JP2003504080A - ワクチン - Google Patents

ワクチン

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JP2003504080A
JP2003504080A JP2001509752A JP2001509752A JP2003504080A JP 2003504080 A JP2003504080 A JP 2003504080A JP 2001509752 A JP2001509752 A JP 2001509752A JP 2001509752 A JP2001509752 A JP 2001509752A JP 2003504080 A JP2003504080 A JP 2003504080A
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テレサ カブゾン，シルバ
クリフォード ディロン，ダビン
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スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、プロスターゼ・ファミリーからの、新規タンパク質、及びそれらの製造に関する。特に、本発明は、免疫学的融合パートナー、例えば、ＮＳ１に融合されたプロスターゼ・タンパク質又はその断片に関する。このような抗原は、前立腺腫瘍の治療のためのワクチンを提供するために配合されることができる。プロスターゼ・タンパク質及び同族体の新規精製方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）として知られるタンパク質、す
なわち、前立腺特異的セリン・プロテアーゼのタンパク質誘導体、それらの精製
及び製造方法に、そしてまた上記誘導体を含む医薬組成物及び医薬におけるそれ
らの使用に関する。特に、このような誘導体は、癌ワクチン療法、特に前立腺癌
ワクチン療法、及び前立腺腫瘍のための診断剤に利用される。
【０００２】 特に、本発明の誘導体は、免疫学的な又は発現エンハンサー融合パートナーに
結合されたプロスターゼを含む融合タンパク質を含む。
【０００３】 本発明は、プロスターゼ誘導体の精製方法、及び前立腺癌患者、及び前立腺腫
瘍以外のプロスターゼ発現性腫瘍、前立腺過形成、及び前立腺上皮内新形成（pr
ostate intraepithelial neoplasia (PIN)）を免疫療法により治療するためのワ
クチンの配合方法をも提供する。
【０００４】 前立腺癌は、５０歳を超える男性において推定３０％の発症率をもつ、男性の
間で最も一般的な癌である。歴然として臨床的証拠は、ヒト前立腺癌は、骨に転
移する傾向をもち、そしてこの疾患は、上昇した患者の死亡率を導く、アンドロ
ゲン不応状態（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｓｔａｔｕｓ）に依存してアンドロゲン
から不可避的に進行するようである（Abbas F., Scardino P.“The Natural His
tory of Clinical Prostate Carcinoma.”In Cancer (1997); 80 : 827-833）。
この一般的な疾患は、現在、米国における男性の間の癌による死亡の第２の原因
である。
【０００５】 上記疾患のための療法に関するかなりの研究にも拘らず、前立腺癌は治療する
のが難しいままである。現在、治療は、外科手術及び／又は放射線療法に基づく
が、これらの方法は、かなりのパーセンテージのケースにおいて有効ではない（
Frydenberg M., Stricker P., Kaye K.“Prostate Cancer Diagnosis and Manag
ement”The Lancet (1997); 349 : 1681-1687)。いくつかの腫瘍関連抗原は、既
に知られている。これらの抗原の多くは、免疫療法のための興味深い標的である
が、完全に腫瘍特異的ではなく又は正常なタンパク質に密接に関連し、そしてこ
れ故、一旦、強力な免疫応答により標的化されると、それらに臓器特異的自己免
疫のリスクを負わせる。
【０００６】 非決定的臓器に対する自己免疫応答が許容されうるとき、心臓、腸、その他の
決定的な臓器に対する自己免疫は、受け入れがたい安全特性を導くことができる
であろう。いくつかの先に同定された前立腺特異的タンパク質、例えば、前立腺
特異的抗原（ＰＳＡ）及び前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的
膜抗原（ＰＳＭＡ）、及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）は、限定された治療能
力をもち、そしてさらに、前立腺癌の存在と又は転移のレベルと常に相関するの
ではない（Pound C., Partin A., Eisenberg M. et al.“Natural History of P
rogression after PSA Elevation following Radical Prostatectomy”In Jama
(1999); 281 : 1591-1597)(Bostwick D., Pacelli A., Blute M. et al.“Prost
ate Specific Membrane Antigen Expression in Prostatic Intraepithelial Ne
oplasia and Adenocarcinoma.”In Cancer (1998); 82 : 2256-2261）。
【０００７】 腫瘍拒絶のメカニズムの存在が、数十年前から認められてきた。腫瘍抗原は、
その生物のゲノムによりコードされており、そしてそれ故、免疫寛容現象を通じ
て免疫系により理論的に認識されないけれども、時として、癌患者において検出
されうる免疫応答を引き起こすことができる。これは、腫瘍により発現された抗
原に対する抗体又はＴ細胞応答により証明されている（Xue BH., Zhang Y., Sos
man J. et al.“Induction of Human Cytotoxic T-Lymphocytes Specific for P
rostate-Specific Antigen.”In Prostate (1997); 30 (2) : 73-78)。比較的弱
い抗腫瘍効果が、腫瘍細胞の細胞表面マーカーを認識する抗体の投与を通じて観
察されることができるとき、腫瘍細胞により発現された抗原に対する強いＴ細胞
応答の誘導が、動物モデル（主にネズミ）において樹立された腫瘍の完全な退行
を導くことができる。
【０００８】 現在、細胞による腫瘍抗原の発現は、上記抗原に対する免疫応答の誘導（ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ）のために十分なものではないと認められている。腫瘍拒絶応答
の開始は、一連の活性化シグナルのデリバリーに責任を負う、抗原提示細胞の介
在に依存して、一連の免疫増幅現象を要求する。
【０００９】 プロスターゼは、保存されたセリン・プロテアーゼ触媒トリアッドＨ−Ｄ−Ｓ
と、潜在的な分泌機能を示す、アミノ末端プレ−プロペプチド配列をもつ、長さ
２５４アミノ酸の前立腺特異的プロテアーゼ（トリプシン様）である（P. Nelso
n, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand,“Molecul
ar cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serin
e protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci
. USA (1999) 96, 3114-3119）。推定グリコシル化部位が記載されている。予想
される構造は、他の知られたセリン・プロテアーゼと酷似し、その成熟ポリペプ
チドが単一ドメインに折り畳まれていることを示している。その成熟タンパク質
は、長さ２２４アミノ酸であり、１のＡ２エピトープが自然にプロセスされるこ
とが示されている。
【００１０】 プロスターゼ・ヌクレオチド配列、及び演繹ポリペプチド配列及び同族体が、
Ferguson, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119）及び国
際特許出願第ＷＯ９８／１２３０２号（そしてまた対応の付与された特許第ＵＳ
５，９５５，３０６号）、ＷＯ９８／２０１１７（そしてまた対応の付与され
た特許第ＵＳ ５，８４０，８７１号、及び同ＵＳ ５，７８６，１４８号）（
前立腺特異的カリクレイン）、及びＷＯ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）中に開
示されている。
【００１１】 本発明は、プロスターゼ・タンパク質並びにその断片及び同族体（“誘導体”
）に基づくプロスターゼ・タンパク質融合物を提供する。このような誘導体は、
前立腺腫瘍の治療のために好適である治療用ワクチン配合品における使用のため
に好適である。
【００１２】 本発明のプロスターゼ断片は、配列番号７又は配列番号８に示すアミノ酸配列
から選ばれる、少なくとも約１０の、好ましくは約２０の、より好ましくは約５
０の、より好ましくは約１００の、より好ましくは約１５０の連続アミノ酸から
成るであろう。より特に、断片は、配列番号７又は配列番号８に示すより大きな
分子の、いくつかの機能特性、好ましくは免疫学的活性を保持するであろうし、
そして本明細書中に記載する方法において、（例えば、ワクチン製剤中、診断薬
中、その他の中で）有用である。特に、上記断片は、配列番号７又は配列番号８
のタンパク質を認識するであろう、担体に好適に付着されるとき、免疫応答を生
成することができるであろう。
【００１３】 プロスターゼ同族体は、配列番号７又は配列番号８の長さ全体にわたり配列番
号７又は配列番号８の配列に対し、一般に、実質的な配列類似性を共有するであ
ろうし、そして少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、より好ま
しくは少なくとも９０％の、さらにより好ましくは少なくとも９５％の、最も好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリ
ペプチドを含むであろう。このようなポリペプチドは、配列番号７又は配列番号
８のアミノ酸を含むものを含む。
【００１４】 プロスターゼ抗原誘導体又はその断片及び同族体は、好ましい態様において、
そのプロテアーゼの生物学的活性を実質的に低下させ又は好ましくは除去するた
めに、上記タンパク質の活性部位内に突然変異を担持することができる。好まし
い突然変異は、そのセリン・プロテアーゼのヒスチジン及びアスパラギン酸触媒
残基の置換を含む。好ましい態様においては、プロスターゼは、Ｐ７０３ＰＤＥ
５配列（配列番号８）のアミノ酸４３に対応する、プロスターゼ配列の残基７１
におけるヒスチジン・アラニン突然変異を含む（Ferguson, et al. (Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119）。突然変異されたタンパク質は、好ま
しくは、突然変異されていないものに比較して、上記タンパク質の（酵素比活性
において表される）触媒効率における有意な低下をもつ。好ましくは、この触媒
効率における低下は、少なくとも、１０3 の換算係数、より好ましくは少なくと
も１０6 の換算係数である。ヒスチジン・アラニン突然変異を経験したタンパク
質を、以下、* （星印）という。
【００１５】 １の態様においては、本発明は、腫瘍関連プロスターゼ又はその断片又は同族
体、及び融合パートナーとして働く異種タンパク質又はタンパク質の部分を含む
、融合タンパク質に関する。上記タンパク質と融合パートナーは、化学的結合さ
れることができるが、好ましくは、異種発現系において組換え融合タンパク質と
して発現される。
【００１６】 本発明の好ましい態様においては、Ｔヘルパー・エピトープの提示を助けるこ
とができる免疫学的融合パートナーに結合された、プロスターゼ融合タンパク質
又はその断片又は同族体が提供される。従って、この融合パートナーは、外来タ
ンパク質又はペプチドに特異的な多数のＴ細胞による活性化シグナルの分泌に関
連した傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）ヘルパー効果を通じて、働くことができ、
それにより、融合されていないタンパク質に比較して、上記プロスターゼ成分に
対する免疫の誘導を高める。好ましくは、異種パートナーは、大多数のヒトにお
いてＴ細胞により認識されることができるように選ばれる。
【００１７】 他の態様においては、本発明は、発現エンハンサーとして作用する融合パート
ナーに結合された、プロスターゼ・タンパク質又はその断片又は同族体を提供す
る。従って、この融合パートナーは、異種系におけるプロスターゼの発現を助け
、天然の組換えタンパク質に比較して、発現系内で高いレベルが生産されること
を可能にする。
【００１８】 好ましくは、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現エンハンサー
・パートナーの両者であるであろう。したがって、本発明は、この態様において
、融合パートナーに結合された腫瘍特異的プロスターゼ又はその断片を含む融合
タンパク質を提供する。好ましくは、上記融合パートナーは、免疫学的融合パー
トナーと発現エンハンサー・パートナーの両者として働いている。したがって、
本発明の好ましい形態においては、上記融合パートナーは、インフルエンザ・ウ
ィルスからの非構造タンパク質、ＮＳ１（ヘマグルチニン）、又はその断片であ
る。典型的には、Ｎ末端の８１アミノ酸が使用される。但し、それらがＴヘルパ
ー・エピトープを含む限り、異なる断片を使用することができる（C. Hackett,
D. Horowitz, M. Wysocka & S. Dillon, 1992, J. Gen. Virology, 73, 1339-13
43）。ＮＳ１が上記免疫学的融合パートナーであるとき、それは、それがより高
い発現収率を達成ならしめるという点で、さらなる利点をもつ。特に、このよう
な融合物は、天然の組換えプロスターゼ・タンパク質よりも高い収率で発現され
る。
【００１９】 好ましい態様においては、上記融合物内のプロスターゼ成分は、配列番号５（
Millenium WO98/12302）、配列番号６（Incyte WO98/20117)、配列番号７（PNAS
(1999) 96, 3114-3119)、及び配列番号８（Corixa WO00/04149, P703PDE5 配列
）を含む群から選ばれる。さらに、最も好ましい態様においては、上記融合タン
パク質は、配列番号１又は配列番号３に示すように、突然変異されたプロスター
ゼから５〜２２６カルボキシ末端アミノ酸に融合された、ＮＳ１非構造タンパク
質のＮ−末端の８１アミノ酸を含む。
【００２０】 本発明のタンパク質は、適当な宿主細胞、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）内で発現される。好ましい態様においては、上記タンパク質は、アフィニティ
ー・タグ、例えば、５〜９の、そして好ましくは、６の、最も好ましくは少なく
とも４つのヒスチジン残基を含むヒスチジン尾をもって発現される。これらは、
例えば、イオン金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を通して
の精製を助けるために有利である。
【００２１】 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸をも提供する。このような配
列は、好適な発現ベクター内に挿入され、そしてＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種の
ために使用され又は好適な宿主内で発現されることができる。さらなる態様にお
いては、本発明のポリヌクレオチドの中の１以上を含む遺伝子構築物が、インビ
ボにおいて細胞内に導入される。これは、さまざまな又は周知のアプローチのい
ずれかを用いて達成されうる。１以上の核酸配列のインビボにおけるデリバリー
のための好ましい方法の中の１は、発現ベクター、例えば、組換え生ウィルス又
はバクテリア微生物の使用を含む。好適なウィルス発現ベクターは、例えば、ポ
ックスウィルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア・ポックス）、アルファ
ウィルス（シンドビス・ウィルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓ
ｔ）ウィルス、ベネズエラ・ウマ脳炎ウィルス）、アデノウィルス、アデノ関連
ウィルス、ピコルナウィルス（ポリオウィルス、ライノウィルス）、及びヘルペ
スウィルス（水疱瘡ウィルス、等）である。１以上の核酸配列のインビボにおけ
るデリバリーのための他の好ましい方法は、バクテリア発現ベクター、例えば、
リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ、赤痢菌、及びＢＣＧの使用を含
む。上記生きたベクターによる接種及びインビボにおける感染は、上記抗原のイ
ンビボにおける発現、及び免疫応答の誘導を導くであろう。上記ウィルスとバク
テリアは、有害であることができ、又は生ワクチンを得るためにさまざまな方法
で減弱されることができる。このような生ワクチンも本発明の部分を形成する。
【００２２】 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、標準的なＤＮＡ合成技術を用
いて、例えば、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098中にD.M. Roberts et al. に
より記載されたような酵素によるライゲーションにより、化学的合成により、イ
ンビトロにおける酵素による重合により、又は例えば、耐熱性ポリメラーゼを利
用したＰＣＲ技術により、又は上記技術を組合せたものにより、合成されうる。
ＤＮＡの酵素による重合は、インビトロにおいて、一般に、５０μｌ以下の容量
で、１０〜３７℃の温度において、適宜、ヌクレオシド３リン酸、ｄＡＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを含有する適当なバッファー中、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて、行われ
ることができる。ＤＮＡ断片の酵素によるライゲーションは、一般に、５０ml以
下の容量で、４℃〜周囲温度において、適当なバッファー、例えば、０．０５Ｍ
Ｔｒｉｓ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍジチオトレイト
ール、１mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ、及び０．１mg／mlウシ血清アルブミン
中、ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４リガーゼを用いて行われることができる。上
記ＤＮＡポリマー又は断片の化学的合成は、固相技術、例えば、“Chemical and
Enzymatic Systems of Gene Fragments - A Laboratory Manual”(ed. H.G. Ga
ssen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982）、又は他の科学刊行物、
例えば、M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titma
s, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth
, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers
, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers,
Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams e
t al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Si
nha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 19
84, 12, 4539；及びH.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801 中に
記載された技術を用いて、慣用のホスホトリエステル、ホスフィット又はホスホ
ルアミジット化学により、行われることができる。
【００２３】 本発明のさらなる態様においては、本明細書中に記載する、タンパク質の製法
が提供される。本発明に係る方法は、例えば、Maniatis et al., Molecular Clo
ning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989 中に記載された
ような慣用の組換え技術により行われることができる。
【００２４】 特に、本発明に係る方法は、好ましくは、以下のステップ： ｉ）上記タンパク質又はその免疫学的誘導体をコードするヌクレオチド配列を
含むＤＮＡポリマーを、宿主細胞内で、発現することができる、複製可能な又は
組込み性発現ベクターを調製し； ii）上記ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換させ； iii)上記ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下で上記の形質転換された宿主
細胞を培養して、上記タンパク質を製造し；そして iv）上記タンパク質を回収する、 を含むことができる。
【００２５】 用語「形質転換する」とは、本明細書中、宿主細胞内への外来ＤＮＡの導入を
意味するために使用される。これは、例えば、Genetic Engineering; Eds. S.M.
Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford,
England, 1988 中に記載されたような慣用技術を用いて、例えば、適当なプラス
ミド又はウィルス・ベクターによる、形質転換、トランスフェクション又は感染
により、達成されることができる。用語「形質転換された」又は「形質転換体」
は、以下、着目の外来遺伝子を含有し、かつ、発現する、得られた宿主細胞に適
用されるであろう。好ましくは、本発明の組換え抗原は、単細胞宿主内、最も好
ましくはバクテリア系内で、最も好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で、発現
される。
【００２６】 好ましくは、上記組換え戦略は、ＮＳ１融合タンパク質をコードする遺伝子構
築物（着目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合されたＮＳ１をコードす
るＤＮＡを、５′から３′までの方向で、含む）を、発現ベクター内にクローニ
ングして、ＮＳ１−カルボキシル末端Ｐ７０３融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ断片を形成することを含む。アフィニティー・ポリヒスチジン尾を、上記融合
タンパク質のカルボキシ末端に遺伝子操作により設けて、アフィニティー・クロ
マトグラフィーを通じての簡単な精製を可能にする。
【００２７】 上記発現ベクターは、新規であり、そしてまた本発明の部分を形成する。
【００２８】 上記複製可能な発現ベクターを、上記宿主細胞に適合性であるベクターを解裂
させて、無傷のレプリコンをもつ線状ＤＮＡセグメントを提供し、そしてその線
状セグメントを、１以上のＤＮＡ分子であってその線状セグメントと一緒になっ
て所望の産物、例えば、本発明に係るタンパク質又はその誘導体をコードするＤ
ＮＡポリマーを、ライゲーション条件下で、併合することにより、本発明に従っ
て、調製されうる。
【００２９】 したがって、上記ハイブリッドＤＮＡは、所望により、事前に形成され、又は
上記ベクターの構築の間に、形成されることができる。
【００３０】 ベクターの選択は、一部、宿主細胞により決定され、その宿主細胞は、原核生
物又は真核生物であることができるが、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵
母又はＣＨＯ細胞でありうる。好適なベクターは、プラスミド、バクテリオファ
ージ、コスミド、及び組換えウィルスを含む。発現ベクター及びクローニング・
ベクターは、好ましくは、そのマーカーを発現する宿主細胞だけが選択条件下で
生存するであろうような選択マーカーを含む。選択遺伝子は、非限定的に、アン
ピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク
質をコードするものを含む。発現ベクターは、指示された宿主と適合性である制
御配列をも含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのための、そしてより一般的には原核生
物のための発現制御配列は、プロモーター及びリボソーム結合部位を含む。プロ
モーター配列は、天然の、例えば、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）（Weis
sman 1981, In Interferon 3 (ed. L. Gresser）、ラクトース（ｌａｃ）（Chan
g et al. Nature, 1977, 198 : 1056)、及びトリプトファン（ｔｒｐ）（Goedde
l et al. Nucl. Acids. 1980, 8, 4057)、及びラムダ由来ＰL プロモーター系で
あることができる。さらに、天然にない合成プロモーターも、バクテリア・プロ
モーターとして働く。
【００３１】 例えば、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーターの配列から得られたｔａｃ合成ハイブ
リッド・プロモーターに関して、そうである（De Boer et al., Proc. Natl Aca
d Sci. USA 1983, 80, 21-26）。上記システムは、Ｅ．ｃｏｌｉとともに特に好
適である。
【００３２】 酵母適合性ベクターも、栄養要求性突然変異体に原栄養性を、又は野生型株に
重金属耐性を付与することにより、首尾よい形質転換体の選択を許容するマーカ
ーを担持する。酵母ベクターのための制御配列は、解糖酵素のためのプロモータ
ー（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7, 149)、酸性ホスファターゼを
コードするＰＨＯ５遺伝子、ＣＵＰ１遺伝子、ＡＲＧ３遺伝子、ＧＡＬ遺伝子プ
ロモーター、及び合成プロモーター配列を含む。酵母内での発現において有用な
他の制御要素は、ターミネーター配列とリーダー配列である。リーダー配列は、
特に有用である。なぜなら、それは典型的には、上記細胞からのタンパク質の分
泌を指令する疎水性アミノ酸から作られたシグナル・ペプチドをコードするから
である。好適なシグナル配列は、分泌された酵母タンパク質のための遺伝子、例
えば、酵母インベルターゼ遺伝子及びα因子遺伝子、酸性ホスファターゼ、キラ
ー毒素、ａ−接合因子遺伝子、並びに最近には、クルイベロミセス・マルキシア
ナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）のＩＮＵ１Ａ遺伝子
から得られた異種イヌリナーゼ（ｉｎｕｌｉｎａｓｅ）シグナル配列により、コ
ードされることができる。好適なベクターが、ピシア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での発現のために開発されてきた。
【００３３】 さまざまな誘導プロモーター又は構成プロモーターに基づく、さまざまなＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターが利用可能である（Cereghino and Cregg, FEMS
Microbiol. Rev. 2000, 24 : 45-66）。細胞質タンパク質及び分泌タンパク質の
製造のためには、最も一般に使用されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターは、ひじ
ょうに強く、かつ、厳しく調節されたアルコール・オキシダーゼ（ＡＯＸ１）プ
ロモーターを含む。上記ベクターは、ｈｉｓ４宿主内に選択のためのＰ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓヒスチジノール・デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）遺伝子をも含む。外
来タンパク質の分泌は、シグナル配列の存在を要求し、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅプレプロ・アルファ接合因子リーダー配列は、Ｐｉｃｈｉａ発現系にお
いて広く、かつ、首尾よく使用されてきた。発現ベクターは、発現株の安定性を
最大化するために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム内に組み込まれる。Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ内でと同様に、宿主ゲノム（ＡＯＸ１又はＨＩＳ４）により共有
される配列内でのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターの解裂は、そのゲノム座へ
のそのベクターの組み込みを効率的に標的化する相同的組換え事件を刺激する。
一般に、発現カセットの多数の組み込みコピーを含む組換え株は、単一コピー株
よりも多量の異種タンパク質を産生することができる。高コピー数の形質転換体
を得るための最も有効な方法は、スフェロプラスト（ｓｐｈａｅｒｏｐｌａｓｔ
）技術によるＰｉｃｈｉａ受容体株の形質転換を要求する（Cregg et al. 1985,
Mol. Cell. Biol. 5 : 3376-3385)。
【００３４】 複製可能な発現ベクターの作製は、例えば、先に引用したManiatis et al. 中
に記載された手順により、上記ＤＮＡの制限、重合、及びライゲーションのため
に適当な酵素を用いて慣用的には、行われることができる。
【００３５】 組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下、宿主細胞を、本発明な
複製可能な発現ベクターにより形質転換することにより、作製される。好適な形
質転換条件は、慣用のものであり、例えば、先に引用した、Maniatis et al. 、
又は“DNA Cloning”Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985中に記載
されている。
【００３６】 形質転換条件の選択は、形質転換されるべき宿主細胞の選択に依存する。例え
ば、本発明のポリヌクレオチドのための形質転換剤として生ウィルス・ベクター
を使用するインビボ形質転換が、先に記載されている。宿主、例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのバクテリア形質転換は、ＣａＣｌ2 の溶液（Cohen et al., Proc. Nat. A
cad. Sci., 1973, 69, 2110)により、又は塩化ルビジウム（ＲｂＣｌ），ＭｎＣ
ｌ2 、酢酸カリウム、及びグリセロールの混合物を含む溶液により、そしてその
後、３−〔Ｎ−モルフォリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ、及びグリセ
ロールにより、宿主が処理された後の、（所望の配列を含む発現ベクターであり
うる）ポリヌクレオチドの直接的取り込みにより行われることができる。直接取
り込みによる培養における下等真核生物、例えば、酵母細胞の形質転換は、Hinn
en et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75 : 1929-1933）の方法を用いるこ
とにより行われることができる。培養における哺乳動物細胞は、その細胞上への
ベクターＤＮＡのリン酸カルシウム共沈を用いて形質転換されることができる（
Graham & Van der Eb, Virology 1978, 52, 546)。哺乳動物細胞内へのポリヌク
レオチドの導入のための他の方法は、デキストラン仲介トランスフェクション、
ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレー
ション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（単複）の封入、及び核内へのポリ
ヌクレオチドの直接的マイクロ−インジェクションを含む。
【００３７】 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸又は本発明の複製可能な発現
ベクターにより形質転換された宿主細胞にも延びる。
【００３８】 ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下で上記形質転換された宿主細胞を培養
することは、例えば、先に引用した、Maniatis et al. 、及び“ＤＮＡ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”中に記載されているように、慣用には、行われる。したがって、好ま
しくは、上記細胞は、栄養を供給され、そして５０℃未満の、好ましくは２５〜
３５℃の、最も好ましくは３０℃の温度で、培養される。培養時間は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ又はウェスタン・ブロットにより評価されるとき、バクテリア細胞内で
の上記ポリペプチドの割合に従って、数分〜数時間にわたり変化しうる。
【００３９】 産物は、宿主細胞に従って、及び発現産物の局在化（細胞内にあるか又は培養
基中に分泌されるか又は細胞周辺腔内にあるか）に従って、慣用の方法により回
収されることができる。したがって、宿主細胞がバクテリア、例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉである場合、それは、例えば、物理的、化学的又は酵素により溶解されるこ
とができ、そしてタンパク質産物は、その得られた溶解産物から単離される。宿
主細胞が哺乳動物である場合、その産物は、一般に、栄養培地から又は無細胞抽
出物から単離されることができる。その宿主細胞が酵母、例えば、サッカロミセ
ス・セレビシエ又はピシア・パストリスである場合、その産物は、一般に、溶解
された細胞から又はその培養基から単離されることができ、そしてその後、慣用
技術を用いてさらに精製されることができる。発現系の特異性は、着目のポリペ
プチドに対する抗体を使用するウェスタン・ブロットにより評価されることがで
きる。
【００４０】 慣用のタンパク質単離技術は、選択的沈降、吸着クロマトグラフィー、及びモ
ノクローナル抗体アフィニティー・カラムを含むアフィニティー・クロマトグラ
フィーを含む。本発明に係るタンパク質が、ヒスチジン尾（Ｈｉｓタグ）をもっ
て発現されるとき、それらは、イオン金属アフィニティー・クロマトグラフィー
・カラム（ＩＭＡＣ）のカラムを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーに
より容易に精製されることができる。
【００４１】 本発明の好ましい態様においては、本発明に係るタンパク質は、アフィニティ
ー・タグ、例えば、ポリヒスチジン尾（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｉｌ
）を提供される。このような場合、そのブロッキング・ステップ後のタンパク質
は、好ましくは、アフィニティー・クロマトグラフィーにかけられる。ポリヒス
チジン尾をもつようなタンパク質のためには、固定化された金属イオン・アフィ
ニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行うことができる。この金属イオ
ンは、いずれかの好適なイオン、例えば、亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム又
は銅であることができるが、好ましくは、亜鉛又はニッケルである。好ましくは
、ＩＭＡＣバッファーは、洗剤、好ましくは、非イオン洗剤、例えば、Ｔｗｅｅ
ｎ ８０（商標）、又は双性イオン洗剤、例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（商標
）を含む。なぜなら、これは、最終産物中のより低レベルの内毒素をもたらすこ
とができるからである。
【００４２】 さらなるクロマトグラフィー・ステップは、例えば、ＩＭＡＣカラム前又は後
のいずれかに操作されることができるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅステップを含む。
好ましくは、pHは、７．５〜１０の、より好ましくは７．５〜９．５の、最適に
は８〜９の間の範囲内に、理想的には８．５である。
【００４３】 本発明のタンパク質は、液体又は凍結乾燥形態で可溶性で提供されるが、後者
が好ましい形態である。一般に、各ヒト投与量は、１〜１０００μｇのタンパク
質、そして好ましくは３０〜３００μｇを含むであろう。
【００４４】 本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明に係るタンパク質を含む医
薬組成物をも提供する。好ましいワクチン組成物は、少なくともＮＳ１−Ｐ７０
３Ｐ* （配列番号１）又はＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ（配列番号３）を含む。上記タン
パク質は、好ましくは、ブロックされたチオール基をもち、そして高く精製され
、例えば、５％未満の宿主細胞汚染をもつ。このようなワクチンは、場合により
、１以上の他の腫瘍関連抗原及び誘導体を含むことができる。例えば、好適な他
の関連抗原は、ＰＡＰ−１，ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特
異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＳＴＥＡＰを含む。
【００４５】 ワクチンの調製は、一般に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant a
pproach”(eds. Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press New York）
中に記載されている。リポソーム内への封入は、Fullerton 、米国特許第４，２
３５，８７７号中に記載されている。
【００４６】 本発明に係るタンパク質は好ましくは、本発明のワクチン配合品中でアジュバ
ント化される。好適なアジュバントは、商業的に入手可能な、例えば、Freund's
Incomplete Adjuvant及びComplete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit,
MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (Smit
hkline Beecham, Philadelphia, PA) ：アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミ
ニウム・ゲル（ａｌｕｍ）又はリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄又は亜鉛の
塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン又はアニオン誘導
体化された多糖；ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ）；生
分解性微小球；モノホスホリル・リピドＡ、及びクイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）であ
る。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２，−７、又
は−１２も、アジュバントとして使用されうる。
【００４７】 本発明の配合物においては、上記アジュバント組成物は、主にＴＨ１タイプの
免疫応答を誘導する。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ，
ＴＮＦα，ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞仲介免
疫応答の誘導を好む傾向がある。応答が主にＴｈ１型であるところの好ましい態
様においては、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベ
ルよりも大きな程度まで、増加するであろう。上記サイトカインのレベルは、標
準的なアッセイを用いて容易に評価されることができる。サイトカイン・ファミ
リーのレビューのためには、Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7 : 14
5-173, 1989 を参照のこと。
【００４８】 したがって、主要なＴｈ１型応答の顕出のために使用される好適なアジュバン
トは、例えば、アルミニウム塩と、モノホスホリル・リピドＡ、好ましくは、３
−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の組合せ物を含
む。ＴＨ１型免疫応答を主に誘導する他の知られたアジュバントは、ＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチド
がメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは周
知であり、そして、例えば、ＷＯ９６／０２５５５中に記載されている。免疫刺
激性ＤＮＡ配列も、例えば、Sato et al., Science 273 : 352, 1996により記載
されている。他の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Aq
uila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）であり、これは、単独で又は
他のアジュバントとともに使用されることができる。例えば、増強されたシステ
ムは、モノホスホリル・リピドＡとサポニン誘導体の組合せ物、例えば、ＷＯ９
４／００１５３中に記載されたようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ物、又は
ＷＯ９６／３３７３９中に記載されたような、ＱＳ２１がコレステロールにより
クエンチされているようなより反応原性の低い組成物を含む。他の好ましい配合
品は、油／水エマルジョン、及びトコフェロールを含む。油／水エマルジョン中
に、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ、及びトコフェロールを含む特に強力なアジュバン
ト配合品は、ＷＯ９５／１７２１０中に記載されている。
【００４９】 油／水エマルジョン中にＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ、及びトコフェロールを含む
特に強力なアジュバント配合品は、ＷＯ９５／１７２１０中に記載されており、
そして好ましい配合品である。
【００５０】 他の好ましいアジュバントは、Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (C
hiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Detox (
Ribi, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT)、その他のアミノアルキ
ル・グルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰｓ）を含む。
【００５１】 他の好ましいアジュバントは、以下の一般式（Ｉ）： ＨＯ（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ａ−Ｒ ｛式中、ｎが１〜５０であり、Ａが結合又は−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲがＣ1-50ア
ルキル又はフェニルＣ1-50アルキルである。｝により表されるアジュバント分子
を含む。
【００５２】 本発明の１の態様は、式中、ｎが１〜５０であり、好ましくは４〜２４であり
、最も好ましくは９であり；Ｒ成分がＣ1-50、好ましくはＣ4-20アルキル、そし
て最も好ましくはＣ14アルキルであり、そしてＡが結合である、一般式（Ｉ）の
ポリオキシエチレン・エーテルを含むワクチン配合物から成る。ポリオキシエチ
レン・エーテルの濃度は、０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％の、そし
て最も好ましくは０．１〜１％の範囲内にあるべきである。好ましいポリオキシ
エチレン・エーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリル・エーテ
ル、ポリオキシエチレン−９−ステオリル・エーテル、ポリオキシエチレン−８
−ステオリル・エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリル・エーテル、ポリ
オキシエチレン−３５−ラウリル・エーテル、及びポリオキシエチレン−２３−
ラウリル・エーテルから選ばれる。ポリオキシエチレン・エーテル、例えば、ポ
リオキシエチレン・ラウリル・エーテルは、Merck index (12th edition : entr
y 7717）中に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５
４９中に記載されている。
【００５３】 上記一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレン・エーテルは、所望により、他の
アジュバントと併合されることができる。例えば、好ましいアジュバント組合せ
物は、好ましくは、係属中のＵＫ特許出願ＧＢ９８２０９５６．２中に記載され
ているようなＣｐＧとのものである。
【００５４】 したがって本発明の１の態様においては、本発明に係るタンパク質より好まし
くは、油／水エマルジョン中、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体、ＱＳ
２１、及びトコフェロールによりアジュバント化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* が
提供される。
【００５５】 好ましくは、上記ワクチンは、さらに、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を
含む。他の特定の好適なアジュバント配合品であってＣｐＧとサポニンを含むも
のが、ＷＯ００／０９１５９中に記載されており、そして好ましい配合品である
。より好ましくは、その特定の配合品中のサポニンは、ＱＳ２１である。好まし
くは、上記配合品は、さらに、油／水エマルジョン、及びトコフェロールを含む
。
【００５６】 さまざまなデリバリー媒質のいずれかが、腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免
疫応答の生成を容易にするために、医薬組成物及びワクチン中に使用されうる。
デリバリー媒質は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、例えば、樹状細胞、マクロファ
ージ、Ｂ細胞、単球、その他の細胞であって効率的なＡＰＣｓであるように遺伝
子操作されることができるものを含む。このような細胞は、抗原を提示するため
のその能力を高め、Ｔ細胞応答の活性化及び／又は維持を改善し、抗腫瘍効果自
体をもち、そして／又は受容者と免疫学的に適合性とする（すなわち、適合した
ＨＬＡルプロタイプ）ように、遺伝子修飾されることができるが、そうされる必
要はない。ＡＰＣｓは、一般に、腫瘍、及び腫瘍周囲組織を含む、さまざまな生
物学的液体及び臓器の中のいずれかから単離されることができ、そして自己、同
種、同系、又は異種細胞であることができる。
【００５７】 本発明の特定の好ましい態様は、抗原提示細胞として樹状細胞又は前駆細胞を
使用する。樹状細胞は、高く強力なＡＰＣｓであり（Banchereau and Steinman,
Nature 392 : 245-251, 1998)、そして予防又は治療用抗腫瘍免疫を顕出するた
めの生理学的アジュバントとして有効であると示されている（Timmerman and Le
vy, Ann. Rev. Med. 50 : 507-529, 1999 参照）。一般に、樹状細胞は、それら
の典型的な形状（インビトロにおいて見られる顕著な細胞質プロセス（樹状突起
）をもって、その場で、星状である）、高い効率をもって抗原を取り込み、プロ
セスし、そして提示するそれらの能力、並びに未処理Ｔ細胞応答を活性化させる
それらの能力に基づき、同定されることができる。もちろん、樹状細胞は、イン
・ビボ又はエクス・ビボにおいて樹状細胞上に一般に見られない、特異的細胞表
面レセプター又はリガンドを発現するように遺伝子操作されることができ、そし
てこのように修飾された樹状細胞も本発明により企画される。樹状細胞の代替物
として、分泌小胞抗原がロードされた樹状細胞（エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ
ｓ）といわれる）が、ワクチン中で使用されうる（Zitvogel et al., Nature Me
d. 4 : 594-600, 1998参照）。
【００５８】 樹状細胞及び前駆細胞は、末梢血液、骨髄、腫瘍浸潤性細胞、腫瘍周囲組織浸
潤性細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血又はいずれかの他の好適な組織又は液
体から得られうる。例えば、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）は、
サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４，ＩＬ−３、及び／又はＴＮＦ
αの組合せ物を、末梢血から収獲した単球の培養物に添加することにより、エク
ス・ビボにおいて分化されうる。あるいは、末梢血、臍帯血又は骨髄から収獲さ
れたＣＤ３４陽性細胞を、その培養基に、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３，ＴＮＦα，
ＣＤ４０リガンド、リポ多糖ＬＰＳ，ｆｌｔ３リガンド、及び／又は他の化合物
であって樹状細胞の分化、成熟及び増殖を誘導する化合物の組合せ物を、添加す
ることにより、樹状細胞に分化させることができる。
【００５９】 樹状細胞は、便利には、“未熟”細胞と“成熟”細胞として分類され、これは
、２つの十分に特徴付けされた表現型の間を区別する簡単な方法を与える。しか
しながら、この命名法は、分化の可能な中間段階の全てを排除すると解釈されて
はならない。未熟樹状細胞は、抗原の取り込みとプロセッシングに関する高い能
力をもつＡＰＣとして特徴付けられ、これは、Ｆｃγレセプターとマンノース・
レセプターの高い発現を相関する。成熟表現型は、典型的には、上記マーカーの
低い発現を特徴とするが、Ｔ細胞活性化に責任を負う細胞表面分子、例えば、ク
ラスＩ及びクラスII ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４とＣＤ１１）、及び
共同刺激性分子（例えば、ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６、及び４−１ＢＢ）の
高い発現を特徴とする。
【００６０】 ＡＰＣｓは、プロスターゼ腫瘍ポリペプチド、又はその免疫原性部分がその細
胞表面上で発現されるように、プロスターゼ腫瘍タンパク質（又はその誘導体）
をコードするポリヌクレオチドにより、一般に、トランスフェクトされることが
できる。このようなトランスフェクションは、エクス・ビボにおいて生じること
ができ、そしてこのようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物又はワクチ
ンは、その後、本明細書中に記載するように、治療、目的のために使用されるこ
とができる。あるいは、樹状又は他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子デリバリ
ー媒体が、患者に投与され、インビボにおいて生じるトランスフェクションをも
たらすことができる。例えば、樹状細胞のインビボ及びエクスビボにおけるトラ
ンスフェクションは、一般に、本分野において知られたいずれかの方法、例えば
、ＷＯ９７／２４４４７中に記載されたもの、又はMahvi et al., Immunology a
nd cell Biology 75 : 456-460, 1997により記載された遺伝子銃アプローチを用
いて、行われることができる。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞又は前
駆細胞を、プロスターゼ腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸又はプラスミド・ベクタ
ー内）又はＲＮＡ；抗原を発現している組換えバクテリア又はウィルス（例えば
、ワクシニア、伝染性上皮腫（ｆｏｗｌｐｏｘ）、アデノウィルス又はレンチウ
ィルス・ベクター）とともに、インキュベートすることにより達成されることが
できる。
【００６１】 ワクチン及び医薬組成物は、単位投与の又は多投与の容器、例えば、密封され
たアンプル又はバイアル内で提供されることができる。このような容器は、好ま
しくは、使用まで、その配合品の無菌性を保つために、気密シールされる。一般
に、配合品は、油／水性媒質中の、懸濁液、溶液又はエマルジョンとして保存さ
れることができる。あるいは、ワクチン又は医薬組成物は、使用直前の滅菌液体
担体の添加だけを要求する凍結乾燥条件下で保存されうる。
【００６２】 本発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば、３Ｄ−ＭＰＬと、本発明に
係るタンパク質を混合することを含む、ワクチン製剤の製法をも提供する。
【００６３】 本発明の他の局面は、前立腺癌又は他のプロスターゼ関連腫瘍を患う患者を免
疫療法により治療するためのワクチンの製造のための、本明細書中に請求するタ
ンパク質又は核酸の使用である。
【００６４】 本発明を、以下の実施例を参照しながらこれからさらに説明する： 実施例Ｉ： 融合タンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −３−Ｈｉｓを発現する組換えＥ．ｃｏ ｌｉ株の作製 １．−タンパク質デザイン 上記候補のために従った発現戦略は、良い発現レベルと容易な精製プロセスの
両者のための最良の予測をもつことができるであろう組換えタンパク質のための
最も適切な一次構造の設計を含んでいた。
【００６５】 上記組換えタンパク質がワクチン接種のために配合されるときそのプロテアー
ゼ生物学的活性を保持することができるチャンスは実際には、ひじょうに低いけ
れども、その活性サイドの突然変異を、そのタンパク質分解生物学的活性を実質
的に低下させ又は好ましくは除去するために行った。したがって、配列番号８の
４３位にあるＨｉｓ残基は、Ａｌａ残基に突然変異された。
【００６６】 Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現されるべき融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３* −Ｈｉｓ
のデザインを、図１に記載する。この融合物は、インフルエンザ・ウィルスの非
構造タンパク質のＮ−末端（８１アミノ酸）、その後、前立腺抗原の非プロセス
・アミノ酸配列（上記プロテアーゼ活性部位の４３残基の突然変異Ｈｉｓ→Ａｌ
ａを含む配列番号８に記載するｐ７０３ｐｄｅ５配列のアミノ酸５→２２６）、
その後、Ｈｉｓ尾を含む。このヒスチジン尾は、上記融合及びプロセスされたタ
ンパク質の融通のきく精製を可能にするためにプロスターゼに付加された。
【００６７】 得られたタンパク質の一次構造は、図２に記載された配列をもつ。上記タンパ
ク質に対応するコーディング配列は図３に説明されており、そしてＥ．ｃｏｌｉ
発現プラスミド内のλｐＬプロモーターの制御下にその後に置かれた。
【００６８】 ２．Ｅ．ｃｏｌｉ発現系 ＮＳ１の製造のために、ＮＳ１（インフルエンザ・ウィルスからの非構造タン
パク質）の８１アミノ末端残基をコードするＤＮＡを、発現ベクターｐＭＧ８１
内にクローン化した。このプラスミドは、挿入された外来遺伝子の転写及び翻訳
を駆動するために、ラムダ・ファージＤＮＡからのシグナルを使用する。このベ
クターは、Ｎタンパク質が提供されるときの転写極性効果を軽減するために、ラ
ムダＰＬ、プロモーターＰＬ、オペレーターＯＬ、及び２つの利用部位（ｕｔｉ
ｌｉｓａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）（ＮｕｔＬ及びＮｕｔＲ）を含む（Gross et a
l., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5 : 1015）。ＰＬプロモーターを含むベクター
を、Ｅ．ｃｏｌｉ溶原性宿主内に導入して、プラスミドＤＮＡを安定化させる。
溶原性宿主株は、ゲノム内に組み込まれた複製欠陥ラムダ・ファージＤＮＡを含
む（Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expressi
on. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NY）。ラムダ・ファージＤＮＡは、
上記ベクターのＯＬレプレッサーに結合するｃＩレプレッサー・タンパク質の合
成を指令し、そしてＰＬプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を防止し、
そしてそれにより、挿入された遺伝子の転写を防止する。発現株ＡＲ５８のｃＩ
遺伝子は、ＰＬにより指令された転写が温度シフトにより調節されることができ
るような、温度感受性突然変異を含む。すなわち、培養温度の上昇はレプレッサ
ーを失活させ、そして外来遺伝子の導入が開始される。この発現系は、外来タン
パク質の、特に、上記細胞に対し毒性であることができるものの制御された合成
を可能にする（Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292 : 128）。
【００６９】 ３．Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＲ５８： ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓタンパク質の製造のために使用されるＡＲ５８
溶原性Ｅ．ｃｏｌｉ株は、標準的なＮＩＨ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株Ｎ９９の誘
導体（Ｆ−ｓｕ−ｇａｌｋ２，ｌａｃＺ−ｔｈｒ- ）である。それは、欠陥溶原
性ラムダ・ファージ（ｇａｌＥ：：ＴＮ１０，１ｋｉｌ−ｃＩ８５７ ＤＨ１）
を含む。このｋｉｌ−表現型は、宿主の巨大分子合成の遮断（ｓｈｕｔ ｏｆｆ
）を防止する。ｃＩ８５７突然変異は、上記ｃＩレプレッサーに温度感受性病変
を付与する。ＤＨ１欠失は、ラムダ・ファージの右オペロンと、宿主のｂｉｏ，
ｕｖｒ３、及びｃｈｌＡ座を除去する。ＡＲ５８株は、ＳＡ５００誘導体（ｇａ
ｌＥ：：ＴＮ１０，１ｋｉｌ−ｃＩ８５７ ＤＨ１）上で前もって増殖させたＰ
ラムダ・ファージによる、Ｎ９９の形質導入により生成された。Ｎ９９内への欠
陥溶原体（ｌｙｓｏｇｅｎ）の導入は、隣接ｇａｌＥ遺伝子内のテトラサイクリ
ン耐性をコードするＴＮ１０トランスポゾンの存在のために、テトラサイクリン
により選択された。Ｎ９９とＳＡ５００は、the National Institutes of Healt
h のDr. Martin Rosenbergの実験室から得られたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株である
。
【００７０】 ４．組換えタンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓを発現するように設計さ
れたベクターの構築 出発材料は： １）ＣＯＲＩＸＡ ｐ７０３ｐｄｅ５（ＷＯ００／０４１４９）から受け取っ
たｃＤＮＡ、ここで、その推定シグナル配列、及びＰ７０３Ｐのプロ−ペプチド
の一片が欠落しており（図１参照）、そしてプロスターゼ抗原のためのコーディ
ング配列を含んでいる； ２）ＰＬプロモーターの長バージョンを含むベクターｐＲＩＴ１４９０１；及
び ３）インフルエンザ・ウィルスからのＮＳ1 コーディング領域を含むプラスミ
ドＰＭＧ８１、 であった。
【００７１】 図４に概説したクローニング戦略は、以下のステップを含んでいた： ａ）ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位をもつｐ７０３配列のＰＣＲ増幅 ａ）ＰＣＲ反応のためのテンプレートは、ＣＯＲＩＸＡから受け取ったｃＤＮ
Ａプラスミドであり、オリゴヌクレオチド・センスｃａｎ１３９：５′ＧＣＧ
ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＣＧ
３′、及びオリゴヌクレオチド・アンチセンスｃａｎ１３４：５′ＧＧＧ ＡＣ
Ｔ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ３′
であった； ｂ）商業的ベクターＬｉｔｍｕｓ ２８（ｂｉｏｌａｂｓ）内への上記増幅さ
れた配列の挿入、これは中間体プラスミドｐＲＩＴ １４９４９を導く； ｃ）センス・オリゴヌクレオチドｃａｎ１４０：５′ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＣＣ
ＧＣＡ ＧＣＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ３′、及びアンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドｃａｎ１４１：５′ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＧＣ ＴＧＣ Ｇ
ＧＣ ＴＧＡ ＣＡＧ ３′を用いた、プラスミドｐＲＩＴ １４９４９内に含
まれたｐ７０３配列の残基４３の、指令されたＨｉｓ→Ａｌａ突然変異誘発、こ
れは、プラスミドｐＲＩＴ １４９５０の獲得を導く； ｄ）上記プラスミドｐＲＩＴ １４９５０からのＮｃｏＩ−ＳｐｅＩ断片の単
離； ｅ）ｐＭＧ８１プラスミドからの、制限部位ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩの消化後の
ＮＳ１断片（８１ａａ）の精製； ｆ）両断片のライゲーションを、発現プラスミドｐＲＩＴ １４９０１（ｐｒ
ＰＬ ｌｏｎｇ）にライゲートした； ｇ）ＮＳ１−ｐ７０３突然変異−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミド
ｐＲＩＴ １４９５２（図５参照）を含むＥ．ｃｏｌｉ ＡＲ５８株形質転換体
の選択及び特徴付け。
【００７２】 このように上記組換え株は、番号１に記載された３１３アミノ酸残基長をもつ
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* Ｈｉｓ尾付き融合タンパク質を産生し、そのアミノ酸配列
を番号１に、そしてそのコーディング配列を番号２に記載する。
【００７３】 実施例II： 組換えＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −３−Ｈｉｓ融合タンパク質の製造 １．バクテリア株Ｂ１２２５の増殖及び導入−ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −３−Ｈ
ｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ １４９５２により形質転換されたＡＲ５８の細胞（株Ｂ
１２２５）を、硫酸カナマイシン（１００mg／Ｌ）を補った４００mlのＦＥＣ０
１５ＡＡ培地を含む２Ｌフラスコ内で培養した。３０℃、及び２００rpm で１６
時間インキュベートした後、少量のサンプルを、顕微鏡検査のために上記フラス
コから取り出した。
【００７４】 ５０mlの上記プレ−カルチャーを、硫酸カナマイシン（５０mg／Ｌ）を補った
ＦＥＣ０１２ＡＦ培地８．７Ｌを含む２０−Ｌ発酵槽内に移した。このpHを、Ｎ
Ｈ4 ＯＨ（２５％ｖ／ｖ）の添加により、調節し、そして６．８に維持し、そし
てその温度を３０℃に維持した。通気速度を、２０Ｌ／分で一定に保ち、そして
そのｐＯ2 を、その撹拌速度のフィード・バック制御により飽和の２０％に調節
した。ヘッド圧を、０．５バールに維持した。
【００７５】 フェッド−バッチ発酵プロセスは、炭素源としてグリセロールに基づく。供給
溶液を、０．０４ml／分の開始速度で添加し、そして２０％の最小ｐＯ2 レベル
を保つことができるように、その増殖速度を制限するために最初の３０時間、指
数関数的に増加させた。
【００７６】 ３０時間後、発酵槽の温度を、抗原ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓの細胞内発
現を誘導するために、３９．５℃まで、速やかに上昇させた。この供給速度を、
導入期の全体にわたり（１８時間）１．２８ml／分で一定に保った。
【００７７】 ブロスのサンプルを、バクテリアの増殖及び抗原の発現をモニターするために
、増殖期と導入期の両者の間に、採取した。微生物学的同定と純度試験も、上記
材料に基づいて実現した。
【００７８】 発酵の終わりに、そのバイオマスは、約１３０の光学密度に達し、これは、約
５０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量に対応する。最終容量は、約１０．５Ｌであった。上
記抗原を含有する細胞を、４℃で１時間５０００ｇでの遠心分離により、上記培
養基から直接分離し、そしてそのペレットを、−７０℃でプラスチック・バッグ
内で保存した。
【００７９】 ２．上記タンパク質の抽出： 封入体としてＥ．ｃｏｌｉ内で発現された組換えＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉ
ｓタンパク質を、異なるステップを用いて細胞ホモジェネートから精製した（図
６参照）。簡単に言えば、発酵収獲物からの凍結濃縮細胞を、１２０の最終光学
密度（ＯＤ６５０）まで、破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）バッファー（ホスフェ
ート２０mM−ＮａＣｌ ２Ｍ−ＥＤＴＡ ５mM pH７．５）中に再懸濁される前
に、＋４℃まで解凍した。高圧ホモジェナイザー（１０００バール）を２回通過
させることにより、上記細胞を破壊した。
【００８０】 実施例III： 融合タンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓの精製 ａ）導入 上述のように、組換えタンパク質、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓを、封入体
（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）の形態で、Ｅ．ｃｏｌｉ内で製造する。
上記精製方法のセット−アップのための主要な問題点は、おそらく、ジスルフィ
ド結合による共有結合を通じて、それ自体又は宿主細胞汚染物による、上記組換
えタンパク質の酸化であった。開発された方法は、着目の抗原に対する有効な免
疫応答を、載せるその生成物の能力を保存しながら、許容できる全体収率をもっ
て高く精製された生成物をもつために、過度の酸化現象を減少させることを目的
とした。
【００８１】 ｂ）上記方法の説明 破壊された細胞懸濁液を、０．４５μｍ膜を備えたＰａｌｌｓｅｐ ＶＭＦ（
Vibrating Membrane Filtration)システム（Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ）上で処
理した。上記“ペレット画分”を、まず、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ洗剤
を含有する２０mMホスフェート・バッファーpH７．５によるダイアフィルトレー
ションにより洗浄した。次に、洗浄された材料を、４Ｍ塩酸グアニジン及び２０
mMグルタチオンを含有する同一バッファー中で可溶化した。その生成物を、０．
４５μＭフィルターを通して回収し、そしてその透過物を、酸化的再カップリン
グを防止するために、２００mMのヨードアセトアミドで処理した。
【００８２】 カルボキシアミド化した画分を、ＩＭＡＣ（Nickel-Chelating-Sepharose FF,
Pharmacia）にかけた。上記カラムを、まず、４Ｍウレア、０．５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ８０、及び２０mMイミダゾールを含有する２０mM ＴｒｉｓバッファーpH７
．４で平衡化した。サンプルをロードした後、上記カラムを、同一バッファーで
洗浄した。次に、上記タンパク質を、４００mMイミダゾールにより、上記バッフ
ァー中で溶離させた。
【００８３】 アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、ＩＭＡＣ−溶離液の電気伝導
力を、４Ｍウレアと０．５〜１．０％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する２０mM Ｔ
ｒｉｓバッファーpH８．５を用いて５mS／cm未満に低下させた。充填床の支持体
（Q-Sepharose FF, Pharmacia)を、希釈バッファーで平衡化させた。上記平衡バ
ッファーを用いたサンプル・ローディングと洗浄ステップの後、上記タンパク質
を、２５０mMのＮａＣｌを含有する同一バッファーで溶離させた。
【００８４】 次に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−溶離液を、１０kdカット−オフ膜（Om
ega, Filton)を備えた接線の方向に動く（tangental flow）濾過装置内で、適当
な保存バッファー（２０mM ＴｒｉｓバッファーpH８．０）に対してダイアフィ
ルトレーションした。
【００８５】 ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓを含有する限外濾過保持物を、０．２２μｍ膜
を通して滅菌濾過した。
【００８６】 全体精製収率はひじょうに高く：ホモジェネート１ｌ当り約３〜４ｇの精製さ
れた物質（Ｄ０１２０）であった。
【００８７】 実施例IV： ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓタンパク質を用いたワクチン製造 １．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓタンパク質を用いたワクチン製造： 上記実験において使用されたワクチンを、アジュバント化されているかどうか
を問わず、株ＡＲ５８からＥ．ｃｏｌｉ内で発現されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −
Ｈｉｓをコードする、組換えＤＮＡから製造する。アジュバントとして、上記配
合物は、油／水エマルジョン中に、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピ
ドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とＱＳ２１の混合物を含む。このアジュバント系ＳＢＡＳ
２は、ＷＯ９５／１７２１０中に先に記載されている。
【００８８】 ３Ｄ−ＭＰＬは：グラム陰性バクテリア、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella
minnesota）のリポ多糖（ＬＰＳ）に由来する免疫刺激剤である。ＭＰＬは、脱
アシル化されており、そしてピリドＡ成分上のホスフェート基を欠いている。こ
の化学的処理は、その免疫刺激剤特性を保存しながら、毒性を劇的に低下させる
（Ribi, 1986)。Ribi Immunochemistryが、ＭＰＬを製造し、そしてSB-Biologic
als に供給する。Smith Kline Beecham Biologicals において行われた実験は、
さまざまな媒質と併合された３Ｄ−ＭＰＬが、体液と細胞免疫のＴＨ１型の両者
を強く高めることを示した。
【００８９】 ＱＳ２１は：南米の木キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Mol
ina)の樹皮から抽出された天然サポニン分子である。上記樹皮の粗抽出物から個
々のサポニンを分離するために開発された精製技術が、その親成分と比較してよ
り強いアジュバント活性とより低い毒性を示すトリテルペン・グリコシドである
、特別なサポニン、ＱＳ２１の単離を可能にした。ＱＳ２１は、いくつかのサブ
ユニットＡｇｓに対するＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬｓを活性化し、そしてＡｇ特
異的リンパ球増殖を刺激することが示されている（kensil, 1992）。Ａｑｕｉｌ
ａ（正式にはCambridge Biotech Corporation)が、ＱＳ２１を製造し、そしてＱ
Ｓ２１をSB-Biological に供給している。
【００９０】 Smithkline Beecham Biologicals において行われた実験は、体液とＴＨ１型
細胞免疫応答の両者の誘導においてＭＰＬとＱＳ２１の併合物の明らかなシナル
ジスティック効果を証明した。
【００９１】 上記油／水エマルジョンは、２つの油（トコフェロールとスクアレン）から作
られた有機相と、乳化剤としてＴｗｅｅｎ ８０（商標）を含むＰＢＳの水相か
ら構成される。
【００９２】 上記エマルジョンは、５％スクアレン、５％トコフェロール、０．４％ Ｔｗ
ｅｅｎ ８０を含み、そして１８０nmの平均粒子サイズをもち、そしてＳＢ６２
として知られる（ＷＯ９５／１７２１０参照）。
【００９３】 Smithkline Beecham Biologicals において行われた実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／
ＱＳ２１（ＳＢＡＳ２）への上記Ｏ／Ｗエマルジョンの付加物が、さまざまなサ
ブユニット抗原に対する後者の免疫刺激特性をさらに高めることを証明した。
【００９４】 ２．エマルジョンＳＢ６２の製造（２倍濃縮物）： Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）を、ホスフェート緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）中
に溶解させて、ＰＢＳ中２％の溶液を得る。１００mlの２倍濃縮エマルジョンを
提供するために、５ｇのＤＬアルファ・トコフェロールと５mlのスクアレンを、
ボルテックスして完全混合する。９０mlのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を添加し、そ
して完全混合する。次に得られたエマルジョンをシリンジを通過させ、そしてＭ
１１０Ｓマイクロフルイディクス装置を用いて最終的にマイクロフルイダイズさ
せる。得られた油滴は、約１８０nmのサイズをもつ。
【００９５】 ３．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓの凍結乾燥： 実施に際しては、化合物の全てを溶液中に入れ、そして滅菌を、０．２μｍ膜
上での濾過により達成する。配合を、凍結乾燥の日に行った。
【００９６】 配合の順番を以下に示す：
【００９７】
【表１】
【００９８】 全化合物の容量を、最終的に以下をもつように調節する： Ｔｒｉｓ １０mM、ｔｗｅｅｎ ８０ ０．２％、３．１５％スクロース中、
２５０−５０−１０μｇ ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* -Ｈｉｓ。
【００９９】 上記バイアルに、１．２５×（６２５μｌ希釈剤、５００μｌの注射）を過充
填した。
【０１００】 Ｓｔｅｒｉｓ（Germany）から購入したＬｙｏｖａｃ ＧＴ６凍結乾燥装置を
用いて、凍結乾燥サイクルを、以下のように３日間にわたり行った：
【０１０１】
【表２】
【０１０２】 ４．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ ＱＳ２１／３Ｄ ＭＰＬ油／水（ＳＢＡ
Ｓ２）配合物の製造： 上記アジュバントを、油／水エマルジョン中の、ＭＰＬとＱＳ２１の組合せ物
として配合する。
【０１０３】 １）配合組成（注射容量：１００μｌ）；グループ１は、油／水エマルジョン
中の、ＭＰＬとＱＳ２１の組合せ物中に配合されたＰ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ（２０
μｇ）を受容した。グループ２は、油／水エマルジョン中、ＭＰＬとＱＳ２１の
組合せ物中の、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ（２５μｇ）を受容した。
【０１０４】 ２）成分
【０１０５】
【表３】
【０１０６】 ３）配合 配合物を注射の日に即席で調製した。
【０１０７】 油／水エマルジョン中に３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１を含有する配合（ＳＢＡＳ２
Ｂ配合物−グループ２と３）を、以下のように行った：Ｐ７０３ｐ（２０μｇ）
（グループ２）とＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ（２５μｇ）（グループ３）を
、５分間の間隔で、ＳＢ６２（５０μｌ）、ＭＰＬ（２０μｇ）、ＱＳ２１（２
０μｇ）、そして保存料としての１μｇ／mlチオメルサールの順次添加の前に、
１０倍濃縮されたＰＢＳ pH６．８中で希釈した。全てのインキュベーションを
、撹拌しながら室温で行った。
【０１０８】 アジュバント化されていない配合物（グループ４と５）を以下のように行った
：Ｐ７０３ｐ（２０μｇ）（グループ４）とＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ（２
５μｇ）（グループ５）を、５分間の間隔で保存料として１μｇ／mlチオメルサ
ールの添加前に、１．５Ｍ ＮａＣｌとＨ2 Ｏ中に希釈した。全てのインキュベ
ーションを、撹拌しながら室温で行った。
【０１０９】 最終的なワクチンは、アジュバントを用いた又はＰＢＳ単独による凍結乾燥さ
れたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ調製物の再構築の後に得られる。
【０１１０】 抗原を含まないアジュバント対照を、上記タンパク質をＰＢＳで置き替えるこ
とにより調製した。
【０１１１】 実施例Ｖ： ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓタンパク質を用いた免疫原性 １．マウスにおけるＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓの免疫原性 本実験の目的は、アジュバントの存在下又は不存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産
される精製組換え突然変異ＮＳ１−ｐ７０３* −Ｈｉｓによるワクチン接種によ
り、マウス内で誘導される免疫応答を特徴付けることであった。
【０１１２】 ａ）−免疫化プロトコール： １０匹の免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウス、６〜８週齢のマウスの群を、ＳＢＡＳ
０２Ｂ（５０μｌ ＳＢ６２／１０μｇ ＭＰＬ／１０μｇ ＱＳ２１）中で２
５μｇの突然変異ＮＳ１−Ｐ７０３を配合された又は配合されていないもので、
２週間の間隔で、筋中に、２回、ワクチン接種した。
【０１１３】 ２回目の注射後１４日目に、血液を採取し、そしてその血清を、抗−Ｐ７０３
抗体の存在についてテストした。
【０１１４】 ｂ）全ＩｇＧ抗体応答： 抗Ｐ７０３抗体応答を、最後のワクチン接種から１４日後に、上記マウスの血
清中で評価した。これは、被覆抗原としてＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* を用いてＥＬＩ
ＳＡにより行った。
【０１１５】 Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物を、宿主汚染物質に対する可能性のある抗体の存在につい
てチェックするために使用した。
【０１１６】 ｃ）−結果： 上記結果は、１）正常対照マウスの血清と比較して、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* タ
ンパク質単独を注射されたマウスの血清中で証明されるように、ＮＳ１−Ｐ７０
３Ｐ* により、より高い免疫応答（ＩｇＧ１）が誘導されること；２）ＡＳ０２
Ｂアジュバント中に配合されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* 分子を受容した動物中で、
高い抗体力価が見られること、を示している。
【０１１７】 ＮＳ１−ｐ７０３ｐ特異的ＩｇＧ応答のアイソタイプ特性も計測された。図８
に示すように、マウスがＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* タンパク質を単独で受容したとき
、ＩｇＧ１が検出されたが、アイソタイプ特性は、ＡＳ０２アジュバントの存在
によりＴＨ１応答（より多くのＩｇＧ２ａ）に向けられた。
【０１１８】 実施例VI： １．−ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓ 同様の方法で、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓを調製した。そのアミノ酸とＤＮ
Ａ配列を、配列番号３と配列番号４に示す。
【０１１９】 簡単に言えば、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓ融合タンパク質
を発現させるための戦略は、以下のステップを含んでいた： ａ）出発材料として、実施例１に記載したものと同一の出発材料（配列番号８
に記載するｐ７０３ｐｄｅ５配列のアミノ酸５→２２６）； ｂ）ｐ７０３非突然変異配列の両側にクローニング制限部位を配置するための
ＰＣＲ増幅； ｃ）ＮＳ１遺伝子を含むＰＭＧ８１ベクター（プロモーターｐＬロング）内へ
の挿入； ｄ）受容体株ＡＲ５８又はＡＲ１２０の形質転換； ｅ）組換え株の選択。
【０１２０】 得られたタンパク質を、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ突然変異タンパク質と
同様とやり方で、精製することができる。得られたタンパク質の一次構造は、図
９に記載する配列をもつ。上記タンパク質に対応するコーディング配列を、図１
０に示す。
【０１２１】 参考文献：
【０１２２】
【表４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現された融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３* −Ｈｉｓのデ
ザイン。
【図２】 Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現された融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３* −Ｈｉｓの一
次構造（配列番号１）。
【図３】 ＮＳ１1-81−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓのクローニング配列（配列番号２）。
【図４】 Ｅ．ｃｏｌｉ内でＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓを製造するためのクローニン
グ戦略。
【図５】 ＲＩＴ １４９５２のプラスミド地図。
【図６】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ発酵プロセス。
【図７】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* −Ｈｉｓ精製プロセス。
【図８】 ＳＢＡＳ２でアジュバント化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ* の免疫原性。
【図９】 Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現された融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３−Ｈｉｓの一次
構造（配列番号３）。
【図１０】 ＮＳ１1-81−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓのクローニング配列（配列番号４）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年８月２０日（２００１．８．２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/64 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０９／４４３，６８６ (32)優先日 平成11年11月18日(1999．11．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４８３，６７２ (32)優先日 平成12年１月14日(2000．1．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５３６，８５７ (32)優先日 平成12年３月27日(2000．3．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５６８，１００ (32)優先日 平成12年５月９日(2000．5．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５７０，７３７ (32)優先日 平成12年５月12日(2000．5．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５９３，７９３ (32)優先日 平成12年６月13日(2000．6．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ００１５７４７．９ (32)優先日 平成12年６月27日(2000．6．27) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０９／６０５，７８３ (32)優先日 平成12年６月27日(2000．6．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カブゾン，シルバ テレサ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール， リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ディロン，ダビン クリフォード アメリカ合衆国，ワシントン 98104，シ アトル，スイート 464，コロンビア ス トリート 1124，コリクサ コーポレイシ ョン Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 BA31 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA12 4B050 CC04 DD11 GG06 LL01 LL03 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 CA45 4C084 AA13 NA10 ZB262 ZC102 ZC192 4C085 AA03 BB01 BB22 DD62 EE01 EE06

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 融合パートナーに結合されたプロスターゼ・タンパク質又は
    その誘導体。
  2. 【請求項２】 前記プロスターゼ抗原が、配列番号５、配列番号６、配列番
    号７、及び配列番号８から成る群から選ばれる、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】 前記融合パートナーが、免疫学的融合パートナー又は発現エ
    ンハンサー融合パートナーである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 【請求項４】 前記融合パートナーが、インフルエンザからのＮＳ１タンパ
    ク質又はその断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 【請求項５】 前記融合タンパク質が、アフィニティー・タグをさらに含む
    、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードす
    る核酸配列。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の核酸配列又は請求項７に記載のベクターに
    より形質転換された宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項
    ６に記載の核酸を含むワクチン。
  10. 【請求項１０】 アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカイン又はケ
    モカインをさらに含む、請求項９に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質が、油／水又は水／油エマルジョン媒質中
    で提供される、請求項９又は１０に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】 前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１，ＣｐＧオ
    リゴヌクレオチド、又はポリエチレン・エーテル又はエステルを含む、請求項１
    ０又は１１に記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 １以上の他の抗原をさらに含む、請求項９〜１２のいずれ
    か１項に記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 医薬において使用される、本明細書中に請求するワクチン
    。
  15. 【請求項１５】 前立腺癌又は他のプロスターゼ関連腫瘍を患う患者を免疫
    療法により治療するためのワクチンの製造のための、本明細書中に記載するタン
    パク質又は核酸の使用。
  16. 【請求項１６】 請求項６に記載の核酸配列を用いて宿主細胞を形質転換さ
    せ、上記配列を発現させ、そして所望の生成物を単離することを含む、請求項１
    〜５のいずれか１項に記載のタンパク質の製法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の製法による、プロスターゼ・タンパク
    質又はその誘導体を精製するステップ、及び本明細書中に記載する得られたタン
    パク質を、好適なアジュバント、希釈剤又は他の医薬として許容される賦形剤と
    混合するステップを含む、ワクチンの製法。
  18. 【請求項１８】 前立腺癌にかかり易い又はそれを患った患者の治療方法で
    あって、上記患者に、医薬として活性な量の、請求項９〜１４のいずれか１項に
    記載のワクチンを投与することを含む、前記方法。
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