク質（例えばＦｉｍＨ）のＣ末端残基に結合され、一方復帰配向で
は供与された鎖のＣ末端残基はアドヘジンのＣ末端残基に結合される。達成され
た構造的配置の型に依存して、適切な三次元構造を達成するのに必要な適切な配
座フォールディングのための十分な可撓性をもたらすために、ピリ線毛タンパク
質配列と供与体鎖配列の間に（多分４残基ほどの短いあるいは類似の長さと配座
の構造である）リンカー配列を挿入することも必要である（またこのようなこと
は本発明の実施例を実行するために行われた）。このような操作は望ましいアド
ヘジンの直接化学合成かあるいは供与鎖配列をコード化するコドンの順序が望ま
しい配向を持つポリヌクレオチドを使用するかのいずれかで容易に達成される。
このような供与された鎖の配列はもち論ＦｉｍＣまたはＰａｐＤのＧ１鎖、また
はＦｉｍＧなどのピリ線毛サブユニットのＮ末端延長鎖から誘導される。これが
言及されねばならないのは、シャペロンがアセンブルされるピリ線毛に組み込ま
れないために、このようなシャペロンが「ピリ線毛タンパク質」ではないためで
ある。Due to topological requirements and constraints, and depending on the fact that the protein is genetically engineered and the β chain is “donated,” the donor sequence may either be advanced or in terms of being “complemented” with the pili protein sequence. It can be engineered with a reverted (ie inverted) amino acid sequence orientation. However, since this donor strand must fold around the pili hair strand in the antiparallel orientation and draw a loop to return to the starting point, such a donor complementary structure is in the forward or reverse orientation. You can genetically manipulate with. Whether engineered in the forward or reverse orientation depends on the source of the sequences used to prepare the strand, eg where the N-terminal sequence of FimG is used to complement FimH. , Depending on whether the donor strand is a partner from the G1 chain of the corresponding chaperone or is modeled in the N-terminal strand of the adjacent subunit. If engineered in the forward orientation, the N-terminal residue of the donor chain is attached to the C-terminal residue of the pili protein (eg FimH), while in the reverse orientation the C-terminal residue of the donated chain is It is attached to the C-terminal residue of adhesin. Depending on the type of structural arrangement achieved, the pili protein sequences and donors provide sufficient flexibility for proper conformational folding necessary to achieve the proper three-dimensional structure. It is also necessary to insert a linker sequence (possibly as short as 4 residues or a structure of similar length and conformation) between the body chain sequences (and such is the practice of the invention). Was done to). Such manipulations are readily accomplished either by direct chemical synthesis of the desired adhesin or by using polynucleotides in which the order of the codons encoding the donor strand sequences has the desired orientation.
The sequence of such a donated chain is derived from the G1 chain of FimC or PapD, or the N-terminal extension of the pili subunit, such as FimG. This must be mentioned because such chaperones are not "pilus proteins" because they are not incorporated into the assembled pili.

【００６３】 タンパク質の追加により、あるいは同時発現タンパク質としてのいずれかでシ
ャペロンを提供する必要なしで完全に形成された機能的ピリンタンパク質を産生
する能力は、それが単一ポリペプチド鎖の大規模産生を可能にし、時間、コスト
およびその産生の複雑性を削減することで非常に利点がある。The ability to produce a fully formed functional pilin protein without the need to provide chaperones, either by the addition of proteins or as co-expressed proteins, makes it possible for large scale production of a single polypeptide chain. And is of great advantage in reducing time, cost and complexity of its production.

【００６４】 この目的を促進するために、すべて同じアミノ酸配列内にピリ線毛タンパク質
部分と供与体補体部分を含むＦｉｍＨなどのアドヘジンとＰａｐＫなどのピリン
を含むピリ線毛、とりわけタイプ１ピリ線毛およびＰピリ線毛ならびにその形成
されたサブユニットから誘導されるポリペプチドまたはタンパク質である修飾ピ
リ線毛ポリペプチドに本発明は指向される。かくして本発明内でのポリペプチド
に関連して、供与体補体部分とアドヘジンまたはピリン部分との間の差は単に便
宜的なものであり事実上単一ポリペプチドがここで考察されるが、このような供
与体補体断片は多分従来のペプチド結合以外の何らかの化学結合によりアドヘジ
ン部分に化学的に付着される。このような修飾タンパク質は供与体鎖相補に続き
ＦｉｍＨとＰａｐＫを含む。かくして供与体鎖相補ＦｉｍＨはｄｓｃＦｉｍＨで
表される（ここでｄｓｃは、供与体のｄ、鎖のｓ、相補のｃを意味する）。本発
明の代替実施例において、供与体鎖は必ずしも共有結合で付着される必要はなく
、アドヘジンまたはＦｉｍＨなどのピリンタンパク質の生の形状の全体形状であ
る複合体の一部として非共有結合で単に結合することができる。To facilitate this end, a pili containing an adhesin, such as FimH, and a pilin, such as PapK, all containing a pili protein part and a donor complement part in the same amino acid sequence, especially a type 1 pili. The present invention is directed to modified pili pili polypeptides, which are polypeptides or proteins derived from pili and P pili and their formed subunits. Thus, in the context of polypeptides within the invention, the difference between the donor complement portion and the adhesin or pilin portion is merely expedient and in effect a single polypeptide is discussed herein, Such donor complement fragments are probably chemically attached to the adhesin moiety by some chemical bond other than conventional peptide bonds. Such modified proteins include FimH and PapK following donor strand complementation. Thus, the donor strand complement FimH is represented by dscFimH (where dsc means donor d, strand s, complementary c). In an alternative embodiment of the invention, the donor chain does not necessarily have to be attached covalently, but only non-covalently as part of a complex that is the overall form of the raw form of a pilin protein such as adhesin or FimH. Can be combined.

【００６５】 シャペロン複合体とは無関係でワクチンとして利用できる純粋なピリンまたは
アドヘジンを産生する問題は、シャペロンなどの補助タンパク質の必要なしに純
粋な形態で容易に調製される一つの構造または複合体を形成するために、そのフ
ォールドがペプチドまたは非ペプチドで相補されるシャペロンアッシャー経路に
よりアセンブルされるいずれかの細菌構造から望ましいピリ線毛タンパク質（シ
ャペロンを含まない用語）を提供することでの本発明により解決される（この経
路の考察についてはハンおよびハルトグレン，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１
２４巻、２０１−２２０ページ（１９９８年）を参照のこと）。The problem of producing pure pilin or adhesin that can be used as a vaccine independent of the chaperone complex is that one structure or complex that is easily prepared in pure form without the need for auxiliary proteins such as chaperones By providing the desired pili protein (a term that does not include chaperones) from any bacterial structure whose fold is assembled by a chaperone-Asher pathway whose peptide or non-peptide complements to form. Solved (For a discussion of this pathway, see Han and Hartgren, J. Struct. Biol. 1).
24, pp. 201-220 (1998)).

【００６６】 ここでの開示に従って、本発明はピリ線毛タンパク質成分と供与体鎖補体より
なる免疫原複合体に関し、ここで前記ピリ線毛タンパク質成分は供与体鎖成分と
共有結合する場合とそうでない場合とがある。かくしてピリ線毛と供与体成分は
必ずしもそれに限定されないが、ファンデルワールス力、および一般エントロピ
ー力、ロンドン力などを含む静電相互作用、疎水性相互作用を含む非共有結合相
互作用により結合される。このようなピリ線毛タンパク質成分はアドヘジンの場
合もありそうでない場合もある。それがアドヘジンの場合は、とりわけ望ましい
アドヘジンはＦｉｍＨとＰａｐＧである。他のピリ線毛タンパク質はＦｉｍＨと
ＦｉｍＡ（いずれもタイプ１ピリ線毛からのもの）およびＰａｐＫ，ＰａｐＡ，
ＰａｐＦ，ＰａｐＥ，およびＰａｐＨ（すべてタイプＰピリ線毛からのもの）よ
り成るグループから選択されるものである。供与体鎖成分はピリ線毛の欠失鎖を
置換することのできるアミノ酸または他のポリマー鎖を含む。このような置換は
、ＰａｐＫとＦｉｍＨの欠失鎖を置換するここで開示されたＰａｐＤ，ＦｉｍＣ
およびＦｉｍＧからの鎖を利用するここで開示されたルールを頼ることで解決さ
れる。In accordance with the disclosure herein, the present invention relates to an immunogenic complex consisting of a pili protein component and a donor chain complement, wherein the pili protein component is covalently linked to the donor chain component. There are cases where it is not. Thus, the pili and donor component are bound by non-covalent interactions, including, but not necessarily limited to, van der Waals forces, electrostatic interactions including general entropy forces, London forces, and hydrophobic interactions. . Such pili protein components may or may not be adhesins. If it is an adhesin, the particularly preferred adhesins are FimH and PapG. Other pili proteins are FimH and FimA (both from type 1 pili) and PapK, PapA,
Is selected from the group consisting of PapF, PapE, and PapH (all from type P pili). The donor chain component comprises amino acid or other polymer chains that can replace the missing strand of pili. Such substitutions include PapD, FimC disclosed herein, which replace the deleted strands of PapK and FimH.
And relying on the rules disclosed herein utilizing chains from FimG.

【００６７】 本発明は更にその両方が同じタンパク質複合体の部分であるピリ線毛タンパク
質成分と供与体補体成分を含むポリペプチド、とりわけ免疫原ポリペプチドに関
する。供与体補体部分は細菌性ピリンまたはアドヘジン、それらの部分であり、
または細菌性ピリンまたはアドヘジンから誘導されるものである。このような新
規なポリペプチドは、（本発明の免疫原複合体で言及されたアドヘジンを含むす
べてのピリ線毛タンパク質を含む）細菌細胞からの正常ピリ線毛を作りあげるも
ののような生のピリ線毛タンパク質分子のアミノ酸配列から形成されるであろう
。このような細菌細胞はピリ線毛構造を持ついずれかの細菌細胞、望ましくは腸
内細菌科からのもの、もっとも望ましくは大腸菌である。The invention further relates to polypeptides, especially immunogenic polypeptides, which comprise a pili protein component and a donor complement component, both of which are part of the same protein complex. The donor complement moiety is a bacterial pilin or adhesin, those moieties,
Alternatively, it is derived from bacterial pilin or adhesin. Such novel polypeptides can be used to produce normal pili such as those that make up normal pili from bacterial cells (including all pili proteins including adhesins mentioned in the immunogenic complex of the invention). It will be formed from the amino acid sequence of the hair protein molecule. Such a bacterial cell is any bacterial cell having a pili structure, preferably from the family Enterobacteriaceae, most preferably E. coli.

【００６８】 このようなポリペプチド、とりわけ免疫原ポリペプチドを形成するに際して、
ピリ線毛タンパク質の欠失鎖は、供与体鎖が機能性供与体補体を提供する限り源
に拘らずいずれか適切な前記供与体鎖を用いて補償することができる（ここで「
機能性」という用語は供与体相補鎖がアドヘジン配列のＣ末端に付着される時に
、アドヘジンが存在する全シャペロンまたは他の別の配座指向分子の必要性なし
でその生の三次元配座をアドヘジンが引き受けることを可能にすることを意味す
る）。一般にいずれの配列もそれが溝に適合するようモデリングできる限りは使
用できる。In forming such polypeptides, particularly immunogenic polypeptides,
The missing strand of the pili protein can be compensated with any suitable donor chain, regardless of source, so long as the donor chain provides a functional donor complement (herein "
The term "functional" refers to its native three-dimensional conformation when the donor complement is attached to the C-terminus of the adhesin sequence without the need for the entire chaperone or other conformation-directing molecule in which the adhesin is present. It means that Adhesin can take over). Generally any sequence can be used as long as it can be modeled to fit in the groove.

【００６９】 例えばアドヘジン配列が本発明のポリペプチドのピリ線毛タンパク質部分を提
供する場合には、前記アドヘジンはもっとも望ましくは大腸菌などの細菌性細胞
で見出されるＦｉｍＨタンパク質である。かくしてＦｉｍＨのアミノ酸配列は一
つの菌株から他のものに考えられる少しの変化を起こし、そのためこのような配
列すべては本発明のポリペプチドにより考慮される。もっとも望ましくは、配列
識別番号１のＦｉｍＨ配列は、ピリ線毛タンパク質がアドヘジンである時に本発
明のポリペプチドのアドヘジン部分、セグメントまたは断片を形成する。For example, where the adhesin sequence provides the pili protein portion of a polypeptide of the invention, the adhesin is most preferably the FimH protein found in bacterial cells such as E. coli. Thus, the amino acid sequence of FimH undergoes some conceivable changes from one strain to another, so all such sequences are contemplated by the polypeptides of the invention. Most desirably, the FimH sequence of SEQ ID NO: 1 forms an adhesin portion, segment or fragment of a polypeptide of the invention when the pili protein is an adhesin.

【００７０】 ここで使用されるように、「部分」、「セグメント」および「断片」という用
語はその配列がより大きな配列のサブセットを形成するアミノ酸残基などのよう
な残基の連続配列を引用する。例えばもしポリペプチドがトリプシンまたはキモ
トリプシンなどの普通のエンドペプチターゼのいずれかで処置されたとすると、
このような処置から生じるオリゴペプチドは出発ポリペプチドの部分、セグメン
トまたは断片を表すものとなる。As used herein, the terms “portion”, “segment” and “fragment” refer to a contiguous sequence of residues, such as amino acid residues, whose sequences form a subset of a larger sequence. To do. For example, if the polypeptide was treated with either of the common endopeptidases such as trypsin or chymotrypsin,
The oligopeptide resulting from such treatment will represent a portion, segment or fragment of the starting polypeptide.

【００７１】 供与体補体部分がシャペロン、とりわけペリプラズム細菌性シャペロンから誘
導される場合には、前記シャペロンは望ましくはＦｉｍＣまたはＰａｐＤであり
、またシャペロンまたはピリンが腸内細菌科の細菌細胞とりわけ大腸菌から誘導
される場合はもっとも望ましく、また供与体補体がＦｉｍＣまたはＰａｐＤのＧ
１β鎖（特にＧ１配列の位置についてはそれぞれ図２と図６を参照）、とりわけ
前記Ｎ末端配列が少なくとも含む場合に、ＦｉｍＧなどのピリンからのアミノ末
端延長配列である場合にはもっとも望ましい。If the donor complement part is derived from a chaperone, especially a periplasmic bacterial chaperone, said chaperone is preferably FimC or PapD, and the chaperone or pilin is from a bacterial cell of the family Enterobacteriaceae, especially E. coli. Most desirable when induced, and the donor complement is G of FimC or PapD.
It is most desirable if it is an amino-terminal extension from a pilin such as FimG, especially when the 1β chain (see in particular FIG. 2 and FIG. 6 respectively for the position of the G1 sequence), at least the N-terminal sequence, comprises.

【００７２】 供与体補体、または供与体鎖、本発明のポリペプチドの部分、または本発明の
免疫原複合体はピリ線毛タンパク質の欠失鎖の適切な保証を提供するいずれかの
アミノ酸、または他のポリマー配列を含む。供与体補体として使用される適切な
鎖は本開示の教訓を使用して容易に決定される。かくして選択されたピリ線毛タ
ンパク質を相補する有用な供与体鎖を見付けるために、適切なシャペロンで選択
されたピリ線毛タンパク質をモデリングし、それにより適切な供与体鎖を形成す
るために使用される相補配列の位置と範囲を決定する必要がある。もち論関連す
る鎖のアミノ酸配列は既知でなければならない。The donor complement, or donor chain, part of the polypeptide of the invention, or the immunogenic complex of the invention, any amino acid, which provides adequate guarantee of the deleted strand of the pili protein, Or include other polymer sequences. The appropriate chain to use as the donor complement is readily determined using the lessons of this disclosure. Thus, in order to find a useful donor chain that complements the selected pili protein, it is used to model the selected pili protein with an appropriate chaperone and thereby form the appropriate donor chain. It is necessary to determine the position and range of the complementary sequence to be used. The amino acid sequence of the related chains must be known.

【００７３】 ピリ線毛タンパク質（ピリンとアドヘジンの両方）およびここで列挙されるシ
ャペロンのアミノ酸配列は図１，２，５，６で示される。対応する配列識別番号
は表１で示される。The amino acid sequences of pili proteins (both pilin and adhesin) and the chaperones listed here are shown in FIGS. The corresponding sequence identification numbers are shown in Table 1.

【００７４】[0074]

【表１】 [Table 1]

【００７５】 配列表でこれらのタンパク質に与えられた配列が種から種へまた一つの種の中
で菌株から菌株へと変化することができ、そのためここで与えられる配列が唯一
つの特定のポリペプチドを表すことは留意されねばならない。例えばＰａｐＧの
配列識別番号１９はヒト上皮細胞の蔗糖と特異的に結合するＰａｐＧＩＩの配列
でもある。後者の配列は更に（Ｎ末端端部で最初の２０残基を含む）分泌のため
のシグナル配列を示す。The sequences given to these proteins in the sequence listing can vary from species to species and from strain to strain within one species, so that the sequences given here are unique to only one particular polypeptide. It must be noted that For example, the sequence identification number 19 of PapG is also the sequence of PapGII which specifically binds to sucrose of human epithelial cells. The latter sequence further shows the signal sequence for secretion (including the first 20 residues at the N-terminal end).

【００７６】 本発明はいずれのタンパク質でも、また同じタンパク質でなくても、またいず
れの生体にも拘らず、生のものが望ましいが必ずしも必要ではなくタンパク質の
望ましい配座がここで開示される供与体鎖相補により達成される限り同じように
操作できる。かくして本発明のメカニズムは、生の配座などの一定の配座を達成
するもう一つのタンパク質で供与される鎖を必要とするタンパク質に、また本発
明を記載するここで使用される細菌タンパク質と共に使用することを必ずしも制
限されないタンパク質に指向する。かくしてここで記載されるメカニズムは一般
的なものである。The invention contemplates the preferred conformation of the protein disclosed herein, whether or not it is the same protein, whether in the same protein or in any living organism, but preferably in the raw form, but not necessarily. The same operation can be performed as long as it is achieved by body chain complementation. Thus, the mechanism of the invention is that proteins that require a chain donated by another protein to achieve a constant conformation, such as the raw conformation, and with the bacterial proteins used herein that describe the invention, Directed to proteins that are not necessarily limited to use. Thus, the mechanism described here is general.

【００７７】 本発明の選択された実施例において、適切に選択された供与体鎖は、アミノ酸
配列の部分として供与体鎖で前記ピリ線毛タンパク質を合成することにより、ま
たは相補構造（所謂「ｄｓｃピリ線毛タンパク質」）をコード化する遺伝子を発
現することにより、あるいは何か他の付着を形成することにより遺伝子操作され
、唯一の必要条件は、そのようなｄｓｃピリ線毛タンパク質がピリ線毛内でシャ
ペロンの存在により生体内で安定した構造を生じるようにピリ線毛タンパク質に
特徴的な生の三次元形状を持つことである。これらはここで提供される実施例に
記載された手続きに従ったモデル化により、また前記の関連タンパク質−シャペ
ロン複合体の記述に従って容易に決定される。In selected embodiments of the present invention, a suitably selected donor chain may be prepared by synthesizing the pili protein in the donor chain as part of an amino acid sequence or in a complementary structure (so-called “dsc”). Are engineered by expressing a gene encoding a pili protein, or by forming some other attachment, the only requirement is that such a dsc pili protein is a pili protein. It has a characteristic three-dimensional shape that is characteristic of pili proteins so that the presence of chaperones in it creates a stable structure in vivo. These are readily determined by modeling according to the procedures described in the examples provided herein, and according to the description of the related protein-chaperone complex above.

【００７８】 本発明の一つの実施例では、供与体鎖アミノ酸配列はＦｉｍＣの１５−ｍｅｒ
（または１５残基）Ｇ１断片を用いてＦｉｍＣＨまたは他のピリ線毛タンパク質
のＣ末端端部で遺伝子操作されこのＧ１セグメントは１乃至２０アミノ酸、望ま
しくは約３乃至１０残基の長さのリンカー配列を使用してＦｉｍＨのＣ末端に付
着され、内約４残基のものが特に望ましい実施例であった。もう一つの特異的実
施例において、ピリン、とりわけＦｉｍＧのアミノ末端延長部が供与体鎖として
使用される。このようなピリンのＮ末端配列が供与体鎖を形成するのに使用され
る時、このような配列は通常約６個またはそれ以上のアミノ酸、望ましくは約６
乃至２０個のアミノ酸、もっとも望ましくは約８乃至１８個のアミノ酸、とりわ
け８乃至１７個のアミノ酸の配列を含み、ここで前記配列はＰａｐｄ状シャペロ
ンによりアセンブリされるピリ線毛サブユニットのいずれかのＮ末端延長部に同
一またはそれから誘導される。このような配列は安定性、溶解性、または他の特
性を高めるために１個以上の位置でアミノ酸置換をすることができた。かくして
本発明はピリ線毛サブユニットのフォールドを完成しそれを安定化する配列、と
りわけ２個またはそれ以上の交互疎水性残基を持つものを包含する。要約すると
、供与体鎖補体を受け入れるいずれの配列も、ここで発明の鎖により相補するこ
とができ、また天然配座を達成するために受容体タンパク質に溝を完成するいず
れの鎖も利用することができる。このような配列の有用性は、生のＧ１配列のア
ミノ酸の１個またはそれ以上が同じ性格（疎水性、酸性、塩基性等）のアミノ酸
により置換された時にもっとも有利である。従って本発明内で有用な供与体鎖は
天然源から誘導されるべきではなくて、供与体鎖相補タンパク質が置かれる（そ
のためそれがワクチンとしての用途に必要ではなくてある他の実用性を持つ）用
途に拘らず、供与体鎖が望ましい全体としての配座を産生する受容体タンパク質
を相補する限り事実上また性格上完全に合成のものである。In one embodiment of the invention, the donor chain amino acid sequence is the FimC 15-mer.
(Or 15 residues) G1 fragment was used to engineer at the C-terminal end of FimCH or other pili proteins, where the G1 segment is a linker of 1 to 20 amino acids, preferably about 3 to 10 residues in length. A sequence was used to attach to the C-terminus of FimH, of which about 4 residues were particularly preferred examples. In another specific example, a pilin, especially the amino terminal extension of FimG, is used as the donor chain. When the N-terminal sequence of such a pilin is used to form the donor chain, such a sequence is usually about 6 or more amino acids, preferably about 6 amino acids.
To 20 amino acids, most preferably about 8 to 18 amino acids, especially 8 to 17 amino acids, wherein said sequence is any of the pili-like subunits assembled by Papd-like chaperones. Identical to or derived from the N-terminal extension. Such sequences could have amino acid substitutions at one or more positions to enhance stability, solubility, or other properties. The invention thus includes sequences which complete and stabilize the fold of the pili subunit, especially those with two or more alternating hydrophobic residues. In summary, any sequence that accepts donor chain complement can be complemented by the chain of the invention herein, and also utilizes any chain that completes the groove in the acceptor protein to achieve its native conformation. be able to. The utility of such sequences is most advantageous when one or more of the amino acids of the raw G1 sequence are replaced by amino acids of the same nature (hydrophobic, acidic, basic, etc.). Thus, donor chains useful within the present invention should not be derived from natural sources, but rather have donor chain complementary proteins (thus having some other utility where it is not necessary for use as a vaccine). ) Regardless of the application, it is virtually synthetic in nature as long as the donor chain complements the acceptor protein producing the desired overall conformation.

【００７９】 とりわけ望ましい実施例では、ＦｉｍＧの最初の１３個のアミノ酸（図１およ
び配列識別番号９を参照）は、従来のペプチド結合で連続された３個のセグメン
ト、すなわち ピリ線毛タンパク質ー−リンカー−供与体鎖 を持つ配列ＤＮＫＱ（Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ）より成るテトラペプチ
ドにより分離された２個の配列を持つＦｉｍＨ（配列識別番号１）のＣ末端端末
に連結される。このような配列（ｄｓｃＦｉｍＨを形成するためにピリ線毛タン
パク質としてＦｉｍＨを使用した配列）の産生は以下の実施例１で提供される。In a particularly preferred embodiment, the first 13 amino acids of FimG (see FIG. 1 and SEQ ID NO: 9) are three segments contiguous with conventional peptide bonds, namely the pili protein- It is ligated to the C-terminal end of FimH (SEQ ID NO: 1) with two sequences separated by a tetrapeptide consisting of the sequence DNKQ (Asp-Asn-Lys-Gln) with a linker-donor chain. The production of such a sequence (a sequence using FimH as a pili protein to form dscFimH) is provided in Example 1 below.

【００８０】 加えて本発明の新規なポリペプチドは、任意のリンカー配列（例えば相補され
る対応タンパク質に融合される適切なサブユニットのＮ末端延長部）と対応する
ｄｓｃタンパク質を形成するためにそこに付着された適切な供与体鎖を持つＦｉ
ｍＨ，ＦｉｍＡ，ＦｉｍＧ，ＦｉｍＦ，ＰａｐＧ，ＰａｐＫ，ＰａｐＡ，Ｐａｐ
ＥおよびＰａｐＦなどのピリ線毛タンパク質の配列と多分２０％以下の配列同一
性の配列相同を持つポリペプチドを含む。例えばＰａｐＥとＰａｐＫは２０％以
下の配列同一性を持つ。本発明の方法は、シャペロン−アッシャー経路によりア
センブルされたいずれのタンパク質（すなわちタイプ１ピリ線毛のアセンブリ）
でも成功する。加えて抗原能力を増加する手段として、または他の性質の範囲を
増加または減少するため選択されたアミノ酸の置換は、十分に当業者の技術の範
囲内で考慮される。ＦｉｍＣの存在が本発明のポリペプチドの調製を必要としな
いために、ＦｉｍＣとの相互作用およびまたはそれとの結合に必要とされるが、
その他の目的には役立たないＦｉｍＨ部分の選択されたセグメントは除去される
か他のアミノ酸、例えそれが異なった性格のものであってもそれと置換される。
従って抗原性を犠牲にすることなく溶解性、または他のいずれかの望ましい性質
を増加する適切な置換を行うことは当業者の技術の範囲内に十分あると見做され
る。In addition, the novel polypeptides of the present invention are designed to form a dsc protein corresponding to any linker sequence (eg, the N-terminal extension of the appropriate subunit fused to the complementary complementary protein). Fi with the appropriate donor chain attached to
mH, FimA, FimG, FimF, PapG, PapK, PapA, Pap
It includes polypeptides with sequence homologies with perhaps 20% or less sequence identity with the sequences of pili proteins such as E and PapF. For example, PapE and PapK have less than 20% sequence identity. The method of the present invention is directed to any protein assembled by the chaperone-Asher pathway (ie, type 1 pili assembly).
But succeed. In addition, substitutions of selected amino acids as a means of increasing antigen potency, or to increase or decrease a range of other properties, are well within the skill of those in the art. It is required for interaction with and / or binding to FimC, as the presence of FimC does not require the preparation of the polypeptides of the invention,
Selected segments of the FimH moiety that serve no other purpose are removed or replaced with another amino acid, even if it is of a different character.
Thus, it is considered well within the skill of the artisan to make appropriate substitutions that increase solubility, or any other desired property, without sacrificing antigenicity.

【００８１】 本発明に従って、配列を引用する時に「パーセント同一性」または「同一パー
セント」という用語は、配列が比較されるべき配列（「比較配列」）のアライン
メント後の請求されまたは記載された配列を記載されまたは請求された配列（「
基準配列」）と比較することを意味する。パーセント同一性は次いで下記の式に
従って決定される。In accordance with the present invention, the term “percent identity” or “percent identity” when referring to a sequence refers to the claimed or recited sequence after alignment of the sequences with which the sequences are to be compared (“comparative sequences”). Sequences described or claimed ("
Reference sequence ”). The percent identity is then determined according to the formula below.

【００８２】 パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］ ここでＣは基準配列と比較配列の間のアラインメントの全長にわたり基準配列
と比較配列の間の差の数であり、ここで（ｉ）比較配列内の一致する整列塩基ま
たはアミノ酸を持たない基準配列内の各塩基またはアミノ酸、および（ii）基準
配列内の各ギャップ部、ならびに(iii)比較配列内の整列塩基またはアミノ酸と
は異なる基準配列内の各整列塩基またはアミノ酸、これらが差を構成する。また
Ｒは塩基またはアミノ酸として数えられる基準配列内で生成されたいずれかのギ
ャップ部を持つ比較配列とのアラインメントの全長にわたる基準配列内の塩基ま
たはアミノ酸の数である。Percent identity = 100 [1- (C / R)] where C is the number of differences between the reference and comparison sequences over the entire length of the alignment between the reference and comparison sequences, where ( i) each base or amino acid in the reference sequence that does not have a matching alignment base or amino acid in the comparison sequence, and (ii) each gap in the reference sequence, and (iii) the alignment base or amino acid in the comparison sequence Each aligned base or amino acid in a different reference sequence, which makes up the difference. R is also the number of bases or amino acids in the reference sequence over the entire length of the alignment with the comparison sequence with any gaps generated in the reference sequence that are counted as bases or amino acids.

【００８３】 前に計算されたようにパーセント同一性が特定の最小パーセント同一性とほぼ
同じまたはそれ以上である比較配列と基準配列の間にアラインメントが存在する
ならば、ここで計算されたパーセント同一性が特定のパーセント同一性以下であ
るアラインメントが例え存在するとしても比較配列は基準配列に対し特定の最小
パーセント同一性を持つことになる。If there is an alignment between the reference sequence and the reference sequence whose percent identity is about the same as or greater than the particular minimum percent identity as calculated previously, then the percent identity calculated here. The comparative sequence will have a specified minimum percent identity to the reference sequence, even if there are alignments in which the sex is less than or equal to the specified percent identity.

【００８４】 本発明は単一に遺伝子操作されたタンパク質に限定されないだけでなく、更に
遺伝子操作されたタンパク質複合体を含む。このような複合体の限定されない例
はＦｉｍＨと供与体相補ＦｉｍＧの間に形成された複合体であろう。このような
複合体では、ＦｉｍＨ（すなわち供与体鎖が加えられることなくかくして露出尾
部溝を持つ生のＦｉｍＨ）はＦｉｍＧと複合体化されるであろう。後者のピリ線
毛タンパク質のアミノ末端延長部は次いでＦｉｍＨの露出尾部溝に挿入されるが
、ここでＦｉｍＣのＧ１鎖を持つ、あるいは（前進または復帰配列配向で供与体
鎖を持つ）ＦｉｍＧのＣ末端に付着されたＦｉｍＦのＮ末端延長部などの他の適
切な供与体補体鎖を持つここで開示される方法により調製されるであろう。これ
らのタンパク質はここでワクチンなどの免疫原組成物に有用なダイマー、とりわ
けヘテロダイマーなどの自己アセンブリングＦｉｍＨ複合体を形成するために組
合されるであろう。供与体相補ＦｉｍＡ（ｄｓｃＦｉｍＡ）は、ＦｉｍＧがアド
ヘジンと供与体相補ピリ線毛タンパク質の類似の複合体をなしかつ形成するのと
同じやり方でＦｉｍＨと組合せる。The present invention is not limited to single genetically engineered proteins, but also includes genetically engineered protein complexes. A non-limiting example of such a complex would be the complex formed between FimH and the donor complement FimG. In such a complex, FimH (ie the raw FimH thus having an exposed tail groove without addition of the donor chain) will be complexed with FimG. The amino terminal extension of the latter pili protein is then inserted into the exposed tail groove of FimH, where it has the G1 chain of FimC, or the C of FimG (with the donor chain in forward or reverse sequence orientation). It will be prepared by the methods disclosed herein with other suitable donor complement chains such as the N-terminal extension of FimF attached to the end. These proteins will now be combined to form dimers useful in immunogenic compositions such as vaccines, especially self-assembling FimH complexes such as heterodimers. Donor complement FimA (dscFimA) combines with FimH in the same manner that FimG forms and forms a similar complex of donor complement pili protein with adhesin.

【００８５】 本発明のとりわけ望ましい実施例は、ＦｉｍＣのＧ１β鎖またはＦｉｍＧのア
ミノ末端延長部などのようなピリ線毛タンパク質部分と供与体補体の配列などの
ＦｉｍＨのアミノ酸配列（またはその変異体）より成るアミノ酸配列を持つ一つ
のポリペプチドを含み、とりわけここでＦｉｍＣのＧ１配列（しかしＦｉｍＧの
アミノ末端延長部ではないもの）は逆転され、ＦｉｍＨのＣ末端にアミノ酸リン
カーを通じて付着される。このようなリンカーは、とりわけ供与体鎖をピリ線毛
タンパク質に向けループを描いて出発点に戻るようにし欠失鎖の位置に逆平行構
造を形成するようにループ構造を容易に形成できる配列の異なったアミノ酸より
成る。このような望ましい実施例は配列識別番号１０として提示され、ここでリ
ンカーはセリン／グリシンと交互し、供与体鎖はＦｉｍＣ（配列識別番号３）か
らのものである。ピリ線毛タンパク質のＦｉｍＨとＤＮＫＱリンカー配列により
分離されたＦｉｍＧのＮ末端延長部の類似の望ましい実施例が(下記の実施例で
準備された)配列識別番号１１で示される。ＰａｐＧ（配列識別番号１９）、Ｄ
ＮＫＱリンカー、およびＰａｐＦ（配列識別番号２０）からの供与体鎖が配列識
別番号２１で示される。A particularly preferred embodiment of the invention is the amino acid sequence of FimH (or a variant thereof), such as the sequence of pili protein moieties and donor complement, such as the G1β chain of FimC or the amino terminal extension of FimG. ), Wherein the G1 sequence of FimC (but not the amino terminal extension of FimG) is inverted and is attached to the C-terminus of FimH through an amino acid linker. Such a linker may, among other things, be of a sequence that facilitates loop formation to direct the donor strand to the pili protein and draw a loop back to the starting point, forming an antiparallel structure at the position of the deleted strand. It consists of different amino acids. Such a preferred embodiment is presented as SEQ ID NO: 10, where the linker alternates with serine / glycine and the donor chain is from FimC (SEQ ID NO: 3). A similar preferred embodiment of the N-terminal extension of FimG of the pili protein and the FimG separated by a DNKQ linker sequence is shown in SEQ ID NO: 11 (prepared in the examples below). PapG (SEQ ID NO: 19), D
The NKQ linker and the donor strand from PapF (SEQ ID NO: 20) are shown in SEQ ID NO: 21.

【００８６】 本発明に基づく供与体鎖配列は以下のものを含む。[0086]   Donor chain sequences according to the present invention include:

【００８７】 ＦｉｍＣのＧ１β鎖： 前進： NH₂-TLQLAIISRIKLYYR-COOH 配列識別番号３ 復帰： NH₂-RYYLKIRSIIALQLT-COOH 配列識別番号４ ＰａｐＦのＮ末端配列： NH₂-DVQINIRGNVYIP-COOH 配列識別番号２０ ＰａｐＤのＧ１β鎖： 前進： NH₂-DVTITVNGKVVAKP-COOH 配列識別番号５ 復帰： NH₂-PKAVVKGNVTITVD-COOH 配列識別番号６ ＦｉｍＧのＮ末端延長部： NH₂-DVTITVNGKVVAK-COOH 配列識別番号７ ＦｉｍＦのＮ末端延長部： NH₂-DSTITIRGYVRDN-COOH 配列識別番号８ ここで開示される精神と柔軟性を続けることで、ピリンおよびアドヘジンを安
定させるいずれの配列も供与体鎖または供与体補体として有利に利用することが
できる。以下の実施例２で示されるように、この特異的な実施例に基づき産生さ
れた供与体鎖相補ＦｉｍＨ（ｄｓｃＦｉｍＨ）はペリプラズム内のシャペロンの
不在下で発現され、生のＦｉｍＨの物性を提示した。G1β chain of FimC: forward: NH ₂ -TLQLAIISRIKLYYR-COOH sequence identification number 3 reversion: NH ₂ -RYYLKIRSIIALQLT-COOH sequence identification number 4 PapF N-terminal sequence: NH ₂ -DVQINIRGNVYIP-COOH sequence identification number 20 PapD G1β chain: forward: NH ₂ -DVTITVNGKVVAKP-COOH sequence identification number 5 reversion: NH ₂ -PKAVVKGNVTITVD-COOH sequence identification number 6 FimG N-terminal extension: NH ₂ -DVTITVNGKVVAK-COOH sequence identification number 7 FimF N-terminal extension : by continuing the spirit and flexibility disclosed herein NH ₂ -DSTITIRGYVRDN-COOH SEQ ID NO: 8, that any of the sequences to stabilize the pilin and adhesins advantageously utilized as the donor chain or donor complement it can. As shown in Example 2 below, the donor chain complement FimH (dscFimH) produced according to this specific example was expressed in the absence of chaperones within the periplasm, presenting the physical properties of raw FimH. .

【００８８】 ｄｓｃピリ線毛タンパク質構造の形成に補体として使用される特定の供与体鎖
に拘らずいくつかの構造的必要条件が明らかに留意されねばならず、またここで
の発明に基づく選択されたピリ線毛タンパク質の供与体相補のための適切な供与
体鎖の選択のための「ルール」を考慮することになろう。その一つとして、供与
体鎖はピリ線毛タンパク質構造に逆平行配置で結合し、そのためそれはＣ末端で
、例えば復帰配向でアドヘジンのＣ末端でシャペロンからの供与体鎖に付着する
ことが一般的に望ましく、そのためそれが折り曲がると、逆平行配向または供与
体鎖としてピリ線毛サブユニットのＮ末端配列の前進方向での配向を可能にし、
再び望ましい逆平行配向を促進する。加えて、これらいずれの供与体鎖が源に拘
らず適切な鎖相補活性を形成するために折り曲げることが可能とされねばならな
いために、本発明のポリペプチドの供与体鎖とピリ線毛タンパク質のＣ末端は通
常適切なループ、または他の適応したアミノ酸により分離されるであろう。この
ようなループ結合構造は２０までのアミノ酸、特に１乃至１０の残基、例えば約
４または５の残基の配列を含むことができ、例えばＦｉｍＣシャペロンのＦ１−
Ｇ１ループに起き、または特に有用な残基の配列はＰａｐＤのＢ１−Ｃ１ループ
であろう。本発明の新規なポリペプチドのアミノ酸鎖は自己アセンブリングのも
のであるため供与体鎖は配座柔軟性が全体として遺伝子操作アドヘジンに提供さ
れる限りは更なるガイダンスの必要なしで適切な相補鎖にたどり着くであろう。Regardless of the particular donor chain used as complement in the formation of the dsc pili protein structure, some structural requirements must be clearly noted and the inventive selection herein. One will consider the "rule" for the selection of the appropriate donor strand for donor complementation of the pili protein involved. For one, the donor chain is attached to the pili protein structure in an antiparallel arrangement, so that it is commonly attached to the donor chain from the chaperone at the C-terminus, eg in the C-terminus of the adhesin in the reorientation. Which, when folded, allows an antiparallel orientation or an orientation in the forward direction of the N-terminal sequence of the pili subunit as a donor chain,
Again it promotes the desired antiparallel orientation. In addition, because any of these donor chains, regardless of source, must be capable of folding to form the appropriate strand complementing activity, the donor chain of the polypeptide of the invention and the pili protein of The C-termini will usually be separated by appropriate loops, or other adapted amino acids. Such a loop binding structure may comprise a sequence of up to 20 amino acids, in particular 1 to 10 residues, eg about 4 or 5 residues, eg F1- of the FimC chaperone.
The sequence of residues occurring or particularly useful in the G1 loop would be the B1-C1 loop of PapD. Since the amino acid chains of the novel polypeptides of the invention are self-assembling, the donor chain should be a suitable complementary chain without the need for further guidance as long as conformational flexibility is provided to the genetically engineered adhesin as a whole. Will arrive.

【００８９】 本発明のポリペプチドは分離または精製形態にあることは考慮されねば成らな
い。It has to be taken into account that the polypeptides of the invention are in isolated or purified form.

【００９０】 ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に関連して本発明のコンテキストで
「分離された」という用語は、物質がそのもとの環境（例えばここで開示された
ポリペプチドを組換えて産生するのに使用される細胞）から移動されることを意
味する。このようなペプチドは組成物の一部になることができ、しかもなおこの
ようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないように分離される。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは望ましくは分離形態で提供され
、また望ましくは均質にするため精製される。The term “isolated” in the context of the present invention in the context of a polypeptide (or polynucleotide), means that a substance recombinantly produces its original environment (eg, a polypeptide disclosed herein). Cells that are used to). Such peptides can be part of the composition, yet isolated such that such vector or composition is not part of its natural environment.
The polypeptides and polynucleotides of the invention are preferably provided in isolated form and are preferably purified to homogeneity.

【００９１】 本発明に基づき開示された組換えおよびまたは免疫原ポリペプチドは更に「精
製された」形態にある。「精製された」という用語は完全な精製を必要としない
。寧ろそれは相対的な定義であり、それらの用語が当業者により理解されるよう
に高度に精製された調製物であるかまたは単に部分的に精製されている調製物を
含むことができる。例えばＣＤＮＡライブラリーから分離された個体クローンか
らのポリペプチドは従来の方法で電気泳動で均質に精製されている。出発原料ま
たは天然原料から少なくとも１桁の大きさ、望ましくは２または３桁の大きさ、
またより望ましくは４または５桁の大きさでの精製が特に考慮される。更に望ま
しくは重量で０．００１％の純度、または少なくとも０．０１％または０．１％
、またより望ましくは１％の純度を持つ請求されたポリペプチドが特に考慮され
る。The recombinant and / or immunogenic polypeptides disclosed in accordance with the present invention are in further “purified” form. The term "purified" does not require complete purification. Rather, it is a relative definition and can include highly purified preparations, as those terms are understood by those skilled in the art, or simply partially purified preparations. For example, polypeptides from individual clones isolated from a CDNA library have been electrophoretically purified to homogeneity by conventional methods. At least one order of magnitude, preferably two or three orders of magnitude from the starting or natural source,
More preferably, purification of 4 or 5 orders of magnitude is particularly considered. More preferably 0.001% by weight, or at least 0.01% or 0.1%
, And more desirably, the claimed polypeptide having a purity of 1% is specifically contemplated.

【００９２】 本発明のポリペプチドを組換えで産生する目的のために、「発現産物」という
用語は遺伝子、および遺伝子コード縮重から生じる等価物をコーディングする。
従って同じアミノ酸をコーディングするいずれかの核酸配列の天然翻訳産物であ
るポリペプチドまたはタンパク質を意味する。For the purpose of recombinantly producing the polypeptides of the present invention, the term “expression product” encodes a gene and equivalents resulting from the degeneracy of the genetic code.
Thus, a polypeptide or protein that is the natural translation product of any nucleic acid sequence that encodes the same amino acid.

【００９３】 かくして本発明のポリペプチドは更に組成物の形態で存在する。このような組
成物は薬用目的に使用される場合には、薬理許容希釈剤または賦形剤に懸濁され
た本発明のポリペプチドを一般に持つであろう。Thus, the polypeptides of the present invention further exist in the form of compositions. Such compositions, when used for medicinal purposes, will generally have the polypeptide of the invention suspended in a pharmaceutically acceptable diluent or excipient.

【００９４】 本発明は更に本発明のポリペプチドをコーディングできるポリヌクレオチド、
とりわけ配列識別番号１１のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチド
に指向される。このようなポリヌクレオチドは従って本発明のポリペプチドの少
なくとも１個のコーディング領域を含み、これはかくしてその発現産物となるで
あろう。The invention further provides a polynucleotide capable of encoding the polypeptide of the invention,
In particular it is directed to the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. Such a polynucleotide therefore comprises at least one coding region for a polypeptide of the invention, which will thus be its expression product.

【００９５】 ここで使用されるように、「コーディング領域」という用語は遺伝子の発現産
物をその天然ゲノム環境で天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわ
ち遺伝子の天然発現産物をコーディングする領域を引用する。コーディング領域
は正常、突然変異または変換された遺伝子からのものであり得るし、あるいはＤ
ＮＡ配列、またはＤＮＡ合成の技術の当業者に周知の方法を使用する実験室で完
全に合成された遺伝子からのものでもあり得る。As used herein, the term “coding region” refers to the part of a gene that naturally or normally encodes the expression product of a gene in its natural genomic environment, ie, the region that codes for the natural expression product of the gene. Quote. The coding region may be from a normal, mutated or transformed gene, or D
It may also be from the NA sequence, or a gene synthesized in the laboratory using methods well known to those skilled in the art of DNA synthesis.

【００９６】 本発明にしたがって、「ヌクレオチド配列」という用語はデオキシリボヌクレ
オチドのヘテロポリマーを引用する。一般に本発明により提供されるタンパク質
をコード化するＤＮＡセグメントは微生物またはウイルスオペロンから誘導され
る調節エレメントを含む組換え転写ユニットに発現され得る合成遺伝子を提供す
るために、ＣＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一
連のオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。According to the present invention, the term "nucleotide sequence" refers to a heteropolymer of deoxyribonucleotides. Generally, a DNA segment encoding a protein provided by the present invention is provided with a CDNA fragment and a short oligonucleotide linker to provide a synthetic gene that can be expressed in a recombinant transcription unit containing regulatory elements derived from a microbial or viral operon. Or from a series of oligonucleotides.

【００９７】 「発現産物」という用語は、遺伝子の天然翻訳産物および、遺伝子コード縮重
から生じる等価物をコーディングしまたかくして同じアミノ酸をコーディングす
るいずれかの核酸配列であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。The term “expression product” refers to a polypeptide or protein that is the natural translation product of a gene and any nucleic acid sequence that encodes the equivalent resulting from genetic code degeneracy and thus the same amino acid. .

【００９８】 「プライマー」という用語は、ＤＮＡの一つの鎖で対にされ、ＤＮＡポリメラ
ーゼがデオキシリボヌクレオチド鎖の合成を開始する遊離３′ＯＨ端部を提供す
る短い核酸配列を意味する。The term “primer” refers to a short nucleic acid sequence paired with one strand of DNA and providing a free 3′OH end at which a DNA polymerase initiates the synthesis of deoxyribonucleotide strands.

【００９９】 「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの
結合に伴なうＤＮＡの領域を意味する。The term “promoter” means a region of DNA that is associated with the binding of RNA polymerase to initiate transcription.

【０１００】 ここで使用されるように、ＤＮＡ配列への引用は一本鎖および二本鎖ＤＮＡの
両方を含む。かくして前後関係が他を指示することのない限り、特異的な配列は
このような配列の一本鎖ＤＮＡ、その補体を持つこのような配列の二重構造（二
本鎖ＤＮＡ）およびそのような配列の補体を引用する。As used herein, references to DNA sequences include both single-stranded and double-stranded DNA. Thus, unless the context dictates otherwise, specific sequences are single-stranded DNA of such sequences, double-stranded structures of such sequences with their complement (double-stranded DNA) and such The complement of various sequences is cited.

【０１０１】 本発明は更に本発明のポリペプチドに特異的な抗体、およびそれに応答して精
製される抗血清に指向する。このような抗体はポリクローナルまたはモノクロー
ナルであり、モノクローナルの場合には細胞から、とりわけハイブリドーマから
従来の標準方法で生成される。加えて本発明は更に細胞、および細胞系に関し、
それは形質移入、または形質転換された後にこのような抗体を産生するために遺
伝子操作され、そのためこれらのゲノムは生染色体内でまたはプラスミドもしく
は他のベクターの一部として、本発明のポリペプチドに特異的な抗体のための遺
伝子をコーディングするポリヌクレオチド、とりわけ前記遺伝子操作細胞がその
ような技術が周知である完全に形成された抗体を形成し分泌することのできる細
胞である場合に遺伝子操作された細胞および細胞系である。The present invention is further directed to antibodies specific for the polypeptides of the present invention, and antisera purified in response thereto. Such antibodies may be polyclonal or monoclonal and, if monoclonal, are produced from cells, especially hybridomas, by conventional standard methods. In addition, the present invention further relates to cells and cell lines,
It is genetically engineered to produce such antibodies after transfection or transformation, so that their genome is specific for the polypeptides of the invention either within the live chromosome or as part of a plasmid or other vector. A gene encoding a gene for a specific antibody, especially if the engineered cell is a cell capable of forming and secreting a fully formed antibody for which such techniques are well known. Cells and cell lines.

【０１０２】 本発明は更に本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドなどのベクターに関
し、前記ポリヌクレオチドはここで開示されたポリペプチドをコード化し、また
ここでこのようなベクターは細胞を形質転換するのに有用であり前記形質転換細
胞が本発明のポリペプチドを発現することを可能にする。The present invention further relates to vectors, such as plasmids, which comprise a polynucleotide of the invention, said polynucleotide encoding a polypeptide as disclosed herein, wherein such a vector is also capable of transforming cells. Useful to enable said transformed cell to express a polypeptide of the invention.

【０１０３】 本発明は更にそのようなベクターにより形質転換され、それにより続くその分
泌ありまたはなしの条件下で本発明のポリペプチドを発現する細胞に関する。The invention further relates to cells transformed with such a vector, thereby expressing the polypeptide of the invention under conditions with or without its subsequent secretion.

【０１０４】 本発明は更にここで開示されたポリペプチドを含むワクチンおよびワクチン組
成物に指向する。このようなワクチンは、本発明のポリペプチドの免疫原有効量
を含有する組成物を含むであろう。本発明の望ましい実施例はその配列が配列識
別番号１０と１１で示されるポリペプチドを含むワクチン組成物である。The present invention is further directed to vaccines and vaccine compositions that include the polypeptides disclosed herein. Such a vaccine would include a composition containing an immunogenically effective amount of a polypeptide of the invention. A preferred embodiment of the invention is a vaccine composition, the sequences of which comprise the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 10 and 11.

【０１０５】 本発明の細菌性ポリペプチドを含むワクチンのための免疫原組成物を利用する
（または診断用あるいは受動ワクチンとして使用するために抗体を産生する）こ
とが本発明の一つの目的である。一つの実施例において、タイプ１またはタイプ
Ｐピリ線毛を産生する細菌からの（天然または組換え産生され、同じく機能的相
同体からの）タンパク質または断片が考察される。よりもっと特異的には、大腸
菌が源として考察される。It is an object of the invention to utilize (or produce antibodies for diagnostic or passive vaccine use) immunogenic compositions for vaccines comprising the bacterial polypeptides of the invention. . In one example, proteins or fragments from bacteria (natural or recombinantly produced, also functional homologs) that produce type 1 or type P pili are considered. Even more specifically, E. coli is considered as the source.

【０１０６】 本発明のもう一つの見地において、このような免疫原組成物は***症を診
断する抗体を産生するために、またはこのような感染症の予防およびまたは処置
のためのワクチンを産生するため同じく免疫原組成物の免疫原に対する抗体の高
力価を維持するワクチンを追加免疫するために利用できる。In another aspect of the invention, such immunogenic compositions are provided with vaccines for producing antibodies that diagnose urinary tract infections, or for the prevention and / or treatment of such infections. Vaccines that also maintain a high titer of antibodies to the immunogen of the immunogenic composition for production can be used to boost.

【０１０７】 他の抗原が診断と細菌性***症の予防およびまたは処置のための抗体を産
生するために利用される一方、改良されまたはより有効なワクチンの必要性が存
在する。このようなワクチンはピリ線毛タンパク質により仲介される細菌性感染
症を予防するのに改良され高められた効果を持たねばならない。While other antigens have been utilized to produce antibodies for diagnosis and prevention and / or treatment of bacterial urinary tract infections, there is a need for improved or more effective vaccines. Such a vaccine must have improved and enhanced efficacy in preventing bacterial infections mediated by pili proteins.

【０１０８】 病原性細菌による感染症に対する予防を提供するために、また診断試薬として
の使用のために高力価特異的抗血清を刺激するアドヘジンおよびピリンより成る
改良された抗原組成物の必要性が存在する。Need for an improved antigen composition consisting of adhesin and pilin that stimulates high titer-specific antisera for providing protection against infection by pathogenic bacteria and for use as a diagnostic reagent. Exists.

【０１０９】 一つの見地において、本発明は精製ｄｓｃピリ線毛タンパク質ポリペプチドま
たはその免疫原複合体より成る免疫原組成物に指向する。特異的な実施例は生の
アドヘジン、望ましくはＦｉｍＨ、および例えばペリプラズムシャペロン、望ま
しくはＦｉｍＣ、もっとも望ましくはＦｉｍＣのＧ１鎖から誘導されるものなど
のような供与体補体、あるいはピリンのアミノ末端延長部、望ましくはＦｉｍＧ
、もっとも望ましくはＦｉｍＧの最初のＮ末端残基とりわけ最初の１３残基と、
ヒトまたは他の哺乳類種に適切に導入される時免疫応答を誘導できる免疫原形態
で複合体に維持されるｄｓｃピリ線毛タンパク質を含む。かくして望ましい実施
例は、もう一つのサブユニットのＮ末端延長部を含むものである。In one aspect, the invention is directed to an immunogenic composition that comprises a purified dsc pili protein polypeptide or immunogenic complex thereof. Specific examples include a live adhesin, preferably FimH, and a donor complement such as, for example, a periplasmic chaperone, preferably FimC, most preferably derived from the G1 chain of FimC, or the amino-terminal extension of pilin. Part, preferably FimG
, Most preferably the first N-terminal residue of FimG, especially the first 13 residues,
It includes dsc pili proteins that are maintained in the complex in an immunogenic form that is capable of inducing an immune response when properly introduced into humans or other mammalian species. Thus the preferred embodiment is to include the N-terminal extension of another subunit.

【０１１０】 本発明のｄｓｃポリペプチドと複合体は本来ワクチンとしての用途を意図して
いる。一般にワクチンは水溶液または懸濁液の形態で注射可能医薬品として調製
される。オイルベースのワクチンも吸入用として周知である。使用の前に溶解ま
たは懸濁される固体形態も調合される。活性成分と適合し薬剤用途に受け入れら
れる薬理担体が一般に加えられる。このような担体の例は必ずしもそれに限定さ
れないが、水、食塩水、デキストロース、またはグリセロールを含む。担体を組
合せたものも使用される。The dsc polypeptides and complexes of the invention were originally intended for use as vaccines. Vaccines are generally prepared as injectable pharmaceuticals in the form of aqueous solutions or suspensions. Oil-based vaccines are also well known for inhalation. Solid forms which are either dissolved or suspended before use are also prepared. Pharmaceutical carriers that are compatible with the active ingredient and acceptable for pharmaceutical use are generally added. Examples of such carriers include, but are not necessarily limited to, water, saline, dextrose, or glycerol. A combination of carriers is also used.

【０１１１】 ワクチン組成物は更にワクチンの有効性を改良するのに役立ち得るｐＨを安定
させ、またはアジュバント、湿潤剤あるいは乳化剤として機能する追加の物質を
取り込む。The vaccine composition further incorporates additional substances that stabilize the pH or function as adjuvants, wetting agents or emulsifiers that can help improve the efficacy of the vaccine.

【０１１２】 ワクチンは一般に非経口投与のために調合され、皮下または筋肉内に注射され
る。このようなワクチンは従来周知の方法を用いて座薬としてまたは経口投与用
として調合される。Vaccines are generally formulated for parenteral administration and injected subcutaneously or intramuscularly. Such vaccines may be formulated as suppositories or for oral administration using well known methods.

【０１１３】 病原性細菌に免疫性を付与するのに十分なワクチンの量は当業者に周知の方法
で決定される。この量はワクチン受容体の特性と必要とされる免疫の水準に依存
して決定されるであろう。典型的には投与されるワクチン量は熟練した医師の判
断に依存して決定されるであろう。ワクチンが皮下または筋肉内に注射により投
与される場合には、５０乃至５００μｇの範囲の精製タンパク質が与えられる。The amount of vaccine sufficient to confer immunity to pathogenic bacteria is determined by methods well known to those skilled in the art. This amount will be determined depending on the characteristics of the vaccine receptor and the level of immunity required. Typically, the amount of vaccine administered will be determined by the judgment of a skilled physician. When the vaccine is administered subcutaneously or intramuscularly by injection, it gives a range of 50 to 500 μg of purified protein.

【０１１４】 ワクチンとしての使用に加えて、本発明のポリペプチドおよびその免疫原断片
は受動免疫療法での使用、診断用試薬としての使用、およびアフィニティークロ
マトグラフィーなどの他のプロセスでの試薬としての使用で抗体の産生を刺激す
る免疫原として使用できる。In addition to use as vaccines, the polypeptides of the invention and immunogenic fragments thereof may be used in passive immunotherapy, as diagnostic reagents, and as reagents in other processes such as affinity chromatography. It can be used as an immunogen to stimulate the production of antibodies in use.

【０１１５】 本発明は更にいずれのシャペロンの存在の必要なく、またワクチンとして（ま
たは診断用あるいは治療目的のための抗体を産生する免疫原として）置換アドヘ
ジンの産生の間いずれのシャペロンも同時発現する必要なく本発明のタンパク質
およびポリペプチドの組換え産生または合成を提供する。The present invention further co-expresses any chaperone during the production of the substituted adhesin as a vaccine (or as an immunogen that produces antibodies for diagnostic or therapeutic purposes) without the need for the presence of any chaperone. It provides for the recombinant production or synthesis of the proteins and polypeptides of the invention without need.

【０１１６】 本発明の組換えポリペプチドは従来の技術で公知の遺伝子操作方法により（例
えば以下の実施例１）、あるいは更に自動化された周知の方法で直接合成により
容易に産生される。従って本発明のポリペプチドと複合体を調製する手続きの大
要はここでは再引用する必要はない。The recombinant polypeptides of the present invention are readily produced by genetic engineering methods known in the art (eg, Example 1 below), or by direct synthesis by well-known automated methods. Therefore, a summary of the procedure for preparing the polypeptides and complexes of the invention need not be re-cited here.

【０１１７】 完全アドヘジン−供与体補体ポリペプチドのための遺伝子操作または合成配列
を産生することに加えて、標準ペプチド結合を用いて従来のオリゴペプチド以外
のある種のリンカーにより、アドヘジン鎖のＣＯＯＨ端部またはその近辺に適切
な供与体鎖断片を付着することも可能である。このような化学的融合構造は本発
明により考察され、このような構造の性質は本発明の機能的ポリペプチドを産生
する化学者の提案の想像力によってのみ限定される。このような連結構造は更に
適切なループ構造を形成する標準ポリマーを含み、または前に記載の非共有結合
相互作用のいずれかにより存在するであろう。In addition to producing genetically engineered or synthetic sequences for the complete adhesin-donor complement polypeptide, some peptide linkers other than conventional oligopeptides were used with standard peptide linkages to produce COOH of the adhesin chain. It is also possible to attach suitable donor chain fragments at or near the ends. Such chemical fusion structures are considered by the present invention and the nature of such structures is limited only by the imagination of the chemist's suggestion to produce the functional polypeptides of the present invention. Such linking structures will further comprise standard polymers forming suitable loop structures, or will be present by any of the non-covalent interactions previously described.

【０１１８】 かくして本発明に従って、発現媒体にシャペロンを同時産生しまたは外因性シ
ャペロンもしくはその断片を加えたりする必要性なしで、アドヘジンまたはピリ
ン生構造と配座を完成することを可能にする能力は、ワクチンとしての使用のた
めの免疫原ポリペプチドの大規模合成を可能にする。Thus, according to the present invention, the ability to allow the adhesin or pilin biostructure and conformation to be completed without the need for co-producing chaperones or adding exogenous chaperones or fragments thereof to the expression vehicle is , Enables large-scale synthesis of immunogenic polypeptides for use as vaccines.

【０１１９】 本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、更に本発明のポリ
ペプチドの精製を可能にするマーカー配列に骨組みに融合されたコーディング配
列を持つ。このマーカー配列は例えば細菌宿主の場合には、マーカーに融合され
た成熟ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキ
サヒスチジン標識であり、あるいは例えば、マーカー配列は、哺乳類宿主、例え
ばＣＯＳ−７細胞が使用される時には血球凝集素（ＨＡ）標識である。ＨＡ標識
はインフルエンザ血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに一致する（
ウィルソン，Ｉ．他，細胞，３７巻：７６７ページ（１９８４年））。The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention further has a coding sequence fused to the framework with a marker sequence that allows purification of the polypeptide of the present invention. The marker sequence is, for example, in the case of a bacterial host, a hexahistidine tag provided by the pQE-9 vector that provides for purification of the mature polypeptide fused to the marker, or, for example, the marker sequence is a mammalian host, such as It is a hemagglutinin (HA) label when COS-7 cells are used. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (
Wilson, I. Cell, 37: 767 (1984)).

【０１２０】 宿主細胞が本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドより成るベ
クターで遺伝子操作（形質導入または形質転換もしくは形質移入）される時、ベ
クターは例えばクローニングベクターまたは発現ベクターである。ベクターは例
えばプラスミド、ウィルス粒子、ファージ等の形態にある。遺伝子操作宿主細胞
はプロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択しまたはこのようなポリペプチ
ドをコード化するポリヌクレオチドを増幅するために適するように修飾された従
来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨおよびその他の培養条件は発
現のために選択された宿主細胞と共にこれまで使用されたものであり、当業者に
とっては明らかなものであろう。When the host cell is genetically engineered (transduced or transformed or transfected) with a vector consisting of a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention, the vector is, for example, a cloning vector or an expression vector. Vectors are in the form of, for example, plasmids, virus particles, phages and the like. The genetically engineered host cells can be cultured in conventional nutrient media modified as appropriate to activate the promoter, select for transformed cells, or amplify polynucleotides encoding such polypeptides. Temperatures, pH and other culture conditions have been previously used with the host cells selected for expression and will be apparent to those of skill in the art.

【０１２１】 ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体
；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラ
スミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、痘疹、アデノウィル
ス、鶏痘ウィルス、および仮性狂犬病などのウィルスＤＮＡ、などのＤＮＡ配列
を含む。Vectors are chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences such as derivatives of SV40; bacterial plasmids; phage DNA; baculovirus; yeast plasmids; vectors derived from a combination of plasmid and phage DNA, smallpox, adenovirus, fowlpox. DNA sequences such as viruses, and viral DNA such as pseudorabies.

【０１２２】 適切なＤＮＡ配列は各種の手順によりベクターに挿入される。一般にＤＮＡ配
列は、従来周知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。
このような手順等は当業者の範囲内にあるものと見做される。The appropriate DNA sequence may be inserted into the vector by a variety of procedures. Generally, the DNA sequence is inserted into the appropriate restriction endonuclease site by procedures well known in the art.
Such procedures are considered within the purview of those skilled in the art.

【０１２３】 発現ベクター内のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成に指向するために適切な発現制御
配列（プロモーター）に操作可能に結合される。このようなプロモーターの代表
的な例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター，大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ
，ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび原核または真核細胞もしくはそのウィ
ルスで遺伝子の発現を制御するものとして知られる他のプロモーターがあげられ
る。発現ベクターは更に転写開始のリボソーム結合部位および転写終結因子を含
む。ベクターは更に発現を増幅するための適切な配列を含む。The DNA sequences in the expression vector are operably linked to appropriate expression control sequences (promoters) to direct mRNA synthesis. Representative examples of such promoters include the LTR or SV40 promoter, E. coli lac or trp.
, The phage lambda P _L promoter and other promoters known to control gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses. The expression vector further contains a ribosome binding site for transcription initiation and a transcription termination factor. The vector further contains appropriate sequences for amplifying expression.

【０１２４】 加えて発現ベクターは、望ましくは真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性など、もしくは大腸菌でのテトラサイクリンまた
はアンピシリン耐性などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型特性を提供す
るための１個またはそれ以上の選択マーカーを含む。In addition, the expression vector desirably provides phenotypic traits for selection of transformed host cells, such as dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, or tetracycline or ampicillin resistance in E. coli. One or more selectable markers for

【０１２５】 前に記載の適切なＤＮＡ配列、同じく適切なプロモーターまたは制御配列を含
むベクターは、タンパク質を発現できるようにするために適切な宿主細胞を形質
転換するのに採用される。Vectors containing the appropriate DNA sequences described above, as well as the appropriate promoter or control sequences, are employed to transform an appropriate host cell in order to be able to express the protein.

【０１２６】 適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセ
ス属、ネズミチフス菌など；真菌細胞、例えば酵母など，ショウジョウバエＳ２
およびスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ，ＣＯＳまたはボウズ黒色腫
（癌細胞）などの動物細胞；アデノウィルス；植物細胞その他などがそれである
。適切な宿主の選択はここでの教示から当業者の範囲内にあるものと見做される
。Representative examples of suitable hosts include bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; fungal cells such as yeast, Drosophila S2.
And insect cells such as Spodoptera Sf9; animal cells such as CHO, COS or Bowes melanoma (cancer cells); adenovirus; plant cells and the like. Selection of the appropriate host is considered to be within the skill of those in the art given the teachings herein.

【０１２７】 より詳細には、本発明は更に前に広範囲に記載されたように１個またはそれ以
上の配列を含む組換え構築物を含む。この構築物はプラスミドまたはウィルスベ
クターなどのベクターより成り、そのベクター内に本発明の配列が前進または復
帰配向で挿入されている。この実施例の望ましい見地において、構築物は更に例
えば配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む調節配列より成る。多数の
適切なプロモーターが当業者にとっては公知であり商業的に利用可能である。以
下のベクターが例として提供される。細菌系：ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ
９（キアージェン，インコーポレイテッド）；ｐｂｓ，ｐＤ１０，ファージスク
リプト，ｐｓｉＸ１７４，ピーブルースクリプトＳＫ，ｐｂｓｋｓ，ｐＮＨ８Ａ
，ｐＮＨ１６Ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａ（ストラータジーン）；ｐｔｒｃ
９９ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐｋｋ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（フ
ァルマシア）。真核系：ｐＷＬＮＥＯ，ｐＳＶ２ＣＡＴ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１
，ｐＳＧ（ストラータジーン）；ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（
ファルマシア）。しかし他のいずれのプラスミドまたはベクターでもそれらが宿
主内で複製可能で生存可能な限りにおいて使用することができる。More particularly, the present invention further includes recombinant constructs that include one or more sequences as extensively described above. This construct comprises a vector, such as a plasmid or viral vector, into which the sequences of the invention have been inserted in forward or reverse orientation. In a preferred aspect of this example, the construct further comprises regulatory sequences including, for example, a promoter operably linked to the sequences. Large numbers of suitable promoters are known to those of skill in the art, and are commercially available. The following vectors are provided as examples. Bacterial system: pQE70, pQE60, pQE
9 (Qiagen, Inc.); pbs, pD10, phage script, psiX174, pea blue script SK, pbsks, pNH8A.
, PNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc
99a, pKK223-3, pkk233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic system: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1
, PSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (
Pharmacia). However, any other plasmid or vector can be used as long as they are replicable and viable in the host.

【０１２８】 プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク
ターまたは他のベクターを選択可能マーカーと共に使用していずれかの望ましい
遺伝子から選択することができる。２個の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８と
ｐＣＭ７である。特に指定された細菌プロモーターは１ａｃＩ，１ａｃＺ，Ｔ３
，Ｔ７，ｇｐｔ，ラムダＰＲ，Ｐ_LおよびＴＲＰである。真核プロモーターはＣ
ＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０，レトロウィ
ルスからのＬＴＲ_S，およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む適切なベクター
とプロモーターの選択は従来の技術の水準内に十分にある。The promoter region can be selected from any desired gene using a CAT (chloramphenicol transferase) vector or other vector with a selectable marker. Two suitable vectors are pKK232-8 and pCM7. Specifically designated bacterial promoters are 1acI, 1acZ, T3
, T7, gpt, lambda PR, a P _L and TRP. Eukaryotic promoter is C
MV immediate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, selection of the appropriate vector and promoter comprising LTR _S, and mouse metallothionein--I from retroviruses are well within the level of prior art.

【０１２９】 前記の構築物を含む宿主細胞は高次の真核細胞、例えば哺乳類細胞，または低
次の真核細胞、例えば酵母細胞などであることができ、あるいは宿主細胞は原核
細胞、例えば細菌細胞であることができる。構築物の宿主細胞への導入はリン酸
カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン仲介形質移入または電気窄孔法など
により実施することができる（デービス，Ｌ．ジブナー，Ｍ，バッテイ，Ｉ．，
分子生物学の基本的方法（１９８６年））。The host cell comprising the above construct can be a higher order eukaryotic cell, such as a mammalian cell, or a lower order eukaryotic cell, such as a yeast cell, or the host cell is a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Can be The introduction of the construct into the host cell can be carried out by calcium phosphate transfection, DEAE dextran mediated transfection, electroporation, etc. (Davis, L. Zivner, M, Battey, I.,
Basic methods of molecular biology (1986)).

【０１３０】 宿主細胞での構築物は組換え配列によりコード化される遺伝子産物を産生する
ために従来のやり方で使用することができる。選択肢として、本発明のポリペプ
チドは従来のペプチド合成機で合成産生され得る。The constructs in host cells can be used in a conventional manner to produce the gene product encoded by the recombinant sequence. Alternatively, the polypeptides of the present invention may be synthetically produced by conventional peptide synthesizers.

【０１３１】 成熟タンパク質は適切なプロモーターの制御の下で哺乳類細胞酵母、細菌、ま
たは他の細胞で発現することができる。無細胞翻訳システムもまた本発明のＤＮ
Ａ構築物から誘導されるＲＮＡｓを用いてタンパク質を産生するのに利用できる
。原核宿主と真核宿主を用いて使用する適切なクローニングベクターおよび発現
ベクターはサムブルック、他，分子クローニング：研究室マニュアル、第２版、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）；ウー他、遺伝
子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク、ニューヨーク１９
９７年）、および組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学６２巻所収（トゥア
ン，編、フマーサ・プレス、トトワ、ニュージャージー、１９９７年）に記載さ
れており、この開示はここで引用例として組み込まれている。Mature proteins can be expressed in mammalian cell yeast, bacteria, or other cells under the control of appropriate promoters. The cell-free translation system is also the DN of the present invention.
It can be used to produce proteins with RNAs derived from the A construct. Suitable cloning and expression vectors for use with prokaryotic and eukaryotic hosts are Sambrook, et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor, New York (1989); Wu et al., Methods of Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY 19).
1997), and recombinant gene expression protocols, Molecular Biology, Volume 62, (Touan, Ed., Humasa Press, Totowa, NJ, 1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference. There is.

【０１３２】 高次の真核細胞による本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写はエ
ンハンサー配列のベクターへの挿入により増大する。エンハンサーは通常約１０
乃至約３００塩基対でプロモーターの転写を増大するためにプロモーターに作用
するＤＮＡのシス作用領域である。その例は複製起点１００乃至２７０塩基対の
後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウ
ィルスエンハンサーを含む。Transcription of the DNA encoding the polypeptides of the present invention by higher order eukaryotic cells is increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancer is usually about 10
Is a cis-acting region of DNA that acts on the promoter to increase transcription of the promoter by about 300 base pairs. Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin 100 to 270 base pairs, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and the adenovirus enhancer.

【０１３３】 一般に組換え発現ベクターは、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする
選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子とビール酵母菌ＴＲＰ１
遺伝子と、下流構造配列の転写に向う高度に発現された遺伝子から誘導されるプ
ロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは他のものの中でもオペロ
ンコード化解糖酵素、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因
子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質から誘導することができ
る。異種構造配列は適切なフェーズで翻訳開始および終結配列で組立てられる。
選択肢として、異種配列は望ましい特性、例えば発現組換え産物の安定化と単純
化された精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコード化す
ることができる。Recombinant expression vectors generally include an origin of replication and a selectable marker that allows for transformation of the host cell, such as the E. coli ampicillin resistance gene and brewery yeast TRP1.
It will include a gene and a promoter derived from a highly expressed gene that directs transcription of a downstream structural sequence. Such promoters can be derived from operon-encoded glycolytic enzymes such as 3-phosphoglycerate kinase (PGK), alpha factor, acid phosphatase, or heat shock proteins, among others. Heterologous structural sequences are assembled in appropriate phases with translation initiation and termination sequences.
Alternatively, the heterologous sequence can encode a fusion protein that includes an N-terminal identification peptide that confers desirable properties, such as stabilization of the expressed recombinant product and simplified purification.

【０１３４】 細菌用としての有用な発現ベクターは望ましいタンパク質をコード化する構造
ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始および終結シグナルと共に機能プロモーターを持つ
有効な読取りフェーズに挿入することにより構築される。ベクターはベクターの
維持を確実にし、また望ましければ宿主内で増幅を提供するために１個またはそ
れ以上の表現型選択マーカーと複製起点より成るであろう。形質転換のために適
切な原核宿主は大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびシュードモナス属、スト
レプトミセス属および連鎖球菌属内の様々な種を含み、また選択の問題として他
のものも利用される。Useful expression vectors for bacteria are constructed by inserting a structural DNA sequence encoding the desired protein into an efficient reading phase with a functional promoter along with appropriate translation initiation and termination signals. The vector will consist of one or more phenotypic selectable markers and an origin of replication to ensure maintenance of the vector and, if desired, to provide amplification in the host. Suitable prokaryotic hosts for transformation include E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and various species within the genera Pseudomonas, Streptomyces and Streptococcus, and others are available as a matter of choice.

【０１３５】 代表的でかつ限定されない例として、細菌用途に有用な発現ベクターは選択マ
ーカーと、また周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７
）の遺伝要素を含む商業的に利用可能なプラスミドから誘導される細菌複製起点
より成ることができる。このような商業的ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３
（スウェーデン，ウプサラ，ファルマシア・ファイン・ケミカルズ）およびｐＧ
ＥＭ１（アメリカ合衆国、ウィスコンシン、マジソン、プロメガ・バイオテック
）を含む。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」セクションは適切なプロモー
ターと発現される構造配列に組合される。As a representative and non-limiting example, expression vectors useful in bacterial applications include a selectable marker and also the well known cloning vector pBR322 (ATCC37017).
) Of a bacterial origin of replication derived from a commercially available plasmid containing the genetic element of Such commercial vectors are eg pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pG
Includes EM1 (Promega Biotech, Madison, Wisconsin, USA). These pBR322 "backbone" sections are combined with the appropriate promoter and structural sequences to be expressed.

【０１３６】 適切な宿主菌株の形質転換と適切な細胞密度への宿主菌株の成長に続き、選択
プロモーターは適切な手段（例えば温度移行または化学誘導など）により誘導さ
れ、細胞は追加の期間培養される。Following transformation of the appropriate host strain and growth of the host strain to the appropriate cell density, the selective promoter is induced by appropriate means (eg temperature transfer or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period of time. It

【０１３７】 細胞は典型的には遠心分離で収穫され、物理的または化学的手段で分離され、
生成粗抽出物は更なる精製のために保持される。The cells are typically harvested by centrifugation and separated by physical or chemical means,
The resulting crude extract is retained for further purification.

【０１３８】 タンパク質の発現に採用される微生物細胞は凍結融解循環、超音波処理、フレ
ンチプレス、機械的分離、または細胞溶解剤の使用を含むいずれかの便利な方法
で分離することができ、これらの方法は従来の技術に習熟した人に周知のもので
ある。Microbial cells employed for expression of proteins can be isolated by any convenient method, including freeze-thaw cycling, sonication, French press, mechanical separation, or use of cell lysing agents. This method is well known to those skilled in the art.

【０１３９】 各種の哺乳類細胞培養システムも組換えタンパク質を発現するために利用する
ことができる。哺乳類発現システムの例は、グラズマン、細胞、２３巻；１７５
ページ（１９８１年）に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系、および
適合性ベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ヒ
ーラ細胞系、およびＢＨＫ細胞系を含む。哺乳類発現ベクターは複製起点、適切
なプロモーターとエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナーまたはアクセプター部位、転写終結配列、
および５′フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライス、およ
びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列は、必要とされる非転写遺伝要
素を提供するために使用できる。A variety of mammalian cell culture systems can also be utilized to express recombinant protein. Examples of mammalian expression systems are Glasman, Cell, 23: 175
Included are the COS-7 line of monkey kidney fibroblasts described in page (1981), and other cell lines capable of expressing compatible vectors, such as C127, 3T3, CHO, HeLa cell line, and BHK cell line. Mammalian expression vectors include origins of replication, appropriate promoters and enhancers, and any necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donor or acceptor sites, transcription termination sequences,
And 5'flanking non-transcribed sequences. DNA sequences derived from the SV40 splice and polyadenylation sites can be used to provide the required nontranscribed genetic elements.

【０１４０】 ポリペプチドは周知のタンパク質回収および精製方法により組換え細胞培養物
から回収およびまたは精製することができる。このような方法は硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む。発現ポリペプチドの成熟タン
パク質の立体配置を完成するために、必要とあればタンパク質の構造復元（リフ
ォールディング）段階を使用できる。この点に関し、シャペロンがこのような構
造復元手続きに使用することができる。最後に高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を最終精製段階で使用することができる。Polypeptides can be recovered and / or purified from recombinant cell culture by well-known protein recovery and purification methods. Such methods include ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. Protein structural refolding steps can be used, if necessary, to complete the configuration of the mature protein of the expressed polypeptide. In this regard, chaperones can be used for such structural reconstruction procedures. Finally, high performance liquid chromatography (H
PLC) can be used in the final purification step.

【０１４１】 本発明で免疫原として有用なポリペプチドは天然産物、または化学合成手続き
の産物であり、あるいは原核または真核宿主の組換え技術（例えば細菌、酵母、
高次植物、昆虫、および哺乳類細胞の培養）で産生される。組換え産生手続きで
採用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化され、または
グリコシル化されない。とりわけ望ましい免疫原はＦｉｍＨベータ鎖ポリペプチ
ドまたはそのマンノース結合断片であり、何故ならＦｉｍＨは多くの最近種の中
でも高度に保存されるからである。従ってＦｉｍＨに対抗する抗体（またはその
マンノース結合断片）は（大腸菌に加えて）他の最近種のＦｉｍＨに当然結合し
、また大腸菌ＦｉｍＨ（またはＦｉｍＨマンノース結合断片）に対抗するワクチ
ンは大腸菌感染症（例えば他の腸内細菌科の感染症）に加えて他の細菌感染症に
対して予防するものとなる。Polypeptides useful as immunogens in the present invention are natural products, or the products of chemical synthetic procedures, or recombinant techniques of prokaryotic or eukaryotic hosts (eg bacteria, yeast,
Cultures of higher plants, insects, and mammalian cells). Depending on the host employed in a recombinant production procedure, the polypeptides of the invention will be glycosylated or non-glycosylated. A particularly desirable immunogen is the FimH beta chain polypeptide or mannose-binding fragment thereof, because FimH is highly conserved among many modern species. Therefore, antibodies against FimH (or mannose-binding fragments thereof) naturally bind to FimH of other recent species (in addition to E. coli), and vaccines against E. coli FimH (or FimH mannose-binding fragments) have E. For example, in addition to other infectious diseases of Enterobacteriaceae), it also protects against other bacterial infections.

【０１４２】 ポリペプチド、その断片または他の誘導体、あるいは類似体またはそれらを発
現する細胞は、更にそれらへの抗体を産生するための免疫原として使用できる。
これらの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることが
できる。本発明は更にキメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、同じくＦａｂ断片ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含む。従来の技術で公知の各種の手続きは
このような抗体と断片の産生に使用される。The polypeptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs or cells expressing them can further be used as immunogens to produce antibodies thereto.
These antibodies can be, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. The invention further includes chimeric, single chain, and humanized antibodies, as well as Fab fragments or products of Fab expression libraries. Various procedures known in the art are used to produce such antibodies and fragments.

【０１４３】 本発明の配列に一致するポリペプチドに対して生成された抗体はポリペプチド
を動物に直接注射して、またはポリペプチドを動物、望ましくは非ヒトに投与す
ることで得られる。このようにして得られた抗体は次いでポリペプチド自身に結
合するであろう。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコード化する配列
でさえも、全生ポリペプチドを結合する抗体を生成するために使用できる。その
例はハイブリドーマ法（ケーラ、およびミルシュタイン，１９７５年、ネイチャ
ー４５６巻：４９５−４９７ページ）トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法（コズボー他、１９８３年、今日の免疫学、４巻、７２ページ）、および、ヒ
トモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ法（コール他、１
９８５年、モノクローナル抗体と癌治療、アラン・Ｒ・リス，インコーポレイテ
ッド、７７−９６ページに所収）などである。Antibodies raised against the polypeptides corresponding to the sequences of the invention may be obtained by directly injecting the polypeptide into an animal or by administering the polypeptide to an animal, preferably a non-human. The antibody so obtained will then bind the polypeptides itself. In this way, even sequences encoding only fragments of the polypeptide can be used to generate antibodies that bind the whole live polypeptide. Examples are the hybridoma method (Kera and Milstein, 1975, Nature 456: 495-497) Trioma method, human B cell hybridoma method (Kozbo et al., 1983, Today's Immunology, Vol. 4, p. 72). , And the EBV hybridoma method for producing human monoclonal antibodies (Cole et al., 1
1985, Monoclonal antibody and cancer treatment, Alan R. Lith, Inc., pages 77-96).

【０１４４】 一本鎖抗体の産生を記載した技術（合衆国特許番号４，９４６，７７８号）は
本発明の免疫原ポリペプチド産物への一本鎖抗体を産生するために適応できる。
更に遺伝子導入マウスは本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を
発現するために使用される。加えて細胞は本発明のポリペプチドに相補する可変
領域を含む抗体鎖に一致する遺伝子配列で形質転換することができ、それにより
ここで開示されたポリペプチドに対する遺伝子操作抗体を生成する。Techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) can be adapted to produce single chain antibodies to the immunogenic polypeptide products of this invention.
In addition, transgenic mice are used to express humanized antibodies to the immunogenic polypeptide products of this invention. In addition, cells can be transformed with genetic sequences that correspond to the antibody chains that contain variable regions that are complementary to the polypeptides of the invention, thereby producing engineered antibodies to the polypeptides disclosed herein.

【０１４５】 本発明の手続きを実行するに際して、特定の緩衝液、媒体、試薬、細胞、培養
条件およびその他の引用は限定するものではなくて、この議論が提示される特定
のコンテキストに当業者の一人が関心と価値があると認識するすべての関連材料
を含むように読み取られるべきであることをもち論理解せねばならない。例えば
、１個の緩衝液系または培養培地をもう一つのものと取り替えてそれでも同一で
はなくても類似の結果を達成することはしばしば可能である。当業者は適切でな
い実験をすることなく、ここで開示される方法と手順を用いて彼らの目的に最適
に役立つようにこのような取り替えを行うことができるようにこのようなシステ
ムと方法についての十分な知識を持っているであろう。In carrying out the procedures of the present invention, the particular buffers, media, reagents, cells, culture conditions and other citations are not limiting and are known to those skilled in the art in the particular context in which this discussion is presented. It has to be understood that it should be read to include all the relevant material that one recognizes as being of interest and value. For example, it is often possible to replace one buffer system or culture medium with another to still achieve similar, if not identical, results. Those of ordinary skill in the art will be able, without undue experimentation, to use such methods and procedures disclosed herein to make such replacements in a manner that best serves their purpose, and for such systems and methods. You will have enough knowledge.

【０１４６】 本発明は更に下記の限定されない実施例により説明されるであろう。これらの
実施例の開示を適用するに際して、本発明の他の異なった実施例がもち論のこと
当業者に対し前記のことを示唆するであろうことは十分明白に心に留めておかな
ければならない。The invention will be further illustrated by the following non-limiting examples. In applying the disclosure of these embodiments, it should be fully and clearly kept in mind that other different embodiments of the invention will suggest the foregoing to those skilled in the art. I won't.

【０１４７】[0147]

【発明の実施の形態】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

実施例１ 供与体鎖を使用するシス型ＦｉｍＨのフォールディング ピリ線毛サブユニットタンパク質は、別に正しい立体配座を提供するペリプラ
ズムシャペロンの不在下ではＣ末端Ｇβ鎖の欠失の故で個別にフォールドできな
い（または不十分にフォールドする）ために、欠失部位がシス位置で提供される
場合には正しくフォールドできることが実験的に示された。ここで欠失第７β鎖
はＦｉｍＨの３′端部に融合された。ここで、以下で供与体鎖として引用される
ＦｉｍＧの最初の１３アミノ酸をコード化するＤＮＡ配列（図１参照）はＦｉｍ
Ｈコーディング配列の３′端部にそれを直接融合することでＦｉｍＨのシスに提
供され、供与体鎖相補ＦｉｍＨタンパク質（ｄｓｃＦｉｍＨと呼ばれるもの）を
コーディングするＤＮＡ配列を生成した。加えて、Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｎより成るＰａｐＤのヘアピンループ領域が供与体鎖の上流に挿入され発現タ
ンパク質にヒンジ部を形成し、これにより供与体鎖を元にフォールドし（図９で
示される配置と共に）ＦｉｍＨに逆平行配置を形成させた。Example 1 Folding of cis FimH using a donor chain Pili pili subunit proteins cannot fold individually in the absence of the periplasmic chaperone, which otherwise provides the correct conformation due to the deletion of the C-terminal Gβ chain. It has been experimentally shown that due to (or insufficiently folding), the deletion site can fold correctly if provided in the cis position. Here, the deleted seventh β chain was fused to the 3'end of FimH. Here, the DNA sequence encoding the first 13 amino acids of FimG, referred to below as the donor chain (see FIG. 1), is FimG.
Fusion of it directly to the 3'end of the H coding sequence generated a DNA sequence which provided for cis in FimH and which encodes a donor chain complementary FimH protein (called dscFimH). In addition, Asp-Asn-Lys-G
A hairpin loop region of PapD consisting of In is inserted upstream of the donor chain to form a hinge region in the expressed protein, thereby folding based on the donor chain (with the arrangement shown in FIG. 9) and antiparallel to FimH. Was formed.

【０１４８】 ｄｓｃＦｉｍＨを構築するために、下記の２個のオリゴヌクレオチドが一緒に
アニーリングされｐＵＣ１８−ＦｉｍＨのＣ１９１およびＢａｍＨ１部位に連結
され、ｐＵＣ１８−ｄｓｃＦｉｍＨを生成し（ここでＤＮＫＱがリンカーとして
用いられ、これはアミノ酸の標準１文字コードを使用する前に記載のループまた
はヒンジ部に使用される４個のアミノ酸であり）、ここで上部（コーディング鎖
）は、 5′−CGATTATTGGCGTGACTTTTGTTTATCAAGATAACAAACAGGATGTCA CCATCACGGTGAACGGTAAGGTCGTCGCCAAATAAG-3′ 配列識別番号２２ であり、底部鎖は、 5′−GATCCTTATTTGGCGACGACCTTACCGTTCACCGTGATGGTGACCATC CTGTTTGTTATCTTGATAAACAAAAGTCACGCCAATAAT-3′ 配列識別番号２３ である。To construct dscFimH, the following two oligonucleotides were annealed together and ligated to the C191 and BamH1 sites of pUC18-FimH to generate pUC18-dscFimH (where DNKQ was used as a linker, This is the 4 amino acids used in the loops or hinges described above using the standard one letter code for amino acids), where the top (coding strand) is 5'-CGATTATTGGCGTGACTTTTGTTTATCAAGATAACAAACAGGATGTCA CCATCACGGTGAACGGTAAGGTCGTCGCCAAATAAG-3 'sequence identifier. The bottom strand is 5'-GATCCTTATTTGGCGACGACCTTACCGTTCACCGTGATGGTGACCATC CTGTTTGTTATCTTGATAAACAAAAGTCACGCCAATAAT-3 'SEQ ID NO: 23.

【０１４９】 ここでｐＵＣ１８−ｄｓｃＦｉｍＨは配列化され、次いでｐＴｒｃ９９ＡのＥ
ｃｏＲ１およびＢａｍＨ１部位にサブクローニングされ（エーマン他、遺伝子、
６９巻、３０１ページ（１９８８年））ｐＴｒｃ−ｄｓｃＦｉｍＨを生成した。
ＦｉｍＨは次いでＥｃｏＲ１とＢａｍＨ１部位を使用してｐＵＣ１８−ＦｉｍＨ
からｐＴｒｃ９９Ａにサブクローニングされ、ｐＴｒｃ−ＦｉｍＨを生成した。Here pUC18-dscFimH is sequenced and then the E of pTrc99A.
subcloned into the coR1 and BamH1 sites (Ehmann et al., Gene,
69, page 301 (1988)) pTrc-dscFimH was generated.
FimH then used pUC18-FimH using the EcoR1 and BamH1 sites.
Was subcloned into pTrc99A to generate pTrc-FimH.

【０１５０】 ＦｉｍＨ、ＦｉｍＨ＋ＦｉｍＣ、およびｄｓｃＦｉｍＨは個別に発現された。
ＦｉｍＨ（ｐＴｒｃ−ＦｉｍＨ）、ｄｓｃＦｉｍＨ（ｐＴｒｃ−ｄｓｃＦｉｍＨ
）、およびＦｉｍＣ（ｐＪＰ４）はＣ６００で発現された（ジョーンズ他、アメ
リカ合衆国全米科学アカデミー紀要、９０巻、８３９７ページ（１９９３年）参
照）。一般の培養物はルリアブロスに１：１００で希釈され１時間で０．６続い
て０．５ｍＭ ＩＰＴＧのＯＤ₆₀₀で成長した。ペリプラズムは周知の手順で準
備された（スローニム他、ＥＭＢＤ Ｊ．１１巻、４７４７ページ（１９９２年
）参照）。FimH, FimH + FimC, and dscFimH were individually expressed.
FimH (pTrc-FimH), dscFimH (pTrc-dscFimH)
), And FimC (pJP4) were expressed in C600 (see Jones et al., Bulletin of the National Academy of Sciences, 90, 8397 (1993)). General cultures were diluted 1: 100 in Luria broth and grown for 1 hour at 0.6 followed by an OD ₆₀₀ of 0.5 mM IPTG. The periplasm was prepared by well-known procedures (see Slonim et al., EMBD J. 11: 4747 (1992)).

【０１５１】 ペリプラズム抽出物でのＦｉｍＣおよびＦｉｍＨまたはｄｓｃＦｉｍＨの存在
は抗ＦｉｍＣＨ抗体を用いるイムノブロッティング（抗原抗体反応）によりモニ
ターされた。加えてマンノース−セファロースクロマトグラフィー（ジョーンズ
他、１９９３年、前掲）がその受容体に結合するＦｉｍＨまたはｄｓｃＦｉｍＨ
の能力を測定するために使用された。ＦｉｍＨは単独で発現されたときには分解
したが、シャペロンとの同時発現で安定した。ＦｉｍＨとは対照的に、ｄｓｃＦ
ｉｍＨはＦｉｍＣの不在下でもペリプラズムで安定していた。ＦｉｍＨはそれが
ＦｉｍＣと同時発現されたときにマンノース−セファロースビードと結合しかく
してＦｉｍＣＨ複合体として溶離した。ＦｉｍＨはＦｉｍＣの不在下では分解す
るために、マンノース−セファロースビードからは全長ＦｉｍＨは溶離しなかっ
た。これとは対照的に、ｄｓｃＦｉｍＨは単独で発現されたときにはマンノース
ビードと結合し、それから溶離した。ＦｉｍＣがｄｓｃＦｉｍＨと同時発現され
た時、ＦｉｍＣはｄｓｃＦｉｍＨと複合体を形成せずかくしてマンノース−セフ
ァロースビードからｄｓｃＦｉｍＨと同時溶離しなかった。The presence of FimC and FimH or dscFimH in the periplasmic extracts was monitored by immunoblotting (antigen-antibody reaction) with anti-FimCH antibody. In addition, mannose-sepharose chromatography (Jones et al., 1993, supra) binds FimH or dscFimH to its receptor.
Was used to measure the ability of the. FimH was degraded when expressed alone, but stabilized upon coexpression with chaperones. In contrast to FimH, dscF
ImH was stable in the periplasm even in the absence of FimC. FimH bound to the mannose-sepharose beads when it was co-expressed with FimC and thus eluted as the FimCH complex. Full-length FimH did not elute from the mannose-sepharose beads because FimH degrades in the absence of FimC. In contrast, dscFimH bound to and eluted from mannose beads when expressed alone. When FimC was co-expressed with dscFimH, FimC did not complex with dscFimH and thus did not co-elute with dscFimH from mannose-sepharose beads.

【０１５２】 ＦｉｍＨとは対照的に、ｄｓｃＦｉｍＨは血球凝集素正表現型を回復するＦｉ
ｍＨ（ＦｉｍＨ負）タイプ１遺伝子クラスターを相補できなかった。ここでＦｉ
ｍＨとｄｓｃＦｉｍＨはｐＵＣ１８−ＦｉｍＨとｐＵＣ１８−ｄｓｃＦｉｍＨか
らＥｃｏＲ１とＸｂａＩ部位を用いてｐＢａｄ１８−Ｋｎにサブクローニングさ
れ（ガズマン他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７７巻、４１２１ペ
ージ（１９９５年）参照）、ｐＢａｄ−ＦｉｍＨおよびｐＢａｄ−ｄｓｃＦｉｍ
Ｈを生成し、それはＯＲＮ１０３／ｐＥＴＳ１０に形質転換された。ＯＲＮ１０
３はタイプ１ピリ線毛を産生せず、またｐＥＴＳ１０はＦｉｍＨタイプ１遺伝子
クラスターをコード化する。菌株は１：１００でルリアブロスに希釈され、０．
８のＯＤ₆₀₀続いて１時間０．４ｍＭ ＩＰＴＧと０．０２％アラビノースの導
入で成長した。細胞は収穫され、血球凝集素検定で公知の方法により実施された
（ハルトグレン他、モレキュラー・ミクロバイオロジー、４巻、１３１１ページ
（１９９０年）参照）。In contrast to FimH, dscFimH restores the hemagglutinin positive phenotype Fi
The mH (FimH negative) type 1 gene cluster could not be complemented. Where Fi
mH and dscFimH were subcloned from pUC18-FimH and pUC18-dscFimH into pBad18-Kn using EcoR1 and XbaI sites (see Gazman et al., Journal of Bacteriology, 177, 4121 (1995)), pBad-. FimH and pBad-dscFim
Produced H, which was transformed into ORN103 / pETS10. ORN10
3 does not produce type 1 pili and pETS10 encodes the FimH type 1 gene cluster. The strain was diluted 1: 100 in Luria broth and diluted to 0.
An OD _{600 of} 8 was subsequently grown for 1 hour with the introduction of 0.4 mM IPTG and 0.02% arabinose. The cells were harvested and performed by a method known in the hemagglutinin assay (see Hartgren et al., Molecular Microbiology, Vol. 4, page 1311 (1990)).

【０１５３】 本発明に従って、付加供与体鎖は溝を占有し、ＦｉｍＨピリ線毛ドメインのＩ
ｇフォールドを完成し、かくしてまずシャペロンと次いでピリ線毛内のもう一つ
のサブユニットと通常は相互作用する表面を遮断した。かくしてｄｓｃＦｉｍＨ
はＦｉｍＣとアセンブルせずまたピリ線毛内にもアセンブルしなかった。In accordance with the present invention, the addition donor chain occupies the groove and the I of the FimH pili domain.
The g-fold was completed, thus blocking the surface normally interacting with the chaperone and then another subunit within the pili. Thus dscFimH
Did not assemble with FimC and did not assemble into pili.

【０１５４】 ＦｉｍＨとｄｓｃＦｉｍＨは精製され、その変性曲線が得られた。ＦｉｍＨは
３Ｍの尿素で複合体を保温し、２個のピークを産出しその一つが純粋ＦｉｍＨを
含むカチオン交換クロマトグラフィーに委ねることでＦｉｍＣＨ複合体から分離
された。ＦｉｍＣＨ複合体はＣ₆₀₀／ｐＨＪ９２０５／ｐＨＪ２０のペリプラズ
ムから精製された（ジョーンズ他（１９９３年）およびスローニム他（１９９２
年、前掲）参照）。ペリプラズム抽出物は２０ｍＭ ＭＥＳｐＨ５．４に対して
透析され、ソース１５Ｓカラム（ファルマシア）に注入され、ＦｉｍＣＨは６５
ｍＭ ＮａＣｌで溶離された。溶離液は０．５５Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄／２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．４でブチル４ＦＦカラムに注入され、ＦｉｍＣＨは０．３Ｍ
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で溶離した。ＦｉｍＣＨ複合体は２個のサブユニットを分離す
るために３Ｍの尿素に持ち込まれた。３Ｍ尿素内の純粋ＦｉｍＨはソース１５Ｓ
カラムのフロースルーから回収された。ＦｉｍＨは内２色性およびそのマンノー
ス結合能力で測定されるように３Ｍ尿素内でその生の構造を保持した。FimH and dscFimH were purified and their denaturation curves were obtained. FimH was separated from the FimCH complex by incubating the complex with 3M urea and producing two peaks, one of which was subjected to cation exchange chromatography containing pure FimH. The FimCH complex was purified from the C ₆₀₀ / pHJ9205 / pHJ20 periplasm (Jones et al. (1993) and Slonim et al. (1992).
Year, supra))). Periplasmic extract was dialyzed against 20 mM MES pH 5.4 and injected onto a Source 15S column (Pharmacia) with FimCH 65.
Eluted with mM NaCl. Eluent is injected into butyl 4FF column with _{0.55M (NH 4) 2 SO 4} / 20mM MES pH5.4, FimCH is 0.3M
Elute with (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . The FimCH complex was brought into 3M urea to separate the two subunits. Pure FimH in 3M Urea is source 15S
Recovered from the column flow through. FimH retained its native structure in 3M urea as measured by endodichroism and its mannose binding capacity.

【０１５５】 ｄｓｃＦｉｍＨは更にＣ₆₀₀／ｐＴｒｃ−ｄｓｃＦｉｍＨのペリプラズムから
精製された（スローニム他（１９９２年）を参照）。ペリプラズムは２０ｍＭト
リスＣｌ ｐＨ８．８に対して透析され、ｄｓｃＦｉｍＨはソース１５Ｑカラム
のフロースルーから回収された。このフロースルーは０．９Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
／２０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ８８のブチル４ＦＦに注入され、ｄｓｃＦｉｍＣＨ
は０．４Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で溶離された。溶離液は次いで２０ｍＭ ＭＥＳ
ｐＨ４．７のソース１５Ｓカラムに装荷されｄｓｃＦｉｍＨは５５ｍＭ ＮａＣ
ｌで溶離した。DscFimH was further purified from the C ₆₀₀ / pTrc-dscFimH periplasm (see Slonim et al. (1992)). The periplasm was dialyzed against 20 mM TrisCl pH 8.8 and dscFimH was recovered from the flow through of the Source 15Q column. This flow-through is 0.9M (NH ₄ ) ₂ SO ₄
/ 20 mM TrisCl pH88 injected into butyl 4FF, dscFimCH
Was eluted with 0.4 M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . The eluent is then 20 mM MES
dscFimH loaded on a source 15S column at pH 4.7 was 55 mM NaC.
Elute with 1.

【０１５６】 ＦｉｍＨとｄｓｃＦｉｍＨはチロシン蛍光分光学発光極大値（３５０ｎｍ）で
測定されるように８．５Ｍ以上の尿素（＋４ｍＭ ＤＴＴ）の濃度でのみ完全な
変性を持つ類似の変性曲線を示した。この測定のために、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐ
Ｈ６．５＋４ｍＭ ＤＴＴでＦｉｍＨまたはｄｓｃＨＦｉｍＨ２２．５μｇが適
切な尿素濃度で保温された。蛍光がアルファスキャンＰＴＩ蛍光計の３５０ｎｍ
での発光で２９０ｎｍの励起波長を用いて測定された。ＦｉｍＨは約７．５Ｍ尿
素で起こる変性曲線の中間点で６．５Ｍ尿素の濃度に到達するまで変性を開始し
なかった。FimH and dscFimH showed similar denaturation curves with complete denaturation only at concentrations of urea (+4 mM DTT) above 8.5 M as measured by tyrosine fluorescence spectrophotometric emission maxima (350 nm). For this measurement, 20 mM MES p
FimH or dscHFimH22.5 μg was incubated with H6.5 + 4 mM DTT at an appropriate urea concentration. Fluorescence is alpha scan PTI fluorometer 350nm
Was measured using an excitation wavelength of 290 nm. FimH did not initiate denaturation until a concentration of 6.5M urea was reached at the midpoint of the denaturation curve that occurs at approximately 7.5M urea.

【０１５７】 Ｄ鎖、Ｃ鎖、およびＦ鎖により形成されるβシートでのねじりの故で、Ｆｉｍ
ＣのＧ１鎖はＦｉｍＨのＦ鎖との潜在的なバックボーン水素結合相互作用を満足
させることはできない。最後の構造のモデリングはシリコングラフィックワーク
ステーションを走行させるＳＹＢＹＬ（トリポス・アソシエーツ）およびインサ
イトＩＩ（モレキュラー・シミュレーションズ・インコーポレイテッド）を使用
して実施された。Due to the twist in the β-sheet formed by the D, C, and F chains, Fim
The C1 G1 chain is unable to satisfy potential backbone hydrogen bonding interactions with the FimH F chain. Modeling of the final structure was performed using SYBYL (Tripos Associates) and Insight II (Molecular Simulations, Inc.) running a Silicon Graphics workstation.

【０１５８】 実施例２ 試験管内フォールディング検定 試験管内フォールディング検定は、ピリ線毛サブユニットタンパク質のアミノ
酸配列における欠失立体情報がシスで提供できることを立証するために使用され
た。この検定は変性タンパク質の急速希釈後のＣＤスペクトルの試験で測定され
るように（既に記載されたＦｉｍＣＨ複合体から得られた）尿素変性ＦｉｍＨお
よびｄｓｃＦｉｍＨの意図されたリフォールディングに基づいていた。スペクト
ルはＪＡＳＣＯ Ｊ７１５分光偏光計で０．０２ｃｍ細胞を使用して２０ｍＭ
ＭＥＳ ｐＨ６．５で１５０μｇのタンパク質から測定された。Example 2 In Vitro Folding Assay An in vitro folding assay was used to demonstrate that deletion stereogenic information in the amino acid sequence of the pili subunit protein can be provided in cis. This assay was based on the intended refolding of urea-denatured FimH and dscFimH (obtained from the previously described FimCH complex) as determined by examination of CD spectra after rapid dilution of denatured proteins. The spectrum is 20 mM using a JASCO J715 spectropolarimeter using 0.02 cm cells.
Measured from 150 μg protein at MES pH 6.5.

【０１５９】 変性前に、ＦｉｍＨ（３Ｍ尿素）はｄｓｃＦｉｍＨと比較して事実上同一のβ
シートＣＤスペクトルを有していた。９Ｍ尿素（＋４ｍＭ ＤＴＴ）で変性後に
、ＦｉｍＨとｄｓｃＦｉｍＨのＣＤスペクトルは非生タンパク質の特徴を持つよ
うになった。変性ｄｓｃＦｉｍＨの光散乱は大きな集合体の存在を示していた。
しかしｄｓｃＦｉｍＨの急速な希釈はタンパク質のリフォールディングをその生
のβシート構造に導いた。リフォールドされたｄｓｃＦｉｍＨはマンノースと結
合し、また（光散乱で示されるように）単分散であり、それがその生構造にリフ
ォールドされたことを示していた。これとは対照的に、ＦｉｍＨをリフォールド
する試みは不溶集合体に導き、従って濾過後は何らのシグナルも誘出しなかった
。ＦｉｍＣはその急速希釈後は変性ＦｉｍＨに結合できなかった。しかしもしＦ
ｉｍＣが希釈液に存在していたならば、ＦｉｍＨはＦｉｍＣと複合体を形成しそ
の生マンノース結合βシート構造にフォールドされた。かくしてこれらの検定で
は、ｄｓｃＦｉｍＨが独立してフォールドしたのに対し、ＦｉｍＨはＦｉｍＣの
存在下でフォールドし、不在下ではフォールドしなかった。ＦｉｍＣＨ３Ｍ尿素
でＦｉｍＣＨ複合体から分離された生ＦｉｍＨと結合することができ、これはシ
ャペロンが実際にフォールドされたサブユニットに結合できることを示していた
。更なる立証として、ＦｉｍＣのＡｒｇ８での突然変異（図２参照）シャペロン
複合体形成に重要な残基は、生ＦｉｍＨと結合しあるいは変性ＦｉｍＨのリフォ
ールディングを促進する変異体タンパク質の能力を無効にした。Prior to denaturation, FimH (3M urea) had virtually the same β as compared to dscFimH.
It had a sheet CD spectrum. After denaturation with 9 M urea (+4 mM DTT), the CD spectra of FimH and dscFimH became characteristic of non-live protein. Light scattering of the modified dscFimH indicated the presence of large aggregates.
However, rapid dilution of dscFimH led to protein refolding into its native β-sheet structure. The refolded dscFimH bound mannose and was also monodisperse (as shown by light scattering), indicating that it was refolded into its biostructure. In contrast, attempts to refold FimH led to insoluble aggregates and therefore did not elicit any signal after filtration. FimC was unable to bind to denatured FimH after its rapid dilution. But if F
If imC was present in the diluent, FimH formed a complex with FimC and folded into its live mannose-binding β-sheet structure. Thus, in these assays, dscFimH folds independently, whereas FimH folds in the presence of FimC and not in the absence. FimCH3M urea was able to bind to live FimH separated from the FimCH complex, indicating that the chaperone could actually bind to the folded subunit. As further proof, mutations in FimC at Arg8 (see Figure 2) residues critical for chaperone complex formation abolish the mutant protein's ability to bind live FimH or promote refolding of denatured FimH. did.

【０１６０】 要約すると、これらの結果は、シャペロンが欠失立体情報をサブユニットタン
パク質に提供することによりサブユニットのフォールディングに必要であること
を示している。ここでサブユニットフォールディングに必要な情報は２個のポリ
ペプチドにある。このような配置において、サブユニットのＦ鎖のＣ末端カルボ
キシル基はシャペロン割れ目にある保存Ａｒｇ８とＬｙｓ１１２残基に固着する
。Ｇ１鎖に沿った続くβシート形成を開始する。これらの相互作用は、サブユニ
ットの疎水性コアの適切な崩壊を促進するようにサブユニットのＦ鎖疎水性側鎖
のＧ１鎖交互疎水性残基への登録を位置決めするであろう。ｄｓｃＦｉｍＨでは
、通常シャペロンにより提供される立体情報は、ＦｉｍＧのＮ末端に一致する配
列で提供される単一ポリペプチド鎖に現在存在する。シスに配設された欠失配列
はＦｉｍＨのピリンドメインを完全正統Ｉｇフォールドにフォールドすることを
可能にし、先端フィブリラムにあるＦｉｍＧで別途完成されるフォールドを擬態
する。In summary, these results indicate that chaperones are required for subunit folding by providing deletion conformational information to subunit proteins. Here, the information required for subunit folding lies in two polypeptides. In such an arrangement, the C-terminal carboxyl group of the subunit F chain anchors at the conserved Arg8 and Lys112 residues in the chaperone cleft. Initiate subsequent β-sheet formation along the G1 chain. These interactions will position the registration of the subunit F chain hydrophobic side chains to the G1 chain alternating hydrophobic residues so as to facilitate proper disintegration of the subunit hydrophobic core. In dscFimH, the steric information normally provided by chaperones is currently present in a single polypeptide chain provided with a sequence that matches the N-terminus of FimG. The deletion sequence placed in cis allows the pilin domain of FimH to fold into a perfectly orthodox Ig fold, mimicking a fold otherwise completed with FimG in the apical fibrillum.

【０１６１】 前に述べたように、ＦｉｍＨベイストワクチンは実験の膀胱感染症からマウス
とサルを防御することが示された（ランガーマン他、サイエンス、２７６巻、６
０７ページ（１９９７年）；ランガーマン他、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．中）
。しかしこのようなワクチンはＦｉｍＣの同時発現とＦｉｍＣＨの複合体の精製
を必要とした。ここに開示された本発明に従って、供与体鎖相補は今やｄｓｃＦ
ｉｍＨワクチンの産生を可能にする。これらのワクチンはそれが単一サブユニッ
トより成り、逆平行供与体鎖の故でより安定することを期待されている点で有利
である。かくしてｄｓｃＦｉｍＨでのワクチン接種はＦｉｍＣＨ複合体で達成さ
れるものと比較できる抗ＦｉｍＨ力価を産生することが発見された。かくして本
発明で教示される方法はアドヘジンベイストワクチンの産生を一般に促進する。As previously mentioned, the FimH-based vaccine has been shown to protect mice and monkeys from experimental bladder infections (Langerman et al., Science, 276, 6).
07 (1997); Langerman et al., J. Infect. Dis. During)
. However, such a vaccine required co-expression of FimC and purification of the FimCH complex. In accordance with the invention disclosed herein, the donor strand complement is now dscF.
Enables production of imH vaccine. These vaccines are advantageous in that they consist of a single subunit and are expected to be more stable because of the antiparallel donor chains. Thus it was discovered that vaccination with dscFimH produced anti-FimH titers comparable to those achieved with the FimCH complex. Thus, the methods taught in the present invention generally facilitate the production of adhesin-based vaccines.

【０１６２】 実施例３ ｄｓｃ免疫原投薬量 本実験は１５μｇ，３μｇおよび０．６μｇでのｄｓｃ免疫原（用量下降）の
投薬量を評価した。ＣＦＡ／ＩＦＡがアジュバンドとして使用された。ここで３
０μｇ，６μｇおよび１．２μｇのＦｉｍＨが比較のために使用された。ｄｓｃ
とＦｉｍＣＨの間の比率は、ＦｉｍＣＨ複合体の各用量でＦｉｍＨの量（Ｆｉｍ
Ｃに対するＦｉｍＨの比率が１：１）がｄｓｃＦｉｍＨの各用量に存在する量に
等しいため類似しているであろうことが期待された。抗原を検出するものとして
抗ＦｉｍＨ Ｔ３と抗Ｆｉｍ ｄｓｃＦｉｍＨを用いる終点力価がこの相関を説
明し、免疫応答を評価しまた比較可能性を実証するために使用された。ｄｓｃ免
疫源の０．６μｇの用量（対ＦｉｍＣＨ、１．２μｇ）の例外を除いて終点力価
は同じように見えた。この結果はエリザを使用する終点力価希釈液として表２で
示される。各グループは２個組で行われた。例えばグループ１とグループ７では
免疫源として使用されたピリンの量が異なる。これはグループ７がＦｉｍＣとＦ
ｉｍＨの複合体であるＦｉｍＣＨを３０μｇ受け取ったためであり、一方グルー
プ１は供与体鎖セグメントのみを端部に持ったＦｉｍＨであるｄｓｃＦｉｍＨを
１５μｇ受けたことに注目されたい。かくしてＦｉｍＣＨの量を倍増することに
より、より密接に関連する分子量が達成されたが、それは複合体の分子量が対応
する供与体鎖相補物質のそれの殆んど２倍であるためである。これはｄｓｃタン
パク質対複合体ピリン−シャペロン複合体の免疫性を実証する。Example 3 dsc Immunogen Dosage This experiment evaluated the dose of dsc immunogen (down dose) at 15 μg, 3 μg and 0.6 μg. CFA / IFA was used as an adjuvant. Where 3
0 μg, 6 μg and 1.2 μg FimH were used for comparison. dsc
The ratio between FimCH and FimCH is the amount of FimH at each dose of FimCH complex (FimCH
It was expected that the ratio of FimH to C would be similar because the ratio of 1: 1) is equal to the amount present in each dose of dscFimH. Endpoint titers using anti-FimH T3 and anti-Fim dscFimH as detecting antigens were used to account for this correlation and to assess immune response and to demonstrate comparability. Endpoint titers appeared similar with the exception of the 0.6 μg dose of dsc immunogen (vs FimCH, 1.2 μg). The results are shown in Table 2 as endpoint titer dilutions using Elisa. Each group was done in duplicate. For example, Group 1 and Group 7 differ in the amount of pilin used as the immunogen. This is Group 7 FimC and F
Note that 30 μg of FimCH, a complex of imH, was received, while Group 1 received 15 μg of dscFimH, FimH with only the donor chain segment at the end. Thus, by doubling the amount of FimCH, a more closely related molecular weight was achieved because the molecular weight of the complex was almost twice that of the corresponding donor strand complement. This demonstrates the immunity of the dsc protein-complex pilin-chaperone complex.

【０１６３】[0163]

【表２】 [Table 2]

【０１６４】 尿道内に投与された大腸菌のＮＵ１４菌株での攻撃の結果が図１０で示される
。この結果は供与体鎖相補タンパク質（ｄｓｃＦｉｍＨ）による防御を示す。こ
こでｄｓｃ抗原は対照（ＣＦＡ／ＩＦＡ−完全フロイント アジュバント／不完
全フロイント アジュバント）および生（アジュバントあるいは抗原なし）、同
じく高用量ＦｉｍＣＨ（ＣＦＡ／ＩＦＡ）と比較された。少なくとも３μｇと１
５μｇの用量で対照または生のグループのいずれかと比較された時に著しい防御
がｄｓｃＦｉｍＨで観察された。The results of challenge with the NU14 strain of E. coli administered intraurethrally are shown in FIG. The results show protection by the donor chain complement protein (dscFimH). Here the dsc antigen was compared to control (CFA / IFA-complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant) and live (no adjuvant or antigen), also high dose FimCH (CFA / IFA). At least 3 μg and 1
Significant protection was observed with dscFimH when compared to either control or raw groups at the 5 μg dose.

【０１６５】 実施例４ ＤＳＣタンパク質の免疫性 これらの実験においては、ＭＦ５９（カイロン・コーポレイション）がアジュ
バントとして使用され、モニターは１８週続けられた。全体的に見て、応答はす
べての用量でＦｉｍＣＨとｄｓｃＦｉｍＨとの間で比較可能であった。終点力価
は表３および図１１のグラフで示された。攻撃実験で（その結果は図１２で描か
れている）、より低用量対より大きな用量でよりよい防御が観察された（これは
ＭＦ５９アジュバントの使用に起因することができた）。０．６μｇ用量が最良
であるように見えた。Example 4 Immunity of DSC Proteins In these experiments, MF59 (Chiron Corporation) was used as an adjuvant and monitoring continued for 18 weeks. Overall, the response was comparable between FimCH and dscFimH at all doses. The endpoint titers are shown in Table 3 and the graph in FIG. In challenge experiments (the results are depicted in Figure 12) better protection was observed at lower vs. higher doses, which could be attributed to the use of MF59 adjuvant. The 0.6 μg dose appeared to be the best.

【０１６６】[0166]

【表３】 [Table 3]

【０１６７】 実施例５ 低用量ｄｓｃＦｉｍＨ 更なる実験が受容可能な応答がより低い用量で達成できることを示すために実
施された。免疫原性はいくつかのより低い用量で（アジュバントとしてＭＦ５９
を使用することで）測定された。その結果は表４，５および６で提示される。一
般にたとえ０．３２μｇ（追加免疫の後）または２μｇ（追加免疫前）でよい応
答が観察された。この実験にとって、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスが０日で免疫化され
、また４個（グループ当り５匹のマウス）で追加免疫された。免疫応答は（エリ
ザにより）３個の異なった捕捉抗原：すなわちＦｉｍＨ Ｔ３（ＦｉｍＨ 切形
）、ｄｓｃＦｉｍＨおよびＦｉｍＨ（０．４Ｍ尿素）に対して追加免疫前および
追加免疫後で測定された。Example 5 Low Dose dscFimH Further experiments were performed to show that acceptable responses can be achieved at lower doses. Immunogenicity at several lower doses (MF59 as an adjuvant
Was measured). The results are presented in Tables 4, 5 and 6. Generally good responses were observed even with 0.32 μg (after boost) or 2 μg (before boost). For this experiment, C3H / HeJ mice were immunized at day 0 and boosted with 4 mice (5 mice per group). Immune responses were measured (by Eliza) against three different capture antigens: FimH T3 (FimH truncated), dscFimH and FimH (0.4 M urea) before and after boosting.

【０１６８】[0168]

【表４】 [Table 4]

【０１６９】[0169]

【表５】 [Table 5]

【０１７０】[0170]

【表６】 [Table 6]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１Ａ】 大腸菌などのピリ線毛より成る各種Ｆｉｍタンパク質のアミノ
酸配列の比較を示す図FIG. 1A is a diagram showing a comparison of amino acid sequences of various Fim proteins composed of pili such as Escherichia coli

【図１Ｂ】 図１Ａの続きを示す図FIG. 1B is a diagram showing a continuation of FIG. 1A.

【図１Ｃ】 図１Ｂの続きを示す図FIG. 1C is a diagram showing a continuation of FIG. 1B.

【図２Ａ】 ＦｉｍＣの配列を示す図FIG. 2A is a diagram showing the sequence of FimC.

【図２Ｂ】 図２Ａの続きを示す図FIG. 2B is a diagram showing a continuation of FIG. 2A.

【図３】 ＦｉｍＨのマンノース結合ドメイン（Ａ）とピリドメイン（Ｂ）
のβシートトポロジーダイアグラムを示す図FIG. 3 Mannose binding domain (A) and pyri domain (B) of FimH
Diagram showing the β-sheet topology diagram of

【図４】 ＦｉｍＨが垂直にＦｉｍＣが水平に配向されたＦｉｍＣ−Ｆｉｍ
Ｈ複合体のマルスクリプトリボンダイアグラムを示す図FIG. 4 is a FimC-Fim in which FimH is oriented vertically and FimC is oriented horizontally.
Diagram showing Maruscript ribbon diagram of H complex

【図５Ａ】 Ｐピリ線毛サブユニット（ＰａｐＡ，ＰａｐＫ，ＰａｐＥおよ
びＰａｐＦ）の配列配置を示す図FIG. 5A is a view showing the sequence arrangement of P pili subunits (PapA, PapK, PapE, and PapF).

【図５Ｂ】 図５Ａの続きを示す図FIG. 5B is a diagram showing a continuation of FIG. 5A.

【図６】 ＰａｐＤの配列および二次構造説明を示す図FIG. 6 is a diagram showing the sequence and secondary structure of PapD.

【図７】 二次構造の名称でＰａｐＫのトポロジーを示す図FIG. 7 is a diagram showing the topology of PapK in the name of secondary structure.

【図８】 ＰａｐＤ−ＰａｐＫ複合体の構造と二次構造表示を示す図FIG. 8 is a diagram showing the structure and secondary structure representation of the PapD-PapK complex.

【図９】 ｄｓｃＦｉｍＨを形成するためにテトラペプチドリンカーを使用
するためにＦｉｍＨがＦｉｍＧの残基１−１３に連結された本発明の一つの実施
例の一般配置を示す図FIG. 9 shows the general configuration of one embodiment of the invention in which FimH is linked to residues 1-13 of FimG to use a tetrapeptide linker to form dscFimH.

【図１０】 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスがピリ線毛タンパク質プラスＣＦＡ／Ｉ
ＦＡで免疫化された実験の結果を示す図FIG. 10: C3H / HeJ mice show pili protein plus CFA / I
The figure which shows the result of the experiment immunized with FA.

【図１１】 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスがピリ線毛タンパク質プラスＭＦ５９で
免疫化され４週および１６週に（筋肉内で）提示された免疫原で追加免疫され終
点力価が左側に示される実験の結果を示す図FIG. 11: Results of an experiment in which C3H / HeJ mice were immunized with pili protein plus MF59 and boosted with the presented immunogens (intramuscularly) at 4 and 16 weeks with endpoint titers shown on the left. Showing

【図１２】 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスが提示されたピリ線毛タンパク質プラス
ＭＦ５９で免疫化された実験の結果を示す図FIG. 12 shows the results of an experiment in which C3H / HeJ mice were immunized with presented pili protein plus MF59.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/12 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号 ６０／１８４，４４２ (32)優先日 平成12年２月23日(2000．2．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピンクナー，ジェローム，エス． アメリカ合衆国，63119 ミズーリ，ウエ ブスター グローブス，ノース フォレス ト 658 (72)発明者 サウアー，フレデリック アメリカ合衆国，63105 ミズーリ，セン トルイス，パークデール 7510 (72)発明者 バーンハート，ミッシェル アメリカ合衆国，63139 ミズーリ，セン トルイス，ポトマック 4933 (72)発明者 ワクスマン，ガブリエル アメリカ合衆国，63130 ミズーリ，ユニ バーシティ シティ，ウエスト ドライブ 500 (72)発明者 ナイト，シュテファン スウェーデン，Ｓ−752 63 ウプサラ， ノレーンズ ファーグ 51 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA50 CA01 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA01Y AA26Y AA57X AA87X AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA45 4C085 AA03 BB11 CC21 CC32 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 DA76 DA86 EA31 FA72 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (51) Int.Cl. ⁷ Identification Code FI Theme Coat (Reference) C07K 14/195 C07K 16/12 16/12 19/00 19/00 C12N 1/15 C12N 1/15 1 / 19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 21/08 C12P 21/02 C12R 1:01 // C12P 21/08 C12N 15/00 A (C12N 15/09 5/00 A C12R 1:01) (C12P 21/02 C12R 1:01) (31) Priority claim number 60/184, 442 (32) Priority date February 23, 2000 (February 23, 2000) (33) Priority Claiming country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM , EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT , TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Pinkner, Jero Beam, es. United States, 63119 Missouri, Webster Groves, North Forest 658 (72) Inventor Sauer, Frederick United States, 63105 Missouri, Cent Louis, Parkdale 7510 (72) Inventor Burnhart, Michelle United States, 63139 Missouri, Saint Louis, Potomac 4933 (72) Inventor Waxman, Gabriel United States, 63130 Missouri, University City, West Drive 500 (72) Inventor Knight, Stephan Sweden, S-752 63 Uppsala, Norains Ferg 51 F Term (reference) 4B024 AA01 BA31 BA50 CA01 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA01Y AA26Y AA57X AA87A21 A20 A11 A20A21 A21 A21 A20A21 A20A21 A20A21 A20A21 A21A45A21 A20A21A20A21A20A21A25 BA41 CA11 DA76 DA86 EA31 FA72 FA74

Claims (51)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ピリ線毛タンパク質成分と供与体鎖成分より成ることを特徴
とする一つの免疫原複合体。1. An immunogenic complex comprising a pili protein component and a donor chain component. 【請求項２】 請求項１記載の免疫原複合体であって、ここで前記ピリ線毛
タンパク質成分が前記供与体鎖成分と共有結合することを特徴とする免疫原複合
体。2. The immunogenic complex of claim 1, wherein the pili protein component is covalently linked to the donor chain component. 【請求項３】 請求項１記載の免疫原複合体であって、ここで前記ピリ線毛
タンパク質成分が前記供与体鎖成分と非共有結合することを特徴とする免疫原複
合体。3. The immunogenic complex according to claim 1, wherein the pili protein component is non-covalently bound to the donor chain component. 【請求項４】 請求項１記載の免疫原複合体であって、ここで前記ピリ線毛
タンパク質がアドヘジンであることを特徴とする免疫原複合体。4. The immunogenic complex according to claim 1, wherein the pili protein is an adhesin. 【請求項５】 請求項４記載の免疫原複合体であって、ここで前記アドヘジ
ンがＦｉｍＨであることを特徴とする免疫原複合体。5. The immunogenic complex according to claim 4, wherein the adhesin is FimH. 【請求項６】 請求項１記載の免疫原複合体であって、ここで供与体鎖が配
列識別番号３，４，５，６，７、および８より成るグループから選択されること
を特徴とする免疫原複合体。6. The immunogenic complex of claim 1, wherein the donor chain is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7, and 8. Immunogenic complex. 【請求項７】 一つのポリペプチドであって、同一アミノ酸配列の部分とし
てピリ線毛部分と供与体補体部分より成ることを特徴とするポリペプチド。7. A polypeptide comprising one pili and a donor complement part as a part of the same amino acid sequence. 【請求項８】 請求項７記載のポリペプチドであって、ここで供与体補体部
分が細菌シャペロンから誘導されることを特徴とするポリペプチド。8. The polypeptide according to claim 7, wherein the donor complement portion is derived from a bacterial chaperone. 【請求項９】 請求項７記載のポリペプチドであって、ここで供与体補体部
分が細菌ピリンまたはアドヘジン、その部分であり、あるいは細菌ピリンまたは
アドヘジンから誘導されることを特徴とするポリペプチド。9. The polypeptide of claim 7, wherein the donor complement portion is bacterial pilin or adhesin, a portion thereof, or derived from bacterial pilin or adhesin. . 【請求項１０】 請求項８記載のポリペプチドであって、ここでシャペロン
がＰａｐＤおよびＦｉｍＣより成るグループから選択されることを特徴とするポ
リペプチド。10. The polypeptide according to claim 8, wherein the chaperone is selected from the group consisting of PapD and FimC. 【請求項１１】 請求項８記載のポリペプチドであって、ここで細菌シャペ
ロンが大腸菌から誘導されることを特徴とするポリペプチド。11. The polypeptide according to claim 8, wherein the bacterial chaperone is derived from Escherichia coli. 【請求項１２】 請求項７記載のポリペプチドであって、ここで供与体補体
部分が配列識別番号３，４，５，６，７および８より成るグループから選択され
ることを特徴とするポリペプチド。12. The polypeptide according to claim 7, wherein the donor complement portion is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7 and 8. Polypeptide. 【請求項１３】 請求項７記載のポリペプチドであって、ここでピリ線毛タ
ンパク質部分が腸内細菌科の細菌に発見されることを特徴とするポリペプチド。13. The polypeptide according to claim 7, wherein the pili protein portion is found in a bacterium of the family Enterobacteriaceae. 【請求項１４】 細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項１３記載のポ
リペプチド。14. The polypeptide according to claim 13, wherein the bacterium is Escherichia coli. 【請求項１５】 ピリ線毛タンパク質がアドヘジンであることを特徴とする
請求項７記載のポリペプチド。15. The polypeptide according to claim 7, wherein the pili protein is an adhesin. 【請求項１６】 ピリ線毛タンパク質がピリンであることを特徴とする請求
項７記載のポリペプチド。16. The polypeptide according to claim 7, wherein the pili protein is pilin. 【請求項１７】 ピリ線毛タンパク質がＰａｐＫであることを特徴とする請
求項７記載のポリペプチド。17. The polypeptide according to claim 7, wherein the pili protein is PapK. 【請求項１８】 アドヘジンがＦｉｍＨであることを特徴とする請求項１５
記載のポリペプチド。18. The adhesin is FimH.
The described polypeptide. 【請求項１９】 請求項１８記載のポリペプチドであって、配列識別番号１
０および１１より成るグループから選択される配列を持つことを特徴とするポリ
ペプチド。19. The polypeptide of claim 18, which is SEQ ID NO: 1.
A polypeptide having a sequence selected from the group consisting of 0 and 11. 【請求項２０】 一つの単一ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であっ
て、請求項７記載のポリペプチドおよびアドヘジンより成ることを特徴とする単
一ポリペプチドまたはポリペプチド複合体。20. A single polypeptide or polypeptide complex, which comprises the polypeptide of claim 7 and an adhesin. 【請求項２１】 一つの単一ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であっ
て、請求項７記載のポリペプチドおよびピリンより成ることを特徴とする単一ポ
リペプチドまたはポリペプチド複合体。21. A single polypeptide or polypeptide complex, which comprises the polypeptide according to claim 7 and pilin. 【請求項２２】 請求項２０と２１記載のポリペプチド複合体であって、こ
こでポリペプチドのピリ線毛タンパク質部分がＦｉｍＧでありアドヘジンがＦｉ
ｍＨであることを特徴とするポリペプチド複合体。22. The polypeptide complex according to claims 20 and 21, wherein the pili protein portion of the polypeptide is FimG and the adhesin is Fi.
A polypeptide complex which is mH. 【請求項２３】 請求項７，２０または２１記載のポリペプチドのコーディ
ング領域を含むことを特徴とする一つのポリヌクレオチド。23. One polynucleotide comprising the coding region of the polypeptide of claim 7, 20 or 21. 【請求項２４】 請求項１，２，３，４，５，および６記載のポリペプチド
およびまたは複合体より成るグループから選択されることを特徴とする免疫原複
合体に特異的な一つの抗体。24. One antibody specific for an immunogenic complex, characterized in that it is selected from the group consisting of the polypeptides and / or complexes according to claims 1, 2, 3, 4, 5, and 6. . 【請求項２５】 請求項７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５
，１６，１７，１８，１９，２０，２１，および２２記載のポリペプチドより成
るグループから選択されることを特徴とするポリペプチドに特異的な一つの抗体
。25. The method according to claim 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.
, 16, 17, 18, 19, 20, 21, and 22. A single antibody specific to the polypeptide, which is selected from the group consisting of the polypeptides. 【請求項２６】 請求項２４または２５記載の抗体であって、ここで前記抗
体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体。26. The antibody according to claim 24 or 25, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 【請求項２７】 請求項２６記載の抗体を発現することを特徴とする一つの
遺伝子操作細胞。27. One genetically engineered cell, which expresses the antibody according to claim 26. 【請求項２８】 請求項２３記載のポリヌクレオチドを発現することを特徴
とする一つの遺伝子操作細胞。28. One genetically engineered cell, which expresses the polynucleotide according to claim 23. 【請求項２９】 請求項２３記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とす
る一つのベクター。29. One vector, comprising the polynucleotide according to claim 23. 【請求項３０】 請求項１９記載のポリペプチドを発現することを特徴とす
る一つの遺伝子操作細胞。30. One genetically engineered cell, which expresses the polypeptide according to claim 19. 【請求項３１】 薬理許容担体、希釈剤または賦形剤に懸濁された請求項２
４または２５記載の抗体を含むことを特徴とする一つの組成物。31. The method of claim 2 suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.
One composition comprising the antibody of 4 or 25. 【請求項３２】 一つの組成物であって、請求項１，２，３，４，５および
６記載の複合体より成るグループから選択される免疫原複合体を含み、前記免疫
原複合体が薬理許容担体、希釈剤または賦形剤に懸濁されることを特徴とする組
成物。32. One composition comprising an immunogenic complex selected from the group consisting of the complex of claims 1, 2, 3, 4, 5 and 6, wherein said immunogenic complex is A composition which is suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. 【請求項３３】 一つの組成物であって、請求項７，８，９，１０，１１，
１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１および２２記載
のポリペプチドより成るグループから選択されるポリペプチドを含み、前記ポリ
ペプチドが薬理許容担体、希釈剤または賦形剤に懸濁されることを特徴とする組
成物。33. A composition, comprising the steps of claim 7, 8, 9, 10, 11,
A polypeptide selected from the group consisting of the polypeptides described in 12, 13, 14, 15, 16, 17, 17, 18, 19, 20, 21 and 22, wherein the polypeptide is a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. A composition which is suspended in an agent. 【請求項３４】 一つのワクチン組成物であって、請求項１，２，３，４，
５および６記載の複合体より成るグループから選択される免疫原複合体の免疫原
有効量を含み、前記免疫原複合体が薬理許容担体、希釈剤または賦形剤に懸濁さ
れることを特徴とするワクチン組成物。34. One vaccine composition comprising:
An immunogen-effective amount of an immunogenic complex selected from the group consisting of the complex of 5 and 6, wherein said immunogenic complex is suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. Vaccine composition. 【請求項３５】 一つのワクチン組成物であって、請求項７，８，９，１０
，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，およ
び２２記載のポリペプチドより成るグループから選択されるポリペプチドの免疫
原有効量を含み、前記ポリペプチドが薬理許容担体、希釈剤または賦形剤に懸濁
されることを特徴とするワクチン組成物。35. A single vaccine composition, wherein the composition is 7, 8, 9, 10
, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 17, 18, 19, 20, 21 and 22, wherein said polypeptide comprises an immunogenically effective amount of a polypeptide selected from the group consisting of: A vaccine composition, which is suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. 【請求項３６】 危険にさらされる哺乳類の疾病を予防する一つの方法であ
って、前記動物に請求項３４または３５記載のワクチン組成物を投与することを
含むことを特徴とする方法。36. A method of preventing a disease in a mammal at risk, which method comprises administering to said animal the vaccine composition of claim 34 or 35. 【請求項３７】 請求項３６記載の方法であって、ここで疾病が腸内細菌科
の細菌により生じることを特徴とする方法。37. The method of claim 36, wherein the disease is caused by a bacterium of the family Enterobacteriaceae. 【請求項３８】 細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項３７記載の方
法。38. The method according to claim 37, wherein the bacterium is Escherichia coli. 【請求項３９】 哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項３０記載の方
法。39. The method of claim 30, wherein the mammal is a human. 【請求項４０】 疾病が尿路疾病であることを特徴とする請求項３６記載の
方法。40. The method of claim 36, wherein the disease is a urinary tract disease. 【請求項４１】 疾病に悩む哺乳類の疾病を処置する一つの方法であって、
前記哺乳類に請求項３１記載の組成物の薬理有効量を投与することを含むことを
特徴とする方法。41. A method of treating a disease in a mammal afflicted with a disease, comprising:
32. A method comprising administering to said mammal a pharmaceutically effective amount of the composition of claim 31. 【請求項４２】 請求項４１記載の方法であって、ここで疾病が腸内細菌科
の細菌により引き起こされることを特徴とする方法。42. The method of claim 41, wherein the disease is caused by a bacterium of the family Enterobacteriaceae. 【請求項４３】 細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項４２記載の方
法。43. The method according to claim 42, wherein the bacterium is Escherichia coli. 【請求項４４】 動物がヒトであることを特徴とする請求項４１記載の方法
。44. The method of claim 41, wherein the animal is a human. 【請求項４５】 疾病が***症であることを特徴とする請求項４４記載
の方法。45. The method of claim 44, wherein the disease is urinary tract infection. 【請求項４６】 請求項４５記載の方法であって、ここで疾病が腸内細菌科
の細菌により引き起こされることを特徴とする方法。46. The method of claim 45, wherein the disease is caused by a bacterium of the family Enterobacteriaceae. 【請求項４７】 疾病が大腸菌により引き起こされることを特徴とする請求
項４６記載の方法。47. The method of claim 46, wherein the disease is caused by E. coli. 【請求項４８】 そこに付着される供与体補体鎖を持つピリ線毛ポリペプチ
ドを合成することを含むことを特徴とする免疫原ポリペプチドを産生する一つの
方法。48. A method of producing an immunogenic polypeptide comprising synthesizing a pili pili polypeptide having a donor complement chain attached thereto. 【請求項４９】 請求項４８記載の方法であって、ここで供与体補体鎖が配
列識別番号３，４，５，６，７，および８より成るグループから選択されること
を特徴とする方法。49. The method of claim 48, wherein the donor complement chain is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7, and 8. Method. 【請求項５０】 ピリ線毛ポリペプチドがアドヘジンであることを特徴とす
る請求項４８記載の方法。50. The method of claim 48, wherein the pili polypeptide is an adhesin. 【請求項５１】 アドヘジンがＦｉｍＨであることを特徴とする請求項５０
記載の方法。51. The adhesin is FimH, 50.
The method described.