JP2003503083A - Prevention and treatment of amyloid-related diseases - Google Patents

Prevention and treatment of amyloid-related diseases

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、小グリア細胞の活性化に影響を及ぼす化合物を同定するためのアッセイ法、かつ具体的には、PGE2媒介性活性を調節することによってこれらの小グリア細胞からのサイトカインの分泌に影響を及ぼす化合物を同定するためのアッセイ法を提供する。本発明のアッセイ法には、例えばTNF-αおよびIL-1αといったサイトカインの分泌などの細胞活性によって同定されうる、β-アミロイドPGE2媒介性活性化を調節する化合物と、小グリアを接触させることにより、小グリア細胞活性化を調べるためのアッセイ法が含まれる。候補化合物の効果は、化合物と接触していない対照培養物と効果を比較することによって、または標準化プロフィールと効果を比較することによって決定されうる。 (57) Abstract: The present invention, assays for identifying compounds that affect the activation of microglial cells, and specifically, microglia thereof by adjusting the PGE 2 mediated activity Assays for identifying compounds that affect secretion of cytokines from E. coli. The assay method of the present invention, for example, can be identified by cellular activity, such as cytokine secretion, such as TNF-alpha and IL-l [alpha], a compound that modulates the β- amyloid PGE 2 mediated activation, contacting the microglial Include assays to determine microglial activation. The effect of a candidate compound can be determined by comparing the effect with a control culture that has not been contacted with the compound, or by comparing the effect with a standardized profile.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 発明の分野 本発明は一般に神経疾病の治療に関し、かつ具体的には、アミロイドプラーク
形成が関与する神経疾病の治療に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to the treatment of neurological disorders, and specifically to the treatment of neurological disorders involving amyloid plaque formation.

【０００２】 発明の背景 アルツハイマー病（AD）、脳性アミロイド血管障害（CAA）、及び、プリオン
媒介疾病を含む多数の重要な神経系疾患は、中枢神経系（CNS）における、アミ
ロイドと呼ばれる凝集タンパク質の沈着により特徴付けられる（総説として、Gl
ennerら、J.Neurol.Sci. 94:1〜28(1989年)；Haanら、Clin.Neurol.Neurosurg.
92(4）:305〜310(1990年)参照）。高度に不溶性なこれらの凝集物は、β-プリー
ツシート構造の一般的特徴を有する非分枝性の繊維状タンパク質で構成される。
CNSにおいては、アミロイドは脳血管及び髄膜血管(脳血管性沈着物)、並びに脳
実質(プラーク)中に存在し得る。ヒト及び動物モデルにおける神経病理学的な研
究により、アミロイド沈着物に隣接する細胞は通常の機能が阻害されていること
が示唆された（Mandybur、Acta Neuropathol. 78:329〜331(1989年)；Kawaiら、
Brain Res. 623:142〜6(1993年)；Martinら、Am.J.Pathol. 145:1348〜1381(199
4年)；Kalariaら、Neuroreport 6:477〜80(1993年)；Masliahら、J.Neurosci. 1
6:5795〜5811(1996年)）。ADについての研究により、アミロイド原線維が神経変
性を実際に開始しうることがさらに示された（Lendonら、J.Am.Med.Assoc. 277:
825〜31(1997年)；Yankner、 Nat.Med. 2:850〜2(1996年)；Selkoe、 J.Biol.Ch
em. 271:18295〜8(1996年)；Hardy、 Trends Neurosci. 20:154〜9(1997年)）。BACKGROUND OF THE INVENTION Many important nervous system diseases, including Alzheimer's disease (AD), cerebral amyloid angiopathy (CAA), and prion-mediated diseases, involve the aggregation of amyloid proteins called amyloids in the central nervous system (CNS). Characterized by deposition (for review, Gl
enner et al., J. Neurol. Sci. 94: 1-28 (1989); Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg.
92 (4): 305-310 (1990)). These highly insoluble aggregates are composed of unbranched fibrillar proteins with the general features of β-pleated sheet structure.
In the CNS, amyloid may be present in cerebrovascular and meningeal blood vessels (cerebrovascular deposits) and in brain parenchyma (plaques). Neuropathological studies in human and animal models have suggested that cells adjacent to amyloid deposits have impaired normal function (Mandybur, Acta Neuropathol. 78: 329-331 (1989); Kawai et al.
Brain Res. 623: 142-6 (1993); Martin et al., Am. J. Pathol. 145: 1348-1381 (199).
4 years); Kalaria et al., Neuroreport 6: 477-80 (1993); Masliah et al., J. Neurosci. 1
6: 5795-5811 (1996)). Studies on AD have further shown that amyloid fibrils may actually initiate neurodegeneration (Lendon et al., J. Am. Med. Assoc. 277:
825-31 (1997); Yankner, Nat. Med. 2: 850-2 (1996); Selkoe, J. Biol. Ch.
em. 271: 18295-8 (1996); Hardy, Trends Neurosci. 20: 154-9 (1997)).

【０００３】 AD及びCAAでは、生化学的マーカー及び神経病理学的マーカーが共通するが、
アミロイド沈着物の程度及び部位がやや異なり、また、個々の患者により示され
る症状も異なっている。老齢のヒトにおける進行性の知的不全の最も一般的な原
因であるADの神経変性の過程は、大脳辺縁系、連合新皮質(association neocort
ex)及び前脳基部の、軸索プラーク及びもつれ形成を伴う進行性及び不可逆性の
求心路遮断により特徴付けられる（総説として、Terryら編「アルツハイマー病
（Alzheimer's disease）」Raven Press, New York(1994年)中の第179〜196頁、
Terryらの「アルツハイマー病における構造変化（Structural alteration in Al
zheimer's disease.）」参照）。ジストロフィー性軸索、並びに反応性星状細胞
及び小グリア細胞は、これらのアミロイド関連軸索プラークと関連する。任意の
プラークにおける軸索の母集団も雑多であるが、一般的にシナプスタンパク質AP
P(I型)を含む球状軸索、並びに、細胞骨格タンパク質及び対（paired）らせん状
繊維(PHF；II型)を含む紡錘状軸索から構成される。Although biochemical markers and neuropathological markers are common in AD and CAA,
The degree and location of amyloid deposits are somewhat different, and the symptoms exhibited by individual patients are different. The process of neurodegeneration of AD, which is the most common cause of progressive intellectual disability in aged humans, is characterized by the limbic system, the association neocort.
ex) and basal forebrain, characterized by progressive and irreversible deafferentation with axonal plaque and tangle formation (for review, see Terry et al., “Alzheimer's disease” Raven Press, New York ( 1994) pp. 179-196,
Terry et al., "Structural alteration in Alzheimer's disease
zheimer's disease.) ")). Dystrophy axons, and reactive astrocytes and microglial cells are associated with these amyloid-associated axonal plaques. The axon population in any plaque is also heterogeneous, but is generally synaptic protein AP
It is composed of spherical axons containing P (type I) and spindle-shaped axons containing cytoskeletal proteins and paired helical fibers (PHF; type II).

【０００４】 CAA患者は種々の血管系症候群を示し、中でも最も記録に残されているのは脳
実質内出血（cerebral parenchymal hemorrhage）についてである。脳実質内出
血は、脳血管内での広範囲にわたるアミロイド沈着の結果起こる（Hardy、Trend
s Neurosci. 20:154〜9(1997年)；Haanら、Clin.Neurol.Neurosurg. 92:305〜10
(1990年)；Terryら、上述；Vinters、Stroke 18:211〜24(1987年)；Itohら、J.N
eurological Sci. 116:135〜41(1993年)；Yamadaら、J.Neurol.Neurosurg.Psych
iatry 56:543〜7(1993年)；Greenbergら、Neurology 43:2073〜9(1993年)；Levy
ら、Science 248:1124〜6(1990年)）。いくつかの家族性CAAの場合、出血が始ま
る前に痴呆が確認され、脳血管性のアミロイド沈着はまた、認知機能をも妨げう
るという可能性が示唆された。CAA patients present with various vascular syndromes, the most documented of which is cerebral parenchymal hemorrhage. Intracerebral hemorrhage is the result of extensive amyloid deposits in cerebral blood vessels (Hardy, Trend
S. Neurosci. 20: 154-9 (1997); Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92: 305-10.
(1990); Terry et al., Supra; Vinters, Stroke 18: 211-24 (1987); Itoh et al., JN.
eurological Sci. 116: 135-41 (1993); Yamada et al., J. Neurol. Neurosurg. Psych
iatry 56: 543-7 (1993); Greenberg et al., Neurology 43: 2073-9 (1993); Levy.
Et al., Science 248: 1124-6 (1990)). In some familial CAAs, dementia was identified before bleeding was suggested, suggesting that cerebrovascular amyloid deposition may also interfere with cognitive function.

【０００５】 神経プラークが生じる正確な機構、ならびにプラーク形成とADおよびCAAに伴
う神経変性過程との関連は明確になっていない。ADを発症する可能性が高くなる
要因はすでにいくつか特定されている。ADを発症するリスクは以下に伴って明ら
かに高まる：（1）加齢、（2）頭部外傷、（3）ADまたはダウン症候群の家族歴
、（4）性別（女性の方がADの有病率が高い）、（5）血管疾病、（6）環境毒素
に対する曝露、（7）感染過程または（8）免疫機能の変化。分子遺伝学の最近の
進歩により、ADの発症における最も重要な危険因子の一つは遺伝的素因であるこ
とが示唆されている。例えば、アポリポ蛋白質E4（apoE4）対立遺伝子を有するA
D患者ではアミロイドプラークの数が著しく多いことが観察されており、いくつ
かの遺伝学的研究の結果から、この神経変性疾病の原因にapoE4対立遺伝子の存
在が関わっていることが示されている。The exact mechanism by which neural plaques occur and the link between plaque formation and the neurodegenerative processes associated with AD and CAA is unclear. Several factors that increase the likelihood of developing AD have already been identified. The risk of developing AD is significantly increased with: (1) aging, (2) head injury, (3) family history of AD or Down's syndrome, (4) gender (female with AD Higher morbidity), (5) vascular disease, (6) exposure to environmental toxins, (7) infectious processes or (8) changes in immune function. Recent advances in molecular genetics have suggested that one of the most important risk factors for the development of AD is a genetic predisposition. For example, A with the apolipoprotein E4 (apoE4) allele
A significantly higher number of amyloid plaques has been observed in patients with D, and the results of several genetic studies indicate that the presence of the apoE4 allele is responsible for the cause of this neurodegenerative disease .

【０００６】 AD及びCAAの両方において、主要なアミロイド構成成分はアミロイドβタンパ
ク質(Aβ)である。2つの推定セクレターゼによりアミロイドβ前駆体タンパク質
(APP)から生成されるAβペプチドは、正常なCNS及び血液中に低レベルで存在す
る。2つの主要な変種である、Aβ1〜40及びAβ1〜42は、APPの代替カルボキシ末
端切断によって生成される(Selkoeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7341〜7345(
1988年)；Selkoe、Trends Neurosci. 16:403〜409(1993年))。AD及びCAAの両方
のアミロイド沈着物内の2つのペプチドの内、Aβ1〜42の方がより原線維発生性(
fibrillogenic)で、より豊富である。上述のADの場合におけるアミロイド沈着に
加えて、ほとんどのADのケースでまた血管壁中のアミロイド沈着を伴う（Hardy(
1997年)、前記；Haanら(1990年)、前記；Terryら、前記；Vinters(1987年)、前
記；Itohら(1993年)、前記；Yamadaら(1993年)、前記；Greenbergら(1993年)、
前記；Levyら(1990年)、前記）。これらの血管損傷は、ADでない場合でも存在し
得る、CAAの証しである。In both AD and CAA, the major amyloid component is amyloid β protein (Aβ). Amyloid β precursor protein by two putative secretases
Aβ peptide produced from (APP) is present at low levels in normal CNS and blood. Two major variants, A [beta] 1 to 40 and Aβ1~42 are generated by alternative carboxy-terminal truncation of APP (Selkoe et al., Proc 85: 7,341 to 7,345 (
1988); Selkoe, Trends Neurosci. 16: 403-409 (1993)). Of the two peptides in the amyloid deposits of both AD and CAA, Aβ1-42 was more fibrillogenic (
fibrillogenic) and more abundant. In addition to the amyloid deposits in the case of AD described above, most AD cases also involve amyloid deposits in the vessel wall (Hardy (
1997), supra; Haan et al. (1990), supra; Terry et al., Supra; Vinters (1987), supra; Itoh et al. (1993), supra; Yamada et al. (1993), supra; Greenberg et al. (1993). Year),
Supra; Levy et al. (1990) supra). These vascular injuries are evidence of CAA, which may be present even when not in AD.

【０００７】 グリア細胞の活性化は、痴呆の発症において極めて重要な病原因子の役割を果
たすと考えられている。AD脳における疾患の根源は、アミロイドプラークと関連
のある小グリア活性化によって誘発される反応性の変化である。例えば、ADのイ
ンビトロ初代小グリア細胞培養物では、遺伝的素因と、小グリア細胞の増殖およ
び活性化との間に相関が得られている（Lombardiら（1998）J Neurosci Res 54
：539〜53）。小グリアがサイトカインおよびサイトトキシンの両方を分泌する
ことは多くの研究で示されており、脳疾患のほとんどすべての種類で反応性小グ
リアが認められていることから、その分泌産物は脳疾患組織の比率を最終的に決
定する一助となっている可能性が高い。例えば、ジュリアン（Giulian）ら（199
4）Neurochem Int. 25：227〜33を参照。また、反応性小グリアは、酸素遊離基
、および特に攻撃性の高いパーオキシナイトライトを形成する一酸化窒素（NO）
の生成により、ならびに組織壊死因子-α（TNF-α）などの神経毒性があると思
われるサイトカインの放出により、神経疾患の一因になっている可能性もある（
P. Schubertら（1998）Alzheimer Dis Assoc Disord.、12 Suppl 2：S21〜8）。[0007] Activation of glial cells is believed to play a vital pathogenic factor in the development of dementia. The source of the disease in the AD brain is the change in reactivity induced by microglial activation associated with amyloid plaques. For example, in in vitro primary microglial cultures of AD, a correlation has been obtained between genetic predisposition and microglial proliferation and activation (Lombardi et al. (1998) J Neurosci Res 54.
: 539-53). Many studies have shown that microglia secrete both cytokines and cytotoxins, and because of the presence of reactive microglia in almost all types of brain disease, its secreted product is brain tissue. Is likely to help determine the final ratio of For example, Giulian et al. (199
4) Neurochem Int. 25: 227-33. Reactive microglia also form nitric oxide (NO), which forms oxygen free radicals and peroxynitrite, which is particularly aggressive.
And the release of potentially neurotoxic cytokines such as tissue necrosis factor-α (TNF-α) may contribute to neurological disease (
P. Schubert et al. (1998) Alzheimer Dis Assoc Disord., 12 Suppl 2: S21-8).

【０００８】 プロスタグランジンおよび一酸化窒素（NO）は、活性化小グリア細胞により放
出される数多くの物質の一部である。それぞれプロスタグランジンおよびNOの合
成における2つの重要な酵素である、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）および誘
導型NO合成酵素（iNOS）は、細菌内毒素（リポ多糖［LPS］）によって活性化さ
れたラット新生仔小グリア培養物中で急速に共誘導される。COX-2の発現は、内
因性NOならびに外因性NOによる負の制御下にあると思われる（Minghettiら（199
7）Eur J Neurosci. 9：934〜40）。誘導型シクロオキシゲナーゼ（COX-2）の阻
害薬によるADの治療も検討されている。しかし、COX-2の産物は炎症誘導性応答
および抗炎症性応答のいずれも媒介すること、ならびに慢性神経炎症状態で神経
炎症の軽減を目的にすべてのCOX-2産物を阻害するとある種のCOX-2産物の抗炎症
性が阻害されることが次第に明らかになりつつある。カジアーノ（Caggiano）（
1998）J. Neurochemistry 70：2357〜68。例えば、PGI2およびPGF2αには抗炎症
活性があり、COX-2阻害薬によってそれらの抗炎症作用が低下するおそれがある
。Prostaglandins and nitric oxide (NO) are some of the many substances released by activated microglial cells. Cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible NO synthase (iNOS), two key enzymes in the synthesis of prostaglandins and NO, respectively, are activated by bacterial endotoxin (lipopolysaccharide [LPS]). Rapidly induced in rat neonatal microglial cultures. COX-2 expression appears to be under negative control by both endogenous and exogenous NO (Minghetti et al.
7) Eur J Neurosci. 9: 934-40). Treatment of AD with inhibitors of inducible cyclooxygenase (COX-2) is also being considered. However, products of COX-2 mediate both pro-inflammatory and anti-inflammatory responses, and inhibition of all COX-2 products for the purpose of reducing neuroinflammation in chronic neuroinflammatory conditions leads to some COX-2 It is becoming increasingly clear that the anti-inflammatory properties of the -2 product are inhibited. Caggiano (
1998) J. Neurochemistry 70: 2357-68. For example, PGI 2 and PGF 2 α have anti-inflammatory activity, and COX-2 inhibitors may reduce their anti-inflammatory activity.

【０００９】 プロスタグランジンE2（PGE2）も活性化小グリア細胞によって産生され、これ
は小グリア細胞における環状アデノシン一リン酸（cAMP）レベルを上昇させるこ
とが知られている（Minghettiら、前記）。伝統的には、PGE2は炎症における正
の因子であるとみなされてきた。しかし最近になって、PGE2は、1）ニューロン
を細胞毒性疾患から保護する（Akaikeら（1994）Brain Research、663：237〜24
3）；2）LPS誘導性カリウム外向き整流電流（outwardly rectifying potassium
current）およびIL-1β産生を阻害する（Caggianoら（1998）J. Neurochemistry
、70：2357〜68）；3）培養ラット小グリアにおけるLPS誘導性iNOS発現を用量依
存的な様式でダウンレギュレートする（Minghetti（1997）Glia、19：152〜60）
；および4）小グリアによる一酸化窒素を介した細胞疾患を軽減する（Thery（19
94）Glia、11：383〜86）ということが示されている。さらに、PGE2はマクロフ
ァージによるTNF-α遺伝子の発現を調節することが示されている（S.L. Kunkle
ら（1998）J. Biol. Chem、263：5380〜84）。Prostaglandin E2 (PGE 2 ) is also produced by activated microglia, which is known to increase cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels in microglia (Minghetti et al., Supra). ). Traditionally, PGE 2 has been regarded as a positive factor in inflammation. But more recently, PGE 2 1) protects neurons from cytotoxic disease (Akaike et al. (1994) Brain Research, 663: 237-24.
3) ； 2) Outwardly rectifying potassium
current) and IL-1β production (Caggiano et al. (1998) J. Neurochemistry
, 70: 2357-68); 3) Down-regulates LPS-induced iNOS expression in cultured rat microglia in a dose-dependent manner (Minghetti (1997) Glia, 19: 152-60).
And 4) reduce nitric oxide-mediated cellular disorders caused by microglia (Thery (19
94) Glia, 11: 383-86). Furthermore, PGE 2 has been shown to regulate TNF-α gene expression by macrophages (SL Kunkle
(1998) J. Biol. Chem, 263: 5380-84).

【００１０】 当技術分野には、小グリア細胞の活性化を抑制するさらに特異的な治療用ター
ゲティングシステムに対する需要がある。さらに、神経変性疾患に罹患した患者
におけるアミロイドプラーク形成を抑制する方法に対する需要もある。There is a need in the art for more specific therapeutic targeting systems that inhibit activation of microglial cells. Moreover, there is a need for methods of inhibiting amyloid plaque formation in patients with neurodegenerative diseases.

【００１１】 発明の概要 本発明は、小グリア細胞の活性化に影響を及ぼす化合物を同定するためのアッ
セイ法、これらのアッセイ法で同定された小グリア細胞のAβ:PGE2活性化を阻害
する化合物、およびこのような化合物を治療的介入に用いる方法を提供する。本
発明のアッセイ法は、Aβ:PGE2媒介性活性の調節を通じて小グリア活性化に影響
を及ぼす。小グリアのAβ:PGE2への曝露により、小グリアはどちらかの作用物質
単独で曝露された添加剤よりもずっと活性化される。小グリアのこの相乗的活性
化は特に病原性の高い機構を示すため、本発明のアッセイ法を用いて化合物を同
定する方法は、相乗効果の一方または両方の因子を阻害する治療薬を同定しうる
点で特に有用である。さらに、本発明のアッセイ法を用いて同定された治療薬は
、この相乗的な活性化過程に対して特異的な効果を示すため、患者への介入に特
に適すると思われる。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides assays for identifying compounds that affect activation of microglial cells, and inhibits Aβ: PGE 2 activation of the microglial cells identified in these assays. Provided are compounds and methods of using such compounds for therapeutic intervention. The assay of the present invention affects microglia activation through modulation of Aβ: PGE 2 mediated activity. Exposure of microglia to Aβ: PGE 2 results in much more activation of microglia than additives exposed with either agent alone. Because this synergistic activation of microglia represents a particularly pathogenic mechanism, methods of identifying compounds using the assays of the present invention identify therapeutic agents that inhibit one or both factors of synergism. It is especially useful because Moreover, the therapeutic agents identified using the assay method of the invention appear to be particularly suitable for patient intervention as they show specific effects on this synergistic activation process.

【００１２】 本発明のアッセイ法は、小グリアを、Aβおよび/またはPGE2媒介性活性化を調
節する化合物と接触させることによって、小グリア細胞の活性化を調べるための
アッセイ法を含む。候補化合物の効果は、例えば、TNF-αおよびIL-1αなどのサ
イトカインの分泌を測定することにより、化合物と接触していない対照培養物に
おける結果と比較することによって、またはその効果をサイトカインの標準化プ
ロフィールと比較することによって決定しうる。The assays of the invention include assays for examining activation of microglial cells by contacting microglia with a compound that modulates Aβ and / or PGE 2 mediated activation. The effect of the candidate compound can be assessed, for example, by measuring the secretion of cytokines such as TNF-α and IL-1α, by comparing the effect with the results in control cultures not contacted with the compound, or by standardizing the effect of the cytokine. It can be determined by comparison with the profile.

【００１３】 1つの好ましい態様において、本発明は、小グリア細胞をAβ:PGE2および被験
化合物とともに培養することにより、アミロイド関連疾患の進行を変化させる、
停止させる、または予防する化合物を同定するためのアッセイ法を特徴とする。
続いて培養物を、例えばサイトカイン分泌、一酸化窒素合成酵素（NOS）もしく
はその産物の増加、活性酸素種（ROS）または活性化にかかわるLFA-1、VLA-4も
しくはMac-1といった分子の発現などの細胞活性の変化によって明示される、Aβ
:PGE2による相乗的活性化に関して検討する。培養物を化合物への曝露前のレベ
ルと比較すること、または代替的に、これらの細胞活性の1つもしくは複数に関
する標準化プロフィールと比較することもできる。化合物を細胞に添加する時期
は、Aβペプチドへの曝露前でもよく（例えば、化合物がプラーク形成を予防す
る能力を検討する目的で）、Aβペプチドと同時でもよく、Aβペプチドとインキ
ュベートした後でもよい（例えば、化合物がプラーク形成の進行を停止または好
転させる能力を決定する目的で）。アミロイド関連疾患はADまたはCAAであるこ
とが好ましく、アッセイ法に用いるサイトカインはIL-1α、IL-1β、TNF-αおよ
び/またはIL-6であることが好ましい。In one preferred embodiment, the present invention alters the progression of amyloid-related disease by culturing microglial cells with Aβ: PGE 2 and a test compound,
An assay for identifying compounds that arrest or prevent are featured.
The cultures are then subjected to expression of molecules such as LFA-1, VLA-4 or Mac-1 involved in cytokine secretion, increased nitric oxide synthase (NOS) or its products, reactive oxygen species (ROS) or activation. Aβ is manifested by changes in cell activity such as
: Consider synergistic activation with PGE 2 . Cultures can be compared to levels prior to exposure to the compound, or, alternatively, to a standardized profile for one or more of these cell activities. The compound may be added to the cells prior to exposure to the Aβ peptide (eg, to determine the compound's ability to prevent plaque formation), simultaneously with the Aβ peptide, or after incubation with the Aβ peptide. (For example, to determine the ability of a compound to halt or reverse the progression of plaque formation). The amyloid-related disease is preferably AD or CAA, and the cytokines used in the assay are preferably IL-1α, IL-1β, TNF-α and / or IL-6.

【００１４】 本発明は、小グリア活性化の調節のための治療標的となる特定の分子を決定す
るための方法も特徴とする。例えば、PGE2の特定のアイソフォームに影響を及ぼ
す化合物を用いて、Aβ:PGE2相乗作用に関与する受容体アイソフォームを決定し
、小グリア活性化に対する化合物の効果を検討することにより、関与する受容体
アイソフォームを同定した。The invention also features a method for determining a particular molecule as a therapeutic target for modulation of microglial activation. For example, by using compounds that affect a particular isoform of PGE 2, A [beta]: determines the receptor isoform involved in PGE 2 synergy, by examining the effect of the compound on microglia activation, involved Receptor isoforms have been identified.

【００１５】 もう1つの態様において、本発明は、患者におけるサイトカイン分泌を調節す
るための方法であって、患者の中枢神経系由来の小グリア細胞を分析すること、
小グリア細胞からのサイトカインの発現レベルを決定すること、およびサイトカ
イン発現を低下させるのに十分な量の化合物を投与することによる方法を提供す
る。サイトカインの分泌は例えば、脊髄穿刺によって入手しうる患者の脳脊髄液
から、小グリア細胞活性化に関連した可溶性因子をモニタリングすることによっ
てモニタリングされうる。[0015] In another embodiment, the invention provides a method for modulating cytokine secretion in a patient, comprising analyzing microglial cells from the central nervous system of the patient,
Methods are provided by determining the expression level of cytokines from microglial cells and by administering a compound in an amount sufficient to reduce cytokine expression. Cytokine secretion can be monitored, for example, by monitoring soluble factors associated with microglial activation from the cerebrospinal fluid of patients available by spinal tap.

【００１６】 また、本発明は、哺乳動物宿主の脳組織におけるβ-アミロイドプラークのレ
ベルを低下させるための方法であって、小グリア活性化を低下させるのに有効な
量の化合物を宿主に投与することを含む方法も提供する。治療に用いる化合物は
小グリア活性化を30〜80％低下させ、サイトカイン分泌レベルを20〜80％低下さ
せることが好ましい。The invention also provides a method for reducing the level of β-amyloid plaques in the brain tissue of a mammalian host, wherein the host is administered an amount of a compound effective to reduce microglial activation. Methods are also provided that include doing. Preferably, the compound used for treatment reduces microglia activation by 30-80% and cytokine secretion levels by 20-80%.

【００１７】 本発明は、細胞の標準化プロフィール、およびこのような標準を神経変性疾病
アッセイ法における陽性対照として用いる方法も提供する。アッセイ法はトラン
スジェニック動物を用いるバイオアッセイ法でもイムノアッセイ法でもよく、診
断、予後判定、治療薬の有効性の判定などの目的に用いることができる。この標
準は、小グリア活性化のレベルが既知で一定している基準物質として働くことに
より、アッセイ法の再現性および特異性を確保する役割を果たす。また、この標
準により、感度の決定、および感度に対する選択性の調整を必要に応じて行うこ
とも可能になる。The invention also provides a standardized profile of cells, and methods of using such standards as a positive control in a neurodegenerative disease assay. The assay method may be a bioassay method using a transgenic animal or an immunoassay method, and can be used for purposes such as diagnosis, prognosis determination, and efficacy determination of therapeutic agents. This standard serves to ensure reproducibility and specificity of the assay by acting as a reference substance with known and consistent levels of microglial activation. This standard also allows the determination of sensitivity and the adjustment of selectivity with respect to sensitivity, if desired.

【００１８】 本発明は、本発明の標準を用いてアッセイ法を較正する方法も特徴とする。較
正は、所定レベルのサイトカイン濃度での有効性を決定する目的で単一のアッセ
イ法の中で行うこともでき、アッセイ法間の検出レベルを補正することによって
異なるアッセイ法の結果を比較しうるようにアッセイ法間で行うこともできる。
例えば、一方のアッセイ法の感度が別のものよりも高い場合、標準を用いた較正
を用いて、異なるアッセイ法を用いて得られた結果の比較のために測定レベルを
補正レベルに変換する係数を決定することができる。The invention also features a method of calibrating an assay using the standards of the invention. Calibration can also be performed in a single assay with the purpose of determining efficacy at a given level of cytokine concentration, and the results of different assays can be compared by correcting for detection levels between assays. As between assays.
For example, if one assay is more sensitive than another, calibration with standards is used to convert the measured level to a corrected level for comparison of results obtained using different assay methods. Can be determined.

【００１９】 本発明は、本発明の標準を用いて試薬を試験することにより、診断アッセイ法
または予後判定アッセイ法に用いる試薬の品質を判定する方法も特徴とする。標
準は一定したレベルの小グリア活性化のほか、好ましくは一定したバックグラウ
ンドも提供する。試薬を標準に対して試験することにより、アッセイ法に用いる
試薬の選択性および/または再現性を確保することができる。The invention also features a method of determining the quality of a reagent for use in a diagnostic or prognostic assay by testing the reagent with a standard of the invention. The standard provides a constant level of microglial activation as well as preferably a constant background. Testing reagents against standards can ensure the selectivity and / or reproducibility of the reagents used in the assay.

【００２０】 本発明の1つの目的は、PGE2を介した経路を調節することによってアミロイド
プラークの負荷を軽減する治療用化合物を同定することである。One object of the present invention is to identify therapeutic compounds that reduce amyloid plaque burden by modulating the PGE 2 mediated pathway.

【００２１】 本発明のもう1つの目的は、アミロイド関連疾患に対する治療薬を同定するた
めに、Aβペプチドとある種のサイトカインとの相乗作用を利用することである
。[0021] Another object of the invention is to utilize the synergistic action of Aβ peptides with certain cytokines to identify therapeutic agents for amyloid-related diseases.

【００２２】 本発明のもう1つの目的は、小グリア活性化に関与する特定の分子を標的とす
る化合物を用いることにより、神経変性疾患に関与する特定の分子を同定するこ
とである。Another object of the invention is to identify specific molecules involved in neurodegenerative diseases by using compounds that target specific molecules involved in microglial activation.

【００２３】 本発明のもう1つの目的は、本発明のアッセイ法を用いて同定された化合物を
投与することにより、神経変性疾患の患者を治療することである。Another object of the invention is to treat a patient with a neurodegenerative disease by administering a compound identified using the assay method of the invention.

【００２４】 本発明のもう1つの目的は、本発明のアッセイ法を用いて同定された化合物を
投与することにより、アミロイドプラークの形成を予防することである。[0024] Another object of the invention is to prevent the formation of amyloid plaques by administering the compounds identified using the assay method of the invention.

【００２５】 本発明の1つの利点は、本発明のアッセイ法により、特定の経路を標的とし、
そのために全般的副作用の少ない治療薬を同定することができる点である。One advantage of the present invention is that the assay methods of the present invention target specific pathways,
Therefore, it is possible to identify therapeutic agents with few general side effects.

【００２６】 本発明のもう1つの利点は、より厳密に適合化された治療薬が提供される点で
ある。特に、ヒト小グリアはEP3を発現しないため、EP3を標的とすることに伴う
副作用のない治療薬を用いることができる。Another advantage of the present invention is that it provides a more closely tailored therapeutic agent. In particular, since human microglia does not express EP3, therapeutic agents that do not have the side effects associated with targeting EP3 can be used.

【００２７】 本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、本開示を読むことによ
り、当業者には明らかになると考えられる。The above and other objects, advantages and features of the invention will be apparent to those of skill in the art upon reading this disclosure.

【００２８】 好ましい態様についての詳細な説明 本発明の方法及び化合物について記述する前に、本発明は、記載される特定の
方法または化合物に限定されるものではなく、当然ながら変更できることが理解
されるべきである。また、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限
定されうるので、本明細書中で使用される専門用語は、単に特定の態様を説明す
ることを目的として用いられ、限定することを意図したものではないことが理解
されるべきである。Detailed Description of the Preferred Embodiments Before describing the methods and compounds of the present invention, it is understood that the present invention is not limited to the particular methods or compounds described and can, of course, vary. Should be. Also, since the scope of the invention may be limited only by the appended claims, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. It should be understood that it was not intended.

【００２９】 他に特に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的用語及び科
学的用語は、本発明が属する通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意
味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材
料が、本発明の実施または試験において使用されうるが、好ましい方法及び材料
について以下に記載する。本明細書中で言及された全ての出版物は、該出版物が
関連として引用される方法及び/または材料の開示および説明のために本明細書
に組み入れられる。Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described below. All publications mentioned herein are incorporated herein for the purpose of disclosure and description of methods and / or materials in connection with which the publications are cited.

【００３０】 本明細書及び追加の特許請求の範囲において使用されるように、文脈において
他の意味が明瞭に示されない限り、「a」、「an」及び「the」のような単数形は
複数の対象物を含むことが留意されるべきである。したがって、例えば「化合物
（a compound）」についての言及は多数のそのような化合物を含み、「AD型の病
状（an AD-type pathology）」についての言及は、1つまたは複数の、そのよう
な病状及び当業者に公知な同義語などについての言及を含む。As used herein and in the additional claims, singular forms such as “a”, “an” and “the” are plural unless the context clearly dictates otherwise. It should be noted that this includes the objects of Thus, for example, a reference to “a compound” includes a number of such compounds, and a reference to “an AD-type pathology” includes one or more such Includes references to medical conditions and synonyms known to those of skill in the art.

【００３１】 本明細書中で言及された全ての出版物は、例えば、ここで記載された発明と関
連して用いられた出版物中に記載される、細胞系、構築物及び方法を記載および
開示する目的で、本明細書中に参照として組み入れられる。上述の、及び本明細
書全体にわたって述べられた出版物は、単に本出願の出願日以前の開示について
のみ提供される。先行発明の価値により、本発明者がそのような開示に先行する
権利を有さないということを認めると解釈されるものではない。また、与えられ
た出版日は実際の出版日と異なっている可能性があり、個別の確認が必要である
可能性がある。All publications mentioned herein describe and disclose cell lines, constructs and methods, such as those described in the publications used in connection with the invention described herein. Incorporated herein by reference for that purpose. The publications mentioned above and throughout the specification are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. The value of prior invention is not to be construed as an admission that the inventors do not entitled to antedate such disclosure. Also, the given publication date may differ from the actual publication date and may require individual confirmation.

【００３２】 定義 本明細書中で使用された「治療」、「治療すること」、「治療する」等の用語
は、一般的に、所望の薬理学的効果及び/または生理学的効果を得ることを意味
する。効果は、疾病もしくは症状を完全にもしくは部分的に防止する点では予防
的であり、並びに/または、疾病及び/もしくは疾病に起因する悪影響の部分的も
しくは完全な治癒という点では治療的である。本明細書中の「治療」とは、哺乳
動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、以下の治療を含む： （a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていな
い患者において、疾病または症状が起こることを防止すること； （b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止すること； （c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退を引き起こすこ
と。Definitions As used herein, the terms “treatment”, “treating”, “treat” and the like generally refer to obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. Means The effect is prophylactic in that it completely or partially prevents the disease or condition, and / or is curative in that it partially or completely cures the disease and / or the adverse effects resulting from the disease. The term "treatment" as used herein includes any treatment of diseases of mammals, particularly humans, and includes the following treatments: (a) Diagnosis of having a predisposition to a disease or condition, but still having it Preventing the occurrence of a disease or condition in an untreated patient; (b) inhibiting the disease condition, ie, stopping its progression; (c) alleviating the disease condition, ie, the disease or condition. Causing a recession of.

【００３３】 「効果的な用量」または「有効量」とは、所望の生理学的変化及び/または心
理学的変化を供給するのに十分な化合物の投与を意味する。これは患者、疾病及
び治療次第で変化すると考えられる。用量は、疾患の症状もしくは容態（condit
ion）の緩和もしくは改善のために患者におけるアミロイドプラークレベルを十
分に変化させる場合の治療的用量、または、望ましくないレベルまでのアミロイ
ドプラークの蓄積を防止するのに十分な予防的用量のどちらかでありうる。By “effective dose” or “effective amount” is meant administration of a compound sufficient to provide the desired physiological and / or psychological changes. This will vary depending on the patient, disease and treatment. The dose depends on the symptoms or condition of the disease (condit
either in a therapeutic dose sufficient to alter the level of amyloid plaque in a patient to alleviate or ameliorate their abundance, or in a prophylactic dose sufficient to prevent the accumulation of amyloid plaque to undesired levels. It is possible.

【００３４】 本明細書中で使用された「化合物」という用語は、アミロイド関連疾患並びに
、特にAD媒介性疾患、及び/又はCAA媒介性疾患に係わる、分子現象及び臨床的現
象に影響を及ぼす能力をもつ任意の分子、例えば、タンパク質または小分子薬を
あらわしたものである。As used herein, the term “compound” refers to the ability to affect the molecular and clinical events associated with amyloid-related disorders and, in particular, AD-mediated and / or CAA-mediated disorders. Is any molecule having, for example, a protein or a small molecule drug.

【００３５】 本明細書中で使用された「診断」という用語は、症状からの疾病の同定、およ
び疾病状態(例えば、アルツハイマー病の始まり)を示唆する領域(例えば、脳組
織)内の分子(例えば、TGF-α又はIL-1α)の存在の決定を含む、状態の決定また
は予測に用いられる、任意の型の分析を含む。As used herein, the term “diagnosis” identifies a disease from symptoms, and molecules (eg, brain tissue) within a region (eg, brain tissue) suggesting a disease state (eg, the onset of Alzheimer's disease). For example, any type of analysis used to determine or predict a condition, including determining the presence of TGF-α or IL-1α).

【００３６】 本明細書中で使用された「単位剤形」という用語は、ヒト患者及び動物患者の
ための単位投与量として適した物理的に別々の単位を意味し、各単位は、薬学的
に許容されうる希釈剤、担体またはビヒクルと共に、所望の効果を奏するのに十
分な量を見積もられた本発明の化合物を予め決められた容量で含む。本発明の新
規単位剤形についての詳細は、用いられる特定の化合物及び達成すべき効果、及
び、宿主中の各化合物に関する薬理学に左右される。The term “unit dosage form” as used herein refers to physically discrete units suitable as unit doses for human and animal patients, each unit being a pharmaceutical With an acceptable diluent, carrier or vehicle, in a pre-determined volume, in an amount sufficient to produce the desired effect (s) of the compound of the invention. The details of the novel unit dosage form of the present invention depend on the particular compound used and the effect to be achieved and the pharmacology of each compound in the host.

【００３７】 本明細書中で使用された「アルツハイマー病（本明細書中で「AD」と略される
）」という用語は、本来海馬及び大脳皮質中に在るβ-アミロイドタンパク質を
本質的に含む軸索プラークの形成に関する容態、並びに、学習及び記憶の両方の
損傷を意味する。本明細書中で使用された「AD」とは、AD及びAD型病状の両方を
含むことを意味する。The term “Alzheimer's disease (abbreviated herein as“ AD ”)” as used herein essentially refers to the β-amyloid protein originally present in the hippocampus and cerebral cortex. It is implicated in the formation of axonal plaques, including impaired both learning and memory. As used herein, "AD" is meant to include both AD and AD type pathologies.

【００３８】 本明細書中で使用された「AD型病状」という用語は、必ずしもこれらに限定さ
れるわけではないが、海馬及び大脳皮質中のβ-アミロイドタンパク質を含む軸
索プラークの形成を含む、CNS変化の組み合わせを意味する。そのようなAD型病
状には、必ずしもこれらに限定されるわけではないが、APPの異常な発現及び/ま
たは沈着、APPの過剰発現、異常なAPP遺伝子産物の発現、並びにADに関連するそ
の他の現象と関連した疾患が含まれうる。AD型病状の例として、必ずしもこれら
に限定されるわけではないが、APPの過剰発現に関連するダウン症に関連したAD
型病状が含まれる。The term “AD type pathology” as used herein includes, but is not necessarily limited to, the formation of axon plaques containing β-amyloid protein in the hippocampus and cerebral cortex. , Means a combination of CNS changes. Such AD-type pathologies include, but are not necessarily limited to, aberrant APP expression and / or deposition, APP overexpression, aberrant APP gene product expression, and other AD-related pathologies. Diseases associated with the phenomenon may be included. Examples of AD-type pathologies include, but are not necessarily limited to, AD associated with Down's syndrome associated with APP overexpression.
Type conditions are included.

【００３９】 本明細書中で使用される「アルツハイマー病に関連する現象」という用語は、
ADに関連した構造的事象、分子的事象、または機能的な事象を意味し、特に動物
モデルにおいて容易に評価されうる事象を意味する。このような事象には、必ず
しもこれらに限定されるわけではないが、アミロイド沈着、神経病理学的発展、
学習及び記憶障害、並びに、その他のAD関連性特徴が含まれる。The term “phenomenon associated with Alzheimer's disease” as used herein refers to
It refers to a structural, molecular, or functional event associated with AD, particularly an event that can be readily evaluated in an animal model. Such events include, but are not necessarily limited to, amyloid deposits, neuropathological development,
Includes learning and memory deficits, as well as other AD-related features.

【００４０】 本明細書中で使用される「脳性アミロイド血管障害（本明細書中でCAAと略さ
れる）」という用語は、脳実質内出血を併発し得る大脳血管内のアミロイド沈着
の形成と関連した症状を意味する。CAAはまた、脳卒中の危険性の上昇、並びに
脳出血及びくも膜下出血の発生の危険性の上昇と関連する（Vinters、Stroke 18
:311〜324(1987年)；Haanら、Dementia 5:210〜213(1994年)；Itohら、J.Neurol
.Sci. 116:135〜414(1993年)）。CAAはまた、出血が始まる前の痴呆に関連する
。CAAと関連する血管アミロイド沈着は、ADがない場合でも存在し得るが、多く
の場合ADと関連する。As used herein, the term "cerebral amyloid angiopathy (abbreviated herein as CAA)" is associated with the formation of amyloid deposits in cerebral blood vessels that can be complicated by intracerebral hemorrhage. It means the symptom. CAA is also associated with an increased risk of stroke and an increased risk of developing cerebral and subarachnoid hemorrhage (Vinters, Stroke 18
: 311-324 (1987); Haan et al., Dementia 5: 210-213 (1994); Itoh et al., J. Neurol.
.Sci. 116: 135-414 (1993)). CAA is also associated with dementia before bleeding begins. Vascular amyloid deposits associated with CAA are often present in the absence of AD, but are often associated with AD.

【００４１】 本明細書中で使用される「脳性アミロイド血管障害と関連した現象」という用
語は、CAAに関連する分子的事象、構造的事象、または機能的事象、特に動物モ
デルにおいて容易に評価されうる事象を意味する。このような事象には、必ずし
もこれらに限定されるわけではないが、アミロイド沈着、脳実質内出血、及び他
のCAA関連性特徴が含まれる。The term “phenomenon associated with cerebral amyloid angiopathy” as used herein is readily assessed in molecular, structural, or functional events associated with CAA, particularly in animal models. Means a possible event. Such events include, but are not necessarily limited to, amyloid deposits, intracerebral hemorrhage, and other CAA-related features.

【００４２】 本明細書中で使用される「β-アミロイド沈着」という用語は、Aβ及びその他
の物質により構成される、脳における沈着物を意味する。The term “β-amyloid deposits” as used herein refers to deposits in the brain composed of Aβ and other substances.

【００４３】 本明細書で用いる「相乗作用」という用語は、単独で適用された同じ刺激に対
する反応の合計よりも大きい、2つまたはそれ以上の刺激に対する反応のことを
指す。例えば、Aβ:PGE2に曝露された小グリア細胞は、例えばサイトカイン値の
上昇によって明示される通り、AβまたはPGE2のいずれか単独による活性化の合
計よりも高いレベルを呈する。同様に「相乗作用」とは、例えば小グリア細胞の
Aβ:PGE2活性化に応じたサイトカイン発現の増加といった、相乗作用に起因する
効果でもある。As used herein, the term “synergy” refers to a response to two or more stimuli that is greater than the sum of the responses to the same stimulus applied alone. For example, microglial cells exposed to Aβ: PGE 2 exhibit higher levels than the sum of activation by either Aβ or PGE 2 alone, as evidenced by elevated cytokine levels, for example. Similarly, "synergism" means, for example,
It is also an effect resulting from synergism, such as an increase in cytokine expression in response to Aβ: PGE 2 activation.

【００４４】 本明細書で用いる「標準化プロフィール」「標準」などの用語は、標準が例え
ばイムノアッセイ法および/またはバイオアッセイ法のための基準物質としての
役割を果たせるように、サイトカイン発現およびバックグラウンド特性などの細
胞活性のレベルが十分に確立されている、小グリア細胞活性化アッセイ法用の調
製物のことを指す。標準化プロフィールは、小グリア活性化を判定する目的で用
いるために十分に確立された1つまたは複数の特性を有する。このような特性は
、好ましくは、例えばサイトカイン分泌、一酸化窒素合成酵素（NOS）もしくは
その産物の増加、活性酸素種（ROS）または活性化にかかわるLFA-1、VLA-4もし
くはMac-1といった分子の発現などの、細胞活性の変化である。As used herein, terms such as “standardized profile” “standard” refer to cytokine expression and background characteristics such that the standard can serve as a reference substance for, eg, immunoassays and / or bioassays. Refers to a preparation for a microglial cell activation assay in which the level of cell activity such as is well established. The standardized profile has one or more well-established properties for use in determining microglial activation. Such properties are preferably, for example, LFA-1, VLA-4 or Mac-1 involved in cytokine secretion, increased nitric oxide synthase (NOS) or its products, reactive oxygen species (ROS) or activation. A change in cell activity, such as expression of a molecule.

【００４５】 一般的方法論 本発明のアッセイ法、方法および化合物は、小グリア活性化を調節するため、
特に例えばサイトカイン放出などの小グリア分泌を抑制するための治療薬として
の、小グリア上のPGE2受容体の使用に向けられている。本発明の基となる中心的
な発見は、PGE2受容体アイソフォームEP2およびEP4が小グリア上に存在するとい
うことである。本発明のアッセイ法および方法は、1）炎症性二次メッセンジャ
ーであるTNF-αの誘導によって明示された、小グリア活性化におけるPGE2アイソ
フォームとAβとの間の相乗的反応の、および2）IL-1α合成/分泌によって明示
された、初代グリア細胞培養物におけるPGE2アイソフォームとAβとの相乗的反
応の、観察に基づく。これらのIL-1α反応は、特定の神経変性疾病に関与する分
子を同定するため、ならびにPGE2受容体アイソフォームの活性および/またはPGE 2 シグナル伝達経路における他の分子の活性の操作によってこれらの疾病の進行
を変化させる、停止させるもしくは予防する化合物を同定するために用いうる。
PGE2受容体アイソフォームを通じて活性を調節するものとして同定された化合物
は、小グリア活性化および蛋白質分泌を変化させ、それによって神経変性疾患に
おける炎症反応の進行を変化させるために用いることが可能である。[0045] General methodology   The assays, methods and compounds of the invention are for modulating microglia activation,
Especially as a therapeutic agent for suppressing microglial secretion such as cytokine release
, PGE on small glial2It is directed to the use of receptors. The core of the present invention
The discovery is PGE2Receptor isoforms EP2 and EP4 are present on microglia
Is to say. The assay method and method of the present invention comprises: 1) an inflammatory second messenger
-Induced PGE in microglial activation revealed by induction of TNF-α2Iso
Of synergistic reaction between form and Aβ, and 2) manifested by IL-1α synthesis / secretion
PGE in primary glial cell cultures2Synergistic reaction between isoform and Aβ
Responsive, based on observation. These IL-1α responses are related to specific neurodegenerative diseases.
To identify offspring as well as PGE2Receptor isoform activity and / or PGE 2 The progression of these diseases by manipulating the activity of other molecules in the signaling pathway
Can be used to identify compounds that alter, arrest or prevent.
PGE2Compounds identified as modulating activity through receptor isoforms
Alters microglial activation and protein secretion, leading to neurodegenerative diseases
It can be used to alter the progression of the inflammatory response in.

【００４６】 例えば、本発明のアッセイ法を用いて、Aβに反応した小グリア活性化に関与
する特定のPGE2受容体アイソフォームを同定した。PGE2受容体のEP4アイソフォ
ームが小グリア活性化に関与しているという所見から、EP4アイソフォームに特
異的であって他のPGE2アイソフォームには影響を及ぼさない化合物を用いて、PG
E2:Aβによる相乗的な小グリア活性化を抑制するためのEP4の治療的ターゲティ
ングが可能となる。EP3は胃出血および潰瘍誘発を含む胃腸疾患を媒介すること
が知られていることから、これはEP3を含む他のアイソフォームに対する作用を
含む従来のNSAIDおよびCOX-2阻害薬よりも優れる大きな利点である。本発明の方
法によって同定された化合物を用いることにより、小グリアにおけるPGE2の有害
な作用を遮断する一方で、消化管などの領域におけるPGE2の有益な作用を保持す
ることが可能である。For example, the assay of the present invention was used to identify specific PGE 2 receptor isoforms involved in microglial activation in response to Aβ. The finding that the EP4 isoform of the PGE 2 receptor is involved in microglial activation was followed by the use of compounds that are specific for the EP4 isoform and do not affect other PGE 2 isoforms.
Allows therapeutic targeting of EP4 to suppress synergistic microglial activation by E 2 : Aβ. Since EP3 is known to mediate gastrointestinal disorders including gastric bleeding and ulcer induction, this is a major advantage over conventional NSAIDs and COX-2 inhibitors, including their effects on other isoforms including EP3. Is. By using the compounds identified by the method of the present invention, it is possible to block the deleterious effects of PGE 2 in microglia while retaining the beneficial effects of PGE 2 in areas such as the gastrointestinal tract.

【００４７】 本発明の例示的アッセイ法 Aβ:PGE2媒介性小グリア活性化を調節する化合物の同定および特徴決定のため
には、インビボまたはインビトロの方法のいずれも用いることができる。さまざ
まなインビトロアッセイ法に用いうる被験試料には、マウス培養細胞によって馴
化された組織培養液のアリコート、ヒト培養細胞によって馴化された組織培養液
のアリコート、マウス培養細胞抽出物、マウス脳器官型スライスもしくは移植片
によって馴化された組織培養液、マウス脳器官型スライスもしくは移植片、ヒト
培養細胞抽出物、マウス血漿、ヒト血漿、3種のヒトapoEアイソフォームのうち1
つを発現するように遺伝的に操作されたトランスジェニックマウスからの血漿、
改変型APPを有するトランスジェニックマウスからの血漿、またはヒトもしくは
マウスのCSFもしくは組織抽出物が含まれるが、これらに限定されない。Exemplary Assays of the Invention Either in vivo or in vitro methods can be used to identify and characterize compounds that modulate Aβ: PGE 2 -mediated microglial activation. Test samples that can be used in various in vitro assays include tissue culture aliquots conditioned by mouse cell cultures, tissue culture aliquots conditioned by human cell cultures, mouse cell extract, mouse brain organotypic slices. Or tissue culture conditioned by transplant, mouse brain organotypic slices or transplants, human cell extract, mouse plasma, human plasma, 1 of 3 human apoE isoforms
Plasma from transgenic mice genetically engineered to express
Examples include, but are not limited to, plasma from transgenic mice with modified APP, or human or mouse CSF or tissue extracts.

【００４８】インビトロアッセイ法 本発明の化合物がAβおよびPGE2媒介性小グリア活性化を変化させる効果を測
定するために、種々のインビトロアッセイ法を用いることができる。AβおよびP
GE2媒介性小グリア分泌に対する化合物の効果は、細胞培養液の固相酵素免疫ア
ッセイ法（ELISA）、ウエスタンブロット分析もしくは免疫沈降法、免疫細胞化
学、グリース反応、またはROSもしくはNOの評価を非制限的に含む方法によって
測定しうる。In Vitro Assays A variety of in vitro assays can be used to measure the effect of the compounds of the invention on altering Aβ and PGE 2 -mediated microglial activation. Aβ and P
The effect of compounds on GE 2 -mediated microglial secretion was assessed by solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot analysis or immunoprecipitation, immunocytochemistry, Griess reaction, or evaluation of ROS or NO in cell culture media. It can be measured by a method including by limitation.

【００４９】 例えば、サイトカイン、特にTNF-α、IL-1αまたはIL-6のレベルを測定するこ
とにより、インビトロアッセイ法で、PGE2とAβとの間の相乗的反応に対する化
合物の効果を決定することができる。96穴マイクロタイタープレート中で、等量
の小グリア細胞系または小グリアを含む初代脳培養物を培養する。培養物をAβ
およびPGE2で処理する。さまざまな用量の化合物（薬物）をマイクロタイタープ
レートに添加し、細胞を適切な期間、例えば12時間にわたり37℃でインキュベー
トする。インキュベーションの完了後に、細胞培養液および可溶化液中に分泌さ
れたサイトカインのレベルを測定して化合物の効果を判定することができる。In vitro assays determine the effect of compounds on the synergistic reaction between PGE 2 and Aβ, for example by measuring the levels of cytokines, especially TNF-α, IL-1α or IL-6. be able to. Culture primary brain cultures containing equal amounts of microglial cell lines or microglia in 96-well microtiter plates. Aβ culture
And PGE 2 . Various doses of compound (drug) are added to the microtiter plate and the cells are incubated at 37 ° C for a suitable period of time, for example 12 hours. After completion of the incubation, the levels of cytokines secreted into the cell culture and lysate can be measured to determine the effect of the compound.

【００５０】 さらにもう1つの例では、特定の神経変性疾病に関与するPGE2受容体アイソフ
ォームを同定するため、PGE2活性の操作によってこれらの疾病の進行を変化させ
る、停止させるまたは予防する化合物を同定するために、IL-1αまたはIL-6反応
を用いることもできる。これは細胞自体の直接アッセイ法によって行う。小グリ
ア細胞などの神経変性による病的状態に関与する細胞を、RT-PCR分析によって、
PGE2受容体アイソフォームのmRNA、特にEP4アイソフォームの有無に関して分析
することが可能である。In yet another example, in order to identify PGE 2 receptor isoforms involved in certain neurodegenerative diseases, compounds that alter, arrest or prevent the progression of these diseases by engineering PGE 2 activity. The IL-1α or IL-6 reaction can also be used to identify This is done by a direct assay on the cells themselves. By RT-PCR analysis, cells involved in pathological conditions due to neurodegeneration such as microglial cells
It is possible to analyze for the presence or absence of the mRNA of the PGE 2 receptor isoform, especially the EP4 isoform.

【００５１】 さらにもう1つの例では、混合リンパ球反応（MLR）が、PMBCを小グリア活性化
に関する代用マーカーとして用いて、本発明の化合物のそれぞれの生物活性を決
定するための有益なスクリーニング用ツールとなる。MLRでは、健康志願者から
ヘパリン処理容器内に全血を採取することによってPBMC（末梢血単核細胞）を入
手し、同量のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で希釈する。この混合物をフィコー
ル・ハイパック（Ficoll-Hypaque）（登録商標）勾配などのショ糖密度勾配上に
重層化し、1000×gで25分間、室温またはそれ以下で遠心処理を行う。血漿-フィ
コール境界面のバンドからPBMCを採取し、分離した上で、HBSSなどの生理食塩液
で少なくとも2回洗浄する。混入した赤血球を、37℃で10分間のACK溶解などによ
って可溶化させ、PBMCをHBSSで2回洗浄する。精製PBMCのペレットをRPMI 1640＋
20％ヒト非動化血清などの完全培地中に再懸濁する。96穴マイクロタイタープレ
ート中で行うMLRにより、PBMCの活性化および/またはサイトカイン分泌を判定す
る。簡潔に述べると、約105個の精製PBMC細胞を200μlの完全培地中で共培養し
、候補化合物の存在下または非存在下でAβおよびPGE2により処理する。続いて
小グリア活性化に対する化合物の効果を判定する。In yet another example, a mixed lymphocyte reaction (MLR) uses PMBC as a surrogate marker for microglial activation for useful screening to determine the biological activity of each of the compounds of the invention. Become a tool. In MLR, PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) are obtained by collecting whole blood from healthy volunteers in heparinized vessels and diluted with an equal volume of Hanks balanced salt solution (HBSS). This mixture is layered on a sucrose density gradient such as a Ficoll-Hypaque® gradient and centrifuged at 1000 × g for 25 minutes at room temperature or below. PBMCs are collected from the plasma-Ficoll interface band, separated and washed at least twice with a physiological saline solution such as HBSS. The contaminated red blood cells are solubilized by ACK lysis or the like at 37 ° C for 10 minutes, and PBMCs are washed twice with HBSS. Purified PBMC pellets RPMI 1640+
Resuspend in complete medium such as 20% human immobilized serum. Activation of PBMC and / or cytokine secretion is determined by MLR performed in 96-well microtiter plates. Briefly, about 10 5 purified PBMC cells are co-cultured in 200 μl complete medium and treated with Aβ and PGE 2 in the presence or absence of candidate compounds. The effect of the compound on microglia activation is then determined.

【００５２】 本発明の方法を利用するその他のインビトロアッセイ法を用いてもよく、それ
らは本開示および本明細書に記載されたアッセイ法の例を読むことにより、当業
者には明らかになると考えられる。Other in vitro assays utilizing the methods of the invention may be used and will be apparent to those of ordinary skill in the art upon reading the disclosure and examples of assays described herein. To be

【００５３】生物アッセイ法 PGE2媒介性小グリア細胞活性に対する化合物の効果を決定するためにアルツハ
イマー病の動物モデルを用いることができる。AD表現型のスクリーニングには、
これらに限定されるわけではないが、以下を含む現象についての評価が含まれう
る：1)分子マーカー（例えば、脳組織中のサイトカインの分泌レベル；PGE2活性
の有無；種々のAβ活性化グリアの脳組織における有無；軸索プラークの形成な
ど）の分析；2）記憶及び学習に関連する行動症状の評価；3）ニューロンの選択
集団の喪失に特徴付けられた神経変性の検出（神経変性は例えば、脳組織におけ
るシナプトフィシン発現の検出、または、神経繊維等の神経細胞体タンパク質染
色後の形態学に基づいた直接的な定量により測定されうる）（例えば、Gamesら
、Nature 373:523〜7（1995年）参照）。CAAについてのスクリーニングには、こ
れらに限定されるわけではないが、以下を含む現象についての評価が含まれ得る
：1)分子マーカーの分析（例えば、脳血管組織中のタンパク質の発現レベル；CA
Aと関連する種々の遺伝的変種、アイソフォーム及び変異体の脳組織における存
在/不在；脳血管アミロイド沈着の形成）；並びに、2）アミロイド沈着と関連す
る脳出血の検出。これらの現象はスクリーニングアッセイ法を単独、または組み
合わせることにより評価されうる。 Bioassays Animal models of Alzheimer's disease can be used to determine the effect of compounds on PGE 2 -mediated microglial activity. For AD phenotype screening,
Evaluations may be included for phenomena including, but not limited to: 1) molecular markers (eg, cytokine secretion levels in brain tissue; presence or absence of PGE 2 activity; various Aβ-activating glia). Presence / absence in brain tissue; axon plaque formation, etc.); 2) evaluation of behavioral symptoms related to memory and learning; 3) detection of neurodegeneration characterized by loss of a selected population of neurons For example, it can be measured by detection of synaptophysin expression in brain tissue, or by direct quantification based on morphology after staining of nerve cell body proteins such as nerve fibers) (eg, Games et al., Nature 373: 523-7 ( 1995))). Screening for CAA can include evaluation for phenomena including, but not limited to: 1) analysis of molecular markers (eg, expression levels of proteins in cerebrovascular tissue; CA
Presence / absence of various genetic variants, isoforms and variants associated with A in brain tissue; formation of cerebrovascular amyloid deposits); and 2) detection of cerebral hemorrhage associated with amyloid deposits. These phenomena can be assessed by screening assays alone or in combination.

【００５４】 好ましくは、スクリーニングには対照値、例えば試験化合物（化合物群）非存
在下での試験動物中のアミロイド生成レベルを含むと考えられる。陽性、即ちAD
またはCAAの治療において有益である可能性を有すると考えられる試験物質は、A
D関連現象またはCAA関連現象に対して実質的な効果を有するもの（例えば、Aβ
沈着レベルを、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、そ
して最も好ましくは少なくとも80％減少させることができる試験薬剤）であると
考えられる。Preferably, the screen will include a control value, eg the level of amyloid formation in the test animal in the absence of the test compound (compounds). Positive, ie AD
Or a test substance that is considered to have potential benefit in the treatment of CAA is A
Those that have a substantial effect on D-related or CAA-related phenomena (eg, Aβ
It is believed to be a test agent) capable of reducing the deposition level by preferably at least 20%, more preferably at least 50% and most preferably at least 80%.

【００５５】 これらの現象を評価するための方法、ならびにAD及び/またはCAAの治療のため
の化合物から予想される効果は当分野において周知である。例えば、種々のスク
リーニングアッセイ法においてトランスジェニック動物を使用するための方法、
例えば化合物のADに対する効果の試験等は、1996年12月19日に公開された国際公
開広報第96/40896号、1996年12月19日に公開された国際公開広報第96/40895号、
1995年5月4日に公開された国際公開広報第95/11994号（Aβのインビボにおける
モニタリングのための方法及び組成物について記載している；各々は、このよう
なスクリーニングアッセイ法及び技術のための方法および組成物の開示に関して
、参照として本明細書に組み入れられている）に見出される。Methods for assessing these phenomena, as well as the expected effects from compounds for the treatment of AD and / or CAA, are well known in the art. For example, methods for using transgenic animals in various screening assays,
For example, the test of the effect of the compound on AD, the international publication No. 96/40896 published on December 19, 1996, the international publication No. 96/40895 published on December 19, 1996,
International Publication No. WO 95/11994, published May 4, 1995 (describes methods and compositions for in vivo monitoring of Aβ; each is for such screening assays and techniques). , Which is hereby incorporated by reference for its disclosure of methods and compositions.

【００５６】 化合物への曝露後、動物を殺し、次のどちらかについて免疫組織学的に分析す
る：1)脳内の軸索プラーク（ADモデル）、ならびに/または、2）脳血管壁上のア
ミロイド沈着（CAAモデル）ならびに/または、3）小グリア細胞数及び/もしくは
活性化状態（正常な動物）。（例えば、4％パラホルムアルデヒド中で）脳組織
を固定し、切片とする；切片を、TNF-α、Aβペプチド、LFA-1、VLA-4、IL-6ま
たはIL-1αなど、PGE2媒介性小グリア細胞活性を示唆する配列の発現に反応性の
抗体で染色する。フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
またはアルカリホスファターゼと接合した二次抗体を、一次抗体の検出に用いる
。これらの実験は、アミロイドプラークの同定を可能にし、また、これらのプラ
ークの、脳の特定領域への局部化が可能となる。Following compound exposure, animals are killed and immunohistologically analyzed for either: 1) axonal plaques in the brain (AD model) and / or 2) on cerebral vascular walls. Amyloid deposition (CAA model) and / or 3) Microglial cell count and / or activation status (normal animals). Brain tissue is fixed and sectioned (eg, in 4% paraformaldehyde); sections are PGE 2 mediated, such as TNF-α, Aβ peptide, LFA-1, VLA-4, IL-6 or IL-1α Stain with an antibody reactive with the expression of a sequence suggesting sex microglial activity. Fluorescein, rhodamine, horseradish peroxidase,
Alternatively, a secondary antibody conjugated to alkaline phosphatase is used to detect the primary antibody. These experiments allow the identification of amyloid plaques and the localization of these plaques to specific areas of the brain.

【００５７】 切片をまた、Alz-50、tau、A2B5、神経繊維、ニューロン特異的エノラーゼ並
びにその他のアルツハイマー性プラーク及び/またはCAAプラークに特徴的な抗原
等の抗原を認識する、アルツハイマー性プラークを診断するための他の抗体で染
色する。軸索プラーク内のAβ沈着物と、ADのNFTまたはCAAにおけるような血管
壁に沿ったNFTの共局在化を分析するために、チオフラビン及びコンゴーレッド
による染色もまた行うことができる。Sections are also used to diagnose Alzheimer's plaques that recognize antigens such as Alz-50, tau, A2B5, nerve fibers, neuron-specific enolase and other Alzheimer's plaques and / or antigens characteristic of CAA plaques. Stain with another antibody to Staining with thioflavin and Congo red can also be performed to analyze the co-localization of Aβ deposits within axonal plaques and NFTs along the vessel wall as in NFTs or CAA of AD.

【００５８】標準化プロフィール 本発明のもう1つの態様では、Aβ:PGE2媒介性小グリア細胞の活性化および/ま
たはサイトカイン産生を、標準化プロフィールを用いて決定する。このプロフィ
ールは、例えばPGE2受容体アンタゴニストなどの化合物で処理した細胞と、その
特定の細胞種の非処理細胞に関する標準化プロフィールとの間の差を決定するた
めに用いられうる。標準化プロフィールは、統計的に有意な数の試料、好ましく
は少なくとも20個、より好ましくは少なくとも50個、さらにより好ましくは少な
くとも100個の試料を用いて作製する。初代培養物を標準のために用いる場合に
は、標準プロフィールを作製するために用いる試料を年齢、表現型などに関して
一致させることが好ましい。例えば、標準化プロフィールを、ADに罹患した70歳
〜84歳の人から採取した末梢血試料に関して決定することができる。もう1つの
例では、標準化プロフィールを、70歳〜85歳の痴呆でない人からの細胞に関して
決定することができる。さらにもう1つの例では、小グリア細胞系に関して標準
を決定してもよい。 Normalization Profile In another embodiment of the invention, Aβ: PGE 2 -mediated microglial activation and / or cytokine production is determined using a standardization profile. This profile can be used, for example, to determine the difference between cells treated with a compound such as a PGE 2 receptor antagonist and the normalized profile for untreated cells of that particular cell type. The standardization profile is generated using a statistically significant number of samples, preferably at least 20, more preferably at least 50 and even more preferably at least 100 samples. If primary cultures are used for standards, it is preferred that the samples used to generate the standard profile be matched for age, phenotype, etc. For example, a standardized profile can be determined on a peripheral blood sample taken from a person aged 70-84 years with AD. In another example, a standardized profile can be determined for cells from non-demented persons aged 70-85. In yet another example, the standard may be determined for the microglial cell line.

【００５９】 ひとたび標準を作製して、決定的な特性を決定すると、この標準を用いてアッ
セイ法間のデータのハーモナイゼーションを行うことができる。例えば、比較す
る小グリア活性化アッセイ法にプロトコールの差があり、ヒト試料に関して異な
るアッセイ値が生じていることがある。これらのアッセイ法のそれぞれを特性の
知られた対照としての標準に対して行うことにより、異なるアッセイ法間のハー
モナイゼーションを行える補正値を決定できる。ヒトCNS標準を、例えば、1：2
希釈、1：5希釈、1：10希釈および1：50希釈といった数多くの濃度に希釈し、比
較する小グリア活性化アッセイ法をヒト試料の各希釈物に対して行う。各希釈物
に関して得られたアッセイ値の結果を用いて、試料における小グリア活性化に関
して決定された真の値を反映するように、データのハーモナイゼーションのため
の補正値を決定する。Once the standard has been created and the critical properties have been determined, this standard can be used to harmonize data between assays. For example, there may be protocol differences in the microglia activation assays that are being compared, resulting in different assay values for human samples. Performing each of these assays against a standard as a well-characterized control can determine a correction value that allows for harmonization between different assays. Human CNS standards, eg, 1: 2
Dilute to a number of concentrations such as dilution, 1: 5 dilution, 1:10 dilution and 1:50 dilution and compare microglia activation assay for each dilution of the human sample. The results of the assay values obtained for each dilution are used to determine a correction value for the harmonization of the data to reflect the true value determined for microglia activation in the sample.

【００６０】 本発明の化合物 本発明のアッセイ法を、ADまたはCAAなどの神経疾患の治療に治療薬として用
いるための化合物を同定するために用いることができる。本発明の化合物は、小
グリアの相乗的活性化に関与する任意の経路に影響を及ぼすと思われ、好ましく
は、PGE2受容体アイソフォーム媒介性活性、特にEP4アイソフォーム媒介性活性
を変化させる。本発明の方法を用いて小グリア活性化を変化させるものとして同
定された化合物は、神経疾患の治療において治療薬および/または予防薬として
用いることができる。Compounds of the Invention The assays of the invention can be used to identify compounds for use as therapeutic agents in the treatment of neurological disorders such as AD or CAA. The compounds of the invention are believed to affect any pathway involved in synergistic activation of microglia and preferably alter PGE 2 receptor isoform mediated activity, particularly EP 4 isoform mediated activity. . The compounds identified as altering microglia activation using the methods of the invention can be used as therapeutic and / or prophylactic agents in the treatment of neurological disorders.

【００６１】 候補化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、多種多様
な源より得られうる。例えばランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチド
の発現を含む、多種多様な有機化合物及び生物分子のランダム合成、並びに直接
合成のための多数の手段を利用することができる。細菌抽出物、真菌抽出物、植
物抽出物及び動物抽出物の形態である天然化合物のライブラリーが利用可能であ
るか、または容易に製造することができる。さらに、天然または人工的に作製し
たライブラリー及び化合物を、従来の化学的手段、物理的手段及び生化学的手段
により容易に改変して、コンビナトリアルライブラリーを製造するのに用いるこ
とができる。公知の薬学的化合物を、たとえばアシル化、アルキル化、エステル
化、アミド化等の直接的化学修飾またはランダムな化学修飾に付して構造的類似
体を製造することができる。Candidate compounds may be obtained from a wide variety of sources including libraries of synthetic or natural compounds. Numerous means are available for random synthesis of a wide variety of organic compounds and biomolecules, including direct expression of randomized oligonucleotides and oligopeptides, as well as direct synthesis. Libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts are available or can be readily prepared. Moreover, natural or artificially produced libraries and compounds can be readily modified by conventional chemical, physical and biochemical means, and used to produce combinatorial libraries. Known pharmaceutical compounds can be subjected to direct or random chemical modifications such as acylation, alkylation, esterification, amidation to produce structural analogs.

【００６２】 神経変性疾患の治療 方法および本発明のアッセイ法を用いて同定された化合物は、治療を必要とす
る被験者、すなわち、神経変性疾患に罹患した、またはそのリスクがある被験者
に投与しうる。本化合物は、小グリア細胞の活性化および/またはサイトカイン
分泌の低下といった望ましい効果をもたらしうる任意の好都合な手段を用いて被
験者に投与することができる。Methods of Treating Neurodegenerative Diseases and compounds identified using the assays of the invention may be administered to a subject in need of treatment, ie, a subject suffering from or at risk for a neurodegenerative disease. . The compounds can be administered to a subject using any convenient means that can provide the desired effect, such as activation of microglial cells and / or reduction of cytokine secretion.

【００６３】 化合物は治療投与のための様々な製剤に組み込まれうる。より具体的には、本
発明の化合物を、適切な薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせる
ことにより、医薬組成物として処方することができ、そして、錠剤、カプセル、
粉末、顆粒剤、軟膏、溶剤、経皮パッチ、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾ
ル等の、固体、半固体、液体または気体の形の製剤へと調剤することができる。The compounds may be incorporated into a variety of formulations for therapeutic administration. More specifically, the compounds of the present invention may be formulated as a pharmaceutical composition by combining with a suitable pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and tablets, capsules,
It can be formulated into solid, semisolid, liquid or gaseous forms, such as powders, granules, ointments, solvents, transdermal patches, suppositories, injections, inhalants, and aerosols.

【００６４】 そのように、化合物の投与を、経口、舌下、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経
皮、肺循環（pulmonary）、気管内等の投与を含む多様な方法により達成するこ
とができる。As such, administration of the compounds may be accomplished by a variety of methods including oral, sublingual, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, transdermal, pulmonary, intratracheal, etc. administration. You can

【００６５】 薬学的剤形において、化合物をその薬学的に許容されうる塩の形状で投与する
ことができ、またそれらを単独、もしくは、他の薬学的に活性な化合物と適当に
連係して、及び、組み合わせて使用することもできる。以下の方法、及び、賦形
剤は単なる例示であって、いかなる意味でも限定を加えるものではない。In a pharmaceutical dosage form, the compounds may be administered in the form of their pharmaceutically acceptable salts and they may be alone or in appropriate association with other pharmaceutically active compounds, Also, they can be used in combination. The following methods and excipients are merely exemplary and are in no way limiting.

【００６６】 経口製剤として、化合物を単独または錠剤、粉末、顆粒剤もしくはカプセルを
作るのに適当な添加剤と組み合わせて、用いることができる。例となる添加剤は
：ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプン等の従
来の添加剤；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスタ
ーチまたはゼラチン等の結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカ
ルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マ
グネシウム等の潤滑剤；および、望ましいならば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防
腐剤及び香味薬剤である。As oral formulations, the compounds can be used alone or in combination with suitable additives to make tablets, powders, granules or capsules. Exemplary additives are: conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; binders such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatin; corn starch, potato starch or sodium carboxymethyl cellulose. Disintegrants; lubricants such as talc or magnesium stearate; and, if desired, diluents, buffers, wetting agents, preservatives and flavoring agents.

【００６７】 本発明の化合物を、注射用の製剤として、化合物を植物油もしくは他の同様な
油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸エステルもしくはプロピレングリコール等
の、水性または非水性の溶媒中に、溶解、懸濁、または乳化することにより調製
することができる。望ましいならば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定
剤及び防腐剤などの従来の添加剤もまた添加することができる。製剤中の治療的
に活性な化合物の濃度は、約0.5重量％〜100重量％の範囲で変化してもよい。The compounds of the present invention, as a formulation for injection, are dissolved and suspended in aqueous or non-aqueous solvents such as vegetable oils or other similar oils, synthetic fatty acid glycerides, high fatty acid esters or propylene glycol. It can be prepared by turbidity or emulsification. If desired, conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizers and preservatives can also be added. The concentration of therapeutically active compound in the formulation may vary from about 0.5% to 100% by weight.

【００６８】 化合物を吸入により投与するために、エアロゾル製剤として使用することがで
きる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、許
容される圧縮された噴射剤中に調製することができる。The compounds may be used as an aerosol formulation for administration by inhalation. The compounds of the present invention can be prepared in an acceptable compressed propellant such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.

【００６９】 さらに、乳化基材または水溶性基材等の多様な基材と混合することにより、化
合物を坐剤とすることができる。本発明の化合物を、坐剤によって直腸投与する
ことができる。坐剤は、ココアバター、カーボワックス及びポリエチレングリコ
ール等の、体温で融解するが室温では凝固するビヒクルを含むことができる。Furthermore, the compounds can be made into suppositories by mixing with a variety of bases such as emulsifying bases or water-soluble bases. The compounds of the present invention may be administered rectally by suppository. The suppository can include vehicles such as cocoa butter, carbowaxes and polyethylene glycols, which melt at body temperature but solidify at room temperature.

【００７０】 シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤などの経口投与または直腸投与のための
単位剤形は、各用量単位（例えば、茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯、錠剤ま
たは坐剤）が、1つもしくはそれ以上の阻害剤を含む組成物を予め決められた量
含むように提供されうる。同様に、注射または静脈投与のための単位剤形は、組
成物中の阻害剤（または複数）を、溶液として滅菌水、通常の生理食塩水または
他の薬学的に許容されうる担体中に含んでもよい。Unit dosage forms for oral or rectal administration, such as syrups, elixirs and suspensions, one for each dose unit (eg 1 teaspoon, 1 tablespoon, tablets or suppositories) Alternatively, a composition containing more than one inhibitor may be provided to include a predetermined amount. Similarly, a unit dosage form for injection or intravenous administration comprises the inhibitor (s) in the composition as a solution in sterile water, normal saline or other pharmaceutically acceptable carrier. But it's okay.

【００７１】 ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤等の薬学的に許容されうる賦形剤
は、容易に公衆が入手可能である。さらに、pH調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、
安定剤、加湿剤等の、薬学的に許容されうる補助的な物質は容易に公衆が入手可
能である。Pharmaceutically acceptable excipients such as vehicles, adjuvants, carriers or diluents are readily available to the public. Furthermore, pH adjusters and buffers, tonicity adjusters,
Pharmaceutically acceptable auxiliary substances such as stabilizers, humectants and the like are readily available to the public.

【００７２】 本発明の方法における使用のための化合物はまた、50ダルトンより多く約2500
ダルトンよりも少ない分子量を有する小さな有機化合物であってよい。候補化合
物はタンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典
型的には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシ
ル基を、好ましくは化学官能基の内から少なくとも2つを含む。候補化合物は、1
つもしくは複数の上記官能基で置換された、環状炭素構造もしくはヘテロ環構造
及び/または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含むことが多い。候補化合物は
また、これらに限定されないが、以下を含む生物分子の中からも発見される：ペ
プチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体
、またはそれらの組み合わせ。Compounds for use in the method of the invention also have greater than about 2500 Daltons and about 2500
It may be a small organic compound having a molecular weight lower than Dalton. Candidate compounds contain functional groups required for structural interactions with proteins, especially hydrogen bonds, and typically contain at least an amine group, a carbonyl group, a hydroxyl group or a carboxyl group, preferably at least one of the chemical functional groups. Including two. Candidate compound is 1
It often contains cyclic carbon structures or heterocyclic structures and / or aromatic or polyaromatic structures substituted with one or more of the above functional groups. Candidate compounds are also found among biomolecules including, but not limited to, peptides, sugars, fatty acids, steroids, purines, pyrimidines, derivatives, structural analogs, or combinations thereof.

【００７３】 生理学的に許容されうる担体中の化合物は0.5mg/kg重〜20mg/kg重の用量で、5
mg〜1400mg、より一般的には100mg〜1000mg、好ましくは500mg〜700mgの投与量
で宿主に添加される。コレステロール生合成を抑制する化合物についての投与量
は、コレステロール生合成が10％〜80％、より好ましくは20％〜70％、そして、
より一層好ましくは25％〜50％減少されるように選ばれる。PGE2受容体の活性を
阻害する化合物の投与量としては、サイトカイン及び/又は細胞毒の分泌が約20
％〜100％、好ましくは40％〜60％減少されるように選ばれる。PGE2活性を阻害
する化合物についての投与量は、例えば、小グリア細胞分泌が少なくとも50％減
少される等、標的分子の活性の割合が適当なレベルまで減少されるように選ばれ
る。The compound in a physiologically acceptable carrier has a dose of 0.5 mg / kg to 20 mg / kg by weight of
mg to 1400 mg, more usually 100 mg to 1000 mg, preferably 500 mg to 700 mg, is added to the host. The dose of the compound that suppresses cholesterol biosynthesis is such that cholesterol biosynthesis is 10% to 80%, more preferably 20% to 70%, and
Even more preferably selected to be reduced by 25% to 50%. The dose of the compound that inhibits the activity of the PGE 2 receptor is about 20 times the secretion of cytokines and / or cytotoxins.
% To 100%, preferably 40% to 60%. Dosages for compounds that inhibit PGE 2 activity are chosen such that the rate of activity of the target molecule is reduced to an appropriate level, eg, the microglial secretion is reduced by at least 50%.

【００７４】 本発明の組成物は通常、サイトカインの、Aβ:PGE2誘導された放出を、約10％
〜80％、より好ましくは20％〜70％、より一層好ましくは25％〜50％減少するよ
うな量で毎日投与されると考えられる。通常、一日の総用量は少なくとも約10mg
、通常少なくとも約400mg〜500mg、好ましくは約700mgであり、また約1500mgよ
り少なく、通常は約1000mgより少ないと考えられる。患者の通常の健康状態、薬
物に対する患者の反応、PGE2アンタゴニストが単独で用いられるか、または他の
薬物と組み合わせて用いられるか等によって、量を変化させることができる。日
々の投与は、1回または複数回で、通常約4回よりも少なくてよく、特に投与され
る薬物のレベルに依存する。The compositions of the present invention typically produce Aβ: PGE 2 -induced release of cytokines by about 10%.
It is believed to be administered daily in an amount that reduces by -80%, more preferably 20% -70%, even more preferably 25% -50%. Usually, the total daily dose is at least about 10 mg
Is usually at least about 400 mg to 500 mg, preferably about 700 mg, and is considered to be less than about 1500 mg and usually less than about 1000 mg. The amount can vary depending on the patient's normal health status, the patient's response to the drug, whether the PGE 2 antagonist is used alone or in combination with other drugs, etc. Daily administration may be one or more times, usually less than about 4 times, depending in particular on the level of drug administered.

【００７５】 実施例 以下の実施例は、当業者に完全な開示及び、本発明をどのように製造し、どの
ように使用するかの記載を提供するために示すものであって、発明とみなされる
範囲を限定することを意図したものではなく、示された実験が全てもしくは唯一
行われた実験であることを意味または暗示するものでもない。使用された数値（
例えば、量、温度、濃度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが
、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。他に指示のない限り、
部分とは重量部分、分子量とは平均分子量、温度とは摂氏温度、そして、圧力と
は大気圧またはその付近である。EXAMPLES The following examples are presented to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the invention, and are considered to be inventions. It is not intended to limit the scope presented, nor is it meant or implied that the experiments shown are all or the only experiments performed. The number used (
Efforts have been made to ensure accuracy with respect to amounts (eg, amounts, temperatures, concentrations, etc.), but some experimental error and deviation should be accounted for. Unless otherwise instructed
Portions are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric pressure.

【００７６】 実施例1：初代グリア細胞培養物の調製および特徴決定 星状細胞（astrocyte）との共培養によって培養小グリアの休止状態が促され
ることが知られているため、初代混合グリア培養物はPGE2:Aβ相乗作用を検討す
るための系として特に適している。簡潔に述べると、P3野生型マウスからの皮質
を、Ca2+およびMg2+を含まないHBSS（Gibco）中で解離した。髄膜を注意深く切
り離し、0.53mM EDTAおよび0.05％トリプシンを添加したHBSSを含む培養皿に組
織を移した。時折ゆっくりと攪拌しながら組織を室温で18分間インキュベートし
た。トリプシンを除去し、組織をHBSSで2回洗浄した後、10％ウシ胎仔血清（FBS
）、110mg/Lのピルビン酸ナトリウムおよび5単位/mlのペニシリン/ストレプトマ
イシンを添加した高グルコースDMEMからなる増殖培地中に滴下した。増殖培地中
の皮質9個分が1つのT75フラスコおよび1つのT25フラスコに入る割合でこの細胞
懸濁物を広げた。その翌日に非接着細胞を除去した。この時点およびその後3日
毎に培養物の増殖培地を交換した。培養物が十分に集密化したと思われた約1週
間後にそれをトリプシン処理し、細胞10〜5個/ウェルの割合で48穴プレートに分
け入れた。実験は数日経って細胞が再び集密に達した時点で開始した。Example 1 Preparation and Characterization of Primary Glial Cell Cultures Primary mixed glial cultures are known because co-culture with astrocytes is known to promote the resting state of cultured microglia. Is particularly suitable as a system for studying PGE 2 : Aβ synergy. Briefly, cortex from P3 wild type mice was dissociated in HBSS (Gibco) without Ca 2+ and Mg 2+ . The meninges were carefully dissected and the tissues transferred to culture dishes containing HBSS supplemented with 0.53 mM EDTA and 0.05% trypsin. Tissues were incubated at room temperature for 18 minutes with occasional gentle agitation. After removing trypsin and washing the tissue twice with HBSS, 10% fetal bovine serum (FBS
), 110 mg / L sodium pyruvate and 5 units / ml penicillin / streptomycin were added dropwise into the growth medium consisting of high glucose DMEM. The cell suspension was spread at a rate of 9 cortices in the growth medium into one T75 flask and one T25 flask. The next day, non-adherent cells were removed. At this point and every 3 days thereafter, the growth medium of the culture was changed. About 1 week after the culture appeared to be fully confluent, it was trypsinized and plated into 48-well plates at 10-5 cells / well. The experiment was started when the cells reached confluence again after several days.

【００７７】 混合グリア培養物の特徴決定に関しては、細胞種特異的マーカーを免疫細胞化
学法のために用いた。以下の各培養物に染色を施した：1）非処理、すなわち培
地のみ、2）100ng/ml LDSで処理（48時間の曝露）または3）HFIP法によって調製
して24時間熟成させた25μM Aβで処理（48時間の曝露）。免疫細胞化学法に関
しては、培養物を4％パラホルムアルデヒド（PBS中）で4℃にて30分間固定し、0
.1％サポニンを含むPBSで洗浄した。H2O2とともにインキュベートして内因性過
酸化物活性を消失させた後、5％脱脂粉乳を含むPBS（PBS/NFDM）とのプレインキ
ュベーションを行った。初代抗体とのインキュベーションを4℃のPBS/NFDM中で
一晩行った。ベクタステイン（Vectastain）ABCキットを製造者の指示に従って
用いて抗体を可視化し、ベクタステイン（Vectastain）DABで現像した。For characterization of mixed glial cultures, cell type specific markers were used for immunocytochemistry. Each of the following cultures was stained: 1) untreated, ie medium alone, 2) treated with 100 ng / ml LDS (48 h exposure) or 3) 25 μM Aβ prepared by the HFIP method and aged for 24 h. Treated with (48 hours exposure). For immunocytochemistry, cultures were fixed with 4% paraformaldehyde (in PBS) for 30 minutes at 4 ° C and 0
It was washed with PBS containing .1% saponin. After incubation with H 2 O 2 to eliminate endogenous peroxide activity, preincubation with PBS containing 5% nonfat dry milk (PBS / NFDM) was performed. Incubation with primary antibody was performed overnight in PBS / NFDM at 4 ° C. Antibodies were visualized using the Vectastain ABC kit according to the manufacturer's instructions and developed with Vectastain DAB.

【００７８】 抗GFAP（Sigma）によって星状細胞集団を強調表示した。星状細胞の形態は、
培地のみで増殖させた場合には典型的な外観を示したが、LPS処理後には活性化
星状細胞を思わせる外観となり、24時間熟成させたAβへの曝露後には著しく活
性化された。小グリアの存在は抗Mac-1モノクローナル抗体mAB 5.1による免疫細
胞化学法によって確認した。mAB 5.1免疫細胞化学法の後に、培地のみで処理し
た試料では典型的な分枝を有する休止形態の小グリアが観察された。LPSまたはA
βによる処理後には染色がやや強くなり、アメーバ様小グリアが一部に認められ
たが、小グリアの大多数は分枝状の外観を保っていた。Astrocyte populations were highlighted by anti-GFAP (Sigma). The morphology of astrocytes is
Although it showed a typical appearance when grown in the medium alone, it had an appearance resembling activated astrocytes after LPS treatment, and was remarkably activated after exposure to Aβ aged for 24 hours. The presence of microglia was confirmed by immunocytochemistry with the anti-Mac-1 monoclonal antibody mAB 5.1. After mAB 5.1 immunocytochemistry, typical branched, resting forms of microglia were observed in samples treated with medium alone. LPS or A
After treatment with β, staining became slightly stronger and amoeba-like microglia were partially observed, but the majority of microglia maintained a branched appearance.

【００７９】 活性化小グリアに対して特異的なマーカーを同定するために数多くの化合物の
試験を行った。インテグリン類のLFA1およびVLA-4はこの特徴を満たすことが報
告されているため（例えば、Hailerら、Glia 18：319〜331、1996）、本発明の
系を用いてこれらの分子の試験を行った。マウスCD11a（LFA1）およびマウスCD4
9d（VLA-4）に対するモノクローナル抗体をセロテック（Serotec）社から入手し
た。これらの抗体はいずれも極めて低いバックグラウンドを示し、培地のみで増
殖した培養物には反応産物は認められなかった。これに対して、LPSで処理した
培養物中の小グリアはいずれのインテグリンに対する抗体とも強いシグナルを生
じた。24時間熟成させたAβに曝露された小グリアはいずれの抗体に関する反応
産物によってもはるかに強く濃染された。Numerous compounds were tested to identify markers specific to activated microglia. Since the integrins LFA1 and VLA-4 have been reported to meet this feature (eg Hailer et al. Glia 18: 319-331, 1996), these systems were tested using the system of the invention. It was Mouse CD11a (LFA1) and mouse CD4
Monoclonal antibody against 9d (VLA-4) was obtained from Serotec. All of these antibodies showed an extremely low background, and no reaction product was observed in the culture grown in the medium alone. In contrast, microglia in cultures treated with LPS gave strong signals with antibodies to either integrin. Microglia exposed to Aβ that were aged for 24 hours were much more intensely stained with the reaction products for either antibody.

【００８０】 これらの2つのマーカーの選択性の高さおよびバックグラウンドの低さから、
例えば、蛍光標識抗体および蛍光定量法を用いることにより、それらを定量アッ
セイ法に適用しうる可能性が示唆される。活性化された皮質混合グリア培養物に
よるサイトカイン分泌を調べるために、本発明者らは、さまざまな用量のLPSに
対する曝露から48時間後の細胞内IL-1αおよび分泌型IL-1αならびに分泌型TNF-
αのレベルを測定した。この3種類のマーカーに関してLPSの効力は同程度であっ
た。さらに、用量反応曲線は器官型海馬スライス培養物のLPS処理で得られたも
のと同等であり、細胞内IL-1αレベルと分泌型IL-1αレベルとの比も海馬スライ
スおよびBV-2マウス小グリア細胞で認められたものと同じである。Due to the high selectivity and low background of these two markers,
For example, the use of fluorescently labeled antibodies and fluorometric methods suggests their potential application in quantitative assay methods. To investigate cytokine secretion by activated cortical mixed glial cultures, we examined intracellular IL-1α and secreted IL-1α and secreted TNF 48 hours after exposure to various doses of LPS. -
The level of α was measured. The efficacy of LPS was similar for these three markers. Furthermore, the dose-response curve was similar to that obtained by LPS treatment of organotypic hippocampal slice cultures, and the ratio of intracellular IL-1α levels to secretory IL-1α levels was also small in hippocampal slices and BV-2 mouse small. The same as found in glial cells.

【００８１】 実施例2：初代混合グリア細胞におけるAβ:PGE2相乗作用実験 48穴プレート中で48時間にわたり成熟（集密）マウス初代混合グリア培養物に
よって馴化された培地をアッセイすることにより、内因性PGE2レベル、およびイ
ンドメタシンがPGE2を抑制する能力を検討した。基本条件下では、200pg/馴化培
地1mlをわずかに下回るPGE2が認められ、初代培養物に関する文献報告と一致し
ていた。100ng/ml LPSに対する曝露により、このレベルが、用いた培地希釈度で
はアッセイ法が飽和に達する濃度へと劇的に上昇し、刺激に対する培養物の強い
反応能が示された。馴化期間中に培養物を14μMインドメタシンで処理するとPGE 2 分泌は48時間で約30pg/mlに低下した。これはPGE2:Aβ相乗作用が観察されると
思われる範囲内にある。[0081] Example 2: Aβ: PGE in primary mixed glial cells2Synergy experiment   For 48 hours in 48-well plates to mature (confluent) mouse primary mixed glial cultures
Therefore, by assaying the conditioned medium, the endogenous PGE2Level, and
N-methacin is PGE2The ability to suppress Under basic conditions, 200 pg / acclimation
PGE slightly less than 1 ml2, Which is consistent with literature reports on primary cultures.
Was there. Exposure to 100 ng / ml LPS resulted in this level at the media dilution used.
Dramatically increases assay concentration to saturation and cultures are robust to stimuli
Reactivity was shown. Treatment of cultures with 14 μM indomethacin during acclimation leads to PGE 2 Secretion decreased to about 30 pg / ml in 48 hours. This is PGE2: When Aβ synergy is observed
It is within the expected range.

【００８２】 外因性PGE2の存在下および非存在下におけるAβの影響をこれらの初代皮質混
合グリア培養物で検討した。Aβペプチドを50％HFIP中に4mg/mlで再懸濁し、37
℃で一晩インキュベートした後にスピードバク（Speed Vac）で乾燥させ、水中
に4mg/mlで再懸濁した。続いてペプチドを37℃で11時間または24時間「熟成させ
（aged）」、超音波処理を氷上で30秒間行った後に用いた。The effect of Aβ in the presence and absence of exogenous PGE 2 was investigated in these primary cortical mixed glial cultures. Aβ peptide was resuspended in 50% HFIP at 4 mg / ml, 37
After overnight incubation at 0 ° C., it was dried in a Speed Vac and resuspended in water at 4 mg / ml. The peptides were then “aged” at 37 ° C. for 11 or 24 hours and sonicated on ice for 30 seconds before use.

【００８３】 14μMインドメタシンで24時間前処理した細胞のウェル2組に対して、熟成させ
たAβペプチドを単独または100pg/mlの外因性PGE2との併用により適用した。100
pg/mlのPGE2はトロンボキサンまたは他のプレステノイドに対する受容体を刺激
しないと考えられる低用量であり、しかも生理的に意味がある可能性が高い。イ
ンドメタシン前処理はウェルへの播種から3日後に開始し、播種4日後に48時間の
実験処理を開始した。処理は2組ずつ行った。48時間後に培地および可溶化液を
回収してアッセイした。Aged peptides of Aβ peptide were applied alone or in combination with 100 pg / ml of exogenous PGE 2 to duplicate wells of cells pretreated with 14 μM indomethacin for 24 hours. 100
PGE 2 at pg / ml is a low dose that does not appear to stimulate receptors for thromboxane or other prestenoids, and is likely to be physiologically relevant. The indomethacin pretreatment was started 3 days after seeding the wells and 4 days after seeding the experimental treatment for 48 hours. The treatment was performed in pairs. Media and lysates were harvested 48 hours later and assayed.

【００８４】 PGE2および11時間熟成させたAβはいずれも単独では、細胞内IL-1α（図1）、
分泌型IL-1α（図2）および分泌型IL-6（図3）に影響を及ぼさなかった。しかし
、11時間熟成させたAβペプチドは、細胞性IL-1αおよび分泌型IL-1αのいずれ
の誘導に関してもPGE2との極めて強い相乗作用を示した。IL-1α誘導は、細胞性
サイトカインに関しては11時間熟成させたAβの場合の17倍を上回り（PGE2単独
よりも倍数がさらに大きい）、検出不能なレベルからの分泌型サイトカインの誘
導を示した。本発明者らは、抗マウスIL-1αモノクローナル抗体（R&D Systems
）を用いる免疫細胞化学法により、この生化学シグナルが細胞に由来することを
確認した。PGE 2 and Aβ that had been aged for 11 hours were both isolated from intracellular IL-1α (FIG. 1),
It had no effect on secretory IL-1α (FIG. 2) and secretory IL-6 (FIG. 3). However, the Aβ peptide aged for 11 hours showed an extremely strong synergistic effect with PGE 2 on the induction of both cellular IL-1α and secretory IL-1α. IL-1α induction was more than 17-fold higher than that of Aβ aged 11 hours for cellular cytokines (even greater than PGE 2 alone), indicating induction of secreted cytokines from undetectable levels. . The present inventors have developed an anti-mouse IL-1α monoclonal antibody (R & D Systems
It was confirmed that this biochemical signal was derived from cells by an immunocytochemistry method using

【００８５】 実施例3：MMGT-16マウス小グリア細胞培養物におけるAβ:PGE2相乗作用実験 次に、上記の実施例2のプロトコールを、マウス小グリア細胞系MMGT-16におけ
るPGE2とAβとの相乗作用を検討するために用いた。Example 3: Aβ: PGE 2 synergistic experiment in MMGT-16 mouse microglial cell cultures Next, the protocol of Example 2 above was applied to PGE 2 and Aβ in the mouse microglial cell line MMGT-16. Was used to study the synergistic effect of

【００８６】 MMGT-16細胞における相乗作用は、TNF-α（図4）およびIL-1β（図5）の双方
の分泌を測定することによって検討した。IL-1βの分泌はPGE2またはAβのいず
れかを単独で添加しても影響を受けず、一方、両方を添加するとIL-1βの分泌は
劇的に増加した。PGE2はTNF-α分泌にも識別しうる影響を及ぼさず、Aβ単独で
はTNF-α分泌に対するわずかな影響がみられた。しかし、AβおよびTNF-αの両
方をともに添加することにより、TNF-αの分泌は相乗的に増加した。Synergy in MMGT-16 cells was examined by measuring the secretion of both TNF-α (Figure 4) and IL-1β (Figure 5). IL-1β secretion was unaffected by the addition of either PGE 2 or Aβ alone, whereas the addition of both dramatically increased IL-1β secretion. PGE 2 had no discernable effect on TNF-α secretion, and Aβ alone had a slight effect on TNF-α secretion. However, the addition of both Aβ and TNF-α synergistically increased TNF-α secretion.

【００８７】 実施例4：MMGT-16マウス小グリア細胞培養物におけるAβ:PGE2相乗作用実験 BV-2マウス小グリア細胞は初代小グリアの多くの表現型特性を示し（Blasiら
、1990；Bocchiniら、1992）、これにはAβに対する反応性（Murphyら、1998）
が含まれる。BV-2細胞は基本培養条件下では準活性化状態にあって顕著な量のPG
E2を分泌し、BV-2細胞ではAβ処理のみによってIL-1αが誘導される。Aβ誘導性
IL-1αの増加は、外因性PGE2との同時インキュベーションを行ってもそれ以上は
増強されなかった。これは内因性PGE2による共活性化に起因するものと考えられ
た。Example 4 Aβ: PGE 2 Synergy Experiments in MMGT-16 Mouse Microglial Cultures BV-2 mouse microglial cells display many of the phenotypic characteristics of primary microglia (Blasi et al., 1990; Bocchini. Et al., 1992), which is responsive to Aβ (Murphy et al., 1998).
Is included. BV-2 cells are in a semi-activated state under basal culture conditions and a significant amount of PG
It secretes E 2, and IL-1α is induced only by Aβ treatment in BV-2 cells. Aβ inducibility
The increase in IL-1α was not further enhanced by co-incubation with exogenous PGE 2 . This was probably due to co-activation by endogenous PGE 2 .

【００８８】 BV-2細胞培養物による24時間馴化培地におけるPGE2濃度は一般に500pg/ml〜80
0pg/mlであり、これはAβ:PGE2刺激に用いた値をはるかに上回る。BV-2細胞にお
ける内因性PGE2はインドメタシンによって完全には抑制されなかった。14μMイ
ンドメタシンで一晩前処理した後に、COX1/COX2阻害薬混合物の持続的な存在下
で24時間の馴化期間を置くことにより、PGE2レベルは30〜200pg/mlとなった。さ
らに高用量のインドメタシンはBV-2細胞に対して有毒であり、さらにCOX阻害薬
を単独または併用で追加してもそれ以上の有効な処理とはならなかった。BV-2細
胞のAβ活性化は再現性が高く、実験のうち90％で3.2倍の平均刺激度が認められ
た（n＝21；対照培地との比較でp＜0.05）。PGE 2 concentrations in 24-hour conditioned medium with BV-2 cell cultures are generally between 500 pg / ml-80
0 pg / ml, which far exceeds the value used for Aβ: PGE 2 stimulation. Endogenous PGE 2 in BV-2 cells was not completely suppressed by indomethacin. After overnight pretreatment with 14 μM indomethacin, a 24-hour acclimation period in the continuous presence of COX1 / COX2 inhibitor mixture resulted in PGE 2 levels of 30-200 pg / ml. Higher doses of indomethacin were toxic to BV-2 cells, and addition of COX inhibitors alone or in combination did not result in further effective treatment. Aβ activation in BV-2 cells was highly reproducible, with 90% of the experiments demonstrating a 3.2-fold average stimulation (n = 21; p <0.05 compared to control medium).

【００８９】 実施例5：ヒト胎児混合グリア細胞におけるAβ:PGE2相乗作用実験 次に、ヒト胎児混合グリア培養におけるAβとPGE2との相乗作用を検討するた
めに、実施例2の実験プロトコールに変更を加えたものを実施した。サンフラン
シスコベイエリア（San Francisco Bay Area）において、研究者に生組織を提供
している非営利団体であるアドバンスト・バイオサイエンス・リソース（Advanc
ed Bioscience Resource）から、組織を入手した。皮質10個分からの培養物を、
最初の平板培養物である2つのT75フラスコから2つのT150フラスコに分割した後
、48穴プレートに移した。いずれの分割ならびに実験処理の開始とも、完全に集
密化してから24時間後に行った。ヒト調製物の細胞種の構成比は、位相差顕微鏡
では実施例1に用いた調製物と極めて類似しているように思われた。Aβペプチド
処理を26gで行い、Aβの熟成期間には11時間を用いた。Example 5: Aβ: PGE 2 synergy experiment in human fetal mixed glial cells Next, in order to examine the synergistic effect of Aβ and PGE 2 in human fetal mixed glial culture, the experimental protocol of Example 2 was used. The changes were implemented. Advanced Bioscience Resources (Advanc), a non-profit organization that provides living organizations to researchers in the San Francisco Bay Area.
ed Bioscience Resource). Cultures from 10 cortices,
The original plating, two T75 flasks, was split into two T150 flasks and then transferred to 48 well plates. Both the division and the start of the experimental treatment were carried out 24 hours after the complete confluence. The cell type composition of the human preparation appeared to be very similar to the preparation used in Example 1 by phase contrast microscopy. Aβ peptide treatment was carried out with 26 g, and the aging period of Aβ was 11 hours.

【００９０】 実施例6：EP受容体の分析 まず、小グリア上に存在するEP受容体のサブタイプを決定した。BV-2小グリア
RNAのRT-PCRにより、EP1、EP2およびEP4のmRNAが小グリアによって産生されるが
、EP3は存在しないことが明らかになった。BV-2およびMMGT-16細胞系はPGE2受容
体アイソフォームEP1、EP2およびEP4を発現するため、これらの受容体をAβ:PGE 2 の相乗作用を調節するための候補とした。EP3は検出されず、この薬理学的に許
容されない標的が関心対象の作用を媒介する可能性は否定された。マウス全脳に
はすべてのアイソフォームが認められた。同定されたAβ-PGE2相乗作用のADに対
する意義を調べるために、ヒト小グリア上に存在するPGE2のアイソフォームを明
らかにした。RNAをヒト胎児脳から調製した小グリア培養物から入手し、細胞可
溶化液はADおよび非痴呆（ND）高齢被験者から調製した小グリア培養物から入手
した。ADおよびND培養物から所要の結果を得るのに十分な最小限の材料を入手し
た。各受容体アイソフォームに対するいくつかのプライマー対を、データベース
配列を用いて設計した。これらの対は以下に示す通りである： マウス腎臓はすべての受容体サブタイプのmRNA種を発現することが知られている
ため、ヒト腎臓全RNAを、最適なRT-PCR条件の決定および最適なプライマー対の
選択のための陽性対照として用いた。[0090] Example 6: EP receptor analysis   First, the subtype of EP receptors present on microglia was determined. BV-2 small glare
RT-PCR of RNA produces mRNAs for EP1, EP2 and EP4 by microglia
, EP3 became clear to be nonexistent. BV-2 and MMGT-16 cell lines are PGE2Acceptance
To express the body isoforms EP1, EP2 and EP4, these receptors were labeled with Aβ: PGE 2 It was selected as a candidate for regulating the synergistic action of EP3 was not detected and this pharmacologically acceptable
It was ruled out that unacceptable targets could mediate the effects of interest. Mouse whole brain
All isoforms were found. Aβ-PGE identified2Against synergistic AD
PGE present on human microglia to investigate the significance of2The isoform of
I made it soft. RNA was obtained from microglial cultures prepared from human fetal brain and
Lysates obtained from microglial cultures prepared from AD and non-demented (ND) elderly subjects
did. Obtain the minimum amount of material from AD and ND cultures sufficient to obtain the desired results.
It was Database of several primer pairs for each receptor isoform
Designed with sequences. These pairs are as follows: Mouse kidney is known to express mRNA species for all receptor subtypes
Therefore, human kidney total RNA was used to determine optimal RT-PCR conditions and optimal primer pairs.
Used as a positive control for selection.

【００９１】 PCRプロトコールの最適化を行った後、逆転写酵素の存在下または非存在下で
胎児由来小グリアからcDNAを調製した。逆転写酵素を含まない材料を用いて得ら
れた陽性PCRバンドによってRNAにDNAが混入していることが示された場合には、R
NAのDNase処理後に第2の逆転写反応を行った。RT-PCRにより、胎児小グリア材料
にEP1、EP2およびEP4のPGE2受容体アイソフォームmRNAは存在するが、EP3 mRNA
は存在しないことが明らかになった（表1）。After optimization of the PCR protocol, cDNA was prepared from fetal microglia in the presence or absence of reverse transcriptase. If a positive PCR band obtained using material that does not contain reverse transcriptase indicates that RNA is contaminated with DNA, R
A second reverse transcription reaction was performed after NA DNase treatment. RT-PCR revealed that EP1, EP2, and EP4 PGE 2 receptor isoform mRNAs were present in fetal microglial material, but EP3 mRNA
It was revealed that there is no (Table 1).

【００９２】[0092]

【表１】 （Nd）実施せず、（-）なし、（+/-）わずか、（+）明らかに検出可能、（++）
強い、（+++）極めて強い AD28：84歳AD；17 d.i.v. ND31：79歳、非痴呆；28 d.i.v. AD21：96歳AD；51 d.i.v. ND24：83歳、非痴呆；60 d.i.v. 胎児：妊娠約22週；約14 d.i.v.[Table 1] (Nd) not performed, (-) none, (+/-) slightly, (+) clearly detectable, (++)
Strong, (+++) extremely strong AD 28: 84 years old AD; 17 div ND31: 79 years old, non-dementia; 28 div AD21: 96 years old AD; 51 div ND24: 83 years old, non-dementia; 60 div Fetus: pregnant about 22 Week; about 14 div

【００９３】 次に、条件を合わせたADおよびNDの対の細胞可溶化液試料を用いて、このプロ
トコールを2回繰り返した。単回の決定のみを行うのに十分な材料を入手したた
め、RNAを単離した後に、cDNA調製を行う前にそれをDNase処理した。いずれのセ
ットの試料に関しても、再びRT PCRにより、PGE2受容体アイソフォームEP1、EP2
およびEP4のmRNAが存在し、EP3 mRNAは存在しないことが明らかになった。十分
に質の高いmRNAが存在することを確認するために一部の試料に対してβ-APP RT-
PCRを行い、満足いく結果を得た。PGE2が脳内に存在し、刺激された小グリア培
養物によって分泌されることからDP RT-PCRを行った。ほとんどの試料でPGE2受
容体のmRNAの存在が検出された。ヒト全脳から調製したRNA中にはすべてのPGE2
受容体アイソフォームに加えてDPが検出された。すべての場合において、プロス
タグランジン受容体に関して陽性と評価されたPCR産物は、予想された断片の内
部にあるオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした予想サイズのバンド
であった。全体的にみて、初代ヒト培養小グリアでの結果は、マウス小グリア不
死化細胞系からの結果とよく一致した。This protocol was then repeated twice with matched lysate samples of AD and ND. Since enough material was available to make only a single determination, it was DNase treated after RNA isolation and before cDNA preparation. For both sets of samples, RT PCR was again used to analyze the PGE 2 receptor isoforms EP1 and EP2.
And EP4 mRNA was present and EP3 mRNA was absent. Β-APP RT- for some samples to ensure the presence of sufficiently high quality mRNA
PCR was performed and satisfactory results were obtained. DP RT-PCR was performed because PGE 2 is present in the brain and is secreted by stimulated microglial cultures. The presence of PGE 2 receptor mRNA was detected in most samples. All PGE 2 in RNA prepared from human whole brain
DP was detected in addition to the receptor isoform. In all cases, PCR products that tested positive for the prostaglandin receptor were bands of the expected size that hybridized with the oligonucleotide probe internal to the expected fragment. Overall, the results with primary human cultured microglia were in good agreement with the results from the mouse microglia immortalized cell line.

【００９４】 マウス小グリアにおけるPGE2アイソフォームを検出するために、マウスEP配列
に関して設計して最適化したプライマーを用いて同様の実験を行った。BV-2およ
びMMGT-16マウス小グリアはEP1、EP2およびEP4に特異的なmRNAは含むがEP3特異
的mRNAは含まないことが示された。マウス脳およびマウス混合グリア培養物は4
種のEPアイソフォームのすべてに関するmRNAを含む。EP3が存在しないことから
、この受容体が相乗作用のメディエーターである可能性は否定される。混合グリ
ア培養実験では、EP1、EP3またはEP4産物のいずれが小グリア、混入した星状細
胞またはその両方に由来するかを導き出すことはできない。Similar experiments were performed with primers designed and optimized for mouse EP sequences to detect PGE 2 isoforms in mouse microglia. It was shown that BV-2 and MMGT-16 mouse microglia contained EP1, EP2 and EP4 specific mRNAs but no EP3 specific mRNAs. 4 for mouse brain and mouse mixed glial cultures
Contains mRNA for all of the EP isoforms of the species. The absence of EP3 denies the possibility that this receptor is a synergistic mediator. In mixed glial culture experiments it is not possible to deduce which EP1, EP3 or EP4 products originate from microglia, contaminating astrocytes or both.

【００９５】 RT-PCRの現在のアプリケーションは定量的ではないものの、存在量の差を示唆
する若干の観察所見を得ることは可能である。所定のPCR反応セットの内部では
適切な比較を行えるため、反応条件の効率およびプライマーセットの違いは問題
とはならない。例えば、小グリアおよび全脳試料に関してRT-PCRバンドの強度が
等しかったのはEP4の場合のみであり、EP1およびEP2のバンドは小グリアの全試
料とも全脳のものより弱かったが、これは質の高いテンプレートの量の差（cDNA
はこの反応で厳密には定量化されない）または存在量の真の差のいずれかを反映
したものである。本発明者らには、EP4の反応が異なるテンプレートについても
同じサイクル数で飽和に達するかどうかは不明であり、異なる源におけるEP4の
存在量が等しいと結論づけることはできない。しかし、データからは、他のアイ
ソフォームと対比してEP4は全脳よりも小グリア内に高い比率で存在する可能性
が示唆される。Although the current application of RT-PCR is not quantitative, it is possible to obtain some observations that suggest differences in abundance. Since an appropriate comparison can be performed within a given PCR reaction set, the efficiency of reaction conditions and the difference in primer set are not a problem. For example, only in the case of EP4 was the RT-PCR band of equal intensity for microglia and whole brain samples, and the EP1 and EP2 bands were weaker than those of whole brain in all microglia samples, which was Difference in quantity of high quality template (cDNA
Is not strictly quantified in this reaction) or a true difference in abundance. It is not clear to the inventors whether the EP4 reaction reaches saturation for different templates with the same number of cycles and it cannot be concluded that the abundance of EP4 in different sources is equal. However, the data suggest that EP4 may be present in a higher proportion in microglia than in the whole brain, in contrast to other isoforms.

【００９６】 実施例7：Aβ:PGE2活性化におけるEP2およびEP4の関与 4種のPGE2アイソフォームのうちEP2およびEP4の2つはGsと結合し、活性化され
るとcAMPレベルを上昇させる。EP3はGiと結合してcAMP産生を阻害し、EP1はCa++ i を高める。PGE2シグナルを媒介する受容体アイソフォームを区別する第1のステ
ップとして、Aβ共活性化経路における二次メッセンジャーを同定した。緩徐に
加水分解される細胞透過性cAMP類似体である8-Br-cAMPはAβとの共活性化因子と
してPGE2の代わりとなりうることが示され、このことからEP2またはEP4のいずれ
かが小グリアの相乗的活性化を媒介する可能性が強く示唆された。PGE2シグナル
伝達経路にcAMPが関与するというさらなる証拠は、直接的なアデニル酸シクラー
ゼ活性化因子であるフォルスコリンがAβ共活性化因子としてPGE2の代わりとな
りうること、およびIV型（cAMP特異的）ホスホジエステラーゼ阻害薬ロリプラム
がAβ:PGE2刺激による小グリアのサイトカイン産生を増強させうることである。[0096] Example 7: Aβ: PGE2Involvement of EP2 and EP4 in activation   4 types of PGE2Two of the isoforms, EP2 and EP4, are GsIs bound and activated
Increases cAMP levels. EP3 is GiInhibits cAMP production by binding to++ i Increase. PGE2The first step that distinguishes receptor isoforms that mediate signaling
The second messenger in the Aβ co-activation pathway was identified. Slowly
8-Br-cAMP, a cell-permeable cAMP analog that is hydrolyzed, is a coactivator with Aβ
Then PGE2Could be used instead of EP2 or EP4.
It was strongly suggested that Kagi may mediate synergistic activation of microglia. PGE2signal
Further evidence for the involvement of cAMP in the transduction pathway is direct adenylate cycler.
Forskolin, a zebu activator, acts as an Aβ coactivator in PGE2Instead of
And the type IV (cAMP-specific) phosphodiesterase inhibitor rolipram
Is Aβ: PGE2It is possible to enhance the cytokine production of microglia upon stimulation.

【００９７】 cAMPがAβ:PGE2相乗作用のPGE2シグナル成分を媒介するという二次メッセンジ
ャーの所見に基づき、受容体アイソフォームEP2およびEP4をさらに詳細に検討し
た。タックマン（Taqman）を用いるリアルタイム定量的PCRアッセイ法により、
脳細胞種上のEP2およびEP4 mRNAの相対的存在量を評価した。マウス皮質ニュー
ロン、星状細胞および小グリアの初代培養物をRNAテンプレートの源として調製
した。小グリアは星状細胞に比べてEP2 mRNAの発現レベルが3倍であり、EP4 RNA
発現レベルは4倍であった（図6）。個々のPCR反応効率は大きく異なる可能性が
あるため、EP2アッセイ法による値をEP4アッセイ法に関する値と比較することは
できない。Receptor isoforms EP2 and EP4 were examined in more detail based on the second messenger finding that cAMP mediates the PGE 2 signal component of Aβ: PGE 2 synergy. By the real-time quantitative PCR assay method using Taqman,
The relative abundance of EP2 and EP4 mRNA on brain cell types was evaluated. Primary cultures of mouse cortical neurons, astrocytes and microglia were prepared as a source of RNA template. Microglia have a three-fold higher expression level of EP2 mRNA than astrocytes, and EP4 RNA
The expression level was 4-fold (Fig. 6). Since the individual PCR reaction efficiencies can vary widely, the values from the EP2 assay cannot be compared to those from the EP4 assay.

【００９８】 Aβ:PGE2におけるEP2およびEP4の役割をさらに明らかにするため、各々の活性
および/または発現をブロックした。EP2の活性をブロックするためにはEP1/2選
択的アンタゴニストAH6809（Woodwardら、1995）を用いた。AH6809の活性は、[3 H]-PGE2の結合およびPGE2刺激によるcAMP蓄積機能アッセイ法で確認した。[3H]-
PGE2のEP1との結合のAH6809による阻害に関するKiの予測値は1μMであり、PGE2
誘導性cAMP生成の阻害に関するEC50は1μMであることが確認された。本化合物の
選択性は、[3H]-PGE2のEP4との結合がAH6809で阻害されなかったことによって示
された。To further elucidate the role of EP2 and EP4 in Aβ: PGE 2, we blocked the activity and / or expression of each. The EP1 / 2 selective antagonist AH6809 (Woodward et al., 1995) was used to block the activity of EP2. The activity of AH6809 was confirmed by [ 3 H] -PGE 2 binding and PGE 2 stimulated cAMP accumulation functional assay. [ 3 H]-
The predicted K i for inhibition of PGE 2 binding to EP1 by AH6809 was 1 μM and PGE 2
The EC 50 for inhibition of inducible cAMP production was confirmed to be 1 μM. The selectivity of this compound was demonstrated by the fact that the binding of [ 3 H] -PGE 2 to EP4 was not inhibited by AH6809.

【００９９】 EP2アンタゴニストAH6809は、Kdの10倍の濃度でも初代グリアのAβ:PGE2活性
化に影響を及ぼさないことが明らかになった（図7）。さらに、EP2アンタゴニス
トAH6809はBV-2細胞のAβ刺激に対して影響を及ぼさなかった（図7）。BV-2小グ
リアのAβ処理には2種類の著しい形態的効果がみられた。第1に、細胞は、詳細
に報告されている小グリアのAβに対する走化性に対応する様式で集塊を形成し
た。第2に、個々の細胞の形態は、球状から伸長した突起を有する形状へと変化
するように変わった。EP2アンタゴニストはいずれの反応にも影響を及ぼさず、
このことからEP2は役割を果たしていないことが示された。The EP2 antagonist AH6809 was found to have no effect on Aβ: PGE 2 activation of primary glia even at a concentration of 10 times the K d (FIG. 7). Furthermore, the EP2 antagonist AH6809 had no effect on Aβ stimulation of BV-2 cells (FIG. 7). Two significant morphological effects were observed in Aβ treatment of BV-2 microglia. First, cells formed clumps in a manner corresponding to the well-reported chemotaxis of microglia to Aβ. Second, the morphology of individual cells changed to change from spherical to a shape with elongated protrusions. EP2 antagonists do not affect either response,
This indicates that EP2 does not play a role.

【０１００】 選択的EP4アンタゴニストが得られなかったため、小グリアのAβ:PGE2活性化
におけるEP4の関与を探るためにアンチセンス手法を用いる。アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドをまず、EP2/EP4を介した事象であるPGE2刺激によるcAMP蓄積に
対する効果を測定することにより、EP4の発現を阻害する能力に関して検討する
。ひとたびアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性が確認されれば、Aβ:PGE2活
性化に対するオリゴヌクレオチドの効果に関する試験をBV-2小グリア細胞で行う
。Since no selective EP4 antagonist was obtained, an antisense approach is used to explore the involvement of EP4 in Aβ: PGE 2 activation of microglia. Antisense oligonucleotides are first tested for their ability to inhibit EP4 expression by measuring the effect on PGE 2 stimulated cAMP accumulation, an event mediated by EP2 / EP4. Once the activity of the antisense oligonucleotide is confirmed, tests for the effect of the oligonucleotide on Aβ: PGE 2 activation are performed in BV-2 microglial cells.

【０１０１】 EP4アンチセンスオリゴヌクレオチドで48時間処理した細胞では、PGE2曝露後
のcAMP蓄積がほぼ50％低下した。残存性cAMP刺激は、残存性EP4発現またはEP2受
容体を介したGs刺激に起因すると考えられる。同じ配列から構成される蛍光標識
オリゴヌクレオチドを用いた並行実験により、オリゴヌクレオチドが本質的にす
べての細胞を透過することが判明した。Cells treated with EP4 antisense oligonucleotides for 48 hours had a nearly 50% reduction in cAMP accumulation after PGE 2 exposure. Survivable cAMP stimulation is believed to be due to G s stimulation through persistence EP4 expression or EP2 receptor. Parallel experiments with fluorescently labeled oligonucleotides composed of the same sequence revealed that the oligonucleotides penetrate essentially all cells.

【０１０２】 次に、BV-2細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで48時間前処理した後、オ
リゴヌクレオチドの持続的な存在下で、前処理した細胞をAβに対して曝露させ
る。アンチセンスEP4構築物はAβに対する形態的反応を低下させ、細胞の集塊化
および伸長した突起を有する形状を有する細胞数をいずれも抑制する。Aβ処理
に対する反応性の低下は、TNF-αおよびIL-1βの分泌レベルがいずれも低いこと
を検出することによって確認される。EP4構築物はIL-1βを50％減少させるが、
これはこの阻害方法に関してはかなりの効果である（図8）。BV-2 cells are then pretreated with antisense oligonucleotides for 48 hours and then the pretreated cells are exposed to Aβ in the continuous presence of the oligonucleotide. The antisense EP4 construct reduces the morphological response to Aβ and suppresses both cell agglutination and the number of cells that have a shape with elongated processes. The reduced responsiveness to Aβ treatment is confirmed by detecting low levels of both TNF-α and IL-1β secretion. The EP4 construct reduces IL-1β by 50%,
This is a considerable effect for this method of inhibition (Figure 8).

【０１０３】 本発明は、本明細書中において最も実用的で好ましい態様と考えられる形で示
され、記載されている。しかし、本発明の範囲内で逸脱してもよく、そして本明
細書の開示を読むことにより当業者には明らかな改良が浮かぶと考えられること
が認識される。The invention is shown and described herein in what is considered to be the most practical and preferred embodiments. However, it is recognized that departures may be made within the scope of the present invention, and upon reading the disclosure herein, obvious improvements will occur to one skilled in the art.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 細胞内IL-1αレベルの変化によって明示された、初代皮質混合グ
リア細胞におけるPGE2:Aβ相乗作用を示した棒グラフである。FIG. 1 is a bar graph showing PGE 2 : Aβ synergy in primary cortical mixed glial cells as evidenced by changes in intracellular IL-1α levels.

【図２】 分泌されたIL-1αレベルの変化によって明示された、初代皮質混
合グリア細胞におけるPGE2:Aβ相乗作用を示した棒グラフである。FIG. 2 is a bar graph showing PGE 2 : Aβ synergy in primary cortical mixed glial cells as evidenced by changes in secreted IL-1α levels.

【図３】 分泌されたIL-6レベルの変化によって明示された、初代皮質混合
グリア細胞におけるPGE2:Aβ相乗作用を示した棒グラフである。FIG. 3 is a bar graph showing PGE 2 : Aβ synergy in primary cortical mixed glial cells as evidenced by changes in secreted IL-6 levels.

【図４】 分泌されたIL-1βレベルの変化によって明示された、マウス細胞
系MMGT-16におけるPGE2:Aβ相乗作用を示した棒グラフである。FIG. 4 is a bar graph showing PGE 2 : Aβ synergy in the mouse cell line MMGT-16, as evidenced by changes in secreted IL-1β levels.

【図５】 分泌されたTNF-αレベルの変化によって明示された、マウス細胞
系MMGT-16におけるPGE2:Aβ相乗作用を示した棒グラフである。FIG. 5 is a bar graph showing PGE 2 : Aβ synergy in the mouse cell line MMGT-16, as evidenced by changes in secreted TNF-α levels.

【図６】 小グリアおよび星状細胞におけるPGE2受容体アイソフォームEP2
およびEP4に関するmRNAのレベルを示した一組の棒グラフである。FIG. 6: PGE 2 receptor isoform EP2 in microglia and astrocytes
And a set of bar graphs showing the levels of mRNA for EP4.

【図７】 EP2アンタゴニストAH6809の存在下における初代グリアおよび小
グリア活性化レベルを示した棒グラフである。FIG. 7 is a bar graph showing primary and microglial activation levels in the presence of EP2 antagonist AH6809.

【図８】 BV-2細胞におけるAβによるIL-1αの刺激を軽減するEP4アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの能力を示した棒グラフである。FIG. 8 is a bar graph showing the ability of EP4 antisense oligonucleotides to reduce Aβ stimulation of IL-1α in BV-2 cells.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミラー フォイ ディーン アメリカ合衆国 インディアナ州 キャン ビー イースト アン ストリート 6667 (72)発明者 ヒギンズ リンダ エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パロ アルト ロイス ロード 3610 (72)発明者 カタラノ ロザンヌ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ハイ ワード フェアビュー アベニュー 24578 (72)発明者 コーデル バーバラ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パロ アルト ベン ロモンド ドライブ 4051 (72)発明者 プチャクツ エリズビータ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 プレ ザントン ラスムッセン コート 2607 Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB20 BB50 CB01 FB03 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ20 QQ79 QQ91 QR48 QR77 QS24 4C084 AA17 DC50 NA14 ZA162─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG , ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, C A, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM , DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, K E, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS , LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, R U, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM , TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Miller Foydeen             Can, Indiana, United States             Be East Ann Street 6667 (72) Inventor Higgins Linda S.             United States Palo, California               Altlois Road 3610 (72) Inventor Catalano Rosanne             United States California High             Ward Fairview Avenue             24578 (72) Inventor Cordell Barbara             United States Palo, California               Alt Ben Lomond Drive             4051 (72) Inventor Puchakuts Elizvita             Pre, California, United States             Sandton Rasmussen Court 2607 F term (reference) 2G045 BB14 BB20 BB50 CB01 FB03                 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ20                       QQ79 QQ91 QR48 QR77 QS24                 4C084 AA17 DC50 NA14 ZA162

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 小グリア細胞を被験化合物とともに培養する段階；および 小グリア活性化に対する化合物の効果を決定する段階 を含む、アッセイ法。1. Incubating microglial cells with a test compound; and   Steps in determining the effect of compounds on microglial activation An assay method comprising: 【請求項２】 細胞活性の測定可能な変化がサイトカイン発現の増加である
、請求項1記載のアッセイ法。2. The assay method of claim 1, wherein the measurable change in cell activity is increased cytokine expression. 【請求項３】 化合物の効果が、化合物の非存在下における対照培養物と効
果を比較することによって決定される、請求項1または2記載のアッセイ法。3. The assay method according to claim 1 or 2, wherein the effect of the compound is determined by comparing the effect with a control culture in the absence of the compound. 【請求項４】 化合物の効果が、特定の細胞活性の標準化プロフィールと効
果を比較することによって決定される、請求項1、2または3記載のアッセイ法。4. The assay method of claim 1, 2 or 3, wherein the effect of the compound is determined by comparing the effect with a standardized profile of specific cell activity. 【請求項５】 アミロイド関連疾患の進行を変化させる、停止させる、また
は予防する化合物を同定するためのアッセイ法であって、以下の段階を含む方法
： サイトカインを既知のレベルで発現する小グリア細胞を含む試料を得る段階； 細胞をAβペプチドと接触させる段階； 細胞を被験化合物と接触させる段階；および 発現されたサイトカインに対するAβペプチドの相乗効果を決定する段階。5. An assay for identifying a compound that alters, arrests or prevents the progression of an amyloid-related disease, the method comprising the steps of: microglial cells expressing cytokines at known levels. Obtaining a sample containing: a cell contacting with an Aβ peptide; a cell contacting with a test compound; and determining the synergistic effect of the Aβ peptide on the expressed cytokine. 【請求項６】 疾患がADである、請求項5記載のアッセイ法。6. The assay method of claim 5, wherein the disease is AD. 【請求項７】 以下の段階を含む方法によって同定される、Aβ:PGE2媒介性
小グリア活性化を阻害する化合物： 小グリア細胞を化合物とともに培養する段階；および 小グリア活性化に対する化合物の効果を決定する段階。7. A compound that inhibits Aβ: PGE 2 -mediated microglial activation, identified by a method comprising the steps of: culturing microglial cells with the compound; and the effect of the compound on microglia activation. Stage of determining. 【請求項８】 化合物がプロスタグランジンE2アンタゴニストである、請求
項7記載の化合物。8. The compound of claim 7, wherein the compound is a prostaglandin E 2 antagonist. 【請求項９】 小グリア活性化の低下によって脳組織におけるサイトカイン
分泌の低下がもたらされる、哺乳動物宿主の脳組織におけるβ-アミロイドプラ
ークのレベルを低下させるための方法であって、以下の段階を含む方法： 小グリア活性化を低下させるのに有効な量の化合物を該哺乳動物宿主に投与す
る段階。9. A method for reducing the level of β-amyloid plaques in brain tissue of a mammalian host, wherein reduced microglia activation results in reduced cytokine secretion in brain tissue, the method comprising the steps of: Methods of Including: Administering to the mammalian host an amount of a compound effective to reduce microglia activation. 【請求項１０】 ADを有する、またはそのリスクがある哺乳動物宿主に対し
て化合物を投与する段階を含む、請求項9記載の方法。10. The method of claim 9, comprising administering the compound to a mammalian host having or at risk for AD.
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