JP2003502340A - Retro-inverso peptide derived from interleukin-3 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １２〜約４０のアミノ酸をもち、そして、配列番号１に示す配列をもつ、インターロイキン−３（ＩＬ−３）由来のレトロ−インバーソ・ペプチド。これらのペプチドは、天然ＩＬ−３と同一活性を有し、そしてまた神経栄養活性を有する。上記ペプチド内のＤ−アミノ酸結合に因り、それらは、インビボにおけるタンパク質分解に対して感受性が低い。   (57) [Summary] A retro-inverso peptide derived from interleukin-3 (IL-3) having from 12 to about 40 amino acids and having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. These peptides have the same activity as native IL-3 and also have neurotrophic activity. Due to D-amino acid linkages in the peptides, they are less susceptible to proteolysis in vivo.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 発明の分野 本発明は、インターロイキン-3(IL-3)から誘導されるレトロ-インベルソ(retr
o-inverso)ペプチドに関する。これらのペプチドは、本来の親タンパク質と同様
の活性を有し、また神経栄養活性を有する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to retro-inverso (retr) derived from interleukin-3 (IL-3).
o-inverso) peptide. These peptides have similar activities to the original parent protein and also have neurotrophic activity.

【０００２】 発明の背景 サイトカインは、天然および特異的免疫のエフェクター相中に製造され、免疫
および炎症応答を仲介しかつ調節するように働くタンパク質である。サイトカイ
ンは、他のポリペプチドホルモンのように、標的細胞の表面上の特異的レセプタ
ーに結合することによってその作用を開始する。サイトカインの最もよく知られ
ている族の１つは、天然の免疫を仲介するインターロイキンである。インターロ
イキンの構造および機能の詳細な記載については、アバス(Abbas)ら、細胞およ
び分子の免疫学(Cellular and Molecular Immunology), W.B.サンダース社(Saun
ders Company)、フィラデルフィア、pp.225-243、1991参照。 BACKGROUND Cytokines invention are prepared in the effector phase of natural and specific immunity, a protein which serves to mediate to and modulate the immune and inflammatory responses. Cytokines, like other polypeptide hormones, initiate their action by binding to specific receptors on the surface of target cells. One of the best known families of cytokines are the interleukins that mediate innate immunity. For a detailed description of the structure and function of interleukins, see Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, WB Sanders (Saun.
ders Company), Philadelphia, pp.225-243, 1991.

【０００３】 IL-3は、造血系内の多くの標的細胞に作用する。このサイトカインの構造およ
び機能の詳細な概説は、ザ サイトカイン ハンドブック(The Cytokine Handbo
ok）、第３版、トムソン(Thomson),A.編、アカデミック プレス(Academic Pres
s)、サンディエゴ、CA、1998に見出すことができる。IL-3は、他のインターロイ
キンおよび造血増殖因子と広い構造的類似性を有する糖タンパク質である。ネズ
ミIL-3は、140個のアミノ酸を含み、一方、ヒトIL-3は、133個のアミノ酸を含む
。ネズミおよびヒトIL-3のアミノ酸配列は、わずか30％同一性しか示さず、交雑
種(cross-species)生物活性の欠如を反映する（ヤング(Yang)ら、Cell 47:3-10,
1986）。IL-3 acts on many target cells within the hematopoietic system. For a detailed review of the structure and function of this cytokine, see The Cytokine Handbook.
ok), 3rd Edition, Thomson, A. Ed., Academic Press
s), San Diego, CA, 1998. IL-3 is a glycoprotein with broad structural similarities to other interleukins and hematopoietic growth factors. Murine IL-3 contains 140 amino acids, while human IL-3 contains 133 amino acids. The amino acid sequences of murine and human IL-3 show only 30% identity, reflecting a lack of cross-species biological activity (Yang et al., Cell 47: 3-10,
1986).

【０００４】 IL-3は、いずれの造血増殖因子よりも最も広い標的特異性を有する。標的細胞
の範囲としては、多能性造血幹細胞から誘導されるあらゆる系統の始原細胞を包
含する。かくして、IL-3は、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満
細胞、巨核球および赤血球の発生および分化を刺激することができる。イン ビ
トロ(in vitro)では、造血幹細胞および始原細胞は、組織培養培地だけの中で培
養するなら、直ちに死ぬ。他の造血増殖因子と同様に、IL-3は、アポトーシスに
よる死を防ぎ、イン ビトロ(in vitro)での生存を促進する（ウィリアムズ(Wil
liams)ら、Nature 343:76-78, 1990）。IL-3が奪われたときには、IL-3依存性の
細胞はアポトーシスをうける（ウィリアムズ(Williams)ら、前出）。IL-3 has the broadest target specificity of any hematopoietic growth factor. The range of target cells includes progenitor cells of any lineage derived from pluripotent hematopoietic stem cells. Thus, IL-3 can stimulate the development and differentiation of macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, megakaryocytes and erythrocytes. In vitro, hematopoietic stem cells and progenitor cells die immediately if cultured in tissue culture medium alone. Like other hematopoietic growth factors, IL-3 prevents apoptotic death and promotes in vitro survival (Williams
liams) et al., Nature 343: 76-78, 1990). When IL-3 is deprived, IL-3-dependent cells undergo apoptosis (Williams et al., Supra).

【０００５】 １日３回３日間、IL-3の2000 ED₅₀単位の皮下投与により、脾臓重量の増加な
らびに、肥満細胞および肥満細胞の始原細胞、好中球およびマクロファージの数
の増加がもたらされる（シュレーダー(Schrader)ら、特性決定されたポリペプチ
ドによる免疫調節(Immune Regulation by Characterized Polypeputides), ゴー
ルドシュタイン(Goldstein), G.ら編、リス(Liss)、ニューヨーク、pp.475-484
、1986）。ヒトIL-3の霊長類およびヒトへの投与は、マウスにおいてみられるの
と同様の効果をもたらした（ドナヒュー(Donahue)ら、Science 241:1820-1823,
1988；マイヤー(Mayer)ら、Blood 74:613-621, 1989）。カニクイザルにおいて
、IL-3は、皮下注射の部位に骨髄外造血を誘発した（カーン(Khan)ら、Toxicol.
Pathol. 24:391-397, 1996）。IL-3は、血小板製造を刺激するのに特に有用性
を有し得る（ガンサー(Ganser)ら、Blood, 76:666-676, 1990）。さらに、臨床
的試みは、IL-3およびG-CSFまたはGM-CSFの連続投与は、骨髄造血の最適刺激を
提供し得ることを示唆する（レモリ(Lemoli)ら、J. Clin. Oncol. 14:3018-3025
, 1996）。[0005] Subcutaneous administration of 2000 ED ₅₀ units of IL-3 three times daily for 3 days results in increased spleen weight and increased numbers of mast cells and mast cell progenitors, neutrophils and macrophages. (Schrader et al., Immune Regulation by Characterized Polypeputides, Goldstein, G. et al., Ed., Liss, New York, pp.475-484.
, 1986). Administration of human IL-3 to primates and humans produced similar effects to those seen in mice (Donahue et al., Science 241: 1820-1823,
1988; Mayer et al., Blood 74: 613-621, 1989). In cynomolgus monkeys, IL-3 induced extramedullary hematopoiesis at the site of subcutaneous injection (Khan et al., Toxicol.
Pathol. 24: 391-397, 1996). IL-3 may have particular utility in stimulating platelet production (Ganser et al., Blood, 76: 666-676, 1990). Furthermore, clinical trials suggest that continuous administration of IL-3 and G-CSF or GM-CSF may provide optimal stimulation of myelopoiesis (Lemoli et al., J. Clin. Oncol. 14 : 3018-3025
, 1996).

【０００６】 ニューロトロフィン(neurotrophin)および神経栄養因子は、神経細胞母集団の
生存、標的神経支配および／または機能に影響を及ぼすことができるタンパク質
またはペプチドである（バルデ(Barde)、Neuron, 2:1525-1534, 1989）。ニュー
ロトロフィンのイン ビボ(in vivo)およびイン ビトロ(in vitro)での効力は
よく証明されている。例えば、毛様神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor
)(CNTF)は、鶏の胚毛様神経節(ciliary ganglia)の生存をイン ビトロ(in vitr
o)で助長し、培養した交感神経、感覚および脊髄運動ニューロンの生存を助ける
（イプ(Ip)ら、J. Physiol. Paris, 85:123-130, 1991）。[0006] Neurotrophins and neurotrophic factors are proteins or peptides that can affect survival, target innervation and / or function of neuronal populations (Barde, Neuron, 2 : 1525-1534, 1989). The efficacy of neurotrophins in vivo and in vitro is well documented. For example, ciliary neurotrophic factor
) (CNTF) is used to improve the survival of chicken ciliary ganglia in vitro.
o) promotes survival of cultured sympathetic, sensory and spinal motoneurons (Ip et al., J. Physiol. Paris, 85: 123-130, 1991).

【０００７】 ペプチドのイン ビボ(in vivo)での治療上の使用に対する主な障害は、それ
らがタンパク質分解を受けやすいことである。静脈内注射したIL-3の半減期は短
く、たった40分間のオーダーである（クラッパー(Crapper)ら、Immunology 53:3
3-42, 1984）。レトロ-インベルソペプチドは、配列の方向が逆（レトロ）で、
各アミノ酸のキラリティー（DまたはL）が逆にされた（インベルソ）、線状ペプ
チドの異性体である。幾つかのペプチド結合だけが逆にされており、逆にされた
部分におけるアミノ酸残基のキラリティーが逆にされた、線状ペプチドの部分的
に修飾されたレトロ-インベルソ異性体がまたある。そのようなペプチドの主な
利点は、タンパク質分解に対する改善された抵抗性の故に、それらのイン ビボ
(in vivo)での高められた活性である（概説のためには、チョレフ(Chorev)ら、T
rends Biotech., 13:438-445, 1995参照）。そのようなレトロ-インベルソ類似
体は、増加された代謝安定性を示すが、それらの生物活性はしばしば大きく妥協
される（ギチャード(Guichard)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9765-97
69, 1994）。例えば、リッチマン(Richman)ら（J. Peptide Protein Res., 25:6
48-662）は、Gly³-Phe⁴アミド結合において修飾された線状および環状のリュー
エンケファリンの類似体は、本来のリューエンケファリンの6〜14％の範囲の活
性を有することを決定した。チョレフ(Chorev)ら（同書）は、ビトロネクチン(v
itronectin)のそのレセプターへの結合を阻害するペプチドのレトロ-反転が、50
,000倍だけ親異性体より効かない１つのペプチドおよび、親環状ペプチドより4,
000倍効く別のペプチドをもたらすことを示した。ギチャード(Guichard)ら（TIB
TECH 14, 1996）は、レトロ-インベルソ（すべてD-レトロ）抗原擬態性が、ラン
ダムコイル、ループまたは環状の配座のペプチドを用いてしか生じ得ないことを
教示する。「らせん形」のペプチドの場合には、抗原擬態性を査定するのに使用
される溶媒条件下で、らせん性が実際に不在でありさえしなければ、適切な機能
の擬態性が期待される。A major obstacle to therapeutic use of peptides in vivo is their susceptibility to proteolysis. IL-3 injected intravenously has a short half-life, on the order of only 40 minutes (Crapper et al., Immunology 53: 3.
3-42, 1984). Retro-inverso peptides have the sequence reversed (retro),
It is an isomer of a linear peptide in which the chirality (D or L) of each amino acid is reversed (inverso). There are also partially modified retro-inverso isomers of linear peptides in which only some peptide bonds have been reversed and the chirality of amino acid residues in the inverted part has been reversed. The major advantage of such peptides is their improved in vivo resistance due to their improved resistance to proteolysis.
enhanced activity (in vivo) (for review, Chorev et al., T
rends Biotech., 13: 438-445, 1995). Although such retro-inverso analogs exhibit increased metabolic stability, their biological activity is often largely compromised (Guichard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9765- 97
69, 1994). For example, Richman et al. (J. Peptide Protein Res., 25: 6
48-662) determined that linear and cyclic analogues of leuenkephalin modified at the Gly ³ -Phe ⁴ amide bond have activity in the range of 6-14% of the original leuenkephalin. Chorev et al. (Ibid) wrote that vitronectin (v
50 retro-inversions of peptides that block the binding of itronectin) to its receptor
One peptide that is less effective than the parent isomer by 1,000 times
It has been shown to yield another peptide that is 000 times more effective. Guichard et al. (TIB
TECH 14, 1996) teaches that retro-inverso (all D-retro) antigen mimicry can only occur with peptides in random coil, loop or circular conformations. In the case of "helix-shaped" peptides, proper mimicry of function is expected under the solvent conditions used to assess antigen mimicry, unless helicity is actually absent .

【０００８】 生物活性を保持しながら、増加された代謝安定性を示す、IL-3誘導の神経栄養
ペプチドについての必要性がある。There is a need for IL-3 induced neurotrophic peptides that exhibit increased metabolic stability while retaining biological activity.

【０００９】 発明の概要 本発明の１つの実施態様は、12〜約40個のアミノ酸を有する分離されたレトロ
-インベルソペプチドであり、該ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を含む。
この好ましい実施態様の１つの態様においては、該配列の少なくとも１つの塩基
性に荷電したアミノ酸が、別の塩基性に荷電したアミノ酸で置換される。この好
ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つの酸性に荷電し
たアミノ酸が、別の酸性に荷電したアミノ酸で置換される。有利には、該配列の
少なくとも１つの非極性アミノ酸が、別の非極性アミノ酸で置換される。好まし
くは、該配列の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、別の非荷電アミノ酸で置換
される。この好ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つ
の芳香族アミノ酸が、別の芳香族アミノ酸で置換される。有利には、ペプチドが
、アミノ末端、カルボキシ末端またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方にて、
CH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO、C₆H₅CH₂COおよびH₂N(CH₂)_nCO（n=1〜10）からなる群より
独立して選択される部分で修飾される。好ましくは、ペプチドはグリコシル化さ
れている。この好ましい実施態様の別の態様においては、ペプチドの１つ以上の
アミド結合が還元されている。好ましくは、該ペプチド中の１つ以上の窒素がメ
チル化されている。この好ましい実施態様のなお別の態様においては、ペプチド
中の１つ以上のカルボン酸基がエステル化されている。好ましくは、ペプチドは
、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。SUMMARY OF THE INVENTION One embodiment of the present invention is an isolated retroreactor having 12 to about 40 amino acids.
An inverso peptide, which peptide comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
In one aspect of this preferred embodiment, at least one basic charged amino acid of the sequence is replaced with another basic charged amino acid. In another aspect of this preferred embodiment, at least one acidic charged amino acid of the sequence is replaced with another acidic charged amino acid. Advantageously, at least one non-polar amino acid in the sequence is replaced with another non-polar amino acid. Preferably, at least one uncharged amino acid in the sequence is replaced with another uncharged amino acid. In another aspect of this preferred embodiment, at least one aromatic amino acid in the sequence is replaced with another aromatic amino acid. Advantageously, the peptide is amino-terminal, carboxy-terminal or both amino- and carboxy-terminal,
Modified with moieties independently selected from the group consisting of CH ₃ CO, CH ₃ (CH ₂ ) _n CO, C ₆ H ₅ CH ₂ CO and H ₂ N (CH ₂ ) _n CO (n = 1-10) To be done. Preferably the peptide is glycosylated. In another aspect of this preferred embodiment, one or more amide bonds of the peptide are reduced. Preferably, one or more nitrogens in the peptide are methylated. In yet another aspect of this preferred embodiment, one or more carboxylic acid groups in the peptide are esterified. Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

【００１０】 本発明はまた、必要とする哺乳動物において、軸索生長または髄鞘形成を促進
する方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、軸索生長または髄鞘形成を促進す
るのに有効な量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列
を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物を投与する段階を含む。好まし
くは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。有利には、哺
乳動物はヒトである。この好ましい実施態様の１つの態様においては、投与段階
は、直接局所注入、全身、頭蓋内、脳脊髄内、局所または経口である。The present invention also provides a method of promoting axonal growth or myelination in a mammal in need thereof, the method comprising the step of promoting axon growth or myelination in a mammal. Administering a composition comprising a retro-inverso peptide having an effective amount of 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human. In one aspect of this preferred embodiment, the administering step is direct local infusion, systemic, intracranial, intracerebrospinal, topical or oral.

【００１１】 本発明はまた、造血を刺激する方法を提供し、この方法は、多能性造血幹細胞
を、造血刺激有効量の、12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される
配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
好ましくは、この方法は、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細
胞、巨核球または赤血球の発生および分化をもたらす。The present invention also provides a method of stimulating hematopoiesis, which comprises pluripotent hematopoietic stem cells having a hematopoietic stimulating effective amount of 12 to about 40 amino acids, SEQ ID NO: 1 Contacting with a composition comprising a retro-inverso peptide comprising the sequence shown in.
Preferably, this method results in the development and differentiation of macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, megakaryocytes or erythrocytes.

【００１２】 本発明の別の態様においては、哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促
進するのに使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示さ
れる配列を含むレトロ-インベルソペプチドが提供される。好ましくは、ペプチ
ドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。有利には、哺乳動物はヒト
である。In another aspect of the invention, it has 17 to about 40 amino acids for use in promoting axon growth or myelination in a mammal and is designated SEQ ID NO: 1. Provided is a retro-inverso peptide comprising the sequence Preferably, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.

【００１３】 本発明はまた、多能性造血幹細胞の造血を刺激するのに使用するための、17〜
約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベルソ
ペプチドを提供する。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有
する。The present invention also relates to the use of pluripotent hematopoietic stem cells for stimulating hematopoiesis, comprising:
Provided is a retro-inverso peptide having about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1.

【００１４】 本発明の別の実施態様は、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示さ
れる配列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において、
軸索生長または髄鞘形成を促進するための薬剤の製造に使用することである。好
ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、哺乳動
物はヒトである。Another embodiment of the invention is a mammal in need of a retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
Use in the manufacture of a medicament for promoting axonal growth or myelination. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.

【００１５】 本発明はまた、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を
含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において、多能性造血
幹細胞の造血を刺激するための薬剤の製造に使用することを提供する。好ましく
は、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、哺乳動物はヒ
トである。The present invention also provides a retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1, in a mammal in need thereof, of a pluripotent hematopoietic stem cell. Provided for use in the manufacture of a medicament for stimulating hematopoiesis. Preferably, the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Advantageously, the mammal is a human.

【００１６】 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、造血および血小板製造の刺激を含む本来のIL-3と同様の効果を仲介
する、インターロイキン-3(IL-3)から誘導されるレトロ-インベルソ(RI)ペプチ
ドを提供する。「から誘導される」という語は、ペプチドが、インターロイキン
-3または以下に定義するその類似体の活性領域を含むことを示す。これらのRI
IL-3-誘導ペプチドは、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞
、巨核球および赤血球の増殖および分化を刺激する。 Detailed Description of the Preferred Embodiments The present invention provides a retro-derivative derived from interleukin-3 (IL-3) that mediates effects similar to native IL-3, including stimulation of hematopoiesis and platelet production. Inverso (RI) peptides are provided. The term "derived from" means that the peptide is an interleukin
-3 or an analogue of the analogue defined below. These RI
IL-3-derived peptides stimulate proliferation and differentiation of macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, megakaryocytes and erythrocytes.

【００１７】 これらのペプチドはまた、末梢神経および中枢神経系に対する、毒性の、外傷
性の、虚血性の、変性の、かつ受け継がれた障害後の機能回復を促進することに
おいて、治療上の用途を有する。これらのペプチドはまた、増加された髄鞘形成
を促進し、かつ脱髄疾患の影響を打ち消すために有用である。特定のレトロ-イ
ンベルソペプチドの親ペプチドと同様の効果を仲介する能力は、以下の実施例に
記載された標準のIL-3アッセイを用いて、当業者が決定することができる。これ
らのペプチドの使用は種々の疾患の治療を容易にする。というのは、それらは、
本来のサイトカインまたは組換えサイトカインより安定であり、かつ合成が容易
であるからである。These peptides also have therapeutic use in promoting functional recovery after toxic, traumatic, ischemic, degenerative and inherited injury to the peripheral and central nervous systems. Have. These peptides are also useful for promoting increased myelination and counteracting the effects of demyelinating disease. The ability of a particular retro-inverso peptide to mediate effects similar to the parent peptide can be determined by one of skill in the art using the standard IL-3 assay described in the Examples below. The use of these peptides facilitates the treatment of various diseases. Because they are
This is because it is more stable and easier to synthesize than the original cytokine or recombinant cytokine.

【００１８】 本発明の特定のRI IL-3-誘導ペプチドおよび、それが誘導される親タンパク
質を表１に示す。対応する本来の（レトロ-反転されていない）ペプチドは、米
国特許第5,700,909号に開示されており、その内容のすべてが参照することによ
り本明細書に組入れられる。Specific RI IL-3-derived peptides of the invention and the parent protein from which they are derived are shown in Table 1. The corresponding native (non-retro-inverted) peptide is disclosed in US Pat. No. 5,700,909, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

【００１９】[0019]

【表１】 [Table 1]

【００２０】 先に論じたように、これらRI IL-3-誘導ペプチドは、対応する全長のIL-3タ
ンパク質と同じ造血活性を有し、また神経栄養および髄鞘栄養(myelinotrophic)
活性を有する。本発明の１つの実施態様は、造血促進有効量の、12〜約40個のア
ミノ酸を有しかつSEQ ID NO:1で示されるRI IL-3-誘導ペプチドまたは同様の活
性を有するその類似体を含むRIペプチドを投与することによって、多能性造血幹
細胞の、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、巨核球および
赤血球のような細胞への発生および分化を刺激する方法である。そのような類似
体としては、例えば１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基のアラニン
または別のアミノ酸での置換；１個以上のリシンおよび／またはアルギニン残基
の欠失；１個以上のチロシンおよび／またはフェニルアラニン残基の置換；１個
以上のフェニルアラニン残基の欠失；ならびにペプチド内の１個以上のアミノ酸
の保存的置換を含む。リシン／アルギニンおよびチロシン／フェニルアラニン残
基の置換または欠失は、トリプシンおよびキモトリプシンそれぞれによるペプチ
ド分解の受けやすさを減らす。As discussed above, these RI IL-3-derived peptides have the same hematopoietic activity as the corresponding full-length IL-3 protein, and are neurotrophic and myelinotrophic.
Have activity. One embodiment of the invention is a hematopoietic-promoting effective amount of a RI IL-3-derived peptide having 12 to about 40 amino acids and set forth in SEQ ID NO: 1, or an analog thereof having similar activity. Stimulates the development and differentiation of pluripotent hematopoietic stem cells into cells such as macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, megakaryocytes and erythrocytes by administering RI peptides containing Is the way. Such analogs include, for example, the replacement of one or more lysine and / or arginine residues with alanine or another amino acid; the deletion of one or more lysine and / or arginine residues; the one or more tyrosine. And / or substitution of phenylalanine residues; deletion of one or more phenylalanine residues; and conservative substitution of one or more amino acids within the peptide. Substitution or deletion of lysine / arginine and tyrosine / phenylalanine residues reduces susceptibility to peptide degradation by trypsin and chymotrypsin, respectively.

【００２１】 本発明における使用のために企図されるこれらのペプチド配列の別の変更は、
重要でない挿入および欠失を含む。保存的アミノ酸置換が企図される。そのよう
な置換は、例えば、それらの側鎖の化学的性質に関連したアミノ酸の族内で生じ
る置換である。アミノ酸の族としては、塩基性に荷電したアミノ酸（リシン、ア
ルギニン、ヒスチジン）；酸性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミ
ン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリ
ン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電の極性アミノ酸
（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チ
ロシン）；ならびに芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよび
チロシン）を包含する。特に、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの分離し
た置換または、アスパラギン酸のグルタミン酸での分離した置換または、スレオ
ニンのセリンでの分離した置換または、アミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸
での同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ペプチドの特性に大きな
影響を与えないことが、一般に受け入れられる。SEQ ID NO:1で示される配列を
含む任意のRIペプチドまたはその挿入物、欠失物または置換物の、軸索生長、髄
鞘形成、脱髄逆転および神経細胞死の阻止を促進する能力は、以下に示される実
施例において提供されるアッセイを用いて決定することができる。Another modification of these peptide sequences contemplated for use in the present invention is:
Includes minor insertions and deletions. Conservative amino acid substitutions are contemplated. Such substitutions are, for example, substitutions that occur within a family of amino acids related to their side chain chemistry. The amino acid group includes basic charged amino acids (lysine, arginine, histidine); acidic charged amino acids (aspartic acid, glutamic acid); nonpolar amino acids (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, Tryptophan); uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine); and aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine). In particular, a separate substitution of leucine with isoleucine or valine, a separate substitution of aspartic acid with glutamic acid, or a separate substitution of threonine with serine, or similar conservative substitutions of amino acids with structurally related amino acids. It is generally accepted that conservative amino acid substitutions consisting of substitutions do not significantly affect the properties of the peptide. The ability of any RI peptide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or inserts, deletions or substitutions thereof to promote axonal growth, myelination, demyelination reversal and inhibition of neuronal cell death is It can be determined using the assays provided in the examples provided below.

【００２２】 種々の化学的修飾は、安定性、生物活性およびペプチドの血液脳障壁(blood b
rain barrier)を越える能力を改善する。１つのそのような修飾は、脂肪族また
は芳香族の酸の誘導体での脂肪族アミノ末端修飾であり、アミド結合を形成する
。そのような誘導体としては、例えばCH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO（n=1〜10）、C₆H₅CH₂ COおよびH₂N(CH₂)_nCO（n=1〜10）を包含する。別の修飾は、アミド／エステル結
合によりペプチドに結合される、脂肪族または芳香族アミン／アルコールの誘導
体でのカルボキシ末端修飾である。そのような誘導体としては先に挙げたものを
包含する。ペプチドはまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の修飾の両方を有
することができ、誘導体は、先に挙げたものから独立して選択される。ペプチド
はまたグリコシル化されることができ、アルファアミノ基もしくはD-Asnまたは
その両方が、グルコースまたはガラクトースで修飾される。別の企図される修飾
においては、選択された主鎖アミド結合が還元される（NH-CH₂）。他の修飾とし
ては、アミド結合における選択された窒素のN-メチル化および、ペプチド上の酸
基の少なくとも１つが芳香族または脂肪族のエステルとして修飾されるエステル
化を含む。上記修飾の任意の組合せがまた企図される。Various chemical modifications have demonstrated stability, biological activity and peptide blood-brain barrier.
improve the ability to cross the rain barrier). One such modification is an aliphatic amino-terminal modification with a derivative of an aliphatic or aromatic acid, forming an amide bond. Examples of such derivatives include CH ₃ CO, CH ₃ (CH ₂ ) _n CO (n = 1 to 10), C ₆ H ₅ CH ₂ CO and H ₂ N (CH ₂ ) _n CO (n = 1 to 10) is included. Another modification is a carboxy terminal modification with a derivative of an aliphatic or aromatic amine / alcohol linked to the peptide by an amide / ester bond. Such derivatives include those listed above. The peptides can also have both amino and carboxy terminal modifications and the derivatives are independently selected from those listed above. Peptides can also be glycosylated, with either the alpha amino group or D-Asn or both modified with glucose or galactose. In another contemplated are modified, is reduced backbone amide bond is selected (NH-CH _2). Other modifications include N-methylation of selected nitrogens on the amide bond and esterification in which at least one of the acid groups on the peptide is modified as an aromatic or aliphatic ester. Any combination of the above modifications is also contemplated.

【００２３】 本発明の別の実施態様は、細胞を、造血促進有効量の、12〜約40個のアミノ酸
を有しかつSEQ ID NO:1で示されるRI IL-3-誘導ペプチドまたは上記したのと同
様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドと接触させることによる、分化し
ているかまたは分化していない神経細胞における軸索生長を促進する方法である
。[0023] Another embodiment of the present invention provides a cell comprising a hematopoietic-promoting effective amount of a RI IL-3-derived peptide having 12 to about 40 amino acids and set forth in SEQ ID NO: 1, or above. Is a method of promoting axon growth in differentiated or undifferentiated nerve cells by contacting with a RI peptide containing an analog thereof having the same activity as that of.

【００２４】 任意のそのようなペプチドの軸索生長を刺激する能力は、以下の実施例１〜９
に記載された方法を用いて、当業者が容易に決定することができる。任意の特定
のIL-3-誘導ペプチドの本来のIL-3の同じ活性を仲介する能力は、実施例10〜11
において論じられた親ペプチドについての標準アッセイを用いて決定することが
できる。The ability of any such peptide to stimulate axonal growth is demonstrated in Examples 1-9 below.
It can be easily determined by those skilled in the art using the method described in 1. The ability of any particular IL-3-derived peptide to mediate the same activity of native IL-3 was demonstrated in Examples 10-11.
Can be determined using the standard assay for parent peptides discussed in.

【００２５】 細胞増殖培地中での神経栄養活性のための、本発明のRIペプチドの典型的最小
量は通常、少なくとも約５ng/mlである。イン ビトロ(in vitro)での使用のた
めに、この量またはそれ以上の量の本発明のRIペプチドが予想される。典型的に
は、0.1〜約10g/mlの範囲の濃度のこれらのペプチドが使用される。任意の特定
の組織のための有効量は、実施例１にしたがって決定することができる。A typical minimum amount of RI peptide of the invention for neurotrophic activity in cell growth medium is usually at least about 5 ng / ml. For in vitro use, this amount or more of the RI peptide of the invention is envisaged. Typically, concentrations of these peptides in the range of 0.1 to about 10 g / ml are used. An effective amount for any particular tissue can be determined according to Example 1.

【００２６】 造血細胞または神経細胞は、本発明のRIペプチドを細胞に直接投与することに
よって、イン ビトロ(in vitro)またはイクス ビボ(ex vivo)で処置されるこ
とができる。これは、例えば細胞を特定の細胞タイプのために適当な増殖培地中
で培養し、次いでペプチドを培地に添加することによって行うことができる。典
型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物において、処置されるべき細胞がイン
ビボ(in vivo)にあるときには、幾つかの技術のうちの１つによって組成物を投
与することができる。最も好ましくは、組成物は、ペプチドの所望の局所濃度を
与えるのに十分な量で、血液中に直接注射される。これらのRIペプチドは、Dペ
プチド結合の故に、イン ビボ(in vivo)で長く持続する。リシンおよびアルギ
ニン残基を欠くペプチドにおいては、タンパク質分解が減らされる。より小さい
ペプチド（すなわち、50-mer以下）は、血液脳障壁を最も多く越えるようであり
、CNS疾患の治療のために中枢神経系に入る（バンクス(Banks)ら、Peptides, 13
:1289-1294, 1992参照）。Hematopoietic cells or neural cells can be treated in vitro or ex vivo by directly administering the RI peptides of the invention to the cells. This can be done, for example, by culturing the cells in an appropriate growth medium for the particular cell type and then adding the peptide to the medium. Typically in a vertebrate, preferably a mammal, the cells to be treated are
When in vivo, the composition can be administered by one of several techniques. Most preferably, the composition is injected directly into the blood in an amount sufficient to give the desired local concentration of peptide. These RI peptides are long lasting in vivo due to the D peptide bond. Proteolysis is reduced in peptides lacking lysine and arginine residues. Smaller peptides (ie, 50-mer or smaller) appear to cross the blood-brain barrier most and enter the central nervous system for treatment of CNS disorders (Banks et al., Peptides, 13
: 1289-1294, 1992).

【００２７】 神経疾患の治療のためには、直接頭蓋内注入または脳脊髄流体中への注入をま
た、所望の局所濃度のニューロトロフィン(neurotrophin)を与えるのに十分な量
で使用することができる。両方の場合に、製薬上許容される注射用担体が使用さ
れる。そのような担体としては、例えばホスフェート緩衝塩水およびリンゲル溶
液が含まれる。あるいは、直接局所注入または全身投与によって、組成物を末梢
神経組織へ投与することができる。種々の慣用の投与方式が予想され、静脈内、
肺、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜外、鞘内、局所および経口を含む。局所
投与のための製薬上許容される担体としては、クリーム、ジェル、ペースト、軟
膏、ローション、懸濁液、エマルジョンおよび分散液を含む。For the treatment of neurological disorders, direct intracranial injection or injection into the cerebrospinal fluid may also be used in an amount sufficient to give the desired local concentration of neurotrophin. it can. In both cases, pharmaceutically acceptable injectable carriers are used. Such carriers include, for example, phosphate buffered saline and Ringer's solution. Alternatively, the composition can be administered to peripheral nerve tissue by direct local infusion or systemic administration. Various conventional modes of administration are envisaged, intravenous,
Includes lung, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, epidural, intrathecal, topical and oral. Pharmaceutically acceptable carriers for topical administration include creams, gels, pastes, ointments, lotions, suspensions, emulsions and dispersions.

【００２８】 本発明のペプチド組成物は、単位投与形態で、例えば注射用組成物または、患
者へ投与される毎日の投与量と等価な投与量での局所調製物で、または制御され
た放出組成物として、包装され、投与されることができる。PBS中または凍結乾
燥解形態で活性成分の毎日の投与量を含む中隔封止されたびんは、単位投与の例
である。好ましい実施態様においては、IL-3効果、例えば造血の刺激を促進する
ため、および神経変性疾患または脱髄疾患の治療のための、脊椎動物の体重に基
づく、本発明のRIペプチドの毎日の全身投与量は、約0.01〜約10,000g/kgの範囲
にある。より好ましくは、毎日の全身投与量は、約0.1〜1,000g/kgである。最も
好ましくは、毎日の全身投与量は、約10〜100g/kgである。局所に投与される物
質の毎日の投与量は、ほぼより少ない大きさのオーダーである。ペプチドが胃腸
内系でのタンパク質分解に抵抗性であるので、経口投与が特に好ましい。The peptide compositions of the present invention may be in unit dosage form, for example, an injectable composition or a topical preparation at a dose equivalent to the daily dose administered to a patient, or a controlled release composition. As a product, it can be packaged and administered. A septum-sealed bottle containing a daily dose of the active ingredient in PBS or in lyophilized form is an example of a unit dose. In a preferred embodiment, daily systemic administration of a RI peptide of the present invention based on vertebrate body weight for promoting IL-3 effects, such as stimulation of hematopoiesis, and for the treatment of neurodegenerative or demyelinating diseases. Dosages range from about 0.01 to about 10,000 g / kg. More preferably, the daily systemic dose is about 0.1-1,000 g / kg. Most preferably, the daily systemic dose is about 10-100 g / kg. Daily doses of topically administered substances are on the order of almost lesser magnitudes. Oral administration is particularly preferred because the peptide is resistant to proteolysis in the gastrointestinal system.

【００２９】 本発明の１つの好ましい実施態様においては、ペプチドは局所的に、神経細胞
にイン ビボ(in vivo)で、その移植により投与される。例えば、ポリ乳酸、ポ
リガラクト酸(polygalactic acid)、再生コラーゲン、多層リポソームおよび多
くの他の慣用の蓄積処方物が、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に
処方することができる生物侵食性または生物分解性物質を含む。これらの物質は
、移植されると、徐々にこわれ、周囲の組織に活性物質を放出する。生物侵食性
、生物分解性および他の蓄積処方物の使用は、本発明において特に企図される。
注入ポンプ、マトリックス封鎖(entrapment)系および経皮デリバリー装置との組
合せがまた企図される。ペプチドはまた、米国特許第5,529,914号に記載されて
いるように、移植の前に、ポリエチレングリコール等角(conformal)コーティン
グ中に封入されることができる。In one preferred embodiment of the invention, the peptide is administered locally to nerve cells in vivo by implantation thereof. For example, polylactic acid, polygalactic acid, regenerated collagen, multilamellar liposomes and many other conventional depot formulations can be formulated with biologically active neurotrophic peptide compositions. Contains biodegradable materials. When implanted, these substances gradually break down, releasing the active substance into the surrounding tissue. The use of bioerodible, biodegradable and other depot formulations is specifically contemplated in the present invention.
Combinations with infusion pumps, matrix entrapment systems and transdermal delivery devices are also contemplated. Peptides can also be encapsulated in polyethylene glycol conformal coatings prior to implantation, as described in US Pat. No. 5,529,914.

【００３０】 本発明のペプチドはまた、ミセルまたはリポソーム中に封入されることができ
る。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的にした組織に
結合することができるレセプター、リガンドまたは抗体の使用によって、特定の
組織、例えば神経組織を標的にし得る。これらの処方物の製造は、当技術分野に
おいてよく知られている（ラディン(Radin)ら、Meth. Enzymol., 98:613-618, 1
983）。The peptides of the invention can also be encapsulated in micelles or liposomes. Liposome encapsulation technology is well known. Liposomes can be targeted to specific tissues, such as neural tissue, by the use of receptors, ligands or antibodies that can bind to the targeted tissue. The manufacture of these formulations is well known in the art (Radin et al., Meth. Enzymol., 98: 613-618, 1
983).

【００３１】 目下、神経系の構造完全性の完全な機能再生および回復を促進することができ
る、入手可能な薬剤がない。これは特にCNSの場合に本当である。神経栄養因子
の使用による末梢神経のどのような程度の再生も、本発明の範囲内にある。さら
には、神経栄養因子は、神経母集団または脳の特定領域の変性に関連する神経変
性疾患の治療において治療上有用であり得る。そのような変性の、どのような程
度の遅延、停止、または反転も、本発明の範囲内にある。パーキンソン病の主な
原因は、黒質のドーパミン作用性のニューロンの変性である。本発明のRIペプチ
ドは、パーキンソン病の治療において治療上有用であり得る。年をとると視野の
喪失に至る視覚神経変性疾患である、網膜神経障害がまた、本発明のRIペプチド
を用いて治療可能である。Currently, there are no drugs available that can promote full functional regeneration and restoration of the structural integrity of the nervous system. This is especially true for CNS. Any degree of regeneration of peripheral nerves through the use of neurotrophic factors is within the scope of this invention. Moreover, neurotrophic factors may be therapeutically useful in the treatment of neurodegenerative diseases associated with degeneration of specific areas of the neural population or brain. Any delay, termination, or reversal of such modification is within the scope of the invention. The major cause of Parkinson's disease is degeneration of substantia nigra dopaminergic neurons. The RI peptides of the invention may be therapeutically useful in treating Parkinson's disease. Retinal neuropathy, a visual neurodegenerative disease that leads to visual field loss in old age, is also treatable with the RI peptides of the invention.

【００３２】 脳のニューロン母集団に到達するために、神経栄養因子は、大脳内に投与され
なければならない、というのは、これらのタンパク質は血液脳障壁を越えないか
らであると長く信じられてきた。米国特許第5,571,787号は、サポシンCから誘導
される、ヨウ素化した神経栄養18-merフラグメントが血液脳障壁を越えることを
開示する。このように、約22個までのアミノ酸を有するRIペプチドがまたこの障
壁を越え、かくして、静脈内投与することができる。他のニューロン母集団、例
えば運動ニューロンは、脳脊髄流体中への直接注入がまた代替経路として想像さ
れるが、これはまた静脈内注射によって処置することができる。In order to reach the neuronal population of the brain, neurotrophic factors must be administered in the cerebrum, since it has long been believed that these proteins do not cross the blood-brain barrier. It was US Pat. No. 5,571,787 discloses that iodinated neurotrophic 18-mer fragments derived from saposin C cross the blood-brain barrier. Thus, RI peptides having up to about 22 amino acids also cross this barrier and thus can be administered intravenously. For other neuronal populations, such as motor neurons, direct injection into the cerebrospinal fluid is also envisioned as an alternative route, but this can also be treated by intravenous injection.

【００３３】 細胞は、ミエリン形成を促進するかまたは脱髄を防止するように、イン ビボ
(in vivo)、イクス ビボ(ex vivo)またはイン ビトロ(in vitro)で、上記した
方法で処置されることができる。神経繊維の脱髄をもたらす疾患［MS、急性転移
性白質脳炎、脳および／または脊髄への外傷、進行性多焦点白質脳炎、異染性白
質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィーおよび未成熟の幼児における白質の
悪展開(maldevelopment)（室周囲白軟化症(periventicular leucomalacia)）を
含む］は、本発明の神経栄養ペプチドを疾患に冒された細胞へ投与することによ
って、遅らせるか、または停止させることができる。The cells are treated in vivo to promote myelination or prevent demyelination.
It can be treated (in vivo), ex vivo or in vitro by the methods described above. Diseases leading to demyelination of nerve fibers [MS, acute metastatic leukoencephalitis, brain and / or spinal cord trauma, progressive multifocal leukoencephalitis, metachromatic leukodystrophy, adrenoleukodystrophy and white matter in premature infants Maldevelopment, including periventicular leucomalacia, can be delayed or stopped by administration of the neurotrophic peptides of the invention to diseased cells.

【００３４】 本発明のRI IL-3誘導ペプチド組成物はまた、造血を助け、培養された運動ニ
ューロンの生存率を高め、かつ神経栄養因子およびミエリン促進物質の効果を決
定するために使用することができる。しかしながら、より実際には、それらは、
実験室試薬として、および造血を促進し、神経細胞をイン ビトロ(in vitro)で
維持するために、細胞増殖培地の成分としての即時用途を有する。The RI IL-3 inducing peptide composition of the present invention may also be used to aid hematopoiesis, enhance the survival rate of cultured motor neurons and determine the effects of neurotrophic factors and myelin promoting agents. You can However, more practically, they are
It has immediate use as a laboratory reagent and as a component of cell growth media to promote hematopoiesis and maintain neurons in vitro.

【００３５】 本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている自動化された固相プロト
コールを用いて合成される。ペプチドはすべて、使用前に、逆相カラムでの高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)により、約95％より上の純度まで精製される。The peptides of the present invention are synthesized using automated solid phase protocols well known in the art. All peptides are purified by high performance liquid chromatography (HPLC) on a reverse phase column to a purity of greater than about 95% before use.

【００３６】 以下の実施例は説明的なものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図し
ない。The following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention.

【００３７】 実施例１ 軸索生長の刺激 NS20Y神経芽腫細胞を、10％子牛胎児血清(FCS)を含むDMEM中で増殖させる。細
胞をトリプシンで除き、30mmペトリ皿中で、カバーガラス上で培養する。20〜24
時間後、培地を、0.5%FCSおよび0、0.5、1、2、4または8ng/mlのRI IL-3誘導ペ
プチド（12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）を
含む2mlのDEMEと取り替える。細胞をさらに24時間培養し、PBSで洗浄し、ブワン
溶液(Bouin's solution)（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸15:5:1）で30
分間固定した。固定液をPBSで除き、位相差顕微鏡下で軸索生長について評点付
けをした。１つの細胞直径以上長いと明らかに定義された１つ以上の軸索を示す
細胞は、正であると評点をつけられた。各皿の異なる部分で、少なくとも200個
の細胞について評点を付けて、軸索を有する細胞のパーセンテージを決定し、ア
ッセイは二重に行った。Example 1 Stimulation of Axon Growth NS20Y neuroblastoma cells are grown in DMEM containing 10% fetal calf serum (FCS). Cells are trypsinized and cultured on 30 mm Petri dishes on coverslips. 20-24
After a period of time, the medium was supplemented with 0.5% FCS and 0, 0.5, 1, 2, 4 or 8 ng / ml RI IL-3 inducing peptide (having 12 to about 40 amino acids and represented by SEQ ID NO: 1). Replace with 2 ml of DEME containing). Cells are cultured for another 24 hours, washed with PBS, and washed with Bouin's solution (saturated aqueous picric acid / formalin / acetic acid 15: 5: 1) for 30 hours.
Fixed for minutes. The fixative was removed with PBS and scored for axonal growth under a phase contrast microscope. Cells showing one or more axons that were clearly defined to be longer than one cell diameter were scored as positive. At least 200 cells were scored in different parts of each dish to determine the percentage of cells with axons and the assay performed in duplicate.

【００３８】 実施例２ 細胞死の阻止 NS20Y細胞を実施例１のようにして培養し、８ng/mlのRI IL-3誘導ペプチド（
12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の存在下ま
たは不在下にて0.5％ウシ胎児血清中のカバーグラス上で２日間増殖させる。培
地を除き、PBS中の0.2％トリパンブルーを各ウェルに加える。青色に染色された
死細胞を、倒立顕微鏡にて全体中のパーセンテージとして評点付けをし、各ウェ
ルの４領域で400個の細胞を数える。二重アッセイでの平均誤差は５％であった
。Example 2 Inhibition of cell death NS20Y cells were cultured as in Example 1 and 8 ng / ml of RI IL-3 inducing peptide (
It has 12 to about 40 amino acids and is grown for 2 days on coverslips in 0.5% fetal bovine serum in the presence or absence of (including the sequence set forth in SEQ ID NO: 1). Remove medium and add 0.2% trypan blue in PBS to each well. Dead cells stained blue are scored as a percentage of the whole with an inverted microscope and 400 cells are counted in 4 areas of each well. The average error in the duplicate assay was 5%.

【００３９】 実施例３ イクス ビボ(ex vivo)での軸索生長の促進 クフラー(Kuffler)ら（J. Neurobiol. 25:1267-1282, 1994）により記載され
たようにして、ラット成体から脊髄神経節を除き、感覚ニューロンを調製した。
ニューロンを0.5ng/mlのRI IL-3誘導ペプチド（12〜約40個のアミノ酸を有し、
SEQ ID NO:1で示される配列を含む）で処理する。処理の３日後、最長の軸索突
出の長さをマイクロメーターのグリッドで測定する。RIペプチドで処理したニュ
ーロン中の最長の軸索は、対照（非-RI）ペプチドで処理したものまたは未処理
の対照より約３倍長い。48時間の処理後、すべての細胞は、神経増殖因子(NGF)
に同様に応答し、そこで、広範囲の分岐が観察される。これらの結果は、IL-3誘
導ペプチドが感覚ニューロンの分化を促進することを示す。Example 3 Promotion of Axonal Growth Ex Vivo From rat adult spinal nerves as described by Kuffler et al. (J. Neurobiol. 25: 1267-1282, 1994). The nodes were removed and sensory neurons were prepared.
Neurons with 0.5 ng / ml of RI IL-3 inducing peptide (having 12 to about 40 amino acids,
(Including the sequence shown in SEQ ID NO: 1). After 3 days of treatment, the length of the longest axonal protrusion is measured with a micrometer grid. The longest axons in neurons treated with RI peptide are approximately 3-fold longer than those treated with control (non-RI) peptide or untreated controls. After 48 hours of treatment, all cells had nerve growth factor (NGF)
Similarly responding to, where extensive branching is observed. These results indicate that IL-3 induced peptides promote differentiation of sensory neurons.

【００４０】 実施例４ ラットモデルにおける脱髄の逆転 実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト多発性硬化症(MS)のラットモデル
である。ラットにおいては、EAEは、外来タンパク質（モルモットの脊髄）を注
入することによって誘発され、それは、11日後に、白質における炎症および脱髄
をもたらす。この脱髄は、活発に脱髄しているヒトMS障害にみられるものと似て
いる（リュウ(Liu)ら、Multiple Sclerosis 1:2-9, 1995）。Example 4 Reversal of demyelination in a rat model Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) is a rat model of human multiple sclerosis (MS). In the rat, EAE is induced by injecting a foreign protein (guinea pig spinal cord), which leads to inflammation and demyelination in the white matter after 11 days. This demyelination is similar to that seen in actively demyelinating human MS disorders (Liu et al., Multiple Sclerosis 1: 2-9, 1995).

【００４１】 モルモットの脊髄および完全フロイントアジュバント(CFA)のエマルジョンの
注入によって、ルイス(Lewis)ラットにEAEが誘発される。14日目、弱っているの
が明らかなときに、RI IL-3誘導ペプチド（12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ
ID NO:1で示される配列を含む）での処置を開始し（200g/kg筋肉内）、毎日８日
間続ける。６匹のラットは、賦形剤のみを注入される。14日および22日に、１歩
の長さ（筋肉の弱りの尺度）を評点付けする。さらに、mm²当たりの脊髄におけ
る脱髄障害（斑）の数および大きさを、22日に評点付けする。最後に、脳中のコ
レステロールエステルの量（ミエリン破壊のマーカー）を、22日に評点付けする
。EAE is induced in Lewis rats by infusion of an emulsion of guinea pig spinal cord and complete Freund's adjuvant (CFA). On day 14, when it appears to be weakened, a RI IL-3 derivative peptide (having 12 to about 40 amino acids, SEQ
Treatment with the sequence shown in ID NO: 1) is started (200 g / kg i.m.) and continued daily for 8 days. Six rats are injected with vehicle only. On day 14 and 22, the length of one step (a measure of muscle weakness) is scored. In addition, the number and size of demyelinating disorders (plaques) in the spinal cord per mm ² are scored on day 22. Finally, the amount of cholesterol ester in the brain, a marker of myelin destruction, is scored on day 22.

【００４２】 両群の１歩の長さは14日目に減少し、それに対して、８日間の処置後、IL-3誘
導ペプチドで処置した動物は正常に戻ったが、賦形剤処置した動物は戻らない。
コレステロールエステル含量の有意の減少が、処置群の脳において観察される。
さらに、脊髄障害の数は、IL-3誘導ペプチドでの処置の10日後に有意に減少する
。最後に、平均の障害の大きさは有意に減少する。対照動物と実験動物との間の
体重減少の差はない。これらの結果は、IL-3誘導ペプチドでの全身処置後に、EA
Eの有意の臨床的生化学的かつ形態学的な逆転を示す。この作用は、ミエリン修
復に直接作用しない、最近のMS薬の抗炎症効果とは違う。The length of one step in both groups was reduced on day 14 whereas the animals treated with IL-3 inducing peptide returned to normal after 8 days of treatment but were treated with vehicle. Animals do not return.
A significant reduction in cholesterol ester content is observed in the treated group of brains.
Furthermore, the number of spinal cord disorders is significantly reduced 10 days after treatment with IL-3 derived peptides. Finally, the average lesion size is significantly reduced. There is no difference in weight loss between control and experimental animals. These results show that after systemic treatment with IL-3 derived peptides, EA
Shows a significant clinical biochemical and morphological reversal of E. This effect is different from the anti-inflammatory effects of modern MS drugs, which do not directly affect myelin repair.

【００４３】 実施例５ イクス ビボ(ex vivo)の髄鞘形成アッセイ 新生児マウスの小脳外植片を、サトミ(Satomi)（Zool. Sci. 9:127-137, 1992
）にしたがって調製する。軸索生長および髄鞘形成を、培養で22日間観察し、そ
の期間中に、新生児マウスの小脳は普通ニューロン分化し、髄鞘形成が開始する
。12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI IL-3誘
導ペプチドを、外植片の調製後第２日に加え（３つの対照および３つの処置外植
片）、軸索の生長および髄鞘形成を、ビデオカメラの付いた明視野顕微鏡(brigh
t field microscope)下で査定する。サポシンCを、約1〜10g/mlの濃度での正の
対照として使用する。髄鞘形成は、IL-3誘導ペプチドによって、サポシンCを用
いたときと同様の程度にまで刺激される。Example 5 Ex Vivo Myelination Assay Cerebellar explants from neonatal mice were subjected to Satomi (Zool. Sci. 9: 127-137, 1992).
). Axon growth and myelination were observed in culture for 22 days, during which time the neonatal mouse cerebellum normally differentiates into neurons and myelination begins. A RI IL-3 derivative peptide having 12 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was added on the second day after preparation of the explants (3 controls and 3 treatments). Explant), axon growth and myelination, using a brightfield microscope with a video camera.
t field microscope). Saposin C is used as a positive control at a concentration of about 1-10 g / ml. Myelination is stimulated by IL-3 derived peptides to a similar extent as with saposin C.

【００４４】 あるいは、髄鞘形成は、³⁵Sをスルホリピド（以下に記載するように、ミエリ
ンに限定的である）に組み込むことによってアッセイすることができる。Alternatively, myelination can be assayed by incorporating ³⁵ S into sulfolipid, which is limited to myelin, as described below.

【００４５】 実施例６ ³⁵Sのスルホリピドへの組み込み 初代のミエリン含有シュヴァン(Schwann)細胞を、0.5％ウシ胎児血清(FBS)を
含む低サルフェート培地(DMEM)中で48時間インキュベートした後、³⁵S-メチオニ
ンおよび、12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI
IL-3誘導ペプチドを添加する。サポシンCを正の対照として使用する。細胞をP
BSですすぎ、採取し、100リットルの蒸留水中で超音波処理する。一定分量の細
胞溶解物をタンパク質分析のために除き、残りを5mlのクロロホルム／メタノー
ル（2:1、体積／体積）で抽出する。脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、
ヒライワ(Hiraiwa)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4778-4781に記載さ
れているようにして、抗スルファチドモノクローナル抗体を用いて免疫染色する
。ペプチドおよびサポシンC処置後、同様の量のスルファチドが観察される。Example 6 Incorporation of ³⁵ S into Sulfolipids Primary myelin-containing Schwann cells were incubated in low sulphate medium (DMEM) containing 0.5% fetal bovine serum (FBS) for 48 hours, followed by ³⁵ S. -Methionine and RI having 12 to about 40 amino acids and comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1
Add IL-3 derived peptide. Saposin C is used as a positive control. P cells
Rinse with BS, collect and sonicate in 100 liters of distilled water. Aliquots of cell lysate are removed for protein analysis and the rest is extracted with 5 ml chloroform / methanol (2: 1, volume / volume). Chromatography of the lipid extract,
Immunostaining with anti-sulfatide monoclonal antibody is performed as described by Hiraiwa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4778-4781. Similar amounts of sulfatide are observed after peptide and saposin C treatment.

【００４６】 実施例７ 外傷性虚血性CNS障害の治療におけるRIペプチドの使用 脳または脊髄に外傷性障害を有するヒトが、滅菌塩水溶液または蓄積形態での
約100g/kgのRI IL-3誘導ペプチド（12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:
1で示される配列を含む）の全身注入を受ける。感覚または運動神経機能の獲得
による改善が査定される（すなわち、増加された手足の動き）。さらなる改善が
生じなくなるまで治療を続ける。Example 7 Use of RI Peptides in the Treatment of Traumatic Ischemic CNS Disorders Humans with traumatic injury to the brain or spinal cord are treated with about 100 g / kg RI IL-3 derived peptide in sterile saline solution or in the form of accumulation. (Having 12 to about 40 amino acids, SEQ ID NO:
(Including the sequence shown in 1). Improvements due to the acquisition of sensory or motor function are assessed (ie, increased limb movement). Continue treatment until no further improvement occurs.

【００４７】 実施例８ 脱髄疾患の治療におけるRIペプチドの使用 初期段階のMSと診断された患者に、実施例７と同じ投与量範囲を用いた全身注
入によって、12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むR
I IL-3誘導ペプチドが与えられる。投与は毎日または毎週繰り返され、筋肉の
強度の改善、筋骨格協調および髄鞘形成（MRIにより決定）が観察される。慢性
再発MSを有する患者を、次の再発が生じるときに、同じ方法で治療する。Example 8 Use of RI Peptides in the Treatment of Demyelinating Disease Patients diagnosed with early stage MS receive 12 to about 40 amino acids by systemic infusion using the same dosage range as in Example 7. R having the sequence shown in SEQ ID NO: 1
The I IL-3 derived peptide is given. Dosing is repeated daily or weekly and improved muscle strength, musculoskeletal coordination and myelination (determined by MRI) are observed. Patients with chronic recurrent MS are treated in the same manner when the next relapse occurs.

【００４８】 典型的には、軟質寒天中の骨髄の始原細胞から分化した細胞のコロニーの形成
を刺激するその能力によって、IL-3がアッセイされる。あるいは、ヒト白血病か
ら誘導された細胞系統、例えばTF-1およびMO-7eでのその増殖効果について、IL-
3をアッセイすることができる。IL-3アッセイについての詳細なプロトコールは
、サイトカイン、実際的アプローチ(Cytokines, a Practical approach）、 バ
ルクヴィル(Balkwill), F.編、IRLプレス(Press)、ニューヨーク、第２版、1995
年、pp.247-268、372-377に見出すことができ、その内容のすべてが、参照する
ことにより本明細書に組入れられる。IL-3アッセイプロトコールは、以下の実施
例において提供されている。IL-3 is typically assayed for its ability to stimulate the formation of colonies of differentiated cells from bone marrow progenitor cells in soft agar. Alternatively, for its proliferative effect on human leukemia-derived cell lines, such as TF-1 and MO-7e, IL-
3 can be assayed. Detailed protocols for the IL-3 assay are Cytokines, a Practical Approach, Balkwill, F. Ed., IRL Press, New York, 2nd Edition, 1995.
, Pp. 247-268, 372-377, all the contents of which are incorporated herein by reference. The IL-3 assay protocol is provided in the Examples below.

【００４９】 実施例９ IL-3コロニー形成アッセイ IL-3は、異なる細胞タイプの混合コロニーの形成を刺激する。50個より多い細
胞のコロニーをカウントし、７〜14日後に双眼顕微鏡を用いて目で分析する。コ
ロニーの数は通常、寒天培地中のIL-3の特異的活性または濃度に関連する。乾燥
しかつ固定したゲルの染色による形態学的分析により、コロニータイプの適当な
同定が可能になる（メトカルフ(Metcalf)、造血コロニー刺激因子(The Hemopoie
tic Colony Stimulating Factors)、エルセビア プレス(Elsevier Press)、ア
ムステルダム、1984）。Example 9 IL-3 Colony Formation Assay IL-3 stimulates the formation of mixed colonies of different cell types. Colonies with more than 50 cells are counted and analyzed visually after 7-14 days using a binocular microscope. The number of colonies is usually related to the specific activity or concentration of IL-3 in the agar medium. Morphological analysis by staining of dried and fixed gels allows proper identification of colony types (Metcalf, hematopoietic colony stimulating factor (The Hemopoie
tic Colony Stimulating Factors), Elsevier Press, Amsterdam, 1984).

【００５０】 骨髄吸引液を、5〜10mlのイスコフの変性ダルベコー培地(Iscove's modified
Dulbecco's medium)(IMDM)および400単位の防腐剤不含有ヘパリンを含む滅菌管
に集めることによって、ヒト骨髄から細胞懸濁液を調製する。細胞を、600〜1,0
00 x gにて10分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を、IMDMおよび2％子牛胎児血
清(FCS)中に再懸濁させ、次いでピペッティングにより穏やかに混合する。細胞
を血球計にてカウントし、必要なように濃度を調整する。骨髄吸引液の細胞充実
性は、患者の病状およびまた吸引技術と共に変わるので、細胞を再懸濁するため
に使用される体積について、ある種の判断を働かせなければならない。細胞が少
ない(hypocellular)骨髄試料は1〜2ml中に再懸濁させるが、通常5〜10mlが使用
される。細胞懸濁液は培養まで氷上に保持される。The bone marrow aspirate was treated with 5 to 10 ml of Iscove's modified Dulbecco's medium (Iscove's modified
Cell suspensions are prepared from human bone marrow by collecting in sterile tubes containing Dulbecco's medium (IMDM) and 400 units of preservative-free heparin. 600 to 1,0 cells
Centrifuge at 00 xg for 10 minutes, discard the supernatant, resuspend cells in IMDM and 2% fetal calf serum (FCS), then gently mix by pipetting. Count the cells with a hemacytometer and adjust the concentration as needed. Since the cellularity of bone marrow aspirate varies with the condition of the patient and also with the aspiration technique, some judgment must be exercised regarding the volume used to resuspend the cells. A hypocellular bone marrow sample is resuspended in 1-2 ml, but typically 5-10 ml is used. The cell suspension is kept on ice until culturing.

【００５１】 以下のプロトコールは、ヒト骨髄からのMix-CFCのアッセイについての段階を
詳述する。このアッセイは、混合コロニーの増殖を可能にし、このコロニーは、
Mix-CFCのクローン増殖から得られる幾つかの骨髄系統（好中球、好酸球、好塩
基球、赤血球、単球-マクロファージおよび巨核球）を含み得る。３通りの、そ
れぞれ5 x 10⁴のヒト骨髄細胞を含む1ml分量を3cm直径のペトリ皿に置く。培養
混合物は、以下のようにして作り、全部の値を3.3mlにする（余分に0.3mlを見込
む）：The following protocol details the steps for the assay of Mix-CFC from human bone marrow. This assay allows the growth of mixed colonies, which colonies
It may include several bone marrow lineages derived from clonal expansion of Mix-CFC (neutrophils, eosinophils, basophils, erythrocytes, monocytes-macrophages and megakaryocytes). Three 1 ml aliquots, each containing 5 x 10 ⁴ human bone marrow cells, are placed in 3 cm diameter petri dishes. The culture mixture is made as follows and the total value is 3.3 ml (estimate an extra 0.3 ml):

【００５２】[0052]

【表２】 [Table 2]

【００５３】 寒天（3.3％）を沸騰水浴に入れて溶かした。寒天を溶かしている間、培養混
合物を水浴中で37℃に暖めて、寒天が添加されたときにあまりに直ぐに凝固する
ことを防ぐことができる。寒天（0.30ml）を添加し、完全であるが穏やかに混合
し、皿当たり1mlを培養する。皿をトレイ上に置き、セットする。皿は約２分間
冷蔵中に置いて、プロセスを速めることができる。次に、プレートを37℃の十分
に加湿した気体インキュベータ中に置き、14日間インキュベートする。ズームレ
ンズを有する顕微鏡または倒立顕微鏡を用いて約40xの倍率下でコロニーを評点
付けする。個々のコロニーを、パスツールピペットを用いて細胞学的検査のため
に拾い、標準のサイトスピン(cytospin)調製のために0.1mlの培地（およびタン
パク質源、１％血清または0.1％のBSA）中に懸濁させる。Agar (3.3%) was placed in a boiling water bath to dissolve. While melting the agar, the culture mixture can be warmed to 37 ° C in a water bath to prevent it from solidifying too quickly when the agar is added. Add agar (0.30 ml), mix thoroughly but gently and incubate 1 ml per dish. Place the dish on the tray and set. The dish can be kept refrigerated for about 2 minutes to speed up the process. The plates are then placed in a fully humidified gas incubator at 37 ° C and incubated for 14 days. Colonies are scored under a magnification of approximately 40x using a microscope with a zoom lens or an inverted microscope. Individual colonies were picked for cytological examination using a Pasteur pipette and in 0.1 ml medium (and protein source, 1% serum or 0.1% BSA) for standard cytospin preparation. Suspended in.

【００５４】 実施例10 IL-3細胞増殖アッセイ 幾つかのIL-3依存性細胞系統を、ペプチドがIL-3活性を有するかどうかを決定
するために使用することができる。細胞系統FDCP-1、FDCP-2、32DCL23、TF-1（
ヒト赤白血病）、AML-193（ヒト急性骨髄性白血病: ATCC CRL 9589）、MO-7e（
ヒト巨核芽球性白血病）およびDAM1（ヒト巨核芽球細胞；チェン(Chen)ら、Br.
J. Haematol. 88:481-490, 1994）はIL-3依存性である。12〜約40個のアミノ酸
を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む特定のRI IL-3誘導ペプチドがIL-3
活性を有するかどうかを決定するために、ペプチドまたはその類似体、例えば１
つ以上の保存性アミノ酸置換を有するペプチドが、以下のようにして細胞と共に
インキュベーションすることによってIL-3活性についてアッセイされる： 細胞は、指数関数的増殖速度に達するまで懸濁液中で培養された後、スウィング
アウトローター(swing-out rotor)を用いて卓上(bench)遠心機で800xgにて５分
間回転させることによって採取される。細胞ペレットを適当な培地に懸濁させ、
再び遠心分離し、さらに２回再懸濁させる。細胞は、フィッシャー培地（ギブコ
およびグルタミン）およびウマ血清（10％体積／体積）中に1-2 x 10⁶/mlの濃度
で再懸濁され、試験下のIL-3誘導ペプチドの希釈またはIL-3の標準調製物の希釈
と共に、試験濃度1-2 x 10⁵細胞/mlにて、全体積100リットル中で培養される。
ウマ血清（または、細胞が正常に培養されるなら、子牛胎児血清）の最終濃度は
10〜20％（体積／体積）である。細胞を、CO₂インキュベータ中で37℃にてイン
キュベートする。Example 10 IL-3 Cell Proliferation Assay Several IL-3 dependent cell lines can be used to determine if a peptide has IL-3 activity. Cell lines FDCP-1, FDCP-2, 32DCL23, TF-1 (
Human erythroleukemia), AML-193 (human acute myelogenous leukemia: ATCC CRL 9589), MO-7e (
Human megakaryoblastic leukemia) and DAM1 (human megakaryoblast cells; Chen et al., Br.
J. Haematol. 88: 481-490, 1994) is IL-3 dependent. A specific RI IL-3 derivative peptide having 12 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is IL-3.
To determine whether it has activity, a peptide or analog thereof, eg 1
Peptides with three or more conservative amino acid substitutions are assayed for IL-3 activity by incubation with cells as follows: Cells are cultured in suspension until they reach an exponential growth rate. Afterwards, it is harvested by spinning at 800 xg for 5 minutes in a bench centrifuge using a swing-out rotor. Suspend the cell pellet in a suitable medium,
Centrifuge again and resuspend two more times. Cells were resuspended in Fischer's medium (Gibco and glutamine) and horse serum (10% v / v) at a concentration of 1-2 x 10 ⁶ / ml and diluted with IL-3 inducing peptide or IL under test. with dilutions of a standard preparation of -3, test concentration at 1-2 x 10 ⁵ cells / ml, it is cultured in a total volume of 100 l.
The final concentration of horse serum (or fetal calf serum if the cells are cultured normally) is
It is 10 to 20% (volume / volume). The cells are incubated at 37 ° C. in a CO ₂ incubator.

【００５５】 24時間または48時間後、生存または増殖への増殖因子の効果を、トリパンブル
ー排除アッセイ（細胞懸濁液をトリパンブルー溶液と1:1で混合し、染料を排除
する目に見える細胞をカウントする）を用いて査定する。細胞増殖（DNA合成）
の査定のための別の方法は、[³H]チミジン取り込みの測定を含む。24時間または
48時間後、[³H]チミジン（37kBq）を各ウェルに加え、インキュベーションを4時
間続ける。細胞をインキュベータから除き、続けてミリポア細胞採取器(Millipo
re cell harvester)または同様の装置上のGF/Cフィルターに移す。細胞を、トリ
クロロ酢酸(TCA)で３回洗浄し、フィルターに保持されたTCA沈殿性物質を、液体
シンチレーションカウンターでカウントする。標準およびRI IL-3誘導ペプチド
の希釈物の相対的増殖促進活性を比較して、RI IL-3誘導ペプチドの増殖促進活
性を定量化する。After 24 or 48 hours, the effect of growth factors on survival or proliferation was analyzed by trypan blue exclusion assay (cell suspension mixed 1: 1 with trypan blue solution to remove dye visible cells. Is counted). Cell proliferation (DNA synthesis)
Another method for the assessment of E. coli involves the measurement of [ ³ H] thymidine incorporation. 24 hours or
After 48 hours, [ ³ H] thymidine (37 kBq) is added to each well and incubation is continued for 4 hours. Remove the cells from the incubator and continue to the Millipore cell harvester (Millipo
re cell harvester) or a GF / C filter on a similar device. The cells are washed 3 times with trichloroacetic acid (TCA) and the TCA precipitants retained on the filters are counted in a liquid scintillation counter. The growth promoting activity of the RI IL-3 inducing peptide is quantified by comparing the relative growth promoting activity of the standard and dilutions of the RI IL-3 inducing peptide.

【００５６】 本発明は詳細な説明に記載されたそれらの実施態様のみに限定されるものでは
ないことに注意すべきである。本発明の意図を有する任意の実施態様が、本発明
の範囲内にあると考えられるべきである。しかしながら、本発明は、以下の請求
の範囲によってのみ限定される。It should be noted that the present invention is not limited to only those embodiments described in the detailed description. Any embodiment with the intention of the invention should be considered to be within the scope of the invention. However, the invention is limited only by the following claims.

【配列表】[Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA94 BD39 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA18 BA19 CA53 DA15 DC50 ZA022 ZA512 4H045 AA10 AA30 BA53 CA40 DA05 EA24 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C07K 14/54 C12N 5/00 E C12N 5/06 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE) , CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA , GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, S D, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW F terms (reference) 4B065 AA94 BD39 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA18 BA19 CA53 DA15 DC50 ZA022 ZA512 4H045 AA10 AA30 BA53 CA40 DA05 EA24

Claims (31)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列
を含むレトロ-インベルソペプチド。1. A retro-inverso peptide having 12 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項２】 該配列の少なくとも１つの塩基性に荷電したアミノ酸が、別
の塩基性に荷電したアミノ酸で置換されている請求項１記載のペプチド。2. A peptide according to claim 1 wherein at least one basic charged amino acid of said sequence is replaced by another basic charged amino acid. 【請求項３】 該配列の少なくとも１つの酸性に荷電したアミノ酸が、別の
酸性に荷電したアミノ酸で置換されている請求項１または２記載のペプチド。3. A peptide according to claim 1 or 2 wherein at least one acidic charged amino acid of said sequence is replaced by another acidic charged amino acid. 【請求項４】 該配列の少なくとも１つの非極性アミノ酸が、別の非極性ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド。4. A peptide according to any one of claims 1 to 3, wherein at least one non-polar amino acid in the sequence is replaced with another non-polar amino acid. 【請求項５】 該配列の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、別の非荷電ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。5. A peptide according to any one of claims 1 to 4, wherein at least one uncharged amino acid of said sequence is replaced by another uncharged amino acid. 【請求項６】 該配列の少なくとも１つの芳香族アミノ酸が、別の芳香族ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド。6. The peptide according to any one of claims 1 to 3, wherein at least one aromatic amino acid in the sequence is replaced with another aromatic amino acid. 【請求項７】 該ペプチドが、アミノ末端、カルボキシ末端または、アミノ
末端およびカルボキシ末端の両方で、CH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO、C₆H₅CH₂COおよびH₂N
(CH₂)_nCO（n=1〜10）からなる群より独立して選択される部分を用いて修飾され
ている請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチド。7. The peptide comprises CH ₃ CO, CH ₃ (CH ₂ ) _n CO, C ₆ H ₅ CH ₂ CO and H ₂ N at the amino terminus, the carboxy terminus, or both the amino terminus and the carboxy terminus.
_{(CH 2) n CO (n} = 1~10) set forth in any one peptide of claims 1 to 6 which independently is modified with a moiety selected from the group consisting of. 【請求項８】 該ペプチドがグリコシル化されている請求項１〜７のいずれ
か１項記載のペプチド。8. The peptide according to any one of claims 1 to 7, wherein the peptide is glycosylated. 【請求項９】 その１つ以上のアミド結合が還元されている請求項１〜８の
いずれか１項記載のペプチド。9. The peptide according to any one of claims 1 to 8, wherein one or more amide bonds thereof are reduced. 【請求項１０】 該ペプチド中の１個以上の窒素がメチル化されている請求
項１〜９のいずれか１項記載のペプチド。10. The peptide according to any one of claims 1 to 9, wherein one or more nitrogens in the peptide are methylated. 【請求項１１】 該ペプチド中の１個以上のカルボン酸基がエステル化され
ている請求項１〜１０のいずれか１項記載のペプチド。11. The peptide according to claim 1, wherein one or more carboxylic acid groups in the peptide are esterified. 【請求項１２】 ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有す
る請求項１〜１１のいずれか１項記載のペプチド。12. The peptide according to claim 1, which has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1. 【請求項１３】 12〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配
列を含むレトロ-インベルソペプチドおよび製薬上許容される担体を含む組成物
。13. A composition comprising a retro-inverso peptide having 12 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 【請求項１４】 必要とする哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促
進する方法であって、該哺乳動物に、軸索生長または髄鞘形成を促進する有効量
の、17〜約40個のアミノ酸を有しSEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-イン
ベルソペプチドを含む組成物を投与する段階を含む方法。14. A method for promoting axon growth or myelination in a mammal in need thereof, wherein the mammal has an effective amount of 17 to about 40, which promotes axon growth or myelination. A method comprising the step of administering a composition comprising a retro-inverso peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項１５】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項１４記載の方法。15. The method of claim 14, wherein said peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項１６】 該哺乳動物がヒトである請求項１４または１５記載の方法
。16. The method according to claim 14 or 15, wherein the mammal is a human. 【請求項１７】 該投与段階が、直接局所注入、全身、頭蓋内、脳脊髄内、
局所および経口からなる群より選択される請求項１４〜１６のいずれか１項記載
の方法。17. The administration step comprises direct local injection, systemic, intracranial, intracerebrospinal,
The method according to any one of claims 14 to 16, which is selected from the group consisting of topical and oral administration. 【請求項１８】 造血を刺激する方法であって、多能性造血幹細胞を、造血
を刺激するのに有効量の、12〜約40個のアミノ酸を有しSEQ ID NO:1で示される
配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物と接触させることを含む方
法。18. A method of stimulating hematopoiesis, wherein pluripotent hematopoietic stem cells are provided in an amount effective to stimulate hematopoiesis, the sequence having 12 to about 40 amino acids and being represented by SEQ ID NO: 1. Comprising contacting a composition comprising a retro-inverso peptide comprising 【請求項１９】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項１８記載の方法。19. The method of claim 18, wherein said peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項２０】 該方法が、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、
肥満細胞、巨核球および赤血球からなる群より選択される細胞の発生および分化
をもたらす請求項１８または１９記載の方法。20. The method comprises: macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils,
20. The method of claim 18 or 19 which results in the development and differentiation of cells selected from the group consisting of mast cells, megakaryocytes and red blood cells. 【請求項２１】 哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促進するのに
使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を
含むレトロ-インベルソペプチド。21. A retro-inverter having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, for use in promoting axon growth or myelination in a mammal. So-peptide. 【請求項２２】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項２１記載のペプチド。22. The peptide of claim 21, wherein the peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項２３】 該哺乳動物がヒトである請求項２１または２２記載のペプ
チド。23. The peptide according to claim 21 or 22, wherein the mammal is a human. 【請求項２４】 多能性造血幹細胞の造血を刺激するのに使用するための、
17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-インベ
ルソペプチド。24. For use in stimulating hematopoiesis of pluripotent hematopoietic stem cells,
A retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 【請求項２５】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２４記載のペプチド。25. The peptide according to claim 24, wherein the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. 【請求項２６】 17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配
列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において軸索生長
または髄鞘形成を促進するための薬剤の製造に使用する方法。26. A retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 promotes axonal growth or myelination in a mammal in need thereof. The method used in the manufacture of a drug for. 【請求項２７】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２６記載の使用方法。27. The use according to claim 26, wherein the peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. 【請求項２８】 該哺乳動物がヒトである請求項２６または２７記載の使用
方法。28. The use according to claim 26 or 27, wherein the mammal is a human. 【請求項２９】 17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配
列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において多能性造
血幹細胞の造血を刺激するための薬剤の製造に使用する方法。29. Stimulating hematopoiesis of pluripotent hematopoietic stem cells in a mammal in need thereof, a retro-inverso peptide having 17 to about 40 amino acids and comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The method used in the manufacture of a drug for. 【請求項３０】 該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２９記載の使用方法。30. The use according to claim 29, wherein said peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1. 【請求項３１】 該哺乳動物がヒトである請求項２９または３０記載の使用
方法。31. The use according to claim 29 or 30, wherein the mammal is a human.