JP2003502488A - 多価アレイおよび多価アレイのコンビナトリアルライブラリーを作製する方法および試薬 - Google Patents

多価アレイおよび多価アレイのコンビナトリアルライブラリーを作製する方法および試薬

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Abstract

(57)【要約】 多価アレイのライブラリーを調製する方法およびこの方法によって作製されたライブラリー。ライブラリーの成分多価アレイは、規定された長さ、規定された末端官能基および規定されたペンダント官能基を有する。方法は、少なくとも1つの重合可能な基および少なくとも1つの潜在的反応性基を含む少なくとも1つのモノマーを、金属カルベン触媒の存在下で重合して、少なくとも1つの潜在的反応性基を有するポリマーテンプレートを形成する工程;およびこのポリマーテンプレートを、少なくとも1つの反応性基を含む少なくとも1つの官能化剤と、このポリマーテンプレートの潜在的反応性基がこの官能化剤の反応性基と効率的に反応するような条件下で結合して多価アレイを形成する工程を有する多価アレイの調製を含む。この方法は、ルテニウムカルベン触媒またはオスミウムカルベン触媒およびキャッピング剤を使用するテレケリックポリマーの調製を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (発明の背景) 新規な材料および合成方法が、研究および製造の有意な分野として出現してい
る。これは、生物工学、医薬、薬学、医療デバイス、センサ、光学材料などの分
野において適用を有する。開環メタセシス重合(ROMP)法は、このような有
用な材料の作製のための強力な合成方法として出現している。ROMPが機能性
材料を作製するために使用された多くの例は、ペンダント官能基をモノマーに組
み込むことに焦点を当てており、これによって、多価アレイを形成する。本明細
書中で使用されるように、多価アレイは、種々の性質をポリマーに付与するペン
ダント官能基を有するより身近なオリゴマーを含む、種々の長さのポリマー(ラ
ンダムコポリマーまたはブロックコポリマーを含む)をいう。このような多価ア
レイはまた、しばしば、多価リガンド、多価ディスプレイ、多座アレイ、多座リ
ガンド、または多座ディスプレイと呼ばれる。
【0002】 このような多価アレイは、医学分野および生物工学分野において特に有用であ
る。例えば、多価アレイの特定のエピトープヘの細胞表面レセプターの結合は、
幅広い種々の生物学的応答を誘引し得る。このような多価結合事象は、一価相互
作用により誘発される結果とは劇的に異なる独特の結果を有する。例えば、上皮
増殖因子によるシグナル伝達は、二価リガンドの結合によって促進され、これは
、明かに、膜貫通レセプターの二量化を促進する。一価リガンドもまた、レセプ
ターに結合するが、シグナルを生成しない。さらに、多価アレイが、細胞表面タ
ンパク質の放出を誘導することが示されており、タンパク質ディスプレイを制御
するための新規な機構を示唆する。タンパク質−炭水化物認識プロセスにおいて
、多価糖類置換アレイは、ずれ流動(shear flow)の動的な条件下で
増加したアビディティ、特異性、および独特の阻害効力を示し得る。従って、生
物学的に関連した結合エピトープの規定された多価アレイを合成するための能力
によって、生理学的に有意なプロセスを探索しそして操作するための手段が提供
される。
【0003】 これらが長距離にわたり得るので、種々の長さおよびエピトープ密度の線状多
価アレイは、生物学的な系における構造−機能関係を探索するのに特に有用であ
る。化学経路および化学酵素経路は、二価リガンド、三価リガンド、デンドリマ
ー、および高分子量ポリマーの生成のために開発されているが、十分に規定され
た線状オリゴマーは、合成がより困難であることが証明されている。従って、種
々のそして制御された長さの、異なる多価材料の多様なアレイを作製するための
一般的な戦略が必要である。
【0004】 これがなされ得る1つの方法は、ROMP技術の使用が考慮される。ROMP
は、規定された生物学的に活性なポリマー(Gibsonら、Chem.Com
mun.,1095−1096(1997);Biaginiら、Chem.C
ommun.,1097−1098(1997);Biaginiら、Poly
mer,39,1007−1014(1998);およびKiesslingら
、Topics in Organometallic Chemistry、
1、199−231(1998))を、タンパク質−炭水化物認識事象を阻害す
ることから細胞表面タンパク質のタンパク質分解放出を促進することまでにわた
る強力で独特な活性を有して生成するために使用されている(Mortellら
、J,Am.Chem.Soc.,118,2297−2298(1996);
Mortellら、J.Am.Chem.,Soc.,116,12053−1
2054(1994);Kanaiら、J.Am.Chem.Soc.,119
,9931−9932(1997));Kingsburyら、J.Am.Ch
em.Soc.,121,791−799(1999);Scrhockら、J
.Am.Chem.Soc.,112,3875−3886(1990);Go
rdonら、Nature,392,30−31(1998);およびSand
ersら、J.Biol.Chem.,274,5271−5278(1999
))。ROMPによる多価材料のアセンブリは、多価ディスプレイの生成のため
の古典的な方法の対していくつかの利点を有する。詳細には、ROMPは、リビ
ング重合条件下で行われ得、開始速度が成長速度よりも速い場合、モノマー対開
始剤の比(M:I)を変えることによって、規定された長さの材料を生成し得る
(Ivin,Olefin Methathesis and metathe
sis polymerization;Academic Press:Sa
n Diego,1997)。このアプローチは、Grubbsのルテニウム金
属カルベン触媒([(Cy)3P]2Cl2Ru=CHPh)を用いて首尾よく適
用されて、狭い多分散性を有する材料を生成し、得られた物質はかなり均質であ
ることを示す(Diasら、J.Am.Chem.Soc.,119,3887
−3897(1997);およびLynnら、J.Am.Chem.Soc.,
118,784−790(1996))。アニオン性重合触媒およびカチオン性
重合触媒と対称的に、ルテニウム金属カルベン開始剤は、幅広い範囲の官能基に
対して寛容である。
【0005】 しかし、生物学的に活性な材料を組み立てるためにROMPに依存する標準的
なアプローチの使用における固有な不利が存在する。例えば、所望のペンダント
官能基がモノマーに組み込まれる。従って、新規な官能化された環式オレフィン
モノマー(典型的には、官能化された二環式モノマー)は、生成されるべきそれ
ぞれの新規なポリマーのクラスに対して合成されなければならない。また、それ
ぞれのモノマーの物理的性質(例えば、その溶解性ならびに環式オレフィンの電
子密度および歪み)は、反応の開始、成長および非生産的な停止の、異なる速度
を生じる(Kanaiら、J,Am.Chem,.Soc.,119,9931
−9932(1997))。さらに、所望の生成物の精製は、使用したモノマー
の構造に依存して複雑であり得る。
【0006】 多価アレイの都合の良い大規模合成は、これらの技術的複雑さによって妨害さ
れる。従って、これらの1つ以上の問題に取り組む多価アレイを合成するための
一般的な方法が必要である。最終的に、大規模な生産とオリゴマーのライブラリ
ーの生成との両方がこのような方法によって容易になる。
【0007】 多価アレイのさらなる改変の導入のためのさらなる戦略は、選択された官能基
をROMPポリマーの末端に組み込むことである。ポリマー末端へのさらなる官
能基の結合は、さらにROMPにより生成される材料に使用するレパートリーを
拡大する。この選択的な末端キャッピングは、表面支持ROMP誘導ポリマーの
合成において示されるように、新たな適用のための材料を合成するために、リビ
ングなチタン開始ROMP反応およびモリブデン開始ROMP反応において以前
に使用されている(Cannizzoら、Macromolecures,20
,1488−1490(1987);Albagliら、J.Phys.Che
m.,97,10211−10216(1993);およびAlbagliら、
J.Am.Chem.Soc.,115,7328−7334(1993))。
チタン開始剤およびモリブデン開始剤とは異なり、ルテニウムROMP開始剤は
、幅広い種々の極性官能基に寛容であり、他の触媒を使用してアクセス可能でな
い生成物の生成を可能にする(Grubbs,J.M.S.Pure Appl
Chem.,A31,1829(1994))。ルテニウムカルベン触媒RO
MPによって生成されるポリマーに特定の末端基を結合することによって、新た
な表面を作製するためのポリマーの選択的な固定化のような適用のためのさらな
る官能化が可能な材料に対するアクセス(Weekら、J.Am.Chem.S
oc.,121,4088−4089(1999))および例えば結合事象に対
して報告する特定のリガンドの開発が提供される。従って、選択された官能基を
ルテニウムカルベン触媒ROMPによって生成されるポリマーの末端に組み込む
ための方法および試薬が必要である。
【0008】 (発明の要旨) 本発明は、官能化ポリマー(この用語は比較的短いオリゴマーを含む)のよう
な多価アレイを合成するための方法を提供する。有意には、本発明の方法は、有
意な機能を有する幅広い範囲の材料ヘのアクセスを提供し得る。例えば、これら
は、付加される官能基、末端官能基ならびに長さにおいて異なるオリゴマー物質
のライブラリーを生成するために使用され得る。有意に、本発明の方法は、ペン
ダント官能基の数、種類、および位置を制御し、そして選択された官能基をポリ
マー末端に提供するための能力を提供する。このような設計の制御は、例えば、
生物学的系における構造/機能活性の関係を解明するのに重要である。本発明の
方法は、ランダムコポリマー(すなわち、2つ以上の異なるモノマーから誘導さ
れるポリマー)を生成するために使用され得る。さらに、いくつかのブロックが
不変を維持し、一方、他のブロックが本発明の方法によって多様化されるブロッ
クコポリマーが生成され得る。このブロックは、骨格および/またはペンダント
官能基において多様であり得る。
【0009】 一つの実施形態において、本発明は、多価アレイを調製する方法を提供する。
本方法は、金属カルベン触媒の存在下で少なくとも一つの重合可能な基および少
なくとも一つの潜在的反応性基を含む少なくとも一つのモノマーを重合して、少
なくとも一つの潜在的反応性基を含むポリマーテンプレートを形成する工程;お
よびポリマーテンプレートを、少なくとも一つの反応性基を含む少なくとも一つ
の官能化剤と、ポリマーテンプレートの潜在的反応性基と官能化剤の反応性基と
を反応させるのに効果的な条件下で組み合わせて、多価アレイを形成する工程を
包含する。モノマーは、必要に応じて、官能化剤(本明細書中において、プレ官
能化モノマーと呼ばれる)の反応性基と非反応性の官能基を含む。一つの特定の
実施形態において、モノマーの潜在的反応性基は、求核性基を含み、そして官能
化剤の反応性基は、求電子基を含む。別の特定の実施形態において、モノマーの
潜在的反応性基は、求電子基を含み、そして官能化剤の反応性基は、求核基を含
む。特に好ましい実施形態において、求電子基は、活性化エステル基であり、そ
して求核基は、第1級アミン基である。
【0010】 関連の実施形態において、本方法は、金属カルベン触媒の存在下で、それぞれ
が少なくとも一つの重合可能な基を含む少なくとも二つのモノマーを重合し、少
なくとも一つの潜在的反応性基を含むポリマーテンプレートを形成する工程であ
って、ここで、一つのモノマーが少なくとも一つの潜在的反応性基を含む工程;
およびポリマーテンプレートを、少なくとも一つの反応性基を含む少なくとも一
つの官能化基と、ポリマーテンプレートの潜在的反応性基と官能化剤の反応性基
と反応させて多価アレイを形成するのに効果的な条件下で結合させる工程を包含
する。他のモノマー(単数または複数)は、所望の反応性または非反応性官能基
でプレ官能化され得るか、またはペンダント官能基を保有しなくあり得る。
【0011】 これらの方法によって作製されるポリマーテンプレート、そして従って多価ア
レイは、ブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであり得る。ブロックコ
ポリマーは、上記方法によって形成され、ここで、少なくとも一つのモノマーを
重合する工程は、金属カルベン触媒の存在下で二つ以上の異なるモノマーを連続
的に重合して異なるモノマーの交互ブロックを含むポリマーテンプレートを形成
する工程を包含する。モノマーのそれぞれのブロックの長さは、制御され得る。
このブロックコポリマー形成の方法はまた、官能基の間の間隔が選択されたポリ
マーを生成するために使用され得る。あるいは、ランダムコポリマーは、上記方
法によって形成され、ここで、少なくとも一つのモノマーを重合する工程が、二
つ以上の異なるモノマーを同時に重合する工程を包含する。それぞれの異なるモ
ノマーは、ペンダント官能基の引き続く結合のために異なる潜在的反応性基を含
み得る。このようなペンダント官能性基は、ポリマーテンプレートの潜在的反応
性基と反応する官能化剤(炭水化物またはペプチドを含む)から誘導され得る。
【0012】 本発明はさらに、ROMPにより生成された材料への官能基の末端結合のため
の方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬は、種々の官能化ポリマ
ー(本明細書中において、比較的短いオリゴマーがこの用語に含まれる)を合成
するために使用され得る。有意には、本発明の方法は、有意な機能を有する幅広
い範囲の材料ヘのアクセスを提供し得る。例えば、これらは、末端官能基、官能
基の種類および数、ならびに長さにおいて異なるオリゴマー物質のライブラリー
を生成するために使用され得る。このような材料は、例えば、基質表面での固定
を可能にする官能基を含み得る。あるいは、このような物質は、蛍光可能な官能
基のようなレポーター基を含み得、これは、細胞表面でのレセプター−リガンド
相互作用を視覚化するために使用され得る分子プローブの作製を可能にする。末
端官能基を組み込む別の利点は、これによってポリマーのより容易な精製が可能
になり得ることである。このような多様な材料は、キャッピング剤(好ましくは
、二官能性キャッピング剤)および/または官能化メタセシス触媒を使用して調
製され得る。末端官能基を導入するための方法は、ポリマーテンプレートから官
能化ポリマーの合成のために従来のROMP重合方法とともにかまたは本明細書
中に開示される改善された方法とともに使用され得る。
【0013】 本発明の一つの実施形態において、テレケリックポリマー(好ましくは、モノ
テレケリックポリマー)を調製する方法が提供される。本方法は、少なくとも一
つのルテニウムカルベン触媒またはオスミウムカルベン触媒の存在下で少なくと
も一つの重合可能基を含む少なくとも一つのモノマーを重合してポリマーを形成
する工程;およびこのポリマーを、少なくとも一つの官能化キャッピング剤と、
このポリマーとキャッピング剤とを反応させて末端官能化ポリマーを形成するの
に有効な条件下で結合させる工程を包含する。
【0014】 官能化キャッピング剤は、官能化剤との引き続く反応のための潜在的反応性基
を含み得る。あるいは、官能化キャッピング剤は、非反応性の官能基(すなわち
、さらには反応しない所望の官能基を有するもの)を含み得る。
【0015】 別の実施形態において、本発明は、以下を包含するテレケリックポリマーを調
製する方法を提供する:少なくとも一つの官能化されたルテニウムカルベン触媒
またはオスミウムカルベン触媒の存在下で少なくとも一つの重合可能基を含む少
なくとも一つのモノマーを重合して官能化ポリマーを形成する工程;およびこの
官能化ポリマーを、少なくとも一つのキャッピング剤と、この官能化ポリマーと
キャッピング剤とを反応させて末端官能化ポリマーを形成するのに有効な条件下
で結合させる工程。
【0016】 官能化されたカルベン触媒は、官能化剤との引き続く反応のために潜在的反応
性基を含み得る。あるいは、官能化されたカルベン触媒は、非反応性の官能基(
すなわち、さらには反応しない所望の官能基を有するもの)を含み得る。
【0017】 なお別の実施形態において、本発明は、ビテレケリック(biteleche
lic)ポリマーを調製するための方法を提供する。本方法は、少なくとも一つ
の官能化されたルテニウムカルベン触媒またはオスミウムカルベン触媒の存在下
で少なくとも一つの重合可能基を含む少なくとも一つのモノマーを重合して官能
化ポリマーを形成する工程;およびこの官能化ポリマーを、少なくとも一つの官
能化キャッピング剤と、この官能化ポリマーテンプレートとキャッピング剤とを
反応させてビテレケリックポリマーを形成するのに有効な条件下で結合させる工
程を包含する。
【0018】 官能化されたROMP触媒を使用して合成される本発明の末端官能化ポリマー
は、使用されるモノマーの種類および量の選択によって、さらなる(非末端)官
能基(潜在的反応性基を含む)および非反応性基を含むように合成され得る。本
発明の官能化キャッピング剤と反応する末端官能化ポリマーは、さらなる(非末
端)官能性基(潜在的反応性基を含む)および非反応性基を含み得る。潜在的反
応性基を含むポリマーは、本明細書中において設計されたポリマーテンプレート
であり、これは、官能化剤との反応によるポリマー合成の後に選択的に官能化さ
れ得る。
【0019】 本発明の方法での使用のための官能化キャッピング剤および官能化されたカル
ベンROMP触媒もまた提供される。
【0020】 本発明の方法は、多価アレイ(官能基を保有するポリマー)のライブラリーを
生成するために使用され得る。このようなライブラリーおよびライブラリー自身
を作製する方法は、本発明によって提供される。ライブラリーは、ライブラリー
の個々のメンバーが選択された構造上の特徴(例えば、長さ、官能基の種類およ
び数、官能基の位置、ならびに末端官能基の種類および数(1または2))の範
囲にわたるように構成される。本発明の方法、規定された長さ、官能基の規定さ
れた密度、官能基間の規定された距離、(規定された相対的な数および間隔の)
異なる官能基の規定された組み合わせ、同じかまたは異なる官能基の規定された
位置、および官能基の規定された分類の多価アレイの合成を可能にする。本発明
の多価アレイのライブラリーは、ライブラリーのメンバーのそれぞれが規定され
た長さを有し、そしてライブラリーのメンバーのそれぞれが規定された官能基密
度を有するライブラリーを含む。
【0021】 本発明のライブラリーは、所望の機能を示す多価アレイのスクリーニングおよ
び選択に有用である。種々の生物学的活性(細胞表面結合、生物学的シグナル伝
達効果など)についてのスクリーニングのための多価アレイのライブラリーは、
特に興味深い。
【0022】 本発明はまた、ポリマーテンプレートおよび少なくとも一つのポリマーテンプ
レートを含むキットを提供する。このキットはまた、ペンダント官能基をポリマ
ーテンプレートにとり付けるための官能化剤を使用するための指示手段を含む。
キットはまた、少なくとも一つの官能化剤および/または少なくとも一つのキャ
ッピング剤を含み得る。キットに提供されるキャッピング剤は、官能化され得、
そして固体支持体または金属表面に連結されているかまたは連結され得るキャッ
ピング剤を含み得る。官能化キャッピング剤はまた、ポリマーと結合された官能
基(例えば、固体支持体)との間にある切断可能なリンカーを含み得る。キット
はさらに、切断可能なリンカーを切断するための試薬または指令を提供し得る。
【0023】 (好ましい実施形態の詳細な説明) 本発明は、多価アレイを合成するための方法を提供する。好ましくは、本発明
は、大規模生成と、例えばオリゴマーのライブラリーの生成の両方のために使用
され得る一般的な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態は、有意である、
なぜなら、これらは、例えば、種々の平均長、種々のエピトープ密度および種々
の官能基のポリマーの調製について比較的高収率、一般的、便利、そして/また
は効果的であるからである。種々の長さのアレイの形成を制御する本発明の方法
の能力が特に重要である。
【0024】 一つの局面において、本発明の方法は、金属カルベン触媒ROMP系によって
生成されるポリマー骨格の重合後修飾に基づく。所望のペンダント官能基をモノ
マーに組み込む従来の方法と対照的に、本発明の方法は、所望のペンダント官能
基を予め形成されたポリマーに結合する。有意に、金属カルベン触媒ROMPに
よって生成される予め形成されたポリマーへのペンダント官能基の結合は、以前
の方法が提供し得る材料よりも広い種々の材料に対してより良い制御およびアク
セスを提供する。このような材料は、幅広い種々の天然レセプターおよび合成レ
セプターに対して独特の表面またはリガンドを提供する。
【0025】 一般的に、本方法は、中間体ポリマー(本明細書中においてポリマーテンプレ
ートと呼ばれる)を形成するために、モノマーおよびROMP金属カルベン触媒
(金属カルベン触媒とも呼ばれる)の使用を含む。好ましくは、モノマーおよび
ROMP触媒は、通常の溶媒(代表的には、有機溶媒または溶媒の混合物)中に
おいてモノマーの重合を可能にするのに十分な溶解性であるが、反応は、溶媒の
不在下で(すなわち、ニート)で行われ得る。あるいは、水のようなより極性の
溶媒は、金属カルベン触媒およびモノマーが相互に溶解性である場合、使用され
得る。モノマーは、その構造中に、少なくとも一つの重合可能基、およびペンダ
ント官能基の引き続く結合(すなわち、引き続く官能化)のための少なくとも一
つの潜在的反応性基を含む。従って、適切な潜在的な反応性基は、最初のROM
P反応の間、未反応であるが、引き続く官能化の間、反応性である(すなわち、
用語「潜在的」)基である。潜在的反応性基の例としては、活性化された脱離基
(例えば、活性化エステル)または保護された官能基(例えば、保護アミン)が
挙げられる。本明細書中で使用されるように、「保護」基は、その基の固有の反
応性が、一時的にマスクされる(すなわち、「マスク」は除去され得る)基であ
る。好ましくは、モノマーは、非極性モノマー(すなわち、有機溶媒に可溶なモ
ノマー)であり、これは、得られるポリマーの単離を単純化し得る。
【0026】 得られる中間体ポリマーは、一つ以上の官能基が、潜在的反応性基と反応する
一つ以上の官能化剤を使用して付加され得るテンプレートとして働く。典型的な
反応において、一つだけの官能基が、ポリマーテンプレートに付加される;しか
し、化学量論量のいくつかの官能化剤よりも少なく使用することによって、いく
つかの異なる官能基が、ポリマーテンプレートに付加され得る。これらの官能基
は、生物学的実体(例えば、細胞表面レセプター)に対して認識要素(すなわち
、結合部位)を提供し得る。あるいは、これらは、一般的に未反応性(例えば、
細胞表面レセプターに対して非結合性)であり得る。従って、得られたポリマー
は、生体活性または生体適合性であり得る。
【0027】 最初のROMP反応において、ROMP触媒(すなわち、開始剤)に対するモ
ノマーの比を変化させることで、種々の長さのポリマーが得られる。また、最初
のROMP反応において、異なるモノマーが使用され得る。ランダムコポリマー
は、2以上の異なるモノマーを重合化することによって作製され得る。モノマー
の各々は、異なる潜在的反応性基を、続くペンダント官能基の結合のために有し
得る。これは、種々の官能化剤の化学量論量未満の付加に依存する上記の方法に
加えて、異なるペンダント官能基が骨格に付加され得る1つの方法である。ある
いは、ブロックコポリマーは、第1のモノマーを重合化し、一旦第1モノマーが
完全に消費されてから第2モノマーを添加することなどよって作製される。異な
るペンダント官能基を組み込むための別の方法は、従来のROMP方法において
なされるように、ROMP反応中に不活性である、さらなる官能化を必要としな
い所望のペンダント官能基をすでに含むモノマーを使用することである(例えば
、化合物5、図2、ルートBを参照のこと)。ペンダント官能基を含むか、また
は含まないモノマーを使用することは、本発明の方法にさらなる利点を提供する
【0028】 ランダムポリマーを作製するこれらの種々の方法のスキームを、図1に示す。
図1Aにおいて、単一のモノマーが使用され、1つの繰返し単位当たりに同じ潜
在的反応性基(A)を有するポリマーテンプレートを作製し、これに、化学量論
量未満の3つの異なる官能化剤(官能基Bを含む試薬、官能基Cを含む試薬、お
よび官能基Dを含む試薬)を添加し、異なるペンダント官能基(B、C、および
D)を有する、骨格中に同じ繰返し単位を有するポリマーを形成する。あるいは
、異なるモノマー(各々同じ潜在的反応性基を有する)を使用し、骨格中に異な
る繰返し単位を有するが、同じ潜在的反応性基を有するポリマーテンプレートを
形成し得る。図1Bにおいて、異なるモノマー(これらのいくらかは、異なる潜
在的反応性基(U、V)および安定官能基(T)を有する)は、重合化され、異
なる繰返し単位および異なる潜在的反応性基を有するポリマーテンプレートを形
成し、これに、異なる2種の官能化剤を連続的または同時的に添加して、異なる
ペンダント官能基(T、Y、Z)を有する骨格中に、異なる繰返し単位を有する
ポリマーを形成する。
【0029】 最初のROMP反応に続いておよび/またはペンダント官能基の添加に続いて
、ポリマーの骨格は、必要に応じて、さらなる利点のために改変され得る。例え
ば、この骨格を、二重結合を除去するために還元(例えば、ジイミドを使用する
)するか、またはヒドロキシル基を形成するために酸化(例えば、OS4を使用
する)する。他のアルケン官能化がまた、骨格に取り込まれ得、所望の材料を得
る。
【0030】 本発明の方法に従う合成経路の一例を、図2に示す。この例において、多価の
マンノースアレイを調製する。図2Aは、非極性活性化エステルモノマー1の重
合化、続く、得られたポリマーテンプレート3と炭水化物含有官能化剤4との反
応による合成後の改変を含む、本発明の方法の一例を示す。比較の目的で、図2
Bは、エマルジョン条件下で、炭水化物官能化モノマー5の重合を含む従来の方
法の例を示す。
【0031】 別の局面において、本発明は、ROMPによって生成される物質に、新規な官
能基を末端結合させるための方法および試薬を提供する。本発明の方法の好まし
い実施形態は重要である。なぜならば、この実施形態は、例えば、官能基の種々
の平均長、種々の型、数および分布、ならびに種々の末端官能基を有する、ポリ
マーを調製するために、比較的高収率、普遍的、都合が良く、そして/または有
効であるからである。有意に、金属カルベン触媒ROMPにより生成されるポリ
マーへの鎖終結官能基の結合は、以前の重合化方法が提供し得るよりも広範で種
々の物質へのアクセスを提供する。このような物質は、独特な表面、または広範
な種々の天然レセプターおよび合成レセプターに対するリガンドを提供する。
【0032】 本発明の好ましいROMP方法において、終結および鎖移動の速度は、成長速
度と比較して比較的遅い。開始(ki)が成長(kp)に比べて速い場合(例え
ば、ki>kp)、制御された長さおよび低い多分散性を有する、均質物質が生
成され得る(図3)。リビング重合において、モノマーが消費された後に、活性
金属カルベン中心が、各鎖の末端に存在する(図3、III)。この種は、電子
リッチのアルケンと反応し得、官能化し得る末端アルケンを有する生成物(IV
)および未反応のアルコキシ置換ルテニウム金属カルベンを生成する。この戦略
に対する有意な利点は、リビング鎖のみが官能基を獲得することであり、これに
より、より均質な集合の官能化材料を得る。
【0033】 図4に示されるように、この戦略により、テレケリックポリマー(すなわち、
独特の官能基を有する1以上の末端基を含むポリマー)を生成する。このアプロ
ーチは、先行の方法を超える別の利点を有し得る。なぜならば、各ポリマーブロ
ックの長さが制御され得るからである。テレケリックポリマーは、1以上の独特
の末端基を有し得、そして本発発明の方法において、これらが達成され得る。図
4を参照すると、モノテレケリックポリマーは、RまたはR’のいずれかが官能
基を含む生成物である。一方、ビテレケリックポリマーは、RおよびR’の両方
が官能基を含む生成物である。例えば、モノ官能性ポリマーは、以下に詳細に記
載されるように、官能化キャッピング剤または官能化触媒を使用して得られ得る
。一方、このビテレケリックポリマーは、官能化触媒および官能化キャッピング
剤の両方を使用した場合に、生成され得る。開示される生物学的な例に加えて、
テレケリックポリマーは、しばしば、架橋プラスチックの合成に使用される。所
望の特性(例えば、熱安定性)の増強は、規定される均質な物質を生成する能力
から得られ得る。
【0034】 ポリマーの末端官能化のための本発明の方法としては、従来のROMP法また
は改良方法((上記のように)ポリマーの合成後に、選択的に官能化され得る潜
在的反応性基を保持するポリマーが合成される)のいずれかが挙げられる。
【0035】 後者の(改良)方法において、少なくとも1個の重合可能基および少なくとも
1個の潜在的反応性基を構造中に含むモノマーが、続くペンダント官能基との結
合(すなわち、続く官能化)のために使用される。従って、適切な潜在的反応性
基は、開始ROMP反応の間に未反応である基である。モノマー潜在的反応性基
の例としては、活性化脱離基(例えば、活性化エステル)または保護官能基(例
えば、保護アミン)が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「保護」基は
、基の本来の反応性が一時的にマスク(すなわち、「マスク」は除去され得る)
された基である。得られたポリマーは、テンプレートとして作用し、これに1個
以上の官能基が、モノマー(本明細書中でモノマー潜在的反応性基と称される)
から誘導される潜在的反応性基と反応する1個以上の官能化剤を使用して付与さ
れ得る。これらの官能基は、生物学的機能を有し得、例えば、この官能基は、生
物学的実体(例えば、細胞表面レセプター)に対して認識エレメント(すなわち
、結合部位)を提供し得る。あるいは、この官能基は、一般に未反応であり得る
(例えば、細胞表面レセプターに対して結合しない)。従って、得られたポリマ
ーは、生物活性または生物学的適合性であり得る。
【0036】 本発明の方法において使用するための適切なモノマーは、少なくとも1個の重
合可能な基(時折1個だけの重合可能基)を有する。モノマーは、ペンダント官
能基を有し得るか、またはペンダント官能基を有さない。この官能基は、上記の
ような非反応性基または潜在官能基であり得る。特定の実施形態において、少な
くとも1個の反応基(後の官能化のために使用される)を有するモノマーを使用
して、上記のようなポリマーテンプレートを生成し得る。
【0037】 適切なモノマーは、ROMP重合化条件に対して安定であるモノマーである。
好ましくは、適切なモノマーは、標準状態でPOMPにより重合され得るモノマ
ーであり得る。より好ましくは、このモノマーには、置換された環状(例えば、
単環式、2環式、3環式、またはこれより高次の環式)モノマー−オレフィンが
挙げられる。例としては、以下が挙げられるが、これに限定されない:歪み(s
trained)オレフィン(例えば、ノルボルネン、シクロブテン)、および
低歪みオレフィン(例えば、シクロオクテン)。このような置換環式モノ−オレ
フィンはまた、環内にヘテロ原子および官能基を含み、これらには以下が挙げら
れる:例えば、チオエーテル(RSR’またはR2S)、エーテル(ROR’ま
たはR2O)、アミン(1級RNH2;2級RR”NHまたはR2NH;3級RR
’R”NまたはR2R’NまたはR3N)、アミド(すなわち、RCONHR’)
、およびエステル(RCO2R’)。このようなオレフィンの例としては、オキ
サノルボルネン、7−チア−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−2−エン、および
3,6,7,8−テトラヒドロ−1H−アゾシン−2−オンが挙げられ、これら
の構造は、以下の通りである:
【0038】
【化14】 ROMP方法のために適切なモノマーのさらなる例が開示される:例えば、発
明の背景の節で引用した種々の文献、ならびに米国特許第5,831,108号
、同第5,342,909号、同第5,710,298号、同第5,312,9
40号、同第5,750,815号、同第5,880,231号、同第5,84
9,851号、同第4,883,851号、および同第5,587,442号、
ならびにWuら、Macromolecules,26,4975−4977(
1993);Hillmyerら、Macromolecules,25,33
45−3350(1992);Maughonら、Macromolecule
s,30,3459−3469(1997);Maynardら、Macrom
olecules,32,6917−6924(1999);Hillmyer
ら、Macromolecules,28,6311−6316(1995);
Maughonら、Macromolecules,29,5765−5769
(1996)。図3は、数種の有用なモノマーのさらなる特定の例を提供する。
【0039】 モノマーは、必要に応じて、ペンダント基(官能基、非反応基または潜在的反
応性基であり得る)を含む。重合後に選択的官能化のために使用されるモノマー
上の潜在的反応性基は、求電子基または求核基を含み得る。同様に、これらの後
者の付加した官能基が誘導される化合物(すなわち、官能化剤)は、求電子基ま
たは求核基を含み得る。これらの基の2つのセットは、同じか、または異なり得
る。しかし、任意の2つの反応物(モノマーおよび官能化剤)について、この潜
在的反応性基が調和し、ペンダント官能基とポリマーテンプレートとの反応およ
び結合を可能にする。官能化剤としては、得られるポリマーに有用な特性(例え
ば、生物活性)を与え得る、例えば、炭水化物またはペプチドのような広範な種
々の分子が挙げられ得る。従って、ペンダント官能基は、生物学的実体(例えば
、細胞表面レセプター)に認識エレメント(すなわち、結合部位)を与え得る。
あるいは、ペンダント官能基は、一般に非反応性であり得る(例えば、細胞表面
レセプターに非結合性である)。このポリマーとしては、そのような基の組合せ
が挙げられる。例えば、ポリマーは、認識エレメントおよび未反応エレメントの
代替のブロックを含み得る。
【0040】 求電子性潜在的反応性基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない:アシルスルホンアミド(RCONHSO2R’)、アシルアジド(RC
ON3)、エポキシド(RR’COCR”R”’)、無水物(RCO2COR’)
、エステル(RCO2R’;ペンタフルオロフェニルエステルおよびN−ヒドロ
キシスクシンイミジルエステルを含む)、カルボン酸(RCO2H;アシルハラ
イドRCOX(ここで、X=Br、I、F、Cl)のような活性酸を含む)、ハ
ライド(F,Br、Cl、I)、ホウ素酸およびエステル(RB(OH)2;R
B(OH)(OR”);RB(OR’)2)、ケトン(RCOR’)、アルデヒ
ド(RCHO)、リン酸エステル(モノ、ジ、およびトリエステル(例えば、P
O(OR)(OH)2、PO(OR)2(OH);PO(OR)3)、ホスファイ
ト(POR3)、アシルニトリル(RCOCN)、アルケン(RR’CCR”R
”’)、アルキン(RCCR’)など。求核性潜在的反応性基の例としては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない:アミン(1級RNH2;2級RR”
NHまたはR2NH;3級RR’R”NまたはR2R’NまたはR3N)、アジド
(RN3)、ヒドロキシル(ROH)、チオール(RSH)、スルホン(R2SO 2 またはRSO2R’)、アシルヒドラジド(RCONHNH2)、ホスファイト
(POR3)、ヒドラジン(RHNNH2)、オキシム(RHCNOH)、イソシ
アネート(RNCO)、ヒドロキサム酸(RCONHOH)、チオシアネート(
RSCN)など。これらの基の立体化学は、規定されか、またはラセミ体であり
得る。所望ならば、これらの基は、以下の基で保護され得る:カルバメート(R
NHCO2R’)、カルボネート(ROCO2R’)、チオエーテル(RSR’ま
たはR2S)、ジスルフィド(RSSR’またはRSSR)、ニトロ基(RNO2 )など。
【0041】 適切なモノマーはまた、官能化のために使用されない1以上の付加基(すなわ
ち、官能化の条件下で非反応性)を含み得る。このような基には、ヒドロキシル
(ROH)、アルキル、アリール、ハライド(F,Br、Cl、I)、アミド(
RCONHR’)、チオール(RSH)などが挙げられる。これらの基の立体化
学は、規定されか、またはラセミ体であり得る。これらの基のいくらかは、潜在
的反応性基と同一であるが、ペンダント官能基の結合のために選択される条件下
では反応せず、本明細書中で安定な官能基として言及される。従って、安定とは
、本文脈中において選択条件下で非反応性である基に対して言及される、相対的
な用語として使用される。
【0042】 ノルボルネン環状構造に基づく適切なモノマーのクラスの例は、以下の一般構
造を有する:
【0043】
【化15】 ここで、Yは、CH2、O、S、またはN−R3(ここで、R3は、Hまたは有機
基である)であり、R1およびR2は、Hまたは有機基であり得、そしてR1およ
びR2は、一緒になって脂肪族環または芳香族環を形成し得る。R1、R2または
その両方は、官能基または潜在基を含み得る。好ましい実施形態において、少な
くとも1個のR1またはR2は、上に定義されるような潜在的反応性基(例えば、
活性化エステル)を含む。特定の例は、ビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エ
ン−エキソ−2−カルボン酸N−ヒドロオキシスクシンイミドエステル(化合物
1、図4)である。
【0044】 このモノマーは、当業者に公知の標準的な有機合成技術を使用して調製され得
る。例えば、モノマーのビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−エキソ−2
−カルボン酸は、Ver Nooyら、J.Am.Chem.Soc.,77,
3583−3586(1995)の手順に従って合成され得る。
【0045】 1以上のプレ官能化(prefunctionalized)モノマーが使用
され、本明細書に記載される方法によって末端が官能化されるポリマーを合成し
得る。異なる潜在的反応性基を有する1以上のモノマーを使用して、本明細書中
に記載される方法によって末端が官能化され得るポリマーテンプレートを合成し
得る。潜在的反応性基を有する1以上のモノマーのみを使用して、または1以上
のプレ官能化モノマー(すなわち、さらなる官能化を必要としないペンダント基
を有するモノマー)と組合せて使用することで、本明細書中に記載される方法に
よって末端が官能化されるポリマーテンプレートを形成し得る。
【0046】 従って、本発明の方法に従って末端が連続的に官能化されるポリマーを形成す
るために重合化され得るモノマーは、以下のような種々の官能基を含み得る:(
1)重合化後にペンダント官能基を含むように官能化され得るモノマー潜在的反
応性基;(2)(単純または複雑であり得る)所望のペンダント官能基を生成す
るためにさらに官能化することを必要としない非反応性官能基;またはペンダン
ト官能基なし(ノルボルネンの場合)。このようなモノマーの種々の組合せは、
ブロックコポリマーまたはランダムコポリマーを提供するために本発明の方法に
おいて使用され得る。
【0047】 いずれかのROMP(本明細書中上記の従来の反応または改良された反応)に
おいて、ROMP触媒(すなわち、開始剤)に対するモノマーの比を変化させる
ことにより、種々の長さのポリマーが得られる。このポリマー(またはポリマー
テンプレート)は、好ましくは、金属カルベン触媒(すなわち、複分解反応を触
媒する金属カルベン(M=CR45)結合を含む化合物、ここで、R4基および
5基は、各々独立して、Hまたは有機基(この有機基は、以下に記載の潜在的
反応性基または非反応官能基のような官能基を含み得る)であり、そして「M」
は、リガンド圏内の1以上のリガンドに結合した金属(好ましくは、ルテニウム
またはオスミウム)を表す)を使用して、1以上のモノマーを重合化することに
よって調製される。適切な触媒の特定の例は、以下が挙げられるが、これらに限
定されない:Grubbのルテニウム金属カルベン触媒(化合物14、図12)
ならびに図3に示される化合物および以下に開示される化合物:Kingsbu
ryら、J.Amer.Chem.Soc.,121,791−799(199
9);Schwabら,J.Amer.Chem.Soc.,118,100−
110(1996);Diasら,Organometallics,17,2
758−2767(1998);del Rioら,Tetrahedron
Lett.,40,1401−1404(1999);Furstnerら,C
hem.Commun,95−96(1999);Huang,J.ら,Org
anometallics,18,5375−5380(1999);Wesk
ampら,Angew.Chem.,Int.編,Engl.,37,2490
−2493(1998);Westkamp,T.ら,J.Organomet
al.Chem.,582,362−365(1999);Robson,D.
A.ら,Macromolecules,32,6371−6373(1999
);Schollら、Organic Letters,1,953−956(
1999);およびSchollら,Tetrahedron Lett.,4
0,2247−2250(1999)。例えば、以下に開示される他の化合物が
挙げられる:米国特許第5,831,108号(Grubbsら)、同第5,3
42,909号(Grubbsら)、同第5,710,298号(Grubbs
ら),同第5,312,940号(Grubbsら)、同第5,750,815
号(Grubbsら)、同第5,880,231号(Grubbsら)、同第5
,849,851号(Grubbsら)、および同第4,883,851号(G
rubbsら)。
【0048】 触媒の好ましい基としては、(以下により詳細に記載されるように)電子リッ
チなアルケンと反応する基が挙げられ、そして好ましくは、少なくとも1個の潜
在的反応性基(本明細書中で触媒潜在的反応性基と呼ばれる)および/または少
なくとも1個の所望の非反応性官能基を有する。非反応性官能基には、例えば、
天然産物またはそのアナログ、金属キレーター、金属、蛍光プローブ、固体支持
体、および金属表面が挙げられる。
【0049】 触媒上の潜在的反応性基は、好ましいモノマー上の潜在的反応性基と類似して
おり、このモノマー中のこれらの反応基は、ROMP反応を妨げず、続く官能化
を可能にする。
【0050】 官能化に使用される触媒潜在的反応性基は、求電子基または求核基を含む。求
電子性潜在的反応性基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
:アシルスルホンアミド、アシルアジド、エポキシド、無水物、エステル(活性
化エステル(例えば、ペンタフルオロフェニルエステルおよびN−ヒドロキシス
クシンイミジルエステル)を含む)、カルボン酸(活性酸(例えば、アシルハラ
イド)を含む)、ハライド、ホウ素酸、ケトン、アルデヒド、ホスホン酸エステ
ル(モノエステル、ジエステル、およびトリエステル)、ホスファイト、アシル
ニトリル、アルケン、およびアルキンなど。求核性潜在的反応性基の例としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アミン、アジド、ヒドロキシル
、チオール、スルホン、アシルヒドラジド、ホスファイト、ヒドラジン、オキシ
ム、イソシアネート、チオシアネートなど。これらの基の立体化学は、規定され
か、またはラセミ体であり得る。所望の場合、これらの基は、カルバメート基、
カルボネート基、チオエーテル基、ジスルフィド基、ニトロ基などのような基で
保護され得る。好ましくは、式M=CR45の金属カルベン触媒において、Mは
、リガンド圏内の金属を表し、R4は、潜在的反応性基(アジド、エポキシド、
シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート、チオシアネート、活性化エー
テル、活性酸、ヒドラジン、またはヒドラゾン)を含む有機基であり、そしてR 5 は、Hまたは有機基(好ましくは、H)である。
【0051】 特に好ましい触媒は、以下の一般式:
【0052】
【化16】 を有する。ここで、Mは、RuまたはOsであり、XおよびX’は、独立してア
ニオンリガンド(好ましくは、ハライド、アルコキシド、チオレート、アミド、
ホスフィド、およびアシル)であり、そしてXおよびX’は一緒になって、2座
のリガンドを示し得、そしてLおよびL’は、独立して、中性リガンド(好まし
くは、アレーン、ケトン、アルキン、カルベン、カルボニル、イミド、ホスフィ
ン、アルシン、アミン、イミン、およびニトリル)であり、そしてLおよびL’
は一緒になって2座のリガンドを示し得、そしてR4は、潜在的反応性基を含む
有機基である。好ましくはR4は、アジド、エポキシド、シアノ基、アセタール
、ケタール、カルバメート、チオシアネート、活性化エステル、活性酸、ヒドラ
ジン、またはヒドラゾンを含む、有機基である。あるいは、R4は、天然産物ま
たはそのアナログ、金属キレーター、金属、蛍光プローブ、固体支持体、および
金属表面から選択される非反応官能基を含む、有機基である。R4が固体支持体
または金属表面を含む場合、R4基は、代表的に、固体表面または金属表面から
選択された空間を提供し、そして固体表面または金属表面との結合(共有結合ま
たは非共有結合)を形成する官能基を提供するリンカー基LKを含む。
【0053】 LKは、固体表面または金属表面と結合し得る官能基を有する有機基である連
結基である。LKは、この固体上の表面基に直接結合され得る。いくつかの場合
において、この固体は官能化され得、次いで、LK基は、固体と結合されている
官能基と結合する。このLK基は、脂肪族または芳香族であるさらなる繰返し単
位を含み得、表面からの空間を提供する。LKは、例えば、式:−(M)m−L
1−(N)p−LK2を有し、ここでMおよびNは、同一または異なる有機基で
あり;mおよびpは、0から約20の範囲の整数であり、そしてLK1およびL
2は、官能基である。MおよびNは、例えば、脂肪族基または芳香族基あるい
はそれらの組合せであり得、これは、必要に応じて、好ましくは、非反応基で置
換される。(M)mまたはN(p)は、芳香族基(例えば、脂肪族基(例えば、
オレフィンまたはアルキン)によって結合されたフェニル環)であり得る。LK 1 は、−M−および−N−鎖を単に結合する官能基であるか、または上記のよう
な潜在的反応性基であり得、異なる官能基を導入するために反応され得るか、ま
たは固体からLK基の切断部を得るために切断され得る。LK2は、固体との結
合(共有結合または非共有結合)を可能にする官能基を含む。LK2は、例えば
、チオール基、活性化エステル基またはアミン基を含む。LK1は、任意の種々
の官能基であり、とりわけ、−O−、−S−、−CO−、−COO−、CO−N
R’−(ここで、R’は、水素または有機基(例えば、アルキル基)である)を
含み得る。さらに、MおよびN中の隣接しないCH2基は、−O−、または−S
−で置換され得る。LK1はまた、1以上の結合が化学的、酵素学的、または光
化学的のいずれかで破壊されて、LK基を切断し得る官能基を含み得る。切断可
能なLK1は、とりわけ、エステルおよびアミドを含む。
【0054】 固体支持体または金属表面と結合する、例示的な金属カルベンROMP触媒は
、以下の式:
【0055】
【化17】 を有する。ここで、M、X、X’、L、L’およびLKは、上記式IIにおいて
定義した通りであり、R’は、水素または有機基であり、そして好ましくは、水
素であり、そしてLKは、任意のリンカー基である。この触媒は、Barret
tら、Organic Letters,1,1083−1086(1999)
に例示されるような固体支持体と直接結合し得る。
【0056】 この触媒を使用して、ポリマーの末端に官能基を取り込み、例えば、2個のポ
リマーを共に結合させること、ポリマーを固体支持体に結合させること、または
ポリマーを小分子、蛍光プローブ、タンパク質、金属、金属キレーターなどで改
変すること可能にする。従って、本発明の方法において有用である触媒は、以下
の種々の官能基(触媒M=CR45におけるR4またはR5の少なくとも1個)を
含む:(1)重合化後に末端官能基を含むように官能化され得る触媒潜在的反応
性基;(2)所望の末端官能基を生成するためにさらなる官能基化を必要としな
い非反応官能基;または(3)官能基なし。このような触媒の種々の組合せは、
本発明の方法において使用され得る。
【0057】 最初の重合化は、好ましくは、溶媒または溶媒の混合物(代表的に、1種以上
の有機溶媒)中で実施され、ここで、モノマーおよび触媒は、互いに可溶性であ
るが、特定の実施形態において、溶媒を必要としない。適切な溶媒としては、置
換および非置換の脂肪族および芳香族炭化水素溶媒(例えば、塩素化炭化水素、
エーテル、プロトン性炭水化物などが挙げられ、これらは、反応条件下で非反応
性である。例として、1,2−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、p−キシ
レン、塩化メチレン、ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテ
ル、ペンタン、水、メタノールなどが挙げられる。
【0058】 重合化反応の条件(例えば、温度、時間、大気圧)は、モノマーおよび触媒の
選択に依存して変化し、そして過度の実験を行うことなく当業者によって選択さ
れ得る。好ましくは、ROMP反応は、不活性大気圧下(例えば、窒素またはア
ルゴン)で約20℃〜約30℃の温度(すなわち、室温)またはそれより高い温
度で実施され得るが、約−20℃〜約125℃の範囲の温度が可能である。圧力
は、重要ではないが、液相反応混合物を維持するように変化され得る。反応時間
は、数分から数日に変化し得る。
【0059】 典型的に、ROMP反応において、ポリマーは、触媒とキャッピング剤との反
応により終結される。このキャッピング剤は、典型的に、触媒に適合される。ル
テニウム触媒について、例えば、エチルビニルエーテルが使用されている。この
ような試薬は本発明において使用され得るが、好ましくは、電子リッチなアルケ
ンがポリマーに末端官能基を組み込むために使用される。本明細書中で使用され
る場合、電子リッチなアルケンとは、エチレンより大きな電子密度を有するアル
ケンをいう。従来のキャッピング方法において、キャッピング剤は、ビニルエー
テル、典型的には、エチルビニルエーテルであり、これは、末端アルケンおよび
不活性化されたα−酸素置換ルテニウム金属カルベンを有する材料を生成する(
Hillmeyerら、Macromolecules,28,6311〜63
16(1995))。
【0060】 対照的に、本発明のキャッピング剤は、好ましくは、二官能性キャッピング剤
であり、電子供与基、および好ましくは以下のいずれかを組み込む:続く官能化
のための潜在的反応性基(例えば、ポリマーの末端に官能基を組み込むことによ
り、2つのポリマーを一緒にカップリングすること、固体支持体または金属表面
にカップリングすること、小分子(例えば、蛍光プローブ、金属、金属キレータ
ーなど)で修飾すること、天然産物(例えば、典型的に大きな生物学的分子)(
ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸などを含む)で修飾することなどを可能
にする);あるいはさらなる官能性を必要としない非反応性官能基(すなわち、
これはレポーター基のようなポリマーの末端に組み込まれて、検出を容易にする
ことが所望される、蛍光基、化学発光基、酵素、抗体、ビオチン、放射性基など
のような官能基である)。従って、触媒と同様の様式で、本発明の方法において
有用なキャッピング剤は、例えば以下のような様々な官能基を含み得る(キャッ
ピング剤D−C=CR67中のR6またはR7の少なくとも1つにおいて):(1
)重合後に末端官能基を含むように官能化され得る、キャッピング剤潜在的反応
性基;(2)所望の末端官能基を生成するさらなる官能化を必要としない非反応
性官能基;または(3)官能基なし(エチルビニルエーテルの場合のように)。
このようなキャッピング剤の様々な組み合わせが、本発明の方法において使用さ
れ得る。
【0061】 有意に、本発明の触媒およびキャッピング剤は、リビング(living)金
属(特に、オスミウムまたはルテニウム)開始ROMP反応の、末端の構造を制
御するための一般的な有用性を有する。単一の末端基のポリマーへの選択的組み
込みは、他のオリゴマーに付加されるか、選択的に固定化されるか、検出のため
に使用されるか、定量的結合研究のために使用されるか、またはポリマー構造を
研究するために使用され得る二官能性ポリマーの生成を促進する。得られる材料
は、多くのレポーター分子(様々な蛍光化合物、ビオチン、抗体、酵素、脂質、
および固体支持体を含む)のいずれかと結合され得る。金属カルベン開始剤の官
能基耐性、触媒の選択における柔軟性、合成後の官能化プロトコルの普遍性、お
よびキャッピング方法の多様性は、ROMPにより生成され得る有用な材料の範
囲を有意に広げる。
【0062】 ポリマー中の官能基の間隔は、ある程度は、異なる官能基を有するポリマーを
、選択された末端の反応により互いに付加させることによって制御され得る。2
つ以上のポリマーから構成される複合ポリマーは、これらの成分ポリマーへの末
端基の適切な組み込みにより合成され得、これらの成分ポリマーは次いで、組み
込まれた末端基の反応により互いに結合される。1つ以上の官能基の選択された
分布または間隔を有する複合ポリマーは、このように合成され得る。
【0063】 典型的に、キャッピング剤は、以下の一般式を有する:
【0064】
【化18】 ここで、Dは、電子供与基(すなわち、エチレンと比較した場合、オレフィンの
電子密度の全体的な増加を引き起こす基)である。Dは、SR9、OR9またはハ
ロゲンを含み得、ここで、R9は水素または有機基であり、好ましくはアルキル
基である。R6、R7およびR8は、独立して、水素または有機基であり、そして
これらの基のうち少なくとも1つは、好ましくは、潜在的反応性基、またはさら
なる官能化を必要としない非反応性官能基を含む。R8は、好ましくは、水素で
ある。R6およびR7の両方が官能性を含み得るが、好ましくは一方のみが含み得
、そしてより好ましくは他方がHである。1つの好ましい実施形態において、R 6 は以下から選択される潜在的反応性基を含み得る:アジド、ニトロ基、ジスル
フィド、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルデヒド、ケトン、
エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート、チオシアネート
、活性化エステル、または活性化酸。あるいは、別の好ましい実施形態において
、R6は、以下から選択される非反応性官能基であり得る:天然産物またはそれ
らのアナログ(例えば、ビオチン)、金属キレーター(例えば、ニトリロ三酢酸
)、金属(例えば、Zn)、蛍光プローブ(例えば、BODIPY FL ED
A(これは、4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−
ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニルエチレンジアミンである)から誘導
されるアミド)、固体支持体(例えば、ポリエチレン樹脂)、および金属表面(
例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)のために使用される金表面)。反応性官
能基を含むキャッピング剤の例は図7Aに例示され、そして非反応性官能基を含
むキャッピング剤の例は図7Bに例示される。
【0065】 特定の実施形態において、キャッピング剤は、固体への共有結合または非共有
結合を提供する。固体への結合のための代表的なキャッピング剤には、以下の式
のキャッピング剤が挙げられる:
【0066】
【化19】 ここで、Dは、上記で定義されたような電子供与基であり;R8およびR7は、水
素または有機基であり、好ましくは両方が水素であり;nは、1〜約20の整数
であり;そしてLKは、固体に結合し得る官能基を有する有機基である連結基で
ある。LKは、固体上の表面基に直接結合し得る。いくつかの場合において、こ
の固体は官能化され得、次いでLK基は固体に付加された官能基に結合する。L
K基は、脂肪族または芳香族であるさらなる繰返し単位を含み、表面からの間隔
を提供し得る。LKは、例えば、式:−(M)m−LK1−(N)p−LK2を有
し、ここで、MおよびNは、同じかまたは異なる有機基であり;mおよびpは0
〜約20の範囲の整数であり、そしてLK1およびLK2は官能基である。Mおよ
びNは、例えば、脂肪族基または芳香族基、あるいはそれらの組み合わせであり
得、これらの基は、好ましくは非反応性基で必要に応じて置換されている。(M
)mまたは(N)pは、脂肪族基(例えば、オレフィンまたはアルキン)により
結合された芳香族基(例えば、フェニル環)であり得る。LK1は、−M−鎖お
よび−N−鎖を単に連結する官能基であり得るか、あるいはこれは、異なる官能
性を導入するように反応され得るか、または固体からLK基が切断されるように
切断され得る上記のような潜在的反応性基であり得る。LK2は、固体への連結
(共有結合または非共有結合)を可能にする官能基を含む。LK2は、例えば、
チオール基、活性化エステル基、またはアミン基を含み得る。LK1は、とりわ
け、−O−、−S−、−CO−、−COO−、CO−NR’−(ここでR’は、
水素または有機基、例えば、アルキル基である)を含む任意の様々な官能基であ
り得る。さらに、MおよびN中の隣接していないCH2基は、−O−または−S
−で置換され得る。LK1はまた、1つ以上の結合が、化学的にか、酵素的にか
または光化学的にのいずれかで破壊されて、LK基を切断し得る官能性を含み得
る。切断可能なLK1には、とりわけ、エステルおよびアミドが挙げられる。
【0067】 特定の実施形態において、キャッピング剤は、固体表面または支持体に対する
切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーキャッピング剤は、(1)ポリ
マーをキャップする反応のための電子リッチなオレフィン;(2)固体に共有結
合または非共有結合される官能基(または、固体に共有結合または非共有結合さ
れ得る潜在的反応性基);および(3)化学的、酵素的または光化学的に切断さ
れ得る(1)と(2)との間の中間の潜在性官能基、を有する有機基である。キ
ャップされたポリマーを適切な、化学的、酵素的または光化学的条件に暴露する
ことによって、固体からポリマーが選択的に切断され得る。例えば、切断可能な
リンカーキャッピング剤は、ポリマーと反応して、ポリマーを固体表面に結合し
得る。この固体は、次いで、非特異的に結合した材料を除去するため(例えば、
ポリマーを精製するため)に洗浄され得る。その後、精製されたポリマーは、固
体支持体への結合を切断し、その固体からポリマーを放出するために、化学的、
酵素的または光化学的に処理され得る。
【0068】 特に好ましい光化学的に切断可能なキャッピング剤は、以下の式を有する:
【0069】
【化20】 ここで、Dは上記で定義された通りであり;R8は、キャッピング剤中の他のR8 から独立して、水素または有機基であり;R7もまた、水素または有機基であり
;nは1〜約20の範囲の整数であり;R9は、Hまたは有機基であり得;Wは
、電子吸引性基であり;そしてZは電子供与基であり、そしてLK2は、固体支
持体への結合のためのリンカー基である(式中の球で示される)。光化学的に切
断され得る結合は、この式において波線で示される。(CH2)n鎖中の隣接し
ていない1つ以上のCH2基は、−O−(エーテルを提供する)または−S−(
チオエーテルを提供する)で置換され得る。R8は、好ましくはHである。R9
、好ましくは低級アルキル基(すなわち、1〜約6個の炭素原子を有する)であ
り、より好ましくは、メチル基である。Wは、電子吸引基であり、これはとりわ
け、NO2、CN、CF3またはハロゲンであり得る。Zは、電子供与基であり、
これはとりわけ、R、OR、もしくはSR(ここでRは、アルキル基である)、
またはNR’2(ここで、R’は、水素またはアルキル基である)であり得る。
【0070】 図8Aは、切断可能なリンカー基を有するキャッピング剤の使用を概略的に例
示する。切断可能なリンカーがPEG(ポリエチレングリコール)を介して樹脂
に結合されている式VIのキャッピング剤は、ポリマーテンプレート(代表的な
潜在的反応性基(活性化基)を含む)と反応して、ポリマーを樹脂(固体支持体
)に結合する。この固体担持ポリマーは、次いで、代表的な求核剤と反応するこ
とによって官能化されて、固体担持された官能化ポリマーを生成する。固体支持
体への結合は、ポリマーの官能化および精製を容易にし得る。官能化されたポリ
マーは、適切な波長の光を使用する照射によって固体支持体から切断され得る。
様々な有機基の光化学的切断(図8Aに示されるようなエステルの切断を含む)
は、周知のプロセスである。当業者は、切断可能なリンカーと共に使用するため
の周知の光化学的方法を容易に用いるかまたは適合し得る。上記のように、リン
カーはまた、化学的または酵素的反応を使用して切断され得る。また、様々な周
知の化学的または酵素的反応が使用され得るか、または本発明の切断可能リンカ
ーと共に使用するために容易に適合され得る。
【0071】 切断可能なキャッピング剤は、容易に入手可能な出発物質を使用して、当該分
野で周知の方法によって合成され得る。例えば、図8Aのキャッピング剤の合成
は、図8Bに例示され、そして合成の詳細は実施例で示される。
【0072】 特定の好ましいキャッピング剤は、潜在性または非反応性官能基、およびエチ
レングリコール基の両方を含む。典型的に、これらの両方は、一つの部分、また
はR6もしくはR7の部分を形成する。キャッピング剤の特に好ましい例には、保
護されたカルボン酸誘導体にエチレングリコール鎖を介して連結されたアルキル
ビニルエーテルが挙げられる。その設計により、このリンカーは、タンパク質ま
たは疎水性分子との非特異的相互作用を最小にする。
【0073】 本発明の方法は、キャッピング剤とポリマー鎖との間の標準的なカップリング
技術を包含する。これらのカップリング技術は、選択されたキャッピング剤に依
存し、そして溶液または固体状態の反応条件を含み得る。このような技術および
条件は、当業者により容易に決定され得、重合条件と異なる場合、類似している
【0074】 キャッピング剤の代替として、ポリマーテンプレートは、触媒を、酸素または
他の酸化剤で酸化し、ポリマーテンプレートの骨格の末端でアルデヒドを形成す
ることによって、末端官能化され得る。例えば、ポリマーテンプレートは、単に
空気に曝されるか、または室温および圧力下で酸素雰囲気下に置かれ得る。
【0075】 官能化剤(すなわち、触媒および/またはキャッピング剤が潜在的反応性基を
含む場合、またはポリマーが末端アルデヒド基を含む場合、末端官能基が誘導さ
れる化合物)は、上でR6基について議論されるように、得られるポリマーに有
用な特性(例えば、蛍光性)を与える広範な分子を含み得る。
【0076】 本発明の方法は、官能化剤とポリマー(またはポリマーテンプレート)との間
の標準的なカップリング技術を包含する。これらのカップリング技術は、選択さ
れる潜在的反応性基に依存し、そしてポリマーテンプレートの溶解度に依存する
液体または固体状態の反応条件を含み得る。このような技術および条件は、当業
者によって容易に決定され得る。
【0077】 得られるポリマーは以下の一般式を有する:
【0078】
【化21】 ここで、「BB」は、骨格の繰返し単位を表し、この繰返し単位は、環式または
非環式であり得、そしてランダム配置またはブロック配置において同じであるか
または異なり得、R1およびR2は、それぞれ互いに独立して、かつ異なる繰返し
単位の他のR1およびR2と独立して、水素または所望のペンダント官能基を含む
有機基であり、R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、金属カルベン触媒か
ら誘導される有機基であり、そしてR6およびR7は、それぞれ独立して、水素、
またはキャッピング剤から誘導される有機基であり、そしてnは、繰返しモノマ
ー単位の平均数(これは、モノマー対触媒の比を制御することによって変動し得
る)である。R1およびR2は、同じかまたは異なるタイプの繰返し単位中のR1
およびR2のそれぞれと同一かまたは異なり得る。R4、R5、R6またはR7の少
なくとも1つは、潜在的反応性基または非反応性官能基(すなわち、末端官能基
)を含む。典型的に、nは、少なくとも2、かつ約10,000以下であるが、
特別な制限はない。本発明のポリマーは、nが約50以下であるポリマー、nが
約50〜約200の範囲であるポリマー、nが約100〜約1,000の範囲で
あるポリマーを含む。上記のように、ROMPは、モノマー対ROMP触媒(す
なわち、開始剤)の比に依存して、変動する平均長(すなわち、変動する重合度
、DP)を有するポリマーを提供する。本明細書中で記載される全てのポリマー
の長さは、重合反応において使用されるモノマー対開始剤の比により予測される
長さとして表される。
【0079】 好ましくは、R1およびR2の少なくとも1つは、保護されたアミンまたは活性
化エステル(すなわち、カップリング剤を必要とすることなく、穏やかな条件下
で反応するもの(例えば、HATU(O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−
イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
)))を含む。
【0080】 異なる骨格を有するポリマーテンプレートの例は、図9に示される。好ましい
例のノルボルネンテンプレートに基づくポリマーテンプレートは、以下の一般構
造を有する:
【0081】
【化22】 ここで、Y、R1、R2、R4、R5、R6、R7およびnは、上記で定義された通り
である。好ましくは、R1およびR2の少なくとも1つは、保護されたアミンまた
は活性化エステルを含む。好ましいポリマーテンプレートは、図2に化合物3と
して示される。好ましくは、R4、R5、R6、およびR7の少なくとも1つは、官
能化されたキャッピング剤および/または官能化された金属カルベン触媒から誘
導される官能基を含む。
【0082】 別の好ましい例のポリマーテンプレートは、以下の一般構造を有する:
【0083】
【化23】 ここで、BB、R1、R2、R4、R5、R6、R7およびnは、上記で定義された通
りであり、そして各Zは、独立して、H、OH、SH、X(F、Br、I、Cl
のようなハライド)、またはN(R82(ここで、各R8は、独立して、Hまた
は有機基である)である。R4、R5、R6またはR7の少なくとも1つは、潜在的
反応性基または非反応性官能基を含む。
【0084】 本明細書中で使用される場合の「R」基の定義において、用語「有機基」とは
、脂肪族基、環式基、または脂肪族基と環式基との組み合わせ(例えば、アルカ
リールおよびアラルキル基)として分類される炭化水素基(炭素および水素以外
の任意の元素、例えば、酸素、窒素、硫黄、リン、ゲルマニウム、スズ、ホウ素
、およびケイ素を有し、様々な官能基の形態であり得る)を意味する。本発明の
状況において、有機基は、それらが不可欠な反応性基を含む場合を除いて、ポリ
マーテンプレートまたは得られるポリマーの形成を妨害しない基である。用語「
脂肪族基」とは、飽和または不飽和の直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する
。この用語は、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含むよう
に使用される。用語「アルキル基」とは、飽和の直鎖または分枝鎖の炭化水素基
を意味し、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、t−ブチル、ヘプチル、ド
デシル、オクタデシル、アミル、2−エチルヘキシルなどが挙げられる。用語「
アルケニル基」とは、1つ以上の炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の直鎖ま
たは分枝鎖の炭化水素基(例えば、ビニル基)を意味する。用語「アルキニル基
」とは、1つ以上の炭素−炭素三重結合を有する不飽和の直鎖または分枝鎖の炭
化水素基を意味する。用語「環式基」とは、脂環式基、芳香族基または複素環式
基(これは芳香族または脂環式であり得る)として分類される、閉環炭化水素基
を意味する。用語「脂環式基」とは、脂環式基の特徴と類似した特徴を有する環
式炭化水素基を意味する。用語「芳香族基」または「アリール基」とは、単核ま
たは多核の芳香族炭化水素基を意味する。用語「複素環式基」とは、環内の1つ
以上の原子が炭素以外の元素(例えば、窒素、酸素、硫黄など)である閉環炭化
水素を意味する。
【0085】 置換は、本発明の錯体の有機基について予測される。本願全体にわたって使用
される特定の用語の議論および詳述を簡単にするための手段として、用語「基」
および「部分」は、置換を可能にするかまたは置換され得る化学種と、そのよう
な置換を可能にしないかまたは置換され得ない化学種との間を区別するために使
用される。従って、用語「基」が化学的置換基を記載するために使用される場合
、記載される化学物質は、置換されていない基、および鎖中に、例えばO、N、
Si、またはS原子を有する基(アルコキシ基のように)、ならびにカルボニル
基、または他の従来的な置換を含む。用語「部分」が、化合物または置換基を記
載するために使用される場合、置換されていない化学物質のみを含むことが意図
される。例えば、成句「アルキル基」は、純粋な鎖式の飽和炭化水素アルキル置
換基(例えば、メチル、エチル、プロピル、t−ブチルなど)だけでなく、当該
分野で公知のさらなる置換基(例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスル
ホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなど)を有する
アルキル置換基も含むことを意図する。従って、「アルキル基」は、エーテル基
、ハロアルキル基、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル
、スルホアルキルなどを含む。言い換えると、成句「アルキル部分」は、純粋な
鎖式の飽和炭化水素アルキル置換基(例えば、メチル、エチル、プロピル、t−
ブチルなど)を含むことに制限される。
【0086】 有機基を含み得る各R基についての本明細書中で例示される構造について、有
機基は有意に大きなサイズ、例えば、以下のような、10,000炭素原子のオ
ーダーであり得る。好ましくは、R1およびR2の有機基は、それぞれ独立して、
1〜C5000有機基、より好ましくは、C1〜C2500有機基、さらにより好ましく
は、C1〜C1000有機基、最も好ましくは、C1〜C100有機基であり、ペプチド
、タンパク質、炭水化物、金属キレーター、天然産物などを含む。好ましくは、
4、R5、R6およびR7の有機基は、それぞれ独立して、C1〜C10,000有機基
、より好ましくは、C1〜C6000有機基、さらにより好ましくは、C1〜C1000
機基、最も好ましくは、C1〜C500有機基であり、抗体、核酸、ペプチド、タン
パク質、炭水化物、金属キレーター、蛍光タグ、酵素、固体支持体などを含む。
好ましくは、R3、R8およびR9の有機基は、それぞれ独立して、C1〜C20有機
基、より好ましくは、C1〜C10アルキル基、最も好ましくは、C1〜C3アルキ
ル部分である。
【0087】 本発明の方法は、多価のアレイが式VII、VIIIおよびIXを有するライ
ブラリを含む多価のアレイのライブラリを生成するために用いられ得る。所定の
ライブラリにおいて、成分アレイ(ライブラリのメンバー)は、選択された範囲
の構造変形物にわたる。例えば、所定のライブラリにおいて、メンバーアレイの
全てが、ほぼ同じ長さを有し、そして異なるペンダント官能基または末端官能基
を保持するように合成され得る。別の例において、ライブラリは、同じペンダン
ト官能基または末端官能基を有する、長さの選択された変形を有するメンバーで
構築され得る。さらに別の例において、ライブラリは、ある範囲の官能基密度お
よび官能基分布にわたるように設計され得る。官能基密度は、最も一般的に、官
能基/ポリマーの数であるが、規定された数の隣接するモノマーが同じ官能基で
置換されるブロック中の、例えば、ポリマー全体にわたってランダムに分布する
異なる分布の官能基を表し得、ここで、官能基は選択された間隔で互いに離され
るか、または異なる相対位置および異なる官能基の間隔で離されている。本発明
の方法により、ポリマーの長さ、末端官能性および官能基のタイプ、密度および
分布の全てを制御することが可能である。
【0088】 ライブラリは、少なくとも1つの構造特性において規定される(すなわち、ラ
ンダムではない)異なる構造を有する複数の多価アレイからなる。例えば、ライ
ブラリは、規定された官能基密度(官能基/モノマー)を有するメンバーを含み
得るが、ここでこれらの官能基は、ポリマー全体にわたってランダムに分布して
いる。ライブラリは、典型的に、10以上の構造的に識別可能な多価のアレイか
らなる。好ましいライブラリは、約50〜約200個の構造的に識別可能な多価
のアレイからなる。
【0089】 本発明のライブラリは、生物学的官能性であり得る所望の官能性を有する多価
のアレイを、スクリーニング、選択および同定するために有用である。
【0090】 本発明はまた、多価アレイの合成のためのキットを提供する。キットは、ポリ
マーテンプレートを含み得、このテンプレートは、官能化剤を含んでも含まなく
てもよいが、好ましくはペンダント官能基の結合のための使用説明書を含み、そ
して必要に応じて、これらの試薬は、結合のために必要である。使用説明書は、
ポリマーテンプレート上に存在する潜在的反応性基に依存する。これらのキット
はまた、ポリマー鎖の末端を官能基化するためのキャッピング剤を含み得る。
【0091】 本発明の方法の合成後修飾ストラテジーの有用性を実証するために、3つのモ
ノマー対開始剤比(10:1、25:1および50:1)を使用した、平均長(
重合度、DP)が異なる一連のNHS置換材料を調製した(反応経路A、図2)
。全ての重合反応は、効率的に進行し、全てのモノマーを消費した。活性化オリ
ゴマー骨格をアミンで処理して一連のオリゴマーを得ることにより、マンノース
エピトープを、付加した。同一のモノマー対ROMP触媒比を使用するエマルジ
ョン重合条件下で、従来の方法により類縁材料を生成した(反応経路B、図2)
。2つの方法により調製されたオリゴマーの巨視的物理的特性におけるバリエー
ションは、検出されず、そして1H NMRスペクトルにおいて観測可能な差は
無かった。これらの結果は、PSM手順が有効であることを示す。各々の方法で
生成した材料の相対的長さを、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を使用し
て評価した。炭水化物ポリマー6および7(図2)を、アセチル化して有機可溶
性誘導体に変換した。これらは、より容易にGPCで評価し得る。これらの材料
の分析は、エマルジョン条件下で生成したポリマーが、重合後修飾により生成し
たポリマーよりわずかに短いことを示唆した(図10)。しかし、各方法は、ポ
リマー長とモノマー対開始剤(M:I)比との間の線形相関を生じ、重合がリビ
ング重合であることを示す。従って、本発明に従うPSMプロトコルを使用して
、長さの異なる多価アセンブリを調製し得る。GPCデータはまた、各方法によ
り作製される最も短いポリマーが、互いに約3単位長内であることを示し、一方
最も長いポリマーは、約12単位内である。エマルジョンとPSMポリマーとで
の長さの違いは、重合反応におけるバリエーションを生じるモノマーの物理的特
性の差を強調する。本発明の新しいPSM手順は、重要である。なぜならば、広
範囲の異なる認識エレメントが単一骨格に結合して、同一骨格を有する材料を生
じ得るからである。このような物質は、構造/機能の関係の決定を容易にする。
【0092】 本発明の方法を、新しいプロセスから誘導されるオリゴマーの生物学的活性と
、従来のアプローチにより作製されるオリゴマーと比較することによりさらに調
べた。マンノース置換ポリマーを消化して、十分に研究されたレクチンコンカナ
バリンA(Con A)と相互作用させる(Goldstein,et al.
,Carbohydrate Specificity of Concana
valin A; Bittiger,H. and Schnebli,H.
P.,Ed.;John Wiley & Sons, Ltd.: Lond
on,1976;Coll.,pp 55−65)。Con Aは、pH7でホ
モテトラマーであり、異なる細胞表面上のマンノース残基との同時相互作用を介
して赤血球の凝集を促進し得る。可溶性炭化水素リガンドの細胞凝集を阻害する
能力を測定し得る。Con A阻害アッセイにおけるROMP誘導オリゴマーの
能力は、その長さに依存する(Kanai et al.,J.Am.Chem
.Soc.,119,9931−9932(1997);and Mann e
t al.,J.Am.Chem.Soc.,120,10575−10582
(1998))。従って、血球凝集アッセイ(Osawa et al.,Me
thods Enzymol.,28,323−327(1972))は、2つ
の別個の調製方法から生じた材料の活性を評価するための簡便な形式を提供する
【0093】 従来のプロトコルおよびPSMプロトコルにより生成された異なる材料のCo
n A阻害効力を、一価のα−メチルマンノピラノシドを標準として使用して、
糖残基ベースで比較した。単一の系列内で、ポリマー6または7のいずれでも、
最も有効なオリゴマーは、50:1のモノマー対開始剤比を使用して得られたオ
リゴマーであった(図11)。この結果は、最も有効なインヒビターがCon
A上の2つの糖結合部位にわたることを明らかにした以前の研究と一致する(K
anai et al.,J.Am.Chem.Soc.,119,9931−
9932(1997);and Mann et al.,J.Am.Chem
.Soc.,120,10575−10582(1998))。各M:1比にお
いて、PSMオリゴマーは、エマルジョン条件下で調製されたオリゴマーよりわ
ずかに活性であった。例えば、α−メチルマンノピラノシドを超える400倍の
増加が、エマルジョン重合において50:1のモノマー−開始剤比から誘導され
たポリマーについて見られたが、重合後修飾条件下で作製された関連材料につい
て、550倍の増大が見出された。以前に研究されたノルボルネンイミドマンノ
ースポリマーで見られた効果の大きさは、本願で見られた効果の大きさより大き
かった。この結果は、還元されたノルボルネンイミドマンノースポリマーについ
て見られた結果と類似する。このことは、現在の骨格の配向におけるより高いエ
ントロピーコストに起因し得、この骨格は、二環式ノルボルネンイミドテンプレ
ートより堅固でない。より長いオリゴマーがより活性なインヒビターであるので
、この発見は、PSMオリゴマーの平均長がエマルジョン重合条件下で生成され
た材料の平均長を超えることを示すGPCデータと一致する。全体として、これ
らのデータは、PSMプロトコルを使用して、標準的ROMPアプローチにより
生成される物質から生じる効力に匹敵するかまたはその効力を超える効力を有す
る生物学的活性材料を合成し得る。
【0094】 末端官能基を導入するためのストラテジーを試験するために、二官能性キャッ
ピング剤18(図12)を、マスクされたカルボン酸をリビングポリマー鎖上に
組込むために設計した。標的分子は、エチレングリコールリンカーを介して保護
カルボン酸に連結されるエノールエーテルを含む。β−トリメチルシリル(TM
S)エチルカルボン酸保護基は、2つの目的に役立つ。第1に、1H NMRス
ペクトルにおけるTMS基の明確なシグナルは、キャッピング有効性の評価を提
供し;そして第2に、β−TMSエチル基は、この研究において使用される硫酸
炭化水素認識エピトープに影響しない条件下で除去され得る。さらに、カルボン
酸は、さらなる官能化のために容易に、選択的に、かつ高効率で活性化され得る
。標的キャッピング剤18は、トリエチレングリコールから6段階で容易にアセ
ンブルされ得る。
【0095】 エノールエーテル18のROMP反応を終結する能力を、異なる特性を有する
3つのモノマーの反応において評価した。18の反応性を標準的な条件下で確か
めるために、非極性モノマー11をROMPに供し、そして過剰の化合物18を
この反応を終結させるために導入した(図12)。1H NMRデータから、触
媒から組み込まれたフェニルプロトンの積分値を、TMS基プロトンと比較する
ことにより、生じたポリマー鎖の約80%がキャップされて材料19を与えたこ
とを明らかにした。高極性置換基を有するポリマーを末端標識する最初の試みは
、キャッピング反応がこれらの基質に対してあまり有効でないことを明らかにし
た。具体的には、極性化合物13のオリゴマー化に必要なエマルジョン条件を使
用した場合、エノールエーテル18を用いる反応終結は、21aを生じ、これが
有用ではあるがより低いキャッピング効率(30%)で生成した(図12)。相
間移動プロセスから生じる複雑さを最小にするために、極性の官能化ポリマー2
1bを生成するための代替のストラテジーを使用した。N−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを含むポリマー(例えば、20)を、ROMPを使用して有機溶
媒中でアセンブルし得る。生じた材料を求核剤で処理することにより、続いて重
合後修飾し、新しい置換ポリマーを生成する。メチルエステル11の反応からの
生成物のように、13の反応から得られたポリマー20は、キャッピング剤18
を用いて約80%の効率で終結され得る。次いでポリマー20は、アミン含有糖
部分にカップリングされ、3,6−ジスルホガラクトース誘導体21bを与える
。材料21bの精製後、NMRスペクトルデータにおいて、ポリマー21aおよ
び21bは、キャッピング剤から生じるシグナルの積分値の差以外は、実質的に
は区別がつかなかった。単相の均一系反応条件は、エマルジョン重合条件よりも
、より高いキャッピング収率をもたらすと考えられる。なぜならば、出発物質お
よび生成物の溶解度は、ポリマーアセンブリおよび終結における種々の段階の相
対速度に強く影響するからである。
【0096】 生物学における多価認識事象の重要性およびこのようなプロセスの特徴を解明
する際の多価アレイの有用性は、レポーター基を備えた多座リガンドを生成する
ための合成方法の開発を加速した。例えば、アクリルアミド共重合は、糖認識エ
レメントおよびレポーター基を組込み得、そしてこのストラテジーは、タンパク
質―炭水化物相互作用をアッセイするための材料を開発するために使用されてき
た。あるいは、所望の官能性タグを予め形成されたポリマー骨格にカップリング
させることによるか、単一の当量のタグを使用することにるか、または多価骨格
にカップリングする前にレポーター基を各モノマーに結合することのいずれかに
より、レポーター基を有するポリマーを生成した。報告された合成経路では、多
価アレイに組込まれるポリマー鎖の長さまたはレポーター基の数を制御すること
ができない。
【0097】 電子リッチなアルケンを付加することに加えて、ポリマー鎖は、末端金属カル
ベンの酸化を介して官能基でキャップされ得る。例えば、活性金属カルベン中心
が生長鎖の末端に存在するポリマーを酸素に暴露することにより、ポリマー鎖上
に末端アルデヒドを生じる。このストラテジーをエノールエーテル11で記載さ
れるだけの方法と並行して探索する。硫酸ガラクトースモノマー23を、ROM
P触媒14に供し、モノマーの消費後に、反応系を空気に解放してポリマー25
を得る(図8)。このアプローチは、酸素での効率的なキャッピングおよび続く
ヒドラゾン、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミンの形成に依存する。この方
法は、より少ない工程を使用して、最終生成物を得るが;しかし、キャッピング
効率は、ポリマー19、20ならびに21aおよび21bの場合よりもモニタリ
ングすることが困難である。
【0098】 単一のレポーターの選択的取込みのための本発明の合成スキームの有用性を実
証するために、末端標識されたネオグリコポリマーを蛍光性レポーター基に末端
標識を介してカップリングした。これらの蛍光性ネオグリコポリマーを、ポリマ
ーと細胞表面L−セレクチンとの相互作用の研究を可能にするために設計した。
【0099】 L−セレクチン(細胞接着分子のセレクチンファミリーのメンバー)は、組織
損傷部位への白血球の漸増を促進する。21aに関連する、特定の硫酸糖質含有
ネオグリコポリマーは、セレクチン機能の強力なインヒビターである。これらの
ネオグリコポリマーは、細胞表面上のL−セレクチンに結合することによりタン
パク質機能を阻害すると考えられる。21aおよび25を、レポーターリガンド
22および27にそれぞれ変換することにより、細胞表面L−セレクチンに結合
するネオグリコポリマーは、直接調べられ得る。
【0100】 22の生成の最初の工程は、β−トリメチルシリルエチルエステルの鹸化によ
るカルボン酸の非マスク化に関与する(図12)。フルオレセイン誘導体(5−
((5−アミノペンチル)チオウレイジル)フルオレセインまたはフルオレセイ
ンカダベリン)を、アミド結合形成を介して結合した。生じた結合体をサイズ排
除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーにより単離して、
フルオレセイン修飾オリゴマー22を得た。ポリマー25を、直接、5−(((
2−(カルボヒドラジノ)メチル)チオ)アセチル)アミノフルオレセイン)(
ヒドラジンフルオレセイン誘導体26)に供し、所望のフルオレセインタグ化ポ
リマー27を得た(図13)。
【0101】 ポリマー22および27のJurkat細胞(ヒト急性T細胞白血病株)に結
合してL−セレクチンを表示する能力を、蛍光顕微鏡を使用して調べた(図12
)。比較のために、細胞を、L−セレクチンに対するフルオレセイン結合体化抗
体で標識した。抗体およびポリマーの両方が、局在化部位で細胞に結合し、同様
な斑点状の蛍光パターンを生じた。観測されたパターンは、L−セレクチンが白
血球表面上に任意には分布しないが、微小絨毛と称する細胞の特定の領域に局在
する。結合は、細胞表面L−セレクチンの存在に依存し、蛍光性ポリマーも抗L
−セレクチン抗体も、L−セレクチン欠乏細胞(HL60細胞株、データは示さ
れない)への結合が観察されなかった。同様の結果が、アルデヒドキャップポリ
マー27で見られた(図14)。
【0102】 これらの結果は、ネオグリコポリマーが細胞表面上のL−セレクチンに特異的
に結合するということを示唆する。リガンド22が非特異的に結合する場合、全
体的な細胞表面の染色が予測される。さらに、さらなる顕微鏡研究は、これらの
糖タンパク質ミミックの有意な生物学的活性が、多価接触を介して媒介されると
いうことを示唆する。このデータは、視覚化細胞表面認識事象についてのプロー
ブ22および27の有用性を強調する。
【0103】 本発明の目的および利点は、以下の実施例によりさらに例示されるが、これら
の実施例に引用される特定の材料およびその量、ならびに他の条件および詳細は
、過度に本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【0104】 (実施例) 材料:ビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ベンジリデンルテニウム(IV
)ジクロリドを、Strem Chemicals,Inc.(Newbury
port,MA)から得た。5−((5−アミノペンチル)チオウレイジル)フ
ルオレセイン(フルオレセインカダベリン)を、Molecular Prob
es(Eugene,OR)から購入した。細胞培養培地RPMI 1640お
よびウシ胎児血清をGibco BRL(Gaithersburg,MD)由
来であった。ペニシリン、ストレプトマイシン、L−グルタミン、およびピルビ
ン酸ナトリウムは、Sigma(St.Louis,MO)由来であった。フル
オレセイン標識抗L−セレクチン抗体(DREG−56)を、Pharming
en (San Diego,CA)から購入した。VectaShieldは
Vector Laboratories(Burlingame,CA)由来
であった。他に特定されない限り、全ての他の試薬は、Aldrich Che
mical Co.,Milwaukee,WIから購入した。全ての溶媒は、
Aldrich Chemical Co.またはFisher Scient
ific,Pittsburgh,PAのいずれかから購入した。
【0105】 一般的方法:全ての非水性反応を、オーブン乾燥したガラス器具中で、窒素雰
囲気下にて行った。反応溶媒をナトリウム/ベンゾフェノン(テトラヒドロフラ
ン)、水素化カルシウム(ジクロロメタン、トリエチルアミン、ジクロロエタン
)から蒸留するか、または4Å型モレキュラーシーブから減圧蒸留した(DMS
O)。ACSグレードの1,2−ジクロロエタン(DCE)を、Aldrich
Chemical Co.,Milwaukee,WIから受け取ったまま使
用した。重合反応で使用した溶媒を、使用前に少なくとも3回の凍結−排気−解
凍サイクルで脱酸素した。蒸留脱イオン(ddまたはMQ)水および500MW
CO透析管(Fisher Scientific,Pittsburgh,P
A)を、ポリマー精製に使用した。クロマトグラフィー溶媒は、ACSグレード
であり;ジクロロメタン、アセトン、およびヘキサンは蒸留した。ドデシルトリ
メチルアンモニウムブロミド(DTAB)を、アセトンから再結晶した。0.2
5mmのプレコートMerck Silica Gel60 F254(VWR
Scientific,So.Plainfield,NJ)での薄層クロマト
グラフィー(TLC)により、紫外光、p−アニスアルデヒド染色(15ml
p−アニスアルデヒド、10ml 酢酸、10ml硫酸、350mlエタノール
)、または過マンガン酸カリウム染色(3g KMnO4、20g K2CO3
5mlの5%水性NaOH、200ml水)で可視化して、反応をモニタリング
した。蒸留した試薬グレードのヘキサンおよびジクロロメタンならびにACSグ
レードの酢酸エチル、メタノール、およびクロロホルムを使用して、フラッシュ
カラムクロマトグラフィーを、Merck Silica Gel 60(23
0−400メッシュ,Scientific Adsorbents Inc.
,Atlanta,GA)で行った。酸に敏感な化合物を扱う場合、クロロホル
ムおよびジクロロメタンを、使用直前に塩基性アルミナを通して濾過することに
より中和した。赤外スペクトルをMattson FTIR分光計で記録した。
Micromass Autospec Mass Spectrometer
での、液体二次イオン質量分析法(LSIMS)(添加したヨー化ナトリウムを
含む3−ニトロ安息香酸(3−NBA+NaI)マトリックス)により、質量分
析データを得た。1H NMRおよび13C NMRスペクトルを、Bruker
AC−300分光計で記録し、そして残留溶媒ピーク(CDCl31H:δ7
.24、13C:δ77.0;D2O:1H:δ4.67)またはCDCl3中のテ
トラメチルシラン内部標準(1H:δ0.00)を参照にする。NMR溶媒をC
ambridge Isotope Laboratories,Inc.,A
ndover,MAから得た。1H−1Hカップリングを1次と仮定し、そしてピ
ーク多重度を、s(一重線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、m
(多重線)、またはb(幅広)として報告する。
【0106】 ビシクロ[2,2,1]ヘプタ−5−エン−exo−2−カルボン酸N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル(図2の化合物1)の調製:ノルボルネン酸(1
51.8mg,1.1mmol、Ver Nooy et al.,J.Am.
Chem.Soc.,77,3583−3586(1955)の方法に従って調
製)、N−ヒドロキシスクシンイミド(172.5mg,1.49mmol、A
ldrichから得られた)、およびEDCI(1−(3−ジメチルアミノプロ
ピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩、278.1mg、1.45mmol
、Aldrichから得られた)を、CH2Cl2(3.6mL、Aldrich
から得られた)中一晩窒素下で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣を
、Still,J.Org.Chem.,43,2923(1978)の手順に
従って、溶媒としてCH2Cl2を用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ
ーにかけた。白色固体を単離した(186.7mg、0.88mmol)。収率
80%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ6.19(dd,J=5
.7,2.9Hz,lH),6.17(dd,J=5.7,3.1Hz,1H)
,3.25(br s,1H),2.98(br s,1H),2.82(d,
J=1.65Hz,2H),2.49(ddd,J=10.48,4.78,1
.65Hz,1H),2.03(ddd,J=11.95,4.23,4.2H
z,1H),1.55−1.41(m,3H).EI m/z 235.018
47[235.2395,C1213NO4についての計算値]。
【0107】 ビシクロ[2,2,1]ヘプタ−5−エン−exo−2−カルボン酸N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル(図2の化合物3)(n=10)の重合:N−ヒ
ドロキシエステル(98.3mg、0.425mmol)1を、1,2−ジクロ
ロエタン(DCE)(2.1mL)に溶解した。これに、[(Cy)3P]2Cl 2 Ru=CHPh(Strem,Newburyport,NH)の脱酸素DC
E(2.1mL中35mg)溶液を加えた。この反応系を窒素下で室温にて45
分間攪拌した。TLCにより反応が完了したと思われ、そして過剰のエチルビニ
ルエーテルをキャッピングのために加えた。反応混合物をCH2Cl2を溶離液と
して用いてシリカゲルの小さい栓を通して濾過した。溶媒を減圧下で除去して、
褐色固体(96.8mg)を得、これをさらに精製することなく使用した。収率
98%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.3(m),5.7−
5.2(m),3.5−0.90(br m)。
【0108】 アミノエチル−α−D−マンノピラノシド(図2の化合物4)の調製:アジド
エチルマンノシドを、Chernyak et al.,Carbohyd.R
es.,223,303−309(1992)の手順に従って、わずかに改変し
て調製した。アジドエタノールをアリルアルコールの代わりに用い、そしてグリ
コシル化条件をLee et al.,Carbohyd.Res.,37,1
93−201(1974)に記載されるように使用した。アジドエチルマンノシ
ドを、1;1のメタノール:水中でPearlmann触媒(Aldrich)
を用いて還元して4を得た(上記の手順の改変)。
【0109】 アミノエチル−α−D−マンノピラノシルビシクロ[2,2,1]ヘプタ−5
−エン−exo−2−カルボキサミド(化合物5、図2)の調製:マンノースモ
ノマー5をペンタフルオロフェニルエステルおよび化合物4を介して、Mann
ing et al.,Tetrahedron,53,11937−1195
2(1997)に以前に記載される手順により調製した。1H NMR(300
MHz,D2O):δ6.19(dd,J=5.7,2.9Hz,1H),4.
694(d,J=1.65Hz,1H),3.76(dd,J=2.94,1.
83,1H),3.70(dt,J=12.32,1.9Hz,1H),3.6
4−3.41(m,6H),3.29(br m,1H),2.76(br m
,1H),2.03(m,1H),1.57(m,1H),1.35−1.17
(m,3H).EI m/z 343.1627[343.377,C1625
7についての計算値]。
【0110】 ビシクロ[2,2,1]ヘプタ−5−エン−exo−2−カルボン酸N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルの重合の生成物(図2の化合物6(n=10))
へのカップリング:0.35mLジメチルホルムアミド(DMF)中のアミノエ
チルマンノシド4(16.0mg,0.0788mmol)、N−メチルモルホ
リン(7.7μl、0.0702mmol,Aldrich)およびポリマー3
(n=10,15.2mg,0.0647mmol)を24時間攪拌した。ジイ
ソプロピルカルボジイミド(DIC,11μL、0.0638mmol、Ald
rich)を加え、そして攪拌を一晩続けた。DMFを減圧下で除去し、そして
生じた固体を1〜2mLのCH2Cl2で3回、そして1〜2mLのエタノールで
3回洗浄した。この固体を乾燥し、そして(トリメチルシリル)ジアゾメタン(
TMSCHN2,35μL,0.0702mmol,Aldrich)およびメ
タノール(350μL)を加え、そしてこの反応系を一晩攪拌した。反応を水を
加えてクエンチし、そして溶媒を減圧下で除去した。この固体をMQ水に溶解し
、そして透析管中に置いた。このサンプルを透析(48時間、4回の水交換、各
回1L)して、カップリング反応からの不純物および未反応の4を除去した。こ
の溶液を0.25ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして溶媒を減圧下で
除去して、褐色固体を得た(15.4mg、71%)。1H NMR(300M
Hz,D2O):δ7.3(br m,0.278H),5.5−4.9(br
,2H),4.0−3.0(br m,14H),2.5−2.15(br m
,2H),1.9−1.4(br,2H),1.1−0.9(br,2H)。
【0111】 アミノエチルα−D−マンノピラノシルビシクロ[2,2,1]ヘプタ−5−
エン−exo−2−カルボキサミド(図2の化合物7(n=10))の重合:マ
ンノースモノマー5(19.6mg,0.0571mmol)およびDTAB(
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド,29mg,0.0933mmol、
Aldrich)を水(182μL)に溶解して脱気した。DCE(181μL
)をルテニウム触媒2(6.1mg)に加え、そしてこの溶液(91μLが2の
4.7mg,0.00571mmolに対応する)を5の溶液に加えた。この反
応系を室温で30分間攪拌し、次いで60℃に4時間加熱した。一旦、TLCに
より反応が完結すれば、過剰のエチルビニルエーテルを加えて活性カルベンをク
エンチした。この反応混合物を減圧下でエバポレートし、そして固体をジクロロ
メタンおよびエタノールで洗浄した。このポリマーをMQ水に溶解し、1Lの水
に対して2日間透析し、水を12時間ごとに換えた。この溶液を透析管から除去
し、そして0.25ミクロンのフィルターを通してろ過し、減圧下で溶媒を除去
した後、褐色固体(18.2mg)を得た。収率90%。1H NMR(300
MHz,D2O):δ7.3(br m,0.238H),5.5−4.9(b
r,2H),4.0−3.0(br m,14H),2.5−2.15(br
m,2H),1.9−1.4(br,2H),1.1−0.9(br,1H)。
【0112】 (キャッピング剤の固体支持体上での合成(図8B−1)) 4−ペンタン酸(1.0mL,9.8mmol,1当量)、K2CO3(6.7
8g,49mmol,5当量)、ベンジルブロミド(1.4mL,11.8mm
ol,1.2当量)およびヨー化テトラブチルアンモニウム(0.254g,0
.686mmol、0.07当量)を約50mLの乾燥アセトン中で合わせた。
この反応系を窒素下で3時間攪拌した。TLC(9:1、ヘキサン/酢酸エチル
)は、出発物質以外示さなかった。この反応物を濾過し、そして溶媒を減圧下で
除去した。残渣を酢酸エチルに溶解し、そして1M HCl、飽和NaHCO3
、およびブラインで続けて洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、そして減圧
下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(30:1 ヘキサン/酢
酸エチル(ベンジルブロミドが溶出されるまで)〜1:1 ヘキサン/酢酸エチ
ルの溶媒を使用する)を使用して、生成物(1.8g,9.5mmol,収率9
7%)を単離した。
【0113】 4−ペンタン酸ベンジル(1.86g,9.8mmol、1当量)を、約50
mLのCH2Cl2に加え、そして−78℃に冷却した。窒素をこの溶液に約20
分間通気した。次いでオゾンを溶液が過剰のオゾンを示す淡青色に変るまで通気
した。窒素をこの溶液に5分間通気し、次いでトリフェニルホスフィン(6g、
22.5mmol,2.3当量)をこのフラスコに加えた。この混合物を約30
分間攪拌した。冷浴を取り外すと、濁った溶液は、反応系が室温まで昇温するに
つれて透明になった。TLC(2:1 ヘキサン/酢酸エチル)は、出発物質を
示さなかった。勾配カラム(トリフェニルホスフィンが溶出するまでヘキサン、
次いで、9:1 ヘキサン/酢酸エチルから6:1 ヘキサン/酢酸エチルの勾
配)を使用して生成物(1.7g,9.1mmol、収率93%)を単離した。
【0114】 Ph3PCH2OMeCl(6.24g,18.2mmol,2当量)をトルエ
ンと共沸させて水を除去した。無水エーテルを、Ph3PCH2OMeClを含む
フラスコに加え、この溶液を氷浴中で冷却し、95%カリウムt−ブトキシド(
1.94g、16.4mmol、1.8当量)を加え、そしてこの溶液を5分間
、赤色が維持している間攪拌した。β−ホルミル−プロピオン酸ベンジルエステ
ル(1.7g、9.1mmol,1当量)のエーテル溶液を、約5分間かけて滴
下した。溶液は橙色に変化し、そして反応は、氷浴中で30分間攪拌した後TL
C(9:1 ヘキサン/酢酸エチル)により完了した。ブラインを添加し、そし
て反応系をさらに5分間室温で攪拌した。相を分離し、そして水層を3回エーテ
ルで抽出した。エーテル層を合わせて、MgSO4で乾燥し、そして減圧下で濃
縮した。30:1 ヘキサン/酢酸エチル〜20:1 ヘキサン/酢酸エチルの
勾配を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物(0.65g、2
.9mmol,収率32%)を得た。
【0115】 5−メトキシ−4−ペンタン酸ベンジル(70mg、0.318mmol、1
当量)をTHFに溶解した。水性KOHの0.5mM溶液(0.76mL、0.
382mmol,1.2当量)を加え、そしてこの反応系を1時間攪拌した。T
LC(9:1 ヘキサン/酢酸エチル)は、出発物質を示さなかった。生成物の
カリウム塩を得た(27.9mg、0.214mmol、収率67%)。この塩
をメタノールに溶解し、そしてAmberlyst15強酸樹脂を加えて溶液を
中和した。この反応系を濾過し、そしてメタノールを減圧下で濃縮して、所望の
生成物(24.7mg,0.19mmol、収率89%)を得た。
【0116】 Amberlyst15強酸樹脂を、以下の溶媒の各々で2回、以下の順序で
洗浄することにより調製した:メタノール、水、1M NaOH、水、エタノー
ル、6M HCl、水、エタノール、メタノール。
【0117】 Hydroxyethyl−Photoliker Novasyn TG樹
脂(0.26mmol/g樹脂充填、30mg、0.0078mmol、1当量
)、5−メトキシ−4−ペンテン酸(1.8mg、0.0135mmol、1.
7当量)、ジイソプロピルカルボジイミド(2.5μL、0.0162mmol
、2.1当量)、およびDMAP(0.5mg、0.0045mmol、0.6
当量)を、0.5mLのアミンを含まないDMF中で混合した。この反応物を光
から保護し、そして4日間攪拌した。遊離のヒドロキシル基についてのスポット
テストを、結合体化効率を決定するために使用した(Kuisle,O.;Lo
lo,M.;Quinoa,E.;Riguera,R.Tetrahedro
n,55,14807−14812(1999))。樹脂(約1mg)をピペッ
トによってこの反応物から取り出し、そしてTLCプレート上に置いた。トルエ
ン中の0.03Mのp−TsCl溶液(2滴)およびトルエン中の0.075M
の4−p−ニトロベンジルピリジン溶液(2滴)を添加した。このプレートを、
橙色が完全に消失するまで加熱した。CHCl3中の10%ピペリジン溶液(2
滴)をこのプレートに添加し、そして乾燥させた。スミレ色または桃色の発色は
なく、これはこの反応が完了したことを示す。この樹脂を塩化メチレンおよびエ
タノールで数回洗浄し、そして回収した(27mg)。
【0118】 赤血球凝集アッセイ:このアッセイを、Kanaiら、J.Am.Chem.
Soc.,119,9931−9932(1997)およびその参考文献に以前
に記載されるように行った。このアッセイにおいて使用したポリマーサンプルの
濃度を、既知濃度のNaOAc外部サンプルを用いて、5.25ppmのピーク
1H NMR積分によって決定した。
【0119】 (二官能性キャッピング剤18の合成)
【0120】
【化24】 (2−(2−(2−ベンジルオキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール)
【0121】
【化25】 50%水性NaOH(5.3mL)中のトリエチレングリコール(8.9mL
,66.6mmol)の溶液にベンジルブロミド(7.9mL,66.6mmo
l)を添加し、そしてこの混合物を室温で24時間攪拌した。この反応物をH2
O(75mL)で希釈し、そしてEt2O(4×100mL)で抽出した。合わ
せた有機抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濃縮し、そしてフラッシュカラムクロ
マトグラフィー(シリカ,EtOAc)によって精製して、2−(2−(2−ベ
ンジルオキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール(6.14g,38%)を得た
。Rf=0.6(EtOAc);IR(ニート):3500−3400,290
0−2700,1751,1633,1613,1453,1349,1246
,1100,1069cm-11H NMR(300MHz,CDCl3):δ7
.35−7.26(m,5H),4.57(s,2H),3.73−3.59(
m,12H),2.50(b,1H);13C NMR(75MHz,CDCl3
):δ138.1,128.4,127.8,127.7,73.3,72.6
,70.7,70.6,70.4,69.4,61.7。
【0122】 (10−フェニル−3,6,9−トリオキサデカン酸)
【0123】
【化26】 三酸化クロム(3.33g,33.30mmol)を1.5MのH2SO4(4
.4mL)に0℃で添加した。アセトン(110mL)中の2−(2−(2−ベ
ンジルオキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール(2.00グラム,8.32m
mol)の溶液を添加し、そしてこの反応物を室温で5時間攪拌した。この溶液
をEt2O(5×100mL)で抽出し、そして合わせた抽出物を飽和NaCl
(3×50mL)で洗浄し、そして濃縮して20mLの体積にした。5%NaH
CO3(2×20mL)での抽出に続いて、この水性抽出物を濃HClでpH=
2まで酸性化し、そしてこの水溶液をEt2O(3×50mL)で逆抽出した。
合わせた有機抽出物を飽和NaCl(3×20mL)で洗浄した。濃縮して10
−フェニル−3,6,9−トリオキサデカン酸(1.71g,81%)を得た。
f=0.1−0.4(10% MeOH/CH2Cl2);IR(ニート):3
500,3453,2900−2700,1751,1739,1629,16
14,1453,1353,1245,1204,1120,1100,102
6cm-11H NMR(300MHz,CDCl3):δ10.06,(b,1
H),7.35−7.25(m,5H),4.57(s,2H),4.17(s
,2H),3.77−3.60(m,8H);13C NMR(75MHz,CD
Cl3):δ138.1,128.4,127.8,127.7,73.3,7
2.6,70.7,70.6,70.4,69.4,61.7。
【0124】 (10−フェニル−3,6,9−トリオキサデカン酸2−(トリメチルシリル
)エチルエステル)
【0125】
【化27】 10−フェニル−3,6,9−トリオキサデカン酸(1.71g,6.71m
mol)をCH2Cl2(13.4mL)に溶解させ、そしてこの溶液を0℃まで
冷却した。1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩
酸塩(EDCl)(1.41g,7.38mmol)およびN,N−ジメチルア
ミノピリジン(DMAP)(41.0mg,0.34mmol)を添加し、そし
てこの懸濁液を0℃で10分間攪拌した。2−(トリメチルシリル)エタノール
(872.4mg,7.38mmol)を、シリンジを介して滴下し、そしてこ
の溶液を室温まで温める間に20分間攪拌した。この反応をH2Oでクエンチし
、そしてEt2O(3×50mL)で抽出した。合わせたEt2O抽出物を、10
%HCl(1×50mL)、5%NaHCO3(1×50mL)、および飽和N
aCl(1×50mL)で連続して洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥させた。濃
縮に続いくフラッシュクロマトグラフィー(シリカ,4:1 ヘキサン/EtO
Ac)によって、10−フェニル−3,6,9−トリオキサデカン酸2−(トリ
メチルシリル)エチルエステル(2.32g,収率97%)を得た。Rf=0.
26(4:1 ヘキサン/EtOAc);IR(ニート):3500−3400
,3000−2700,1751,1733,1615,1455,1250,
1148,1124cm-11H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.
32−7.23(m,5H),4.54(s,2H),4.24−4.18(m
,2H),4.10(s,2H),3.72−3.59(m,8H),1.01
−0.95(m,2H),0.01(s,9H);13C NMR(75MHz,
CDCl3):δ170.5,138.2,128.3,127.6,127.
5,73.2,70.8,70.6,69.4,68.8,63.0,17.3
,−1.6;LRMS(LSIMS,3−NBA):m/z 377.2[M+
Na+,C18305NaSiについての計算値377.5]。
【0126】 (3,6−ジオキサ−8−ヒドロキシ−オクタン酸2−(トリメチルシリル)
エチルエステル)
【0127】
【化28】 無水EtOH(14mL,AAPER Alcohol and Chemi
cal Co.,Shelbyville,KY)中の10−フェニル−3,6
,9−トリオキサデカン酸2−トリメチルシリル(エチル)エステル(500m
g,1.4mmol)の溶液に、20%Pd(OH)2/C(100mg,Al
drich)を添加した。この溶液を50psiのH2下で6時間振盪し、CE
LITEのパッドを通して濾過(溶出剤EtOH)し、そして減圧下で濃縮して
3,6−ジオキサ−8−ヒドロキシ−オクタン酸2−トリメチルシリル(エチル
)エステル(284.4mg,77%)を得た。Rf=0.29(2:1 Et
OAc/ヘキサン);IR(ニート):3500−3400,2952,289
4,2872,1750,1629,1615,1456,1428,1250
,1200,1148,1124,1064cm-11H NMR(300MH
z,CDCl3):δ4.26−4.19(m,2H),4.11(s,2H)
,3.75−3.59(m,8H),2.65(b,1H),1.02−0.9
5(m,2H),0.02(s,9H);13C NMR(75MHz,CDCl 3 ):δ170.6,72.4,70.8,70.2,68.6,63.2,6
1.5,17.3,−1.6;LRMS(LSIMS,3−NBA):m/z
287.1[M+Na+,C11245NaSiについての計算値287.4]。
【0128】 (3,6−ジオキサ−8−アール−オクタン酸2−(トリメチルシリル)エチ
ルエステル)
【0129】
【化29】 3,6−ジオキサ−8−ヒドロキシ−オクタン酸2−トリメチルシリル(エチ
ル)エステル(250mg,0.95mmol)をCH2Cl2(4.7mL)中
に溶解させ、そしてこの溶液を0℃まで冷却した。ジメチルスルホキシド(13
5μL,1.9mmol)をシリンジを介して添加し、続いて固体のP25を素
早く添加した。0℃で30分後、Et3N(460μL,3.3mmol)を添
加し、そしてこの反応物を0℃で30分間攪拌した。この反応を10%HCl(
10mL)でクエンチし、そしてCH2Cl2(3×20mL)で抽出した。合わ
せた有機抽出物をH2O(1×25mL)および飽和NaCl(1×25mL)
で洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィー(シ
リカ,1:1 ヘキサン/EtOAc)による精製によって、生成物(216.
0mg,82%)を得た。Rf=0.29(1:1 ヘキサン/EtOAc);
IR(ニート):3500−3400,2957,2922,2854,174
9,1734,1646,1456,1260,1098cm-11H NMR
(300MHz,CDCl3):δ9.71(s,1H),4.25−4.19
(m,2H),4.16(d,J=0.7Hz,2H),4.10(s,2H)
,3.75(s,4H),1.01−0.96(m,2H),0.02(s,9
H);13C NMR(75MHz,CDCl3):δ200.6,170.4,
76.8,71.2,71.0,68.8,63.2,17.4,−1.5;L
RMS(LSIMS,3−NBA):m/z 285.1[M+Na+,C112 25NaSiについての計算値285.4]。
【0130】 (3,6,10−トリオキサ−8,9−エン−ウンデカン酸2−(トリメチル
シリル)エチルエステル)
【0131】
【化30】 THF(2.0mL)中の(メトキシメチル)トリフェニルホスホニウムクロ
リド(117.6mg,0.34mmol)の懸濁液に、0℃でカリウムter
t−ブトキシド(36.3mg,0.30mmol)を添加した。この暗赤色溶
液を0℃で5分間攪拌した。3,6−ジオキサ−8−アール−オクタン酸2−ト
リメチルシリル(エチル)エステル(42.5mg,0.16mmol)を、T
HF(160μL)中の1M溶液として滴下し、この間にこの溶液は暗赤色から
淡黄色に変化した。この反応を飽和NaCl(5mL)でクエンチし、そしてE
2O(3×15mL)で抽出した。合わせたEt2O抽出物をH2O(1×20
mL)で洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥させた。濃縮に続くフラッシュクロマ
トグラフィー(シリカ,9:2 ヘキサン/EtOAc)によって、3,6,1
0−トリオキサ−8,9−エン−ウンデカン酸2−トリメチルシリル(エチル)
エステル18(27.9mg,59%)を得た。Rf=0.21(5:1 ヘキ
サン/EtOAc);IR(ニート):2952,2932,2898,286
0,1752,1732,1660,1457,1251,1214,1197
,1176,1147,1102,859,838cm-11H NMR(50
0MHz,CDCl3):δ6.52(d,J=13.1Hz,1H),6.0
0(dt,J=6.5,1.1Hz,1H),4.87(dt,J=12.5,
7.5Hz,1H),4.53(td,J=7.0,6.5Hz,1H),4.
24−4.17(m,4H),4.10(s,2H),4.09(s,2H),
4.07(dd,J=7.3,1.2Hz,2H),3.92(dd,J=7.
4,0.9Hz,2H),3.71−3.54(m,8H),3.58(s,3
H),3.53(s,3H),1.01−0.94(m,4H),0.01(s
,18H);13C NMR(75MHz,CDCl3):δ170.6,170
.5,151.5,149.1,102.7,98.7,70.9,70.9,
69.0,68.8,68.7,68.5,63.8,63.0,59.8,5
5.9,17.4,−1.6;LRMS(LSIMS,3−NBA):m/z
313.2[M+Na+,C13265NaSiについての計算値313.4]。
【0132】 (ポリマー9の合成)
【0133】
【化31】 1,2−ジクロロエタン(DCE)を、4回の凍結−吸引−解凍(FPT)サ
イクルによって脱酸素した。DCE(100μL)中のルテニウム触媒14の溶
液を、DCE(400μL)中のノルボルネンモノマー11(15mg,0.1
0mmol)の溶液に添加した。この赤色混合物を室温で30分間攪拌した。キ
ャッピング剤18(30μL)をニートで添加し、そしてこの反応物を室温で1
8時間攪拌した。この混合物を濃縮し、少量のCH2Cl2に溶解させ、そしてシ
リカゲルの短いパッドを通して濾過して過剰のキャッピング剤18を除去した。
残った物質をこのシリカゲルからEtOAcで溶出し、そしてこの溶液を濃縮し
て乾燥させた。透明な固体の物質をヘキサン(3×)で洗浄し、そして乾燥させ
てポリマー19(9.6mg,64%)を得た。
【0134】 (ポリマー20の合成)
【0135】
【化32】 DCEを4回の凍結−吸引−解凍サイクルで脱酸素した。DCE(40μL)
中のルテニウム触媒14(3.3mg,0.004mmol)の溶液を、DCE
(280μL)中のノルボルネンモノマー12(15mg,0.064mmol
)の溶液に添加した。この混合物を室温で30分間攪拌した。キャッピング剤1
8(13.5μL)をニートで添加し、そしてこの反応物を室温で18時間攪拌
した。この混合物を濃縮し、少量のCH2Cl2に溶解させ、そしてシリカゲルの
短いパッドを通して濾過して、触媒由来の不純物および過剰のキャッピング剤を
除去した。この溶液を減圧下で濃縮し、そしてこれを精製なしで3,6−ジスル
ホガラクトースアミンとのカップリングに使用した。
【0136】 (ポリマー21bの合成)
【0137】
【化33】 ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(5μL,0.032mmol)を
、DMF(320μL)中のポリマー20(7.5mg)の溶液に添加した。(
2−アミノエチル)−3,6−O−ジスルホ−β−D−ガラクトピラノシド(1
6.7mg,0.048mmol)を、H2O(48μL)中の1M溶液として
添加し、そしてEt3N(8.9μL,0.064mmol)を添加した。この
反応物を室温で約40時間攪拌し、次いでH2O(約1mL)で希釈した。この
水溶液をCHCl3(3×2mL)で抽出し、そして減圧下で濃縮した。残渣を
MeOH(3×2mL)で洗浄して、ネオグリコポリマー(neoglycop
olymer)21bを得た。
【0138】 (フルオレセイン標識ネオグリコポリマー22の合成)
【0139】
【化34】 (ポリマー21aの合成) 別々の反応容器において、ジクロロエタン(DCE)、および3,6−ジスル
ホガラクトースモノマー13のナトリウム塩(15mg,0.027mmol)
、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)(13.5mg,0.
044mmol)、および2,2−ビス(ヒドロキシメチル)−2,2’,2”
−ニトリロトリエタノール(ビス−トリス)緩衝液(91μL,100mM,p
H5.9)の溶液を、この溶液の各々を4回の凍結−吸引−解凍(FPT)サイ
クルに供することによって脱酸素した。脱酸素したジクロロエタン(45μL)
を、窒素下でルテニウムメタルカルベン14(1.5mg,0.0018mmo
l)を含むバイアルに入れ、そしてこの紫色溶液を、モノマーおよびDTABの
緩衝溶液を含む反応容器に添加した。この反応物を40〜45℃まで20分間加
熱し、キャッピング剤18(10μL)をニートで添加し、そしてこの混合物を
40〜45℃で15分間攪拌した。この反応物を室温まで冷却させ、そして6時
間攪拌した。この粗製混合物を、この溶液が単相になるまでH2OおよびMeO
Hで希釈し、そして最終体積は約1mLであった。このポリマーをカチオン交換
クロマトグラフィー(SEPHADEX−SP C−25,Pharmacia
,Piscataway,NJ;0.75×4.0cm;Na+,溶出剤H2O)
によって精製し、乾燥するまで濃縮し、この樹脂をMeOHに懸濁させ、そして
遠心分離した(3×)。MeOH不溶性物質をH2Oに溶解させ、そして乾燥す
るまで濃縮して、キャップされたポリマー21を淡褐色の鱗状固体として中程度
の収率(60〜80%)で得た。
【0140】 (ポリマー21aの脱保護) キャップされたポリマー21aをH2O(95μL)中に溶解させ、そして1
MのNaOH(5μL)を添加した。このフラスコに指形冷却器を取り付け、そ
してこの溶液を60℃で2時間加熱した。室温まで冷却した後、この溶液をH2
Oで希釈して1mLの最終体積にし、そして中和した(AMBERLYST 1
5 強酸性の高度架橋樹脂,Aldrich)。この混合物をガラス綿の小さな
プラグを通して濾過して樹脂を除去し、次いで乾燥するまで濃縮して、脱保護ポ
リマーを得た。
【0141】
【化35】 (結合体22の合成) 脱保護ポリマー(3.2mg)をH2O(60μL)に溶解させた。EDCI
(0.8mg,0.004mmol)およびN−ヒドロキシスルホスクシンイミ
ド(スルホNHS,Pierce,Roickford,IL)(0.9mg,
0.004mmol)を添加し、そしてこの混合物を室温で5分間インキュベー
トした。5−((5−アミノペンチル)チオウレイジル)フルオレセイン(フル
オレセインカダベリン)(1.3mg,0.002mmol)を添加し、そして
この反応物を室温、暗所で24時間攪拌した。このフルオレセイン結合したポリ
マーを、カチオン交換クロマトグラフィー(SEPHADEX−SP C−25
,Pharmacia;0.75×4.0cm;Na+,溶出剤H2O)およびサ
イズ排除クロマトグラフィー(SEPHADEX G−25,Pharmaci
a,0.75×22.0cm,溶出剤H2O)で精製して、フルオレセイン結合
ポリマー22(2.2mg,69%)を得た。
【0142】
【化36】 (酸素末端ポリマー27の合成および改変) 別々の反応容器において、DCE、ならびにビス−トリス緩衝液(91μL,
100mM,pH5.9)中の3,6−ジスルホガラクトースモノマーのナトリ
ウム塩23(15mg,0.027mmol)およびDTAB(13.5mg,
0.044mmol)の溶液を、各溶液を4回の凍結−吸引−解凍サイクルに供
することによって脱酸素した。脱酸素したDCE(45μL)を、窒素下でルテ
ニウムカルベン14(1.5mg,0.0018mmol)を含むバイアルに入
れ、そしてこの紫色の溶液をモノマーおよびDTABの緩衝溶液を含む反応容器
に添加した。この反応物を60℃まで2.5時間加熱し、室温まで冷却させ、次
いで大気に開放して12時間攪拌した。5−(((2−(カルボヒドラジノ)メ
チル)チオ)アセチル)アミノフルオレセイン26(Molecular Pr
obes,Eugene,OR,2.5mg,0.0051mmol)を添加し
、そしてこの反応物を室温、暗所で48時間攪拌した。このフルオレセイン結合
ポリマーをカチオン交換クロマトグラフィー(SEPHADEX−SP C−2
5,Pharmacia;0.75×4.0cm;Na+,溶出剤H2O)によっ
て精製し、そしてMeOH(3×)で洗浄して、フルオレセイン結合ポリマー1
7(8.6mg,57%)を得た。
【0143】 (蛍光顕微鏡検査法) Jurkat細胞を、37℃および5%CO2で、10%ウシ胎仔血清、10
0U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mMのL−グ
ルタミン、および1mMのピルビン酸ナトリウムを含むRPMI 1640中で
増殖させた。細胞の生存度は、0.4%のTrypan Blueでの染色によ
る決定の場合は95%より高かった。各実験について、5×105の生存細胞を
使用した。Jurkat細胞を750×gで1分間遠心分離し、上清培養培地を
デカントし、そして細胞を1mLの冷却PBS中に再懸濁させた。この細胞を再
び遠心分離し、そして100μLの冷却PBS中に再懸濁させた。FITC標識
抗−L−セレクチン抗体、あるいはフルオレセイン標識ポリマー22またはフル
オレセインポリマー17を添加した。このポリマーのガラクトース残基に基づく
最終濃度は4mMであった。細胞を4℃で30分間インキュベートし、そして2
mLの冷却PBSで2回洗浄した。細胞を、1mLの新鮮な2%HEPES緩衝
化パラホルムアルデヒド中、4℃で30分間固定し、そして2mLの冷却PBS
で2回洗浄した。細胞を遠心分離し、そして50mLの冷却PBS中に再懸濁さ
せた。次いで、この細胞溶液をカバーガラスに塗布し、そして5mLのVect
aShield抗クエンチ剤を含むきれいなガラススライド上に取りつけた。ス
ライドを4℃で一晩インキュベートし、次いでFITC選択フィルタおよびPr
inceton Instruments MicroMaxカメラを備えるZ
eiss Axioskop顕微鏡(Zeiss,Germany)上の油浸漬
レンズ(630×)の下で観察した。画像は、IPLab Spectrumソ
フトウエア(Signal Analytics Corporation (
Vienna,VA))を使用して得られた。示された画像は、4つの独立した
試験の最小値から得られた結果の代表であった。
【0144】 本明細書中に引用される特許、特許文書、および刊行物の完全な開示は、その
各々が個々に援用されるように、本明細書中でその全体が参考として援用される
。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明に対する種々の改変お
よび変更が当業者に明らかとなる。本発明は、本明細書中に記載される例示の実
施形態および実施例によって過度に限定されるようには意図されず、そしてこの
ような実施例および実施形態は、本明細書中上記の特許請求の範囲によってのみ
限定されるように意図される本発明の範囲の単なる例として示されることが理解
されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ランダムコポリマーの形成のための2つの合成経路の概略である。
【図2】 図2は、同じ多価のモノマーアレイを生成するために使用される2つの合成経
路である。(A)は、非極性活性化エステルモノマーテンプレート1の重合、続
いて、炭水化物認識エレメント4を用いる、得られたポリマーテンプレート3の
合成後修飾を含む本発明の方法の一例である。(B)は、乳化条件下で炭水化物
官能化モノマー5の重合を含む従来の方法の一例である。
【図3】 図3は、カルベン触媒での官能基の取り込みおよび誘導体化された電子リッチ
なオレフィンを用いた停止を示す、開環メタセシス重合(ROMP)における機
構および中間体である。
【図4】 図4は、モノテレケリックポリマー(RまたはR’のいずれかが官能基を含む
場合)およびビテレケリックポリマー(RとR’の両方が官能基を含む場合)の
開環メタセシス重合(ROMP)における機構および中間体である。
【図5】 図5は、本発明における使用に適した必要に応じて置換されたモノマーの例で
ある。
【図6】 図6は、本発明の使用に適切な金属カルベン触媒の例である。
【図7A】 図7Aは、反応性官能基を含むキャッピング剤の例である。
【図7B】 図7Bは、非反応性官能基を含むキャッピング剤の例である。
【図8A】 図8Aは、切断可能なリンカーを有するキャッピング剤の使用の図である。
【図8B】 図8Bは、切断可能なリンカーを有するキャッピング剤の例示的な合成の図で
ある。
【図9】 図9は、本発明の方法によって調製され得るポリマーテンプレートの例である
【図10】 図10は、GPCデータが、それぞれの重合からの結果が内部的に一致してい
るが、乳化重合条件(図2の経路B)が、合成後修飾条件(図2の経路A)より
も短い相対長のポリマーを生成することを示す。
【図11】 図11は、ポリマー長に対する血球凝集抑制の依存性である。IC50値が(一
つの糖類基準で)報告される。効力は、α−メチルマンノースに比較して決定さ
れた。この結果は、最低限5個の実験の平均であり、そして用量決定に付随する
誤差は、2の因子であり、アッセイにおける二倍希釈によって指示される。PS
Mは、図2の経路Aの合成後修飾条件を表し、そしてEは、図2の経路Bの乳化
条件を表す。
【図12】 図12は、末端キャップ化ポリマーの合成のためのスキームである。試薬およ
び条件:1および2について、(a)1,2−ジクロロエタン(DCE)、30
分;3(b)について、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)
(1.6当量)、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)2,2’,2’’−ニトリ
ロトリエタノール(ビス−tris)緩衝液(100mM、pH5.9)、DC
E、45℃、30分;(c)過剰のキャッピング剤8がニートで加えられた;(
d)(2−アミノエチル)−3,6−O−ジスルホ−β−D−ガラクトピラノシ
ド、ジイソプロピルカルボジイミド、Et3N、DMF、H2O;(e)50mM
NaOH、60℃、二時間;(f)5−((5−アミノペンチル)チオウレイ
ジル)フルオレセイン、EDCI、N−ヒドロキシスルホスクシイミド、H2
、24時間。
【図13】 図13は、末端アルデヒドを介する蛍光ネオグリコポリマーの合成のためのス
キームである。
【図14】 図14は、蛍光顕微鏡によって観測されるジャーカット細胞に結合する、蛍光
標識された抗L−セリン抗体(A)、蛍光結合体化ネオグリコポリマー12(B
)、および蛍光結合体化ネオグリコポリマー17(C)である。それぞれの画像
は、630倍での個々の細胞であり、そして少なくとも4つの独立した実験の表
示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) // C07F 7/08 C07F 7/08 K (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM, HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,K G,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT ,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW, MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,S D,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR ,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN,YU,ZA, ZW (72)発明者 ゴードン, エヴァ ジェイ. アメリカ合衆国 イリノイ 60090, ウ ィーリング, フェアフィールド コート 1319 (72)発明者 ストロング, ローラ イー. アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53704, マディソン, ドワイト ロード 4403 Fターム(参考) 4H049 VN01 VP01 VQ19 VQ30 VR24 VU16 VW01 4H050 AB40 AB48 WB11 WB13 WB14 WB16 WB17 WB21 WB22 4J032 BA02 BA07 BA12 BB01 BC03 CA34 CA35 CA36 CA68 CD01 CD02

Claims (90)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 テレケリックポリマーを調製する方法であって、該方法は、
    以下: 少なくとも1つの重合可能な基を含む少なくとも1つのモノマーを、少なくと
    も1つのルテニウムカルベン触媒またはオスミウムカルベン触媒の存在下で重合
    して、ポリマーを形成する工程;および 該ポリマーを、少なくとも1つのキャッピング剤と、該ポリマーと該キャッピ
    ング剤が反応するのに効率的な条件下で結合させる工程、 を包含し、ここで、該カルベン触媒、該キャッピング剤のいずれかまたはその両
    方が官能化され、そして末端官能化ポリマーが形成される、方法。
  2. 【請求項2】 前記官能化されたキャッピング剤が、引き続く官能化剤との
    反応のための潜在的反応性基を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 請求項2に記載の方法であって、ここで、前記官能化された
    キャッピング剤が、以下の式: 【化1】 を有し、ここで、Dは電子供与基であり、そしてR6は、アジド、ニトロ基、ジ
    スルフィド、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルデヒド、ケト
    ン、エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート、チオシアネ
    ート、活性化エステル、および活性化酸から選択される潜在的反応性基を含む有
    機基であり、そしてR7およびR8は、独立して水素または有機基である、方法。
  4. 【請求項4】 前記官能化されたキャッピング剤が非反応性官能基を含む、
    請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】 請求項4に記載の方法であって、ここで、前記官能化された
    キャッピング剤が、以下の式: 【化2】 を有し、ここで、Dは電子供与基であり、そしてR6は、天然産物またはそのア
    ナログ、金属キレーター、金属、蛍光プローブ、固体支持体、および金属表面か
    ら選択される非反応性基を含む有機基であり、そしてR7はHまたは有機基であ
    る、方法。
  6. 【請求項6】 前記ポリマーがモノテレケリックポリマーである、請求項1
    に記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記ルテニウムカルベン触媒またはオスミウムカルベン触媒
    が官能化されている、請求項1に記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記官能化されたカルベン触媒が、引き続く官能化剤との反
    応のための潜在的反応性基を含む、請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項9】 請求項8に記載の方法であって、前記官能化されたカルベン
    がM=CR45によって表され、ここでR4は潜在的反応性基を含む有機基であ
    り、R5はHまたは有機基であり、そしてMはリガンド圏内のルテニウムまたは
    オスミウムを表す、方法。
  10. 【請求項10】 請求項9に記載の方法であって、ここでR4は、アジド、
    エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート、チオシアネート
    、活性化エステル、活性化酸、ヒドラジン、およびヒドラゾンの群から選択され
    る潜在的反応性基を含む有機基である、方法。
  11. 【請求項11】 請求項9に記載の方法であって、ここで前記官能化された
    カルベンが、以下の式: 【化3】 を有し、ここでMはRuまたはOsであり、XおよびX’は各々独立してアニオ
    ン性リガンドであり、LおよびL’は各々独立して中性リガンドであり、そして
    4は、アジド、エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート
    、チオシアネート、活性化エステル、活性化酸、ヒドラジン、およびヒドラゾン
    の群から選択される潜在的反応性基を含む有機基である、方法。
  12. 【請求項12】 前記官能化されたカルベン触媒が非反応性官能基を含む、
    請求項7に記載の方法。
  13. 【請求項13】 請求項12に記載の方法であって、ここで前記官能化され
    たカルベンがM=CR45によって表され、ここでR4は非反応性官能基を含む
    有機基であり、R5はHまたは有機基であり、そしてMはリガンド圏内のルテニ
    ウムまたはオスミウムを表す、方法。
  14. 【請求項14】 請求項13に記載の方法であって、ここでR4は、天然産
    物またはそのアナログ、金属キレーター、金属、蛍光プローブ、固体支持体、お
    よび金属表面から選択される非反応性官能基を含む有機基である、方法。
  15. 【請求項15】 請求項14に記載の方法であって、ここで前記官能化され
    たカルベンが、以下の式: 【化4】 を有し、ここでMはRuまたはOsであり、XおよびX’は独立してアニオン性
    リガンドであり、LおよびL’は独立して中性リガンドであり、そしてR4は、
    天然産物またはそのアナログ、金属キレーター、金属、蛍光プローブ、固体支持
    体、または金属表面から選択される非反応性官能基を含む有機基である、方法。
  16. 【請求項16】 前記ポリマーがモノテレケリックポリマーである、請求項
    7に記載の方法。
  17. 【請求項17】 前記ポリマーがビテレケリックポリマーである、請求項1
    に記載の方法。
  18. 【請求項18】 前記官能化されたキャッピング剤が、引き続く官能化剤と
    の反応のための潜在的反応性基を含む、請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項19】 前記官能化されたキャッピング基が非反応性官能基を含む
    、請求項17に記載の方法。
  20. 【請求項20】 前記官能化されたカルベン触媒が、引き続く官能化剤との
    反応のための潜在的反応性基を含む、請求項17に記載の方法。
  21. 【請求項21】 請求項20に記載の方法であって、ここで前記官能化され
    たカルベンがM=CR45で表され、ここでR4は潜在的反応性基を含む有機基
    であり、R5はHまたは有機基であり、そしてMはリガンド圏内のルテニウムま
    たはオスミウムを表す、方法。
  22. 【請求項22】 請求項21に記載の方法であって、ここでR4は、アジド
    、エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメート、チオシアネー
    ト、活性化エステル、活性化酸、ヒドラジン、およびヒドラゾンの群から選択さ
    れる潜在的反応性基を含む有機基である、方法。
  23. 【請求項23】 前記官能化されたキャッピング剤が切断可能なリンカーを
    含む、請求項1に記載の方法。
  24. 【請求項24】 前記キャッピング剤が非反応性官能基を含む、請求項23
    に記載の方法。
  25. 【請求項25】 前記非反応性官能基が固体支持体である、請求項24に記
    載の方法。
  26. 【請求項26】 請求項25に記載の方法であって、前記キャッピング剤が
    以下の式: 【化5】 を有し、ここでDは電子供与基であり;R8は、該キャッピング剤の他のR8とは
    独立して、Hまたは有機基であり;nは1〜約20の範囲の整数であり、R9
    水素または有機基であり;Wは電子求引基であり、そしてZは電子供与基であり
    、そしてLK2は前記固体支持体との結合のためのリンカー基である、方法。
  27. 【請求項27】 WがNO2基であり、そしてZがOR基であり、ここでR
    はアルキル部分である、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項28】 前記官能化された金属カルベン触媒が非反応性官能基を含
    む、請求項1に記載の方法。
  29. 【請求項29】 前記非反応性官能基が固体支持体である、請求項28に記
    載の方法。
  30. 【請求項30】 請求項29に記載の方法であって、ここで前記官能化され
    た金属カルベン触媒が、以下の式: 【化6】 を有し、ここでMはRuまたはOsであり、XおよびX’は独立してアニオン性
    リガンドであり、そして一緒に二座アニオン性リガンドを形成し得、LおよびL
    ’は独立して中性リガンドであり、そして一緒に中性二座リガンドを形成し得、
    R’は水素または有機基であり、そしてLKは有機基である任意のリンカー基で
    ある、方法。
  31. 【請求項31】 官能化されたキャッピング剤であって、該キャッピング剤
    は以下の式: 【化7】 を有し、ここでDは電子供与基であり、R6はエチレングリコール基、ならびに
    アジド、ニトロ基、ジスルフィド、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミ
    ン、アルデヒド、ケトン、エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カル
    バメート、チオシアネート、活性化エステル、および活性化酸から選択される潜
    在的反応性基を含む有機基であり、そしてR7はHまたは有機基である、官能化
    されたキャッピング剤。
  32. 【請求項32】 請求項31に記載のキャッピング剤であって、該キャッピ
    ング剤は以下の式: 【化8】 を有し、ここでDは電子供与基であり;R8は、該キャッピング剤の他のR8とは
    独立して、水素または有機基であり;nは1〜約20の範囲の整数であり;そし
    てLKは、固体支持体への結合を可能にする官能基を有する有機基であるリンカ
    ー基である、キャッピング剤。
  33. 【請求項33】 請求項32に記載のキャッピング剤であって、ここでLK
    は式:−(M)m−LK1−(N)p−LK2を有し、ここでMおよびNは同じか
    または異なる有機基であり;mおよびpは0〜約20の範囲の整数であり、そし
    てLK1およびLK2は官能基である、キャッピング剤。
  34. 【請求項34】 LK1が切断可能な官能基である、請求項33に記載のキ
    ャッピング剤。
  35. 【請求項35】 官能化されたカルベンであって、該カルベンは以下の式: 【化9】 を有し、ここでMはRuまたはOsであり、XおよびX’は独立してアニオン性
    リガンドであり、そして一緒にアニオン性二座リガンドを形成し、LおよびL’
    は独立して中性リガンドであり、そして一緒に中性二座リガンドを形成し、そし
    てR4は、アジド、エポキシド、シアノ基、アセタール、ケタール、カルバメー
    ト、チオシアネート、活性化エステル、活性化酸、ヒドラジン、およびヒドラゾ
    ンの群から選択される潜在的反応性基を含む有機基である、カルベン。
  36. 【請求項36】 固体に支持された官能化されたカルベンであって、該カル
    ベンは以下の式: 【化10】 を有し、ここでMはRuまたはOsであり、XおよびX’は独立してアニオン性
    リガンドであり、そして一緒にアニオン性二座リガンドを形成し、LおよびL’
    は独立して中性リガンドであり、そして一緒に中性二座リガンドを形成し、R’
    は水素または有機基であり、そしてLKは固体支持体への切断可能なリンカーで
    ある、カルベン。
  37. 【請求項37】 多価アレイを調製する方法であって、該方法は、以下: 少なくとも1つの重合可能な基および少なくとも1つの潜在的反応性基を含む
    少なくとも1つのモノマーを、金属カルベン触媒の存在下で重合させて、少なく
    とも1つの潜在的反応性基を含むポリマーテンプレートを形成する工程;ならび
    に 該ポリマーテンプレートを、少なくとも1つの反応性基を含む少なくとも1つ
    の官能化剤と、該ポリマーテンプレートの該潜在的反応性基と該官能化剤の反応
    性基の反応に効率的な条件下で結合させて、多価アレイを形成する工程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項38】 前記モノマーが1つのみの重合可能な基を含む、請求項3
    7に記載の方法。
  39. 【請求項39】 前記モノマーが環状モノオレフィンである、請求項38に
    記載の方法。
  40. 【請求項40】 前記環状モノオレフィンが二環式化合物である、請求項3
    9に記載の方法。
  41. 【請求項41】 前記モノマーが、前記官能化剤の前記反応性基に非反応性
    である官能基をさらに含む、請求項37に記載の方法。
  42. 【請求項42】 前記モノマーの前記潜在的反応性基が、求核基、および求
    電子基を含む前記官能化剤の前記反応性基を含む、請求項37に記載の方法。
  43. 【請求項43】 前記モノマーの前記潜在的反応性基が、求電子基、および
    求核基を含む前記官能化剤の前記反応性基を含む、請求項37に記載の方法。
  44. 【請求項44】 前記求核基が、アミン、アジド、ヒドロキシル、チオール
    、スルホン、アシルヒドラジド、ニトロ基、ホスファイト、ヒドラジン、オキシ
    ム、イソシアネート、ヒドロキサム酸、およびチオシアネートの群から選択され
    る、請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項45】 前記求電子基が、アシルスルホンアミド、アシルアジド、
    エポキシド、無水物、エステル、カルボン酸、ハライド、ボロン酸およびボロン
    エステル、ケトン、アルデヒド、リン酸エステル、ホスファイト、アシルニトリ
    ル、アルケン、およびアルキンの群から選択される、請求項43に記載の方法。
  46. 【請求項46】 前記求電子基が活性化エステル基であり、そして前記求核
    基が第一級アミン基である、請求項43に記載の方法。
  47. 【請求項47】 請求項37に記載の方法であって、ここで前記モノマーが
    以下の一般構造: 【化11】 を有し、ここでYはCH2、O、S、またはN−R3(ここで、R3はHまたは有
    機基である)であり、R1およびR2は各々独立してHまたは有機基であり、これ
    らは環を形成するように結合し得るが、ただしR1およびR2のうち少なくとも1
    つは潜在的反応性基を含む、方法。
  48. 【請求項48】 前記モノマーが、ビシクロ[2.2.1]ヘプタ−5−エ
    ン−exo−2−カルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請
    求項47に記載の方法。
  49. 【請求項49】 請求項37に記載の方法であって、少なくとも1つのモノ
    マーを重合する工程が、金属カルベン触媒の存在下で、2つ以上の異なるモノマ
    ーを連続して重合して、該異なるモノマーの交互ブロックを含むポリマーテンプ
    レートを形成する工程を包含する、方法。
  50. 【請求項50】 異なるモノマーの各々が、引き続くペンダント官能基の結
    合のための異なる潜在的反応性基を含む、請求項49に記載の方法。
  51. 【請求項51】 少なくとも1つの前記モノマーが、さらなる官能化を必要
    としない非反応性ペンダント官能基を含む、請求項50に記載の方法。
  52. 【請求項52】 少なくとも1つのモノマーを重合する工程が、2つ以上の
    異なるモノマーを同時に重合する工程を包含する、請求項37に記載の方法。
  53. 【請求項53】 前記多価アレイを試薬と反応して、該アレイ中のポリマー
    骨格アルケン結合を官能化する工程をさらに包含する、請求項37に記載の方法
  54. 【請求項54】 前記ポリマーテンプレートの前記潜在的反応性基と反応す
    る前記官能化剤が、炭水化物またはペプチドを含む、請求項37に記載の方法。
  55. 【請求項55】 前記モノマーを重合する工程が、室温で有機溶媒中で行わ
    れる、請求項37に記載の方法。
  56. 【請求項56】 前記官能化剤と結合する前に前記ポリマーテンプレートの
    末端と反応させるために、該ポリマーテンプレートとキャッピング剤とを結合す
    る工程をさらに包含する、請求項37に記載の方法。
  57. 【請求項57】 前記キャッピング剤が電子リッチなアルケンである、請求
    項56に記載の方法。
  58. 【請求項58】 前記電子リッチなアルケンが、検出を容易にするレポータ
    ー基を含む、請求項57に記載の方法。
  59. 【請求項59】 前記電子リッチなアルケンが、固体支持体または金属表面
    に連結されているか、または連結可能である、請求項58に記載の方法。
  60. 【請求項60】 請求項37に記載の方法であって、ここで、前記ポリマー
    テンプレートと少なくとも1つの官能化剤とを結合する工程が、該ポリマーテン
    プレートと化学量論量未満の第1官能化剤とを結合することを包含する、方法。
  61. 【請求項61】 前記ポリマーテンプレートと化学量論量未満の第2官能化
    剤とを結合する工程をさらに包含する、請求項60に記載の方法。
  62. 【請求項62】 ポリマーテンプレートであって、該ポリマーテンプレート
    は以下の一般構造: 【化12】 を有し、ここで「BB」は骨格反復単位を表し、これは環状であっても非環状で
    あってもよく、そしてランダム配置またはブロック配置で同じであっても異なっ
    ていてもよく、R1およびR2は各々独立してHまたは有機基であり、これらは環
    を形成するように連結され得るが、ただしR1およびR2のうちの少なくとも1つ
    は保護されたアミンまたは活性化エステルを含み、R4、R5、R6、およびR7
    Hまたは有機基であり、そしてnは反復モノマー単位の平均数である、ポリマー
    テンプレート。
  63. 【請求項63】 nが少なくとも2である、請求項62に記載のポリマーテ
    ンプレート。
  64. 【請求項64】 R4、R5、R6、およびR7のうち少なくとも1つが官能基
    を含む、請求項62に記載のポリマーテンプレート。
  65. 【請求項65】 ポリマーテンプレートであって、該ポリマーテンプレート
    は以下の一般構造: 【化13】 を有し、ここで「BB」は骨格反復単位を表し、これは環状であっても非環状で
    あってもよく、そしてランダム配置またはブロック配置で同じであっても異なっ
    ていてもよく、R1およびR2は各々独立してHまたは有機基であり、これらは環
    を形成するように連結され得るが、ただしR1およびR2のうちの少なくとも1つ
    は保護されたアミンまたは活性化エステルを含み、R4、R5、R6、R7はHまた
    は有機基であり、Zは独立して水素、ハライド、ヒドロキシル、チオール、また
    はアミンであり、そしてnは反復モノマー単位の平均数である、ポリマーテンプ
    レート。
  66. 【請求項66】 R4、R5、R6、およびR7のうち少なくとも1つが官能基
    を含む、請求項65に記載のポリマーテンプレート。
  67. 【請求項67】 請求項65に記載のポリマーテンプレート、およびペンダ
    ント官能基を該ポリマーテンプレートに結合するように官能化剤を使用するため
    の指示手段を含む、キット。
  68. 【請求項68】 少なくとも1つの官能化剤をさらに含む、請求項67に記
    載のキット。
  69. 【請求項69】 少なくとも1つのキャッピング剤をさらに含む、請求項6
    8に記載のキット。
  70. 【請求項70】 前記キャッピング剤が官能化される、請求項69に記載の
    キット。
  71. 【請求項71】 前記キャッピング剤が電子リッチなアルケンである、請求
    項69に記載のキット。
  72. 【請求項72】 前記電子リッチなアルケンが、検出を容易にするレポータ
    ー基を含む、請求項71に記載のキット。
  73. 【請求項73】 少なくとも1つの官能化剤をさらに含む、請求項67に記
    載のキット。
  74. 【請求項74】 少なくとも1つのキャッピング剤をさらに含む、請求項7
    3に記載のキット。
  75. 【請求項75】 複数の多価アレイを含むライブラリーであって、ここで、
    多価アレイは複数のモノマー反復単位を含むポリマーであり、ここで各モノマー
    反復単位は同じであっても異なっていてもよく、ここで該ポリマーの該モノマー
    の一部は官能基を含み、そして該ライブラリーの各多価アレイは、規定された長
    さおよび規定された官能基密度を有する、ライブラリー。
  76. 【請求項76】 前記多価アレイの前記ポリマーが、2つ以上の異なるモノ
    マーを含む、請求項75に記載のライブラリー。
  77. 【請求項77】 異なるモノマーが異なる官能基を有する、請求項76に記
    載のライブラリー。
  78. 【請求項78】 同じ官能基を有するモノマー間の距離が規定される、請求
    項75に記載のライブラリー。
  79. 【請求項79】 異なる官能基を有するモノマー間の間隔が規定される、請
    求項75に記載のライブラリー。
  80. 【請求項80】 前記ライブラリーの前記多価アレイが、実質的に同じ長さ
    を有するが官能基密度が異なるように合成される、請求項75に記載のライブラ
    リー。
  81. 【請求項81】 前記ライブラリーの前記多価アレイが、実質的に異なる長
    さを有するが実質的に同じ官能基密度を有するように合成される、請求項75に
    記載のライブラリー。
  82. 【請求項82】 前記ライブラリーの前記多価アレイが同じ官能基を有する
    、請求項75に記載のライブラリー。
  83. 【請求項83】 前記ライブラリーの前記多価アレイが異なる官能基を有す
    る、請求項75に記載のライブラリー。
  84. 【請求項84】 前記官能基が生物学的に活性な官能基である、請求項75
    に記載のライブラリー。
  85. 【請求項85】 前記ライブラリーの前記多価アレイが固体に連結される、
    請求項75に記載のライブラリー。
  86. 【請求項86】 前記多価アレイがモノテレケリックポリマーである、請求
    項75に記載のライブラリー。
  87. 【請求項87】 前記多価アレイがビテレケリックポリマーである、請求項
    75に記載のライブラリー。
  88. 【請求項88】 複数の多価アレイを含むライブラリーであって、ここで、
    各多価アレイが請求項1に記載の方法によって作製される、ライブラリー。
  89. 【請求項89】 複数の多価アレイを含むライブラリーであって、ここで、
    各多価アレイが請求項37に記載の方法によって作製される、ライブラリー。
  90. 【請求項90】 複数の多価アレイを含むライブラリーを作製する方法であ
    って、該方法は、以下: (a)請求項1に記載の方法によって多価アレイの各々を合成する工程、および
    (b)該多価アレイを結合してライブラリーを作製する工程、 を包含する、方法。
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