JP2003503048A - Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents

Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション

Info

Publication number
JP2003503048A
JP2003503048A JP2001506802A JP2001506802A JP2003503048A JP 2003503048 A JP2003503048 A JP 2003503048A JP 2001506802 A JP2001506802 A JP 2001506802A JP 2001506802 A JP2001506802 A JP 2001506802A JP 2003503048 A JP2003503048 A JP 2003503048A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
acid
antisense
ship
oligonucleotide
antisense compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001506802A
Other languages
English (en)
Inventor
ベネット，シー・フランク
カウサート，レックス・エム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2003503048A publication Critical patent/JP2003503048A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 Ｓｈｉｐ−２の発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物及び方法が提供される。その組成物は、Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸に指向されたアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。Ｓｈｉｐ−２発現のモジュレーションのため及びＳｈｉｐ−２の発現と関係する疾患の治療のためにこれら化合物を使用する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、Ｓｈｉｐ−２の発現をモジュレートするための組成物及び方法を提
供する。特に、本発明は、ヒトＳｈｉｐ−２をコードする核酸に特異的にハイブ
リダイズできるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。こうし
たオリゴヌクレオチドは、Ｓｈｉｐ−２の発現をモジュレートすることが示され
ている。
【０００２】
【発明の背景】
細胞制御が達成される主なメカニズムの１つは、続いて細胞内で生化学的経路
をモジュレートする、膜を横切る細胞外信号の伝達を介する。キナーゼとよばれ
る酵素の作用を介した生物学的分子へのホスフェート部分の取り付けと定義され
るリン酸化の過程は、細胞内信号が分子から分子に伝播し、最終的に細胞応答を
生じる１つの経過に相当する。これらの信号伝達カスケードは、ホスフェート部
分を除去するホスファターゼと呼ばれる酵素の等しい数の存在により立証される
ように、高度に制御され、そしてしばしば重複する。タンパク質及び脂質の両方
は、細胞内でリン酸化を受け、そして各々について特異的なキナーゼ及びホスフ
ァターゼが単離されている。
【０００３】 リン酸化は細胞内のこうした偏在する過程であるため、そして細胞表現型は、
これらの経路の活性によって大きく影響を受けるため、現在、いくつかの疾患状
態及び／又は障害は、キナーゼ及びホスファターゼの異常な活性化又はこれらの
酵素における機能的突然変異の結果であると考えられている。その結果、これら
のタンパク質の性質決定にかなりの注意が払われている。 Ｓｈｉｐ−２（ＳＨ２含有ホスファチジルイノシトールホスファターゼ−２と
しても知られる）は、イノシトール含有脂質におけるイノシトール環の５−位か
ら、ホスフェートを選択的に除去するホスファターゼである（Ｐｅｓｅｓｓｅら
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２３
９，６９７〜７００）。そうすることで、Ｓｈｉｐ−２は、可溶性リン脂質メッ
センジャーのレベルを制御することにより、信号伝達カスケードの終結に重要な
役割を果たす。この酵素は、多様な造血幹細胞で発現され、イノシトール（１，
３，４，５）四リン酸及びホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸
を特異的に脱リン酸化する（Ｐｅｓｅｓｓｅら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８
８，４３７，３０１〜３０３）。Ｓｈｉｐ−２は、心臓、骨格筋及び胎盤で増加
した発現を示す。イヌ甲状腺細胞で発現されることもまた、見出されてきており
、この際、ＴＳＨ及びＥＧＦ刺激された細胞により、発現は増進された（Ｐｅｓ
ｅｓｓｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９
９７，２３９，６９７〜７００）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＳｈｉｐ−２の
チロシンリン酸化が、ＥＧＦ、ＰＤＦＲ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１又はインスリンに
応答して起こることが示されている（Ｈａｌｉｂら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，１９９８，２７３，１８６０５〜１８６０９）。このリン酸化の速度は、Ａｋ
ｔ／ＰＫＢキナーゼ経路の活性化及びＳｈｉｐ−２のアダプタータンパク質Ｓｈ
ｃとの関係と相関する。このデータは、５１Ｃ／ＳＨＩＰ２が、増殖因子及びイ
ンスリンによるホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ信号発信の制御に重
要な役割を果たす可能性があることを示唆する。
【０００４】 現在、Ｓｈｉｐ−２の合成を効果的に阻害する既知の療法剤はない。その結果
、Ｓｈｉｐ−２機能を有効に阻害することが可能なさらなる剤の必要性が長い間
感じられている。 アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させる有効な手段として
現れてきており、したがって、Ｓｈｉｐ−２発現モジュレーションのためのいく
つかの療法的、診断的、及び研究用途に際立って有用であることを示すことがで
きる。
【０００５】
【発明の要旨】
本発明は、Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸に指向されそしてＳｈｉｐ−２の発
現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに向けら
れている。本発明のアンチセンス化合物を含んでなる薬剤及び他の組成物もまた
、提供される。さらに提供されるのは、細胞又は組織において、Ｓｈｉｐ−２発
現をモジュレートする方法であって、前記細胞又は組織を、１つ又はそれ以上の
本発明のアンチセンス化合物又は組成物と接触させることを含んでなる方法であ
る。さらに提供されるのは、療法的又は予防的に有効な量の１つ又はそれ以上の
本発明のアンチセンス化合物又は組成物を投与することにより、Ｓｈｉｐ−２の
発現に関連する疾患又は状態を有するかあるいは有すると疑われる動物、特にヒ
トを治療する方法である。
【０００６】
【発明の詳しい説明】
本発明は、Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸分子の機能をモジュレートし、究極
的に、産生されるＳｈｉｐ−２の量をモジュレートするのに使用するため、オリ
ゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これは、Ｓｈ
ｉｐ−２をコードする１つ又はそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするア
ンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書において、用語“
標的核酸”及び“Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸”は、Ｓｈｉｐ−２をコードす
るＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ
を含む）、及びまたこうしたＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含む。オリゴマー化合
物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸の正常機能に
干渉する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による、その標的核酸
の機能のこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”と称される。干渉
されるべきＤＮＡの機能には、複製及び転写が含まれる。干渉されるべきＲＮＡ
の機能には、生命の維持に必要なすべての機能、例えば、タンパク質翻訳部位へ
のＲＮＡの転位置、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又はそれ以上のｍＲＮ
Ａ種を生じるＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが関与する又は促進する可能
性がある触媒活性が含まれる。標的核酸機能のこうした干渉の総合的な影響は、
Ｓｈｉｐ−２発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュ
レーション”は、遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）を意味する。本発
明の文脈において、阻害が遺伝子発現のモジュレーションの好ましい型であり、
そしてｍＲＮＡが好ましい標的である。
【０００７】 アンチセンスに特異的な核酸を標的化するのが好ましい。本発明の文脈におい
て、特定の核酸へアンチセンス化合物を“指向させる”ことは、多段階過程であ
る。この過程は、通常、その機能がモジュレートされるべき核酸配列の特定で始
まる。これは、例えば、その発現が特定の障害又は疾患状態と関連する細胞遺伝
子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であっても、感染性病原体由来の
核酸であってもよい。本発明において、標的は、Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸
分子である。標的化過程は、望ましい効果、例えばタンパク質の発現の検出又は
モジュレーションが生じるようにアンチセンス相互作用を起こすための、この遺
伝子内の単数又は複数の部位の決定も含む。本発明の文脈内で、好ましい遺伝子
内部位は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又
は終結コドンを含む領域である。当該技術分野に知られるように、翻訳開始コド
ンは、典型的には、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応する
ＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンはまた、“ＡＵＧコ
ドン”、“開始コドン”又は“ＡＵＧ開始コドン”とも称される。少数の遺伝子
は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを有する翻訳開始
コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧが in vivo
で機能することが示されている。したがって、“翻訳開始コドン”及び“開始コ
ドン”という用語は、各例のイニシエーターアミノ酸が、典型的にはメチオニン
（真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）であっても、多くのコドン配
列を含む可能性がある。真核及び原核遺伝子が、２つ又はそれ以上の代替開始コ
ドンを有する可能性もあり、そのいかなる１つを、特定の細胞種又は組織におい
て、あるいは一連の特定の条件下で、翻訳開始に優先的に利用してもよいことも
また当該技術分野に知られる。本発明の文脈において、“開始コドン”及び“翻
訳開始コドン”は、こうしたコドンの配列に関わらず、Ｓｈｉｐ−２をコードす
る遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するのに、in vivo で用いら
れる単数又は複数のコドンを指す。
【０００８】 遺伝子の翻訳終結コドン（又は“終止コドン”）は、３つの配列、すなわち５
’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ
、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）の１つを有する可能性
があることも当該技術分野に知られる。“開始コドン領域”及び“翻訳開始コド
ン領域”という用語は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち５’又は
３’）の約２５から約５０の隣接するヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の
部分を指す。同様に、“終止コドン領域”及び“翻訳終結コドン領域”という用
語は、翻訳終結コドンからどちらかの方向（すなわち５’又は３’）の約２５か
ら約５０の隣接するヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を指す。
【０００９】 翻訳開始コドン及び翻訳終結コドンの間の領域を指すことが当該技術分野に知
られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は“コード領域”もまた、効
果的に標的化することが可能である領域である。他の標的領域には、翻訳開始コ
ドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野に知られ、そして
したがってｍＲＮＡの５’キャップ部位及び翻訳開始コドンの間のヌクレオチド
又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
並びに翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野
に知られ、そしてしたがってｍＲＮＡの翻訳終結コドン及び３’末端の間のヌク
レオチド又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、３’非翻訳領域（３’Ｕ
ＴＲ）が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’トリホスフェート連
結を介し、ｍＲＮＡの最も５’の残基に連結している、Ｎ７−メチル化グアノシ
ン残基を含んでなる。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体と
共に、キャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’キ
ャップ領域もまた、好ましい標的領域である可能性がある。
【００１０】 直接翻訳される真核ｍＲＮＡ転写物もあるが、多くは、翻訳される前に転写物
から切除される“イントロン”として知られる、１つ又はそれ以上の領域を含む
。残った（そしてしたがって翻訳される）領域は、“エクソン”として知られ、
そして共にスプライシングされ、連続するｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡス
プライシング部位、すなわちイントロン−エクソン接合部もまた、好ましい標的
領域である可能性があり、そして異常なスプライシングが疾患に関連付けられて
いる状況、又は特定のｍＲＮＡスプライシング産物の過剰発現が疾患に関連付け
られている状況で特に有用である。再編成又は欠失による異常な融合接合部もま
た好ましい標的である。イントロンもまた、例えばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡを標
的とするアンチセンス化合物の、有効な、そしてしたがって好ましい標的領域で
ある可能性があることもまた見出されている。 ひとたび１つ又はそれ以上の標的部位が特定されてきたら、標的に十分に相補
的な、すなわち十分によく、そして十分な特異性でハイブリダイズし、望ましい
モジュレーションを与える、オリゴヌクレオチドを選択する。
【００１１】 本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、相補的ヌクレオシド
又はヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグ
スティーン水素結合であってもよい水素結合を意味する。例えば、アデニン及び
チミンは、水素結合の形成を通じ、対形成する、相補的核酸塩基である。“相補
的”は、本明細書において、２つのヌクレオチド間での正確な対形成の能力を指
す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、ＤＮＡ又はＲ
ＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することが可能である場合、その
オリゴヌクレオチド及びそのＤＮＡ又はＲＮＡは、その位置で互いに相補的であ
るとみなされる。各分子において、十分な数の対応する位置が、互いに水素結合
することが可能なヌクレオチドで占められている場合、オリゴヌクレオチド及び
ＤＮＡ又はＲＮＡは互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイ
ズ可能”及び“相補的”は、安定で、そして特異的な結合が、オリゴヌクレオチ
ド及びＤＮＡ又はＲＮＡ標的間で起こるような、十分な度合いの相補性又は正確
な対形成を示すのに用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異
的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と１００％相補的である必
要はないことが、当該技術分野に理解されている。アンチセンス化合物は、その
化合物の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常機
能に干渉して有用性の損失を引き起こし、そして特異的結合が望ましい条件下、
すなわち in vivoアッセイ又は療法処置の場合、生理学的条件下、あるいは in
vitro アッセイの場合、アッセイが行われる条件下で、非標的配列へのアンチセ
ンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な度合いの相補性がある場合、特異
的にハイブリダイズ可能である。
【００１２】 アンチセンス化合物は、一般的に、研究試薬及び診断剤として用いられる。例
えば、完全な特異性で遺伝子発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するために、一般の当業者
に用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の多様なメン
バーの機能を区別するのにも用いられる。アンチセンスモジュレーションは、し
たがって、研究使用に利用されている。 アンチセンスの特異性及び感受性はまた、療法的使用のため、当業者に利用さ
れている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトにおける疾患状態
の治療において、療法部分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ヒトに安全にそして効果的に投与されてきており、そして多くの臨床試
験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織及び動
物、特にヒトの治療のための治療措置において、有用に設計することが可能な療
法様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）である可能性があることが立証されている。
【００１３】 本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（Ｒ
ＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はその擬似体のオリゴマー又はポリマ
ーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（
主鎖）連結で構成されるオリゴヌクレオチドと共に、同様に機能する天然に存在
しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。こうした修飾又は置換オリゴヌ
クレオチドは、例えば、細胞取り込み増進、核酸標的に対する増進した親和性、
及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの望ましい特性のため、しば
しば、天然型より好ましい。
【００１４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい型であるが
、本発明は、限定されるわけではないが、以下に記載されるものなどのオリゴヌ
クレオチド擬似体を含む、他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。本発明に
したがったアンチセンス化合物は、好ましくは、約８から約３０核酸塩基（すな
わち約８から約３０の連結されたヌクレオシド）を含んでなる。特に好ましいア
ンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好まし
いのは、約１２から約２５核酸塩基を含んでなるものである。当該技術分野に知
られるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩
基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の２つの最も一般的な
種類は、プリン類及びピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖
部分に共有結合するホスフェート基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペント
フラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、ホスフェート基は、その糖の２’
、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれに連結してもよい。オリゴヌクレオチ
ドを形成する際、ホスフェート基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合
し、直線ポリマー化合物を形成する。次に、この直線ポリマー構造のそれぞれの
末端を、さらに環状構造を形成するように結合させてもよいが、開いた直線構造
が、一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、ホスフェート基は、一般
的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成すると称される。ＲＮＡ
及びＤＮＡの通常の連結又は主鎖は、３’から５’のホスホジエステル連結であ
る。
【００１５】 本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例には、修飾された主鎖又
は非天然ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に
定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、主鎖内に
リン原子を保持するもの、及び主鎖内にリン原子を持たないものが含まれる。本
明細書の目的のための、そして当該技術分野に時に引用されるような、ヌクレオ
シド間主鎖にリン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴ
ヌクレオシドとみなすことが可能である。
【００１６】 好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエー
ト類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエス
テル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、３’−アルキレンホスホネート
類及びキラルホスホネート類を含む、メチル及び他のアルキルホスホネート類、
ホスフィネート類、３’−アミノホスホロアミデート類及びアミノアルキルホス
ホロアミデート類を含む、ホスホロアミデート類、チオノホスホロアミデート類
、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、並び
にボラノホスフェート類であって、通常の３’−５’連結を有する前記修飾オリ
ゴヌクレオチド、これらの２’−５’連結類似体、及びヌクレオシド単位の隣接
する対が３’−５’から５’−３’へ、又は２’−５’から５’−２’へ連結さ
れる逆の極性を有するものが含まれる。多様な塩、混合塩及び遊離酸型もまた、
含まれる。
【００１７】 上記のリン含有連結の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけ
ではないが、米国特許第３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６
，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５
，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７
１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４
５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５
；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０
，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；及
び５，６２５，０５０号が含まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一所有
され、そして前記特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】 リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル又
はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロ
アルキルヌクレオシド間連結、あるいは１つ又はそれ以上の短鎖ヘテロ原子又は
複素環ヌクレオシド間連結により形成される主鎖を有する。これらには、モルホ
リノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；
スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムア
セチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含
有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；ス
ルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；並びに混合Ｎ、
Ｏ、Ｓ及びＣＨ2 構成部分を有する他のものが含まれる。
【００１９】 上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許には、限定され
るわけではないが、米国特許第５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，
１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３
３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３
４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；
５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，
２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，
６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１
２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；及び５，６７７，４３９号が含
まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一所有され、そして前記特許の各々
は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】 他の好ましいオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖及び
ヌクレオシド間連結両方、すなわち主鎖が、新規の基と置き換えられる。塩基単
位は、適切な核酸指向性化合物とのハイブリダイゼーションのため、維持される
。こうしたオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を持
つことが示されているオリゴヌクレオチド擬似体であって、ペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、ア
ミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖と置き換えられる。核酸塩基は保
持され、そして主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と、直接又は間接的に結合され
る。ＰＮＡ化合物の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけでは
ないが、米国特許第５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９
，２６２号が含まれ、前記特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＮＡ化合物のさらなる解説は、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１
，２５４，１４９７〜１５００に見出すことが可能である。
【００２１】 本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエート主鎖を持つオリゴヌクレオ
チド及びヘテロ原子主鎖を持つオリゴヌクレオチド、並びに特に上に引用される
米国特許５，４８９，６７７号の−ＣＨ2 −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ
（ＣＨ3 ）−Ｏ−ＣＨ2 −（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知
られる）、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−
Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −ＣＨ2 −（天然ホス
ホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2 −として示される）及び上に引用され
る米国特許５，６０２，２４０のアミド主鎖を持つオリゴヌクレオチドである。
やはり好ましいのは、上に引用される米国特許５，０３４，５０６号のモルホリ
ノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】 修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１つ又はそれ以上の置換糖部分も含ん
でもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含んでなる：
ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；
Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであっ
て、そのアルキル、アルケニル及びアルキニルが、Ｃ1 からＣ10アルキル又はＣ 2 からＣ10アルケニル及びアルキニルで置換されていても又は未置換でもよいも
の。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ2 ）n Ｏ］m ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＣＨ 3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＮＨ2 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＮＨ2 、
及びＯ（ＣＨ2 ）n ＯＮ［（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 ］］2 であって、ｎ及びｍが１か
ら約１０であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下
の１つを含んでなる：Ｃ1 からＣ10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカ
リル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3 、ＯＣ
Ｎ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3 、ＯＣＦ3 、ＳＯＣＨ3 、ＳＯ2 ＣＨ3 、ＯＮＯ 2 、ＮＯ2 、Ｎ3 、ＮＨ2 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、
アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポ
ーター基、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬物動
態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するた
めの基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキ
シエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＣＨ3 、２’−Ｏ−（２−メトキシエチ
ル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉ
ｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６〜５０４）、すなわちアルコキシアルコ
キシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、以下の実施例に記載されるよう
な、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、
すなわちＯ（ＣＨ2 ）2 ＯＮ（ＣＨ3 ）2 基、及びやはり以下の実施例に記載さ
れるような、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野に２’−Ｏ
−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、
すなわち２’−Ｏ−ＣＨ2 −Ｏ−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ2 ）2 が含まれる。
【００２３】 他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3 ）、２’−アミノ
プロポキシ（２’−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 ）、及び２’−フルオロ（２’
−Ｆ）が含まれる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に
３’末端ヌクレオチド上の又は２’−５’連結オリゴヌクレオチド内の糖の３’
位及び５’末端ヌクレオチドの５’位でも行ってもよい。オリゴヌクレオチドは
また、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬似体も有して
もよい。こうした修飾された糖構造の調製を解説する代表的な米国特許には、限
定されるわけではないが、米国特許第４，９８１，９５７；５，１１８，８００
；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６
，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５
，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９
０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６
４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；及び５，７００，９
２０号が含まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一所有され、そして前記
特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】 オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば単に
“塩基”と称される）修飾又は置換も含んでもよい。本明細書において、“未修
飾”又は“天然”核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ
）、並びにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）
が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基が含まれ、例
えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キ
サンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−
メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他の
アルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５
−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾ
ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオ
ウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒド
ロキシル及び他の８−置換アデニン類及びグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロ
モ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル類及びシトシン類、７−
メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニ
ン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び
３−デアザアデニンがある。さらなる核酸塩基には、米国特許３，６８７，８０
８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８
５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．監修，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗ
ａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１
９９１，３０，６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１
５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，２８９〜３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．監修
，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩
基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特
に有用である。これらには、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、並
びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン類が含まれ、２−アミノプロピルアデ
ニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メ
チルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を、０．６〜１．２℃増加させることが
示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬ
ｅｂｌｅｕ，Ｂ．監修，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ボカラトン，１９９３，２７６〜
２７８頁）、そして現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖
修飾と組み合わされた場合、特により好ましい。
【００２５】 上記の修飾された核酸塩基の特定のものと共に他の修飾された核酸塩基の調製
を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、上記の米国特許
第３，６８７，８０８号と共に、米国特許第４，８４５，２０５；５，１３０，
３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，
４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０
８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８
７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；
及び５，６８１，９４１号が含まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一所
有され、そして前記特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれ、そして米
国特許５，７５０，６９２号は本出願と同一所有され、そしてまた参照により本
明細書に組み込まれる。
【００２６】 本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、そのオリ
ゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増進させる、１つ又はそれ
以上の部分又はコンジュゲートを化学的に連結させることを伴う。こうした部分
には、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅ
ｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９
，８６，６５５３〜６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒ
ｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３〜１０６０）、チオ
エーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６〜３０９；Ｍ
ａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，
３，２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３〜５３８）、脂肪族鎖
、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒ
ａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏ
ｖら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａ
ｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９〜５４）、リン脂質
、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセリン又はトリエチルアンモニウム１
，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａ
ｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３
６５１〜３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，
１８，３７７７〜３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａ
ｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１
９９５，１４，９６９〜９７３）、あるいはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒ
ａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１〜３
６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９〜２３７）、あるいはオクタデシルア
ミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋ
ｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２
３〜９３７）が含まれる。
【００２７】 こうしたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を解説する代表的な米国特
許には、限定されるわけではないが、米国特許第４，８２８，９７９；４，９４
８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；
５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７；５，５８０，
７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，
１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０
３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８
７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；
４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，
３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，
１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６
３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５
８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；
５，３１７，０９８；５，３７１，２４１；５，３９１，７２３；５，４１６，
２０３；５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，
５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４
２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９
７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８及び５，６８８，９４１
号が含まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一所有され、そして前記特許
の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】 既定の化合物のすべての位置が均質に修飾されていることは必要ではなく、そ
して実際、上述の修飾の１つ以上が、単一の化合物に、又はオリゴヌクレオチド
の単一のヌクレオシドにも取り込まれていてもよい。本発明はまた、キメラ化合
物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、“キメラ”アンチ
センス化合物又は“キメラ”は、各々少なくとも１つの単量体単位、すなわちオ
リゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチドで構成される、２つ又はそれ以上
の化学的に異なる領域を含む、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドで
ある。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、そのオリゴヌクレオチドに
、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、及び／又は
標的核酸に対する増加した結合親和性を与えるように、そのオリゴヌクレオチド
が修飾されている、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらな
る領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可
能な酵素に対する基質として働く可能性がある。例として、ＲＮアーゼＨは、Ｒ
ＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。Ｒ
ＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それにより、遺
伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に増進させる。その結果、キメ
ラオリゴヌクレオチドを用いた場合、同一の標的領域にハイブリダイズするホス
ホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較し、より短いオリゴヌクレオ
チドで、しばしば匹敵する結果を得ることが可能である。ＲＮＡ標的の切断は、
ゲル電気泳動、及び必要な場合、当該技術分野に知られる関連する核酸ハイブリ
ダイゼーション技術により、日常的に検出可能である。
【００２９】 本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ又はそれ以上の上述のようなオリ
ゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、及び／又はオリゴヌクレオチド擬似
体の混成構造として形成されてもよい。こうした化合物は、当該技術分野に、ハ
イブリッド又はギャップマーと称されている。こうしたハイブリッド構造の調製
を解説する、代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許第５
，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７
７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５
６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６
；及び５，７００，９２２号が含まれ、前記特許の特定のものは、本出願と同一
所有され、そして前記特許の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる
。
【００３０】 本発明にしたがって用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の公知の技術
を通じ、好適にそして日常的に、作成することが可能である。こうした合成のた
めの装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォス
ターシティー）を含む、いくつかの業者により、販売されている。こうした合成
のための、当該技術分野に知られるいかなる他の手段を、さらに、又は別に、使
用してもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオ
チドを調製する同様の技術を用いることが公知である。 本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源の
アンチセンス組成物、又はアンチセンス分子の in vivo合成を指示するよう設計
された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００３１】 本発明の化合物はまた、例えばリポソーム、受容体指向性分子、経口、直腸、
局所又は他の製剤のように、取り込み、分布及び／又は吸収を補助するため、他
の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合し、これらに被包し、これらとコン
ジュゲート化し、又は別の方法で関連させてもよい。こうした取り込み、分布及
び／又は吸収補助製剤の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけ
ではないが、米国特許第５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６
，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５
，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３
３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２
１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３
；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２
，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５
，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５
７５；及び５，５９５，７５６号が含まれ、前記特許の各々は参照により本明細
書に組み込まれる。
【００３２】 本発明のアンチセンス化合物は、いかなる薬学的に許容できる塩、エステル、
又はこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際、生物学的
に活性がある代謝産物又はその残基を（直接又は間接的に）提供することが可能
な、いかなる他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の
化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容できる塩、こうしたプロドラッグの薬学
的に許容できる塩、並びに他の生物学的等価物にも関する。 “プロドラッグ”という用語は、内因性酵素又は他の化学薬品及び／又は状態
の作用により、体内又は体の細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換される、不
活性型で調製されている療法剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプ
ロドラッグ型は、１９９３年１２月９日に公表されたＧｏｓｓｅｌｉｎらに対す
るＷＯ９３／２４５１０又はＩｍｂａｃｈらに対するＷＯ９４／２６７６４に開
示される方法にしたがったＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフ
ェート）誘導体として調製される。
【００３３】 “薬学的に許容できる塩”という用語は、本発明の化合物の生理学的及び薬学
的に許容できる塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そして
その望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。 薬学的に許容できる塩基付加塩は、金属又はアミン、例えばアルカリ及びアル
カリ土類金属又は有機アミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例
は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、及びそれらに匹敵する
ものである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ク
ロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロへキシルアミン、エチ
レンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒ
ｇｅら，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒ
ｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６：１〜１９を参照されたい）。前記酸性化合物
の塩基付加塩は、慣用的な方式で、十分な量の望ましい塩基と、遊離酸型を接触
させ、塩を生じさせることにより、調製する。遊離酸型は、慣用的な方式で、酸
と塩型を接触させ、そして遊離酸を単離することにより、再生してもよい。遊離
酸型は、それぞれの塩型と、極性溶媒における可溶性などの特定の物理的特性に
おいて、幾分異なるが、それ以外は、本発明の目的には、その塩は、それぞれの
遊離酸と同等である。本明細書において、“薬学的付加塩”は、本発明の組成物
の成分の１つの酸型の薬学的に許容できる塩を含む。これらには、アミンの有機
又は無機酸塩が含まれる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、
硝酸塩及びリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容できる塩は、当業者に公知
であり、そして多様な無機及び有機酸の塩基性塩であって、例えば、無機酸、例
えば塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸を用い；有機酸、カルボン酸、スルホン
酸、スルホ又はホスホ酸又はＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン
酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレ
イン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル
酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、
４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エ
ンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸又はイソニコチン酸を用い
；そしてアミノ酸、例えば天然のタンパク質合成に関与する２０のアルファ−ア
ミノ酸、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸を用い、そしてまたフェニル酢
酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、
エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスル
ホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２
−又は３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシル
スルファミン酸（シクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）の形成と共に）を用い、
あるいは他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸などを用いる、前記塩基性
塩が含まれる。化合物の薬学的に許容できる塩はまた、薬学的に許容できる陽イ
オンで調製してもよい。適切な薬学的に許容できる陽イオンは、当業者に公知で
あり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び第四級アンモニウム陽
イオンを含む。炭酸塩又は炭酸水素塩もまた、使用可能である。
【００３４】 オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容できる塩の好ましい例には、限
定されるわけではないが、（ａ）陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、アン
モニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミン及びスペ
ルミジンなどで形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、
リン酸、硝酸及びそれらに匹敵するもので形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、
例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸
、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸
、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、
ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、及び
それらに匹敵するもので形成される塩；並びに（ｄ）塩素、臭素、及びヨードな
ど元素陰イオンから形成される塩が含まれる。
【００３５】 本発明のアンチセンス化合物は、診断剤、療法剤、予防剤のため、そして研究
試薬及びキットとして、利用してもよい。療法剤では、Ｓｈｉｐ−２の発現をモ
ジュレートすることにより治療することが可能な疾患又は障害を有すると疑われ
る動物、好ましくはヒトを、本発明にしたがったアンチセンス化合物を投与する
ことにより、治療する。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を、適
切な薬学的に許容できる希釈剤又はキャリヤに添加することにより、薬剤組成物
に利用することが可能である。本発明のアンチセンス化合物及び方法の使用はま
た、例えば、感染、炎症又は腫瘍形成を予防する又は遅延するために、予防的に
有用である可能性もある。
【００３６】 本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がＳｈｉｐ−２をコードする
核酸にハイブリダイズし、サンドイッチ及び他のアッセイが、この事実を利用し
て容易に構築されることを可能にするため、研究及び診断剤に有用である。本発
明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、Ｓｈｉｐ−２をコードする核酸のハイ
ブリダイゼーションは、当該技術分野に知られる手段により検出することが可能
である。こうした手段は、オリゴヌクレオチドに対する酵素のコンジュゲート化
、オリゴヌクレオチドの放射標識又は他のいかなる適切な検出手段でもよいもの
を含んでもよい。試料中のＳｈｉｐ−２のレベルを検出するための、こうした検
出手段を用いたキットもまた、調製してもよい。
【００３７】 本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む薬剤組成物及び製剤も含む
。本発明の薬剤組成物は、局所又は全身治療が望ましいかどうかに応じ、そして
治療しようとする領域に応じ、いくつかの方式で投与してもよい。投与は、局所
（眼、並びに膣及び直腸搬送を含む粘膜に対するものを含む）、例えば、噴霧器
によるものを含む、粉末又はエアロゾル吸入による、肺；気管内、鼻内、上皮及
び経皮、経口又は非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下
、腹腔内又は筋内注射又は注入；あるいは頭蓋内、例えば鞘内又は脳室内、投与
を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオ
チドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００３８】 局所投与のための薬剤組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、ク
リーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末を含んでもよい。慣用
的な薬学的キャリヤ、水性、粉末又は油性基剤、粘稠化剤及びそれらに匹敵する
ものが必要である又は望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋及びそれら
に匹敵するものもまた、有用である可能性がある。 経口投与のための組成物及び製剤は、粉末又は顆粒、水又は非水性媒体中の懸
濁物又は溶液、カプセル、サシェー剤（ｓａｃｈｅｔ）又は錠剤が含まれる。粘
稠化剤、フレーバー剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、希釈剤、乳化剤
、分散補助又は結合剤が望ましい可能性もある。
【００３９】 非経口、鞘内又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤及び
他の適切な添加物、例えば限定されるわけではないが、浸透増進剤、キャリヤ化
合物及び他の薬学的に許容できるキャリヤ又は賦形剤もまた含んでもよい、無菌
水性溶液を含んでもよい。 本発明の薬剤組成物には、限定されるわけではないが、溶液、乳剤、及びリポ
ソーム含有製剤が含まれる。これらの組成物は、限定されるわけではないが、あ
らかじめ成形された液体、自己乳化固体及び自己乳化半流動体を含む、多様な成
分から生成することが可能である。
【００４０】 好適に単位投薬型で存在してもよい、本発明の薬剤製剤は、薬学業界に公知の
慣用技術にしたがい、調製してもよい。こうした技術には、活性成分を単数又は
複数の薬学的キャリヤ又は賦形剤と会合させる工程が含まれる。一般的に、活性
成分を液体キャリヤ又は細かく分割された固体キャリヤあるいは両方と、均質に
そして根本的に会合させ、そしてその後、必要であれば、産物を成形することに
より、製剤を調製する。 本発明の組成物は、多くの可能な投薬型のいずれで製剤してもよく、限定され
るわけではないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、及び浣
腸剤などが含まれる。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸
濁物として製剤してもよい。水性懸濁物は、例えば、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁物の粘性を増
加させる物質をさらに含んでもよい。懸濁物は、安定化剤も含んでもよい。
【００４１】 本発明の１つの態様において、薬剤組成物は泡状物として製剤し、そして用い
てもよい。薬学的泡には、限定されるわけではないが、乳剤、微小乳剤、クリー
ム、ゼリー及びリポソームなどの製剤を含む。性質は基本的に同様であるが、こ
れらの製剤は成分及び最終産物のコンシステンシーが多様である。こうした組成
物及び製剤の調製は、薬学及び製剤業の当業者に一般的に知られ、そして本発明
の組成物の製剤に適用してもよい。
【００４２】 乳剤 本発明の組成物は、乳剤として調製しそして製剤してもよい。乳剤は、典型的
には、通常、直径０．１μｍを越える小滴の形で、別のものの中に分散される１
つの液体の混成系である（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓ
ａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監
修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニュ
ーヨーク，第１巻，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋ
ｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨー
ク州ニューヨーク，第１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢ
ａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニュ
ーヨーク州ニューヨーク，第２巻，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら，Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン，１９８５，ｐ．
３０１）。乳剤は、しばしば、互いによく混合され、そして分散している、２つ
の混和しない液相で構成される二相系である。一般的に、乳剤は、油中水（ｗ／
ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかである可能性がある。水性相がバルクの
油性相中に細かく分割され、そして微小小滴として分散している場合、生じた組
成物は、油中水（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油性相がバルクの水性相
中に細かく分割され、そして微小小滴として分散している場合、生じた組成物は
、水中油（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相、及び水性相、油性相中の
溶液として、又はそれ自体別個の相として存在してもよい活性薬剤に加え、さら
なる成分を含んでもよい。薬剤賦形剤、例えば乳化剤、安定化剤、色素、及び酸
化防止剤もまた、必要に応じ、乳剤中に存在してもよい。薬剤乳剤はまた、例え
ば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）の場合のように、二
相以上で構成される多重乳剤であってもよい。こうした複雑な製剤は、しばしば
、単純な二元乳剤が提供しない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗ乳剤の個々の油
小滴が小さい水小滴を被包する多重乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に
、油性連続中に安定化されている水小球に被包される油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ
乳剤を提供する。
【００４３】 乳剤は、熱力学的安定性がほとんど又はまったくないことが特徴である。しば
しば、乳剤の分散又は断続相は、外部又は連続相中によく分散し、そして乳化剤
の媒介又は製剤の粘性により、この型で維持される。乳剤型軟膏基剤及びクリー
ムの場合のように、乳剤のどちらかの相が半流動体又は固体であってもよい。乳
剤を安定化する他の手段は、乳剤のどちらの相に取り込まれていてもよい乳化剤
の使用を伴う。乳化剤は、広く、４つのカテゴリーに分類することが可能である
：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、及び細分散固体（Ｉｄｓ
ｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅ
ｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，ｐ．１９９）
。
【００４４】 合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、乳剤の製剤に広い適用可能性
を見出されてきており、そして文献に概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉ
ｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，
Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ
，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎ
ｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，１９８８，第１巻，ｐ．１９９）。界面活
性剤は、典型的には両親媒性であり、そして親水性及び疎水性部分を含んでなる
。界面活性剤の親水性対疎水性性質の比は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）と名
づけられてきており、そして製剤の調製において、界面活性剤を分類し、そして
選択する、価値あるツールである。界面活性剤は：非イオン性、陰イオン性、陽
イオン性及び両性の親水性基の性質に基づき、異なる種類に分類することが可能
である（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒ
ｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８
，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１
巻，ｐ．２８５）。
【００４５】 乳剤製剤に用いられる天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファ
チド類、レシチン及びアラビアゴム（ａｃａｃｉａ）が含まれる。吸収基剤は、
無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を吸い込み、ｗ／ｏ乳剤を形成す
るが、その半流動体のコンシステンシーを維持することが可能な、親水性特性を
有する。細分割固体もまた、特に、界面活性剤と組み合わせた場合、そして粘性
調製において、優れた乳化剤として用いられている。これらには、極性無機固体
、例えば重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイ
ト、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、カオリン、モンモリロナイト、コロ
イド性ケイ酸アルミニウム及びコロイド性ケイ酸マグネシウムアルミニウム、色
素及び非極性固体、例えば炭素又はグリセリルトリステアレートが含まれる。
【００４６】 多様な非乳化物質もまた、乳剤製剤に含まれ、そして乳剤の特性に寄与する。
これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿
潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、親水性コロイド、保存剤及び酸化防止剤が含まれ
る（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，ｐ
．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒ
ｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８
，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１
巻，ｐ．１９９）。
【００４７】 親水性コロイド又は親水コロイドには、天然に存在するゴム及び合成ポリマー
、例えば多糖類（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グア
ル（ｇｕａｒ）ゴム、カラヤ（ｋａｒａｙａ）ゴム、及びトラガカント（ｔｒａ
ｇａｃａｎｔｈ）ゴム）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロ
ース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボ
マー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これ
らは水中で分散し、又は膨張し、コロイド性溶液を形成し、その溶液は、分散相
小滴の周りに強い界面フィルムを形成することにより、そして外部相の粘性を増
加させることにより、乳剤を安定化する。
【００４８】 乳剤は、しばしば、微生物の増殖を容易に維持する可能性があるいくつかの成
分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドを含むため、
これらの製剤はしばしば保存剤を取り込む。乳剤製剤に含まれる通常用いられる
保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化
ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル及びホウ酸が含まれる。
酸化防止剤もまた、通常、製剤の劣化を予防するため、乳剤製剤に添加される。
用いられる酸化防止剤は、遊離基スカベンジャー、例えば、トコフェロール類、
没食子酸アルキル類、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトル
エン、又は還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ二亜硫酸ナトリウム、及び酸
化防止剤共力剤、例えばクエン酸、酒石酸、及びレシチンであってもよい。
【００４９】 皮膚、経口及び非経口経路を介した乳剤製剤の適用及びその製造法は、文献に
概説されている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１
９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク
，第１巻，ｐ．１９９）。経口搬送のための乳剤製剤は、製剤が簡単であり、吸
収及び生物学的利用能の観点から有効であるため、非常に広く用いられている（
Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌ
ｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，ｐ．
２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ
ｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，
Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻
，ｐ．１９９）。ミネラルオイルに基づく下剤、油可溶性ビタミン及び高脂肪栄
養調製が、ｏ／ｗ乳剤として一般に経口投与されている物質中にある。
【００５０】 本発明の１つの態様において、オリゴヌクレオチド及び核酸の組成物は、微小
乳剤として製剤される。微小乳剤は、単一の、光学的に等方性で、そして熱力学
的に安定な液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系と定義することが可能
である（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒ
ｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８
，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１
巻，ｐ．２４５）。典型的には、微小乳剤は、まず水性界面活性剤溶液中に油を
分散させ、そしてその後、十分な量の第四の成分、一般的には、鎖の長さが中程
度のアルコールを添加し、透明な系を形成することにより、調製される系である
。したがって、微小乳剤もまた、表面活性分子の界面フィルムにより安定化され
ている、２つの混和しない液体の熱力学的に安定な、等方性の透明な分散体と記
載されている（Ｌｅｕｎｇ及びＳｈａｈ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．監修，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ，ニューヨーク，１８５〜２１５頁）。微小乳剤は、通常、油、水、界面活性
剤、補助界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）及び電解質を含む、３から５
つの成分の組み合わせを介して調製される。微小乳剤が、油中水（ｗ／ｏ）又は
水中油（ｏ／ｗ）型、いずれであるかは、用いられる油及び界面活性剤の特性、
並びに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素テールの構造及び幾何学的パッキ
ングに応じる（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペン
シルバニア州イーストン，１９８５，ｐ．２７１）。
【００５１】 状態図を利用した現象学的アプローチは、詳しく研究されてきており、そして
どのように微小乳剤を製剤するかに関し、当業者に包括的な知識をもたらしてい
る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ
，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍ
ａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，
ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏ
ｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８
８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第
１巻，ｐ．３３５）。慣用的な乳剤に比較し、微小乳剤は、自発的に形成される
、熱力学的に安定な小滴の製剤中で、水不溶性薬剤を可溶化させる利点を提供す
る。
【００５２】 微小乳剤の調製に用いられる界面活性剤には、限定されるわけではないが、単
独の又は補助界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面
活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類、ポリグリセリ
ン脂肪酸エステル類、テトラグリセリンモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラ
グリセリンモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセリンモノオレアート（
ＰＯ３１０）、ヘキサグリセリンペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセ
リンモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセリンモノオレアート（ＭＯ７
５０）、デカグリセリンセキオレアート（ＳＯ７５０）、デカグリセリンデカオ
レアート（ＤＡＯ７５０）が含まれる。補助界面活性剤は、通常、短鎖アルコー
ル、例えばエタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールであり、界面活
性剤フィルム中に浸透し、そしてその結果、界面活性剤分子の間に生成される空
の空間により秩序の乱れたフィルムを生成することにより、界面流動度を増加さ
せるよう作用する。しかし、微小乳剤は、補助界面活性剤を使用せずに調製して
もよく、そしてアルコール不含自己乳化微小乳剤系が当該技術分野に知られる。
水性相は、限定されるわけではないが、典型的には、水、薬剤の水性溶液、グリ
セリン、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセリン類、プロピレングリコー
ル類、及びエチレングリコールの誘導体であってもよい。油相には、限定される
わけではないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ Ｍ
ＣＭ、脂肪酸エステル類、中程度の鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、トリ−グリ
セリド類、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類
、ポリグリコール化グリセリド類、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリ
ド類、植物油類及びシリコン油を含んでもよい。
【００５３】 微小乳剤は、薬剤可溶化及び薬剤の吸収増進の観点から特に興味深い。液体に
基づく微小乳剤（ｏ／ｗ及びｗ／ｏ両方）は、ペプチドを含む、薬剤の経口生物
学的利用能を増進すると提唱されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５〜
１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。微小乳剤は、改善された薬剤可溶
化、酵素的加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が膜流動性及び浸透性の改変を
誘導することによる、薬剤吸収増進の可能性、調製が容易であること、固体投薬
型に比べ経口投与が容易であること、改善された臨床的効果、及び減少した毒性
といった利点をもたらす（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら，Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８〜１４３）。しばしば、微小乳剤
は、室温で成分を共にした際に、自発的に形成される可能性がある。これは、熱
不安定性薬剤、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを製剤する際、特に有利である
可能性がある。微小乳剤はまた、美容及び薬剤適用両方において、活性成分の経
皮搬送にも有効である。本発明の微小乳剤組成物及び製剤は、胃腸管からのオリ
ゴヌクレオチド及び核酸の全身吸収増加を促進すると共に、胃腸管、膣、口腔前
庭及び他の投与領域内でのオリゴヌクレオチド及び核酸の局所細胞取り込みも改
善するであろうと期待される。
【００５４】 本発明の微小乳剤はまた、製剤の特性を改善するため、そして本発明のオリゴ
ヌクレオチド及び核酸の吸収を増進するため、さらなる成分及び添加剤、例えば
ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、ラブラソール、及び浸透増進剤
も含んでもよい。本発明の微小乳剤に用いられる浸透増進剤は、５つの広いカテ
ゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性
剤の１つに属すると分類することが可能である（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの種類の各々は、上に論じられ
ている。
【００５５】 リポソーム 微小乳剤に加え、研究され、そして薬剤製剤に用いられている、多くの編成界
面活性剤構造がある。これらには、単層、ミセル、二層及び小胞が含まれる。リ
ポソームなどの小胞は、薬剤搬送の観点から、これらが提供するその特異性及び
作用期間のため、非常な興味をひきつけている。本発明において、“リポソーム
”という用語は、球状二層又は二層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞
を意味する。 リポソームは、親脂質成分及び水性内部から形成される膜を有する、単層又は
多層小胞である。水性部分は、搬送しようとする組成物を含む。陽イオン性リポ
ソームは、細胞壁に融合することが可能であるという利点を持つ。非陽イオン性
リポソームは、細胞壁とは効率的に融合できないが、in vivo でマクロファージ
により取り込まれる。
【００５６】 無傷の哺乳動物の皮膚を横断するため、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下
で、各々直径５０ｎｍ未満の一連の細かい孔を通過しなければならない。したが
って、非常に変形性で、そしてこうした細かい孔を通過することが可能であるリ
ポソームを使用することが望ましい。 リポソームのさらなる利点には；天然リン脂質から得られたリポソームは、生
体適合性であり、そして生物分解性であり；リポソームは広い範囲の水及び脂質
可溶性薬剤を取り込むことが可能であり；リポソームは、その内部区画中で、代
謝及び分解から、被包薬剤を保護することが可能であることが含まれる（Ｒｏｓ
ｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂ
ｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ（監修），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，第１巻，ｐ．２４５
）。リポソーム製剤の調製において考慮するのが重要なのは、リポソームの脂質
表面電荷、小胞サイズ及び水性体積である。
【００５７】 リポソームは、作用部位に活性成分を輸送しそして搬送するのに有用である。
リポソーム膜は、生物学的膜に構造的に似ているため、リポソームが組織に適用
された際、リポソームは細胞膜と合体し始める。リポソーム及び細胞の合体が進
行するにつれ、活性剤が作用する可能性がある細胞内に、リポソームの内容物が
移される。 リポソーム製剤は、多くの薬剤の搬送様式として、広範な研究の焦点となって
いる。局所投与に関し、リポソームが他の製剤に対し、いくつかの利点を提供す
る証拠が増えている。こうした利点には、投与薬剤の高い全身性吸収に関連する
減少した副作用、望ましい標的での増加した投与薬剤集積、及び親水性及び疎水
性両方の非常に多様な薬剤の皮膚への投与可能性が含まれる。 いくつかの報告により、リポソームが高分子量ＤＮＡを含む剤を皮膚に搬送す
る能力が詳しく述べられている。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを
含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分は、上部表皮の標的化を生じ
た。
【００５８】 リポソームは、２つの広い種類に属する。陽イオン性リポソームは陽性に荷電
しているリポソームであり、陰性に荷電しているＤＮＡ分子と相互作用し、安定
な複合体を形成する。陽性荷電ＤＮＡ／リポソーム複合体は、陰性荷電細胞表面
に結合し、そしてエンドソーム中に入る。エンドソーム内は酸性ｐＨであるため
、リポソームは破裂し、内容物を細胞質に放出する（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０〜９
８５）。 ｐＨ感受性又は陰性荷電リポソームは、ＤＮＡと複合体化するよりもＤＮＡを
捕捉する。ＤＮＡ及び脂質は共に、同様に荷電しているため、複合体形成よりも
反発が起こる。にもかかわらず、あるＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部に
捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、培養中の細胞単層
に搬送するのに、ｐＨ感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現
が、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９〜２７４）。
【００５９】 リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来ホスファチジルコリン以
外のリン脂質が含まれる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホ
スファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ
ＰＰＣ）で形成してもよい。陰イオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリ
ストイルホスファチジルグリセリンで形成されるが、陰イオン性融合体形成性（
ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＯＰＥ）で形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば
ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ
）で形成される。別の種類は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／
又はコレステロールの混合物で形成される。
【００６０】 いくつかの研究により、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所搬送が評価されて
いる。インターフェロンを含むリポソームのモルモット皮膚への適用により、皮
膚疱疹傷の減少が生じたが、他の手段を介した（例えば溶液として又は乳剤とし
ての）インターフェロンの搬送は無効であった（Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５〜４１０）。
さらに、さらなる研究により、水性系を用いたインターフェロン投与に対し、リ
ポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、そ
してリポソーム製剤が水性投与より優れていると結論付けられた（ｄｕ Ｐｌｅ
ｓｓｉｓら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９
〜２６５）。
【００６１】 非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含
んでなる特定の系もまた、皮膚への薬剤搬送における有用性を決定するため、調
べられている。ＮｏｖａｓｏｍｅTMＩ（グリセリルジラウレート／コレステロー
ル／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅTM ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０
−ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を用い、マウス
皮膚の真皮にシクロスポリン−Ａを搬送した。結果により、こうした非イオン性
リポソーム系は、皮膚の異なる層へのシクロスポリン−Ａ堆積を助長するのに有
効であることが示された（Ｈｕら，Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９
９４，４，６，４６６）。
【００６２】 リポソームは“立体的に安定化された”リポソームも含み、本明細書において
、この用語は、１つ又はそれ以上の特殊化脂質であって、リポソームに取り込ま
れた際に、こうした特殊化脂質を欠くリポソームに比べ、循環期間の増進を生じ
る前記特殊化脂質を含んでなるリポソームを指す。立体的に安定なリポソームの
例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が（Ａ）１つ又はそれ以上の糖脂質
、例えばモノシアロガングリオシドＧM1を含んでなる、あるいは（Ｂ）１つ又は
それ以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘
導体化されているものである。いかなる特定の学説に縛られることも望ましくな
いが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ誘導体化
脂質を含む、立体的に安定なリポソームに関しては、これらの立体的に安定なリ
ポソームの増進された循環半減期は、細網内皮細胞系（ＲＥＳ）の細胞への減少
した取り込みによるものと当該技術分野に考えられている（Ａｌｌｅｎら，ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。１つ又はそれ以上の糖脂質を含ん
でなる、多様なリポソームが当該技術分野に知られる。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏ
ｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）
は、モノシアロガングリオシドＧM1、ガラクトセレブロシド硫酸、及びホスファ
チジルイノシトールがリポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これ
らの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）により詳しく解説された。共にＡｌｌｅ
ｎらに対する、米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４は、
（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧM1又はガラクトセレブロ
シド硫酸エステルを含んでなるリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，
１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示
する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソ
ームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）に開示される。
【００６３】 １つ又はそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでなる多くの
リポソーム及びその調製法が、当該技術分野に知られる。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（
Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥ
Ｇ部分を含む、非イオン性界面活性剤２Ｃ12１５Ｇを含んでなるリポソームを記
載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、
ポリマー性グリコールを用いたポリスチレン粒子の親水性被覆が、有意に増進さ
れた血液半減期を生じることを記した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥ
Ｇ）のカルボキシル基の結合により修飾されている合成リン脂質がＳｅａｒｓ（
米国特許第４，４２６，３３０号及び第４，５３４，８９９号）に記載される。
Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、
ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）を含んでなるリポソームの血液循環半減期が有意に増加していることを
立証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、こうした観察を、
他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成される、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ
にまで広げた。外表面上に共有結合しているＰＥＧ部分を有するリポソームは、
Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号及びＷＯ９０／０４
３８４に記載される。１〜２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含むリポ
ソーム組成物、及びその使用法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５
５６号及び第５，３５６，６３３号）及びＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１
３，８０４号及び欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）に記載される。いくつ
かの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含んでなるリポソームは、ＷＯ９１／
０５５４５及び米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎらに対する
）及びＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧ修飾
セラミド脂質を含んでなるリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）
に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び第
５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面上の官能部分でさらに誘導体
化することが可能な、ＰＥＧ含有リポソームを記載する。
【００６４】 限定された数の、核酸含有リポソームが当該技術分野に知られる。Ｔｈｉｅｒ
ｒｙらに対するＷＯ９６／４００６２は、リポソーム中に高分子量核酸を被包す
る方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許第５，２６４，２２１号は
、タンパク質結合リポソームを開示し、そしてこうしたリポソームの内容物にア
ンチセンスＲＮＡを含むことが可能であることを主張する。Ｒａｈｍａｎらに対
する米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソームにオリゴデオキシヌクレオ
チドを被包する、特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ９７／０４７
８７は、ｒａｆ遺伝子に指向されているアンチセンスオリゴヌクレオチドを含ん
でなるリポソームを開示する。
【００６５】 トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、リポソームのさらに
別の種類であり、そして薬剤搬送ビヒクルとして魅力的な、非常に変形性の脂質
凝集体である。トランスファーソームは、非常に変形性であり、その小滴より小
さい孔を通じ、容易に浸透することが可能な脂質小滴と記載することが可能であ
る。トランスファーソームは、用いられる環境に対し適応可能であり、例えば、
自己最適化し（皮膚の孔の形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化なし
に標的に到達し、そしてしばしば自動装填する。トランスファーソームの作成の
ため、標準的リポソーム組成物に、表面縁活性化剤、通常、界面活性剤を添加し
てもよい。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に搬送するのに用い
られている。血清アルブミンのトランスファーソーム仲介搬送は、血清アルブミ
ン含有溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
【００６６】 界面活性剤は、乳剤（微小乳剤を含む）及びリポソームなどの製剤において、
広い適用を見出す。天然及び合成両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の特質
を分類しそして位置付ける、最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ
）の使用による。親水性基（“頭部”としても知られる）の性質は、製剤に用い
られる、異なる界面活性剤を分類するのに最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇ
ｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅ
ｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，１９８８，ｐ．２
８５）。
【００６７】 界面活性剤分子がイオン化されていない場合、非イオン性界面活性剤と分類さ
れる。非イオン性界面活性剤は、薬剤及び美容製品に広い適用を見出し、そして
広い範囲のｐＨ値に渡り、使用可能である。一般的に、そのＨＬＢ値は、構造に
応じ、２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、非イオン性エス
テル類、例えばエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールエステ
ル類、グリセリルエステル類、ポリグリセリルエステル類、ソルビタンエステル
類、スクロースエステル類、及びエトキシル化エステル類が含まれる。非イオン
性アルカノールアミド類及びエーテル類、例えば脂肪アルコールエトキシレート
類、プロポキシル化アルコール類、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロック
ポリマー類もまた、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非
イオン性界面活性剤種の最も一般的なメンバーである。
【００６８】 界面活性剤分子が陰性電荷を持つ場合、その分子を水に溶解し又は分散させた
際、その界面活性剤は、陰イオン性と分類される。陰イオン性界面活性剤には、
カルボン酸塩類、例えば石鹸、アシルラクチレート類、アミノ酸のアシルアミド
類、硫酸のエステル類、例えば硫酸アルキル類及びエトキシル化硫酸アルキル類
、スルホン酸塩類、例えばベンゼンスルホン酸アルキル類、イセチオン酸アシル
類、アシルタウレート類及びスルホコハク酸塩類、及びリン酸塩類が含まれる。
陰イオン性界面活性剤種の最も重要なメンバーは、硫酸アルキル類及び石鹸であ
る。
【００６９】 界面活性剤分子が陽性電荷を持つ場合、その分子を水に溶解し又は分散させた
際、その界面活性剤は、陽イオン性と分類される。陽イオン性界面活性剤には、
第四級アンモニウム塩類及びエトキシル化アミン類が含まれる。第四級アンモニ
ウム塩は、この種類の最も用いられるメンバーである。 界面活性剤分子が陽性又は陰性電荷どちらも持つ能力を有する場合、その界面
活性剤は、両性と分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換ア
ルキルアミド類、Ｎ−アルキルベタイン類及びホスファチド類が含まれる。 薬剤製品、製剤及び乳剤中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅ
ｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク，１９８８，ｐ．２８
５）。
【００７０】 浸透増進剤 １つの態様において、本発明は多様な浸透増進剤を使用し、核酸、特にオリゴ
ヌクレオチドの動物皮膚への効率的な搬送を達成する。大部分の薬剤は、溶液に
、イオン化及び非イオン化両方の形で存在する。しかし、通常、脂質可溶性又は
親油性薬剤のみが、容易に細胞膜を通過する。非親脂質性薬剤であっても、横断
しようとする膜が浸透増進剤で処理されている場合、細胞膜を横断することが可
能であることが発見されている。細胞膜を越える非親油性薬剤の拡散を補助する
のに加え、浸透増進剤はまた、親脂質性薬剤の浸透性も増進する。 浸透増進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩
、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の１つに属するとして、分類するこ
とが可能である（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ
．９２）。上述の浸透増進剤の種類の各々は、以下により詳細に記載される。
【００７１】 界面活性剤：本発明と関連し、界面活性剤（又は“表面活性剤”）は、水性溶
液に溶解された際、溶液の表面張力又は水性溶液及び別の液体の間の界面張力を
減少させ、その結果、粘膜を通じたオリゴヌクレオチドの吸収を増進する化学実
体である。胆汁酸及び脂肪酸に加え、これらの浸透増進剤は、例えば、ラウリル
硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエ
チレン−２０−セチル−エーテル（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，１９９１，ｐ．９２）；及びペルフルオロ化学乳剤、例えばＦＣ−４３（Ｔ
ａｋａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０
，２５２）を含む。
【００７２】 脂肪酸：浸透増進剤として作用する、多様な脂肪酸及びその誘導体には、例え
ば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプ
レート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセリン）、ジラウリ
ン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリン−１−モノカプレート、１−ドデシ
ルアザシクロへプタン−２−オン、アシルカルニチン類、アシルコリン類、それ
らのＣ1-10アルキルエステル類（例えばメチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）
、並びにそれらのモノ−及びジ−グリセリド類（すなわちオレエート、ラウリレ
ート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノリレート
など）が含まれる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，
ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０
，７，１〜３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
．，１９９２，４４，６５１〜６５４）。
【００７３】 胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収
の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍ
ａｎ│ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，Ｈａｒｄｍａｎら監修，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ
ｌ，ニューヨーク，１９９６，ｐｐ．９３４〜９３５）。多様な中性胆汁塩、及
びそれらの合成誘導体は、浸透増進剤として作用する。したがって、“胆汁塩”
という用語には、胆汁のいかなる天然に存在する成分と共にそのいかなる合成誘
導体も含まれる。本発明の胆汁塩には、例えば、コール酸（又はその薬学的に許
容できるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコ
ール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グル
コール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキ
シコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウ
ロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコー
ル酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ
）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グ
リコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエー
テル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉ
ｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１
９９１，９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，第３９章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ監修
，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン，１
９９０，７８２〜７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，１９９０，７，１〜３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘ
ｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９〜５８３）。
【００７４】 キレート剤：本発明と関連して用いられるようなキレート剤は、金属性イオン
と複合体を形成することにより、溶液からそのイオンを除去し、その結果、粘膜
を通じたオリゴヌクレオチドの吸収を増進する化合物と定義することが可能であ
る。本発明の浸透増進剤としてのその使用に関し、大部分の性質決定されている
ＤＮＡヌクレアーゼは、触媒のための二価金属イオンを必要とし、そしてしたが
ってキレート剤により阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤として
も作用する、さらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ．，１９９３，６１８，３１５〜３３９）。本発明のキレート剤には、限定さ
れるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエ
ン酸、サリチル酸塩類（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレー
ト及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシ
ル誘導体、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９及びベータ−ジケトン類のＮ−アミ
ノアシル誘導体（エナミン類）が含まれる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１〜３３；Ｂｕｕｒら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅ
ｌ．，１９９０，１４，４３〜５１）。
【００７５】 非キレート非界面活性剤：本明細書において、非キレート非界面活性剤浸透増
進化合物は、キレート剤又は界面活性剤として有意な活性を示さないが、にもか
かわらず、消化管粘膜を通じ、オリゴヌクレオチドの吸収を増進する化合物とし
て定義することが可能である（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。この種類の浸透増進剤には、例えば、非
飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導
体（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁）；及び
非ステロイド性抗炎症剤、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及
びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
【００７６】 細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを増進する剤も、本発明の薬剤及
び他の組成物に添加してもよい。例えば、陽イオン性脂質、例えばリポフェクチ
ン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、陽イオン性グリセ
リン誘導体、及びポリカチオン分子、例えばポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ
出願ＷＯ９７／３０７３１）もまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増進
することが知られる。 投与された核酸の浸透を増進するのに他の剤を利用してもよく、エチレングリ
コール及びプロピレングリコールなどのグリコール類、２−ピロールなどのピロ
ール類、アゾン類、並びにリモネン及びメントンなどのテルペン類が含まれる。
【００７７】 キャリヤ： 本発明の特定の組成物はまた、製剤中にキャリヤ化合物も取り込む。本明細書
において、“キャリヤ化合物”又は“キャリヤ”は、不活性である（すなわち、
それ自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を
分解するか、又は循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有
する核酸の生物学的利用能を減少させる in vivo過程により、核酸として認識さ
れる、核酸、又はその類似体を指す可能性がある。核酸及びキャリヤ化合物の同
時投与は、典型的には、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体に対す
るキャリヤ化合物及び核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓又は他の循環外貯蔵器
官に回収される核酸の量を実質的に減少させることが可能である。例えば、部分
的にホスホロチオエートであるオリゴヌクレオチドの肝組織における回収は、ポ
リイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸又は４−アセトアミド−４’
イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された際、減
少する可能性がある（Ｍｉｙａｏら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，
１９９５，５：１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６：１７７−１８３）
。
【００７８】 賦形剤： キャリヤ化合物と対照的に、“薬学的キャリヤ”又は“賦形剤”は、動物に１
つ又はそれ以上の核酸を搬送するための、薬学的に許容できる溶媒、懸濁剤又は
いかなる他の薬理学的に不活性なビヒクルでもよいものである。賦形剤は、液体
又は固体であってもよく、そして既定の薬剤組成物の核酸及び他の成分と組み合
わせた際、望ましい嵩高さ、コンシステンシーなどを提供するように、計画した
方式の投与と共に選択する。典型的な薬学的キャリヤには、限定されるわけでは
ないが、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポ
リビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（
例えばラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸
カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート類又はリン酸水素カルシウム
など）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド
性二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアリン酸塩類、水素添加植物油類、
コーンスターチ、ポリエチレングリコール類、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリ
ウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）
；及び湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれる。
【００７９】 核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に適した、薬学的に許容できる有機
又は無機賦形剤もまた、本発明の組成物を製剤するのに用いてもよい。薬学的に
許容できる適切なキャリヤには、限定されるわけではないが、水、塩溶液、アル
コール類、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチル
セルロース、ポリビニルピロリドン及びそれらに匹敵するものが含まれる。 核酸の局所投与のための製剤には、無菌及び非無菌水性溶液、アルコールなど
の一般的な溶媒中の非水性溶液、あるいは液体又は固体油基剤中の核酸溶液を含
んでもよい。溶液はまた、緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加物も含んでもよい
。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に適した、薬学的に許容できる有機
又は無機賦形剤を用いてもよい。 適切な薬学的に許容できる賦形剤には、限定されるわけではないが、水、塩溶
液、アルコール、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロー
ス、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシ
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン及びそれらに匹敵するものが含まれる
。
【００８０】 他の成分 本発明の組成物は、さらに、薬剤組成物に慣用的に見られる他の付属成分を、
その当該技術分野に確立された使用レベルで、含んでもよい。したがって、例え
ば、組成物は、例えば鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤などの、さらな
る適合する薬学的に活性がある成分を含んでもよいし、あるいは、本発明の組成
物の多様な投薬型を物理的に製剤するのに有用である、さらなる成分、例えば、
色素、フレーバー剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、粘稠化剤及び安定化剤など
を含んでもよい。しかし、こうした成分は、添加される際、本発明の組成物の成
分の生物学的活性を、過度に妨げてはならない。製剤は、滅菌し、そして望まし
い場合、製剤の単数又は複数の核酸と有害に反応しない、補助剤、例えば滑沢剤
、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色
料、フレーバー剤及び／又は芳香物質及びそれらに匹敵するものと混合してもよ
い。 水性懸濁物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトー
ル及び／又はデキストランを含む、懸濁物の粘性を増加させる物質を含んでもよ
い。懸濁物はまた、安定化剤も含んでもよい。
【００８１】 本発明の特定の態様は、（ａ）１つ又はそれ以上のアンチセンス化合物及び（
ｂ）非アンチセンス機構により機能する、１つ又はそれ以上の他の化学療法剤、
を含む薬剤組成物を提供する。こうした化学療法剤の例には、限定されるわけで
はないが、抗癌薬剤、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシ
ン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロランブ
シル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグ
アニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウ
リジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリ
スチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチル
スチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれる。一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版
，Ｂｅｒｋｏｗら監修，１９８７，ニュージャージー州ラーウェイ，１２０６−
１２２８頁を参照されたい。限定されるわけではないが非ステロイド抗炎症薬剤
及びコルチコステロイドを含む抗炎症薬剤、及び限定されるわけではないが、リ
ビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルを含む抗ウイルス薬剤
もまた、本発明の組成物と組み合わせてもよい。一般的には、それぞれ、Ｔｈｅ
Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ，第１５版，Ｂｅｒｋｏｗら監修，１９８７，ニュージャージー州ラーウェ
イ，２４９９−２５０６及び４６−４９頁を参照されたい。他の非アンチセンス
化学療法剤もまた、本発明の範囲内である。２つ又はそれ以上の配合化合物を、
共に又は連続的に用いてもよい。
【００８２】 別の関連する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸に指向されている
１つ又はそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、及び第二の
核酸標的に指向されている１つ又はそれ以上のさらなるアンチセンス化合物を含
んでもよい。多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野に知られる。２つ又
はそれ以上の配合化合物を、共に又は連続的に用いてもよい。 療法組成物の製剤及びそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内であると考え
られる。投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度及び応答性に応じ、治療過
程は数日から数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまで又は疾患状態の軽減が達成
されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤集積の測定値から計算
することが可能である。一般の当業者は、容易に最適投薬、投薬方法論及び反復
率を決定することが可能である。最適投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対
強度に応じ異なる可能性があり、そして一般的に in vitro 及び in vivo動物モ
デルで有効であることが見出されたＥＣ50に基づき、概算することが可能である
。一般的に、投薬は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇであり、そして
毎日、毎週、毎月又は毎年１回又はそれ以上、あるいは２から２０年ごとに１回
、投与してもよい。一般的な当業者は、体液又は組織における、薬剤の測定され
た滞留時間及び濃度に基づく投薬反復率を、容易に概算することが可能である。
治療の成功後、患者に疾患状態の再発を防ぐ維持療法を受けさせることが望まし
い可能性があり、ここで、オリゴヌクレオチドは、毎日１回又はそれ以上、から
２０年ごとに１回、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲の維持用
量で投与される。 本発明は特定のその好ましい態様と一致し、特異性を持って記載されているが
、以下の実施例は、本発明を例示するためのみに提供され、そして本発明を限定
することを意図しない。
【００８３】
【実施例】実施例１ オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイト デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト ２’−デオキシ及び２’−メトキシのβ−シアノエチルジイソプロピルホスホ
ロアミダイトは、供給業者（例えば、Chemgenes, Needham MA 又は Glen Resear
ch，Inc. Sterling VA) から購入された。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレ
オシドアミダイトは、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第５，５０６
，３５１号に記載されているようにして調製される。２’−アルコキシアミダイ
トを使用して合成されるオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールと塩基の
パルス送逹後の待機工程を３６０秒に増やした以外は、未修飾オリゴヌクレオチ
ドについての標準的サイクルを利用した。 ５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有す
るオリゴヌクレオチドは、公表された方法 (Sanghvi et al, Nucleic Acids Res
earch, 1993, 21, 3197-3203) に従って、商業的に入手可能なホスホロアミダイ
ト (Glen Reserach, Inc．Sterling VA 又は ChemGenes，Needham MA) を使用し
て合成された。
【００８４】 ２’−フルオロアミダイト ２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト ２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、先に記載された通りに (Kawasaki et
al, J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) 及び参照により本明細書に取り込まれ
る米国特許第５，６７０，６３３号に記載された通りに合成された。簡単に説明
すると、保護されたヌクレオシドであるＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２
’−フルオロアデノシンが、商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ルアデノシンを出発原料として利用し、かつ、それによって２’−α−フルオロ
原子が２’−β−トリチル基のＳN ２−置換によって導入される文献手順を修飾
することにより合成された。かくして、Ｎ６−ベンゾイル−β−Ｄ−アラビノフ
ラノシルアデノシンが、３’，５’−ジテトラハイドロピラニル（ＴＨＰ）中間
体としてまずまずの収率で選択的に保護された。このＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイ
ル基の脱保護が標準的方法論を使用して行なわれ、そして、標準的方法を使用し
て、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロ
アミダイト中間体を得た。
【００８５】 ２’−フルオロデオキシグアノシン ２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジ
シロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発
原料として使用し、そして中間体のジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシ
ンに転化して行なわれた。ＴＰＤＳ基の脱保護をしてから、そのヒドロキシル基
をＴＨＰで保護して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニ
ンを得た。その粗生成物をフッ化物で処理することによって、選択的Ｏ−脱アシ
ル化とトリフレート化を行い、次いで、ＴＨＰ基を脱保護した。標準的方法を使
用して５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００８６】 ２’−フルオロウリジン ２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−
１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルが７０％フッ化水素−ピリジンで処理
される文献手順を修飾することにより合成された。標準的方法を使用して、５’
−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００８７】 ２’−フルオロデオキシシチジン ２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンが２’−デオキシ−２’−フルオロ
ウリジンのアミノ化を介して合成されてから、選択的保護をしてＮ４−ベンゾイ
ル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンが得られた。標準的方法を使用し
て、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得た。
【００８８】 ２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト ２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、次のようにして、
又は Martin, P, Helvetica Chimica Acta，1995，78，486-504 の方法に従って
調製される。
【００８９】 ２，２’−アンヒドロ〔１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウ
リジン〕 ５−メチルウリジン（リボシルチミン，Yamasa，Choshi，Japan から入手可能
）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ) 、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ
）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に
加えた。この混合物を攪拌しながら加熱して還流させ、発生した二酸化炭素を制
御されたやり方で放出させた。１時間後、僅かに暗色になったこの溶液を減圧下
で濃縮した。得られたシロップは、攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）
中に注がれた。その生成物はガム状になった。エーテルがデカントされて、その
残渣が最小量のメタノール（約４００ｍＬ）中に溶解された。その溶液は新しい
エーテル（２．５Ｌ）中に注がれて堅いガム状になった。エーテルがデカントさ
れ、そのガムは減圧オーブン（１ｍｍＨｇで６０℃で２４時間）中で乾燥されて
固体になり淡黄褐色粉末に粉砕された（５７ｇ，８５％粗収率）。ＮＭＲスペク
トルはその構造と一致したが、フェノールがナトリウム塩として混ざっていた（
約５％）。この物質が、更なる反応に使用された（酢酸エチル中のメタノール（
１０〜２５％）の濃度勾配を使用するカラムクロマトグラフィーによって更に精
製されて、ｍｐ２２２〜４℃の白色固体を得ることができる）。
【００９０】 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン ２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ) 、トリ
ス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メトキシ
エタノール（１．２Ｌ）が、２Ｌステンレススチール圧力容器に加えられ、１６
０℃に予備加熱された油浴に載せられた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した
後、容器を開けてその溶液を濃縮乾固し、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中で磨り潰し
た。残渣を熱アセトン（１Ｌ）中に懸濁させた。不溶性塩を濾過してアセトン（
１５０ｍＬ）で洗浄し、そして濾液を濃縮した。その残渣（２８０ｇ）は、ＣＨ 3 ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解されて濃縮された。０．５％Ｅｔ3 ＮＨを含有す
るＣＨ2 Ｃｌ2 ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中にシリカゲルカラム（
３ｋｇ）を詰めた。残渣は、ＣＨ2 Ｃｌ2 （２５０ｍＬ）中に溶解され、シリカ
（１５０ｇ）上に吸着されてから、カラムに充填された。その生成物は充填溶媒
で溶出されて１６０ｇ（６３％）の生成物が得られた。不純物のある画分を再展
開することによって追加の物質が得られた。
【００９１】 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ)
がピリジン（２５０ｍＬ）と同時濃縮され、その乾燥残渣がピリジン（１．３Ｌ
）中に溶解された。第１アリコートの塩化ジメトキシトリチル（９４．３ｇ，０
．２７８Ｍ）が加えられ、その混合物が室温で１時間攪拌された。第２アリコー
トの塩化ジメトキシトリチル（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）が加えられ、その反
応液が更に１時間攪拌された。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）が加えられて
反応が停止された。ＨＰＬＣで、約７０％生成物の存在が示された。溶媒が留去
され、ＣＨ3 ＣＮ（２００ｍＬ）中で磨り潰された。その残渣はＣＨＣｌ3 （１
．５Ｌ）中に溶解され、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3 及び２×５００ｍＬ
の飽和ＮａＣｌで抽出された。有機層がＮａ2 ＳＯ4 で乾燥され、濾過され、そ
して濃縮された。２７５ｇの残渣が得られた。その残渣は、０．５％Ｅｔ3 ＮＨ
を含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）中に充填された３．
５ｋｇのシリカゲルカラムで精製されて溶出された。その純粋な画分は濃縮され
て１６４ｇの生成物が得られた。約２０ｇの追加量が不純画分から得られて、１
８３ｇの総収量（５７％）となった。
【００９２】 ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦ及び
１８８ｍＬのピリジンから調製された７５０ｍＬの３：１混合液）及び無水酢酸
（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を混合して室温で２４時間攪拌した。反応は
ＴＬＣにより、ＭｅＯＨの添加で最初にＴＬＣサンプルの反応を停止させること
によって追跡された。ＴＬＣで反応が完結したと判断されたところで、ＭｅＯＨ
（５０ｍＬ）を加えてその混合物を３５℃で濃縮した。その残渣は、ＣＨＣｌ3 （８００ｍＬ）中に溶解され、２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２×
２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出された。水層が２００ｍＬのＣＨＣｌ3 で逆抽
出された。合わせた有機層が硫酸ナトリウムで乾燥され、濃縮されて１２２ｇの
残渣が得られた（約９０％生成物）。その残渣は、３．５ｋｇのシリカゲルカラ
ムで精製され、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出された。純粋な生成物画
分が濃縮されて９６ｇが得られた（８４％）。追加の１．５ｇが後続画分から回
収された。
【００９３】 ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ3 ＣＮ（７００ｍＬ
）中に溶解させることにより、第１溶液を調製した。トリエチルアミン（１８９
ｍＬ，１．４４Ｍ）がＣＨ3 ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ
）の溶液に加えられ、−５℃に冷却され、そしてオーバーヘッドスターラーを使
用して０．５時間攪拌された。０〜１０℃に維持されたこの攪拌溶液にＰＯＣｌ 3 が３０分かけて滴下され、そして得られた混合液が更に２時間攪拌された。こ
の溶液に第１溶液が４５分かけて滴下された。得られた反応混合液は、冷たい部
屋に一夜保管された。この反応混合液から塩が濾過され、その溶液は濃縮された
。その残渣は、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中に溶解されて、不溶固体が濾過により除去
された。濾液は、１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ3 及び２×３００ｍＬの飽和Ｎａ
Ｃｌで洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、そして濃縮された。その残渣は、
ＥｔＯＡｃ中で磨り潰されて表題化合物が得られた。
【００９４】 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン ジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ4 ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチ
ル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−
４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）の溶液が、室温で２時間
攪拌された。このジオキサン溶液は濃縮され、その残渣はＭｅＯＨ（２×２００
ｍＬ）と共沸された。その残渣は、ＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解され、２Ｌ
ステンレススチール圧力容器に移された。ＮＨ3 ガスで飽和されたＭｅＯＨ（４
００ｍＬ）が加えられ、そしてその容器は１００℃で２時間加熱された（ＴＬＣ
で転化が完結したことが示された）。容器の内容物は濃縮乾固され、残渣がＥｔ
ＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解されて、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一回洗浄
された。有機層が硫酸ナトリウムで乾燥され、溶媒が留去されて８５ｇ（９５％
）の表題化合物が得られた。
【００９５】 Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解させ、無水安息
香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）が攪拌しながら加えられた。３時間攪拌した
後、約９５％の反応が完結したことがＴＬＣで示された。溶媒が留去され、そし
て残渣はＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸された。その残渣は、ＣＨＣｌ3 （７０
０ｍＬ）中に溶解され、飽和ＮａＨＣＯ3 （２×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ
（２×３００ｍＬ）で抽出され、ＭｇＳＯ4 で乾燥され、溶媒が留去されて残渣
が得られた（９６ｇ）。この残渣は、溶離溶媒として０．５％Ｅｔ3 ＮＨを含有
するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用する１．５ｋｇシリカカラムでのク
ロマトグラフィーに付された。純粋な生成物画分が濃縮され、９０ｇ（９０％）
の表題化合物が得られた。
【００９６】 Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）がＣＨ2 Ｃｌ2 （１Ｌ）中に溶
解された。窒素雰囲気下で、テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）及
び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，
０．１２３Ｍ）を攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間攪拌さ
れた（ＴＬＣで反応が９５％完結したことが示された）。この反応混合物は、飽
和ＮａＨＣＯ3 （１×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出
された。それら水性洗浄液は、ＣＨ2 Ｃｌ2 （３００ｍＬ）で逆抽出され、抽出
液が合わされ、ＭｇＳＯ4 で乾燥され、そして濃縮された。得られた残渣は、溶
離溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用する１．５ｋｇシリカカラ
ムでのクロマトグラフィーに付された。純粋な画分が合わされて、９０．６ｇ（
８７％）の表題化合物が得られた。
【００９７】 ２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジ
メチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト ２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト ２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術
分野では２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトと
しても知られている〕は、次の段落に記載の通りに調製される。アデノシン、シ
チジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外アミンが、アデノシン及
びシチジンの場合はベンゾイル基で保護され、グアノシンの場合はイソブチリル
基で保護されること以外は、チミジン（５−メチルウリジン）と同じように調製
される。
【００９８】 ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｏ2 −２’−アンヒドロ−５−メ
チルウリジン Ｏ2 −２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン (Pro. Bio．Sint., Varese ，
Itary,１００．０ｇ，０．４１６ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０．６
６ｇ，０．０１３当量，０．００５４ミリモル）が、アルゴン雰囲気下、機械攪
拌下で周囲温度で乾燥ピリジン（５００ｍＬ）中に溶解された。tert−ブチルジ
フェニルクロロシラン（１２５．８ｇ，１１９．０ｍＬ，１．１当量，０．４５
８ミリモル）が一度に加えられた。反応液は、周囲温度で１６時間攪拌された。
ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．２２，酢酸エチル）で反応の完結が示された。その溶液は、
減圧下で粘稠オイルになるまで濃縮された。これをジクロロメタン（１Ｌ）と飽
和重炭酸ナトリウム（２×１Ｌ）及び食塩水（１Ｌ）に分配した。有機層は、硫
酸ナトリウムで乾燥され、減圧下で粘稠オイルになるまで濃縮された。そのオイ
ルは、酢酸エチルとエチルエーテルの１：１混合液（６００ｍＬ）中に溶解され
、その溶液は−１０℃に冷却された。得られた結晶性生成物は濾取され、エチル
エーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄され、そして乾燥（４０℃，１ｍｍＨｇ，２
４ｈ）されて１４９ｇ（７４．８％）の白色固体を得た。ＴＬＣ及びＮＭＲは、
純粋な生成物と一致した。
【００９９】 ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチ
ル）−５−メチルウリジン ２Ｌステンレススチールの未攪拌圧力反応器中に、テトラヒドロフラン（１．
０Ｍ，２．０当量，６２２ｍＬ）中のボランを加えた。ヒュームフード中でそし
て手攪拌をしながら、エチレングリコール（３５０ｍＬ，過剰）をまず水素の発
生が収まるまで注意して加えた。５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｏ 2 −２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３１１モル）及び
重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ，０．００３当量）が手攪拌をしながら加えら
れた。反応器は密閉され、内部温度が１６０℃に到達するまで油浴で加熱されて
から、１６時間維持された（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。その反応容器は周囲温度
まで冷却されて開けられた。ＴＬＣ（望まれる生成物についてＲｆ＝０．６７で
ありアラ−Ｔ副生成物についてＲｆ＝０．８２，酢酸エチル）で、生成物への約
７０％転化率が示された。更なる副生成物形成を避けるために反応を停止させ、
エチレングリコールを除去するために、より厳しい条件で温水浴（４０〜１００
℃）で減圧（１０〜１ｍｍＨｇ）濃縮した。（低沸点溶媒が飛んだら、残りの溶
液を酢酸エチルと水に分配してもよい。その生成物は有機層の方にゆく。）残渣
は、カラムクロマトグラフィー（２ｋｇシリカゲル，酢酸エチル−ヘキサン勾配
１：１〜４：１）により精製された。適切な画分が合わされ、溶媒が飛ばされ、
そして白色泡状固体（８４ｇ，５０％）になるまで乾燥された。出発原料（１７
．４ｇ）が混ざっていて、純粋な再利用可能出発原料は２０ｇであった。あまり
純粋でない回収出発原料の出発原料に基づいた収率は５８％であった。ＴＬＣ及
びＮＭＲは、９９％純度の生成物と一致した。
【０１００】 ２’−Ｏ−〔（２−フタルイミドキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジン ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチ
ル）−５−メチルウリジン（２０ｇ，３６．９８ミリモル）が、トリフェニルホ
スフィン（１１．６３ｇ，４４．３６ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイミ
ド（７．２４ｇ，４４．３６ミリモル）と混合された。次いで、それは高真空下
４０℃でＰ2 Ｏ5 で２日間乾燥された。その反応混合液はアルゴンで満たされ、
そして乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ，Aldrich,密封ビン入り) が加えられて澄明
な溶液になった。その反応混合液にアゾジカルボン酸ジエチル（６．９８ｍＬ，
４４．３６ミリモル）が滴下された。滴下の速度は、その結果得られる深赤色が
次の滴下が行なわれる前に消えるような速度に維持された。滴下が完了した後、
反応液は４時間攪拌された。その時間までにＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン，６
０：４０）で反応の完結が示された。溶媒が減圧留去された。得られた残渣は、
フラッシュカラムに入れられ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶離され
、２’−Ｏ−〔（２−フタルイミドキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジンが白色泡状固体（２１．８１９ｇ，８６％）と
して得られた。
【０１０１】 ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキ
シミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−〔（２−フタルイミドキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ，４．５ミリモル）が乾燥ＣＨ2 Ｃｌ 2 （４．５ｍＬ）中に溶解され、そしてメチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６
４ミリモル）が−１０〜０℃で滴下された。１時間後、その混合液は濾過され、
濾液が氷冷ＣＨ2 Ｃｌ2 で洗浄され、合わせた有機相が水、食塩水で洗浄され、
そして無水Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥された。この溶液は濃縮され、２’−Ｏ−（２−
アミノオキシエチル）チミジンが得られ、次いで、ＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）中
に溶解された。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液，ｗ／ｗ，１．１当量）
が加えられ、得られた混合液が１時間攪拌された。溶媒が減圧留去され、残渣は
クロマトグラフィーにかけられて、５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−
２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
が白色泡状物（１．９５ｇ，７８％）として得られた。
【０１０２】 ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキ
シミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン（１．７７ｇ，３．１２ミリモル
）が、乾燥ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍｐ−トルエンスルホン酸ピリジニ
ウム（ＰＰＴＳ）の溶液中に溶解された。この溶液に、不活性雰囲気下１０℃で
、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）が加えられ
た。その反応混合液は、１０℃で１０分間攪拌された。その後、反応容器が氷浴
から取り出されて室温で２時間攪拌され、反応がＴＬＣ（ＣＨ2 Ｃｌ2 中５％Ｍ
ｅＯＨ）により追跡された。ＮａＨＣＯ3 水溶液（５％，１０ｍＬ）が加えられ
、そして酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出された。酢酸エチル相が無水Ｎａ2
ＳＯ4 で乾燥され、そして濃縮乾固された。残渣は、ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）
中の１Ｍ ＰＰＴＳの溶液中に溶解された。ホルムアルデヒド（２０％，ｗ／ｗ
，３０ｍＬ，３．３７ミリモル）が加えられ、そしてその反応混合液が室温で１
０分間攪拌された。氷浴中で１０℃まで冷却され、シアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）が加えられ、そしてその反応混合液は１０
℃１０分間攪拌された。１０分後、その反応混合液が氷浴から取り出されて室温
で２時間攪拌された。その反応混合液に、５％ＮａＨＣＯ3 溶液（２５ｍＬ）が
加えられ、そして酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出された。酢酸エチル層が無
水Ｎａ 2 ＳＯ4 で乾燥され、そして濃縮乾固された。得られた残渣は、フラッ
シュカラムクロマトグラフィーにより精製され、ＣＨ2 Ｃｌ2 中の５％ＭｅＯＨ
で溶離され、５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジンが白色泡状物（１４．６ｇ，
８０％）として得られた。
【０１０３】 ２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン トリエチルアミン三フッ化水素塩（３．９１ｍＬ，２４．０ミリモル）が、乾
燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２ミリモル，乾燥，ＫＯＨ上
に保持）中に溶解された。次いで、このトリエチルアミン−２ＨＦ混合液は、５
’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
オキシエチル〕−５−メチルウリジン（１．４０ｇ，２．４ミリモル）に加えら
れて、室温で２４時間攪拌された。反応は、ＴＬＣ（ＣＨ2 Ｃｌ2 中５％ＭｅＯ
Ｈ）により追跡された。溶媒が減圧留去され、そして残渣は、フラッシュカラム
に入れられ、ＣＨ2 Ｃｌ2 中の１０％ＭｅＯＨで溶離され、２’−Ｏ−（ジメチ
ルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ，９２．５％）が得
られた。
【０１０４】 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチル
ウリジン ２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍ
ｇ，２．１７ミリモル）が、Ｐ2 Ｏ5 で４０℃で高真空下一晩乾燥された。次い
で、無水ピリジン（２０ｍＬ）と共に同時濃縮された。得られた残渣は、アルゴ
ン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）中に溶解された。４−ジメチルアミノピリジ
ン（２６．５ｍｇ，２．６０ミリモル) 、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（
８８０ｍｇ，２．６０ミリモル）がこの混合液に加えられ、そしてその反応混合
液は、全ての出発原料が消失するまで室温で攪拌された。ピリジンが減圧留去さ
れ、その残渣は、クロマトグラフィーに付され、そして、ＣＨ2 Ｃｌ2 中の１０
％ＭｅＯＨ（２，３滴のピリジンを含有する）で溶離され、５’−Ｏ−ＤＭＴ−
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ｇ
，８０％）が得られた。
【０１０５】 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）
−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルホスホロアミダイト〕 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチル
ウリジン（１．０８ｇ，１．６７ミリモル）が、トルエン（２０ｍＬ）と共に同
時濃縮された。その残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン・テトラゾニド（０
．２９ｇ，１．６７ミリモル）が加えられ、そしてＰ2 Ｏ5 で４０℃で高真空下
一晩乾燥された。次いで、その反応混合液は、無水アセトニトリル（８．４ｍＬ
）中に溶解され、そして２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ1 ，Ｎ1 −テトライソプ
ロピルホスホロアミダイト（２．１２ｍＬ，６．０８ミリモル）が加えられた。
その反応混合液は、周囲温度で不活性雰囲気下で４時間攪拌された。反応の進行
は、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル，１：１）により追跡された。溶媒が留去さ
れてから、残渣が酢酸エチル（７０ｍＬ）中に溶解され、そして５％水性ＮａＨ
ＣＯ3 （４０ｍＬ）で洗浄された。酢酸エチル層は、無水Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥さ
れて濃縮された。得られた残渣はクロマトグラフィー（溶離液として酢酸エチル
）に付されて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオ
キシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホロアミダイト〕（１．０４ｇ，７４．９％）が泡状物とし
て得られた。
【０１０６】 ２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト ２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野では
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られてい
る〕が、以下に記載されるように調製される。アデノシン、シチジン及びチミジ
ンヌクレオシドアミダイトも、同じようにして調製される。
【０１０７】 Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エ
チルアセチル）−５’−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’
−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト〕 この２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類縁体は、ジアミノプリンリボ
シドの選択的２’−Ｏ−アルキル化によって得られることができる。２’−Ｏ−
（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを少量のその３’−Ｏ−異性体
と一緒に提供するための複数ｇ数のジアミノプリンリボシドは、Schering AG (B
erlin)から購入することができる。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノ
プリンリボシドは溶解され、そしてアデノシンデアミラーゼでの処理により２’
−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに転化されることができる (McGee, D
.P.C., Cook, P.D., Guinosso, C.J., WO94/02501 A1 940203)。標準的保護方法
で、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイ
ル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチル）グアノシンが与えられる筈である。後者は、還元されて、２−Ｎ−イソ
ブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル
）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供することが
できる。先に示したように、ヒドロキシ基は、Mitsunobu 反応を介してＮ−ヒド
ロキシフタルイミドにより置換され、そしてその保護されたヌクレオシドは常法
によりホスファイト化されて、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカル
バモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメト
キシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト〕を生成することができる。
【０１０８】 ２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドア
ミダイト ２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分
野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ2 −Ｏ
−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ2)2 又は２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとして
も知られている）は、以下のようにして調製される。他のヌクレオシドアミダイ
トも同じようにして調製される。
【０１０９】 ２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル〕−５−メチル
ウリジン ２〔２−（ジメチルアミノ）エトキシ〕エタノール（Aldrich,６．６６ｇ，５
０ミリモル）が、１００ｍＬボンベ中のテトラヒドロフラン中のボランの溶液（
１Ｍ，１０ｍＬ，１０ミリモル）に攪拌しながらゆっくり加えられる。固体が溶
解するにつれ水素ガスが発生する。Ｏ2 −，２’−アンヒドロ−５−メチルウリ
ジン（１．２ｇ，５ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（２．５ｍｇ）が加えられ
てボンベが密閉され、油浴に入れられ、そして１５５℃に２６時間加熱される。
ボンベは室温に冷却されて開けられる。その粗製溶液は濃縮され、残渣が水（２
００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）とに分配される。過剰フェノールがヘキサ
ン層に抽出される。水層が酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出され、合わされ
た有機層が水で１回洗浄され、無水硫酸ナトリウムで乾燥され、そして濃縮され
る。残渣は、メタノール／塩化メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを有す
る）を溶離液として用いるシリカゲルのカラムに付される。そのカラム画分は、
濃縮されるにつれて無色固体を形成するので集められ、表題化合物が白色固体と
して得られる。
【０１１０】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エトキシ）エチル〕−５−メチルウリジン 無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ミリモル）の２’−Ｏ−〔２（
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル〕−５−メチルウリジンに、トリ
エチルアミン（０．３６ｍＬ）及び塩化ジメトキシトリチル（ＤＭＴ−Ｃｌ，０
．８７ｇ，２当量）が加えられ１時間攪拌される。その反応混合液は水（２００
ｍＬ）中に注がれ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （２×２００ｍＬ）で抽出される。合わされた
ＣＨ2 Ｃｌ2 層は飽和ＮａＨＣＯ3 溶液で洗浄されてから、飽和ＮａＣｌ溶液で
洗浄され、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥される。溶媒が留去されてから、Ｍ
ｅＯＨ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ：Ｅｔ3 Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミン含
有）を使用してシリカゲルクロマトグラフィーに付され、表題化合物が得られる
。
【０１１１】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノエトキシ）エチル〕−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ
，Ｎ −ジイソプロピル）ホスホロアミダイト ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）及び２−シアノエトキシ−Ｎ
，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（１．１ｍＬ，２当量）が、ＣＨ2 Ｃ
ｌ2 （２０ｍＬ）中に溶解された５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔
２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル〕−５−メチルウリジン（２
．１７ｇ，３ミリモル）の溶液にアルゴン雰囲気下で加えられる。その反応混合
液は一晩攪拌され、溶媒が留去される。得られた残渣は、溶離液として酢酸エチ
ルを使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製され、
表題化合物が得られる。
【０１１２】実施例２ オリゴヌクレオチド合成 未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドが、ヨードに
よる酸化での標準的なホスホロアミダイト化学を用いて自動ＤＮＡ合成装置(App
lied Biosystems Model 380B) で合成される。 ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、標準的な酸化ビンが、ホスファイト連結の
段階的チオ化のために、アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−
３−オン１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液によって置換される以外は、ホスホ
ジエステルオリゴヌクレオチドについてと同じように合成される。チオ化待機工
程は６８秒に増やされ、その後にキャッピング工程が行なわれた。ＣＰＧカラム
からの切り離し及び濃水酸化アンモニウム中での５５℃での脱ブロック（１８時
間）後に、それらオリゴヌクレオチドは、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２．５倍
容量のエタノールで２回沈殿させることにより精製された。ホスフィネートオリ
ゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５０８，
２７０号に記載の通りに調製される。
【０１１３】 アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込ま
れる米国特許第４，４６９，８６３号に記載の通りに調製される。 ３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、参照に
より本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１０，２８９号又は５，６２５，
０５０号に記載の通りに調製される。 ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれ
る米国特許第５，２５６，７７６号又は米国特許第５，３６６，８７８号に記載
の通りに調製される。 アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組
み込まれる、公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／
ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４
９９として公開されている）に記載の通りに調製される。
【０１１４】 ３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参
照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７６，９２５号に記載の通り
に調製される。 ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれ
る米国特許第５，０２３，２４３号に記載の通りに調製される。 ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれ
る米国特許第５，１３０，３０２号及び米国特許第５，１７７，１９８号に記載
の通りに調製される。
【０１１５】実施例３ オリゴヌクレオシド合成 ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンメチルイミノ連結
オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ連結オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレ
ンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド、アミド−３連結オリゴヌクレオシ
ドとしても特定されるメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド、アミ
ド−４連結オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンアミノカルボニル連
結オリゴヌクレオシド、並びに、例えば、交互ＭＭＩ及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ連結
を有する混合主鎖化合物は、全て参照により本明細書に組み込まれる米国特許第
５，３７８，８２５号、５，３８６，０２３号、５，４８９，６７７号、５，６
０２，２４０号及び５，６１０，２８９号に記載の通りに調製される。 ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドは、参照
により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２６４，５６２号及び５，２６４
，５６４号に記載の通りに調製される。 エチレンオキシド連結オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込ま
れる米国特許第５，２２３，６１８号に記載の通りに調製される。
【０１１６】実施例４ ＰＮＡ合成 ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis，Prop
erties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 199
6, 4，5-23において言及された種々の操作のいずれかに従って調製される。それ
らは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号、５
，７００，９２２号、及び５，７１９，２６２号に従っても調製されることがで
きる。
【０１１７】実施例５ キメラオリゴヌクレオチドの合成 本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又は混合オリゴヌク
レオチド／オリゴヌクレオシドは、幾つかの異なるタイプのものであることがで
きる。これらには、連結されたヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが、連結
されたヌクレオシドの５’及び３’“ウィング”セグメントの間に位置している
第１タイプ、及びその“ギャップ”セグメントが、そのオリゴマー化合物の３’
又は５’末端のいずれかに位置している第２“オープンエンド”タイプが含まれ
る。第１タイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で“ギャップマー”又は
ギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られている。第２タイプのオリゴヌク
レオチドは、当該技術分野で“ヘミマー”又は“ウィングマー”としても知られ
ている。
【０１１８】 〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕--〔２’−デオキシ〕--〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕キメラホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド ２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエート及び２’−デオキシホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上記の
ように、Applied Biosystems自動ＤＮＡ合成装置 Model 380B を用いて合成され
る。オリゴヌクレオチドは、この自動合成装置及びＤＮＡ部分のための２’−デ
オキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト並びに５’
及び３’ウィングのための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’
−Ｏ−ホスホロアミダイトを用いて合成される。標準的合成サイクルが、テトラ
ゾール及び塩基の送達後の待機工程を６００秒に増やすことによって修飾され、
ＲＮＡについて４回繰り返され、２’−Ｏ−メチルについて２回繰り返される。
完全に保護されたオリゴヌクレオチドは、支持体から切り離されて、そのホスフ
ェート基が３：１アンモニア／エタノール中で室温で一晩かけて脱保護され、次
いで凍結乾燥される。次いで、メタノール性アンモニア中での室温での２４時間
の処理が行なわれて全ての塩基が脱保護され、そのサンプルが再度凍結乾燥され
た。そのペレットは、ＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦ中で室温で２４時間懸濁されて
、２’位が脱保護される。次いで、その反応が１Ｍ ＴＥＡＡで停止されてから
、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩される前にｖｏｔｏｖａｃによってサンプルが
１／２容量に減ぜられる。次いで、回収されたオリゴは、収率について分光光度
計で分析され、そして純度についてキャピラリー電気泳動により及び質量分析計
により分析される。
【０１１９】 〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕--〔２’−デオキシ〕--〔２’−Ｏ−
（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド 〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕--〔２’−デオキシ〕--〔２’−Ｏ−
（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−
Ｏ−メチルアミダイトを２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アミダイトに置き換
えた以外は、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の操作
に従って調製された。
【０１２０】 〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔２’−デオキシ
ホスホロチオエート〕--〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステ
ル〕キメラオリゴヌクレオチド 〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔２’−デオキシ
ホスホロチオエート〕--〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル
〕キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトを２’−Ｏ−（２
−メトキシエチル）アミダイトに置き換え、ヨードでの酸化でそのキメラ構造の
ウィング部分内にホスホジエステルヌクレオチド間連結を生成させ、そして３，
Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Beaucage試薬）を使
用する硫化で中央ギャップのためにホスホロチオエートヌクレオチド間連結を生
成させる以外は、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の
操作に従って調製される。 他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオ
リゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる
米国特許第５，６２３，０６５号に従って合成される。
【０１２１】実施例６ オリゴヌクレオチド単離 制御された気孔度のガラスカラム（Applied Biosystems）からの切り離し及び
濃水酸化アンモニウム中での５５℃での１８時間の脱ブロック後に、それらオリ
ゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドは、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２．５
倍容量のエタノールで２回沈殿させることにより精製される。合成されたオリゴ
ヌクレオチドは、変性ゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され
て少なくとも８５％完全長物質であると判定された。合成で得られたホスホロチ
オエート及びホスホジエステル連結の相対量は、31Ｐ核磁気共鳴スペクトルによ
って周期的に確認され、そして、ある検討のためにオリゴヌクレオチドは、Chia
ng et al., J. Biol. Chem. ，1991，266, 18162-18171に記載の通りに、ＨＰＬ
Ｃにより精製された。ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製物質
で得られた結果と類似していた。
【０１２２】実施例７ オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレートフォーマット オリゴヌクレオチドが、標準９６ウェルフォーマットで同時に９６配列を作成
することができる自動合成装置で、固相Ｐ(III) ホスホロアミダイト化学により
合成された。ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、ヨード水溶液での酸化に
より与えられた。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は、無水アセトニトリ
ル中で３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Beaucage
試薬）を使用する硫化により生成された。標準的に塩基が保護されたβ−シアノ
エチルジイソプロピルホスホロアミダイトは、業者（例えば、PE-Applied Biosy
stems, Foster City，CA，又は Pharmacia，Piscataway，NJ）から購入された。
非標準的ヌクレオシドは、公知文献又は特許された方法によって合成される。そ
れらは、塩基が保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト
として利用される。 オリゴヌクレオチドは支持体から切り離され、高温（５５〜６０℃）で濃ＮＨ 4 ＯＨで１２〜１６時間脱保護されてから、その解放された生成物が真空乾燥さ
れる。次いで、乾燥された生成物は無菌水中に懸濁されてマスタープレートを与
え、全ての分析用及び試験用プレートサンプルがロボットピペッターを使用して
それから希釈される。
【０１２３】実施例８ オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレートフォーマット 各々のウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度が、サンプルの希釈及びＵＶ吸収
スペクトルによって評価された。個々の生成物の完全長の完全性が、９６ウェル
フォーマット（Beckman P/ACE TM MDQ）又は個別に調製されたサンプルについて
の市販のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置（例えば、Beckman P/ACE TM 5000,
ABI 270）のいずれかでのＣＥにより評価された。塩基及び主鎖組成は、電子ス
プレー式質量分析計を使用するそれら化合物の質量分析により確認された。全て
のアッセイ試験プレートは、単一及び複数チャネルロボットピペッターを使用し
てマスタープレートから希釈された。そのプレート上の化合物の少なくとも８５
％が少なくとも８５％完全長であれば許容できると判断された。
【０１２４】実施例９ 細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理 標的核酸発現へのアンチセンス化合物の効果は、その標的核酸が測定可能なレ
ベルで存在することを前提として、種々の細胞型のいくつかで試験されることが
できる。これは、定型的には、例えば、ＰＣＲ又はノーザンブロット分析を使用
して測定されることができる。以下の４つの細胞型が例示目的で提供されるが、
他の細胞型も定型的に使用されることができる。
【０１２５】 Ｔ−２４細胞： 移行細胞膀胱癌細胞系Ｔ−２４が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ）（Manassas，VA）から得られた。Ｔ−２４細胞は、１０％ウ
シ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、ペニシリン１００
ユニット／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（Gibco/
Life Technologies, Gaithersburg, MD)を補充した完全 McCoy's 5A 基本培地(G
ibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) で、定型的に培養された。細胞は
、９０％集密度に達したときにトリプシン化及び希釈により定型的に継代処理さ
れた。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されるために、９６ウェルプレート（Fa
lcon-Primaria # 3872）中に７００細胞／ウェルの密度で播かれた。 ノーザンブロット又は他の分析のためには、細胞は、適切な容量の培地及びオ
リゴヌクレオチドを使用して、１００ｍｍ又は他の標準的組織培養プレート上に
播かれて同じように処理されることができる。
【０１２６】 Ａ５４９細胞： ヒト肺癌細胞系Ａ５４９細胞が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）（Manassas，VA）から得られた。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ
胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、ペニシリン１００ユ
ニット／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（Gibco/Li
fe Technologies, Gaithersburg, MD)を補充したＤＭＥＭ基本培地(Gibco/Life
Technologies, Gaithersburg, MD) で、定型的に培養された。細胞は、９０％集
密度に達したときにトリプシン化及び希釈により定型的に継代処理された。
【０１２７】 ＮＨＤＦ細胞： ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）が、Clonetics Corporation (Walkers
ville MD) から得られた。ＮＨＤＦは、その供給業者により推奨された通りに補
充された線維芽細胞増殖培地 (Clonetics Corporation, Walkersville MD) で定
型的に維持された。細胞は、供給業者により推奨された通りに１０継代数まで維
持された。
【０１２８】 ＨＥＫ細胞： ヒト胚ケラチノサイト（ＨＥＫ）が、Clonetics Corporation (Walkersville
MD) から得られた。ＨＥＫは、その供給業者により推奨された通りに配合された
ケラチノサイト増殖培地 (Clonetics Corporation, Walkersville MD) で定型的
に維持された。細胞は、供給業者により推奨された通りに１０継代数まで維持さ
れた。
【０１２９】 アンチセンス化合物での処理： 細胞が８０％集密度に達したときに、それらはオリゴヌクレオチドで処理され
た。９６ウェルプレート内での細胞増殖のために、ウェルは２００μＬのＯＰＴ
Ｉ−ＭＥＭTM−１減血清培地(Gibco BRL) で１回洗浄されてから、３．７５μｇ
／ｍＬの LIPOFECTIN TM(Gibco BRL) と最終濃度が１５０ｎＭの望まれるオリゴ
ヌクレオチドとを含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭTM−１で処理された。
４時間の処理の後、培地は新たな培地で置き換えられた。細胞はオリゴヌクレオ
チド処理後１６時間で採取された。
【０１３０】実施例１０ Ｓｈｉｐ−２発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析 Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野で知られ
る種々のやり方でアッセイされることができる。例えば、Ｓｈｉｐ−２ｍＲＮＡ
レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）又はリアルタイムＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量されることができる
。リアルタイム定量的ＰＣＲが現時点では好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞性Ｒ
ＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行なわれることができる。ＲＮＡ単離の方法は
、例えば、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，
Volume 1，pp．4.1.1-4.2.9 及び 4.5.1-4.5.3，John Wiley & Sons, Inc., 199
3 に教示されている。ノーザンブロット分析は、当該技術分野で定型的なもので
あり、例えば、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biolo
gy，Volume 1，pp．4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons，Inc.，1996に教示されて
いる。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、PE-Applied Biosystems, Foster City
，CAから入手可能な ABI PRISMTM 7700 配列検出システムを製造業者の説明書に
従って使用することで、慣用的に達成されることができる。他のＰＣＲ方法も、
当該技術分野で公知である。
【０１３１】 Ｓｈｉｐ−２タンパク質レベルは、イムノプレシピテーション、ウェスタンブ
ロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又はフルオレセンス励起セル
ソーティング（ＦＡＣＳ）のような、当該技術分野で周知の種々のやり方で定量
されることができる。Ｓｈｉｐ−２に向けられた抗体が、同定されることも、抗
体のＭＳＲＳカタログ（Aerie Corporation, Birmingum，MI）のような種々の供
給源から得ることもでき、又は慣用的な抗体発生方法を介して調製されることが
できる。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M．et al.，
Current Protocols in Molecular Biology，Volume 2，pp．11.12.1-11.12.9, J
ohn Wiley & Sons，Inc.，1997に教示されている。モノクローナル抗体の調製は
、例えば、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，
Volume 2，pp．11.4.1-11.11.5，John Wiley & Sons, Inc., 1997 に教示されて
いる。
【０１３２】 イムノプレシピテーション法は、当該技術分野で標準的であり、例えば、Ausu
bel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Volume 2，pp．
10.16.1-10.16.11，John Wiley & Sons, Inc., 1998 に見出すことができる。ウ
ェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野で標準的であり、例
えば、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Volu
me 2，pp．10.8.1-10.8.21，John Wiley & Sons, Inc., 1997 に見出すことがで
きる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野で標準的であ
り、例えば、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology
，Volume 2，pp．11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons ，Inc.，1991に見出すこ
とができる。
【０１３３】実施例１１ ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離 ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡが、Miura et al.，Clin．Chem., 1996 ，42，1758-176
4 に従って単離された。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例えば
、Ausubel, F.M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Volume 1
，pp．4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons，Inc.，1993に教示されている。簡単に
説明すると、９６ウェルプレートで増殖した細胞について、増殖培地が細胞から
除去されて各々のウェルが２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄された。６０μＬの細胞
溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５
Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０，２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシドコン
プレックス）が各々のウェルに加えられ、そのプレートが穏やかに攪拌されてか
ら、室温で５分間インキュベートされた。５５μＬの溶解産物がオリゴｄ（Ｔ）
コーテッド９６ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine CA）に移された。プレート
は、室温で６０分間インキュベートされ、２００μＬの洗浄用緩衝液（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．３Ｍ ＮａＣｌ）で３回
洗浄された。最後の洗浄後に、そのプレートは、過剰の洗浄用緩衝液を除去する
めにペーパータオルで拭われてから、５分間風乾された。予め７０℃に加熱され
た６０μＬの溶離用緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６）が各々のウェ
ルに加えられ、そのプレートは、９０℃のホットプレート上で５分間インキュベ
ートされ、次いで、その溶出液が新たな９６ウェルプレートに転写された。 １００ｍｍ又は他の標準的プレート上で増殖した細胞が、適切な容量の全ての
溶液を使用して、同じように処理されることができる。
【０１３４】実施例１２ 全ＲＮＡ単離 全ｍＲＮＡが、RNEASY 96 TMキット及び Qiagen Inc.(Valencia CA) から購入
した緩衝液を、製造業者の推奨する操作に従って使用して単離された。簡単に説
明すると、９６ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地が細胞から
除去されて各々のウェルが２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄された。１００μＬの緩
衝液ＲＬＴが各々のウェルに加えられ、そのプレートは２０秒間激しく攪拌され
た。次いで、１００μＬの７０％エタノールが各々のウェルに加えられ、その内
容物はピペットで３回吸い上げては下ろすことにより混合された。次いで、それ
らサンプルは、廃液収集トレイを備えかつ真空源に連結された QIAVAC TMマニフ
ォールドに取り付けられた RNEASY 96TMウェルプレートに移された。１５秒間真
空が適用された。１ｍＬの緩衝液ＲＷ１が RNEASY 96TMウェルプレートの各々の
ウェルに加えられ、再び、１５秒間真空が適用された。次いで、１ｍＬの緩衝液
ＲＰＥが RNEASY 96TMウェルプレートの各々のウェルに加えられ、１５秒間真空
が適用された。次いで、緩衝液ＲＰＥでの洗浄が繰り返され、そして追加の１０
分間真空が適用された。次いで、そのプレートは QIAVAC TMマニフォールドから
外され、ペーパータオルで拭われた。次いで、そのプレートは、１．２ｍＬ収集
管を含有する収集管ラックを備えた QIAVAC TMマニフォールドに再び取り付けら
れた。次いで、各々のウェル内に６０μＬの水をピペッティングし、１分間イン
キュベートし、次いで真空を３０秒間適用することにより、ＲＮＡが溶出された
。この溶出工程は、追加の６０μＬ水で繰り返された。 この繰り返しのピペッティング及び溶出工程は、QIAGEN BIO-Robot 9604 (Qia
gen, Inc., Valencia CA) を使用して、自動化されることができる。培養プレー
ト上での細胞溶解の後、そのプレートは、ピペッティング、ＤＮアーゼ処理、及
び溶出工程が行なわれるロボットデッキに移される。
【０１３５】実施例１３ Ｓｈｉｐ−２ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析 Ｓｈｉｐ−２ｍＲＮＡレベルの定量が、ABI PRISM TM 7700 配列検出システム
（PE-Applied Biosystems, Foster City，CA）を製造業者の説明書に従って使用
することで、リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定された。これは、リアルタ
イムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の高処理定量を可能にする密閉管
のゲルをベースにしない蛍光検出システムである。ＰＣＲが完了した後に増幅生
成物が定量される標準的ＰＣＲとは反対に、リアルタイム定量的ＰＣＲにおける
生成物は、それらが蓄積されたときに定量される。これは、ＰＣＲ反応に、順向
及び逆向ＰＣＲプライマーの間で特異的にアニールしかつ２種の蛍光染料を含有
するオリゴヌクレオチドプローブを含めることによって達成される。リポーター
染料 (例えば、JOE 又は FAM，Operon Technologies Inc.，Alameda, CA 又は P
E-Applied Biosystems，Foster City, CA のいずれかから得られる) がそのプロ
ーブの５’末端に付けられており、そして、消光染料 (例えば、TAMRA,Operon T
echnologies Inc.，Alameda, CA 又は PE-Applied Biosystems，Foster City, C
A のいずれかから得られる) がそのプローブの３’末端に付けられている。プロ
ーブ及び染料が無傷であるときは、リポーター染料発光が３’末端染料の近位に
あるので消光される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングが、Ｔａ
ｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって開裂されることができ
る基質を創り出す。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長段階の間、Ｔａｑポリメラーゼに
よるプローブの開裂が、リポーター染料をそのプローブの残りの部分から（この
ことから消光部分からも）解き放ち、そして配列特異性蛍光シグナルが発せられ
る。各々のサイクルで、追加のリポーター染料分子がそれらそれぞれのプローブ
から切り離され、そして、その蛍光強度が、通常の時間間隔で、ABI PRISM TM 7
700 配列検出システム内に構築されたレーザー光学素子によって追跡される。各
々のアッセイで、未処理コントロールサンプルからのｍＲＮＡの段階的希釈物を
含有する一連の平行反応が、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処
理後のパーセント阻害率を定量するのに使用される標準曲線を形成する。
【０１３６】 ＰＣＲ試薬は、PE-Applied Biosystems, Foster City，CAから入手された。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ反応は、２５μＬＰＣＲカクテル（１×TAQMANTM緩衝液Ａ，５．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 ，各々３００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ，６００μ
ＭのｄＵＴＰ，各々１００ｎＭの順向プライマー，逆向プライマー，及びプロー
ブ，２０ユニットのＲＮＡアーゼ阻害剤，１．２５ユニットの AMPLITAQ GOLDTM ，及び１２．５ユニットのＭｕＬＶ逆転写酵素）を、２５μＬポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａ溶液を含有する９６ウェルプレートに加えることによって行なわれた。このＲ
Ｔ反応は、４８℃で３０分間インキュベートすることによって行なわれた。AMPL
ITAQ GOLD TMを活性化させるために９５℃で１０分間インキュベートした後、４
０サイクルの２段階ＰＣＲプロトコルが行なわれた：９５℃で１５秒間（変性）
の後、６０℃で１．５分間（アニーリング／伸長）。Ｓｈｉｐ−２プローブ及び
プライマーは、公表された配列情報（GenBank アクセス番号Ｙ１４３８５，配列
番号：１として本明細書中に組み込まれている）を使用して、ヒトＳｈｉｐ−２
配列にハイブリダイズするように設計された。
【０１３７】 Ｓｈｉｐ−２について、ＰＣＲプライマーは： 順向プライマー：CTGCGTCCTGTATCAGAAGCAT（配列番号：２） 逆向プライマー：GGTCTGCACAGCCAAGAAATC （配列番号：３）であり、そしてＰＣ
Ｒプローブは：FAM-CACGTATCGCATTCTGCCTGATGGAGA-TAMRA （配列番号：４）であ
って、FAM (PE-Applied Biosystems，Foster City, CA)は蛍光リポーター染料で
あり、TAMRA (PE-Applied Biosystems，Foster City, CA)は消光染料である。 ＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは： 順向プライマー：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC （配列番号：５） 逆向プライマー：GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号：６）であり、そしてＰＣＲ
プローブは：5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3'（配列番号：７）であって
、JOE (PE-Applied Biosystems，Foster City, CA)は蛍光リポーター染料であり
、TAMRA (PE-Applied Biosystems，Foster City, CA)は消光染料である。
【０１３８】実施例１４ Ｓｈｉｐ−２ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析 アンチセンス処理の１８時間後、細胞単層は、冷ＰＢＳで２回洗浄され、そし
て１ｍＬ RNAZOL TM(TEL-TEST “B" Inc.，Friendswood, TX)中で溶解された。
全ＲＮＡが、製造業者の推奨するプロトコルと従って調製された。２０マイクロ
グラムの全ＲＮＡが、ＭＯＰＳ緩衝液系(AMRESCO，Inc. Solon, OH) を使用する
、１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルによる電気泳動
によって分画された。ＲＮＡは、ノーザン／サザーン転写緩衝液系 (TEL-TEST
“B" Inc., Friendswood, TX) を使用する一晩キャピラリー転写によって、その
ゲルから HYBOND TM-N＋ナイロン膜 (Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway
，NJ) に転写された。ＲＮＡ転写は、ＵＶ可視化によって確認された。膜は、ST
RATALINKERTMUV Crosslinker 2400 (Stratagene. Inc, La Jolla, CA) を使用す
るＵＶ架橋によって固定された。
【０１３９】 膜は、QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液 (Stratagene，La Jolla，CA)
を使用して、ストリンジェント条件用の製造業者の説明書によって、順向プライ
マー CTGCGTCCTGTATCAGAAGCAT （配列番号：２）及び逆向プライマー GGTCTGCAC
AGCCAAGAAATC（配列番号：３）を使用してＰＣＲによって調製されたＳｈｉｐ−
２特異的プローブでプローブされた。負荷及び転写効率の変動を標準化するため
に、膜はストリップされ、そして、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ (Clontech，Palo Alto, CA)についてプロー
ブされた。ハイブリダイズした膜は、PHOSPHORIMAGERTM及び IMAGEQUANT TM Sof
tware V3.3 (Molecular Dynamics，Sunnyvale, CA)を使用して、可視化されて定
量された。データは、未処理コントロールにおけるＧＡＰＤＨレベルに標準化さ
れた。
【０１４０】実施例１５ Ｓｈｉｐ−２発現−ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのアンチセ
ンス阻害 本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドが、公表された配列情報（GenBan
k アクセス番号Ｙ１４３８５，配列番号：１として本明細書中に組み込まれてい
る）を使用して、ヒトＳｈｉｐ−２ＲＮＡの異なる領域を指向するように設計さ
れた。それらオリゴヌクレオチドは表１に示されている。標的部位は、配列供給
資料（GenBank アクセス番号Ｙ１４３８５）に与えられた、そのオリゴヌクレオ
チドが結合するヌクレオチド番号によって示されている。表１の全ての化合物は
、ホスホロチオエート主鎖（ヌクレオシド間連結）を全体にわたって有するオリ
ゴデオキシヌクレオチドである。それら化合物は、本明細書中の他の実施例に記
載した定量的リアルタイムＰＣＲによるＳｈｉｐ−２ｍＲＮＡレベルへの効果に
ついて分析された。データは、２つの実験からの平均値である。“N.D.”は“デ
ータなし”を示す。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】 表１に示すように、配列番号：１１、１３、１４、２０、２６、３１、４０、
４１及び４７は、このアッセイで、Ｓｈｉｐ−２発現が少なくとも２５％阻害さ
れたことを示しているので好ましいものである。
【０１４３】実施例１６ Ｓｈｉｐ−２発現−ホスホロチオエート２’−ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレ
オチドのアンチセンス阻害 本発明に従って、第２の一連のヒトＳｈｉｐ−２ＲＮＡへ指向されたオリゴヌ
クレオチドが合成された。それらオリゴヌクレオチド配列は表２に示されている
。標的部位は、配列供給資料（GenBank アクセス番号Ｙ１４３８５）に与えられ
た、そのオリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって示されている
。 表２の全ての化合物は、４ヌクレオチドの“ウィング”によって両側（５’及
び３’方向）がフランクされた１０の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央
“ギャップ”領域から構成される、長さが１８ヌクレオチドのキメラオリゴヌク
レオチド（ギャプマー）である。それらウィングは、２’−メトキシエチル（２
’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。そのヌクレオシド間（主鎖）連結は
、そのオリゴヌクレオチドの全体にわたるホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である
。その２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は、５−メチルシチジンである。 データは、本明細書中の他の実施例に記載した定量的リアルタイムＰＣＲによ
って得られ、そして２つの実験から平均された。“N.D.”は“データなし”を示
す。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】 表２に示すように、配列番号：８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１８、１９、２１、２４、２６、２８、２９、３１、３４、３５、３６、３
９、４０、４１、４３、４５及び４６は、この実験で、Ｓｈｉｐ−２発現が少な
くとも２５％阻害されたことを示しているので好ましいものである。
【０１４６】実施例１７ Ｓｈｉｐ−２タンパク質レベルのウェスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）が標準的方法を使用して行な
われる。細胞は、オリゴヌクレオチド処理後１６〜２０時間後に採取され、ＰＢ
Ｓで１回洗浄され、Laemmli 緩衝液（１００μＬ／ウェル）中に懸濁され、５分
間煮沸され、そして１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せられる。ゲルは、１５
０Ｖで１．５時間展開され、そしてウェスタンブロットのために膜上に転写され
た。Ｓｈｉｐ−２に向けられた適切な１次抗体が、その１次抗体種に向けられた
放射標識又は蛍光標識された２次抗体と共に使用される。バンドは、PHOSPHORIM
AGERTM (Molecular Dynamics，Sunnyvale, CA)を使用して可視化される。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月１７日（２００２．５．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，ニューシャイア・ストリ ート 3008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA05 CA06 GA11 GA18 HA08 HA11 HA13 HA14 HA15 HA17 4C057 AA03 MM04 4C076 AA16 BB01 BB13 BB21 CC21 4C084 AA13 MA05 MA13 MA17 MA23 MA28 MA31 MA35 MA37 MA52 MA55 MA66 NA14 ZC35 ZC41 4C086 AA01 AA02 EA06 MA01 MA04 MA05 MA13 MA17 MA23 MA28 MA31 MA35 MA37 MA52 MA55 MA66 NA14 ZC35 ZC41

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトＳｈｉｐ−２をコードする核酸分子に指向された長さが
    ８〜３０核酸塩基のアンチセンス化合物であって、前記アンチセンス化合物が、
    ヒトＳｈｉｐ−２に特異的にハイブリダイズして、その発現を阻害するアンチセ
    ンス化合物。
  2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１のアンチ
    センス化合物。
  3. 【請求項３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：１１、１３
    、１４、２０、２６、３１、４０、４１、４７、８、１０、１２、１５、１６、
    １８、１９、２１、２４、２８、２９、３４、３５、３６、３９、４３、４５又
    は４６を含んでなる配列を有する、請求項２のアンチセンス化合物。
  4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：１１、１３
    、１４、２６、３１、４０又は４１を含んでなる配列を有する、請求項２のアン
    チセンス化合物。
  5. 【請求項５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾
    されたヌクレオシド間連結を含んでなる、請求項２のアンチセンス化合物。
  6. 【請求項６】 修飾されたヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結で
    ある、請求項５のアンチセンス化合物。
  7. 【請求項７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾
    された糖部分を含んでなる、請求項２のアンチセンス化合物。
  8. 【請求項８】 修飾された糖部分が２’−メトキシエチル糖部分である、請
    求項７のアンチセンス化合物。
  9. 【請求項９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾
    された核酸塩基を含んでなる、請求項２のアンチセンス化合物。
  10. 【請求項１０】 修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項
    ９のアンチセンス化合物。
  11. 【請求項１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオ
    チドである、請求項２のアンチセンス化合物。
  12. 【請求項１２】 請求項１のアンチセンス化合物及び薬学的に許容できるキ
    ャリヤ又は希釈剤を含んでなる組成物。
  13. 【請求項１３】 更にコロイド状分散系を含んでなる、請求項１２の組成物
    。
  14. 【請求項１４】 アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    ある、請求項１２の組成物。
  15. 【請求項１５】 ヒトの細胞又は組織内におけるＳｈｉｐ−２の発現を阻害
    する方法であって、前記細胞又は組織を請求項１のアンチセンス化合物と接触さ
    せてＳｈｉｐ−２の発現を阻害する方法。
  16. 【請求項１６】 Ｓｈｉｐ−２に関係する疾患又は状態を有するヒトを治療
    する方法であって、治療又は予防有効量の請求項１のアンチセンス化合物を投与
    してＳｈｉｐ−２の発現を阻害する方法。
  17. 【請求項１７】 疾患又は状態が糖尿病である、請求項１６の方法。
JP2001506802A 1999-06-25 1999-12-23 Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション Pending JP2003503048A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/339,964 US6025198A (en) 1999-06-25 1999-06-25 Antisense modulation of Ship-2 expression
US09/339,964 1999-06-25
PCT/US1999/030752 WO2001000808A1 (en) 1999-06-25 1999-12-23 Antisense modulation of ship-2 expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003503048A true JP2003503048A (ja) 2003-01-28

Family

ID=23331322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001506802A Pending JP2003503048A (ja) 1999-06-25 1999-12-23 Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6025198A (ja)
EP (1) EP1192248A1 (ja)
JP (1) JP2003503048A (ja)
AU (1) AU767011B2 (ja)
CA (1) CA2377437A1 (ja)
WO (1) WO2001000808A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9169293B2 (en) 2009-09-25 2015-10-27 Shire Orphan Thereapies GmbH NPR-B agonists

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6613506B1 (en) 2000-11-28 2003-09-02 Subsidiary No. 3, Inc. Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes
EP1097713A1 (en) * 1999-11-03 2001-05-09 Euroscreen S.A. Inhibitors of the inositol polyphosphate 5-phosphatase ship-2 molecule
CA2399940A1 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 The Rockefeller University Enhancement of antibody-mediated immune responses
US8568766B2 (en) 2000-08-24 2013-10-29 Gattadahalli M. Anantharamaiah Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease
EP1318841A2 (en) * 2000-09-19 2003-06-18 University Of South Florida Control of nk cell function and survival by modulation of ship activity
US7691821B2 (en) * 2001-09-19 2010-04-06 University Of South Florida Inhibition of SHIP to enhance stem cell harvest and transplantation
US20020165192A1 (en) * 2000-09-19 2002-11-07 Kerr William G. Control of NK cell function and survival by modulation of ship activity
EP2336166A1 (en) 2000-10-12 2011-06-22 University Of Rochester Compositions that inhibit proliferation of cancer cells
AU2002248510A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of identifying agents affecting atrophy and hypertrophy
MXPA04007586A (es) 2002-02-06 2005-06-08 Vicor Technologies Inc Moleculas anti-infarto.
EP1534729A2 (en) * 2002-02-26 2005-06-01 University of Utah Research Foundation Variants of nedd4l associated with hypertension and viral budding
US7375842B2 (en) * 2002-04-09 2008-05-20 Eastman Kodak Company Variable data printing using variants
CA2495478A1 (en) 2002-08-05 2004-02-12 University Of Rochester Protein transducing domain/deaminase chimeric proteins, related compounds, and uses thereof
US20070224124A1 (en) * 2002-09-30 2007-09-27 University Of South Florida Novel SH2containing inositol 5'-phosphatase isoform that partners with the Grb2 adapter protein
US7807646B1 (en) * 2003-11-20 2010-10-05 University Of South Florida SHIP-deficiency to increase megakaryocyte progenitor production
US7763592B1 (en) * 2003-11-20 2010-07-27 University Of South Florida SHIP-deficiency to increase megakaryocyte progenitor production
CA2564868C (en) * 2004-04-28 2013-11-26 Molecules For Health, Inc. Methods for treating or preventing restenosis and other vascular proliferative disorders
JP5225069B2 (ja) 2005-03-23 2013-07-03 ゲンマブ エー／エス 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
US7476733B2 (en) * 2005-03-25 2009-01-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Development of a real-time PCR assay for detection of pneumococcal DNA and diagnosis of pneumococccal disease
US8080534B2 (en) 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
EP2392646A1 (en) * 2005-10-14 2011-12-07 MUSC Foundation For Research Development Targeting PAX2 for the induction of DEFB1-mediated tumor immunity and cancer therapy
AU2007297535C1 (en) 2006-09-21 2017-11-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy
WO2008136852A2 (en) 2006-11-01 2008-11-13 University Of Rochester Methods and compositions related to the structure and function of apobec3g
CA2672297A1 (en) 2006-12-11 2008-06-19 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for treating pathologic angiogenesis and vascular permeability
US9526707B2 (en) * 2007-08-13 2016-12-27 Howard L. Elford Methods for treating or preventing neuroinflammation or autoimmune diseases
EP2682400B1 (en) * 2007-08-28 2017-09-20 Uab Research Foundation Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use
CA2697957A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Uab Research Foundation Synthetic apolipoprotein e mimicking polypeptides and methods of use
EP2268664B1 (en) 2007-12-03 2017-05-24 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Doc1 compositions and methods for treating cancer
US20110262395A1 (en) 2008-05-08 2011-10-27 University Of Utah Research Foundation Sensory receptors for chronic fatigue and pain and uses thereof
US8816095B2 (en) * 2008-08-15 2014-08-26 Georgetown University Na channels, disease, and related assays and compositions
WO2010065617A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 University Of Utah Research Foundation Pde1 as a target therapeutic in heart disease
US20110060000A1 (en) 2009-09-10 2011-03-10 Maurizio Grimaldi Acridine analogs in the treatment of gliomas
TW201121995A (en) 2009-12-18 2011-07-01 Alcon Res Ltd Novel NPR-B agonists
US20110207789A1 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Ye Fang Methods related to casein kinase ii (ck2) inhibitors and the use of purinosome-disrupting ck2 inhibitors for anti-cancer therapy agents
US9249226B2 (en) 2010-06-09 2016-02-02 Genmab A/S Antibodies against human CD38
US9970002B2 (en) 2012-12-12 2018-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for functional nucleic acid delivery
WO2015077566A1 (en) 2013-11-21 2015-05-28 Huang Zhen Methods for structural determination of selenium derivatized nucleic acid complexes
IL250302B (en) 2014-07-31 2022-07-01 Uab Research Foundation Apoe mimetic peptides with high potency to clear plasma cholesterol
CN109563516B (zh) 2016-07-28 2023-10-27 雷杰纳荣制药公司 Gpr156变体及其用途
EP3496736A4 (en) 2016-08-03 2020-05-13 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. THERAPEUTICS AGAINST TLR9
MX2019008675A (es) 2017-01-23 2019-09-18 Regeneron Pharma Variantes de hidroxiesteroide 17-beta deshidrogenasa 13 (hsd17b13) y usos de estas.
CA3065938A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
MX2020002643A (es) 2017-09-06 2020-09-25 Regeneron Pharma Variantes relacionadas con el receptor de inmunoglobulina interleucina 1 simple (sigirr) y usos de estas.
US20190071683A1 (en) 2017-09-07 2019-03-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Solute Carrier Family 14 Member 1 (SLC14A1) Variants And Uses Thereof
WO2019051355A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Ohio State Innovation Foundation NEW MICROARN INHIBITOR THERAPY FOR SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS
SG11202003254SA (en) 2017-10-11 2020-05-28 Regeneron Pharma Inhibition of hsd17b13 in the treatment of liver disease in patients expressing the pnpla3 i148m variation
JP2021501601A (ja) 2017-10-16 2021-01-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． コルヌリン（ｃｒｎｎ）バリアント及びその使用
AU2019225992A1 (en) * 2018-02-21 2020-08-20 Alcyone Therapeutics, Inc. Fluid delivery systems and methods
WO2021003295A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modulators of hsd17b13 and methods of use thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9169293B2 (en) 2009-09-25 2015-10-27 Shire Orphan Thereapies GmbH NPR-B agonists
US9745344B2 (en) 2009-09-25 2017-08-29 Shire Orphan Therapies Gmbh NPR-B agonists
US9982016B2 (en) 2009-09-25 2018-05-29 Shire Orphan Therapies Gmbh NPR-B agonists
US10196423B2 (en) 2009-09-25 2019-02-05 Shire Orphan Therapies Gmbh NPR-B agonists

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001000808A1 (en) 2001-01-04
AU2382200A (en) 2001-01-31
CA2377437A1 (en) 2001-01-04
AU767011B2 (en) 2003-10-30
US6025198A (en) 2000-02-15
EP1192248A1 (en) 2002-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU770526B2 (en) Antisense modulation of PI3K P85 expression
JP4054192B2 (ja) Ｐｔｐ１ｂ発現のアンチセンス阻害
JP2003503048A (ja) Ｓｈｉｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505351A (ja) Ｍａｐキナーゼキナーゼ６発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520584A (ja) カスパーゼ３発現のアンチセンスモジュレーション
JP2004513626A (ja) クラスタリン発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520241A (ja) Ｍｅｋｋ２発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520586A (ja) Ｓｍａｄ７発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505027A (ja) Ｐｉ３キナーゼｐ１１０デルタ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520042A (ja) 誘導性一酸化窒素シンターゼ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505062A (ja) Ｐｔｅｎ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505063A (ja) Ｍｅｋｋ５発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003512070A (ja) インテグリン−結合キナーゼ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003508089A (ja) ＰＩ３キナーゼｐ１１０ベータ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520051A (ja) Ｐｅｐｃｋ−サイトゾル発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505092A (ja) Ｓｈｐ−２発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003505026A (ja) 肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ発現のアンチセンスモジュレーション
AU763066B2 (en) Antisense modulation of cellular inhibitor of apoptosis-2 expression
JP2003525058A (ja) Ｅ２ｆ転写因子１発現のアンチセンスモジュレーション
AU753245B2 (en) Antisense modulation of Cellular Inhibitor of Apoptosis-1 expression
JP2003531630A (ja) Ｄｎａ結合阻害剤−１発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003527085A (ja) Ｐｅｐｃｋ−ミトコンドリア発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003518928A (ja) Ａｋｔ−３発現のアンチセンスモジュレーション
JP2004503232A (ja) Ｃ／ＥＢＰβ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003520041A (ja) グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ発現のアンチセンスモジュレーション

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20041126

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20050524

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070621